ES2904255T3 - Proteínas inhibidoras de insectos novedosas - Google Patents

Proteínas inhibidoras de insectos novedosas Download PDF

Info

Publication number
ES2904255T3
ES2904255T3 ES16831304T ES16831304T ES2904255T3 ES 2904255 T3 ES2904255 T3 ES 2904255T3 ES 16831304 T ES16831304 T ES 16831304T ES 16831304 T ES16831304 T ES 16831304T ES 2904255 T3 ES2904255 T3 ES 2904255T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
protein
plant
insect
pesticidal
tic5290
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16831304T
Other languages
English (en)
Inventor
David Bowen
Catherine Chay
Stanislaw Flasinski
Yong Yin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Monsanto Technology LLC
Original Assignee
Monsanto Technology LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Monsanto Technology LLC filed Critical Monsanto Technology LLC
Application granted granted Critical
Publication of ES2904255T3 publication Critical patent/ES2904255T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/44—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a nitrogen atom attached to the same carbon skeleton by a single or double bond, this nitrogen atom not being a member of a derivative or of a thio analogue of a carboxylic group, e.g. amino-carboxylic acids
    • A01N37/46—N-acyl derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus
    • A01N63/23—B. thuringiensis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un promotor heterólogo unido operativamente con un segmento de polinucleótido que codifica una proteína pesticida o fragmento pesticida de la misma que tiene actividad inhibidora de insectos, en la que: a. dicha proteína pesticida comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; o b. dicha proteína pesticida comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 %, o el 90 %, o el 95 %, o el 98 %, o el 99 % o aproximadamente el 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO:2.

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas inhibidoras de insectos novedosas
LISTADO DE SECUENCIAS
El archivo denominado "38_21_61551_0001SEQLISTING_ST25.txt" que contiene un formulario electrónico del listado de secuencia se creó el 22 de junio de 2016. Este archivo tiene 16.179 bytes (medido en MS-Windows®). Campo de la invención
La invención hace referencia, en términos generales, al campo de las proteínas inhibidoras de insectos. Se desvela una clase novedosa de proteínas que presenta actividad inhibidora de insectos contra plagas relevantes desde el punto de vista agrícola de plantas de cultivo y semillas. En particular, la proteína desvelada es activa como insecticida contra plagas relevantes desde el punto de vista agrícola de plantas de cultivo y semillas, particularmente especies de plagas de insectos coleópteros, lepidópteros y hemípteros. Se proporcionan plantas, partes de plantas y semillas que contienen una construcción de polinucleótidos recombinantes que codifica una o más de las proteínas de toxinas que se describen.
Antecedentes de la invención
Mejorar el rendimiento de cultivo de plantas significativas desde el punto de vista agrícola, las cuales incluyen, entre otras, maíz, soja, caña de azúcar, arroz, trigo, verduras y algodón, se ha vuelto cada vez más importante. Además de la necesidad de cultivar productos agrícolas para alimentar, vestir y proporcionar energía a una población humana creciente, se predice que los efectos relacionados con el clima y la presión de la población creciente para usar la tierra para fines diferentes de las prácticas agrícolas reducirán la cantidad de tierra disponible para el cultivo. Estos factores han llevado a pronósticos negativos con respecto a la seguridad del alimento, particularmente en ausencia de mejoras importantes en la biotecnología vegetal y las prácticas agronómicas. A la vista de estas presiones, las mejoras sostenibles desde el punto de vista ambiental en tecnología, técnicas agrícolas y el manejo de plagas son herramientas vitales para expandir la producción de cultivos en la cantidad limitada de tierra arable disponible para el cultivo.
Los insectos, particularmente los insectos del orden de los lepidópteros, coleópteros y hemípteros se consideran una causa principal de daño a los campos de cultivo, lo cual reduce el rendimiento de cultivo en las áreas infestadas. Las especies de plagas de lepidópteros que tienen un impacto negativo en la agricultura incluyen, de modo no taxativo, Helicoverpa zea, Ostrinia nubilalis, Diatraea saccharalis, Diatraea grandiosella, Anticarsia gemmatalis, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Agrotis ipsilon, Trichoplusia ni, Chrysodeixis includens, Heliothis virescens, Plutella xylostella, Pectinophora gossypiella, Helicoverpa armigera, Elasmopalpus lignosellus, Striacosta albicosta y Phyllocnistis citrella. Las especies de plagas de coleópteros que tienen un impacto negativo en la agricultura incluyen, entre otros, Agriotes spp., Anthonomus spp., Atomaria linearis, Chaetocnema tibialis, Cosmopolites spp., Curculio spp., Dermestes spp., Diabrotica spp., Epilachna spp., Eremnus spp., Leptinotarsa decemlineata, Lissorhoptrus spp., Melolontha spp., Orycaephilus spp., Otiorhynchus spp., Phlyctinus spp., Popillia spp., Psylliodes spp., Rhizopertha spp., Scarabeidae, Sitophilus spp., Sitotroga spp., Tenebrio spp., Tribolium spp. y Trogoderma spp, particularmente en la que la plaga es Diabrotica virgifera virgifera (gusano de la raíz del maíz occidental, WCR), Diabrotica barben (gusano de la raíz del maíz del norte, NCR), Diabrotica virgifera zeae (gusano de la raíz del maíz mexicano, MCR), Diabrotica balteata (gusano de la raíz del maíz brasileño (BZR), Diabrotica undecimpunctata howardii (gusano de la raíz del maíz del sur, SCR) y un complejo de gusano de la raíz del maíz brasileño (BCR) que consiste en Diabrotica viridula y Diabrotica speciosa). Las especies de plagas de hemípteros que tienen un impacto negativo en la agricultura incluyen, entre otros, Lygus hesperus, Lygus lineolaris y Pseudatomoscelis seriatus.
Históricamente, la aplicación intensiva de insecticidas químicos sintéticos era considerada como un agente de control de plagas en la agricultura. Las preocupaciones por el medioambiente y la salud humana, además de los problemas emergentes de resistencia, estimularon la investigación y desarrollo de pesticidas biológicos. Este esfuerzo de investigación llevó al descubrimiento y uso progresivo de varias especies microbianas entomopatógenas, inclusive bacterias.
El paradigma de control biológico cambió cuando se descubrió el potencial de bacterias entomopatógenas, especialmente las bacterias que pertenecen al género Bacillus, y se desarrolló como un agente de control de plagas biológicas. Se han usado cepas de la bacteria Bacillus thuringiensis (Bt) como fuente de proteínas pesticidas, dado que se descubrió que las cepas de Bt presentan una toxicidad elevada contra insectos específicos. Se conoce que las cepas de Bt producen delta-endotoxinas que están localizadas dentro de cuerpos de inclusión cristalinos paraesporales al comienzo de la esporulación y durante la fase de crecimiento estacionario (p. ej., proteínas Cry), y también se conoce que producen proteínas insecticidas secretadas. Cuando son ingeridas por un insecto susceptible, las delta-endotoxinas, así como las toxinas secretadas, ejercen sus efectos en la superficie del epitelio del intestino medio y rompen la membrana celular, lo cual lleva a la ruptura y muerte de la célula. Los genes que codifican proteínas insecticidas también se han identificado en especies bacterianas que no son Bt, incluso otros Bacillus y una diversidad de especies bacterianas adicionales, por ejemplo, Brevibacillus laterosporus, Lysinibacillus sphaericus ("Ls" conocido anteriormente como Bacillus sphaericus) y Paenibacillus popilliae.
Las toxinas insecticidas solubles secretadas y cristalinas son altamente específicas para sus hospedadores y han obtenido una aceptación mundial como alternativas a los insecticidas químicos. Por ejemplo, las proteínas de toxinas insecticidas se han empleado en varias aplicaciones agrícolas para proteger plantas importantes desde el punto de vista agrícola de infestaciones de insectos, disminuir la necesidad de aplicaciones de pesticidas químicos y aumentar los rendimientos. Las proteínas de toxinas insecticidas se usan para controlar plagas relevantes desde el punto de vista agrícola mediante procedimientos mecánicos, tal como aspersión para dispersar formulaciones microbianas que contienen varias cepas bacterianas en la superficie de plantas, y mediante el uso de técnicas de transformación genética para producir plantas y semillas transgénicas que expresan proteínas de toxinas insecticidas.
El uso de plantas transgénicas que expresan proteínas de toxinas insecticidas se ha adaptado a nivel mundial. Por ejemplo, en 2012, 26,1 millones de hectáreas se plantaron con cultivos transgénicos que expresan toxinas Bt (James, C., Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2012. ISAAA Brief No. 44). El uso mundial de cultivos transgénicos protegidos contra insectos y la cantidad limitada de proteínas de toxinas insecticidas usadas en esos cultivos ha creado una presión para seleccionar alelos insecticidas existentes que impartan resistencia a las proteínas insecticidas utilizadas actualmente.
El desarrollo de resistencia en las plagas objetivo a las proteínas de toxinas insecticidas crea una necesidad continua para descubrir y desarrollar nuevas formas de proteínas de toxinas insecticidas que sean útiles en el manejo del aumento en la resistencia a insecticidas de cultivos transgénicos que expresan proteínas de toxinas insecticidas. Las toxinas de proteínas nuevas con eficacia mejorada y que presenten un control sobre un amplio espectro de especies de insecto susceptibles reducirá la cantidad de insectos sobrevivientes que puedan desarrollar alelos de resistencia. Además, el uso en una planta de dos o más proteínas de toxinas insecticidas transgénicas tóxicas para la misma plaga de insectos y que presente modos diferentes de acción reduce la probabilidad de resistencia en cualquier especie de insecto objetivo individual.
Por ende, los inventores desvelan en el presente documento una familia de toxinas de proteínas novedosa de Bacillus thuringiensis junto con proteínas de toxinas similares, proteínas variantes y proteínas recombinantes ejemplares que presentan actividad insecticida contra especies de plagas de lepidópteros, coleópteros y hemípteros diana, particularmente contra gusano de la raíz del maíz occidental.
Sumario de la invención
En el presente documento se desvela un grupo novedoso de proteínas pesticidas con actividad inhibidora de insectos (proteínas de toxinas), denominadas aquí TIC5290, que se demostró que exhiben actividad inhibidora contra una o más plagas de plantas de cultivo. La proteína TIC5290 y las proteínas en la clase de toxinas de proteínas TIC5290 se pueden utilizar solas o en combinación con otras proteínas insecticidas y agentes tóxicos en formulaciones e in planta, proporcionando así alternativas a las proteínas insecticidas y productos químicos insecticidas que se utilizan actualmente en los sistemas agrícolas.
En una realización, en la presente solicitud se desvela una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un promotor heterólogo unido operativamente a un segmento de polinucleótido que codifica una proteína pesticida o fragmento de la misma que tiene actividad inhibidora de insectos, en la que: (a) dicha proteína pesticida comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; (b) dicha proteína pesticida comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 %, o el 90 %, o el 95 %, o el 98 %, o el 99 % o aproximadamente el 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO:2; o dicha molécula de ácido nucleico recombinante es un enlace operable con un vector, y dicho vector se selecciona del grupo que consiste en un plásmido, fagémido, bácmido, cósmido y un cromosoma artificial bacteriano o de levadura. La molécula de ácido nucleico recombinante puede comprender una secuencia que funciona para expresar la proteína pesticida en una planta; o se expresa en una célula de planta para producir una cantidad eficaz como pesticida de la proteína pesticida.
En otra realización de la presente solicitud, se encuentran células hospedadoras que comprenden una molécula de ácido nucleico recombinante de la solicitud, en la que la célula hospedadora se selecciona del grupo que consiste en una célula bacteriana y una célula de planta. Las células hospedadoras contempladas incluyen Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Brevibacillus, Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella, Pantoea y Erwinia. En determinadas realizaciones, dicha especie Bacillus es Bacillus cereus o Bacillus thuringiensis, dicha Brevibacillus es Brevibacillus laterosperus, o dicha Escherichia es Escherichia coli. Las células hospedadoras contempladas incluyen una célula dicotiledónea y una célula monocotiledónea. Algunas células hospedadoras contempladas adicionales incluyen células vegetales de alfalfa, banana, cebada, poroto, brócoli, repollo, Brassica, zanahoria, mandioca, ricino, coliflor, apio, garbanzo, repollo chino, cítricos, coco, café, maíz, trébol, algodón (Gossypium sp.), una cucurbitácea, pepino, abeto de Douglas, berenjena, eucaliptus, lino, ajo, uva, lúpulo, puerro, lechuga, pino taeda, mijo, melón, nuez, avena, aceituna, cebolla, plantas ornamentales, palmera, pasto forrajero, arveja, maní, morrón, gandul, pino, papa, álamo, calabaza, pino insigne, rábano, colza, arroz, rizomas, centeno, cártamo, arbusto, sorgo, pino del sur, soja, espinaca, calabacín, frutilla, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, maíz dulce, liquidámbar, boniato, pasto varilla, té, tabaco, tomate, triticale, césped, sandía y trigo.
En aun otra realización, la proteína pesticida presenta actividad contra insecto coleópteros, incluso gusano de la raíz del maíz occidental, gusano de la raíz del maíz del sur, gusano de la raíz del maíz del norte, gusano de la raíz del maíz mexicano, gusano de la raíz del maíz brasileño o complejo de gusano de la raíz del maíz brasileño que consiste en Diabrotica viridula y Diabrotica speciosa.
En otra realización, la proteína pesticida presenta actividad contra un insecto lepidóptero, incluso oruga del frijol terciopelo, barrenador de la caña de azúcar, gusano barrenador del tallo inferior del maíz, gusano elotero, oruga del tabaco, falso medidor, gusano soldado africano, gusano soldado del sur, cogollero del maíz, gusano soldado, oruga del viejo mundo, gusano de la hoja oriental, gusano rosado, gusano cortador grasiento, barrenador de maíz del suroeste, polilla del repollo o barrenador europeo del maíz.
En aun otra realización, la proteína pesticida presenta actividad contra un insecto hemíptero, incluso chinche de la hoja occidental, chinche de la hoja o pulga saltona del algodón.
En la presente solicitud también se contemplan plantas que comprenden una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un promotor heterólogo unido operativamente a un segmento de polinucleótido que codifica una proteína pesticida o fragmento de la misma, en la que: (a) dicha proteína pesticida comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; (b) dicha proteína pesticida comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 %, o el 90 %, o el 95 %, o el 98 %, o el 99 % o aproximadamente el 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO:2. En determinadas realizaciones, la proteína pesticida comprende SEQ ID NO:2. En una realización, la planta es una monocotiledónea o una dicotiledónea. En otra realización, la planta se selecciona del grupo que consiste en alfalfa, banana, cebada, frijol, brócoli, col, Brassica, zanahoria, mandioca, ricino, coliflor, apio, garbanzo, col chino, citrus, coco, café, maíz, trébol, algodón, una cucurbitácea, pepino, abeto de Douglas, berenjena, eucalipto, lino, ajo, uva, lúpulo, puerro, lechuga, pino taeda, mijo, melones, nuez, avena, oliva, cebolla, ornamental, palma, pasto de pastura, arveja, maní, pimiento, gandul, pino, papa, álamo, calabaza, pino insigne, rábano, semilla de colza, arroz, rizoma, centeno, cártamo, arbusto, sorgo, pino del sur, soja, espinaca, calabaza, frutilla, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, maíz dulce, liquidámbar, boniato, pasto varilla, té, tabaco, tomate, triticale, césped, sandía, y trigo.
En realizaciones adicionales, se desvelan semillas que comprenden las moléculas de ácido nucleico recombinante. En otra realización, se contempla una composición inhibidora de insectos que comprende las moléculas de ácido nucleico desveladas en la presente solicitud. La composición inhibidora de insectos además puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica al menos otro agente pesticida que es diferente de dicha proteína pesticida. El al menos otro agente pesticida se selecciona del grupo que consiste en una proteína inhibidora de insectos, una molécula de ARNdc inhibidora de insectos, y una proteína auxiliar. El al menos otro agente pesticida en la composición inhibidora de insectos presenta actividad contra una o más especies de pestes del orden de lepidópteros, coleópteros o hemípteros. El al menos otro agente pesticida en la composición inhibidora de insectos se encuentra en una realización seleccionada del grupo que consiste en: un Cry1A, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1Ae, Cry1B, Cry1C, variantes de CrylC, Cry1D, Cry1E, Cry1F, quimeras Cry1A/F, Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry2A, Cry2Ab, Cry2Ae, Cry3, variantes de Cry3A, Cry3B, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry34, Cry35, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET29, ET33, ET34, ET35, ET66, ET70, TIC400, TIC407, TIC417, TIC431, TIC800, TIC807, TIC834, TIC853, TIC900, TIC901, TIC1201, TIC1415, TIC2160, TIC3131, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869, TIC1100, VIP3A, VIP3B, VIP3Ab, AXMI-AXMI-, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100, AXMI-115, AXMI-113 y AXMI-005, AXMI134, AXMI-150, AXMI-171, AXMI-184, AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, AXMI-209, AXMI-205, AXMI-218, AXMI-220, AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z y AXMI-225z, AXMI-238, AXMI-270, AXMI-279, AXMI-345, AXMI-335,AXMI-R1 y variantes de los mismos, IP3 y variantes del mismo, DIG-3, DIG-5, DIG-10, DIG-657 y una proteína DIG-11.
Se contemplan productos básicos que comprenden una cantidad detectable de las moléculas de ácido nucleico recombinante desveladas en la presente solicitud. Dichos productos básicos incluyen maíz básico embolsado por un manipulador de granos, copos de maíz, tortas de maíz, harina de maíz, jarabe de maíz, aceite de maíz, ensilaje de maíz, almidón de maíz, cereal de maíz y similares, y productos básicos de algodón correspondientes tales como semilla de algodón entera o procesada, aceite algodonero, hilas, semillas y partes de plantas procesadas para pienso o alimento, fibras, papel, biomasas, y productos combustibles tales como combustible derivado de aceite algodonero o sedimentos derivados de residuos de desmotadora de algodón, y productos básicos de soja correspondientes tales como semilla de soja entera o procesada, aceite de soja, proteína de soja, harina de soja, copos de soja, salvado de soja, leche de soja, queso de soja, vino de soja, alimentación animal que comprende soja, papel que comprende soja, crema que comprende soja, biomasa de soja, y productos combustibles producidos utilizando plantas de soja y partes de plantas de soja, y arroz, trigo, sorgo, guandú, maní, frutas, melón correspondientes, y productos básicos vegetales que incluyen, donde corresponda, jugos, concentrados, compotas, jaleas, mermeladas, y otras formas comestibles de dichos productos básicos que contienen una cantidad detectable de dichos polinucleótidos y/o polipéptidos de la presente solicitud.
En la presente solicitud también se contempla un procedimiento para producir semilla que comprende las moléculas de ácido nucleico recombinante desveladas en la presente solicitud. El procedimiento comprende sembrar al menos una de las semillas que comprenden las moléculas de ácido nucleico recombinante desveladas en la presente solicitud; cultivar plantas a partir de la semilla; y cosechar semillas de las plantas en las que las semillas cosechadas comprenden las moléculas de ácido nucleico recombinante en la presente solicitud.
En otra realización ilustrativa, se proporciona una planta resistente a la infestación por insectos en la que las células de dicha planta comprenden: (a) una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una cantidad eficaz como insecticida de una proteína pesticida como se expone en SEQ ID NO:2; o (b) una cantidad eficaz como insecticida de una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tienen al menos el 85 %, o el 90 %, o el 95 %, o aproximadamente el 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO:2.
En la presente solicitud también se desvelan procedimientos para controlar una plaga de especie de coleóptero, lepidóptero o hemíptero, y controlar una infestación de plagas de la especie coleóptero, lepidóptero o hemíptero de una planta, particularmente una planta de cultivo. El procedimiento comprende, en una realización, (a) poner en contacto la plaga con una cantidad eficaz como insecticida de una o más proteínas pesticidas como se expone en SEQ ID NO:2; o (b) poner en contacto la plaga con una cantidad eficaz como insecticida de una o más proteínas pesticidas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tienen al menos el 85 %, o el 90 %, o el 95 %, o aproximadamente el 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO:2.
En el presente documento además se desvela un procedimiento para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un segmento de polinucleótido que codifica una proteína pesticida o fragmento de la misma, en la que: (a) dicha proteína pesticida comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; (b) dicha proteína pesticida comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 %, o el 90 %, o el 95 %, o el 98 %, o el 99 % o aproximadamente el 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO:2; (c) dicho segmento de polinucleótido se hibrida en condiciones rigurosas a un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3. En una realización de la invención, el procedimiento comprende poner en contacto una muestra de ácidos nucleicos con una sonda de ácido nucleico que se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con ADN genómico de una planta que comprende un segmento de polinucleótido que codifica una proteína pesticida o fragmento de la misma proporcionada en el presente documento, y no se hibrida en dichas condiciones de hibridación con ADN genómico de una planta de otro modo isogénica que no comprende el segmento, en la que la sonda es homóloga o complementaria con SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, o una secuencia que codifica una proteína pesticida que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 %, o el 90 %, o el 95 %, o el 98 %, o el 99 % o aproximadamente el 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO:2. El procedimiento además comprende (a) someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridación rigurosas; y (b) detectar la hibridación de la sonda con ADN de la muestra.
Además, la invención proporciona procedimientos para detectar la presencia de una proteína pesticida o fragmento de la misma en una muestra que comprende proteína, en la que dicha proteína pesticida comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; o dicha proteína pesticida comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 %, o el 90 %, o el 95 %, o el 98 %, o el 99 % o aproximadamente el 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO:2. En una realización, el procedimiento comprende: (a) poner en contacto una muestra con un anticuerpo inmunorreactivo; y (b) detectar la presencia de la proteína. En algunas realizaciones, la etapa de detectar comprende un ELISA o una transferencia Western.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 ilustra la actividad inhibidora del gusano de la raíz del maíz occidental (WCR) in planta de las proteínas TIC5290 dirigidas a cloroplasto o no dirigidas a cloroplasto ejemplares.
Breve descripción de las secuencias
SEQ ID NO:1 es un ácido nucleico que codifica una secuencia de proteína pesticida TIC5290 obtenida de EG6657 de la especie Bacillus thuringiensis.
SEQ ID NO:2 es la secuencia de aminoácidos de la proteína TIC5290.
SEQ ID NO:3 es una secuencia codificante sintética que codifica una proteína pesticida TIC5290 utilizada para la expresión en células de plantas.
Descripción detallada de la invención
El problema en la técnica del control dB plagas agrícolas puede caracterizarse como una necesidad de nuevas proteínas de toxinas que sean eficaces contra plagas diana, que presenten un amplio espectro de toxicidad contra especies de plagas diana, que sean capaces de expresarse en plantas sin provocar problemas agronómicos indeseables y proporcionen un modo alternativo de acción en comparación con las toxinas actuales que se utilizan en las plantas a nivel comercial.
En el presente documento se desvelan proteínas insecticidas novedosas, ejemplificadas por TIC5290 y miembros de la familia relacionados que proporcionan resistencia contra plagas de insectos coleópteros, lepidóptero y hemípteros, y más específicamente contra las especies de plagas del gusano de la raíz del maíz. También se desvelan secuencias codificantes sintéticas diseñadas para la expresión en célula de planta que codifican TIC5290. Además, se desvelan moléculas de ácido nucleico recombinante que comprenden un promotor en enlace operable a una secuencia codificante que codifica una proteína de toxina TIC5290, o miembros de la familia relacionados, o fragmentos de la misma.
En la presente solicitud, la referencia a TIC5290, "proteína TIC5290", "toxina de proteína TIC5290", "proteína de toxina TIC5290", "proteína pesticida TIC5290", "toxinas relacionadas a TIC5290" o "proteína de toxina relacionada a TIC5290", y similares, se refiere a cualquier proteína pesticida o proteína inhibidora de insectos novedosa, que comprende, que consiste en, que es sustancialmente homóloga a, que es similar a, o que deriva de cualquier secuencia de proteína pesticida o proteína inhibidora de insectos de TIC5290 (SEQ ID NO:2) y segmentos pesticidas o inhibidores de insectos de la misma, o combinaciones de los mismos, que confieren actividad contra plagas de coleópteros, plagas de lepidópteros y plagas de hemípteros, incluso cualquier proteína que presenta actividad pesticida o inhibidora de insectos si la alineación de dicha proteína con TIC5290 provoca la identidad de secuencia de aminoácidos de cualquier porcentaje de fracción de entre aproximadamente el 65 y aproximadamente el 100 por ciento.
El término "segmento" o "fragmento" se usa en esta solicitud para describir secuencias consecutivas de aminoácidos o ácido nucleico que son más cortas que secuencias completas de aminoácidos o ácido nucleico que describen la proteína TIC5290 o proteína insecticida miembro de la familia relacionada. En la presente solicitud, también se desvela un segmento o fragmento que presenta actividad inhibidora de insectos si la alineación de dicho segmento o fragmento, con la sección correspondiente la proteína TIC5290 establecida en SEQ ID NO:2, produce una identidad de secuencia de aminoácidos de cualquier porcentaje de fracción entre aproximadamente el 65 y aproximadamente el 100 por ciento entre el segmento o fragmento y la sección correspondiente de la proteína TIC5290.
En la presente solicitud, la referencia a los términos "activo" o "actividad", "actividad pesticida", "pesticida" o "actividad insecticida", "inhibidora de insectos" o "insecticida", se refieren a la eficacia de un agente tóxico, por ejemplo una toxina de proteína, para inhibir (inhibir el crecimiento, la alimentación, la fecundidad o la viabilidad), suprimir (suprimir crecimiento, la alimentación, la fecundidad o la viabilidad), controlar (controlar la infestación de plagas, controlar las actividades de alimentación de plagas en un cultivo específico que contiene una cantidad eficaz de una proteína TIC5290) o destruir (provocar la morbilidad, la mortalidad o la fecundidad reducida) una plaga. Estos términos pretenden incluir el resultado de proporcionar una cantidad efectiva como pesticida de una proteína tóxica a una plaga donde la exposición de la plaga a la proteína tóxica produce morbilidad, mortalidad, fecundidad reducida o debilitamiento. Estos términos también incluyen la repulsión de la plaga de la planta, un tejido de la planta, una parte de la planta, semilla, células de la planta o de la ubicación geográfica específica donde la planta puede crecer, como resultado de proporcionar una cantidad eficaz como pesticida de la proteína tóxica en o sobre la planta. En general, la actividad pesticida se refiere a la capacidad de una proteína tóxica de ser eficaz para inhibir el crecimiento, desarrollo, viabilidad, comportamiento alimenticio, comportamiento de apareamiento, fecundidad o cualquier disminución medible de los efectos adversos provocados por una alimentación de insectos en esta proteína, fragmento de proteína, segmento de proteína o polinucleótido de una plaga diana específica, incluso, entre otros, insectos del orden lepidópteros, coleópteros o hemípteros. La proteína tóxica puede ser producida por la planta o puede ser aplicada a la planta o al ambiente dentro de la ubicación donde se encuentra la planta. Los términos "bioactividad", "efectivo", "eficaz" o variaciones de estos, también son términos utilizados de forma intercambiable en la presente solicitud para describir los efectos de las proteínas de la presente invención en plagas de insectos diana. Una cantidad eficaz como insecticida de un agente tóxico, cuando se proporciona a la dieta de una plaga objetivo, presente actividad pesticida cuando el agente tóxico entra en contacto con la plaga. Un agente tóxico puede ser una proteína pesticida o uno o más agentes químicos conocidos en la técnica. Los agentes químicos pesticidas o insecticidas y los agentes de proteínas pesticidas o insecticidas se pueden utilizar solos o en combinaciones entre sí. Los agentes químicos incluyen, de modo no taxativo, moléculas de ARNdc que se dirigen a genes específicos para la supresión en una plaga objetivo, organocloruros, organofosfatos, carbamatos, piretroides, neonicotinoides y rianoides. Los agentes de proteínas pesticidas o insecticidas incluyen las toxinas de proteínas que se indican en la presente solicitud, así como otros agentes tóxicos proteináceos que incluyen los que se dirigen a lepidópteros, coleópteros y hemípteros, así como toxinas de proteína que se usan para controlar otras plagas vegetales, tal como proteínas de Cry disponibles en la técnica para su uso para controlar la especie hemípteros.
Se pretende que la referencia a una plaga, particularmente una plaga de una planta de cultivo signifique plagas de insectos de plantas de cultivo, particularmente aquellas que son controladas por la proteína TIC5290. Sin embargo, la referencia a una plaga también puede incluir plagas de insectos homópteros de plantas, así como nematodos y hongos cuando los agentes tóxicos que se dirigen a estas plagas se colocan o presentan junto con la proteína TIC5290, o una proteína que sea 65 a alrededor de 100 idéntica a TIC5290.
Las proteínas insecticidas de la clase de toxina de proteína TIC5290 están relacionadas por función común y presentan actividad insecticida contra plagas de insectos de la especie de insectos coleópteros y lepidópteros, inclusive adultos, pupas, larvas y neonatos, así como la especie de insectos hemípteros, inclusive adultos y ninfas. Los insectos del orden lepidópteros incluyen, de modo no taxativo, gusanos soldados, gusanos cortadores, falsos medidores, y heliothinaes en la familia Noctuidae, por ejemplo, gusano cogollero (Spodoptera frugiperda), gardama (Spodoptera exigua), gusano de las crucíferas (Mamestra configurata), gusano soldado del sur (Spodoptera eridania), gusano cortador negro (Agrotis Ípsilon), oruga de la col (Trichoplusia ni), falso medidor (Pseudoplusia includens), oruga de las leguminosas (Anticarsia gemmatalis), gusano verde del trébol (Hypena scabra), oruga del tabaco (Heliothis virescens), gusano cortador granulado(Agrotis subterránea), gardama (Pseudaletia unipuncta), gusano cortador pálido (Agrotis orthogonia); barrenadores, polillas del nogal, gusanos telarañeros, gusanos de las bellotas, gusanos de la col y gusanos presidiarios de la familia Pyralidae, por ejemplo, barrenador europeo del maíz (Ostrinia nubilalis), gusano de la naranja (Amyelois transitella), gusano de la raíz del maíz (Crambus caliginosellus), gusano tejedor del césped (Herpetogramma licarsisalis), polilla del girasol (Homoeosoma electellum), gusano saltarín (Elasmopalpus lignosellus); enrolladores, larvas de mariposa, gusanos de semilla y gusanos de frutas en la familia Tortricidae, por ejemplo, gusano de la pera y la manzana (Cydia pomonella), polilla de la vid (Endopiza viteana), polilla oriental de la fruta (Grapholita molesta), polilla de capullo de girasol (Suleima helianthana); y muchos otros lepidópteros importantes desde el punto de vista económico, por ejemplo, palomilla dorso de diamante (Plutella xylostella), gusano rosado (Pectinophora gossypiella) y polilla gitana (Lymantria dispar). Otras plagas de insectos del orden lepidóptero incluyen, p. ej., gusano de la hoja del algodonero (Alabama argillacea), enrollador de los brotes (Archips argyrospila), enrollador de la hoja europeo (Archips rosana) y otras especies Archips, (Chilo suppressalis, barrenador de arroz asiático, o barrenador de tallo de arroz), enrollador de las hojas de arroz (Cnaphalocrocis medinalis), gusano de la raíz del maíz (Crambus caliginosellus), oruga del césped (Crambus teterrellus), barrenador de maíz del suroeste (Diatraea grandiosella), barrenador de la caña de azúcar (Diatraea saccharalis), gusano de la cápsula espinosa (Earias insulana), gusano manchado (Earias vittella), oruga del viejo mundo (Helicoverpa armigera), gusano del maíz (Helicoverpa zea, también conocido como gusanos de la vaina de soja y gusanos belloteros del algodón), gusano cogollero del tabaco (Heliothis virescens), gusano tejedor del césped (Herpetogramma licarsisalis), polilla del racimo europeo (Lobesia botrana), minador de los cítricos (Phyllocnistis citrella), mariposa blanca grande (Pieris brassicae), mariposa pequeña blanca (Pieris rapae, también denominado gusano importado de la col), polilla del repollo (Plutella xylostella), oruga de la remolacha (Spodoptera exigua), gusano gris del tabaco (Spodoptera litura, también denominado gusano defoliador), y polilla del tomate (Tuta absoluta).
Los insectos del orden coleóptero incluyen, entre otros, Agriotes spp., Anthonomus spp., Atomaria linearis, Chaetocnema tibialis, Cosmopolites spp., Curculio spp., Dermestes spp., Diabrotica spp., Epilachna spp., Eremnus spp., Leptinotarsa decemlineata, Lissorhoptrus spp., Melolontha spp., Orycaephilus spp., Otiorhynchus spp., Phlyctinus spp., Popillia spp., Psylliodes spp., Rhizopertha spp., Scarabeidae, Sitophilus spp., Sitotroga spp., Tenebrio spp., Tribolium spp. y Trogoderma spp, particularmente cuando la plaga es gusano de la raíz del maíz occidental (Diabrotica virgifera, WCR), gusano de la raíz del maíz del norte (Diabrotica barberi, NCR), gusano de la raíz del maíz mexicano (Diabrotica virgifera zeae, MCR), gusano de la raíz del maíz brasileño (Diabrotica balteata, BZR), gusano de la raíz del maíz del sur (Diabrotica undecimpunctata howardii, SCR) y un complejo de gusano de la raíz del maíz brasileño (BCR, que consiste en Diabrotica viridula y Diabrotica speciosa).
Los insectos de hemíptero incluyen, entre otros, chinches de la hoja occidental (Lygus hesperus), chinches de la hoja (Lygus lineolaris) y pulga saltona del algodón (Pseudatomoscelis seriatus).
Se pretende que la referencia en la presente solicitud a una "molécula aislada de ADN", o una frase o término equivalente, signifique que la molécula de ADN está presente sola o en combinación con otras composiciones, pero no está en su entorno natural. Por ejemplo, los elementos de ácido nucleico, tales como una secuencia codificante, una secuencia de intrones, una secuencia líder sin traducir, una secuencia promotora, una secuencia de terminación transcripcional y similares, que se encuentran naturalmente dentro del ADN del genoma de un organismo no se consideran "aisladas", siempre y cuando el elemento esté dentro del genoma del organismo y en la ubicación dentro del genoma en el que se encuentra naturalmente. Sin embargo, cada uno de estos elementos, y subpartes de estos elementos, se encuentra "aislado" dentro del ámbito de la presente descripción siempre que el elemento no se encuentre dentro del genoma del organismo y en la ubicación dentro del genoma en el cual se encuentra naturalmente. De manera similar, una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína insecticida o cualquier variante insecticida de origen natural de la proteína podría ser una secuencia de nucleótidos aislada siempre que la secuencia de nucleótidos no esté dentro del ADN de la bacteria en la cual la secuencia que codifica la proteína se encuentra naturalmente. Una secuencia sintética de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína insecticida de origen natural se podría considerar aislada a los fines de la presente descripción. A los efectos de la presente descripción, cualquier secuencia transgénica de nucleótidos, es decir, la secuencia de nucleótidos del ADN insertado en el genoma de las células de una planta o bacteria, o presente en un vector extracromosómico, se podría considerar una secuencia aislada de nucleótidos ya sea que esté presente dentro del plásmido o estructura similar usada para transformar la célula, dentro del genoma de la planta o bacteria, o presente en cantidades detectables en tejidos, progenie, muestras biológicas o productos de materia prima derivados de la planta o bacteria.
Tal como se describe adicionalmente en el presente documento, se descubrió un marco de lectura abierto (ORF) que codifica TIC5290 (SEQ ID NO:1) en a Dn obtenido de cepa EG6657 de Bacillus thuringiensis. La secuencia codificante se clonó u se expresó en células hospedadoras microbianas para producir proteína (SEQ ID NO:2) utilizada en bioensayos. La toxina más cercana homóloga a TIC5290 es la proteína Vip4Aa con una identidad de secuencia del 56,9 %, lo que indica que TIC5290 representa una subfamilia Vip4 novedosa. Los bioensayos que utilizaban proteínas derivadas de células hospedadoras microbianas de TIC5290 demostraron actividad contra la plaga gusano de la raíz del maíz occidental de coleópteros (Diabrotica virgifera virgifera, WCR); la especie cogollero del maíz de lepidópteros (Spodoptera frugiperda, FAW), gusano elotero (Helicoverpa zea, CEW), barrenador europeo del maíz (Ostrinia nubilalis), y polilla del repollo (Plutella xylostella); así como la plaga chinches de la hoja occidental de hemípteros (Lygus hesperus).
Se contempla que se pueden crear secuencias de proteínas de toxinas adicionales relacionadas con TIC5290 mediante el uso de una secuencia de aminoácidos de origen natural de TIC5290 para crear proteínas novedosas y con propiedades novedosas. La proteína de toxina TIC5290 se puede alinear con otras proteínas similares a TIC5290 para combinar diferencias en el nivel de secuencia de aminoácidos en variantes de secuencia de aminoácidos novedosas y realizando cambios adecuados a la secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica las variantes.
Además, se contempla que las variantes mejoradas de TIC5290 se pueden modificar genéticamente in planta mediante el uso de diversos procedimientos de edición de genes conocidos en la técnica. Dichas tecnologías utilizadas para la edición de genomas incluyen, entre otros, sistemas ZFN (nucleasa de dedos de zinc), meganucleasas, TALEN (nucleasas efectora tipo activador de transcripción) y CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas)/Cas (asociadas con CRISPR). Estos procedimientos de edición de genomas se pueden utilizar para alterar la secuencia codificante de proteína de toxina transformada dentro de una célula de planta en una secuencia codificante de toxina diferente. Específicamente, a través de estos procedimientos, se alteran uno o más codones dentro de la secuencia codificante de toxina para modificar genéticamente una nueva secuencia de aminoácidos de proteína. Alternativamente, se reemplaza o se elimina un fragmento dentro de la secuencia codificante, o se insertan fragmentos de ADN adicionales en la secuencia codificante, para modificar genéticamente una nueva secuencia codificante de toxina. La nueva secuencia codificante puede codificar una proteína de toxina con nuevas propiedades tales como mayor actividad o espectro contra plagas de insectos, así como proporcionar actividad contra una especie de plagas de insectos en la que se ha desarrollado resistencia contra la proteína de toxina de insecto original. La célula de planta que comprende la secuencia codificante de toxina con edición de gen se puede utilizar a través de procedimientos conocidos en la técnica para generar plantas enteras que expresan la nueva proteína de toxina.
También se contempla que los fragmentos de la proteína TIC5290 o variantes de proteína pueden ser formas truncadas, donde uno o más aminoácidos se eliminan del extremo N, extremo C, la mitad de la proteína, o combinaciones de estos, con actividad inhibidora de insectos. Estos fragmentos pueden ser variantes sintéticas o de origen natural de TIC5290 o variantes de proteína derivadas, pero retienen la actividad inhibidora de insectos de TIC5290.
Las proteínas que se asemejan a la proteína TIC5290 pueden identificarse mediante comparación entre sí, usando varios algoritmos informáticos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las identidades de secuencia de aminoácidos de proteínas relacionadas con la proteína TIC5290 pueden analizarse usando una alineación Clustal W usando los siguientes parámetros por defecto: Matriz de peso: blosum, penalización por abertura de hueco: 10,0, Penalización por extensión de hueco: 0,05, Huecos hidrofílicos: Activados, Restos hidrofílicos: GPSNDQERK, Penalizaciones por huecos específicos de restos: En (Thompson, y col. (1994) Nucleic Acids Research, 22:4673-4680). El porcentaje de identidad de aminoácidos se calcula adicionalmente mediante el producto de 100 % multiplicado por (identidades de aminoácidos/longitud de la proteína de la invención). También se encuentran disponibles otros algoritmos de alineación en la técnica, y proporcionan resultados similares a los obtenidos usando una alineación Clustal W.
Se pretende que una proteína que presenta actividad inhibidora de insectos contra especies de insectos lepidópteros, coleópteros o hemípteros se relacione con TIC5290 si la alineación de dicha proteína de consulta con TIC5290 presenta al menos entre el 85 % y aproximadamente el 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos a lo largo de la longitud de la proteína de consulta que es aproximadamente el 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos (o cualquier fracción de un porcentaje en este intervalo) entre la proteína de consulta y la objeto.
La proteína TIC5290 también se puede relacionar por la estructura primaria (motivos de aminoácidos conservados), por la longitud (aproximadamente 937 aminoácidos) y por otras características. Los análisis bioinformáticos sugieren que TIC5290 es una proteína formadora de poros, tiene un dominio PA14 Pfam (PF07691) que es probable que participe de funciones de unión a receptores de células en el intestino medio de insectos diana se detecta en los aminoácidos 16-140, seguido de un dominio Binary_toxB Pfam (PF03495) en los aminoácidos 186-593 que deben contribuir a la formación de un poro transmembrana de barril beta. Es probable que ambos Pfam contribuyan en la actividad insecticida de la proteína. Las características de la toxina de proteína TIC5290 se indican en la tabla 1.
Figure imgf000009_0001
Tal como se describe adicionalmente en los ejemplos de la presente solicitud, se diseñaron secuencias de molécula de ácido nucleico recombinante que codifican TIC5290 para su uso en plantas. Una secuencia de molécula de ácido nucleico recombinante optimizada por planta ejemplar que se diseñó para su uso en plantas que codifica la proteína TIC5290 se establece en SEQ ID NO:3.
Los vectores y casetes de expresión que contienen estas secuencias de moléculas de ácido nucleico sintéticas se pueden construir e introducir en maíz, soja, algodón u otras células de plantas de acuerdo con procedimientos y técnicas de transformación conocidos en la técnica. Por ejemplo, la transformación mediada por Agrobacterium se describe en las publicaciones de solicitud de patente estadounidense 2009/0138985A1 (soja), 2008/0280361A1 (soja), 2009/0142837A1 (maíz), 2008/0282432 (algodón), 2008/0256667 (algodón), 2003/0110531 (trigo), 2001/0042257 A1 (remolacha azucarera), patente estadounidense n.° 5.750.871 (canola), 7.026.528 (trigo), y 6.365.807 (arroz), y en Arencibia y col. (1998) Transgenic Res. 7:213-222 (caña de azúcar). Las células transformadas pueden ser regeneradas en plantas transformadas que expresan TIC5290 y demuestran actividad pesticida a través de bioensayos realizados en presencia de larvas de plagas de lepidópteros o hemípteros que utilizan discos de hoja de planta obtenidos de plantas transformadas. Para analizar la actividad pesticida contra plagas de coleópteros, se utilizan plantas transformadas de generación Ro y F1 en ensayo de gusano de raíz como se describe en el ejemplo más adelante.
Como una alternativa a los procedimientos de transformación tradicionales, una secuencia de ADN, por ejemplo, un transgén, casetes de expresión, etc., se puede insertar o integrar en un sitio o locus específico dentro del genoma de una planta o célula de una planta mediante integración dirigida al sitio. Las moléculas y construcciones de ADN recombinante de la presente descripción, por ende, pueden incluir una secuencia de plantilla donante que comprende al menos un transgén, casete de expresión u otra secuencia de ADN para la inserción en el genoma de la planta o célula de planta. Dicha plantilla donante para integración dirigida al sitio además puede incluir uno o dos brazos de homología que flanquean una secuencia de inserción (es decir, la secuencia, transgén, casete, etc., que se inserta en el genoma de la planta). Las construcciones de ADN recombinante de la presente descripción además pueden comprender casetes de expresión que codifican una nucleasa específica del sitio y/o cualquier proteína asociada para llevar a cabo integración dirigida al sitio. Estos casetes de expresión de nucleasa pueden estar presentes en la misma molécula o vector que la plantilla donante (en cis) o en una molécula o vector separado (en trans). En la técnica se conocen diversos procedimientos para integración dirigida al sitio que implican diferentes proteínas (o complejos de proteínas y/o ARN guía) que cortan el ADN genómico para producir una interrupción de cadena doble (DSB) o nick en un sitio o locus genómico deseado. Tal como se entiende en la técnica, durante el proceso de reparación del DSB o nick introducido por la enzima de nucleasa, el ADN de plantilla donante puede integrarse al genoma en el sitio del DSB o nick. La presencia de los brazos de homología en la plantilla donante puede promover la adopción y direccionamiento de la secuencia de inserción en el genoma de la planta durante el proceso de reparación a través de recombinación homóloga, aunque se puede producir un evento de inserción a través de unión de extremos no homólogos (NHEJ). Ejemplos de nucleasas específicas del sitio que se pueden utilizar incluyen nucleasas de dedos de zinc, meganucleasas modificadas genéticamente o naturales, TALE-endonucleasas y endonucleasas guiadas por ARN (p. ej., Cas9 o Cpf1). Para los procedimientos que utilizan nucleasas específicas del sitio guiadas por ARN (p. ej., Cas9 o Cpf1), las construcciones de ADN recombinante también comprenden una secuencia que codifica uno o más ARN guías para dirigir la nucleasa al sitio deseado dentro del genoma de la planta.
Se contemplan composiciones de moléculas de ácido nucleico recombinante que codifican TIC5290. Por ejemplo, la proteína TIC5290 puede expresarse con construcciones de ADN recombinante en las cuales una molécula de polinucleótido con un ORF que codifica la proteína está unida de manera operativa a elementos de expresión genética, tal como un promotor, y cualquier otro elemento regulador necesario para la expresión en el sistema para el cual está destinada la construcción. Los ejemplos no taxativos incluyen un promotor funcional vegetal unido de manera operativa a las secuencias que codifican la proteína TIC5290 insecticida para la expresión de la proteína en plantas o un promotor funcional de Bt unido de manera operativa a una secuencia que codifica una proteína TIC5290 para la expresión de la proteína en una bacteria Bt u otra especie Bacillus. Otros elementos pueden estar unidos de manera operativa a las secuencias que codifican proteínas TIC5290, inclusive, de modo no taxativo, potenciadores, intrones, líderes no traducidos, etiquetas de inmovilización de proteínas codificadas (etiqueta His), péptidos de translocación (es decir, péptidos de tránsito a plástidos, péptidos de señal), secuencias de polipéptidos para enzimas de modificación postraduccional, sitio de unión a ribosomas y sitios de direccionamiento a iARN. Las moléculas de polinucleótidos recombinantes ilustrativas que se proporcionan en el presente documento incluyen, de modo no taxativo, un promotor heterólogo unido de manera operativa a un polinucleótido tal como SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3 que codifica el polipéptido o proteína que tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO:2. Un promotor heterólogo también puede estar unido de mera operativa a secuencias sintéticas codificantes de ADN que codifican una TIC5290 dirigida a plástidos y TIC5290 no dirigida. Los codones de una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica proteínas que se desvelan en el presente documento pueden sustituirse por codones sinónimos (lo que se conoce en la técnica como sustitución silenciosa).
Una construcción de ADN recombinante que comprende una secuencia que codifican proteínas TIC5290 puede comprender adicionalmente una región de ADN que codifica uno o más agentes inhibidores de insectos que pueden configurarse para expresar o coexpresar simultáneamente con una secuencia de ADN que codifica una proteína TIC5290, una proteína diferente a la proteína TIC5290, una molécula de ARNcd inhibidora de insectos o una proteína auxiliar. Las proteínas auxiliares incluyen, de modo no taxativo, cofactores, enzimas, compañeros de unión u otros agentes que funcionan para contribuir a la eficacia de un agente inhibidor de insectos, por ejemplo, al contribuir a su expresión, al influenciar su estabilidad en plantas, optimizando energía libre para la oligomerización, aumentando su toxicidad y su espectro de actividad. Una proteína auxiliar puede facilitar la absorción de uno o más agentes inhibidores de insectos, por ejemplo, o potenciar los efectos tóxicos del agente tóxico.
Una construcción recombinante de ADN puede disponerse de forma que todas las proteínas o moléculas de ARNcd se expresen desde un promotor o cada proteína o moléculas de ARNcd esté bajo el control de promotores separados, o una combinación de estos. Las proteínas de la presente invención pueden expresarse desde un sistema de expresión multigénico en el cual TIC5290 se expresa desde un segmento de nucleótidos común que también contiene otros promotores y marcos de lectura abiertos, dependiendo del tipo de sistema de expresión seleccionado. Por ejemplo, un sistema de expresión de múltiples genes de planta puede utilizar un único promotor para conducir la expresión de los marcos de lectura abiertos en conjunto/unidos de forma múltiple del interior de un único operón. En otro ejemplo, un sistema de expresión de múltiples de genes de la planta puede utilizar casetes de expresión no unidos por unión múltiple, donde cada uno expresa una proteína diferente u otro agente tal como una o más moléculas de ARNcd.
Las moléculas de ácido nucleico recombinantes o construcciones de ADN recombinante que comprenden secuencias codificantes de proteínas TIC5290 pueden administrarse a las células hospedadoras mediante vectores, p. ej., un plásmido, baculovirus, cromosoma sintético, virión, cósmido, fagémido, fago o vector viral. Esos vectores pueden usarse para lograr una expresión estable o transitoria de una secuencia codificante de proteína TIC5290 en una célula hospedadora, o expresión posterior del polipéptido codificado. Un polinucleótido recombinante exógeno o construcción de ADN recombinante que comprende una secuencia codificante de proteína TIC5290 y que se introduce en una célula hospedadora se denomina en el presente documento "transgén".
Se proporcionan en el presente documento bacterias transgénicas, células vegetales transgénicas, plantas transgénicas y partes de plantas transgénicas que contienen un polinucleótido recombinante que expresa una o más de las secuencias que codifican proteínas TIC5290. El término "célula bacteriana" o "bacteria" puede incluir, de modo no taxativo, una célula de Agrobacterium, una de Bacillus, una de Escherichia, una de Salmonella, una de Pseudomonas, o una de Rhizobium. La expresión "célula vegetal" o "planta" puede incluir, de modo no taxativo, una célula dicotiledónea o una célula monocotiledónea. Las plantas y células de plantas contempladas incluyen, entre otros, una planta o célula de planta de alfalfa, banana, cebada, frijol, brócoli, col, Brassica, zanahoria, mandioca, ricino, coliflor, apio, garbanzo, col chino, citrus, coco, café, maíz, trébol, algodón, cucurbitáceas, pepino, abeto de Douglas, berenjena, eucalipto, lino, ajo, uva, lúpulo, puerro, lechuga, pino taeda, mijo, melones, nuez, avena, oliva, cebolla, ornamental, palma, pasto de pastura, arveja, maní, pimiento, gandul, pino, papa, álamo, calabaza, pino insigne, rábano, semilla de colza, arroz, rizoma, centeno, cártamo, arbusto, sorgo, pino del sur, soja, espinaca, calabaza, frutilla, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, maíz dulce, liquidámbar, boniato, pasto varilla, té, tabaco, tomate, triticale, césped, sandía, y trigo. En determinadas realizaciones, se proporcionan plantas transgénicas y partes de plantas transgénicas regeneradas de una célula de planta transgénica. En determinadas realizaciones, las plantas transgénicas se pueden obtener de una semilla transgénica cortando, quebrando, moliendo o separando de otro modo la parte de la planta. En determinadas realizaciones, la parte de planta puede ser una semilla, una cápsula, una hoja, una flor, un tallo, una raíz, o cualquier parte de estos, o una parte no regenerable de una parte de planta transgénica. Tal como se utiliza en este contexto, una parte "no regenerable" de parte de una planta transgénica es una parte que no se puede inducir para formar una planta entera o que no se puede inducir para formar una planta entera que sea capaz de reproducción sexual y/o asexual. En determinadas realizaciones, una parte no regenerable de una parte de planta es una parte de una semilla, cápsula, hoja, flor, tallo o raíz transgénica.
Se proporcionan procedimientos para confeccionar plantas transgénicas que comprenden cantidades inhibidoras de insectos, coleópteros, lepidópteros o hemípteros de una proteína TIC5290. Esas plantas se pueden realizar mediante la introducción de un polinucleótido recombinante que codifica la proteína TIC5290 proporcionada en la presente solicitud en una célula de planta, y la selección de una planta derivada de dicha célula de planta que expresa una cantidad inhibidora de insectos, coleópteros, lepidópteros o hemípteros de la proteína TIC5290. Las plantas pueden derivarse de células vegetales mediante técnicas de transformación de semillas, polen o meristemo. Se conocen en la técnica procedimientos para transformar plantas.
En el presente documento también se desvelan productos vegetales procesados, donde el producto procesado comprende una cantidad detectable de una proteína TIC5290, un segmento inhibidor de insectos o fragmento de este, o cualquier parte distinguible de este. En determinadas realizaciones, el producto procesado se selecciona del grupo que consiste en partes de plantas, biomasa vegetal, aceite, alimento, azúcar, pienso, harina, copos, salvado, hebras, vainas, semillas y semillas procesadas. En determinadas realizaciones, el producto procesado no es regenerable. El producto vegetal puede comprender materias primas u otros productos comerciales derivados de una planta transgénica o parte de planta transgénica, donde las materias primas u otros productos pueden rastrearse a través del comercio mediante la detección de segmentos de nucleótidos, ARN expresado o proteínas que codifican o comprenden partes distinguibles de una proteína TIC5290.
Las plantas que expresan la proteína TIC5290 pueden cruzarse mediante la reproducción con eventos transgénicos que expresan otras proteínas de toxina y/o que expresan otros rasgos transgénicos, tales como genes de tolerancia a herbicidas, genes que confieren rasgos de tolerancia al estrés o resistencia y similares, o dichos rasgos pueden combinarse en un único vector, de forma que se unan estos rasgos.
Tal como se describe adicionalmente en los ejemplos, las secuencias artificiales o sintéticas que codifican TIC5290 que se diseñaron para su uso en plantas se establecen en SEQ ID NO:3.
Para la expresión en células vegetales, la proteína TIC5290 puede expresarse para residir en el citosol o dirigirse a varios orgánulos de la célula vegetal. Por ejemplo, dirigir una proteína hacia el cloroplasto puede dar como resultado un aumento en los niveles de proteína expresada en una planta transgénica, a la vez que previene la aparición de elementos fuera del fenotipo. El direccionamiento también puede dar como resultado la eficacia de resistencia a las plagas en el evento transgénico. Un péptido objetivo o péptido de tránsito es una cadena peptídica corta (3-70 aminoácidos de longitud) que dirige el transporte de una proteína hacia una región específica en la célula, inclusive el núcleo, mitocondria, retículo endoplásmico (RE), cloroplasto, apoplasto, peroxisoma y membrana plasmática. Algunos péptidos objetivo se escinden de la proteína mediante peptidasas de señal luego de que las proteínas son transportadas. Para dirigirse hacia el cloroplasto, las proteínas contienen péptidos de tránsito que tienen alrededor de 40-50 aminoácidos. Por descripciones del uso de péptidos de tránsito a cloroplastos, véanse las patentes estadounidenses N.° 5.188.642 y 5.728.925. Muchas de las proteínas localizadas en cloroplastos se expresan a partir de genes nucleares como precursores y se dirigen al cloroplasto mediante un péptido de tránsito a cloroplastos (CTP, por sus siglas en inglés). Los ejemplos de dichas proteínas de cloroplastos aislados incluyen, de modo no taxativo, las asociadas con la subunidad pequeña (SSU) de ribulosa-1,5,-bisfosfato carboxilasa, ferredoxina, ferredoxina oxidoreductasa, la proteína I y proteína II del complejo captador de luz, tioredoxina F, enolpiruvil shikimato fosfato sintasa (EPSPS), y los péptidos de tránsito descritos en la patente estadounidense n.° 7.193.133. Se ha demostrado in vivo e in vitro que las proteínas que no son cloroplastos pueden dirigirse al cloroplasto mediante el uso de fusiones de proteínas con un CTP heterólogo, y que el CTP es suficiente para dirigir una proteína hacia el cloroplasto. Se ha observado que la incorporación de un péptido de tránsito a cloroplastos adecuado, tal como Arabidopsis thaliana EPSPS CTP (CTP2) (véase, Klee y col., Mol. Gen. Genet. 210:437-442, 1987) o Petunia hybrida EPSPS CTP (CTP4) (véase, della-Cioppa y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6873-6877, 1986) dirige secuencias de proteína de EPSPS heteróloga a cloroplastos en plantas transgénicas (véanse las patentes estadounidenses N.° 5.627.061; 5.633.435; y 5.312.910; y EP 0218571; EP 189707; EP 508909; y EP 924299). Para dirigir la proteína TIC5290 hacia el cloroplasto, una secuencia que codifica un péptido de tránsito a cloroplastos se coloca en la posición 5', unido de manera operativa y en el marco de una secuencia codificante sintética que codifica la proteína de toxina TIC5290 que se diseñó para su expresión óptima en células vegetales.
Los vectores y casetes de expresión que contienen estas secuencias de nucleótidos artificiales o sintéticas se pueden construir e introducir en células vegetales de maíz, algodón y soja, de acuerdo con procedimientos y técnicas de transformación que son conocidas en la técnica. Las células transformadas se regeneran en plantas transformadas, que se observa que expresan TIC5290. Para analizar la actividad pesticida, se realizan bioensayos en presencia de plagas de lepidópteros, coleópteros y hemípteros.
Las secuencias codificantes de la proteína TIC5290 y las secuencias que tienen un porcentaje sustancial de identidad con la proteína TIC5290 pueden identificarse mediante el uso de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, tales como reacción en cadena de la polimerasa (PCR), hibridación y amplificación térmica. Por ejemplo, la proteína TIC5290 puede utilizarse para producir anticuerpos que se unen específicamente a proteínas relacionadas, y pueden utilizarse para buscar y hallar otros miembros de proteína que se relacionen de forma estrecha.
Adicionalmente, las secuencias de nucleótidos que codifican la proteína de toxina TIC5290 pueden utilizarse como sondas y cebadores para buscar e identificar otros miembros de la clase mediante el uso de procedimientos de hibridación y amplificación isotérmica o de ciclo térmico. Por ejemplo, los oligonucleótidos derivados de la secuencia tal como se expone en la SEQ ID NO:3 pueden utilizarse para determinar la presencia o ausencia de un transgén TIC5290 en una muestra de ácido desoxirribonucleico derivada de un producto de materia prima. Dada la sensibilidad de determinados procedimientos de detección de ácido nucleico que emplean oligonucleótidos, se anticipa que los oligonucleótidos derivados la secuencia tal como se establece como SEQ ID NO:3 se pueden utilizar para detectar un transgén TIC5290 en productos de materia prima derivados de fuentes acumuladas donde solamente una parte del producto de materia prima se deriva de una planta transgénica que contiene SEQ ID NO:3. Además, se reconoce que dichos oligonucleótidos se pueden utilizar para introducir variación de secuencia de nucleótidos en SEQ ID NO:3. Dichos oligonucleótidos de "mutagénesis" son útiles para la identificación de las variantes de secuencia de aminoácidos TIC5290 que exhiben un intervalo de actividad inhibidora o expresión variada de insectos en células hospedadoras de plantas transgénicas.
Los homólogos de secuencias de nucleótidos, p. ej., proteínas insecticidas codificadas por secuencias de nucleótidos que se hibridan con cada una o cualquiera de las secuencias desveladas en la presente solicitud en condiciones de hibridación, también de desvelan en el presente documento. Además, se desvela un procedimiento para detectar una primera secuencia de nucleótidos que se hibrida con una segunda secuencia de nucleótidos, en el que la primera secuencia de nucleótidos (o su secuencia de complemento inversa) codifica una proteína pesticida o fragmento pesticida de la misma y se hibrida en condiciones de hibridación estrictas con la segunda secuencia de nucleótidos, en el que la segunda secuencia de nucleótidos puede ser la secuencia de nucleótidos presentada como SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3. Las secuencias que codifican nucleótidos se hibridan entre sí en condiciones de hibridación apropiadas y las proteínas codificadas por estas secuencias de nucleótidos reaccionan de forma cruzada con antisuero dirigido contra cualquiera de las demás proteínas. Las condiciones de hibridación estrictas, tal como se definen en el presente documento, comprenden al menos la hibridación a 42 °C seguida por dos lavados de cinco minutos cada uno a temperatura ambiente con 2X SSC, SDS al 0,1 %, seguidos por dos lavados de treinta minutos cada uno a 65 °C en 0,5x SSC, SDS al 0,1 %. Los lavados a temperaturas aun mayores constituyen condiciones incluso más exigentes, por ejemplo, las condiciones de hibridación de 68° C, seguido de lavado a 68 °C, en 2xSSC que contiene SDS al 0,1 %.
El experto en la técnica reconocerá que, debido a la redundancia del código genético, muchas otras secuencias son capaces de codificar proteínas relacionadas con TIC5290 y esas secuencias, en la medida en que funcionan para expresar proteínas pesticidas en cepas Bacillus o en células vegetales, son realizaciones de la presente invención, reconociendo desde luego que muchas de esas secuencias codificantes redundantes no se hibridarán en estas condiciones con las secuencias Bacillus naturales que codifican TIC5290. La presente solicitud contempla el uso de estos y otros procedimientos de identificación conocidos por los expertos en la técnica para identificar secuencias que codifican proteínas TIC5290 y secuencias con un porcentaje de identidad sustancial con respecto a las secuencias que codifican proteínas TIC5290.
También se desvelan en esta solicitud procedimientos para controlar insectos, en particular plagas particulares de lepidópteros, coleópteros o hemípteros de plantas de cultivo, con la proteína TIC5290. Dichos procedimientos pueden comprender cultivar una planta que comprende una cantidad inhibidora de insectos, coleópteros, lepidópteros o hemípteros de una proteína de la proteína de toxina TIC5290. En determinadas realizaciones, esos procedimientos pueden comprender además uno o más cualesquiera de: (i) aplicar cualquier composición que comprende o codifica una proteína de toxina TIC5290 a una planta o semilla que da paso a una planta; y (ii) transformar una planta o una célula vegetal que da paso a una planta con un polinucleótido que codifica una proteína de toxina TIC5290. En general, se contempla que la proteína de toxina TIC5290 puede proporcionarse en una composición, en un microorganismo o en una planta transgénica, para conferir una actividad inhibidora de insectos contra insectos lepidópteros, coleópteros o hemípteros.
En determinadas realizaciones, una molécula de ácido nucleico recombinante de la proteína de toxina TIC5290 es el principio activo como insecticida de una composición inhibidora de insectos preparada mediante el cultivo de Bacillus recombinante o cualquier otra célula bacteriana recombinante transformada para expresar una proteína de toxina TIC5290 en condiciones adecuadas para expresar la proteína de toxina TIC5290. Dicha composición puede prepararse por disecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación, o concentración de un cultivo de dichas células recombinantes que expresan/producen dicho polipéptido recombinante. Dicho procedimiento puede producir un Bacillus u otro extracto de célula bacteriana entomopatógena, suspensión celular, homogenato celular, lisado celular, sobrenadante celular, filtrado celular o sedimento celular. Al obtener los polipéptidos recombinantes así producidos, una composición que incluye los polipéptidos recombinantes puede incluir células bacterianas, esporas bacterianas y cuerpos de inclusión parasporales y se pueden formular para varios usos, incluso como productos en espray inhibidores de insectos agrícolas o como formulaciones inhibidoras de insectos en bioensayos dietarios.
Para reducir la posibilidad de desarrollo de resistencia, una composición inhibidora de insectos que comprende TIC5290 además puede comprender al menos un polipéptido adicional que presenta actividad inhibidora de insectos contra la misma especie de insectos lepidópteros, coleópteros o hemípteros pero que es diferente de la proteína de toxina TIC5290. Algunos polipéptidos adicionales posibles para dicha composición incluyen una proteína inhibidora de insectos y una molécula de ARNbc inhibidora de insectos. Un ejemplo para el uso de dichas secuencias de ribonucleótidos para controlar plagas de insectos se describe en Baum, y col. (publicación de patente estadounidense 2006/0021087 A1). Dichos polipéptidos adicionales para el control de pestes lepidópteras pueden seleccionarse del grupo que consiste en una proteína inhibidora de insectos, tal como, de modo no taxativo, Cry1A (patente estadounidense N.° 5.880.275), Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1Ae, CrylB (solicitud de patente estadounidense N.° 10/525.318), CrylC (patente estadounidense N.° 6.033.874), Cry1D, CrylDa y variantes de estas, quimeras Cry1E, Cry1F y Cry1A/F (patentes estadounidenses N.° 7.070.982; 6.962.705; y 6.713.063), quimeras tipo Cry1G, Cry1H, Cry1l, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry1 tales como, entre otros, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869 y TlC1100 (publicación de solicitud internacional WO2016/061391 (A2)), TIC2160 (publicación de solicitud internacional WO2016/061392(A2)), Cry2A, Cry2Ab (patente estadounidense N.° 7.064.249), Cry2Ae, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET66, TIC400, TIC800, TIC834, TIC1415, Vip3A, VIP3Ab, VIP3B, AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035 y AXMI-045 (publicación de patente estadounidense 2013­ 0117884 A1), AXMI-52, AXMI-58, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100 (publicación de patente estadounidense 2013-0310543 A1), AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005 (publicación de patente estadounidense 2013-0104259 A1), AXMI-134 (publicación de patente estadounidense 2013-0167264 A1), AXMI-150 (publicación de patente estadounidense 2010-0160231 A1), AXMI-184 (publicación de patente estadounidense 2010-0004176 A1), AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, axmi209 (publicación de patente estadounidense 2011­ 0030096 A1), AXMI-218, AXMI-220 (publicación de patente estadounidense 2014-0245491 A1), AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z, AXMI-225z (publicación de patente estadounidense 2014-0196175 A1), AXMI-238 (publicación de patente estadounidense 2014-0033363 A1), AXMI-270 (publicación de patente estadounidense 2014-0223598 A1), AXMI-345 (publicación de patente estadounidense 2014-0373195 A1), AXMI-335 (publicación de solicitud internacional WO2013/134523(A2)), DIG-3 (publicación de patente estadounidense 2013-0219570 A1), DIG-5 (publicación de patente estadounidense 2010-0317569 A1), DIG-11 (publicación de patente estadounidense 2010-0319093 A1), AfIP-1A y derivados de estos (publicación de patente estadounidense 2014-0033361 A1), AfIP-1B y derivados de estos (publicación de patente estadounidense 2014-0033361 A1), PIP-1APIP-1B (publicación de patente estadounidense 2014-0007292 A1), PSEEN3174 (publicación de patente estadounidense 2014-0007292 A1), AECFG-592740 (publicación de patente estadounidense 2014-0007292 A1), Pput_1063 (publicación de patente estadounidense 2014-0007292 A1), DIG-657 (publicación de solicitud internacional WO2015/195594(A2)), Pput_1064 (publicación de patente estadounidense 2014-0007292 A1), GS-135 y derivados de estos (publicación de patente estadounidense 2012-0233726 A1), GS153 y derivados de estos (publicación de patente estadounidense 2012-0192310 A1), GS154 y derivados de estos (publicación de patente estadounidense 2012-0192310 A1), GS155 y derivados de estos (publicación de patente estadounidense 2012-0192310 A1), SEQ ID NO:2 y derivados de esta como se describe en la publicación de patente estadounidense 2012-0167259 A1, SEQ ID NO:2 y derivados de esta como se describe en la publicación de patente estadounidense 2012-0047606 A1, SEQ ID NO:2 y derivados de esta como se describe en la publicación de patente estadounidense 2011-0154536 A1, SEQ ID NO:2 y derivados de esta como se describe en la publicación de patente estadounidense 2011-0112013 A1, SEQ ID NO:2 y 4 y derivados de estas como se describe en la publicación de patente estadounidense 2010-0192256 A1, SEQ ID NO:2 y derivados de estas como se describe en la publicación de patente estadounidense 2010-0077507 A1, SEQ ID NO:2 y derivados de estas como se describe en la publicación de patente estadounidense 2010-0077508 A1, SEQ ID NO:2 y derivados de estas como se describe en la publicación de patente estadounidense 2009-0313721 A1, SEQ ID NO:2 o 4 y derivados de estas como se describe en la publicación de patente estadounidense 2010-0269221 A1, SEQ ID n O:2 y derivados de estas como se describe en la patente estadounidense N.° 7.772.465 (B2), CF161_0085 y derivados de estas como se describe en WO2014/008054 A2, proteínas tóxicas de lepidópteros y sus derivados como se describe en las publicaciones de patente estadounidense US2008-0172762 A1, US2011-0055968 A1, y US2012-0117690 A1; SEQ ID NO:2 y derivados de esta como se describe en US7510878(B2), SEQ ID NO:2 y derivados de esta como se describe en la patente estadounidense N.° 7812129(B1); y similares.
Dichos agentes tóxicos adicionales para el control de plagas de coleópteros pueden seleccionarse del grupo que consiste en una proteína inhibidora de insectos, tal como, de modo no taxativo, Cry3Bb (patente estadounidense n.° 6,501,009), variantes de CrylC, variantes de Cry3A, Cry3, Cry3B, Cry34/35, 5307, AXMI134 (publicación de patente estadounidense 2013-0167264 A1) AXMI-184 (publicación de patente estadounidense 2010-0004176 A1), AXMI-205 (publicación de patente estadounidense 2014-0298538 A1), axmi207 (publicación de patente estadounidense 2013­ 0303440 A1), AXMI-218, AXMI-220 (publicación de patente estadounidense 20140245491A1), AXMI-221z, AXMI-223z (publicación de patente estadounidense 2014-0196175 A1), AXMI-279 (publicación de patente estadounidense 2014-0223599 A1), AXMI-R1 y variantes de este (publicación de patente estadounidense 2010-0197592 A1, TIC407, TIC417, TIC431, TIC807, TIC853, TIC901, TIC1201, TIC3131, DIG-10 (publicación de patente estadounidense 2010-0319092 A1), eHIPs (publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2010/0017914), IP3 y variantes de este (publicación de patente estadounidense 2012-0210462 A1) y w-Hexatoxin-Hv1a (publicación de solicitud de patente estadounidense US2014-0366227 A1).
Dichos polipéptidos adicionales para el control de plagas de hemípteros pueden seleccionarse del grupo que consiste en proteínas activas de hemípteros tales como, de modo no taxativo, TIC1415 (publicación de patente estadounidense 2013-0097735 A1), TIC807 (patente estadounidense n.° 8609936), TIC834 (publicación de patente estadounidense 2013-0269060 A1), AXMI-036 (publicación de patente estadounidense 2010-0137216 A1) y AXMI-171 (publicación de patente estadounidense 2013-0055469 A1). Otros polipéptidos para el control de plagas de insectos coleópteros, lepidópteros y hemípteros pueden encontrarse en el sitio web de nomenclatura de toxinas de Bacillus thuringiensis mantenido por Neil Crickmore (en la web, en btnomenclature.info).
En otras realizaciones, dicha composición/formulación puede comprender adicionalmente al menos un polipéptido adicional que exhibe la actividad inhibidora de insectos que no se inhibe por una proteína de otra forma inhibidora de insectos de la presente invención para expandir el espectro de la inhibición de insectos obtenida.
La posibilidad de que los insectos desarrollen resistencia a determinados insecticidas se ha documentado en la técnica. Una estrategia de manejo de resistencia a insectos es emplear cultivos transgénicos que expresan dos agentes inhibidores de insecto diferentes que operan a través de diferentes modos de acción. Por lo tanto, cualesquiera insectos con resistencia a uno de los agentes inhibidores de insectos pueden ser controlados por el otro agente inhibidor de insectos. Otra estrategia de manejo de resistencia a insectos emplea el uso de plantas que no están protegidas contra la especie de plaga de coleópteros, lepidópteros o hemípteros diana para proporcionar un refugio para dichas plantas desprotegidas. Un ejemplo específico se describe en la patente estadounidense N.° 6.551.962.
Otras realizaciones tales como las sustancias químicas pesticidas aplicadas tópicamente que se diseñan para controlar plagas que también se controlan mediante las proteínas desveladas en el presente documento que se utilizan con las proteínas en tratamientos de semillas, formulaciones de rociado, goteo, limpieza que se pueden aplicar directamente al suelo (suelo empapado), se pueden aplicar a plantas en crecimiento que expresan las proteínas desveladas en el presente documento, o se pueden formular a semillas que contienen uno o más transgenes que codifican una o más proteínas desveladas. Dichas formulaciones para su uso en tratamientos de semillas se pueden aplicar con varios adhesivos y adherentes conocidos en la técnica. Dichas formulaciones pueden contener pesticidas que son sinérgicos en modo de acción con las proteínas desveladas, de modo que los pesticidas de la formulación actúan a través de un modo de acción diferente para controlar las mismas plagas o plagas similares que se pueden controlar mediante las proteínas desveladas, o que dichos pesticidas actúan para controlar las plagas dentro de un rango de hospedadores más amplio o especies de plagas de plantas que no se controlan de manera eficaz mediante las proteínas pesticidas TIC5290.
La composición/formulación mencionada anteriormente puede comprender un portador aceptable desde el punto de vista agrícola, por ejemplo un cebo, un polvo, arena, sedimento, gránulo, aerosol, emulsión, una suspensión coloide, una solución acuosa, una preparación de esporas/cristal de Bacillus, un tratamiento de semillas, una célula de planta/tejido de planta/semilla/planta recombinante transformada para expresar una o más de las proteínas de cristal, o bacteria transformada para expresar una o más de las proteínas. Dependiendo del nivel de inhibición insecticida o de insectos inherente en el polipéptido recombinante y el nivel de formulación que se aplica a una planta o ensayo de dieta, la composición/formulación puede incluir diversas cantidades en peso del polipéptido recombinante, p. ej., entre el 0,0001 % y el 0,001 %, el 0,01, el 1 %, el 99 % en peso de la molécula de polipéptido recombinante.
Ejemplos
En virtud de lo anterior, los expertos en la técnica apreciarán que pueden realizarse muchos cambios a los aspectos específicos desvelados y aun así obtener un resultado parecido o similar.
Ejemplo 1
Descubrimiento de TIC5290
Este ejemplo describe el descubrimiento de la proteína pesticida TIC5290.
Una secuencia que codifica una proteína pesticida de Bacillus thuringiensis (Bt) novedosa se identificó, se clonó, y la secuencia se confirmó y se evaluó en bioensayo de insectos. La proteína pesticida, TIC5290, presentada en la presenta como SEQ ID NO:1 (secuencia codificante Bt) y 2 (proteína), se aisló de cepa EG6657 de Bt. TIC5290 es una proteína de 937 aminoácidos de largo y se identificó en función de la homología a toxinas de proteínas insecticidas conocidas y a través del uso de análisis de Pfam para agruparla con familias de proteínas insecticidas conocidas. El análisis bioinformático sugiere que TIC5290 es una proteína que forma poros. Es probable que un dominio PA14 Pfam (PF07691) en los restos de aminoácidos entre 16 y 140 participe en funciones de unión. Este dominio está seguido por un dominio Binary_toxB Pfam (PF03495) en los aminoácidos entre 186 y 593 que deben contribuir en la formación de un poro transmembrana de barril beta. La toxina Bt más cercana homóloga a TIC5209 es la proteína Vip4Aa con una identidad de secuencia del 56,9 %, lo que sugiere que TIC5290 representa una subfamilia Vip4 novedosa.
Se designaron cebadores PCR para amplificar una copia de longitud completa de la región codificante para TIC5290 de ADN genómico total de la cepa EG6657. El amplicón PCR también incluyó los codones de inicio y detención de la secuencia codificante.
El amplicón TIC5290 se clonó utilizando procedimientos conocidos en la técnica en un vector de expresión de plásmido Bt en enlace operable con un promotor de expresión Bt que se encuentra en encendido durante la esporulación del bacilo. Además, el amplicón se clonó en un vector utilizado para la expresión de proteínas en un sistema de expresión de Escherichia coli (E. coli). Se observó que las cepas recombinantes resultantes expresan proteína recombinante.
Ejemplo 2
TIC5290 demuestra actividad de coleópteros, lepidópteros y hemípteros en bioensayo de insectos
Este ejemplo ilustra la actividad inhibidora presentada por proteínas TIC5290 contra diversas especies de coleópteros, lepidópteros y hemípteros.
La proteína pesticida novedosa TIC5290 se expresó en Bt y E. coli y se evaluó para detectar la toxicidad a diversas especies de coleópteros, lepidópteros, hemípteros y dípteros. Las preparaciones de cada toxina de Bt y E. coli se evaluaron contra las especies Leptinotarsa decemlineata (escarabajo de patata de Colorado, CPB) y Diabrotica virgifera virgifera (gusano de la raíz del maíz occidental, WCR) de coleópteros. Las preparaciones de toxina también se evaluaron contra las especies gusano elotero (CEW, Helicoverpa zea), barrenador europeo del maíz (ECB, Ostrinia nubilalis), cogollero del maíz (FAW, Spodoptera frugiperda), falso medidor (SBL, Chrysodeixis includens), barrenador de maíz del suroeste (SWC, Diatraea grandiosella), oruga del tabaco (TBW, Heliothis virescens) y polilla del repollo (DBM, (lutella xylostella) de lepidópteros. Las preparaciones de toxina también se evaluaron contra las especies chinches de la hoja (TPB, Lygus lineolaris) y chinches de la hoja occidental (WTP, Lygus hesperus) de hemípteros; así como la especie de dípteros, mosquito de la fiebre amarilla (YFM, Aedes aegypti). El gusano elotero (CEW, Helicoverpa zea) también se denomina gusano de vaina de soja (SPW) y gusano de cuenco de algodón (CBW).
El ensayo de proteínas expresó en cada uno de los vectores requeridos diferentes preparaciones agregadas a una dieta de insectos. Para los vectores que utilizan el promotor activo durante la esporulación, se cosechó una mezcla de cristal/espora después de tres días de crecimiento en cultivo y se utilizó en una dieta de insectos (generalmente aplicada a dietas artificiales de insectos y proporcionadas por separado a diversos insectos). Las preparaciones de proteína derivadas de la expresión en E. coli se purificaron y también se proporcionaron en una dieta de insectos. TIC5290 demostró actividad contra WCR, CEW, ECB, FAW, DBM y WTP, como se muestra en la tabla 2 a continuación en la que "+" indica actividad.
Tabla 2. Actividad de bioensayo de TIC5290 contra plagas de insectos coleópteros, lepidópteros, hemípteros y dípteros.
Figure imgf000016_0001
Ejemplo 3
diseño de secuencias codificantes sintéticas que codifican tic5290 para la expresión en células de plantas Las secuencias codificantes sintéticas o artificiales se construyeron para su uso en la expresión de TIC5290 en plantas y se clonaron en un vector de transformación de planta binario, y se usaron para transformar células de plantas. Las secuencias de ácido nucleico sintéticas se sintetizaron de acuerdo con procedimientos descritos generalmente en la patente estadounidense 5,500,365, evitando determinadas secuencias problemáticas perjudiciales, tales como secuencias de poliadenilación de plantas ricas en A/T y ATTTA, conservando al mismo tiempo la secuencia de aminoácidos de la proteína Bt natural. La secuencia codificante sintética para la proteína pesticida TIC5290 se presenta como SEQ ID NO:3 y codifica la proteína presentada como SEQ ID NO:2.
Ejemplo 4
casetes de expresión para la expresión de tic5290 en células de plantas
Se diseñó una variedad de casetes de expresión de plantas con las secuencias tal como se expone en SEQ ID NO:3. Dichos casetes de expresión son útiles para la expresión transitoria en protoplastos vegetales o la transformación se células vegetales. Los casetes de expresión típicos se diseñaron con respecto a la posible colocación de la proteína dentro de la célula de planta. Para la proteína dirigida de plástido, la proteína pesticida TIC5290 sintética que codifica la secuencia se unió operativamente en marco con una secuencia codificante de péptido señal dirigida a cloroplasto. Los vectores de transformación de plantas resultantes comprenden un primer casete de transgén para la expresión de la proteína pesticida que comprende un promotor constitutivo, enlazado operativamente 5' con un líder, enlazado operativamente 5' con un intrón (u opcionalmente sin intrón), enlazado operativamente 5' con una secuencia codificante sintética que codifica una proteína TIC5290 no dirigida y dirigida a plástido, que a su vez está enlazada operativamente 5' a 3' UTR; y un segundo casete de transgén para la selección de células vegetales transformadas usando selección de antibiótico o glifosato. Todos los elementos descritos anteriormente se dispusieron de forma contigua, a menudo con una secuencia adicional proporcionada para la construcción del casete de expresión tal como los sitios de endonucleasas de restricción o sitios de clonación libres de ligaduras.
Ejemplo 5
TIC5290 proporciona resistencia eficaz a gusano de la raíz del maíz occidental (Diabrotica virgifera virgifera) cuando se expresa en plantas de maíz transformadas de forma estable
Ese ejemplo ilustra la actividad inhibidora presentada por TIC5290 contra coleópteros tales como gusano de la raíz del maíz cuando se expresa en plantas y se proporciona como una dieta a la plaga de insectos respectiva.
Se clonaron vectores de transformación de plantas binarios que comprendían casetes de transgén diseñados para expresar proteínas pesticidas TIC5290 no dirigidas y dirigidas a plástido utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Los vectores resultantes se utilizaron para transformar de forma estable plantas de maíz. Se seleccionaron y cultivaron eventos de inserción de ADN-T simples. Se evaluó la actividad pesticida contra la plaga de coleópteros gusano de la raíz del maíz occidental (Diabrotica virgifera virgifera) alimentando en las raíces de las plantas de maíz transformadas de forma estable.
Se utilizaron plantas transformadas de forma estable R0 para evaluar la resistencia de coleópteros, así como generando progenie F1. Se seleccionaron múltiples eventos de copia simple de cada transformación de vector binario. Una parte de esos eventos que provienen de cada transformación de vector binario se utilizaron en el ensayo de coleópteros, mientras otra parte de eventos se utilizó para generar progenie F1 para evaluación adicional. Las plantas de ensayo R0 se transplantaron en macetas de ocho pulgadas. Las plantas se inocularon con huevos de gusano de la raíz del maíz occidental (Diabrotica virgifera virgifera, WCR). Los huevos se incubaron durante aproximadamente diez días antes de la inoculación para permitir que se produzca eclosión cuatro días después de la inoculación para asegurar que una cantidad suficiente de larvas sobrevive y son capaces de atacar las raíces de maíz. Las plantas transformadas se inocularon en aproximadamente la etapa V2 y V3. Las plantas se cultivaron después de la infestación durante aproximadamente veintiocho días. Las plantas se retiraron de las macetas con las raíces lavadas cuidadosamente para eliminar toda la tierra. El daño a las raíces se evaluó utilizando una escala de clasificación de daño de 1-5 como se presenta en la tabla 3 más adelante. También se realizó una comparación con el control negativo para asegurar que el ensayo se había realizado de forma adecuada. Las puntuaciones bajas de daño de raíces indican resistencia conferida por la proteína TIC5290 a la plaga de coleópteros. Se utilizaron múltiples eventos R0 para cada transformación de vector binario en el ensayo WCR. Muchos de los eventos R0 que expresaban TIC5290 no dirigida y dirigida a plástido demostraron resistencia a WCR determinada por las puntuaciones de clasificación de daño a las raíces en comparación con los controles transgénicos.
Tabla 3. Puntuaciones de clasificación de daño a las raíces Ro.
Figure imgf000017_0002
Una porción de los eventos transformados de forma estable R0 que provenían de cada transformación de vector binario se utilizaron para producir progenie F1. Las plantas transformadas de forma estable R0 se dejaron autofertilizar, produciendo progenie F1. La semilla F1 se plantó. Se identificaron plantas heterocigotas a través de procedimientos moleculares conocidos en la técnica y se utilizaron para el ensayo contra WCR, así como mediciones de expresión ELISA de proteína de toxina TIC5290. Una porción de la progenie F1 heterocigota de cada evento se utilizó para ensayo de insectos, mientras la otra porción se utilizó para medir la expresión de TIC5290. Los huevos de gusano de la raíz del maíz occidental (Diabrotica virgifera virgifera, WCR) se incubaron durante aproximadamente diez días para permitir la eclosión dentro de los cuatro días después de la inoculación. Las plantas se inocularon en aproximadamente la etapa V2 y V3. Para WCR, cada maceta se inoculó con aproximadamente dos mil huevos. Las plantas se cultivaron después de la infestación durante aproximadamente veintiocho días. Las plantas se retiraron de las macetas con las raíces lavadas cuidadosamente para eliminar toda la tierra. El daño a las raíces se evaluó utilizando una escala de clasificación de daño de 0-3 como se presenta en la tabla 4 más adelante. Se realizó una comparación con el control negativo para asegurar que el ensayo se había realizado de forma adecuada. Las puntuaciones bajas de daño de raíces indicaron resistencia conferida por la proteína TIC5290 a la plaga de coleópteros. Muchos de los eventos F1 demostraron resistencia eficaz a WCR en comparación con los controles. La figura 1 representa la clasificación de daño a las raíces promedio para varios eventos para TIC5290 cuando se expresa en plantas de maíz F1 independientemente de si la proteína está dirigida al cloroplasto.
Tabla 4. Puntuaciones de clasificación de daño a las raíces F 1 .
Figure imgf000017_0001
Ejemplo 5
Ensayo de actividad de TIC5290 contra plagas de lepidópteros cuando se expresa en plantas de maíz, soja y algodón transformadas de forma estable.
Se clonan vectores de transformación de plantas binarios que comprendían casetes de transgén diseñados para expresar proteína pesticida TIC5290 no dirigida y dirigida a plástido utilizando procedimientos conocidos en la técnica.
Maíz, soja o algodón se transforma con los vectores de transformación binarios descritos anteriormente usando un procedimiento mediado por Agrobacterium. Las células transformadas se inducen para formar plantas por procedimientos conocidos en la técnica. Los bioensayos usando discos de hoja de planta se realizaron análogos a los descritos en la patente estadounidense n.° 8,344,207. Una planta de maíz, soja o algodón no transformada se usa para obtener tejido a ser usado como control negativo. Se evalúan múltiples eventos de transformación de cada vector binario contra plagas de lepidópteros tales como, entre otros, gusano elotero (CEW, Helicoverpa zea), barrenador europeo del maíz (ECB, Ostrinia nubilalis), cogollero del maíz (FAW, Spodoptera frugiperda), falso medidor (SBL, Chrysodeixis includens), barrenador de maíz del suroeste (SWCB, Diatraea grandiosella), oruga del tabaco (TBW, Heliothis virescens) y polilla del repollo (DBM, (lutella xylostella) de lepidópteros. Se determina que estos insectos que demuestran debilitamiento y/o mortalidad en el bioensayo de insectos son susceptibles a los efectos de la toxina de insectos TIC5290.
Ejemplo 6
Ensayo de actividad contra plagas de hemípteros que utilizan plantas de algodón transformadas de forma estable que expresan TIC5290.
Se clonan vectores de transformación de plantas binarios que comprendían casetes de transgén diseñados para expresar proteínas pesticidas TIC5290 no dirigidas y dirigidas a plástido utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Los vectores resultantes se utilizan para transformar de forma estable plantas de algodón. Se evalúa la actividad pesticida contra plagas de hemípteros alimentando en las plantas de algodón transformadas de forma estable.
Los vectores binarios descritos anteriormente en el ejemplo 3 en donde se expresaba TIC5290 no dirigida y dirigida a plástido se utilizan para transformar de forma estable plantas de algodón. Se seleccionan y cultivan eventos de inserción de ADN-T simples. Las plantas transformadas de forma estable R0 se dejan autofertilizar, produciendo progenie R1.
Las semillas transgénicas R1 que comprenden casetes de expresión para TIC5290 se siembran en macetas de 10 pulgadas junto con semillas correspondientes a un control no transgénico. Las plantas se mantienen en un cámara de ambiente con un fotoperíodo de dieciséis horas de luz en treinta y dos grados Celsius y ocho horas de oscuridad a veintitrés grados Celsius, y una intensidad de luz entre ochocientos y novecientos microeinsteins. Entre los cuarenta y cuarenta y cinco días después de la plantación, las plantas individuales se encierran en una jaula hecha de láminas de "polinización" de plástico transpirable (Vilutis y Company Inc, Frankfort, IL). Los manguitos de láminas se aseguran al tallo principal justo debajo de la superficie del suelo utilizando un lazo Velcro®. Dos pares de adultos de Lygus lineolaris o Lygus hesparus macho o hembra sexualmente maduros (de seis días de edad) de cultivo de laboratorio se recogen en un tubo de plástico de fondo redondo de catorce mililitros (Becton Dickson Labware, Franklin Lakes, NJ) y se utilizaron para cada planta. Los adultos se liberan en cada jaula individual a través de una hendidura pequeña en el lado de la jaula y luego la jaula se asegura cerca asegurando que los insectos no se escapen. Los insectos se dejan aparear y las plantas se mantienen en la jaula durante veintiún días. Después de veintiún días, las plantas se cortan debajo de las jaulas y se mueven a un laboratorio donde los insectos se recogen de cada planta y se cuentan. Antes de abrir la jaula, las plantas se agitan vigorosamente para asegurar que todos los insectos caen de sus sitios de alimentación a la base de la jaula. La base de la jaula se abre y todo el material de planta se elimina y se coloca en una lámina negra. Los insectos se recogen utilizando una aspiradora. La planta se inspecciona completamente para recuperar cualquier insecto restante. Los números de insectos y su etapa de desarrollo se registran para cada planta. Los conteos de insectos se dividen en varios grupos en función de la madurez del Lygus; ninfas hasta 3° instar, 4° instar, 5° instar y adultos. Las plantas de algodón transgénicas que demuestran cantidades reducidas de ninfas y adultos con respecto a las plantas de control de algodón no transformadas demuestran resistencia conferida a las plagas de hemípteros a través de la expresión de la proteína de toxina TIC5290.
Todas las composiciones desveladas y reivindicadas en el presente documento pueden realizarse y llevarse a cabo sin demasiada experimentación en vista de la presente descripción. Mientras que las composiciones de la presente invención se han descrito en términos de las realizaciones ilustrativas que anteceden, será evidente para los expertos en la técnica que podrán aplicarse variaciones, cambios, modificaciones y alteraciones a la composición descrita en el presente documento, sin alejarse del concepto, espíritu y ámbito verdaderos de la invención. Más específicamente, será evidente que los agentes descritos en el presente documento pueden sustituirse con determinados agentes descritos que se están relacionados en forma química y fisiológica, logrando los mismos

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un promotor heterólogo unido operativamente con un segmento de polinucleótido que codifica una proteína pesticida o fragmento pesticida de la misma que tiene actividad inhibidora de insectos, en la que:
a. dicha proteína pesticida comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; o
b. dicha proteína pesticida comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 %, o el 90 %, o el 95 %, o el 98 %, o el 99 % o aproximadamente el 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO:2.
2. La molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1, en la que:
a. el promotor heterólogo es un promotor funcional vegetal; o
b. el promotor heterólogo es un promotor funcional de Bacillus thuringiensis; o
c. la molécula de ácido nucleico recombinante está comprendida en un vector, y dicho vector se selecciona del grupo que consiste en un plásmido, fagémido, bácmido, cósmido y un cromosoma artificial bacteriano o de levadura.
3. Una célula hospedadora que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1, en la que dicha célula hospedadora se selecciona del grupo que consiste en una célula bacteriana y una célula de planta.
4. La molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1, en la que dicho insecto se selecciona del grupo que consiste en un insecto coleóptero, un insecto lepidóptero y un insecto hemíptero.
5. Una planta o parte de la misma que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1.
6. La planta o parte de la misma de la reivindicación 5, en la que dicha planta es una planta monocotiledónea o una planta dicotiledónea.
7. Una semilla de la planta de la reivindicación 5, en la que dicha semilla comprende dicha molécula de ácido nucleico recombinante.
8. Una composición inhibidora de insectos que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1 y la proteína pesticida o el fragmento pesticida codificado por la secuencia de polinucleótido.
9. La composición inhibidora de insectos de la reivindicación 8, que comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica al menos otro agente pesticida que es diferente de dicha proteína pesticida.
10. Un producto básico producido a partir de la planta o parte de la misma de la reivindicación 5, seleccionado del grupo que consiste en maíz básico embolsado por un manipulador de granos, copos de maíz, tortas de maíz, harina de maíz, sémola de maíz, jarabe de maíz, aceite de maíz, ensilaje de maíz, almidón de maíz, cereal de maíz y similares, semilla de algodón completa o procesada, aceite de algodón, hila, semillas y partes de plantas procesadas para pienso o alimento, fibra, papel, biomasas, semilla de soja completa o procesada, aceite de soja, proteína de soja, sémola de soja, harina de soja, copos de soja, salvado de soja, leche de soja, queso de soja, vino de soja, pienso animal que comprende soja, papel que comprende soja, crema que comprende soja, biomasa de soja, en el que el producto básico comprende una cantidad detectable de dicha molécula de ácido nucleico recombinante o de una proteína pesticida codificada por ella.
11. Una semilla obtenible mediante:
a. la siembra de al menos una primera semilla de acuerdo con la reivindicación 7;
b. el cultivo de una planta a partir de la primera semilla; y
c. la cosecha de semilla de la planta, en la que dicha semilla cosechada comprende dicha molécula de ácido nucleico recombinante.
12. Una planta resistente a infestación por insectos, en la que las células de dicha planta comprenden la molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1.
13. Un procedimiento para controlar una infestación por plagas o plagas de especies de coleópteros o lepidópteros o hemípteros, comprendiendo dicho procedimiento:
a. poner en contacto la plaga con una cantidad eficaz como insecticida de una proteína pesticida como se expone en SEQ ID NO:2; o
b. poner en contacto la plaga con una cantidad eficaz como insecticida de una o más proteínas pesticidas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 %, o el 90 %, o el 95 %, o el 98 %, o el 99 %, o aproximadamente el 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO:2.
14. Un procedimiento de detección de la presencia de la molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1 en una muestra que comprende ADN genómico vegetal, que comprende:
a. poner en contacto la muestra con una sonda de ácido nucleico que se híbrida en condiciones de hibridación rigurosas con ADN genómico de una planta que comprende la molécula de ADN de la reivindicación 1, y no se hibrida en tales condiciones de hibridación con ADN genómico de una planta de otro modo isogénica que no comprende la molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1;
b. someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridación rigurosas; y
c. detectar la hibridación de la sonda con ADN de la muestra.
15. Un procedimiento de detección de la presencia de una proteína pesticida o fragmento pesticida de la misma que tiene actividad inhibidora de insectos en una muestra que comprende proteína, en la que dicha proteína pesticida comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; o dicha proteína pesticida comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 %, o el 90 %, o el 95 %, o el 98 %, o el 99 % o aproximadamente el 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO:2; que comprende:
a. poner en contacto la muestra con un anticuerpo que es específico para la proteína pesticida; y
b. detectar la presencia de la proteína.
ES16831304T 2015-07-30 2016-07-27 Proteínas inhibidoras de insectos novedosas Active ES2904255T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562199024P 2015-07-30 2015-07-30
PCT/US2016/044296 WO2017019787A1 (en) 2015-07-30 2016-07-27 Novel insect inhibitory proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2904255T3 true ES2904255T3 (es) 2022-04-04

Family

ID=57885446

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16831304T Active ES2904255T3 (es) 2015-07-30 2016-07-27 Proteínas inhibidoras de insectos novedosas

Country Status (23)

Country Link
US (2) US10100330B2 (es)
EP (1) EP3328187B1 (es)
JP (1) JP6933641B2 (es)
CN (1) CN107849571B (es)
AR (1) AR105768A1 (es)
BR (1) BR112018001379B1 (es)
CA (1) CA2992084A1 (es)
CL (1) CL2018000227A1 (es)
CO (1) CO2018000801A2 (es)
CR (1) CR20180060A (es)
EC (1) ECSP18006878A (es)
ES (1) ES2904255T3 (es)
HR (1) HRP20211858T1 (es)
HU (1) HUE057364T2 (es)
MX (1) MX378742B (es)
NI (1) NI201800013A (es)
PE (1) PE20180775A1 (es)
PY (1) PY1648650A (es)
RU (1) RU2765310C2 (es)
SV (1) SV2018005620A (es)
UA (1) UA126327C2 (es)
WO (1) WO2017019787A1 (es)
ZA (1) ZA201800227B (es)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6933641B2 (ja) * 2015-07-30 2021-09-08 モンサント テクノロジー エルエルシー 新規の昆虫阻害タンパク質
MX389580B (es) * 2016-10-10 2025-03-20 Monsanto Technology Llc Proteínas inhibidoras de insectos novedosas
EP3691453A4 (en) 2017-10-02 2021-07-07 Syngenta Participations AG MANIPULATED PESTICIDE PROTEINS AND METHODS OF CONTROLLING PLANT PESTURES
US10907173B2 (en) 2017-12-22 2021-02-02 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
CN112368296A (zh) * 2018-09-25 2021-02-12 孟山都技术公司 新型昆虫抑制性蛋白
WO2021216571A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Monsanto Technology Llc Transgenic corn event mon95275 and methods for detection and uses thereof
WO2025111199A1 (en) * 2023-11-21 2025-05-30 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5849870A (en) * 1993-03-25 1998-12-15 Novartis Finance Corporation Pesticidal proteins and strains
WO1998018932A2 (en) * 1996-10-30 1998-05-07 Mycogen Corporation Novel pesticidal toxins and nucleotide sequences which encode these toxins
US6551962B1 (en) 2000-10-06 2003-04-22 Monsanto Technology Llc Method for deploying a transgenic refuge
US7304162B2 (en) * 2003-02-21 2007-12-04 Intrexon Corporation Oxadiazoline ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
CN1849397B (zh) * 2003-07-07 2014-06-04 孟山都技术有限公司 苏云金芽孢杆菌分泌的杀虫蛋白及其应用
CN101133079A (zh) * 2003-12-16 2008-02-27 孟山都技术有限公司 来自苏云金芽孢杆菌的分泌的杀虫蛋白质和基因组合物及其用途
ES2547381T3 (es) 2004-04-09 2015-10-05 Monsanto Technology, Llc Composiciones y procedimientos de control de infestaciones de insectos en plantas
EP1920060B1 (en) * 2005-08-31 2011-04-13 Monsanto Technology LLC Insecticidal compositions and methods for making insect-resistant transgenic plants
CA2658677C (en) 2006-07-21 2014-04-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
US7510878B2 (en) 2006-07-21 2009-03-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
US7772465B2 (en) 2007-06-26 2010-08-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
US8283524B2 (en) 2008-05-15 2012-10-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
CN102076858B (zh) 2008-06-11 2013-10-30 先锋国际良种公司 具有鳞翅目活性的新的苏云金芽孢杆菌基因
US8445749B2 (en) 2008-09-19 2013-05-21 Pioneer Hi Bred International Inc Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
US20100077507A1 (en) 2008-09-22 2010-03-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel Bacillus Thuringiensis Gene with Lepidopteran Activity
EA201170961A1 (ru) 2009-01-23 2012-02-28 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Новый ген bacillus thuringiensis с активностью против lepidoptera
JP5746055B2 (ja) * 2009-02-27 2015-07-08 アテニックス・コーポレーションＡｔｈｅｎｉｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｏｎ 殺虫性タンパク質及びその使用方法
BR112012011222A2 (pt) 2009-11-12 2015-09-15 Pioneer Hi Bred Int molécula de ácido nucleico isolada, contruto de dna, célula hospedeira, planta transgênica, semente transformada, polipeptídeo isolado com atividade pesticida, composição e métodos para controlar uma população de praga de lepidópteros, para matar uma praga de lepidóptero e para proteger uma planta contra uma praga
US8586832B2 (en) 2009-12-21 2013-11-19 Pioneer Hi Bred International Inc Bacillus thuringiensis gene with Lepidopteran activity
CN103154247A (zh) 2010-08-19 2013-06-12 先锋国际良种公司 对鳞翅目昆虫具有活性的新苏云金杆菌基因
MX2013007532A (es) 2010-12-28 2013-09-16 Pioneer Hi Bred Int Nuevo gen de bacillus thuringiensis con actividad contra el orden lepidoptera.
AU2012214420B2 (en) * 2011-02-11 2017-03-02 Monsanto Technology Llc Pesticidal nucleic acids and proteins and uses thereof
WO2012139004A2 (en) * 2011-04-07 2012-10-11 Monsanto Technology Llc Insect inhibitory toxin family active against hemipteran and/or lepidopteran insects
BR112014003911A2 (pt) * 2011-08-19 2017-03-14 Synthetic Genomics Inc método integrado para a identificação de alto rendimento de novas composições pesticidas e seu uso
US9974302B2 (en) * 2013-08-09 2018-05-22 Monsanto Technology Llc Pesticidal toxin active against coleopteran and/or hemipteran insects
JP6933641B2 (ja) * 2015-07-30 2021-09-08 モンサント テクノロジー エルエルシー 新規の昆虫阻害タンパク質

Also Published As

Publication number Publication date
EP3328187A4 (en) 2019-01-09
RU2765310C2 (ru) 2022-01-28
PY1648650A (es) 2018-10-01
SV2018005620A (es) 2018-08-31
CA2992084A1 (en) 2017-02-02
CN107849571A (zh) 2018-03-27
MX2018001258A (es) 2018-04-20
JP2018525987A (ja) 2018-09-13
JP6933641B2 (ja) 2021-09-08
CL2018000227A1 (es) 2018-04-27
HRP20211858T1 (hr) 2022-03-04
MX378742B (es) 2025-03-10
NI201800013A (es) 2018-06-12
RU2018107162A3 (es) 2020-01-28
ECSP18006878A (es) 2018-04-30
EP3328187B1 (en) 2021-11-10
US20170044568A1 (en) 2017-02-16
EP3328187A1 (en) 2018-06-06
HUE057364T2 (hu) 2022-05-28
PE20180775A1 (es) 2018-05-07
BR112018001379A2 (pt) 2018-09-11
US10100330B2 (en) 2018-10-16
UA126327C2 (uk) 2022-09-21
CO2018000801A2 (es) 2018-04-10
ZA201800227B (en) 2018-12-19
BR112018001379B1 (pt) 2024-04-30
CN107849571B (zh) 2022-04-19
US20180346925A1 (en) 2018-12-06
AR105768A1 (es) 2017-11-08
CR20180060A (es) 2018-07-09
WO2017019787A1 (en) 2017-02-02
RU2018107162A (ru) 2019-08-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2864657T3 (es) Nuevas proteínas insecticidas quiméricas tóxicas para plagas de lepidópteros o inhibidoras de las mismas
ES2892627T3 (es) Proteínas inhibidoras de insectos novedosas
RU2765310C2 (ru) Новые белки, проявляющие ингибирующую активность по отношению к насекомым
US12123011B2 (en) Insect inhibitory proteins
US11987800B2 (en) Insect inhibitory proteins
CN110678067B (zh) 新型昆虫抑制蛋白
US10036037B2 (en) Insect inhibitory proteins
US20250002931A1 (en) Insect inhibitory proteins
CN117616117A (zh) 新型昆虫抑制蛋白
BR122025023258A2 (pt) Molécula de ácido nucleico recombinante, plantas ou parte das mesmas e seu uso, semente de planta, seu método de produção e seu uso, composição inibidora de inseto, produto de commodity e seu uso, bem como métodos para controlar uma infestação por pragas ou por insetos de espécies de coleópteros ou lepidópteros ou hemípteros, para detectar a presença da molécula de ácido nucleico recombinante em uma amostra compreendendo dna genômico vegetal, e para detectar a presença de uma proteína pesticida ou fragmento da mesma em uma amostra compreendendo proteína
BR122025023257A2 (pt) Molécula de ácido nucleico recombinante, plantas ou parte das mesmas e seu uso, semente de planta, seu método de produção e seu uso, composição inibidora de inseto, produto de commodity e seu uso, bem como métodos para controlar uma infestação por pragas ou por insetos de espécies de coleópteros ou lepidópteros ou hemípteros, para detectar a presença da molécula de ácido nucleico recombinante em uma amostra compreendendo dna genômico vegetal, e para detectar a presença de uma proteína pesticida ou fragmento da mesma em uma amostra compreendendo proteína
BR122025023260A2 (pt) Molécula de ácido nucleico recombinante, plantas ou parte das mesmas e seu uso, semente de planta, seu método de produção e seu uso, composição inibidora de inseto, produto de commodity e seu uso, bem como métodos para controlar uma infestação por pragas ou por insetos de espécies de coleópteros ou lepidópteros ou hemípteros, para detectar a presença da molécula de ácido nucleico recombinante em uma amostra compreendendo dna genômico vegetal, e para detectar a presença de uma proteína pesticida ou fragmento da mesma em uma amostra compreendendo proteína
BR122023004657B1 (pt) Molécula de ácido nucleico recombinante, composição inibidora de insetos, produto primário processado, métodos para produção de células de sementes, para controlar uma infestação por pragas ou por insetos de espécies de coleópteros ou lepidópteros ou hemípteros, para detectar a presença da molécula de ácido nucleico recombinante em uma amostra compreendendo dna genômico vegetal, e para detectar a presença de uma proteína pesticida ou fragmento da mesma em uma amostra compreendendo proteína, uso de uma planta, uma parte de planta, uma semente ou produto primário, e proteína pesticida
BR112019012768B1 (pt) Molécula de ácido nucleico recombinante, composição inibitória de insetos, método para produzir sementes transgênicas, e método para controlar uma praga de espécies de coleoptera ou lepidoptera ou hemiptera, e controlar uma infestação de espécies coleoptera ou lepidoptera ou hemiptera de uma planta
BR122022003509B1 (pt) Molécula de ácido nucleico recombinante, composição inibitória de insetos, método para produzir semente transgênica, e método para controlar uma praga de espécies de coleoptera ou lepidoptera ou hemiptera, e controlar uma infestação de espécies coleoptera ou lepidoptera ou hemiptera de uma planta
BR122025006482B1 (pt) Molécula de ácido nucleico recombinante, composição inibidora de insetos, produto primário processado, métodos para produção de sementes, para controlar uma infestação de pragas, e para detectar a presença da molécula de ácido nucleico recombinante e de uma proteína pesticida, uso de uma planta, parte de planta, célula de planta ou semente, e proteína pesticida
BR112019019892B1 (pt) Molécula de ácido nucleico recombinante, composição inibidora de insetos, produto primário processado, métodos para produção de sementes, para controlar uma infestação de pragas e para detectar a presença da molécula de ácido nucleico recombinante ou para detectar a presença de uma proteína pesticida, uso de uma planta, parte de planta, célula de planta ou semente, bem como proteína pesticida quimérica
BR122025006475B1 (pt) Molécula de ácido nucleico recombinante, composição inibidora de insetos, produto primário processado, métodos para produção de sementes, para controlar uma infestação de pragas e para detectar a presença da molécula de ácido nucleico recombi- nante e de uma proteína pesticida, uso de uma planta, parte de planta, célula de planta ou semente e proteína pesticida