ES2904359T3 - Composiciones poliméricas liofilizadas para mezclar con plasma rico en plaquetas para formar implantes para la reparación de tejidos y/o composiciones para inyecciones terapéuticas intraarticulares - Google Patents

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Abstract

Una solución inyectable que comprende una composición polimérica liofilizada que comprende quitosano, un activador de coágulos y al menos un lioprotector reconstituido en plasma rico en plaquetas (PRP), producto sanguíneo o combinaciones de los mismos que al inyectarse: i) en el tejido se solidifica para formar un implante para la reparación de tejidos; o ii) en una articulación articular se mezcla con fluidos intraarticulares, en el que dicho quitosano tiene un número de peso molecular de 20 a 125 kDa, en el que el al menos un lioprotector se selecciona del grupo que consiste en monosacárido, poliol, disacárido, trisacárido, oligosacárido/polisacárido, excipiente de alto peso molecular, aminoácido, proteína y una combinación de los mismos; en el que el activador del coágulo se selecciona del grupo que consiste en cloruro de calcio, gluconato de calcio, acetato de calcio, carbonato de calcio, glubionato de calcio, glucepato de calcio, lactato de calcio, lactobionato de calcio, fosfato de calcio y combinaciones de los mismos; y en el que el producto sanguíneo se selecciona del grupo que consiste en PRP, PPP, PRF, suspensión de plaquetas, lisado de plaquetas y combinaciones de los mismos.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones poliméricas liofilizadas para mezclar con plasma rico en plaquetas para formar implantes para la reparación de tejidos y/o composiciones para inyecciones terapéuticas intraarticulares
CAMPO
La presente divulgación se refiere a composiciones poliméricas liofilizadas reconstituidas en plasma rico en plaquetas (PRP) o sangre para formar implantes para la reparación de tejidos y/o composiciones para inyecciones terapéuticas intraarticulares.
ANTECEDENTES
El quitosano (CS) se ha utilizado como andamio para la ingeniería de tejidos duros y blandos [Arca, H.C. y S. Senel, Chitosan Based Systems for Tissue Engineering Part 1: Hard Tissues FABAD J. Pharm. Sci., 2008a. 33: págs. 35 a 49, Arca, H.C. y S. Senel, Chitosan Based Systems for Tissue Engineering Part II: Soft Tissues. FABAD J. Pharm. Sci., 2008b. 33: págs. 211 a 216]. Se fabricaron andamios liofilizados con quitosano puro [Nettles, D.L., S.H. Elder, y J.A. Gilbert, Potential use of chitosan as a cell scaffold material for cartilage tissue engineering. Tissue engineering, 2002. 8(6): págs. 1009 a 1016, Concaro, S., et al., Effect of cell seeding concentration on the quality of tissue engineered constructs loaded with adult human articular chondrocytes. Journal of tissue engineering and regenerative medicine, 2008. 2(1): págs. 14 a 21], quitosano reticulado [Hoffmann, B., et al., Glutaraldehyde and oxidised dextran as crosslinker reagents for chitosan-based scaffolds for cartilage tissue engineering. Journal of Materials Science-Materials in Medicine, 2009. 20(7): págs. 1495 a 1503], quitosano modificado [Li, Z., et al., Preparation and evaluation of thiolated chitosan scaffolds for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2010a. 92A(3): págs. 973 a 978], y de quitosano mezclado con glicosaminoglicanos [Chen, Y.-L., et al., Composite chondroitin-6-sulfate/dermatan sulfate/chitosan scaffolds for cartilage tissue engineering. Biomaterials, 2007. 28(14): págs. 2294 a 2305], polisacáridos [Li, Z. y M. Zhang, Chitosan-alginate as scaffolding material for cartilage tissue engineering. Journal of biomedical materials research. Part A, 2005. 75(2): págs. 485 a 493], polipéptidos [Gong, Z., et al., Use of synovium-derived stromal cells and chitosan/collagen type I scaffolds for cartilage tissue engineering. Biomedical materials (Bristol, Inglaterra), 2010. 5(5): pág. 055005] o polímeros sintéticos [Martel-Estrada, S.A., et al., In vitro bioactivity of chitosan/poly (D,L-lactide-co-glycolide) composites. Materials Letters, 2011. 65(1): págs. 137 a 141]. También se desarrollaron varios andamios liofilizados que combinan quitosano y cerámicas bioactivas, vidrios bioactivos o vitrocerámicas [Costa-Pinto, A.R., R.L. Reis, y N.M. Neves, Scaffolds Based Bone Tissue Engineering: The Role of Chitosan Tissue Engineering Part B-Reviews, 2011. 17(5): págs. 331 a 347]. Los andamios liofilizados compuestos por quitosano de diferente peso molecular, grado de desacetilación (DDA) y alto o bajo contenido en calcio se implantaron previamente en defectos condilares osteocondrales de conejo para la reparación del cartílago [Abarrategi, A., et al., Chitosan scaffolds for osteochondral tissue regeneration. Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2010. 95A(4): págs. 1132 a 1141].
El quitosano se liofilizó en presencia de lioprotectores para diferentes aplicaciones. Una estructura de bicapa de esponja de quitosano adherida a una película de quitosano se liofilizó en presencia de cloruro de sodio, glucosa o sacarosa para cultivar fibroblastos dérmicos neofetales humanos [Ma, J., et al., A preliminary in vitro study on the fabrication and tissue engineering applications of a novel chitosan bilayer material as a scaffold of human neofetal dermal fibroblasts. Biomaterials, 2001. 22(4): págs. 331 a 336]. Los andamios de quitosano/poli (etilenglicol)-ppirofosfato cálcico se liofilizaron en presencia de sacarosa, glucosa o fructosa [Wang, J.W. y M.H. Hon, Sugarmediated chitosan/poly(ethylene glycol)-beta-dicalcium pyrophosphate composite: mechanical and microstructural properties. Journal of biomedical materials research. Part A, 2003a. 64(2): págs. 262 a 272]. Se prepararon microesferas de quitosano liofilizadas con sacarosa, maltosa o trehalosa para la administración nasal de fármacos [Cho, H.J., et al., Evaluation of protein stability and in vitro permeation of lyophilized polysaccharides-based microparticles for intranasal protein delivery. International journal of pharmaceutics, 2011. 416(1): págs. 77 a 84]. Se liofilizaron obleas de quitosano y xerogeles a base de quitosano tiolado en presencia de glicerol y manitol como posibles sistemas de administración bucal [Ayensu, I., J.C. Mitchell y J.S. Boateng, In vitro characterisation of chitosan based xerogels for potential buccal delivery of proteins. Carbohydrate Polymers, 2012b. 89(3): págs. 935 a 941, Ayensu, I., J.C. Mitchell y J.S. Boateng, Development and physico-mechanical characterisation of lyophilised chitosan wafers as potential protein drug delivery systems via the buccal mucosa. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces, 2012a. 91: págs. 258 a 265]. El manitol se utilizó como agente de carga para las inserciones vaginales liofilizadas de quitosano/alginato [Abruzzo, A., et al., Chitosan/alginate complexes for vaginal delivery of chlorhexidine digluconate. Carbohydrate Polymers, 2013. 91(2): págs. 651 a 658].
Apósitos para heridas que contienen acetato de quitosano liofilizado (documentos US7371403, US7482503, US7897832) se distribuyen regularmente a las tropas de combate. Estos apósitos se probaron ampliamente en modelos animales preclínicos [Burkatovskaya, M., et al., Use of chitosan bandage to prevent fatal infections developing from highly contaminated wounds in mice. Biomaterials, 2006. 27(22): págs. 4157 a 4164 Gustafson, S.B., et al., Chitosan dressing provides hemostasis in swine femoral arterial injury model. Prehospital Emergency Care, 2007. 11(2): págs. 172 a 178; Sohn, V.Y., et al., Efficacy of Three Topical Hemostatic Agents Applied by Medics in a Lethal Groin Injury Model. Journal of Surgical Research, 2009. 154(2): págs. 258 a 261; Burkatovskaya, M., et al., Effect of chitosan acetate bandage on wound healing in infected and noninfected wounds in mice. Wound Repair and Regeneration, 2008. 16(3): págs. 425 a 431; Kozen, B.G., et al., An alternative hemostatic dressing: Comparison of CELOX, HemCon and QuikClot. Academic Emergency Medicine, 2008. 15(1): págs. 74 a 81; Arnaud, F., et al., Comparison of 10 hemostatic dressings in a groin puncture modelin swine. Journal of Vascular Surgery, 2009. 50(3): págs. 632 a 639; Dai, T., et al., Chitosan Acetate Bandage as a Topical Antimicrobial Dressing for Infected Burns. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2009. 53(2): págs. 393 a 400; Devlin, J.J., et al., COMPARISON OF ChitFlex (R), CELOX (TM), AND QuikClot (R) IN CONTROL OF HEMORRHAGE. Journal of Emergency Medicine, 2011. 41(3): págs. 237 a 245; Littlejohn, L.F., et al., Comparison of Celox-A, ChitoFlex, WoundStat, and Combat Gauze Hemostatic Agents Versus Standard Gauze Dressing in Control of Hemorrhage in a Swine Model of Penetrating Trauma. Academic Emergency Medicine, 2011. 18(4): págs. 340 a 350] pero los datos clínicos son menos extensos [Wedmore, I., et al., A special report on the chitosan-based hemostatic dressing: Experience in current combat operations. Journal of Trauma-Injury Infection and Critical Care, 2006. 60(3): págs. 655 a 658; Brown, M.A., M.R. Daya, y J.A. Worley, EXPERIENCE WITH CHITOSAN DRESSINGS IN A CIVILIAN EMS SYSTEM. Journal of Emergency Medicine, 2009. 37(1): págs. 1 a 7; Cox, E.D., et al., New hemostatic agents in the combat setting. Transfusion, 2009. 49: págs. 248S a 255S; Granville-Chapman, J., N. Jacobs y M.J. Midwinter, Pre-hospital haemostatic dressings: A systematic review. Injury-International Journal of the Care of the Injured, 2011. 42(5): págs. 447 a 459]. También se han descrito apósitos liofilizados de quitosano mezclados y cargados de antimicrobianos [Yeo, J.H., et al., The effects of Pva/chitosan/fibroin (PCF)-blended spongy sheets on wound healing in rats. Biological & pharmaceutical bulletin, 2000. 23(10): págs. 1220 a 1223; Rossi, S., et al., Wound dressings based on chitosans and hyaluronic acid for the release of chlorhexidine diacetate in skin ulcer therapy. Pharmaceutical development and technology, 2007. 12(4): págs. 415 a 422; Ong, S.-Y., et al., Development of a chitosan-based wound dressing with improved hemostatic and antimicrobial properties. Biomaterials, 2008. 29(32): págs. 4323 a 4332].
En todos los casos anteriores, los andamios/recubrimientos se diseñaron para permanecer sólidos en el momento de su uso/implantación. Se utilizó un enfoque diferente de gelificación in situ para formulaciones de hidrogeles termoestables de quitosano que contienen diferentes agentes gelificantes (1,2-propanediol, glicerol, trehalosa o manitol) (documento US2009004230) [Schuetz, Y.B., R. Gurny, y O. Jordan, A novel thermoresponsive hydrogel based on chitosan. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics: official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.V, 2008. 68(1): págs. 19 a 25; Patois, E., et al., Novel thermosensitive chitosan hydrogels: in vivo evaluation. Journal of biomedical materials research. Part A, 2009. 91(2): págs. 324 a 330]. En este caso, las tortas de quitosano liofilizadas se reconstituyeron y solubilizaron al añadir agua fría bajo agitación magnética a 4 °C. Las propiedades termogelantes se conservaron en las formulaciones que contenían quitosano (59% de DDA-410 kDa o 63% de DDA-1220 kDa) con 8% o 10% de trehalosa, así como con 10% de manitol tras la liofilización [Schuetz, Y.B., R. Gurny, y O. Jordan, A novel thermoresponsive hydrogel based on chitosan. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics: official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.V, 2008. 68(1): págs. 19 a 25]. Las formulaciones liofilizadas que contienen 1,4% (p/v) de quitosano y 8% de trehalosa reconstituida en agua demostraron ser termosensibles y residir por vía subcutánea hasta 3 meses in vivo en la rata, donde indujeron una leve inflamación [Patois, E., et al., Novel thermosensitive chitosan hydrogels: in vivo evaluation. Journal of biomedical materials research. Part A, 2009. 91(2): págs. 324 a 330].
El uso de plasma rico en plaquetas (PRP) en ortopedia y medicina deportiva se revisó recientemente [Fortier, L.A., C.H. Hackett, y B.J. Cole, The Effects of Platelet-Rich Plasma on Cartilage: Basic Science and Clinical Application. Operative Techniques in Sports Medicine, 2011b. 19(3): págs. 154 a 159; Kon, E., et al., Platelet-rich plasma (PRP) to treat sports injuries: evidence to support its use. Knee Surgery Sports Traumatology Arthroscopy, 2011b. 19(4): págs. 516 a 527; Lopez-Vidriero, E., et al., The Use of Platelet-Rich Plasma in Arthroscopy and Sports Medicine: Optimizing the Healing Environment. Arthroscopy-the Journal of Arthroscopic and Related Surgery, 2010. 26(2): págs. 269 a 278; Andia, I., M. Sánchez y N. Maffulli, Joint pathology and platelet-rich plasma therapies. Expert Opinion on Biological Therapy, 2012. 12(1): págs. 7 a 22; Ahmad, Z., et al., The role of platelet rich plasma in musculoskeletal science. JRSM short reports, 2012. 3(6): pág. 40, 8 páginas; Smyth, N.A., et al., Establishing proof of concept: El plasma rico en plaquetas y el concentrado de aspirado de médula ósea pueden mejorar la reparación del cartílago tras el tratamiento quirúrgico de las lesiones osteocondrales del astrágalo. World journal of orthopedics, 2012. 3(7): págs. 101 a 108; Smyth, N.A., et al., Platelet-Rich Plasma in the Pathologic Processes of Cartilage: Review of Basic Science Evidence. Arthroscopy-the Journal of Arthroscopic and Related Surgery, 2013. 29 (8): págs.
1399 a 1409; Kon, E., et al., PRP-Augmented Scaffolds for Cartilage Regeneration: A Systematic Review. Operative Techniques in Sports Medicine, 2013. 21(2): págs. 108 a 115; Zhu, Y., et al., Basic science and clinical application of platelet-rich plasma for cartilage defects and osteoarthritis: a review. Osteoarthritis and Cartilage, 2013a. 21(11): págs. 1627 a 1637]. Se propuso un sistema de clasificación que comprende cuatro familias de PRP [Zumstein, M.A., T. Bielecki y D.M.D. Ehrenfest, The Future of Platelet Concentrates in Sports Medicine: Platelet-Rich Plasma, Platelet-Rich Fibrin, and the Impact of Scaffolds and Cells on the Long-term Delivery of Growth Factors. Operative Techniques in Sports Medicine, 2011. 19(3): págs. 190 a 197]. Las dos primeras familias son la fibrina rica en plaquetas (PRF), materiales sólidos de fibrina en los que están presentes los leucocitos (Leucocitos-PRF) o ausentes (Pura-PRF). Las dos últimas familias son suspensiones líquidas de plaquetas que contienen leucocitos (Leucocitos-PRP) o que carecen de leucocitos (Pura-PRP), que pueden ser activadas por trombina, cloruro de calcio (CaCh), gluconato de calcio u otros activadores para formar geles. Los lisados plaquetarios se produjeron por medio de la descongelación del PRP antes de su uso, lo que rompe las plaquetas y libera factores de crecimiento derivados de las mismas [Del Fante, C., et al., Platelet Lysate Mucohadesive Formulation to Treat Oral Mucositis in Graft Versus Host Patients: A New Therapeutic Approach. AAPS PharmSciTech, 2011. 12(3): págs. 893 a 899; Sandri, G., et al., Platelet lysate formulations based on mucoadhesive polymers for the treatment of corneal lesions. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2011. 63(2): págs. 189 a 198; Rossi, S., et al., "Sponge-like" dressings based on biopolymers for the delivery of platelet lysate to skin chronic wounds International journal of pharmaceutics, 2013. 440(2): págs. 207 a 215].
In vitro, se demostró que los liberados de PRP activados aumentan la proliferación de fibroblastos de la piel, la sinovia y los tendones [Anitua, E., et al., Fibroblastic response to treatment with different preparations rich in growth factors. Cell proliferation, 2009. 42(2): págs. 162 a 170; Anitua, E., et al., Autologous preparations rich in growth factors promote proliferation and induce VEGF and HGF production by human tendon cells in culture. Journal of orthopaedic research : publicación oficial de la Orthopaedic Research Society, 2005. 23(2): págs. 281 a 286], la secreción de ácido hialurónico (AH) y el factor de crecimiento hepatocitario (HGF) de los fibroblastos sinoviales aislados de pacientes con OA (osteoartritis) [Anitua, E., et al., Platelet-released growth factors enhance the secretion of hyaluronic acid and induce hepatocyte growth factor production by synovial fibroblasts from arthritic patients. Rheumatology (Oxford, England), 2007. 46(12): págs. 1769 a 1772], la proliferación, el proteoglicano (Pg ) y la síntesis de colágeno de los condrocitos [Park, S.I., et al., Time-sequential modulation in expression of growth factors from platelet-rich plasma (PRP) on the chondrocyte cultures. Mol Cell Biochem, 2012. 361(1-2) : págs. 9 a 17] y de condrocitos incrustados en perlas de alginato [Akeda, K., et al., Platelet-rich plasma stimulates porcine articular chondrocyte proliferation and matrix biosynthesis. Osteoarthritis and Cartilage, 2006. 14(12): págs. 1272 a 1280] y a disminuir la expresión de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) y del receptor de quimioquinas (CXCR4) en los condrocitos [Bendinelli, P., et al., Molecular Basis of AntiInflammatory Action of Platelet-Rich Plasma on Human Chondrocytes: Mechanisms of NF-kappa B Inhibition Via HGF. Journal of Cellular Physiology, 2010. 225(3): págs. 757 a 766]. El PRP aumentó la proliferación celular tanto de los condrocitos de oveja como de las células madre mesenquimales [Drengk, A., et al., Influence of platelet-rich plasma on chondrogenic differentiation and proliferation of chondrocytes and mesenchymal stem cells. Cells Tissues Organs, 2009. 189(5) : págs. 317 a 326]. Los condrocitos sembrados en microportadores de gelatina, mezclados con PRP y activados con CaCh forman construcciones estructuralmente estables [Pettersson, S., et al., Human articular chondrocytes on macroporous gelatin microcarriers form structurally stable constructs with blood-derived biological glues in vitro. Journal of tissue engineering and regenerative medicine, 2009. 3(6): págs. 450 a 460]. El suplemento del medio de cultivo de células madre mesenquimales (MSC) humanas con PRP no activado aumentó la proliferación y la expresión de Runx, Sox9 y agrecano [Mishra, A., et al., Buffered Platelet-Rich Plasma Enhances Mesenchymal Stem Cell Proliferation and Chondrogenic Differentiation. Tissue Engineering Part C-Methods, 2009. 15(3): págs. 431 a 435]. La adición de PRP al medio de cultivo de construcciones bifásicas compuestas por condrocitos bovinos sembrados sobre un sustrato cerámico poroso mejoró la formación de cartílago [Petrera, M., et al., Supplementation With Platelet-Rich Plasma Improves the In Vitro Formation of Tissue-Engineered Cartilage With Enhanced Mechanical Properties. Arthroscopy-the Journal of Arthroscopic and Related Surgery, 2013. 29 (10): págs. 1685 a 1692]. Los injertos compuestos por condrocitos, fibrinógeno y PRP permanecieron viables durante un período de cultivo de 3 semanas [Sitek, P., et al., PRP-fibrinogen gel-like chondrocyte carrier stabilized by TXA-preliminary study Cell Tissue Banking 2013. 14 (1): págs.
133 a 140]. El PRP inhibió los efectos proinflamatorios de la IL-1p en cultivos de condrocitos humanos [van Buul, G.M., et al., Platelet-Rich Plasma Releasate Inhibits Inflammatory Processes in Osteoarthritic Chondrocytes American Journal of Sports Medicine, 2013. 39 (11): págs. 2362 a 2370; Wu, C.-C., et al., Regenerative potentials of platelet-rich plasma enhanced by collagen in retrieving pro-inflammatory cytokine-inhibited chondrogenesis Biomaterials, 2011. 32(25): págs. 5847 a 5854]. Los liberados de lisado de plaquetas activadas tuvieron un fuerte efecto en la proliferación de condrocitos de OA, así como en la expresión de Sox9 y agrecano [Spreafico, A., et al., Biochemical Investigation of the Effects of Human Platelet Releasates on Human Articular Chondrocytes. Journal of Cellular Biochemistry, 2009. 108(5): págs. 1153 a 1165]. El lisado de plaquetas aumentó la migración de progenitores corticoesponjosos humanos e indujo su diferenciación condrogénica en cultivos de pellets de alta densidad [Krueger, J.P., et al., Human platelet-rich plasma stimulates migration and chondrogenic differentiation of human subchondral progenitor cells. Journal of Orthopaedic Research, 2012. 30(6): págs. 845 a 852]. Los lisados de plaquetas también aumentaron la diferenciación condrogénica de las células estromales de la médula ósea humana [Zaky, S.H., et al., Platelet lysate favours in vitro expansion of human bone marrow stromal cells for bone and cartilage engineering J Tiss Eng Reg Med, 2008. 2 (8): págs. 472 a 481].
En modelos preclínicos, se mezclaron condrocitos de conejo con PRP, se activó el PRP con trombina/CaCh y se inyectó por vía subcutánea para formar nódulos de cartílago dorsal después de 2 meses [Wu, W., et al., Autologous injectable tissue-engineered cartilage by using platelet-rich plasma: Experimental study in a rabbit model. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 2007b. 65 (10): págs. 1951 a 1957], lo que sugiere que se podría utilizar un enfoque similar para la reparación del cartílago [Wu, W., et al., Platelet-rich plasma - A promising cell carrier for microinvasive articular cartilage repair. Medical Hypotheses, 2009. 72(4): págs. 455 a 457]. Andamios de bicapa de colágeno liofilizados cargados con PRP [Qi, Y.Y., et al., Local Delivery of Autologous Platelet in Collagen Matrix Synergistically Stimulated In-situ Articular Cartilage Repair, en 13th International Conference on Biomedical Engineering, Vols 1-3, C.T. Lim y J.C.H. Goh, Editores. 2009a. págs. 1289 a 1292; Qi, Y.Y., et al., Local Delivery of Autologous Platelet in Collagen Matrix Simulated In Situ Articular Cartilage Repair. Cell Transplantation, 2009b.
18(10-11): págs. 1161 a 1169] y andamios de ácido poliláctico-glicólico (PLGA) cargados con PRP junto con trombina/CaCl2 [Sun, Y., et al., The regenerative effect of platelet-rich plasma on healing in large osteochondral defects. International orthopaedics, 2010. 34(4): págs. 589 a 597] mejora de la cicatrización en modelos de defectos del surco rotuliano de conejo. La carga de PRP en un andamio bifásico condujo a una mejora de las puntuaciones histológicas en un modelo de defecto osteocondral en el cóndilo porcino [Betsch, M., et al., Bone Marrow Aspiration Concéntrate and Platelet Rich Plasma for Osteochondral Repair in a Porcine Osteochondral Defect Model. PLOS ONE, 2013. 8(8): pág. e71602]. La microfractura aumentada con PRP mejoró la curación en un modelo de defecto crónico del cóndilo femoral medial de rata [Hapa, O., et al., Does platelet-rich plasma enhance micro fracture treatment for chronic focal chondral defects? Un estudio in vivo llevado a cabo en un modelo de rata. Acta Orthop Traum Turc, 2013. 47(3): págs. 201 a 207]. El hidrogel conjugado de gelatina-poliglicol-tiramina (GPT) se utilizó como andamio junto con condrocitos autólogos y PRP para tratar los defectos del xifoides en ratas [Lee, H.-R., et al., Platelet-rich plasma loaded in situ-formed hydrogel enhances hyaline cartilage regeneration by CB1 upregulation. Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2012a. 100A(11): págs. 3099 a 3107] y defectos del surco rotuliano de conejo [Lee, H.-R., et al., Platelet-rich plasma loaded hydrogel scaffold enhances chondrogenic differentiation and maturation with up-regulation of CB1 and CB2. Journal of Controlled Release, 2012b. 159(3): págs. 332 a 337]. El PRP utilizado en forma de gel junto con la microfractura fue más eficaz en comparación con las inyecciones líquidas de PRP no activado en un modelo de defecto condilar de oveja [Milano, G., et al., The effect of platelet rich plasma combined with microfractures on the treatment of chondral defects: an experimental study in a sheep model. Osteoarthritis and cartilage 2010. 18(7): págs. 971 a 980]. Se observó una buena cicatrización cuando se utilizó una membrana de ácido hialurónico junto con PRP y fragmentos de cartílago en un modelo de defecto osteocondral troclear en conejos adultos [Marmotti, A., et al., One-step osteochondral repair with cartilage fragments in a composite scaffold. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc, 2012. 20(12): págs. 2590 a 2601]. Se preparó un andamio tridimensional a partir de PRP y se cargó con células estromales derivadas de la médula ósea para tratar con éxito defectos trocleares osteocondrales en conejos [Xie, X., et al., Comparative evaluation of MSCs from bone marrow and adipose tissue seeded in PRP-derived scaffold for cartilage regeneration. Biomaterials, 2012. 33(29): págs. 7008 a 7018]. Sin embargo, en un modelo de defecto condilar de oveja, un andamio biomimético de 3 capas funcionó mejor por sí solo que cuando se impregnó el andamio con p Rp activado con CaCh [Kon, E., et al., Platelet autologous growth factors decrease the osteochondral regeneration capability of a collagen-hydroxyapatite scaffold in a sheep model. Bmc Musculoskeletal Disorders, 2010b. 11]. La matriz ósea desmineralizada rehidratada con PRP no mejoró la reparación osteocondral en el astrágalo de cabras [van Bergen, C.J.A., et al., Demineralized bone matrix and platelet-rich plasma do not improve healing of osteochondral defects of the talus: an experimental goat study. Osteoarthritis and Cartilage, 2013. 21(11): págs. 1746 a 1754]. El PRP tampoco mejoró la cicatrización en el cóndilo femoral medial de conejos NZW inmaduros [serra, I.C., et al., Effect of autologous platelet-rich plasma on the repair of full-thickness articular defects in rabbits. Knee Surgery Sports Traumatology Arthroscopy, 2013. 21(8): págs.
1730 a 1736]. Las inyecciones intraarticulares de plasma condicionado autólogo mejoran la cicatrización en modelos de defectos condilares en ovejas [Milano, G., et al., Repeated Platelet Concentrate Injections Enhance Reparative Response of Microfractures in the Treatment of Chondral Defects of the Knee: An Experimental Study in an Animal Model. Arthroscopy-the Journal of Arthroscopic and Related Surgery, 2012. 28(5): págs. 688 a 701; Milano, G., et al., The effect of autologous conditioned plasma on the treatment of focal chondral defects of the knee. An experimental study. International journal of immunopathology and pharmacology, 2011. 24(1 Suppl 2): págs. 117 a 124]. Se utilizaron inyecciones intraarticulares de PRP embebido en microesferas de hidrogel de gelatina en un modelo de OA de conejo [Saito, M., et al., Intraarticular administration of platelet-rich plasma with biodegradable gelatin hydrogel microspheres prevents osteoarthritis progression in the rabbit knee. Clinical and Experimental Rheumatology, 2009. 27(2): págs. 201 a 207]. Se utilizaron inyecciones intraarticulares de PRP en un modelo de artritis inflamatoria en cerdos para restaurar el fenotipo cartilaginoso y disminuir la inflamación [Lippross, S., et al., Intraarticular Injection of Platelet-Rich Plasma Reduces Inflammation in a Pig Model of Rheumatoid Arthritis of the Knee Joint Arthritis Rheumatism, 2011. 63(11): págs. 3344 a 3353]. En un modelo de defecto meniscal de conejo, la gelatina reticulada y liofilizada cargada con lisado de plaquetas mejoró la cicatrización [Ishida, K., et al. The regenerative effects of platelet-rich plasma on meniscal cells in vitro and its in vivo application with biodegradable gelatin hydrogel. Tissue engineering, 2007. 13(5): págs. 1103 a 1112]. El PRP se cargó en andamios de gelatinaester hialurónica pero no mejoró la reparación en dos modelos diferentes de defectos de menisco en conejo [Zellner, J., et al., Stem cell-based tissue-engineering for treatment of meniscal tears in the avascular zone. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials, 2013. 101(7):1133 a 1142; Zellner, J., et al., Role of mesenchymal stem cells in tissue engineering of meniscus. Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2010.
94A(4): págs. 1150 a 1161].
Dos ensayos clínicos que investigan el PRP para la cicatrización de meniscos están publicados en www.clinicaltrials.gov (Identificadores: NCT00961597 y NCT01991353).
Las combinaciones de quitosano y productos derivados de la sangre han sido descritas anteriormente por otros. Se utilizaron procedimientos de liofilización para preparar formatos sólidos de quitosano (andamios o apósitos para heridas) combinados con productos derivados de la sangre en los siguientes 3 trabajos. En Oktay et al, se cargaron esponjas sólidas liofilizadas de quitosano con PRP activado con un 10% de CaCh y sangre autóloga (que contenía trombina) y se implantaron en un defecto craneal donde indujeron una reacción inflamatoria [Oktay, E.O., et al., Effects of platelet-rich plasma and chitosan combination on bone regeneration in experimental rabbit cranial defects. The Journal of oral implantology, 2010. 36(3): págs. 175 a 184]. Se utilizaron dos procedimientos de fabricación diferentes para preparar andamios sólidos que contenían PRP no activado y quitosano en Kutlu et al. [Kutlu, B., et al., Platelet-rich plasma-loaded chitosan scaffolds: Preparation and growth factor release kinetics. Journal of Biomedical Materials Research Part B-Applied Biomaterials, 2013. 101B(1): págs. 28 a 35]. Para el primer procedimiento, el quitosano se disolvió en ácido acético y se mezcló con volúmenes crecientes de PRP antes de la liofilización. Para el segundo procedimiento, se dejaron caer volúmenes crecientes de PRP sobre andamios de quitosano liofilizados. En el documento Rossi et al. (US20110280952), se prepararon apósitos sólidos tipo esponja compuestos de lisado de plaquetas y glutamato/glicina de quitosano o de lisado de plaquetas y glutamato/glicina/glicerofosfato de quitosano para su administración en heridas cutáneas crónicas [Rossi, S., et al., "Sponge-like" dressings based on biopolymers for the delivery of platelet lysate to skin chronic wounds. International journal of pharmaceutics, 2013. 440(2): págs. 207 a 215]. En todos los casos anteriores, las formulaciones de quitosano eran sólidas y estaban diseñadas para permanecer así inmediatamente después de la implantación. En Ezodini-Erdanaki et al, se mezcló polvo de quitosano esterilizado en forma sólida con una gota de sangre autóloga y se implantó en un defecto tibial en un modelo de rata [Ezoddini-Ardakani, F., et al., Histologic evaluation of chitosan as an accelerator of bone regeneration in microdrilled rat tibias. Dental research journal, 2012. 9(6): págs. 694 a 699]. En el documento Sandri et al. (WO2010064267), se prepararon compuestos de glutamato de quitosano e hidroxipropilmetilcelulosa mezclados con lisado de plaquetas para aplicaciones de curación de heridas [Sandri, G., et al., Platelet lysate formulations based on mucoadhesive polymers for the treatment of corneal lesions. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2011. 63(2): págs. 189 a 198]. En Bi et al, se utilizaron compuestos inyectables de quitosano/ácido cítrico/glucosa mezclados con polvo de fosfato tricálcico y PRP activado con trombina bovina y CaCl2 al 10% en un modelo de defecto óseo de cabra [Bi, L., et al., Reconstruction of goat tibial defects using an injectable tricalcium phosphate/chitosan in combination with autologous platelet-rich plasma. Biomaterials, 2010.
31(12): págs. 3201 a 3211].
Ninguna de las técnicas anteriores describe formulaciones solubles de quitosano liofilizado y PRP concentrado que sean fisiológicas, viables y activas. En Ezodini-Erdanaki et al. se utiliza sangre entera. En Sandri et al., se informó que el pH del vehículo de glutamato de quitosano era ácido a 5,5, el lisado de plaquetas (que contiene plaquetas rotas y factores de crecimiento derivados de las plaquetas) se diluye dos veces durante la preparación y el procedimiento de preparación implica el almacenamiento de los factores de crecimiento derivados de las plaquetas durante 2 semanas a 4 °C, lo que más que probablemente destruye la actividad [Sandri, G., et al., Platelet lysate formulations based on mucoadhesive polymers for the treatment of corneal lesions. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2011. 63(2): págs. 189 a 198]. En Bi et al, los activadores del coágulo son CaCh al 10%, que tiene una osmolalidad de ~2500 mOsm (muy por encima de los ~300 mOsm fisiológicos), y trombina bovina, que se ha relacionado con graves coagulopatías [Bi, L., et al., Reconstruction of goat tibial defects using an injectable tricalcium phosphate/chitosan in combination with autologous platelet-rich plasma. Biomaterials, 2010. 31(12): págs. 3201 a 3211].
Existe la necesidad de formulaciones estables de quitosano liofilizado para su reconstitución y activación simultánea en PRP para formar soluciones fisiológicas inyectables, preferentemente que se gelifiquen in situ para de este modo formar implantes de tejido que conserven el volumen. También se necesitan formulaciones que no se retraigan y que se adhieran a las superficies de los tejidos. Las soluciones líquidas del polímero quitosano con sangre entera y PRP se han tratado en los documentos (US8258117, WO2008064487, WO2011060555, WO2011060545). Sin embargo, la mezcla de un polímero liofilizado directamente en el PRP o la sangre para formar implantes de tejido no lo ha hecho. Ninguna de las técnicas mencionadas anteriormente satisface estas necesidades. Hasta donde sabemos, no hay publicaciones que describan la solubilización directa de formulaciones de quitosano liofilizado en PRP o en sangre para formar implantes gelificantes viables no retráctiles in situ.
La investigación sobre la viscosuplementación se centró principalmente en el uso del ácido hialurónico en diversas formas [Huskin, J.P., et al., Multicentre, prospective, open study to evaluate the safety and efficacy of hylan G-F 20in knee osteoarthritis subjects presenting with pain following arthroscopic meniscectomy. Knee Surgery Sports Traumatology Arthroscopy, 2008. 16(8): págs. 747 a 752; Conrozier, T., et al., Prospective, multi-centre, randomised evaluation of the safety and efficacy of five dosing regimens of viscosupplementation with hylan G-F 20 in patients with symptomatic tibio-femoral osteoarthritis: a pilot study. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery, 2009.
129(3): págs. 417 a 423; Noel, E., et al., Efficacy and safety of Hylan G-F 20 in shoulder osteoarthritis with an intact rotator cuff. Open-label prospective multicenter study. Joint Bone Spine, 2009. 76(6): págs. 670 a 673; Wang, Y., et al., Effects of Hylan G-F 20 supplementation on cartilage preservation detected by magnetic resonance imaging in osteoarthritis of the knee: a two-year single-blind clinical trial. Bmc Musculoskeletal Disorders, 2011. 12], con algunos estudios que informan sobre el uso de inyecciones intraarticulares de PRP para el tratamiento de la OA o la enfermedad del cartílago [Wang-Saegusa, A., et al., Infiltration of plasma rich in growth factors for osteoarthritis of the knee short-term effects on function and quality of life. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery, 2011.
131(3): págs. 311 a 317; Napolitano, M., et al., Autologous platelet gel for tissue regeneration in degenerative disorders of the knee. Blood Transfusion, 2012. 10(1): págs. 72 a 77; Sánchez, M., et al, Intra-articular injection of an autologous preparation rich in growth factors for the treatment of knee OA: a retrospective cohort study. Clinical and Experimental Rheumatology, 2008. 26(5): págs. 910 a 913; Kon, E., et al., Platelet-rich plasma: intra-articular knee injections produced favorable results on degenerative cartilage lesions. Knee Surgery Sports Traumatology Arthroscopy, 2010a. 18(4): págs. 472 a 479; Kon, E., et al., Platelet-Rich Plasma Intra-Articular Injection Versus Hyaluronic Acid Viscosupplementation as Treatments for Cartilage Pathology: From Early Degeneration to Osteoarthritis. Arthroscopy-the Journal of Arthroscopic and Related Surgery, 2011a. 27(11): págs. 1490 a 1501; Filardo, G., et al., Platelet-rich plasma intra-articular knee injections for the treatment of degenerative cartilage lesions and osteoarthritis.I Knee Surgen/ Sports Traumatology Arthroscopy, 2011. 19(4): págs. 528 a 535; Patel, S., et al., Treatment With Platelet-Rich Plasma Is More Effective Than Placebo for Knee Osteoarthritis A Prospective, Double-Blind, Randomized Trial. American Journal of Sports Medicine, 2013. 41(2): págs. 356 a 364; Gobbi, A., et al., Platelet-rich plasma treatment in symptomatic patients with knee osteoarthritis: preliminary results in a group of active patients. Sports health, 2012. 4(2): págs. 162 a 172; Hart, R., et al., Platelet-rich plasma in patients with tibiofemoral cartilage degeneration. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery, 2013. 133 (9): págs. 1295 a 1301]. En el único ensayo controlado aleatorio publicado hasta la fecha, se comprobó que una única inyección de PRP filtrado con leucocitos y activado con CaCh aliviaba los síntomas de la OA de rodilla en su fase inicial a los 6 meses [Patel, S., et al., Treatment With Platelet-Rich Plasma Is More Effective Than Placebo for Knee Osteoarthritis A Prospective, Double-Blind, Randomized Trial. American Journal of Sports Medicine, 2013. 41(2): págs. 356 a 364]. Varios ensayos clínicos que investigan el efecto de las inyecciones intraarticulares de PRP sobre la OA o la degeneración del cartílago están publicados en www.clinicaltrials.gov (identificadores NCT01418755, NCT01670578, NCT01270412, NCT02012530).
Existe la necesidad de: formulaciones de quitosano liofilizadas que contengan lioprotectores para la estabilidad del almacenamiento, pero que sigan siendo fisiológicas tras la reconstitución con PRP; formulaciones que se puedan reconstituir (rehidratar) de forma rápida, preferentemente completa y fácil en PRP para formar compuestos homogéneos inyectables de quitosano/PRP; formulaciones que contengan un activador de coágulos para la gelificación in situ si es necesario; formulaciones de quitosano con al menos una de las siguientes características: 1) Tortas liofilizadas con propiedades mecánicas adecuadas para el almacenamiento y el transporte; 2) Tortas que se reconstituyen, preferentemente de forma completa y rápida, en PRP, PPP, sangre total o agua, de acuerdo con lo necesario; 3) La coagulación no se ve inhibida por los componentes de las tortas cuando se necesita formar un implante híbrido sólido de quitosano/PRP; 4) Los implantes híbridos son sólidos y estables para resistir la carga mecánica in vivo; 5) Los implantes híbridos inhiben la retracción del coágulo mediada por las plaquetas para rellenar los defectos del tejido; 6) Los implantes híbridos son homogéneos, preferentemente sin separación de fases de los componentes poliméricos y sanguíneos que mejoran, preferentemente, las respuestas in vivo; 7) Las mezclas son viscosas y pastosas para aplicaciones de reparación de tejidos; 8) Las mezclas reconstituidas tienen propiedades fisiológicas para la implantación in vivo.
El estado de la técnica mencionado anteriormente no aborda el PRP mezclado con soluciones poliméricas para proporcionar una viscosuplementación eficaz sin requerir ninguna solidificación. Se espera que las formulaciones fisiológicas de quitosano liofilizado reconstituidas con PRP proporcionen viscosuplementación (debido a la presencia de quitosano) y proporcionen una liberación lenta de factores derivados de las plaquetas en la cavidad articular por medio de la unión del quitosano al PRP. Se necesitan formulaciones de quitosano liofilizado diseñadas para la viscosuplementación que comprendan al menos uno de los siguientes criterios de rendimiento: 1) Buenas propiedades mecánicas de las tortas para su almacenamiento y envío; 2) Reconstitución o rehidratación de las tortas, preferentemente completa, más preferentemente completa y rápida; 3) Las mezclas reconstituidas son viscosas para la viscosuplementación intraarticular; 4) Las mezclas reconstituidas tienen propiedades fisiológicas adecuadas para las inyecciones intraarticulares.
BREVE SUMARIO
En un aspecto, se proporciona una solución inyectable que comprende una composición polimérica liofilizada que comprende quitosano y al menos un lioprotector. La composición se reconstituye en plasma rico en plaquetas (PRP) y/o productos derivados de la sangre para formar: i) al menos un implante viable in situ solidificante y no retráctil para la reparación de tejidos; ii) una composición para inyección terapéutica intraarticular. El al menos un lioprotector se selecciona del grupo que consiste en monosacárido, poliol, disacárido, trisacárido, oligosacárido/polisacárido, excipiente de alto peso molecular, aminoácido, proteína y combinaciones de los mismos. La solución inyectable no comprende fosfato de glicerina.
La sangre y/o los productos derivados de la sangre se seleccionan del grupo que consiste en PRP, PPP, PRF, plasma autólogo condicionado, suspensión de plaquetas, lisado de plaquetas y combinaciones de los mismos.
El al menos un lioprotector se selecciona del grupo que consiste en monosacárido, poliol, disacárido, trisacárido, oligosacárido/polisacárido, excipiente de alto peso molecular, aminoácido, proteína y combinaciones de los mismos.
Preferentemente, el monosacárido se selecciona del grupo que consiste en glucosa, fructosa, fucosa, galactosa, manosa, ribosa, xilosarabinosa y combinaciones de las mismas. Preferentemente, el disacárido se selecciona del grupo formado por lactosa, maltosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa, melibiosa y combinaciones de los mismos. Preferentemente, el trisacárido se selecciona entre maltotriosa, rafinosa y combinaciones de los mismos. Preferentemente, el poliol se selecciona entre manitol, sorbitol, xilitol, inositol y combinaciones de los mismos. Preferentemente, el aminoácido se selecciona del grupo que consiste en histidina, glicina, arginina, alanina, ácido glutámico, lisina, fenilalanina y combinaciones de los mismos. Preferentemente, el oligosacárido/polisacárido se selecciona del grupo formado por dextrano, ciclodextrina, maltodextrina, hidroxietilalmidón, ficol, celulosa, hidroxipropiletilcelulosa, inulina y combinaciones de los mismos. Preferentemente, la proteína se selecciona del grupo que consiste en albúmina de suero bovino (BSA), caseína, globulina, lactoalbúmina, lactato deshidrogenasa (LDH), lisozima, mioglobina, ovoalbúmina y combinaciones de las mismas.
Preferentemente, la cantidad de al menos un lioprotector es de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 30%, más preferentemente de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 10% y aún más preferentemente de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 6% p/v.
El quitosano en la composición de quitosano liofilizado tiene un número de peso molecular de aproximadamente 20 a aproximadamente 125 kDa y preferentemente de aproximadamente 30 a aproximadamente 100 kDa. Preferentemente, la concentración de quitosano en la composición de quitosano liofilizado es de aproximadamente 0,25% a aproximadamente 10%, más preferentemente de aproximadamente 0,25% a aproximadamente 5% y aún más preferentemente de aproximadamente 0,25% a aproximadamente 2,5% p/v.
La composición de quitosano liofilizado comprende además al menos un activador del coágulo seleccionado del grupo que consiste en cloruro de calcio, gluconato de calcio, acetato de calcio, carbonato de calcio, glubionato de calcio, glucepato de calcio, lactato de calcio, lactobionato de calcio, fosfato de calcio y combinaciones de los mismos.
En otro aspecto, se proporciona una composición de quitosano liofilizado que preferentemente tiene al menos una, más preferentemente más de una, aún más preferentemente todas las siguientes características generales: 1-Torta liofilizada sólida y homogénea con buenas propiedades mecánicas para el envío (Evaluada por el aspecto de las tortas); 2- Reconstitución rápida y completa, preferentemente en menos de 5 minutos, más preferentemente en menos de 2 minutos, en al menos una de las siguientes sustancias: PRP, plasma pobre en plaquetas (PPP), sangre o agua, de acuerdo con lo necesario (Evaluada por inspección visual tras la reconstitución).
A fin de mezclar la composición de quitosano liofilizado con PRP o sangre, la composición tiene preferentemente al menos una, más preferentemente más de una, aún más preferentemente todas las características siguientes: 3- La mezcla no inhibe la coagulación cuando es necesario formar un implante sólido (en una realización, evaluada con tromboelastografía); 4- La mezcla coagulada (preferentemente un implante) es mecánicamente estable (en una realización, evaluada con una prueba de aplastamiento manual); 5- La mezcla coagulada (preferentemente un implante) inhibe la retracción del coágulo que se produce con la sangre o el PRP solos (en una realización, evaluada con mediciones de expresión de líquidos); 6- Se consigue una buena mezcla sin separación de fases de los componentes poliméricos y sanguíneos (en una realización evaluada con histología); 7- La mezcla, antes de la reconstitución, es viscosa y pastosa para aplicaciones de reparación de tejidos o una suspensión viscosa en el caso de la viscosuplementación intraarticular (en una realización evaluada con la prueba de fluidez); 8- La mezcla tiene propiedades cercanas a las fisiológicas, preferentemente de unos 165 mOsm a unos 660 mOsm, más preferentemente de unos 195 mOsm a unos 550 mOsm, aún más preferentemente unos 330 mOsm, preferentemente de unos pH 64 a aproximadamente pH 7,9, más preferentemente de aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,9, aún más preferentemente de aproximadamente pH 7,4 después de la reconstitución para la implantación in vivo o las inyecciones intraarticulares (en una realización evaluada con mediciones de osmolalidad y pH).
En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para preparar la solución inyectable que comprende una composición polimérica liofilizada que comprende quitosano que comprende las etapas de:
a) poner en contacto el quitosano con agua para formar una mezcla acuosa,
b) poner en contacto la mezcla acuosa con al menos un lioprotector,
c) poner en contacto la mezcla acuosa con al menos un activador de coágulos,
d) esterilizar el quitosano, el al menos un lioprotector y el al menos un activador de coágulos, individualmente, antes de mezclar o después de añadir el al menos un lioprotector y el al menos un activador de coágulos a dicha mezcla acuosa de quitosano y agua; y
e) liofilizar la mezcla acuosa que contiene al menos un lioprotector y, opcionalmente, al menos un activador del coágulo.
El quitosano en la composición de polímero/quitosano liofilizado tiene un número de peso molecular de aproximadamente 20 a aproximadamente 125 kDa y aún más preferentemente de aproximadamente 30 a aproximadamente 100 kDa. Preferentemente, la concentración de quitosano en la composición de quitosano liofilizado es inferior a aproximadamente el 10%, más preferentemente inferior a aproximadamente el 5% y aún más preferentemente inferior al 2,5%.
El al menos un lioprotector se selecciona del grupo que consiste en monosacárido, poliol, disacárido, trisacárido, oligosacárido/polisacárido, excipiente de alto peso molecular, aminoácido, proteína y combinaciones de los mismos. Preferentemente, el monosacárido se selecciona del grupo que consiste en glucosa, fructosa, fucosa, galactosa, manosa, ribosa, xilosa, arabinosa y combinaciones de las mismas. Preferentemente, el disacárido se selecciona del grupo formado por lactosa, maltosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa, melibiosa y combinaciones de las mismas. Preferentemente, el trisacárido se selecciona entre maltotriosa, rafinosa y combinaciones de las mismas. Preferentemente, el poliol se selecciona entre manitol, sorbitol, xilitol, inositol y combinaciones de los mismos. Preferentemente, el aminoácido se selecciona del grupo que consiste en histidina, glicina, arginina, alanina, ácido glutámico, lisina, fenilalanina y combinaciones de los mismos. Preferentemente, el oligosacárido/polisacárido se selecciona del grupo formado por dextrano, ciclodextrina, maltodextrina, hidroxietilalmidón, ficol, celulosa, hidroxipropiletilcelulosa, inulina y combinaciones de los mismos. Preferentemente, la proteína se selecciona del grupo que consiste en albúmina de suero bovino (BSA), caseína, globulina, lactoalbúmina, lactato deshidrogenasa (LDH), lisozima, mioglobina, ovoalbúmina y combinaciones de las mismas.
Preferentemente, la cantidad de al menos un lioprotector es de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 30%, más preferentemente de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 10% y aún más preferentemente de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 6% p/v.
El al menos un activador del coágulo se selecciona del grupo que consiste en cloruro de calcio, gluconato de calcio, acetato de calcio, carbonato de calcio, glubionato de calcio, glucepato de calcio, lactato de calcio, lactobionato de calcio, fosfato de calcio y combinaciones de los mismos.
En otra realización, se pueden preparar diferentes formulaciones estériles de quitosano para la liofilización. Las variantes pueden incluir el peso molecular promedio del quitosano (Mw), el peso molecular promedio en número (Mn), el grado de desacetilación (DDA), la concentración y los niveles de protonación, como se describe en los diferentes ejemplos. Otras variables pueden ser el procedimiento de mezclado, la concentración y el procedimiento de adición del al menos un activador del coágulo (preferentemente una sal metálica, más preferentemente un haluro metálico, aún más preferentemente CaCh), la concentración de lioprotector (preferentemente seleccionado del grupo formado por trehalosa, manitol y sacarosa), la concentración de sal (preferentemente una sal metálica, más preferentemente un haluro metálico, aún más preferentemente NaCl) y la concentración de tampón (preferentemente histidina). En una realización, se añade un trazador para la obtención de imágenes, preferentemente un trazador de rodaminaquitosano esterilizado por filtro a las tortas, preferentemente en una proporción final del 0,01% (vol de trazador/vol de solución) para la obtención de imágenes.
En otro aspecto, la solución inyectable que comprende una composición de quitosano liofilizada reconstituida en sangre o un producto sanguíneo seleccionado del grupo que consiste en PRP, PPP, PRF, plasma autólogo condicionado, suspensión de plaquetas y lisado de plaquetas y combinaciones de los mismos se utiliza para preparar implantes para la reparación de tejidos o la inyección intraarticular. Preferentemente, la reparación del tejido se selecciona del grupo que consiste en la reparación del menisco, la reparación del cartílago, la reparación del hueso, la reparación del manguito de los rotadores, la epicondilitis, la reparación del ligamento/tendón, la lesión aguda, la tendinopatía, el desgarro, la reparación del músculo, la cirugía oral/maxilofacial, la reparación de la piel, el tratamiento de la herida, el tratamiento de la úlcera y las combinaciones de las mismas.
En otro aspecto, el PRP y el PPP se utilizan para probar las características de rendimiento de las tortas liofilizadas. En una realización preferente, la sangre entera anticoagulada se centrifuga, preferentemente a unos 160 g durante unos 10 minutos, preferentemente a temperatura ambiente, para de este modo dar lugar a un sobrenadante. El sobrenadante se recoge junto con los primeros 2 mm de eritrocitos y se centrifuga de nuevo a unos 400 g durante unos 10 minutos, preferentemente a temperatura ambiente, a fin de separar el PRP (fondo de 1,5 mL del tubo, clasificado como Leucocito-PRP, que también contiene una fracción de eritrocitos) y el PPP (plasma claro).
En otra realización, para probar la reconstitución de las tortas, se pipetea aproximadamente 1 mL de PRP o PPP (preferente para la evaluación visual porque es claro) en cada vial que contiene la torta liofilizada. La mezcla se lleva a cabo, preferentemente, por remolino o por medio de la agitación enérgica durante 10 segundos en presencia (o ausencia) de tres bolas de acero inoxidable de 0,39 g. En una realización, las tortas liofilizadas se resolvieron en un plazo de entre 3 y 5 minutos. También se registraron el pH y la osmolalidad de las mezclas reconstituidas para determinar si se acercaban a las fisiológicas.
En otra realización, para probar el rendimiento de las tortas, se puede pipetear aproximadamente 1 mL de PRP en cada vial que contenga la torta liofilizada. Las formulaciones se mezclaron por remolino o por agitación vigorosa durante 10 segundos en presencia o ausencia de tres bolas de acero inoxidable de 0,39 g.
En otra realización, las propiedades de coagulación de las formulaciones se pueden probar por medio de tromboelastografía (TEG). La mezcla no inhibe la coagulación cuando hay que formar un implante sólido.
En otra realización, la retención del volumen del coágulo híbrido se puede evaluar por medio de la medición de la expresión de líquido de los coágulos híbridos que se produce tras la retracción del coágulo. Las mezclas coaguladas (implantes) deben inhibir en gran medida la retracción del coágulo que se produce con la sangre o el PRP solos para rellenar completamente los defectos del tejido.
La dispersión del quitosano en los coágulos híbridos se puede evaluar por medio de histología. Se debe lograr una buena mezcla sin separación de fases del polímero y los componentes sanguíneos para garantizar una biodegradabilidad oportuna y respuestas biológicas beneficiosas in situ.
Las propiedades pastosas de las formulaciones se pueden evaluar con una prueba de fluidez. Preferentemente, las mezclas deben tener propiedades de manipulación adecuadas, que serán preferentemente viscosas y pastosas para aplicaciones de reparación de tejidos o una suspensión viscosa en el caso de la viscosuplementación intraarticular Las propiedades mecánicas de las formulaciones se pueden evaluar con una prueba de aplastamiento. Preferentemente, las mezclas coaguladas (implantes) deben ser mecánicamente estables para soportar la carga en los lugares de implantación.
Las propiedades de manipulación de las formulaciones se pueden probar ex vivo en un modelo de defecto de menisco y en un modelo de defecto de cartílago. Preferentemente, las mezclas se deben poder administrar fácilmente en los defectos de los tejidos con los aparatos habituales de un quirófano.
El aclaramiento in vivo de las formulaciones liofilizadas se puede evaluar en un modelo de defecto condral de conejo y en un modelo de implantación subcutánea de conejo. Preferentemente, las mezclas deben ser biodegradables y se deben eliminar a tiempo sin inducir efectos nocivos tales como la inflamación crónica. Más preferentemente, los implantes híbridos compuestos de quitosano/PRP deben ser retenidos durante más tiempo que el PRP in vivo para modular los eventos de cicatrización de la herida.
Los implantes híbridos de Quitosano/PRP se pueden inyectar in vivo en defectos de menisco y defectos de cartílago agudos y crónicos para modular los mecanismos de curación y mejorar la reparación.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Las Figuras 1A y 1B muestran varias tortas de quitosano liofilizadas y las pruebas de las mismas del Ejemplo 1. Las Figuras 2A y 2B muestran las tortas de quitosano liofilizadas y las pruebas de las mismas del Ejemplo 2. Las Figuras 3A y 3B muestran coágulos híbridos preparados con formulaciones liofilizadas y soluciones líquidas del Ejemplo 3.
Las Figuras 4A y 4B muestran las tortas de quitosano liofilizadas y los coágulos híbridos del Ejemplo 4.
Las Figuras 5A y 5B muestran la prueba de fluidez y el TEG de las distintas formulaciones de quitosano del Ejemplo 5.
La Figura 6A muestra varias tortas de quitosano liofilizadas y coágulos híbridos del Ejemplo 6.
La Figura 6B representa las pruebas de TEG y de expresión de líquidos de varias formulaciones bajo diversas condiciones de prueba del Ejemplo 6.
La Figura 6C muestra la prueba de fluidez y la implantación ex vivo de las formulaciones de quitosano del Ejemplo 6.
La Figura 6D representa la prueba de resistencia mecánica de los coágulos híbridos del Ejemplo 6.
La Figura 7A muestra los coágulos híbridos del Ejemplo 7.
La Figura 7B muestra coágulos híbridos sometidos a varias pruebas del Ejemplo 7.
La Figura 7C muestra los resultados histológicos del Día 1 de los implantes de quitosano/PRP liofilizados inyectados en conejos NZW del Ejemplo 7.
La Figura 7D muestra los resultados histológicos del Día 3 de los implantes de quitosano/PRP liofilizados inyectados en conejos NZW del Ejemplo 7.
La Figura 7E muestra los resultados macroscópicos de los implantes de quitosano/PRP liofilizados inyectados en conejos NZW del Ejemplo 7.
La Figura 8A muestra el aspecto de las tortas y la solubilidad de varias tortas de quitosano liofilizado del Ejemplo 8.
La Figura 8B muestra la prueba de expresión de líquidos de varias tortas de quitosano liofilizadas del Ejemplo 8. La Figura 8C muestra las pruebas de TEG y la histología del coágulo de varias tortas de quitosano liofilizadas del Ejemplo 8.
La Figura 8D muestra la aplicación de los híbridos de quitosano/PRP a los defectos meniscales quirúrgicos del Ejemplo 8.
La Figura 8E muestra los resultados del día 1 y del día 21 tras la implantación de los híbridos de quitosano/PRP en los defectos meniscales del Ejemplo 8.
La Figura 9A muestra la implantación de los implantes de quitosano/PRP en los defectos crónicos del cartílago del Ejemplo 9.
La Figura 9B muestra los resultados del día 21 tras la implantación de los híbridos de quitosano/PRP en los defectos crónicos del cartílago del ejemplo 9.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FIGURAS
A continuación con referencia a la Figura 1A, las flechas blancas señalan las partículas de quitosano no disueltas después de reconstituir las tortas de quitosano liofilizadas con PRP mediante el uso de un procedimiento de remolino (1A1) y por medio de la mezcla de con perlas de acero inoxidable (1A2). La dispersión de quitosano en los coágulos híbridos de PRP no fue homogénea para ninguna de las formulaciones (1A3 y 1A4 representan los resultados de la formulación Núm. 4). El rectángulo en 1A3 se sometió a una gran ampliación que dio lugar a 1A4 y muestra los agregados de quitosano. Formulación Núm. 4: 0,56% (p/v) CS 80,6% de DdA Mw380 kDa con 7% (p/v) de trehalosa y 45 mM de CaCh.
A continuación con referencia a la Figura 1B, la expresión de líquido de los coágulos híbridos (formulaciones Núms.
2, 3, 4, 5, 6) fue menor que para el PRP solo (1B1). El implante de quitosano/PRP liofilizado (formulación Núm. 3) se detectó en la parte superior de los agujeros de microperforación 10 días después del tratamiento en un modelo de reparación de cartílago de conejo (1B2). Formulación Núm. 2: 0,67% (p/v) CS 80,6% de DDA Mw341 kDa con 201 mM de NaCl activado después de la reconstitución con CaCh líquido; Formulación Núm. 3: 0,56% (p/v) CS 80,6% de DDA Mw 389 kDa con 6,3% (p/v) de sacarosa y 45 mM de CaCh; Formulación Núm. 4: 0,56% (p/v) CS 80,6% de DDA Mw 380 kDa con 7% (p/v) de trehalosa y 45 mM de CaCh; Formulación Núm. 5: 0,56% (p/v) CS 80,6% de DDA Mw400 kDa con 5,2% (p/v) de sacarosa, 45 mM de CaCh y 33 mM de histidina; Formulación Núm. 6: 0,56% (p/v) CS 80,6% de DDA Mw391 kDa con 5,8% (p/v) de trehalosa, 45 mM de CaCh y 33 mM de histidina.
A continuación con referencia a la Figura 2A, se representan las tortas de quitosano liofilizadas obtenidas con la formulación Núm. 1 (2A1) y la formulación Núm. 14 (2A2). La dispersión de quitosano en los coágulos híbridos no fue homogénea para ninguna de las formulaciones (2A3 y 2A4 muestran la formulación Núm. 1). El rectángulo en 2A3 se sometió a una gran ampliación que dio como resultado 2A4, que muestra la presencia de quitosano, mientras que la región por encima del rectángulo en 2A3 no. Formulación Núm. 1: 0,56% (p/v) CS 80,6% de DDA Mn 151 kDa con 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 14: 0,56% (p/v) CS 80,6% de d Da Mn 148 kDa con 10% (p/v) de trehalosa y 42,2 mM de CaCh.
A continuación con referencia a la Figura 2B, la coagulación de los híbridos de quitosano/PRP liofilizados fue normal en presencia de un lioprotector del 2% (p/v) (Formulación Núm. 10 mostrada en 2B1) pero fue inhibida en presencia de un lioprotector del 8% (p/v) o del 10% (p/v) (Formulaciones Núm. 13 y 14 mostradas en 2B2 y 2B3 respectivamente). Formulación Núm. 10: 0,56% (p/v) CS 80,6% de DDA Mn 162 kDa con 2% (p/v) de trehalosa y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 13: 0,56% (p/v) CS 80,6% de DDA con 8% (p/v) de trehalosa y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 14: 0,56% (p/v) CS 80,6% de DDA Mn 148 kDa con 10% (p/v) de trehalosa y 42,2 mM de CaCl2.
A continuación con referencia a las Figuras 3A y 3B, los agregados de quitosano no se dispersaron en los coágulos híbridos liofilizados preparados en tubos de vidrio (Formulaciones Núms. 1 y 2 mostradas en 3A1 y 3A2 respectivamente) ni en los defectos meniscales (Formulaciones Núms. 1 y 2 mostradas en 3B1 y 3B2 respectivamente). Los coágulos híbridos preparados con soluciones líquidas eran homogéneos tanto si se preparaban en tubos de vidrio (formulaciones líquidas Núm. 3 y 4 mostradas en 3A3 y 3A4 respectivamente) como en defectos meniscales (formulaciones líquidas Núm. 3 y 4 mostradas en 3B3 y 3B4 respectivamente). Las líneas blancas discontinuas en 3A1 a 3A4 representan el borde inferior de los coágulos híbridos en tubos de vidrio. Las líneas blancas discontinuas en 3B1 a 3B4 representan los bordes de los defectos meniscales. El trazador de rodamina-quitosano aparece blanco bajo epifluorescencia. Formulación Núm. 1: 0,56% (p/v) CS 80,6% de DDA Mn 159 kDa con 130 mM de NaCl y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 2: 0,56% (p/v) CS 80,6% de DDA Mn 162 kDa con 2% (p/v) de trehalosa y 42,2 mM de CaCh; Formulación líquida Núm. 3: 0,56% (p/v) CS 80,6% de DDA Mn 163 kDa con 42 mM de NaCl y 45 mM de CaCh después de la mezcla con PRP; Formulación líquida Núm. 4: 0,56% (p/v) de CS 80,6% de DDA Mn 145 kDa con 2% (p/v) de trehalosa y 45 mM de CaCh después de la mezcla con PRP.
A continuación con referencia a la Figura 4A, se obtuvieron tortas de quitosano liofilizadas con la formulación Núm. 6 (4A1) y la formulación Núm. 10 (4A2). Formulación Núm. 6: 0,56% (p/v) CS 80,6% de DDA Mn 183 kDa con 6% (p/v) de trehalosa, 3,8 mM de histidina y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 10: 0,56% (p/v) CS 80,6% de DDA Mn 167 kDa con 6% (p/v) de manitol, 3,8 mM de histidina y 42,2 mM de CaCh;
A continuación con referencia a la Figura 4B, la dispersión de quitosano en los coágulos híbridos fue homogénea cuando se utilizó quitosano de Mn medio para preparar las tortas liofilizadas (Formulación Núm. 18 con CS 82,5% de DDA Mn 38 kDa mostrado en 4B3 y 4B4), pero no cuando se utilizó quitosano de alto Mn (Formulación Núm. 3 con CS 80,6% de DDA Mn 131 kDa mostrado en 4B1 y 4B2) o de bajo Mn (Formulación Núm. 23 con CS 84,4% de DDA Mn 11 kDa mostrado en 4B5 y 4B6). El trazador de rodamina-quitosano aparece blanco bajo epifluorescencia en las Figuras. Formulación Núm. 3: 0,56% (p/v) CS 80,6% de DDA Mn 131 kDa con 2% (p/v) de trehalosa y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 18: 0,56% (p/v) CS 82,5% de DDA Mn 38 kDa con 2% (p/v) de manitol, 3,8 mM de histidina y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 23: 0,56% (p/v) CS 84,4% de DDA Mn 11 kDa con 2% (p/v) de trehalosa y 42,2 mM de CaCl2.
A continuación con referencia a la Figura 5A, el aumento de la concentración de quitosano del 0,56% (p/v) al 1% (p/v) o del Mn de quitosano de 32 kDa a 56 kDa mejoró las propiedades pastosas de las formulaciones liofilizadas de acuerdo con una prueba de fluidez en una placa de plástico inclinada (compárense 5A1 con 5A2 y 5A1 con 5A3). Las flechas negras en 5A1 a 5A4 señalan la fluidez del PRP sin quitosano. Los óvalos negros de 5A1 a 5A4 señalan la fluidez de las diferentes formulaciones de quitosano-PRP.
A continuación con referencia a la Figura 5B, las formulaciones que contenían 0,56% (p/v) de quitosano Mn 32 kDa coagularon en forma de 1 fase de manera similar a los controles de sólo PRP (5B1). El aumento del Mn de quitosano o de su concentración indujo un mecanismo de coagulación de dos fases, como revelan los trazados de TEG (5B2 a 5B4). Formulación Núm. 1: 0,56% (p/v) CS 81,2% de DDA Mn 32 kDa con 2% (p/v) de trehalosa y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 2: 0,56% (p/v) CS 81,2% de DDA Mn 32 kDa con 6% (p/v) de trehalosa y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 3: 0,56% (p/v) CS 81,2% de DDA Mn 32 kDa con 2% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 4: 0,56% (p/v) Cs 81,2% de DDA Mn 32 kDa con 6% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 5: 1% (p/v) CS 81,2% de DDA Mn 32 kDa con 2% (p/v) de trehalosa y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 6: 1% (p/v) CS 81,2% de DDA Mn 32 kDa con 6% (p/v) de trehalosa y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm.7: 1% (p/v) CS 81,2% de DDA M„ 32 kDa con 2% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm.8: 1% (p/v) CS 81,2% de DDA Mn 32 kDa con 6% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 13: 0,56% (p/v) CS 80,1% de DDA Mn 56 kDa con 2% (p/v) de trehalosa y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 14: 0,56% (p/v) CS 80,1% de DDA Mn 56 kDa con 6% (p/v) de trehalosa y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 15: 0,56% (p/v) CS 80,1% de DDA Mn 56 kDa con 2% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 16: 0,56% (p/v) CS 80,1% de DDA Mn 56 kDa con 6% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm.17: 1% (p/v) CS 80,1% de DDA Mn 56 kDa con 2% (p/v) de trehalosa y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm.18: 1% (p/v) CS 80,1% de DDA Mn 56 kDa con 6% (p/v) de trehalosa y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 19: 1% (p/v) CS 80,1% de DDA Mn 56 kDa con 2% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 20: 1% (p/v) Cs 80,1% de DDA Mn 56 kDa con 6% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh.
A continuación con referencia a la Figura 6A, se obtuvieron tortas de quitosano liofilizadas con la formulación Núm. 9 (6A1) y la formulación Núm. 11 (6A2). Se comprobó que la dispersión de quitosano en los coágulos híbridos era mayoritariamente homogénea tanto si se utilizaba quitosano Mn 28 kDa (6A3) como quitosano Mn 56 kDa (6A4) (Formulaciones Núm. 12 y Núm. 16 mostradas en 6A3 y 6A4 respectivamente). Formulación Núm. 9: 1% (p/v) CS 80,5% de DDA Mn 28 kDa con 2% (p/v) de trehalosa y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 11: 1% (p/v) c S 80,5% de DDA Mn 28 kDa con 2% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 12: 1% (p/v) c S 80,5% de DDA Mn 28 kDa con 6% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 16: 1% (p/v) CS 81,8% de DDA Mn 56 kDa con 6% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh.
A continuación con referencia a la Figura 6B, los trazados de TEG mostraron un mecanismo de coagulación de 2 fases (6B1 y 6B2). La expresión de líquido de los coágulos híbridos fue mayoritariamente ausente (0% de expresión de líquido) con quitosano/PRP liofilizado frente a un 80% de pérdida de volumen con PRP solo (6B3). Formulación Núm. 9: 1% (p/v) CS 80,5% de DDA Mn 28 kDa con 2% (p/v) de trehalosa y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm.
10: 1% (p/v) Cs 80,5% de DDA Mn 28 kDa con 6% (p/v) de trehalosa y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 11: 1% (p/v) CS 80,5% de DDA Mn 28 kDa con 2% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 12: 1% (p/v) CS 80,5% de DDA Mn 28 kDa con 6% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 13: 1% (p/v) c S 80,1% de DDA Mn 56 kDa con 2% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 14: 1% (p/v) CS 80,1% de DDA Mn 56 kDa con 6% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 15: 1% (p/v) c S 81,8% de DDA Mn 56 kDa con 2% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 16: 1% (p/v) CS 81,8% de DDA Mn 56 kDa con 6% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh.
A continuación con referencia a la Figura 6C, todas las formulaciones (Núms. 1 a 16) eran pastosas en comparación con el PRP (Formulaciones Núms. 9 a 16 mostradas en 6C1). Las flechas negras en 6C1 señalan la fluidez del PRP sin quitosano. Los óvalos negros en 6C1 señalan la fluidez de diferentes formulaciones de quitosano-PRP. Los coágulos híbridos se administraron ex vivo en los defectos de cartílago creados en las articulaciones de los cerdos mediante el uso de una jeringa equipada con una aguja de calibre 20, donde se solidificaron (las formulaciones Núms. 9, 10, 11, 12, 15 y 16 mostradas en 6C2). Formulación Núm. 9: 1% (p/v) CS 80,5% de d Da Mn 28 kDa con 2% (p/v) de trehalosa y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 10: 1% (p/v) CS 80,5% de DDA Mn 28 kDa con 6% (p/v) de trehalosa y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 11: 1% (p/v) CS 80,5% de DDA Mn 28 kDa con 2% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 12: 1% (p/v) Cs 80,5% de DDA Mn 28 kDa con 6% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 13: 1% (p/v) c S 80,1% de DDA Mn 56 kDa con 2% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 14: 1% (p/v) CS 80,1% de DDA Mn 56 kDa con 6% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 15: 1% (p/v) CS 81,8% de DDA Mn 56 kDa con 2% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 16: 1% (p/v) Cs 81,8% de DDA Mn56 kDa con 6% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh.
A continuación con referencia a la Figura 6D, los coágulos híbridos que contenían un 2% (p/v) de lioprotector (Formulación Núm. 3 mostrada en 6D1 y 6D2) tenían una mayor resistencia mecánica en comparación con los coágulos híbridos preparados con un 6% (p/v) de lioprotector (Formulación Núm. 4 mostrada en 6D3 y 6D4). Formulación Núm. 3: 1% (p/v) CS 81,2% de DDA Mn 32 kDa con 2% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 4: 1% (p/v) CS 81,2% de DDA Mn 32 kDa con 6% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh. A continuación con referencia a la Figura 7A, se prepararon coágulos híbridos sin la ayuda de perlas de acero inoxidable (7A1 a 7A4) y mezclándolos con tres perlas de acero inoxidable de 0,39 g (7A5 a 7A8). Formulación Núm.
15: 0,56% (p/v) CS 80,6% de DDA Mn 41 kDa con 2% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 19: 1% (p/v) c S Núm. 80,6% de DDA Mn 41 kDa con 2% (p/v) manitol y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 23: 0,56% (p/v) CS 80,6% de DDA Mn 89 kDa con 2% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 27: 1% (p/v) CS 80,6% de DDA Mn 108 kDa con 2% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh.
A continuación con referencia a la Figura 7B, los resultados de la prueba de aplastamiento, el % de expresión de líquidos, la fluidez y la amplitud máxima para las formulaciones reconstituidas sin y con perlas de acero y para el control de PRP de 2 donantes diferentes se representan en la 7B. Formulación Núm. 15: 0,56% (p/v) CS 80,6% de DDA Mn 41 kDa con 2% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 19: 1% (p/v) CS Núm. 80,6% de DDA Mn 41 kDa con 2% (p/v) manitol y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 23: 0,56% (p/v) CS 80,6% de DDA Mn 89 kDa con 2% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 27: 1% (p/v) CS 80,6% de DDA Mn 108 kDa con 2% (p/v) de manitol y 42,2 mM de CaCh.
A continuación con referencia a la Figura 7C, los implantes subcutáneos de quitosano/PRP liofilizados inyectados en la espalda de conejos NZW mostraron quimiotaxis de leucocitos hacia los implantes al día (7C1, 7C2, 7C3 y 7C4) post-inyección. Los controles con sólo PRP atrajeron muchos menos leucocitos a 1 día (7C5 y 7C6) después de la inyección. Formulación Núm. 13: 0,56% (p/v) CS 80,6% de DDA Mn 41 kDa con 2% (p/v) de trehalosa y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 14: 0,56% (p/v) CS 80,6% de DDA Mn 41 kDa con 6% (p/v) de trehalosa y 42,2 mM de CaCl2.
A continuación con referencia a la Figura 7D, los implantes subcutáneos de quitosano/PRP liofilizados inyectados en la espalda de conejos NZW mostraron quimiotaxis de leucocitos hacia los implantes a los 3 días (7D1, 7D2, 7D3 y 7D4) post-inyección. Los controles con sólo PRP atrajeron muchos menos leucocitos a los 3 días (7D5 y 7D6) después de la inyección. Formulación Núm. 13: 0,56% (p/v) CS 80,6% de DDA Mn 41 kDa con 2% (p/v) de trehalosa y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 14: 0,56% (p/v) CS 80,6% de DDA Mn 41 kDa con 6% (p/v) de trehalosa y 42,2 mM de CaCl2.
A continuación con referencia a la Figura 7E, los híbridos de quitosano/PRP liofilizados se retuvieron in vivo durante al menos 14 días post-implantación (7E1, 7E2 y 7E3) mientras que los controles de PRP recalcificados están presentes sólo hasta 3 días post-implantación (7E4 muestra el control de PRP en el día 1). Formulación Núm. 13: 0,56% (p/v) CS 80,6% de d Da Mn 41 kDa con 2% (p/v) de trehalosa y 42,2 mM de CaCh; Formulación Núm. 14: 0,56% (p/v) CS 80,6% de DDA Mn 41 kDa con 6% (p/v) de trehalosa y 42,2 mM de CaCh.
A continuación con referencia a la Figura 8A, se obtuvieron tortas de quitosano liofilizado con CS Mn 43 kDa y 85 % de DDA (8A1) y CS Mn 36 kDa y 80 % de DDA (8A2) con una concentración de CS del 1% (p/v) y una concentración de trehalosa del 1% (p/v). Las tortas de quitosano liofilizado eran completamente solubles cuando se mezclaban (8A3 y 8A4).
A continuación con referencia a la Figura 8B, los híbridos de quitosano/PRP no expresaron ningún líquido, mientras que los controles de sólo PRP expresaron más del 80% de su peso en suero (8B1, 8B2, 8B3y 8B4).
A continuación con referencia a la Figura 8C, los híbridos de quitosano/PRP tuvieron una disminución del tiempo de reacción del coágulo y de la amplitud máxima del coágulo, medidos por tromboelastografía (8C1 y 8C2). La dispersión del CS en los coágulos híbridos fue homogénea (8C3 y 8C4).
A continuación con referencia a la Figura 8D, se crearon defectos quirúrgicos en la porción anterior del menisco medial en ovejas mediante el uso de una hoja de bisturí (8D1). Los defectos se alargaron hasta una longitud de 10 mm (8D2). Los defectos se rasparon (8D3). Los defectos se operaron sin apretar y se colocaron previamente agujas de calibre 18 para crear canales de trepanación desde la periferia del menisco hasta el desgarro (8D4 y 8D5). Los híbridos de quitosano/PRP se entregaron al desgarro del menisco a través de los canales de trepanación (8D6). A continuación con referencia a la Figura 8E, los híbridos de quitosano/PRP residieron en las lágrimas durante al menos 24 horas después de la cirugía (8E1 y 8E2). A los 21 días, en el postoperatorio, los bordes de los desgarros de menisco tratados con híbridos de quitosano/PRP estaban bien apuestos (8E3 y 8E4).
A continuación con referencia a la Figura 9A, se crearon defectos de sólo cartílago de 4 mm X 4 mm en la tróclea de conejos NZW (9A1). Se cerraron las rodillas y se dejó que los defectos se desarrollaran hasta el estado crónico durante 1 mes (9A2). Los defectos se desbridaron y se perforaron 4 agujeros de microperforación de 0,9 mm de diámetro a través del hueso subcondral a una profundidad de ~ 4 mm. Se trató una rodilla por medio de la inyección del implante de Quitosano/PRP (CS Mn 40 kDa y 80% de DDA con una concentración de CS del 1% (p/v) y una concentración de trehalosa del 2% (p/v)) sobre el defecto microperforado (9A4). La rodilla contralateral se trató por medio de la inyección de PRP recalcificado como control sobre el defecto microperforado (9A3).
A continuación con referencia a la Figura 9B, se llevó a cabo la evaluación del aspecto macroscópico de los defectos (9B1 y 9B2) y la evaluación histológica (9B3 y 9B4) después de 21 días de curación. Los cuadrados negros discontinuos en 9B1 y 9B2 muestran los bordes del defecto de cartílago crónico.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
En una realización preferente, en un procedimiento, el quitosano a temperatura ambiente se pesó en tubos Falcon de 15 mL y se añadió ddH2O y HCl 1N a cada tubo. La concentración de quitosano osciló entre el 0,42% y el 2% (p/v). La concentración de HCl osciló entre 12 y 57 mM. Los tubos se colocaron en un rotador y se agitaron durante toda la noche a temperatura ambiente para garantizar una disolución completa.
Se utilizaron dos procedimientos de esterilización para la esterilización de la solución de quitosano: 1) Autoclave durante 10 minutos para quitosano Mn > 100 kDa o 2) Filtración para quitosano Mn< 100 kDa.
Bajo una campana de flujo laminar, se añadió CaCl2270 mM esterilizado por filtro a la solución de quitosano hasta una concentración final de 45 mM o de 42,2 mM. Se añadieron trehalosa y manitol al 15% (p/v) esterilizados por filtro o sacarosa y trehalosa al 20% (p/v) esterilizados en autoclave, lo que dio lugar a una concentración de lioprotector que osciló entre el 0 y el 10% (p/v). Se añadió NaCl 5 M en autoclave de acuerdo con lo necesario para conseguir una concentración final entre 130 y 201 mM. Se añadió histidina esterilizada por filtro de acuerdo con lo necesario para alcanzar una concentración final de 3,8, 33 o 39 mM. Se añadió un trazador de rodamina-quitosano esterilizado por filtro en una proporción final del 0,01% (vol de trazador/vol de solución) para la obtención de imágenes.
Después de mezclar bien con un vórtex hasta conseguir una solución homogénea, se distribuyeron alícuotas de 1 mL en viales de vidrio de 3 mL o 10 mL para la liofilización mediante el uso de una membrana en la parte superior de los viales para mantener la esterilidad. Alternativamente, se distribuyeron alícuotas más pequeñas de 30o pL en viales de vidrio de 2 mL para su liofilización. El ciclo de liofilización consistió en: 1) Congelación en rampa a -40 °C en 1 hora y luego isoterma 2 horas a -40 °C, 2) -40 °C durante 48 horas y 3) Calentamiento en rampa a 30 °C en 12 horas y luego isoterma 6 horas a 30 °C, a 300 o 100 militorrs. Las tortas se evaluaron visualmente después de la liofilización. De acuerdo con el Criterio 1 anterior, las tortas liofilizadas deben ser homogéneas, sólidas y presentar buenas propiedades mecánicas para su almacenamiento y envío.
Se recolectó sangre entera anticoagulada de donantes de conejo, oveja y humanos y se colocó en tubos Vacutainer. El anticoagulante fue el citrato dextroso ácido (13 mM de citrato trisódico dihidratado; 7 mM de ácido cítrico; 24 mM de dextrosa en sangre) o el citrato de sodio (12,9 mM de citrato trisódico dihidratado en sangre).
Los tubos Vacutainer que contenían sangre entera anticoagulada se centrifugaron en una centrífuga ACE E-Z PRP™ a 160 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se recolectó junto con los primeros 2 mm aproximadamente de eritrocitos y se centrifugó de nuevo a 400 g durante 10 minutos a temperatura ambiente a fin de separar el plasma rico en plaquetas (1,5 mL del fondo del tubo, clasificado como Leucocito-PRP, que también contiene una fracción de eritrocitos) y el plasma pobre en plaquetas (plasma claro).
Para probar la reconstitución de las tortas y la solubilización del quitosano, se pipeteó 1 mL de PRP o PPP (preferente para la evaluación visual porque es claro frente al PRP que contiene eritrocitos) en cada vial que contenía las tortas liofilizadas. La mezcla se efectuó por remolino o por agitación vigorosa durante 10 segundos en presencia o ausencia de tres bolas de acero inoxidable de 0,39 g. Se registró la facilidad de solubilización de las tortas. De acuerdo con el Criterio 2 anterior, las tortas se deben reconstituir rápida y fácilmente en PRP, PPP, sangre o agua, de acuerdo con lo necesario. También se registraron el pH y la osmolalidad de las mezclas reconstituidas para determinar si se acercan a las fisiológicas. De acuerdo con el Criterio 8 anterior, las mezclas reconstituidas deben tener propiedades cercanas a las fisiológicas para la implantación in vivo o las inyecciones intraarticulares
Para probar el rendimiento de las tortas, se pipeteó 1 mL de PRP en cada vial que contenía la torta liofilizada. La mezcla se efectuó por remolino o por agitación vigorosa durante 10 segundos en presencia o ausencia de tres bolas de acero inoxidable de 0,39 g.
Las propiedades de coagulación se midieron por medio de la carga de 360 pl de cada formulación en un vaso de TEG inmediatamente después de la reconstitución y el registro de los trazados de TEG durante 1 hora. De acuerdo con el Criterio 3 anterior, la coagulación no se debe inhibir cuando se requiera la gelificación in situ.
Las propiedades mecánicas de las formulaciones se evaluaron con una prueba de aplastamiento manual. Tras una hora de coagulación, cada coágulo híbrido se sometió a un aplastamiento manual y se calificó su resistencia mecánica en una escala de 0 (débil) a 4+ (fuerte). De acuerdo con el Criterio 4 anterior, los implantes híbridos de quitosano/PRP deben ser mecánicamente estables para soportar la carga en los lugares de implantación.
La retención del volumen del coágulo híbrido se evaluó por medio de la dispensación de las formulaciones reconstituidas en tubos de vidrio a 37 °C. Después de 60 minutos, se cuantificó la expresión de líquidos de los coágulos híbridos por medio de la medición del peso. De acuerdo con el Criterio 5 anterior, los implantes híbridos de quitosano/PRP deben ser capaces de rellenar los defectos del tejido sin sufrir una retracción mediada por las plaquetas.
La dispersión del quitosano frente a la agregación en los coágulos híbridos se evaluó por medio de histología. Por ejemplo, los coágulos híbridos que contenían el trazador de rodamina-quitosano se fijaron en Formalina Neutral Tamponada (NBF) al 10% y se observaron secciones gruesas de hoja de afeitar con microscopía de epifluorescencia. Los coágulos híbridos se fijaron en NBF (formalina neutral tamponada) al 10% y se recolectaron secciones de parafina de 5 pm para la tinción con Safranin O/Fast Green. De acuerdo con el Criterio 6 anterior, se debe lograr una buena mezcla sin separación de fases del polímero y los componentes sanguíneos para garantizar una óptima respuesta in vivo y una biodegradabilidad oportuna.
Las propiedades pastosas de las formulaciones se evaluaron con una prueba de fluidez. La fluidez se evaluó por medio de la colocación de una gota de 30 pl de cada formulación en un trozo de plástico rígido fijado en un ángulo determinado (38 grados) inmediatamente después de la reconstitución y la toma de fotografías en momentos determinados. De acuerdo con el Criterio 7 anterior, las mezclas deben tener propiedades de manipulación apropiadas que serían viscosas y pastosas para aplicaciones de reparación de tejidos o una suspensión viscosa en el caso de la viscosuplementación intraarticular.
Las propiedades de manipulación de las formulaciones se probaron ex vivo en un modelo de defecto meniscal. Por ejemplo, se utilizó una cuchilla de afeitar recta para tomar secciones transversales de ~0,5 mm del menisco del cerdo y se creó un colgajo horizontal hacia la superficie femoral (superior) del menisco. Se utilizó un punzón de biopsia de 4 mm para crear un defecto de espesor parcial hacia la superficie tibial (inferior) del menisco. Los meniscos se envolvieron en una película de plástico húmeda y se colocaron a 37 °C durante al menos 30 minutos antes del inicio del experimento. Se inyectaron formulaciones de quitosano liofilizadas reconstituidas con PRP en los defectos de menisco de espesor parcial mediante el uso de una jeringa provista de una aguja de calibre 20 y se cerró el colgajo inmediatamente. Los meniscos se volvieron a envolver inmediatamente y se sellaron con una película de plástico húmeda y se colocaron a 37 °C durante 1 hora. Los meniscos se fijaron en NBF al 10% y se observaron secciones gruesas de hoja de afeitar con microscopía de epifluorescencia. Las secciones de parafina se tiñeron con Safranin O/Fast Green.
Las propiedades de manipulación de las formulaciones se probaron ex vivo en un modelo de defecto de cartílago. Se utilizaron punzones de biopsia (8 mm de diámetro) y cuchillas quirúrgicas planas para crear defectos de cartílago en los cóndilos y la tróclea de los cerdos. Las articulaciones se colocaron en una cámara húmeda a 37 °C durante al menos 30 minutos antes del inicio del experimento. Las fórmulas de quitosano liofilizadas y reconstituidas en PRP se inyectaron en los defectos de cartílago con una jeringa y una aguja de calibre 20. Las juntas se sellaron inmediatamente en la cámara húmeda y se colocaron a 37 °C durante 1 hora. A continuación, se inspeccionaron las articulaciones para determinar si se producía la coagulación in situ.
En otra realización, para probar el aclaramiento in vivo de las formulaciones liofilizadas, se crearon defectos condrales de 3,5 mm X 4,5 mm bilateralmente en la tróclea de dos conejos NZW de 19 meses de edad. Se perforaron cuatro agujeros de microperforación a través del hueso subcondral con una broca de 0,9 mm a una profundidad de unos 4 mm. Se preparó PRP autólogo a partir de sangre de conejo extraída inmediatamente antes de la cirugía. Tras la creación del defecto, la torta de quitosano liofilizada se reconstituyó con 1 mL de PRP mediante el uso del procedimiento de mezcla de perlas y el implante (1 gota colgante) se entregó sobre el sitio del defecto y se dejó solidificar in situ durante ~5 min antes de cerrar la rodilla. En la rodilla contralateral, el quitosano liofilizado se mezcló con 1 mL de sangre fresca recolectada inmediatamente antes de su reconstitución y entrega. La residencia del implante se evaluó a los 10 días y a los 21 días.
En otra realización, se utilizó un segundo modelo de conejo que permitía el ensayo simultáneo de varias formulaciones diferentes de quitosano para probar la biodegradabilidad in vivo. Se preparó PRP autólogo a partir de sangre de conejo extraída inmediatamente antes de la cirugía. Cada torta liofilizada se reconstituyó en 300 pL de PRP sin ayuda de la mezcla de perlas y se inyectó por vía subcutánea en la espalda de los conejos mediante el uso de una jeringa provista de una aguja SubQ. Los controles fueron PRP recalcificados sin quitosano. La residencia del implante y el reclutamiento celular se evaluaron a los 1, 3, 7 y 14 días después de la inyección.
En otra realización, se utilizó un modelo de reparación de menisco de oveja para probar la retención del implante híbrido y el efecto de los implantes en la reparación del tejido meniscal. Se inyectaron implantes híbridos de quitosano liofilizado, un activador de coágulos, un lioprotector y PRP autólogo en defectos de menisco creados quirúrgicamente. La retención del implante se evaluó a 1 día y la reparación del tejido se evaluó a los 21 días de la intervención.
En otra realización, se desarrolló un modelo de reparación crónica del cartílago en el conejo y se utilizó para probar el efecto de los implantes híbridos de reparación osteocondral. Se crearon defectos quirúrgicos en la tróclea de los conejos NZW y se dejó que progresaran hasta la fase crónica. Los defectos de cartílago se trataron con implantes híbridos compuestos por quitosano liofilizado, un activador de coágulos, un lioprotector y PRP autólogo. La cicatrización se evaluó a los 21 días del postoperatorio.
EJEMPLO 1
I-Preparación de formulaciones de quitosano
Formulaciones sin lioprotectores ni tampón: Peso molecular promedio del quitosano Mw 500 kDa, medido por GPC como se describe en [Nguyen, S., F.M. Winnik, y M.D. Buschmann, Improved reproducibility in the determination of the molecular weight of chitosan by analytical size exclusion chromatography. Carbohydrate Polymers, 2009. 75(3): págs. 528 a 533], y el 80,6% de d Da se disolvió en HCl durante la noche a temperatura ambiente para obtener una concentración final de quitosano del 0,56% o del 0,67% (p/v). Las soluciones se esterilizaron en autoclave durante 10 minutos y se enfriaron en hielo. El Mw del quitosano después del autoclave estaba entre 319 y 403 kDa. Se añadió NaCl 5M esterilizado en autoclave y CaCh 270 mM esterilizado por filtro, de acuerdo con lo necesario, antes de dispensar en viales individuales de 10 mL para la liofilización.
Formulaciones con lioprotectores y tampón: El quitosano (Mw 500 kDa, 80,6% de DDA) se disolvió en HCl durante una noche a temperatura ambiente para obtener una concentración final de quitosano de 0,56% o 0,67% (p/v). Se añadió sacarosa al 20% (p/v) o trehalosa al 20% (p/v) en autoclave, de acuerdo con lo necesario. Las soluciones se esterilizaron en autoclave durante 10 minutos y se enfriaron en hielo. El Mw del quitosano después del autoclave estaba entre 342 y 421 kDa. Se añadió CaCh 270 mM esterilizado por filtro y L-histidina 200 mM de reserva, de acuerdo con lo necesario, antes de dispensar en viales individuales de 10 mL para su liofilización.
De acuerdo con las Tablas 1 y 2, se ajustó la concentración de HCl para que todas las formulaciones tuvieran un pH teórico de 6,6. La concentración del tampón de histidina se ajustó para que coincidiera con el contenido global de monómero en las tortas. Las concentraciones de lioprotectores se ajustaron para que todas las formulaciones tuvieran una osmolalidad teórica de 350 mOsm.
2-Ciclo de liofílización
El ciclo de liofilización consistió en: 1) Congelación en rampa a -40 °C en 1 hora y luego isoterma 2 horas a -40 °C, 2) -40 °C durante 48 horas y 3) Calentamiento en rampa a 30 °C en 12 horas y luego isoterma 6 horas a 30 °C, a 300 militorrs.
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_ _
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___ _ _ -Aspecto de las tortas
El aspecto de las tortas se calificó en una escala de -(encogida, en forma de lámina o agrietada) a 3+ (forma sólida y voluminosa homogénea). Las tortas que obtuvieron una puntuación de 2+ o 3+ se consideraron aceptables.
Las formulaciones que contenían NaCl tenían superficies desiguales y la formulación Núm. 1 se encogió significativamente durante la liofilización. Las formulaciones que contenían tampón de histidina (33 a 39 mM) presentaban superficies agrietadas e irregulares.
Las formulaciones que contenían sacarosa o trehalosa con y sin CaCh tenían una superficie blanca y lisa y estaban ligeramente deprimidas en la parte superior. La presencia de un lioprotector ayuda a obtener tortas mecánicamente estables.
4- Aislamiento de PRP de conejo
Se extrajo sangre entera de conejos NZW y se mezcló con anticoagulante de citrato de ácido (ACD) (8,5 mL de sangre por 1,5 mL de ACD).
La sangre se centrifugó en una centrifugadora ACE E-Z PRP™ a 160 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las fracciones sobrenadantes que contienen plasma y la capa leucocitaria, así como los primeros 1 a 2 mm de la capa eritrocitaria, se extrajeron mediante el uso de una aguja roma de 2 A pulgadas (calibre 18) conectada a una jeringa de 10 mL.
El plasma y la capa leucocitaria se centrifugaron además a 400 g durante 10 minutos a temperatura ambiente a fin de separar el plasma rico en plaquetas (PRP) del plasma pobre en plaquetas (PPP).
5- Reconstitución de las tortas
Las tortas se reconstituyeron con 1 mL de PRP solamente (Formulaciones Núm. 3 a Núm. 6) o con 1 mL de PRP y luego se activaron con 200 pL de CaCh al 3% (p/v) (Formulaciones Núm. 2, Núm. 7 y Núm. 8).
Se probaron dos procedimientos de mezcla diferentes: Agitar el vial durante 10 segundos y aspirar-expulsar dos veces con una jeringa equipada con una aguja o mezclar con tres perlas de acero de 0,39 g durante 10 segundos. Se observaron partículas de quitosano no disueltas después de la reconstitución con los dos procedimientos de mezcla probados (Figuras 1A1 y 1A2).
6- Expresión de líquidos
Las formulaciones reconstituidas en PRP se dispensaron en tubos de vidrio a 37 °C. Después de 60 minutos, se cuantificó la expresión de líquidos y la pérdida de volumen de los coágulos híbridos por medio de la medición del peso.
Todas las formulaciones que se probaron coagularon. El activador del coágulo se puede añadir directamente a la torta liofilizada.
Todos los coágulos híbridos expresaron menos líquido que el PRP solo (Figura 1B1).
7- Homogeneidad de los coágulos
Los coágulos híbridos se fijaron en NBF al 10% y las secciones de parafina se tiñeron con Safranin O/Fast Green para evaluar la dispersión del quitosano en los coágulos.
Los agregados de quitosano no se dispersaron por los coágulos híbridos en ninguna de las formulaciones (Figuras 1A3 y 1A4).
8 Modelo de reparación de cartílago in vivo
Se probaron dos formulaciones (Núm. 3 y Núm. 4) in vivo en un modelo de reparación de cartílago de conejo.
Se crearon defectos condrales de 3,5 mm X 4,5 mm bilateralmente en la tróclea de dos conejos NZW de 19 meses. Se perforaron cuatro agujeros de microperforación a través del hueso subcondral con una broca de 0,9 mm hasta una profundidad de ~4 mm.
El PRP autólogo se preparó a partir de sangre de conejo extraída inmediatamente antes de la cirugía, como se describe en la sección 4- Aislamiento de PRP de conejo. Tras la creación del defecto, la torta de quitosano liofilizada se reconstituyó con 1 mL de PRP mediante el uso del procedimiento de mezcla de perlas y el implante (1 gota colgante) se entregó sobre el sitio del defecto y se dejó solidificar in situ durante ~5 min antes de cerrar la rodilla. En la rodilla contralateral, el quitosano liofilizado se mezcló con 1 mL de sangre fresca recolectada inmediatamente antes de su reconstitución y entrega.
A los 10 días del postoperatorio, se observaron implantes híbridos de quitosano/PRP liofilizados en la superficie de los agujeros de microperforación, junto con un infiltrado inflamatorio (Figura 1B2). Los implantes híbridos se liberaron a los 21 días del postoperatorio.
Tabla 3. Rendimiento de las 10 formulaciones diferentes.
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En el Ejemplo 1, se requieren lioprotectores para obtener tortas mecánicamente estables para el almacenamiento y el envío, pero la adición de tampón a las tortas induce el agrietamiento de la superficie. El activador de coágulos se puede añadir directamente a las tortas liofilizadas para inducir la coagulación de las mezclas de quitosano/PRP in situ. Sin embargo, las tortas liofilizadas preparadas con quitosano de alto peso molecular no se disolvieron fácil y completamente en el PRP. Los híbridos de quitosano/PRP liofilizados no indujeron una inflamación crónica tras su implantación en un modelo de defecto condral agudo de conejo y se eliminaron a los 21 días in vivo.
EJEMPLO 2
1- Preparación de formulaciones de quitosano
Peso molecular promedio del quitosano Mn 211 kDa, medido por GPC como se describe en [Nguyen, S., F.M. Winnik, y M.D. Buschmann, Improved reproducibility in the determination of the molecular weight of chitosan by analytical size exclusion chromatography. Carbohydrate Polymers, 2009. 75(3): págs. 528 a 533] y el 80,6% de DDA se disolvió en HCl durante la noche a temperatura ambiente para obtener una concentración final de quitosano del 0,56% o del 0,42% (p/v). Las soluciones se esterilizaron en autoclave durante 10 minutos y se enfriaron en hielo. El Mn del quitosano después del autoclave estaba entre 112 y 160 kDa. Se añadieron sacarosa al 20% (p/v) en autoclave, trehalosa al 20% (p/v) y NaCl 5M, así como CaCh 270 mM esterilizado por filtro, de acuerdo con lo necesario. Se añadió un trazador de rodamina-quitosano esterilizado por filtro (Mn 143 kDa, 80,0% de DDA) antes de dispensarlo en viales individuales de 10 mL para su liofilización.
De acuerdo con la Tabla 4, se ajustó la concentración de HCl de forma que todas las formulaciones tuvieran un pH objetivo teórico de 6,45. La concentración de NaCl se ajustó de forma que todas las formulaciones tuvieran una osmolalidad teórica de 350 mOsm. La concentración de lioprotector se ajustó entre el 1 y el 10% (p/v).
2- Ciclo de liofilización
El ciclo de liofilización consistió en: 1) Congelación en rampa a -40 °C en 1 hora y luego isoterma 2 horas a -40 °C, 2) -40 °C durante 48 horas y 3) Calentamiento en rampa a 30 °C en 12 horas y luego isoterma 6 horas a 30 °C, a 100 militorrs.
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_ ___ _ ____ ____ ____ ____ ____ ____ _____ ____ 3- Aspecto de las tortas
Las formulaciones que contenían sólo quitosano tenían forma de lámina (Figura 2A1). Las formulaciones que contenían NaCl sólo se redujeron significativamente durante la liofilización.
Las formulaciones que contenían un 2% (p/v) o más de sacarosa o trehalosa eran más voluminosas, lo que confirma que se requieren lioprotectores para obtener coágulos mecánicamente estables. Las tortas eran más voluminosas cuando se utilizaban concentraciones crecientes de lioprotectores (Figura 2A2).
4- Aislamiento de PRP de oveja
Se extrajo sangre entera de ovejas cruzadas de Arcott y se mezcló con anticoagulante de citrato de ácido (ACD) (8,5 mL de sangre por 1,5 mL de ACD).
La sangre se centrifugó en una centrifugadora ACE E-Z PRP™ a 160 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las fracciones sobrenadantes que contienen plasma y la capa leucocitaria, así como los primeros 1 a 2 mm de la capa eritrocitaria, se extrajeron mediante el uso de una aguja roma de 2 A pulgadas (calibre 18) conectada a una jeringa de 10 mL.
El plasma y la capa leucocitaria se centrifugaron además a 400 g durante 10 minutos a temperatura ambiente a fin de separar el plasma rico en plaquetas (PRP) del plasma pobre en plaquetas (PPP).
5- Reconstitución de las tortas
Las tortas se reconstituyeron con 1 mL de PRP y se mezclaron con tres perlas de acero de 0,39 g durante 10 segundos. Se utilizaron dos donantes de ovejas diferentes para probar cada torta.
Se observaron partículas de quitosano no disueltas tras la reconstitución.
6- Tromboelastografía (TEG)
Se cargaron 360 pl de cada formulación en un vaso de TEG inmediatamente después de la mezcla y se registraron los trazados de t Eg durante 1 hora.
Las formulaciones que contenían sólo quitosano no coagularon de forma reproducible.
La coagulación fue inhibida para las formulaciones que contenían sólo NaCl.
Las formulaciones que contenían 2% (p/v) de sacarosa o trehalosa coagularon normalmente y tuvieron un tiempo de reacción del coágulo (R) que osciló entre 9 y 18 minutos y una amplitud máxima (MA) entre 55 y 75 mm (Figura 2B1).
La coagulación se inhibió en 3 de los 8 casos de formulaciones que contenían 8% (p/v) de sacarosa o trehalosa. En los otros 5 casos, se observó una disminución de la amplitud máxima (AM) entre 14 y 20 mm (Figura 2B2).
La coagulación se inhibió en 5 de los 8 casos de formulaciones que contenían 10% (p/v) de sacarosa o trehalosa (Figura 2B3). En los otros 3 casos, se observó una disminución de la amplitud máxima (AM) entre 9 y 24 mm.
6- Expresión de líquidos
Las formulaciones reconstituidas en PRP se dispensaron en tubos de vidrio a 37 °C. Después de 60 minutos, se cuantificó la expresión de líquidos y la pérdida de volumen de los coágulos híbridos por medio de la medición del peso.
Todos los coágulos híbridos probados expresaron menos líquido que el PRP solo.
7- Homogeneidad de los coágulos
Los coágulos híbridos se fijaron en NBF al 10% y se observaron secciones gruesas de hoja de afeitar con microscopía de epifluorescencia para evaluar la dispersión del quitosano en los coágulos.
Los agregados de quitosano no se dispersaron en los coágulos híbridos que contenían sacarosa o trehalosa (Figuras 2A3 y 2A4). La dispersión fue mejor en las formulaciones desprovistas de lioprotectores.
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En el Ejemplo 2, el aumento de las concentraciones de lioprotectores mejora la estabilidad mecánica de las tortas, pero también inhibe la coagulación de las mezclas de quitosano/PRP. Las tortas liofilizadas que contienen quitosano de alto peso molecular no se disuelven fácil y completamente en el PRP.
EJEMPLO 3
I-Preparación de formulaciones de quitosano
El quitosano (Mn 211 kDa, 80,6% de DDA) se disolvió en HCl durante la noche a temperatura ambiente para obtener una concentración final de quitosano del 0,56% (p/v). Las soluciones se esterilizaron en autoclave durante 10 minutos y se enfriaron en hielo. El Mn del quitosano después del autoclave fue de 151 y 162 kDa. Se añadió trehalosa al 20% (p/v) esterilizada en autoclave y NaCl 5m , así como CaCh 270 mM esterilizado por filtro, de acuerdo con lo necesario. Se añadió un trazador de rodamina-quitosano esterilizado por filtro (Mn 143 kDa, 80,0% de DDA) antes de dispensarlo en viales individuales de 10 mL para su liofilización.
De acuerdo con la Tabla 6, se ajustó la concentración de HCl de forma que todas las formulaciones tuvieran un pH objetivo teórico de 6,45. La concentración de NaCl se ajustó de forma que la formulación tuviera una osmolalidad teórica de 350 mOsm. La concentración de lioprotector se fijó en el 2% (p/v) para la formulación Núm. 2.
El ciclo de liofilización fue idéntico al descrito en el Ejemplo 2, Sección 2-Ciclo de liofilización.
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______ _ 2- Aislamiento de PRP humano
Se extrajo sangre entera de un donante humano y se mezcló con una solución de citrato de sodio al 3,8% (p/v) (9 mL de sangre por 1 mL de citrato de sodio).
La sangre se centrifugó en una centrifugadora ACE E-Z PRP™ a 160 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las fracciones sobrenadantes que contienen plasma y la capa leucocitaria, así como los primeros 1-2 mm de la capa eritrocitaria, se extrajeron mediante el uso de una aguja roma de 2 A pulgadas (calibre 18) conectada a una jeringa de 10 mL.
El plasma y la capa leucocitaria se centrifugaron además a 400 g durante 10 minutos a temperatura ambiente a fin de separar el plasma rico en plaquetas (PRP) del plasma pobre en plaquetas (PPP).
3- Aspecto de las tortas
La formulación que contiene NaCl sólo se encogió significativamente durante la liofilización.
La formulación que contenía 2% (p/v) de trehalosa era mecánicamente estable y cumplía los criterios de rendimiento 1.
4- Reconstitución de las tortas
Las tortas se reconstituyeron con 1 mL de PRP y se mezclaron con tres perlas de acero de 0,39 g durante 10 segundos.
Se observaron partículas de quitosano no disueltas tras la reconstitución.
5- Preparación y mezcla de formulaciones líquidas
También se prepararon formulaciones líquidas de quitosano para probarlas en paralelo con las formulaciones liofilizadas (Tabla 7). Las soluciones se esterilizaron en autoclave durante 10 minutos y se enfriaron en hielo. El Mn del quitosano después del autoclave fue de 145 y 163 kDa.
Se mezclaron 400 pl de formulación líquida de quitosano con 800 pl de PRP y se activó con 240 pl de CaCh al 3% (p/v).
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6- Homogeneidad de los coágulos
Las formulaciones liofilizadas reconstituidas y las formulaciones líquidas se dispensaron en tubos de vidrio a 37 °C y se dejaron coagular durante 1 hora.
Los coágulos híbridos se fijaron en NBF al 10% y se observaron secciones gruesas de hoja de afeitar con microscopía de epifluorescencia para evaluar la dispersión del quitosano en los coágulos.
Los agregados de quitosano no se dispersaron en los coágulos híbridos liofilizados (Figura 3A1 y 3A2).
El quitosano estaba bien disperso dentro de los coágulos híbridos preparados con soluciones líquidas (Figura 3A3 y 3A4).
7- Implantación ex vivo en defectos de menisco
Se utilizó una cuchilla de afeitar recta para tomar secciones transversales de ~0,5 mm del menisco del cerdo y se creó un colgajo horizontal hacia la superficie femoral (superior) del menisco.
Se utilizó un punzón de biopsia de 4 mm para crear un defecto de espesor parcial hacia la superficie tibial (inferior) del menisco.
Los meniscos se envolvieron en una película de plástico húmeda y se colocaron a 37 °C durante al menos 30 minutos antes del inicio del experimento.
Las formulaciones liofilizadas reconstituidas y las formulaciones líquidas se inyectaron en los defectos de menisco de espesor parcial mediante el uso de una jeringa provista de una aguja de calibre 20 y el colgajo se cerró inmediatamente.
Los meniscos se volvieron a envolver inmediatamente y se sellaron con una película de plástico húmeda y se colocaron a 37 °C durante 1 hora.
El quitosano/PRP liofilizado y las formulaciones líquidas se implantaron con éxito ex vivo en defectos meniscales donde coagularon in situ.
Se fijaron meniscos de cerdo en NBF al 10% y se observaron secciones gruesas de cuchilla con microscopía de epifluorescencia para evaluar la dispersión de quitosano en los coágulos.
El quitosano se agregaba y no se dispersaba por los defectos meniscales en las formulaciones liofilizadas (Figuras 3B1 y 3B2).
El quitosano estaba bien disperso dentro de los defectos meniscales para las formulaciones líquidas (Figuras 3B3 y 3B4).
Tabla 8. Rendimiento de las 2 formulaciones liofilizadas diferentes.
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En el Ejemplo 3, aunque las formulaciones líquidas de quitosano se pueden mezclar fácilmente con PRP, la reconstitución de las formulaciones de quitosano liofilizadas en PRP es mucho más difícil. Las tortas liofilizadas que contenían quitosano de alto peso molecular no se disolvían fácil y completamente en el PRP, pero aun así se podían implantar ex vivo en un modelo de defecto meniscal mediante el uso de un aparato de quirófano estándar.
EJEMPLO 4
I-Preparación de formulaciones de quitosano
Formulaciones con Quitosano Mn > 100 kDa: Los quitosanos (Mn 211 kDa, 80,6% de DDA y Mn 105 kDa, 81,2% de DDA) se disolvieron en HCl durante una noche a temperatura ambiente para obtener una concentración final de quitosano del 0,56% (p/v). Las soluciones se esterilizaron en autoclave durante 10 minutos y se enfriaron en hielo. Se añadieron trehalosa 15% (p/v) esterilizada por filtro, manitol 15% (p/v), CaCh 270 mM, tampón L-histidina 55 mM pH 6,5 (preparado por medio de la mezcla de 10 mL de L-histidina 0,017% p/v y 10 mL de HCl 30 mM) y NaCl 5M esterilizado en autoclave, de acuerdo con lo necesario. Se añadió un trazador de rodamina-quitosano esterilizado por filtro (Mn 110 kDa, 80,2% de DDA) antes de dispensarlo en viales individuales de 3 mL para su liofilización. Formulaciones con Quitosano Mn< 100 kDa: Los quitosanos (Mn 38 kDa, 82,5% de DDA, Mn 11 kDa, 84,4% de DDA y Mn 4 kDa, 80,2% de DDA) se disolvieron en HCl durante la noche a temperatura ambiente para obtener una concentración final de quitosano del 0,56% (p/v). Las soluciones se filtraron y esterilizaron. Se añadieron trehalosa 15% (p/v) esterilizada por filtro, manitol 15% (p/v), CaCh 270 mM, NaCl 5M y tampón de histidina 55 mM pH 6,5 (preparado por medio de la mezcla de 10 mL de L-histidina 0,017% p/v y 10 mL de HCl 30 mM), de acuerdo con lo necesario. Se añadió el trazador de rodamina-quitosano esterilizado por filtro (Mn 40 kDa, 80,0% de DDA o Mn 10 kDa, 81,9% de DDA) antes de dispensarlo en viales individuales de 3 mL para su liofilización.
De acuerdo con la Tabla 9, la concentración de HCl se ajustó para que todas las formulaciones tuvieran una relación HCl: glucosamina de 0,6. La concentración de NaCl se ajustó de forma que la formulación tuviera una osmolalidad teórica de 350 mOsm. Se eligió una concentración más baja de histidina (3,8 mM frente a los 33 a 39 mM de los ejemplos anteriores) para evitar el agrietamiento de las tortas. La concentración de lioprotector se fijó en un 2% o 6% (p/v) suficiente para proporcionar una torta estable pero sin impedir la coagulación.
El ciclo de liofilización fue idéntico al descrito en el Ejemplo 2, Sección 2-Ciclo de liofilización.
Tabla 9. Formulaciones liofilizadas que contienen el activador de la coagulación (CaCh) para ser reconstituidas directamente con PRP.
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2- Aspecto de las tortas
Las formulaciones sin lioprotector se encogieron significativamente durante la liofilización.
El tampón de histidina utilizado a una concentración de 3,8 mM no indujo el agrietamiento de las tortas como se vio anteriormente en el Ejemplo 1 con concentraciones más altas de 33 a 39 mM.
Las tortas eran más voluminosas cuando se utilizaban mayores concentraciones de lioprotectores. Las tortas que contenían manitol eran más voluminosas que las que contenían trehalosa (Figura 4A1 y 4A2).
3- Reconstitución de las tortas
El PRP y el PPP humano se extrajeron como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 3, Sección 2-Aislamiento del PRP humano.
Las tortas se reconstituyeron con 1 mL de PRP o 1 mL de PPP y se mezclaron con tres perlas de acero de 0,39 g durante 10 segundos.
Los quitosanos de medio y bajo Mn se disolvieron mejor que los quitosanos de mayor Mn, especialmente en presencia de lioprotectores.
4-Expresión de líquidos
Las formulaciones reconstituidas en PRP se dispensaron en tubos de vidrio a 37 °C. Después de 60 minutos, se cuantificó la expresión de líquidos de los coágulos híbridos por medio de la medición del peso.
Todos los coágulos híbridos expresaron menos líquido que el PRP solo.
5- Homogeneidad de los coágulos
Los coágulos híbridos se fijaron en NBF al 10% y se observaron secciones gruesas de hoja de afeitar con microscopía de epifluorescencia para evaluar la dispersión del quitosano en los coágulos.
El quitosano se agrega en la mayoría de los coágulos híbridos preparados con quitosano de alto Mn (Figuras 4B1 y 4B2).
El quitosano se dispersó bien dentro de la mayoría de los coágulos híbridos cuando se utilizó quitosano de Mn medio (Figuras 4B3 y 4B4).
Los eritrocitos presentes en el PRP sedimentaron hacia el fondo de los coágulos dejando una banda de quitosano en la superficie del coágulo cuando se utilizaron los quitosanos de menor Mn (Figuras 4B5& 4B6).
6- Implantación ex vivo en defectos de menisco
Las formulaciones de quitosano/PRP liofilizadas se implantaron con éxito ex vivo en defectos meniscales donde coagularon in situ como se describe en el Ejemplo 3, Sección 7- Implantación ex vivo en defectos meniscales.
Tabla 10. Rendimiento de las 30 formulaciones diferentes.
Figure imgf000030_0001
En el Ejemplo 4, la disminución del peso molecular del quitosano mejora la solubilidad de las tortas en el PRP, pero que sólo el quitosano de peso molecular medio (Mn 38 kDa) produjo coágulos híbridos de quitosano/PRP que eran homogéneos sin ninguna separación de fase que ocurre a un peso molecular más bajo o agregación que ocurre a un peso molecular más alto.
EJEMPLO 5
I-Preparación de formulaciones de quitosano
Los quitosanos de Mn medio (Mn 56 kDa, 80,1% de DDA y Mn 32 kDa, 81,2% de DDA) se disolvieron en HCl durante la noche a temperatura ambiente para obtener una concentración final de quitosano de 0,56%, 1% o 2% (p/v). Las soluciones se filtraron y esterilizaron. Se añadieron trehalosa 15% (p/v) esterilizada por filtro, manitol 15% (p/v) y CaCl2270 mM, de acuerdo con lo necesario. Se añadió un trazador de rodamina-quitosano esterilizado por filtro (Mn 40 kDa, 80,0% de DDA) antes de dispensarlo en viales individuales de 3 mL para su liofilización.
De acuerdo con la Tabla 11, la concentración de HCl se ajustó para que todas las formulaciones tuvieran una relación HCl: glucosamina de 0,6. La concentración de lioprotector se fijó en un 2% o 6% (p/v) suficiente para proporcionar una torta estable pero sin impedir la coagulación.
El ciclo de liofilización fue idéntico al descrito en el Ejemplo 2, Sección 2-Ciclo de liofilización
Tabla 11. Formulaciones liofilizadas que contienen el activador de la coagulación (CaCh) para ser reconstituidas directamente con PRP.
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000032_0001
2- Aspecto de las tortas
Las tortas eran más voluminosas cuando se utilizaban mayores concentraciones de lioprotectores. Las tortas que contenían manitol eran más voluminosas que las que contenían trehalosa.
3- Reconstitución de las tortas
El PRP y el PPP humano se extrajeron de 2 donantes humanos diferentes, como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 3, Sección 2-Aislamiento del PRP humano.
Las tortas se reconstituyeron con 1 mL de PRP o 1 mL de PPP y se mezclaron con tres perlas de acero de 0,39 g durante 10 segundos.
Las formulaciones que contenían 2% (p/v) de quitosano no se solubilizaron bien.
Las tortas que contenían quitosano de Mn 32 kDa fueron más fáciles de reconstituir en comparación con las tortas que contenían quitosano de Mn 56 kDa, tanto a una concentración de quitosano del 0,56% como del 1% (p/v).
4- Tromboelastografía (TEG)
Se cargaron 360 pl de cada formulación en un vaso de TEG inmediatamente después de la mezcla y se registraron los trazados de t Eg durante 1 hora.
Las formulaciones que contenían un 0,56% (p/v) de quitosano Mn 32 kDa coagularon de manera monofásica de forma similar a los controles de sólo PRP (Figura 5B1).
El aumento de la Mn o de la concentración de quitosano indujo un mecanismo de coagulación de dos fases, como lo revelan los trazados de TEG (Figuras 5B2 y 5B3).
En todos los casos, la adición de un 6% (p/v) de lioprotector dio coágulos más blandos con una amplitud máxima menor (MA entre 24 y 61 mm) que la adición de un 2% (p/v) de lioprotector (MA entre 51 y 84 mm).
5- Prueba de solvencia
La fluidez se evaluó por medio de la colocación de una gota de 30 pL de cada formulación en una pieza rígida de plástico fijada en un ángulo determinado (38 grados) inmediatamente después de la reconstitución y la toma de fotografías en momentos determinados.
El aumento de la concentración de quitosano mejoró las propiedades pastosas de las formulaciones (Compárense las Figuras 5A1 y 5A2). El aumento del Mn de quitosano mejoró las propiedades pastosas de las formulaciones (Compárense las Figuras 5A1 y 5A3).
Tabla 12. Rendimiento de las 24 formulaciones diferentes.
Figure imgf000032_0002
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En el Ejemplo 5, las propiedades pastosas de las formulaciones se pueden mejorar por medio del aumento de la concentración de quitosano o el Mn de quitosano. Las tortas liofilizadas que contienen quitosano de peso molecular medio se pueden reconstituir fácilmente en PRP siempre que la concentración de quitosano sea inferior al 2% (p/v).
EJEMPLO 6
1-Preparación de formulaciones de quitosano
Cinco quitosanos diferentes de Mn medio (Mn 56 kDa, 80,1% de DDA, Mn 56 kDa, 81,8% de DDA, Mn 32 kDa, 81,2% de DDA, Mn 30 kDa, 81,0% de DDA y Mn 28 kDa, 80,5% de DDA) se disolvieron en HCl durante la noche a temperatura ambiente para obtener una concentración final de quitosano del 1% (p/v). Las soluciones se filtraron y esterilizaron. Se añadieron trehalosa 15% (p/v) esterilizada por filtro, manitol 15% (p/v) y CaCh 270 mM, de acuerdo con lo necesario. Se añadió el trazador de Rodamina-quitosano esterilizado por filtro (Mn 40 kDa, 80,0% de DDA o Mn 110 kDa, 80,2% de DDA) antes de dispensarlo en viales individuales de 3 mL para su liofilización.
De acuerdo con la Tabla 13, la concentración de HCl se ajustó para que todas las formulaciones tuvieran una relación HCl: glucosamina de 0,6. La concentración de lioprotector se fijó en un 2% o 6% (p/v) suficiente para proporcionar una torta estable pero sin impedir la coagulación.
El ciclo de liofilización fue idéntico al descrito en el Ejemplo 2, Sección 2-Ciclo de liofilización.
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2- Aspecto de las tortas
Las tortas eran más voluminosas cuando se utilizaban mayores concentraciones de lioprotectores. Las tortas que contenían manitol eran más voluminosas que las que contenían trehalosa (Figuras 6A1 y 6A2).
3- Reconstitución de las tortas
El PRP y el PPP humano se extrajeron como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 3, Sección 2-Aislamiento del PRP humano.
Las tortas se reconstituyeron con 1 mL de PRP o 1 mL de PPP y se mezclaron con tres perlas de acero de 0,39 g durante 10 segundos.
Todas las formulaciones se disolvieron bien y cumplieron los criterios de rendimiento 2.
4- Tromboelastografía (TEG)
Se cargaron 360 pl de cada formulación en un vaso de TEG inmediatamente después de la mezcla y se registraron los trazados de t Eg durante 1 hora.
Todas las formulaciones indujeron un mecanismo de coagulación de 2 fases, como lo revelan los trazados de TEG (Figuras 6B1y 6B2).
En todos los casos, la adición de un 6% (p/v) de lioprotector dio coágulos más blandos con una amplitud máxima menor (MA entre 37 y 67 mm) que la adición de un 2% (p/v) de lioprotector (MA entre 68 y 79 mm).
5- Prueba de solvencia
La fluidez se evaluó por medio de la colocación de una gota de 30 pL de cada formulación en una pieza rígida de plástico fijada en un ángulo determinado (38 grados) inmediatamente después de la reconstitución y la toma de fotografías en momentos determinados.
Todas las formulaciones tenían propiedades pastosas en comparación con el PRP solo (Figura 6C1).
6- Expresión de líquidos
Las formulaciones reconstituidas en PRP se dispensaron en tubos de vidrio a 37 °C. Después de 60 minutos, se cuantificó la expresión de líquidos de los coágulos híbridos por medio de la medición del peso.
Todos los coágulos híbridos expresaron menos líquido que el PRP solo (Figura 6B3).
7- Homogeneidad de los coágulos
Los coágulos híbridos se fijaron en NBF al 10% y se observaron secciones gruesas de hoja de afeitar con microscopía de epifluorescencia para evaluar la dispersión del quitosano en los coágulos.
El quitosano se dispersó en los coágulos híbridos para todas las formulaciones (Figura 6A3 y 6A4)
8- Prueba de aplastamiento
Después de 1 hora de coagulación, cada coágulo híbrido fue sometido a una prueba de aplastamiento y se calificó su resistencia mecánica.
0 = El coágulo no pudo se pudo manipular sin desintegrarse.
+ = El coágulo se rompió fácilmente y el aspecto de aplastamiento fue de múltiples fragmentos (más de 5 fragmentos).
++ = El coágulo era relativamente firme y el aspecto aplastado era de múltiples fragmentos (3 a 5 fragmentos). ++ = El coágulo era firme y elástico, el aspecto aplastado era de 2 a 3 fragmentos.
++++ = El coágulo era firme y elástico, el aspecto aplastado era de 2 fragmentos (a veces todavía conectados) o sólo había un agujero en el centro del coágulo.
La adición de un 6% (p/v) de lioprotector disminuyó la resistencia mecánica del coágulo en comparación con el 2% (p/v) de lioprotector (Compárense las Figuras 6D1 y 6D2 con las 6D3 y 6D4).
9- Implantación ex vivo en defectos de cartílago
Se utilizaron punzones de biopsia de 8 mm y cuchillas quirúrgicas planas para crear defectos de cartílago en el cóndilo y la tróclea del cerdo.
Las articulaciones se colocaron en una cámara húmeda a 37 °C durante al menos 30 minutos antes del inicio del experimento.
Las formulaciones liofilizadas reconstituidas de quitosano/PRP se inyectaron en los defectos del cartílago.
Las uniones se sellaron inmediatamente en la cámara húmeda y se colocaron a 37 °C durante 1 hora.
Las formulaciones de quitosano/PRP liofilizadas se implantaron con éxito ex vivo en defectos de cartílago mediante el uso de una jeringa y una aguja de calibre 20, donde se coagularon in situ (Figura 6C2).
Tabla 14. Rendimiento de las 16 formulaciones diferentes.
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En el Ejemplo 6, se pueden utilizar diferentes lotes de polvo de quitosano con Mn similar para preparar tortas que tendrán características de rendimiento equivalentes. Las tortas de quitosano con altas concentraciones de lioprotector producen híbridos de quitosano/PRP que son indeseablemente blandos.
EJEMPLO 7
1-Preparación de formulaciones de quitosano
Cuatro quitosanos Mn diferentes (Mn 10 kDa, 80,6% de DDA, Mn 41 kDa, 80,6% de DDA, Mn 89 kDa, 80,6% de DDA y Mn 108 kDa, 80,6% de DDA) se disolvieron en HCl durante la noche a temperatura ambiente para obtener concentraciones finales de quitosano de 0,56% (p/v), 1% (p/v) y 2% (p/v), esta última concentración sólo preparada para el quitosano Mn 10 kDa. Las soluciones se filtraron y esterilizaron. Se añadieron trehalosa 15% (p/v) esterilizada por filtro, manitol 15% (p/v) y CaCh 270 mM, de acuerdo con lo necesario. Se añadió el trazador de rodaminaquitosano esterilizado por filtro (Mn 10 kDa, 81,9% de DDA, Mn 40 kDa, 80,0% de DDA o Mn 110 kDa, 80,2% de DDA) antes de dispensarlo en viales individuales de 3 mL o 2 mL para su liofilización.
De acuerdo con la Tabla 15, la concentración de HCl se ajustó para que todas las formulaciones tuvieran una relación HCl: glucosamina de 0,6. La concentración de lioprotector se fijó en un 2%, 4% o 6% (p/v), suficiente para proporcionar una torta estable pero sin impedir la coagulación.
El ciclo de liofilización fue idéntico al descrito en el Ejemplo 2, Sección 2-Ciclo de liofilización.
Tabla 15. Formulaciones con CaCh reconstituidas directamente con PRP.
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Figure imgf000037_0002
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2- Aspecto de las tortas
Las tortas eran más voluminosas cuando se utilizaban mayores concentraciones de lioprotectores. Las tortas que contenían manitol eran más voluminosas que las que contenían trehalosa.
3- Reconstitución de las tortas
El PRP y el PPP humano se extrajeron como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 3, Sección 2-Aislamiento del PRP humano.
Las tortas se reconstituyeron con 1 mL de PRP o 1 mL de PPP y se mezclaron a mano sin la ayuda de perlas de acero durante 10 segundos. Para cuatro de las formulaciones (Núms. 15, 19, 23, 27), se utilizaron también tres perlas de acero de 0,39 g para reconstituir las tortas, a fin de compararlas con los resultados obtenidos anteriormente.
Las formulaciones preparadas con quitosano Mn 10 kDa al 0,56% (p/v) y al 1% (p/vol) se disolvieron completamente. Las formulaciones preparadas con quitosano Mn 10 kDa al 2% (p/vol) y con quitosano Mn 41 kDa al 0,56% y al 1% (p/vol) se disolvieron bien. Las formulaciones preparadas con quitosano Mn 89 kDa y 108 kDa eran más gruesas y difíciles de manejar.
4- Tromboelastografía (TEG)
Se cargaron 360 pl de cada formulación en un vaso de TEG inmediatamente después de la mezcla y se registraron los trazados de TEG durante 1 hora.
Las formulaciones que contienen quitosano Mn 10 kDa al 0,56% (p/v) indujeron un trazado de coagulación en una fase. El aumento de la concentración de quitosano y de Mn indujo un mecanismo de coagulación en dos fases, como revelan los trazados de TEG.
El tiempo de reacción del coágulo fue alto para las formulaciones que contenían quitosano Mn 10 kDa y corto para las formulaciones que contenían quitosano Mn 108 kDa, quedando las formulaciones de 40 kDa en un punto intermedio.
La amplitud máxima fue mayor para los coágulos híbridos que contenían un 2% (p/v) de lioprotector en comparación con los coágulos híbridos que contenían un 4% o un 6% (p/v) de lioprotector.
5- Prueba de solvencia
La fluidez se evaluó por medio de la colocación de una gota de 30 pL de cada formulación en una pieza rígida de plástico fijada en un ángulo determinado (38 grados) inmediatamente después de la reconstitución y la toma de fotografías en momentos determinados.
Las formulaciones que contenían quitosano Mn 10 kDa al 0,56% (p/vol) y al 1% (p/vol) eran líquidas.
Todas las demás formulaciones tenían propiedades pastosas en comparación con el PRP solo.
6- Expresión de líquidos
Las formulaciones reconstituidas en PRP se dispensaron en tubos de vidrio a 37 °C. Después de 60 minutos, se cuantificó la expresión de líquidos de los coágulos híbridos por medio de la medición del peso.
Todos los coágulos híbridos expresaron menos líquido que el PRP solo.
7- Homogeneidad de los coágulos
Se observaron grandes agregados de quitosano en la mayoría de los coágulos híbridos preparados con quitosano Mn 89 kDa y 108 kDa (Figura 7A3, 7A4, 7A7 y 7A8). El quitosano se dispersó bien en la mayoría de los coágulos híbridos cuando se utilizó quitosano Mn 41 kDa (Figura 7Al, 7A2, 7A5 y 7A6). Los eritrocitos presentes en el PRP sedimentaron hacia el fondo de los coágulos dejando una banda de quitosano en la superficie del coágulo cuando se utilizó el quitosano Mn 10 kDa.
8- Prueba de aplastamiento
Después de 1 hora de coagulación, cada coágulo híbrido fue sometido a una prueba de aplastamiento y se calificó su resistencia mecánica.
0 = El coágulo no se pudo manipular sin desintegrarse.
+ = El coágulo se rompió fácilmente y el aspecto de aplastamiento fue de múltiples fragmentos (más de 5 fragmentos).
++ = El coágulo era relativamente firme y el aspecto aplastado era de múltiples fragmentos (3 a 5 fragmentos). ++ = El coágulo era firme y elástico, el aspecto aplastado era de 2 a 3 fragmentos.
++++ = El coágulo era firme y elástico, el aspecto aplastado era de 2 fragmentos (a veces todavía conectados) o sólo había un agujero en el centro del coágulo.
La adición de un 6% (p/v) de lioprotector disminuyó la resistencia mecánica del coágulo.
9- Implantación ex vivo en defectos de cartílago
Se utilizaron punzones de biopsia de 8 mm y cuchillas quirúrgicas planas para crear defectos de cartílago en el cóndilo, la tróclea y la meseta tibial del cerdo.
Las articulaciones se colocaron en una cámara húmeda a 37 °C durante al menos 30 minutos antes del inicio del experimento.
Las formulaciones liofilizadas reconstituidas de quitosano/PRP se inyectaron en los defectos del cartílago.
Las uniones se sellaron inmediatamente en la cámara húmeda y se colocaron a 37 °C durante 1 hora.
Las formulaciones de quitosano/PRP liofilizadas se implantaron con éxito ex vivo en defectos de cartílago mediante el uso de una jeringa y una aguja de calibre 20, donde se coagularon in situ.
10- Reconstitución de las formulaciones liofilizadas sin perlas frente a la mezcla con perlas
El aspecto histológico de los coágulos híbridos fue similar tanto si las tortas liofilizadas se reconstituyeron sin la ayuda de perlas de acero inoxidable como si se mezclaron con tres perlas de acero inoxidable de 0,39 g (compárense las Figuras 7A1, 7A2, 7A3 y 7A4 con la 7A5, 7A6, 7A7 y 7A8).
Las características de rendimiento de las formulaciones liofilizadas fueron similares para los coágulos híbridos preparados sin la ayuda de las perlas de acero inoxidable o por medio de la mezcla con tres perlas de acero inoxidable de 0,39 g (véase la Tabla de la Figura 7B).
11- Osmolalidad de las formulaciones reconstituidas con PRP
Las formulaciones de quitosano liofilizado que contenían manitol tenían una osmolalidad más alta que las formulaciones liofilizadas que contenían trehalosa. La osmolalidad aumentó con la concentración de lioprotector. Las formulaciones que contenían un 2% (p/vol) de trehalosa tenían una osmolalidad entre 443 y 495 mOsm. Las formulaciones que contenían 2% (p/vol) de manitol tenían una osmolalidad entre 526 y 582 mOsm. Las formulaciones que contenían un 4% (p/vol) de trehalosa tenían una osmolalidad entre 516 y 564 mOsm. Las formulaciones que contenían 4% (p/vol) de manitol tenían una osmolalidad entre 608 y 665 mOsm. Las formulaciones que contenían un 6% (p/vol) de trehalosa tenían una osmolalidad entre 595 y 631 mOsm. Las formulaciones que contenían 6% (p/vol) de manitol tenían una osmolalidad entre 759 y 823 mOsm.
12- Implantación subcutánea de formulaciones de quitosano liofilizadas
Se probaron in vivo varias formulaciones de baja y alta osmolalidad en un modelo de implante subcutáneo de conejo (Tabla 16).
Figure imgf000041_0001
Se afeitó el pelo del lomo de los conejos NZW y se desinfectó la piel con 3 pases de Baxedin® y luego con 3 pases alternados de proviodina e isopropanol al 70%.
El PRP autólogo se preparó a partir de sangre de conejo extraída inmediatamente antes de la cirugía, como se ha descrito anteriormente en la sección del Ejemplo 14- Aislamiento del PRP de conejo. Cada torta de quitosano liofilizada de 300 pl se reconstituyó con 300 pl de PRP sin ayuda de perlas para la mezcla.
Se utilizó una jeringa de 1 cc equipada con una aguja Sub Q para administrar 150 pl de cada implante bajo la piel de la espalda del conejo
Los controles de PRP se calcificaron nuevamente con 42,2mM de CaCh antes de la inyección.
Los lugares de inyección se variaron sistemáticamente en cada animal para evitar resultados dependientes del lugar. Se sacrificó a los animales a los 1 (Figuras 7C1 a 7C6), 3 (Figuras 7D1 a 7D6), 7 y 14 días después de la inyección (Figuras 7E2y 7E3).
En el día 1, los implantes de quitosano parecían estar prácticamente intactos. En algunos casos, los eritrocitos presentes en el PRP eran visibles dentro de los implantes. Los glóbulos blancos fueron atraídos por los implantes y se encontraron principalmente en la periferia de los mismos (Figuras 7C1,7C2, 7C3 y 7C4).
Al tercer día, los implantes de quitosano/PRP estaban parcialmente degradados y los glóbulos blancos invadían los implantes (Figuras 7D1, 7D2, 7D3 y 7D4).
Hubo un efecto del tiempo dado que el reclutamiento de glóbulos blancos se incrementó en el día 3 en comparación con el día 1 (Compárense las Figuras 7D1 a 7D4 con las Figuras 7C1 a 7C4).
Los híbridos de quitosano/PRP fueron residentes in vivo hasta 14 días después de la inyección (Figuras 7E1, 7E2 y 7E3).
Los controles de PRP recalcificado sólo se visualizaron hasta 3 días después de la inyección (la Figura 7E4 muestra el control de PRP a 1 día) y no indujeron mucho reclutamiento celular (Figuras 7C5, 7C6, 7D5, 7D6 y 7E4).
Tabla 17. Rendimiento de las 40 formulaciones diferentes.
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En el Ejemplo 7, la mezcla con perlas de acero inoxidable no es necesaria para la reconstitución de las tortas de quitosano liofilizado con PRP. Las formulaciones que contienen altas concentraciones de lioprotector tienen una alta osmolalidad y atraen más leucocitos al implantarse in vivo. También se comprobó que los híbridos de quitosano y PRP se retenían durante más tiempo que los controles de PRP recalcificado únicamente in vivo. 8 formulaciones específicas (Núms. 13, 15, 17, 19, 35 a 38) cumplían todas las características de rendimiento predefinidas.
EJEMPLO 8
1-Preparación de formulaciones de quitosano
Dos quitosanos diferentes (Mn 43 kDa, 85% de DDA y Mn 36 kDa, 80% de DDA) se disolvieron en HCl durante la noche a temperatura ambiente para obtener concentraciones finales de quitosano del 1% (p/v). Las soluciones se filtraron y esterilizaron. Se añadió trehalosa filtrada al 15% (p/v) y 270 mM de CaCh, de acuerdo con lo necesario. A algunos de los viales se les añadió un trazador de Rodamina-quitosano esterilizado por filtro (Mn 40 kDa, 80,0% de DDA) antes de dispensarlos en viales individuales de 3 mL para su liofilización.
De acuerdo con la Tabla 18, la concentración de HCl se ajustó para que todas las formulaciones tuvieran una relación HCl: glucosamina de 0,6. La concentración de lioprotector se fijó en el 1% (p/v) para tener una osmolalidad cercana a la fisiológica, proporcionar una torta estable pero no impedir la coagulación.
El ciclo de liofilización fue idéntico al descrito en el Ejemplo 2, Sección 2-Ciclo de liofilización.
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2- Aspecto de las tortas
Las tortas tenían una superficie lisa y un aspecto agradable sin ningún tipo de colapso. Se observó una ligera retracción de todas las tortas en los frascos de vidrio tras la liofilización (Figuras 8A1 y 8A2).
3- Reconstitución de las tortas
El PRP y el PPP humano se extrajeron como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 3, Sección 2-Aislamiento del PRP humano.
Las tortas se reconstituyeron con 1 mL de PRP o 1 mL de PPP y se mezclaron a mano sin la ayuda de perlas de acero durante 10 segundos.
Las formulaciones tuvieron buena solubilidad y se disolvieron completamente (Figuras 8A3y 8A4).
4- Tromboelastografía (TEG)
Se cargaron 360 pl de cada formulación en un vaso de TEG inmediatamente después de la mezcla y se registraron los trazados de t Eg durante 1 hora.
El tiempo de reacción del coágulo y la amplitud máxima fueron menores para las formulaciones de quitosano/PRP en comparación con el control PRP (Figuras 8C1y 8C2).
5- Prueba de solvencia
La fluidez se evaluó por medio de la colocación de una gota de 30 pL de cada formulación en una pieza rígida de plástico fijada en un ángulo determinado (38 grados) inmediatamente después de la reconstitución y la toma de fotografías en momentos determinados.
Las formulaciones tenían propiedades pastosas en comparación con el control PRP.
6- Expresión de líquidos
Las formulaciones reconstituidas en PRP se dispensaron en tubos de vidrio a 37 °C. Después de 60 minutos, se cuantificó la expresión de líquidos de los coágulos híbridos por medio de la medición del peso.
Los coágulos híbridos no expresaron ningún líquido mientras que los controles PRP expresaron más del 80% de su peso en suero (Figuras 8B1, 8B2, 8B3 y 8B4).
7- Homogeneidad de los coágulos
Los coágulos híbridos se fijaron en NBF al 10% y se observó la dispersión de quitosano mediante el uso de microscopía epifluorescente.
El quitosano estaba bien disperso dentro de los coágulos híbridos (Figuras 8C3y 8C4).
8- Prueba de aplastamiento
Después de 1 hora de coagulación, cada coágulo híbrido se sometió a una prueba de aplastamiento y se calificó la resistencia mecánica como se describe en el Ejemplo 7, Sección 8 - Prueba de aplastamiento.
Los coágulos híbridos tenían una buena resistencia mecánica.
11- Osmolalidad de las formulaciones reconstituidas con PRP
La formulación que contiene Quitosano Mn 43 kDa, 85% de DDA tuvo una osmolalidad de 457 mOsm al ser reconstituida. La formulación que contenía Quitosano Mn 36 kDa, 80% de DDA tenía una osmolalidad de 444 mOsm tras la reconstitución.
12- Implantación in vivo en defectos de menisco
Las dos formulaciones descritas anteriormente, así como los controles de sólo PRP, se probaron en un modelo de reparación del menisco de oveja.
En la mañana de la cirugía, se extrajo PRP de la sangre de oveja como se describe en el Ejemplo 2, Sección 4-Aislamiento de PRP de oveja.
Se llevó a cabo una artrotomía de 1,5 cm de longitud para acceder al espacio articular femorotibial medial y se llevó a cabo una incisión horizontal en la cápsula articular medial para acceder al 1/3 anterior del menisco.
Se cremó un desgarro de 10 mm a 1/3 de la longitud entre los bordes capsular y libre (más cerca de la cápsula) mediante el uso de una hoja de bisturí Núm. 11 para crear una herida punzante (Figura 8D1) que se alargó con una cuchilla de empuje de menisco (Figura 8D2).
El desgarro y la membrana sinovial se rasparon para crear un espacio en 3D para que el implante FD de quitosano/PRP se adhiriera sin interrumpir las fibras circunferenciales que imparten las tensiones de aro (Figura 8D3).
Se colocaron dos suturas de polipropileno 3-0 en forma de colchón horizontal alrededor del desgarro del menisco (Figura 8D4).
Se crearon dos canales de trepanación desde la periferia del menisco hasta el desgarro con la colocación de dos agujas de calibre 18 separadas ~2mm (Figura 8D5).
Las tortas de quitosano se reconstituyeron con 1 mL de PRP autólogo y se mezclaron vigorosamente durante 10 segundos.
La mezcla de quitosano/PRP se aspiró con una jeringa de 1 cc.
El material híbrido de quitosano/PRP se extrusó en los canales y en el desgarro mientras se sacaban las agujas de calibre 18 (Figura 8D6).
Las suturas se apretaron 5 minutos después del parto con una tensión suficiente para aponer los bordes del desgarro meniscal.
Se suturó la cápsula articular y se repitió el procedimiento con la otra rodilla de acuerdo con el diseño del estudio. Los controles de sólo PRP se calcificaron nuevamente con 42,2mM de CaCh inmediatamente antes de la inyección. Se sacrificó a los animales a los 1 y 21 días después de la cirugía de inyección.
En el día 1, el quitosano/PRP era residente en las lágrimas (Figuras 8E1y 8E2).
En el día 21, los bordes de las lágrimas tratadas con quitosano/PRP estaban bien apuestos (Figuras 8E3y 8E4). En el Ejemplo 8, se demostró que las formulaciones de quitosano/PRP se pueden inyectar en los defectos del menisco in vivo mediante el uso de instrumentación quirúrgica estándar, que los híbridos de quitosano/PRP son residentes en los desgarros del menisco y que los desgarros tratados con híbridos de quitosano/PRP tienen bordes bien apuestos después de 21 días de curación.
EJEMPLO 9
I-Preparación de la formulación de quitosano
El quitosano (Mn 40 kDa, 80% de DDA) se disolvió en HCI durante la noche a temperatura ambiente para obtener concentraciones finales de quitosano del 1% (p/v). La solución se filtró y se esterilizó. Se añadió trehalosa filtrada al 15% (p/v) y 270 mM de CaCh, de acuerdo con lo necesario. Se añadió a los viales un trazador de Rodaminaquitosano esterilizado por filtro (Mn 40 kDa, 80,0% de DDA) antes de dispensarlo en viales individuales de 2 mL para su liofilización.
De acuerdo con la Tabla 19, la concentración de HCI se ajustó para que las formulaciones tuvieran una relación HCl: glucosamina de 0,6. La concentración de lioprotector se fijó en el 2% (p/v).
El ciclo de liofilización fue idéntico al descrito en el Ejemplo 2, Sección 2-Ciclo de liofilización.
CL QCCL OO
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8-Modelo de reparación crónica del cartílago in vivo
Se crearon defectos condrales de 4 mm * 4 mm bilateralmente en la tróclea de tres conejos NZW de 9 meses de edad (Figura 9A1), se suturaron las rodillas y se dejó que los defectos se desarrollaran hasta la fase crónica durante 1 mes (Figura 9A2).
Se volvieron a abrir las rodillas, se desbridaron los defectos y se perforaron cuatro agujeros de microperforación a través del hueso subcondral con una broca de 0,9 mm hasta una profundidad de ~4 mm.
El PRP autólogo se preparó a partir de sangre de conejo extraída inmediatamente antes de la cirugía, como se describe en el Ejemplo 1, sección 4-Aislamiento de PRP de conejo. Tras la creación del defecto, la torta de quitosano liofilizada se reconstituyó con 300 pl de PRP, se mezcló vigorosamente durante 10 segundos y se colocó el implante (1 gota colgante) sobre el lugar del defecto y se dejó solidificar in situ durante ~5 min antes de cerrar la rodilla (Figura 9A4).
Se administró PRP recalcificado en la rodilla contralateral como control (Figura 9A3).
A los 21 días del postoperatorio, los tejidos de reparación en los lados tratados y de control tenían un aspecto diferente (Figuras 9B1y 9B2).
Se observó un mayor reclutamiento de células y una amplia remodelación ósea en la rodilla tratada con quitosano/PRP (Figura 9B4), lo cual estuvo ausente en la rodilla de control (Figura 9B3).
El Ejemplo 9, proporcionó que los implantes híbridos de quitosano/PRP se pueden entregar in vivo a defectos crónicos de cartílago, donde estimulan el reclutamiento celular y la remodelación ósea, características previamente asociadas con una mejor reparación.
Basándonos en lo anterior, se pudo determinar qué composiciones de quitosano cumplían al menos una, en algunos casos más de una, y en algunos casos todas nuestras características de rendimiento predefinidas. Los criterios que se cumplieron incluyen: 1) Tortas mecánicamente estables para su almacenamiento y envío (Figuras 6A1y 6A2); 2) Reconstitución rápida, fácil y completa en PRP (Figuras 6A1y 6A2); 3) Coagulación in situ conseguida y no inhibida (Figuras 6B1y 6B2); 4) Implantes híbridos de quitosano/PRP capaces de soportar la carga mecánica post­ implantación (Figuras 6D1y 6D2); 5) Inhibición de la retracción del coágulo mediada por las plaquetas para rellenar los defectos del tejido (Figura 6B3); 6) Buena mezcla sin separación de fases de los polímeros y los componentes sanguíneos (Figuras 6A3y 6A4); 7) Formulaciones viscosas y pastosas para aplicaciones de reparación de tejidos (Figura 6C1) y 8) Propiedades cercanas a las fisiológicas para aplicaciones in vivo (Ejemplo 7). Los híbridos de quitosano/PRP residen durante al menos 14 días para estimular con éxito la reparación del tejido in vivo, en contraste con el PRP recalcificado, que sólo se eliminó en 3 días (Figuras 7C, 7D y 7E). Además, los híbridos de quitosano/PRP se utilizaron in vivo en modelos animales para tratar defectos de menisco (Figuras 8D y 8E), defectos agudos de cartílago (Figura 1B) y defectos crónicos de cartílago (Figuras 9A y 9B). Los ejemplos de realizaciones preferidas para la implantación de tejidos y la gelificación in situ son : 1) Quitosano de un peso molecular entre aproximadamente Mn 28 y aproximadamente 56 kDa a una concentración no superior a aproximadamente 1% (p/v) y no superior a aproximadamente 4% (p/v) de lioprotector o 2) Quitosano de un peso molecular entre aproximadamente Mn 89 y aproximadamente 108 kDa a una concentración no superior a aproximadamente 0,56% (p/v) y no superior a aproximadamente 4% (p/v) de lioprotector. Otras formulaciones probadas que cumplían algunos de los criterios predefinidos contenían quitosano de un peso molecular entre aproximadamente Mn 4 y aproximadamente 211 kDa en un intervalo de concentración de aproximadamente 0,42 y aproximadamente 2% (p/v), entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10% de lioprotector (sacarosa, trehalosa, manitol), una sal (NaCI) o un tampón (histidina).
El alcance de las reivindicaciones no debe estar limitado por las realizaciones preferentes expuestas en los ejemplos, sino que debe recibir la interpretación más amplia que sea coherente con la descripción en su conjunto.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una solución inyectable que comprende una composición polimérica liofilizada que comprende quitosano, un activador de coágulos y al menos un lioprotector reconstituido en plasma rico en plaquetas (PRP), producto sanguíneo o combinaciones de los mismos que al inyectarse:
i) en el tejido se solidifica para formar un implante para la reparación de tejidos; o
ii) en una articulación articular se mezcla con fluidos intraarticulares,
en el que dicho quitosano tiene un número de peso molecular de 20 a 125 kDa,
en el que el al menos un lioprotector se selecciona del grupo que consiste en monosacárido, poliol, disacárido, trisacárido, oligosacárido/polisacárido, excipiente de alto peso molecular, aminoácido, proteína y una combinación de los mismos;
en el que el activador del coágulo se selecciona del grupo que consiste en cloruro de calcio, gluconato de calcio, acetato de calcio, carbonato de calcio, glubionato de calcio, glucepato de calcio, lactato de calcio, lactobionato de calcio, fosfato de calcio y combinaciones de los mismos; y
en el que el producto sanguíneo se selecciona del grupo que consiste en PRP, PPP, PRF, suspensión de plaquetas, lisado de plaquetas y combinaciones de los mismos.
2. La solución inyectable de la reivindicación 1, en la que el quitosano está presente de 0,25% a 10% p/v.
3. La solución inyectable de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en la que el al menos un lioprotector está presente de 0,1% a 10% p/v.
4. Un proceso para preparar la solución inyectable de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende las etapas de: a) Poner en contacto el quitosano con agua para formar una mezcla acuosa,
b) Poner en contacto la mezcla acuosa con al menos un lioprotector,
c) Poner en contacto la mezcla acuosa con al menos un activador de coágulos,
d) esterilizar el quitosano, el al menos un lioprotector y el al menos un activador del coágulo, individualmente, antes de mezclar o después de añadir el al menos un lioprotector y el al menos un activador del coágulo a dicha mezcla acuosa de quitosano/agua,
e) liofilizar la mezcla acuosa, y
f) reconstituir la mezcla con plasma rico en plaquetas (PRP), producto sanguíneo o combinaciones de los mismos para formar una solución inyectable.
5. El proceso de la reivindicación 4, en el que el al menos un lioprotector se selecciona del grupo que consiste en monosacárido, poliol, disacárido, trisacárido, oligosacárido/polisacárido, excipiente de alto peso molecular, aminoácido, proteína o una combinación de los mismos.
6. El proceso de la reivindicación 4, en el que el al menos un lioprotector está presente de 0,1% a 6% p/v.
7. La solución inyectable de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso como implante para la reparación de tejidos.
8. La solución inyectable de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso como inyección intraarticular.
9. La solución inyectable de la reivindicación 7, en la que la reparación del tejido se selecciona del grupo que consiste en la reparación del menisco, la reparación del cartílago, la reparación del manguito de los rotadores, la reparación del hueso, la reparación del ligamento/tendón, la epicondilitis, la lesión aguda, la tendinopatía, el desgarro, la reparación del músculo, la cirugía oral/maxilofacial, la reparación de la piel, el tratamiento de heridas y el tratamiento de úlceras.
10. La solución inyectable de la reivindicación 1 comprende: una composición polimérica liofilizada que comprende quitosano, en una concentración no superior al 1% (p/v), con un peso molecular en el intervalo de Mn 28 a 56 kDa, un activador del coágulo y al menos un lioprotector, en una concentración no superior al 4% (p/v), reconstituido en plasma rico en plaquetas (PRP), producto sanguíneo o combinaciones de los mismos.
11. La solución inyectable de la reivindicación 1 comprende: una composición polimérica liofilizada que comprende quitosano, en una concentración no superior al 0,56% (p/v), con un peso molecular en el intervalo de Mn89 a 108 kDa, un activador del coágulo y al menos un lioprotector, en una concentración no superior al 4% (p/v), reconstituido en plasma rico en plaquetas (PRP), producto sanguíneo o combinaciones de los mismos.
12. La solución inyectable de la reivindicación 1 comprende: una composición polimérica liofilizada que comprende quitosano, en un intervalo de concentración de 0,42 y 2% (p/v), con un intervalo de peso molecular de Mn 4 a 211 kDa, un activador del coágulo, al menos un lioprotector, en un intervalo de concentración entre 1 y 10%, y una sal o un tampón, reconstituido en plasma rico en plaquetas (PRP), producto sanguíneo o combinaciones de los mismos.
13. Uso de una composición polimérica liofilizada que comprende quitosano, un activador de coágulos y al menos un lioprotector para formar una solución inyectable por medio de la reconstitución de dicha composición polimérica en plasma rico en plaquetas (PRP), producto sanguíneo o combinaciones de los mismos.
14. La solución inyectable de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que presenta al menos una de las siguientes características:
i) coagulación in situ conseguida y no inhibida;
ii) implantes híbridos de quitosano/PRP capaces de soportar cargas mecánicas tras la implantación;
iii) inhibición de la retracción del coágulo mediada por las plaquetas para rellenar los defectos del tejido; iv) una buena mezcla sin separación de fases de los polímeros y el PRP, el producto sanguíneo o combinaciones de los mismos;
v) formulaciones viscosas y pastosas para aplicaciones de reparación de tejidos;
vi) propiedades cercanas a las fisiológicas para su aplicación in vivo;
y combinaciones de los mismos.
15. La solución inyectable de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 10 a 12 y 14, en la que dicha solución no comprende fosfato de glicerol.
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