ES2260241T3

ES2260241T3 - Composicion y procedimiento para la reparacion y regeneracion de cartilago y otros tejidos.

Info

Publication number: ES2260241T3
Application number: ES01947086T
Authority: ES
Inventors: Caroline D. Hoemann; Michael D. Buschmann; Marc D. Mckee
Original assignee: Biosyntech Canada Inc
Current assignee: Biosyntech Canada Inc
Priority date: 2000-06-29
Filing date: 2001-06-29
Publication date: 2006-11-01
Anticipated expiration: 2021-06-29
Also published as: KR100880622B1; CN1471412B; US20060029578A1; IL153490A; US20110086008A1; HK1055563A1; EP1294414B1; KR20030027904A; JP5089006B2; CN1471412B8; CA2412505C; PT1294414E; DE60117984T8; AU2001268882B2; ATE320277T1; DE60117984T2; CA2412505A1; AU6888201A; DK1294414T3; WO2002000272A3

Abstract

Una composición polimérica para su uso en reparación de un tejido de un paciente, mezclándose dicha composición polimérica con al menos sangre entera, produciendo dicha composición polimérica cuando se mezcla con sangre entera una mezcla, pasando dicha mezcla a un estado no líquido con el tiempo o con la aplicación de calor, reteniéndose dicha mezcla en el lugar de la introducción y adhiriéndose al mismo para la reparación del tejido, donde dicha composición polimérica comprende un polímero y se disuelve o suspende en un tampón que contiene una sal inorgánica u orgánica.

Description

Composición y procedimiento para la reparación y regeneración de cartílago y otros tejidos.

Antecedentes de la invención (a) Campo de la invención

La presente invención se refiere a una composición para mejorar la reparación y regenerar los tejidos cartilaginosos y otros tejidos incluyendo sin limitaciones menisco, ligamento, tendón, hueso, piel, córnea, tejidos periodontales, abscesos, tumores reseccionados, y úlceras, y a su uso en la fabricación de un medicamento para la reparación tisular.

(b) Descripción de la invención 1) El Problema de la Reparación del Cartílago Cartílago: Estructura, Función, Desarrollo, Patología

El cartílago articular cubre los extremos de los huesos en articulaciones diartrodiales para distribuir las fuerzas de locomoción a las estructuras óseas subyacentes proporcionando simultáneamente superficies de contacto de articulación casi carentes de fricción. Estas propiedades las proporciona la matriz extracelular compuesta por colágeno tipo II y otros componentes minoritarios de colágeno y un alto contenido en el proteoglicano agrecano. En general, la red fibrilar colagenosa resiste fuerzas de tracción y de rotura mientras que el agrecano altamente cargado resiste la compresión y el flujo de fluido intersticial. Las propiedades de baja fricción son el resultado de una composición molecular especial de la superficie articular y del fluido sinovial, así como de la exudación de fluido intersticial durante la carga sobre la superficie articular (Athesian, 1997; Higaki y col., 1997; Schwartz y Hills, 1998).

El cartílago articular se forma durante el desarrollo de los huesos largos después de la condensación de células mesenquimáticas precondrocíticas y la inducción de un cambio de fenotipo de colágeno predominantemente de tipo I a colágeno de tipo II y agrecano (Hall, 1983; Pechak y col., 1986). El hueso se forma a partir del cartílago cuando los condrocitos se hipertrofian y cambian a la expresión de colágeno de tipo X, acompañada de una invasión de vasos sanguíneos, calcificación de la matriz, aparición de osteoblastos y producción de matriz ósea. En el adulto, permanece una fina capa de cartílago articular en los extremos de los huesos y se mantiene por los condrocitos mediante la síntesis, ensamblaje y renovación de la matriz (Kuettner, 1992). La enfermedad del cartílago surge cuando suceden fracturas debidas a traumatismos físicos o cuando una erosión más gradual, como es característico en muchas formas de artritis, expone el hueso subcondral para crear un dolor articular sintomático (McCarty y Koopman, 1993). Además del cartílago articular, los tejidos cartilaginosos permanecen en el adulto en diversas partes del cuerpo tales como orejas y nariz, áreas que a menudo se someten a cirugía reconstructiva.

2) Reparación del Cartílago: La Respuesta Natural

El cartílago articular tiene una respuesta limitada a las lesiones en el adulto principalmente a causa de la falta de vascularización y a la presencia de una densa matriz extracelular rica en proteoglicano (Newman, 1998; Buckwalter y Mankin, 1997; Minas y Nehrer, 1997). La primera inhibe la aparición de células inflamatorias y pluripotenciales de reparación, mientras que la segunda aprisiona a los condrocitos residentes en una matriz que no permite su migración. Sin embargo, las lesiones que penetran el hueso subcondral crean un conducto hacia hueso altamente vascular que permite la formación de un coágulo de fibrina que atrapa células de origen óseo y medular en la lesión que conducen a un tejido de granulación. Las porciones más profundas del tejido de granulación reconstituyen la placa de hueso subcondral mientras que la parte superior se transforma en un tejido fibrocartilaginoso de reparación. Este tejido puede poseer temporalmente el aspecto histológico del cartílago hialino, aunque no sus propiedades mecánicas (Wei y col., 1997) y es por lo tanto incapaz de soportar el ambiente mecánico local, conduciendo a la aparición de degeneración antes del fin del primer año después de la lesión. Por tanto, la respuesta natural de reparación en el cartílago articular adulto es que las lesiones de espesor parcial no tienen respuestas de reparación (distintas de flujo cartilaginoso y clonación localizada de condrocitos), mientras que las lesiones de espesor total con penetración en hueso presentan una respuesta limitada y fallida. La edad, sin embargo, es un factor importante dado que las lesiones de espesor total en cartílago articular inmaduro se curan mejor que en el adulto (DePalma y col., 1966; Wei y col., 1997) y laceraciones superficiales en cartílago articular fetal se curan completamente en un mes sin ninguna intervención de vasculatura o células derivadas del hueso (Namba y col., 1998).

3) Enfoques Actuales para la Reparación Asistida del cartílago

Los tratamientos clínicos actuales para defectos sintomáticos del cartílago implican técnicas dirigidas a: 1) eliminar irregularidades superficiales mediante afeitado y desbridamiento 2) penetración de hueso subcondral mediante taladro, fractura o abrasión para aumentar la respuesta de reparación natural descrita anteriormente (es decir, la familia de técnicas de estimulación de la médula ósea) 3) realineamiento de la articulación u osteotomía para usar el cartílago restante para la articulación 4) modulación farmacológica 5) trasplante de tejido y 6) trasplante celular (Newman, 1998; Buckwallter y Mankin, 1997). La mayoría de estos procedimientos han demostrado tener algunos beneficios a corto plazo reduciendo síntomas (meses a unos pocos años), mientras que ninguno de ellos ha sido capaz de mostrar consecuentemente una reparación satisfactoria de lesiones articulares después de los primeros pocos años. Las técnicas de estimulación de la médula ósea de afeitado, desbridamiento, taladro, fractura y artroplastia de abrasión permiten un alivio temporal de los síntomas pero producen un tejido fibrocartilaginoso subfuncional que finalmente se degrada. La modulación farmacológica suministrando factores de crecimiento a los lugares de los defectos puede aumentar la reparación natural pero insuficientemente hasta la fecha (Hunziker y Rosenberg, 1996; Sellers y col., 1997). Los trasplantes de tejido osteocondral por aloinjerto y autoinjerto que contienen condrocitos viables pueden conseguir una reparación más satisfactoria pero tienen graves limitaciones de donantes (Mahomed y col., 1992; Outerbridge y col., 1995).

4) Estimulación de la Médula Ósea

La familia de las técnicas de estimulación de la médula ósea incluye desbridamiento, afeitado, taladro, microfractura y artroplastia de abrasión. Actualmente se usan de forma extensiva en la práctica clínica ortopédica para el tratamiento de lesiones locales del cartílago articular que son de espesor total, es decir, que alcanzan el hueso subcondral, y tienen un tamaño limitado, típicamente menos de 3 cm^{2} de área. Iniciaron el uso de estos procedimientos Pridie y otros (Pridie, 1959; Insall, 1967; DePalma y col., 1966), quienes razonaron que se podría formar un coágulo de sangre en la región de una lesión de cartílago articular alterando la superficie de contacto cartílago/hueso para inducir la hemorragia desde el hueso en el defecto de cartílago que es avascular. Este hematoma podría iniciar entonces la cascada clásica de acontecimientos de curación de heridas que conduce a la curación satisfactoria o al menos la cicatrización de heridas en tejidos vascularizados (Clark, 1996). Más tarde se propusieron variaciones a la técnica de taladrado de Pridie incluyendo la artroplastia de abrasión (Childers y Ellwood, 1979; Johnson, 1991) y la microfractura (Rodrigo y col., 1993; Steadman y col., 1997). La artroplastia de abrasión usa instrumentos motorizados para triturar hueso subcondral anormalmente denso para alcanzar un suministro sanguíneo en el hueso más blando más profundo. La técnica de microfractura usa un punzón, o una lezna, para perforar la placa ósea subcondral con la profundidad suficiente (típicamente 3-4 mm), de nuevo para alcanzar un suministro vascular y crear un coágulo sanguíneo en el interior de la lesión del cartílago. Los practicantes de la técnica de microfractura afirman observar una mayor tasa de éxito que el taladro dada la ausencia de necrosis inducida por calor y la menor desestabilización biomecánica de la placa ósea subcondral con numerosos agujeros de fractura más pequeños en lugar de grandes huecos en la placa producidos por taladro (Steadman y col., 1998). Otra técnica relacionada más para tratar lesiones focales del cartílago articular es la mosaicoplastia o trasplante por autoinjerto osteocondral (OATS) en el que se transfieren cilindros de cartílago/hueso desde una región periférica "no usada" de una articulación a la región altamente cargada que contiene la lesión de cartílago (Hangody y col., 1997).

No hay consenso universal entre los ortopedistas sobre qué tipo de lesión de cartílago articular debe recibir qué tipo de tratamiento. También hay una falta de estudios científicos rigurosos que demuestren la eficacia de estos tratamientos para indicaciones particulares. Por tanto, la elección del tratamiento para las lesiones de cartílago depende en gran medida de la práctica, las inclinaciones y la experiencia personal del médico. Las razones para esta falta de consenso son múltiples, pero incluyen la variabilidad en el tipo de lesión tratada y un éxito variable, que no incontrolado, en la formación de un coágulo sanguíneo de "buena calidad". Algunos de los problemas asociados con la formación de un coágulo sanguíneo de buena calidad con estos procedimientos son 1) la naturaleza incontrolada de la hemorragia procedente del hueso, que nunca rellena totalmente la lesión del cartílago 2) contracción del coágulo medida por plaquetas que ocurre en minutos a partir de la formación del coágulo y reduce el tamaño del coágulo y podría separarlo del cartílago circundante (Cohen y col., 1975) 3) dilución de la sangre del hueso con el fluido sinovial o el fluido circulante de la artroscopia y 4) la actividad fibrinolítica o disolvente de coágulos del fluido sinovial (Mankin, 1974). Algunas de estas cuestiones fueron la motivación tras algunos estudios en los que se formaba un coágulo sanguíneo ex vivo y después se cortaba al tamaño adecuado y se introducían en un defecto de menisco (Arnoczky y col., 1988) o en un defecto osteocondral (Palette y col., 1992). Algo similar a la clásica cascada de curación de heridas ayudaba después a la curación del defecto. Este enfoque proporcionó claramente un mayor relleno del defecto con tejido de reparación, sin embargo, la calidad del tejido de reparación no era por lo general aceptable, siendo predominantemente fibroso y mecánicamente insuficiente. Algunas razones probables para un tejido de reparación menos que satisfactorio con este procedimiento son 1) contracción continua del coágulo mediado por plaquetas 2) la falta de viabilidad de algunos componentes sanguíneos debido a la prolongada manipulación ex vivo y 3) la solidificación del coágulo ex vivo que impide una buena adhesión a todas las superficies tisulares que rodean la defecto del cartílago y limita el relleno del defecto. En resumen, los procedimientos clínicos actuales practicados por los ortopedistas para el tratamiento de lesiones focales de cartílago articular dependen en su mayor parte de la formación de un coágulo sanguíneo dentro de la lesión. Sin embargo, la capacidad para formar un coágulo sanguíneo de buena calidad que rellena la lesión y contiene todos los elementos apropiados para la curación de la herida (plaquetas, monocitos, red de fibrina, etc.) en un estado viable produce resultados irregulares y a menudo insatisfactorios. Una de las realizaciones de la presente invención mejora esta situación proporcionando una composición y un procedimiento para suministrar estos elementos de curación de heridas transportados la sangre en una matriz de volumen completo que no se contrae a la lesión de cartílago articular.

5) Biomateriales y Factores de Crecimiento

Se han propuesto varias técnicas experimentales para reparar lesiones de cartílago usando biomateriales y factores de crecimiento, a veces cada uno por separado pero a menudo en combinación. La analogía con la familia de técnicas de estimulación de la médula ósea descrita anteriormente es clara. El armazón de fibrina del coágulo sanguíneo podría remplazarse por un armazón prefabricado de biomaterial y los factores mitogénicos y quimiotácticos naturales en el coágulo sanguíneo podrían remplazarse con cantidades y especies controlados por el usuario de elementos solubles tales como factores de crecimiento recombinantes. Los ejemplos de este procedimiento incluyen el uso de colas de fibrina para suministrar proteínas recombinantes tales como factores de crecimiento tipo insulina (Nixon y col., 1999) y factores de crecimiento de transformación (Hunziker y Rosenberg, 1996). Se han combinado otros agentes biológicos con biomateriales genéricos tales como ácido poliláctico (PLA), ácido poliglicólico (PGA), matrices de colágeno y colas de fibrina, incluyendo proteínas morfogenéticas óseas (Sellers y col., 1997; Sellers, 2000; Zhang y col. Patente WO 00/44413, 2000), péptidos tipo angiotensina (Rodgers y Dizerega, Patente WO 00/02905, 2000), y extractos de hueso que contienen una multiplicidad de proteínas llamadas proteínas óseas o BP (Atkinson, Patente WO 00/48550, 2000). En el último procedimiento, era necesario mantener esponjas de colágeno empapadas en BP en el defecto del cartílago usando un adhesivo adicional basado en fibrina/trombina, creando así un medio para la curación de la herida más bien complejo y difícil de reproducir. Se ha cubierto el biomaterial con fibronectina o péptidos RGD para ayudar a la adhesión celular y la migración celular (Breckke y Coutts, Patente de Estados Unidos 6.005.161, 1999). Algunos procedimientos previos han combinado la estimulación de la médula ósea con la inyección post-quirúrgica de hormona del crecimiento en el espacio sinovial con éxito limitado (Dunn y Dunn, Patente de Estados Unidos 5.368.051, 1994). Se han propuesto también composiciones específicas de biomateriales tales como mezclas de colágeno, quitosana y glicoaminoglicanos (Collombel y col., Patente de Estados Unidos 5.166.187, 1992; Suh y col., Patente WO 99/47186, 1999), una pasta triturada de cartílago y hueso (Stone, Patente de Estados Unidos 6.110.209, 2000), una construcción de múltiples componentes basada en colágeno (Pahcence y col., Patente de Estados Unidos 6.080.194, 2000) y una resina curable químicamente reactiva basada en metacrilato (Braden y col., Patente de Estados Unidos 5.468.787, 1995). Ninguno de estos enfoques ha llegado a las clínicas debido a su incapacidad de superar alguno de los siguientes problemas 1) falta de retención y adherencia del biomaterial en el defecto del cartílago 2) falta de liberación sostenida de formas activas de estas moléculas a concentraciones eficaces durante periodos de tiempo prolongados 3) múltiples e incontroladas actividades biológicas de las moléculas suministrados 4) citotoxicidad de los productos ácidos de degradación de PGA y PLA 5) cinética de degradación inapropiada o inmunogenicidad del biomaterial vehículo y 6) efectos sistémicos o ectópicos indeseables (calcificación de órganos) de los agentes biológicos activos. La puesta en práctica satisfactoria de estos enfoques espera la solución de algunos o todos estas
cuestiones.

6) Trasplante celular

Las técnicas que implican el trasplante de células han provocado mucho interés reciente debido a su capacidad de potenciar la reparación del cartílago mediante la introducción en defectos articulares, después de realización de pases y manipulación ex vivo, de un gran número de condrocitos autólogos (Grande y col., 1989; Brittberg y col., 1994 y 1996; Breinan y col., 1997), condrocitos alogénicos (Chesterman y Smith, 1968; Bently y Greer, 1971; Green, 1977; Aston y Bently, 1986; Itay y col., 1987; Wakatini y col., 1989; Robinson y col., 1990; Freed y col., 1994; Noguchi y col., 1994; Hendrickson y col., 1994; Kandel y col., 1995; Sams y Nixon, 1995; Specchia y col., 1996; Frankel y col., 1997; Hyc y col., 1997; Kawamura y col., 1998), condrocitos xenogénicos (Homminga y col., 1991), células pericondrales (Chu y col., 1995; Chu y col., 1997), o células madre mesenquimáticas derivadas de médula ósea autogénicas y alogénicas (Wakatini y col., 1994; Butnariu-Ephrat, 1996; Caplan y col., 1997; Nevo y col., 1998). El enfoque del trasplante celular posee algunas ventajas potenciales sobre otras técnicas de reparación de cartílago ya que 1) minimizan las lesiones adicionales de hueso y cartílago, 2) reducen la dependencia de donantes mediante la producción de células ex vivo, 3) podrían mimetizar procesos biológicos naturales de desarrollo del cartílago, y 4) pueden proporcionar tipos de células adaptados para realizar una mejor reparación. Una técnica que usa condrocitos autólogos es de dominio público y se encuentra disponible en el mercado, habiéndose usado en varios miles de pacientes estadounidenses y suecos (http://www.genzyme.com). En esta técnica, los condrocitos se aíslan a partir de una biopsia de cartílago de un área que no soporta carga, se hacen proliferar durante varias semanas, y se reintroducen en la lesión del cartílago por inyección bajo un parche periostal suturado y sellado con fibrina tomado de la tibia del paciente. Se ha cuestionado el conocimiento de su eficacia (Messner y Gillquist, 1996; Brittberg, 1997; Newman, 1998) y desgraciadamente no se conoce debido a la falta de finalización de un ensayo clínico controlado y aleatorizado requerido por la FDA. Recientes estudios en animales indican que los condrocitos autólogos sometidos a pases, inyectados, contribuyen muy poco a la curación observada y que el resultado es similar al obtenido usando estimulación de médula ósea (Breinan y col., 1997 y Breinan y col., 2000) Por tanto, la preparación quirúrgica del defecto podría ser el principal factor que induce la reparación también en este procedimiento. Sin embargo, dado el enorme beneficio potencial del trasplante celular, se ha concedido un gran número de patentes en los pasados dos años para proteger aspectos del procesamiento de condrocitos autólogos (Tubo y col., Patente de Estados Unidos 5.723.331, 1998; Villeneuve, Patente de Estados Unidos 5.866.415, 1999), así como el uso y la preparación de adipocitos (Mueller y Thaler, Patente de Estados Unidos 5.837.235, 1998; Halvorsen y col., Patente EP 1 077 253, 2001), precursores hematopoyéticos (Peterson y Nousek-Goebl, Patente de Estados Unidos 6.200.606, 2001), células de la membrana amniótica (Sackier, 1997), células madre mesenquimáticas (Caplan y Haynesworth, Patente de Estados Unidos 5.811.094, 1998; Naughton y Naughton, Patente de Estados Unidos 5.785.964, 1998; Naughton y Willoughby, Patente de Estados Unidos 5.842.477, 1998; Grande y Lucas, Patente de Estados Unidos 5.906.934, 1999; Johnstone y Yoo, Patente de Estados Unidos 5.908.784, 1999) y técnicas generales que usan condrocitos/fibroblastos y sus progenitores, células epiteliales, adipocitos, células de la placenta y células sanguíneas del cordón umbilical (Purchio y col., Patente de Estados Unidos 5.902.741, 1999), todas para su uso en reparación de cartílago.

7) El Problema del Suministro Celular

El trasplante de células para la reparación asistida de cartílago necesariamente implica una técnica para suministrar y retener células transplantadas viables y funcionales en el lugar de la lesión. Cuando las células se cultivan ex vivo con o sin una matriz de soporte, se puede usar un ajuste por presión preparando un implante que sea ligeramente mayor que el defecto y forzando su introducción (Aaston y Bentley 1986; Wakatani y col., 1989; Freed y col., 1994; Chu y col., 1997; Frankel y col., 1997; Kawamura y col., 1998). El ajuste por presión requiere el uso de un tejido que se ha formado ex vivo y que de esta forma no está optimizado para los factores geométricos, físicos, y biológicos del lugar en el que se implanta. Suturar o fijar el implante puede ayudar a su retención (Sams y Nixon, 1995) aunque las suturas suponen una lesión adicional para la superficie articular induciendo ya otro proceso de reparación limitado (Breinan y col., 1997). Los adhesivos biológicos se han probado con éxito limitado (Kandel y col., 1995; Jurgenson y col., 1997). Cuando el implante no es susceptible al ajuste por presión, como ocurre con geles de colágeno contráctiles o coágulos de fibrina, implantados, a menudo se usa un parche suturado de periostio u otro tejido similar para retener el material de implante dentro del lugar del defecto (Grande y col., 1989; Brittberg y col., 1994; Grande y col., 1989; Brittberg y col., 1996; Breinan y col., 1997). Dicha técnica puede beneficiarse de la capacidad del periostio de estimular la formación de cartílago (O'Driscoll y col., 1988 y 1994), pero sufre de nuevo de la introducción de suturas y la compleja naturaleza de la operación que implica la retirada del periostio y artrotomía. También se han suministrado células en defectos profundos de espesor total usando una solución viscosa de ácido hialurónico (Robinson y col., 1990; Butnariu-Ephrat, 1996). Como con fuentes celulares para reparación de cartílago, hay varias patentes recientemente publicadas para vehículos de suministro en reparación de cartílago, que varían desde matrices de gel (Griffith y col., 1998; Caplan y col., 1999), a suturas y fibras (Vacanti y col., 1998; Vacanti y Langer, 1998a y 1998b), hasta mecanismos de tipo tornillo (Schwartz, 1998) y sistemas magnéticos (Halpern, 1997). Considerando en conjunto lo anterior, las técnicas actuales de suministro de células para reparación de cartílago son claramente no óptimas. Un vehículo de suministro celular deseable sería una solución polimérica cargada con células que solidifique cuando se inyecte en el lugar del defecto, se adhiera y rellene el defecto, y proporcione un armazón temporal biodegradable para permitir la adecuada diferenciación celular y la síntesis y ensamblaje de una matriz extracelular de cartílago articular densa y mecánicamente funcional.

8) Reparación de otros tejidos incluyendo menisco, ligamento, tendón, hueso, piel, córnea, tejidos periodontales, abscesos, tumores reseccionados y úlceras

La reparación natural y asistida de tejido musculoesquelético y otros tejidos son campos muy amplios con numerosos procesos biológicos complejos y una gran diversidad de enfoques para acelerar el proceso de reparación (como en la reparación de hueso), ayudarla en tejidos que tienen poca capacidad intrínseca de reparación (como en reparación de cartílago), y para reducir la cicatrización (como en tratamientos de quemaduras) (Clark, 1996). Aunque ciertamente existen diferencias en los elementos biológicos y los procesos implicados, los acontecimientos globales en reparación de heridas (no fetal) son idénticos. Estos incluyen la formación de un coágulo sanguíneo en el lugar de la alteración del tejido, liberación de factores quimiotácticos y mitogénicos de las plaquetas, afluencia de células inflamatorias y células pluripotenciales de reparación, vascularización, y finalmente la resolución del proceso de reparación mediante la diferenciación de células de reparación y la síntesis de sus componentes de la matriz extracelular. En un resultado de reparación satisfactorio, el medio local específico del tejido y la población local específica de células pluripotenciales de reparación conducirá a la formación del tipo correcto de tejido, hueso para remplazar hueso, piel para remplazar piel etc. Dada la similitud de los elementos generales en el proceso de reparación de tejidos, no resulta sorprendente que enfoques que ayudan a la reparación en un tejido pudieran también tener algún éxito en la ayuda a la reparación de otros tejidos. Esta posibilidad se vuelve mucho más probable si el procedimiento y la composición para ayudar en la reparación se basa en aumentar algún aspecto de la cascada natural de curación de las heridas, sin desviarse significativamente de esta secuencia de acontecimientos más o menos optimizada. En la presente invención se proponen una composición y procedimientos particulares para proporcionar un coágulo sanguíneo más efectivo, adhesivo, y no contráctil en el lugar de reparación tisular. Se muestran ejemplos y realizaciones preferidos para reparación de cartílago, uno de los tejidos más difíciles de reparar. Sin embargo, la aplicación de la composición y el procedimiento y modificaciones del mismo, conservando los mismos principios básicos para ayudar a reparar otros tejidos incluyendo menisco, ligamento, tendón, hueso, piel, córnea, tejidos periodontales, abscesos, tumores reseccionados y úlceras son obvios para los especialistas en la técnica.

9) Uso de Quitosana en Productos Farmacéuticos, Curación de Heridas, Reparación de Tejidos y como Agente Hemostático

La Quitosana, que se produce principalmente por la desacetilación alcalina de la quitina, un componente natural de los caparazones de gambas y cangrejos, es una familia de polisacáridos lineales que contiene monómeros de glucosamina (predominantemente) y N-acetilglucosamina unidos en posición 1-4 (Austin y col., 1981). La quitosana y sus derivados aminosustituidos son polímeros catiónicos dependientes del pH, biodegradables y biocompatibles que se han usado en la industria biomédica para curación de heridas e inducción ósea (Denuziere y col., 1998; Muzzarelli y col., 1993 y 1994), suministro de fármacos y genes (Carreno-Gomez y Duncan, 1997; Schipper y col., 1997; Lee y col., 1998; Bernkop-Schnurch y Pasta, 1998) y en armazones para cultivo celular y encapsulación celular (Yagi y col., 1997, Eser Elcin y col., 1998; Dillon y col., 1998; Koyano y col., 1998; Sechriest y col., 2000, Lahiji y col., 2000; Suh y col., 2000). La quitosana se ha calificado como un polímero mucoadhseivo (Bernkop-Schnurch y Krejicek, 1998), ya que se adhiere a la capa mucosa de los epitelios gastrointestinales mediante interacciones iónicas e hidrófobas, facilitando de este modo el suministro de fármacos por vía oral. La biodegradabilidad de la quitosana sucede mediante su susceptibilidad a la escisión enzimática por quitinasas (Fukamizo y Brzezinski, 1997), lisozimas (Sashiwa y col. 1990), celulasas (Yalpani y Pantaleone, 1994), proteasas (Terbojevich y col., 1996), y lipasas (Muzzarelli y col., 1995). Recientemente, se ha demostrado que los condrocitos son capaces de expresar quitotriosidasa (Vasios y col., 1999), el análogo humano de la quitosanasa; su papel fisiológico puede estar en la degradación de hialorunano, un polisacárido que posee alguna similitud con la quitosana dada que se compone de disacáridos de N-acetil-glucosamina y ácido glucurónico.

La quitosana se ha propuesto en diversas formulaciones, sola o con otros componentes para estimular la reparación de tejidos dérmico, corneal y duros en varios informes (Sall y col., 1987; Bartone y Adickes, 1988; Okamoto y col., 1995; Inui y col., 1995, Shigemasa y Minami, 1996; Ueno y col., 1999; Cho y col., 1999; Stone y col., 2000; Lee y col., 2000) e invenciones (Sparkes y Murray, Patente 4.572.906, 1986; Mosbey, Patente 4.956.350, 1990; Hansson y col., Patente 5.894.070, 1999; Gouda y Larm, Patente 5.902.798, 1999; Drohan y col., Patente 6.124.273, 2000; Jorgensen documento WO 98/22114, 1998). Las propiedades de la quitosana que se citan más comúnmente como beneficiosas para el proceso de reparación de heridas son su biodegradabilidad, adhesividad, prevención de la deshidratación y como barrera contra las invasiones bacterianas. Otras propiedades que también se han atribuido son su naturaleza activadora celular y quimioatrayente (Peluso y col., 1994; Shigemesa y Minami, 1996; Inui y col., 1995), su actividad hemostática (Malette y col., 1983; Malette y Quigley, Patente 4.532.134, 1985) y una capacidad aparente para limitar la fibroplasia y cicatrización promoviendo un tipo de tejido de granulación más suelto (Bartone y Adickes, 1988; Stone y col., 2000). Aunque es evidente un consenso general sobre los efectos beneficiosos de la quitosana en la curación de heridas, no se conoce su mecanismo exacto de acción, ni el medio más eficaz para su aplicación, es decir, en forma de polvo, suspensión, esponja, membrana, gel sólido, etc. Parte de la razón para la ambigüedad en su mecanismo de acción podría ser que muchos estudios previos usaron quitosana que no estaba químicamente definida (contenido y distribución de acetilo, peso molecular) y de pureza desconocida. El interesante potencial hemostático de la quitosana también ha conducido a su aplicación directa para reducir la hemorragia en zonas de injertos y heridas (Malette y col., 1983; Malette y Quigley, Patente 4.532.134, 1985). Algunos estudios afirman que la actividad hemostática de la quitosana deriva únicamente de su capacidad para aglutinar glóbulos rojos (Rao y Sharma, 1997) mientras otros creen que su carácter de amina policatiónica puede activar a las plaquetas para liberar trombina e iniciar la clásica cascada de coagulación, lo que ha conducido a su uso como hemostático en combinación con fibrinógeno y plaquetas autólogas purificadas (Cochrum y col. Patente 5.773.033, 1998). En el contexto de la presente invención, es importante observar en estos informes e invenciones una completa ausencia de cualquier ejemplo en el que se mezclase sangre con quitosana en solución y se aplicase terapéuticamente para ayudar a la reparación tisular a través de la formación de un coágulo sanguíneo que contenga quitosana en el lugar de la reparación.

Una dificultad técnica que a menudo presenta la quitosana es una baja solubilidad a pH y fuerza iónica fisiológicos, limitando de este modo su uso en estado de solución. Por tanto, típicamente se consigue la disolución de quitosana mediante la protonación de los grupos amina en soluciones ácidas acuosas que tienen un pH que varía de 3,0 a 5,6. Tales soluciones de quitosana permanecen solubles hasta un pH cercano a 6,2 donde la neutralización de los grupos amina reduce la repulsión electrostática entre las cadenas y permite que las fuerzas atrayentes de interacción de tipo puente de hidrógeno, hidrófobas y de van der Waals provoquen la precipitación polimérica a un pH cerca de 6,3 a 6,4. Una invención anterior (Patente WO 99/07416 para Chenite; Chenite y col., 2000) ha mostrado que añadiendo una sal dibásica de poliol-fosfato (es decir, glicerol-fosfato) a una solución de quitosana puede aumentar el pH de la solución a la vez que se evita la precipitación. En presencia de estas sales particulares, las soluciones de quitosana de concentración sustancial (0,5-3%) y alto peso molecular (> varios cientos de kDa) permanecen líquidas a temperatura baja o ambiente durante un largo periodo de tiempo con un pH en una región neutra fisiológicamente aceptable entre 6,8 y 7,2. Este aspecto facilita la mezcla de quitosana con células de una forma que mantiene su viabilidad. Una propiedad adicional importante es que tales soluciones acuosas de quitosana/poliol-fosfato (C/PP) solidifican o gelifican cuando se calientan a una temperatura apropiada que permite que se inyecten las soluciones de quitosana/células mixtas en lugares del cuerpo en los que, por ejemplo, se pueden formar nódulos cartilaginosos en espacios subcutáneos en ratones desnudos (Chenite y col., 2000). Es importante observar que algunos estudios diferentes han retenido quitosana en estado soluble a pH fisiológico pero estos estudios requerían reducir la concentración de quitosana (hasta un 0,1% en Lu y col. Biomaterials 1999) o el peso molecular y grado de desacetilación de la quitosana (hasta \sim350kD y un 50% respectivamente en Cho y col. Biomaterials, 1999). Otros estudios también han mostrado que la quitosana presenta un microambiente que sostiene los fenotipos de condrocitos y osteoblastos (Suh y col., 2000; Lahiji y col., 2000; Seichrist y col., 2000), sin embargo, estos estudios no se basaban en quitosana líquida en una forma que pudiese mezclarse con células e inyectarse. Finalmente, se han empapado esponjas de N,N-dicarboxilmetil quitosana con BMP7 y se han situado en defectos osteocondrales de conejos (Mattioli-Belmonte, 1999). Aquí se observó de nuevo algún resultado histoquímico e inmunohistoquímico mejorado, sin embargo, parece que el llenado incompleto del defecto con tejido de reparación y una dificultad significativa para retener la construcción en el interior del defecto son problemas insuperables. La presente invención supera estas cuestiones y presenta varias soluciones novedosas para el suministro de composiciones para la reparación de cartílago y otros tejidos.

10) Sumario de la Técnica Anterior

En el sumario de la técnica anterior para reparación asistida de cartílago, puede decirse que se han propuesto y ensayado experimentalmente muchas técnicas para mejorar la muy limitada respuesta de reparación natural del cartílago articular. Algunas de estas técnicas han conseguido un cierto nivel de aceptación en la práctica clínica pero esto se ha debido principalmente a la ausencia de cualquier procedimiento práctico y claramente eficaz para mejorar la respuesta de reparación en comparación con el que se obtiene cuando se aplica la familia de técnicas de estimulación de la médula ósea. Esta invención trata y resuelve varios de los principales asuntos problemáticos en el uso de células y componentes sanguíneos para reparar cartílago articular. Un obstáculo principal para el desarrollo de un procedimiento eficaz de reparación de cartílago es la ausencia de una composición y un procedimiento para proporcionar un medio macromolecular apropiado en el interior del espacio que requiere el crecimiento del cartílago (defecto de cartílago u otro lugar que requiera masificación o reconstrucción tisular). Este medio o matriz macromolecular debe 1) ser susceptible de cargarse con elementos biológicos activos (células, proteínas, genes, sangre, componentes sanguíneos) en estado líquido 2) ser entonces inyectable en el lugar del defecto para rellenar todo el defecto o la región completo que requiera el crecimiento del cartílago 3) presentar un medio principalmente no proteico para limitar la adhesión celular y la contracción de la matriz medida por células, ambos cuales inducen un fenotipo celular fibrocítico (productor de tejido fibroso) en lugar de un fenotipo celular condrocítico (productor de tejido cartilaginoso) y que puede también separar la matriz de las paredes del defecto 4) ser citocompatible, teniendo niveles fisiológicos de pH y presión osmótica y una ausencia de cualquier elemento citotóxico 5) ser degradable pero estar presente durante un periodo de tiempo suficientemente largo para permitir que los elementos biológicamente activos incluidos reconstituyan un tejido cartilaginoso capaz de soportar la carga mecánica sin degradación. Además es obvio para los especialistas en la técnica que tal combinación de características podría aplicarse con modificaciones mínimas para la reparación de otros tejidos tales como menisco, ligamento, tendón, hueso, piel, córnea, tejidos periodontales, abscesos, tumores reseccionados y úlceras.

Sería altamente deseable que se proporcionase una composición para su uso en reparación y regeneración de tejidos cartilaginosos.

Sumario de la invención

Un objetivo de la presente invención es proporcionar una nueva composición para su uso en la reparación y regeneración de tejidos cartilaginosos.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona por tanto una composición para su uso en la reparación, regeneración, reconstrucción o masificación de tejidos cartilaginosos u otros tejidos tales como menisco, ligamento, tendón, hueso, piel, córnea, tejidos periodontales, abscesos, tumores reseccionados y úlceras.

De acuerdo con la presente invención, se describe también el uso de una solución polimérica que puede mezclarse con elementos biológicos y situarse o inyectarse en una parte del cuerpo en la que la mezcla ayude a la reparación, regeneración, reconstrucción o masificación de tejidos. Los tejidos reparados incluyen, por ejemplo, sin limitación cartílago, menisco, ligamento, tendón, hueso, piel, córnea, tejidos periodontales, abscesos, tumores reseccionados y úlceras.

La presente invención se refiere a una composición polimérica para su uso en la reparación de un tejido de un paciente. La composición se mezcla con al menos sangre entera, produciendo dicha composición cuando se mezcla con sangre entera una mezcla, pasando dicha mezcla a un estado no líquido con el tiempo o tras la aplicación de calor. La mezcla se retiene en el lugar de la introducción y se adhiere al mismo para reparar el tejido. La composición polimérica comprende un polímero y se disuelve o se suspende en un tampón que contiene una sal inorgánica u orgánica.

El polímero es preferiblemente un polisacárido modificado o natural.

La composición de la invención puede usarse en un procedimiento para reparar un tejido de un paciente, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de introducir en dicho tejido una composición en gel polimérica dependiente de la temperatura de modo que dicha composición se adhiere al tejido y promueve el soporte para la proliferación celular para reparar el tejido.

La composición consta de sangre entera.

A continuación en este documento se describe un procedimiento para reparar un tejido de un paciente, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de introducir un composición polimérica en dicho tejido, siendo dicha composición polimérica miscible con al menos un componente sanguíneo, produciendo dicha composición polimérica cuando se mezcla con dicho componente sanguíneo una mezcla, pasando dicha mezcla a un estado no líquido con el tiempo o tras la aplicación de calor, reteniéndose dicha mezcla en el lugar de la introducción y adhiriéndose al mismo para reparar el tejido.

El polímero usado en la invención puede ser un polisacárido modificado o natural, tal como quitosana, quitina, hialuronano, glicosaminoglicano, sulfato de condroitina, sulfato de queratina, sulfato de dermatano, heparina o sulfato de heparina.

La composición polimérica puede comprender una proteína natural, recombinante o sintética tal como colágeno soluble o gelatina soluble o un poliaminoácido, tal como por ejemplo una polilisina.

La composición polimérica puede comprender ácido poliláctico, ácido poliglicólico, homocopolímeros y copolímeros de bloque sintéticos que contienen funcionalidades carboxílicas, amino, sulfónicas, fosfónicas, fosfénicas con o sin funcionalidades adicionales tales como, por ejemplo, sin limitación, hidroxilo, tiol, alcoxi, ariloxi, aciloxi, y aroiloxi.

La composición polimérica preferiblemente se disuelve o se suspende inicialmente en un tampón que contiene sales inorgánicas tales como cloruro de sodio, fosfato, sulfato y carboxilato de potasio, calcio y magnesio.

La composición polimérica puede disolverse o suspenderse en un tampón que contiene una sal orgánica tal como glicerol-fosfato, fructosa fosfato, glucosa fosfato, L-serina fosfato, adenosina fosfato, glucosamina, galactosamina, HEPES, PIPES y MES.

La composición polimérica tiene preferiblemente un pH entre 6,5 y 7,8 y una osmolaridad ajustada a un valor fisiológico entre 250 mOsm/l y 600 mOsm/l.

La sangre puede ser, por ejemplo, sin limitación, sangre venosa, sangre arterial, sangre de un hueso, sangre de la médula ósea, médula ósea, sangre de cordón umbilical o sangre de placenta. También puede comprender eritrocitos, leucocitos, monocitos, plaquetas, fibrinógeno, trombina o plasma rico en plaquetas libre de eritrocitos.

La sangre también puede comprender un anticoagulante tal como citrato, heparina o EDTA. Por el contrario, la sangre también puede comprender un pro-coagulante tal como trombina, calcio, colágeno, ácido elágico, epinefrina, adenosina difosfato, factor tisular, un fosfolípido y un factor de coagulación como el factor VII para mejorar la coagulación/solidificación en el lugar de la introducción.

La sangre puede ser autóloga o no autóloga

La composición polimérica se usa preferiblemente en una proporción que varía de 1:100 a 100:1 con respecto a la sangre.

La composición polimérica y la sangre entera se mezclan preferiblemente de forma mecánica usando ondas sonoras, agitación, agitación con vórtice, o pases múltiples en jeringas.

La composición polimérica puede comprender quitosana al 1,5% p/v.

Los tejidos que se pueden reparar o regenerar son por ejemplo sin limitación cartílago, menisco, ligamento, tendón, hueso, piel, córnea, tejidos periodontales, abscesos, tumores reseccionados o úlceras. En algunos casos, el lugar de la introducción en el cuerpo pude prepararse quirúrgicamente para eliminar tejidos anormales. Dicho procedimiento puede realizarse mediante perforado, raspado o taladrado en regiones tisulares adyacentes o regiones vascularizadas para crear canales para que la composición polimérica migre hacia el lugar que requiere reparación.

A continuación en este documento se describe una solución de quitosana para su uso en suministro celular para reparar o regenerar un tejido in vivo, comprendiendo dicha solución de quitosana, quitosana al 0,5-3% p/v y estando formulada para ser termogelificante, estando mezclada dicha solución con células antes de inyectarse en un tejido a reparar o regenerar. La solución puede inducirse a termogelificar mediante la adición de fosfato, glicerol fosfato o glucosamina, sólo por citar algunos ejemplos. Preferiblemente, la solución de quitosana tiene un pH entre 6,5 y 7,8.

Las células pueden seleccionarse por ejemplo entre el grupo constituido por células primarias, células sometidas a pases, células seleccionadas, plaquetas, células estromales, células madre, y células genéticamente modificadas. Las células preferiblemente se suspenden en una solución vehículo tal como una solución que contiene ácido hialurónico, hidroxietilcelulosa, colágeno, alginato o un polímero soluble en agua.

También se describe una solución gelificante de quitosana para su uso en cultivo de células in vitro, comprendiendo dicha solución de quitosana, quitosana al 0,5-3% p/v y estando formulada para ser termogelificante, estando mezclada dicha solución con las células antes de cultivarse in vitro. Preferiblemente, la composición polimérica de este medio de cultivo contiene quitosana desacetilada entre el 0,01 y el 10% p/v y del 20% al 100% con un peso molecular medio que varía de 1 kDa a 10 Mda y sangre.

La invención también se refiere al uso de la composición polimérica de la invención como se ha descrito anteriormente para la fabricación de un medicamento para la reparación tisular.

Preferiblemente, el tejido a reparar se selecciona del grupo constituido por cartílago, menisco, ligamento, tendón, hueso, piel, córnea, tejidos periodontales, abscesos, tumores reseccionados, y úlceras y preferiblemente dicho tejido es cartílago.

Para el propósito de la presente invención, se definen a continuación los siguientes términos.

Las expresiones "polímero" o "solución polimérica", ambos intercambiables en la presente solicitud pretenden significar sin limitación una solución polimérica, una suspensión polimérica, un particulado o polvo polimérico y una suspensión micelar polimérica.

El término "reparación" cuando se aplica a cartílago y otros tejidos pretende significar sin limitación reparación, regeneración, reconstrucción, reconstitución o masificación de tejidos.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A a 1F son representaciones esquemáticas de la mezcla de solución polimérica con células y la solidificación y cultivo in vitro para el crecimiento de cartílago;

Las Figuras 2A a 2C ilustran la viabilidad de los condrocitos después de la encapsulación y el cultivo en gel de quitosana/glicerol-fosfato;

Las Figuras 3A a 3E ilustran la formación de cartílago en gel de quitosana in vitro, medida por la acumulación de glicosaminoglicano (GAG);

La Figura 4 ilustra un análisis de protección de ARNasa de ARNm específicos de cartílago expresados por condrocitos primarios cultivados en gel de quitosana durante 0, 14 y 20 días;

La Figura 5 ilustra un análisis de transferencia de western de proteínas específicas de cartílago expresadas por condrocitos primarios cultivados en gel de quitosana durante 0, 14 y 20 días;

La Figura 6 ilustra un comportamiento mecánico de discos de gel cultivados con y sin condrocitos;

La Figura 7 es una representación esquemática de mezcla polimérica con células e inyección subcutánea en ratones;

Las Figuras 8A y 8B ilustran una histología con azul de toluidina de cartílago que ha crecido subcutáneamente en ratones desnudos;

La Figura 9 ilustra un análisis de protección de ARNasa de ARNm específicos de cartílago expresados en implantes in vivo de gel de quitosana con o sin condrocitos primarios;

La Figura 10 ilustra un análisis de transferencia de western de proteínas de cartílago expresadas in vivo en implantes de ratones de gel de quitosana que alberga condrocitos primarios;

La Figura 11 ilustra las propiedades mecánicas de implantes de cartílago que han crecido subcutáneamente en ratones desnudos;

Las Figuras 12A y 12B ilustran adhesión de solución termogelificante de quitosana a defectos sólo condrales en cóndilos femorales porcinos de articulaciones intactas ex vivo;

Las Figuras 13A y 13B ilustran la carga de solución termogelificante de quitosana en defectos condrales en conejos, y 24 horas de residencia in vivo;

La Figura 14 ilustra la retención de solución termogelificante de quitosana en defectos condrales en conejos, 24 horas después de la inyección;

La Figura 15A es una representación esquemática mostrando la preparación, mezcla y solidificación in vitro de una mezcla de sangre/polímero;

Las Figuras 15B y 15C ilustran la solidificación in vitro de sangre líquida/polímero en un pocillo (Figura 15B) o tubo (Figura 15C) de agarosa compuesto de vidrio o plástico;

La Figura 16 ilustra un tiempo medio de solidificación de una mezcla de sangre/quitosana frente a sangre sola usando sangre de tres especies diferentes;

La Figura 17A ilustra una contracción de coágulo de sangre o mezclas de sangre/polímero, medida por la liberación de plasma con el tiempo, después de la deposición en un vial de vidrio;

Las Figuras 17B y 17C ilustran el aspecto físico de sangre sólida y de mezclas de sangre/polímero, 28 horas después de la contracción, en tubos de vidrio (Figura 17B) o como discos hinchables libres moldeados en pocillos de agarosa e incubados en tampón de Tyrode (Figura 17C);

La Figura 18 ilustra una mezcla de quitosana líquida, pero no otras soluciones líquidas de polisacáridos, invirtiendo una anti-coagulación mediada por heparina;

Las Figuras 19A a 19C ilustran una histología de mezcla de sangre/polímero;

Las Figuras 20A y 20B ilustran la viabilidad de leucocitos y plaquetas después de la mezcla con una solución de quitosana;

La Figura 21 ilustra una liberación prolongada de proteínas sanguíneas a partir de una mezcla formada in vitro de sangre/polímero frente a sangre sola;

Las Figuras 22A a 22C ilustran la preparación, mezcla e inyección de mezcla de polímero/sangre para mejorar la curación de defectos de cartílago articular;

Las Figuras 22D y 22E son una representación esquemática de terapia para curar cartílago articular humano;

Las Figuras 23A y 23B ilustran quimiotaxis mejorada de células de reparación que se originan en la médula ósea y que migran hacia el defecto de cartílago, 1 semana después del suministro de la mezcla de sangre/polímero a un defecto condral con agujeros penetrantes en el hueso; y

Las Figuras 24A y 24B ilustran el crecimiento de cartílago hialino en defectos tratados con una mezcla de sangre/polímero frente al crecimiento de tejido fibrótico en defectos no tratados.

Descripción detallada de la invención

Cuando se combina con sangre, el polímero podría estar en una solución acuosa o en una suspensión acuosa, o en un estado particulado, siendo las características fundamentales de la preparación del polímero que 1) es miscible con sangre, 2) que le mezcla resultante es inyectable o puede colocarse sobre o en una parte del cuerpo que requiera reparación, regeneración, reconstrucción o masificación tisular y 3) que le mezcla tiene un efecto beneficioso sobre la reparación, regeneración, reconstrucción o masificación de tejido en el lugar de emplazamiento.

Una realización preferida se muestra en el Ejemplo 5 donde una solución del polisacárido natural, quitosana, se usó a una concentración del 1,5% p/v y en 0,135 moles/l de tampón glicerol fosfato disódico a pH = 6,8. Esta solución se mezcló con sangre periférica de conejo en una proporción de 1 parte de solución polimérica por 3 partes de sangre. La mezcla de polímero/sangre se inyectó después en un defecto de cartílago articular quirúrgicamente preparado en el conejo, donde solidificó en 5 minutos (Figura 22). Observaciones histológicas del proceso de curación mostraron una reparación estimulada que produjo cartílago hialino después de 6-8 semanas (Figura 24). Los defectos de control que no recibieron la mezcla de polímero/sangre se curaron de forma incompleta o se curaron con un tejido fibroso o fibrocartilaginoso no funcional (Figura 24). Este ejemplo demuestra que el uso de una mezcla de polímero/sangre puede provocar una curación más eficaz y una mayor funcionalidad del tejido reparado que simplemente induciendo hemorragias en el lugar de la herida. Modificaciones triviales de esta invención son evidentes para los especialistas en la técnica. La solución de quitosana puede sustituirse por otros polímeros y otras formulaciones de polímeros o mezclas poliméricas siempre que mantengan las tres características citadas en el párrafo anterior. Y claramente, este enfoque pude aplicarse de forma trivial en la reparación de tejidos distintos del cartílago tales como menisco, ligamento, tendón, hueso, piel, córnea, tejidos periodontales, abscesos, tumores reseccionados, y úlceras. Las aplicaciones en la masificación y reconstrucción de tejido también son evidentes.

Se presentan ejemplos y pruebas para mostrar posibles mecanismos de acción de esta invención incluyendo 1) inhibición de la típica contracción mediada por plaquetas de un coágulo sanguíneo mezclando sangre con polímero antes de la solidificación (Figura 17) 2) el armazón de volumen total mantenido resultante y por lo tanto un mejor relleno del defecto para la reparación tisular (Figura 18) 3) adherencia de la mezcla solidificada de polímero/sangre a los tejidos adyacentes (Figura 22A) 4) una liberación más lenta de factores proteicos quimiotácticos y mitogénicos a partir de la mezcla de polímero/sangre que a partir de un coágulo sanguíneo simple (Figura 21) 5) mantenimiento de la viabilidad de leucocitos y plaquetas en la mezcla de polímero/sangre (Figura 20) y 6) suministro de un ambiente polisacárido en el sitio de reparación que es más conducente a la formación de cartílago que una matriz puramente proteica (Figuras 2-6, 8-10, 24). Se ha demostrado que estos fenómenos suceden en los ejemplos.

Su demostración no descarta, sin embargo, la posibilidad de que sucedan otros acontecimientos importantes tales como los que implican la cinética de degradación celular del polímero, y la unión/concentración de factores endógenos por la quitosana.

Los Ejemplos 1 y 2 describen, como antecedentes de la invención, una solución termogelificante de quitosana usada para suministrar condrocitos primarios a regiones subcutáneas en ratones o a cámaras de cultivo in vitro. En este caso, la ausencia de componentes sanguíneos requiere una capacidad gelificante por parte de la solución de quitosana sola, y esta propiedad se consigue mediante una preparación particular de la solución de quitosana utilizando glicerol fosfato y otros tampones similares. En estos ejemplos se demuestra que la solución polimérica puede mezclarse con células y la solución de polímero/células puede inyectarse in vivo o in vitro después de lo cual melifica, manteniendo la funcionalidad y viabilidad de las células (Figuras 1-11). Las células pueden resuspenderse en un tampón fisiológico, u otra suspensión vehículo celular tal como celulosa en un tampón isotónico, antes de mezclarse con la solución de quitosana. Se muestran datos que demuestran la formación de tejido cartilaginoso in vitro (Figuras 2-6) e in vivo (Figuras 8-11) donde se inyectan condrocitos primarios con esta solución polimérica. Se pueden usar otros tipos celulares y se pueden cambiar las concentraciones de quitosana y de tampón para conseguir el mismo resultado.

El Ejemplo 3 describe el uso de quitosana termogelificante in vivo, sin sangre o células como antecedente de la invención.

La presente invención se entenderá más fácilmente refiriéndose a los siguientes ejemplos, que se dan para ilustrar la invención en lugar de limitar su alcance.

Ejemplo 1 Mezcla de solución termogelificante de quitosana con condrocitos primarios para crecimiento in vitro de cartílago

Se esterilizó quitosana (0,22 g, desacetilada al 85%) en forma de una sal HCl en polvo por exposición a radiación ultravioleta en una campana biológica de flujo laminar y después se disolvió en 7,5 m de H_{2}O produciendo un pH cercano a 5,0. Se disolvió D(+)-glucosamina (0,215 g, PM 215,6) en 10 ml de NaOH 0,1 M y se esterilizó por filtración usando un filtro de disco de 22 \mum de tamaño de poro. Se disolvió glicerol fosfato (0,8 g, PM 297 incluyendo 4,5 moles de agua por mol de glicerol fosfato) en 2,0 ml de H_{2}O y se esterilizó por filtración usando un filtro de disco de 22 \mum de tamaño de poro. Se añadieron gota a gota 2,25 ml de la solución de glucosamina en condiciones de esterilidad a la solución de quitosana con agitación a una temperatura de 4ºC. Se añadió después 1 ml de la solución de glicerol fosfato en las mismas condiciones. Esta solución final todavía es líquida y permanece así durante un largo periodo de tiempo (es decir, días) si la temperatura se mantiene baja, es decir, cercana a 4ºC. El pH de esta solución es fisiológico a 6,8 y la osmolaridad también es fisiológica, alrededor de 376 mOsm/kg-H_{2}O. Es de crítica importancia mantener estos dos parámetros en los límites requeridos para mantener la viabilidad celular. Estos límites varían con el tipo celular pero son generalmente 6,6 < pH < 7,8 y 250 mOsm/kg-H_{2}O < osmolaridad < 450 mOsm/kg-H_{2}O. Se prepara una solución disolviendo 150 mg de hidroxietilcelulosa (Fluka) y 6 ml de DMEM (Medio de Eagle modificado por Dulbecco), y se esteriliza por filtración usando un filtro de disco de 22 \mum de tamaño de poro. Se resuspende un sedimento celular con 2 ml de una solución de hidroxietilcelulosa-DMEM y se mezcla en la solución de quitosana-glicerol fosfato. Como control negativo se generó la solución de quitosana mezclada con 2 ml de solución de hidroxietilcelulosa-DMEM sin células. Cuando esta solución se calienta a 37ºC se transforma en un hidrogel sólido de forma similar a la solución termogelificante descrita en una invención previa (Chenite y col., Patente WO 99/07416). De manera más relevante, esta invención anterior no demostró que se mantuviera la viabilidad celular durante todo el proceso de termogelificación en esta solución de quitosana, y por tanto no permitió el uso de esta solución de quitosana para el suministro celular, reparación tisular y regeneración tisular.

La solución anterior en estado líquido a 4ºC se mezcló con condrocitos primarios aislados enzimáticamente (Buschmann y col., 1992) y después se vertió en una placa de cultivo de plástico (Figuras 1A a 1F) En la Figura 1A, se resuspende y se mezcla un sedimento celular (Figura 1B) en la solución líquida de gel de quitosana a 4ºC. En las Figuras 1C y 1D, la solución líquida se vierte en una placa petri de cultivo tisular y se deja solidificar a 37ºC durante 30 minutos, después de lo cual el gel sólido con células se lava con DMEM, y se perforan los discos usando un punzón de biopsia. El la Figura 1E, se disponen rejillas de malla de 1000 \mum de poro en placas de 48 pocillos. En la Figura 1F, los discos de gel de quitosana se disponen en cultivo en pocillos individuales.

Se formó un gel que alberga células después de 20 minutos de incubación a 37ºC. Usando un punzón de biopsia, se perforaron discos de 6 mm de diámetro y 1 mm de espesor a partir del gel y se colocaron en cultivo durante un tiempo de hasta 3 semanas. Los discos se cultivaron individualmente en placas de cultivo tisular de 48 pocillos con mallas de nylon estériles 1000 \muM debajo para permitir el acceso del medio a todas las superficies. Más del 90% de las células encapsuladas fueron viables inmediatamente después de la encapsulación, y durante todo el periodo de cultivo (Figuras 2A a 2C). Se incubaron muestras en calceína AM y homodímero-1 de etidio para poner de manifiesto las células vivas (verdes) y muertas (rojas). Los condrocitos recién aislados (Figura 2A) se encapsularon en el gel, solidificaron y se ensayo su viabilidad inmediatamente (Figura 2B), o después de 20 días de cultivo en el gel (Figura 2C). La Figura 2C muestra células con morfología típica de condrocitos de la parte central del gel.

Varios tipos distintos de células mostraron el mismo alto grado de viabilidad después de la encapsulación y el cultivo celular, incluyendo Rat-1, COS, 293T y condrocitos articulares bovinos desdiferenciados, confirmando que el proceso de gelificación mantenía la viabilidad celular y podía, por tanto, usarse para suministrar células in vivo por inyección. La tinción del gel con células con azul de toluidina después de 22 días de cultivo puso de manifiesto un anillo metacromático de tinción alrededor de los condrocitos primarios encapsulados, indicando la formación de proteoglicano, o GAG, que estaba empezando a condensar entre células estrechamente adyacentes (Figura 3D). Estas regiones también se tiñeron con anticuerpos surgidos contra agrecano, colágeno de tipo II y proteína de unión. También se descubrió que la matriz de gel de quitosana se unía a azul de Toluidina (Figura 3C). Esta propiedad permitió observar la estructura enrejada del gel, después de emplear una fijación de aldehído. Es interesante observar que el anillo pericelular de GAG observado alrededor de los condrocitos contenía poca matriz de quitosana, pareciendo que esta última se había degradado por factores producidos por los condrocitos (Figura 3D). Se encapsularon condrocitos primarios de ternera en gel de quitosana a 2 x 10^{7} condrocitos primarios por ml y se cultivaron en forma de discos de 6 mm durante hasta 20 días. Se encapsularon condrocitos primarios de ternera y se cultivaron en agarosa al 2% y se analizaron en paralelo. Se procesaron los cultivos del día 0 y día 20 por seccionado en parafina y tinción con azul de toluidina para los cultivos en gel de agarosa (Figuras 3A y 3B) y los cultivos en gel de quitosana (Figuras 3C y 3D). En el día=0, los núcleos se tiñen de azul oscuro (Figuras 3A y 3C) mientras que el GAG pericelular acumulado se tiñe en azul-violeta metacromático (Figuras 3B y 3D, flechas grandes). Estas regiones pericelulares eran inmunopositivas para agrecano, colágeno (II) y proteína de unión del cartílago. A un aumento de 40X en la Figura 3E, ensayos bioquímicos cuantitativos del GAG presente en los días 0, 14 y 20 del cultivo usando en ensayo DMMB pusieron de manifiesto una acumulación similar de GAG en el gel de quitosana comparado con el gel de agarosa.

Análisis de ARN del ARNm de colágeno de tipo II y agrecano expresado por los condrocitos encapsulados pusieron de manifiesto altos niveles en los días 14 y 22 de cultivo (Figura 4, carriles 4 y 5) que eran comparables con los niveles observados en condrocitos articulares en cartílago (Figura 4, carril 6). Se hibridó una mezcla de sondas de ARN marcadas con ^{32}P antisentido complementarias a colágeno bovino de tipo II, agrecano y GAPDH con ARNt (carril 1), o ARN total, de riñón de bovino (carril 2), de condrocitos primarios (10^{7}/ml) cultivados en gel de quitosana durante 0 días (carril 3), 14 días (carril 4) o 20 días (carril 5), o cartílago articular bovino adulto (carril 6). Las muestras se trataron con ARNasa A y T1, después se sometieron a electroforesis y autorradiografía. Las bandas protegidas que muestran la presencia de transcritos individuales son como se ha indicado. El mantenimiento del fenotipo de condrocito en el gel de quitosana/glicerol fosfato se muestra por la expresión continuada de agrecano y colágeno de tipo II.

El análisis de western de proteínas producidas por las células encapsuladas mostró una acumulación de proteína de unión de la matriz del cartílago entre 2 y 3 semanas en cultivo (Figura 5). Se extrajeron las proteínas totales, se separaron por SDS-PAGE y se procesaron por inmunotransferencia con antisueros que reconocían vimentina, PCNA, el propéptido-C de colágeno de tipo II o la proteína de unión de cartílago. Las muestras analizadas incluyen gel de quitosana sin células (carril 1), riñón bovino (carril 2), muestras duplicadas de condrocitos primarios (10^{7}/ml) cultivados en gel de quitosana en el día=0 (carriles 3 y 4), día=14 (carriles 5 y 6) o día=20 (carriles 7 y 8), cartílago articular de ternera de 2 semanas (carril 9), o cartílago bovino adulto (carril 10). Los resultados muestran la acumulación de proteínas específicas del cartílago CP2 y de unión en los días 14 y 20, así como la persistencia de la expresión de PCNA hasta el día 20 de cultivo, como marcador de la proliferación celular.

Los discos que contenían condrocitos primarios articulares bovinos se evaluaron mecánicamente en los días 4 y 13 de cultivo usando ensayos de relajación de la tensión por compresión no reducida uniaxial. Comparando con geles de control sin células, se observó un grado significativo de compactación dependiente de las células incluso en el día 4 y se hizo mucho más drástico en el día 13 (Figura 6). Los discos (\sim5 mm de diámetro) de los días 4, 13 y 19 de cultivo se ensayaron mecánicamente en compresión no reducida aplicando 5 desniveles del 10% del espesor del disco (\sim1,5 mm) durante 10 segundos y manteniendo ese desplazamiento durante la posterior relajación de la tensión (el 2º desnivel del 10-20% se muestra en el gráfico). Los discos de gel sin células presentaron un comportamiento débil mientas que los geles cargados con células se volvieron más compactas de forma evidente con el tiempo en cultivo y más característicamente viscoelásticas, como el cartílago articular.

Analizando estos datos con una modelo poroelástico compuesto (Soulhat y col., 1999) se descubrió una duplicación del módulo de la matriz no fibrilar (2,5\rightarrow5 kPa), también se encontró un aumento de cinco veces en el módulo de la matriz fibrilar (100\rightarrow500 kPa) junto con una reducción cercana a las 100 veces de la permeabilidad hidráulica (5\rightarrow0,08 x 10-12 N-s/m4) debido a la presencia de condrocitos primarios en estos geles durante sólo 13 días de cultivo in vitro. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que el gel de quitosana es citocompatible y citodegradable, conducente al mantenimiento del fenotipo de condorcito, y permite la elaboración de una matriz neo-cartilaginosa con un aumento significativo de la consistencia in vitro.

Ejemplo 2 Mezcla de la solución termogelificante de quitosana con condrocitos primarios e inyección subcutánea para crecimiento in vivo de cartílago

Para demostrar que este sistema gelificante in situ puede emplearse en animales, se sometió a ratones atímicos (CD1 nu/nu) a inyecciones dorsales, subcutáneas de 100 a 300 \mul de gel de quitosana descrito en el Ejemplo 1, que contenía 10 millones de condrocitos articulares de ternera por ml (Figura 7). Se mezcló un sedimento celular de condrocitos primarios de ternera con el gel líquido de quitosana a 4ºC para conseguir una concentración de 1 a 2 x 10^{7} células/ml, y se inyectó en forma líquida como implantes dorsales subcutáneos de 100 \mul en ratones desnudos anestesiados. La gelificación in situ fue evidente por palpación al cabo de 5 a 10 minutos después de la inyección.

A los ratones de control se les inyectó de forma similar gel de quitosana solo. Se formó un gel palpable en 10 minutos desde la inyección. Los implantes se recuperaron en los 21, 48 y 63 días después de la inyección. La tinción con azul de Toluidina puso de manifiesto la gran producción de matriz extracelular rica en GAG a partir de los implantes que contenían células (Figura 8A). No se observó acumulación de GAG en los implantes de gel de quitosana solo (Figura 8B). Se inyectaron condrocitos primarios de ternera a 2 x 10^{7} células/ml de gel líquido de quitosana en forma líquida como implantes dorsales subcutáneos en ratones desnudos anestesiados. Los ratones de control recibieron implantes subcutáneos dorsales de 100 \mul de gel de quitosana solo. Se recogieron los implantes y se procesaron 48 días después de la inyección, para histología en parafina y tinción con azul de toluidina. La tinción violeta metacromática pone de manifiesto la acumulación de GAG en el implante con condrocitos (Figura 8A) No se detectó acumulación de GAG en el implante de gel de quitosana solo (Figura 8B).

Se detectó expresión de ARNm específico de cartílago, colágeno de tipo II y agrecano en los implantes in vivo con condrocitos primarios en el día 48 después de la inyección (Figura 9).

No se detectó expresión de colágeno de tipo II o agrecano en los implantes de gel de quitosana solo (Figura 9). Se hibridó una mezcla de sondas de ARN marcado con ^{32}P antisentido complementarias a colágeno de tipo II, agrecano y GAPDH bovinos con ARNt (carril 1), o ARN total, de riñón bovino (carril2), de implantes en ratón desnudo con gel de quitosana solo en el día=48 in vivo (carril 3) o implantes de gel de quitosana con condrocitos primarios a 2 x 10^{7} células/ml en el día=48 in vivo (carril 4), o cartílago articular bovino adulto (carril 5). Las muestras se trataron con ARNasa A y T1, después se sometieron a electroforesis y autorradiografía. Las bandas protegidas que muestran la presencia de transcritos individuales son como se ha indica. El mantenimiento in vivo del fenotipo de condrocito en el gel de quitosana/glicerol-fosfato se muestra por la expresión de agrecano y colágeno de
tipo II.

En los implantes in vivo con condrocitos primarios de los días 48 y 63 después de la inyección se detectaron proteínas específicas de cartílago (Figura 10). No se detectaron proteínas específicas de cartílago en los implantes con gel de quitosana solo (Figura 10). Se extrajeron las proteínas totales, se separaron por SDS-PAGE y se procesaron por inmunotransferencia con antisueros que reconocían vimentina, PCNA, el propéptido C del colágeno de tipo II, o la proteína de unión de cartílago. Las muestras analizadas incluyen gel de quitosana sin células (carril 1), riñón bovino (carril 2), dos distintos implantes in vivo de gel de quitosana solo en ratones desnudos en el día 63 (carriles 3 y 4), de implantes in vivo de gel de quitosana con 2 x 10^{7} condrocitos de ternera por ml de gel en el día 48 (carril 5) o en el día 63 (carril 6), cartílago de ternera de 2 semanas (carril 7), o cartílago bovino adulto (carril 8). Los resultados muestran la acumulación de proteínas específicas de cartílago de la matriz extracelular CP2 y de unión, sólo en aquellos implantes de gel de quitosana que contienen condrocitos. El acrónimo PCNA significa "antígeno nuclear de células en proliferación". CP hace referencia a propétido-C de colágeno de tipo 2 y de unión hace referencia a la proteína de unión de cartílago.

Los implantes in vivo sin células tenían una consistencia pastosa, mientras que los implantes con células podían perforarse en discos de 3 a 5 mm y someterse a ensayo mecánico poniendo de manifiesto una alta consistencia mecánica que no se encontró en ningún disco in vitro sin células (Figura 11). Estos datos indican que los condrocitos se pueden suministrar in situ por inyección, con la solución termogelificante de quitosana como vehículo. Los condrocitos inyectados permanecen viables y sintetizan y ensamblan niveles significativos de una matriz rica en proteoglicanos que se compacta con el paso del tiempo para formar un tejido cartilaginoso funcional. En la Figura 11, se inyectó gel líquido de quitosana con condrocitos primarios de ternera a 2 x 10^{7} células/ml en forma líquida como implantes dorsales subcutáneos de 100 \mul en ratones desnudos anestesiados. Los ratones de control recibieron implantes dorsales subcutáneos de 100 \mul de gel de quitosana líquido solo. Se recogieron los implantes 48 días después de la inyección. Los implantes de gel de quitosana solo tuvieron una consistencia pastosa, y no pudieron ensayarse mecánicamente. Los implantes con condrocitos primarios tenían el aspecto de cartílago y se perforó una biopsia de 3 mm del centro del implante, y se ensayó en compresión no reducida usando una compresión del 2,5% del espesor con un criterio de relajación de 0,05 g/min. El módulo de equilibrio en compensaciones de compresión del 20% y el 50% se muestra para el implante del día 48 que contiene células comparado con un disco de control dejado in vitro durante un periodo de 42 días. El gel cultivado in vivo cargado con condrocitos ha desarrollado consistencia mecánica sustancial durante 48 días debido a la síntesis y ensamblaje de una matriz cartilaginosa funcional (Figura 8A).

Ejemplo 3 Adhesión de solución termogelificante de quitosana a superficies de cartílago y hueso

Una de las ventajas más significativas de esta formulación termogelificante de quitosana para la reparación de cartílago es su capacidad para conformarse y adherirse a defectos irregulares de cartílago y otras cavidades de forma irregular en el cuerpo que requieren reparación, regeneración, reconstrucción o masificación tisular. Muchos procedimientos actuales de reparación tisular sufren drásticamente en este aspecto. Se suministró ex vivo gel líquido de quitosana-glicerol fosfato sin células a defectos femorales condilares intracondrales (que no implican hueso) porcinos. Se crearon defectos con forma de disco en el cartílago articular usando un punzón de biopsia (Figura 12A) y se inyectó la solución de quitosana descrita en el Ejemplo 1 en estos defectos y se dejó solidificar en una incubadora a 37ºC. Se enfrentó la superficie articulante del cartílago y se realizaron movimientos articulares simulados después de los cuales se observó que el gel permanecía en el defecto del cartílago (Figura 12B). El gel no sólo permaneció en el defecto, sino que también se adhirió a las superficies óseas y cartilaginosas circundantes y no se contrajo. En las Figuras 12A y 12B, se depositó gel líquido de quitosana en defectos de cartílago de 6 mm de diámetro y espesor total (Figura 12A) y se dejó solidificar a 37ºC durante 30 minutos en una incubadora humidificada. Después se cerró la articulación y se simuló el movimiento de la articulación durante varios minutos. El gel de quitosana se adhirió y se quedó retenido en todos los defectos después del movimiento articular simulado (Figura 12B).

También se realizó el relleno in vivo de los defectos intracondrales en el surco rotuliano de conejos. Se creó un defecto rectangular (4 mm x 5 mm) afeitando el cartílago hacia abajo hasta la capa de cartílago calcificada más dura con un bisturí microquirúrgico. Se introdujeron varios agujeros por microfractura usando una aguja de calibre 16. Se inyectó la solución termogelificante de quitosana descrita en el Ejemplo 1 en este defecto y se dejó solidificar durante 5 minutos (Figura 13A) y se suturó la articulación de la rodilla del conejo. Se permitió al conejo deambular libremente y el día siguiente se sacrificó y se preparó la articulación de rodilla tratada para análisis histológico (Figura 13B). Se anestesió un conejo blanco de Nueva Zelanda vivo, y se creó un defecto sólo condral de 3 x 4 mm en la tróclea del surco rotuliano femoral. Se introdujeron varios agujeros por microfractura con una aguja de calibre 16. Se cargó quitosana termogelificante líquida en el defecto y se dejó gelificar durante 5 minutos in situ (Figura 13A). Se cerró la articulación, y se dejó que el conejo se recuperara sin restricción de movimientos durante 24 horas antes del sacrificio y disección de la articulación (Figura 13B).

El análisis histológico (Figura 14) puso de manifiesto la retención de este gel termogelificante de quitosana en la capa de cartílago muy fina del conejo (de sólo aproximadamente 0,8 mm de espesor). El gel se adhirió firmemente al tejido óseo y cartilaginoso circundante, demostrando buena retención, posibilitando de este modo su uso como un vehículo polimérico gelificante de suministro inyectable para la reparación de cartílago y otros tejidos. La articulación y defecto que se muestran en la Figura 13B (rellenos con quitosana termogelificante, y residiendo 24 horas in vivo) se fijó, embebió en resina plástica LR White, se seccionó y se tiñó con Azul de Toluidina. Una sección transversal del defecto pone de manifiesto la retención del gel de quitosana in situ, así como la adherencia a las superficies ósea y cartilaginosa en el defecto.

Ejemplo 4 Preparación, mezcla y solidificación in vitro de mezcla de sangre/polímero

Se emplearon varios procedimientos de mezcla distintos para mezclar sangre con una solución polimérica acuosa (Figura 15A). Se mezclan sangre y polímero en un recipiente, produciendo una mezcla líquida homogénea de sangre y polímero.

En general, se mezclaron 3 volúmenes de sangre con 1 volumen de polisacárido al 1,5% en una solución isotónica e isoosmolar. En el caso de gel de quitosana, se disolvió quitosana al 1,5% en HCl 70 mM y glicerol fosfato 135 mM. En el primer procedimiento de mezcla de sangre/polímero, se cargó una jeringa de 1 cc con 750 \mul de sangre periférica entera, y se cargó una segunda jeringa de 1 cc con 250 \mul de solución polimérica. Se interconectaron las jeringas y se mezclaron bombeando las dos fases de una a otra 40 veces, hasta aparentemente homogéneas. En el segundo procedimiento de mezcla, se depositaron 625 \mul de solución polimérica líquida en un criovial de 2,0 ml (Corning) con varias bolas de acero de 3 mm-6 mm. Se cargó el criovial con 1,875 ml de sangre entera, se enroscó la tapa y se agitó vigorosamente el vial durante 10 segundos. En el tercer procedimiento de mezcla, se depositaron 2 ml de solución polimérica líquida en un vial estéril de vidrio de borosilicato de 12 ml (vial serológico de 5 cc InterGlass). Se cerró el vial con un tapón de goma y una brida de metal y se extrajeron 25 ml de aire a vacío en el vial con una jeringa y una aguja de calibre 20. Usando técnicas de flebotomía apropiadas, se extrajo sangre periférica de una arteria de conejo, o de una vena humana o equina en una jeringa estéril de 10 ml. Se acopló una aguja de calibre 20 a la jeringa, y se insertó a través del tapón de goma del vial. Se admitieron 6 ml de sangre periférica en el vial. El vial se agitó con vórtice durante 10 segundos a máxima velocidad. Siguiendo cualquiera de estas procedimientos de mezcla, la mezcla resultante se depositó en un vial de vidrio de borosilicato de 4 ml a temperatura ambiente, en un vial de plástico a 37ºC, o en un pocillo de agarosa (Figuras 15B y 15C), o en un defecto de cartílago articular ex vivo. Como control, se realizó el mismo tratamiento sólo con sangre entera periférica. Como otro control, se extrajo un vial vacutainer de sangre tratada con EDTA para medir CBC y número de plaquetas. Todas las muestras de sangre analizadas presentaron recuentos normales de CBC y plaquetas para las respectivas especies. Independientemente de la especie, la sangre/polímero preparada solidificó y se adhirió fuertemente a las paredes del vial de vidrio al cabo en 2,5 a 18 minutos después de la mezcla (Figura 16). La sangre entera periférica mezclada solidificó en general más lentamente comparado con el gel con sangre/quitosana (Figura 16). Las muestras diferentes de sangre, con o sin gel de quitosana líquido se mezclaron y se midió el tiempo de solidificación por el número de minutos transcurridos entre la mezcla y la obtención de una masa sólida adherente en el vial de mezcla original o recipiente secundario.

Los ensayos de soluciones de sangre/polímero adicionales, incluyendo sangre/ácido hialurónico, sangre/hidroxi-
etilcelulosa y sangre/alginato, pusieron de manifiesto que estas mezclas también solidifican en un periodo de tiempo que es comparable con sangre sola (Figura 17A). Se concluyó que la mezcla de gel de quitosana líquido en sangre periférica entera acelera la formación de coágulo y que el tiempo de solidificación del gel con sangre/quitosana es aceptable para aplicación clínica. Se ensayó la contracción en sangre periférica fresca de conejo mezclada, o sangre de conejo mezclada con PBS o diversas soluciones de polisacárido al 1,5% incluyendo quitosana en tampón glicerol fosfato. También se analizó sangre fresca sin mezclar. También se analizó una mezcla de sangre con heparina/quitosana en tampón glicerol fosfato. Se depositaron 500 \mul de cada muestra en un tubo de vidrio de 4 ml a 37ºC. En distintos momentos se eliminó todo el plasma excluido de cada tubo y se pesó para determinar el nivel de contracción del coágulo. Todas las muestras excepto las mezclas de sangre/quitosana en glicerol fosfato se contrajeron al 30-50% de su volumen original. Las mezclas de sangre/quitosana se contrajeron manteniendo mínimamente el 90% de su volumen inicial.

Para ensayar el grado de contracción de las mezclas de sangre/polímero solidificadas en relación a sangre entera coagulada, se realizó un ensayo de contracción de coágulo sobre una serie de muestras de sangre/polímero, usando varios controles (Figuras 17A, 17B y 17C). Un grupo de controles consistió en sangre entera periférica no agitada, o sangre entera periférica agitada, o sangre entera periférica agitada 3:1 (volumen:volumen) con solución salina tamponada con fosfato. Estas muestras se compararon con muestras experimentales que contenían 3 volúmenes de sangre entera periférica agitada con 1 volumen de distintas soluciones de polisacárido al 1,5% disueltas en PBS (alginato, hidroxietilcelulosa o ácido hialurónico). Otra muestra consistió en 3 volúmenes de sangre entera periférica mezclados con 1 volumen de solución de quitosana-glicerol fosfato. A intervalos de hasta 18 horas después de la solidificación, se midió por triplicado el suero excluido para cada condición, como una indicación del grado de contracción. Las muestras con sangre periférica, \pmPBS, se contrajeron al 30% de la masa original (Figura 17A). La sangre periférica mezclada con el alginato de polisacárido, hidroxietilcelulosa, o ácido hialurónico se contrajo al 40-50% de la masa original (Figura 17A). Las muestras de gel con sangre/quitosana mostraron contracción insignificante, con contracción de al 90% de la masa original (Figura 17A). Las muestras de gel con sangre heparinizada/quitosana también resistieron la contracción, al 85% de la masa original (Figura 17A). A partir de estos datos se concluyó que el gel con sangre/quitosana resiste la contracción, y proporciona un armazón de fibrina que rellena más espacio en el interior del defecto de cartílago. En las Figuras 17B y 17C, las muestras mostradas incluyen sangre (1), o sangre mezclada (2), sangre/PBS (3), sangre/quitosana en glicerol-fosfato (4), sangre con heparina/quitosana (5), sangre/alginato (6), sangre/hidroxietilcelulosa (7), y sangre/ácido hialurónico (8).

Para ensayar si la sangre anti-coagulada podría usarse para generar implantes de sangre/polisacáridos que solidifiquen in situ, se mezclaron 3 volúmenes de sangre tratada con EDTA 1,5 mM, citrato al 0,38%, citrato dextrosa ácido al 0,38%, o heparina sódica (Becton Dickinson) con 1 volumen de solución de quitosana-glicerol fosfato. La solución de quitosana-glicerol fosfato fue capaz de invertir la anti-coagulación mediada por heparina (Figura 18), EDTA y citrato. Se mezclaron quitosana al 1,5% en solución de glicerol-fosfato, o tres soluciones distintas de polisacáridos al 1,5%, en una proporción de 1 volumen de solución de polisacárido a 3 partes de sangre entera periférica. Se depositaron 500 \mul de cada muestra en un tubo de vidrio de borosilicato y se dejaron solidificar durante 60 minutos a 37ºC. Los diferentes polisacáridos incluyen ácido hialurónico-PBS (1), hidroxietilcelulosa-PBS (2), alginato-PBS (3) y quitosana-glicerol fosfato (4). Como control se analizó sólo sangre con heparina (5). Después de 60 minutos, los tubos se colocaron horizontalmente y se documentaron fotográficamente. Sólo la mezcla de quitosana-glicerol fosfato y la sangre heparinizada se hicieron sólidas.

Otras mezclas de sangre con heparina/polisacárido usando hidroxietilcelulosa, alginato, o ácido hialurónico no lograron solidificar (Figura 18). A partir de estos datos se concluyó que se pueden generar implantes de sangre/quitosana que solidifiquen in situ usando sangre anti-coagulada.

Cortes histológicos de muestras sólidas de sangre/polímero mostraron que las mezclas eran homogéneas, que los glóbulos rojos no se hemolisan después de la mezcla o la solidificación, y que las plaquetas llegaron a activarse y eran funcionales (como se evidencia por la generación de una densa red de fibrina) (Figuras 19A a 19C). Se fijó una muestra solidificada de sangre/quitosana, se embebió en plástico LR White, se seccionó y se tiñó con Azul de Toluidina. (En la Figura 19A, a un aumento de 20x, es evidente una mezcla global homogénea. En la Figura 19B, a un aumento de 100x, son evidentes agrupaciones entremezcladas de glóbulos rojos e hidropolímeros de quitosana. A un aumento de 2000x (por microscopía electrónica de barrido del medio) la presencia de una red de fibras de fibrina por todo el compuesto de sangre/quitosana es evidente).

Algunos leucocitos permanecieron viables varias horas después de la mezcla y la solidificación (Figura 20). Se mezcló sangre entera periférica con gel de quitosana y se dejó solidificar. En la Figura 20A, 60 minutos después de la solidificación, el tapón se colocó en tinción de viabilidad con calceína AM/homodímero-1 de etidio para poner de manifiesto los glóbulos blancos vivos (células verdes, flechas grandes), plaquetas vivas (células verdes, flechas pequeñas) y glóbulos blancos muertos (núcleos rojos). En la Figura 20B, se fijó una muestra distinta a los 180 minutos después de la solidificación, se embebió en LR-White y se sometió a Microscopía Electrónica de Transmisión. Es evidente una fagocitosis activa por parte de monocitos periféricos (cabeza de flecha) en micrografías TEM, que refleja la viabilidad celular 3 horas después de la mezcla y solidificación.

Se realizó un análisis de las proteínas séricas totales perdidas a partir de sangre o de sangre/quitosana después de la solidificación. Se solidificaron volúmenes iguales de sangre, o gel con sangre/quitosana en pocillos de agarosa. Los discos se transfirieron a pocillos individuales de una placa de 48 pocillos que contenían 1 ml de PBS y se incubaron a 37ºC durante 3 horas. Los discos se cambiaron sucesivamente con éxito a solución de PBS reciente a 37ºC a las 4, 5, 7 y 19 horas. Los lavados con PBS se centrifugaron ligeramente para eliminar cualquier célula antes del análisis. Se extrajeron varios discos para las proteínas totales después de 3 ó 19 horas en PBS. Las proteínas totales presentes en los discos, o en los lavados con PBS, se analizaron por SDS-PAGE y tinción de proteína total Sypro Orange. Las proteínas séricas se liberaron más lentamente y más sostenidamente de las muestras de sangre/quitosana comparadas con las muestras de sangre (Figura 21). Estos datos sugieren que se liberan proteínas sanguíneas y derivadas de plaquetas implicadas en la curación de heridas de forma más sostenida y prolongada de los defectos rellenos con sangre/quitosana, comparados con los defectos rellenos con coágulo sanguíneo. Se generaron discos sólidos de gel con sangre/quitosana, o de sangre sola, a partir de un volumen líquido inicial de 150 \mul. Los discos resultantes se lavaron en 1 ml de PBS durante 3 horas, después se transfirieron sucesivamente a las 4, 5, 7, y 19 horas para un total de cuatro lavados adicionales con 1 ml de PBS. Después de 3 ó 19 horas de lavado, se extrajeron discos representativos con GuCl para solubilizar las proteínas totales retenidas. Las proteínas solubles se precipitaron en volúmenes iguales de extractos de GuCl o lavados con PBS, se separaron en geles SDS-PAGE, y se tiñeron para proteínas totales usando Sypro Orange. Comparativamente, se retuvieron más proteínas en los discos de sangre/polímero que en los discos de sangre durante todo el periodo de lavado de 19 horas. Comparativamente, se observó una liberación más lenta y más prolongada de proteínas séricas a los lavados con PBS para sangre/quitosana que para sangre en el periodo de lavado de 19 horas.

Ejemplo 5 Preparación, mezcla e inyección de mezcla de sangre/polímero para mejorar la curación de defectos de cartílago articular

Se trataron defectos condrales con perforaciones en el hueso subcondral con una mezcla de sangre periférica/quitosana-glicerol fosfato que se suministró en forma de líquido, y se dejó solidificar in situ (Figuras 22A a 22C). En la Figura 22A, se creó un defecto de cartílago cuadrado de 3 x 4 mm de espesor total en el surco rotuliano femoral de un conejo blanco de Nueva Zelanda adulto (de más de 7 meses). Se perforaron cuatro agujeros por microtaladro de 1 mm de diámetro en el hueso, hasta que se observó hemorragia. En la Figura 22B, se mezcló sangre entera líquida a una proporción de 3 volúmenes de sangre a 1 volumen de quitosana en una solución de glicerol fosfato, y se depositaron para rellenar el defecto. En la Figura 22C, después de 5 minutos in situ, el implante de sangre/quitosana pareció solidificar. Se suturaron la cápsula y la piel, y se dejó que el animal se recuperara sin restricción del movimiento.

En la Figura 22D se esquematiza un tratamiento similar en pacientes humanos, donde defectos de cartílago preparados reciben una inyección artroscópica de sangre/polímero líquido que solidifica in situ. Como alternativa, se mezcla una inyección artroscópica de polímero líquido con sangre derivada de hueso en el lugar del defecto (Figura 22E). En la Figura 22D, la sangre del paciente se mezcla con el polímero ex vivo, y se suministra a un defecto preparado mediante inyección artroscópica, o (Figura 22E) el polímero se suministra artroscópicamente o durante cirugía abierta de rodilla y se mezcla en el lugar del defecto con sangre del paciente obtenida del defecto.

Como estudio de demostración de hipótesis, se ensayaron los efectos del tratamiento con gel con sangre/quitosana en conejos. Se anestesiaron conejos blancos de Nueva Zelanda adultos (7 meses de edad), esqueléticamente maduros, con xilazina-ketamina seguido de anestesia con gas isofluoreno/oxígeno. Se expuso la tróclea del surco rotuliano femoral a una incisión pararrotuliana y a un desplazamiento rotuliano. Se produjo un defecto de espesor total del cartílago, de hasta 4 x 5 mm en la tróclea del surco rotuliano femoral, con un bisturí microquirúrgico. Se generaron cuatro agujeros penetrantes en el hueso de 4 mm de profundidad y 1 mm de diámetro por microtaladro con irrigación constante de PBS a 4ºC, o por punción con una lezna y un martillo hechos a medida. El defecto se lavó abundantemente con PBS, y dependiendo del grado de hemorragia, se inyectaron hasta 200 \mul de epinefrina estéril (2 \mug/ml) en solución salina tamponada con fosfato en los agujeros sangrantes. El defecto de cartílago se cubrió con una gasa estéril empapada con PBS. Se extrajo sangre periférica de conejo de la arteria central de la oreja con una aguja vacutainer^{TM} y viales vacutainer^{TM} sin tratar de vidrio siliconado de 4 cc de Becton Dickinson.

En un tratamiento, se extrajeron 750 \mul de sangre en una jeringa estéril de 1 cc. Una segunda jeringa estéril que contenía 250 \mul de solución de quitosana-glicerol fosfato (quitosana al 1,5%/HCl 70 mM/\beta-glicerol fosfato 135 mM) se interconectó con la jeringa que contenía sangre con un conector de plástico estéril. Las jeringas se bombearon de una a la otra 40 veces. La mezcla se extrajo en una jeringa, a la que se le acopló una aguja de calibre 20. Después de purgar la mitad de la mezcla, se depositó una gota (aproximadamente 25 \mul) en el defecto. En un tratamiento diferente, se añadieron 2 ml de sangre a un tubo criovial de polipropileno que contenía 667 \mul de quitosana al 1,5%/HCl 70 mM/\beta-glicerol fosfato 135 mM y 6 perlas de acero inoxidable de 3,2 mm de diámetro estériles. El tubo se tapó y se agitó durante 10 segundos rigurosamente (aproximadamente de 40 a 50 acciones). La mezcla líquida resultante de sangre/quitosana se extrajo del vial con una jeringa estéril de 1 cc, y se acopló una aguja de calibre 20 a la jeringa. Después de purgar 200 \mul de la jeringa, se depositó una gota (aproximadamente 25 \mul) para llenar el defecto de cartílago. La mezcla de sangre/quitosana se dejó solidificar durante 5 minutos, después de lo cual se suturaron la cápsula y la piel, y se desinfectó la herida. Los conejos se sacrificaron al cabo de 1 semana (n=1, macho) o a los 51 ó 56 días (n=2, 1 macho, 1 hembra). Las articulaciones se fijaron, se descalcificaron, se embebieron en LR/White de plástico, se seccionaron, y se tiñeron con Azul de Toluidina. Los defectos tratados con sangre/quitosana al cabo de 1 semana de curación pusieron de manifiesto grandes números de células quimiotácticas que migran hacia la zona rellena con sangre/quitosana. (Figura 23A). Los defectos no tratados tuvieron una respuesta quimiotáctica relativamente débil (Figura 23B) hacia el coágulo sanguíneo en la parte superior del defecto. Se creó un defecto condral con agujeros por microtaladro en ambos surcos rotulianos femorales de un conejo blanco de Nueva Zelanda adulto, uno de los cuales se rellenó con gel con sangre/quitosana, y el otro se dejó sin tratar. Una semana después de la curación, se fijaron las articulaciones, se procesaron en LR-White, y se tiñeron con azul de Toluidina. A 2 a 3 mm bajo al superficie del cartílago, fue evidente un gran número de células migrando hacia el defecto relleno con sangre/quitosana (Figura 23A), mientras que se vieron menos células migrando en la misma región del defecto no tratado (Figura 23B).

Después de 5 a 8 semanas de curación, el defecto tratado con sangre/quitosana se llenó con tejido hialino de reparación en 2 conejos (1 macho, 1 hembra) (Figura 24A). Este tejido de reparación basado en sangre/quitosana tenía el aspecto de tejido hialino de reparación de cartílago, rico en GAG. El tejido de reparación de defectos no tratados o tratados sólo con sangre, tenía el aspecto de fibrocartílago (Figura 24B). No hubo evidencia histológica de sangre/quitosana o coágulo de sangre persistiendo en el lugar del defecto a las o más allá de 3 semanas después del suministro. Se creó un defecto condral con agujeros por microtaladro en ambos surcos rotulianos femorales de un conejo blanco de Nueva Zelanda adulto, uno de los cuales se rellenó con gel con sangre/quitosana, y el otro se dejó sin tratar. A los 51 ó 56 días después de la curación, las articulaciones se fijaron, se procesaron en LR-White, y se tiñeron con azul de Toluidina. En la Figura 24A, el tejido de reparación del defecto tratado con sangre/quitosana tenía el aspecto de cartílago hialino teñido metacromáticamente, que se adhería a las superficies del defecto, y rellenaban el defecto. En la Figura 24B, el tejido de reparación del defecto no tratado tenía el aspecto de fibrocartílago prácticamente sin tinción metacromática de GAG y relleno sólo parcial del defecto.

Aunque la invención se ha descrito con referencia particular a las realizaciones ilustradas, se entenderá que aparecerán numerosas modificaciones de las mismas para los especialistas en la técnica. Por consiguiente, la descripción anterior y los dibujos adjuntos deben tomarse como ilustrativos de la invención y no en un sentido limitante. Por ejemplo, se ha demostrado que mezclar quitosana en solución con sangre permite la formación de coágulo de polímero/sangre que no se contare significativamente, muestra una liberación ralentizada de proteínas sanguíneas quimiotácticas y mitogénicas, mantenimiento de la viabilidad de las células sanguíneas, y reparación drásticamente mejorada de defectos de cartílago articular. Es obvio para los especialistas en la técnica que la solución de quitosana podría prepararse de forma diferente para conseguir el mismo resultado. Los ejemplos incluyen: 1) concentración de quitosana y proporción de mezcla con sangre alteradas 2) elección alterada de solución acuosa cambiando el tipo de tampón y la concentración de las especies 3) una suspensión acuosa de agregados de quitosana 4) un polvo de quitosana particulado combinado con una técnica de mezcla apropiada para distribuir estas partículas por toda la sangre y disolverlas parcialmente. Se pueden usar otros polímeros tales como 1) otros polisacáridos tipo hialuronano si su efecto anti-coagulante se supera formulándolo en un estado pro-coagulante (tal como usando una baja concentración o combinándolo con trombina) y 2) se podría usar un polímero proteínico tal como polilisina o colágeno para conseguir efectos similares. Aunque no se cree que estos últimos enfoques tendrán tanto éxito como la realización preferida, debido a inmunogenicidad, toxicidad, y efectos de adhesión/contracción celular, estas y otras formulaciones se consideran parte de la presente invención ya que poseen las características de la preparación polimérica de la presente invención que son que 1) es miscible con sangre o componentes seleccionados de la sangre, 2) que la mezcla resultante es inyectable o puede colocarse sobre o en una parte del cuerpo que requiere reparación, regeneración, reconstrucción o masificación tisular y 3) que la mezcla tiene un efecto beneficioso sobre la reparación, regeneración, reconstrucción o masificación de tejido en el lugar de emplazamiento.

Referencias

\bulletArnoczky, S. P., R. F. Warren, and J. M. Spivak. 1988. Meniscal repair using an exogenous fibrin clot. An experimental study in dogs. J Bone Joint Surg Am 70, no. 8: 1209-17.

\bulletAston, J. E., and G. Bentley. 1986. Repair of articular surfaces by allografts of articular and growth-plate cartilage. Journal of Bone & Joint Surgery - British Volume 68-B, no. 1: 29-35.

\bulletAteshian, G. A. 1997. A theoretical formulation for boundary friction in articular cartilage. Journal of Biomechanical Engineering 119, no. 1: 81-86.

\bulletAustin, P. R., C. J. Brine, J. E. Castle, and J. P. Zikakis. 1981. Chitin: New facets of research. Science 212, no. 4496: 749-53.

\bulletAtkinson, B., inventor. 24 August 2000. "Device and method for regeneration and repair of cartilage lesions". Sulzer Biologics, assignee. WO Patent 00/48550.

\bulletBartone, F. F, E. D. Adickes, 1988, Chitosan: effects on wound healing in urogenital tissue: preliminary report: J Urol, v. 140, p. 1134-7.

\bulletBentley, G., and R. B. Greer. 1971. Homotransplantation of isolated epiphyseal. and articular cartilage chondrocytes into joint surfaces of rabbits. Nature 230: 385-8.

\bulletBernkop-Schnurch, A., and M. Pasta. 1998. Intestinal peptide and protein delivery -novel bioadhesive drug- carrier matrix shielding from enzymatic attack. Journal of Pharmaceutical Sciences 87, no. 4: 430-434.

\bulletBraden, M., S. Downes, M. P. Patel, and K. W. M. Davy, inventors. 21 November 1995. "Biomaterials for tissue repair". US Patent 5.468.787.

\bulletBreinan, H. A., T. Minas, H. P. Hsu, S. Nehrer, C. B. Sledge, and M. Spector. 1997. Effect of cultured autologous chondrocytes on repair of chondral defects in a canine model. Journal of Bone & Joint Surgery - American Volume.79, no. 10: 1439-51.

\bulletBreinan, H. A., S. D. Martin, H. P. Hsu, and M. Spector. 2000. Healing of canine articular cartilage defects treated with microfracture, a type-II collagen matrix, or cultured autologous chondrocytes. J Orthop Res 18, no. 5: 781-9.

\bulletBrekke, J. H., and R. D. Coutts, inventors. 21 December 1999. "Method and device for reconstruction of articular cartilage". THM Biomedicals, assignee. US Patent 6.005.161.

\bulletBrittberg, M., A. Lindahl, G. Homminga, A. Nilsson, O. Isaksson, and L. Peterson. 1997. A critical analysis of cartilage repair. Acta Orthopaedica Scandinavica 68, no. 2: 186-91.

\bulletBrittberg, M., A. Lindahl, A. Nilsson, C. Ohlsson, O. Isaksson, and L. Peterson. 1994. Treatment of Deep Cartilage Defects in the Knee with Autologous Chondrocyte Transplantation. N. Engl. J. Med. 331, no. 14: 889-95.

\bulletBrittberg, M., A. Nilsson, A. Lindahl, C. Ohlsson, and L. Peterson. 1996. Rabbit articular cartilage defects treated with autologous cultured chondrocytes. Clinical Orthopaedics & Related Research, no. 326: 270-83.

\bulletBuckwalter, J. A., and H. J. Mankin. 1997. Articular cartilage. 2. Degeneration and osteoarthrosis, repair, regeneration, and transplantation (review). Journal of Bone & Joint Surgery - American Volume 79A, no. 4: 612-32.

\bulletBuschmann, M. D., Y. A. Gluzband, A. J. Grodzinsky, J. H. Kimura, and E. B. Hunziker. 1992. Chondrocytes in agarose culture synthesize a mechanically functional extracellular matrix. Journal of Orthopaedic Research 10, no. 6: 745-58.

\bulletButnariu-Ephrat,'' M., D. Robinson, D. G. Mendes, N. Halperin, and Z. Nevo. 1996. Resurfacing of goat articular cartilage by chondrocytes derived from bone marrow. Clinical Orthopaedics & Related Research, no. 330: 234-43.

\bulletCaplan, A. I., M. Elyaderani, Y. Mochizuki, S. Wakitani, and V. M. Goldberg. 1997. Principles of cartilage repair and regeneration. Clinical Orthopaedics & Related Research, no. 342: 254-69.

\bulletCaplan, A. l., D. J. Fink, and R. G. Young, inventors. 5 January 1999. "Biomatrix for soft tissue regeneration". US Patent 5.855.619.

\bulletCaplan, A. I., and S. E. Haynesworth, inventors. 22 September 1998. "Connective tissue regeneration using human mesenchymal stem cell preparations". US Patent 5.811.094.

\bulletCarreno-Gomez, B., and R. Duncan. 1997. Evaluation of the biological properties of soluble chitosan and chitosan microspheres. Intl J of Pharmaceutics 148: 231-40.

\bulletChenite, A., C. Chaput, C. Combes, F. Jalal, A. Selmani. Temperature-controlled pH-dependent formation of ionic polysaccharide gels. WO Patent 99/07416.

\bulletChenite, A., C. Chaput, D. Wang, C. Combes, M. D. Buschmann,. C. D. Hoemann, J. C. Leroux, B. L. Atkinson, F. Binette, and A. Selmani. 2000. Novel injectable neutral solutions of chitosan form biodegradable gels in situ. Biomaterials 21, no. 21: 2155-61.

\bulletChesterman, P. J., and A. U. Smith. 1968. Homotransplantation of articular cartilage and isolated chondrocytes. An experimental study in rabbits. Journal of Bone & Joint Surgery - British volume 50, no 1: 184-97.

\bulletChilders, J. C. Jr, and S. C. Ellwood. 1979. Partial chondrectomy and subchondral bone drilling for chondromalacia. Clin Orthop, no. 144: 114-20.

\bulletCho, Y. W., Y. N. Cho, S. H. Chung, G. Yoo, S. W. Ko, 1999, Water-soluble chitin as a wound healing accelerator: Biomaterials, v. 20, p. 2139-45.

\bulletChu, C. R., R. D. Coutts, M. Yoshioka, F. L. Harwood, A. Z. Monosov, and D. Amiel. 1995. Articular cartilage repair using allogeneic perichondrocyte-seeded biodegradable porous polylactic acid (PLA): a tissue-engineering study. Journal of Biomedical Materials Research 29, no. 9: 1147-54.

\bulletChu, C. R., J. S. Dounchis, M. Yoshioka, R. L. Sah, R. D. Coutts, and D. Amiel. 1997. Osteochondral repair using perichondrial cells. A 1-year study in rabbits. Clinical Orthopaedics & Related Research, no. 340: 220-9.

\bulletClark, Richard A. F. 1996. The molecular and cellular biology of wound repair. 2 ed. New York: Plenum.

\bulletCochrum, K. C.,H. R. Parker, and M. M. C. Chu, inventors. 30 June 1998. "Fibrogen/Chitosan hemostatic agents". The Regents of the University of California, assignee. US Patent 5.773.033.

\bulletCohen, I., J. Gabbay, T. Glaser, and A. Oplatka. 1975. "Fibrin-blood platelet interaction in a contracting clot". Br J Haematol 31, no. 1: 45-50.

\bulletCollombel, C.,O. Damour, C. Gagnieu, F. Poisignon, C. Echinard, and J. Marichy, inventors. 24 November 1992. "Biomaterials with a base of mixtures ofcollagen, chitosan and glycosaminoglycans process for preparing them and their application in human medicine". Centre National de la Recherche, assigriee. US Patent 5.166.187.

\bulletDenuziere, A., D. Ferrier, O. Damour, and A. Domard. 1998. Chitosan-chondroitin sulfate and chitosan-hyaluronate polyelectrolyte complexes: biological properties. Biomaterials 19, no. 14: 1275-85.

\bulletDePalma, A. F., C. D. McKeever, and D. K. Subin. 1966. Process of repair of articular cartilage demonstrated by histology and autoradiography with tritiated thymidine. Clinical Orthopaedics & Related Research 48: 229-42.

\bulletDillon, G. P., X. Yu, A. Sridharan, J. P. Ranieri, and R. V. Bellamkonda. 1998. The Influence of Physical Structure and Charge on neurite Extension in a 3D Hydrogel Scaffold. Journal of Biomaterials Science Polymer Edition 9, no. 10: 1049-69.

\bulletDrohan, W. N., M. J. MacPhee, S. I. Miekka, S. S. Manish, Clive Elson, and John R. Taylor, inventors. 26 September 2000. "Chitin hydrogels, methods of their production and use". Inc. Chitogenics, The American National Red Cross, and Coalition for Hemophilia, assignees. US Patent 6,124, 273.

\bulletDunn, A. R., and S. L. Dunn, inventors. 29 November 1994. "Method of regenarating articular cartilage". US patent 5.368.051.

\bulletEser, E. A., Y. M. Elcin, and G. D. Pappas. 1998. Neural Tissue Engineering: Adrenalin Chromaffin Cell Attachment and Viability on Chitosan Scaffolds. Neurological Research 20: 648-54.

\bulletFrankel, S. R., B. Toolan, D. Menche, M. I. Pitman, and J. M. Pachence. 1997. Chondrocyte transplantation using a collagen bilayer matrix for cartilage repair. J. Bone Joint Surg. 79-B, no. 5: 831-36.

\bulletFreed, L. E., D. A. Grande, Z. Lingbin, J. Emmanual, J. C. Marquis, and R. Langer. 1994. "Joint resurfacing using allograft chondrocytes and synthetic biodegradable polymer scaffolds". Journal of Biomedical Materials Research 28, no. 8: 891-9.

\bulletFukamizo, T., and R. Brzezinski. 1997. Chitosanase from streptomyces sp. Strain n174- a comparative review of its structure and function (review). Biochemistry and Cell Biology-Biochimie Et Biologie Cellulaire 75, no. 6: 687-96.

\bulletGouda, I., and O. Larm, inventors. 11 May 1999. "Method of promoting dermal wound healing with chitosan and heparin or heparin sulfate". Medicarb, assignee. US Patent 5.902.798.

\bulletGrande, D. A., and P. A. Lucas, inventors. 25 May 1999. "Mesenchymal stem cells for cartilage repair". Morpho-
gen Pharmaceuticals Inc., and North Shore University Hospital Research Corp., assignees. US Patent 5.906.934.

\bulletGrande, D. A., M. l. Pitman, L. Peterson, D. Menche, and M. Klein. 1989. The repair of experimentally produced defects in rabbit articular cartilage by autologous chondrocyte transplantation. J. Orthop. Res. 7, no. 2: 208-18.

\bulletGreen, W. T. 1977. Articular cartilage repair. Behavior of rabbit chondrocytes during tissue culture and subsequent allografting. Clinical Orthopaedics & Related Research, no. 124: 237-50.

\bulletGriffith-Cima, L., A. Atala, C. A. Vacanti, and K. T. 30 Paige, inventors. 20 January 1998. "Tissue formation by injecting a cell-polymeric solution that gels in vivo". M.I.T., assignee. US Patent 5.709.854.

\bulletHalvorsen, Y-D. C., W. O. Wilkison, and J. Gimble, inventors. 21 February 2001. "Use of adipose tissue- derived stromal cells for chondrocyte differentiation and cartilage repair". EP Patent 1.077.253.

\bulletHall, B. K. 1983. Cartilage. New York, NY: Academic Press.

\bulletHalpern, A. A., inventor. 12 August 1997. "Method for cartilage repair." US Patent 5.655.546.

\bulletHangody, L., G. Kish, Z. Karpati, I. Szerb, and I. Udvarhelyi. 1997. Arthroscopic autogenous osteochondral mosaicplasty for the treatment of femoral condylar articular defects. A preliminary report. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc 5, no. 4: 262-7.

\bulletHangody, L., G. Kish, Z. Karpati, l. Szerb, and R. Eberhardt. 1997. Treatment of osteochondritis dissecans of the talus: use of the mosaicplasty technique-a preliminary report. Foot Ankle Int 18, no. 10: 628-34.

\bulletHansson, H-A., G. Johasson-Ruden, and O. Larm, inventors. 13 April 1999. "Hard Tissue stimulating agent". Astra Akiebolag, assignee. US Patent 5.894.070.

\bulletHendrickson, D. A., A. J. Nixon, D. A. Grande, R. J. Todhunter, R. M. Minor, H. Erb, and G. Lust. 1994. Chondrocyte-fibrin matrix transplants for resurfacing extensive articular cartilage defects. Journal of Orthopaedic Research 12, no. 4: 485-97.

\bulletHigaki, H., T. Murakami, and Y. Nakanishi. 1997. Lubricating ability of langmuir-blodgett films as boundary lubricating films on articular surfaces. JSME International Journal Series C - Mechanical Systems Machine Blements & Manufacturing 40, no. 4: 776-81.

\bulletHomminga, G. N., S. K. Bulstra, R. Kuijer, and A. J. van der Linden. 1991. Repair of sheep articular cartilage defects with a rabbit costal perichondrial graft. Acta Orthopaedica Scandinavica 62, no. 5: 415-8.

\bulletHunziker, E. B., 1 and L. C. Rosenberg. 1996. Repair of partial-thickness defects in articular cartilage - cell recruitment from the synovial membran. Journal of Bone & Joint Surgery - American Volume 7 A, no. 5: 721-33.

\bulletHyc, A., J. Malejczyk, A. Osiecka, and S. Moskalewski. 1997. Irnmunological response against allogeneic chondrocytes transplanted intojoint surface defects in rats. Cell Transplantation 6, no. 2: 119-24.

\newpage

\bulletInsall, J. N. 1967. Intra-articular surgery for degenerative arthritis of the knee. A report of the work of the late K. H. Pridie. J Bone Joint Surg Br 49, no. 2: 211-28.

\bulletInui, H., M. Tsujikubo, S. Hirano, 1995, Low molecular weight chitosan stimulation of mitogenic response to platelet-derived growth factor in vascular smooth muscle cells: Biosci Biotechnol Biochem, v. 59, p. 2111-4.

\bulletItay, S.,A. Abramovici, and Z. Nevo. 1987. Use of cultured embryonal chick epiphyseal chondrocytes as grafts for defects in chick articular cartilage. Clinical Orthopaedics & Related Research, no. 220: 284-303.

\bulletJohnson, L. L., 1991. Arthroscopic abrasion arthroplasty. In operative arthroscopy. McGinty, J. B. (Ed.) y col., 341-60. New York: Raven.

\bulletJohnstone, B., and J. Yoo, inventors. 1 June 1999. "In vitro chondrogenic induction of human mesenchymal stem cells", Case Western Reserve University, assignee. US Patent 5.908.784.

\bulletJorgensen, T., J. Moss, and H. Nicolajsen, inventors. 28 May 1998. "A method for promoting tissue repair". Dumex-Alpharma, assignee. WO Patent 98/22114.

\bulletJurgensen, K., D. Aeschlimann, V. Cavin, M. Genge, and E. B. Hunziker. 1997. A new biological glue for cartilage-cartilage interfaces - tissue transglutaminase. Journal of Bone & Joint Surgery - American Volume 79A, no. 2: 185-93.

\bulletKandel, R. A., H. Chen, J. Clark, and R. Renlund. 1995. Transplantation of cartilaginous tissue generated in vitro into articular joint defects. Art. Cells, Blood Subs., and Immob. Biotech. 23, no. 5: 565-77.

\bulletKawamura, S., S. Wakitani, T. Kimura, A. Maeda, A. l. Caplan, K. Shino, and T. Ochi. 1998. Articular cartilage repair. Rabbit experiments with a collagen gel-biomatrix and chondrocytes cultured in it. Acta Orthopaedica Scandinavica 69, no. 1: 56-62.

\bulletKoyano, T., N. Minoura, M. Nagura, and K. Kobayashi. 1998. Attachment and growth of cultures fibroblast cells on pva/chitosan-blended hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research 39, no. 3: 486-90.

\bulletKuettner, K, E. 1992. Biochemistry of articular cartilage in health and disease. Clin Biochem 25, no. 3: 155-63.

\bulletLahiji, A, A Sohrabi, D S Hungerford, C G Frondoza, 2000, Chitosan supports the expression of extracellular matrix proteins in human osteoblasts and chondrocytes: J Biomed Mater Res, v. 51, p. 586-95.

\bulletLee, K. Y., l. C. Kwon, Y. H. Kim, W. H. Jo, and S. Y. Jeong. 1998. Preparation of chitosan self-aggregates as a gene delivery system. Journal of Controlled Release 51, no. 2-3: 213-20.

\bulletLee, YM, Y J Park, S J Lee, Y Ku, S B Han, S M Choi, P R Klokkevold, C P Chung, 2000, Tissue engineered bone formation using chitosan/tricalcium phosphate sponges: J Periodontol, v. 71, p. 410-7.

\bulletLu, J. X., F. Prudhommeaux, A. Meunier, L. Sedel, and G. Guillemin. 1999. Effects of chitosan on rat knee cartilages. Biomaterials 20, no. 20: 1937-44.

\bulletMahomed, M. N., R. J. Beaver, and A. E. Gross. 1992. The long-term success of fresh, small fragment osteochondral allografts used for intraarticular post- traumatic defects in the knee joint. Orthopedics (Thorofare, NJ) 15, no. 10: 1191-9.

\bulletMalette, W. G., H. J. Quigley, R. D. Gaines, N. D. Johnson, W. G. Rainer, 1983, Chitosan: a new hemostatic: Ann Thorac Surg, v. 36, p. 55-8.

\bulletMalette, W. G., and H. J. Quigley, inventors. 19 July 1983. " Method of acheving hemostasis". US Patent 4.394.373.

\bulletMalette, W. G., and H. J. Quigley, inventors. 30 July 1985. "Method of achieving hemostasis, inhibiting fibroplasia, and promoting tissue regeneration in tissue wound". US Patent 4.532.134.

\bulletMankin, H. J. 1974. The reaction of articular cartilage to injury and osteoarthritis (first of two parts). N Engl J Med 291, no. 24: 1285-92.

\bullet ---. 1974. The reaction of articular cartilage to injury and osteoarthritis. (second of two parts). N Engl J Med 291, no. 25: 1335-40.

\bulletMattioli-Belmonte, M., A. Gigante, R. A. Muzzarelli, R. Politano, A. De Benedittis, N. Specchia, A. Buffa, G. Biagini, F. Greco, 1999, N,N-dicarboxymethyl chitosan as delivery agent for bone morphogenetic protein in the repair of articular cartilage: Med Biol Eng Comput, v. 37, p. 130-4.

\bulletMcCarty, Daniel J, and William J Koopman. 1993. Arthritis and allied conditions. A textbook of rheumatology. Philadelphia: Lea and Febiger.

\bulletMessner, K., and J. Gillquist. 1996. Cartilage repair - a critical review (review). Acta Orthopaedica Scandinavica 67, no. 5: 523-29.

\bulletMinas, T., and S. Nehrer. 1997. Current concepts in the treatment of articular cartilage defects. (Review) (41 refs). Orthopedics (Thorofare, NJ) 20, no. 6: 525-38.

\bulletMosbey, D. T., inventor. 11 September 1990. "Wound filling composition". Minnesota Mining and Manufacturing Company, assignee. US Patent 4.956.350.

\bulletMueller, W., and T. Thaler, inventors. 17 November 1998. "Process for regenerating bone and cartilage". Sulzer Medizinaltechnik AG., assignee. US Patent 5.837.235.

\bulletMuzzarelli, R. A. A., and G. Biagini. 1993. Role and fate of exogenous chitosans in human wound tissues. Chitin Enzymology: 187-96.

\bulletMuzzarelli, R. A. A., W. S. Xia, M. Tomasetti, and P. Ilari. 1995. Depolymerization of chitosan and substituted chitosans with the aid of a wheat germ lipase preparation. Enzyme & Microbial Technology 17, no. 6: 541-45.

\bulletMuzzarelli, R. A., M. Mattioli-Belmonte, C. Tietz, R. Biagini, G. Ferioli, M. A. Brunelli, M. Fini, R. Giardino, P. Ilari, and G. Biagini. 1994. Stimulatory effect on bone formation exerted by a modified chitosan. Biomaterials 15, no. 13: 1075-81.

\bulletNamba, R. S., M. Meuli, K. M. Sullivan, A. X. Le, and N. S. Adzick. 1998. Spontaneous repair of superficial defects in articular cartilage in a fetal lamb model. Journal of Bone & Joint Surgery - American Volume 80A, no. 1: 4-10.

\bulletNaughton, G. K., and B. A. Naughton, inventors. 28 July 1998. "Three-dimensional genetically engineered cell and tissue culture system." US Patent 5.785.964.

\bulletNaughton, G. K., and J. Willoughby, inventors. 1 December 1998. "Method for repairing cartilage". US Patent 5.842.477.

\bulletNevo, Z., D. Robinson, S. Horowitz, A. Hasharoni, and A. Yayon. 1998. The manipulated mesenchymal stem cells in regenerated skeletal tissues. Cell Transplantation 7, no. 1: 63-70.

\bulletNewman, A. P. 1998. Articular cartilage repair. American Journal of Sports Medicine 26, no. 2: 309-24.

\bulletNixon, A. J., L. A. Fortier, J. Williams, and H. Mohammed. 1999. Enhanced repair ofextensive articular defects by insulin-like growth factor-I-laden fibrin composites. J Orthop Res 17, no. 4: 475-87.

\bulletNoguchi, T., M. Oka, M. Fujino, M. Neo, and T. Yamamuro. 1994. Repair of osteochondral defects with grafts ofcultured chondrocytes. Comparison ofallografts and isografts. Clinical Orthopaedics & Related Research, no. 302: 251-8.

\bulletO'Driscoll, S. W., F. W. Keeley, and R. B. Salter 1988. Durability ofregenerated articular cartilage produced by free autogenous periosteal grafts in "Major full-thickness defects in joint surfaces under the influence of continuous passive motion". A follow-up report at one year. Journal ofBone & Joint Surgery - American Volume 70, no. 4: 595-606.

\bulletO'Driscoll, S. W., A. D. Recklies, and A. R. Poole. 1994. Chondrogenesis in periosteal explants. An organ culture model for in vitro study. Journal ofBone & Joint Surgery - American Volume 76, no. 7: 1042-51.

\bulletOkamoto, Y, K Shibazaki, S Minami, A Matsuhashi, S Tanioka, Y Shigemasa, 1995, Evaluation ofchitin and chitosan on open would healing in dogs: J Vet Med Sci, v. 57, p. 851-4.

\bulletOuterbridge, H. K., A. R. Outerbridge, and R. E. Outerbridge. 1995. The use ofa laterai patellar autologous graft for the repair ofa large osteochondral defect in the knee. Journal ofBone & Joint Surgery - American Volume 77, no. 1: 65-72.

\bulletPachence, J. M., S. Frenkel, and D. Menche, inventors. 27 June 2000. "Multi-stage collagen-based template or implant for use in the repair ofcartialge lesions". Hospital for Joint Disease Orthopaedic Institute, assignee. US Patent 6.080.194.

\bulletPaletta, G. A., S. P. Arnoczky, and R. F. Warren. 1992. The repair ofosteochondral defects using an exogenous fibrin clot. An experimental study in dogs. Am J Sports Med 20, no. 6: 725-31.

\bulletPechak, D. G., M. J. Kujawa, and A. I. Caplan. 1986. Morphology ofbone development and bone remodeling in embryonic chick limbs. Bone 7, no. 6: 459-72.

\bulletPeluso, G., O. Petillo, M. Ranieri, M. Santin, L. Ambrosio, D. Calabro, B. Avallone, G. Balsamo, 1994, Chitosan-mediated stimulation of macrophage function: Biomaterials, v. 15, p. 1215-20.

\bulletPeterson, D. R. and N. Nousek-Goebl. 13 March 2001. "Isolation ofprecursor cells from hematopoietic and nonhematopoietic tissues and their use in vivo bone and cartilage regeneration". DePuy Orthopaedics, assignee. US Patent 6.200.606.

\bulletPridie, K. H., A method of resurfacing osteoarthritic knee joints. 1959. In Proceedings of the British Orthopaedic Association. J. Bone and Joint Surg. 41-B: 618-619.

\bulletPurchio, A. F., M. Zimber, N. Dunkelman, G. K. Naughton, and B. A. Naughton, inventors. 11 May 1999. "Three-dimensional cartilage cultures". Advanced Tissue Sciences Inc., assignee. US Patent 5.902.741.

\bulletRao, S.B., C. P. Sharma, 1997, Use of chitosan as a biomaterial: studies on its safety and hemostatic potential: J Biomed Mater Res, v. 34, p. 21-8.

\bulletRobinson, D., N. Halperin, and Z. Nevo. 1990. Regenerating hyaline cartilage in articular defects of old chickens using implants of embryonal chick chondrocytes embedded in a new natural delivery substance. Calcif. Tissue Int. 46, no.4: 246-53.

\bulletRodgers, K., and G. Dizerega, inventors. 20 January 2000. "Methods for accelerating bone and cartilage growth and repair". University of Southern California, assignee. WO Patent 00/02905.

\bulletRodrigo, J. J., J. R. Steadman, and J. F. Sillima. 1993. Osteoarticular injuries of the knee. Operative orthopaedics. Second edition ed., 2077-82.

\bulletSackier, J. M., C.B. Wood, R. Krishnan, G. R. Wiggington, and D. M. H. Butler, inventors. 18 March 1997. "Method of regenerating or replacing cartilage tissue using amniotic cells". Genethics Limited, assignee. US Patent 5.612.028

\bulletSall, K.N.,J. K. Kreter, R. H. Keates, 1987, The effect of chitosan on corneal wound healing: Ann Ophthalmol, v. 19, p. 31-3.

\bulletSams, A. E., and A. J. Nixon. 1995. Chondrocyte-laden collagen scaffolds for resurfacing extensive articular cartilage defects. Osteoarthritis & Cartilage 3, no. 1: 47-59.

\bulletSashiwa, H., H. Saimoto, Y. Shigemasa, R. Ogawa, and S. Tokura. 1990. Lysozyme susceptibility of partially deacetylated chitin. International Journal of Biological Macromolecules 12, no. 5: 295-6.

\bulletSchipper, N. G. M., S. Olsson, J. A. Hoogstraate, A. G. Deboer, K. M. Varum, and P. Artursson. 1997. Chitosans as absorption enhancers for poorly absorbable drugs. 2. Mechanism of absorption enhancement. Pharmaceutical Research 14, no. 7: 923-29.

\bulletSchwartz, R. E., inventor. 12 May 1998. "Cartilage repair unit and method of assembling same". Matrix Bio-
technologies Inc., assignee. US Patent 5.749.874.

\bulletSchwarz, I. M., and B. A. Hills. 1998. Surface-active phospholipid as the lubricating component of lubricin. British Journal of Rheumatology 37, no. 1: 21-26.

\bulletSechriest, V. F., Y. J. Miao, C. Niyibizi, A. Westerhausen-Larson, H. W. Matthew, C. H. Evans, F. H. Fu, and J. K. Suh. 2000. GAG-augmented polysaccharide hydrogel: a novel biocompatible and biodegradable material to support chondrogenesis. J Biomed Mater Res 49, no. 4: 534-41.

\bulletSellers, R. S., D. Peluso, and E. A. Morris. 1997. The effect of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) on the healing of full-thickness defects of articular cartilage. Journal of Bone & Joint Surgery - American Volume 79, no. 10: 1452-63.

\bulletSellers, R. S., R. Zhang, S. S. Glasson, H. D. Kim, D. Peluso, D. A. D'Augusta, K. Beckwith, and E. A. Morris. 2000. Repair of articular cartilage defects one year after treatment with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2). J Bone Joint Surg Am 82, no. 2: 151-60.

\bulletShigemasa, Y., and S. Minami. 1996. Applications of chitin and chitosan for biomaterials. Biotechnol Genet Eng Rev 13: 383-420.

\newpage

\bulletSoulhat, J, M. D. Buschmann, and A. Shirazi-Adl. 1999. A fibril-network reinforced biphasic model of cartilage in unconfined compression. Journal of Biomechanical Engineering 121, no. 3: 340-7.

\bulletSparkes, B. G., and D. G. Murray,. inventors. 25 February 1986. "Chitosan based wound dressing materials". Her Majesty the Queen in right of Canada, assignee. US4572906.

\bulletSpecchia, N., A. Gigante, F. Falciglia, and F. Greco. 1996. Fetal chondral homografts in the repair of articular cartilage defects. Bulletin-Hospital for Joint Diseases 54, no. 4: 230-5.

\bulletSteadman, J. R., W. G. Rodkey, K. K. Briggs, and J. J. Rodrigo. 1998. The microfracture procedure: Rationale, technique, and clinical observations for treatment of articular cartilage defects. J. Sports Traumatol. Rel. Res. 20, no. 2: 61-70.

\bulletStone, C.A., H. Wright, T. Clarke, R. Powell, V. S. Devaraj, 2000, Healing at skin graft donar sites dressed with chitosan: Br J Plast Surg, v. 53, p. 601-6.

\bulletStone, K. R., inventor. 29 August 2000. "Method and paste for articular cartilage transplatation". US Patent 6.110.209.

\bulletSuh, J., H. Matthew, P. Fu, and F. Fu, inventors. 23 September 1999. "Chitosan-based composite materials containing glycosaminoglycan for cartilage repair". University of Pittburg, assignee. WO Patent 99/47186.

\bulletSuh, J. K., H. W. Matthew, 2000, Application of chitosan-based polysaccharide biomaterials in cartilage tissue engineering: a review: Biomaterials, v. 21, p. 2589-98.,

\bulletTerbojevich, M., A. Cosani, and R. A. A. Muzzarelli. 1996. Molecular parameters of chitosans depolymerized with the aid of papain. Carbohydrate Polymers 29, no. 1: 63-68.

\bulletTubo, R. A., L. M. Barone, and C. A. Wrenn, inventors. 3 March 1998. "Methods and compositions for the repair of articular cartilage defects in mammals". Genzyme Corp., assignee. US Patent 5.723.331.

\bulletUeno, H., H. Yamada, l. Tanaka, N. Kaba, M. Matsuura, M. Okumura, T. Kadosawa, T. Fujinaga, 1999, Accelerating effects of chitosan for healing at early phase of experimental open wound in dogs: Biomaterials, v. 20, p. 1407-14.

\bulletVacanti, J. P., and R. S. Langer, inventors. 23 June 1998a. "Preparation of three-dimensional fibrous scaffold for attaching cells to produce vascularized tissue in vivo". US Patent 5.770.193.

\bulletVacanti, J. P., and R. S. Langer, inventors. 23 June 1998b. "Three-dimensional fibrous scaffold containing attached cells for producing vascularized tissue in vivo". US Patent 5.770.417.

\bulletVacanti, J. P., C. A. Vacanti, and R. S. Langer, inventors. 7 April 1998. "Biodegradable synthetic polymeric fibrous matrixcontainingchondrocyte for in vivo production of a cartilaginous structure". M.I.T., and Children's Medical Center Corp., assignees. US Patent 5.736.372.

\bulletVasios, G. W., P. D. DiBenedetto, C. A. Preston, R. A. Tubo, and J. M. McPherson. 1999. Chitotriosidase is expressed in normal chondrocytes and is upregulated in chondrocytes derived from osteoarthritic cartilage. 45th Annual Meeting, Orthopaedic Research Society.

\bulletVilleneuve, P. E., inventor. 2 February 1999. "Material s for healing cartilage and bone defects". US Patent 5.866.415.

\bulletWakitani, S., T. Kimura, A. Hirooka, T. Ochi, M. Yoneda, H. Owaki, K. Ono, and N. Yasui. 1989. Repair of rabbit articular surfaces with allografts of chondrocytes embedded in collagen gels. Nippon Seikeigeka Gakkai Zasshi -
Journal of the Japanese Orthopaedic Association 63, no. 5: 529-38.

\bulletWakitani, S., T. Goto, S. J. Pineda, R. G. Young, J. M. Mansour, A. I. Caplan, and V. M. Goldberg. 1994. Mesenchymal cell-based repair of large, full-thickness defects of articular cartilage. J Bone Joint Surg Am 76, no. 4: 579-92.

\bulletWei, X., J. Gao, and K. Messner. 1997. Maturation-, dependent repair of untreated osteochondral defects in the rabbit knee joint. Journal of Biomedical Materials Research 34, no. 1: 63-72.

\bulletYagi, K., N. Michibayashi, N. Kurikawa, Y. Nakashima, T. Mizoguchi, A. Harada, S. Higashiyama, H. Muranaka, and M. Kawase. 1997. Effectiveness of fructose-modified chitosan as a scaffold for hepatocyte attachment. Biological & Pharmaceutical Bulletin 20, no. 12: 1290-4.

\newpage

\bulletYalpani, M., and D. Pantaleone. 1994. An examination of the unusual susceptibilities of aminoglycans to enzymatic hydrolysis. Carbohydrate Research 256, no. 1: 159-75.

\bulletZhang, R., E. Morris, and D. Peluso, inventors. 3 August 2000. "Methods and compositions for healing and repair of articular cartilage". Inc. Genetics Institute, assignee. WO Patent 00/44413.

Claims

1. Una composición polimérica para su uso en reparación de un tejido de un paciente, mezclándose dicha composición polimérica con al menos sangre entera, produciendo dicha composición polimérica cuando se mezcla con sangre entera una mezcla, pasando dicha mezcla a un estado no líquido con el tiempo o con la aplicación de calor, reteniéndose dicha mezcla en el lugar de la introducción y adhiriéndose al mismo para la reparación del tejido, donde dicha composición polimérica comprende un polímero y se disuelve o suspende en un tampón que contiene una sal inorgánica u orgánica.

2. La composición polimérica de la reivindicación 1, en la que el polímero es un polisacárido modificado o natural.

3. La composición polimérica de la reivindicación 2, en la que el polisacárido se selecciona del grupo constituido por quitosana, quitina, hialuronano, glicosaminoglicano, sulfato de condroitina, sulfato de queretano, sulfato de dermatano, heparina y sulfato de heparina.

4. La composición polimérica de la reivindicación 1, en la que dicha composición polimérica comprende una proteína o poliaminoácido natural, recombinante o sintético.

5. La composición polimérica de la reivindicación 4, en la que el poliaminoácido es polilisina.

6. La composición polimérica de la reivindicación 4, en la que la proteína natural es colágeno soluble o gelatina.

7. La composición polimérica de la reivindicación 1, en la que dicha composición polimérica comprende ácido poliláctico, ácido poliglicólico, un homocopolímero y copolímeros de bloque sintéticos que contienen funcionalidades carboxílica, amino, sulfónica, fosfónica, con o sin funcionalidades adicionales.

8. La composición polimérica de la reivindicación 7, en la que las funcionalidades adicionales se seleccionan del grupo constituido por hidroxilo, tiol, alcoxi, ariloxi, aciloxi y aroiloxi.

9. La composición polimérica de la reivindicación 1, en la que la sal inorgánica se selecciona del grupo constituido por sales de sodio, cloruro, potasio, calcio, magnesio, fosfato, sulfato y carboxilato.

10. La composición polimérica de la reivindicación 1, en la que dicha composición polimérica se disuelve o suspende en un tampón que contiene una sal orgánica seleccionada del grupo constituido por glicerol-fosfato, fructosa fosfato, glucosa fosfato, L-serina fosfato, adenosina fosfato, glucosamina, galactosamina, HEPES, PIPES y MES.

11. La composición polimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que dicha composición polimérica tiene un pH entre 6,5 y 7,8.

12. La composición polimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que dicha solución polimérica tiene una osmolaridad ajustada a un valor fisiológico entre 250 mOsm/l y 600 mOsm/l.

13. La posición polimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en las que la sangre se selecciona del grupo constituido por sangre venosa, sangre arterial, sangre de hueso, sangre de la médula ósea, sangre del cordón umbilical y sangre de placenta.

14. La composición polimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que la sangre está anticoagulada

15. La composición polimérica de la reivindicación 14, en la que la sangre contiene un anticoagulante seleccionado del grupo constituido por citrato, heparina o EDTA.

16. La composición polimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que la sangre comprende un pro-coagulante para mejorar la coagulación/solidificación en el sitio de introducción.

17. La composición polimérica de la reivindicación 16, en la que el pro-coagulante se selecciona del grupo constituido por trombina, calcio, colágeno, ácido elágico, epinefrina, adenosina difosfato, factor tisular, un fosfolípido y un factor de coagulación.

18. La composición polimérica de la reivindicación 17, en la que el factor de coagulación es el factor VII.

19. La composición polimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en la que la sangre es autóloga o no autóloga.

20. La composición polimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en la que el volumen de la composición polimérica se usa en una proporción que varía de 1:100 a 100:1 con respecto al volumen de sangre o componente sanguíneo.

21. La composición polimérica de las reivindicaciones 1 a 19, en la que dicha composición polimérica y la sangre se mezclan mecánicamente usando ondas sonoras, agitación, agitación con vórtice o pases múltiples en jeringas.

22. La composición polimérica de la reivindicación 3, en la que dicha composición polimérica comprende quitosana al 1,5% p/v.

23. La composición polimérica de la reivindicación 1, en la que dicho polímero es quitosana.

24. La composición polimérica de la reivindicación 10, en la que dicho tampón comprende glicerol fosfato.

25. Uso de la composición polimérica como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 para la fabricación de un medicamento para reparación tisular.

26. El uso de la reivindicación 24, en la que el tejido se selecciona del grupo constituido por cartílago, menisco, ligamento, tendón, hueso, piel, córnea, tejidos periodontales, abscesos, tumores reseccionados y úlceras.

27. El uso de la reivindicación 26, en la que dicho tejido es cartílago.