ES2904611T3 - Combinación de adenovirus y agentes quimioterapéuticos para el tratamiento del cáncer - Google Patents

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Abstract

Adenovirus ONCOS-102 (Ad5/3-d24-GMCSF) para la utilización en el tratamiento del mesotelioma maligno humano, en el que el virus se administra en combinación con dos agentes quimioterapéuticos en un paciente, y en el que los dos agentes quimioterapéuticos son pemetrexed y cisplatino, o pemetrexed y carboplatino.

Description

DESCRIPCIÓN
Combinación de adenovirus y agentes quimioterapéuticos para el tratamiento del cáncer
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la medicina. Específicamente, la presente invención se refiere a una nueva estrategia de utilización de adenovirus ONCOS-102 para el tratamiento de cáncer humano en combinación con dos agentes quimioterapéuticos: pemetrexed y cisplatino, o pemetrexed y carboplatino. Además, se dan a conocer procedimientos de utilización de dicha combinación de virus y agentes quimioterapéuticos en el tratamiento del mesotelioma maligno. Otras medicaciones además del virus y los dos quimioterapéuticos también pueden incluirse en el protocolo de tratamiento.
Antecedentes de la invención
El mesotelioma maligno (MM) es una forma agresiva y rara de cáncer que se desarrolla a partir del mesotelio. El MM está causado principalmente por la exposición al amianto y muestra un periodo de latencia largo, habitualmente superior a 30 años. La media de tiempo de supervivencia para los pacientes de mesotelioma después del diagnóstico típicamente es de solo 9 a 12 meses. El MM afecta a la pleura (el revestimiento exterior de los pulmones y la pared torácica interna) en 85.5% de los casos de MM, el peritoneo (el revestimiento de la cavidad abdominal) en 13.2% de los casos de MM, el pericardio (el saco que circunda al corazón) en 0.5% de los casos de MM y la túnica vaginal (un saco que circunda los testículos) en 0.8% de los casos de MM. Los tumores de MM con frecuencia son poco sensibles a las terapias estándar y la incidencia se está incrementando constantemente en todo el mundo. La baja incidencia de MM ha dificultado durante mucho tiempo la identificación de nuevos fármacos; de esta manera, existe una elevada necesidad de nuevas modalidades de tratamiento.
Típicamente, el cáncer se trata con regímenes de tratamiento convencionales, tales como cirugía, terapias hormonales, quimioterapias, radioterapias y/u otras terapias. Sin embargo, en muchos casos los cánceres que con frecuencia se caracterizan por un estadio avanzado no pueden curarse con las terapias actuales.
La viroterapia es un enfoque de tratamiento relativamente nuevo que aprovecha la capacidad natural de algunos virus de matar las células en las que proliferan y la capacidad de extenderse a células vecinas, amplificando de esta manera el efecto terapéutico de la dosis inicial introducida. En viroterapia, la transducción de las células de cáncer y la replicación vírica se controlan cuidadosamente mediante ingeniería genética del genoma vírico para conseguir una erradicación tumoral eficaz y segura. Una erradicación tumoral segura exige la introducción de diversas modificaciones genéticas en el genoma adenovírico, restringiendo de esta manera la replicación a exclusivamente las células tumorales y obteniendo finalmente la erradicación selectiva del tumor sin efectos secundarios en el tejido sano.
Pueden utilizarse deleciones específicas de genes adenovíricos reguladores clave para crear proteínas disfuncionales o la anulación de su expresión, que conduce a una dependencia de una característica genética específica presente en las células diana. Las deleciones parciales de E1A resultan en una replicación restringida en las células normales, pero permiten la replicación en las células diana, tales como las células de cáncer. Se han creado virus de replicación condicional con una deleción de 24 pares de bases en CR2 (región constante 2) y se ha demostrado que resultan potentes y selectivos en el tratamiento del glioma y en xenoinjertos de cáncer de mama (Fueyo et al., 2000; Heise et al., 2000). Su especificidad para el cáncer resulta de la incapacidad de la E1A disfuncional de liberar factor de transcripción E2F1, lo que conduce a que se requiera E2F1 libre. E2F1 es abundante en las células de cáncer, en donde la ruta de pRb resulta interrumpida muy frecuentemente (Hanahan y Weinberg, 2000).
Los resultados clínicos y preclínicos han mostrado que el tratamiento con virus oncolíticos desarmados no resulta suficientemente inmunoestimuladora para dar lugar a respuestas inmunitarias terapéuticas antitumorales sostenidas. A este respecto, los virus oncolíticos han sido armados para que sean más inmunoestimuladores. Los virus pueden manipularse para expresar proteínas altamente inmunogénicas, tales como el factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF). En el caso de que se expresen proteínas inmunogénicas dentro del microambiente tumoral, son potentes estimuladores de inmunidad antitumoral específica y duradera. La introducción de genes inmunoterapéuticos en células tumorales y, además, su traducción en proteínas, conduce a la activación de la respuesta inmunitaria y a una destrucción más eficiente de las células tumorales. Las células inmunitarias más relevantes a este respecto son las células asesinas naturales (NK) y las células T CD8+ citotóxicas.
ONCOS-102 (Ad5/3-D24-GM-CSF; divulgado en el documento n°WO 2010/072900) es un adenovirus de serotipo 5, que comprende una cápside quimérica para la administración génica potenciada en células de cáncer y una deleción de 24 pb en el sitio de unión de Rb de la región E1A para la replicación restringida a las células de cáncer. ONCOS-102 está armado con factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) para potenciar el efecto inmunoestimulador. La seguridad y actividad inmunitaria de ONCOS-102 ya han sido demostradas en estudio clínico de fase 1 (NCT01598129). En dicho estudio de fase 1, el tratamiento local de mesotelioma pleural con ONCOS-102 indujo una respuesta sistémica de células T CD8+ antitumorales y la infiltración de las células T CD8+ en los tumores en un paciente de mesotelioma pleural maligno refractario de estadio terminal.
Koski et al. (2010) divulgan el tratamiento con ONCOS-102 de un total de 21 pacientes con tumores sólidos avanzados refractarios a terapias estándares. Según dichos estudios, ONCOS-102 aparentemente resulta seguro en el tratamiento de los pacientes de cáncer. También se observaron signos prometedores de eficacia.
La publicación n° WO 99/59604 divulga un procedimiento para el tratamiento del cáncer de células escamosas que consiste en la inyección directa del adenovirus en el cáncer y la administración de dos quimioterapéuticos: cisplatino y 5-fluorouracilo.
Siurala et al. (2015) divulgan una combinación de adenovirus oncolítico de cápside modificada CGTG-102 (análogo a ONCOS-102) con doxorrubicina, con o sin ifosfamida. Al someterlo a ensayo in vivo frente a tumores de sarcoma de tejido blando establecidos en hámsters sirios totalmente inmunocompetentes, se encontró que la combinación resultaba eficaz.
La publicación n° US 7393478 B2 divulga un procedimiento para inhibir el crecimiento tumoral en un sujeto, que comprende administrar en el sujeto una cantidad eficaz de una micela que comprende cisplatino y un agente terapéutico. El agente terapéutico en dicho procedimiento puede ser, por ejemplo, GM-CSF.
En la práctica, el tratamiento del mesotelioma maligno (MM) se ha mantenido sin cambios desde 2003. La quimioterapia de primera línea utilizada más comúnmente para el MM se realiza con los agentes quimioterapéuticos pemetrexed (Pemetrexed Disosium, Alimta), cisplatino (Platinol), carboplatino (Paraplatin) y combinaciones de los mismos. A pesar de los avances en los regímenes convencionales de tratamiento del cáncer, el mesotelioma humano sigue siendo incurable y se requieren desesperadamente nuevas alternativas de tratamiento.
Sumario de la invención
Los objetivos de la presente exposición son proporcionar una nueva combinación de adenovirus oncolítico y agentes quimioterapéuticos, una nueva terapia de combinación que utiliza adenovirus oncolítico y agentes quimioterapéuticos para el tratamiento de cáncer en un paciente y que, además, resuelve los problemas relacionados con la terapia convencional del cáncer.
Un aspecto de la invención es el adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del mesotelioma maligno humano, en el que la administración del virus en un paciente humano que lo necesita se lleva a cabo en combinación con la administración de dos agentes quimioterapéuticos: pemetrexed y cisplatino, o pemetrexed y carboplatino.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras siguientes se incluyen con el fin de demostrar adicionalmente determinados aspectos y características de la presente invención. La invención podrá entenderse mejor en referencia a uno o más de dichos dibujos en combinación con la descripción detallada de formas de realización específicas, que incluyen ejemplos.
Figura 1. Tratamiento de las células de mesotelioma humano: JL-1, MSTO-211H y H226 con pemetrexed y cisplatino o pemetrexed y carboplatino solos o en combinación con ONCOS-102 (10 PV/célula), o con ONCOS-102 solo en un estudio in vitro de eficacia. a) Se midió la eficacia antitumoral mediante ensayo de viabilidad celular de MTS. Se determinó la viabilidad celular frente a células no tratadas (control) 72 horas después del tratamiento. La cantidad de: b) células necróticas (PI) y c) células apoptóticas tempranas (anexina-V marcada con FITC) 48 horas después del tratamiento se analizó mediante citometría de flujo. Barras de error, medias±SEM: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
Figura 2. Tratamiento combinado de células de mesotelioma humano: JL-1, MSTO-211H y H226 con pemetrexed y cisplatino o pemetrexed y carboplatino solos o en combinación con ONCOS-102 (10 PV/célula), o con ONCOS-102 solo, muerte celular tumoral inmunogénica in vitro. a) Se midió el ATP extracelular a partir de sobrenadante 48 (Jl-1, MSTO-211H) y 72 (H226) horas después del tratamiento utilizando un kit de determinación de ATP. b) La secreción de HMGB1 extracelular en el sobrenadante se midió 3 días después del tratamiento utilizando un ensayo ELISA. c) La exposición a calreticulina sobre la superficie celular externa de las células de mesotelioma humano sometidas a ensayo se midió 24 (H226, JI-1) y 48 (MSTO-211H) horas después del tratamiento, mediante citometría de flujo. Barras de error, medias±SEM: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
Figura 3. Eficacia oncolítica de ONCOS-102, perfil de expresión de receptores y ensayo de infectividad vírica medida en tres líneas celulares de mesotelioma (Jl-1, MSTO-211H y H226). a) La eficacia oncolítica de ONCOS-102 (0,1; 1; 10; 100 y 1000 PV/célula) se midió mediante ensayo de viabilidad celular con MTS 3 días después del inicio del tratamiento. Se determinó el perfil de viabilidad celular contra células no tratadas (control). b) La expresión de CAR, DSG2 y CD46 sobre las líneas celulares de mesotelioma se midió mediante citometría de flujo tras la tinción con anticuerpos específicos. c) Se llevó a cabo el ensayo de infectividad de ONCOS-102 para cinco grupos de tratamiento. La determinación de la infectividad de ONCOS-102 se basó en la cuantificación visual de las células infectadas tras la tinción de la proteína vírica hexón y finalmente el cálculo para las manchas detectadas. Para cada 5 réplicas, se adquirieron 5 imágenes de campos no solapados, utilizando un microscopio AMG EVO XL. Para la comparación de la infectividad, los datos se presentaron como número medio de manchas en 5 pocillos. Barras de error, medias±SEM: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.
Figura 4. Se analizó la eficacia antitumoral de ONCOS-102 (1E+8 PV/ratón por vía intratumoral (i.t.)) en combinación con pemetrexed (10 mg/kg en 100 pl intraperitoneales (IP)), cisplatino (1,5 mg/kg en 100 pl IP) o carboplatino (8 mg/kg en 100 pl IP) en un modelo de xenoinjerto de mesotelioma humano en ratones BALB/c desnudos (7 ratones en cada grupo, 14 tumores por grupo) y se comparó con el control o con cada tratamiento por sí solo. a) Se trataron ratones BALB/c desnudos por vía s.c. con tumores H226 (6*10® células/tumor) según el esquema de tratamiento (Tabla 1) con ONCOS-102 (i.t.) y quimioterapias (IP) en 8 grupos. Los animales se trataron cada 3 días durante 2 meses. b) Se calculó el perfil de supervivencia mediante prueba de Kaplan-Meier. c) La GM-CSF humana producida por ONCOS-102 se analizó en tumor, hígado y suero después de la eutanasia de los animales, utilizando la técnica ELISA. d) Se midieron las copias adenovíricas (gen E4) mediante qPCR de tumor, hígado y suero de los animales eutanizados. Barras de error, medias±SEM: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.
Figura 5. Se analizó la eficacia antitumoral de ONCOS-102 (1E+8 PV/ratón i.t.), pemetrexed (10 mg/kg en 100 pl IP) y cisplatino (1,5 mg/kg en 100 pl IP), la combinación de los tres o la combinación de los quimioterapéuticos en un modelo de xenoinjerto de mesotelioma humano en ratones BALB/c desnudos (2 ratones por grupo, 2 tumores en cada ratón). Se trataron ratones BALB/c desnudos portadores de tumores H226 s.c. (7*10® células/tumor) con ONCOS-102 (i.t.) y quimioterapia (IP) en 4 grupos. Los animales se trataron cada 3 días durante 54 días. b) Se monitorizó el peso corporal y se midió durante todo el experimento. El peso (g) se convirtió en el valor de peso corporal a edad parental, en el que la masa corporal el día cero se fijó en 100%. c) Se calculó el perfil de supervivencia mediante la prueba de Kaplan-Meier. Barras de error, medias±SEM: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.
Figura 6. Se analizó la eficacia antitumoral de ONCOS-102 (2E+8 PV/ratón i.t.), pemetrexed (6,7 mg/kg en 100 pl IP) y carboplatino (5,4 mg/kg en 100 pl IP), la combinación de los tres o la combinación de los quimioterapéuticos en un modelo de xenoinjerto de mesotelioma humano en ratones BALB/c desnudos (2 ratones por grupo, 2 tumores en cada ratón). Se trataron ratones BALB/c desnudos portadores de tumores H22® s.c. (7*10® células/tumor) con ONCOS-102 (i.t.) y quimioterapia (IP) en 4 grupos. Los animales se trataron cada 3 días durante 30 días. b) Se monitorizó el peso corporal y se midió durante todo el experimento. El peso (g) se convirtió en el valor de peso corporal a edad parental, en el que la masa corporal el día cero se fijó en 100%. c) Se calculó el perfil de supervivencia mediante la prueba de Kaplan-Meier. Barras de error, medias±SEM: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.
Descripción detallada de la invención
A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente solicitud presentan los mismos significados entendidos comúnmente por el experto ordinario en la materia a la que se refiere la presente invención.
El mesotelioma es un cáncer resistente al tratamiento bajo terapias estándares con una cantidad en constante aumento de casos mortales en todo el mundo. Los pulmones, en el tórax, así como órganos abdominales, tales como el estómago, los intestinos, el hígado y el corazón, se encuentran cada uno de ellos envueltos en membranas, tales como la pleura, el peritoneo y el pericardio. Una parte que recubre la superficie de dichas membranas se denomina mesotelio. El tumor que se desarrolla a partir de dicho mesotelio se denomina mesotelioma. Existen tres subtipos histológicos principales de mesotelioma maligno: epitelioide, sarcomatoso y bifásico. La expresión "mesotelioma maligno" (MM) tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a mesotelioma que afecta a la pleura, el peritoneo, el pericardio o la túnica vaginal. El tratamiento estándar más eficaz contra el MM hasta hoy es una combinación de pemetrexed y cisplatino, que conduce a una tasa de respuesta (TR) de 41%. La combinación de cisplatino y pemetrexed mejora la supervivencia de los pacientes de mesotelioma en comparación con la quimioterapia con agentes individuales. Sin embargo, el MM es todavía una enfermedad letal con un pronóstico de media de tiempo hasta la progresión del tumor (TPT)/supervivencia global (SG) desde el inicio del tratamiento de hasta 12 meses y, por lo tanto, se requieren nuevas modalidades de tratamiento.
La expresión "respuesta antivírica" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la respuesta de una célula a la infección vírica e incluye, por ejemplo, la producción de interferones, la liberación de citoquinas, la producción de quimioquinas, la producción de linfoquinas o cualquier combinación de las mismas.
Las expresiones "célula huésped normal" y "tejido normal" tal como se utilizan en la presente memoria se refieren a una célula o tejido no infectado no canceroso con una respuesta antivírica intacta.
La expresión "agente oncolítico" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un agente capaz de inhibir el crecimiento y/o eliminación de las células tumorales.
El término "sujeto" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier organismo vivo, incluyendo seres humanos y animales, tejido humano y animal, y células humanas y animales.
El término "paciente" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier sujeto (preferentemente humano) que sufre una enfermedad, tal como MM, que es probable que se beneficie de un tratamiento con una terapia de combinación tal como se describe en la presente memoria.
Los adenovirus son virus sin cubierta de entre 70 y 90 nm de diámetro con una cápside icosaédrica. Su genoma es de ADN lineal de doble cadena y de entre 25 y 45 kilobases de tamaño con repeticiones terminales invertidas (RTI) en ambos extremos y una proteína terminal unida a los extremos 5'.
La cápside icosaédrica está formada por tres proteínas principales, de las que los trímeros de hexón son los más abundantes. Cada uno de los doce vértices de la cápside también contiene una proteína pentamérica, una base de pentón que está unida covalentemente a la fibra. La fibra es una proteína trimérica que sobresale de la base pentón y es una estructura de tipo barra nudosa. Otras proteínas víricas: IIIa, IVa2, VI, VIII y IX, también están asociadas a la cápside vírica. Las proteínas VII, el péptido pequeño mu y una proteína terminal (PT) están asociadas al ADN. La proteína V proporciona una unión estructural a la cápside mediante la proteína VI.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "cápside" se refiere a la cubierta proteica del virus, que incluye proteínas de base hexón, fibra y pentón.
Todos los adenovirus humanos presentan similitudes en su estructura de fibra. Cada una presenta una cola N-terminal, un eje con secuencias repetidas y un dominio de botón C-terminal con una estructura globular. El dominio de botón es responsable principalmente de la unión al receptor celular diana y su estructura globular presenta una gran superficie para la unión lateral y apical. Las proteínas de fibra de los adenovirus de diferentes subgrupos característicamente difieren en longitud y capacidad de flexión.
La fibra participa en la unión del virus a la célula diana. En primer lugar, el dominio de botón de la proteína de fibra se une al receptor de la célula diana; en segundo lugar, el virus interactúa con una molécula de integrina y, en tercer lugar, el virus resulta endocitado por la célula diana. A continuación, el genoma vírico es transportado desde los endosomas al interior del núcleo y puede iniciarse la replicación del genoma vírico.
Tal como se utiliza en la presente memoria, "quimerismo Ad5/3" de la cápside se refiere a un quimerismo en el que la parte de botón de la fibra es de Ad serotipo 3 y el resto de la fibra es de Ad serotipo 5.
Los adenovirus dependen de la maquinaria celular para replicar el genoma vírico. Pueden infectar las células quiescentes e inducir un estado similar a la etapa S del ciclo celular, activando la replicación del ADN vírico. El genoma adenovírico puede dividirse en genes inmediatos tempranos (E1A), tempranos (E1B, E2, E3, E4), intermedios (IX, Iva) y tardíos (L1-L5).
Los productos del gen E3 no resultan esenciales para la replicación vírica in vitro, aunque están dedicados al control de diversas respuestas inmunitarias del huésped. E3-gp19K inhibe el transporte del complejo mayor de histocompatibilidad (c Mh ) de clase 1 del retículo endoplásmico (RE) a la membrana plasmática, bloqueando de esta manera la presentación de péptidos a los linfocitos T a través del CMH.
La proteína adenovírica E1A se describió originariamente como una proteína de unión a pRb capaz de inducir la replicación del ADN en células normales quiescentes. Una de las funciones clave de la proteína e 1a es interrumpir las interacciones de pRb-E2F, liberando de esta manera los factores de transcripción E2F, que activan los promotores sensibles a E2F y la transcripción de los genes que controlan, tal como E2A adenovírico. La región conservada 2 (CR2) en la proteína E1A establece una interacción fuerte con el dominio de unión de bolsillo de pRb y CR1 media en la rotura misma de la unión de E2F y pRb. Se han creado virus de replicación condicional con una deleción de 24 pares de bases en la CR2 y se ha demostrado que son potentes y selectivos en el tratamiento del glioma y los xenoinjertos de cáncer de mama. Su especificidad para el cáncer resulta de la incapacidad de E1A disfuncional de liberar factor de transcripción E2F1, conduciendo a que se requiera E2F1 libre.
El adenovirus ONCOS-102 se ha divulgado anteriormente, en la publicación n° WO 2010/072900. ONCOS-102 es un adenovirus de serotipo 5 (Ad5) que muestra las modificaciones siguientes, difiriendo del genoma de Ad5: 1. Una deleción de 24 pares de bases (pb) en la región constante 2 (CR2) del gen E1A. La proteína E1A disfuncional no puede unirse y liberar el factor de transcripción E2F1 respecto de la proteína del retinoblastoma (Rb), conduciendo a que se requiera E2F1 libre para la transcripción génica del adenovirus. El factor E2F1 libre es abundante en las células de cáncer, en donde la ruta de pRb resulta interrumpida más frecuentemente. De esta manera, los virus con la deleción de 24 pb en E1A son capaces de replicarse eficientemente en las células de cáncer. La transcripción del gen E1A en ARNm está controlada por el promotor endógeno de E1A.
2. Se ha introducido una deleción de 965 pb en la región temprana 3 (E3) codificante de las proteínas 6.7K y gp19K. Dichas proteínas están asociadas a la capacidad del adenovirus de evadir los mecanismos de control inmunitario del huésped y sus funciones son prescindibles en la replicación adenovírica.
3. Un transgén codificante de la proteína factor estimulador de colonias de macrófagos-granulocitos (GM-CSF) humana ha sido insertado en la región E3, sustituyendo 6.7K y gp19K. La transcripción génica del GM-CSF en ARNm está controlada por el promotor endógeno de E3. En otras palabras, en adenovirus ONCOS-102, los 965 pares de bases codificantes de los genes víricos gp19K y 6.7k han sido delecionados de la región E3 y se ha introducido un transgén de GM-CSF para sustituirlos.
4. El botón de fibra de serotipo 5 ha sido sustituido por fibra de serotipo 3, permitiendo de esta manera la entrada del virus en las células mediante el receptor de serotipo 3 en lugar del receptor CAR de serotipo 5.
En el adenovirus ONCOS-102, se encuentra presente el promotor de E1A nativo, es decir, no ha sido sustituido por otro promotor.
Brevemente, en adenovirus ONCOS-102, GM-CSF se encuentra bajo elementos endógenos de control de E3 vírico, dando como resultado la expresión del transgén asociado a la replicación a partir de aproximadamente 8 horas después de la infección. El virus se replica de una manera selectiva tumoral, resultando de esta manera en la producción restringida al tumor de GM-CSF. La especificidad tumoral se consigue mediante una deleción de 24 pb, que anula el sitio de unión a Rb de E1A y, tal como se ha demostrado en publicaciones anteriores, el virus se replica selectivamente en las células con defectos de la ruta de p16-Rb, entre ellas la mayoría, si no todos, los cánceres humanos. La potencia oncolítica del adenovirus ONCOS-102 se ha demostrado que resulta más eficaz que el virus de control de tipo salvaje.
Los adenovirus oncolíticos que expresan GM-CSF inducen inmunidad anticáncer, actuando simultáneamente de manera directa sobre las células de cáncer mediante oncólisis. GM-CSF es un potente inductor de la inmunidad antitumoral sistémica asociada al reclutamiento y maduración de las células presentadoras de antígenos (CPA), principalmente células dendríticas, así como el reclutamiento de células del brazo innato de la inmunidad. Sin embargo, los niveles de citoquinas elevados sistémicamente representan un riesgo de efectos secundarios tóxicos. Aparte del riesgo directo de efectos secundarios mediados por concentraciones séricas elevadas de GM-CSF, un riesgo indirecto resulta del reclutamiento de células mieloides supresoras derivadas (MDSC). Aunque el efecto inmunosupresor de las MDSC resulta potencialmente perjudicial para los pacientes de cáncer en general, podría resultar particularmente contraproducente en el contexto de la inmunoterapia del cáncer. De esta manera, la restricción de la expresión de GM-CSF al sitio tumoral resulta crucial.
El adenovirus ONCOS-102 ha mostrado un buen potencial oncolítico y la producción de GM-CSF humano funcionalmente activo in vitro (Koski et al., 2010). Se ha demostrado en hámster inmunocompetentes que el virus resulta eficaz en detener el crecimiento de tumores pancreáticos singénicos agresivos. La evidencia de replicación del virus en tumores se demostró mediante medición del número de copia vírico. Se demostró selectividad de la replicación, ya que no se produjo ningún incremento del número de copia vírico en tejido hepático inyectado directamente. Se demostró la producción ligada a la replicación local de GM-CSF en tumores, mientras que se produjeron muy pocas fugas de GM-CSF al suero o al hígado. También se demostró que la combinación de una dosis baja de ciclofosfamida con adenovirus ONCOS-102 puede potenciar el efecto antitumoral, mientras que el tratamiento de ciclofosfamida solo no resultaba en una reducción significativa del crecimiento tumoral.
Globalmente, el tratamiento de los pacientes de cáncer avanzado con adenovirus ONCOS-102 aparentemente resulta seguro y se han observado signos prometedores de posible eficacia. Aunque el virus se encuentra presente en suero durante periodos prolongados incluso después de una única dosis, las inyecciones múltiples es probable que mejoren la transducción tumoral y potencien la inmunidad antitumoral.
La "quimioterapia", tal como se utiliza el término en la presente memoria, se refiere a la utilización de compuestos químicos o fármacos en el tratamiento de una enfermedad, aunque el término quimioterapia está más frecuentemente asociado al tratamiento del cáncer. Los compuestos quimioterapéuticos del cáncer comprenden prácticamente 100 fármacos individuales.
Los efectos secundarios más comunes de los agentes quimioterapéuticos son las náuseas y los vómitos. Una elevada proporción de individuos también sufre de mielosupresión, o supresión de la médula ósea, que produce glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas. Estos efectos secundarios y otros también resultan exacerbados por la supresión del sistema inmunitario concomitante a la destrucción y falta de producción de glóbulos blancos, y riesgo asociado de infección oportunista.
Entre otros efectos secundarios comunes a un amplio abanico de agentes quimioterapéuticos se incluyen: pérdida de cabello (alopecia), pérdida del apetito, pérdida de peso, cambios en el sentido del gusto, estomatitis y esofagitis (inflamación y úlceras), estreñimiento, diarrea, fatiga, daños cardiacos, cambios en el sistema nervioso, daños pulmonares, daños en el tejido reproductor, daños hepáticos, y daños en los riñones y sistema urinario.
Se ha mostrado que la muerte de las células de cáncer puede ser inmunogénica o no inmunogénica. La muerte celular inmunogénica (MCI) comprende cambios en la estructura de la superficie celular y conduce a la liberación de factores proinmunogénicos. Posteriormente, atrae células presentadoras de antígenos (CPA) para incorporar antígenos tumorales, procesarlos y finalmente inducir una respuesta inmunitaria antitumoral (células T antitumorales específicas). El éxito del tratamiento del cáncer, utilizando quimioterapia, virus oncolíticos o una combinación de los dos, se basa en la inducción de la muerte celular tumoral inmunogénica y la inducción de respuestas inmunitarias antitumorales. Se ha conocido que algunos adenovirus quimioterapéuticos y oncolíticos actúan como potentes inductores de la MCI y, de esta manera, presentan un impacto beneficioso sobre las respuestas inmunitarias anticáncer, contribuyendo a la actividad antitumoral. La MCI puede evaluarse por la presencia de biomarcadores de MCI, tales como la calreticulina (CRT) en la membrana plasmática externa, seguido de la liberación extracelular de proteína de alta movilidad del grupo 1 (HMGB1, por sus siglas en inglés) y adenosíntrifosfato (ATP).
Tal como se ha divulgado anteriormente, la terapia del cáncer con adenovirus ONCOS-102, así como la terapia con quimioterapéuticos, han mostrado alguna eficacia utilizados por separado. Los inventores querían estudiar si la combinación de terapia de genes adenovíricos con otras terapias, tales como la terapia tradicional, podría resultar más eficaz en el tratamiento del MM que cualquiera de los dos por sí solo.
La expresión "terapia de combinación" tal como se utiliza la expresión en la presente memoria se refiere a la administración de ONCOS-102 y agentes quimioterapéuticos, preferentemente pemetrexed y cisplatino, o pemetrexed y carboplatino, en un paciente que lo necesita. En la terapia de combinación, el virus y también los agentes quimioterapéuticos pueden administrarse en varias dosis durante varios días. La administración de agentes quimioterapéuticos puede iniciarse antes de iniciar la administración de virus y también pueden administrarse adicionalmente dosis de agentes quimioterapéuticos durante el periodo en que se administran las dosis de virus. El protocolo de tratamiento puede comprender además en primer lugar la preactivación con el virus mediante la administración de los agentes quimioterapéuticos y después continuar con la administración de ambos, el virus y los agentes quimioterapéuticos. En otra forma de realización, la terapia de combinación en primer lugar comprende los agentes quimioterapéuticos pemetrexed y cisplatino, aunque durante la terapia de combinación se sustituye el cisplatino por carboplatino. Lo anterior puede resultar necesario porque, por ejemplo, aparecen efectos secundarios excesivos al utilizar cisplatino en la terapia. También puede administrarse concurrentemente con la terapia de combinación otra medicación.
Tal como se utiliza en la presente memoria, "concurrente" se refiere a una medicación o terapia que se ha administrado antes, después o simultáneamente con la terapia de combinación tal como se indica en la presente memoria. El periodo para una terapia concurrente puede variar entre minutos y varias semanas. Típicamente, la terapia que es concurrente con la terapia de combinación tal como se indica en la presente memoria dura algunos días o algunas semanas.
El término "preactivación" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la utilización de un pretratamiento inductor de apoptosis con la capacidad de la quimioterapia citotóxica convencional. La preactivación tumoral realizada con virus oncolíticos resulta en la muerte inmunogénica de células de cáncer, que está asociada a la presentación de calreticulina sobre la superficie celular y a la liberación de adyuvantes naturales, específicamente proteína B1 de grupo de alta movilidad (HMGB1) y ATP procedentes del interior de las células moribundas, conduciendo finalmente a la estimulación de las CD y a la consiguiente activación de la respuesta inmunitaria adaptativa. Dicho cambio inducido por virus en el medio tumoral resulta esencial para la facilitación de una respuesta inmunitaria antitumoral significativa. Las células presentadoras de antígeno capturan antígenos tumorales a partir de células tumorales moribundas y las procesan para la presentación a CMH de clases I y II, migran a ganglios linfáticos secretores y estimulan las células B y T específicas de antígeno. Por ejemplo, el adenovirus ONCOS-102 puede resultar en la inducción de células T CD8+ específicas de tumor citotóxicas. El término "preactivación" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere también a la capacidad de los agentes quimioterapéuticos, al administrarlos antes de la administración del virus, de causar este tipo de muerte inmunogénica de células de cáncer. Por otra parte, la preactivación tumoral con agentes quimioterapéuticos también se refiere a la expansión del espacio intersticial utilizando un pretratamiento inductor de apoptosis.
Tal como se indica en la presente memoria, la expresión "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de un compuesto, agente terapéutico, virus o fármaco, que es capaz de llevar a cabo el resultado deseado. Por ejemplo, una cantidad eficaz de un agente quimioterapéutico y/o adenovirus es una cantidad suficiente para producir resultados clínicos beneficiosos o deseados, incluyendo resultados clínicos. Puede administrarse una cantidad eficaz en una o más administraciones. Tal como se indica en la presente memoria, la cantidad eficaz es una cantidad suficiente para mejorar, estabilizar, revertir, enlentecer y/o retrasar el avance del mesotelioma maligno o para curar el mesotelioma maligno. En la presente invención, el efecto de los agentes quimioterapéuticos y el adenovirus ONCOS-102 puede monitorizarse por ejemplo mediante monitorización de la reacción tumoral a dicho tratamiento. La monitorización de la reacción del tumor puede llevarse a cabo con cualquier procedimiento adecuado conocido de la técnica. Puede llevarse a cabo, por ejemplo, con procedimientos que miden el estado inmunitario de las células, tales como los indicados en Ranki et al. (2014). Por ejemplo, la monitorización puede llevarse a cabo mediante medición de la presencia de linfocitos infiltrantes tumorales en el tumor; la respuesta de tipo TH1 puede monitorizarse con una micromatriz y también puede utilizarse el ensayo de inmunospot ligada a enzima IFNy (ELISPOT) en la monitorización.
La cantidad eficaz es, de esta manera, una cantidad capaz de, o necesaria para, causar un efecto o reacción deseado en el tumor. Tal como se entiende en la técnica, una cantidad eficaz puede variar dependiendo, entre otros, de la historia del paciente, así como de otros factores, tales como el tipo y/o dosis de agente quimioterapéutico utilizado.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "toxicidad" se refiere a un suceso tóxico asociado a la administración de agentes quimioterapéuticos. Entre dichos sucesos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, neutropenia, trombopenia, muerte tóxica, fatiga, anorexia, náuseas, erupciones en la piel, infección, diarrea, mucositis y anemia. Los efectos tóxicos pueden monitorizarse con cualquier procedimiento convencional conocido en el campo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "periodo de tratamiento" se refiere a un periodo de tiempo en el que se lleva a cabo el tratamiento de combinación. El periodo de tratamiento puede consistir en varias administraciones de ONCOS-102 y agentes quimioterapéuticos, en el que las administraciones pueden llevarse a cabo en ciclos. El periodo de tratamiento puede durar semanas o meses. El periodo de tratamiento puede durar hasta un año.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "periodo de administración" se refiere a un periodo de tiempo durante el que el adenovirus, los agentes quimioterapéuticos u otra medicación se administran a un paciente. Durante el periodo de administración, puede administrarse una única dosis o varias dosis del agente en cuestión. El periodo de administración puede ser de minutos, horas, días, semanas o meses. El periodo de administración puede consistir en ciclos. Por ejemplo, puede utilizarse un ciclo de tres semanas (21 días) en la administración de agentes quimioterapéuticos.
Los fármacos antineoplásicos a base de platino (informalmente denominados platinos) son agentes quimioterapéuticos para el tratamiento del cáncer. Son complejos de coordinación del platino. El carboplatino y el cisplatino son antineoplásicos a base de platino.
El pemetrexed es químicamente similar al ácido fólico y está en la clase de los fármacos quimioterapéuticos denominados antimetabolitos del folato. El pemetrexed funciona mediante la inhibición de tres enzimas utilizados en la síntesis de purinas y pirimidinas: timidilato sintasa (TS), dihidrofolato reductasa (DHFR) y glicinamida ribonucleótido formiltransferasa (GARFT). Mediante la inhibición de la formación de los nucleótidos precursores purinas y pirimidinas, el pemetrexed evita la formación de ADN y ARN que resultan necesarios para el crecimiento y supervivencia de tanto las células normales en división como las células de cáncer.
El pemetrexed ha sido autorizado por la FDA para la utilización en combinación con cisplatino para el tratamiento del MPM no resecable (500 mg/m2y 75 mg/m2, respectivamente). El ensayo EMPHAClS de fase III de grandes dimensiones mostró resultados mejorados en pacientes tratados con cisplatino y pemetrexed en comparación con cisplatino solo. También se mostró que la mediana de supervivencia en pacientes en el grupo de combinación era de 12 meses, en comparación con una media de supervivencia de 9 meses en el grupo de cisplatino solo (p=0.02). Debido a la elevada toxicidad del cisplatino en muchos pacientes de MM, el carboplatino se ha sometido a ensayo como alternativa. Sin embargo, la totalidad de dichos quimioterapéuticos de primera línea ha mostrado una baja eficacia contra el MM.
Las composiciones terapéuticas generalmente se formulan respecto a la vía de administración particular. En la terapia de combinación tal como se indica en la presente memoria el pemetrexed se utiliza en su concentración eficaz. A título de ejemplo, para el tratamiento del MM, el pemetrexed puede administrarse a una dosis diaria total de hasta 500 mg/m2. El pemetrexed puede administrarse, por ejemplo, en forma de una infusión intravenosa (i.v.) durante 10 minutos el día 1 de cada ciclo de 21 días, en el caso de que se utilice un ciclo de 21 días. Por ejemplo, en el caso de aparecer efectos secundarios, la dosis puede ser inferior, tal como de entre 200 mg/m2 y 450 mg/m2 y más preferentemente de entre 250 mg/m2 y 375 mg/m2. El pemetrexed también puede administrarse por vía intraperitoneal en caso apropiado.
En la terapia de combinación tal como se indica en la presente memoria, el cisplatino se utiliza en su concentración eficaz. En el tratamiento del MM, la dosis típica de cisplatino es de 75 mg/m2 infusionados i.v. durante 2 horas iniciada aproximadamente 30 minutos después del final de la infusión del pemetrexred. La cantidad de cisplatino administrada puede variar entre 30 mg/m2 y 75 mg/m2. Por ejemplo, en el caso de efectos secundarios, la dosis puede ser inferior, tal como de entre 30 mg/m2 y 70 mg/m2, más preferentemente de entre 35 mg/m2 y 60 mg/m2 y lo más preferentemente de entre 37.5 mg/m2 y 56.25 mg/m2. El cisplatino también puede administrarse por vía intraperitoneal en caso apropiado.
En la terapia de combinación con adenovirus ONCOS-102, puede administrarse cisplatino y pemetrexed en una proporción molar de entre 0.75:10 y 3:10. Lo más preferentemente la proporción es de 1.5:10.
En la terapia de combinación tal como se indica en la presente memoria, el carboplatino se utiliza en su concentración eficaz. En la terapia de combinación de tratamiento del MM, la dosis típica de carboplatino es de 400 mg/m2 en un paciente con función renal normal. El carboplatino puede infusionarse i.v. durante 30 a 60 min iniciados aproximadamente 30 minutos después del final de la infusión del pemetrexed, que ha sido infusionado durante un tiempo de aproximadamente 10 min. Sin embargo, la dosis de carboplatino generalmente se calcula según la fórmula de Calvert (calculada en mg, no en mg/m2) que considera la tasa de filtración glomerular (TFG) del paciente y la zona objetivo bajo la curva de concentración versus tiempo (AUC, en mg/ml x min): dosis total (mg)=(AUC objetivo) x (TFG 25). De esta manera, la dosis de carboplatino puede ajustarse y reducirse, por ejemplo debido a efectos secundarios, especialmente debido a una función renal reducida.
En la terapia de combinación con adenovirus ONCOS-102, las dosis administradas típicamente son de aproximadamente 500 mg/m2 de pemetrexed y aproximadamente AUC 5 de carboplatino. En una forma de realización preferida, y en el caso de que el paciente presente la función renal normal, pueden administrarse aproximadamente 500 mg/m2 de pemetrexed y aproximadamente 400 mg/m2 de carboplatino. Sin embargo, las cantidades administradas pueden variar entre 250 mg/m2 y 500 mg/m2 de pemetrexed y entre 200 mg/m2 y 400 mg/m2 de carboplatino. En determinados casos, especialmente en el caso de que los agentes quimioterapéuticos muestren efectos tóxicos, pueden administrarse aproximadamente 375 mg/m2 de pemetrexed y aproximadamente 300 mg/m2 de carboplatino. De esta manera, el pemetrexed y el carboplatino pueden administrarse en una proporción molar de 5:4. Sin embargo, la proporción puede variar entre 5:8 y 5:2.
En la terapia de combinación tal como se indica en la presente memoria, puede administrarse adenovirus ONCOS-102 en varias dosis y en diferentes tiempos que los agentes quimioterapéuticos, los cuales también pueden administrarse en varias dosis.
Un objetivo de la presente invención es el adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del mesotelioma maligno humano, en el que el virus se administra en combinación con dos agentes quimioterapéuticos en un paciente, y en el que los dos agentes quimioterapéuticos son pemetrexed y cisplatino, o pemetrexed y carboplatino.
Todavía otro objetivo de la presente invención es el adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del mesotelioma maligno humano, en el que el virus se administra en combinación con pemetrexed y cisplatino en un paciente que lo necesita, y en el que la proporción molar de pemetrexed y cisplatino es de entre 10:0.75 y 10:3.
Todavía otro objetivo de la presente invención es el adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del mesotelioma maligno humano, en el que el virus se administra en combinación con pemetrexed y cisplatino en un paciente que lo necesita, y en el que la proporción molar de pemetrexed y cisplatino es de 10:1.5.
Un objetivo adicional de la presente invención es el adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del mesotelioma maligno humano, en el que el virus se administra en combinación con pemetrexed y carboplatino en un paciente que lo necesita, y en el que la proporción molar de pemetrexed y carboplatino es de entre 5:8 y 5:2.
Todavía otro objetivo de la presente invención es el adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del mesotelioma maligno humano, en el que el virus se administra en combinación con pemetrexed y carboplatino en un paciente que lo necesita, y en el que la proporción molar de pemetrexed y carboplatino es de 5:4.
En unas formas de realización preferidas de la presente invención, también pueden utilizarse diversas combinaciones de ciclohexamida, cianocobalamina, ácido folático y dexametasona, además de ONCOS-102 y pemetrexed y cisplatino o pemetrexed y carboplatino. Más específicamente, a partir de la lista de agentes que consiste en ciclohexamida, cianocobalamina, ácido folático y dexametosa, pueden utilizarse uno, dos, tres o cuatro y cualquier combinación de los mismos concurrentemente con la terapia de combinación que comprende ONCOS-102 y pemetrexed y cisplatino, u ONCOS-102 y pemetrexed y carboplatino. A título de ejemplo, el sujeto puede tratarse con uno o más agentes auxiliares que reducen o eliminan las reacciones de hipersensibilidad antes, durante y después de la administración de los agentes quimioterapéuticos de la terapia de combinación indicada, tal como uno o más de entre dexametasona, ácido fólico y vitamina B12 antes, durante y después de la administración de los agentes quimioterapéuticos. En determinadas formas de realización, el sujeto se trata con entre 2 y 25 mg de dexametasona por vía oral el día antes, el mismo día y el día después de la administración de los agentes quimioterapéuticos: entre 400 y 1000 |jg de ácido fólico por vía oral diarios, durante un periodo que se inicia 7 días antes de la administración de los agentes quimioterapéuticos, durante por lo menos un periodo de tratamiento, y durante 21 días después de la última administración de los agentes quimioterapéuticos y 1000 jg de vitamina B12 por vía intramuscular 1 semana antes de la primera administración de los agentes quimioterapéuticos en un periodo de tratamiento.
Puede utilizarse cualquier procedimiento convencional para la administración de ONCOS-102 en un paciente que necesita del mismo. La vía de administración depende de la formulación o forma de la composición, la enfermedad, la localización de los tumores, el paciente, las comorbilidades y otros factores. En una forma de realización preferida de la invención, la administración se lleva a cabo mediante una inyección intratumoral, intramuscular, intraarterial, intrapleural, intravesicular, intracavitaria o peritoneal, o una administración oral. Preferentemente, la administración se lleva a cabo en forma de inyección intratumoral o inyección intraperitoneal.
La inyección puede personalizarse para cada paciente según la localización y tamaño de los tumores. Por ejemplo, el virus puede inyectarse (i.t.) en un volumen de entre 0,5 ml y 10 ml. La inyección puede llevarse a cabo en varios, preferentemente hasta cinco, sitios tumorales diferentes. El volumen de dosis intraperitoneal puede variar entre 200 ml y 800 ml. Preferentemente, el volumen administrado es de 500 ml.
La dosis eficaz de los vectores depende de por lo menos el sujeto que requiere de tratamiento, tipo de tumor, localización del tumor y estadio del tumor. La dosis puede variar, por ejemplo, entre aproximadamente 108 partículas víricas (PV) y aproximadamente 1014 PV, preferentemente entre aproximadamente 5x109 PV y aproximadamente 1013Pv , y más preferentemente, entre aproximadamente 8x109 PV y aproximadamente 1012 PV. En una forma de realización específica de la invención, la dosis se encuentra comprendida en el intervalo de entre aproximadamente 5x1010 y 5x1011 PV. De esta manera, la cantidad de adenovirus ONCOS-102 que debe administrarse puede encontrarse comprendida en el intervalo de entre 5x1010y 5x1011 PV. Preferentemente, ONCOS-102 se administra a una dosis de 3 x 1011 PV/5 ml. Por otra parte, expresado en unidades formadoras de placa, ONCOS-102 puede administrarse mediante inyección directa en el tumor de mesotelioma maligno de dicho paciente o por vía intraperitoneal a una dosis de entre aproximadamente 108y 1012 unidades formadoras de placa.
Un objetivo de la invención es adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del mesotelioma maligno humano, en el que el virus se administra en combinación con pemetrexed y cisplatino, o pemetrexed y carboplatino, en un paciente que lo necesita, y en el que la cantidad de virus es de entre 5 x 1010 y 5 x 1011 PV.
Otro objetivo de la invención es el adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del mesotelioma maligno humano, en el que el virus se administra en combinación con pemetrexed y cisplatino, o pemetrexed y carboplatino, en un paciente, y en el que el virus se administra en una cantidad de 3 * 1011 PV/5 ml.
Un aspecto adicional de la invención es el adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del mesotelioma maligno humano, en el que el virus se administra en combinación con pemetrexed y cisplatino, o pemetrexed y carboplatino, en un paciente, y en el que los agentes quimioterapéuticos y el virus se administran en cantidades eficaces.
Todavía otro objetivo de la invención es adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del mesotelioma maligno humano, en el que el virus se administra en combinación con pemetrexed y cisplatino, o pemetrexed y carboplatino, en un paciente que lo necesita, y en el que el virus se administra por vía intraperitioneal o mediante inyección directa en el tumor y se administran los dos agentes quimioterapéuticos por vía intravenosa o intraperitoneal.
Según un aspecto de la invención, el adenovirus ONCOS-102 es para la utilización en el tratamiento del mesotelioma maligno humano, en el que el virus se administra en combinación con pemetrexed y cisplatino, o pemetrexed y carboplatino, en un paciente que lo necesita, y en el que el virus se administra antes de la administración de los dos agentes quimioterapéuticos y también durante el periodo de administración de dichos agentes quimioterapéuticos.
Según otro aspecto de la invención, el adenovirus ONCOS-102 está destinado a la utilización en el tratamiento del mesotelioma maligno humano, en el que se administra pemetrexed y cisplatino, o pemetrexed y carboplatino, antes de administrar el virus y también durante el periodo de administración de dicho virus.
Según una forma de realización preferida, los agentes de la terapia de combinación pueden administrarse en primer lugar sensibilizando mediante la administración del virus en una a diez ocasiones durante un periodo de entre un mes y diez meses, seguido de la administración de los agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, una a cuatro semanas después de iniciar la administración del virus. La administración puede realizarse, por ejemplo, en el orden secuencial siguiente: la preactivación con el virus se lleva a cabo mediante la administración del virus en el sujeto que lo necesita en seis ocasiones durante un periodo de cuatro meses. Típicamente, en el inicio del periodo de tratamiento, el tiempo entre dosis es más corto que durante el transcurso del tratamiento. La administración de pemetrexed y cisplatino o de pemetrexed y carboplatino puede iniciarse tres semanas después de iniciar la administración del virus. La administración de agentes quimioterapéuticos puede continuarse de manera que la administración se lleve a cabo, por ejemplo, en un total de seis ocasiones en ciclos de aproximadamente tres semanas. Los tiempos de administración pueden variar entre una y seis veces.
El vector adenovírico oncolítico divulgado en la presente memoria induce oncólisis mediada por el virión de las células tumorales y activa la respuesta inmunitaria humana contra las células tumorales. En una forma de realización preferida, el procedimiento o utilización comprende además la administración de sustancias capaces de regular negativamente las células T reguladoras en un sujeto. La expresión "sustancias capaces de regular negativamente las células T reguladoras" se refiere a agentes que reducen la cantidad de células identificadas como células T supresoras o T reguladoras. Dichas células se han identificado como consistentes en uno o muchos de los marcadores inmunofenotípicos siguientes: CD4+, CD25+, FoxP3+, CD127- y GITR+. Dichos agentes que reducen las células T supresoras o T reguladoras pueden seleccionarse de entre un grupo que consiste en anticuerpos anti-CD25 o quimioterapéuticos.
Las funciones inmunomoduladoras del GM-CSF de transgén constituyen un mecanismo de acción crucial de los adenovirus oncolíticos armados y, además, el adenovirus mismo es un fuerte activador del sistema inmunitario y ello contribuye significativamente a la eficacia antitumoral global del virus.
La expresión "sensibilizador vírico" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un agente que puede mejorar la eficacia del virus oncolítico. Entre los agentes adecuados para dicha terapia de combinación o que pueden utilizarse como sensibilizadores víricos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, Ácido retinoico todo-trans, Azacitidina, Azatioprina, Bleomicina, Carboplatino, Capecitabina, Cisplatino, Clorambucilo, Ciclofosfamida, Citarabina, Daunorubicina, Docetaxel, Doxifluridina, Doxorubicina, Epirubicina, Epotilón, erlotinib, Etopósido, Fluorouracilo, Gemcitabina, Hidroxiurea, Idarubicina, Imatinib, Mecloretamina, Mercaptopurina, Metotrexato, Mitoxantrona, Oxaliplatino, Paclitaxel, Pemetrexed, Temozolomida, Tenipósido, Tioguanina, Valrubicina, Vinblastina, Vincristina, Vindesina y Vinorelbina. Preferentemente, el sensibilizador vírico que debe utilizarse es la ciclofosfamida.
También los inhibidores de punto de comprobación, tales como los anticuerpos anti-PD-1/PD-L1 o anti-CTLA4 (tales como pembrolizumab, nivolumab o ipilimumab) resultan adecuados para la utilización con la terapia de combinación.
La presente exposición se refiere a un procedimiento de tratamiento del mesotelioma maligno en un paciente que comprende una etapa de administración en dicho paciente de adenovirus ONCOS-102 y dos agentes quimioterapéuticos. El adenovirus ONCOS-102 y dos agentes quimioterapéuticos se administran en cantidades eficaces.
La presente exposición se refiere a un procedimiento de tratamiento del mesotelioma maligno en un paciente, que comprende una etapa de administración en dicho paciente de adenovirus ONCOS-102 y dos agentes quimioterapéuticos en cantidades y durante un tiempo suficiente para eliminar las células de mesotelioma maligno o para evitar el crecimiento de las células de mesotelioma maligno.
La exposición se refiere a un procedimiento de tratamiento del mesotelioma maligno en un paciente, que comprende una etapa de administración en dicho paciente de adenovirus ONCOS-102 y dos agentes quimioterapéuticos, en el que los agentes quimioterapéuticos son pemetrexed y cisplatino o pemetrexed y carboplatino.
La exposición se refiere a un procedimiento de tratamiento del mesotelioma maligno en un paciente, que comprende las etapas de administración en dicho paciente de adenovirus ONCOS-102 y dos agentes quimioterapéuticos, en el que dichos agentes quimioterapéuticos se administran en primer lugar antes de iniciar el periodo de administración del virus y también durante el periodo de administración del virus.
La exposición se refiere a un procedimiento de tratamiento del mesotelioma maligno en un paciente, que comprende las etapas de administrar en dicho paciente el adenovirus ONCOS-102 y dos agentes quimioterapéuticos, en el que dicho virus se administra en primer lugar antes de iniciarse el periodo de administración de los agentes quimioterapéuticos y el virus también se administra durante el periodo de administración de dichos agentes quimioterapéuticos.
La exposición se refiere a un procedimiento de tratamiento del mesotelioma maligno en un paciente, que comprende las etapas de administración en dicho paciente de adenovirus ONCOS-102 y dos agentes quimioterapéuticos, en el que el adenovirus ONCOS-102 se administra entre una y diez ocasiones y los agentes quimioterapéuticos se administran entre una y seis ocasiones en dicho paciente.
La exposición se refiere a un procedimiento de tratamiento del mesotelioma maligno en un paciente, que comprende las etapas de administrar en dicho paciente adenovirus ONCOS-102 y dos agentes quimioterapéuticos, en el que dicha administración de ONCOS-102 se lleva a cabo mediante inyección directa en el tumor de mesotelioma maligno de dicho paciente o en forma de inyección intraperitoneal a una dosis de entre 108 y 1012 unidades formadoras de placa.
La exposición se refiere a un procedimiento de tratamiento del mesotelioma maligno en un paciente, que comprende las etapas de administración en dicho paciente de adenovirus ONCOS-102 y dos agentes quimioterapéuticos, en el que la cantidad de adenovirus ONCOS-102 que debe administrarse se encuentra comprendida en el intervalo de entre 5x1010 y 5x1011 PV.
La exposición se refiere a un procedimiento de tratamiento del mesotelioma maligno en un paciente, que comprende las etapas de administrar en dicho paciente el adenovirus ONCOS-102 y dos agentes quimioterapéuticos, en el que dichos agentes quimioterapéuticos se administran a dosis de entre 250 mg/m2 y 500 mg/m2 de pemetrexed y de entre 30 mg/m2 y 75 mg/m2 de cisplatino, o a dosis de entre 250 mg/m2 y 500 mg/m2 de pemetrexed y de entre 200 mg/m2 y 400 mg/m2 de carboplatino.
La exposición se refiere a la utilización del adenovirus ONCOS-102 en el tratamiento del mesotelioma maligno humano, en el que el virus se administra en un paciente en combinación con dos agentes quimioterapéuticos.
La administración concurrente de ciclofosfamida (CPO) en el paciente puede llevarse a cabo durante el periodo de tiempo de la terapia de combinación. La ciclofosfamida es un agente quimicoterapéutico común, que también ha sido utilizada en algunos trastornos autoinmunes. La ciclofosfamida se ha demostrado que mejora la eficacia del virus oncolítico mediante varios mecanismos. Atenúa la respuesta antivírica innata, enlentece la generación de anticuerpos neutralizantes de virus antioncolítico, puede presentar como diana las T reg. y puede afectar a la vasculatura del tumor, potenciando la extravasación del virus oncolítico. Varios estudios preclínicos han demostrado que la ciclofosfamida puede retardar el lavado inmunitario de los virus oncolíticos, potenciando la persistencia de la infección vírica y prolongando la eficacia terapéutica. En la presente invención, la ciclofosfamida puede utilizarse como un sensibilizador vírico para potenciar la replicación vírica y los efectos de la estimulación inducida por GM-CSF de las células NK y T citotóxicas para una respuesta inmunitaria potenciada contra el tumor. Puede utilizarse en forma de dosis de bolo intravenoso o como administración metronómica oral de dosis baja. Entre otros sensibilizadores de virus adecuados que pueden utilizarse en formas de realización de la presente invención se incluyen la temozolomida y el erlotinib.
Para reducir las células T reguladoras, los pacientes recibirán CPO a dosis baja uno a tres días antes de cada inyección de ONCOS-102. Se administra CPO, por ejemplo, en forma de un bolo i.v. de 300 mg/m2. El bolo puede variar entre 100 y 600 mg/m2. La vía de administración de CPO también puede ser, por ejemplo, la administración oral. También puede utilizarse la quimioterapia metronómica.
También puede administrarse ácido fólico en el paciente antes de iniciar la terapia de combinación y también durante la terapia de combinación. La administración de ácido fólico puede iniciarse por lo menos cinco días antes de la administración de la primera dosis de agentes quimioterapéuticos de la terapia de combinación. Por ejemplo, la administración puede iniciarse entre 1 y 2 semanas antes de iniciar la administración de los agentes quimioterapéuticos de la terapia de combinación. El ácido fólico puede administrarse diariamente (administración oral, PO) y la administración puede continuarse también durante la terapia de combinación. La administración puede continuarse hasta aproximadamente tres semanas después de la última dosis de los agentes quimioterapéuticos. La dosis típica de ácido fólico es de 4 mg (PO). Un aspecto preferido de la invención es un procedimiento de tratamiento del mesotelioma en un paciente que lo necesita, que comprende las etapas de (a) administrar en dicho paciente adenovirus ONCOS-102 y dos agentes quimioterapéuticos y una etapa de administración de ácido fólico en el paciente. La cianocobalamina (vitamina B12) puede administrarse en el paciente antes de iniciar la terapia de combinación y también durante la terapia de combinación. La administración de cianocobalamina típicamente se inicia entre 1 y 2 semanas antes de iniciar la administración de los agentes quimioterapéuticos de la terapia de combinación. La cianocobalamina puede administrarse, por ejemplo, en forma de inyección intramuscular (i.m.) a intervalos de nueve semanas y también durante la terapia de combinación. La administración puede continuarse hasta aproximadamente tres semanas después de la última dosis de los agentes quimioterapéuticos. Cantidad típica de cianocobalamina es de 1000 mcg (|jg). Un aspecto preferente de la invención es un procedimiento de tratamiento del mesotelioma en un paciente que lo necesita, que comprende las etapas de (a) administrar en dicho paciente adenovirus ONCOS-102 y dos agentes quimioterapéuticos y una etapa de administración de cianocobalamina en el paciente.
El ácido fólico y la cianocobalamina generalmente se utilizan para reducir las toxicidades hemática y gastrointestinal relacionadas con el tratamiento. Dichos efectos secundarios pueden estar asociados, por ejemplo, a la administración de pemetrexed.
Además, la dexametasona puede administrarse en un paciente sometido a la terapia de combinación. Típicamente, la dexametasona se administra el día antes, el mismo día y el día después de la administración de los agentes quimioterapéuticos de la terapia de combinación. La dexametasona puede administrarse en forma de 4 mg BD (es decir, dos veces al día) durante 5 días y en una frecuencia de cada tres semanas durante hasta seis ciclos. Un objetivo de la invención es un procedimiento de tratamiento del mesotelioma en un paciente que lo necesita, que comprende las etapas de (a) administrar en dicho paciente adenovirus ONCOS-102 y dos agentes quimioterapéuticos y b) administrar dexametasona en el paciente.
La terapia de combinación tal como se indica en la presente memoria puede comprender además la administración de ciclofosfamida en el paciente. Un objetivo de la exposición es un procedimiento de tratamiento del mesotelioma en un paciente que lo necesita, que comprende una etapa de (a) administrar en dicho paciente adenovirus ONCOS-102 y dos agentes quimioterapéuticos y que comprende, además, antes de la etapa (a), la administración de ciclofosfamida en el paciente.
La exposición se refiere a un procedimiento para reducir el crecimiento tumoral en un paciente, en el que dicho procedimiento comprende la administración de adenovirus ONCOS-102 y dos agentes quimioterapéuticos en dicho paciente bajo condiciones en las que se reduce el crecimiento tumoral en dicho paciente.
El procedimiento puede comprender la identificación de que el paciente presenta un tumor antes de la administración de la terapia de combinación. El diagnóstico tumoral puede llevarse a cabo mediante cualquier procedimiento convencional. Puede identificarse que el paciente presenta el tumor, utilizando, por ejemplo, una técnica de obtención de imágenes diagnósticas. El procedimiento puede comprender además la medición de una reducción del crecimiento tumoral después de la administración de la terapia de combinación en el paciente. La reducción del tumor puede estudiarse mediante cualquier procedimiento convencional. La reducción del crecimiento tumoral puede medirse utilizando, por ejemplo, una técnica de obtención de imágenes diagnósticas.
La presente exposición se refiere a la utilización de terapia de combinación a fin de inhibir el crecimiento del tumor. Las señales de inhibición del crecimiento tumoral pueden ser, por ejemplo, una reducción del peso tumoral y una reducción del volumen tumoral. Además, la terapia de combinación puede utilizarse para inhibir la extensión del tumor.
Además, también debe señalarse que la pseudoprogresión tumoral que corresponde a un incremento del tamaño de la lesión relacionado con el tratamiento, puede afectar al resultado del seguimiento de las imágenes destinado a revelar el efecto de la terapia de combinación actual sobre el tamaño tumoral. Dicho tipo de efecto se ha observado después de la quimioterapia y radioterapia combinadas, en aproximadamente 30% de los pacientes. De esta manera, la pseudoprogresión puede encontrarse presente en determinadas partes de los pacientes al utilizar la terapia de combinación tal como se indica en la presente memoria. Para estos pacientes, la reducción del tamaño tumoral no es un indicador adecuado de la eficacia de la terapia.
La exposición se refiere a un procedimiento de reducción del crecimiento de las células de cáncer, que comprende administrar en el sujeto que requiere de tratamiento una cantidad eficaz de adenovirus ONCOS-102 y dos agentes quimioterapéuticos.
La exposición se refiere a un procedimiento de inhibición o eliminación de tumores o células de cáncer en un paciente humano, que consiste en tratar el paciente con adenovirus ONCOS-102 y dos agentes quimioterapéuticos, en el que los agentes quimioterapéuticos son pemetrexed y cisplatino o pemetrexed y carboplatino.
Además, la exposición se refiere a un procedimiento de eliminación de tumores o células de cáncer, que comprende poner en contacto el tumor o células de cáncer con adenovirus ONCOS-102 y dos agentes quimioterapéuticos, en el que los agentes quimioterapéuticos son pemetrexed y cisplatino o pemetrexed y carboplatino.
Además, la exposición se refiere además a un procedimiento para el tratamiento del mesotelioma maligno, que comprende administrar en el sujeto que lo necesita, una cantidad eficaz de adenovirus ONCOS-102 y cantidades eficaces de dos agentes quimioterapéuticos para proporcionar una terapia de combinación que presente un efecto terapéutico potenciado en comparación con el efecto del adenovirus ONCOS-102 administrado solo o de los dos agentes quimioterapéuticos administrados juntos sin dicho virus.
En una forma de realización de la invención, ONCOS-102 actúa como una vacuna in situ del cáncer. Tal como se utiliza en la presente memoria, "vacuna in situ del cáncer" se refiere a una vacuna del cáncer, que tanto elimina células tumorales como también incrementa la respuesta inmunitaria contra las células tumorales. La replicación vírica es una fuerte señal de peligro al sistema inmunitario (=necesario para una respuesta de tipo TH1) y, de esta manera, actúa como un potente fenómeno coestimulador de la maduración mediada por GM-CSF y la activación de las CPA, y el reclutamiento de las células NK. La lisis de las células tumorales también ayuda a presentar fragmentos tumorales y epítopos a la sCPA y, además, se produce coestimulación mediante inflamación. De esta manera, se produce una respuesta independiente de los epítopos (es decir, no restringida a HLA) en el contexto de cada tumor y, por lo tanto, tiene lugar in situ. La respuesta inmunitaria específica tumoral resulta activada en el ambiente tumoral al liberarse antígenos tumorales específicos a partir de las células moribundas con la lisis de las células tumorales.
En una forma de realización preferida de la exposición, el procedimiento o utilización comprende además la administración de radioterapia concurrente en el sujeto.
En una forma de realización preferida de la exposición, el procedimiento o utilización comprende además la administración de agentes inductores de autofagia en el sujeto. La autofagia se refiere a un proceso catabólico que implica la degradación de los componentes de la propia célula mediante la maquinaria lisosómica. La expresión "agentes inductores de autofagia" se refiere a agentes capaces de inducir la autofagia y pueden seleccionarse de entre un grupo que consiste en, aunque sin limitación, inhibidores de mTOR, inhibidores de PI3K, litio, tamoxifeno, cloroquina, bafilomicina, temsirolimus, sirolimus y temozolomida. En una forma de realización específica de la invención, el procedimiento comprende además la administración de temozolomida en un sujeto. La temozolomida puede ser temozolomida oral o intravenosa.
Un objetivo de la presente exposición era desarrollar un nuevo uso terapéuticamente eficaz del adenovirus oncolítico ONCOS-102 y agentes quimioterapéuticos con propiedades de seguridad mejoradas y con un efecto mejorado sobre el cáncer en comparación con la utilización de terapia vírica sola o quimioterapia sola.
Los resultados de los experimentos actuales mostraron que ONCOS-102 como monoterapia eliminó las líneas celulares de mesotelioma humano in vitro y mostró cierta actividad antitumoral en el modelo de xenoinjerto de mesotelioma pleural maligno H226 refractario al tratamiento. Por el contrario, los regímenes de quimioterapia del estándar de cuidado (EdC) actual para el mesotelioma maligno (pemetrexed cisplatino o pemetrexed carboplatino) no mostraron eficacia antitumoral en dicho modelo de xenoinjerto de mesotelioma. Sin embargo, inesperadamente se observó un efecto antitumoral sinérgico al combinar ONCOS-102 con regímenes de quimioterapia EdC. Dichos datos proporcionan un argumento fuerte para combinar ONCOS-102 con la quimioterapia EdC en el tratamiento del mesotelioma maligno.
La quimioterapia, al administrarla con ONCOS-102, incrementó la expresión del marcador ICD en el modelo de xenoinjerto actual. Anteriormente se ha mostrado que ONCOS-102 produce GM-CSF humano funcional en hámsteres, induciendo inmunidad específica tumoral que indica que GMCSF podría participan en el reclutamiento y activación de células dendríticas (CD) también en el modelo de xenoinjerto actual, conduciendo a la estimulación de las células T y finalmente al desarrollo de inmunidad antitumoral. En el modelo de cáncer de mesotelioma humano descrito en detalle en los ejemplos, la función del GM-CSF se perdió debido al sistema inmunitario murino inmunodeficiente. Sin embargo, ya se ha demostrado la utilidad de GM-CSF en la modulación del sistema inmunitario contra el mesotelioma en estudios clínicos (Ranki et al., 2014).
Los datos clínicos anteriores han demostrado que ONCOS-102 puede preactivar una respuesta inmunitaria específica tumoral, es decir, inducir células T CD8+ específicas de tumor citotóxicas, en un paciente de mesotelioma pleural maligno refractario a la quimioterapia (Ranki et al., 2014). Sin embargo, en dicho modelo animal de inmunodeficiencia actual, la preactivación con ONCOS-102 antes del inicio de la quimioterapia no mostró ningún beneficio adicional. Lo anterior no resulta inesperado, ya que el sistema inmunitario desempeña una función mínima en el modelo de ratón de inmunodeficiencia.
Los datos actuales sugieren fuertemente que ONCOS-102 en combinación con la quimioterapia de primera línea puede utilizarse como un tratamiento eficiente contra el MM. Debido a su perfil de seguridad, ONCOS-102 se replicaba solo localmente en tumores y mostraba un tropismo elevado hacia las células de mesotelioma. No se informó de efectos secundarios importantes durante el estudio animal. El tratamiento combinado mostró un efecto sinérgico y fue la terapia más eficaz contra el mesotelioma y, de esta manera, también resultó más eficaz que la quimioterapia de primera línea estándar. Además, la combinación de ONCOS-102 con quimioterapia es una herramienta potente para superar el obstáculo importante del microambiente inmunosupresor en el microambiente del tumor debido a la inducción potenciada de la muerte inmunogénica de células tumorales y finalmente la inducción de respuestas inmunitarias anticáncer. Los inventores han mostrado que el tratamiento combinado conduce a un incremento de ICD, lo que sugiere una actividad potenciada de la muerte inmunogénica de las células tumorales. Además, el tratamiento de combinación mejoró la infectividad de ONCOS-102 en las células de mesotelioma, se perdió la función de GM-CSF en dicho modelo animal, aunque es conocido a partir de estudios anteriores que dicha citoquina desempeña una función importante mediante el reclutamiento directo de las APC y las células asesinas naturales, así como por la activación y maduración de las APC en el sitio tumoral.
Aparte de permitir el transporte del vector hasta el sitio de interés, el vector adenovírico de la invención también garantiza la expresión y persistencia del transgén. Además, se minimiza la respuesta inmune contra el vector, así como el transgén.
La presente invención resuelve los problemas relacionados con la resistencia terapéutica a los tratamientos convencionales. Además, la presente invención proporciona herramientas para tratamientos selectivos, con menor toxicidad y daños en los tejidos sanos. Entre las ventajas de la presente invención se incluyen también efectos secundarios diferentes y menores comparado con otros terapéuticos. Resulta importante que el enfoque es sinérgico con muchas otras formas de terapia, incluyendo la terapia de radiación y, por lo tanto, resulta adecuado para la utilización en regímenes de combinación.
La presente invención consigue la terapia del cáncer, en la que las células tumorales son destruidas por la oncólisis causada por viriones. Además, se reúnen diversos mecanismos diferentes que activan la respuesta inmunitaria humana, entre ellos la activación de las células asesinas naturales (NK) y las células dendríticas (CD) para la utilización terapéutica en la presente invención.
De esta manera, la presente solicitud describe estrategias y proporciona procedimientos y medios para reclutar eficazmente el sistema inmunitario del huésped contra células malignas y proporciona simultáneamente una actividad oncolítica y quimioterapéutica directa en células malignas, manteniendo simultáneamente unas excelentes características de seguridad.
Los aspectos de la exposición se refieren a nuevos procedimientos y medios para conseguir una transferencia génica eficiente y precisa, así como una especificidad incrementada y suficiente capacidad de eliminación tumoral en la terapia del cáncer.
La eficacia inesperada de la terapia inventiva con adenovirus oncolítico combinado con la utilización de agentes quimioterapéuticos proporciona una mejora significativa de la eficacia terapéutica tal como demuestran los estudios in vivo en comparación los regímenes actuales de quimioterapia del estándar de cuidado (EdC) para el mesotelioma maligno (pemetrexed cisplatino o pemetrexed carboplatino).
En resumen, los datos presentados proporcionan un argumento fuerte para combinar ONCOS-102 con la quimioterapia de primera línea para el tratamiento del mesotelioma maligno.
Ejemplos
Los ejemplos a continuación se proporcionan únicamente con el propósito de ilustrar diversas formas de realización de la invención y no pretenden ser limitativos de la presente invención.
Construcción de ONCOS-102
La construcción y caracterización de adenovirus oncolítico quimérico codificante de GM-CSF humano (ONCOS-102) ha sido descrita anteriormente (documento n° WO 2010/072900 y Koski et al.). Brevemente, se generó Ad5/3-D24-GMCSF y se amplificó utilizando técnicas estándar de preparación de adenovirus. Se creó un plásmido derivado de pAdEasy-1 que contenía una fibra quimérica 5/3, pAdEasy5/3, mediante recombinación homóloga en Escherichia coli de genoma vírico Ad5/3luc1 y se digirió con BstXI un fragmento de 8.9 kb de pAdEasy-1. A continuación, un vector lanzadera que contenía una deleción de 24 pb en E'M(pShuttleD24) se linearizó con Pmel y se recombinó con pAdEasy5/3, resultando en pAd5/3-D24. Con el fin de insertar el gen de GMCSF humano en la región E3, se creó un vector de clonación de E3, pTHSN, mediante la inserción del fragmento Spel a Ndel del genoma Ad5 en el sitio de multiclonación de pGEM5Zf* (Promega, Madison, WI). Se digirió adicionalmente pTHSN con Sunl/Munl, creando una deleción de 965 pb en la región E3 (6.7K y gp19K delecionados). El ADN complementario de 432 pb codificante de GM-CSF humano (Invitrogen, Carlsbad, CA) se amplificó con cebadores que presentaban sitios de restricción específicos Sunl/MunI flanqueantes del gen y después se insertó en pTHSN digerido con Sunl/Munl. Se generó pAd5-D24-GMCSF mediante recombinación homóloga en E. coli entre pTHSN-GMCSF linearizado con Fspl y pAd5/3-D24 linarizado con Srfl. El genoma vírico Ad5/3-D24-GMCSF se liberó mediante digestión con Pacl y transfección en células A549 para la amplificación y rescate. Todas las etapas de la clonación se confirmaron mediante PCR y múltiples digestiones de restricción. Se secuenció el plásmido lanzadera pTHSN-GM-CSF. La ausencia de E1 de tipo salvaje se confirmó mediante PCR. La región E1, transgén y la fibra se comprobaron en el virus final mediante secuenciación y PCR. Se llevó a cabo la producción del virus según los principios de GMPc en Oncos Therapeutics (Helsinki, Finlandia) en células A549 para evitar el riesgo de recombinación de tipo salvaje. La formulación de tampón para la solución concentrada de virus era base Trizma 10 mmoles/l, NaCl 75 mmoles/l, sacarosa al 5% (p/v), MgCl 1 mmol/l, L(+)histidina 10 mmoles/l, EtOH al 0.5% (v/v), Tween al 0.02%, EDTA 100 pmoles/l; como diluyente se utilizó solución de NaCl al 0.9% (p/v) (B. Braun, Melsungen, Alemania). Se produjo ONCOS-102 en Biovian (Turku, Finlandia) en GLP y se almacenó a -80°C hasta la utilización. Para la utilización, se descongeló ONCOS-102 poco antes de la aplicación y se almacenó sobre hielo hasta su utilización. Tras descongelar, se diluyó ONCOS-102 en una campana de flujo laminar a fin de obtener la concentración requerida; se prepararon jeringas de inyección y se almacenaron sobre hielo hasta la utilización.
Líneas celulares
La línea celular de mesotelioma epitelioide humano JL-1 (ACC 596, obtenida de DSMZ) se cultivó en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, 10567-014, Gibco) complementado con suero de feto bovino inactivado por calor al 20% (FBS, 16000-044, Gibco), L-glutamina 2 mM, penicilina y estreptomicina al 1% (15140-122, Gibco). Se cultivó el mesotelioma bifásico maligno humano MSTO-211H (ACC 390, adquirido de DSMZ) y el mesotelioma epitelial humano NCI-H226 (H226, CRL-5826, adquirido de ATCC) en RPMI 1640 (A10491-01, Gibco) complementado con FBS inactivado por calor al 10% (16000-044, Gibco), L-glutamina 2 mM, penicilina y estreptomicina al 1% (15140-122, Gibco). Todas las líneas celulares fueron incubadas a 37°C con 5% de CO2.
Agentes quimioterapéuticos
Se adquirió pemetrexed disódico (sc-219564), cisplatino (cs-200896) y carboplatino (sc-202093) de Santa Cruz Biotechnology y se reconstituyeron en agua estéril antes de la utilización.
Se suspendieron 10 mg de pemetrexed (pem) en 1 ml de agua estéril para obtener una solución 10 mg/ml. Dicha solución se utilizó como solución madre y se almacenó a temperatura ambiente. La sustancia se sometió a agitación durante 1 minuto y hasta 5 minutos tras la adición de la solución para obtener una solución homogénea. La solución madre se diluyó adicionalmente en NaCl al 0,9% y se utilizaron 10 mg/kg/ratón en 100 pl.
Se suspendieron 150 mg de cisplatino (cis) en 150 ml de agua estéril para obtener una solución 1 mg/ml. Dicha solución se utilizó como solución madre y se almacenó a temperatura ambiente. La sustancia se sometió a agitación durante 1 minuto y hasta 5 minutos tras la adición de la solución para obtener una solución homogénea. La solución madre se diluyó adicionalmente en NaCl al 0,9% y se utilizaron 1,5 mg/kg/ratón en 100 pl.
Se suspendieron 25 mg de carboplatino (car) en 10 ml de NaCl al 0,9% para obtener una solución 2.5 mg/ml. Dicha solución se utilizó como solución madre y se almacenó a temperatura ambiente. La sustancia se sometió a agitación durante 1 minuto y hasta 5 minutos tras la adición de la solución para obtener una solución homogénea. La solución madre se diluyó adicionalmente y se utilizaron 8 mg/kg/ratón en 100 pl.
Viabilidad celular: ensayo in vitro de eliminación de células tumorales
Las células de mesotelioma se sembraron a razón de 1,0 x 104 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Tras la incubación durante la noche, las células se infectaron con ONCOS-102 en una proporción de partículas víricas/células de 10 (PV/célula). El virus y los agentes quimioterapéuticos se diluyeron en medio que contenía FBS al 5%. Se sometieron a ensayo pemetrexed, cisplatino y carboplatino a las siguientes concentraciones subóptimas previamente seleccionadas: 0.625 mg/ml, 0.0026 mg/ml, 0.0625 mg/ml (células H226); 0.625 mg/ml, 0.0006 mg/ml, 0.00196 mg/ml (células JI-1); 0.083 mg/ml, 0.0026 mg/ml, 0.0625 mg/ml (células MSTO-211H), respectivamente. Se evaluaron ocho combinaciones de tratamiento diferentes: ONCOS-102 solo, pemetrexed cisplatino, pemetrexed carboplatino, ONCOS-102 pemetrexed cisplatino, ONCOS-102 pemetrexed carboplatino, ONCOS-102 pemetrexed cisplatino (preactivación: virus administrado en primer lugar, quimioterapia añadida 24 horas después de la infección), ONCOS-102 pemetrexed carboplatino (preactivación: virus administrado en primer lugar, quimioterapia añadida 24 horas después de la infección) y control (solo medio de cultivo). Se determinó la viabilidad celular 3 días después con MTS siguiendo las instrucciones del fabricante (G3582, Promega).
Análisis de las células apoptóticas y necróticas in vitro
Las células de mesotelioma se sembraron en placas de 6 pocillos a razón de 5*105 células/pocillo. Las células se infectaron con 10 PV/célula de ONCOS-102 complementado con quimioterapéuticos según el esquema de tratamiento indicado anteriormente. Se midió la cantidad de células apoptóticas y necróticas 48 horas después con un kit TACS de anexina V-FITC mediante citometría de flujo (4830-01-K, Trevigen Inc.) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Inmunogenicidad de muerte in vitro de células tumorales
Exposición a CRT. Las líneas celulares se sembraron por duplicado en placas de 6 pocillos a razón de 5*105 células/pocillo. Las células se infectaron con 10 PV/célula de ONCOS-102 y/o con agentes quimioterapéuticos según las combinaciones de tratamiento presentadas anteriormente. Se recolectaron células 24 (H226, Jl-1) y 48 (MSTO-211H) horas después y se tiñeron con anticuerpo policlonal anti-calreticulina de conejo diluida 1:1000 (ab2907, Abcam) durante 40 min a 4°C y posteriormente con anticuerpo secundario Alexa-Fluor 488 diluido 1:100 (A21206, Invitrogen) y se analizaron mediante citometría de flujo.
Liberación de HMGB-1. Las líneas celulares se sembraron por triplicado en placas de cultivo celular y se infectaron con 10 PV/célula de ONCOS-102 y/o con agentes quimioterapéuticos según las combinaciones de tratamiento presentadas anteriormente. 72 horas después, se recolectaron los sobrenadantes y se midió HMGB-1 con un kit ELISA siguiendo las instrucciones del fabricante (ST51011, IBL International).
Liberación de ATP. Las líneas celulares se sembraron por triplicado sobre placas de cultivo celular y se trataron tal como se ha indicado anteriormente. Se recogieron los sobrenadantes tras 48 (JI-1, MSTO-211H) y 72 (H226) horas y se analizaron con el kit de determinación de ATP siguiendo el protocolo del fabricante (A22066, Invitrogen) para el análisis luminométrico.
Infectividad vírica in vitro: ensayo inmunocitoquímico (ICQ)
Se sembraron líneas celulares de mesotelioma en 5 réplicas, en placas de 24 pocillos a razón de 6x105 células/pocillo y se trataron con ocho combinaciones de tratamiento diferentes indicadas anteriormente. 24 horas después, se aspiró el sobrenadante y las células se fijaron mediante incubación con metanol helado durante 15 minutos (322415-100ML, Sigma-Aldrich). La determinación de la infectividad de ONCOS-102 se basó en la cuantificación visual de la proteína vírica hexón en las células infectadas. Brevemente, las células se tiñeron con anticuerpo de ratón anti-hexón diluido 1:2000 (NB600-413, Novus Biologicals) durante 1 hora a TA en la oscuridad y posteriormente con anticuerpo secundario conjugado con biotina-SP diluido 1:500 (115-065-062, Jackson Immuno Research) durante 1 hora a TA en la oscuridad. Posteriormente, se añadió extravidina-peroxidasa en una proporción de 1:200 y se incubó durante 30 minutos a TA en la oscuridad (E2886-1ML, Sigma-Aldrich). Finalmente, las células infectadas se visualizaron mediante la adición de la tinción: DAB durante hasta 5 minutos (D3939-1SET, Sigma-Aldrich). Para cada 5 réplicas (pocillos), se adquirieron 5 imágenes de campos no solapados, utilizando un microscopio AMG EVO XL. Los datos de infectividad se presentan como número medio de manchas en 5 pocillos.
Expresión de CAR, CD46 y DSG2 en líneas celulares de mesotelioma
Los adenovirus humanos infectan las células tras la unión al virus Coxsackie B y al receptor Ad (CAR), CD46 o desmogleína 2 (DSG-2). Las células de mesotelioma se marcaron con anticuerpo monoclonal anti-CAR de ratón (1 jg /1*106 células), (sc-56892 FITC, Santa Cruz Biotech) durante 40 min a 4°C, o con anticuerpo monoclonal anti-CD46 de ratón (1 jg /1*106 células) (ab789, Abcam) o anticuerpo monoclonal anti-DSG2 de ratón (1 jg /1*106 células) (ab14415, Abcam) durante 40 min a 4°C y posteriormente con anticuerpo secundario Alexa-Fluor 488 diluido 1:2000 (a21206, Abcam) para las mediciones de citometría de flujo.
Justificación del nivel de dosis y vía de administración
Las funciones inmunomoduladoras del transgén de GM-CSF son un mecanismo de acción crucial de ONCOS-102. Además, el propio adenovirus es un activador fuerte del sistema inmunitario innato. Los ratones BALB/c desnudos son inmunodeficientes y, de esta manera, solo puede estudiarse la función oncolítica vírica dependiente de la replicación y, de esta manera, se pierde un mecanismo de acción importante (efectos de tipo inmunitario). Se seleccionó la dosis 5Ex7 PV/tumor i.t. (1E+8 PV/ratón) basándose en los resultados de dos estudios piloto en que se sometieron a ensayo dosis de 2E+8/ratón y 1E+8/ratón (figura 5 y 6). Se seleccionó una dosis vírica subóptima (=no curativa) para permitir la evaluación de los efectos combinatoriales potencialmente aditivos/sinérgicos de ONCOS-102 y la quimioterapia. La vía de inyección se seleccionó basándose en la vía utilizada en los ensayos clínicos, es decir, la vía intratumoral.
Se seleccionó la dosis y vía de administración de los quimioterapéuticos basándose en la viabilidad técnica.
Selección de animales, aleatorización, asignación de grupos, alojamiento, dieta y agua y aclimatación
Los animales se separaron aleatoriamente en grupos. Los grupos de animales se mantuvieron en jaulas separadas con tarjetas de estudio en las jaulas. Las tarjetas se marcaron con el número de estudio, grupo de tratamiento, ID de animal individual, así como su origen y fecha de llegada. Los animales individuales en cada jaula se marcaron con perforación del oído para la identificación. Solo se manipuló una jaula cada vez a fin de evitar mezclar los animales de diferentes jaulas.
Los animales se alojaron en una instalación de nivel de bioseguridad 2 (BSL2) en un ambiente de humedad y temperatura monitorizadas. Los animales se alojaron en jaulas de plástico ventiladas individualmente con una tapa de filtro (GreenLine, Scanbur).
Los animales se alimentaron con dieta granulada estándar suministrada ad libitum. Se suministró agua ad libitum durante los periodos de aclimatación y estudio.
Los animales se aclimataron durante 7 días antes de iniciar la parte experimental. Todos los animales se mantuvieron con buena salud durante todo el periodo de aclimatación.
Observaciones clínicas
Todos los animales fueron observados para signos clínicos, morbilidad o mortalidad diariamente durante la aclimatación y el periodo de administración y además durante 60 min después de cada tratamiento. Durante el curso del experimento, se eliminaron los ratones debido a que las dimensiones tumorales alcanzaron el máximo permitido (1.5 cm en cualquier diámetro). Se realizó un seguimiento diario de la salud de los animales y no se observó ninguna indicación de malestar debido a los tumores. Los ratones fueron sacrificados con dióxido de carbono el día 63, que era el punto final del experimento. Además, se llevó a cabo una dislocación cervical.
Se realizó un seguimiento del peso de los animales durante todo el experimento y se observó una pérdida menor del peso en los grupos siguientes: pem+cis (10% de reducción el día 48, 11% el día 60), preactivación con ONCOS-102 pem cis (9% de reducción el día 48, 12% el día 60) (figura 5B), pem+car (6% el día 60) (figura 6B). Se sacrificaron pocos animales por problemas de salud (>30% de pérdida de peso corporal y problemas en la piel (=erupciones) en los grupos tratados con ONCOS-102 solo o en combinación con pemetrexed y cisplatino (único caso). Dichos sucesos adversos probablemente no están relacionados con el tratamiento, ya que también dos animales bajo tratamiento simulado sufrieron problemas en la piel (erupción). El veterinario fue notificado de estos problemas para una investigación adicional; sin embargo, la causa de dichos sucesos sigue sin estar clara. Además, la necropsia mostró algunos cambios en la morfología de los intestinos (yeyuno e íleon) y del estómago en unos cuantos animales (pem+cis, pem+car).
Análisis de la progresión del tamaño tumoral
Se midieron los tamaños tumorales y se registraron a partir del día 8 posterior a las inyecciones celulares. El primer día de tratamiento y el primer día de medición del tamaño tumoral se indican como día 0 en la figura 4A. Los tumores se midieron cada tres días.
Se registró el diámetro más largo y el más corto y se calculó el volumen tumoral utilizando la fórmula 0,52 x longitud x (anchura)2. La progresión del tamaño tumoral se indica como porcentaje del primer punto de medición el día 0 que se fijó arbitrariamente en 100%.
Compilación de datos y análisis estadísticos
Se midió el peso corporal cada 3 días durante todo el experimento. Se calculó para cada animal el porcentaje de cambio del peso corporal respecto a la línea base.
Volúmenes tumorales (Tabla 2): el volumen tumoral absoluto era el punto final en el análisis del volumen tumoral. Lo anterior se evaluó por separado los días 21 y 48. Se aplicó análisis de la varianza para mediciones repetidas como procedimiento de análisis para los volúmenes tumorales, ya que se midieron dos tumores en cada ratón. El modelo contenía el efecto de grupo y el valor de línea base como variables como efectos fijos. Las comparaciones por pares entre grupos se ajustaron con el procedimiento de Tukey. El cálculo de las sinergias se llevó a cabo mediante la utilización del procedimiento de VTF (volumen tumoral fraccionario).
Justificación de la selección de puntos temporales: el día 21 fue el último día en que todos los animales estaban todavía vivos y el día 48 no había muerto más de un animal en cada grupo.
Modelo de xenoinjerto de mesotelioma humano
La experimentación con animales fue autorizada por el Comité de experimentos con animales de la Universidad de Helsinki y el Gobierno provincial de Finlandia meridional. Se obtuvieron ratones de entre 6 y 8 semanas de edad de Scanbur (Karlslunde, Dinamarca) y se pusieron en cuarentena durante 1 semana antes de iniciar el experimento. Los ratones fueron anestesiados con isoflurano Forane (Baxter); se inyectaron células NCI-H226 en 50 |jl en ambos flancos (6E+06/flanco). Los tumores se dejaron crecer durante 8 días antes de los tratamientos. Los virus se administraron cada 6 días. Un grupo recibió solo ONCOS-102; dos grupos recibieron ONCOS-102 y quimioterapia (pemetrexed+cisplatino o pemetrexed+carboplatino) cada seis días, mientras que los dos otros grupos recibieron preactivación con ONCOS-102 seguido de tratamiento combinatorial de quimioterapia (pemetrexed+cisplatino o pemetrexed+carboplatino) y ONCOS-102 en ciclos de 3 días por turnos. Los animales de control se trataron con solución salina al 0.9%. Se diluyó ONCOS-102 en solución salina al 0.9% y se inyectó por vía intratumoral a una dosis de 5x107 PV en cada tumor (dos tumores en cada animal). Las inyecciones se proporcionaron en un patrón de tipo abanico para garantizar una distribución uniforme en todo el tumor. Se diluyó pemetrexed, cisplatino y carboplatino en NaCl al 0,9% y se administraron por vía intraperitoneal a dosis de 10mg/kg, 1.5 mg/kg y 8 mg/kg, respectivamente. El volumen de inyección era de 100 pl por cada agente quimioterapéutico.
Se midió el tamaño tumoral con un calibrador en dos dimensiones cada 3 días, partiendo del primer día de tratamiento. Se registró el diámetro más largo y el más corto y se calculó el volumen tumoral utilizando la fórmula 0,52 x longitud x (anchura)2. La progresión del tamaño tumoral se indica como porcentaje del primer punto de medición el día 0 que se fijó arbitrariamente en 100% (figura 4A). Todos los animales fueron observados para signos clínicos, morbilidad o mortalidad diariamente durante la aclimatación y el periodo de administración y además durante 30 min después de cada tratamiento. Durante el curso del experimento, se eliminaron los ratones debido a que las dimensiones tumorales alcanzaron el diámetro máximo permitido (1.5 cm).
ELISA de GM-CSF humano
Se extrajeron las proteínas totales de muestras de tejido recolectadas de ratones BALB/c desnudos (tumores e hígados) utilizando el reactivo I de extracción de tejidos (FNN0071, Invitrogen) complementado con cóctel inhibidor de proteasas (P-2714, Sigma-Aldrich) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las extracciones de proteínas y el suero previamente recogido se analizaron para la concentración de GM-CSF humano utilizando un ELISA (ab100529, Abcam) siguiendo las instrucciones del fabricante.
PCR en tiempo real cuantitativa
Se llevó a cabo una qPCR para el número de copia de E4 adenovírico siguiendo el protocolo anteriormente descrito (cebador directo: 5'-Gg A Gt G CGC CGA GAC AAC-3', cebador inverso: 5'-ACT Ac G TCC GGC GTT CCA T-3', sonda E4: 5'-(6FAM)-TGG CAT GAC ACT ACG ACC AAC ACG ATC T-(TAMRA)-3') (Koski et al., 2010). Se extrajo el ADN total de muestras murinas de BALB/c desnudos (tumores, hígados y sangre) utilizando el minikit de ADN sanguíneo QIAamp (51106, Qiagen) siguiendo el protocolo del fabricante. Seguidamente, se analizó el ADN aislado para el número de copia de E4 adenovírico, que se normalizó respecto a la beta-actina murina (hígado y sangre) y la beta-actina humana (tumores), respectivamente (cebador directo: 5'-CGA GCG GTT CCG ATG C-3', cebador inverso: 5'-TGG ATG CCA CAG Ga T TCC AT-3', sonda de beta-actina murina: 5'-(6FAM)-AGG CTC TTT TCC AGC CTT CCT TCT TGG-(TAMRA)-3'; (cebador directo: 5'-CAG CAG ATG TGG ATC AGC AAG-3', cebador inverso: 5-CTAGAA GCA TTT Gc G GTG g Ac -3', sonda de beta-actina humana: 5'-(6FAM)-AGG AGT ATG ACG CCG GCC CCT C-(TAMRA)-3'). Las muestras se analizaron utilizando un aparato de qPCR LighCycler (LighCycler 480, Roche).
Análisis estadístico
Se analizó la significancia estadística utilizando un ANOVA unidireccional con pruebas de comparaciones múltiples de Tukey y prueba no paramétrica de Mann-Whitney. Las curvas de supervivencia y los análisis estadísticos se llevaron a cabo utilizando una prueba de Kaplan-Meier. Todos los análisis estadísticos, cálculos y pruebas se llevaron a cabo utilizando GraphPad Prism 5 (software GraphPad, San Diego, EE.UU.). Los resultados se presentan como medias±SEM. Todos los valores de p son de dos colas o de una cola y se consideraron estadísticamente significativos con < 0.05.
Ejemplo 1. Actividad antineoplásica mejorada in vitro de ONCOS-102 combinado con quimioterapia de primera línea contra mesotelioma
Se sometió a ensayo la potencia oncolítica de ONCOS-102 en tres líneas celulares de mesotelioma in vitro (figura 1A). Las células JL-1 (mesotelioma epitelioide), MSTO-211H (bifásico maligno) y H226 (morfología epitelial) aparentemente eran relativamente resistentes a la oncólisis, ya que 10 PV/célula (dosis subóptima) eliminó 18%, 24% y 11% de las células, respectivamente, en 3 días. Las líneas celulares JL-1 y H226 eran más resistentes a la citotoxicidad mediada por quimioterapia que las células MSTO-211H (pemetrexed cisplatino o pemetrexed carboplatino). La incubación con quimioterapéuticos solo eliminó 10% de las células JL-1 y 11% a 12% de las células H226 en 3 días. En contraste, 63% y 73% de las células MSTO-211H fueron eliminadas llegado el día 3 en cocultivo con pemetrexed cisplatino y pemetrexed carboplatino, respectivamente. En comparación con los resultados observados en el tratamiento único (virus o quimioterapia), la combinación de ONCOS-102 con quimioterapéuticos incrementó significativamente la citotoxicidad en las células H226 y JL-1. Sin embargo, no se observó citotoxicidad en las células MSTO-211H al combinar la quimioterapia con ONCOS-102. En general, las células H226 y JL-1 eran más resistentes tanto a la oncólisis (ONCOS-102 solo) como al efecto citotóxico de los quimioterapéuticos que las células MSTO-211H, que eran particularmente sensibles a la quimioterapia.
En línea con los resultados de viabilidad celular, el número de células H226 y JL-1 apoptóticas era generalmente bajo en todos los grupos de tratamiento, aunque el tratamiento de combinación incrementó ligeramente el número de células apoptóticas en comparación con las monoterapias. En contraste con las células H226 y JL-1, el número de células MSTO-211H apoptóticas era significativamente superior en las células tratadas con solo quimioterapia y con quimioterapia+ONCOS-102 (figura 1B).
Ejemplo 2. La combinación de ONCOS-102 y quimioterapia potencia la muerte celular inmunogénica y la replicación vírica en líneas celulares de mesotelioma
Se midieron marcadores de muerte celular inmunogénica, tales como la exposición de calreticulina A en la superficie celular y la liberación extracelular de ATP y HMGB1 a partir de cultivos celulares de mesotelioma tras la exposición a ONCOS-102, agentes quimioterapéuticos o la combinación de ambos (figura 2). La muerte celular tumoral más inmunogénica en mesotelioma JI-1 y H226 se indujo mediante el tratamiento con ONCOS-102 quimioterapia, ya que la cantidad más alta de exposición a CRT y de liberación extracelular de HMGB1 y ATP se midió en dichos grupos. A su vez, la aplicación simultánea de ONCOS-102 y quimioterapia resultó tan inmunogénica como la quimioterapia sola en las células MSTO-211H, lo que concuerda con las observaciones de los ensayos de viabilidad celular y confirma la elevada sensibilidad de estas células a la quimioterapia.
También se evaluó el impacto de la quimioterapia sobre la replicación in vitro de ONCOS-102. Las células H226 y JI-1 infectadas por ONCOS-102 y pretratadas (preactivadas) con agentes quimioterapéuticos (pemetrexed cisplatino o pemetrexed carboplatino) mostraron un incremento significativo del número de células infectadas respecto a las células de control (p<0.001 vs ONCOS-102) (figura 3C). El pretratamiento de las células MSTO211H con quimioterapia, por otra parte, no incrementó el número de células infectadas. En contraste, la quimioterapia administrada simultáneamente con ONCOS-102 en tres líneas celulares de mesotelioma condujo a la inhibición o limitación de la replicación vírica in vitro.
Ejemplo 3. ONCOS-102 muestra un tropismo elevado para las células de mesotelioma
ONCOS-102 es un adenovirus oncolítico quimérico, en el que la fibra botón 5 fue sustituida por un dominio de botón del serotipo 3. Se cribaron las células positivas para los receptores CD46, DSG2 (Ad3) y CAR (Ad5) (figura 3B). MSTO-211H, H226 y JL-1 expresaron un nivel elevado de Cd 46 (98%, 96% y 98% respectivamente) y DSG2 (95%, 7% y 64% respectivamente) sobre sus superficies. El receptor CAR se expresó en dos de los tres mesoteliomas: H226 (88%) y JI-1 (15%).
Ejemplo 4. ONCOS-102 en combinación con pemetrexed y cisplatino o pemetrexed y carboplatino mostró una eficacia antineoplásica mejorada contra el MM en el modelo de xenoinjerto de mesotelioma humano
Dada la sinergia observada de ONCOS-102 y pemetrexed y cisplatino o pemetrexed y carboplatino in vitro, se evaluó a continuación si existía también una actividad antitumoral potenciada en un modelo animal in vivo. Por lo tanto, la línea celular de mesotelioma humano H226 se implantó subcutáneamente en ratones BALB/c desnudos y los tumores se trataron según el régimen de tratamiento presentado en la Tabla 1.
Se calculó el crecimiento tumoral (volumen) en los puntos temporales indicados y se informó como función del tiempo (figura 4A). Los tumores de xenoinjerto de mesotelioma H226 aparentemente eran refractarios a los quimioterapéuticos estándar (pemetrexed+cisplatino o pemetrexed+carboplatino), ya que ninguno de los tratamientos redujo significativamente el crecimiento tumoral. La quimioterapia por sí sola fue la modalidad de tratamiento más ineficiente contra el mesotelioma debido en parte a la dosis subóptima utilizada. Un animal tratado con ONCOS-102 pemetrexed cisplatino mostró una regresión tumoral completa (ambos tumores) el día 21. Además, un animal tratado con preactivación con ONCOS-102 pemetrexed cisplatino mostró una regresión completa de ambos tumores el día 45. ONCOS-102 por sí solo fue capaz de controlar el crecimiento tumoral en cierto grado (p=0.074 control vs. ONCOS-102 el día 48). La modalidad de tratamiento más eficaz contra el mesotelioma pleural fue con pemetrexed y cisplatino preactivado con ONCOS-102 (este tratamiento mostró 97% del tamaño tumoral inicial el día 60 vs. 473% (control), 563% (pemetrexed cisplatino) y 672% (pemetrexed y carboplatino). Además, en todos los regímenes de combinación (ONCOS-102 quimioterapia) los presentes inventores observaron la actividad antineoplásica más significativa, especialmente en comparación con la quimioterapia sola, el virus solo y el control (tamaño tumoral inicial: 97% (preactivación con virus pemetrexed cisplatino), 138% (virus pemetrexed cisplatino), 151% (preactivación con virus pemetrexed carboplatino) y 163% (virus pemetrexed carboplatino) vs. 206% (virus solo), 473% (control), 563% (pemetrexed cisplatino) y 672% (pemetrexed cisplatino) el día 60). ONCOS-102 y quimioterapéuticos, en todas las combinaciones sometidas a ensayo, mostró un fuerte efecto antitumoral sinérgico (R=2.19 ONCOS-102 pemetrexed cisplatino; R=1.7 ONCOS-102 pemetrexed carboplatino; R=2.5 preactivación con ONCOS-102 pemetrexed cisplatino; R=1.41 preactivación con ONCOS-102 pemetrexed carboplatino) el día 48. El día 21, la combinación de ONCOS-102 con pemetrexed cisplatino mostró un efecto sinérgico en ambos regímenes (R=1.8 ONCOS-102 pemetrexed cisplatino; R=1.32 preactivación con ONCOS-102 pemetrexed cisplatino), mientras que la combinación con pemetrexed carboplatino mostró un efecto aditivo (R=1.0 y 0.93 para los grupos de combinación).
Tabla 1. Actividad antineoplásica de ONCOS-102 en combinación con agentes quimioterapéuticos (pemetrexed y cisplatino o pemetrexed y carboplatino) en el mesotelioma, evaluada en ocho grupos (A-H). Se sometieron a ensayo diferentes regímenes de tratamiento, quimioterapias y concentraciones víricas en un modelo de xenoinjerto de mesotelioma humano en ratones BALB/c desnudos durante 2 meses.
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La Tabla 2 divulga el tratamiento combinado del mesotelioma con ONCOS-102 y pemetrexed cisplatino o pemetrexed carboplatino en ratones BALB/c desnudos.
Tabla 2. Tratamiento combinado del mesotelioma con ONCOS-102 y pemetrexed cisplatino o pemetrexed carboplatino en ratones BALB/c desnudos. La evaluación de la sinergia terapéutica se llevó a cabo con el procedimiento de cálculo VTF. El VTF (volumen tumoral fraccionario (%) experimental)/(volumen tumoral medio de control (%)).
*(VTF medio de la quimioterapia (%)) * (VTF media de ONCOS-102 (%)). **(VTF esperado dividido por el VTF observado). Una proporción (R) >1 indica un efecto sinérgico y una proporción <1 indica un efecto menos que aditivo.
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Ejemplo 5. ONCOS-102 se replica localmente en los tejidos tumorales y produce GM-CSF humano
La cuantificación del número de copia de E4 adenovírico y del nivel de GM-CSF en los órganos murinos (tumores e hígado) y en suero se llevó a cabo mediante qPCR y ELISA. ONCOS-102 se encontraba presente únicamente en tumores (localmente), mientras que no se detectaron partículas víricas en suero o hígado en ninguno de los grupos sometidos a ensayo (figura 4D). ONCOS-102 producía proteína de GM-CSF, que se detectó a la concentración más alta en los tumores en los 5 grupos sometidos a ensayo (véase figura 4C).
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Adenovirus ONCOS-102 (Ad5/3-d24-GMCSF) para la utilización en el tratamiento del mesotelioma maligno humano, en el que el virus se administra en combinación con dos agentes quimioterapéuticos en un paciente, y en el que los dos agentes quimioterapéuticos son pemetrexed y cisplatino, o pemetrexed y carboplatino.
2. Adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del mesotelioma maligno humano según la reivindicación 1, en el que la proporción molar entre pemetrexed y cisplatino es de entre 10:0.75 y 10:3.
3. Adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del mesotelioma maligno humano según la reivindicación 2, en el que la proporción molar entre pemetrexed y cisplatino es de 10:1.5.
4. Adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del mesotelioma maligno humano según la reivindicación 1, en el que la proporción molar entre pemetrexed y carboplatino es de entre 5:8 y 5:2.
5. Adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del mesotelioma maligno humano según la reivindicación 4, en el que la proporción molar entre pemetrexed y carboplatino es de 5:4.
6. Adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del mesotelioma maligno humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la cantidad del virus es de entre 5 x 1010 y 5 x 1011 PV.
7. Adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del mesotelioma maligno humano según la reivindicación 6, en el que el virus se administra en una cantidad de 3 x 1011 PV/5 ml.
8. Adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del mesotelioma maligno humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los agentes quimioterapéuticos y el virus se administran en cantidades eficaces.
9. Adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del mesotelioma maligno humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el virus se administra por vía intraperitoneal, intrapleural o mediante inyección directa en el tumor y los dos agentes quimioterapéuticos se administran por vía intravenosa o intraperitoneal.
10. Adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del mesotelioma maligno humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el virus se administra antes de administrar los dos agentes quimioterapéuticos y también durante el periodo de administración de dichos agentes quimioterapéuticos.
11. Adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del mesotelioma maligno humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que los dos agentes quimioterapéuticos se administran antes de administrar el virus y también durante el periodo de administración de dicho virus.
12. Adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del mesotelioma maligno humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende además la administración de uno, dos, tres o cuatro y cualquier combinación de los mismos de entre la lista de agentes que consiste en ciclohexamida, ácido fólico, cianocobalamina y dexametasona en el paciente.
13. Adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del mesotelioma maligno humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende además la administración de ciclofosfamida.
14. Adenovirus ONCOS-102 para la utilización en el tratamiento del mesotelioma maligno humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende además la administración de inhibidores de punto de comprobación, tales como los anticuerpos anti-PD-1/PD-L1 o anti-CTLA4.
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