ES2959563T3

ES2959563T3 - Inhibidores de pi3k p-delta 110 para su uso en la administración de virus en el tratamiento del cáncer

Info

Publication number: ES2959563T3
Application number: ES17701004T
Authority: ES
Inventors: Yaohe Wang; Mark Ferguson; Nicholas R Lemoine
Original assignee: Queen Mary University of London
Current assignee: Queen Mary University of London
Priority date: 2016-01-11
Filing date: 2017-01-11
Publication date: 2024-02-27
Anticipated expiration: 2037-01-11
Also published as: CN109219450A; EP3402468B1; SMT202300244T1; PL3402468T3; CN118320102A; HK1258235A1; US11351209B2; US20190022156A1; EP3402468C0; HUE063428T2; RS64678B1; HRP20231299T1; EP3402468A1; WO2017122000A1

Abstract

La presente invención proporciona una composición que comprende un inhibidor de fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) y un virus modificado para uso separado, posterior o simultáneo en el tratamiento del cáncer, en donde el virus modificado es para administración intravenosa. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidores de pi3k p-delta 110 para su uso en la administración de virus en el tratamiento del cáncer

La presente divulgación se refiere a un procedimiento mejorado para la administración de virus modificados a pacientes, por ejemplo en el tratamiento del cáncer.

Los virus modificados son virus que se han seleccionado o diseñado para atacar y destruir mejor las células cancerosas. Los virus modificados pueden incluir virus competentes para la replicación, condicionalmente competentes para la replicación, defectuosos para la replicación y atenuados. Además, los virus modificados también pueden proporcionar las señales inmunoestimuladoras necesarias para aumentar la respuesta anticancerosa del propio hospedador.

A pesar de los avances en cirugía mínimamente invasiva, radioterapia hiperfraccionada y nuevas combinaciones de agentes quimioterapéuticos, las tasas de supervivencia de los pacientes de muchos tipos de tumores sólidos no han cambiado. Los virus modificados son productos terapéuticos atractivos para el tratamiento de cánceres resistentes a las terapias convencionales

Los virus modificados son una plataforma excelente para la administración de inmunoterapia, dado que se dirigen específicamente a las células tumorales, lo que conduce, en primer lugar, a una lisis directa y a la presentación de antígenos asociados al tumor en el contexto de señales de peligro extravirales que generan una fuerte respuesta inmunitaria. Recientemente, T-VEC, un virus HSV-1 modificado genéticamente y armado con GM-CSF humano, ha sido autorizado por la FDA para el tratamiento del melanoma maligno por medio de inyección intratumoral (Andtbacka,et al., J Clin Oncol,2015. 33(25): págs. 2780 a 2788). JX594, otra cepa de Vaccinia, se ha administrado sistémicamente en humanos con cantidades detectables de expresión transgénica (Breitbach, C.J.,et al., Nature,2011. 477(7362): págs. 99 a 102), pero no se ha desarrollado ninguna estrategia para facilitar la infección eficaz de múltiples localizaciones tumorales tras la administración sistémica.

El idelalisib (5-fluoro-3-fenil-2-[(1S)-1-(7H-purin-6-ilamino) propil]-4(3H)-quinazolinona) es un inhibidor de la fosfoinositida 3-cinasa; más concretamente, bloquea la P1108, la isoforma delta de la enzima fosfoinositida 3-cinasa. Ha pasado por diversos ensayos demostrando toxicidades mínimas y se usa el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica (Brownet al. J Clin Oncol,2013, supl. Resumen 7003); Furman,et al., N Engl J Med,2014. 370(11): págs.

997 a 1007); Gopal,et al., N Engl J Med,2014. 370(11): págs. 1008 a 1018.

Recientemente se han publicado pruebas de que la inhibición de p110 delta puede ser eficaz no solo en neoplasias hemopoyéticas, sino también en cánceres sólidos (Aliet al., Nature,2014. 509 (7505): pág. 407 a-11; Mouchemoreet al.FEBS J, 2014. 280(21): págs. 5228 a 5236).

El Documento D1 (Ferguson, Market al.,Resumen Núm. 649,Abstracts Of The ASGCT 18th Annual Meeting,vol.

23, núm. Supp1.1., 1 de mayo de 2015, páginas s258 y s259) describe la focalización en la inmunidad innata del huésped a través de la mejora de PI3K delta de la entrega sistemática del virus vaccinia oncolítico.

El Documento D2 (US 2012/0100109) describe la administración de un virus oncolítico derivado del VHS y un inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR para tratar varios tipos de tumores resistentes.

El Documento D3 (R. Kanaiet al., Clinical Cancer Research,vol. 17, Núm. 11, 1 de junio de 2011, páginas 3686 a 3696) describe un nuevo virus herpes simple oncolítico que sinergiza con inhibidores de la vía fosfoinositida 3-cinasa/AKT para atacar células madre de glioblastoma.

El Documento D4 (Yin Tonget al., Oncology Reports,11 de febrero de 2014 describe que el inhibidor de P13K LY294002 inhibe la activación de la vía AKT/mTOR inducida por un adenovirus oncolítico que expresa TRAIL y sensibiliza las células de mieloma múltiple al virus oncolítico.

El Documento D5 (Nicole E. Forbeset al., Frontiers In Oncology,vol. 4, 23 de julio de 2014) describe la modulación farmacológica de la inmunidad antitumoral inducida por virus oncolíticos.

Hasta la fecha, la mayoría de los estudios preclínicos que examinan la administración sistémica del virus Vaccinia han usado ratones desnudos portadores de tumores xenoinjertados. Sin embargo, estos modelos experimentales no son inmunocompetentes y está claro que la inmunidad del huésped es una barrera importante para el éxito de la aplicación de virus modificados para su uso en el tratamiento del cáncer. Por lo tanto, es necesario mejorar los procedimientos de administración de dichos vectores.

La presente invención proporciona un kit de partes que comprende un inhibidor de fosfatidilinositol 3-cinasa delta (PI3K delta) y un virus vaccinia modificado para su uso en un procedimiento para el tratamiento del cáncer, en el que el gen de la timidina cinasa se elimina del genoma viral del virus vaccinia modificado, en el que el procedimiento comprende la administración del virus vaccinia modificado tras la administración del inhibidor de la fosfatidilinositol 3-cinasa delta (PI3K delta), en el que el virus vaccinia modificado es para administración intravenosa y en el que el cáncer es un tumor no resecable.

El inhibidor de la fosfatidilinositol 3-cinasa delta (PI3K delta) se puede seleccionar del grupo que consiste en: IC-87114, PI-103, TGX221, A66, AS 604850, Idelalisib, Wortmannin, Alpelisib, Buparlisib, Copanlisib, Duvelisib, Rigosertib y Taselisib, o un derivado de los mismos o una sal aceptable para uso farmacéutico de los mismos.

El virus vaccinia modificado se puede modificar aún más por medio de la inserción de un gen que codifique un agente terapéutico, o la supresión, o inactivación por inserción, de un gen viral.

El kit además puede comprender un agente anticancerígeno o fármaco citostático adicional.

La presente divulgación describe un procedimiento para mejorar la administración sistémica de un virus modificado a pacientes.

En la presente memoria se describe una composición que comprende un inhibidor de la fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K) y un virus modificado para uso separado, posterior o simultáneo en el tratamiento del cáncer, en el que el virus modificado es para administración intravenosa.

La composición puede ser especialmente útil en el tratamiento del cáncer avanzado, por ejemplo en el tratamiento de tumores sólidos en aquellos pacientes en los que ha fracasado la terapia convencional.

De forma adecuada, el inhibidor de la fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K) es un inhibidor delta de PI3K, por ejemplo un inhibidor selectivo de la subunidad catalítica p1105 de PI3K. Como se describe en la presente memoria, el inhibidor de la fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K) tiene un valor IC50 de aproximadamente 5nM a aproximadamente 0,5 ^M. Los inhibidores selectivos de PI3K delta se describen en el Documento WO 2010/0249155 de acuerdo con la Fórmula 1(S) y la Fórmula 1(R) descritas en el mismo y el Documento WO 2014/072937 de acuerdo con la Fórmula (I) descrita en el mismo. El Documento WO 2010/0249155 describe el compuesto IC-87114 (véase también Sadhuet al. J. Immunology,vol. 170(5):2647 a 2654, 2003).

El inhibidor de la fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K) se puede seleccionar del grupo que consiste en: IC-87114, PI-103, TGX221, A66, AS 604850, Idelalisib, Wortmannin, Alpelisib, Buparlisib, Copanlisib, Duvelisib, Rigosertib, y Taselisib, o un derivado del mismo o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, como se muestra en la Tabla 1 a continuación.

Tabla 1

Los derivados adecuados de los inhibidores de la fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K) descritos en la presente memoria incluyen cualquier sustitución o modificación que no altere sustancialmente la propiedad de la molécula para poder actuar como inhibidor de la fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K).

Las sales aceptables para uso farmacéutico del inhibidor de la fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K) en la presente memoria descrito incluyen cualquier forma de sal adecuada formada con un ácido tal como el ácido 1-hidroxi-2-naftoico, el ácido 2,2-dicloroacético, el ácido 2-hidroxietanosulfónico, el ácido 2-oxoglutárico, el ácido 4-acetamidobenzoico, el ácido 4-aminosalicílico, el ácido acético, el ácido adípico, el ácido ascórbico (L), el ácido aspártico (L), el ácido bencenosulfónico, el ácido benzoico, el ácido alcanforico (+), el ácido alcanfor-10-sulfónico (+), el ácido cáprico (ácido decanoico), el ácido caproico (ácido hexanoico), el ácido caprílico (ácido octanoico), el ácido carbónico, el ácido cinámico, el ácido cítrico, el ácido ciclámico, el ácido dodecilsulfúrico, el ácido etano-1,2-disulfónico, el ácido etanosulfónico, el ácido fórmico, el ácido fumárico, el ácido galactárico, el ácido gentísico, el ácido glucoheptónico (D), el ácido glucónico (D), el ácido glucurónico (D), el ácido glutámico, el ácido glutárico, el ácido glicerofosfórico, el ácido glicólico, el ácido hipúrico, el ácido bromhídrico, el ácido clorhídrico, el ácido isobutírico, el ácido láctico (DL), el ácido lactobiónico, el ácido láurico, el ácido maleico, el ácido málico (-L), el ácido malónico, el ácido mandélico (DL), el ácido metanosulfónico, el ácido naftaleno-1,5-disulfónico, el ácido naftaleno-2-sulfónico, el ácido nicotínico, el ácido nítrico, el ácido oleico, el ácido oxálico, el ácido palmítico, el ácido pamoico, el ácido fosfórico, el ácido propriónico, el ácido piroglutámico (-L), el ácido salicílico, el ácido sebácico, el ácido esteárico, el ácido succínico, el ácido sulfúrico, el ácido tartárico (+L), el ácido tiociánico, el ácido toluenosulfónico (p) o el ácido undecilénico.

Los virus modificados pueden ser un virus competente en replicación, condicionalmente competente en replicación, defectuoso en replicación o atenuado. El virus modificado para su uso en el tratamiento del cáncer se puede describir, por lo tanto, como un virus oncolítico.

El virus modificado puede ser un virus vaccinia, un virus del herpes simple, un adenovirus, un virus de la estomatitis vesicular (VSV), un virus del sarampión, un virus de la enfermedad de Newcastle, un poliovirus, un reovirus, un senecavirus o un virus huérfano humano citopático entérico (ECHO), o combinaciones de los mismos. El virus modificado se puede generar por medio de la supresión de uno o varios genes específicos (por ejemplo, por medio de la supresión de la timidina cinasa), y/o la inserción de un transgén que codifique un agente terapéutico.

Como se describe en la presente memoria, el virus modificado es un virus vaccinia (VV). El virus vaccinia es un virus de ADN bicatenario con muchas características que lo convierten en un candidato atractivo para la terapia viral modificada. Muestra una rápida replicación, una eficaz propagación a los tumores y una fuerte capacidad lítica. Además, el virus vaccinia se ha estudiado ampliamente y tiene una biología molecular bien definida, con una gran capacidad de clonación y una diversidad de promotores naturales y sintéticos disponibles en el mercado, lo que lo hace ideal como vector para transportar secuencias heterólogas de ácidos nucleicos. El virus vaccinia tiene un perfil de seguridad bien establecido y se dispone de tratamientos para las infecciones no controladas. Además, el virus vaccinia también es capaz de tolerar condiciones de microambiente hipóxico en tumores sólidos (Hileyet al. Gene Ther.2010; 17:281 a 287).

El virus vaccinia modificado se puede seleccionar del grupo formado por las cepas Western Reserve, Wyeth y Lister. Convenientemente, el virus vaccinia es un mutante de supresión de una de estas cepas, por ejemplo, McCartet al. (Cáncer Res.2001,61, 8751 a 8757) describen una versión de la cepa Western Reserve (WR) con supresiones en el gen de la timidina cinasa (TK) y en el gen del factor de crecimiento vírico (VGF) y Hunget al. (Gene Therapy,2007, 14; 20 a 29) describen una cepa de vaccinia Lister deficiente en TK. El virus vaccinia modificado se puede modificar aún más por medio de la inserción en el virus de genes heterólogos, por ejemplo, genes codificadores de citocinas.

De forma adecuada, el virus vaccinia modificado es un mutante de supresión en el que el gen de la timidina cinasa se elimina del genoma viral. Dichos virus también se pueden modificar aún más por medio de la inserción en el genoma viral de uno o más genes que codifiquen un agente terapéutico, por ejemplo, una citoquina.

El virus modificado puede ser un adenovirus, por ejemplo, adenovirus-5, o un virus del herpes simple (VHS), por ejemplo, VHS-1 o VHS-2. Un ejemplo de virus modificado que es un virus VHS-1 es la construcción vírica talimogene laherparepvec (“T-VEC”), que es una forma atenuada de VHS-1 (cepa JS1) modificada para dirigirse a células cancerosas y expresar GM-CSF. Algunos ejemplos de adenovirus modificados son Oncorine™ (H101), Onyx-015™ (Ad2/5 dl1520) y enadenotucirev (adenovirus quimérico del grupo B A11/Ad3).

Algunos ejemplos de virus vaccinia modificados adecuados para su uso de acuerdo con la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, cepas virales descritas en los Documentos WO 2015/150809 (virus vaccinia), WO 2014/063601 (virus vaccinia y adenovirus tipo 5), JX-594 (virus vaccinia suprimido de timidina cinasa con gen que codifica GM-CSF). Como se describe en la presente memoria, el virus vaccinia modificado es la cepa de virus vaccinia VVL15. De forma adecuada, la cepa del virus vaccinia se suprime de la timidina cinasa y además comprende uno o más transgenes que codifican un agente terapéutico (por ejemplo, uno o más de GM-CSF, IL-12 y/o IL-21), opcionalmente otros genes virales en el virus se pueden suprimir o interrumpir por medio de la inserción de genes (gen “knock-out”). Por ejemplo, los genes del Factor de Crecimiento Viral (VGF) y/o NL1 pueden estar alterados o inactivados.

Algunos ejemplos de un agente terapéutico adecuado para la expresión por medio del virus modificado incluyen, entre otros, las citocinas, las quimiocinas y los factores de crecimiento. La citocina puede ser un agente inmunomodulador, tal como una interleucina (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35 e IL-36), un interferón (INF-a, INF-p, INF-y e INF-w), el factor de necrosis tumoral (TNF) y/o el factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF), o un inhibidor de punto de control PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, BTLA, TIGIT y sus respectivos ligandos, por ejemplo PD-L1 o PD-L2, CD80 o CD86..

Como se describe en la presente memoria, en la composición puede estar presente más de un virus modificado. Por lo tanto, la composición puede comprender al menos un virus modificado, por ejemplo un virus vaccinia y un adenovirus.

La composición puede comprender un portador, diluyente o excipiente aceptable para uso farmacéutico.

Por lo tanto, la presente divulgación se extiende a un procedimiento de tratamiento del cáncer que comprende la etapa de administrar una composición que comprende un inhibidor de la fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K) y un virus modificado a un sujeto que lo necesita, en el que el inhibidor de la fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K) y el virus modificado se administran por separado, posteriormente o simultáneamente al sujeto, en el que el virus modificado se administra por vía intravenosa.

Por lo tanto, la divulgación también describe el uso de un inhibidor de la fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K) y un virus modificado en la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento del cáncer, en el que el virus modificado es para administración intravenosa.

La administración separada, subsiguiente o simultánea del inhibidor de la fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K) y el virus modificado para su uso en el tratamiento del cáncer se puede lograr por cualquier vía conveniente en la que el virus modificado sea para administración intravenosa y el inhibidor de la PI3K sea para administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, oral, intranasal o subcutánea. Como se describe en la presente memoria, el inhibidor de la fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K) se administra por vía oral y el virus modificado se administra por vía intravenosa. El inhibidor de la fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K) y el virus modificado se pueden preparar como una preparación combinada o se pueden preparar como componentes separados.

Se anticipa que la divulgación puede encontrar su mayor utilidad en el tratamiento de pacientes humanos. El sujeto a tratar puede ser un mamífero, por ejemplo, un ser humano. El sujeto puede ser un roedor, por ejemplo, una rata o un ratón, o un animal de compañía, por ejemplo, un gato o un perro. El sujeto puede ser una especie de importancia agrícola, por ejemplo una especie ungulada, es decir, equina, bovina, porcina, caprina u ovina.

La administración intravenosa puede ser ventajosa, dado que debería permitir el tratamiento simultáneo de los tumores primarios y de cualquier depósito metastásico de células cancerosas.

Las composiciones de la divulgación se pueden usar en el tratamiento del cáncer, por ejemplo, en el tratamiento de un sarcoma, un carcinoma o un linfoma. Los ejemplos de tipos de cáncer que se pueden tratar con las composiciones de la divulgación incluyen, entre otros, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de páncreas, cáncer de piel (melanoma, carcinoma de células basales o carcinoma de células escamosas), cáncer de estómago, cáncer de próstata, cáncer de hueso, adenocarcinoma, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de útero, cáncer de testículo, cáncer neuroendocrino, cáncer endocrino, cáncer de timo, cáncer de tiroides, cáncer renal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de esófago, cáncer del sistema nervioso central periférico o cáncer cerebral. Las referencias a un cáncer concreto incluyen la referencia a un tumor formado por células cancerosas del tejido u órgano respectivo.

El tumor puede ser no resecable antes del tratamiento y resecable después del tratamiento. El tumor puede ser recurrente, primario, metastásico y/o resistente a múltiples fármacos. El tumor puede ser un tumor/hiperplasia no maligno.

Una cantidad terapéuticamente eficaz es la dosis suficiente para inducir la lisis tumoral (es decir, suficiente para inducir (permitir la supervivencia de) una dosis terapéuticamente eficaz de virus modificado). Las dosis de suministro y administración se pueden basar en los protocolos actuales existentes, determinarse empíricamente, mediante el uso de modelos de enfermedades animales u, opcionalmente, en ensayos clínicos en seres humanos. Las dosis del estudio inicial se pueden basar en los estudios con animales expuestos en la presente memoria, para un ratón, por ejemplo. Las dosis pueden variar y depender de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico, el tipo, el momento de aparición, la progresión, la gravedad, la frecuencia, la duración o la probabilidad de la enfermedad a la que se dirige el tratamiento, el criterio de valoración clínico deseado, los tratamientos previos o simultáneos, el estado general de salud, la edad, el sexo, la raza o la competencia inmunológica del sujeto y otros factores que apreciará los expertos en la técnica. La cantidad de dosis, el número, la frecuencia o la duración se pueden aumentar o reducir proporcionalmente, de acuerdo con lo indicado por los efectos secundarios adversos, las complicaciones u otros factores de riesgo del tratamiento o la terapia y el estado del sujeto. Los expertos apreciarán los factores que pueden influir en la dosis y la posología necesarias para proporcionar una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico o profiláctico.

Como se describe en la presente memoria, el procedimiento además comprende administrar al sujeto una terapia adicional contra el cáncer. La terapia contra el cáncer, como se usa en la presente memoria, se refiere al tratamiento del cáncer por cualquier medio médico o físico. La terapia adicional contra el cáncer puede ser quimioterapia, terapia biológica, radioterapia, inmunoterapia, terapia hormonal, terapia antivascular, crioterapia, terapia con toxinas y/o cirugía, incluidas las combinaciones de las mismas. La composición de la divulgación puede, por lo tanto, comprender uno o más agentes anticancerígenos o fármacos citostáticos.

Los procedimientos y los usos de la divulgación desvelados en la presente memoria se pueden practicar inmediatamente o días, meses o años después de que se haya identificado que un sujeto padece la enfermedad objeto de tratamiento.

Los procedimientos incluyen la administración del virus en diferentes horarios. Se puede administrar una dosis única del virus a un sujeto o a un tumor durante un período de 1,2, 5, 10, 15, 20 o 24 horas. El virus se puede administrar durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más días o semanas. El intervalo entre inyecciones puede ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 días o semanas. Generalmente, se administran múltiples dosis a la misma región diana general, tal como en la proximidad de un tumor o, en el caso de la administración intravenosa, un punto de entrada concreto en el torrente sanguíneo o el sistema linfático de un sujeto. El vector del virus vaccinia se puede administrar 2, 3, 4, 5 o más veces. El vector del virus vaccinia se podría administrar antes de la resección de los tumores en diferentes pautas y dosis.

Los procedimientos incluyen la administración del virus a diferentes concentraciones virales. En ciertos aspectos, al sujeto se le administran al menos 5X107, 1x108, 2X108, 5X108, 1X109, 2X109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011, 5 x 1011,1 x 1012 o más partículas virales o unidades formadoras de placa (pfu), incluidos los diversos valores e intervalos entre ellos. La dosis viral se puede administrar en 0,1 ml, 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml o más, incluidos los valores e intervalos intermedios. La dosis se puede repartir a lo largo del tiempo o por medio de una inyección separada.

Las composiciones y los procedimientos desvelados en la presente divulgación se pueden usar en diferentes tipos de terapia génica, por ejemplo, terapia génica supresora de tumores, terapia génica suicida, estrategias de inmunización con vectores virales, terapia antiangiogénica, terapia génica proapoptótica y terapia de reemplazo génico.“Oncolytic Viruses for Cáncer Therapy: Overcoming the Obstacles"(Wonget al., Viruses,2010, 2, 78 a 106). Las composiciones y los procedimientos desvelados en la presente divulgación se pueden usar en combinación con medios o procedimientos terapéuticos adicionales en el tratamiento del cáncer, por ejemplo, cirugía, quimioterapia, radioterapia, terapia molecular contra el cáncer o una terapia génica adicional, que se puede usar para administrar genes que son diferentes de los ácidos nucleicos de la divulgación descritos en la presente memoria.

También se describe un kit que comprende un inhibidor de la fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K) y un virus modificado para su uso en el tratamiento del cáncer, que convenientemente también comprende instrucciones de uso.

Las características preferentes del segundo aspecto y de aspectos subsecuentes de la divulgación son como para cada el primer aspectomutatis mutandis.

A continuación, la divulgación se describirá con más detalle por medio de referencia a los siguientes ejemplos y dibujos, en los que:

La FIGURA 1A muestra que la infección vírica sistémica aumenta significativamente los niveles de ARN de la isoforma p110 delta en los esplenocitos de ratones inmunocompetentes. Se inyectaron 1*106 células CT26 en el flanco derecho de ratones BALB/c de tipo salvaje o desnudos antes de una inyección intravenosa de 1*108 PFU VVL15 o PBS. Tres ratones de cada grupo (Desnudo/PBS, Desnudo/VVL15, Inmunocompetente/PBS e Inmunocompetente/VVL15) fueron sacrificados inmediatamente después de la inyección en la vena de la cola o tres horas más tarde. La cantidad de ARN p110 delta en los bazos se cuantificó por medio de qPCR. Hay significativamente más ARN p110 delta a las tres horas en los ratones inmunocompetentes tratados con VVL15 en comparación con todas las demás condiciones (P<0,001).

La FIGURA 1B muestra que la expresión de la proteína p110 delta aumenta con la infección viral Los macrófagos derivados de la médula ósea de dos ratones BALB/c de tipo salvaje se pretrataron con IC87114 a 75 mg kg-1 o con tampón vehículo durante 2 horas antes de infectarlos con VVL15 a MOI 5 o con simulacro durante 1 hora. La expresión de la proteína p110 delta se evaluó por medio de western blot. La infección viral por sí sola aumenta la cantidad de proteína p110 delta detectada, mientras que la adición del IC87114 solo o junto con VVL15 no parece alterar la cantidad de proteína p110 delta detectada.

La FIGURA 1C muestra que la inhibición selectiva de p110 delta reduce la adhesión de VVL15 a los macrófagos. En 2 experimentos diferentes, macrófagos derivados de médula ósea procedentes de dos ratones BALB/c de tipo salvaje (WT) fueron pretratados durante 2 horas con IC87114, un inhibidor selectivo de p110 delta, o con tampón vehículo. A continuación, se llevó a cabo un ensayo de fijación viral. Posteriormente, en el primer experimento se llevó a cabo microscopía confocal después de teñir las células con DAPI (azul) y tubulina (verde), el virus Vaccinia se tiñe de rojo (anticuerpo de la proteína de la cubierta del virus Vaccinia). Se detectó menos virus Vaccinia en el grupo tratado con IC87114. El segundo experimento cuantificó la cantidad de VVL15 presente por medio de qPCR. El grupo tratado con inhibidores fue estadísticamente diferente de los macrófagos no tratados (P < 0,001).

La FIGURA 1D muestra que IC87114 afecta a la adhesión viral de forma dependiente de p110 delta. Se cultivaronex vivomacrófagos derivados de la médula ósea procedentes de dos ratones BALB/c de tipo salvaje o de cuatro ratones transgénicos con p110 delta inactivada (inactivación heterocigótica [n=2], inactivación homocigótica [n=2]) y, a continuación, se llevó a cabo un ensayo de fijación viral en los macrófagos transgénicos, mientras que los macrófagos de tipo salvaje se pretrataron durante 2 horas con IC87114 o tampón vehículo y, posteriormente, se llevó a cabo un ensayo de fijación viral. Tanto los macrófagos murinos transgénicos heterocigotos como los homocigotos delta knock in demostraron una reducción similar de la adhesión viral a los macrófagos de tipo salvaje tratados con IC87114, todos los grupos fueron estadísticamente significativos respecto a los macrófagos de tipo salvaje no tratados (P < 0,05 o P < 0,01).

La FIGURA 2A muestra que el pretratamiento con IC87114 antes de la inyección sistémica del virus Vaccinia mejora la señal de luminiscencia tumoral en ratones BALB/c portadores de tumores de flanco CT26. Once ratones BALB/c portadores de tumores de flanco CT26 recibieron 75 mg kg-1 IC87714 o tampón vehículo tres horas antes de una inyección intravenosa de 1*108 PFU VVL15. La biodistribución de VVL15 se determinó por medio de IVIS. Se detectó una señal significativamente mayor en el grupo pretratado con 75 mg kg-1 de IC87114 en los días 1, 3, 4 y 5 (P<0,01 en el día 1 y P<0,05 en los días 3, 4 y 5). Estos son los resultados combinados de tres experimentos.

Las FIGURAS 2B y 2C muestran que el tratamiento con IC87114 oral y virus Vaccinia intravenoso reduce significativamente la carga tumoral y mejora la supervivencia en ratones BALB/c portadores de tumores ortotópicos 4T1 o tumores de flanco<c>T26.

La FIGURA 2B muestra ratones BALB/c portadores de tumores CT26. A 40 ratones se les inyectó por vía subcutánea en el flanco derecho rasurado 1*106 células tumorales CT26. Los ratones fueron pretratados con tampón vehículo (Grupos A y C) o IC87114 a 50 mg kg-1 (Grupos B y D) por sonda oral tres horas antes de recibir una inyección intravenosa de 1*108 PFU VVL15 (Grupos A y D) o PBS (Grupos B y C). Este tratamiento se inició el día 8 tras la implantación del tumor y se repitió los días 11 y 13. Hay una carga tumoral significativamente menor en el grupo pretratado con IC87114 en comparación con todos los demás grupos. Concretamente, el Grupo D comparado con el Grupo A en los días 11 y 13 (P<0,001). Grupo D comparado con el Grupo B en los días 11 y 13 (P<0,001). Grupo D comparado con el Grupo C en el día 11 (P<0,001). Análisis de supervivencia; los datos se representan en un gráfico de Kaplan-Meier. Los ratones pretratados con IC87114 (Grupo D) sobrevivieron significativamente más que todos los demás grupos. Concretamente, el Grupo D en comparación con el Grupo A (P<0,01). Grupo D en comparación con el Grupo B (P<0,01). Grupo D en comparación con el Grupo C (P<0,05).

La FIGURA 2C muestra ratones BALB/c portadores de tumores ortotópicos 4T1. A 36 ratones hembra BALB/c se les inyectó ortotópicamente 1*105 células 4T1 en 50|jl de PBS en la glándula mamaria torácica inferior izquierda. Los ratones fueron pretratados con tampón vehículo (Grupos A y C) o IC87114 a 75 mg kg-1 (Grupos B y D) por sonda oral tres horas antes de recibir una inyección intravenosa de 1*108 PFU VVL15 (Grupos A y D) o PBS (Grupos B y C). Este tratamiento se llevó a cabo los días 12, 15 y 17 tras la implantación del tumor. Hay una carga tumoral significativamente menor en el grupo pretratado con IC87114 en comparación con todos los demás grupos. Concretamente, el Grupo D comparado con el Grupo A en los días 16 y 19 (P<0,05 y P<0,001 respectivamente). Grupo D comparado con el Grupo B en los días 16 y 19 (P<0,001). Grupo D comparado con el Grupo C en los días 16, 19 y 21 (P<0,001). Análisis de supervivencia; los datos se representan en un gráfico de Kaplan-Meier. Los ratones pretratados con IC87114 (Grupo D) sobrevivieron significativamente más que todos los demás grupos. Concretamente, el Grupo D en comparación con el Grupo A (P<0,05). Grupo D en comparación con el Grupo B (P<0,01). Grupo D en comparación con el Grupo C (P<0,01).

La FIGURA 2D muestra que el pretratamiento con IC87114 reduce la localización del virus Vaccinia en el bazo tras la administración sistémica de VVL15in o.

Las FIGURAS 2D(i) y 2D(ii) muestran microfotografías de cortes transversales de bazo teñidos con hematoxilina y tinción inmunohistoquímica para la proteína de la cubierta viral de Vaccinia. Las flechas marcan las células infectadas por el virus: (i) Pretratadas con tampón vehículo; y (ii) Pretratadas con IC87114. La FIGURA 2D(iii) muestra la semicuantificación de células fuertemente teñidas en campos de alta potencia seleccionados al azar con un aumento de x200. Se contó manualmente el número de células inmunorreactivas para la proteína de cubierta de Vaccinia en cada campo de aumento aleatorio de x200. No hubo diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos de control (p = 0,001).

La FIGURA 2E muestra que el IC87114 atenúa la inmunidad antivírica pero no tiene ningún efecto sobre la inmunidad antitumoral. Ensayo de interferón gamma en esplenocitos procedentes de ratones BALB/c portadores de tumores CT26. A 15 ratones se les inyectó por vía subcutánea en el flanco derecho rasurado 1*106 células tumorales CT26. Los ratones fueron pretratados con tampón vehículo (Grupos A y C) o IC87114 a 75 mg kg-1 (Grupos B y D) por sonda oral tres horas antes de recibir una inyección intravenosa de 1*108 PFU VVL15 (Grupos A y D) o PBS (Grupos B y C). Se llevó a cabo un ELISA de interferón (IFN) gamma. Inmunidad antitumoral: se estimularon los esplenocitos con células CT26 tratadas con mitomicina; no hubo diferencias estadísticamente significativas entre ninguno de los grupos. Inmunidad antiviral: se estimularon los esplenocitos con la proteína B8R, se detectó más IFN gamma en el Grupo A (Sin inhibidor VVL15) en comparación con todos los demás grupos (P<0,05).

Los ejemplos se ofrecen únicamente con fines ilustrativos y no se han de interpretar como limitaciones de la divulgación. La invención está definida por las reivindicaciones.

Procedimientos

Líneas celulares

Todas las líneas celulares se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 5 a 10% de suero de ternera fetal (FCS), excepto los macrófagos, que se cultivaron en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) con 10% de FCS, 28,6|<j>M de beta-mercaptoetanol (pMCE) y 1% de estreptomicina/penicilina. Las líneas celulares de carcinoma colorrectal murino CMT93 y CT26, y la línea celular de cáncer de mama 4T1 se obtuvieron del banco celular Cancer Research UK. La línea celular de riñón normal de mono verde africano, CV1, se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC, VA, EE.UU.). Los macrófagos derivados de la médula ósea de ratones knock-in p110 delta fueron una amable donación del profesor Vanhaesebroeck (University College London, Reino Unido). Las líneas celulares se sometieron a pruebas rutinarias de detección de micoplasmas y se mantuvieron a 37 °C con un 5% de CO2, a menos que se indicara lo contrario. En todos los experimentos se usaron números de pasaje similares. Para el almacenamiento a largo plazo, se centrifugaron las células y se resuspendieron en DMEM con un 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) y un 10% de FBS. Tras una noche de almacenamiento a -80 °C, las células se transfirieron a nitrógeno líquido.

Reactivos

Merck suministró PI-103 (un inhibidor de la isoforma alfa de la PI3 cinasa) y TGX221 (un inhibidor de la isoforma beta de la PI3 cinasa) así como el inhibidor pan-clase 1 Wortmannin. Tocris Bioscience suministró el inhibidor de Rac1 NSC23766, la citocalasina D (un inhibidor de la polimerización de la actina), el Y-27632 (un inhibidor de la proteína cinasa asociada a Rho) y el nocodazol (un inhibidor de la polimerización de los microtúbulos). Santa Cruz Biotechnology suministró el inhibidor selectivo de PI3 cinasa alfa de clase 1a A66. Sigma-Aldrich suministró AS 604850, un inhibidor selectivo de la clase 1b de la isoforma gamma de la PI3 cinasa. Inicialmente Symansis suministró IC87114, el inhibidor selectivo de la isoforma p110 delta de clase 1a, y posteriormente, a partir de marzo de 2012, se obtuvo en su lugar de Synkinase. Las concentraciones usadas fueron PI-103 a 80nM, TGX221 a 0,1j M, Wortmannin a 0,5<j>M, NSC23766 a 50<j>M, A66 a 0,5<j>M, Citocalasina D a 10<j>M, Y-27632 a 10<j>M, Nocodazol a 10<j>M y AS 604850 a 1<j>M. IC87114 se usó a una concentración de 1<j>M para todos los ensayosin vitro,a menos que se indique lo contrario. Los anticuerpos Western Blot fueron anti-p1105 de Santa Cruz Biotechnologies (sc-7176), y anti-vinculina (V9131) y anti-actina (SAB2500963) de Sigma-Aldrich. El anticuerpo contra el virus Vaccinia usado para los experimentos inmunohistoquímicos fue un anticuerpo policlonal de conejo contra el virus Vaccinia suministrado por AbD Serotec, número de lote 250906, y se usó diluido 1:400. El tampón MACs fue solución salina tamponada con fosfato Dulbecco 2mM EDTA 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA). La Pronase fue suministrada por Roche Applied Science (Cat. Núm. 10165921001) y disuelto en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 1 mg ml-1. El MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio) y el PMS (metosulfato de fenazina) fueron suministrados por Promega. El medio de cultivo de células T (MCT) fue RPMI-1640, 10% de FCS, 1% de estreptomicina, 1% de penicilina y 1% de piruvato de sodio. IC87114In vivose usó a 75 mg kg-1 por sonda oral. El factor estimulante de colonias de macrófagos de ratón recombinante (M-CSF) fue suministrado por R&D Systems, Núm. de catálogo. 415-ML. Se usó a una concentración de 30 ng ml'1. La D-Luciferina fue suministrada por Caliper Life Sciences (Número de Lote: 124358465) y se usó a 15 mg ml-1. El tampón vehículo, usado como control o para disolver el IC87114, se preparó por medio de la adición de un 0,25% de Tween-20 y un 0,5% de carboximetilcelulosa a la PBS.

Virus

VVL15 fue una amable donación del Profesor Istvan Fodor (Loma Linda University Campus, Loma Linda, CA, USA). Se construyó por medio de la inserción de los genes luciferasa de luciérnaga y reportero lacZ en la región timidina cinasa de WLister bajo el control del promotor p7.5 de vaccinia temprana-tardía.

Ejemplo 1: Infección de células tumorales por un virus modificado en ratones desnudos y modelos de ratones inmunocompetentes

La Figura 1A muestra que hay significativamente más ARN p110 delta a las tres horas en los esplenocitos de ratones inmunocompetentes tratados con VVL15 en comparación con todas las demás condiciones (P<0,001). Esto implica que existe una regulación al alza del ARN p110 delta inducida por el virus en los esplenocitos derivados de ratones inmunocompetentes, pero no en los desnudos, lo que proporciona más pistas sobre las diferencias entre los modelos y, al menos plausiblemente, da más peso al concepto de que los macrófagos esplénicos desempeñan un papel central en la eliminación del VVL15. La Figura 1B demuestra que esta regulación al alza del ARN p110 delta se traduce en expresión proteica en macrófagos de ratón inmunocompetentes tratados viralmente en comparación con los tratados con simulacro. La Figura 1C muestra que la inhibición de p110 delta por medio de IC87114 (un inhibidor selectivo) reduce significativamente la adhesión de WL15 a los macrófagos.

Aunque se cree que IC87114 es bastante específico, ciertamente podría obstaculizar otras cinasas (Campset al., Nat. Med.,2005. 11(9): págs. 936 s 943). Por lo tanto, es necesario comprobar que la reducción de la fijación de VVL15 observada se debe en realidad a que IC87114 bloquea la actividad de p110 delta. En consecuencia, se usaron macrófagos derivados de médula ósea de transgénicos p110 delta knock-in (se trata de una mutación inactivadora “muerta por cinasa”) en un ensayo de fijación. La Figura 1D muestra que hay una reducción significativa similar de la adhesión de VVL15 a los macrófagos de tipo salvaje tratados con IC87114 en comparación con los macrófagos transgénicos heterocigotos y homocigotos (P<0,01 o P<0,05 respectivamente). Estos datos sugieren que la reducción de la adhesión observada en macrófagos de tipo salvaje tratados con IC87114 se debe a la inhibición selectiva de p110 delta. Por lo tanto, es lógico sugerir que p110 delta participa en el proceso de unión del virus al macrófago. Curiosamente, no hay diferencia en la reducción de la adhesión entre los macrófagos heterocigotos y homocigotos knock-in p110 delta, lo que implica que después de un cierto nivel de bloqueo delta VVL15 se adhiere a la célula de una manera independiente de p110 delta.

En los presentes ejemplos, se decidió usar 75 mg kg-1 como la dosis de IC87714. Se decidió administrar esta dosis tres horas antes de la administración sistémica de VVL15. Este calendario se basó en los datosin vitromostrados en la Figura 1C, que mostraban que había una reducción de la adhesión viral a los macrófagos tras tres horas de incubación con IC87114, y en un estudio farmacocinético llevado a cabo en ratas que demostraba que el tiempo hasta la concentración plasmática máxima tras la administración oral de IC87114 era de 4 horas. La Figura 2<a>muestra que la dosis de 75 mg kg-1 produce una luminiscencia tumoral consistentemente mayor en comparación con el control. Se administró IC87714 por vía oral seguido por una inyección intravenosa de VVL15.

Ejemplo 2: Estudios de eficacia

Posteriormente, esta combinación de inhibidor y virus se usó en dos estudios de eficacia en diferentes modelos murinos (Figuras 2B y 2C), uno de los cuales se había optimizado como modelo metastásico ortotópico fiable que reflejaba la probable aplicación clínica de este tratamiento. Estos estudios demostraron que IC87114 potencia la eficacia antitumoral de VVL15 administrado sistémicamentein vivo,lo que confiere tanto una carga tumoral reducida como una ventaja de supervivencia. Los tumores en los ratones del Grupo D (IC87114 VVL15, Figura 2B y 2C) finalmente empezaron a aumentar de tamaño y los ratones murieron, pero VVL15 es un virus con eliminación de timidina cinasa y es mucho menos eficaz que otros virus Vaccinia modificados disponibles armados con transgenes inmunomoduladores.

La Figura 2E ilustra un ensayo de interferón gammaex vivollevado a cabo en esplenocitos derivados de ratones BALB/c portadores de tumores CT26. Esto demostró que los esplenocitos derivados de los ratones tratados con el régimen optimizado desarrollaron respuestas antitumorales de IFN gamma similares a las de todos los demás grupos probados. Sin embargo, los esplenocitos derivados del grupo IC87114 VVL15 presentaron niveles reducidos de IFN gamma tras la estimulación con la proteína vírica B8R en comparación con los esplenocitos del grupo tratado únicamente con el virus. De este modo, el pretratamiento con IC87114 parece reducir en magnitud el desarrollo posterior de una respuesta antiviral. Esto podría significar que, aparte del efecto que el IC87114 tiene sobre los macrófagos en un momento temprano, tiene un efecto separado más duradero que conduce a la reducción de la inmunidad antiviral y al establecimiento de una infección eficaz de los tumores que conduce a la mejora observada en la eficacia en comparación con el virus solo.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un kit de piezas que comprende un inhibidor de la fosfatidilinositol 3-cinasa delta (PI3K delta) y un virus vaccinia modificado para su uso en un procedimiento para el tratamiento del cáncer, en el que el gen de la timidina cinasa se elimina del genoma viral del virus vaccinia modificado, en el que el procedimiento comprende la administración del virus vaccinia modificado tras la administración del inhibidor de la fosfatidilinositol 3-cinasa delta (PI3K delta), en el que el virus vaccinia modificado es para administración intravenosa y en el que el cáncer es un tumor no resecable.

2. El kit de piezas de uso como se reivindica en la reivindicación 1, en el que el inhibidor de la fosfatidilinositol 3-cinasa delta (PI3K delta) se selecciona del grupo que consiste en: IC-87114, PI-103, TGX221, A66, AS 604850, Idelalisib, Wortmannin, Alpelisib, Buparlisib, Copanlisib, Duvelisib, Rigosertib y Taselisib, o un derivado de los mismos o una sal aceptable para uso farmacéutico de los mismos.

3. El kit de piezas de uso como se reivindica en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el virus vaccinia modificado se modifica además por medio de la inserción de un gen que codifica un agente terapéutico, o la supresión, o inactivación por inserción, de un gen viral.

4. El kit de piezas para su uso como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el kit además comprende un agente anticancerígeno o fármaco citostático adicional.