ES2905663T3 - Terapia de combinación para el cáncer - Google Patents

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Abstract

Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer en combinación con radiación, en donde la composición comprende: una proteína que comprende; (a) un TGFβRII humano, o un fragmento del mismo capaz de unirse a TGFβ; y (b) un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a la proteína humana ligando 1 de muerte programada (PD-L1), que comprende (i) una región variable de cadena pesada que incluye una HVR-H1, una HVR-H2 y una HVR-H3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SYIMM, SIYPSGGITFYADTVKG e IKLGTVTTVDY, respectivamente, y (ii) una región variable de cadena ligera que incluye una HVR-L1, una HVR-L2 y una HVR-L3, que tienen las secuencias de aminoácidos de TGTSSDVGGYNYVS, DVSNRPS y SSYTSSSTRV, respectivamente, en donde la proteína utilizada en combinación con la radiación de un tumor primario inhibe el crecimiento de un tumor secundario o una metástasis distal al tumor primario tratado con la radiación.

Description

DESCRIPCIÓN
Terapia de combinación para el cáncer
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a una terapia de combinación para el tratamiento del cáncer, particularmente a una combinación de (i) una molécula bifuncional que comprende un TGFpRII o un fragmento del mismo capaz de unirse a TGFp y un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a una proteína de punto de control inmunitario, tal como el ligando 1 de muerte programada (PD-L1, del inglés "Programmed Death Ligand 1") y (ii) radiación. En determinadas realizaciones de la invención, la terapia de combinación proporciona un efecto antineoplásico sinérgico.
Antecedentes
En el tratamiento del cáncer, se ha reconocido desde hace mucho tiempo que la quimioterapia se asocia a una alta toxicidad y puede conducir a la aparición de variantes de células cancerosas resistentes. La mayoría de los agentes antineoplásicos provocan efectos secundarios indeseables que incluyen toxicidad cardíaca y renal, alopecia, náuseas y vómitos. La radioterapia también se utiliza en el tratamiento del cáncer. Dicho tratamiento utiliza partículas u ondas de alta energía, tales como rayos x, rayos gamma, haces de electrones o protones, para destruir o dañar las células cancerosas. A diferencia de la quimioterapia, que expone todo el cuerpo a medicamentos que combaten el cáncer, la radioterapia es más bien un tratamiento local. Sin embargo, es difícil administrar de manera selectiva radiación terapéutica solo al tejido anormal y, por lo tanto, el tejido normal cercano al tejido anormal también está expuesto a dosis de radiación potencialmente dañinas durante el tratamiento.
La inmunoterapia contra el cáncer es un nuevo paradigma en el tratamiento del cáncer que, en lugar de dirigirse a las células cancerosas, se centra en la activación del sistema inmunitario. Su principio es rearmar la respuesta inmunitaria del hospedador, especialmente la respuesta adaptativa de los linfocitos T, para proporcionar vigilancia inmunitaria para destruir a las células cancerosas, en particular, la enfermedad mínima residual que ha escapado a otras formas de tratamiento, logrando así una inmunidad protectora duradera.
La aprobación de la FDA del anticuerpo anti-CTLA-4 ipilimumab para el tratamiento del melanoma en 2011 marcó el comienzo de una nueva era de inmunoterapia contra el cáncer. La demostración de que la terapia anti-PD-1 o anti-PD-L1 indujo respuestas duraderas en el melanoma, el riñón y el cáncer de pulmón en ensayos clínicos significa aún más su mayoría de edad (Pardoll, D.M., Nat Immunol. 2012; 13:1129-32). Sin embargo, la terapia con ipilimumab está limitada por su perfil de toxicidad, presumiblemente porque el tratamiento anti-CTLA-4, interfiriendo con el punto de control inhibidor de linfocitos T primarios, puede conducir a la generación de nuevos linfocitos T autorreactivos. Si bien la inhibición de la interacción PD-L1/PD-1 da como resultado la desinhibición de las respuestas inmunitarias crónicas existentes en los linfocitos T agotados que son en su mayoría de naturaleza antivírica o anticancerígena (Wherry, E. J., Nat Immunol. 2011; 12:492-9), la terapia anti-PD-1, no obstante, a veces puede dar como resultado eventos adversos autoinmunes relacionados con los pulmones potencialmente letales. Otro enfoque es dirigir de manera conjunta TGFp y PD_L1 con la proteína de fusión anti PD-L1/Trampa de TGFp que consiste en un TGFpRIl humano y un anticuerpo anti PD-L1 humano, que se demostró en el documento WO 2015/118175 que da como resultado una inhibición sinérgica del tumor en comparación con la administración separada de las dos proteínas. A pesar de las prometedoras actividades clínicas de anti-PD1 y anti-PD-L1 hasta ahora, aumentar el índice terapéutico, ya sea aumentando la actividad terapéutica o disminuyendo la toxicidad, o ambos, sigue siendo un objetivo central en el desarrollo de agentes inmunoterapéuticos.
Sumario de la invención
La presente invención se basa en el descubrimiento de una terapia de combinación para el cáncer que incluye la administración de una proteína bifuncional que contiene al menos una porción del receptor II de TGFp (TGFpRIl) que es capaz de unirse a TGFp y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, que se une a una proteína de punto de control inmunitario tal como la proteína humana ligando 1 de muerte programada (PD-L1). La terapia de combinación también incluye la administración de un agente terapéutico contra el cáncer tal como, por ejemplo, radiación, agentes antineoplásicos, un producto biológico y/o una vacuna. La terapia de combinación muestra un efecto sinérgico en comparación con el efecto de administrar los agentes individuales por separado. La invención se define en las reivindicaciones expuestas en el presente documento.
La divulgación presenta un método para tratar el cáncer en un sujeto que incluye (i) la administración de una proteína bifuncional que comprende un TGFpRII humano, o un fragmento del mismo capaz de unirse a TGFp (por ejemplo, un fragmento soluble), y un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a PD-L1 (por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento); y (ii) la administración de al menos un segundo agente terapéutico antineoplásico adicional.
En cierta divulgación en el presente documento, el método de tratamiento combinado de la divulgación presenta el uso de un polipéptido que incluye (a) al menos un dominio variable de una cadena pesada de un anticuerpo que se une a PD-L1 (por ejemplo, los aminoácidos 1-120 del SEQ ID NO:2); y (b) TGFpRII humano, o un fragmento soluble del mismo capaz de unirse a TGFp (por ejemplo, un dominio extracelular (DEC) de TGFpRIl humano, los aminoácidos 24-159 del SEQ ID NO: 9, o cualquiera de los descritos en el presente documento) en combinación con al menos un agente terapéutico antineoplásico adicional. El polipéptido puede incluir además un enlazador de aminoácidos que conecta el extremo C-terminal del dominio variable al extremo N-terminal del TGFpRIl humano o un fragmento soluble del mismo capaz de unirse al TGFp. El polipéptido puede incluir la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica al SEQ ID NO: 3. El fragmento de inmunoglobulina puede ser un fragmento scFv, Fab, F(ab')2 o Fv.
En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o el polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye el SEQ ID NO: 2 y TGFpRII humano. El anticuerpo puede incluir opcionalmente una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).
En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye el SEQ ID NO: 2 y un fragmento de TGFpRII humano capaz de unirse a TGFp (por ejemplo, un fragmento soluble). El anticuerpo puede incluir opcionalmente una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ iD NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).
En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o el polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye el SEQ ID NO: 2 y un DEC de TGFpRII humano. El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).
En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o el polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye los aminoácidos 1-120 del SEQ ID NO: 2 y TGFpRII humano. El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).
En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye los aminoácidos 1-120 del s Eq ID NO: 2 y un fragmento de TGFpRII humano capaz de unirse a TGFp (por ejemplo, un fragmento soluble). El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ iD NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).
En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o el polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye los aminoácidos 1-120 del s Eq ID NO: 2 y un DEC de TGFpRII humano. El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).
En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o el polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye las regiones hipervariables presentes en el SEQ ID NO: 2 y TGFpRII humano. El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).
En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye las regiones hipervariables presentes en el SEQ ID NO: 2 y un fragmento de TGFpRII humano capaz de unirse a TGFp (por ejemplo, un fragmento soluble). El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).
En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o el polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye las regiones hipervariables presentes en el SEQ ID NO: 2 y un DEC de TGFpRII humano. El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).
En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o el polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye el SEQ ID NO: 12 y TGFpRII humano. El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).
En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye el SEQ ID NO: 12 y un fragmento de TGFpRII humano capaz de unirse a TGFp (por ejemplo, un fragmento soluble). El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).
En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o el polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye el SEQ ID NO: 12 y un DEC de TGFpRII humano. El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).
En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o el polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye las regiones hipervariables presentes en el SEQ ID NO: 12 y TGFpRII humano. El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).
En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye las regiones hipervariables presentes en el SEQ ID NO: 12 y un fragmento de TGFpRII humano capaz de unirse a TGFp (por ejemplo, un fragmento soluble). El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).
En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o el polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye las regiones hipervariables presentes en el SEQ ID NO: 12 y un DEC de TGFpRII humano. El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).
En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o el polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye el SEQ ID NO: 14 y TGFpRII humano. El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).
En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye el SEQ ID NO: 14 y un fragmento de TGFpRII humano capaz de unirse a TGFp (por ejemplo, un fragmento soluble). El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de IgG2).
En cierta divulgación en el presente documento, la proteína o el polipéptido incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye el SEQ ID NO: 14 y un DEC de TGFpRII humano. El anticuerpo puede incluir una región constante modificada (por ejemplo, cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo una sustitución Lys ^ Ala en C-terminal, una mutación de la secuencia Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) a Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20), o una región constante híbrida que incluye una región de bisagra de IgG1 y un dominio CH2 de igG2).
La divulgación también proporciona el uso, en la terapia de combinación de la divulgación, una proteína que incluye el polipéptido descrito anteriormente y al menos un dominio variable de una cadena ligera de un anticuerpo que, cuando se combina con el polipéptido, forma un sitio de unión a antígeno que se une a PD-L1. La proteína puede incluir (a) dos polipéptidos, cada uno con una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 3, y (b) dos polipéptidos adicionales, cada uno con una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1.
La divulgación presenta una terapia de combinación para el tratamiento del cáncer que comprende la administración de una proteína descrita anteriormente, en combinación con la administración de uno o más agentes terapéuticos antineoplásicos adicionales para su uso en el tratamiento del cáncer o para su uso en la inhibición del crecimiento tumoral. El uno o más agentes terapéuticos antineoplásicos adicionales incluyen radiación, un agente antineoplásico, un producto biológico y/o una vacuna.
El cáncer o el tumor se pueden seleccionar del grupo que consiste en colorrectal, de mama, de ovario, de páncreas, gástrico, de próstata, riñón, de cuello del útero, mieloma, linfoma, leucemia, de tiroides, endometrial, de útero, de vejiga, neuroendocrino, de cabeza y cuello, de hígado, nasofaríngeo, testicular, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, melanoma, cáncer de piel de células basales, cáncer de piel de células escamosas, dermatofibrosarcoma protuberans, carcinoma de células de Merkel, glioblastoma, glioma, sarcoma, mesotelioma y síndromes mielodisplásicos.
La divulgación también presenta una terapia de combinación para inhibir el crecimiento de tumores o tratar el cáncer. El método incluye exponer el tumor a una proteína descrita anteriormente. El método incluye además la exposición del tumor a radiación y/o la administración de un quimioterápico, un producto biológico o una vacuna. En cierta divulgación en el presente documento, el tumor o cáncer se selecciona del grupo que consiste en colorrectal, de mama, de ovario, de páncreas, gástrico, de próstata, riñón, de cuello del útero, mieloma, linfoma, leucemia, de tiroides, endometrial, de útero, de vejiga, neuroendocrino, de cabeza y cuello, de hígado, nasofaríngeo, testicular, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, melanoma, cáncer de piel de células basales, cáncer de piel de células escamosas, dermatofibrosarcoma protuberans, carcinoma de células de Merkel, glioblastoma, glioma, sarcoma, mesotelioma y síndromes mielodisplásicos.
Por "TGFpRII" o "Receptor II de TGFp" se entiende un polipéptido que tiene la secuencia de la isoforma A del receptor TGFp de tipo 2 humano de tipo silvestre (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la secuencia de referencia (RefSeq) del NCBI de N.° de registro NP_001020018 (SEQ ID NO: 8)), o un polipéptido que tiene la secuencia de la isoforma B del receptor de TGFp de tipo 2 humano de tipo silvestre (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de RefSeq del NCBI de N.° de registro NP_003233 (SEQ ID No : 9)) o que tiene una secuencia sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o de SEQ ID NO: 9. El TGFpRII puede conservar al menos un 0,1 %, un 0,5 %, un 1 %, un 5 %, un 10 %, un 25 %, un 35 %, un 50 %, un 75 %, un 90 %, un 95 % o un 99 % de la actividad de unión a TGFp de la secuencia de tipo silvestre. El polipéptido del TGFpRII expresado carece de la secuencia señal.
Por un "fragmento de TGFpRII capaz de unirse a TGFp" se entiende cualquier porción de la RefSeq del NCBI de N.° de registro NP_001020018 (SEQ ID NO: 8) o de la RefSeq del NCBI de N.° de registro NP_003233 (SEQ ID NO: 9), o una secuencia sustancialmente idéntica al SEQ ID NO: 8 o el SEQ ID NO: 9 que es de al menos 20 (por ejemplo, al menos 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 175 o 200) aminoácidos de longitud que conserva al menos parte de la actividad de unión a TGFp (por ejemplo, al menos un 0,1 %, un 0,5 %, un 1 %, un 5 %, un 10 %, un 25 %, un 35 %, un 50 %, un 75 %, un 90 %, un 95 % o un 99 %) del receptor de tipo silvestre o del fragmento de tipo silvestre correspondiente. Normalmente, tal fragmento es un fragmento soluble. Un ejemplo de tal fragmento es un dominio extracelular de TGFpRII que tiene la secuencia del SEQ ID NO: 10.
Por "sustancialmente idéntico" se entiende un polipéptido que presenta al menos un 50 %, deseablemente un 60 %, un 70 %, un 75 % o un 80 %, más deseablemente un 85 %, un 90 % o un 95 %, y lo más deseablemente un 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia. La longitud de las secuencias de comparación será generalmente de al menos 10 aminoácidos, deseablemente al menos 15 aminoácidos contiguos, más deseablemente al menos 20, 25, 50, 75, 90, 100, 150, 200, 250, 300 o 350 aminoácidos contiguos, y más deseablemente la secuencia de aminoácidos de longitud completa.
Por "paciente" se entiende un animal humano o no humano (por ejemplo, un mamífero).
Por "tratar" una enfermedad, trastorno o afección (por ejemplo, un cáncer) en un paciente se entiende reducir al menos un síntoma de la enfermedad, trastorno o afección mediante la administración de un agente terapéutico al paciente.
Por "cáncer" se entiende una colección de células que se multiplican de manera anómala.
Otras realizaciones y detalles de la invención se presentan a continuación en el presente documento.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 es un dibujo esquemático de una molécula de anti-PD-LI/trampa de TGFp que comprende un anticuerpo anti-PD-LI fusionado a dos dominios extracelulares (DEC) del receptor II de TGFp a través de un enlazador (Gly4Ser)4Gly.
La FIG. 2 es una tabla que resume el diseño del estudio para el estudio "TI13-027: Combinación de anti-PD-L1/Trampa de TGFp con 5-FU y terapia con oxaliplatino en el modelo de tumor MC38 en ratones C57B/L6 de tipo silvestre" donde el grupo y el tratamiento es N = 10 ratones/grupo.
La FIG. 3 es una tabla que resume el diseño del estudio para el estudio "TI14-012: Combinación de anti-PD-L1/Trampa de TGFp con 5-FU y terapia con oxaliplatino en el modelo de tumor MC38 en ratones con deficiencia de linfocito B" donde el grupo y el tratamiento es N = 10 ratones/grupo.
Las FIG. 4A a 4D son una serie de gráficos que muestran que la combinación de oxaliplatino/5-FU y anti-PD-LI/trampa de TGFp mejora la inhibición del crecimiento tumoral y las respuestas de los linfocitos T CD8+ reactivos a tumores (Ratones C57BL/6; Estudio TI13-027). FIG. 4A y FIG. 4D. Los volúmenes del tumor se midieron dos veces por semana durante todo el período de estudio. Los datos del volumen tumoral se transformaron de manera logarítmica y se realizó un ANOVA de medidas repetidas bidireccional. FIG. 4B. Los datos de peso tumoral se evaluaron con ANOVA unidireccional. FIG. 4C. La frecuencia de linfocitos T CD8+ específicos de P15E productores de IFN-y se cuantificaron mediante un ensayo ELISpot. Los datos de ELISpot se evaluaron mediante ANOVA unidireccional. Todos los ANOVA incluyeron la corrección de Tukey para comparaciones múltiples para medir las diferencias estadísticas entre los grupos de tratamiento. Se determinó que p <0,05 era estadísticamente significativo.
Las FIG. 5A a 5D son una serie de gráficos que muestran que la combinación de oxaliplatino/5-FU y anti-PD-LI/trampa de TGFp mejora la inhibición del crecimiento tumoral y las repuestas de los linfocitos T CD8+ reactivos a tumores (Ratones B6.129S2-Ighmtm1Cg7J; Estudio TI14-012). Figuras 5A y 4D. Los datos del volumen tumoral se transformaron de manera logarítmica y se realizó un ANOVA de medidas repetidas bidireccional. FIG. 5B). Los datos de peso tumoral se evaluaron con ANOVA unidireccional. FIG. 5C. La frecuencia de linfocitos T CD8+ específicos de P15E productores de IFN-y se cuantificaron mediante un ensayo ELISpot. Los datos de ELISpot se evaluaron mediante ANOVA unidireccional. Todos los ANOVA incluyeron la corrección de Tukey para comparaciones múltiples para medir las diferencias estadísticas entre los grupos de tratamiento. Se determinó que p <0,05 era estadísticamente significativo.
Las FIG. 6A a 6C son una serie de gráficos que muestran que la radiación y anti-PD-LI/trampa de TGFp inducen una sinergia en la inhibición del crecimiento tumoral y las respuestas de los linfocitos T CD8+ reactivos a tumores (Tl13-109). FIG. 6A. Los volúmenes tumorales se midieron dos veces por semana y los volúmenes tumorales medios se presentaron como la media ± error estándar de la media (EEM). FIG. 6 B. Los datos de peso tumoral se determinaron el día 14. FIG. 6C. La frecuencia de linfocitos T CD8+ específicos de P15E productores de IFN-y se cuantificaron mediante un ensayo ELISpot el día 14. Los datos de anti-PD-L1/Trampa de TGFp al nivel de dosis de 164 |jg fueron similares a los datos al nivel de dosis de 55 |jg, ya sea como monoterapia o en combinación. Las FIG. 7A a 7C son una serie de gráficos que muestran que la radiación y anti-PD-L1/trampa de TGFp inducen una sinergia en la inhibición del crecimiento tumoral y las respuestas de los linfocitos T CD8+ reactivos a tumores (estudio repetido) (TI14-013). FIG. 7A. Los volúmenes tumorales se midieron dos veces por semana y los volúmenes tumorales medios se presentaron como la media ± error estándar de la media (EEM). FIG. 7B. Los pesos tumorales se evaluaron el día 14. FIG. 7C. La frecuencia de linfocitos T CD8+ específicos de P15E productores de IFN-y se cuantificaron mediante un ensayo ELISpot el día 14.
Las FIG.8A a 8D son una serie de gráficos que muestran que la radiación y anti-PD-L1/trampa de TGFp promueven las células NK y los linfocitos T CD8+ infiltrantes de tumores (TI14-013). FiG. 8A. TIL CD8+ infiltrantes de tumores. FIG. 8B. TIL NK1.1 infiltrantes de tumores. FIG. 8C. Expresión de EOMES en TIL CD8+. FIG. 8D. Desgranulación de TIL CD8+.
La FIG. 9A es un diagrama esquemático que muestra la administración de radiación en un ratón portador de un tumor primario y secundario para analizar un efecto abscópico.
La FIG. 9B es un gráfico de líneas que muestra el volumen del tumor primario en ratones en los días transcurridos desde el inicio del tratamiento.
La FIG. 9C es un gráfico de líneas que muestra el volumen del tumor secundario (mm3) en ratones en los días transcurridos desde el inicio del tratamiento. ( • = Control con isotipo 400 jg ; ♦ = Anti-PDL1-Trampa de TGFp jg ;
■ = Radiación 500 rad; ▼ = Radiación Anti-PDL1-Trampa de TGFp).
Descripción detallada
La presente divulgación se refiere en general a una terapia de combinación para el tratamiento del cáncer, particularmente a una combinación de (i) una molécula bifuncional que comprende un TGFpRIl o un fragmento del mismo capaz de unirse a TGFp y un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a una proteína de punto de control inmunitario, tal como el ligando 1 de muerte programada (PD-L1) y (ii) al menos un agente terapéutico antineoplásico adicional. Dichos agentes terapéuticos antineoplásicos incluyen, por ejemplo, radiación, agentes antineoplásicos, un producto biológico y/o una vacuna. En cierta divulgación en el presente documento, la terapia de combinación proporciona un efecto antineoplásico sinérgico.
La terapia de combinación de la divulgación es particularmente ventajosa, ya que no solo se potencia el efecto antineoplásico en comparación con el efecto de cada agente por separado, sino que la dosis de uno o más agentes en una terapia de combinación se puede reducir en comparación con la monoterapia con cada agente, sin dejar de lograr un efecto antineoplásico general. Debido al efecto sinérgico, la cantidad total de fármacos administrados a un paciente se puede reducir de manera ventajosa, lo que da como resultado una disminución de los efectos secundarios.
La terapia de combinación de la divulgación permite la reducción localizada de TGFp en un microambiente tumoral mediante la captura del TGFp usando un receptor de citocina soluble (TGFpRIl) anclado a un resto de anticuerpo dirigido a un receptor de punto de control inmunitario celular que se encuentra en la superficie exterior de determinadas células tumorales o células inmunitarias. Un ejemplo de un resto de anticuerpo de la divulgación para una proteína de punto de control inmunitario es anti-PD-LI. Esta molécula bifuncional, a veces citada en el presente documento como una "trampa de anticuerpos-citocinas", es eficaz precisamente porque el anticuerpo anti-receptor y la trampa de citocinas están físicamente unidos. La ventaja resultante (sobre, por ejemplo, administración del anticuerpo y el receptor como moléculas separadas) se debe en parte a que las citocinas funcionan predominantemente en el entorno local a través de funciones autocrinas y paracrinas. El resto del anticuerpo dirige la trampa de citocinas al microambiente del tumor donde puede ser más eficaz, neutralizando los efectos inmunosupresores locales autocrinos o paracrinos. Además, en los casos en los que la diana del anticuerpo se internaliza tras la unión del anticuerpo, se proporciona un mecanismo eficaz para la eliminación del complejo citocina/receptor de citocina. Se ha demostrado la internalización de la diana mediada por anticuerpos para PD-L1. Esta es una clara ventaja sobre el uso de un anticuerpo anti-TGFp porque primero, un anticuerpo anti-TGFp podría no ser completamente neutralizante; y en segundo lugar, el anticuerpo puede actuar como un vehículo prolongando la semivida de la citocina, y los complejos de anticuerpo/citocina a menudo actúan como un sumidero en circulación que se acumula y finalmente se disocia para liberar la citocina de regreso a la circulación (Montero-Julian et al., Blood. 1995; 85:917-24). El uso de una trampa de citocinas para neutralizar el ligando también puede ser una mejor estrategia que bloquear el receptor con un anticuerpo, como en el caso de CSF-1. Debido a que el CSF-1 se elimina de la circulación por endocitosis mediada por receptores, un bloqueo de anticuerpos anti-receptor de CSF-1 provocó un aumento significativo en la concentración de CSF-1 en circulación (Hume et al., Blood. 2012;119:1810-20)
Como se describe a continuación, el tratamiento con el anti-PD-L1/Trampa de TGFp, en combinación con al menos otro tratamiento contra el cáncer, provoca un efecto antitumoral sinérgico debido al bloqueo simultáneo de la interacción entre PD-L1 en las células tumorales y PD-1 en las células inmunitarias, la neutralización de TGFp en el microambiente tumoral y el efecto terapéutico del agente antineoplásico. Sin quedar limitados por la teoría, esto presumiblemente se debe a un efecto sinérgico obtenido del bloqueo simultáneo de los dos principales mecanismos de escape inmunitario y, además, el agotamiento dirigido del TGFp en el microambiente tumoral por una sola entidad molecular, así como el efecto antitumoral de los agentes antineoplásicos adicionales. Este agotamiento se logra mediante (1) el direccionamiento anti-PD-L1 de las células tumorales; (2) la unión del TGFp autocrino/paracrino en el microambiente tumoral por la Trampa de TGFp; y (3) destrucción del TGFp unido a través de la endocitosis mediada por el receptor PD-L1. Los mecanismos de acción antes mencionados no se pueden lograr mediante la terapia de combinación de solo el agente anti-PD-L1, una trampa TGFp y tratamientos contra el cáncer adicionales. Además, el TGFpRIl fusionado al extremo C-terminal de Fc (fragmento de cristalización de IgG) fue varias veces más potente que el TGFpRII-Fc que coloca al TGFpRIl en el extremo N-terminal de Fc. La excelente eficacia obtenida con anti-PDL1/trampa de TGFp también disipa algunas preocupaciones de que el TGFpRIl no atrapa al TGFp2. Como señalaron Yang et al., Trends Immunol. 2010; 31:220-227, aunque algunos tipos de tumores secretan TGFp2 inicialmente, a medida que avanza el tumor, el TGFp en el microambiente tumoral es secretado predominantemente por células supresoras derivadas del mieloide, que secretan TGFp1. Además de ser muy prometedor como agente terapéutico inmunooncológico eficaz, el tratamiento con TGFpRII soluble puede reducir potencialmente los problemas de cardiotoxicidad de las terapias dirigidas al TGFp, especialmente los inhibidores de la cinasa TGFpRI. Esto se debe al importante papel que juega el TGFp2 en el desarrollo embrionario del corazón, así como en la reparación del daño miocárdico después de una lesión por isquemia y reperfusión (Roberts et al., J Clin Invest. 1992; 90:2056-62).
TGFB como diana del cáncer
El TGFp había sido una diana algo cuestionable en la inmunoterapia contra el cáncer debido a sus papeles paradójicos como Jekyll y Hyde moleculares del cáncer (Bierie et al., Nat Rev Cancer. 2006; 6:506-20). Como algunas otras citocinas, la actividad de TGFp depende de la etapa de desarrollo y del contexto. De hecho, el TGFp puede actuar como promotor de tumores o supresor de tumores, afectando a la iniciación del tumor, a la progresión y a la metástasis. Los mecanismos que subyacen a esta función doble del TGFp siguen sin estar claros (Yang et al., Trends Immunol.
2010; 31:220-227). Aunque se ha postulado que la señalización dependiente de Smad media la inhibición del crecimiento de la señalización de TGFp, mientras que las vías independientes de Smad contribuyen a su efecto promotor de tumores, también hay datos que muestran que las vías dependientes de Smad están implicadas en la progresión tumoral (Yang et al., Cancer Res. 2008; 68:9107-11).
Tanto el ligando de TGFp como el receptor se han estudiado intensamente como dianas terapéuticas. Hay tres isoformas de ligando, TGFp1, 2 y 3, todas las cuales existen como homodímeros. También hay tres receptores de TGFp (TGFpR), que se denominan TGFpR tipo I, II y III (López-Casillas et al., J Cell Biol. 1994; 124:557-68). TGFpRI es la cadena de señalización y no puede unirse al ligando. TGFpRII se une al ligando TGFp1 y 3, pero no a TGFp2, con alta afinidad. El complejo TGFpRII/TGFp recluta TGFpRI para formar el complejo de señalización (Won et al., Cáncer Res. 1999; 59:1273-7). TGFpRIII es un regulador positivo de la unión de TGFp a sus receptores de señalización y une las 3 isotermas de TGFp con alta afinidad. En la superficie celular, el complejo TGFp/TGFpRIII se une a TGFpRIl y luego recluta TGFpRI, que desplaza a TGFpRIII para formar el complejo de señalización.
Aunque las tres isotermas de TGFp diferentes envían señales a través del mismo receptor, se sabe que tienen patrones de expresión diferencial y funciones que no se superponen in vivo. Los tres ratones con inactivación de la isoterma de TGF-p diferentes tienen fenotipos distintos, lo que indica numerosas funciones no compensadas (Bujak et al., Cardiovasc Res. 2007; 74:184-95). Mientras que los ratones sin TGFpl tienen defectos de hematopoyesis y vasculogénesis y los ratones sin TGFp3 muestran desarrollo pulmonar y palatogénesis defectuosa, los ratones sin TGFp2 muestran diversas anomalías del desarrollo, siendo las más prominentes, las deformidades cardíacas múltiples (Bartram et al., Circulation. 2001; 103:2745-52; Yamagishi et al., Anat Rec. 2012; 295:257-67). Además, El TGFp está implicado para desempeñar un papel importante en la reparación del daño miocárdico después de la lesión por isquemia y reperfusión. En un corazón adulto, los cardiomiocitos secretan TGFp, que actúa como un autocrino para mantener la frecuencia de latidos espontáneos. Notablemente, el 70-85 % del TGFp secretado por cardiomiocitos es TGFp2 (Roberts et al., J Clin Invest. 1992; 90:2056-62). En resumen, dados los roles predominantes de TGFp1 y TGFp2 en el microambiente tumoral y la fisiología cardíaca, respectivamente, un agente terapéutico que neutraliza TGFp1 pero no TGFp2 podría proporcionar un índice terapéutico óptimo minimizando la cardiotoxicidad sin comprometer la actividad antitumoral. Esto es consistente con los hallazgos de los presentes inventores, que observaron una falta de toxicidad, incluyendo cardiotoxicidad, para anti-PD-L1/trampa de TGFp en monos.
Los enfoques terapéuticos para neutralizar TGFp incluyen el uso de los dominios extracelulares de los receptores de TGFp como trampas de receptores solubles y anticuerpos neutralizantes. Del enfoque de la trampa del receptor, el TGFpRIII soluble puede parecer la opción obvia ya que se une a los tres ligandos de TGFp. Sin embargo, TGFpRIII, que se produce naturalmente como glucosaminoglicano (GAG)-glucoproteína de 280-330 kD, con dominio extracelular de 762 restos de aminoácidos, es una proteína muy compleja para el desarrollo bioterapéutico. El TGFpRIII soluble desprovisto de GAG podría producirse en células de insectos y se demostró que es un potente agente neutralizante de TGFp (Vilchis-Landeros et al, Biochem J 355:215, 2001). Los dos dominios de unión separados (el relacionado con la endoglina y el relacionado con la uromodulina) de TGFpRIII podrían expresarse de forma independiente, pero se demostró que tenían afinidades de 20 a 100 veces menores que las del TGFpRIII soluble y una actividad neutralizante muy disminuida (Mendoza et al., Biochemistry. 2009; 48:11755-65). Por otra parte, el dominio extracelular de TGFpRII tiene solo 136 restos de aminoácidos de longitud y se puede producir como una proteína glucosilada de 25-35 kD. Se demostró además que el TGFpRII soluble recombinante se une al TGFp1 con una Kd de 200 pM, que es bastante similar a la Kd de 50 pM para el TGFpRII de longitud completa en las células (Lin et al., J Biol Chem. 1995; 270:2747-54). Se probó el TGFpRII-Fc soluble como agente antineoplásico y se demostró que inhibe el crecimiento de mesotelioma maligna murina establecido en un modelo tumoral (Suzuki et al., Clin Cancer Res. 2004; 10:5907-18). Dado que TGFpRII no se une a TGFp2, y TGFpRIII se une a TGFp1 y 3 con menor afinidad que TGFpRII, se produjo una proteína de fusión del dominio de endoglina de TGFpRIII y el dominio extracelular de TGFpRII en bacterias y se demostró que inhibe la señalización de TGFp1 y 2 en ensayos basados en células de manera más eficaz que TGFpRII o RIII (Verona et al., Protein Eng Des Sel. 2008; 21:463-73). A pesar de algunas actividades antitumorales alentadoras en modelos tumorales, hasta donde saben los presentes inventores, no se ha probado en la clínica ninguna proteína recombinante de trampa de receptor de TGFp.
Otro enfoque más para neutralizar las tres isoformas de los ligandos de TGFp es seleccionar un anticuerpo anti-TGFp panneutralizante, o un anticuerpo anti-receptor que bloquea la unión del receptor a TGFp1, 2 y 3. GC1008, un anticuerpo humano específico para todas las isoformas de TGFp, estaba en un estudio de fase I/II en pacientes con melanoma maligno avanzado o carcinoma de células renales (Morris et al., J Clin Oncol 2008; 26:9028 (Resumen de reunión)). Aunque se descubrió que el tratamiento era seguro y bien tolerado, solo se observó una eficacia clínica limitada y, por lo tanto, fue difícil interpretar la importancia de la terapia anti-TGFp sin una caracterización adicional de los efectos inmunológicos (Flavell et al., Nat Rev Immunol. 2010; 10:554-67). También se probaron en la clínica anticuerpos específicos de isoforma de TGFp. Metelimumab, un anticuerpo específico para TGFp1, se probó en un ensayo clínico de fase 2 como tratamiento para prevenir la cicatrización posoperatoria excesiva de la cirugía de glaucoma; y Lerdelimumab, un anticuerpo específico para TGFp2, se descubrió que era seguro pero ineficaz para mejorar las cicatrices después de la cirugía ocular en un estudio de fase 3 (Khaw et al., Ophthalmology 2007; 114:1822-1830). Los anticuerpos anti-TGFpRII que bloquean la unión del receptor a las tres isoformas de TGFp, tales como el anticuerpo anti-TGFpRII humano TR1 y el anticuerpo anti-TGFpRII de ratón MT1, también han demostrado cierta eficacia terapéutica contra el crecimiento de tumores primarios y la metástasis en modelos de ratón (Zhong et al., Clin Cancer Res. 2010; 16:1191-205). Hasta la fecha, la gran mayoría de los estudios sobre el tratamiento contra el cáncer dirigido a TGFp, incluidos los inhibidores de moléculas pequeñas de la señalización de TGFp que a menudo son bastante tóxicos, se encuentran mayoritariamente en fase preclínica y la eficacia antitumoral obtenida ha sido limitada (Calone et al., Exp Oncol. 2012; 34:9-16; Connolly et al., Int J Biol Sci. 2012; 8:964-78).
El anticuerpo-trampa de TGFp de la divulgación, para su uso en la terapia de combinación de la divulgación, es una proteína bifuncional que contiene al menos una porción de un receptor II de TGFp humano (TGFpRII) que es capaz de unirse a TGFp. En alguna divulgación, el polipéptido de trampa de TGFp es una porción soluble de la isoforma A del receptor de TGFp de tipo 2 humano (SEQ ID NO: 8) que es capaz de unirse a TGFp. En una divulgación adicional, el polipéptido de trampa de TGFp contiene al menos los aminoácidos 73 a 184 del SEQ ID NO: 8. En otra divulgación más, el polipéptido de trampa de TGFp contiene los aminoácidos 24 a 184 del SEQ ID NO: 8. En otra divulgación, el polipéptido de trampa de TGFp es una porción soluble de la isoforma B del receptor de TGFp de tipo 2 humano (SEQ ID NO: 9) que es capaz de unirse a TGFp. En una divulgación adicional, el polipéptido de trampa de TGFp contiene al menos los aminoácidos 48 a 159 del SEQ ID NO: 9. En aún otra divulgación más, el polipéptido de trampa de TGFp contiene los aminoácidos 24 a 159 del SEQ ID NO: 9. En aún otra divulgación más, el polipéptido de trampa de TGFp contiene los aminoácidos 24 a 105 del SEQ ID NO: 9.
Desinhibición del punto de control inmunitario
El enfoque del direccionamiento de los puntos de control de inhibición de linfocitos T para la desinhibición con anticuerpos terapéuticos es un área de intensa investigación (para una revisión, véase Pardoll, Nat Rev Cancer. 2012; 12:253-264). En un enfoque, el resto de anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno se dirige a las proteínas receptoras del punto de control de inhibición de linfocitos T en el linfocito T, tal como, por ejemplo: CTLA-4, PD-1, BTLA, LAG-3, T iM-3 y LAIR1. En otro enfoque, el resto del anticuerpo se dirige a los contrarreceptores de las células presentadoras de antígenos y las células tumorales (que cooptan algunos de estos contrarreceptores para su propia evasión inmunitaria), tal como, por ejemplo: PD-L1 (B7-H1), B7-DC, HVEM, TIM-4, B7-H3 o B7-H4.
La divulgación contempla el uso de anticuerpos de trampas de TGFp que se dirigen a, a través de su resto de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, puntos de control de inhibición de linfocitos T para la desinhibición. Con ese fin, los presentes inventores han probado la eficacia antitumoral de combinar una trampa de TGFp con anticuerpos dirigidos a diversas proteínas receptoras del punto de control de inhibición de linfocitos T, tal como anti-PD-1, anti-PD-L1, anti-TIM-3 y anti-LAG3. Los presentes inventores descubrieron que la combinación de una trampa de TGFp con un anticuerpo anti-PD-L1 presentaba una actividad antitumoral notable más allá de lo observado con las monoterapias. En cambio, ninguna de las otras combinaciones con anticuerpos contra las dianas enumeradas anteriormente mostró una eficacia superior. En particular, se podría haber esperado que un tratamiento combinado de una trampa de TGFp con un anticuerpo anti-PD-1 demostraría una actividad similar a la observada con anti-PD-L1, ya que PD-1/PD-L1 son receptores afines que se unen entre sí para efectuar la inhibición del punto de control inmunitario. Sin embargo, esto no es lo que han descubierto los presentes inventores.
Anticuerpos anti-PD-L1
La divulgación puede incluir el uso de cualquier anticuerpo anti-PD-L1 o fragmento de unión a antígeno del mismo, descrito en la materia. Los anticuerpos anti-PD-L1 están disponibles comercialmente, por ejemplo, el anticuerpo 29E2A3 (Biolegend, n.° de cat. 329701). Los anticuerpos pueden ser monoclonales, quiméricos, humanizado o humano. Los fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, F(ab')2, fragmentos scFv y Fv, que se describen con más detalle a continuación.
Los anticuerpos ilustrativos se describen en la publicación PCT WO 2013/079174. Estos anticuerpos pueden incluir un polipéptido de región variable de cadena pesada que incluye una secuencia HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, en donde:
Figure imgf000009_0001
En alguna divulgación, X 1 es M, I o S; X2 es R, K, L, M o I; X3 es F o M; X4 es F o I; X5 es S o T; X6 es E o D.
En otra divulgación, X1 es M, I o S; X2 es L, M o I; X3 es F o M; X4 es I; X5 es S o T; X6 es D.
En otra divulgación más, X1 es S; X2 es I; X3 es M; X4 es I; X5 es T; X6 es D.
En otra divulgación, el polipéptido incluye además secuencias marco de cadena pesada de región variable yuxtapuestas entre los HVR de acuerdo con la fórmula: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4).
En otra divulgación más, las secuencias marco derivan de secuencias marco consenso humanas o secuencias marco de la línea germinal humana.
En un aspecto adicional más, al menos una de las secuencias marco es la siguiente:
HC-FR1 es EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS;
HC-FR2 es WVRQAPGKGLEWVS;
HC-FR3 es RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR;
HC-FR4 es WGQGTLVTVSS.
En aún una divulgación adicional, el polipéptido de cadena pesada se combina además con una cadena ligera de región variable que incluye una HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3, en donde:
(a) la secuencia de HVR-L1 es TGTX7X8DVGX9YNYVS;
(b) la secuencia de HVR-L2 es X10VX11X12RPS;
(c) la secuencia de HVR-L3 es SSX13TX14X15X16X17RV;
donde además: X7 es N o S; X8 es T, R o S; X9 es A o G; X10 es E o D; X11 es I, N o S; X12 es D, HorN; X13 es F o
Y; X14 es N o S; X15 es R, T o S; X16 es G o S; X17 es I o T.
En otra divulgación, X7 es N o S; X8 es T, R o S; X9 es A o G; X10 es E o D; X11 es N o S; X12 es N; X13 es F o Y; X14 es S; X15 es S; X16 es G o S; X17 es T.
En otra divulgación más,
Figure imgf000010_0001
3 es Y; X14 S; X17 es T.
En aún una divulgación adicional, la cadena ligera incluye además secuencias marco de cadena ligera de región variable yuxtapuestas entre los HVR de acuerdo con la fórmula: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4).
En aún una divulgación adicional, las secuencias marco de cadena ligera derivan de secuencias marco consenso humanas o secuencias marco de la línea germinal humana.
En aún una divulgación adicional, las secuencias marco de cadena ligera son secuencias de cadena ligera lambda.
En aún una divulgación adicional, al menos una de la secuencia marco es la siguiente:
LC-FR1 es QSALTQPASVSGSPGQSITISC;
LC-FR2 es WYQQHPGKAPKLMIY;
LC-FR3 es GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC;
LC-FR4 es FGTGTKVTVL.
Otra divulgación en el presente documento proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 o un fragmento de unión a antígeno que incluye una secuencia de región variable de cadena pesada y cadena ligera, en donde:
(a) la cadena pesada incluye una HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, donde, además: (i) la secuencia de HVR-H1 es X1YX2MX3; (ii) la secuencia de HVR-H2 es SIYPSGGX4TFYADX5VKG; (iii) la secuencia de HVR-H3 es IKLGTVTTVXaY, y;
(b) la cadena ligera incluye una HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3, donde, además: (iv) la secuencia de HVR-L1 es TGTX7X8DVGX9YNYVS; (v) la secuencia de HVR-L2 es X10VX11X12RPS; (vi) la secuencia de HVR-L3 es SSX13TX14X15X16X17RV; en donde: X1 es K, R, T, Q, G, A, W, M, I o S; X2 es V, R, K, L, M o I; X3 es H, T, N, Q, A, V, Y, W, F o M; X4 es F o I; X5 es S o T; X6 es E o D; X7 es N o S; Xa es T, R o S; X9 es A o G; X10 es E o D; X11 es I, N o S; X12 es D, H o N; X13 es F o Y; X14 es N o S; X15 es R, T o S; X16 es G o S; X17 es I o T.
En alguna divulgación del presente documento, X 1 es M, I o S; X2 es R, K, L, M o I; X3 es F o M; X4 es F o I; X5 es S o
T; X6 es E o D; X7 es N o S; Xa es T, R o S; X9 es A o G; X10 es E o D; X11 es N o S; X12 es N; X13 es F o Y; X14 es S;
X15 es S; X16 es G o S; X17 es T.
En otra divulgación, X 1 es M, I o S; X2 es L, M o I; X3 es F o M; X4 es I; X5 es S o T; X6 es D; X7 es N o S; Xa es T, R o
S; X9 es A o G; X10 es E o D; X11 es N o S; X12 es N; X13 es F o Y; X14 es S; X15 es S; X16 es G o S; X17 es T.
En otra divulgación más, X 1 es S; X2 es I; X3 es M; X4 es I; X5 es T; X6 es D; X7 es S; Xa es S; X9 es G; X10 es D; X11 es S; X12 es N; X13 es Y; X14 es S; X15 es S; X16 es S; X17 es T.
En una divulgación adicional, la región variable de cadena pesada incluye una o más secuencias marco yuxtapuestas entre las HVR como: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4) y las regiones variables de cadena ligera incluyen una o más secuencias marco yuxtapuestas entre las HVR como: (LC-FR1 MHVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4).
En aún una divulgación adicional, las secuencias marco derivan de secuencias marco consenso humanas o secuencias de la línea germinal humana.
En aún una divulgación adicional, una o más de las secuencias marco de la cadena pesada es la siguiente:
HC-FR1 es EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS;
HC-FR2 es WVRQAPGKGLEWVS;
HC-FR3 es RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR;
HC-FR4 es WGQGTLVTVSS.
En aún una divulgación adicional, las secuencias marco de cadena ligera son secuencias de cadena ligera lambda. En aún una divulgación adicional, una o más de las secuencias marco de la cadena ligera es la siguiente:
LC-FR1 es QSALTQPASVSGSPGQSITISC;
LC-FR2 es WYQQHPGKAPKLMIY;
LC-FR3 es GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC;
LC-FR4 es FGTGTKVTVL.
En aún una divulgación adicional, el polipéptido de la región variable de la cadena pesada, el anticuerpo, o el fragmento de anticuerpo incluye además al menos un dominio Ch1.
En una divulgación más específica, el polipéptido de la región variable de la cadena pesada, el anticuerpo, o el fragmento de anticuerpo además incluye un dominio Ch1, un Ch2 y un Ch3.
En aún una divulgación adicional, la cadena ligera de la región variable, el anticuerpo, o el fragmento de anticuerpo además incluye un dominio Cl.
En aún una divulgación adicional, el anticuerpo incluye además un dominio Ch1, uno Ch2, uno Ch3 y uno Cl.
En aún una divulgación más específica, el anticuerpo incluye además una región constante humana o murina.
En aún una divulgación adicional, la región constante humana se selecciona del grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG2, IgG3 e IgG4.
En aún una divulgación más específica, la región constante humana o murina es lgG1.
Otra divulgación en el presente documento presenta un anticuerpo anti-PD-L1 que incluye una secuencia de región variable de cadena pesada y cadena ligera, en donde:
(a) la cadena pesada incluye una HVR-H1, una HVR-H2 y una HVR-H3, que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia total con SYIMM, SIYPSGGITFYADTVKG, e IKLGTVTTVDY, respectivamente, y
(b) la cadena ligera incluye una HVR-L1, una HVR-L2 y una HVR-L3, que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia total con TGTSSDVGGYNYVS, DVSNRPS y SSYTSSSTRV, respectivamente.
En una divulgación específica, la identidad de secuencia es del 81 %, el 82 %, el 83 %, el 84 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 %.
Otra divulgación presenta un anticuerpo anti-PD-LI que incluye una secuencia de la región variable de cadena pesada y cadena ligera, en donde:
(a) la cadena pesada incluye una HVR-H1, una HVR-H2 y una HVR-H3, que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia total con MYMMM, SIYPSGGITFYADSVKG e IKLGTVTTVDY, respectivamente, y
(b) la cadena ligera incluye una HVR-L1, una HVR-L2 y una HVR-L3, que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia total con TGTSSDVGAYNYVS, DVSNRPS y SSYTSSSTRV, respectivamente.
En una divulgación específica, la identidad de secuencia es del 81 %, el 82 %, el 83 %, el 84 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 %.
En aún una divulgación adicional, en el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la divulgación, en comparación con las secuencias de HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, al menos los aminoácidos permanecen sin cambios que se destacan subrayando lo siguiente:
(a) en HVR-H1 SYIMM,
(b) en HVR-H2 SIYPSGGITFYADTVKG,
(c) en HVR-H3 IKLGTVTTVDY;
y además, donde, en comparación con las secuencias de HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3, al menos los aminoácidos permanecen sin cambios que se destacan subrayando lo siguiente:
(a) HVR-L1 TGTSSDVGGYNYVS
(b) HVR-L2 DVSNRPS
(c) HVR-L3 SSYTSSSTRV.
En otra divulgación, la región variable de cadena pesada incluye una o más secuencias marco yuxtapuestas entre las HVR como: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4) y las regiones variables de cadena ligera incluyen una o más secuencias marco yuxtapuestas entre las HVR como: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4).
En aún otra divulgación, las secuencias marco provienen de secuencias de la línea germinal humana.
En aún una divulgación adicional, una o más de las secuencias marco de la cadena pesada es la siguiente:
HC-FR1 es EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS;
HC-FR2 es WVRQAPGKGLEWVS;
HC-FR3 es RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR;
HC-FR4 es WGQGTLVTVSS.
En aún una divulgación adicional, las secuencias marco de cadena ligera provienen de una secuencia de cadena ligera lambda.
En aún una divulgación adicional, una o más de las secuencias marco de la cadena ligera es la siguiente:
LC-FR1 es QSALTQPASVSGSPGQSITISC;
LC-FR2 es WYQQHPGKAPKLMIY;
LC-FR3 es GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC;
LC-FR4 es FGTGTKVTVL.
En aún una divulgación más específica, el anticuerpo incluye además una región constante humana o murina.
En aún una divulgación adicional, la región constante humana se selecciona del grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG2, IgG3 e IgG4.
Aún otra divulgación más presenta un anticuerpo anti-PD-L1 que incluye una secuencia de la región variable de cadena pesada y cadena ligera, en donde:
(a) la secuencia de cadena pesada tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de cadena pesada: EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMVWRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITF YADWKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLV TVSS, y
(b) la secuencia de cadena ligera tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de cadena ligera:
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSN
RP S GV SNRF S GSK SGNT ASLTIS GLQ AEDE AD Y Y C S S YT S S S TRVF GT GTK VT VL.
En una divulgación específica, la identidad de secuencia es del 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 %.
Aún otra divulgación más proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 que incluye una secuencia de la región variable de cadena pesada y cadena ligera, en donde:
(a) la secuencia de cadena pesada tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de cadena pesada: EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYMMMWVRQAPGKGLEVWSSIYPSGGI TFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARIKLGTVTTVDYWG QGTLVTVSS, y
(b) la secuencia de cadena ligera tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de cadena ligera:
Figure imgf000012_0001
En una divulgación específica, la identidad de secuencia es del 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 %. En otra realización, el anticuerpo se une a PD-L1 humano, de ratón o de macaco. En un aspecto específico, el anticuerpo es capaz de bloquear la interacción entre PD-L1 humano, de ratón, o de macaco y los respectivos receptores PD-1 humanos, de ratón o de macaco.
En otra divulgación, el anticuerpo se une a PD-L1 humano con una Kd de 5 * 10-9 M o menos, preferentemente con una Kd de 2 * 10'9 M o menos, y aún más preferentemente con una Kd de 1 * 10'9 M o menos.
Otra divulgación se refiere a un anticuerpo anti-PD-LI o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un epítopo funcional que incluye los restos Y56 y D61 de PD-L1 humano.
En una divulgación específica, el epítopo funcional incluye además E58, E60, Q66, R113 y M115 de PD-L1 humano. En una divulgación más específica, el anticuerpo se une a un epítopo conformacional, incluidos los restos 54-66 y 112­ 122 de PD-L1 humano.
Una divulgación adicional se refiere al uso de un anticuerpo anti-PD-L1, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que compite de forma cruzada por la unión a PD-L1 con un anticuerpo de acuerdo con la divulgación como se describe en el presente documento.
Aún más, la divulgación presenta proteínas y polipéptidos que incluyen cualquiera de los anticuerpos anti-PD-L1 descritos anteriormente en combinación con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable para su uso en la terapia de combinación de la divulgación.
Aún otra divulgación presenta el uso de un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido, o una secuencia de región variable de cadena ligera o cadena pesada de un anticuerpo anti-PD-L1, o fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como se describe en el presente documento. Aún en otra divulgación más se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica una secuencia de región variable de cadena ligera o de cadena pesada de un anticuerpo anti-PD-L1, en donde:
(a) la cadena pesada incluye una secuencia HVR-H1, una HVR-H2 y una HVR-H3 que tienen al menos un 80 % de identidad de secuencia con SYIMM, SIYPSGGITFYADTVKG, e iKlGTVTTVDY, respectivamente, o
(b) la cadena ligera incluye una secuencia HVR-L1, una HVR-L2 y una HVR-L3 que tienen al menos un 80 % de identidad de secuencia con TGTSSDVGGYNYVS, DVSNRPS y SSYTSSSTRV, respectivamente.
En una divulgación específica, la identidad de secuencia es del 81 %, el 82 %, el 83 %, el 84 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 %.
En una divulgación adicional, la secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada es:
atggagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgctag ctccagcgag 60
gtgcagctgc tggaatccgg cggaggactg gtgcagcctg gcggctccct gagactgtct 120
tgcgccgcct ccggcttcac cttctccagc tacatcatga tgtgggtgcg acaggcccct 180
ggcaagggcc tggaatgggt gtcctccatc tacccctccg gcggcatcac cttctacgcc 240
gacaccgtga agggccggtt caccatctcc cgggacaact ccaagaacac cctgtacctg 300
cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gatcaagctg 360
ggcaccgtga ccaccgtgga ctactggggc cagggcaccc tggtgacagt gtcctccgcc 420
tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720
tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 780
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 900
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 960
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1020
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcacg ggatgagctg 1140
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260
gactccgacg gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380
aagagcctct ccctgtcccc gggtaaa 1407
y la secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera es:
atggagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cttaagccag 60
tccgccctga cccagcctgc ctccgtgtct ggctcccctg gccagtccat caccatcagc 120
tgcaccggca cctccagcga cgtgggcggc tacaactacg tgtcctggta tcagcagcac 180
cccggcaagg cccccaagct gatgatctac gacgtgtcca accggccctc cggcgtgtcc 240
aacagattct ccggctccaa gtccggcaac accgcctccc tgaccatcag cggactgcag 300
gcagaggacg aggccgacta ctactgctcc tcctacacct cctccagcac cagagtgttc 360
ggcaccggca caaaagtgac cgtgctgggc cagcccaagg ccaacccaac cgtgacactg 420
ttccccccat cctccgagga actgcaggcc aacaaggcca ccctggtctg cctgatctca 480
gatttctate caggcgccgt gaccgtggcc tggaaggctg atggctcccc agtgaaggcc 540
ggcgtggaaa ccaccaagcc ctccaagcag tccaacaaca aatacgccgc ctcctcctac 600
ctgtccctga cccccgagca gtggaagtcc caccggtcct acagctgcca ggtcacacac 660
gagggctcca ccgtggaaaa gaccgtcgcc cccaccgagt gctca 705
En la publicación de solicitud de patente de EE.UU. US 2010/0203056 se describen anticuerpos anti-PD-LI ilustrativos adicionales que se pueden usar en un anti-PD-LI/trampa de TGFp. En alguna divulgación, el resto de anticuerpo es YW243.55S70. En otra divulgación, el resto de anticuerpo es MPDL3280A.
Una divulgación adicional presenta el uso de un resto de anticuerpo anti-PD-L 1 que incluye una secuencia de región variable de cadena pesada y cadena ligera, en donde:
(a) la secuencia de cadena pesada tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de cadena pesada:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYY ADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 12), y (b) la secuencia de cadena ligera tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de cadena ligera:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFS
GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR (SEQ IDNO:13).
En una divulgación específica, la identidad de secuencia es del 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %.
Una divulgación adicional presenta el uso de un resto de anticuerpo anti-PD-L1 que incluye una secuencia de región variable de cadena pesada y cadena ligera, en donde:
(a) la secuencia de la región variable de la cadena pesada es:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYY ADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 12), y (b) la secuencia de la región variable de cadena ligera es:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFS
GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:13).
Otra divulgación presenta un resto de anticuerpo anti-PD-L1 que incluye una secuencia de región variable de cadena pesada y cadena ligera, en donde:
(a) la secuencia de la región variable de la cadena pesada es:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADS VKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 14), y (b) la secuencia de la región variable de cadena ligera es:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFS
GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:13).
Aún otros anticuerpos anti-PD-L1 ilustrativos que se pueden usar en un anti-PD-L1/trampa de TGFp se describen en la publicación de patente de EE.UU. US 7.943.743.
En alguna divulgación, el anticuerpo anti-PD-L1 es MDX-1105.
En una divulgación adicional, el anticuerpo anti-PD-L1 es MEDI-4736.
Región constante
Las proteínas y péptidos para su uso en la terapia de combinación de la divulgación pueden incluir una región constante de una inmunoglobulina o un fragmento, un análogo, una variante, un mutante o un derivado de la región constante. En la divulgación preferida del presente documento, la región constante se obtiene de una cadena pesada de inmunoglobulina humana, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 u otras clases. En la divulgación en el presente documento, la región constante incluye un dominio CH2. En otra divulgación en el presente documento, la región constante incluye los dominios CH2 y CH3 o incluye bisagra-CH2-CH3. Como alternativa, la región constante puede incluir la totalidad o una parte de la región bisagra, del dominio CH2 y/o del dominio CH3.
En la divulgación en el presente documento, la región constante contiene una mutación que reduce la afinidad por un receptor Fc o reduce la función efectora de Fc. Por ejemplo, la región constante puede contener una mutación que elimina el sitio de glucosilación dentro de la región constante de una cadena pesada de IgG. En alguna divulgación del presente documento, la región constante contiene mutaciones, deleciones o inserciones en una posición de aminoácido correspondiente a Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Asn297 o Pro331 de IgG1 (los aminoácidos están numerados según la nomenclatura de la UE). En una divulgación particular en el presente documento, la región constante contiene una mutación en una posición de aminoácido correspondiente a Asn297 de IgG1. En la divulgación alternativa en el presente documento, la región constante contiene mutaciones, deleciones o inserciones en una posición de aminoácido correspondiente a Leu281, Leu282, Gly283, Gly284, Asn344, o Pro378 de IgG1.
En alguna divulgación del presente documento, la región constante contiene un dominio CH2 que proviene de una cadena pesada de IgG2 o IgG4 humana. Preferentemente, el dominio CH2 contiene una mutación que elimina el sitio de glucosilación de dentro del dominio CH2. En una divulgación en el presente documento, la mutación altera la asparagina dentro de la secuencia de aminoácidos Gln-Phe-Asn-Ser (SEQ ID NO: 15) dentro del dominio CH2 de la cadena pesada de IgG2 o IgG4. Preferentemente, la mutación cambia la asparagina a glutamina. Como alternativa, la mutación altera tanto la fenilalanina como la asparagina dentro de la secuencia de aminoácidos Gln-Phe-Asn-Ser (SEQ ID NO: 15). En la divulgación en el presente documento, la secuencia de aminoácidos Gln-Phe-Asn-Ser (SEQ ID NO: 15) se reemplaza por una secuencia de aminoácidos Gln-Ala-Gln-Ser (SEQ ID NO: 16). La asparagina dentro de la secuencia de aminoácidos Gln-Phe-Asn-Ser (SEQ ID NO: 15) se corresponde con Asn297 de IgG1.
En otra divulgación, la región constante incluye un dominio CH2 y al menos una parte de una región bisagra. La región bisagra puede derivarse de una cadena pesada de inmunoglobulina, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 u otras clases. Preferentemente, la región bisagra procede de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas u otras clases adecuadas. Más preferentemente, la región bisagra se obtiene de una cadena pesada de IgG1 humana. En alguna divulgación, la cisteína en la secuencia de aminoácidos de Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys (SEQ ID NO: 17) de la región bisagra de IgG1 está alterada. En alguna divulgación, la secuencia de aminoácidos de Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys (SEQ ID NO: 17) se reemplaza con una secuencia de aminoácidos de Pro-Lys-Ser-Ser-Asp-Lys (SEQ ID NO: 18). En alguna divulgación, la región constante incluye un dominio CH2 derivado de un primer isotipo de anticuerpo y una región bisagra derivada de un segundo isotipo de anticuerpo. En alguna divulgación, el dominio CH2 se deriva de una cadena pesada de IgG2 o IgG4 humana, mientras que la región bisagra se deriva de una cadena pesada de IgG1 humana alterada.
La alteración de los aminoácidos cerca de la unión de la parte Fc y la parte no Fc puede aumentar espectacularmente la semivida en suero de la proteína de fusión Fc (publicación PCT WO 01/58957). Por consiguiente, la región de unión de una proteína o de un polipéptido de la presente divulgación puede contener alteraciones que, en relación con las secuencias naturales de una cadena pesada de inmunoglobulina y eritropoyetina, preferentemente, se encuentran dentro de aproximadamente 10 aminoácidos del punto de unión. Estos cambios de aminoácidos pueden causar un aumento en la hidrofobicidad. En alguna divulgación, la región constante se deriva de una secuencia de IgG en la que se reemplaza el resto de lisina C-terminal. Preferentemente, la lisina C-terminal de una secuencia de IgG se reemplaza por un aminoácido distinto de la lisina, tal como alanina o leucina, para aumentar aún más la semivida en suero. En otra divulgación, la región constante se obtiene de una secuencia de IgG en la que la secuencia de aminoácidos Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) cerca del extremo C-terminal de la región constante está alterada para eliminar posibles epítopos de linfocitos T de unión. Por ejemplo, en alguna divulgación, la secuencia de aminoácidos Leu-Ser-Leu-Ser se reemplaza con una secuencia de aminoácidos Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20). En otra divulgación en el presente documento, los aminoácidos dentro del segmento Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) se reemplazan con otros aminoácidos tales como glicina o prolina. Los métodos detallados para generar sustituciones de aminoácidos del segmento Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) cerca del extremo C-terminal de una IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 u otra molécula de la clase de inmunoglobulinas, se han descrito en la publicación de patente de EE. UU. n.° 2003/0166877.
Las regiones de bisagra adecuadas para la presente divulgación se pueden obtener de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 y otras clases de inmunoglobulinas. La región bisagra de IgG1 tiene tres cisteínas, dos de los cuales participan en enlaces disulfuro entre las dos cadenas pesadas de la inmunoglobulina. Estas mismas cisteínas permiten la formación eficaz y consistente de enlaces disulfuro entre las partes Fc. Por lo tanto, una región de bisagra preferida de la presente invención se obtiene de IgG1, más preferentemente, de IgG1 humana. En alguna divulgación del presente documento, la primera cisteína de dentro de la región bisagra de IgG1 humana está mutada a otro aminoácido, preferentemente, a serina. La región bisagra del isotipo IgG2 tiene cuatro enlaces disulfuro que tienden a potenciar la oligomerización y posiblemente un enlace disulfuro incorrecto durante la secreción en sistemas recombinantes. Una región bisagra adecuada se puede derivar de una bisagra de IgG2; las dos primeras cisteínas están cada una preferentemente mutadas a otro aminoácido. Se sabe que la región bisagra de IgG4 forma enlaces disulfuro entre cadenas de manera ineficaz. Sin embargo, una región bisagra adecuada para la presente divulgación se puede obtener de la región de bisagra de IgG4, que contiene preferentemente una mutación que potencia la formación correcta de enlaces disulfuro entre restos derivados de la cadena pesada (Angal S., et al. (1993) Mol. Immunol., 30:105-8).
De conformidad con la presente divulgación, la región constante puede contener dominios CH2 y/o CH3 y una región bisagra que se derive de diferentes isotipos de anticuerpos, es decir, una región constante híbrida. Por ejemplo, en alguna divulgación, la región constante contiene dominios CH2 y/o CH3 derivados de IgG2 o IgG4 y una región bisagra mutante derivada de IgG1. Como alternativa, se usa una región bisagra mutante de otra subclase de IgG en una región constante híbrida. Por ejemplo, se puede usar una forma mutante de la bisagra de IgG4 que permita una unión disulfuro eficaz entre las dos cadenas pesadas. Una bisagra mutante también puede derivarse de una bisagra de IgG2 en la que las dos primeras cisteínas estén mutadas a otro aminoácido. El ensamblaje de dichas regiones constantes híbridas se ha descrito en la publicación de patente de EE. UU. n.° 2003/0044423.
De conformidad con la presente divulgación, la región constante puede contener una o más mutaciones descritas en el presente documento. Las combinaciones de mutaciones en la porción Fc pueden tener efectos aditivos o sinérgicos en la semivida sérica prolongada y el aumento in vivo de la potencia de la molécula bifuncional. Por lo tanto, en alguna divulgación ilustrativa, la región constante puede contener (i) una región que proviene de una secuencia de IgG en la que la secuencia de aminoácidos Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) se reemplaza con una secuencia de aminoácidos Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20); (ii) un resto de alanina en C-terminal en lugar de lisina; (iii) un dominio CH2 y una región de bisagra que se obtienen de diferentes isotipos de anticuerpos, por ejemplo, un dominio CH2 de IgG2 y una región de bisagra de IgG1 alterada; y (iv) una mutación que elimina el sitio de glucosilación dentro del dominio CH2 que proviene de IgG2, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos Gln-Ala-Gln-Ser (SEQ ID NO: 16) en lugar de la secuencia de aminoácidos Gln-Phe-Asn-Ser (SEQ ID NO: 15) dentro del dominio CH2 que proviene de IgG2.
Fragmentos de anticuerpo
Las proteínas y polipéptidos de la divulgación para su uso en la terapia de combinación de la divulgación también pueden incluir fragmentos de unión a antígenos de los anticuerpos. Los fragmentos de anticuerpos ilustrativos incluyen scFv, Fv, Fab, F(ab')2 y fragmentos VHH de dominio único, tal como los de origen camélido.
Los fragmentos de anticuerpos monocatenarios, también conocidos como anticuerpos monocatenarios (scFv), son polipéptidos recombinantes que normalmente se unen a antígenos o receptores; estos fragmentos contienen al menos un fragmento de una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable de anticuerpo (Vh) unido al menos a un fragmento de una secuencia de cadena ligera variable de anticuerpo (Vl) con o sin uno o más enlazadores de interconexión. Tal enlazador puede ser un péptido flexible y corto seleccionado para asegurar que el plegado tridimensional adecuado de los dominios Vl y Vh se produce una vez que se unen para mantener la especificidad de unión a la molécula diana del anticuerpo completo del que se obtiene el fragmento de anticuerpo monocatenario. Generalmente, el extremo carboxilo terminal de la secuencia de Vl o Vh está unida covalentemente por tal enlazador peptídico al extremo aminoacídico de una secuencia de Vl y Vh complementaria. Los fragmentos de anticuerpos monocatenarios se pueden generar mediante clonación molecular, biblioteca de presentación de anticuerpos en fagos o técnicas similares. Estas proteínas pueden producirse tanto en células eucariotas como en células procariotas, incluyendo bacterias.
Los fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla contienen secuencias de aminoácidos que tienen al menos una de las regiones variables o CDR de los anticuerpos completos descritos en la presente memoria descriptiva, pero carecen de algunos o todos los dominios constantes de esos anticuerpos. Estos dominios constantes no son necesarios para la unión del antígeno, pero constituyen una parte importante de la estructura de los anticuerpos completos. Por lo tanto, los fragmentos de anticuerpos monocatenarios pueden superar algunos de los problemas asociados al uso de anticuerpos que contienen parte o la totalidad de un dominio constante. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos monocatenarios tienden a estar libres de interacciones no deseadas entre moléculas biológicas y la región constante de cadena pesada, u otra actividad biológica no deseada. De manera adicional, los fragmentos de anticuerpos monocatenarios son considerablemente más pequeños que los anticuerpos completos y, por lo tanto, pueden tener una mayor permeabilidad capilar que los anticuerpos completos, permitiendo que los fragmentos de anticuerpos monocatenarios se localicen y se unan a los sitios de unión al antígeno diana de manera más eficaz. También, los fragmentos de anticuerpos se pueden producir a una escala relativamente grande en células procariotas, facilitando así su producción. Además, el tamaño relativamente pequeño de los fragmentos de anticuerpos monocatenarios los hace menos propensos que los anticuerpos completos a provocar una respuesta inmune en un receptor.
También pueden estar presentes fragmentos de anticuerpos que tienen características de unión iguales o comparables a las del anticuerpo completo. Dichos fragmentos pueden contener uno o ambos fragmentos Fab o el fragmento F(ab')2. Los fragmentos de anticuerpos pueden contener las seis CDR del anticuerpo completo, aunque los fragmentos que contienen menos de todas esas regiones, tal como tres, cuatro o cinco CDR, también son funcionales.
Producción de proteína
Las proteínas de anticuerpo-trampa de citocina se producen generalmente de forma recombinante, utilizando células de mamífero que contienen un ácido nucleico diseñado genéticamente para expresar la proteína. Aunque en los Ejemplos 1 y 2 se describe un ejemplo de una línea celular y un método de producción de proteínas adecuados, se han utilizado una amplia variedad de vectores, líneas celulares y métodos de producción de proteínas adecuados para producir productos biofarmacéuticos basados en anticuerpos y se podrían utilizar en la síntesis de estas proteínas de anticuerpo-trampa de citocina.
Indicaciones terapéuticas
Esta divulgación se refiere a una terapia de combinación para el tratamiento del cáncer o la reducción del crecimiento tumoral, particularmente a una combinación de (i) una molécula bifuncional que comprende un TGFpRII o un fragmento del mismo capaz de unirse a TGFp y un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a una proteína de punto de control inmunitario, tal como el ligando 1 de muerte programada (PD-L1) y (ii) al menos un agente terapéutico antineoplásico adicional. Los agentes terapéuticos antineoplásicos incluyen, por ejemplo, radiación, agentes antineoplásicos, productos biológicos o vacunas. En cierta divulgación en el presente documento, la terapia de combinación proporciona un efecto antineoplásico sinérgico.
Los cánceres ilustrativos incluyen colorrectal, de mama, de ovario, de páncreas, gástrico, de próstata, riñón, de cuello del útero, mieloma, linfoma, leucemia, de tiroides, endometrial, de útero, de vejiga, neuroendocrino, de cabeza y cuello, de hígado, nasofaríngeo, testicular, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, melanoma, cáncer de piel de células basales, cáncer de piel de células escamosas, dermatofibrosarcoma protuberans, carcinoma de células de Merkel, glioblastoma, glioma, sarcoma, mesotelioma y síndromes mielodisplásicos.
El cáncer o tumor a tratar con un anti-PD-L1/Trampa de TGFp, en combinación con uno o más reactivos terapéuticos antineoplásicos adicionales, tales como la quimioterapia y/o la radioterapia, puede seleccionarse en función de la expresión o expresión elevada de PD-L1 y TGFp en el tumor, la correlación de sus niveles de expresión con el pronóstico o la progresión de la enfermedad, y la experiencia clínica y preclínica sobre la sensibilidad del tumor a los tratamientos dirigidos a PD-L1 y TGFp. Dichos cánceres o tumores incluyen, entre otros, colorrectal, de mama, de ovario, de páncreas, gástrico, de próstata, riñón, de cuello del útero, de vejiga, de cabeza y cuello, de hígado, cáncer de pulmón no microcítico, melanoma, carcinoma de células de Merkel y mesotelioma.
Composiciones farmacéuticas
La presente divulgación también presenta composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína descrita en el presente documento para su uso en los métodos terapéuticos de la divulgación. La composición se puede formular para su uso en una variedad de sistemas de administración de fármacos. También se pueden incluir en la composición uno o más excipientes o vehículos fisiológicamente aceptables para una formulación adecuada. Las formulaciones adecuadas para su uso en la presente divulgación se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17a ed., 1985. Para una breve revisión de los métodos para suministro de fármacos, véanse, por ejemplo, Langer (Science 249:1527-1533, 1990).
Las composiciones farmacéuticas están destinadas a administración parenteral, intranasal, tópica, oral o local, tal como por un medio transdérmico, para el tratamiento terapéutico. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar por vía parenteral (por ejemplo, mediante inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea), o por ingestión oral, o por aplicación tópica o inyección intraarticular en áreas afectadas por la enfermedad vascular o cancerosa. Las vías de administración adicionales incluyen administración intravascular, intraarterial, intratumoral, intraperitoneal, intraventricular, intraepidural, así como nasal, oftálmica, intraescleral, intraorbital, rectal, tópica o por inhalación en aerosol. Por lo tanto, la divulgación proporciona composiciones para administración parenteral que comprenden los agentes mencionados anteriormente disueltos o suspendidos en un vehículo aceptable, preferentemente un vehículo acuoso, por ejemplo, agua, agua tamponada, solución salina, PBS y similares. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según sea necesario, para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste del pH y tamponantes, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes, detergentes y similares. La divulgación también proporciona composiciones para administración oral, que pueden contener ingredientes inertes tales como aglutinantes o cargas para la formulación de un comprimido, una cápsula y similares. Además, la presente divulgación proporciona composiciones para la administración local, que pueden contener ingredientes inertes como disolventes o emulsionantes para la formulación de una crema, un ungüento y similares.
Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales o pueden esterilizarse por filtración. Las soluciones acuosas resultantes se pueden envasar para su uso tal cual, o liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con un vehículo acuoso estéril antes de la administración. El pH de las preparaciones estará normalmente entre 3 y 11, más preferentemente entre 5 y 9 o entre 6 y 8, y lo más preferentemente entre 7 y 8, tal como del 7 al 7,5. Las composiciones resultantes en forma sólida se pueden empaquetar en múltiples unidades de dosis única, conteniendo, cada una, una cantidad fija del agente o agentes mencionados anteriormente, tal como en un paquete sellado de comprimidos o cápsulas. La composición en forma sólida también se puede envasar en un recipiente para una cantidad flexible, tal como en un tubo comprimible diseñado para una crema o ungüento de aplicación tópica.
Tratamientos
Determinar la dosificación y la duración del tratamiento de acuerdo con cualquier aspecto de la presente divulgación está dentro de las habilidades de un profesional en la materia. El experto puede controlar fácilmente a los pacientes para determinar si se debe iniciar, continuar, interrumpir o reanudar el tratamiento. La cantidad de anticuerpo-trampa de TGFp, el tratamiento contra el cáncer o la dosis de radiación, para llevar a cabo los métodos de tratamiento combinado de la divulgación variarán dependiendo de factores tales como la afección que se está tratando, la salud general del paciente, y el método, vía y dosis de administración.
De acuerdo con determinada divulgación en el presente documento, el anticuerpo-trampa de TGFp y el al menos un agente antineoplásico adicional, se administran en una cantidad terapéutica que se sabe que se utiliza para tratar el tipo específico de cáncer. De acuerdo con otra divulgación en el presente documento, debido a los efectos sinérgicos observados asociados a la terapia de combinación de la divulgación, el anticuerpo-trampa de TGFp y el al menos un agente antineoplásico adicional se pueden administrar en una cantidad que es menor que la cantidad terapéutica que se sabe que se utiliza en monoterapias para tratar el cáncer.
La dosis óptima de anticuerpo-trampa de TGFp se basa en el porcentaje de ocupación del receptor por parte de la fracción de anticuerpo para lograr el efecto terapéutico máximo porque la trampa de citocina se usa en un gran exceso. Por ejemplo, la dosis terapéutica para un anticuerpo monoclonal dirigido a un receptor celular se determina de manera que el nivel mínimo sea de alrededor de 10 a 100 |jg/ml, es decir, 60 a 600 nM (para anticuerpos con una constante de disociación (Kd) de 6 nM, este nivel mínimo aseguraría que entre el 90 y el 99 % de los receptores diana en las células estén ocupados por el anticuerpo). Esto es un gran exceso de citocinas, que normalmente están presentes en pg a ng/ml en circulación.
La dosis óptima del polipéptido de anticuerpo-trampa de TGFp para su uso en los métodos terapéuticos de la divulgación dependerá de la enfermedad a tratar, de la gravedad de la enfermedad y de la existencia de efectos secundarios. La dosis óptima se puede determinar mediante experimentación de rutina. Para la administración parenteral, se administra una dosis entre 0,1 mg/kg y 100 mg/kg, de manera alternativa entre 0,5 mg/kg y 50 mg/kg, de manera alternativa, entre 1 mg/kg y 25 mg/kg, de manera alternativa, entre 10 mg/kg y 25 mg/kg, de manera alternativa, entre 5 mg/kg y 20 mg/kg, de manera alternativa entre 2 mg/kg y 10 mg/kg, de manera alternativa, entre 5 mg/kg y 10 mg/kg, y se puede administrar, por ejemplo, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez al mes por ciclo de tratamiento. En alguna divulgación del presente documento, la dosis eficaz del anticuerpo-trampa de TGFp necesaria para lograr un efecto terapéutico en terapias de combinación será menor que la necesaria en una monoterapia de anticuerpo-trampa de TGFp para lograr un efecto terapéutico similar.
En alguna divulgación del presente documento, la dosis eficaz será aproximadamente de 2 a 10 veces menor que la necesaria en una monoterapia con anticuerpo-trampa de TGFp para lograr un efecto terapéutico similar. En otra divulgación, la dosis eficaz será aproximadamente de 2 a 5 veces menor que la necesaria en una monoterapia con anticuerpo-trampa de TGFp para lograr un efecto terapéutico similar.
La dosis eficaz del reactivo antineoplásico adicional, o radioterapia, para uso en combinación con un anticuerpo-trampa de TGFp para el tratamiento del cáncer puede variar según el compuesto particular o la composición farmacéutica empleada, el modo de administración, la afección a tratar y la gravedad de la afección a tratar. Un médico o clínico con conocimientos ordinarios puede determinar fácilmente la cantidad eficaz de cada reactivo antineoplásico adicional o radiación, necesarios para tratar o prevenir la progresión del cáncer. En alguna divulgación del presente documento, la dosis eficaz del reactivo antineoplásico o radioterapia adicional necesaria para lograr un efecto terapéutico en la terapia de combinación de la divulgación será menor que la necesaria en monoterapias antineoplásicas o de radiación para lograr un efecto terapéutico similar.
De acuerdo con los métodos de la divulgación, los agentes antineoplásicos se pueden administrar en combinación con una molécula de anticuerpo-trampa de citocina para tratar el cáncer o reducir el crecimiento tumoral. Dichos agentes antineoplásicos incluyen, por ejemplo, agentes alquilantes, antimetabolitos, antraciclinas, alcaloides vegetales, inhibidores de la topoisomerasa, antibióticos antineoplásicos, agentes hormonales, agentes antiangiogénicos, agentes inductores de la diferenciación, agentes inductores de la detención del crecimiento celular, agentes inductores de la apoptosis, agentes citotóxicos y otros agentes antitumorales. Dichos fármacos pueden afectar la división celular o la síntesis y función del ADN de alguna manera. Los agentes antineoplásicos representativos incluyen, pero sin limitación, agentes alquilantes (tales como cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucilo, dacarbazina, lomustina, carmustina, procarbazina, clorambucilo e ifosfamida), antimetabolitos (tales como fluorouracilo (5-FU), gemcitabina, metotrexato, arabinósido de citosina, fludarabina y floxuridina), antimitóticos (incluyendo taxanos tales como paclitaxel y decetaxel y alcaloides de la vinca tales como vincristina, vinblastina, vinorelbina y vindesina), antraciclinas (incluyendo doxorrubicina, daunorrubicina, valrrubicina, idarrubicina y epirrubicina, así como actinomicinas tales como actinomicina D), antibióticos citotóxicos (incluyendo mitomicina, plicamicina y bleomicina) e inhibidores de la topoisomerasa (incluyendo camptotecinas tales como irinotecán y topotecán y derivados de epipodofilotoxinas tales como amsacrina, etopósido, fosfato de etopósido y tenipósido).
En cierta divulgación en el presente documento, se utilizan medicamentos a base de platino tales como cisplatino, carboplatino y oxaliplatino. Otros agentes antineoplásicos cuyo tratamiento y efectos pueden beneficiarse de la combinación con la molécula anti-PD-L1/trampa de TGFp incluyen antimetabolitos, tales como fluorouracilo (5-FU), que interfiere con la síntesis de ADN. En cierta divulgación en el presente documento, se pueden administrar combinaciones de uno o más agentes antineoplásicos con la molécula anti-PD-L1/trampa de TGFp. En otra divulgación en el presente documento, se pueden administrar combinaciones de uno o más agentes antineoplásicos con radioterapia y la molécula anti-PD-L1/trampa de TGFp.
En una divulgación específica en el presente documento, el oxaliplatino puede administrarse a una dosis de entre 20 mg/m2 y 200 mg/m2, de manera alternativa entre 40 mg/m2 y 160 mg/m2, de manera alternativa, entre 60 mg/m2 y 145 mg/m2, de manera alternativa, entre 85 mg/m2 y 135 mg/m2, de manera alternativa entre 40 mg/m2 y 65 mg/m2
En una divulgación específica en el presente documento, el 5-FU puede administrarse a una dosis de entre 100 mg/m2 y 3000 mg/m2, de manera alternativa, entre 250 mg/m2 y 2400 mg/m2, de manera alternativa, entre 400 mg/m2 y 1500 mg/m2, de manera alternativa, entre 200 mg/m2 y 600 mg/m2. En una divulgación en el presente documento, se puede administrar la dosis de 5-FU, por ejemplo, mediante infusión durante un periodo prolongado de tiempo.
En una divulgación específica en el presente documento, también se puede administrar leucovorina, para potenciar los efectos del 5-FU o para disminuir los efectos secundarios asociados a la quimioterapia.
En una divulgación en el presente documento, el siguiente régimen quimioterapéutico se proporciona como ejemplo para su uso en combinación con la molécula anti-PD-L1/trampa de TGFp. El día 1, se administran 85 mg/m2 de oxaliplatino y 200 mg/m2 de leucovorina seguido, 2 horas más tarde, por la administración de 400 mg/m2 de 5-FU en bolo y 600 mg/m2 de 5-FU en infusión. El día 2, se administran 200 mg/m2 de leucovorina seguida 2 horas más tarde por 400 mg/m2 de 5-FU en bolo y 600 mg/m2 de 5-FU en infusión.
En otra divulgación en el presente documento, el régimen quimioterapéutico incluye, por ejemplo, la administración el día 1 de una dosis de 85 mg/m2 dosis de oxaliplatino, una dosis de 400 mg/m2 de leucovorina, una dosis de 400 mg/m2 en bolo i.v. de 5-FU y una dosis de 600 mg/m2 de 5-FU en infusión seguida de 1200 mg/m2/día * 2 días (total 2400 mg/ml2 durante 46-48 horas) en infusión continua i.v. El tratamiento se repite cada 2 semanas.
En otra divulgación en el presente documento, se administra una infusión de 2 horas de 400 mg/m2 de leucovorina seguido de una infusión de 5-FU a las 46 horas de 2400 mg/m2. El oxaliplatino también se infunde durante dos horas el día 1 a una dosis de 130 mg/m2. El tratamiento se repite cada dos semanas.
De acuerdo con los métodos de la presente divulgación, la radiación se puede administrar en combinación con una molécula anticuerpo-trampa de citocina para tratar el cáncer. La radioterapia generalmente utiliza un haz de partículas u ondas de alta energía, tal como los rayos X y los rayos gamma, para erradicar las células cancerosas mediante la inducción de mutaciones en el ADN celular. Las células cancerosas se dividen más rápidamente que las células normales, haciendo que el tejido tumoral sea más susceptible a la radiación que el tejido normal. Cualquier tipo de radiación se puede administrar a un paciente, siempre que la dosis de radiación sea tolerada por el paciente sin efectos secundarios negativos significantes. Los tipos adecuados de radioterapia incluyen, por ejemplo, radiación ionizante (por ejemplo, rayos X, rayos gamma o radiación de alta energía lineal). La radiación ionizante se define como la radiación que comprende partículas o fotones que tienen la energía suficiente para producir la ionización, es decir, ganancia o pérdida de electrones. El médico puede controlar, al menos en parte, los efectos de la radiación. Preferentemente la dosis de radiación se fracciona para una exposición máxima de la célula diana y una toxicidad reducida. La radiación se puede administrar de manera simultánea con radiosensibilizadores que mejoran la destrucción de células tumorales o con radioprotectores (por ejemplo, IL-1 o IL-6) que protegen el tejido sano de los efectos nocivos de la radiación. De manera análoga, la aplicación de calor, es decir, la hipertermia o la quimioterapia pueden sensibilizar el tejido a la radiación.
La fuente de radiación para el paciente puede ser externa o interna. La radioterapia externa es la más habitual y normalmente implica dirigir un haz de radiación de alta energía (un haz de partículas) a un sitio del tumor a través de la piel usando, por ejemplo, un acelerador lineal. Mientras que el haz de radiación se localiza en el sitio del tumor, es casi imposible evitar la exposición de tejido sano normal. Sin embargo, la radiación externa generalmente es bien tolerada por los pacientes.
En otro ejemplo, la radiación se administra de manera externa a un paciente utilizando rayos gamma. Los rayos gamma se producen por la descomposición de radioisótopos tales como el cobalto 60. Utilizando un enfoque de tratamiento llamado radioterapia estereotáctica corporal (SBRT, del inglés "Stereotactic Body Radiation Therapy"), los rayos gamma se pueden enfocar estrechamente para apuntar solo al tejido tumoral, tal que se daña muy poco tejido sano. La SBRT se puede utilizar para pacientes con tumores localizados. Por otra parte, los rayos X, producidos por un acelerador de partículas, se pueden utilizar para administrar radiación en un área más grande del cuerpo.
La radioterapia interna implica implantar una fuente de emisión de radiación, tal como perlas, cables, miniesferas, cápsulas, etc., dentro del cuerpo o cerca del sitio del tumor. La radiación utilizada proviene de radioisótopos tales como, pero sin limitación, yodo, estroncio, fósforo, paladio, cesio, iridio, fosfato o cobalto. Tales implantes se pueden eliminar tras el tratamiento o dejar en el cuerpo inactivos. Los tipos de radioterapia interna incluyen, pero sin limitación, braquirradioterapia, irradiación intersticial e irradiación intracavitaria. Una forma actualmente menos común de radioterapia interna implica portadores biológicos de radioisótopos, tales como con la radioinmunoterapia en donde se administran a un paciente anticuerpos específicos de tumores unidos al material radiactivo. Los anticuerpos se unen a antígenos tumorales, administrando así de manera eficaz una dosis de radiación al tejido de interés.
La radioterapia es útil como componente de un régimen para controlar el crecimiento de un tumor primario (véase, por ejemplo, Comphausen et al. (2001) "Radiation Therapy to a Primary Tumor Accelerates Metastatic Growth in Mice", Cancer Res. 61:2207-2211). Aunque la radioterapia sola puede ser menos eficaz para tratar el cáncer, la combinación de la radiación con una molécula anti-PD-L1/Trampa de TGFp como se describe en el presente documento, puede mejorar la eficacia local y sistémica de la radioterapia.
Debido a que la radiación destruye las células efectoras inmunitarias, la dosis y el momento de la radiación son importantes. Los linfocitos T y las células dendríticas en un tumor irradiado disminuyen inmediatamente después de la irradiación; sin embargo, los niveles de linfocitos T se recuperan por encima de los niveles de referencia. Sin importar el método de administración, se puede administrar una dosis diaria completa de radiación en el transcurso de un día. Preferentemente, la dosis total se fracciona y se administra durante varios días. Por consiguiente, una dosis diaria de radiación comprenderá aproximadamente de 1 a 50 Gy/día, por ejemplo, al menos 1, al menos 2, al menos 3, 1 a 4, 1 a 10, 1 a 20, 1 a 50, 2 a 4, 2 a 10, 2 a 20, 2 a 25, 2 a 50, 3 a 4, 3 a 10, 3 a 20, 3 a 25, 3 a 50 Gy/día.
La dosis diaria se puede administrar como una dosis única o puede ser una dosis "microfraccionada" administrada en dos o más porciones en el transcurso de un día. Cuando se emplean fuentes de radiación internas, por ejemplo, braquirradioterapia o radioinmunoterapia, el tiempo de exposición normalmente aumentará, con una disminución correspondiente en la intensidad de la radiación.
De acuerdo con alguna divulgación en el presente documento de la divulgación, el anticuerpo-trampa de TGFp y el al menos un agente antineoplásico adicional se administran de manera simultánea. De acuerdo con otra divulgación en el presente documento, el anticuerpo-trampa de TGFp y el al menos un agente antineoplásico adicional se administran de manera secuencial.
La frecuencia de dosificación del anticuerpo-trampa de TGFp y el al menos un agente terapéutico antineoplásico adicional puede ajustarse en el transcurso del tratamiento, basándose en el criterio del médico que lo administra.
Ejemplos
La invención, que se está describiendo ahora en líneas generales, se entenderá más completamente por referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen simplemente con fines de ilustración de determinados aspectos y realizaciones de la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de la invención de ningún modo.
EJEMPLO 1 — Construcción de ADN y expresión de proteínas
El anti-PD-L1/Trampa de TGFp es una proteína de fusión anticuerpo anti-PD-L1-Receptor II de TGFp. La cadena ligera de la molécula es idéntica a la cadena ligera del anticuerpo anti-PD-L1 (SEQ ID NO: 1). La cadena pesada de la molécula (SEQ ID NO: 3) es una proteína de fusión que comprende la cadena pesada del anticuerpo anti-PD-L1 (SEQ ID NO: 2) fusionado genéticamente a través de un enlazador flexible (Gly4Ser)4Gly (SEQ ID NO: 11) al extremo N-terminal del receptor II de TGFp soluble (SEQ ID NO: 10). En la unión de fusión, el resto de lisina C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo se mutó a alanina para reducir la escisión proteolítica. Para la expresión de anti-PD-L1/trampa de TGFp, el ADN que codifica la cadena ligera anti-PD-L1 (SEQ ID NO: 4) y el ADN que codifica el anti-PD-L1/Receptor de TGFp II (SEQ ID NO: 5) en el mismo vector de expresión o en vectores de expresión separados se usaron para transfectar células de mamífero usando protocolos estándar para transfección transitoria o estable. Los medios de cultivo acondicionados se recogieron y la proteína de fusión anti-PD-L1/trampa de TGFp se purificó mediante cromatografía de proteína A en sefarosa estándar. La proteína purificada que comprende un anticuerpo anti-PD-L1 y dos moléculas del receptor II de TGFp soluble (Figura 1) tiene un peso molecular estimado (PM) de aproximadamente 190 kilodaltons en cromatografía de exclusión por tamaño y electroforesis de poliacrilamida-SDS en condiciones no reductoras. En condiciones reductoras, las cadenas ligeras y pesadas tienen PM aparentes de 28 y 75 kilodaltons, respectivamente.
La proteína de fusión anti-PD-L1 (mut)/trampa de TGFp, que contiene un polipéptido de fusión de cadena pesada análogo (SEQ ID NO: 7) y una cadena ligera con las mutaciones A31G, D52e , r 99Y se preparó de forma similar en la región variable que anula la unión a PD-L1 (SEQ ID NO: 6). Se utilizó en experimentos posteriores como control de trampa de TGFp.
EJEMPLO 2 — Producción de anti-PD-L1/trampa de TGFp como agente bioterapéutico
Se descubrió que la anti-PD-L1/trampa de TGFp producida por la transfección transitoria de células 293 de riñón embrionario humano (HEK) contenía diversos grados de una especie recortada, que apareció como una banda tenue con un PM aparente de aproximadamente 60 kD en SDS-PAGe en condiciones reductoras. Se confirmó que esta banda era la cadena pesada de la anti-PD-L1/trampa de TGFp escindida en un sitio en la porción N-terminal de TGFpRII cerca de la unión de fusión.
Se generaron clones estables que expresan la anti-PD-L1/trampa de TGFp en la línea de células hospedadoras CHO-S, que fue preadaptada para el crecimiento en medio sin suero en cultivo en suspensión. Las células se transfectaron con un vector de expresión que contenía un gen que codifica la proteína anti-PD-L1-TGFpRII y un marcador de selección de glutamina sintetasa. La selección posterior de integrantes estables se realizó con L-metionina sulfoximina (MSX). Se generaron líneas celulares que expresan la anti-PD-L1/trampa de TGFp usando un enfoque de miniagrupación, seguido de la deposición de células individuales en placas de 384 pocilios, utilizando un clasificador de células activado por fluorescencia de Beckton-Dickinson (FACS Aria II). El crecimiento, la productividad y la calidad de las proteínas se evaluaron en un ensayo de lote alimentado con plataforma genérica. Basándose en estos análisis, se seleccionaron 14 clones como candidatos principales para estudios adicionales. Se llevó a cabo un estudio de estabilidad con los clones a ~ 90 PDL (nivel de duplicación de la población) de los bancos de células de investigación establecidos durante la ampliación de los clones. Al concluir el desarrollo del minigrupo, se descubrió que la subunidad de cadena pesada-enlazador-TGFpRIl sufrió un recorte, tal como se vio en la expresión transitoria. Todos los clones del estudio de estabilidad produjeron la especie recortada, aunque se demostró en el material purificado con proteína A que el porcentaje de especies recortadas en relación con la subunidad intacta variaba con cada clon. Además, se desarrolló un proceso de purificación mejorado que consiste en una cromatografía de proteína A seguida de un fuerte intercambio catiónico para reducir la copurificación de las especies recortadas. Incluso con el proceso mejorado, el material purificado con los niveles finales requeridos de especies recortadas de <5 % solo se puede lograr utilizando clones que produzcan niveles bajos de recorte. Basándose en estos análisis combinados, el clon 02B15 se seleccionó como el clon candidato final. El análisis de la anti-PD-LI/trampa de TGFp expresada por este clon a cero PDL, treinta PDL, sesenta PDL y noventa PDL muestra que el porcentaje de recorte no aumentó con los niveles de duplicación de la población.
EJEMPLO DE REFERENCIA 3 — Combinación de quimioterapia y anti-PD-L1/Trampa de TGFp en un modelo de ratón con tumor MC38 subcutáneo
El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común en hombres y el segundo en mujeres, con más de 1,2 millones de casos nuevos en todo el mundo. A pesar del progreso significativo en el tratamiento durante la última década, El CCR es la cuarta causa más común de muertes relacionadas con el cáncer. Por lo tanto, se necesitan nuevas modalidades de tratamiento. En los ejemplos de trabajo expuestos a continuación, se investigó la eficacia de la molécula anti-PD-LI/trampa de TGFp en combinación con terapia basada en oxaliplatino (Ox) y 5-fluorouracilo (5-FU) en un modelo murino de cáncer colorrectal.
El tratamiento combinado con anti-PD-LI/trampa de TGFp y el reactivo antineoplásico Ox/5-FU en ratones con tumores MC38 subcutáneos dio como resultado una inhibición significativa del crecimiento tumoral. Estos datos preclínicos respaldan una estrategia de combinación de quimioterapia (Ox/5-FU) con inmunoterapia anti-PD-LI/trampa de TGFp para el tratamiento del cáncer colorrectal en la clínica.
Materiales y métodos
La línea de células tumorales MC38 se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC). La línea celular MC38 se analizó y verificó para estar libre de virus adventicios y micoplasma. Los ratones C57BL/6, de 8 a 12 semanas de edad, se obtuvieron de Charles River Laboratories. Los ratones B6.129S2-IghmtmlCgn/J, de 8 a 12 semanas de edad, eran de Jackson Laboratories.
Las dosis de material de prueba fueron las siguientes: Anti-PD-L1/trampa de TGFp: 24,6 mg/kg; 492 pg/ratón; 2,46 mg/ml; Volumen de dosis de 0,2 ml administrado por vía intravenosa. Fluorouracilo (5-FU): 60,0 mg/kg; 120 pg/ratón; 6,00 mg/ml; Volumen de dosis de 0,02 ml administrado por vía intravenosa. Oxaliplatino: 5,0 mg/kg; 10 pg/ratón, 0,500 mg/ml, 0,02 ml administrado i.p. El valor en mg/kg fue aproximado, asumiendo un peso corporal promedio de 20 g por ratón.
El control negativo fue un control con isotipo inactivo (Anti-PD-L1(mut)) administrado a una concentración de prueba de 400 pg/ratón.
Cultivo celular. Se cultivaron células MC38 en condiciones asépticas en medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) que contenía suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % y se mantuvieron a 37 °C y CO2 al 5 %. Las células se pasaron al alcanzar una confluencia del 50 al 70 % en una proporción de 1:5, para un total de 2 pases antes de la implantación in vivo. Las células se recogieron mediante tripsinización y se determinaron los recuentos de células viables con un hemocitómetro y tinción de exclusión con azul de tripano. Todos los reactivos de cultivo celular se adquirieron de Life Technologies (Gaithersburg, MD).
Modelo tumoral MC38. En el estudio TI13-027, se suspendieron células tumorales MC38 (1 * 106 células/ratón) en 100 pl de PBS estéril y se implantaron en el flanco derecho de ratones C57BL/6. Cuando el tamaño del tumor alcanzó un promedio de ~ 45 mm3, los ratones se aleatorizaron en 4 grupos (N = 10 ratones/grupo) para iniciar la terapia. Los tratamientos se administraron según las pautas que se muestran en la figura 2 y la figura 3. La longitud (L), el ancho (W, del inglés "Width") y la altura (H, del inglés "Height") del tumor se midieron con un calibrador digital y se registraron de manera automática en el ordenador dos veces por semana con el programa informático WinWedge. Los pesos corporales también se registraron dos veces por semana para evaluar la tolerabilidad. Los volúmenes de los tumores se calcularon mediante las fórmulas de volumen del elipsoide: Volumen = n/6*(L * W * H); donde L = longitud, W = ancho y H = altura del tumor. La eficacia se determinó mediante la medición del volumen de los tumores a lo largo de la duración del estudio in vivo y los pesos de los tumores se midieron en el punto de terminación del estudio como se describe a continuación. Todos los animales se sacrificaron el día 17 y los tumores se extirparon y pesaron. Los bazos se recogieron para análisis ELISPOT de IFN-y.
En el estudio TI14-012, se inyectaron células tumorales MC38 en ratones B6.129S2-Ighmtm1Cgn/J como se describe anteriormente. Todos los demás procedimientos para la evaluación del crecimiento tumoral y la eficacia del tratamiento también se describieron anteriormente.
Ensayos ELISPOT de IFN-y. El ensayo de mancha inmunoabsorbente ligada a enzimas (ELISpot, del inglés " coenzima-linfoma immunosorbent spot") se utilizó para medir la respuesta de los linfocitos T citotóxicos (CTL, del inglés "cytotoxic T lymphocytes") contra el antígeno p15E, que es un epítopo de rechazo de linfocitos T conocido en tumores MC38 (Yang y Perry-Lalley J Immunotherapy 2000; 23:177-183). El ensayo ELISpot mide la frecuencia de linfocitos T CD8+ productores de IFN-y después del cultivo conjunto con células presentadoras de antígeno (APC, del inglés "antigen presenting cells") cargadas con el epítopo p l5E KPSWFTTL. Las APC cargadas con un péptido irrelevante, SIINFEKL, procedente de ovoalbúmina (OVA) de pollo sirvió como control negativo. Las muestras de control positivo se estimularon con PMA e ionomicina, lo que desencadena una activación no específica de los linfocitos T citotóxicos. El ensayo ELISpot se realizó utilizando un kit ELISpot IFN-y de ratón de BD Biosciences de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El día 17 del estudio TI13-027, se recogieron los bazos de N = 5 ratones/grupo, se procesaron en suspensiones de células sueltas, estimuladas con péptido P15E a una concentración final de 1 |jg/ml, y a continuación se cultivaron a 37 °C durante 7 días. Después de la estimulación in vitro, los linfocitos T CD8+ se aislaron mediante clasificación de células activadas por imán utilizando el kit de aislamiento de linfocitos T CD8+ (Miltenyi Biotech) y el separador AutoMACS Pro. Para establecer el sistema de cultivo conjunto para el ensayo ELISpot de estimulación in vitro, las APC procedentes de esplenocitos de ratón sin tratamiento previo se pulsaron con el péptido KPSWFTTL o el péptido irrelevante SIINFEKL durante una hora y, a continuación, se irradiaron con 2 Gy en el GammaCell 40 Exactor. Se cultivaron linfocitos T CD8+ aislados (1 x 105 células/pocillo) de ratones experimentales por triplicado en placas de ensayo ELISpot (recubiertas con anticuerpo anti-IFN-Y) con APC pulsadas con péptido e irradiadas (2,5 x 105 células/pocillo).
El día 18 del estudio TI14-012, se estableció un ensayo ELISpot ex-vivo en el que se recogieron los bazos de N = 5 ratones/grupo, se procesaron en suspensiones de células sueltas y se aislaron los linfocitos T CD8+ con clasificación de células activadas por imán utilizando el kit de aislamiento de linfocitos T CD8+ (Miltenyi Biotech) y el separador AutoMACS Pro. Para establecer el sistema de cultivo conjunto para el ensayo ELISpot de ex vivo, las APC procedentes de esplenocitos de ratón sin tratamiento previo se pulsaron con el péptido KPSWFTTL o el péptido irrelevante SIINFEKL durante una hora y, a continuación, se irradiaron con 2 Gy en el GammaCell 40 Exactor. Se cultivaron linfocitos T CD8+ aislados (5 x 105 células/pocillo) de ratones experimentales por triplicado en placas de ensayo ELISpot (recubiertas con anticuerpo anti-IFN-Y) con APC pulsadas con péptido e irradiadas (5 x 105 células/pocillo).
En ambos experimentos, los linfocitos T CD8+ experimentales se cultivaron conjuntamente con APC pulsadas con péptido a 37 °C durante 19 a 20 horas antes de retirarlas de la placa de ensayo. Se añadió un anticuerpo anti-IFN-Y biotinilado a cada pocillo de la placa, seguido de una etapa de lavado y después la adición de un conjugado de detección de estreptavidina y HRP. Después de otra etapa de lavado, la placa se incubó con una solución de sustrato cromogénico; la reacción se controló y después se detuvo mediante el enjuague de la placa con agua. El número de manchas positivas para IFN-y en cada pocillo de la placa de ensayo se contó utilizando un analizador CTL-Immunospot S5UV (Cellular Technology Limited). Los datos se representan como el número medio de manchas/pocillo ± EEM.
Los controles de mortalidad se realizaron una vez al día durante el estudio. Observaciones clínicas. Los signos clínicos (tales como problemas de salud y cambios de comportamiento) se registraron para todos los animales una vez al día durante el estudio utilizando el sistema de puntuación de condición corporal (CC) como se describió anteriormente (Ullman-Cullere y Foltz, Lab Anim Sci. 1999; 49:319-23). Se sacrificaron humanamente los ratones moribundos mediante asfixia con CO2. Los pesos corporales de todos los animales del estudio se registraron dos veces por semana, incluido el día de finalización de cada grupo. Los volúmenes de los tumores se midieron en tres dimensiones con calibradores digitales y se registraron de manera automática en un ordenador dos veces por semana con el programa informático WinWedge durante la duración del experimento. Los volúmenes de los tumores se calcularon utilizando la fórmula de volumen del elipsoide: Volumen = 0,5236 (L x W x H); donde L = longitud, W = ancho y H = altura del tumor. En el momento del sacrificio, el tumor primario se extirpó y se pesó como criterio de valoración secundario de la eficacia. La frecuencia de linfocitos T CD8+ específicos de P15E productores de IFN-y se cuantificaron mediante un ensayo ELISpot. Los ensayos ELISpot de IFN-y de ratón se realizaron con un kit ELISpot de IFN-y de ratón (BD Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Análisis estadístico. Los volúmenes tumorales se midieron dos veces por semana durante todo el período de estudio. Los datos de los volúmenes tumorales se presentaron como la media ± error estándar de la media (EEM). El % de la inhibición del crecimiento tumoral, relación T/C, se calculó como el volumen tumoral del grupo de tratamiento dividido por el volumen tumoral del grupo control y después multiplicado por 100. Los datos del volumen tumoral se transformaron de manera logarítmica y se realizó ANOVA de medidas repetidas bidireccional con la corrección de Tukey para comparaciones múltiples para medir las diferencias estadísticas entre los grupos de tratamiento. T/C se calculó como el volumen del tumor del grupo de tratamiento dividido por el volumen del tumor del grupo de control. Los pesos de los tumores se midieron al finalizar el estudio. Los datos se representaron como la media ± EEM. El % de la relación T/C se calculó como el peso del tumor del grupo de tratamiento dividido por el peso del tumor del grupo de control y después se multiplicó por 100. Los datos de peso del tumor se evaluaron con ANOVA unidireccional con corrección de Tukey para comparaciones múltiples para medir las diferencias estadísticas entre los grupos de tratamiento. Los datos de ELISpot de IFN-y se expresaron como la media ± EEM. Se utilizó un ANOVA unidireccional con la corrección de Tukey para comparaciones múltiples para los análisis estadísticos utilizando el programa informático GraphPad Prism. Se determinó que p <0,05 era estadísticamente significativo.
Resultados
Debido a la inmunogenicidad provocada por el anticuerpo completamente humanizado en ratones competentes en linfocitos B, la molécula anti-PD-L1/Trampa de TGFp solo se pudo administrar tres veces en una semana en los ratones C57BL/6 de tipo silvestre en el estudio TI13-027. Por consiguiente, no se observó actividad antitumoral significativa con la monoterapia anti-PD-L1/Trampa de TGFp (% de T/C = 91 % en volumen tumoral; véase la figura 4). El tratamiento con oxaliplatino/5-FU indujo una inhibición significativa del crecimiento tumoral en el modelo de tumor MC38 subcutáneo en comparación con el control con isotipo (% de T/C = 53,2 % en volumen tumoral; p <0,0001). La terapia de combinación con anti-PD-L1/Trampa de TGFp y oxaliplatino/5-FU inhibió de manera significativa el crecimiento del tumor MC38 en comparación con el grupo de control (% de T/C = 33,2 % en volumen tumoral; p <0,0001). Además, la combinación de anti-PD-L1/Trampa de TGFp y oxaliplatino/5-FU mejoró de manera significativa el control del crecimiento tumoral en relación con el oxaliplatino/5-FU solo (439,6 mm3 frente a 703,7 mm3 en volumen tumoral; p <0,0001). Se observó la misma tendencia en la que el tratamiento combinado produjo mejoras estadísticamente significativas en el control del crecimiento tumoral en comparación con anti-PD-L1/Trampa de TGFp solo (439,6 mm3 frente a 1204,0 mm3; p< 0,0001) (véanse las figuras 4A a D y la tabla 1).
Tabla 1 Resultados de Volumen Tumoral, peso del tumor y ensayo ELISpot al finalizar el estudio (Ratones C57BL/6 ^ Estudio de TI13-027
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Por último, se observó que la monoterapia con anti-PD-L1/Trampa de TGFp o la monoterapia con oxaliplatino/5-FU aumentan de manera significativa la frecuencia de linfocitos T CD8+ productores de IFN-y en comparación con el grupo de control con isotipo según lo medido por el ensayo ELISpot (p <0,05 y p <0,05, respectivamente). La combinación de anti-PD-L1/Trampa de TGFp y oxaliplatino/5-FU mejoró de manera significativa la frecuencia de los linfocitos T CD8+ productores de IFN-y y específicos de P15E en relación con cualquiera de los grupos de monoterapia (p <0,05; véase la figura 4C).
En el estudio TI14-012, que utiliza ratones deficientes en linfocitos B para evitar la respuesta de anticuerpos de ratón contra anticuerpos humanos (MAHA, del inglés "mouse antibody against human antibody"), se trataron animales experimentales cinco veces con anti-PDL1/Trampa de TGFp. De manera no sorprendente, se observó una mayor actividad antitumoral con la monoterapia anti-PDL1/Trampa de TGFp (% de T/C = 57,3 % en volumen tumoral) en comparación con el estudio TI13-027 en el que los ratones de tipo silvestre se trataron solo tres veces (% de T/C = 91 % en volumen tumoral). En el estudio TI14-012, el tratamiento combinado con anti-PD-L1/Trampa de TGFp y oxaliplatino/5-FU fue significativamente más eficaz en comparación con cualquiera de las monoterapias (p <0,0001) o el control con isotipo (p <0,0001) (véanse la figura 5D y la tabla 2).
Tabla 2 Resultados de Volumen tumoral, peso tumoral y ensayo ELISpot al finalizar el estudio (Ratones B6.129S2-I hmtmlCn/J Estudio de TI14-012
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continuación
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De manera análoga, la monoterapia con anti-PD-LI/Trampa de TGFp dio como resultado un aumento significativo de las frecuencias de linfocitos T c D8+ productores de IFN-y comparadas con el control con isotipo (véase la figura 5C; p <0,05). El tratamiento combinado de anti-PD-L1/Trampa de TGFp y oxaliplatino/5-FU dio como resultado un aumento sinérgico en la frecuencia de linfocitos T CD8+ productores de IFN-y y específicos de P15 en comparación con el grupo de monoterapia o el control con isotipo (véase la figura 5C; p <0,05).
Anti-PD-L1/Trampa de TGFp es una proteína de fusión bifuncional de anticuerpo y receptor de citocinas diseñada para revertir la supresión inmunitaria tanto intrínseca como extrínseca de la célula en el microambiente tumoral a través de la doble orientación del eje PD-1/PD-L1 y la señalización de TGFp. En los estudios descritos en el presente documento, la inhibición significativa del crecimiento tumoral de MC38 y la inducción sinérgica de los linfocitos T CD8+ productores de IFN-y y específicos de P15E se observaron con la combinación del tratamiento con anti-PDL1/Trampa de TGFp y Ox/5-FU en ratones con tumores MC38 subcutáneos. Estos efectos en la eficacia antitumoral y la respuesta inmunitaria observados en ratones de tipo silvestre se acentuaron en ratones con deficiencia en linfocitos B. Se cree que la diferencia se debe principalmente a la administración de un mayor número de dosis de anti-PD-L1/Trampa de TGFp y la ausencia de la respuesta MAHA (anticuerpo de ratón contra humano) en los ratones con deficiencia en linfocitos B. Tomados en conjunto, estos datos demuestran que los componentes de la quimioterapia (Ox/5-FU) se pueden combinar de manera eficaz con la terapia anti-PDL1/Trampa de TGFp para mejorar la inhibición del crecimiento tumoral y las respuestas de los linfocitos T CD8+ reactivos a tumores en un modelo de cáncer colorrectal de ratón. En conclusión, los resultados preclínicos respaldan una combinación para el tratamiento del cáncer colorrectal en la clínica.
EJEMPLO 4 — Combinación de radioterapia y anti-PD-L1/Trampa de TGFp en un modelo de ratón con tumor MC38 intramuscular
La molécula anti-PD-L1/Trampa de TGFp está compuesta por el dominio extracelular del TGFpRIl (Trampa de TGFp) humano unido de manera covalente al extremo C de la cadena pesada de un anticuerpo humano anti-PD-LI. La monoterapia con anti-PD-L1/Trampa de TGFp ha demostrado una eficacia antitumoral superior en múltiples modelos preclínicos. En los estudios informados en el presente documento, se investigó la actividad antitumoral del anti-PD-L1/Trampa de TGFp en combinación con radioterapia local fraccionada en ratones B6.129S2-Ighmtm1Cgn/J portadores de tumores MC38 colorrectales intramusculares. Los datos mostraron que la combinación de la radiación administrada en cuatro dosis fraccionadas de radiación local (360 rad/dosis) y una sola administración de anti-PD-L1/Trampa de TGFp (55 |jg) tuvo efectos antitumorales notablemente sinérgicos que dieron como resultado la remisión del tumor en el 100% de los ratones. Además, la combinación de radiación administrada como cuatro dosis fraccionadas de radiación local (500 rad/dosis) y una sola administración de anti-PD-L1/Trampa de TGFp (164 jg ) provocó efectos antineoplásicos en tumores en sitios distales al tumor que se estaba irradiando, una demostración del efecto abscópico y una indicación de que dicho tratamiento sería útil en el tratamiento de la metástasis. En comparación, la monoterapia con radiación o tratamiento anti-PD-L1/Trampa de TGFp solo dio como resultado una modesta reducción de la carga tumoral. Además, se observaron aumentos significativos en la frecuencia de linfocitos T CD8+ productores de IFN-y y específicos de P15E en los ratones que recibieron la terapia de combinación. Por último, la terapia de combinación se asoció con una mejor infiltración de tumores MC38 mediante los linfocitos T CD8+ efectores y las células NK. Estos resultados indican que el tratamiento anti-PD-L1/Trampa de TGFp se sinergiza con la radiación para facilitar las respuestas antitumorales mediadas por linfocitos T. Los resultados que se describen a continuación respaldan esta estrategia de combinación para posibles aplicaciones clínicas.
Materiales y métodos
Línea celular: La línea celular de carcinoma de colon murino MC38 fue un regalo del Scripps Research Institute. Se analizó la línea celular y se verificó que estaba libre de virus murino y micoplasma. Los ratones B6.129S2-Ighmtm1Cgn/J (C57BL/6), de 8 a 12 semanas de edad, se obtuvieron de Jackson Laboratories.
Las dosis de material de prueba fueron las siguientes: Anti-PD-LI/trampa de TGFp: 2,75 mg/kg; 55 jg/ratón; 13,75 mg/ml; volumen de dosis de 0,2 ml administrado por vía intravenosa y anti-PD-L1/Trampa de TGFp: 8,25 mg/kg; 164 pg/ratón; 41,25 mg/ml; Volumen de dosis de 0,2 ml administrado por vía intravenosa.
Los controles negativos fueron los siguientes: el control con isotipo inactivo (anti-PD-L1 (mut) A11-121-6) se administró a una concentración de prueba de 133 pg/ratón o 45 pg/ratón.
Las células MC38 se cultivaron en condiciones asépticas en medio mínimo esencial de Dulbecco, que contenían un 10 % de suero bovino fetal inactivado por calor y se mantuvieron a 37 °C y CO2 al 5 %. Las células se pasaron al alcanzar una confluencia del 50 al 70 % en una proporción de 1:5, para un total de 2 pases antes de la implantación in vivo. Las células se recogieron mediante tripsinización y se determinaron los recuentos de células viables con un hemocitómetro y tinción de exclusión con azul de tripano.
Modelo tumoral C38: Se implantaron ratones C57BL/6.129S2-Ighmtm1Cgn/J por vía intramuscular en el muslo derecho con 0,5 * 106 células tumorales MC38 viables en 0,1 ml de PBS el día -8. Cuando los tumores habían alcanzado un volumen medio de ~ 128 mm3, los ratones se distribuyeron aleatoriamente en grupos de tratamiento. El tratamiento comenzó el día 0 (8 días después de la inoculación de las células tumorales).
La radioterapia localizada puede provocar efectos antineoplásicos en sitios distales, un fenómeno conocido como el efecto abscópico. Para probar el efecto del anti-PD-L1/Trampa de TGFp en el efecto abscópico de la radioterapia, 7 días antes del tratamiento, se inocularon los ratones con 0,5 * 106 células tumorales MC38 viables para generar un tumor primario MC38 intramuscular en muslo derecho, y con 1 * 106 células MC38 por vía subcutánea en el flanco izquierdo para generar un tumor secundario MC38 subcutáneo (Figura 9A). El tratamiento comenzó el día 7.
Radioterapia: Los ratones se colocaron en una bandeja específica de plexiglás y todo el cuerpo se protegió con una protección de plomo, excepto el área del tumor que se iba a irradiar. La radioterapia se administró al campo del tumor mediante el uso de GammaCell 40 Exactor.
Ensayo de manchas inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISpot): El ensayo ELISpot se utilizó para medir la respuesta de los linfocitos T citotóxicos (CTL) contra el antígeno p15E, que es un epítopo de rechazo de linfocitos T conocido expresado por tumores MC38 (véase Yang y Perry-Lalley 2000). El ensayo ELISpot mide la frecuencia de linfocitos T CD8+ productores de IFN-y después del cultivo conjunto con células presentadoras de antígeno (APC) cargadas con el epítopo p15E KPSWFTTL. Una PC cargada con un péptido irrelevante procedente de ovoalbúmina de pollo (SIINFEKL) sirvió como control negativo. Las muestras de control positivo se estimularon con PMA e ionomicina, lo que desencadena una activación no específica de los CTL. El ensayo ELISpot se realizó con un kit de BD Biosciences. El día 14 del estudio, el bazo se recogió de un ratón en cada grupo de estudio y se procesó en una suspensión de células sueltas. Los linfocitos T CD8+ se aislaron mediante clasificación de células activadas por imán utilizando el kit de aislamiento de linfocitos T CD8+ de Miltenyi Biotech y el separador AutoMACS Pro. A continuación, los linfocitos T CD8+ se sembraron en placas de ensayo ELISpot (recubiertas con anticuerpos anti-IFN-Y) en cultivo conjunto con APC procedentes de esplenocitos de ratón sin tratamiento previo pulsados con el péptido KPSWFTTL durante una hora, y después se irradiaron con 2 Gy en el GammaCell 40 Exactor. Después de la incubación a 37 °C durante 16 a 20 horas, las células se retiraron de la placa de ensayo. Se añadió un anticuerpo anti-IFN-Y biotinilado a cada pocillo de la placa, seguido de una etapa de lavado y después la adición de un conjugado de detección de estreptavidina y HRP. Después de otra etapa de lavado, la placa se incubó con una solución de sustrato cromogénico; la reacción se controló y después se detuvo mediante el enjuague de la placa con agua. El número de manchas positivas para IFN-y en cada pocillo de la placa de ensayo se midió con un sistema de lectura Immunospot ELISpot.
Fenotipo inmunitario: Se prepararon suspensiones de células a partir de bazos mediante rotura mecánica seguida de lisis de los glóbulos rojos. Las suspensiones de células tumorales se prepararon mediante digestión enzimática de suspensiones tumorales finamente picadas. Las suspensiones se incubaron en una solución de colagenasa de tipo IV (400 unidades/ml) y ADNasa 1 (100 pg/ml) durante una hora a 37 °C con agitación frecuente. Después de la digestión del tumor, los desechos se separaron mediante sedimentación y las suspensiones se pasaron a través de un filtro celular de nailon de 40 pm. La tinción de anticuerpos de las suspensiones de células tumorales y de bazo para el análisis FACS se realizó siguiendo las recomendaciones del fabricante (por ejemplo, eBioscience o BD Biosciences).
Para el análisis de las muestras de bazo, se creó una selección parental alrededor de la población de linfocitos identificada por las características de dispersión frontal y lateral. Desde la selección de los linfocitos, las subpoblaciones de células inmunitarias se identificaron en diagramas de puntos: linfocitos T auxiliares (CD4+), linfocitos T citotóxicos (CD8+), células NK (NK1.1+), linfocitos T CD8+ de memoria efectora (CD8+/CD44alto/CD62Lbajo), linfocitos T CD8+ de memoria central (CD8+/CD44alto/CD62Lalto) y linfocitos T reguladores (CD4+/CD25+/Foxp3+). Para evaluar la desgranulación como una medida de la actividad lítica, se midió CD107a en la superficie celular de los linfocitos. Después de la tinción de las proteínas de la superficie celular, las muestras se fijaron y permeabilizaron para permitir la tinción intracelular de los factores de transcripción T-box (Eomes y T-bet) y las citocinas efectoras (IFN-y y grancima B). Desde la selección de leucocitos, se identificaron subpoblaciones de células mieloides en diagramas de manchas: Célula dendrítica (CD11c+/I-Ab+), neutrófilos (CD11b+/Ly6G+), macrófagos (CD11b+/Ly-6Calto) y MDSC (Gr-1+/CD11b+).
Se empleó una estrategia de selección similar para el análisis de muestras de tumores, con la excepción de que primero se creó una selección parental alrededor de la población de células CD45+ para identificar los leucocitos que se infiltran en el tumor de las otras células tumorales y componentes del estroma.
Diseño del estudio. Terapia de combinación TI13-109 de radiación con anti-PD-L1/Trampa de TGFp en el modelo MC38 en ratones con deficiencia en linfocitos B. Grupo y tratamiento (N = 10).
Parte 1: Eficacia
1. Control con isotipo 133 |jg i.v. día 2
2. Radiación 360 rad/día días 0-3
3. Anti-PD-L1/Trampa de TGFp 55 jg i.v. día 2
4. Anti-PD-L1/Trampa de TGFp 164 jg i.v. día 2
5. Radiación 360 rad/día días 0-3
Anti-PD-L1/Trampa de TGFp 55 jg i.v. día 2
6. Radiación 360 rad/día días 0-3
Anti-PD-L1/Trampa de TGFp 164 jg i.v. día 2
Parte 2: Ensayo ELISpot: El día 14, todos los ratones se sacrificaron y se analizó un subconjunto de N = 5 ratones/grupo para las respuestas funcionales a través del ensayo ELISpot. Los bazos se recogieron y procesaron para el ensayo ELISpot como se describe anteriormente. El número de manchas positivas para IFN-y en cada pocillo de la placa de ensayo se midió con un sistema de lectura Immunospot ELISpot.
Diseño del estudio: Terapia de combinación TI14-013 de radiación con anti-PD-L1/Trampa de TGFp en el modelo MC38 en ratones con deficiencia en linfocitos B. Grupo y tratamiento (N = 10).
Parte 1: Eficacia
1. Control con isotipo 45 jg i.v. día 2
2. Radiación 360 rad/día días 0-3
3. Anti-PD-L1/Trampa de TGFp 55 jg i.v. día 2
4. Radiación 360 rad/día días 0-3
Anti-PD-L1/Trampa de TGFp 55 jg i.v. día 2
Parte 2: Ensayo ELISpot y fenotipo inmunitario. El día 14, todos los ratones se sacrificaron y se analizó un subconjunto de N = 5 ratones/grupo para determinar las respuestas funcionales esplénicas a través del ensayo ELISpot y el fenotipo inmunitario de los TIL. Los bazos se recogieron y procesaron para el ensayo ELISpot como se describe anteriormente. El número de manchas positivas para IFN-y en cada pocillo de la placa de ensayo se midió con un sistema de lectura Immunospot ELISpot. El tejido tumoral también se recogió y procesó como se describe anteriormente. Los fenotipos de los TIL se analizaron mediante análisis FACS para el % de TIL CD8+, % de TIL NK1.1+, expresión de EOMES en TIL CD8+ y desgranulación de TIL CD8+.
Los signos clínicos (tales como enfermedades y cambios en el comportamiento de la salud) se registraron para todos los animales una vez al día durante el estudio utilizando el sistema de puntuación de la condición corporal (CC) como se describió anteriormente (Ullman-Cullere y Foltz, Lab Anim Sci. 1999; 49:319-23). Se sacrificaron humanamente los ratones moribundos mediante asfixia con CO2. Se registraron los pesos corporales de todos los animales del estudio dos veces por semana, incluyendo el día de terminación de cada estudio. Los tumores se midieron con calibradores digitales en tres dimensiones durante la duración del experimento. Los volúmenes tumorales se calcularon usando la ecuación: Volumen = 0,5236 ( L * W * H); donde L = longitud, W = ancho y H = altura del tumor. Se generaron curvas de supervivencia de Kaplan-Meier para cuantificar el intervalo de tiempo desde la inoculación del tumor hasta el sacrificio y calcular la mediana del tiempo de supervivencia para cada grupo de tratamiento.
El ensayo ELISpot se utilizó para cuantificar la frecuencia de linfocitos T CD8+ productores de IFN-y específicos de P15E mediante ensayo ELISpot. El fenotipo inmunitario de los esplenocitos y los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) se realizó mediante FACS (clasificación de células activadas por fluorescencia).
Análisis estadístico: Los volúmenes tumorales se midieron dos veces por semana durante todo el período de estudio. Los datos de los volúmenes tumorales se presentaron como la media ± error estándar de la media (EEM). Los datos del volumen tumoral se transformaron de manera logarítmica y se realizó ANOVA de medidas repetidas bidireccional con la corrección de Tukey para comparaciones múltiples para medir las diferencias estadísticas entre los grupos de tratamiento. Se recogieron los pesos tumorales al finalizar el estudio. Los datos se representaron como la media ± EEM. La relación T/C se calculó como el volumen del tumor (o el peso del tumor) del grupo de tratamiento dividido por el volumen del tumor (o el peso del tumor) del grupo de control. Los datos de peso del tumor se evaluaron con ANOVA unidireccional con corrección de Tukey para comparaciones múltiples para medir las diferencias estadísticas entre los grupos de tratamiento.
La frecuencia de linfocitos T CD8+ productores de IFN-y se cuantificó mediante el ensayo ELISpot y se representó como el número medio de manchas por pocillo (media ± EEM). Se utilizó un ANOVA unidireccional con la corrección de Tukey para comparaciones múltiples para los análisis estadísticos utilizando el programa informático GraphPad Prism. Se determinó que p <0,05 era estadísticamente significativo.
Diseño del estudio: Terapia de combinación de radiación con anti-PD-L1/Trampa de TGFp en el modelo MC38 en ratones con deficiencia en linfocitos B para probar el efecto abscópico. Grupo y tratamiento (N =6). Tratamiento iniciado el día 0 con control con isotipo (400 |jg, días 0, 2, 4), radiación (500 rad/día, días 0, 1, 2, 3), anti-PD-L1/Trampa de TGFp (164 jg , día 0) y anti-PD-L1/Trampa de TGFp (164 jg , día 0) radiación (500 rad/día, días 0, 1, 2, 3). La radiación se aplicó sólo al tumor primario, como se muestra en la figura 9A. Los volúmenes del tumor primario y los volúmenes del tumor secundario se midieron dos veces por semana. Los volúmenes tumorales se presentan como media ± EEM.
Resultados
La combinación de radiación con anti-PD-L1/Trampa de TGFp demostró eficacia antitumoral sinérgica. En un modelo de tumor MC38 intramuscular (TI13-109), la radiación (360 rad/día, día 0-3) o monoterapia anti-PD-L1/Trampa de TGFp (55 o 164 jg , día 2) indujo una inhibición significativa del crecimiento tumoral (p<0,0001 respectivamente, frente al control con isotipo), mientras que la combinación de radiación y anti-PD-L1/Trampa de TGFp indujo una sinergia terapéutica notable en comparación con la monoterapia con radiación (p<0,0001) o anti-PD-L1/Trampa de TGFp (p<0,0001) en el día 10 (véase la figura 6A). La relación T/C en el día 14 basada en el peso tumoral fue de 0,45 para radioterapia, 0,50 y 0,36 para anti-PD-L1/Trampa de TGFp a 55 jg y 164 jg , respectivamente, y 0,04 frente a 0,01 para los grupos combinación de radiación y anti-PD-L1/Trampa de TGFp (55 jg frente a 164 jg , respectivamente) (véase la figura 6B). Se observó regresión tumoral, tan pronto como 4 días después del tratamiento con anti-PD-L1/Trampa de TGFp, en el 50 % (10 de 20) de los ratones tratados con monoterapia anti-PD-L1/Trampa de TGFp, en el 100 % (20 de 20) de los ratones tratados con la terapia de combinación y solo en el 10 % (1 de 10) de los ratones tratados con monoterapia de radiación. Además, dado que anti-PD-L1/Trampa de TGFp se administró en una sola dosis, 4 de 10 tumores en regresión volvieron a crecer en el grupo de monoterapia con anti-PD-L1/Trampa de TGFp, mientras que todos los tumores en regresión en el grupo de combinación continuaron reduciéndose hasta el día 14 cuando los ratones se sacrificaron para evaluar la función inmunitaria.
La activación inmunitaria se correlacionó con la eficacia antitumoral. El día 14, los ratones se sacrificaron y la frecuencia de linfocitos T CD8+ productores de IFN-y y reactivos a tumores (P15E) se cuantificaron usando un ensayo ex-vivo ELISpot (véase la figura 6C). Solo se observó una inducción moderada de linfocitos T CD8+ productores de IFN-y y reactivos a tumores en el grupo de monoterapia con radiación y anti-PD-L1/Trampa de TGFp (p >0,05 y p <0,05 respectivamente, frente al control con isotipo). De acuerdo con la eficacia antitumoral observada; sin embargo, los ratones tratados con la terapia de combinación experimentaron una inducción sinérgica en la frecuencia de linfocitos T CD8+ productores de IFN-y y específicos de P15E (véase la figura 6C). La producción de IFN-y de linfocitos T CD8+ inducida por la terapia de combinación fue 7 veces superior a la del control con isotipo y al menos 5 veces superior a la de las monoterapias (p <0,001 frente a cada monoterapia, respectivamente). En este estudio (TI13-109), el aumento de la dosis de anti-PD-L1/Trampa de TGFp de 55 jg a 164 jg en la terapia de combinación no aceleró de manera adicional la regresión del tumor. Debido a un rendimiento de linfocitos T CD8+ bajo en el grupo de dosis elevada, no se pudo realizar una evaluación adecuada de la frecuencia de linfocitos T CD8+ productores de IFN-y y reactivos a tumores (P15E). Por lo tanto, se realizó un estudio repetido para asegurar la consistencia de los hallazgos.
Un experimento repetido (TI14-013) con la dosis baja de 55 jg de anti-PD-L1/Trampa de TGFp produjo efectos sinérgicos casi idénticos tanto en la inhibición del crecimiento tumoral como en la inducción de la producción de IFN-Y por linfocitos T CD8+ específicos de P15E con la terapia de combinación (véanse las figuras 7A a C).
Un análisis de los linfocitos infiltrantes de tumores de ratones tratados en el estudio TI14-013 reveló elevaciones en las frecuencias de TIL CD8+ y células NK después del tratamiento con la combinación de radiación y anti-PD-L1/Trampa de TGFp en relación con los grupos de monoterapia o de control con isotipo (véanse las figuras 8A y B). Un análisis adicional indicó que la combinación de radioterapia y terapia anti-PD-L1/Trampa de TGFp promovió la expresión del factor de transcripción T-box, Eomes y la desgranulación (CD107a) en linfocitos T CD8+ infiltrantes de tumores (véanse las figuras 8C y D).
La terapia de combinación con radiación y una dosis única de anti-PD-L1/Trampa de TGFp redujo el volumen del tumor primario en relación con anti-PD-L1/Trampa de TGFp o la radiación sola (p <0,0001 para ambos, día 14) (Figura 9B). Sin embargo, la terapia de combinación también redujo el volumen del tumor secundario en relación con anti-PD-L1/Trampa de TGFp o la radiación sola (p = 0,0066 y p = 0,0006, respectivamente, día 14) (Figura 9C). De manera destacable, ni la radiación sola ni una sola dosis baja de anti-PD-L1/Trampa de TGFp inhibieron de manera significativa el crecimiento del tumor secundario en relación con el tratamiento de control con isotipo, lo que indica que anti-PD-L1/Trampa de TGFp sinergizado con radiación para inducir un efecto abscópico.
Las sinergias observadas en la eficacia antitumoral y las frecuencias de linfocitos T CD8+ productores de IFN-y y reactivos a tumores acoplados con infiltración mejorada por los linfocitos T CD8+ y las células NK son coherentes con la profunda inducción de respuestas inmunitarias antitumorales innatas y adaptativas mediante la terapia de combinación con radiación y la molécula anti-PD-L1/Trampa de TGFp. De este modo, esta combinación terapéutica tiene aplicaciones clínicamente relevantes para mejorar la radioterapia en pacientes con cáncer.
Los datos descritos en el presente documento demuestran que la radioterapia de haz externo (EBRT) habitual se puede combinar con la terapia anti-PD-L1/Trampa de TGFp para lograr una inhibición sinérgica del crecimiento tumoral y la inducción de respuestas de linfocitos T CD8+ reactivos a tumores en un modelo de cáncer colorrectal MC38. Como P15E es un antígeno retrovírico endógeno expresado por la línea celular tumoral MC38 (Zeh et al. J. Immunol. 1999; 162:989-94), el aumento observado en los linfocitos T CD8+ productores de IFN-y y específicos de P15E constituye una respuesta de linfocitos T reactivos a tumores, y no una respuesta generalizada, después de la terapia de combinación. Esta respuesta inmunitaria sinérgica es coherente con la mayor eficacia antitumoral observada en este régimen terapéutico, lo que indica que el tratamiento combinado con radiación y anti-PD-L1/Trampa de TGFp facilita una respuesta antitumoral mediada por linfocitos T CD8+. También se demostró que la combinación de radiación y terapia anti-PD-L1/Trampa de TGFp promueve la infiltración del tumor MC38 por linfocitos T CD8+ y células NK. Además, la terapia de combinación indujo un fenotipo de TIL CD8+ efector como lo demuestran los niveles más elevados de expresión del factor de transcripción, Eomes y el marcador de desgranulación, CD107a.
Los resultados observados respaldan la sinergia de esta estrategia de combinación para una posible aplicación clínica. La terapia secuencial de radiación y anti-PD-L1/Trampa de TGFp puede ser beneficiosa para los pacientes que tienen niveles elevados de TGFp circulante después de la radioterapia. Además, debido al fuerte efecto sinérgico observado incluso con una sola dosis baja de anti-PD-L1 /Trampa de TGFp, se espera un perfil de seguridad favorable en la clínica con dicha terapia de combinación.
SECUENCIAS SEQ ID NO: 1
Secuencia de péptidos de la cadena ligera lambda de anti-PD-LI secretada
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNR
FSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSS
EELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQW
KSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
SEQ ID NO: 2
Secuencia de péptidos de la cadena H secretada de anti-PD-LI
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADT
VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGP
SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW
TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD
TLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQD
WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS
DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ
KSLSLSPGK SEQ ID NO: 3
Secuencia de péptidos de la cadena H secretada de anti-PDLI/trampa de TGFp
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADT VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDV RFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASP KCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
SEQ ID NO: 4
Secuencia de ADN desde el codón de inicio de la traducción al codón de parada de la traducción de la cadena ligera lambda de anti-PD-LI (la secuencia líder que precede a la VL es el péptido señal del activador del plasminógeno uroquinasa) atgagggccctgctggctagactgctgctgtgcgtgctggtcgtgtccgacagcaagggcCAG TCCGCCCTGACCCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGCTCCCCTGGCCAGTCCATCACCATCAGCTGC ACCGGCACCTCCAGCGACGTGGGCGGCTACAACTACGTGTCCTGGTATCAGCAGCACCCCGGC
AAGGCCCCCAAGCTGATGATCTACGACGTGTCCAACCGGCCCTCCGGCGTGTCCAACAGATTC TCCGGCTCCAAGTCCGGCAACACCGCCTCCCTGACCATCAGCGGACTGCAGGCAGAGGACGAG GCCGACTACTACTGCTCCTCCTACACCTCCTCCAGCACCAGAGTGTTCGGCACCGGCACAAAA GTGACCGTGCTGggccagcccaaggccaacccaaccgtgacactgttccccccatcctccgag gaactgcaggccaacaaggccaccctggtctgcctgatctcagatttctatccaggcgccgtg accgtggcctggaaggctgatggctccccagtgaaggccggcgtggaaaccaccaagccctcc aagcagtccaacaacaaatacgccgcctcctcctacctgtccctgacccccgagcagtggaag tcccaccggtcctacagctgccaggtcacacacgagggctccaccgtggaaaagaccgtcgcc cccaccgagtgctcaTGA
SEQ ID NO: 5
Secuencia de ADN desde el codón de inicio de la traducción al codón de terminación de la traducción (líder de mVK SP: pequeño subrayado; VH: mayúsculas; IgG1m3 con mutación de K a A: letras minúsculas; enlazador (G4S)x4-G: letras mayúsculas en negrita; TGFpRN: letras minúsculas subrayadas en negrita; dos codones de parada: letras mayúsculas subrayadas en negrita)
atggaaacagacaccctgctgctgtgggtgctgctgctgtgggtgcccggctccacaggcGAG GTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGC GCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACATCATGATGTGGGTGCGACAGGCCCCTGGCAAG GGCCTGGAATGGGTGTCCTCCATCTACCCCTCCGGCGGCATCACCTTCTACGCCGACACCGTG AAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCC CTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGATCAAGCTGGGCACCGTGACCACC GTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCCgctagcaccaagggcccatcg gtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctg gtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggc gtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgacc gtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaac accaaggtggacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgc ccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacacc ctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccct gaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgg gaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactgg ctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaa accatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgg
gaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgac atcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtg ctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcag caggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaag agcctctccctgtccccgggtgct GGCGGCGGAGGAAGCGGAGGAGGTGGCAGCGGTGGCGGT
Figure imgf000031_0001
SEQ ID NO: 6
Secuencia polipeptídica de la cadena ligera lambda secretada de la anti-PD-LI (mut)/trampa de TGFp, con mutaciones A31g , D52E, R99Y
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRPSGVSNR FSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTYVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSS E E L QANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKAD GSPVKAGVET TKP SKQSNNKYAASSYLSLTPEQW KSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
SEQ ID NO: 7
Secuencia polipeptídica de la cadena pesada secretada de la anti-PD-LI (mut)/trampa de TGFp EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYMMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDV RFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASP KCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
SEQ ID NO: 8
Polipéptido precursor de la isoforma A del TGFpRN humano (RefSeq del NCBI con N.° de registro: NP_001020018) MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSDVEMEAQKDEIICPSCNRTAHPLRHINNDMIV TDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVC HDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVI FQVTGISLLPPLGVAISVIIIFYCYRVNRQQKLSSTWETGKTRKLMEFSEHCAIILEDDRSDI SSTCANNINHNTELLPIELDTLVGKGRFAEVYKAKLKQNTSEQFETVAVKIFPYEEYASWKTE KDIFSDINLKHENILQFLTAEERKTELGKQYWLITAFHAKGNLQEYLTRHVISWEDLRKLGSS LARGIAHLHSDHTPCGRPKMPIVHRDLKSSNILVKNDLTCCLCDFGLSLRLDPTLSVDDLANS GQVGTARYMAPEVLESRMNLENVESFKQTDVYSMALVLWEMTSRCNAVGEVKDYEPPFGSKVR EHPCVESMKDNVLRDRGRPEIPSFWLNHQGIQMVCETLTECWDHDPEARLTAQCVAERFSELE HLDRLSGRSCSEEKIPEDGSLNTTK
SEQ ID NO: 9
Polipéptido precursor de la isoforma B del TGFpRN humano (RefSeq del NCBI con N.° de registro: NP_003233 MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDN QKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEK KKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQVTGISLLPPLGVAISVIIIFYCY RVNRQQKLSSTWETGKTRKLMEFSEHCAIILEDDRSDISSTCANNINHNTELLPIELDTLVGK GRFAEVYKAKLKQNTSEQFETVAVKIFPYEEYASWKTEKDIFSDINLKHENILQFLTAEERKT ELGKQYWLITAFHAKGNLQEYLTRHVISWEDLRKLGSSLARGIAHLHSDHTPCGRPKMPIVHR DLKSSNILVKNDLTCCLCDFGLSLRLDPTLSVDDLANSGQVGTARYMAPEVLESRMNLENVES FKQTDVYSMALVLWEMTSRCNAVGEVKDYEPPFGSKVREHPCVESMKDNVLRDRGRPEIPSFW LNHQGIQMVCETLTECWDHDPEARLTAQCVAERFSELEHLDRLSGRSCSEEKIPEDGSLNTTK
SEQ ID NO: 10
Un polipéptido del dominio extracelular de la isoforma B del TGFpRN humano
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVA VWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIF SEEYNTSNPD
SEQ ID NO: 11
Enlazador (Gly4Ser)4Gly
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG
SEQ ID NO: 12
Secuencia polipeptídica de la región variable de cadena pesada secretada del anticuerpo anti-PD-L1 MPDL3280A
EVQLVESGGGLVQP G G S L R L S C A A S G F T F S D S W I H W V R QA P G K G L E W V A W I S P Y G G S T Y Y ADSVKGR F T I S A DT S K N T A Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A R RH W P G G F D Y W G Q G T L V T V S S
SEQ ID NO: 13
Secuencia polipeptídica de la región variable de cadena ligera secretada del anticuerpo anti-PD-L1 MPDL3280A y del anticuerpo anti-PD-L1 YW243.55S70
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR
SEQ ID NO: 14
Secuencia polipeptídica de la región variable de cadena pesada secretada del anticuerpo anti-PD-L1 YW243.55S70

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer en combinación con radiación, en donde la composición comprende:
una proteína que comprende;
(a) un TGFpRII humano, o un fragmento del mismo capaz de unirse a TGFp; y
(b) un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a la proteína humana ligando 1 de muerte programada (PD-L1), que comprende
(i) una región variable de cadena pesada que incluye una HVR-H1, una HVR-H2 y una HVR-H3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SYIMM, SIYPs Gg ITFYADTVKG e IKLGTVTTVDY, respectivamente, y (ii) una región variable de cadena ligera que incluye una HVR-L1, una HVR-L2 y una HVR-L3, que tienen las secuencias de aminoácidos de TGTs Sd VGGYNYVS, DVSNRPS y SSYTSSSTRV, respectivamente, en donde la proteína utilizada en combinación con la radiación de un tumor primario inhibe el crecimiento de un tumor secundario o una metástasis distal al tumor primario tratado con la radiación.
2. Una proteína para su uso en el tratamiento de cáncer metastásico en combinación con radiación
en donde la proteína comprende;
(a) un TGFpRN humano, o un fragmento del mismo capaz de unirse a TGFp; y
(b) un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a la proteína humana ligando 1 de muerte programada (PD-L1) que comprende
(i) una región variable de cadena pesada que incluye una HVR-H1, una HVR-H2 y una HVR-H3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SYIMM, SIYPs Gg ITFYADTVKG e IKLGTVTTVDY, respectivamente, y (ii) una región variable de cadena ligera que incluye una HVR-L1, una HVR-L2 y una HVR-L3, que tienen las secuencias de aminoácidos de TGTs Sd VGGYNYVS, DVSNRPS y SSYTSSSTRV, respectivamente, en donde la proteína utilizada en combinación con la radiación de un tumor primario inhibe el crecimiento de un tumor secundario o una metástasis distal al tumor primario tratado con la radiación.
3. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 1 o la proteína para su uso de la reivindicación 2, en donde el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a PD-L1 comprende los aminoácidos 1 a 120 del SEQ ID NO: 2.
4. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 1 o la proteína para su uso de la reivindicación 2, en donde el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a PD-L1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 excepto que la lisina carboxiterminal se ha mutado a alanina.
5. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 1 o la proteína para su uso de la reivindicación 2, en donde el TGFpRII humano, o un fragmento del mismo capaz de unirse a TGFp, comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.
6. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 1 o la proteína para su uso de la reivindicación 2, en donde la proteína comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3.
7. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 1 o la proteína para su uso de la reivindicación 2, en donde el cáncer o el tumor se seleccionan del grupo que consiste en colorrectal, de mama, de ovario, de páncreas, gástrico, de próstata, riñón, de cuello del útero, mieloma, linfoma, leucemia, de tiroides, endometrial, de útero, de vejiga, neuroendocrino, de cabeza y cuello, de hígado, nasofaríngeo, testicular, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, melanoma, cáncer de piel de células basales, cáncer de piel de células escamosas, dermatofibrosarcoma protuberans, carcinoma de células de Merkel, glioblastoma, glioma, sarcoma, mesotelioma y síndromes mielodisplásicos.
8. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 1 o la proteína para su uso de la reivindicación 2, en donde la administración de una dosis inicial de radiación va seguida de la administración de la composición.
9. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 1 o la proteína para su uso de la reivindicación 2, en donde se administran múltiples dosis de radiación.
10. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 1 o la proteína para su uso de la reivindicación 2, en donde se administran múltiples dosis de la composición.
11. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 1 o la proteína para su uso de la reivindicación 2, en donde la composición y un agente antineoplásico adicional se administran de manera secuencial.
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