ES2906129T3 - Cartucho microfluídico con control de fluido - Google Patents

Abstract

Cartucho microfluídico (1) para uso en la realización de un ensayo sobre una muestra de líquido, comprendiendo el cartucho microfluídico un puerto de entrada de muestra (3) conectado a al menos un canal microfluídico (4), donde cada/dicho(s) canal(es) microfluídico(s) comprende(n) uno o más reactivos allí depositados para uso en la realización del ensayo y una zona de detección (32), cada/dicho(s) canal(es) microfluídico(s) está(n) además conectado(s) de manera fluida a una cámara comprimible llena de gas (10) más adelante de cada/dicha zona de detección, donde la compresión o descompresión de una superficie externa de la/dicha cámara provoca que el gas salga expulsado de o se introduzca en la(s) cámara(s) respectivamente, lo que a su vez provoca un movimiento recíproco de la muestra de líquido dentro de dicho/cada canal microfluídico, caracterizado por que el cartucho y los canales y otras características dispuestas en el mismo están formados por un sándwich de tres sustratos planos separados que comprenden un sustrato superior, un sustrato inferior y un sustrato intermedio dispuesto entre los sustratos superior e inferior y donde los sustratos superior e inferior tienen un grosor esencialmente uniforme y la superficie superior externa de la/de dicha cámara es elástica.

Description

DESCRIPCIÓN

Cartucho microfluídico con control de fluido

Campo de la invención

[0001] La presente invención se refiere a un cartucho microfluídico para uso en la realización de un ensayo en una muestra de líquido.

Antecedentes de la invención

[0002] Los cartuchos microfluídicos se usan habitualmente para llevar a cabo una variedad de ensayos, tanto biológicos como químicos y/o fisioquímicos, y los resultados de los ensayos se suelen determinar usando un dispositivo lector asociado en el que se ha introducido el cartucho.

[0003] Se suele requerir el movimiento de fluido dentro del cartucho a fin de asegurar que una muestra es capaz entrar en contacto con los reactivos depositados dentro del cartucho y que son capaces de reaccionar con uno o más analitos objetivos que puedan estar presentes en una muestra. Tras la reacción con un reactivo o más, suele ser conveniente eliminar la muestra del área donde ha tenido lugar la reacción, a fin de que pueda ocurrir una reacción adicional, o simplemente, permitir la detección de cualquier producto de reacción, lo que puede ser difícil de lograr cuando la muestra permanece en su lugar, debido a la interferencia óptica, por ejemplo.

[0004] El movimiento de fluido dentro del cartucho puede ocurrir por la acción capilar por sí sola, o una fuerza activa puede llevar a cabo el control de fluidos dentro del cartucho siempre que, por ejemplo, se usen microbombas y válvulas que puedan estar presentes en el cartucho, o por medio de mecanismos presentes en el dispositivo lector, que estén diseñados para interactuar con el cartucho y bombear un fluido dentro y/o fuera a fin de controlar el movimiento de fluido dentro del propio cartucho, véase, por ejemplo, el documento EP2613881. O bien se puede usar una combinación de acción capilar y una fuerza activa.

[0005] Por ejemplo, el documento US7238324 describe un dispositivo microfluídico que emplea tanto la acción capilar como el uso de una bomba externa. Se permite que entre una muestra al cartucho microfluídico a través de un primer puerto por acción capilar y que fluya hasta una cámara de detección donde ocurre el ensayo. Tras la reacción del ensayo, se introduce un líquido en el chip a través de un segundo puerto mediante el uso de una bomba externa. La finalidad de este líquido es lavar la muestra original y dejar solamente los productos de reacción que se pueden detectar. Sin embargo, esto significa que se debe introducir un líquido independiente en el chip desde el exterior y a través de un puerto adicional, que se podría taponar y/o ser susceptible de contaminación. Además, el líquido se podría contaminar o degradar con el tiempo. Por consiguiente, existe una necesidad de proporcionar cartuchos microfluídicos en los que no sea necesario introducir otros fluidos desde el exterior del cartucho aparte de la muestra ni tener otros puertos aparte del puerto de la muestra a través del que se deba introducir la muestra. Se conocen algunos diseños por incluir bolsas llenas de líquido dentro del propio cartucho a fin de proporcionar reactivos o tampones de lavado adecuados etc., pero esto aumenta significativamente la complejidad y el gasto de los cartuchos, y los reactivos líquidos también pueden ser susceptibles de degradación.

[0006] El documento US5821399 describe un sistema y un cartucho que emplean conductividad eléctrica para medir muestras y el fluido entre muestras. El fluido de aclarado se proporciona en una bolsa llena de fluido dentro del cartucho, que se puede transportar dentro del cartucho y que el lector puede detectar por su conductividad eléctrica. Se puede determinar fácilmente la diferencia en la conductividad eléctrica entre una muestra y el fluido de aclarado o el segmento de aire.

[0007] El documento WO2013154946 describe un sistema microfluídico que usa una combinación de acción capilar y presión de gas para controlar el movimiento de las muestras de líquido dentro del dispositivo microfluídico. Inicialmente, una muestra de líquido introducida en el dispositivo se transporta por acción capilar parcialmente a lo largo de un canal capilar. Según avanza el líquido, la presión de gas en la interfaz distal gas-líquido aumenta en una cantidad suficiente para detener el movimiento del líquido. Para iniciar movimientos adicionales de la muestra de líquido, una bomba conectada a una porción distal del canal capilar reduce la presión del gas que actúa sobre la interfaz distal gas-líquido de la muestra de líquido en una cantidad suficiente para permitir que la muestra de líquido se mueva por acción capilar más allá del canal capilar del dispositivo microfluídico.

[0008] El documento US5096669 describe un dispositivo desechable para uso junto con un dispositivo lector. Se puede introducir una muestra inicialmente en el dispositivo desechable por medio de acción capilar y el lector puede llevar a cabo el movimiento adicional de la muestra dentro del dispositivo al presionar automáticamente un depósito de gas que comprende una membrana flexible, dentro del dispositivo, de manera que provoca que la muestra de fluido fluya sobre los sensores y la concentración de una especie química por determinar.

[0009] El documento WO2013/096801 describe un sistema de detección de flujo lateral que puede incluir características fluídicas. En un modo de realización, se describe un cartucho que contiene el dispositivo de flujo lateral que incluye un método de cromatografía y anticuerpos inmovilizados, pero que además incluye un depósito de gas que se acciona con una bomba dentro del lector. La presión sobre el depósito de gas sirve para mover la muestra de fluido dentro de los canales fluídicos del cartucho y hacia la zona de captura. Tras la captura adecuada, el accionamiento del depósito de gas empuja la muestra de fluido hacia una cámara de lavado. Se describe el uso de un fluido de lavado para enjuagar los componentes del fluido de la muestra, como los glóbulos rojos, que pueden interferir en la detección. Sin embargo, la combinación de las características de flujo lateral con las características microfluídicas proporciona cierto grado de complejidad y las pruebas de flujo lateral generalmente son para mediciones cualitativas o semicuantitativas, en vez de cuantitativas.

[0010] El documento EP2613881, una solicitud anterior del solicitante actual describe un cartucho microfluídico y un lector asociado. Un puerto de fluido dentro del cartucho está diseñado para formar un sellado hermético con el lector de manera que el lector pueda transportar el gas dentro y a través del cartucho.

[0011] El documento WO03/049860 describe un dispositivo complejo para el análisis químico o bioquímico que comprende una primera y segunda capas separadas por una tercera capa frangible. Al romper la tercera capa frangible, el fluido presente en la segunda capa puede entrar en la red fluídica de la primera capa. Se proporcionan muchas cámaras que han de ser comprimidas secuencialmente a fin de proporcionar varios reactivos y realizar cualquier ensayo en concreto.

[0012] El documento US2015/0004680 describe cartuchos biosensores para detectar uno o más componentes en una muestra. Cada cartucho comprende, así como canales microfluídicos, una cámara de bomba de aire y una cámara de bomba de reactivo, cuyas superficies superiores comprenden poros. Cuando un sensor asociado emplea la detección óptica, también se proporcionan tampones de lavado en el cartucho. Las cámaras se describen como bolsas independientes, que se insertan dentro de los huecos del cartucho. Las bolsas de reactivo y tampón se llenan de un líquido adecuado.

[0013] También es necesario poder hacer pruebas de fluidos, como muestras de sangre, de sujetos más rápido y con menos complejidad. Incluso los sujetos desean poder hacerse pruebas a sí mismos en casa.

[0014] Normalmente, cuando un sujeto acude a una clínica médica local o incluso a un hospital se toman muestras relativamente grandes de fluido o de sangre para analizar, y en función de las pruebas llevadas a cabo, se pueden requerir varios viales o muestras independientes. También, cuando la prueba no se lleva a cabo en el momento de recogida de muestras, suele ser necesario almacenar la muestra de manera que se reduzca al mínimo la degradación o pérdida de un analito concreto que se deba detectar. Algunas pruebas cuentan con un tiempo de sensibilidad y el tiempo transcurrido para llevar a cabo una prueba puede resultar en que la enfermedad avance peligrosamente, cuando el sujeto podría haber sido tratado.

[0015] También se dan enfermedades y afecciones en las que sería conveniente que el sujeto pudiera hacerse pruebas a sí mismo periódicamente y pudiera medicarse en función de los resultados de las pruebas. De esta manera se pueden dar instrucciones al sujeto en función del resultado de una prueba, posiblemente con la participación de un profesional sanitario, en cuanto a la medicación que debería tomar.

[0016] Además, los análisis clínicos de muestras se han realizado tradicionalmente usando técnicas de análisis clínico que requieren el uso de laboratorios especializados con máquinas de gran tamaño para llevar a cabo los análisis. En los últimos años, se ha experimentado un impulso para desarrollar dispositivos del tamaño de una mesa o incluso de bolsillo que sean capaces de realizar estas pruebas. Sin embargo, la capacidad de estos dispositivos para manipular solamente pequeños volúmenes de muestra y/o llevar a cabo una variedad de tipos diferentes de análisis es limitada. Además, sería conveniente si un solo lector fuera capaz de llevar a cabo una variedad de series de pruebas diferentes de modo que el usuario no necesite disponer de varios lectores diferentes a fin de poder realizar tipos de pruebas diferentes.

[0017] El documento US8435738, por ejemplo, describe un sistema modular capaz de realizar varios ensayos a partir de una única muestra de sangre. Sin embargo, está claro que se proporcionan módulos individuales e independientes para llevar a cabo funciones diferentes y un sistema de manipulación de muestras transporta la muestra a cada módulo. También parece que el sistema comprende una carcasa diseñada para llevar a cabo la preparación de la muestra, así como para llevar a cabo los distintos ensayos, pero no está claro qué le pasa a cada muestra una vez se ha analizado.

[0018] El documento DE 102004046366 describe un sistema de análisis químico que comprende una pipeta de prueba que contiene un reactivo químico que puede cambiar de color cuando se expone a un químico; el documento US 2014/212882 describe un dispositivo microfluídico que incluye un puerto de entrada para introducir una partícula que contenga la muestra de líquido en el dispositivo, un elemento retenedor y un activador de presión;

[0019] El documento WO 2011/123064 describe una tarjeta de ensayo que comprende un sustrato con al menos un depósito de reactivo comprimible, cada depósito de reactivo comprimible contiene un reactivo asociado y está junto a una cámara de reacción que puede recibir una muestra de ensayo; y

[0020] El documento US2013/299003 describe un método y un dispositivo para accionar el flujo de fluido en un canal de un dispositivo microfluídico. El canal está lleno de un fluido y el movimiento oscilatorio del fluido en el canal se genera en respuesta al movimiento de un activador entre una primera posición retraída y una segunda posición extendida.

Sumario de la invención

[0021] La presente invención se basa en parte en estudios de los presentes inventores sobre el control del movimiento de una muestra de líquido dentro de un cartucho microfluídico y también sobre cómo eliminar la muestra de forma eficaz y/o lavar los componentes unidos de una zona de detección del analito dentro del cartucho, sin tener que introducir un fluido del exterior del cartucho o usar un líquido de lavado u otro(s) que podría(n) estar presente(s) en el cartucho o lector asociado. Los inventores han desarrollado un cartucho microfluídico "seco" que incluye una cámara llena de gas que se puede usar para facilitar un movimiento controlado muy preciso de la muestra de líquido dentro del cartucho y para retirar la muestra y el material no unido de una zona de detección del analito dentro del cartucho, de manera que cualquier elemento detectable que pueda incluir complejos que comprendan el analito o el producto de reacción del analito se puedan detectar en un ambiente de gas. Cabe destacar que los cartuchos de la presente invención no requieren la presencia en el cartucho de líquidos adicionales, aparte de la propia muestra, ni que se introduzcan en el cartucho.

[0022] En un área, la presente invención enseña cartuchos que usan solo un gas, como el aire dentro de la cámara presente en un cartucho microfluídico, para controlar el movimiento de la muestra de líquido dentro del cartucho y opcionalmente, también para eliminar la muestra de líquido y el material no unido de un área de detección, antes de que se lleve a cabo la detección.

[0023] En otra área alternativa y/o complementaria, la presente invención proporciona cartuchos para llevar a cabo una pluralidad de ensayos diferentes usando un único cartucho y un lector asociado.

[0024] En un primer aspecto, se proporciona un cartucho microfluídico como se define en la reivindicación 1, como se adjunta en la presente memoria.

[0025] El cartucho está diseñado para insertarse dentro de un dispositivo lector asociado.

[0026] Para evitar dudas, la presente invención no requiere el uso de bolsas llenas de líquido que estén presentes dentro o proporcionadas con el cartucho ni la capacidad de transferir fluido (líquido o gas) desde un lector asociado al cartucho. En este sentido, se considera que el cartucho de la presente invención es autosuficiente. Los cartuchos de la presente invención, antes de la aplicación de una muestra, están esencialmente libres de líquido y se pueden considerar secos. El único fluido antes de la aplicación de la muestra de líquido, que puede estar o está presente en el cartucho será un gas, normalmente aire. Convenientemente, el único líquido requerido en los ensayos de la presente invención es la propia muestra de líquido.

[0027] En ciertos modos de realización, dichos uno o más reactivos se pueden depositar en una primera ubicación dentro de cada/dicho(s) canal(es) microfluídico(s). En otros modos de realización, dichos uno o más reactivos se pueden depositar en más de una ubicación dentro de cada/dicho(s) canal(es) microfluídico(s). Al menos uno de dichos uno o más reactivos se puede depositar dentro de la zona de detección, o bien no se deposita ningún reactivo dentro de la zona de detección. Los reactivos se pueden proporcionar inicialmente de forma líquida, que se deja secar por evaporación u otros medios. En términos de la presente invención, cuando los/dichos reactivos se presentan inicialmente en forma líquido, que se seca posteriormente, el término "seco" debe entenderse en el sentido de que menos del 10 %, 5 % o 1 % del líquido inicial permanece después del secado.

[0028] En ciertos modos de realización, la zona de detección puede estar más adelante de donde se han depositado dichos uno o más reactivos.

[0029] El término "más adelante", en el contexto de la presente invención, hace referencia a donde la muestra se ha aplicado al sistema y la dirección de flujo de la muestra.

[0030] Opcionalmente, tras la reacción de la muestra de líquido con dichos uno o más reactivos depositados dentro de cada/dicho(s) canal(es) microfluídico(s) y la transferencia de la muestra y otros reactivos a la zona de detección, el gas expulsado de la cámara sirve, opcionalmente, para eliminar el líquido de la zona de detección dentro del canal microfluídico, a fin de que cualquier analito o productos de reacción de los analitos capturados dentro de la zona de detección se pueda detectar en un ambiente esencialmente libre de líquido. Por consiguiente, en un modo de realización, la presente invención proporciona un cartucho y un método donde la detección tiene lugar en un ambiente esencialmente libre de líquido. Además, los inventores han observado que solo es necesario desplazar el líquido de la zona de detección con el uso de un volumen correspondiente de gas de la cámara. Por consiguiente, no es necesario el uso de un paso de lavado convencional, que podría emplear volúmenes significativos de fluido o fluidos, diseñado(s) para prevenir y/o minimizar la interferencia de la señal. Por consiguiente, convenientemente, la presente invención usa un gas, en un volumen mucho más bajo, para eliminar líquido y material en el líquido de la zona de detección del analito. Esto es bastante diferente de lo que se entendería en términos de realizar un paso de lavado convencional.

[0031] El cartucho microfluídico puede comprender una pluralidad de canales microfluídicos, donde toda la pluralidad de canales microfluídicos está en comunicación fluida con un único puerto de entrada de la muestra. El puerto de la muestra puede estar en comunicación con un canal microfluídico que se divide en dicha pluralidad de canales microfluídicos de acuerdo con la presente invención. Cada una de dicha pluralidad de canales microfluídicos puede estar en comunicación fluida con una respectiva cámara llena de gas, o dos o más canales microfluídicos pueden estar en comunicación fluida con una única cámara llena de gas. De acuerdo con la presente invención, cada cámara puede estar controlada por separado o de manera independiente, de modo que se permite el control independiente del movimiento de la muestra dentro de un canal microfluídico individual o se puede controlar el movimiento de la muestra en una pluralidad de dichos canales microfluídicos al mismo tiempo. Aparte de estar en comunicación fluida con uno o más canales microfluídicos en el cartucho, en algunos modos de realización, dicha(s) cámara(s) llena(s) de gas no están conectadas a ninguna otra característica que pueda estar presente en el cartucho microfluídico o lector asociado. Por ejemplo, la única abertura/salida de la cámara llena de gas puede ser la abertura con dicho(s) canal(es) microfluídico(s). Por consiguiente, dicha(s) cámara(s) llena(s) de gas puede(n) estar sellada(s) en términos de no tener una válvula, puerto u otro modo en comunicación con el exterior del cartucho. En un modo de realización, el puerto de entrada de la muestra está conectado a un primer extremo de cada/dicho(s) canal(es) microfluídico(s) y el segundo extremo de cada/dicho(s) canal(es) microfluídico(s) está conectado a la/dicha(s) abertura(s) de una o más de dichas cámaras llenas de gas. En este modo de realización, se puede considerar que la(s) cámara(s) llena(s) de gas están más adelante del puerto de entrada de la muestra y en un extremo opuesto de cada/dicho(s) canal(es) microfluídico(s) al puerto de entrada de la muestra.

[0032] A menos que el contexto estipule lo contrario, se entiende que el término "comunicación fluida" significa que se puede transportar un fluido, incluido un gas o un líquido, entre las partes relevantes.

[0033] Opcionalmente, el cartucho microfluídico puede contener además una o más características de sumidero, diseñadas para recoger residuos fluidos y/o el exceso de la muestra de líquido. Para evitar dudas, algunos modos de realización de la presente invención excluyen específicamente una o más características de sumidero, lo que podría ser beneficioso.

[0034] El diseño del cartucho de la presente invención se puede adaptar fácilmente para que lleve a cabo varios ensayos diferentes y de ahí que se pueda considerar como una plataforma de ensayo para una variedad de ensayos similares y/o diferentes. El cartucho y el/los canal(es) dispuestos en el mismo se pueden formar de cualquier manera que el destinatario experto conozca, entre las que se pueden incluir fotolitografía, grabado químico húmedo, ablación láser, moldeo por inyección, troquelado, grabado en relieve y técnicas de impresión. De acuerdo con el primer aspecto de la invención, el cartucho y los canales y otras características dispuestos en mismo, están formados por una composición de tres sustratos independientes: un primer, segundo y tercer sustrato, como un sustrato superior e inferior con un sustrato intermedio dispuesto entre los sustratos superior e inferior. Se pueden sellar las tres capas juntas mediante la aplicación de calor o el uso de un adhesivo. Además, la capa intermedia puede tener la forma de una capa adhesiva que puede adherirse a los sustratos superior e inferior.

[0035] Los tres sustratos son planos. En el primer y el tercer (p. ej., superior e inferior) sustratos y opcionalmente el segundo (p. ej., intermedio) tienen una naturaleza esencialmente uniforme. Es decir, el grosor de dicho sustrato es uniforme y no varía en toda la superficie del sustrato.

[0036] En un modo de realización específico, el sustrato inferior se adhiere al sustrato intermedio que tiene canales ya dispuestos en mismo. Se depositan los reactivos requeridos para llevar a cabo el ensayo en sus zonas de deposición específicas sobre el sustrato inferior, y se mantienen en su lugar, una vez los ha reconstituido la muestra, las paredes de los canales (formadas por la capa adhesiva intermedia) y se evita que se extiendan a lo largo del canal formado por características impresas sobre el sustrato inferior, por ejemplo, tinta hidrofóbica. De este modo, las característica en los cuatro lados evitan que los reactivos se extiendan hacia fuera de su zona de deposición. Entonces se secan los reactivos y se adhiere la última capa superior de sustrato a la capa intermedia para producir los cartuchos completamente formados. Los expertos en la técnica pueden imaginar muchos otros métodos de deposición de los reactivos del ensayo dentro del cartucho.

[0037] Los cartuchos de la presente invención se pueden formar por un procesamiento web o rollo a rollo conocido en la técnica, a partir de un rollo de película de polímero flexible, lámina de plástico o de metal.

[0038] Convenientemente, los inventores han encontrado que cuando el cartucho está formado por una composición de tres sustratos planos independientes no es necesario que los sustratos superior e inferior del cartucho tengan diferentes grosores ni que tengan porciones de diferentes grosores formadas de otros materiales. Por consiguiente, las capas superior e inferior tienen un grosor uniforme y pueden estar formadas por un único material. Esto simplifica la fabricación de los cartuchos y los costes asociados. El material usado para formar la capa superior y opcionalmente, las inferiores, puede ser flexible, pero en las dimensiones del canal y la cámara de gas es bastante rígido, pero en cierto modo elástico. Sorprendentemente, el sustrato que forma las superficies superior e inferior, en especial, la superficie superior exterior de la/cada cámara llena de gas puede ser elástica, a pesar de que el grosor de la superficie superior es uniforme en toda la superficie del sustrato.

[0039] El adhesivo que se puede usar para sellar las capas juntas también se puede combinar para facilitar la compresibilidad de cada/dicha cámara. Por consiguiente, la naturaleza comprimible de la cámara se puede deber en parte a la elasticidad del adhesivo, así como a la elasticidad del sustrato superior y opcionalmente del inferior. Al contrario que en el estado de la técnica, las cámaras llenas de gas de la presente invención no necesitan comprender una membrana o lámina flexible que forme una superficie exterior de la cámara, que esté hecha de un material diferente y/o que sea de un grosor o flexibilidad diferente en comparación con el sustrato empleado para formar el resto de la capa superior y opcionalmente, la inferior. Por consiguiente, la capa superior y opcionalmente, la capa inferior, está(n) hecha(s) de un único material de grosor uniforme en toda la capa. Idealmente, las capas superior e inferior están hechas del mismo material y tienen un grosor uniforme. Esto simplifica la fabricación de los cartuchos, lo que cabe considerar en términos de coste.

[0040] El cartucho puede estar formado de cualquier material adecuado, como policarbonato, poliolefinas, como copolímeros de olefina cíclica (COC), poliéster, poliestireno, PMMA, etc., y el/cada sustrato puede estar formado de un único material o de una pluralidad de ellos. En el modo de realización que comprende tres sustratos, el sustrato intermedio comprende un patrón cortado a través del sustrato, correspondiente a ciertas características del cartucho, como dichos canal(es), cámara(s) llena(s) de gas, sumidero de residuos y similares. Al aplicar y unir (por ejemplo, por termosellado, encolado, grapado y similares) los sustratos superiores e inferiores adecuadamente cortados, para unir el sustrato intermedio entre los sustratos superior e inferior, se puede proporcionar un cartucho en el que estén dispuestos los canales y otras características. Se puede proporcionar cada capa por separado o unidas entre sí, o las tres capas pueden estar conectadas entre ellas y la composición formada por capas plegadas una sobre otra a fin de formar el cartucho. Los sustratos superior y/o inferior pueden estar formados de, o recubiertos de un material diferente al del sustrato intermedio y/o se puede aplicar el material adhesivo a cualquiera de los sustratos para facilitar el pegado de los tres sustratos. Las características del sustrato superior y/o inferior se pueden diseñar para ubicarse junto a las características de un dispositivo lector (como se tratará de aquí en adelante), lo que puede facilitar la correcta ubicación del cartucho en el lector.

[0041] En un modo didáctico conveniente, a título informativo, la lectura de los ensayos de la presente invención está diseñada para detectarse ópticamente. En este sentido, un lector asociado incluirá medios de detección óptica, como un espectrómetro o fluorímetro, diseñado para detectar la radiación electromagnética que emite el área de detección del cartucho. Para la detección fluorescente, el espectrómetro o fluorímetro dentro del lector detectará la fluorescencia que emite el material dentro de la zona de detección. Por consiguiente, al menos una porción de la primera y tercera capas (p. ej., las capas superior e inferior) del cartucho diseñado para hacer frente al espectrómetro o fluorímetro en el lector debe ser transmisible ópticamente en un rango adecuado del espectro de radiación electromagnética. En caso de detección fluorescente, al menos la porción de la primera o tercera capa (p. ej., superior o inferior) del cartucho debe ser transmisible ópticamente en el rango que abarque una longitud de onda de excitación y una longitud de onda de detección. Por ejemplo, al menos la porción de la primera y tercera capa (p. ej., superior o inferior) del cartucho debe ser transmisible ópticamente en el rango 200-1200 nm.

[0042] Cuando las capas primera y tercera (p. ej., superior y/o inferior) están hechas de un único material, se apreciará que toda la primera y tercera capas (p. ej., superior y/o inferior) serán transmisibles ópticamente y no solo una porción de las mismas. Sin embargo, se pueden emplear pinturas y/o mascarillas para prevenir o minimizar la lixiviación o dispersión fuera de la zona de detección de la radiación electromagnética de longitud de onda adecuada. En un modo de realización, una porción de la tercera capa (p. ej., inferior), que abarca la zona o porción de detección puede estar, por tanto, recubierta de un material diseñado para maximizar la emisión de cualquier señal fluorescente hacia los medios de detección óptica del lector.

[0043] Los sustratos primero y tercero (p. ej., superior e inferior) pueden estar conectados por una bisagra que permite a los dos sustratos plegarse adyacentes entre sí con el sustrato intermedio dispuesto entre ellos. O bien se pueden proporcionar bisagras entre los sustratos primero y segundo (p. ej., superior e intermedio) y los sustratos segundo y tercero (p. ej., intermedio e inferior) de modo que, los sustratos primero, segundo y tercero (p. ej., superior, intermedio e inferior) se pliegan adyacentes entre sí y pueden estar formados a partir de una única lámina de sustrato.

[0044] Cabe destacar que dicha(s) cámara(s) llena(s) de gas está(n) diseñadas para colocarse junto a una característica o características en el lector diseñadas para entrar en contacto con una superficie exterior de dicha(s) cámara(s) llena(s) de gas (p. ej., cuando los sustratos superior y/o inferior tienen forma de composición de tres sustratos que se debe proporcionar al lector de manera esencialmente horizontal) y ser capaz de controlar la fuerza. p. ej., de compresión que se debe aplicar o retirar de una superficie exterior de la cámara. Aplicar una fuerza a la superficie exterior a la/cada cámara provoca que la cámara se deforme y que el gas dentro de la cámara salga expulsado de la cámara hacia un canal microfluídico. Por el contrario, una reducción posterior de la fuerza, p. ej., de descompresión, aplicada a la/cada cámara provoca que la cámara se deforme menos y que, opcionalmente, vuelva a un estado no deformado, de manera que el gas se vuelva a introducir en la cámara desde un canal microfluídico.

[0045] Se apreciará que, sin la aplicación de una fuerza, la cámara llena de gas normalmente comprenderá un volumen máximo de gas. Al aplicar fuerza, el gas se expulsará de la cámara llena de gas, por consiguiente, el volumen de gas dentro de la cámara se verá reducido. Una reducción posterior de la fuerza aplicada a la cámara permitirá que el gas se vuelva a introducir en la cámara, con un consiguiente aumento del volumen de gas dentro de la cámara llena de gas.

[0046] Normalmente el gas dentro de cada cámara es aire, aunque se pueden introducir otros gases o mezclas de gases. Por ejemplo, si uno de los reactivos depositados dentro de cada/dichos canal(es) microfluídico(s) son susceptibles a oxidarse o de lo contrario tienen una vida útil más breve cuando están presentes en el aire, el cartucho y los canales asociados y las cámaras pueden estar llenos de un gas inerte como nitrógeno o similares. Generalmente se hará referencia al gas como aire, pero no debe interpretarse como limitativo.

[0047] Normalmente en el uso, el cartucho se puede proporcionar o insertar dentro del lector antes de la aplicación de la muestra y aplicar la fuerza a dicha/cada cámara a fin de expulsar gas de dicha/cada cámara y hacia dicho/cada canal microfluídico. Se puede considerar que el cartucho está "preparado" para la aplicación de la muestra.

[0048] Se puede introducir una muestra, como una muestra de sangre, o cualquier otra muestra de líquido, dentro del cartucho por medio del puerto de entrada de la muestra. Se puede introducir la muestra directamente al hacer que la muestra entre en contacto con el puerto de entrada. O bien, se puede recoger primero la muestra con el uso de un medio de recogida de muestras y se puede hacer que este medio de recogida de muestras, como una tira reactiva, una micropipeta, un tubo capilar o similares, entre en contacto o se inserte dentro del puerto de entrada de la muestra a fin de que se pueda introducir la muestra dentro del cartucho y canal microfluídico. En algunos modos de realización, como al llevar a cabo un análisis de ácido nucleico, puede ser conveniente llevar a cabo cualquier análisis en un sistema cerrado. Por consiguiente, el medio de recogida de muestras diseñado para introducir la muestra dentro del cartucho microfluídico puede servir tanto para introducir la muestra como para el sellado del puerto de entrada de la muestra, una vez que el medio de recogida de muestras se haya insertado dentro/entrado en contacto con el puerto de entrada de la muestra.

[0049] A continuación de que la muestra haya entrado en contacto con/sido introducida dentro del puerto de entrada de la muestra del cartucho, la muestra se podrá introducir inicialmente dentro del canal microfluídico por medio de acción capilar. O bien, se puede introducir activamente la muestra en el canal microfluídico al reducir la fuerza aplicada a dicha/cada cámara de manera que el gas se introduzca en la cámara, que a su vez introduce la muestra de líquido en y a lo largo de dicho(s)/cada canal(es) microfluídico(s).

[0050] En un modo didáctico, se introduce la muestra de líquido inicialmente a lo largo de un único canal microfluídico, que se divide en una pluralidad de canales microfluídicos, pudiendo cada uno de dicha pluralidad de canales llevar a cabo un ensayo o más. De esta manera, se puede proporcionar una única muestra que a su vez se divide en varias porciones o alícuotas.

[0051] Una vez se ha introducido una muestra en el cartucho y dicho(s)/cada canal(es) microfluídico(s), como por medio de acción capilar y/o de introducir activamente la muestra a través del cartucho, el transporte adicional de fluidos dentro y a lo largo del cartucho y los canal(es) asociado(s) se controla/facilita con precisión por medio de presión controlada, como se aplica a dicha/cada cámara de gas que provoca que el gas se introduzca y/o salga expulsado de dicha(s)/cada cámara(s) llena(s) de gas. El gas que se vuelve a introducir en dicha/cada cámara normalmente servirá para introducir una muestra de líquido de dicho(s)/cada canal(es) microfluídico(s) hacia dicha/cada cámara debido al efecto de vacío y el gas expulsado de dicha/cada cámara empujará el líquido dentro de dicho/cada canal microfluídico fuera de dicha/cada cámara, hacia el puerto de entrada y opcionalmente dentro del sumidero de residuos fluidos, si lo hay.

[0052] Como se ha mencionado anteriormente, la característica de sumidero es completamente opcional. De acuerdo con la presente invención es posible asegurar que, mediante el control de fluidos y tratamiento adecuados de la cámara de gas, no se pueda expulsar del puerto para muestras una vez se ha introducido una muestra u otro líquido en el cartucho. Antes de la aplicación de la muestra, se puede comprimir al máximo cada/dicha cámara de manera que no sea posible expulsar la muestra del puerto de entrada de la muestra. Convenientemente, la compresión de cada/dicha cámara llena de gas antes de la aplicación de la muestra significa que tras, realizar un ensayo y liberar cualquier presión de compresión en cada/dicha cámara llena de gas, la muestra de líquido se introduce más en el cartucho y posiblemente en la cámara llena de gas, lejos del puerto de entrada de la muestra. Esto se puede ver como una característica de seguridad útil, en términos de aislar cualquier muestra, tras el ensayo, del usuario.

[0053] Se puede controlar el movimiento fluídico con mucha precisión mediante medios de control de fuerza en el lector. Además, el lector puede detectar opcionalmente la posición del fluido dentro de cada canal por medios como electrodos, colocados a lo largo de canales microfluídicos que están en contacto con el lector y que pueden retroalimentar la posición de cualquier líquido y/o fluido en cada/dicho canal microfluídico, permitiendo de este modo al lector determinar muy cuidadosamente la posición y/o velocidad del movimiento de fluido a través de la aplicación de fuerza/presión a la cámara llena de gas/aire.

[0054] Como se ha identificado, en el uso, la muestra se aplica al cartucho a través del puerto de entrada de la muestra como por medio de contacto directo por el sujeto/paciente u otros medios, por ejemplo, una pipeta, tubo capilar o similares. En un modo de realización preferido, el puerto de entrada de la muestra es una abertura en un lado o cara (p. ej., la cara superior) del cartucho. Es conveniente que el cartucho tenga la forma de un dispositivo plano generalmente fino que comprenda caras superiores e inferiores y cuatro bordes. En este arreglo, el puerto de entrada de la muestra se puede formar en uno de los bordes del cartucho o en la cara superior, de modo que el usuario únicamente necesita hacer que la muestra entre en contacto con la apertura formada en el borde o en la cara superior, a fin de permitir que el cartucho absorba la muestra. En el uso, el usuario hace que la muestra de fluido entre en contacto con el puerto/abertura y, en ciertos modos de realización, debido a las dimensiones de dicho(s) canal(es) dentro del cartucho, el fluido se introduce en el cartucho mediante acción capilar. Las dimensiones del puerto/abertura de la muestra pueden ser más pequeñas que las dimensiones del/de los canal(es). Por consiguiente, al expulsar fluido de dicho/cada canal microfluídico, un sumidero de residuos fluidos opcional ofrece un gran espacio vacío al que se pueden dirigir la muestra de fluido de residuo y cualquier reactivo/etiquetas no reaccionado hacia y dentro del sumidero de residuos, en vez de hacia fuera a través del puerto de entrada de la muestra.

[0055] En ciertos modos de realización no se proporciona un sumidero de residuos. Como no es necesario eliminar la muestra, o solamente es necesario eliminar la muestra y los reactivos/etiquetas no reaccionados de la zona de detección dentro de dicho/cada canal microfluídico. Se puede llevar a cabo el control preciso del movimiento de fluido de manera que el gas expulsado de dicha/cada cámara llena de gas sea suficiente para simplemente retirar la muestra y cualquier reactivo/etiqueta no reaccionado/no deseado de la zona de detección. La compresión máxima inicial de la/dicha cámara llena de gas, antes de la aplicación de la muestra de líquido, asegura que no sea posible empujar la muestra más allá del puerto de entrada de la muestra. Este control preciso del movimiento de fluido dentro del canal microfluídico significa que pueden no requerirse un sumidero de residuos ni grandes volúmenes de un líquido de lavado, lo que resulta en una simplificación de la fabricación/uso y un ahorro de costes.

[0056] Dicho(s) canal(es) microfluídico(s) del cartucho también pueden comprender una o más características de detención del fluido, diseñadas para evitar que la muestra pase a través de la característica de parada, gracias a la acción capilar por sí sola. Es decir, se debe forzar activamente la muestra más allá de dicha(s) característica(s) de parada o más allá de dichos canal(es) microfluídico(s) mediante el empleo de una fuerza como la fuerza de compresión y/o de descompresión que actúe sobre la cámara llena de gas, lo que sirve para introducir o empujar la muestra de líquido dentro del cartucho. La característica de parada puede ser un material hidrofóbico (p. ej., pintura conductora o no conductora) o un proceso o material que cambia las propiedades de la superficie de un canal, creando, por tanto, un diferencial hidrofílico/hidrofóbico (p. ej., por medio de ablación láser, rayado de la superficie, eliminación de material superficial, evaporación de materiales metálicos, etc.) diseñado para lindar con/ser una característica de pared o está recubierto en una pared (p. ej., superior, lado(s) y/o inferior) de un canal. En un modo de realización donde los canales se forman gracias a tres sustratos intercalados entre sí formando los canales de este modo, el material hidrofóbico se puede aplicar a los sustratos superior y/o inferior, de manera que cuando los tres sustratos estén intercalados entre sí, el material hidrofóbico de parada forma una característica en la superficie superior o inferior de dicho canal (cuyas paredes están formadas por la capa intermedia). Alternativa o adicionalmente, se puede proporcionar un pequeño respiradero de sentido único adyacente al canal o dentro de este, cuyo respiradero puede permitir que el aire se ventile al exterior del cartucho o a un vacío dentro del cartucho, pero no permite que el aire ni otros líquidos entren en dicho(s) canal(es) microfluídico(s). El líquido que entre en el cartucho por acción capilar llenará el respiradero, pero no más allá de este, sin la aplicación de una fuerza adicional.

[0057] En un modo de realización donde se proporcionan múltiples canales a fin de llevar a cabo ensayos independientes y/o repetitivos, se puede proporcionar una característica de parada de fluidos en cada canal más adelante del puerto de entrada de la muestra. De esta manera, una muestra entraría inicialmente en el cartucho a través del puerto de entrada de la muestra, pero se evita que llene la totalidad de cada canal microfluídico mediante una característica de parada de fluidos. A fin de empezar cada ensayo, se debe forzar activamente la muestra más allá de la parada de fluidos y a lo largo de cada canal microfluídico a fin de que entre en contacto con uno o más reactivos, al volver a introducir el gas en dicha/cada cámara de gas. Convenientemente esto asegura que cada ensayo pueda empezar al mismo tiempo o en diferentes momentos según sea necesario y también sirve para minimizar los problemas que puedan surgir debido a las diferencias en la muestra, como los valores del hematocrito y de ahí la diferencia en la viscosidad, por ejemplo.

[0058] También se prefiere que se coloque una característica de parada más arriba del sumidero de residuos fluidos, si lo hay, a fin de que la muestra, en el momento de la aplicación inicial, no fluya hacia la cámara de residuo. Cuando se aplica una fuerza suficiente a dicha/cada cámara llena de gas a fin de empujar activamente la muestra de líquido dentro de dicho(s)/cada canal(es), el líquido puede pasar la característica de parada más arriba del sumidero de residuos fluidos y entrar en el sumidero de residuos. Esta característica de parada también puede estar diseñada de tal forma que, aunque evite que el fluido entre en el sumidero con el contacto inicial, la muestra puede finalmente humedecer más allá de esta característica de parada y fluir hacia el sumidero, pero solo una vez la muestra haya llenado los canales de la muestra. Una vez estos canales están llenos, la fuerza capilar en la característica de parada aumenta y el exceso de muestra puede fluir sobre la característica de parada y hacia el sumidero. De este modo el sumidero puede actuar como un desagüe para el exceso de aplicación de la muestra y la característica de parada de fluidos puede actuar como una puerta de sincronización que controla este movimiento de líquido. En otros modos de realización no se requiere esta característica de parada. El sumidero se puede llenar con la muestra y actuar como un depósito del que se puede extraer la muestra al reducir la fuerza en la(s) cámara(s) llena(s) de gas a fin de transferir esta muestra desde el sumidero hacia el/los canal(es) de la muestra.

[0059] En un modo de realización, el sumidero de residuos está diseñado para ser un área vacía del cartucho en la que el fluido/muestra empleado o el fluido que no se necesita o que no se considera deseado se pueda evacuar. Por ejemplo, la sangre entera contiene muchas proteínas y otros agentes que pueden interferir en las reacciones del ensayo y/o detección de analitos capturados por medio de detección fluorescente, por ejemplo. La presente invención permite la unión y/o reacción inicial de cualquier analito llevada a cabo dentro de loa muestra (p. ej., sangre entera), pero todo o esencialmente todo el material no unido presente en la muestra de líquido y el líquido restante tras la reacción se puede evacuar de la zona de detección posteriormente, opcionalmente a la cámara de residuos, permitiendo más reacciones, y/o se puede llevar a cabo la reacción en un ambiente gaseoso o esencialmente libre de líquido.

[0060] Sin embargo, como se ha mencionado anteriormente, puede no ser necesario incluir un sumidero de residuos. Convenientemente, los presentes inventores han observado que el gas expulsado de dicha/cada cámara al aplicar una fuerza a dicha/cada cámara de gas es suficiente para empujar/transportar la muestra de líquido y el material no unido/no reaccionado lejos de la zona de detección. Por consiguiente, únicamente se retiene el material capturado, unido o inmovilizado en la zona de detección en un ambiente esencialmente libre de líquido, y convenientemente, se realiza fácilmente la detección de cualquier material de este tipo.

[0061] Así como cada/dicho(s) canal(es) microfluídico(s), el cartucho de la presente invención puede comprender una o más características de electrodo que entran en contacto con dicho(s) canal(es) y de ahí, la muestra, una vez introducida en el cartucho. Los electrodos están diseñados para entrar en contacto con los contactos eléctricos del lector, lo que le permite tomar una variedad de lecturas, si procede. Por ejemplo, un electrodo o más en el cartucho pueden estar diseñados para detectar la carga correcta del cartucho y el lector puede indicar al usuario si el cartucho se ha a) introducido correctamente en el lector o no, y/o b) la muestra se ha cargado correctamente en el cartucho, por ejemplo, a una función de detención de fluidos. El/los electrodo(s) también pueden llevar a cabo una o más mediciones eléctricas en la propia muestra. Por ejemplo, cuando la muestra es una muestra de sangre entera, el/los electrodo(s) pueden realizar una medición del hematocrito en la muestra, que puede ser importante para determinar una concentración precisa del analito que se debe detectar. Las mediciones de impedancia y/o conductividad se pueden determinar dependiendo de la muestra estudiada. Por consiguiente, los cartuchos de la presente invención no solo pueden detectar si un analito está presente en una muestra o no por medio de la unión/reacción con cualquier analito, sino que también se pueden realizar mediciones eléctricas. El/los electrodo(s) también se pueden usar para confirmar la correcta eliminación de la muestra del área de detección mediante el gas expulsado de la cámara llena de gas, ya que habrá un cambio significativo en la conductividad detectada cuando un líquido está presente o ausente. También se pueden proporcionar los electrodos a la cámara llena de gas a fin de indicar el grado de compresión de cada/dicha cámara.

[0062] La muestra que se debe aplicar en el cartucho puede ser cualquier muestra de líquido adecuada. Por ejemplo, puede ser una muestra de fluido obtenida de un sujeto, como una muestra de sangre entera, plasma, saliva, semen, sudor, suero, menstruación, líquido amniótico, lágrimas, un hisopo de tejido, orina, líquido cefalorraquídeo, mucosa y similares. Debe apreciarse que los sistemas de ensayo de la presente invención se pueden aplicar en el ámbito de la salud humana, incluidos los grandes mercados en crecimiento de diagnóstico in vitro (p. ej., detección de cáncer, cardiopatías, abuso de drogas y enfermedades infecciosas, incluidas las infecciones bacterianas, fúngicas y virales). Los ensayos también se pueden utilizar para hacer pruebas de droga y la lucha contra las drogas. Sin embargo, el sistema también se puede aplicar en entornos ambientales donde conviene detectar, por ejemplo, agentes tóxicos o agentes infecciosos como bacterias, hongos o virus. Por consiguiente, se pueden tomar muestras de ríos o lagos o hisopos de superficies sólidas a fin de obtener una muestra de líquido que proporcionar al cartucho. Los sistemas de ensayo también se pueden utilizar en aplicaciones veterinarias. Básicamente cualquier ensayo en el que se pueda proporcionar una muestra en forma líquida o convertida a una forma líquida se puede utilizar en la presente invención, p. ej., se puede obtener una muestra de aliento al soplar en un líquido y usar el líquido de acuerdo con la invención. También se pueden tomar hisopos de superficies y colocarlos dentro de un líquido a fin de proporcionar una muestra de líquido.

[0063] Por ejemplo, la muestra puede incluir materiales obtenidos directamente de una fuente, como una muestra de sangre entera, así como materiales tratados previamente con el uso de técnicas como filtración, precipitación, dilución, destilación, mezclado, concentración, inactivación de agentes interferentes, etc. Estos pasos se pueden llevar a cabo antes de que se introduzca la muestra en el cartucho o puede llevarlos a cabo el propio cartucho.

[0064] Se puede introducir la muestra antes de que se inserte el cartucho en el dispositivo lector o después de que el cartucho se haya insertado en el lector. En algunos modos didácticos, el cartucho se insertará en el dispositivo lector antes de que se aplique la muestra y que se aplique una fuerza a la cámara llena de gas a fin de expulsar el gas de dicha/cada cámara. Esto puede preparar el cartucho de forma eficaz para que esté listo para la aplicación de la muestra. Reducir la fuerza aplicada a dicha/cada cámara volverá a introducir el gas en la cámara y a su vez, introducirá la muestra en dicho(s)/cada canal(es) microfluídico(s) y a lo largo de estos. El cartucho también puede estar diseñado de manera que se pueda introducir la muestra inicialmente por medio de acción capilar. De esta manera, se puede proporcionar una característica de parada, como se ha descrito anteriormente, para limitar la entrada de la muestra en dicho(s) canal(es) microfluídico(s). El transporte adicional de la muestra es un resultado de la expulsión o introducción del gas de/en dicha(s)/cada cámara(s) llena(s) de gas. A fin de que se pueda introducir la muestra inicialmente por medio de acción capilar, es necesario que la muestra desplace el gas, presente en dicho(s) canal(es) microfluídico(s). Esto se puede lograr por medio de la salida de una válvula o similares del canal microfluídico hacia fuera del cartucho. En un modo de realización, la válvula es una válvula de sentido único diseñada para solo permitir que el gas salga del cartucho y no permite que se introduzca gas o líquido en el cartucho.

[0065] La válvula puede ser, por ejemplo, un pequeño orificio o hendidura posicionada adyacente o a poca distancia de una característica hidrofóbica de parada diseñada para evitar el transporte adicional de la muestra dentro de dicho(s)/cada canal(es) microfluídico(s) mediante la acción capilar por sí sola. Cada válvula puede estar en comunicación fluida con dicho/cada canal microfluídico por medio de un canal de dimensiones más reducidas que dicho/cada canal microfluídico en sí mismo (como menos del 50 %, 25 % o 20 % del ancho de dicho/cada canal microfluídico). En el uso, cuando se retira la muestra de la zona de detección, a lo largo de dicho/cada canal microfluídico, después de que tenga lugar el proceso de reacción, la muestra se dirige favorablemente hacia el puerto de entrada de la muestra y/o el sumidero de residuos fluidos si lo hay, en vez de hacia la válvula, debido a que las dimensiones de dicho/cada canal microfluídico son mayores que el canal que conecta el canal microfluídico a la válvula. Además, en el momento de la aplicación inicial de la muestra, una pequeña cantidad de la muestra puede llenar el canal de dimensiones más reducidas y actuar como barrera para el flujo adicional de fluido entre la válvula y el canal microfluídico tras la aplicación de la muestra. Sin estar limitado por la teoría, se espera que la capilaridad relativamente mayor del canal más pequeño en comparación con el/dicho canal microfluídico principal mayor sea la causa de la barrera. La pequeña cantidad de la muestra puede permanecer en el canal más pequeño y en efecto, sellar la válvula tras el llenado capilar. De esta manera, la válvula solo tiene efecto durante el llenado capilar inicial y a partir de ahí, el gas que se introduce o expulsa de dicha/cada cámara lleva a cabo o controla el transporte de líquido dentro del cartucho.

[0066] El sistema de válvula para uso de acuerdo con el cartucho reivindicado en la presente puede comprender: una abertura de ventilación o hendidura en una superficie superior o inferior del cartucho; un canal microfluídico de dimensiones más reducidas que el/dicho canal microfluídico del cartucho, cuyo canal microfluídico de dimensiones más reducidas está en comunicación fluida con la abertura de ventilación o hendidura y el/dicho canal microfluídico del cartucho.

[0067] Convenientemente el sistema de válvula está colocado de tal manera que esté adyacente a un tope capilar del/de dicho canal microfluídico, de manera que en el momento en que se introduce la muestra en el cartucho, la muestra llena hasta el tope capilar mediante acción capilar y una porción de la muestra también llena, al menos parcialmente, el microcanal de dimensiones más reducidas. La porción de la muestra que llena al menos parcialmente el microcanal de dimensiones reducidas actúa como una barrera para el transporte de fluido adicional a lo largo del microcanal de dimensiones más reducidas y la exportación de fluidos a través del respiradero o hendidura.

[0068] Convenientemente, un cartucho de la presente invención puede estar diseñado para realizar una pluralidad de ensayos (repeticiones del mismo ensayo y/o ensayos diferentes) sobre una muestra de líquido. Las dimensiones del cartucho y los canales asociados son tales que todos estos ensayos se llevan a cabo, idealmente, a partir de una muestra de líquido, como una muestra de sangre que se puede obtener de un pinchazo en el dedo, que es menos de 100 jl, 50 |jl, como menos de 40 jl, 30 j l o incluso 20 j l o menos. De esta manera es posible realizar un ensayo o un ensayo dentro de un solo canal de un cartucho que emplee menos de 10 jl, como menos de 7 jl, 5 j l, o incluso 2 j l o menos de una muestra de líquido, como sangre. Esto es considerablemente menos de lo necesario para el análisis llevado a cabo en hospitales en analizadores del tamaño de una mesa o en otras plataformas de lugares de asistencia conocidos.

[0069] El analito que se debe detectar puede ser cualquier analito deseado y puede incluir proteínas, péptidos, anticuerpos, ácido nucleico, microorganismos (como bacterias, hongos y virus), agentes químicos, bioquímicos, toxinas, medicamentos, enzimas, metabolitos, fracciones celulares, antígenos y similares. Por ejemplo, el sistema de la presente se puede adaptar para detectar cualquier tipo de analito que se pueda unir a un agente aglutinante adecuado o reaccionar con un(os) reactivo(s) adecuado(s), cuyo producto se puede detectar y opcionalmente se puede unir mediante un agente aglutinante adecuado. El agente aglutinante puede ser cualquier agente adecuado que sea capaz de unirse específicamente al analito o producto de reacción que se deba detectar. Por ejemplo, si el analito es una proteína o péptido, el agente aglutinante puede ser un receptor o anticuerpo que sea capaz de unirse específicamente a la proteína/péptido. Por el contrario, un anticuerpo se puede unir mediante una proteína/péptido con el que el anticuerpo esté específicamente diseñado para unirse. Los ácidos nucleicos se pueden unir mediante otros ácidos nucleicos que permitan específicamente la hibridación del ácido nucleico del analito. Los microorganismos se pueden unir mediante anticuerpos que se unen específicamente a proteínas de la superficie del microorganismo. Los agente químicos, toxinas, medicamentos, metabolitos que se pueden unir mediante fracciones químicas capaces de unirse o reaccionar a los analitos químicos mencionados anteriormente a través de reacciones de unión adecuadas o afinidades. Los expertos en la técnica conocen bien muchos tipos de técnicas de unión.

[0070] Además, el/dicho reactivo puede ser una enzima o un sustrato enzimático. Por ejemplo, los analitos como la glucosa se pueden detectar a través de metodologías enzimáticas bien descritas, como un producto de reacción formado tras la reacción de la enzima con la glucosa, que se puede detectar mediante el uso de técnicas de detección electroquímica u óptica conocidas por el destinatario experto. Se pueden hacer estas mediciones como mediciones independientes o en combinación con otros analitos que se deben detectar en la muestra.

[0071] Debería apreciarse que la referencia en la presente memoria a los complejos analito/agente aglutinante del analito incluye complejos en los que la forma del analito encontrada en la muestra de líquido no se modifica, o donde se ha modificado el analito a través de la reacción con un reactivo adicional y de ahí que se pueda considerar como un producto de reacción del analito.

[0072] El propio agente aglutinante se puede fijar directa o indirectamente a una pared o superficie de dicho(s) canal(es) microfluídico(s) dentro del cartucho, mediante la unión adecuada a la pared o superficie, por ejemplo, por medio de adsorción física, acoplamiento químico covalente o unión química no covalente (p. ej., biotina-avidina) o una combinación de cualquiera de los anteriores. En un modo de realización preferido, el agente aglutinante tiene la forma de una partícula que comprende una fracción aglutinante y la fracción aglutinante se puede unir, directa o indirectamente, por ejemplo, mediante una unión química no covalente (p. ej., biotina- avidina) a la superficie de la partícula. Los modos de realización adicionales también podrían incluir adsorción física, acoplamiento químico covalente, unión química no covalente (p. ej., biotina- avidina) o cualquier combinación de estos a la superficie de un agente magnético como una partícula magnética. Los agentes/partículas magnéticos funcionalizados para comprender el agente aglutinante unido al mismo se pueden depositar simplemente dentro de dicho(s) canal(es) microfluídico(s) del cartucho, de manera que al aplicar la muestra en el cartucho e introducirse en/a lo largo dicho(s)/cada canal(es), los agentes/partículas magnéticos funcionalizados quedan resuspendidos por la muestra de líquido y de ahí que entren en contacto con cualquier analito de la muestra. El área o áreas de deposición para la unión y/u otros reactivos pueden estar definidas específicamente por el uso de una parada hidrofóbica u otras características en uno o ambos extremos del área de deposición, a través de las técnicas descritas previamente a fin de separar, opcionalmente, esta área o áreas de la zona/área de detección. Si procede, esto puede asegurar que no se obtienen valores de fondo elevados debido a que los componentes del reactivo (p. ej., partículas fluorescentes de látex) se secan en el área/zona de medición/detección.

[0073] Como se ha mencionado anteriormente, así como los agentes aglutinantes, el cartucho puede contener o contener alternativamente uno o más reactivos depositados dentro de dicho(s) canal(es) microfluídico(s), cuyos reactivos pueden facilitar la detección del analito o analito capturado. Por ejemplo, dicho uno o más reactivos pueden incluir una etiqueta que se ha adaptado para unirse específicamente al analito que, por consiguiente, facilita su detección, o una enzima que reacciona con un analito a fin de generar un producto de reacción del analito. Por consiguiente, de acuerdo con la presente invención, los ensayos descritos en la presente memoria se pueden usar para detectar un analito o un producto de reacción del analito del mismo.

[0074] El analito unido se puede detectar directamente siempre que el analito unido sea capaz de generar una señal detectable, o en el momento en que se puede producir la unión del analito, de manera que se genere un producto de reacción y se pueda detectar el producto de reacción. Sin embargo, en un modo de realización preferido, el analito unido entra en contacto con una etiqueta capaz de unir el analito unido y posteriormente se detecta el complejo etiqueta/agente aglutinante/analito. La propia etiqueta se puede unir a una fracción aglutinante adicional que también es capaz de unirse específicamente al complejo agente aglutinante/ analito. Normalmente, la etiqueta es capaz de unirse a una porción diferente del analito a la que se une el primer agente aglutinante o es capaz de unirse a una región del complejo agente aglutinante/analito formada únicamente por la generación de este complejo.

[0075] El analito unido se puede transportar a la etiqueta dentro de una región diferente del canal microfluídico por medio de la introducción del gas a la cámara llena de fluido, que como consecuencia introduce la muestra de fluido más allá del canal microfluídico en dirección a dicha/cada cámara llena de gas.

[0076] Conveniente el agente aglutinante y cualquier agente/etiqueta de detección se encuentran en estado seco cuando se depositan en el/los canal(es) microfluídico(s) del cartucho, de modo que se pueden almacenar a largo plazo y reconstituirse mediante la muestra de líquido en el momento en que la muestra de líquido fluye en/a lo largo del/de los canal(es) microfluídico(s).

[0077] En un modo de realización, el agente/etiqueta aglutinante y/o de detección diseñados para facilitar la detección del analito, se coloca inicialmente más adelante (respecto a la dirección, la muestra fluye en el cartucho tras haberse introducido) de una primera característica de parada. De esta manera, dicho agente aglutinante y/o agente de detección no entra inicialmente en contacto con la muestra en el momento de aplicación inicial de la muestra y llenado capilar dentro del cartucho. Únicamente cuando se reduce una fuerza aplicada a dicha/cada cámara llena de gas y el gas se vuelve a introducir en la cámara llena de gas, se introduce la muestra más allá de dicho/cada canal microfluídico y se pone en contacto con el agente aglutinante y/o el agente de detección.

[0078] En un modo didáctico, el transporte de la muestra a lo largo del canal microfluídico puede ocurrir en una pluralidad de etapas. Por ejemplo, tras la aplicación inicial de la muestra y llenado capilar, la muestra se puede introducir a lo largo de una primera porción de dicho/cada canal microfluídico mediante una reducción controlada de la fuerza aplicada a dicha/cada cámara de gas y que el gas se vuelva a introducir en dicha/cada cámara llena de gas de una manera controlada y precisa. La primera porción de dicho/cada canal microfluídico puede comprender dicho agente aglutinante, por ejemplo. Por consiguiente, la introducción de la muestra de fluido en la primera porción permite que el agente aglutinante reaccione con cualquier analito que pueda estar presente en una muestra de líquido. A partir de ahí, la muestra y el agente aglutinante se pueden introducir en una segunda porción de dicho/cada canal microfluídico mediante una reducción adicional de la fuerza aplicada a dicha/cada cámara de gas, de modo que se introduce más gas en dicha/cada cámara llena de gas, que a su vez introduce la muestra y el agente aglutinante en la segunda porción de dicho/cada canal. Por ejemplo, un reactivo o etiqueta adicional puede estar presente en la segunda porción y, la muestra y el agente aglutinante se ponen en contacto con esta. De esta manera, se pueden realizar fácilmente varios pasos o etapas independientes en relación con un ensayo concreto y cada paso/etapa puede requerir un periodo de tiempo diferente a los otros. Debería apreciarse que se pueden prever fácilmente más de dos etapas, como tres, cuatro o más etapas, efectuándose cada etapa mediante una reducción adicional controlada de la fuerza aplicada a la/cada cámara llena de gas. Convenientemente, se puede controlar independientemente cada cámara de gas. De esta manera, también es posible realizar una pluralidad de diferentes tipos de ensayo con el uso de un único cartucho de la invención. De esta manera, se proporciona cada canal independiente con el/los reactivo(s) necesario(s) para realizar un ensayo o ensayos concretos y el lector está programado para llevar a cabo el número necesario de pasos de compresión/descompresión de la cámara de gas para cada ensayo en concreto. Por lo que los cartuchos y el lector asociado de la presente invención son capaces de llevar a cabo, de forma esencialmente simultánea, varios ensayos discretos y diferentes que pueden requerir reactivos, tiempos de reacción, un número de pasos, etc. diferentes.

[0079] Aunque la descripción anterior trata sobre cómo introducir o empujar la muestra de líquido paso a paso, se apreciará que, debido a la naturaleza controlable de los medios de control de fuerza, es posible comprimir y descomprimir de forma reversible una cámara llena de gas a grados minúsculos o variables, como para permitir empujar y tirar de la muestra de líquido en cualquier momento y permitir un efecto de mezclado. Por consiguiente, por ejemplo, cuando la muestra de líquido se transporta a una región del canal microfluídico que incluye uno o más reactivos que se debe(n) reconstruir mediante la muestra de líquido, en el momento en que alcance el área en la que se depositan uno o más reactivos, se puede empujar y tirar de la muestra líquida hacia delante y hacia atrás usando pequeñas compresiones/descompresiones de cada/dichas cámaras llenas de gas, durante un periodo de tiempo, para facilitar la reconstitución o mezclado de dicho reactivo o más dentro de la muestra de líquido.

[0080] El control e implementación necesarios de los métodos y ensayos de la presente invención se pueden facilitar mediante el uso de un dispositivo de microprocesamiento adecuado y un software asociado dentro del lector.

[0081] En otro modo de realización, tras la fase inicial de unión entre la muestra y el agente aglutinante, como una partícula magnética, se pueden transportar los complejos agente aglutinante-analito formados dentro de la muestra de líquido a una región más adelante del canal, donde la etiqueta está colocada de forma seca dentro del canal microfluídico. La muestra de líquido resuspende/rehidrata la etiqueta y permite la unión de la etiqueta a los complejos agente aglutinanteanalito. El transporte de la muestra de líquido y cualquier otro material reconstituido se debe a la descompresión de cada/dicha cámara llena de gas que vuelve a introducir gas en cada/dicha cámara llena de gas. Volver a introducir gas/aire en cada/dicha cámara llena de gas provoca un efecto de vacío que sirve para introducir la muestra de líquido a lo largo de dicho/cada canal microfluídico. Este método puede permitir un mayor control de rehidratación de los agentes depositados y la dispersión homogénea del reactivo.

[0082] En otro modo de realización, se depositan el agente aglutinante y la etiqueta en la misma región de dicho/cada canal microfluídico. La muestra rehidrata estos reactivos esencialmente al mismo tiempo que permite que las reacciones de unión y etiquetado ocurran al mismo tiempo. En este modo de realización, todos los reactivos pueden entrar en contacto con la muestra, entonces el lector acumula los complejos agente aglutinante-analito dentro del área de detección por medio de la aplicación de un imán/electroimán. A diferencia de otros dispositivos de la técnica anterior, la fuerza magnética/del imán puede estar diseñada para simplemente acumular o concentrar las partículas magnéticas dentro de la zona de detección. Por consiguiente, la fuerza magnética puede no servir para introducir o mover las partículas magnéticas longitudinalmente a lo largo de dicho/cada canal microfluídico, sino para concentrar y mantener cualquier complejo en un área de la zona de detección. En un modo de realización, las partículas magnéticas se pueden depositar inicialmente dentro del canal microfluídico en una ubicación en el lugar opuesto donde se debe aplicar la fuerza magnética. Por ejemplo, las partículas magnéticas se pueden depositar en el/a lo largo del fondo de un canal y la fuerza magnética debe entrar en contacto con/aplicarse a la superficie superior del cartucho. De esta manera, las partículas magnéticas se introducirán lateralmente (o perpendicularmente al flujo de la muestra de líquido dentro del canal) a través del canal al aplicarse la fuerza magnética. Se espera que el proceso de introducir activamente las partículas magnéticas a través de la muestra de líquido aumente el número de eventos de captura posibles, que puede ocurrir entre las partículas magnéticas funcionalizadas y el analito, que puede estar presente en la muestra de líquido.

[0083] En un modo didáctico se proporciona un electroimán colocado para alinearse con la zona de detección del cartucho una vez se haya insertado correctamente dentro del lector. Se pueden introducir los complejos partícula-analitoetiqueta en la zona de detección mediante el movimiento fluido controlado y solo se aplica la fuerza electromagnética una vez están en la zona de detección. O bien se puede adaptar el electroimán para proporcionar un campo magnético centrado dentro de la zona de detección. Esto puede servir para concentrar los complejos etiqueta-analito-partícula dentro de una porción definida de la zona de detección, en vez de en toda la zona de detección. Alternativamente al imán presente en el lector, se puede proporcionar un imán o el campo electromagnético adecuado que genere circuitos dentro del propio cartucho. Por ejemplo, el campo electromagnético que genera circuitos se puede colocar de forma adyacente a la zona de detección e incluir conectores eléctricos o similares con el fin de que entre(n) en contacto con los conectores correspondientes dentro del lector. Una vez conectados entre sí, el lector es capaz de proporcionar las señales eléctricas necesarias para generar la fuerza electromagnética.

[0084] A fin de facilitar la detección de un analito unido puede ser conveniente eliminar la muestra de líquido residual de dicha/cada área de detección en la que se deba detectar el analito unido. Cuando es necesario, la presente invención lo logra mediante el uso del gas presente en dicha/cada cámara llena de gas al retirar/empujar la muestra de líquido reaccionado o residual de dicha/cada zona de detección del canal microfluídico, y si lo hay, hacia la cámara de residuos y dentro de esta. Entonces se puede detectar y/o cuantificar el analito unido, como un complejo partícula magnéticaanalito-etiqueta, en un ambiente esencialmente libre de líquido o esencialmente gaseoso. Se debe entender que el analito unido todavía puede estar "húmedo", es decir, que puede haber algún recubrimiento líquido residual, circundante o asociado de otro modo al analito unido, pero el analito unido, según lo entiende el lector experto, no está presente en un líquido a granel. Por ejemplo, el analito unido puede permanecer hidratado (p. ej., no se considera que esté en un estado "seco") durante la detección, aunque no esté presente en un líquido a granel.

[0085] Convenientemente, mediante el control preciso del movimiento del gas dentro y fuera de dicha/cada cámara de gas se puede controlar con precisión el ritmo del movimiento del líquido a lo largo de cada canal, en cualquier dirección. Por ejemplo, puede ser conveniente que la reconstitución de los reactivos secos depositados dentro de dicho/cada canal ocurra rápido, pero la eliminación de la muestra de líquido y el material no unido después de que tenga lugar cualquier reacción ocurre relativamente despacio. Por consiguiente, el lector y los medios de control de fuerza asociados son capaces de variar o alterar la velocidad de expulsión o entrada de gas de/en dicha/cada cámara de gas con su correspondiente efecto en la velocidad/ritmo del movimiento de líquido en dicho/cada canal. Los diferentes ensayos pueden requerir velocidades de reconstitución y/o eliminación de líquido diferentes y también se pueden controlar independientemente mediante los medios de control de fuerza en combinación con programación o software asociado.

[0086] Además, a través del control riguroso de los medios de control de fuerza, es posible controlar de forma precisa volúmenes muy pequeños de expulsiones/entradas de gas de/en dicha/cada cámara de gas, con un pequeño movimiento correspondiente de la muestra de líquido. Por ejemplo, es posible que el volumen de gas que se expulse de/introduzca en dicha/cada cámara llena de gas en incrementos iguales o inferiores a 500 nl, como iguales o inferiores a 200 nl, 100 nl, o incluso 50 nl, 25 nl, o 15 nl, 10 nl o incluso inferiores. Estos pequeños volúmenes de movimiento de gas resultan en movimientos lineales correspondientes muy pequeños del líquido en dicho/cada canal.

[0087] Los inventores han observado que, cuando se lleva a cabo la detección en un ambiente esencialmente libre de líquido, es posible usar estos volúmenes muy pequeños de gas para eliminar la muestra de líquido y/o material no capturado de solo la zona de detección, o incluso una porción de los mismos y de ahí proporcionar el analito capturado o el producto de reacción del analito en un ambiente esencialmente libre de líquido en el que el gas ha eliminado el líquido a granel y el material no capturado. Esto es muy diferente de lo que se consideraría como un paso de lavado convencional en la materia, que usaría grandes volúmenes de un fluido, normalmente un líquido, para lavar la zona de detección de la muestra/el analito unido, etc. antes de llevar a cabo el paso de detección. De hecho, el uso de aire en la presente invención no se puede considerar como un lavado, sino simplemente como la eliminación de la muestra de líquido y material no capturado dentro de esta. Por consiguiente, cuando se necesite eliminar la muestra de líquido y/o material no capturado de la zona de detección, la presente invención es capaz de usar un volumen de gas esencialmente equivalente (o poco mayor, p. ej., 15 nl, 25 nl, 50 nl, 100 nl o 200 nl) en volumen al volumen de la zona de detección o porción de la misma donde ocurre la detección, ya que esto es suficiente para eliminar la muestra de líquido de la zona o porción de detección, dejando el analito o producto de reacción del analito en un ambiente esencialmente libre de líquido. Generalmente, se necesitarían muchos volúmenes de lavado en comparación con el volumen de la muestra en un paso convencional de lavado.

[0088] Además, en términos relativos, se puede requerir solo una pequeña proporción, como menos del 50 %, 40 % o 25 % del volumen de dicha(s)/cada cámara(s) de gas para controlar el transporte de la muestra de líquido dentro de dicho/cada canal y/o la eliminación de la muestra de líquido de dicha/cada zona de detección, cuando sea necesario.

[0089] Cada cartucho puede estar diseñado para llevar a cabo la detección de un único analito o detecciones de analitos múltiples. Además, cada cartucho puede comprender más de un sistema de canal microfluídico, de modo que se puede llevar a cabo más de un ensayo usando un único cartucho. También es posible llevar a cabo más de un ensayo por canal microfluídico. De esta manera cada cartucho puede llevar a cabo muchas repeticiones y/o ensayos claramente diferentes a partir de una única muestra de líquido, como dicha/cada cámara de gas se controla independientemente.

[0090] Convenientemente, se pueden producir fácilmente cartuchos en masa. El cartucho se puede proporcionar en una tira, donde varios cartuchos están inicialmente conectados entre sí, por ejemplo, como por medio de un sello perforado. De esta manera, el usuario puede retirar fácilmente un cartucho de la tira antes de usarlo.

[0091] Una vez se ha cargado una muestra en el cartucho, se puede detectar cualquier analito capturado por medio de un medio óptico adecuado u otros medios presentes en el dispositivo lector. La presente divulgación proporciona este lector y un modo didáctico importante estipula al menos un medio de control de fuerza presente en el lector y diseñado para controlar la fuerza aplicada a una superficie externa de una cámara llena de gas o más para expulsar/introducir gas de/en dicha/cada cámara llena de gas. Una reducción en la fuerza aplicada por los medios de control de fuerza resultará en que el gas se vuelva a introducir en dicha/cada cámara llena de gas. Una ventaja de la presente invención es que los propios cartuchos pueden estar inicialmente "secos", es decir, que contienen poco o ningún líquido a granel dentro del cartucho antes de la aplicación de la muestra. Esto no solo simplifica la fabricación de los propios cartuchos, sino que también mejora la vida útil y permite que muchos de los cartuchos de la presente invención se conserven a temperatura ambiente sin mucha degradación de los componentes químicos o biológicos dentro del cartucho, antes del uso.

[0092] A título informativo, se enseña un dispositivo lector para uso con un cartucho microfluídico de la presente invención, donde el dispositivo lector comprende:

medios de control de fuerza para controlar la compresión o descompresión de una cámara llena de gas del sistema microfluídico; y medios de detección para permitir la detección de un analito deseado dentro de una muestra de líquido introducida en el cartucho microfluídico, o el producto de reacción del analito del mismo;

donde los medios de control de fuerza comprenden un activador piezoeléctrico flexible diseñado para llevar a cabo, directa o indirectamente, la compresión o descompresión de la cámara llena de gas a través del desplazamiento del activador.

[0093] Pierre Curie descubrió el efecto piezoeléctrico en 1883. Se dio cuenta de que ciertos materiales, como los cristales de cuarzo, producen una tensión cuando se someten a tensiones mecánicas. Por el contrario, las formas de esos materiales se deforman cuando se les aplica una tensión. Como resultado, se pueden usar como transductores que convierten la señal eléctrica en vibración metálica.

[0094] Varios materiales tienen propiedades piezoeléctricas; siendo el titanato zirconato de plomo (PZT) el usado con más frecuencia. Modificar la composición química de la cerámica y el proceso de fabricación pueden alterar el rendimiento del doblador piezo. Cuando la capa de pZt se une a una lámina de sustrato adecuada (p. ej., una fina placa metálica), cualquier activación eléctrica de la placa de PZT conlleva un movimiento plano de la placa con respecto al sustrato e induce así una tensión mecánica interna que resulta en un movimiento de flexión de la estructura compuesta similar a un bimetal térmico.

[0095] Los dobladores piezo se conocen ampliamente en la técnica. Normalmente, un cristal cerámico piezo puede estar recubierto de plata por ambos lados y pegado a una tira de latón, aleación de níquel o acero inoxidable.

[0096] La cerámica se puede configurar con o sin retroalimentación La retroalimentación se puede usar junto con un circuito externo para monitorizar la operación del doblador piezo y ajustar la señal de entrada para mantener una frecuencia de salida constante.

[0097] Los dobladores se pueden fabricar en una gran variedad de formas geométricas, recortadas a partir de una bicapa de PZT o una estructura multicapa. Los dobladores piezo de la presente invención pueden tener la forma de tiras flexibles. En los dobladores de tiras, un extremo de la tira se fija montado sobre el otro extremo, que se mueve libremente. Para este montaje, se logra el desplazamiento máximo de doblador de tira y los datos especificados para el desplazamiento, rigidez y resonancia se refieren a esta situación. El desplazamiento depende de la longitud de libre movimiento de la tira. Por lo general, aprox. el 5-10 % de la longitud total del doblador se proporciona para fines de montaje. El montaje se puede hacer mediante la sujeción o el uso de adhesivos como epoxis, cianoacrilatos, etc.

[0098] El doblador piezoeléctrico puede estar polarizado inicialmente, o provocar que un pie o dedo entren en contacto con una superficie externa de una cámara llena de gas. De esta manera, se puede proporcionar inicialmente una fuerza máxima aplicada a la cámara de gas, que provoca que el gas salga expulsado de la cámara de gas. Sobre la señalización eléctrica adecuada, se puede provocar que el doblador piezoeléctrico se flexione hacia fuera de la superficie externa de la cámara de gas que resulta en una disminución en la fuerza aplicada a la cámara y una consiguiente introducción de gas en la cámara. Como cada cámara está en comunicación fluida con dicho(s)/cada canal(es) microfluídico(s), el lector experto comprende fácilmente cómo el gas expulsado o introducido en una respectiva cámara de gas, provoca un movimiento direccional de la muestra de líquido en el respectivo canal microfluídico.

[0099] El lector puede incluir un puerto receptor en el que se debe insertar el cartucho. El lector se puede adaptar para asegurar la correcta inserción del cartucho y esto que podría adquirir una variedad de formas. Por ejemplo, el cartucho se podría colocar inicialmente en un mecanismo portador que entra en el lector como los que se pueden encontrar en ordenadores para cargar CD y similares. O bien el puerto receptor puede tener las medidas para permitir la recepción del cartucho y se puede encontrar un elemento de parada interno dentro del lector con el que el cartucho colinda una vez se ha introducido correctamente. Alternativa o adicionalmente se encuentran características sobre la superficie del cartucho o cortadas en esta que pueden estar diseñadas para ubicarse junto a las características encontradas dentro del lector y solo una vez se haya colocado el cartucho correctamente en el lector, el lector será capaz de controlar el cartucho. Se pueden proporcionar puertos receptores de diferentes tamaños o un único puerto receptor que tenga la forma adecuada para aceptar cartuchos de diferentes tamaños diseñados para llevar a cabo un número determinado de ensayos, por ejemplo.

[0100] El lector puede estar configurado, posiblemente a través del software adecuado, para llevar a cabo una variedad de diferentes tipos de ensayos. Se puede proporcionar al usuario un kit que comprenda cartuchos de ensayo y opcionalmente dispositivos de recolección de muestras. Los cartuchos pueden contener un código de barras u otras características en la superficie que el dispositivo lector es capaz de determinar, que pueden servir para informar al lector del tipo de cartucho que se ha insertado en el lector y de ahí, qué ensayo o ensayos deben realizarse y de ahí, cómo se supone que el lector debe funcionar y/o proporcionar detalles del paciente, por ejemplo. De este modo, se puede proporcionar un único tipo de lector que sea capaz de recibir una variedad de diferentes cartuchos que puedan realizar diferentes ensayos y/o paneles de ensayos.

[0101] En el modo de realización donde el agente aglutinante está unido a la superficie de los agentes magnéticos, como bolas magnéticas, se entiende que el lector comprenderá un imán o electroimán permanente. El imán estará diseñado para acercarse a poca distancia de los agentes magnéticos o se provocará que el electroimán aplique un campo magnético a fin de concentrar y mantener las partículas magnéticas en un área concreta de dicho canal microfluídico del cartucho. Esta área puede ser el área de detección. En un modo didáctico se emplea un electroimán, que solo se activa una vez se han transportado las partículas magnéticas a la zona de detección. A través de un diseño adecuado también es posible controlar o concentrar el campo magnético del electroimán para asegurar que las partículas magnéticas se centran y mantienen dentro de una pequeña región de la zona de detección.

[0102] Esto puede servir para acumular las partículas magnéticas en una pequeña área y aumentar la señal que se puede ser detectar.

[0103] Concentrar las partículas magnéticas en un área concreta puede servir para facilitar la detección de cualquier analito capturado y/o aumentar la sensibilidad de detección. Además, mantener las partículas por medio del campo magnético también permite que el gas expulsado de dicha(s)/cada cámara(s) llena(s) de gas eliminen la muestra de fluido no deseado/residual que rodea al analito unido, de este modo deja al analito capturado libre de agentes potencialmente interferentes/contaminantes que pueden estar presentes en la muestra inicial. El campo magnético o electromagnético permanente se puede reducir o aumentar como al mover un imán permanente más cerca o lejos del cartucho o, al aumentar o disminuir la intensidad del campo aplicado. Esto puede servir para permitir que las partículas magnéticas se "relajen" o se concentren menos en una ubicación concreta, mientras que el campo magnético las mantiene en cierta medida o no. Esto puede facilitar que se lleven a cabo reacciones adicionales sobre las partículas que se pueden realizar de una forma más eficaz en comparación con si las partículas estuvieran altamente concentradas. También se puede preferir en ciertas aplicaciones que la detección se lleve a cabo cuando las partículas estén menos "concentradas" o relajadas.

[0104] En el uso, el imán se puede usar para mantener cualquier agente unido una vez se ha aplicado el campo magnético a la muestra. Se puede expulsar el gas de dicha/cada cámara llena de gas a fin de transportar la muestra de líquido y cualquier otro componente no unido presente en la muestra lejos de dicha/cada área de detección y/o permitir que otros reactivos, como un reactivo de detección, se pongan en contacto con el analito capturado. El control preciso de la velocidad de movimiento del gas y una muestra de líquido correspondiente y la eliminación de cualquier componente no unido es necesaria a fin de asegurar que la fuerza del gas no es suficiente para desprender el material unido magnéticamente. Por consiguiente, la velocidad de expulsión de gas de dicha/cada cámara llena de gas se puede controlar con precisión. En ciertos modos de realización, puede ser conveniente introducir la muestra de líquido y los reactivos, etc., más allá de la zona de detección antes de aplicar un campo/fuerza magnética. Por consiguiente, cualquier captura de las partículas magnéticas solo ocurre una vez la expulsión de gas de la cámara de gas ha hecho retroceder a la muestra de líquido a través de la zona de detección.

[0105] En otro modo de realización, las partículas magnéticas se podrían recubrir con un reactivo aglutinante diseñado para eliminar las interferencias de la muestra. Las partículas magnéticas se unirían a esta interferencia presente dentro la muestra y entonces las partículas magnéticas se podrían mantener en una ubicación específica separada de los reactivos de captura/detección específicos y/o la zona de detección para permitir que se produzca la reacción y la medición en ausencia del/de los interferente(s) específico(s).

[0106] El lector, como se describe a continuación, incluye medios de detección para detectar cualquier analito capturado dentro del cartucho de la muestra. Los medios de detección pueden ser cualquier medio adecuado dependiendo del ensayo concreto. Por ejemplo, los medios de detección pueden ser un fluorímetro o espectrofotómetro que se puede usar para detectar una señal fluorescente, una vez se ha estimulado adecuadamente, del analito unido etiquetado o no etiquetado, o del producto de reacción. El analito unido/producto de reacción pueden dar respuesta fluorescente naturalmente una vez se ha usado la luz de una longitud de onda adecuada para estimular el analito/producto o se puede usar una etiqueta adicional para unir independiente el analito unido y la etiqueta detectados por los medios fluorescentes. Se pueden emplear otras etiquetas y de ahí, adaptar los medios de detección en consecuencia, incluir marcadores radioactivos, marcadores fosforescentes, partículas de metal coloidal, marcadores bioluminiscentes, marcadores colorimétricos, marcadores electroquímicos y similares. Además, como se ha mencionado anteriormente, se puede detectar directamente el analito o el producto de reacción del mismo, o el analito unido o el propio producto de reacción usando técnicas como la espectroscopia Raman y similares. En algunos modos de realización, los medios de detección se diseñan para detectar ópticamente el analito o el producto de reacción del analito, o un analito/producto de reacción del analito capturados y/o etiqueta fijada a cualquier fracción mencionada anteriormente.

[0107] Los marcadores detectables se pueden usar solos o junto con una micropartícula o bola, como una partícula de óxido metálico, polisacárido o látex. Se conocen muchos tipos de látex y otras partículas en la materia.

[0108] El lector comprende medios de control de fuerza que comprenden uno o más dobladores piezo de los tratados anteriormente para entrar en contacto con dicha/cada cámara llena de gas del cartucho y reducir o aumentar una fuerza aplicada a dicha(s)/cada cámara(s) llena(s) de gas, al aumentar o disminuir la curva que forma el doblador. Cuando se proporciona más de una cámara llena de gas, se proporciona un doblador piezo controlado de forma independiente por cada cámara llena de gas. Los medios de control de fuerza pueden incluir un dedo o pie diseñado para entrar en contacto y aplicar fuerza a una superficie exterior de dicha/cada cámara. De esta manera, el doblador piezo actúa sobre el dedo o pie, de manera qué el dedo/pie actúa sobre la cámara llena de gas. En el uso, antes de que los medios de control de fuerza entren en contacto con una superficie exterior de dicha/cada cámara, la cámara estará en un estado de volumen máximo lleno de gas. Al entrar en contacto con la superficie de dicha/cada cámara llena de gas y aplicar fuerza, el gas dentro de cada cámara saldrá expulsado. Aumentar la fuerza aplicada resultará en que se expulse gas adicional de dicha/cada cámara. Por el contrario, una reducción en la fuerza aplicada en dicha/cada cámara llena de gas por los medios de control de fuerza resultará en que el gas se vuelva a introducir en dicha/cada cámara.

[0109] El dedo/pie puede estar diseñado para entrar en contacto con una porción central de una superficie exterior de dicha/cada cámara. Normalmente, el dedo/pie solo puede entrar en contacto con una porción de la superficie exterior total de dicha/cada cámara llena de gas. Por ejemplo, en el uso, el dedo/pie puede entrar en contacto con la superficie superior de un cartucho y tener las medidas para entrar en contacto con entre el 10 % y el 50 % del área de la superficie superior que cubre la cámara de gas. El dedo/pie que está en contacto con la superficie del cartucho se eleva y desciende, o se le fuerza a entrar en contacto y relajarse desde la superficie de la cámara de gas mediante el uso descrito del doblador piezo. La velocidad y el grado de flexión y de ahí, el funcionamiento de los medios de control de fuerza, se pueden controlar con precisión a fin de poder controlar la velocidad y la cantidad de gas expulsado o introducido de/en dicha/cada cámara llena de gas.

[0110] El lector puede incluir otras características como un dispositivo de calentamiento para permitir que los ensayos se realicen a una temperatura concreta, así como el circuito eléctrico y el software adecuados para permitir programar el lector de manera que pueda llevar a cabo uno o más ensayos diferentes.

[0111] Los cartuchos microfluídicos de la invención se pueden usar en un método de realización de un ensayo sobre una muestra de líquido donde el método comprende:

a) proporcionar un cartucho microfluídico como se describe en la presente memoria al dispositivo lector como se describe en la presente memoria;

b) comprimir una/dicha(s) cámara(s) llena(s) de gas del cartucho microfluídico para que el gas salga expulsado de dicha(s)/cada cámara(s) llena(s) de gas;

c) introducir una muestra de líquido en el cartucho microfluídico y permitir que la muestra se introduzca en dicho(s)/cada canal(es) microfluídico(s) mediante acción capilar, y/o descomprimir parcialmente dicha(s)/cada cámara(s) llena(s) de gas de manera que el gas se introduzca en dicha(s)/cada cámara(s), de modo que provoque que la muestra de líquido se introduzca en dicho(s)/cada canal(es) microfluídico(s);

d) permitir que uno o más reactivo(s) reaccionen con cualquier analito presente en la muestra de líquido;

e) opcionalmente, se descomprime parcialmente dicha(s)/cada cámara(s) llena(s) de gas del cartucho microfluídico de manera que la muestra de líquido se introduzca más adelante de dicho(s)/cada canal(es) microfluídico(s) hacia dicha(s)/cada cámara(s) llena(s) de gas y la muestra puede entrar en contacto opcionalmente con un analito, agente aglutinante y/o uno o más reactivos adicionales;

f) opcionalmente, capturar cualquier analito o producto de reacción del analito y comprimir dicha(s)/cada cámara(s) llena(s) de gas, de manera que el gas expulsado de dicha(s)/cada cámara(s) provoque que la muestra de líquido y el material no capturado se alejen de cualquier analito o producto de reacción del analito capturado; y

g) detectar cualquier analito o producto de reacción del analito, o analito o producto de reacción del analito capturado.

[0112] También debe apreciarse que el paso e) del método anterior se puede llevar a cabo en uno o múltiples pasos. Por consiguiente, dependiendo del ensayo que se deba llevar a cabo, el paso e) puede ser un único paso de manera que la disminución en la fuerza aplicada a cada/dicha cámara llena de gas es una disminución única en la fuerza y la muestra se extrae de una sola ubicación en dicho/cada canal microfluídico. O bien, puede haber múltiples pasos, como 2, 3 o 4 pasos, donde las disminuciones sucesivas en la fuerza aplicada a dicha/cada cámara resultan en que la muestra se extraiga de cualquier número de ubicaciones sucesivas dentro de cada/dicho canal microfluídico dependiendo del número de veces en los que se ejerza una disminución en la fuerza. Por consiguiente, los cartuchos microfluídicos de la presente invención permiten que se realicen ensayos donde se requiera un único paso o múltiples pasos.

[0113] La fuerza aplicada a la cámara llena de gas se puede proporcionar mediante medios de control de fuerza como los tratados anteriormente que comprenden un doblador piezo y opcionalmente un dedo o pie asociado con ellos.

[0114] El ritmo al que se aumenta o disminuye la aplicación de fuerza a dichas/cada cámaras llenas de gas puede variar a fin de aumentar o disminuir la velocidad del movimiento del líquido en dicho/cada canal. Por ejemplo, la disminución de la fuerza aplicada en el paso e) puede ser más rápida que el ritmo de aumento en la fuerza aplicada en el paso f) cuando sea necesario.

[0115] La captura de complejos de analito/agente aglutinante del analito se puede deber, por ejemplo, a que el agente aglutinante del analito esté unido a una superficie del canal microfluídico, o capturado gracias a su magnetismo y la aplicación de una fuerza magnética a los complejos formados. Las partículas magnéticas empleadas para formar los complejos se pueden depositar inicialmente en una superficie de dicho(s) canal(es) microfluídico(s) opuesta a la superficie del cartucho con la que el imán se pone en contacto estrecho o se aplica la fuerza magnética. El efecto de esto es que las partículas magnéticas se introducen lateralmente a través de dicho(s) canal(es) microfluídico(s) de forma perpendicular al flujo de líquido a través de dicho(s) canal(es), lo que aumenta y/o mejora el contacto de las partículas magnéticas con el analito o el producto de reacción del analito, de modo que aumenta la sensibilidad del ensayo.

[0116] Es posible llevar a cabo los métodos anteriores usando un único cartucho. Por consiguiente, un método que incluya el paso f) anterior se puede llevar a cabo en un canal con un cartucho de la presente invención, y un método que no incluya el paso f) se puede llevar a cabo en un canal independiente. Alternativa o adicionalmente, el paso e) se puede llevar a cabo una o varias veces en los canales mencionados anteriormente y/o canales adicionales. De esta manera, se pueden realizar varios tipos diferentes de ensayos usando un único cartucho que comprende una pluralidad de canales de ensayo.

[0117] El presente modo didáctico permite el desarrollo de un sistema de ensayo que comprende un cartucho microfluídico desechable de la invención, que es capaz de realizar varios ensayos diferentes sobre una única muestra, y el lector asociado. que es capaz de detectar y/o determinar los niveles de una pluralidad de analitos a partir de la única muestra y proporcionar un resultado a un usuario. El presente modo didáctico también permite que el lector reciba una variedad de cartuchos desechables de la invención donde cada cartucho desechable de dicha variedad es capaz de llevar a cabo un panel distinto de ensayos diferentes. De esta manera, se puede proporcionar un único lector que se pueda usar para proporcionar resultados a partir de una variedad de paneles distintos de ensayos diferentes. En este sentido, se puede adaptar específicamente cada cartucho para el número y tipos de ensayos que se puedan llevar a cabo. Por ejemplo, se pueden requerir diferentes volúmenes de muestra para ensayos concretos y esto se puede abordar de forma independiente mediante el dimensionado adecuado de cada canal y/o cámara. Por consiguiente, al aumentar o disminuir el tamaño de cualquier canal concreto, es posible aumentar o disminuir el volumen de la muestra que se introduce en cada canal concreto. Además, el tamaño de cualquier cámara, conectada a uno o más canales, pueden aumentar o disminuir según sea necesario, dependiendo del tipo de ensayo, número de pasos y/o volumen de la muestra que se introduce en dichos canales. El destinatario experto lo determina fácilmente.

[0118] También es posible llevar a cabo ensayos usando los cartuchos de la presente invención que, aparte de tener canales que están en comunicación fluida con una cámara o cámaras, además comprenden uno o más canales que no están en comunicación fluida con ninguna cámara o cámaras de gas. Un ejemplo no limitativo de este ensayo se describe en el siguiente apartado de ejemplos de la presente memoria.

[0119] El cartucho microfluídico de la presente invención es autosuficiente en el sentido de que aparte de la propia muestra, el resto de los reactivos físicos necesarios para realizar cada ensayo están presentes en el cartucho microfluídico antes de que se lleve a cabo cada proceso de ensayo. Por consiguiente, otros reactivos, como las especies reactivas, tampones, líquidos de lavado, etc., no se introducen en el cartucho durante el proceso de ensayo. Normalmente, el único líquido que entra en el cartucho es la propia muestra de líquido. Cualquier reactivo que haya sido depositado en cada/dicho canal se puede haber aplicado inicialmente por medio de un líquido, pero se habrá secado, y se puede considerar que el cartucho, antes de realizar cualquier ensayo concreto, está seco, sin líquido o esencialmente sin líquido presente.

[0120] El lector asociado puede proporcionar al cartucho calor/frío y/o la aplicación de una fuerza magnética, como se trata seguidamente, pero no debe interpretarse como un reactivo físico.

[0121] Por ensayo múltiple, en el contexto de la presente invención, se debe entender en el sentido de que cada cartucho microfluídico es capaz no solo de llevar a cabo una pluralidad de ensayos a partir de una única muestra introducida en el cartucho, sino que es capaz de llevar a cabo una pluralidad de tipos de ensayos claramente diferentes. Por ejemplo, cada cartucho microfluídico de la presente invención es capaz de llevar a cabo al menos dos, tres, cuatro, cinco de los siguientes tipos de ensayos o más: inmunoanálisis, análisis de ácido nucleico, análisis de los receptores, ensayo de competición, análisis citométrico, ensayo colorimétrico, ensayo enzimático, análisis electroforético, análisis electroquímico, análisis espectroscópico, análisis cromatográfico, análisis microscópico, análisis topográfico, análisis calorimétrico, ensayo turbidimétrico, análisis de aglutinación, análisis viscométrico, análisis de coagulación, análisis de tiempo de coagulación, ensayo de síntesis de proteínas, análisis histológico, ensayo de cultivo, análisis químico, bioquímico, análisis de osmolaridad, iones, gas o absorción. En ciertos modos de realización, se puede llevar a cabo un tipo concreto de ensayo a fin de detectar analitos diferentes. Por ejemplo, se puede llevar a cabo un inmunoanálisis a fin de detectar analitos diferentes. Se puede llevar a cabo dicho uno o más inmunoanálisis en un único y/o múltiples canales microfluídicos.

[0122] En un modo de realización, el cartucho de la presente invención está diseñado para realizar un panel de ensayos relacionados con una enfermedad o afección concreta. Los paneles de pruebas ejemplares pueden incluir paneles de análisis para determinar afecciones cardíacas, una enfermedad de la glándula suprarrenal, la función hepática, la función renal, la función neurológica, diabetes, embarazo y afecciones del embarazo, una afección del metabolismo y abuso de drogas.

[0123] Por ejemplo, un cartucho microfluídico diseñado para el análisis de marcadores asociados a afecciones cardíacas puede comprender un ensayo o ensayos diseñados para detectar y/o determinar el nivel de uno o más de los siguientes:

Perfil lipídico, que puede detectar lipoproteína de baja densidad (LDL), lipoproteína de alta densidad (HDL), triglicéridos y/o colesterol total, por ejemplo;

Apolipoproteínas, el componente proteico de las lipoproteínas, que no se incluyen en el perfil lipídico estándar, pero se pueden someter a ensayo por separado. Niveles anómalos pueden fomentar la aterosclerosis y pueden aumentar el riesgo de cardiopatía isquémica (CAD) y accidente cerebrovascular;

Homocisteína, un aminoácido (bloques de construcción de proteínas). Los niveles sanguíneos elevados pueden fomentar la aterosclerosis y CAD, así como los coágulos sanguíneos pueden producir un ataque cardíaco o accidente cerebrovascular;

Troponina; PNC;

Proteína C-reactiva (PCR), que es una sustancia que refleja niveles bajos de inflamación sistémica y aumenta en personas con riesgo de CAD; y

Marcadores cardíacos, como estudios de enzimas cardíacas que miden ciertas enzimas como la CK-MB, o troponinas u hormonas cardíacas como el péptido natriurético cerebral que se liberan cuando el corazón está sufriendo estrés, está enfermo o dañado, en forma de ataque cardíaco.

Los sujetos que experimentan estrés u otras afecciones pueden someterse a un perfil de la función suprarrenal, que puede incluir uno o más de los siguientes:

Aldosterona, que controla el balance de salinidad, el de potasio y el hídrico en el cuerpo y ayuda a regular la presión arterial. La producción excesiva (hiperaldosteronismo) o la producción insuficiente (hipoaldosteronismo) de esta hormona puede estar causada por tumores y otras anomalías de las glándulas suprarrenales (primario; p. ej., cáncer suprarrenal) o puede derivar de problemas del exterior de las suprarrenales (secundario);

Cortisol, que es una hormona glucocorticoide que ayuda a controlar el metabolismo de los hidratos de carbono, de las proteínas y lipídico; media la respuesta del cuerpo ante el estrés; y regula el sistema inmunitario. La secreción excesiva de cortisol, causada en la mayoría de los casos por un tumor suprarrenal benigno, resulta en la enfermedad de Cushing. La secreción insuficiente puede indicar una forma de insuficiencia suprarrenal conocida como la enfermedad de Addison. Generalmente se miden tanto los niveles de sangre como los niveles de orina (conocido como cortisol libre);

18-hidroxicortisol, un producto del metabolismo del cortisol es un esteroide inusual producido en cantidades excesivas en pacientes con hiperaldosteronismo primario. Medir los niveles sanguíneos de esta hormona puede ayudar a determinar si el hiperaldosteronismo primario está causado por un tumor llamado adenoma suprarrenal o por el crecimiento excesivo (hiperplasia) de tejido suprarrenal; los niveles son significativamente más altos en personas con adenoma; y

La hormona sexual dehidroepiandrosterona-sulfato-a (andrógeno) DHEA-S, sintetizada por la glándula suprarrenal es una precursora de la testosterona. En las mujeres, las glándulas suprarrenales son la principal, y a veces la única fuente de andrógenos. Los niveles elevados de DHEA-S se asocian con el virilismo (características corporales masculinas), hirsutismo (crecimiento excesivo de vello), amenorrea (ausencia de menstruación) e infertilidad. Las anomalías suprarrenales como tumores pueden conllevar niveles anormalmente altos de DHEA-S.

Las pruebas de la función hepática se usan para determinar la causa de síntomas como la ictericia, que se puede deber a una enfermedad hepática. También se usan para detectar posibles daños hepáticos, por ejemplo, en alcohólicos o personas expuestas al virus de la hepatitis, y también para monitorizar cambios en la función hepática anómala. Por consiguiente, un cartucho microfluídico para la función hepática de la presente invención puede incluir uno o más de los siguientes:

Pruebas de enzimas: el hígado es donde numerosas enzimas, entre las que se incluyen alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), fosfatasa alcalina (FA) y gamma glutamil transferasa (GGT), controlan muchas reacciones bioquímicas. Los niveles elevados de enzimas hepáticas en el torrente sanguíneo pueden indicar daño hepático;

Sin embargo, no señalan necesariamente una enfermedad hepática específica. Aunque las pruebas de enzimas se pueden pedir individualmente, proporcionan más información cuando se realizan en conjunto, dado que los niveles de muchas enzimas hepáticas pueden ser elevados en enfermedades que afectan a otros órganos;

Bilirrubina, el pigmento principal en la bilis, que es un producto de degradación de la hemoglobina, una sustancia que se encuentra en los glóbulos rojos y que contiene hierro. Normalmente, solo circula en la sangre una pequeña cantidad de bilirrubina. Los niveles sanguíneos elevados pueden derivar de distintas formas de enfermedad hepática y de las vías biliares, incluida la hepatitis y la obstrucción de la vía biliar. La presencia de un exceso de bilirrubina en sangre produce una coloración amarillenta en la piel y en los ojos llamada ictericia;

Albúmina, que es una proteína principal que, como la mayoría de las proteínas del torrente sanguíneo, sintetiza el hígado. Una disminución en el nivel de albúmina en suero (la porción líquida de sangre que queda tras los coágulos de sangre) es un indicador de enfermedad hepática crónica.

Tiempo de protombina (TP), que es un estudio de coagulación en sangre que se puede realizar para evaluar la función hepática. Debido a que la protombina es una de las proteínas de coagulación que sintetiza el hígado, un TP anómalo puede reflejar insuficiencia hepática;

Se pueden hacer pruebas de hepatitis vírica a personas con enzimas hepáticas anómalas cuya historia clínica y/o síntomas generan sospechas de enfermedad. (Entre los síntomas se incluyen febrícula, malestar, pérdida de apetito y fatiga, pero no siempre están presentes). Los tres tipos más comunes de este virus encontrados en EE. UU. son hepatitis A, B y C (conocidas como VHA, VHB y v Hc ); todos se detectan cuando se realizan pruebas para detectar la presencia de antígenos o anticuerpos específicos encontrados solo en la sangre de individuos infectados. Se pueden realizar diferentes pruebas de anticuerpos/antígenos dependiendo del tipo de hepatitis del que se sospeche. Además, la presencia de anticuerpos concretos puede señalar si la infección está en una fase aguda o crónica.

Se suelen emplear paneles de pruebas para evaluar el riesgo de un paciente de desarrollar diabetes o confirmar que un sujeto tiene diabetes de tipo I o II. Así como el panel lipídico descrito arriba, se puede diseñar un cartucho microfluídico para un panel de diabetes para realizar uno o más de los ensayos siguientes:

El hemograma completo (CBC) hace pruebas para detectar trastornos sanguíneos como infecciones o anemia; la glucosa en ayunas se usa para detectar tanto hiperglucemia como hipoglucemia, para ayudar a diagnosticar la diabetes y para monitorizar los niveles de glucosa en personas con diabetes; la hemoglobina A1c puede detectar prediabetes, diagnosticarla o comprobar si la diabetes está bajo control; y el análisis de glucosa en orina determinará si la albúmina (proteína) se encuentra en su urina (si es así, es posible que los riñones del sujeto no estén funcionando correctamente).

[0124] También es posible realizar pruebas de detección de abuso de drogas o de drogas que se consideren prohibidas para los deportistas. Un cartucho microfluídico de la presente invención diseñado para detectar y/o determinar el nivel de abuso de drogas en un sujeto puede estar diseñado para analizar uno o más de los siguientes:

Anfetaminas; barbitúricos hipnóticos; buprenorfinas; benzodiazepinas; cocaína; éxtasis; metanfetaminas; heroína (opiáceos/morfina); metadona; antidepresivos tricíclicos; cannabis y/u otros agentes psicoactivos.

[0125] Se apreciará que los paneles de ensayos anteriormente descritos son meramente ejemplares y no se deberían interpretar como limitativos. De acuerdo con el presente modo didáctico, se pueden prever paneles de ensayos concretos y proporcionar un cartucho de acuerdo con la presente invención a fin de realizar paneles de ensayo concretos.

[0126] Aunque cada panel de ensayos se realice dentro de un cartucho microfluídico de la presente invención, se necesita detectar y/o determinar los resultados de cada ensayo. Lo que lleva a cabo un lector como se describe en la presente memoria.

[0127] El lector puede incluir un medio de determinación de cartucho, que puede ser un lector de código de barras/código QR o similares, presentes en el lector diseñado para leer un código de barras/código QR u otro tipo de código del cartucho microfluídico. El código transmite al lector la información sobre el tipo de cartucho microfluídico y los ensayos que deben realizarse, a fin de que el lector esté preparado para llevar a cabo y detectar/determinar los resultados a partir del cartucho microfluídico concreto. En un modo didáctico más simple, dichos puertos de recepción del lector pueden estar diseñados para solo aceptar un tipo de cartucho microfluídico concreto, como una cerradura y una llave. Por consiguiente, cada puerto receptor puede solo aceptar un tipo de cartucho concreto a través del cual la introducción de un cartucho en un puerto receptor específico enseña al lector qué tipo de cartucho se ha insertado y qué ensayos se deben realizar. Un usuario también puede introducir detalles en el lector de modo que se enseñe al lector qué ensayos se deben llevar a cabo, pero esto puede ser menos conveniente ya que podría conducir a un error del usuario.

[0128] El lector del presente modo didáctico está construido de manera que es capaz de recibir una pluralidad de cartuchos microfluídicos diferentes de la presente invención. Se entiende por "diferente" que los cartuchos de la presente invención se pueden adaptar para realizar un panel de ensayos concreto, en vez de que los cartuchos parezcan visual y abiertamente diferentes. Es decir, cuando dos cartuchos se colocan juntos, visualmente pueden parecer bastante similares, pero un cartucho se puede adaptar para llevar a cabo un panel de ensayos adecuado para detectar enfermedades cardíacas y otro cartucho se puede adaptar para llevar a cabo un panel de ensayos adecuado para detectar la diabetes, por ejemplo.

[0129] Por consiguiente, en una divulgación adicional, se enseña una plataforma de ensayos múltiples para uso en la realización de paneles de ensayos, comprendiendo la plataforma de ensayos múltiples una pluralidad de cartuchos microfluídicos de la presente invención, siendo cada cartucho capaz de realizar un panel determinado de ensayos sobre una muestra y un lector construido para ser capaz de recibir y verificar cada una de dichas pluralidades del cartucho microfluídico, donde el lector se puede configurar para detectar y/o determinar niveles de un panel de analitos que pueden estar presentes en la muestra.

[0130] En el uso, se predeterminará un sujeto para hacerle pruebas con un panel de ensayos concreto, o un paciente acudirá a un proveedor de asistencia sanitaria, como un médico, enfermera u otro profesional de la salud, y el proveedor de asistencia sanitaria identificará que el sujeto requiere que se le realice un panel de ensayos. El paciente o el proveedor de asistencia sanitaria seleccionará un cartucho configurado para llevar a cabo el panel de ensayos deseado e insertar este cartucho elegido dentro del lector. El lector determinará a partir de las características presentes en el cartucho qué paneles de ensayos debe realizar el cartucho y el lector se autoconfigurará adecuadamente a fin de poder realizar los ensayos y detectar y/o determinar los niveles del panel de analitos concreto presente en la muestra del sujeto. Se proporcionará u obtendrá una muestra del sujeto y se introducirá en el puerto de entrada del cartucho. El lector y el cartucho trabajarán juntos para realizar el panel de ensayos a partir de la muestra y a finalizar los ensayos, el lector detectará y/o determinará los niveles de analito presentes en la muestra. El lector proporcionará entonces los resultados del panel de ensayos al sujeto y/o proveedor de asistencia sanitaria.

[0131] Así como proveedores de asistencia sanitaria, el usuario puede ser un funcionario de la policía o personal de control de dopaje, por ejemplo, el sujeto es un individuo al que se le hacen pruebas de consumo indebido de drogas, por ejemplo.

[0132] Ahora la presente invención se describirá más detalladamente por medio de ejemplos y con referencia a las siguientes figuras que muestran:

La figura 1 muestra un cartucho microfluídico de acuerdo con la presente invención;

La figura 2 muestra en detalle la porción A como se identifica en la figura 1;

La figura 3 muestra un lector para uso con un cartucho microfluídico de la presente invención;

La figura 4 muestra los mecanismos internos del lector mostrado en la figura 3;

La figura 5 muestra en vista en planta una porción interna del lector que comprende un medio de control de fuerza;

La figura 6 muestra una vista transversal a lo largo de la línea A - A de la figura 5;

Figura 7: muestra esquemas de los formatos de cartucho ejemplares, que son capaces de realizar diferentes números de ensayos por cartucho;

Figura 8: muestra un gráfico de comparación que detecta el péptido C de acuerdo con la presente invención y el ensayo de péptido C de Siemens Centaur. N=350;

Figura 9: muestra un gráfico de tendencia de comparación que detecta el péptido C de acuerdo con la presente invención frente al ensayo de péptido C de Siemens Centaur. N=294;

Figura 10: muestra un gráfico de comparación que detecta el dímero D de acuerdo con la presente invención y el analizador de ensayos clínicos HemoslL D-Dimer HS 500;

Figura 11: muestra un gráfico de comparación que detecta la PCR de acuerdo con la presente invención y el analizador de ensayos clínicos de PCR de Siemens Dimension.

Figura 12: muestra un gráfico de comparación que detecta PCRas de acuerdo con la presente invención y el analizador de ensayos clínicos de PCRas de Siemens Dimension.

Figura 13: muestra una curva dosis-respuesta del analito de la HRP2 de Plasmodium falciparum introducido en la sangre y realizado de acuerdo con la presente invención;

Figura 14: muestra un esquema de reactivos usados en un ensayo de múltiples pasos de troponina I;

Figura 15: muestra una representación esquemática de los pasos implicados en un ensayo de múltiples pasos de troponina I;

Figuras 16(a) y (b): muestran gráficos de troponina I medida en individuos sanos usando un ensayo de múltiples pasos de acuerdo con la presente invención en comparación con la prueba de troponina Ultra de Siemens Centaur;

La figura 17 muestra una comparación de la respuesta del ensayo de péptido C realizara de acuerdo con la presente invención antes y después de eliminar el tampón por aire;

La figura 18 muestra una comparación de la respuesta del ensayo de péptido C realizara de acuerdo con la presente invención sobre una muestra de sangre, antes y después de eliminar el tampón por aire; y

La figura 19 muestra un método de gráfico de comparación usando un cartucho de la presente invención que comprende un canal sin una cámara de gas para controlar el llenado y/o eliminación del líquido, a fin de llevar a cabo una prueba de INR y la prueba de INR de Roche CoaguCheck.

[0133] La figura 1 muestra un cartucho microfluídico (1) de acuerdo con la presente invención, para llevar a cabo 4 ensayos independientes a partir de una única muestra. El cartucho (1) comprende un puerto de entrada de la muestra de líquido (3) conectado a un canal microfluídico (4) que se divide en una pluralidad de canales independientes (5 y 7). Cada canal (5) se extiende dentro del cartucho (1) y está conectado de manera fluida a las cámaras llena de gas (10). El canal adicional (7) que no está conectado a una cámara llena de gas es un canal de control para uso en múltiples mediciones de control. En el uso, una muestra de fluido llena los canales (5 y 7) y esto lo pueden detectar los electrodos (no se muestran) que están en contacto eléctrico con los contactos eléctricos correspondientes dentro del lector. En el momento en que el lector detecta una señal adecuada de que se ha cargado una muestra en el cartucho (1) el lector puede empezar los ensayos. También se proporciona un sumidero (13) para recibir líquido. Inmediatamente más arriba del sumidero hay una parada de líquido (15) que evita que el líquido entre en el sumidero inmediatamente (13) por acción capilar por sí sola. Por consiguiente, en la aplicación inicial de la muestra usando una aplicación capilar, la muestra de líquido no pasa de la parada de líquido (15).

[0134] En una descripción más detallada de cada canal (5), hay características impresas (20, 22, 24, 26) diseñadas para limitar el movimiento de cualquier reactivo depositado dentro de cada canal (5) durante el proceso de fabricación. Adyacente a la característica impresa (20) y representado por la sección A, como se muestra más detalladamente en la figura 2, hay un canal de dimensiones más reducidas (p. ej., 0.1 - 0.2 mm) (50) que se extiende perpendicularmente lejos del canal de ensayo (p. ej., 0.75-1 mm) (5). Dentro de cada canal (50) hay una válvula de sentido único (0.1 mm por 0.9 mm) (52) diseñada para permitir que el gas o aire presente en cada canal (5) salga del cartucho (1) en el momento en que se aplique la muestra de líquido. Por consiguiente, en el momento de la aplicación de una muestra al cartucho mediante aplicación capilar, la muestra llena el canal (4) desplazando el aire presente en los canales (5) que sale del cartucho a través de las válvulas de sentido único (52). La muestra llena el canal por acción capilar hasta que la muestra esté aproximadamente adyacente a cada canal lateral (50). Colocada encima de la característica impresa (20) hay una primera zona de reacción (28) de cada canal de ensayo (5) dentro de la que se han depositado uno o más agentes aglutinantes y/o de reacción diseñados para reaccionar y unirse a un analito concreto o producto de reacción del mismo que pueda estar presente en una muestra de líquido a la que se le deban hacer pruebas. Por ejemplo, depositadas en las primeras zonas (28) de dichos canales (5) puede haber partículas magnéticas funcionalizadas con un anticuerpo diseñado específicamente para unirse con un primer epítopo de un analito que se deba detectar. Depositadas en una segunda zona (30) de cada canal puede haber partículas de látex etiquetadas fluorescentemente funcionalizadas con un anticuerpo adicional diseñado específicamente para unirse con un epítopo diferente de un analito que se deba detectar. Colocada distal/proximal a las zonas (28, 30) hay una zona de detección (32) donde se pueden detectar los complejos etiqueta/analito/partícula magnética.

[0135] Colocadas distal/proximal a las zonas de detección (32) hay cámaras llenas de gas (10), diseñadas para colocarse junto a una característica de aplicación de fuerza presente dentro de un dispositivo lector (como se describirá más tarde) de la presente invención, de manera que la característica de aplicación de fuerza es capaz de aplicar una fuerza sobre las cámaras llenas de gas (10) para provocar que el gas de dentro de las cámaras (10) salga expulsado de las cámaras (10) y hacia los canales de ensayo (5). Una disminución en la fuerza aplicada a las cámaras (10) provoca que el aire vuelva a introducirse en las cámaras (10) desde los canales de ensayo (5).

[0136] En el uso, se inserta un cartucho (1) dentro de un lector (100) como se muestra en la figura 3. El lector tiene una puerta que se puede cerrar (102), que se puede abrir a fin de acceder a un puerto de recepción del cartucho (103) del lector. Una vez se ha insertado un cartucho en el lector (100) y que se ha aplicado una muestra al cartucho (1), se puede cerrar la puerta (102). El lector alberga varias características diseñadas para entrar en contacto con el cartucho (1) y/o facilitar la realización del ensayo de la presente invención, como se describirá más detalladamente. La superficie superior del lector (100) comprende una pantalla táctil (104) que permite al usuario interactuar con el lector (100), así como recibir información sobre el rendimiento de cualquier ensayo.

[0137] La figura 4 muestra las características internas del lector (100). El lector incluye una batería recargable (110) para alimentar el lector y sus distintas funciones, como se describirá. Se proporciona alimentación para cargar la batería (110) mediante un conector DC jack (106). El lector (100) además incluye un calentador (111) para calentar el cartucho (1) cuando sea necesario; un bloque óptico (112) que contiene la óptica necesaria para detectar una señal fluorescente del cartucho (1); un imán móvil (113) diseñado para inmovilizar partículas magnéticas dentro de la zona de detección (32) del cartucho; y un mecanismo de palanca (114) diseñado para entrar en contacto con las cámaras (10) del cartucho (1) y aplicar una fuerza para provocar que el gas salga expulsado de las cámaras (10).

[0138] En el uso, se inserta un cartucho (1) en el lector (100) hasta que el cartucho entra en contacto con una característica de alineación (122) dentro del lector (100). Los electrodos presentes en el cartucho con sus contactos correspondientes presentes en el cartucho detectan la inserción correcta del cartucho (1). Esto indica al lector que se ha insertado correctamente un cartucho (1) y puede comenzar el inicio de un proceso de ensayo. Se indica a un motor (120) que active un mecanismo de piñón y cremallera. Se gira el engranaje (124) en sentido horario para provocar que el mecanismo de cremallera (126) de una palanca (128) se mueva verticalmente hacia arriba. Este movimiento provoca que el otro extremo (132) de la palanca (128), en forma de dedo, se mueva hacia abajo y entre en contacto con las cámaras (10) del cartucho (1). El funcionamiento continuo del motor provoca que el mecanismo de cremallera (126) ascienda, con un correspondiente movimiento descendente del otro extremo (132) de la palanca (128), de manera que se aplica una fuerza en aumento a las cámaras (10) del cartucho (1), expulsando el gas de las cámaras (10). Una vez se ha expulsado la cantidad deseada de gas de las cámaras (10), el extremo (132) de la palanca (128) continua en contacto con las cámaras llenas de gas (10) a fin de evitar que el gas se vuelva a introducir en las cámaras (10). En este punto se avisará al usuario mediante un mensaje en la pantalla (104) de que ahora se puede aplicar una muestra al cartucho (1).

[0139] La muestra se pone en contacto y se introduce en el cartucho (1) por medio del puerto de entrada (3). La muestra llena los canales (4, 5, y 7) mediante acción capilar, como se ha descrito anteriormente, con aire ventilado a través de las válvulas (52). Tras el llenado capilar, se detecta eléctricamente en los canales (5 y 7) una porción de la muestra de líquido que indica al lector que continúe. Entonces se puede provocar que el motor gire el mecanismo de engranaje (124) en sentido antihorario, que a su vez provoca que el mecanismo de cremallera (126) descienda y el otro extremo (132) de la palanca (128) ascienda, de manera que se reduzca la fuerza aplicada a las cámaras (10) del cartucho (1). Esta reducción en la fuerza aplicada a las cámaras (10) provoca que el aire se vuelva a introducir en las cámaras (10), que a su vez introduce la muestra en las primeras zonas (28) de los canales (5). El motor (120) y el movimiento de la palanca asociado pueden controlar con precisión la reducción en la fuerza aplicada a las cámaras (10) que controla hasta qué punto se introduce la muestra de líquido en las primeras zonas (28). Esto también se puede controlar por medio de los electrodos percibidos por retroalimentación. La entrada de la muestra de líquido en las primeras zonas (28) de los canales (5) provoca que la muestra resuspenda las partículas magnéticas derivadas funcionalmente presentes en la primera zona (28). El motor (120) se detiene durante un periodo de tiempo a fin de permitir que cualquier analito deseado que pueda estar presente en la muestra de líquido se una a las fracciones aglutinantes analito funcional en la superficie de las partículas magnéticas a fin de formar complejos analito/partícula magnética. Después de un periodo de tiempo definido, el motor se vuelve a activar y se aplica a las cámaras (10) una reducción adicional en la fuerza que provoca que se vuelva a introducir más aire en las cámaras (10), que a su vez introduce la muestra y los complejos analito/partícula magnética en una segunda zona (30) de los canales (5). La segunda zona (30) de cada canal (5) contiene partículas de látex derivadas funcionalmente etiquetadas fluorescentemente que se pueden unir a los complejos analito/partícula magnética a fin de formar una composición de complejo partícula de látex/analito/partículas magnéticas. Después de un período de tiempo adicional, la fuerza aplicada a las cámaras (10) se reduce adicionalmente y el líquido y los complejos presentes en las mismas se introduce en una zona de detección (32).

[0140] Una vez la muestra de líquido y los complejos asociados se han introducido en la zona de detección (32), un motor (150) y el engranaje asociado (152) y la cremallera (154) accionan el imán (113) de manera que se pone el imán a poca distancia de las zonas de detección (32) del cartucho, de manera que los complejos magnéticos se sienten atraídos por el imán y se mantienen en su lugar dentro de la zona de detección (32) mediante la fuerza magnética del imán (113). A partir de ahí, se vuelve a aplicar el motor (120) para provocar que el mecanismo de palanca (114) aumente la fuerza aplicada a las cámaras llenas de gas (10), que provoca que el gas salga expulsado de las cámaras (10) una vez más, que resulta en que se haga retroceder la muestra de líquido y el material no unido magnéticamente presentes en la zona de detección (32) lejos de la zona de detección (32) y a lo largo del canal (5), con una porción del líquido que sale hacia el sumidero (13). Puede no ser necesario expulsar todo el líquido en el sumidero (13) y, de hecho, puede ser solo necesario eliminar el líquido de la zona de detección (32), de manera que los complejos unidos magnéticamente resultantes estén presentes en un ambiente esencialmente de aire. Esto puede ser especialmente beneficioso en términos de no usar un volumen de muestra adicional para realizar un lavado como ocurre en los productos de flujo lateral y no necesita una bolsa tampón en la tira ni un sistema de suministro de tampón en medidor.

[0141] El motor (120) es capaz de funcionar a una velocidad variable y, por lo tanto, es posible introducir fácilmente el aire en las cámaras (10) y que la expulsión de aire de las cámaras (10) ocurra a ritmos diferentes, con un correspondiente ritmo de flujo variable del líquido presente en el canal (5) y las zonas asociadas (28, 30 y 32).

[0142] Tras la eliminación del líquido presente en las zonas de detección (32), los complejos capturados están presentes en un ambiente esencialmente libre de líquido y se pueden detectar usando un detector presente en el bloque óptico (112). El detector puede tener la forma de un espectrómetro, por ejemplo, que es capaz de detectar la etiqueta fluorescente presente en los complejos capturados de partículas de látex/analito/partículas magnéticas.

[0143] En un modo de realización alterativo al mostrado y descrito en relación con la figura 4, los dobladores piezoeléctricos se pueden emplear para controlar la fuerza aplicada a las cámaras llenas de gas del cartucho. La figura 5 muestra un medio de control de fuerza (200). El medio de control de fuerza (200) comprende una serie de dobladores piezoeléctricos (202) fijados a un primer extremo (201) por un bloque de fijación (204). Cada doblador piezoeléctrico también está acoplado eléctricamente al primer extremo de las conexiones eléctricas (206) que controla la señal eléctrica proporcionada a cada doblador (202). Como se puede ver, cada doblador (202) está conectado a su propio conjunto de conexiones eléctricas (206), de manera que cada doblador se puede controlar de forma independiente. Como se muestra en la figura 6, el otro extremo (208) de cada doblador (202) descansa sobre la superficie superior (209) en un pie (210) que en el uso está diseñado para entrar en contacto con la superior externa de una cámara de gas de un cartucho microfluídico (220) de la presente invención.

[0144] La figura 6 muestra una vista transversal a lo largo de la línea A-A de la figura 5 para que se entiendan mejor las distintas partes del medio de control de fuerza (200) y su funcionamiento. En la figura 6, el medio de control de fuerza (200) se muestra junto con un cartucho microfluídico (220) correctamente insertado en el lector de manera que la cámara llena de gas del cartucho microfluídico está colocada directamente debajo del pie (210) del medio de control de fuerza (200). La superficie inferior (212) del pie (210) está moldeada para entrar en contacto con una porción de la cámara de gas del cartucho microfluídico (220) y a través del control adecuado que el doblador piezo (202) aplica al pie (210), el pie (210) es capaz de aplicar una fuerza variable a la cámara de gas del cartucho microfluídico (220).

[0145] Como se muestra en la figura 6, el doblador piezo (202) está en su estado rígido no formado. En este modo de realización, el medio de control de fuerza (200) está construido de manera que el doblador piezo (202) es capaz de extender la máxima fuerza sobre el pie (210), de manera que la superficie inferior (212) del pie (210) empuje hacia abajo y comprima la cámara llena de gas, que provoca que el gas dentro de la cámara salga expulsado de la cámara.

[0146] Aunque no se muestra, aplicar una carga eléctrica al doblador piezo (202) provocará que el doblador piezo (202) se flexione y que el extremo (208) del doblador piezo (202) se flexione hacia arriba. Esta flexión hacia arriba del doblador piezo (202) reduce la fuerza aplicada al pie (210), que a su vez provoca que el pie (210) reduzca la fuerza aplicada a la cámara llena de gas del cartucho (220). La reducción en la fuerza aplicada a la cámara llena de gas proporciona una descompresión de la cámara llena de gas y que el gas vuelva a entrar en la cámara correspondientemente. A través de la señalización eléctrica adecuada, es posible flexionar y relajar el doblador piezo (202) que resulta en que la cámara llena de gas se descomprima o comprima en consecuencia y que el gas se expulse o introduzca en la cámara.

[0147] Se conocen muchos dobladores piezo en la materia y pueden ser adecuados para uso en la presente invención. El destinatario experto elegirá un doblador adecuado para una finalidad concreta. Los presentes inventores han empleado una variedad de estos dobladores piezo con un desplazamiento de hasta varios milímetros y tiempos de respuesta en el rango de los milisegundos. Se puede usar un amplificador de voltaje programable para controlar cada doblador piezo. Un amplificador adecuado incluye un DAC de 32 canales y 14 bits con voltaje de salida a escala completa programable de 50V a 200V (AD5535) o un DAC de canal cuádruple de alto voltaje y 12 bits (AD5504) disponibles en Analog Devices (Norwood, m A 02062, USA). Se pueden alcanzar fuerzas de 1N-2N.

[0148] Lo anterior proporciona una descripción de modos de realización específicos de los cartuchos de la presente invención y su uso con un lector asociado, pero la presente invención está diseñada para tener la forma de una plataforma que se pueda adaptar fácilmente. Por ejemplo, se puede cambiar la posición del respiradero para permitir el llenado capilar de diferentes posiciones dentro del canal (5), o se puede omitir por completo un respiradero y que el llenado de la muestra tenga lugar mediante un llenado activo después de que el gas salga expulsado de la cámara (10) y se introduzca la muestra en el cartucho (1) y los canales (5,7) mediante la vuelta del aire a las cámaras de gas tras una liberación de la presión aplicada a las cámaras (10).

[0149] Además, el lector puede estar diseñado para utilizar múltiples formatos de prueba con una familia de dimensiones de tiras definida por los requisitos del producto. La tira puede estar diseñada para fabricarse en formatos de 2, 4 y 10 canales, por ejemplo, para configuraciones específicas del producto y pruebas de panel (véase la figura 5 que muestra tiras de tamaños diferentes). La disponibilidad de diferentes tamaños de tiras permite al sistema actual hacer pruebas multiplexadas a través de tecnologías mixtas para satisfacer las necesidades específicas de los usuarios del mercado del lugar de asistencia con un mayor rendimiento y una estructura de costes reducida en comparación con los productos establecidos en los mercados objetivos.

[0150] Con referencia a la figura 7 que muestra tiras de tamaños diferentes, el cartucho de 2 canales está diseñado para ensayos únicos con controles, el cartucho de 4 canales para paneles de 2-3 analitos con controles y el cartucho de 10 canales permite ensayos complejos de tecnologías y productos mixtos que requieren una alta capacidad de multiplexación (p. ej., abuso de drogas) para llevarse a cabo. La plataforma descrita tiene una muestra y una arquitectura de ensayo altamente flexible y una capacidad de control del lector y medición que permite la compatibilidad futura para aprovechar nuevas oportunidades según se identifiquen nuevos paneles de pruebas y tipos de pruebas o se trasladen al lugar de asistencia.

[0151] Aunque la tecnología de medición principal es fluorescente, la plataforma también incorpora mediciones electroquímicas y se pueden incorporar otras metodologías fácilmente. Esto se trata más con mayor detalle seguidamente.

[0152] Para hacer múltiples tipos y formatos de prueba en una única plataforma, se han desarrollado un conjunto de competencias y controles tecnológicos básicos flexibles que se pueden usar según sea necesario y en secuencias que ejecuten los diferentes pasos del formato de ensayo. Los principios de diseño de la arquitectura del sistema son:

Fase de captura de partículas magnéticas

Control de movimiento de líquido

Eliminación de líquido de la zona de detección

Detección de marcadores en el aire

Multiplexación multicanal

Multiplexación intracanal

Rango dinámico

Controles integrados

Mediciones electroquímicas

Calentamiento y control de temperatura

Tratamiento previo de la muestra

[0153] Esta arquitectura de plataforma permite los diferentes tipos de pruebas y tecnologías que se deben formatear en el sistema. Cada principio tecnológico básico se trata seguidamente.

Captura de partículas magnéticas y control de líquido

[0154] Se conoce que el uso de captura de partículas mejora la cinética de captura. Para los inmunoanálisis, la plataforma de la presente invención usa partículas paramagnéticas como superficie de captura. Se pueden usar las diferentes dimensiones de partículas paramagnéticas para optimizar el rendimiento de cada tipo de prueba. Durante el desarrollo del ensayo se han utilizado partículas paramagnéticas que oscilan entre 100 y 1000 nm. La fase de captura de partículas se combina con una fase de marcado de partículas fluorescentes. De manera similar, la fase de partículas fluorescentes puede variar en tamaño dependiendo de la sensibilidad del ensayo y los requisitos de rango. Las dimensiones normales de las partículas fluorescentes pueden estar en el rango de 40 nm-4000 nm.

[0155] Algunos ensayos, como el de la proteína C-reactiva (PCR), requieren concentraciones relativamente altas del analito que se debe analizar y utilizan un fluoróforo directo etiquetado anticuerpo conjugado en combinación con partículas magnéticas, mientras que los ensayos de alta sensibilidad utilizan marcadores de partículas fluorescentes en combinación con partículas magnéticas. Cabe destacar que, tanto las fases de captura y marcado tienen libertad de movimiento en la muestra para desarrollar los eventos de captura. Además, esto se ve favorecido por el hecho de que se minimiza el flujo no deseado dentro de la tira. Durante el llenado del canal, la muestra fluye sobre los reactivos secos de la prueba. Se minimizan la disolución de reactivo y, por tanto, los efectos frontales del flujo mediante el uso de formulaciones que permiten un buen llenado de los canales, pero resultan en una disolución controlada más lenta. Tras el evento de llenado de muestra inicial, se detiene el flujo de manera que se evita que la muestra fluya más lejos durante un periodo de tiempo. Esto permite que ocurra una disolución muy consistente y una eficiencia de unión posterior dado que no hay errores de ritmo de flujo dependientes de la matriz que afecten al volumen de la muestra interrogada o a la cinética de unión.

[0156] La realización de la disolución del reactivo y la captura del analito en un volumen fijo, estático y opcionalmente mixto en lugar de un sistema de flujo variable (p. ej.: flujo lateral, triaje) mejora significativamente la precisión y la exactitud del ensayo.

[0157] Para ensayos más complejos, como el de troponina (como se describe en otro lugar), el ensayo se realiza de una forma más eficaz como un proceso multifase que usa múltiples zonas de reactivo. En este caso, la funcionalidad del medidor de ser capaz de comprimir las cámaras de gas (10) para expulsar el gas y eliminar el líquido de la zona de detección también se usa para el control riguroso del movimiento de líquido dentro del cartucho (1) y los canales asociados. Antes de que se aplique una muestra al cartucho (1), el medidor comprime las cámaras llenas de gas (10) expulsando el gas de las cámaras (10) y de los canales de ensayo. El medidor mantiene las cámaras (10) comprimidas durante la aplicación de la muestra y el llenado de la muestra se hace mediante acción capilar o totalmente bajo el control de fluidos accionado por el gas. El motor o doblador piezo de alta resolución dentro del medidor permite una liberación o aumento gradual muy controlado de la presión en las cámaras de gas (10) con el cambio de presión al ritmo y cantidad específicos para una prueba concreta. Esta característica proporciona varios beneficios importantes, incluida la capacidad de mezclado usando la flexión positiva y negativa rigurosa de cualquier doblador piezo.

[0158] El tiempo de llenado de la muestra puede tener un efecto significativo en el rendimiento de un producto al introducir la variabilidad de la disolución del reactivo, efectos frontales del fluido y el volumen de muestra interrogada. El control fluídico reduce la variación en el tiempo de llenado al controlar directamente el ritmo de llenado de la muestra. El control fluídico permite que la muestra se mueva en un tiempo controlado a las diferentes zonas dentro de cada canal, que permite que se realicen tratamientos previos de la muestra y ensayos multifase (descritos en la presente memoria). El control y aislamiento fluídico también es necesario para los sistemas cerrados como se requiere para los ensayos NAT (véase más adelante).

Eliminación de líquido de la zona de detección

[0159] El movimiento y control de líquido se logra al comprimir o liberar las cámaras de gas (10) en el cartucho de prueba usando un motor y un aplicador de fuerza o un mecanismo de doblador piezoeléctrico que entra en contacto con las cámaras de fluido (10). El movimiento de gas resultante de cada cámara (10) permite el control riguroso del movimiento de la muestra y los reactivos, incluida la eliminación del material no unido de la zona de detección (32) del canal de prueba y opcionalmente hacia el área de sumidero (13).

[0160] La función de control de fluidos integrada dentro de cada cartucho aporta varios beneficios de diferenciación importantes.

[0161] En primer lugar, el sistema descrito proporciona una separación muy eficaz de los componentes del ensayo unidos y no unidos usando el gas para controlar el movimiento del líquido. Esto es importante porque evita por completo la complejidad y el coste de una bolsa de reactivo líquido en la tira ni paquetes de reactivos de lavado líquido en el medidor.

[0162] En segundo lugar, la presente invención además permite el uso de tecnología de fabricación de laminado con costes de cartucho muy reducidos y manufacturación usando sistemas de producción por Internet de alto rendimiento y alto control.

[0163] En tercer lugar, la eliminación de la muestra y la etiqueta no unida de la zona de detección (23) mediante el uso de gas significa que se puede hacer la medición de los marcadores fluorescentes en un ambiente de gas, esencialmente libre de líquido.

Detección de marcadores en el aire

[0164] La medición de etiquetas en gas resulta en varias ventajas técnicas significativas para hacer mediciones fluorescentes en comparación con los protocolos de ensayo estándar de la técnica anterior.

[0165] El uso de un ambiente esencialmente gaseoso disminuye significativamente el efecto de enfriamiento de una muestra de líquido, que de este modo elimina una fuente primaria de variación del ensayo y efecto matriz. Por ejemplo, la presencia de células sanguíneas y proteínas de plasma enfría la señal fluorescente reduciendo la sensibilidad y aumentando la variabilidad de la medición fluorescente. La medición de fluoróforos en un ambiente de gas o aire permite el uso de fluoróforos que no se habrían elegido necesariamente debido al enfriamiento de la muestra. Esto permite diseños ópticos más simples, la optimización de fluoróforos para cada ensayo y la multiplexación dentro de un solo canal. Como se describe en un ejemplo más adelante y con referencia a las figuras l5 y 16, la detección en aire proporciona una mejora significativa en la sensibilidad en comparación con la detección en un tampón o en sangre entera.

[0166] En resumen, el método del uso de gas para eliminar la muestra y la etiqueta no unida reduce la variación del ensayo al disminuir los efectos de enfriamiento de la matriz de la muestra y da acceso a un mayor rango de fluoróforos para la optimización del ensayo. Esto se traduce en la flexibilidad del diseño del ensayo, velocidad del ensayo y rendimiento sin igual.

Multiplexación multicanal

[0167] La naturaleza de la plataforma del cartucho microfluídico de la presente invención tiene capacidad de multiplexación multicanal e intracanal. Las pruebas de panel se pueden hacer mediante canales múltiples dentro de una única tira combinada con un cabezal óptico de exploración para medir la etiqueta, p. ej., la intensidad de fluorescencia en cada canal. El número de canales puede variar dependiendo de las necesidades del producto.

[0168] Esto permite el desarrollo de pruebas de panel con cada canal que contiene un ensayo diferente, p. ej., un panel cardíaco, un panel metabólico, etc. Como los ensayos individuales son espacialmente distintos dentro de los canales independientes, cada ensayo se puede configurar con reactivos únicos dentro de la tira multicanal. Esto aporta varias ventajas fundamentales:

En primer lugar, cada ensayo puede usar una formulación óptima que incluya reactivos, tampones, pH, etc., para: la disolución de reactivos, anticoagulación, neutralización de los efectos matriciales (HAMA, etc.), sensibilidad óptima, linealidad, rango y estabilidad del ensayo. No es necesario encontrar una optimización compatible para conjuntos de reactivo de ensayo múltiple ni comprometer el rendimiento del ensayo a fin de desarrollar productos de panel. Cada ensayo puede existir dentro de su propia formulación óptima dentro de un canal individual y mantener su alto rendimiento de ensayo respectivo.

[0169] Por el contrario, la multiplexación de pruebas dentro de un único canal compromete intrínsecamente el rendimiento de las pruebas individuales, ya que la formulación del reactivo debe ser compatible con todos los ensayos. Los requisitos de los ensayos individuales a menudo entran en conflicto, por ejemplo, algo tan fundamental como el pH afectará significativamente al rendimiento del ensayo.

[0170] La multiplexación multicanal se traduce en la flexibilidad en el diseño de pruebas de panel, simplicidad y velocidad del desarrollo del ensayo de panel y mantenimiento del rendimiento de un único ensayo en todos los paneles.

[0171] En segundo lugar, el método multicanal permite que la presente plataforma realice nuevos productos de panel que combinen las diferentes tecnologías de ensayo y los diferentes métodos de transducción en una única tira.

[0172] Cada vez hay más pruebas de que las familias de moléculas pueden ser beneficiosas en cuanto a las mediciones de una única molécula de esa familia. Por ejemplo, los péptidos natriuréticos usados en la estratificación de la insuficiencia cardíaca congestiva están generalmente separados en pruebas BNP y NT-proBNP. La multiplexación multicanal permite la medición de proBNP, BNP, NT-proBNP y otras formas de péptidos natriuréticos en una tira y evitar el cruce de anticuerpos epítopos dentro de la familia del péptido. Por el contrario, la multiplexación intracanal conlleva una mayor no especificidad de las mediciones de la familia de la molécula. Se puede aplicar el método multicanal descrito actualmente al mercado de pruebas de troponina mediante el cual se pueden medir diferentes isoformas de troponina en canales independientes para mejorar el diagnóstico de infartos de miocardio.

Multiplexación intracanal

[0173] Cuando se requieran mediciones radiométricas, por ejemplo, mediciones de HbA1c e iones en sangre, la multiplexación intracanal es necesaria a fin de lograr el rendimiento de ensayo más preciso. La presente plataforma logra esto al medir más de un fluoróforo en un único canal.

[0174] La combinación de multiplexación multi e intracanal permite combinaciones de productos flexibles y potentes con controles integrados que mejorarán la exactitud y la confianza.

Rango dinámico

[0175] El amplio rango dinámico de un analito que se debe medir a menudo puede suponer una limitación del rendimiento del ensayo, Por ejemplo, una prueba de troponina tiene que ser muy sensible, pero al mismo tiempo, capaz de medir concentraciones elevadas a fin de monitorizar los cambios observados en pacientes de infarto de miocardio. El rango dinámico a menudo conlleva no linealidad a través del rango medible requerido, que impacta en la precisión y la exactitud.

[0176] El diseño multicanal permite realizar pruebas complejas con amplios rangos dinámicos que se pueden dividir en múltiples canales de la tira que cubren alta sensibilidad y concentraciones elevadas del rango medible requerido de manera lineal.

[0177] Para la troponina (formas T y/o I), un canal podría contener reactivos optimizados para la medición 0-100 pg/ml mientras que otro canal podría contener reactivos optimizados para medir de 50-1000 pg/ml y un canal adicional optimizado para 500-50000 pg/ml. La sensibilidad y el rango tienen cada uno sus propios parámetros de calibración con la concentración de la muestra asignada a partir del intervalo de confianza de los dos resultados.

Controles integrados

[0178] La presente plataforma permite la incorporación de características de control integrado para verificar la validez de los resultados de las pruebas obtenidos. Cada tipo de prueba requiere controles de ensayo integrados únicos, así como varias características genéricas. Todas las pruebas pueden tener detección de llenado para asegurar una aplicación adecuada de la muestra y no se pueden volver a realizar pruebas a los cartuchos usados. Cuando proceda, el cartucho incorporará una medición del hematocrito para ajustar aquellas pruebas afectadas por la variación del hematocrito. Se pueden implementar controles de canal específicos para incorporar controles bajos y altos que se usan para calibrar las variables de la matriz sanguínea restantes y/o verificar independientemente el resultado de la prueba. Se pueden usar controles de agotamiento para comprobar los anticuerpos antimurinos humanos (HAMA) y otras variables dependientes de la muestra.

[0179] Un microprocesador y un software asociado pueden controlar los tiempos, temperatura, control de fluidos, etc., de cada ensayo concreto, como estos pueden tener requisitos diferentes dentro de un único cartucho.

Mediciones electroquímicas

[0180] Aunque la metodología de detección primaria descrita es la fluorescencia, se pueden hacer otras mediciones ópticas y/o también se pueden hacer mediciones electroquímicas en la presente plataforma para incorporar formatos de pruebas electroquímicas tradicionales (p. ej., prueba de glucosa). Además, tanto las mediciones electroquímicas como las fluorescentes se pueden hacer en la misma tira, p. ej., un panel de diabetes de un inmunoanálisis fluorescente de péptido C junto con una medición de glucosa electroquímica. Los métodos convencionales de medición del electrodo selectivo de iones (ISE) de iones y gases sanguíneos también se pueden incorporar a la presente plataforma. La combinación de tecnologías ópticas, como la fluorescencia y la transducción electroquímica, permite disponer de una amplia variedad de diferentes pruebas de panel.

Calentamiento y control de temperatura

[0181] La temperatura es una variable significativa en la mayoría de las pruebas. En algunos ensayos, se pueden compensar los efectos de la temperatura usando un algoritmo de corrección de temperatura. Sin embargo, esto a menudo resulta problemático de determinar en lotes de cartuchos individuales, y una compensación fija se puede convertir en una fuente de error en sí misma. La caracterización de los perfiles de temperatura en todas las variables del proceso y la matriz puede tener un impacto significativo en el ciclo desarrollo del producto. En algunos productos, como las pruebas moleculares y de TP/INR, el control de temperatura es imprescindible para el funcionamiento y el rendimiento de la prueba. La presente plataforma permite la incorporación de una capacidad de calentamiento integrada que proporciona los requisitos óptimos de temperatura para cada tipo de ensayo. Se usan temperaturas de funcionamiento normales en inmunoanálisis (34°C), pruebas de TP/INR (37°C) y detección de ácido nucleico (>37°C), etc. Se puede optimizar la capacidad de calentamiento para que den un rango de temperaturas de tira y de tratamiento previo controladas para la máxima flexibilidad en el protocolo de prueba.

Tratamiento previo de la muestra

[0182] El control del movimiento de la muestra en la tira permite el tratamiento previo de la muestra antes de que la muestra se presente a los reactivos específicos del ensayo. Se puede aplicar este método en inmunoanálisis, por ejemplo, para eliminar los interferentes como especies HAMA o en perfiles lipídicos, para eliminar fracciones no deseadas de mediciones específicas de lípidos (p. ej., HDL). Los pasos fluídicos de la tira imitan las capacidades que usan los analizadores clínicos para optimizar el rendimiento del producto, que permite que se resuelvan rápidamente las interferencias y la matriz de la muestra durante el desarrollo del producto.

Descripciones de prueba y datos de prueba ejemplares

Inmunoanálisis de un solo paso

[0183] Sumario de la secuencia de la prueba:

1. Inserción del cartucho en el lector.

2. Compresión de la cámara de gas por parte del lector.

3. Aplicación de la muestra al cartucho mediante llenado por acción capilar o llenado controlado por parte del lector.

4. Humectación de los electrodos de detección de llenado del cartucho que determina el momento de inicio del ensayo.

5. La muestra rehidrata los reactivos secos, que contienen:

1. fase partícula paramagnética funcionalizada del anticuerpo antianalito (epítopo 1).

2. fase marcador/partícula fluorescente funcionalizado/a del anticuerpo antianalito (epítopo 2).

6. Los reactivos mezclan y unen el analito contenido en la muestra que forma el complejo de la composición de tres capas del inmunoanálisis (etiqueta/partícula fluorescente-analito-partícula paramagnética).

7. La reacción de unión ocurre durante una cantidad de tiempo determinada (normalmente 2 minutos).

8. Se aplica un campo magnético a la tira ubicada en la zona de detección óptica que acumula las partículas paramagnéticas en esta ubicación formando una banda de complejo partícula-analito-etiqueta en cada canal.

9. Entonces el lector ejecuta un paso de eliminación de la muestra de líquido y de la etiqueta no unida al que inicia la aplicación de una fuerza a las cámaras de gas del cartucho. Esta fuerza de compresión expulsa el gas de las cámaras de gas a través del canal de la prueba que resulta en que la muestra de líquido y la etiqueta/partículas fluorescentes no unidas salgan expulsadas de la zona de detección y, opcionalmente, del canal y hacia el sumidero de residuos de la muestra. Se aplica el campo magnético en la totalidad de este paso, el campo magnético mantiene los complejos partícula paramagnética-analito-etiqueta en la ubicación de la zona de detección mientras que la muestra sale expulsada de esta área.

10. El cabezal óptico medidor explora toda la tira y se mide la intensidad de fluorescencia de cada canal. La intensidad de fluorescencia es proporcional a la concentración del analito. Se calibran cada lote de tiras y canal de analito por separado para que la intensidad de fluorescencia se transforme en concentración del analito.

[0184] Se muestran conjuntos de datos de rendimiento de inmunoanálisis de un solo paso ejemplares en las figuras 8­ 13:

Péptido C

El péptido C es un polipéptido corto de 31 aminoácidos que conecta cadena A de insulina a su cadena B en la molécula de proinsulina. La proinsulina se divide en insulina y péptido C en cantidades equimoleculares. En el contexto del diagnóstico, el péptido C se usa como un biomarcador subrogado de la insulina y se usa para monitorizar la función de la célula p (producción de insulina) en pacientes diabéticos. Los presentes inventores llevaron a cabo una comparación del presente ensayo contra el sistema del tamaño de una mesa disponible en el mercado ADVIA Siemens Centaur (véase la figura 8).

[0185] La tabla 1 de abajo muestra el porcentaje de resultados que están dentro de un sesgo dado del sistema de referencia para el rango del péptido C según se indica. Esto muestra que el presente ensayo normalmente logra aproximadamente el 95 % de los resultados dentro del 30 % del sistema de referencia.

Tabla 1. Exactitud del ensayo de péptido C

[0186] Se ejecutó un análisis sesgado del presente sistema frente al sistema de referencia de Siemens Centaur en muestras por encima de 0.5 ng/ml (294 puntos) que se representa en (la figura 9) en comparación con un analizador clínico establecido disponible en el mercado. El porcentaje de sesgo de cada punto del valor del sistema de referencia se representa frente al valor de referencia. El gráfico muestra que el presente sistema de ensayo tiene una exactitud clínica comparable con un sistema de laboratorio establecido.

Dímero D

El dímero D es un producto de degradación de la fibrina (PDF), un pequeño fragmento de proteína presente en la sangre después de que se degrade un coágulo sanguíneo por fibrinolisis. La molécula de dímero D contiene dos fragmentos D entrecruzados de la proteína de fibrina.

Se usa la concentración de dímero D para ayudar a diagnosticar la trombosis. Se trata de una prueba importante que se realiza a pacientes de los que se sospecha que tienen trastornos trombóticos. Mientras que un resultado negativo prácticamente descarta la trombosis, un resultado positivo puede indicar trombosis, pero no descarta otras causas potenciales. Su principal uso, por tanto, es excluir la enfermedad tromboembólica donde la probabilidad es baja.

[0187] Los inventores llevaron a cabo un análisis de respuesta a la dosis usando la metodología descrita presentemente y compararon los resultados con aquellos de un HemoslL D-Dimer HS 500 (un analizador clínico disponible en el mercado) (véase la figura 10).

Proteína C-reactiva (PCR)

La proteína C reactiva (PCR) es una proteína pentamérica anular (en forma de anillo) que se encuentra en el plasma sanguíneo cuyos niveles, se elevan en respuesta a la inflamación. Es una proteína de fase aguda de origen hepático que aumenta tras la secreción de interleucina 6 por parte de los macrófagos y los linfocitos T.

[0188] La PCR es útil para el diagnóstico de una variedad de tipos de enfermedades que se puede resumir como sigue:

1. Estado inflamatorio en pacientes diabéticos tipo 1.

2. Administración de antibióticos para el control de infecciones y estado de infección general.

3. Enfermedad cardiovascular.

4. Ciertos tipos de cáncer.

[0189] Se muestra un gráfico de comparación de los métodos en la figura 11. El rango de notificación requerido es de 5-200 |jg/ml.

PRC de alta sensibilidad (PCRas)

[0190] La PRC de alta sensibilidad (PCRas) se usa para evaluar el riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares. Las directrices generales son las que siguen:

1. Bajo: nivel PCRas por debajo de 1.0 mg/L.

2. Medio: entre 1.0 y 3.0 mg/L.

3. Alto: por encima de 3.0 mg/L.

[0191] Se muestra un gráfico de comparación de los métodos en la figura 12. Los datos demuestran que la presente plataforma es perfectamente capaz de medir las concentraciones de PCRas requeridas.

HRP2 para paludismo por Plasmodium falciparum

[0192] El parásito Plasmodium falciparum del paludismo segrega la proteína 2 rica en histidina, que se usa como biomarcador para detectar la presencia del parásito Plasmodium falciparum (Pf) del paludismo. La presente plataforma se ha usado para demostrar la medición de HRP2 en muestras de sangre. La proteína HRP2 se introdujo en la sangre y se midió en la presente plataforma y en la prueba rápida de paludismo por Pf de Standard Diagnostics (SD).

[0193] La concentración más baja de HRP2 que se midió en la presente plataforma fue de 0.25 ng/ml. En comparación, al usar la prueba de la SD se observó una banda muy débil para 5ng/ml. No se pudieron medir concentraciones más bajas. El resultado de la prueba de 0.25 ng/ml de la presente plataforma tardó 7 minutos frente a los 30 minutos del tiempo de prueba recomendado requerido para la prueba de SD para medir la concentración de 5ng/ml. El tiempo de ensayo de 30 min. es necesario para que las pruebas del competidor laven la etiqueta no unida de oro coloidal y cualquier sangre lisada para resolver concentraciones muy bajas. El usuario también tiene que llevar a cabo acciones adicionales para aplicar un tampón a la tira para ejecutar este paso de lavado.

[0194] Se analizaron los datos y se resumieron los resultados en la figura 13. El presente ensayo fue capaz de medir concentraciones de HRP2 significativamente más bajas que las pruebas de SD con tiempos de prueba mucho más rápidos. Este ensayo tiene la sensibilidad necesaria para satisfacer los requisitos de una prueba rápida para monitorizar la infección residual en un programa de erradicación de paludismo en la población.

Inmunoanálisis multifase - p. ej., de troponina

[0195] Se puede configurar la presente plataforma para que lleve a cabo ensayos multifase que permitan que ocurran reacciones de unión escalonadas para optimizar la cinética de unión, el tiempo de prueba y la sensibilidad.

[0196] En el ensayo de troponina de alta sensibilidad, se disocian los pasos de unión de partícula paramagnética del anticuerpo y los pasos de unión de etiqueta/partícula para mejorar significativamente el ritmo de unión y la eficiencia de captura del paso de unión analito-partícula paramagnética del anticuerpo en concentraciones muy bajas de troponina. La posterior unión gradual de la partícula de etiqueta y la partícula paramagnética usando isotiocianato antifluoresceína de alta afinidad y partículas funcionalizadas de biotina-estreptavidina, respectivamente, permiten una captura y transducción mayores del complejo unido de troponina.

Sumario de la secuencia de la prueba:

[0197]

1. Inserción del cartucho en el lector.

2. Comprensión de la cámara de gas por parte del lector

3. Aplicación de la muestra al cartucho mediante llenado por acción capilar hasta la primera característica de respiradero-parada donde se ubican los primeros reactivos (anticuerpos etiquetados).

4. Reactivo de resolubilización y tiempo de incubación y de unión anticuerpo-analito.

5. Pequeña descompresión de la cámara que resulta en que la muestra de líquido se introduzca más allá del canal donde se encuentra la mezcla de reactivo de la muestra sobre un reactivo secundario.

6. Reactivo de resolubilización y tiempo de incubación y de unión anticuerpo-analito-etiqueta de partícula. 7. Una segunda pequeña descompresión de la cámara que resulta en que la muestra se introduzca más adelante del canal donde se encuentra la mezcla de reactivo de la muestra sobre un tercer reactivo.

8. Reactivo de resolubilización y tiempo de incubación y de unión anticuerpo-analito-etiqueta de partículapartícula paramagnética y tiempo de unión.

9. Se aplica un campo magnético al cartucho que se encuentra en la zona de detección óptica que acumula las partículas paramagnéticas en esta ubicación formando un complejo de banda anticuerpo-analito-etiqueta de partícula-partícula paramagnética en cada canal.

10. Se eliminan el líquido de la muestra y la etiqueta no unida de la zona de detección mediante la recompresión de las cámaras que expulsan la muestra y la etiqueta no ligada de la zona de detección óptica.

11. El cabezal óptico lector explora toda la tira y se mide la intensidad de fluorescencia de cada canal. La intensidad de fluorescencia es proporcional a la concentración de troponina del analito.

[0198] Se identifican los reactivos en la figura 14 del ensayo de troponina I (TnI).

[0199] Paso 1: este es un llenado capilar pasivo. El ensayo de TnI usa dos anticuerpos capturados, cada uno de los cuales está marcado con un grupo de biotina. El anticuerpo de la etiqueta está marcado con un grupo de isotiocianato de fluoresceína (FITC). Los grupos de biotina y la molécula de FITC sirven como marcadores inmunogénicos para el segundo y tercer paso.

[0200] Paso 2: el control del lector fluídico (descompresión de cámara) mueve la muestra del paso uno a un área de deposición del reactivo secundario Esta deposición contiene partículas de látex recubiertas de anticuerpos anti-FITC. Las partículas de látex anti-FITC se unirán al anticuerpo etiquetado con FTIC (que está unido al complejo Tnl). Esta reacción es rápida.

[0201] Paso 3: el control de lector fluídico mueve la muestra a la tercera zona de deposición. La tercera área de deposición contiene partículas magnéticas recubiertas de estreptavidina. Las partículas paramagnéticas de estreptavidina se unirán rápidamente a los anticuerpos etiquetados con biotina que están unidos al complejo Tnl. A la acumulación de partículas paramagnéticas la sigue la eliminación de la muestra/etiqueta no unida. Entonces se realiza la exploración óptica fluorescente. La intensidad de fluorescencia es proporcional a la concentración de TnI.

[0202] En la figura 15 se muestra un esquema del método anterior.

[0203] El paso 1 es llenado capilar, los pasos 2 y 3 están bajo el control de fluido del lector.

[0204] Este enfoque es muy atractivo ya que tiene una aplicación genérica y simplifica enormemente los reactivos del ensayo, además, cabe destacar que conlleva un excelente rendimiento del ensayo (véanse los resultados ejemplares mostrados en las figuras 16 (a) y (b)), que la sensibilidad del presente método sobre un amplio rango de concentración. Por ejemplo, el látex anti-FITC es una etiqueta genérica para otros ensayos (p. ej., de BNP), asimismo, las partículas paramagnéticas de estreptavidina también son genéricas entre ensayos. La producción lote a lote de reactivo se volverá mucho más fácil para ensayos complejos como el de TnI.

[0205] Para mostrar la importancia de llevar a cabo la detección óptica, así como la detección fluorescente, en el aire, los inventores llevaron a cabo ensayos de péptido C adicionales a fin de mostrar como responden cuando se realizan en un tampón o en sangre entera, en comparación con aire. La figura 17 muestra la respuesta de un ensayo de péptido C en tampón que usa el presente sistema antes (círculos blancos) y después (triángulos negros) de la eliminación por aire. Se puede observar que sin la eliminación del líquido por aire hay un fondo alto debido a que la etiqueta no unida sigue presente en el área de detección. Esto conlleva una precisión y sensibilidad escasas en concentraciones bajas de analito. Tras la eliminación del líquido por aire, esta etiqueta no ligada se elimina de manera eficaz, dejando un fondo muy bajo que permite realizar una medición altamente sensible. La figura 18 muestra la respuesta de un ensayo de péptido C en sangre entera que usa el presente sistema antes (círculos negros) y después (triángulos blancos) de la eliminación del líquido por aire. Se puede observar que sin la eliminación del líquido por aire hay un fondo alto debido a que la etiqueta no unida sigue presente en el área de detección y no hay pendiente visible debido a la interferencia de la muestra de sangre, que enfría la medición fluorescente. Tras la eliminación del líquido por aire, esta etiqueta no ligada y la muestra de sangre entera se eliminan de manera eficiente, dejando los reactivos unidos en un ambiente esencialmente libre de líquido sin células sanguíneas ni etiquetas no unidas. Esto produce un fondo muy bajo y permite realizar una medición altamente sensible.

[0206] Es posible que los cartuchos presentes también realicen ensayos que requieran un depósito para realizar el ensayo, por ejemplo, en la determinación de tiempo de protombina (TP) o índice internacional normalizado (INR) de una muestra de sangre. Las pruebas de TP e INR son ensayos que evalúan la vía extrínseca de la coagulación (TP/INR). Se usan para determinar la tendencia a la coagulación de la sangre, en la medida de las dosis de warfarina, daño hepático y niveles de la vitamina K.

[0207] En la figura 19 se muestra un método de comparación de los gráficos de la medición TP/INR, que se generó al usar un canal que no tiene ningún control de fluidos proporcionado por una cámara de gas. En este sentido, la muestra llenaría por acción capilar por sí sola. Para evitar dudas, las mediciones de TP/INR también se pueden hacer usando un canal con una cámara de gas asociada que permita el control fluídico de la muestra que permita la normalización de los ritmos de llenado. En comparación con los ejemplos de inmunoanálisis descritos previamente, el canal se amplía en la zona de detección de la tira a fin de permitir que se realice la prueba a un volumen de muestra mayor. Además, los reactivos específicos de INR/TP se depositan en esta área. Los reactivos contienen todos los componentes requeridos para iniciar la cascada extrínseca de coagulación y un sustrato fluoróforo específico de trombina que pasa de una forma no fluorescente a una forma fluorescente por la trombina. El llenado capilar resuspende los reactivos y permite la detección de la actividad de la trombina. La medición de la actividad de la trombina (intensidad de fluorescencia) se usa para determinar el resultado de la prueba de TP/INR.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Cartucho microfluídico (1) para uso en la realización de un ensayo sobre una muestra de líquido, comprendiendo el cartucho microfluídico un puerto de entrada de muestra (3) conectado a al menos un canal microfluídico (4), donde cada/dicho(s) canal(es) microfluídico(s) comprende(n) uno o más reactivos allí depositados para uso en la realización del ensayo y una zona de detección (32),

cada/dicho(s) canal(es) microfluídico(s) está(n) además conectado(s) de manera fluida a una cámara comprimible llena de gas (10) más adelante de cada/dicha zona de detección, donde la compresión o descompresión de una superficie externa de la/dicha cámara provoca que el gas salga expulsado de o se introduzca en la(s) cámara(s) respectivamente, lo que a su vez provoca un movimiento recíproco de la muestra de líquido dentro de dicho/cada canal microfluídico,

caracterizado por que el cartucho y los canales y otras características dispuestas en el mismo están formados por un sándwich de tres sustratos planos separados que comprenden un sustrato superior, un sustrato inferior y un sustrato intermedio dispuesto entre los sustratos superior e inferior y donde los sustratos superior e inferior tienen un grosor esencialmente uniforme y la superficie superior externa de la/de dicha cámara es elástica.

2. Cartucho microfluídico de acuerdo con la reivindicación 1, donde tras la reacción de la muestra de líquido con dicho uno o más reactivos depositados en dicho/cada canal microfluídico, el gas expulsado de la cámara sirve para eliminar el líquido de la zona de detección dentro de dicho/cada canal microfluídico, a fin de que cualquier analito o producto de reacción de analito dentro de dicha/cada zona de detección se pueda detectar en un ambiente sustancialmente libre de líquido.

3. Cartucho microfluídico de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, que comprende una pluralidad de canales microfluídicos, donde cada uno de dicha pluralidad de canales microfluídicos está en comunicación fluida con el puerto de entrada de muestra, opcionalmente donde cada uno de dicha pluralidad de canales microfluídicos está conectado a una respectiva cámara llena de gas y/o dos o más canales microfluídicos están conectados a una cámara llena de gas.

4. Cartucho microfluídico de acuerdo con la reivindicación 1 donde la capa intermedia comprende un patrón cortado a través del sustrato que corresponde a ciertas características del cartucho incluyendo el/los canal(es) y la(s) cámara(s) llena(s) de gas.

5. Canal microfluídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4 donde los sustratos planos se sellan entre sí mediante la aplicación de calor y/o el uso de adhesivo.

6. Cartucho microfluídico de acuerdo con la reivindicación 5 donde los sustratos planos se sellan entre sí usando un adhesivo, que es elástico y facilita la compresibilidad de cada/dicha cámara.

7. Cartucho microfluídico de acuerdo con la reivindicación 6 donde la capa intermedia tiene la forma de una capa adhesiva, que es capaz de adherirse a los sustratos superior e inferior.

8. Cartucho microfluídico de acuerdo con cualquier reivindicación previa donde dicho(s)/cada canal(es) microfluídico(s) en el cartucho comprende(n) una o más características de parada de fluido (20, 22, 24), diseñadas para impedir que la muestra y/u otros fluidos pasen a través de dicha(s) característica(s) de parada gracias a la acción capilar por sí sola.

9. Cartucho microfluídico de acuerdo con cualquier reivindicación previa que comprende una válvula de sentido único (50) diseñada únicamente para permitir que el gas salga del cartucho al introducirse una muestra de líquido en el cartucho por acción capilar, mientras que no permite que se introduzca fluido en el cartucho a través de la válvula, opcionalmente donde la válvula está colocada adyacente a una característica de parada (52) que se ha diseñado para impedir el transporte adicional de la muestra dentro del canal microfluídico mediante acción capilar por sí sola.

10. Cartucho microfluídico de acuerdo con cualquier reivindicación previa que además comprende un agente aglutinante de analito depositado en dicho(s) canal(es), donde opcionalmente el agente aglutinante de analito está unido a una superficie de dicho(s) canal(es), o donde el agente aglutinante está fijado a una partícula magnética o paramagnética.

11. Cartucho microfluídico de acuerdo con la reivindicación 10 donde el agente aglutinante o la partícula magnética/paramagnética están depositados en dicho(s)/cada canal(es) microfluídico(s) del cartucho, de manera que al aplicarse la muestra al cartucho e introducirse en dicho(s)/cada canal(es), los agentes aglutinantes o las partículas magnéticas/paramagnéticas quedan resuspendidos por la muestra de líquido.

12. Cartucho microfluídico de acuerdo con cualquier reivindicación previa donde dicho cartucho comprende una pluralidad de canales de ensayo (5) y es capaz de llevar a cabo una pluralidad (como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) de ensayos iguales y/o diferentes sobre una única muestra.

13. Cartucho microfluídico de acuerdo con cualquier reivindicación anterior donde la dicha cámara comprimible llena de gas está sellada y la única entrada/salida de la cámara llena de gas es la abertura con dicho(s) canal(es) microfluídico(s).