ES2907741T3 - Polipéptidos de elabela (ELA) para uso en el tratamiento del cáncer de riñón - Google Patents

Abstract

Un polipéptido d e ELA o un ác ido n ucleico q ue lo c odifica qu e com prende u na s ecuencia d e ami noácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 (QRPVNLTMRRKLRKHNCLQRRCMPLHSRVPFP) en donde el residuo arginina (R) en la posición 9, 10, 20 o 21 se sustituye por un residuo Alanina (A) y/o por un residuo Serina (S) para uso en el tratamiento de un cáncer de riñón.

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptidos de elabela (ELA) para uso en el tratamiento del cáncer de riñón

Sector de la técnica:

La presente invención se define en las reivindicaciones 1-8 y se relaciona con métodos y composiciones farmacéuticas para uso en el tratamiento del cáncer de riñón.

Estado de la técnica:

El cáncer en el riñón constituye aproximadamente 3 % de todos los tumores sólidos. Aproximadamente 85 % de los tumores renales se clasifican como un carcinoma de células renales (RCC, por sus siglas en inglés). Aproximadamente 80 % de los RCC diagnosticados se originan a partir de las células epiteliales que revisten las partes proximales de los conductos que forman la orina en los riñones, los túbulos. Debido a su aspecto bajo el microscopio, este tipo de cáncer se conoce como carcinoma renal de células claras (RCCC, por sus siglas en inglés, 65 %) o carcinoma renal papilar (RPCC, por sus siglas en inglés, 15 %). El carcinoma de células renales (RCC, por sus siglas en inglés) es la octava neoplasia más común en los Estados Unidos, con un estimado de 62.700 nuevos casos y 14.240 muertes estimadas en 2016. En la última década, una mejor compresión de la base genética y metabólica del RCC condujo al desarrollo de varias terapias dirigidas nuevas para tratar el RCC metastásico (mRCC, por sus siglas en inglés). En el contexto de la enfermedad metastásica, el uso secuencial de inhibidores de tirosina cinasa (TKI, por sus siglas en inglés) que se dirigen a la angiogénesis e/o inhibidores de la diana de rapamicina en mamíferos (mTOR, por sus siglas en inglés) puede dar como resultado la supervivencia sin progresión prolongada y una supervivencia general en el rango de 40 meses. A pesar de este progreso, las respuestas duraderas a estos fármacos son sumamente raras. Por lo tanto, existe la necesidad de hallar una estrategia de tratamiento alternativa. La Elabela (ELA) también conocida como Toddler o Apela es una hormona peptídica que se identificó recientemente como el segundo ligando de APJ, el receptor de apelina. La ELA, que se produce como un precursor de 32 aminoácidos (aa), también se encuentra con 21 aa y 11 aa. La ELA se expresa exclusivamente en células madre pluripotentes humanas y en el riñón y la próstata adultos.

Objeto de la invención:

La presente invención se relaciona con métodos y composiciones farmacéuticas para uso en el tratamiento del cáncer de riñón. En particular, el alcance de la presente invención se define por medio de las reivindicaciones. Cualquier objeto que esté fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solo con fines informativos. Cualesquiera referencias en la descripción a métodos de tratamiento se refieren a compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para uso en un método de tratamiento del cuerpo humano mediante terapia.

Descripción detallada de la invención:

Los inventores mostraron que si bien la Elabela (ELA) se expresa en su mayor parte en el riñón, su expresión se reduce en el cáncer de riñón humano. En un modelo animal de xenoinjerto (inyección subcutánea o subcapsular) Ela inhibe la progresión tumoral. Este hallazgo identifica a Ela como un nuevo gen supresor tumoral en el riñón.

Por consiguiente, el primer objeto de la presente descripción se relaciona con un tratamiento para el cáncer de riñón en un sujeto que lo necesita que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de ELA que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 (QRPVNLTMRRKLRKHNCLQRRCMPLH- SRVPFP) en donde el residuo arginina (R) en la posición 9, 10, 20 o 21 se muta opcionalmente.

Según se usa en la presente memoria, el término "cáncer de riñón" tiene su significado general en la técnica y hace referencia a un cáncer que surge en el riñón. En algunas realizaciones, el cáncer de riñón es un carcinoma de células renales. El término "cáncer de células renales" o "carcinoma de células renales" (RCC), según se usa en la presente memoria, hace referencia al cáncer que se origina en el revestimiento del túbulo contorneado proximal. Más específicamente, el RCC abarca varios subtipos histológicos relativamente comunes: carcinoma renal de células claras, papilar (cromófilo), cromófobo, carcinoma de células renales de túbulo colector y carcinoma renal medular. El carcinoma renal de células claras (ccRCC) es el subtipo más común de RCC.

Según se usa en la presente memoria, el término "tratamiento" o "tratar" hace referencia al tratamiento profiláctico o preventivo, así como al tratamiento curativo o modificador de la enfermedad, que incluye el tratamiento del paciente en riesgo de contraer la enfermedad o que se sospecha que contrajo la enfermedad, así como pacientes que están enfermos o que se ha diagnosticado que padecen una enfermedad o afección médica, e incluye la supresión de la recidiva clínica. El tratamiento puede administrarse a un sujeto que padece un trastorno médico o que, en última instancia, puede adquirir el trastorno, con el fin de prevenir, curar, retrasar la aparición de, reducir la gravedad de o mejorar uno o más síntomas de un trastorno o trastorno recurrente, o para prolongar la supervivencia de un sujeto más allá de lo previsto en ausencia de dicho tratamiento. Se entiende por "régimen terapéutico" el patrón de tratamiento de una dolencia, p. ej., el patrón de dosificación usado durante la terapia. Un régimen terapéutico puede incluir un régimen de inducción y un régimen de mantenimiento. La frase "régimen de inducción" o "período de inducción" se refiere a un régimen terapéutico (o la porción de un régimen terapéutico) que se usa para el tratamiento inicial de una enfermedad. El objetivo general de un régimen de inducción es proporcionar un nivel alto de fármaco a un paciente durante el período inicial de un régimen de tratamiento. Un régimen de inducción puede emplear (en parte o en su totalidad) un "régimen de carga", que puede incluir administrar una dosis mayor del fármaco que la que emplearía un médico durante un régimen de mantenimiento, administrar un fármaco más frecuentemente que lo que un médico administraría el fármaco durante un régimen de mantenimiento, o ambos. La frase "régimen de mantenimiento" o "período de mantenimiento" se refiere a un régimen terapéutico (o la porción de un régimen terapéutico) que se usa para el mantenimiento de un paciente durante el tratamiento de una dolencia, p. ej., para mantener al paciente en remisión durante largos períodos de tiempo (meses o años). Un régimen de mantenimiento puede emplear terapia continua (p. ej., administrar un fármaco en intervalos regulares, p. ej., semanalmente, mensualmente, anualmente, etc.) o terapia intermitente (p. ej., tratamiento interrumpido, tratamiento intermitente, tratamiento en la recidiva o tratamiento después de alcanzar criterios predeterminados particulares [p. ej., manifestación de la enfermedad, etc.]).

Según la invención, una primera secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con una segunda secuencia de aminoácidos significa que la primera secuencia tiene 90; 91; 92; 93; 94; 95; 96; 97; 98; 99 o 100 % de identidad con la segunda secuencia de aminoácidos. La identidad de secuencia se mide frecuentemente en relación con el porcentaje de identidad (o similitud u homología); cuanto mayor el porcentaje, mayor será la similitud entre las dos secuencias. Los métodos para la alineación de secuencias para su comparación se conocen en la técnica. Varios programas y algoritmos de alineación se describen en: Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444, 1988; Higgins and Sharp, Gene, 73:237-244, 1988; Higgins and Sharp, CABIOS, 5:151-153, 1989; Corpet et al. Nuc. Acids Res., 16:10881-10890, 1988; Huang et al., Comp. Appls Biosci., 8:155-165, 1992; y Pearson et al., Meth. Mol. Biol., 24:307-31, 1994). Altschul et al., Nat. Genet., 6:119-129, 1994, presenta una consideración detallada de métodos de alineación de secuencias y cálculos de homología. A modo de ejemplo, las herramientas de alineación ALIGN (Myers and Miller, CABIOS 4:11-17, 1989) o LFASTA (Pearson and Lipman, 1988) pueden usarse para realizar comparaciones entre secuencias (Internet Program © 1996, W. R. Pearson y la University of Virginia, fasta20u63, versión 2.0u63, fecha de lanzamiento: diciembre de 1996). ALIGN compara secuencias enteras entre sí, mientras que LFASTA compara regiones de similitud locales. Estas herramientas de alineación y sus respectivos tutoriales están disponibles en Internet en el sitio web de NCSA, por ejemplo. Alternativamente, para las comparaciones de secuencias de aminoácidos con más de aproximadamente 30 aminoácidos, se puede emplear la función de secuencias Blast 2 con el uso de la matriz predeterminada BLOSUM62 ajustada según parámetros predeterminados, (costo de existencia de espacio de 11 y un costo por espacio de residuo de 1). Cuando se alinean péptidos cortos (menos de aproximadamente 30 aminoácidos), la alineación debería llevarse a cabo con el uso de la función de secuencias Blast 2, al emplear la matriz PAM30 ajustada según parámetros predeterminados (penalizaciones por espacio abierto 9, espacio de extensión 1). El sistema de comparación de secuencias BLAST está disponible, por ejemplo, en el sitio web de NCBI; ver también Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990; Gish. & States, Nature Genet., 3:266-272, 1993; Madden et al. Meth. Enzymol., 266:131-141, 1996; Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997; y Zhang & Madden, Genome Res., 7:649-656, 1997.

Según se usa en la presente memoria, el término mutación tiene su significado general en la técnica y se refiere a una sustitución, eliminación o inserción. El término "sustitución" significa que un residuo aminoacídico específico en una posición específica se retira y otro residuo aminoacídico se inserta en la misma posición. El término "eliminación" significa que un residuo aminoacídico específico se retira. El término "inserción" significa que uno o más residuos aminoacídicos se insertan antes o después de un residuo aminoacídico específico, más específicamente, que uno o más, preferiblemente uno o varios, residuos aminoacídicos se unen a un grupo carboxilo o un grupo amino del residuo aminoacídico específico.

En algunas realizaciones, el residuo arginina en la posición en la posición 9, 10, 20 o 21 se muta se sustituye para que la carga en la cadena lateral a pH=7,4 se invierta (p. ej., carga negativa a positiva) o se vuelva neutra (p. ej., carga negativa a neutra). En algunas realizaciones, el peso y el índice de hidopatía permanece en el mismo rango.

En algunas realizaciones, el residuo arginina (R) en la posición 9, 10, 20 o 21 se sustituye por un residuo aminoacídico seleccionado del grupo que consiste en alanina (A) y/o serina (S).

Según la invención, el polipéptido de ELA de la invención se produce mediante métodos de síntesis de péptidos automatizados convencionales o mediante expresión recombinante. Los principios generales para diseñar y producir proteínas son conocidos para los expertos en la técnica. Los polipéptidos de ELA de la invención se pueden sintetizar en disolución o en un soporte sólido según técnicas convencionales. Se encuentran disponibles comercialmente varios sintetizadores automáticos y pueden usarse según protocolos conocidos como se describen en Stewart and Young; Tam et al., 1983; Merrifield, 1986 and Barany and Merrifield, Gross and Meienhofer, 1979. Los polipéptidos de ELA de la invención también pueden sintetizarse mediante tecnología de fase sólida al emplear un sintetizador de péptidos ilustrativo tal como un Modelo 433A de Applied Biosystems Inc. La pureza de cualquier proteína dada; generada a través de síntesis de péptidos automatizada o a través de métodos recombinantes puede determinarse al usar análisis por HPLC de fase inversa. Se puede establecer la autenticidad química de cada péptido mediante cualquier método conocido por los expertos en la técnica. Como una alternativa a la síntesis de péptidos automatizada, se puede emplear tecnología de ADN recombinante en donde una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de elección se inserta en un vector de expresión, se transforma o transfecta en una célula hospedante apropiada y se cultiva en condiciones adecuadas para la expresión como se describe en la presente memoria más adelante. Los métodos recombinantes se prefieren especialmente para producir polipéptidos más largos. Se puede utilizar una variedad de sistemas de vector de expresión/hospedante para contener y expresar la secuencia codificante de péptido o proteína. Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias transformadas con bacteriófagos recombinantes, vectores de expresión de ADN con plásmidos o cósmidos; levadura transformada con vectores de expresión en levadura (Giga-Hama et al., 1999); sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus (p. ej., baculovirus, ver Ghosh et al., 2002); sistemas de células vegetales transfectadas con vectores de expresión de virus (p. ej., virus del mosaico de la coliflor, CaMV, por sus siglas en inglés; virus del mosaico del tabaco, TMV, por sus siglas en inglés) o trasformados con vectores de expresión bacteriana (p. ej., plásmido Ti o pBR322; ver, p. ej., Babe et al., 2000); o sistemas de células animales. Los expertos en la técnica están al tanto de varias técnicas para optimizar la expresión en mamíferos de proteínas, ver, p. ej., Kaufman, 2000; Colosimo et al., 2000. Las células de mamífero que son útiles en producciones de proteína recombinante incluyen, pero no se limitan a, células VERO, células HeLa, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés), células COS (tales como COS-7), células W138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562 y 293. Los protocolos ilustrativos para la expresión recombinante de los sustratos peptídicos o polipéptidos de fusión en bacterias, levadura y otros invertebrados son conocidos para los expertos en la técnica y se describen a grandes rasgos en la presente memoria más adelante. Los sistemas de hospedante mamífero para la expresión de proteínas recombinantes también son conocidos para los expertos en la técnica. Las cepas de célula hospedante pueden elegirse según una capacidad particular para procesar la proteína expresada o producir ciertas modificaciones postraducción que serán útiles para proporcionar la actividad de la proteína. Dichas modificaciones del polipéptido incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación. El procesamiento postraducción que escinde una forma "prepro" de la proteína también puede ser importante para la inserción, plegado y/o función correctos. Diferentes células hospedantes tales como CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38 y similares tienen una maquinaria celular específica y mecanismos característicos para dichas actividades postraducción y pueden elegirse para asegurar la modificación y procesamiento correctos de la proteína extraña introducida.

En algunas realizaciones, se contempla que los polipéptidos de ELA de la invención usados en los métodos terapéuticos de la presente invención puedan modificarse para mejorar su eficacia terapéutica. Dicha modificación de compuestos terapéuticos puede usarse para disminuir la toxicidad, aumentar el tiempo en circulación o modificar la biodistribución. Por ejemplo, la toxicidad de compuestos terapéuticos potencialmente importantes puede disminuirse significativamente mediante la combinación con una variedad de vehículos portadores de fármaco que modifican la biodistribución. Una estrategia para mejorar la viabilidad del fármaco es la utilización de polímeros solubles en agua. Se ha demostrado que varios polímeros solubles en agua modifican la biodistribución, mejoran el modo de captación celular, cambian la permeabilidad a través de barreras fisiológicas; y modifican la velocidad de aclaramiento desde el cuerpo. Para lograr un efecto de liberación dirigida o sostenida, se han sintetizado polímeros solubles en agua que contienen restos de fármaco como grupos terminales, como parte de la cadena principal, o como grupos colgantes en la cadena polimérica. El polietilenglicol (PEG) se ha usado ampliamente como portador de fármacos dado su alto grado de biocompatibilidad y su facilidad de modificación. El acoplamiento a varios fármacos, proteínas y liposomas ha demostrado mejorar el tiempo de permanencia y disminuir la toxicidad. El PEG puede acoplarse a agentes activos a través de los grupos hidroxilo en los extremos de la cadena y a través de otros métodos químicos; sin embargo, el PEG en sí mismo se limita a como máximo dos agentes activos por molécula. En una estrategia diferente, se han explorado copolímeros de PEG y aminoácidos como biomateriales nuevos que mantendrían las propiedades de biocompatibilidad del PEG, pero tendrían la ventaja adicional de numerosos puntos de acoplamiento por molécula (que proporcionan una mayor carga de fármaco) y podrían diseñarse sintéticamente para adaptarse a una variedad de aplicaciones.

El segundo objeto de la presente descripción se relaciona con el tratamiento para tratar el cáncer de riñón en un sujeto que lo necesita que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de ELA de la presente invención

Según se usa en la presente memoria, el término "molécula de ácido nucleico" tiene su significado general en la técnica y se refiere a una molécula de ADN o ARN. Sin embargo, el término abarca secuencias que incluyen cualesquiera de los análogos base conocidos de ADN y ARN tales como, pero sin limitarse a, 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetil- aminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1 -metiladenina, 1 -metilpseudouracilo, 1-metil-guanina, 1- metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5- metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiamino-metil-2-tiouracilo, beta-D- manosilqueosina, 5'-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, metiléster de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metiléster de ácido -uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2,6-diaminopurina.

En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico de la presente invención se incluye en un vector adecuado, tal como un plásmido, cósmido, episoma, cromosoma artificial, fago o un vector vírico. De modo que, un objeto adicional de la invención se relaciona con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de ELA de la invención. Típicamente, el vector es un vector vírico que es un virus adenoasociado (AAV, por sus siglas en inglés), un retrovirus, un virus del papiloma bovino, un vector de adenovirus, un vector lentivírico, un virus de la variolovacuna, un virus del polioma o un virus infeccioso. En algunas realizaciones, el vector es un vector de AAV. Según se usa en la presente memoria, el término "vector de AAV" significa un vector derivado de un serotipo de virus adenoasociado que incluyen, sin limitación, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, a Av 9 y formas mutadas de estos. Los vectores de AAV pueden tener uno o más de los genes naturales de AAV eliminados de forma parcial o total, preferiblemente, los genes rep y/o cap, pero se conservan las secuencias de ITR flanqueadoras funcionales. Los retrovirus pueden elegirse como vectores de suministro génico debido a su capacidad para integrar sus genes en el genoma del hospedante, transferir una gran cantidad de material genético extraño, infectar a un amplio espectro de especies y tipos de células y empaquetarse en líneas celulares especiales. Para construir un vector retrovírico, se inserta un ácido nucleico que codifica un gen de interés en el genoma vírico en el lugar de ciertas secuencias víricas para producir un virus con deficiencia de replicación. Para producir viriones, se construye una línea celular de empaquetamiento que contiene los genes gag, pol y/o env, pero sin los componentes de LTR y de empaquetamiento. Cuando se introduce un plásmido recombinante que contiene un ADNc junto con las secuencias de LTR y empaquetamiento retrovíricas en esta línea celular (mediante precipitación con fosfato cálcico, por ejemplo), la secuencia de empaquetamiento permite que el transcrito de ARN del plásmido recombinante se empaquete en partículas víricas, que después se secretan en los medios de cultivo. Los medios que contienen los retrovirus recombinantes después se recogen, opcionalmente se concentran y se usan para la transferencia de genes. Los vectores retrovíricos son capaces de infectar a una amplia variedad de tipos celulares. Los lentivirus son retrovirus complejos que, además de los genes retrovíricos comunes gag, pol y env, contienen otros genes con función reguladora o estructural. La mayor complejidad permite que el virus module su ciclo de vida, como en el transcurso de una infección latente. Algunos ejemplos de lentivirus incluyen los virus de la inmunodeficiencia humana (VIH 1, VIH 2) y el virus de la inmunodeficiencia símica (VIS). Se han generado vectores lentivíricos al atenuar de forma multiplicada los genes de virulencia del VIH, por ejemplo, los genes env, vif, vpr, vpu y nef se eliminan, lo que vuelve al vector biológicamente seguro. Los vectores lentivíricos se conocen en la técnica, ver, p. ej., las patentes estadounidenses núms. 6.013.516 y 5.994.136. En general, los vectores se basan en plásmidos o se basan en virus, y se configuran para portar las secuencias esenciales para incorporar el ácido nucleico extraño, para la selección y para la transferencia del ácido nucleico a una célula hospedante. Los genes gag, pol y env de los vectores de interés también se conocen en la técnica. Por lo tanto, los genes relevantes se clonan en el vector seleccionado y después se usan para transformar la célula diana de interés. Un lentivirus recombinante capaz de infectar una célula que no se divide, en donde una célula hospedante adecuada se transfecta con dos o más vectores que portan las funciones de empaquetamiento, a saber, gag, pol y env, así como rev y tat, se describe en la patente estadounidense núm. 5.994.136. Se describe un primer vector que puede proporcionar un ácido nucleico que codifica un gen gag y un pol víricos y otro vector puede proporcionar un ácido nucleico que codifica un env vírico para producir una célula de empaquetamiento. La introducción de un vector que proporciona un gen heterólogo en dicha célula de empaquetamiento genera una célula productora que libera las partículas víricas infecciosas que portan el gen de interés extraño. El env preferiblemente es una proteína de envoltura anfotrópica que permite la transducción de células de humanos y otras especies. Típicamente, la molécula de ácido nucleico o el vector de la presente invención incluyen "secuencias de control", que se refieren colectivamente a regiones promotoras, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios reguladores anteriores, orígenes de replicación, sitios de entrada a ribosoma internos ("IRES", por sus siglas en inglés), potenciadores y similares, que colectivamente proporcionan la replicación, transcripción y traducción de una secuencia de codificación en una célula receptora. No todas estas secuencias de control necesitan estar siempre presentes con tal de que la secuencia codificante seleccionada sea capaz de replicarse, transcribirse y traducirse en una célula hospedante apropiada. Otra secuencia de ácido nucleico es una secuencia "promotora" que se usa en la presente memoria en su sentido habitual para hacer referencia a una región nucleotídica que comprende una secuencia reguladora de ADN, en donde la secuencia reguladora deriva de un gen capaz de unirse a la ARN polimerasa e iniciar la transcripción de una secuencia codificante posterior (en dirección a 3'). Los promotores de transcripción pueden incluir "promotores inducibles" (donde la expresión de una secuencia polinucleotídica funcionalmente enlazada al promotor se induce mediante un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.), "promotores reprimibles" (donde la expresión de una secuencia polinucleotídica funcionalmente enlazada al promotor se induce mediante un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.) y "promotores constitutivos".

Se entiende por "cantidad terapéuticamente eficaz" una cantidad suficiente del polipéptido de ELA o la molécula de ácido nucleico que lo codifica para evitar el uso de un método para el tratamiento de la enfermedad (p. ej., cáncer de riñón) en una relación riesgo/beneficio razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. Se entenderá que, el uso total diario de los compuestos y composiciones de la presente invención será decidido por el médico tratante dentro del alcance de la opinión médica bien fundada. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para cualquier sujeto en particular dependerá de una variedad de factores que incluyen la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del sujeto; el tiempo de administración, la vía de administración y la velocidad de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; los fármacos usados en combinación o simultáneamente con el polipéptido específico empleado; y factores similares conocidos en la técnica médica. Por ejemplo, la experiencia en la técnica contempla iniciar con dosis de un compuesto a niveles menores que los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y gradualmente aumentar la dosificación hasta lograr el efecto deseado. Sin embargo, la dosificación diaria de los productos puede variar en un rango amplio de 0,01 a 1000 mg por adulto por día. Preferiblemente, las composiciones contienen 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 250 y 500 mg del ingrediente activo para el ajuste sintomático de la dosificación al sujeto que se va a tratar. Un medicamento típicamente contiene de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 500 mg del ingrediente activo, preferiblemente, de 1 mg a aproximadamente 100 mg del ingrediente activo. Una cantidad eficaz del fármaco se suministra habitualmente en un nivel de dosificación 0,0002 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal por día, especialmente, de aproximadamente 0,001 mg/kg a 7 mg/kg de peso corporal por día.

Según la descripción, el polipéptido de ELA o la molécula de ácido nucleico (insertada o no en un vector) de la presente invención se administra al sujeto en forma de una composición farmacéutica. Típicamente, el polipéptido de ELA o la molécula de ácido nucleico (insertada o no en un vector) de la presente invención puede combinarse con excipientes farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, matrices de liberación sostenida, tales como polímeros biodegradables, para formar composiciones farmacéuticas. "Farmacéuticamente" o "farmacéuticamente aceptable" hace referencia a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción inapropiada cuando se administran a un mamífero, especialmente un ser humano, según sea apropiado. Un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable se refiere a una carga, diluyente, material encapsulante o auxiliar de formulación sólido, semisólido o líquido, no tóxico de cualquier tipo. En las composiciones farmacéuticas de la presente invención para administración oral, sublingual, subcutánea, intramuscular, intravenosa, transdérmica, local o rectal, el principio activo solo o en combinación con otro principio activo, puede administrarse en una forma de administración unitaria, como una mezcla con soportes farmacéuticos convencionales, a animales y seres humanos. Las formas de administración unitarias adecuadas comprimidos formas para vía oral tales como comprimidos, cápsulas de gel, polvos, gránulos y suspensiones o disoluciones orales, formas de administración sublingual y bucal, aerosoles, implantes, formas de administración subcutánea, transdérmica, tópica, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, subdérmica, transdérmica, intratecal e intranasal y formas de administración rectal. Típicamente, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos que son farmacéuticamente aceptables para una formulación capaz de inyectarse. Estos pueden ser, en particular, disoluciones isotónicas, estériles, salinas (fosfato monosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares o mezclas de dichas sales), o composiciones secas, especialmente liofilizadas que después de la adición, dependiendo del caso, de agua esterilizada o disolución salina fisiológica, permiten la reconstitución de disoluciones inyectables. Las formas farmacéuticas adecuadas para el uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de maní o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y deber ser fluida en la medida en que exista la posibilidad de colocarla en una jeringa fácilmente. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Las disoluciones que comprenden compuestos de la invención como base libre o sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua mezclada de forma adecuada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de estos, y en aceites. En condiciones de almacenamiento y uso normales, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos. El polipéptido de ELA o la molécula de ácido nucleico (insertada o no en un vector) de la presente invención puede formularse en una composición en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídricos o fosfóricos, o tales ácidos orgánicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico y tales bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. El portador también puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de estos y aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, al mantener el tamaño de partícula necesario en caso de dispersión y al usar tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr mediante el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Las disoluciones inyectables estériles se preparan al incorporar los compuestos activos en la cantidad necesaria en el disolvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesarios, con la posterior esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan al incorporar los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos de preparación típicos son las técnicas de secado al vacío y liofilización que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una disolución esterilizada por filtración previamente de estos. También se contempla la preparación de disoluciones más o altamente concentradas para inyección directa, donde el uso de DMSO como disolvente tiene como fin dar como resultado una penetración extremadamente rápida que suministra concentraciones altas de los agentes activos a un área tumoral pequeña. Después de la formulación, las disoluciones se administrarán de manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación, tales como el tipo de disoluciones inyectables descrito anteriormente, pero también se pueden emplear cápsulas de liberación de fármaco y similares. Para la administración parenteral en una disolución acuosa, por ejemplo, se debe regular la disolución de manera adecuada si fuera necesario y el diluyente líquido se debe volver isotónico en primer lugar con disolución salina o glucosa suficiente. Estas disoluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. En este sentido, los expertos en la técnica conocerán medios acuosos estériles que se pueden emplear en virtud de la presente descripción. Se producirá necesariamente alguna variación en la dosificación dependiendo de la afección del sujeto al que se esté tratando. La persona responsable de la administración, en cualquier caso, determinará la dosis apropiada para el sujeto individual.

En la presente memoria se describe un método para diagnosticar el cáncer de riñón en un sujeto que comprende las etapas de:

i) medir el nivel de expresión de Elabela (ELA) en una muestra obtenida de dicho sujeto;

ii) comparar la expresión medida en la etapa i) con su valor de referencia predeterminado;

iii) concluir que el sujeto padece cáncer de riñón cuando el nivel de expresión de Elabela (ELA) es más bajo que su valor de referencia predeterminado o concluir que el sujeto no padece cáncer de riñón cuando el nivel de expresión de Elabela (ELA) es más alto que su valor de referencia predeterminado.

El término "diagnosticar", según se usa en la presente memoria, significa evaluar si un sujeto padece cáncer de riñón o no.

La invención se ilustrará adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no deben interpretarse de ninguna forma como una limitación al alcance de la presente invención, que se define en las reivindicaciones 1-8.

Figuras:

Figura 1. Expresión reducida de Elabela en cáncer de riñón humano. El análisis por PCR en tiempo real reveló una disminución de elabela en tejidos tumorales de riñón en comparación con los tejidos pseudonormales derivados del mismo paciente.

Figura 2. Efecto de la expresión de Elabela en las células tumorales de riñón (Renca) en la progresión tumoral subcutánea. Se usaron Elabela natural (ela wt), mutante (Ela mut) o lentivirus testigo para expresar Ela wt, ela mut en células Renca antes de su inoculación en ratones singénicos.

Figura 3. Efecto de la expresión de Elabela en las células tumorales de riñón (Renca) en la progresión tumoral renal. Se usaron Elabela natural (ela wt) o lentivirus testigo para expresar ela wt en células Renca antes de su inoculación subcapsular en ratones singénicos.

Figura 4. Procesamiento de ProEla. Se sintetizaron el péptido proEla 32 natural y mut proEla 32 en el que se reemplazaron los dos sitios de escisión R31/R32 y R42/R43 por S31/S32 y S42/S43, respectivamente, y se incubaron con furina (0,2*10'4U) durante 4 h. Como se evaluó mediante transferencia western al usar un anticuerpo anti-Ela, la furina procesa el proEla 32 natural en los sitios de escisión fisiológicos correspondientes. La incubación de este péptido con furina genera sola la Ela 11 aa, lo cual sugiere que proEla 32 se escinde de manera eficaz en los dos sitios de escisión. La incubación de mut proEla 32 con furina no logró generar ningún producto.

Figura 5. Análisis de la expresión de Ela, furina y APJ en tejidos de ratón adulto. Se extrajo el ARN total de tejidos indicados y se llevó a cabo análisis de PCR en tiempo real al usar cebadores específicos par Ela (A), furina (B) y APJ (C) murinos. La expresión del gen de mantenimiento que se evaluó en cada muestra se usó como testigo endógeno en las condiciones descritas en el texto. Los resultados que se muestran son representativos de 3 experimentos. Para la comparación, se asignó al hígado (Ela y APJ) o al intestino (furina) un valor de 1 dependiendo del nivel de la expresión génica analizada. Los datos la media ± DE (n=3 por grupo).

Figura 6. Expresión de Ela, furina y APJ en pacientes con cáncer de riñón. Se extrajo el ARN total del tumor y de tejidos no tumorales circundantes de muestras clínicas de riñón de n = 7 pacientes y se llevó a cabo análisis por PCR en tiempo real al usar cebadores específicos par Ela, furina y APJ humanos. La expresión del gen de mantenimiento que se evaluó en cada muestra se usó como testigo endógeno en las condiciones descritas en el texto. Las gráficas muestran la diferencia en múltiplo en la expresión de los transcritos indicados con un valor de '1' asignado a tejidos normales. Cabe señalar la expresión reducida del ARNm de Ela en tejidos tumorales en comparación con sus contrapartes normales.

Figura 7. Inhibición del crecimiento tumoral por proEla natural y mut. Se infectaron de manera estable células cancerosas Renca de riñón (que carecen de la expresión de Ela) con vector lentivírico vacío (Testigo) o el mismo vector que contiene la construcción humana de proEla natural o mutante. La expresión de proEla natural y mut humana en estas células se confirmó a nivel de ARN al usar PCR en tiempo real y cebadores humanos. Se proporcionó el uso de cebadores de Ela murinos para la comparación (A). Se inocularon subcutáneamente tres grupos de ratones BALB/c singénicos machos con 1* 105 de células Renca testigo y las mismas células que expresan proEla 32 natural o proEla 32 mutante. Se monitorizó la formación tumoral en los animales durante los períodos indicados. Cabe señalar el tamaño más pequeño de los tumores inducidos por las células tumorales que expresan proEla natural o ProEla mut. La proEla 32 natural inhibió de manera más eficaz el crecimiento tumoral en comparación con pro Ela 32 mutante. Los resultados son representativos de 2 experimentos llevados a cabo con células Renca infectadas independientemente con vectores lentivíricos indicados. Los valores son la media ± EEM (n = 6 por grupo). ***P <0,001.

Figura 8. Se colocaron en placas células RENCA (20.000 células 4 células/pocillo) en placas de 96 pocillos, se llevó a cabo un ensayo de proliferación al usar el sistema de obtención de imágenes con células vivas IncuCyte ZOOM™ (Essen BioScience, MI EE. UU.). Este sistema mide la densidad celular. Las células se propagan rutinariamente en medio RPMI 1640 (Life Technologies) en suero bovino fetal al 2 % a 37 °C. Las células se barren regularmente para Mycoplasma (ATCC). La placa se coloca en el aparato IncuCyte ZOOM™ y se registran imágenes de la diseminación celular colectiva cada 2 horas para una duración total de 50 horas.

Ejemplo 1:

La Elabela (ELA) también conocida como Toddler o Apela es una hormona peptídica que se identificó recientemente como el segundo ligando de APJ, el receptor de apelina. La ELA, que se produce como un precursor de 32 aminoácidos (aa), también se encuentra con 21 aa y 11 aa. Nuestros resultados muestran que Ela se expresa en su mayor parte en el riñón y su expresión se reduce en el cáncer de riñón humano (Figura 1). En un modelo animal de xenoinjerto (inyección subcutánea o subcapsular) Ela inhibe la progresión tumoral (Figuras 2 y 3). Además, hemos generados un polipéptido de ELA mutante en donde los residuos arginina en la posición 9, 10, 20 y 21 se sustituyeron por un residuo serina. Mostramos que el polipéptido de ELA mutante también es capaz de inhibir la progresión tumoral (Figura 2). Este hallazgo identifica a Ela como un nuevo gen supresor tumoral en el riñón.

Ejemplo 2:

Materiales y métodos

Muestras de pacientes

Se obtuvieron muestras nuevas y sus correspondientes tejidos normales de tumores de riñón humano. Todos los pacientes proporcionaron consentimiento informado por escrito. El material de los pacientes se desmarcó y el Comité de Ética de la Investigación Nacional en Francia aprobó el protocolo del estudio. Después de la cirugía, las muestras de tejido se transfirieron inmediatamente a hielo y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido hasta que se usaron para la extracción de ARN.

Producción de vectores lentivíricos, infección celular y cultivo

Se clonaron ProEla natural y mutante (los sitios de procesamiento R31/R32 y R42/R43 se reemplazaron por S31/S32 y S42/S43 aa) en un vector lentivírico autoinactivante multicistrónico que contenía un gen indicador tdTomate (pRRLsin-MND- hPGK-tdTomato-WPRE), bajo el control del potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo. Todas las construcciones se verificaron mediante secuenciación. La construcción y producción de vectores lentivíricos se llevaron a cabo en la instalación "Vect'UB" de TMB-Central de la Bordeaux University. Se produjeron lentivectores pseudotipificados VSV-G mediante la triple transfección transitoria en células HEK293T y se concentraron mediante ultrafiltración (Vivaspin 20, Sartorius Biotech SA, EE. UU.). Se determinaron los valores víricos de lentivectores pLV al transducir células HEK293T con diluciones en serie de sobrenadante vírico y se cuantificó la expresión de tdTomate 5 días después mediante análisis de citometría de flujo. El día de la infección, se sembraron las células Renca de adenocarcinoma de riñón murino (5x104 células/pocillo) en una placa de veinticuatro pocillos con polibreno o 8 pg/ml. Se agregó lentivirus que codifica proEla natural, proEla mutante o solo tdTomate al medio a MOI 10 (Multiplicidad de infección). Se observaron las tasas de infección celular 72 horas después al usar microscopio fluorescente. Las células Renca se mantuvieron en medio RPMI1640 complementado con FCS al 10 %, 100 unidades/ml de penicilina/estreptomicina y 2mM de L-Glutamina.

Análisis de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real

Se extrajo el ARN total de muestras de humanos al usar el kit NucleoSpin RNA (Macherey-Nagel) según las instrucciones del fabricante. Se extrajo el ARN de muestras de ratón al usar el reactivo TRI (MRC Inc., EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. Se sometió a síntesis de ADNc un mg del ARN total al usar el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems, Courtaboeuf, Francia). Se verificó la calidad del ARN de las muestras de humanos al usar el kit Agilent RNA 6000 Nano según las instrucciones del fabricante (Agilent). La cuantificación relativa de ARNm específicos se llevó a cabo mediante PCR en tiempo real al usar el StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Courtaboeuf, Francia), PCR Master Mix (Eurogentec) y cebadores específicos, según las instrucciones del fabricante. Las condiciones para la reacción fueron las siguientes para SYBR Green qPCR: 10 minutos a 95 °C, durante 40 ciclos 15 segundos a 95 °C, 60 segundos a 60 °C y después 15 minutos a 95 °C, 60 segundos a 60 °C y 15 minutos a 95 °C; y para Taqman qPCR: 2 minutos a 50 °C, 10 minutos a 95 °C, durante 40 ciclos 15 segundos a 95 °C y 60 segundos a 60 °C. Se usaron los genes de mantenimiento GAPDH, HPRT1 o S16 como testigos endógenos para células y tejidos de humanos o ratón, como se describió anteriormente (Scamuffa et al., 2008).

Síntesis de péptidos y digestión enzimática in vitro

Se sintetizaron los péptidos Ela 11, proEla 32 natural y proEla 32 mutante mediante Clinisciences. Los péptidos de Ela se digirieron con furina durante 4 h como se describió anteriormente (Sfaxi et al., 2014., Scamuffa et al., 2008) y se sometieron a análisis de transferencia western.

Análisis de transferencia Western

Los productos de digestión enzimática in vitro generados se sometieron a SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida en geles al 13 %. El anticuerpo primario usado fue un anti-Ela 11 (Eurogentec). Se usaron un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante y quimioluminiscencia potenciada (ECL+Plus, Amersham) para el revelado del anticuerpo primario según las instrucciones del fabricante al usar un sistema de obtención de imágenes Chemiluminescence (GeneGnome, Syngene) (Sfaxi et al., 2014., Scamuffa et al., 2008). Ensayo de internalización de receptor

Se privó de suero durante 24 horas a células HEK293A que expresan establemente la proteína de fusión GFP-APJ humana y se trataron durante 30 minutos con 1 mM de péptido Ela 11, proEla 32 natural o proEla 32 mutante. Las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 10 minutos a temperatura ambiente y se analizó la internalización del receptor APJ al usar microscopía con epifluorescencia Nikon.

Análisis de activación de ERK, AKT y P70

Se mantuvieron células HEK293A que sobreexpresaban la proteína de fusión GFP-APJ humana en una condición de medios libres de suero durante 24 y se incubaron con (1pM) o sin Ela 11, proEla natural o proEla mutante durante 5, 15 y 30 min a 37 °C. Las células se lisaron en regulador RIPA (150 mM de NaCl, 50 mM de Tris, 1mM de EDTA, NP40 al 1 %, desoxicolato de sodio al 0,25 %, pH 8) y se sometieron a SDS-PAGE en geles al 12 %. Los lisados celulares se analizaron mediante transferencia western para determinar la fosforilación de ERK, AKT y P70 al usar anti-fosfo-ERK; anti-fosfo-AKT y anti-fosfo-P70 (Cell Signaling), respectivamente. Las transferencias se separaron y resondearon con ERK, AKT o P70 (Cell Signaling) para la normalización de los datos. Se visualizaron los anticuerpos primarios al usar anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (Amersham) y se detectaron señales al usar el sistema de quimioluminiscencia ECLPlus según las instrucciones del fabricante (Amersham).

Vía de señalización de mTOR

Se mantuvieron células RENCA que sobreexpresaban lentivirus que codificaba proEla natural, proEla mutante o solo tdTomate en medios libres de suero durante un tiempo diferente. Las células se lisaron en regulador RIPA (150 mM de NaCl, 50 mM de Tris, 1mM de EDTA, NP40 al 1 %, desoxicolato de sodio al 0,25 %, pH 8) y se sometieron a SDS-PAGE en geles al 12 %. Se analizaron los lisados celulares mediante transferencia western para LC3, NFkB, Erk1/2, AKT, S6K o actina al usar un anti fosfor NFkB, anti-fosfo Erk, anti-fosfo- Akt, anti-fosfo S6K. Las transferencias se separaron y resondearon con ERK, AKT o P70 (Cell Signaling) para la normalización de los datos. Se visualizaron los anticuerpos primarios al usar anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (Amersham) y se detectaron señales al usar el sistema de quimioluminiscencia ECLPlus según las instrucciones del fabricante (Amersham).

Ensayo de tumorigenicidad

Se alojaron ratones Balb/c de 7 a 8 semanas de Janvier Laboratories en estantes tipo carrusel ventilados y se les proporcionó alimento estéril y agua para beber. El Comité para el Alojamiento y Experimento con Animales del gobierno francés aprobó todos los experimentos con ratones notificados en la presente memoria. Para evaluar el efecto de la expresión de proEla natural y proEla mutante sobre la capacidad de células Renca de inducir el crecimiento tumoral, se inyectaron subcutáneamente 1x105 células Renca o las mismas células que expresaban establemente proEla natural o proEla mutante en ratones BALB/c singénicos. Se monitorizó la formación tumoral cada 2-3 días y los ratones se sacrificaron al final de los experimentos. Se calculó el volumen tumoral como se describió anteriormente (Sfaxi et al., 2014).

Ensayo de curación de heridas

Se cultivaron células Renca hasta la subconfluencia. Se realizó un rasguño con una punta en cada pocillo y se observó la curación de heridas después 8 o 24 h después del agotamiento del suero.

Estadística

Todos los datos se expresaron como media ± desviación típica (DT) y el análisis estadístico se llevó a cabo al usar Graphpad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Los valores de p <0,05 se consideraron significativos.

Resultados

Procesamiento de ProEla 32 mediante la proproteína convertasa furina.

La estructura de ADNc de ELA humana prevé un pre-proEla de 54 aminoácidos (aa). Después de la eliminación de los 22 aa del péptido señal, la hormona se libera como proEla de 32 aa. La presencia de dos motivos aminoacídicos básicos R31/R32 y R42/R43 en proEla 32 sugiere la participación de PC en su procesamiento (no se muestran los datos). A través de las bases de datos de Genbank hallamos que la secuencia de proEla está altamente conservada, particularmente alrededor de los sitios de escisión similares a PC RX(K/R)RQ (no se muestran los datos). Para estudiar la importancia de la maduración proteolítica de preEla 32 por medio de los PC en la mediación de su función, primero evaluamos experimentalmente el procesamiento de proEla 32 mediante furina al usar un ensayo de digestión in vitro. Con este fin, sintetizamos proEla 32 aa natural que contiene los sitios de procesamiento de proEla (R31/R32 y R42/R43) y un péptido mutante proEla 32 en el que los sitios de procesamiento se mutaron a S31/S32 y S42/S43, respectivamente.

Como se ilustra en la Figura 4, la incubación de proEla natural con furina humana recombinante (0,2*10'4U) generó predominantemente la Ela 11 aa madura, lo que sugiere que los sitios R31/R32 y R42/R43 se escindieron de manera eficaz y simultánea mediante furina, lo que evitó la generación de la forma intermedia ELA 22 aa en estas condiciones. En cambio, la incubación del péptido mutante ProEla 32 (S31/S32 y S42/S43) con furina no logró generar ningún producto de Ela madura, lo que respalda el procesamiento específico de proEla por medio de los PC en los sitios de escisión fisiológicos R31/R32 y R42/R43.

El análisis de la expresión de Ela, furina y APJ en tejidos de ratones y pacientes con cáncer de riñón adultos.

El análisis de PCR en tiempo real de varios tejidos de ratones adultos reveló si bien furina y APJ se expresan en todos los tejidos analizados, Ela se expresa principalmente en el riñón (Figura 5). La expresión coordinada de Ela, su receptor APJ y su enzima convertidora furina en el epitelio de riñón de ratones normales nos llevó a investigar el alcance del nivel de la expresión de estos genes en cánceres de riñón humanos y evaluar el rol de Ela y su procesamiento en esta enfermedad. De este modo, el uso de análisis de PCR en tiempo real de tejidos obtenidos de pacientes con cáncer de riñón reveló la expresión omnipresente de Ela, APJ y furina (Figura 6). En comparación con tejidos normales, se detectó expresión reducida de Ela y furina en los tejidos de pacientes con cáncer de riñón analizados. De los tejidos de 7 pacientes analizados, Ela presentó disminución en 6 pacientes.

Internalización de APJ y péptidos de Ela

La internalización del receptor inducida por el ligando es una respuesta celular de APJ a la unión al ligando y su activación. Para investigar si ELA 11 madura, pro Ela 32 natural y mutante inducirán la internalización de APJ, se expresaron de manera estable APJ como una proteína de fusión con proteína verde fluorescente potenciada (GFP-APJ, no se muestran los datos) a través de infección lentivírica en células HEK293 y se examinó su localización intracelular en respuesta a péptidos de Ela indicados. A nivel basal, la proteína de fusión se localizó principalmente en la superficie celular. Después de los tratamientos con péptido de Ela, se formaron grandes vesículas en el citoplasma después de 30 min, lo que sugiere que todas las formas del péptido de Ela son capaces de activar el receptor APJ y mediar su internalización. De manera similar, el tratamiento de células con Ela 11 y proEla 32 mut o proEla natural y proEla mut también indujo la internalización de APJ.

Análisis de activación de ERK, AKT y p70

Para evaluar la importancia del procesamiento de proEla en la mediación de la señalización de ERK, AKT y p70, tratamos células HEK293 que expresaban APJ con proEla 32 natural, mut o Ela 11 madura. Todos estos péptidos de Ela (1mM) fueron capaces de inducir la fosforilación de ERK a los 5 min de tratamiento (no se muestran los datos). Este efecto se redujo después de 15 min según se reveló mediante análisis Western. De manera interesante, en las mismas condiciones, el efecto de proEla natural sobre la activación de ERK fue más alto en comparación con el efecto de proEla mut y Ela 11 (no se muestran los datos). El análisis de la activación de AKT reveló que todos los péptidos evaluados indujeron una activación de AKT más baja en comparación con su efecto sobre la activación de ERK. Se observó una débil fosforilación visible de AKT después de 5 min que alcanzó su máximo aproximadamente a los 15 min y disminuyó a continuación (no se muestran los datos). De manera similar, el análisis del efector posterior de a Kt P70s6K reveló que 1 mM de todos los péptidos evaluados no logró inducir un efecto significativo en las mismas condiciones (no se muestran los datos).

Vía de señalización de mTOR

Para evaluar el rol de Elabela sobre la progresión del cáncer de riñón, usamos células RENCA que expresan elabela o elabela mutada en el sitio de furina. Se agotó el suero de las células durante 1, 3, 6, 12 o 24 horas y se observó el efecto de Elabela sobre la vía de mTOR al observar la fosforilación o nfkB, Erk1/2, akt o S6K.

La expresión de las versiones WT y MUT de ELABELA en células RENCA durante el agotamiento del suero indujo: 1. Un bloque en la inducción de autofagia, según se estimó mediante niveles de LC3II reducidos.

2. Una activación sostenida de la vía de mTORC1, según se determinó mediante la fosforilación sostenida de S6K y S6.

3. Una inhibición potenciada de la señalización de ERK, según se determinó mediante un aumento en la fosforilación de ERK.

4. Ningún efecto en la señalización de mTORC2 según se determinó mediante P(473)AKT.

5. Ningún efecto en la señalización de PI3K según se determinó mediante P(308)AKT.

6. Ningún efecto en la señalización de NFkB.

Rol del procesamiento de Ela y proEla en la tumorigénesis.

Para investigar el rol de proEla 32 natural y mutante sobre la progresión tumoral, aprovechamos las células cancerosas Renca de riñón murino que carecen de expresión de Ela y el uso de los vectores lentivíricos pRRLsin-MND-hPGK- tdTomato-WPRE para suministrar y expresar de manera estable proEla 32 natural y mutante en estas células. Antes del análisis, se evaluaron las células cancerosas Renca que expresaban proEla humana natural y mutante para la expresión de estas construcciones al usar PCR en tiempo real (Figura 7A) y mediante la presencia de la proteína fluorescente tdTomate (no se muestran los datos). Se inocularon subcutáneamente tres grupos de ratones BALB/c singénicos machos con 1*105 de células testigo y las mismas células que expresan proEla 32 natural o proEla 32 mutante. Como se ilustra en la Figura 7B, la expresión proEla natural o mutante en estas células tumorales redujo significativamente el crecimiento tumoral en comparación con células testigo que expresan el vector vacío. La expresión de proEla 32 natural natural pareció inhibir de manera más eficaz el crecimiento tumoral en comparación con proEla 32 mutante. Estos datos se confirman mediante experimento de curación de heridas (no se muestran los datos). La Elabela inhibe la curación de heridas de células Renca in vitro y también en la Figura 8 para el ensayo de proliferación de células. Elabela inhibe la proliferación de células renca.

Discusión

La expresión ubicua de furina y la presencia de un motivo de escisión dibásico en el precursor de Ela (proEla 32) sugiere que los PC son candidatos de proteasa para el procesamiento de ProEla (no se muestran los datos). En el estudio actual, demostramos que los PC (furina) participan en el procesamiento proteolítico de proEla en dos sitios de escisión, a saber, R31/R32 y R42/R43. En nuestro modelo, los sitios de escisión de proEla se confirmaron mediante mutagénesis y digestión enzimática in vitro de péptidos proEla naturales y mutantes (Figura 4). Sin embargo, si bien la escisión de proEla (32aa) en estos dos sitios de escisión supone la generación de las formas de péptido Ela 22 y Ela 11, solo se detectó la forma Ela 11 en estas condiciones, lo que sugiere la posible rápida conversión de Ela 22 en Ela 11 en presencia de furina (Figura 4). El análisis de varios tejidos de ratones adultos mostró la coexpresión de Ela, su receptor APJ y ARNm de furina (Figura 5), lo que refuerza el vínculo funcional entre los tres. Estos datos se corroboraron, además, por la llamativa correlación temporal entre la expresión de Ela, APJ y furina durante el desarrollo embrionario (Scamuffa et al., 2006., Helker et al., 2015), lo cual sugiere un rol clave de estos genes durante estos procesos. Por consiguiente, informes previos indican que el fenotipo mutante de ELA es similar a los mutantes de APJ en pez cebra, y la inactivación del locus fur mediante recombinación homóloga en el ratón causa la muerte embrionaria poco después e10.5 (Scamuffa et al., 2006). Por lo tanto, se sugiere que ELA, su proteasa convertidora furina y el receptor APJ participan en funciones biológicas necesarias para el desarrollo embrionario normal. Sin embargo, en este estudio hallamos que la inhibición del procesamiento del precursor proEla no afectó significativamente su función biológica. De hecho, ELA se halló originalmente bien conservada en vertebrados (Pauli et al., 2014., Chng et al., 2013), particularmente alrededor de los sitios de escisión PC (no se muestran los datos) y se describió como un ligando específico para APJ, lo que sugiere una conservación funcional de la vía ELA-APJ en mamíferos. Recientemente, se notificó que Ela media otras funciones a través de su interacción con la ribonucleoproteína nuclear heterogénea L (hnRNPL, por sus siglas en inglés), un regulador inhibidor de p53 (Li et al.,

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido de ELA o un ácido nucleico que lo codifica que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 (QRPVNLTMRRKLRKHNCLQRRCMPLHSRVPFP) en donde el residuo arginina (R) en la posición 9, 10, 20 o 21 se sustituye por un residuo Alanina (A) y/o por un residuo Serina (S) para uso en el tratamiento de un cáncer de riñón.

2. El polipéptido de ELA o áci do nucleico para su uso segú n la reivindicación 1, en do nde el cáncer d e riñón es un carcinoma de células renales.

3. El polipéptido de ELA o ácido nucleico para su uso según la reivindicación 2, en donde el carcinoma de células renales se sel ecciona entre un carcinoma renal de célu las claras, un carcinoma re nal papilar, un carcinoma renal cromófobo, un carcinoma de túbulo colector y un carcinoma renal medular.

4. El polipéptido de ELA o ácido nucleico para su uso según la reivindicación 3, en donde el carcinoma de células renales es un carcinoma renal de células claras.

5. El polipéptido de ELA o ácido nucl eico para su uso según cualquiera de las reivind icaciones anteriores, en donde la mol écula d e áci do n ucleico se i ncluye en u n vector adec uado, ta l como un p lásmido, cósmi do, ep isoma, cromosoma artificial, fago o un vector vírico.

6. El polipéptido de ELA o ácido nucl eico para su uso según cualquiera de las reivind icaciones anteriores, en donde la secuencia de aminoácidos tiene 100 % de identidad con la SEQ ID NO 1.

7. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 (QRPVNLTMR-RKLRKHNCLQRRCMPLHSRVPFP), en donde el residuo arginina (R) en la posición 9, 10, 20 o 21 se sustituye por un residuo Alanina (A) y/o un residuo Serina (S).

8. Una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la reivindicación 7.