ES2624659T3 - Composiciones terapéuticas de SERCA2 y métodos de uso - Google Patents

Composiciones terapéuticas de SERCA2 y métodos de uso Download PDF

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Yoshiaki Kawase
Dennis Ladage
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Abstract

Un vector de expresión vírico adeno-asociado (AAV) para su uso en el tratamiento de hipertensión pulmonar, que comprende un transgén de calcio++ ATPasa del retículo sarcoplasmático (SR) (SERCA), en el que el transgén es la isoforma 2a de SERCA (SERCA2a) y modula al transporte de iones Ca2+, y en el que la expresión del transgén aumenta la función de la célula hospedadora en un sujeto.

Description

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DESCRIPCION
Composiciones terapeuticas de SERCA2 y metodos de uso Antecedentes de la invencion Campo de la invencion
La presente invencion por lo general se refiere al tratamiento de enfermedades pulmonares, y de forma mas espedfica, al tratamiento de hipertension pulmonar en un sujeto mediante el suministro de una protema de Ca++ ATPasa del retmulo sarcoplasmatico que codifica polinucleotido (SERCA2a) en un vector de expresion AAV.
Informacion de antecedentes
La hipertension pulmonar (PH o PHT) es un aumento de la presion sangumea en la arteria pulmonar, vena pulmonar, o capilares pulmonares, conocidos como vasculatura pulmonar, que conducen a dificultad para respirar, mareos, desmayos y otros smtomas, todos los cuales se agravan con el esfuerzo. La hipertension pulmonar puede ser una enfermedad grave con una marcada disminucion de la tolerancia al ejercicio e insuficiencia cardiaca.
Independientemente de cual sea la causa inicial, hipertension arterial pulmonar implica la vasoconstriccion o endurecimiento de los vasos sangumeos conectados a los pulmones y dentro de los mismos. Esto hace que sea mas diffcil que el corazon bombee sangre a traves de los pulmones, asf como es mas diffcil hacer que el agua fluya a traves de una tubena estrecha en contraposicion a una ancha. Con el tiempo, los vasos sangumeos afectados se vuelven mas ngidos y gruesos, en un proceso conocido como fibrosis. Esto aumenta aun mas la presion arterial dentro de los pulmones y perjudica su flujo sangumeo. Ademas, el aumento de la carga de trabajo del corazon provoca engrosamiento y agrandamiento del ventnculo derecho, haciendo que el corazon sea menos capaz de bombear sangre a traves de los pulmones, causando insuficiencia cardiaca de la parte derecha. A medida que el flujo sangumeo a traves de los pulmones disminuye, el lado izquierdo del corazon recibe menos sangre. Esta sangre tambien puede llevar menos oxfgeno de lo normal. Por lo tanto, se hace mas y mas diffcil que la parte izquierda del corazon bombee para suministrar el oxfgeno suficiente al resto del cuerpo, especialmente durante la actividad ffsica.
La hipertension venosa pulmonar no implica una obstruccion para el flujo sangumeo en los pulmones. En su lugar, la parte izquierda del corazon no bombea la sangre de manera eficaz, lo que conduce a la acumulacion de sangre en los pulmones. Esto causa edema pulmonar y derrames pleurales.
En la hipertension pulmonar hipoxica, se cree que los niveles bajos de oxfgeno causan vasoconstriccion o endurecimiento de las arterias pulmonares. Esto conduce a una fisiopatologfa similar a la de la hipertension arterial pulmonar.
En la hipertension pulmonar tromboembolica cronica, los vasos sangumeos se bloquean o se estrechan con coagulos sangumeos. De nuevo, esto conduce a una fisiopatologfa similar a la de la hipertension arterial pulmonar.
Hasta la fecha, no existe cura conocida para la hipertension pulmonar. Aunque la terapia con prostaciclina intravenosa (un regimen de tratamiento actual para la hipertension pulmonar) prolonga la supervivencia en pacientes con PAH, el uso de esta opcion de tratamiento esta limitado por la corta semivida del farmaco, requisito para un sistema de infusion continua, y complicaciones relacionadas con el cateter. Como tal, los regfmenes de tratamiento actuales estan destinados a controlar los smtomas asociados con la enfermedad. Cuando la hipertension pulmonar conduce a otra afeccion, entonces el tratamiento se dirige por lo general a esa enfermedad subyacente. Por consiguiente, durante mucho tiempo se ha deseado la aparicion de una nueva terapia que permita la produccion continua de material terapeutico.
Sumario de la invencion
La presente invencion se basa en el descubrimiento trascendental de que la sobreexpresion de calcio++ ATPasa (SERCA) del reffculo sarcoplasmatico (SR) previene la remodelacion de las celulas del musculo liso de los vasos sangumeos y aumenta la relajacion y produccion de eNOS, que es un vaso dilatado bien conocido. Como tal, la sobreexpresion de SERCA2a en la arteria pulmonar se usa para tratar la hipertension pulmonar.
En un aspecto, la invencion proporciona un vector de expresion vffico adeno-asociado (AAV) para su uso en el tratamiento de hipertension pulmonar, que comprende un transgen de calcio++ ATPasa (SERCA) del reffculo sarcoplasmatico (SR), en el que el transgen es la isoforma 2a de SERCA (SERCA2a) y modula al transporte de iones Ca2+, y en el que la expresion del transgen aumenta la funcion de la celula hospedadora en un sujeto. El tratamiento de hipertension pulmonar incluye, pero no se limita a, disminucion de la presion sangumea en la arteria pulmonar y/o la vena pulmonar. Las celulas hospedadoras pueden estar asociadas con la funcion pulmonar, tales como celulas musculares de la arteria pulmonar, celulas musculares de la vena pulmonar, celulas musculares de capilar pulmonar, arteriolas pulmonares, alveolos y celulas de musculo liso vascular. El vector AAV puede tener el
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serotipo 1 (rAAVI), serotipo 2 (AAV2) o serotipo 8 (rAAV8). El tratamiento puede disminuir la presion sangumea en la arteria pulmonar o la vena pulmonar, puede dar como resultado una presion sistolica inferior y una presion diastolica ventricular inferior, puede mejorar la remodelacion vascular pulmonar, puede disminuir la proliferacion de celulas del musculo liso vascular, o puede aumentar la produccion de eNOS a partir de celulas endoteliales.
El sujeto puede ser un mairnfero, tal como un ser humano.
El vector se puede proporcionar con un metodo seleccionado entre el grupo que consiste en pulverizacion intranasal, inhalacion, y administracion por aerosol. El vector se puede suministrar en forma de una micropartmula.
En otro aspecto, la invencion proporciona un virion de virus adeno-asociado (AAV) recombinante para su uso en el tratamiento de hipertension pulmonar, en el que (a) el virion comprende un vector AAV que comprende un transgen unido de forma operativa con elementos de control que dirigen la expresion del transgen en una celula hospedadora, (b) la expresion del transgen mejora la funcion pulmonar, y (c) el transgen es la isoforma 2a (SERCA2a) de calcio++ ATPasa (SERCA) del retmulo sarcoplasmatico (SR).
En otro aspecto mas, la invencion proporciona un virion de AAV recombinante (rAAV) para su uso en el tratamiento de hipertension pulmonar, comprendiendo el rAAV un polinucleotido que codifica una protema, en el que (a) el polinucleotido esta unido de forma operativa a un elemento de control capaz de dirigir la expresion de la protema, (b) el virion rAAV se administra directamente en una celula muscular pulmonar de un sujeto mamffero, (c) la protema es la isoforma 2a (SERCA2a) de calcio++ ATPasa (SERCA) del retmulo sarcoplasmatico (SR) y (d) la protema se expresa a un nivel terapeuticamente eficaz en la celula muscular.
El sujeto puede ser un ser humano.
El virion de AAV recombinante se puede suministrar con un metodo seleccionado entre el grupo que consiste en pulverizacion intranasal, inhalacion, y administracion por aerosol. El virion de AAV recombinante se puede suministrar en forma de una micropartmula.
Breve descripcion de las figuras
Las Figuras 1A-1D son diagramas graficos que muestran presiones cardiacas y funcion en ratas con hipertension pulmonar despues de tratamiento con AAV1 intratraqueal. SERCA2a.
Descripcion detallada de la invencion
Antes de describir la presente invencion, se debe entender que la presente invencion no se limita a composiciones, metodos y condiciones experimentales descritos en particular, ya que tales composiciones, metodos y condiciones pueden variar. Tambien se debe entender que la terminologfa usada en el presente documento es solamente para fines de descripcion de realizaciones en particular, y no pretende ser limitante, ya que el alcance to de la presente invencion se limitara solamente en las reivindicaciones adjuntas.
Como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno", y "el" incluyen referencias en plural a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. Por lo tanto, por ejemplo, las referencias a, "el metodo", incluyen uno o mas metodos, y/o etapas del tipo que se describe en el presente documento que seran evidentes para las personas con experiencia en la materia despues de la lectura de la presente divulgacion, etc.
A menos que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que normalmente entiende una persona con una experiencia habitual en la materia a la que pertenece la presente invencion. Aunque en el presente documento se puede usar cualquier metodo y material similar o equivalente a los que se describen en el presente documento en la practica o ensayo de la invencion, los metodos y materiales preferentes se describen a continuacion.
La practica de la presente invencion usara, a menos que se indique espedficamente lo contrario, metodos de virologfa, inmunologfa, microbiologfa, biologfa molecular y tecnicas de ADN recombinante convencionales dentro de la experiencia en la materia, muchos de los cuales se describen a continuacion con fines de ilustracion. Las tecnicas de este tipo se describen completamente en la bibliograffa. Vease, por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Edicion, 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I y II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames y S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames y S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984).
La hipertension arterial pulmonar (HAP) es una enfermedad potencialmente mortal, que actualmente no presenta tratamientos establecidos satisfactorios. La transferencia genetica usando virus adeno-asociado (AAV) se conoce bien por su seguridad y capacidad de expresar genes exogenos durante periodos prolongados. Se mostro que la
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sobreexpresion de SERCA2a previene el remodelamiento de las celulas del musculo liso vascular (VSMC), disminuye la proliferacion de VSMC y aumenta la relajacion y produccion de eNOS a partir de celulas endoteliales, que es un vasodilatador bien conocido.
Por lo tanto, los metodos proporcionados en el presente documento, utilizan un vector vmco para suministrar el gen de SERCA2 o sus isoformas directamente a los pulmones y/o a celulas musculares asociadas con la funcion pulmonar. Un aspecto de la presente invencion contempla la transferencia de un polinucleotido terapeutico SERCA2a en una celula. Dicha transferencia emplea un vector de virus adeno-asociado (AAV).
Los polinucleotidos SERCA2a se incorporan en un vector vmco para mediar la transferencia a una celula. Las construcciones de expresion adicionales que codifican otros agentes terapeuticos como se describe en el presente documento tambien se pueden transferir a traves de transduccion vmca usando partmulas vmcas infecciosas, por ejemplo, mediante transformacion con un virus adeno-asociado (AAV) de la presente invencion. Como alternativa, para tales otros agentes terapeuticos se puede usar un retrovirus, un virus del papiloma bovino, un vector de adenovirus, un vector lentivmco, un virus vaccinia, un virus polioma, o un virus infeccioso. De forma analoga, para tales otros agentes terapeuticos se pueden usar metodos no vmcos que incluyen, pero no se limitan a, administracion directa de ADN tal como por perfusion, transfeccion de ADN desnudo, transfeccion mediada por liposomas, encapsulacion y endocitosis mediada por receptores. Estas tecnicas son bien conocidas por los expertos en la tecnica y sus particularidades no se encuentran en el punto crucial de la presente invencion y por lo tanto no es necesario detallar las de forma exhaustiva en el presente documento. Por ejemplo, un vector vmco se usa para la transduccion de celulas pulmonares para suministrar un polinucleotido terapeuticamente significativo a una celula. El virus puede tener acceso al interior de la celula mediante un medio espedfico tal como endocitosis mediada por receptor, o mediante un medio no espedfico tal como pinocitosis.
A continuacion se describira un numero de vectores a modo de ejemplo. Se observara que la presente invencion utiliza vectores de expresion vmca adeno-asociados o viriones de AAV recombinante.
Virus adeno-asociado (AAV)
Se ha mostrado que el virus adeno-asociado (AAV) es una promesa para el suministro de genes para terapia genetica en ensayos clmicos en seres humanos. Como el unico sistema de vectores vmcos basado en un virus no patogeno y de replicacion defectuosa, los viriones de AAV recombinantes se han usado de forma satisfactoria para establecer una transferencia genetica eficaz y sostenida tanto de celulas proliferantes como diferenciadas terminalmente en una diversidad de tejidos.
El genoma de AAV es una molecula lineal de ADN de cadena sencilla que contiene aproximadamente 4681 nucleotidos. El genoma de AAV por lo general comprende un genoma interno no repetitivo flanqueado en cada extremo por repeticiones terminales invertidas (ITR). Las ITR tienen una longitud de aproximadamente 145 pares de bases (pb). Las ITR tienen multiples funciones, incluyendo como ongenes de la replicacion del ADN, y como senales de empaquetamiento para el genoma vmco. La porcion interna no repetida del genoma incluye dos grandes marcos de lectura abiertos, conocidos como genes de replicacion (rep) y capside (cap) de AAV. Los genes rep y cap codifican protemas vmcas que permiten que el virus se replique y empaquete en un virion. En particular, una familia de al menos cuatro protemas vmcas se expresa a partir de la region rep de AAV, Rep 78, Rep 68, Rep 52, y Rep 40, denominadas de acuerdo con su peso molecular aparente. La region cap de AAV codifica al menos tres protemas, VP1, VP2 y VP3.
El AAV se ha modificado por ingeniena para proporcionar genes de interes mediante delecion de la parte no repetitiva interna del genoma de AAV (es decir, los genes rep y cap) y para insertar un gen heterologo entre las ITR. El gen heterologo por lo general se une funcional u operativamente a un promotor heterologo (constitutivo, espedfico de celula, o inducible) capaz de dirigir la expresion genetica en las celulas diana del paciente en condiciones apropiadas. Tambien se pueden incluir senales de terminacion, tales como sitios de poliadenilacion.
Como se usa en el presente documento, la expresion "vector AAV" se refiere a un vector obtenido a partir de un serotipo de virus adeno-asociado, que incluye, pero no se limita a, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, y formas mutadas de los mismos. Los vectores de AAV pueden tener uno o mas de los genes de tipo silvestre de AAV con delecion total o parcial, preferentemente los genes rep y/o cap, pero conservan secuencias de ITR de flanqueo funcionales. A pesar del alto grado de homologfa, los diferentes serotipos tienen tropismos para diferentes tejidos. El receptor de AAV1 es desconocido; sin embargo, se sabe que AAV1 transduce musculo esqueletico y liso de manera mas eficaz que AAV2. Sin quedar ligado por la teona, ya que la mayona de los estudios se han realizado con vectores pseudotipados en los que el ADN vector flanqueado con la ITR de AAV2 se empaqueta en capsides de serotipos alternativos, es evidente que las diferencias biologicas estan relacionadas con la capside en lugar de con los genomas. La evidencia reciente indica que los casetes de expresion de ADN empaquetados en capsides de AAV1 son al menos 1 log-io mas eficientes en la transduccion de cardiomiocitos que los empaquetados en capsides de AAV2.
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Las secuencias de ITR funcional son necesarias para el rescate, replicacion y empaquetamiento del virion de AAV. Por lo tanto, el vector AAV se define en el presente documento para incluir al menos aquellas secuencias requeridas en cis para replicacion y empaquetamiento (por ejemplo, las ITR funcionales) del virus. No es necesario que las ITR sean secuencias de nucleotidos de tipo silvestre, y se puedan alterar, por ejemplo, mediante la insercion, delecion o substitucion de nucleotidos, siempre y cuando las secuencias proporcionen rescate, replicacion y empaquetamiento funcionales.
Los vectores AAV deben tener una copia de las secuencias de repeticion terminales invertidas de AAV (ITR) en cada extremo del genoma para su replicacion, empaquetamiento en partfculas de AAV y su integracion de forma eficaz en cromosomas celulares. Sin embargo, el acido nucleico estimulado por ITR puede ser cualquier secuencia deseada. En una realizacion, el acido nucleico codifica un polipeptido SERCA2 o su isoforma (por ejemplo, SERCA2a), que tiene una funcion deseada en la celula en la que se expresa el vector. Por ejemplo, el polipeptido SERCA2 aumenta el control del almacenamiento y la regulacion de Ca++ en la celula, disminuyendo de ese modo la presion arterial en las arterias de los pulmones.
La ITR consiste en los nucleotidos 1 a 145 en el extremo izquierdo del genoma de ADN de AAV y los nucleotidos correspondientes 4681 a 4536 (es decir, la misma secuencia) en el extremo derecho del genoma de ADN de AAV. Por lo tanto, los vectores AAV deben tener un total de al menos 300 nucleotidos de la secuencia terminal. Por lo tanto, para el empaquetamiento de grandes regiones codificantes en partfculas de vector AAV, es importante desarrollar las secuencias reguladoras mas pequenas posibles, tales como promotores de transcripcion y senal de adicion de poliA. En este sistema, el vector vmco adeno-asociado que comprende las secuencias de repeticion terminal invertida (ITR) del virus adeno-asociado y un acido nucleico que codifica SERCA (por ejemplo, SERCA2), sus isoformas, fragmentos y/o variantes, en el que las secuencias de repeticion terminales invertidas estimulan la expresion del acido nucleico en ausencia de otro promotor.
Por consiguiente, como se usa en el presente documento, AAV se refiere a todos a los serotipos de AAV (es decir, 1-9) y formas mutadas de los mismos. Por lo tanto, en la tecnica es habitual usar las secuencias de ITR de otros serotipos de AAV, ya que se espera que las ITR de todos los serotipos de AAV tengan estructuras y funciones similares con respecto a mecanismos de replicacion, integracion, escision y transcripcion.
El AAV tambien es un virus dependiente de auxiliar. Es decir, se requiere coinfeccion con un virus auxiliar (por ejemplo, adenovirus, virus del herpes o vaccinia), con el fin de formar viriones de AAV. En ausencia de coinfeccion con un virus auxiliar, el AAV establece un estado latente en el que el genoma vmco se inserta en una celula hospedadora del cromosoma, pero no se producen viriones infecciosos. La infeccion posterior con un virus auxiliar "rescata" el genoma integrado, permitiendo que replique y empaquete su genoma en un virion de AAV infeccioso. Aunque el AAV puede infectar celulas de diferentes especies, el virus auxiliar debe ser de la misma especie que la celula hospedadora. Por lo tanto, por ejemplo, el AAV humano se replicara en celulas caninas coinfectadas con un adenovirus canino.
La expresion "funciones auxiliares de AAV" se refieren a secuencias codificantes obtenidas a partir de AAV que se pueden expresar para proporcionar productos geneticos de AAV que, a su vez, funcionan en trans para la replicacion productiva de AAV. Por lo tanto, las funciones auxiliares de AAV incluyen ambos de los marcos de lectura abiertos (ORF) de AAV principales, rep y cap. Se ha mostrado que los productos de expresion de Rep tienen poseen muchas funciones, incluyendo, entre otras: reconocimiento, union y corte del origen de AAV de replicacion del ADN; actividad de ADN helicasa; y modulacion de la transcripcion de promotores de AAV (u otros heterologos). Los productos de expresion de Cap proporcionan las funciones de empaquetamiento necesarias. Las funciones auxiliares de AAV se usan en el presente documento para complementar funciones de AAV en trans que faltan a partir de vectores AAV.
Por consiguiente, la expresion "construccion auxiliar de AAV" se refiere por lo general a una molecula de acido nucleico que incluye secuencias de nucleotidos que proporcionan funciones de AAV con delecion a partir de un vector AAV que se va a usar para producir un vector de transduccion para proporcionar una secuencia de nucleotidos de interes. Las construcciones auxiliares de AAV se usan comunmente para proporcionar la expresion transitoria de genes rep y/o cap de AAV para complementar las funciones ausentes de AAV que son necesarias para la replicacion del AAV lttico; sin embargo, las construcciones auxiliares carecen de las ITR de AAV y no pueden replicarse ni empaquetarse por sf mismas. Las construcciones auxiliares de AAV pueden estar en forma de un plasmido, fago, transposon, cosmido, virus o virion. Se han descrito varias construcciones auxiliares de AAV y vectores que codifican productos de expresion de Rep y/o Cap.
Por lo general, el virus AAV recombinante (rAAV) se produce mediante cotransfeccion de un plasmido que contiene el gen de interes flanqueado por las dos repeticiones terminales de AAV y/o un plasmido de expresion que contiene las secuencias codifica antes de AAV de tipo silvestre sin las repeticiones terminales, por ejemplo pIM45. Las celulas tambien se infectan y/o transfectan con adenovirus y/o plasmidos que portan los genes de adenovirus requeridos para la funcion auxiliar de AAV. Las reservas de virus de rAAV preparadas de esta manera se contaminan con adenovirus que deben estar ffsicamente separados de las partfculas de rAAV (por ejemplo, mediante centrifugacion de densidad de cloruro de cesio o cromatograffa en columna). Como alternativa, se podnan usar vectores de
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adenovirus que contienen las regiones codificantes de AAV y/o lmeas celulares que contienen las regiones codificantes de AAV y/o algunos o todos los genes auxiliares de adenovirus. Tambien se pueden usar lmeas celulares que portan el ADN de rAAV como un provirus integrado.
Como se usa en el presente documento, la expresion "funciones auxiliares" se refiere a funciones vmcas y/o celulares no obtenidas a partir de AAV sobre las que AAV es dependiente para su replicacion. Por lo tanto, la expresion incluye protemas y los ARN que son necesarios en la replicacion de AAV, incluyendo los restos implicados en la activacion de la transcripcion genetica de AAV, el corte y empalme espedfico de ARNm de AAV espedfico de etapa, replicacion de ADN de AAV, smtesis de productos de expresion de Cap y ensamblaje de capside de AAV. Las funciones auxiliares basadas en virus se pueden obtener a partir de cualquiera de los virus auxiliares conocidos tales como adenovirus, virus del herpes (distintos del virus del herpes simple de tipo 1) y virus vaccinia.
Por consiguiente, "vector de funcion auxiliar" se refiere al a una molecula de acido nucleico que incluye secuencias de nucleotidos que proporcionan funciones auxiliares. Un vector de funcion auxiliar se puede transfectar en una celula hospedadora adecuada, en la que el vector a continuacion es capaz de apoyar la produccion de virion de AAV en la celula hospedadora. En la expresion quedan excluidas de forma expresa las partmulas vmcas infecciosas tal como existen en la naturaleza, tales como partmulas de adenovirus, virus del herpes o virus vaccinia. Por lo tanto, los vectores de funcion auxiliar tambien pueden estar en forma de un plasmido, fago, transposon o cosmido.
En particular, se ha demostrado que el complemento total de genes de adenovirus no es necesario para las funciones auxiliares accesorias. En particular, se ha mostrado que los mutantes de adenovirus incapaces de replicar el ADN y la smtesis genetica tardfa permiten la replicacion de AAV. De forma analoga, se ha mostrado que los mutantes dentro de las regiones E2B y E3 apoyan la replicacion de AAV, lo que indica que las regiones E2B y E3 probablemente no estan implicadas en el suministro de funciones auxiliares. Sin embargo, los adenovirus defectuosos en la region E1, o que tienen una region E4 con delecion, no pueden apoyar la replicacion de AAV. Por lo tanto, es probable que las regiones E1A y E4 sean necesarias para la replicacion de AAV, ya sea directa o indirectamente. Otros mutantes de Ad caracterizados incluyen: E1B; E2A; E2B; E3; y E4. Aunque algunos estudios de las funciones auxiliares proporcionadas por adenovirus que tienen mutaciones en la region codificante de E1B han producido resultados contradictorios, recientemente se ha informado que E1B55k es necesario para la produccion de virion de AAV, mientras que E1B19k no lo es.
Los vectores de funcion auxiliar a modo de ejemplo incluyen una region codificante de ARN de VA de adenovirus, una region codificante de ORF6 de E4 de adenovirus, una region codificante de 72 kD de E2A de adenovirus, una region codificante de E1A de adenovirus, y una region que carece de E1B de adenovirus que carece de una region codificante de E1B55k intacta.
Por "capaz de apoyar la produccion de virion de rAAV eficaz" se hace referencia la capacidad de un vector o sistema de funcion accesorio para facilitar funciones accesorias que son suficientes para complementar la produccion de virion de rAAV en una celula hospedadora particular a un nivel sustancialmente equivalente o mayor que la que se podna obtener despues de la infeccion de la celula hospedadora con un virus auxiliar de adenovirus. Por lo tanto, la capacidad de un vector o sistema de funcion auxiliar para soportar la produccion eficaz de virion de rAAV se puede determinar comparando los tftulos de virion de rAAV obtenidos usando el vector o sistema auxiliar con tttulos obtenidos usando infeccion con un adenovirus infeccioso. Mas particularmente, un vector o sistema de funcion auxiliar soporta una produccion de virion rAAV eficaz sustancialmente equivalente a, o superior a, la obtenida usando un adenovirus infeccioso cuando la cantidad de viriones obtenida a partir de un numero equivalente de celulas hospedadoras no es mas que aproximadamente 200 veces inferior a la cantidad obtenida usando la infeccion por adenovirus, mas preferentemente no superior a aproximadamente 100 veces menos, y mas preferentemente igual a, o superior a, la cantidad obtenida usando la infeccion por adenovirus.
Por lo tanto, por "virion de AAV" se hace referencia a una partmula de vivos completa, tal como una partmula de virus de AAV de tipo silvestre (wt) (que comprende un genoma de acido nucleico de AAV lineal, de cadena sencilla asociado con un revestimiento de protema de capside de AAV). En este sentido, se pueden empaquetar moleculas de acido nucleico de AAV de cadena sencilla de cualquier sentido complementario, por ejemplo, cadenas "sentido" o "antisentido", en uno cualquiera de virion de AAV y ambas hebras son igualmente infecciosas.
De forma analoga, un "virion de AAV recombinante", o "virion de rAAV" se define en el presente documento, un virus infeccioso de replicacion defectuosa que incluye una envoltura proteica de AAV que encapsula una secuencia de nucleotidos heterologa de interes que esta flanqueada en ambos por las ITR de AAV. Se produce un virion de rAAV en una celula hospedadora adecuada que ha tenido un vector AAV, funciones auxiliares de AAV, y funciones auxiliares introducidas en el mismo. De esta manera, la celula hospedadora se hace capaz de codificar polipeptidos de AAV que son necesarios para el empaquetamiento del vector AAV (que contiene una secuencia de nucleotidos recombinante de interes) en partmulas de virion recombinantes infecciosas para posterior administracion genetica.
El sistema de AAV util en la invencion, tambien puede incluir una secuencia que codifica un marcador seleccionable. La expresion "marcador seleccionable" o "producto genetico seleccionable", como se usa en el presente documento, se refiere al uso de un gen que puede incluir, pero no se limita a: el gen de fosfotransferasa en la posicion 3' de
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aminoglucosido bacteriano (tambien denominado gen neo) que confiere resistencia al farmaco G418 en celulas de mairnfero; gen bacteriano de higromicina G fosfotransferasa (hyg) que confiere resistencia al antibiotico higromicina; y el gen bacteriano de xantina-guanina fosforribosil transferasa (tambien denominado gen gpt) que confiere la capacidad de crecer en presencia de acido micofenolico. Ademas, el sistema de AAV puede incluir secuencias que codifican un marcador visual detectable, por ejemplo, protema fluorescente de color verde (GFP) o cualquier otro marcador detectable convencional en la tecnica y pueden ser identificados y utilizados por un experto en la materia sin experimentacion indebida.
Los expertos en la materia han eludido algunas de las limitaciones de los vectores basados en adenovirus usando virus "tnbridos" de adenovirus, que incorporan caractensticas deseables de adenovirus asf como de otros tipos de virus como un medio para generar vectores unicos con propiedades altamente especializadas. Por ejemplo, se generaron quimeras de virus de vector entre adenovirus y virus adenoasociado (AAV). Estos aspectos de la invencion no se desvfan del alcance de la invencion que se describe en el presente documento.
Otro metodo para la administracion del polinucleotido para terapia genetica implica el uso de un vector de expresion de adenovirus. Como se usa en el presente documento, la expresion "vector de expresion de adenovirus" pretende incluir aquellas construcciones que contienen secuencias de adenovirus suficientes (a) para soportar el empaquetamiento de la construccion y/o (b) para expresar por ultimo un tejido y/o construccion espedfica de celula que se ha clonado en el mismo.
El vector de expresion puede comprender una forma geneticamente modificada de adenovirus. El conocimiento de la organizacion genetica del adenovirus, un virus de ADN de 36 kb, lineal, de doble cadena, permite la sustitucion de grandes fragmentos de ADN adenovmco con secuencias extranas de hasta 7 kb (Grunhaus y Horwitz, Seminar in Virology, 1992; 3: 237-252). A diferencia con el retrovirus, la infeccion adenovmca de celulas hospedadoras no da como resultado una integracion cromosomica porque el ADN adenovmco se puede replicar de una manera episomica sin genotoxicidad potencial. Ademas, los adenovirus son estructuralmente estables, y no se ha detectado ningun recolocacion del genoma despues de haber detectado una amplia amplificacion.
El crecimiento y manipulacion de adenovirus son conocidos por los expertos en la materia, y presenta una amplia gama de hospedadores in vitro e in vivo. Este grupo de virus se puede obtener en altos tftulos, por ejemplo, de, 109 a 1011 unidades formadoras de placa por ml, y son altamente infecciosos. El ciclo de vida del adenovirus no requiere integracion en el genoma de la celula hospedadora. Los genes extranos suministrados por los vectores de adenovirus son episomicos y, por lo tanto, tienen baja genotoxicidad para las celulas hospedadoras. No se han informado efectos secundarios en estudios de vacunacion con adenovirus de tipo silvestre, lo que demuestra su seguridad y/o potencial terapeutico como vectores de transferencia genetica in vivo.
Los vectores de adenovirus se han usado en expresion de genes eucarioticos y en el desarrollo de vacunas. Recientemente, algunos estudios en animales sugirieron que se podna usar adenovirus recombinante para terapia genetica (vease, por ejemplo, Stratford-Perricaudet et al., Hum. Gene. Ther., 1991; 1: 242-256; Rich et al., 1993). Los estudios en administracion de adenovirus recombinante a diferentes tejidos incluyen inyeccion muscular, inyecciones intravenosas perifericas e inoculacion estereotactica en el cerebro. El adenovirus recombinante y el virus adeno-asociado pueden tanto infectar como transducir celulas primarias humanas que no estan en division.
Aunque el uso de vectores de adenovirus se contempla, tal uso en ensayos de terapia genetica en la actualidad esta limitado por la expresion transgenica de corta duracion. (Vassalli G, et al., Int. J. Cardiol., 2003; 90 (2-3): 229-38). Esto se debe a la inmunidad celular contra antfgenos adenovmcos. Los vectores adenovmcos "cobardes" mejorados tienen una reduccion de la inmunogenicidad, pero siguen siendo ineficaces si se necesita una expresion maxima del transgen durante mas de seis meses o se desean efectos terapeuticos (Gilbert R, et al., Hum. Mol. Genet., 2003; 12 (11): 1287-99). Los vectores AAV han demostrado una expresion a largo plazo (> 1 ano) y son el vector precedente para efectos terapeuticos en los que se necesita una expresion a largo plazo (Daly TM, et al., Gene Ther., 2001; 8 (17): 1291-8).
Vectores Retrov^ricos
Los retrovirus se pueden elegir como vectores de administracion de genes debido a su capacidad para integrar sus genes en el genoma hospedador, transferir una gran cantidad de material genetico extrano, infectar un amplio espectro de especies y tipos celulares y para su empaquetamiento en lmeas celulares especiales.
El genoma retrovmco contiene tres genes, gag, pol y env que codifican las protemas de la capside, enzima polimerasa y componentes de la envoltura, respectivamente. Una secuencia encontrada cadena arriba del gen gag contiene una senal para el empaquetamiento del genoma en viriones. Dos secuencias de repeticion terminal largas (LTR) estan presentes en los extremos en las posiciones 5' y 3' del genoma vmco. Estas contienen secuencias promotoras y potenciadoras fuertes y tambien son necesarias para la integracion en el genoma de la celula hospedadora.
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Para construir un vector retrovmco, un acido nucleico que codifica un gen de interes se inserta en el genoma vmco en lugar de ciertas secuencias vmcas para producir un virus que tiene una replicacion defectuosa. Con el fin de producir viriones, se construye una lmea celular de empaquetamiento que contiene los genes gag, pol, y/o env pero sin los componentes de de LTR y/o empaquetamiento. Cuando se introduce un plasmido recombinante que contiene un ADNc, junto con la LTR retrovmca y las secuencias de empaquetamiento en esta lmea celular (mediante precipitacion con fosfato calcico por ejemplo), la secuencia de empaquetamiento permite que la transcripcion de ARN del plasmido recombinante se empaquete en partmulas vmcas, que a continuacion se secretan en el medio de cultivo. A continuacion, el medio que contiene los retrovirus recombinantes se recoge, se concentra opcionalmente y se usa para transferencia genetica. Los vectores retrovmcos son capaces de infectar una amplia diversidad de tipos celulares. Sin embargo, la integracion y la expresion estable requieren la division de las celulas hospedadoras.
Virus del Herpes
Dado que el virus del herpes simple (VHS) es neurotropico, se ha generado un interes considerable en el tratamiento de los trastornos del sistema nervioso. Ademas, la capacidad del VHS para establecer infecciones latentes en celulas neuronales que no se dividen sin integrarse en el cromosoma de la celula hospedadora o alterando de otro modo el metabolismo de la celula hospedadora, con la existencia de un promotor que es activo durante la latencia hace que el VHS sea un vector atractivo. Y aunque se ha centrado mucha atencion en las aplicaciones neurotropicas del VHS, este vector tambien se puede aprovechar para otros tejidos dada su amplia gama de hospedadores.
Otro factor que hace que el VHS sea un vector atractivo es el tamano y organizacion del genoma. Dado que el VHS es grande, la incorporacion de multiples genes o casetes de expresion es menos problematica que en otros sistemas vmcos mas pequenos. Ademas, la disponibilidad de diferentes secuencias de control vmco con un rendimiento variable (temporal, resistencia, etc.) hace posible controlar la expresion en mayor medida que en otros sistemas. Tambien es una ventaja que el virus tenga relativamente pocos mensajes de corte y empalme, lo que facilita aun mas las manipulaciones geneticas.
El VHS tambien es relativamente facil de manipular y puede crecer hasta tftulos elevados. Por lo tanto, la administracion es menos que un problema, tanto en terminos de volumenes necesarios para alcanzar una multiplicidad de infeccion (MOI) suficiente y con una necesidad menor de repetir la dosificacion. Para una revision del VHS como vector para terapia genetica, vease Glorioso et al., Annu. Rev. Microbiol., 1995; 49: 675-710. Se han desarrollado variantes avirulentas del VHS y estan disponibles facilmente para su uso en contextos de terapia genetica (documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.672.344).
Vectores LentMricos
Los lentivirus son retrovirus complejos que, ademas de los genes retrovmcos comunes gag, pol y env, contienen otros genes con funcion reguladora o estructural. La mayor complejidad permite que el virus modifique su ciclo de vida, como ocurre en el curso de la infeccion latente. Algunos ejemplos de lentivirus incluyen los Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH 1, VIH 2) y el Virus de la Inmunodeficiencia del Simio (SIV). Se han generado vectores lentivmcos por atenuacion multiple de los genes de virulencia del VIH, por ejemplo, los genes env, vif, vpr, vpu y nef sufren delecion haciendo que el vector sea biologicamente seguro.
Los vectores lentivmcos se conocen en la tecnica, veanse, por ejemplo, los documentos de Patente de Estados Unidos N.° 6.013.516 y 5.994.136. En general, los vectores estan basados en plasmidos o basados en virus, y se configuran para portar las secuencias esenciales para incorporar acido nucleico extrano, para seleccion y para transferencia del acido nucleico en una celula hospedadora. Los genes gag, pol y env de los vectores de interes tambien se conocen en la tecnica. Por lo tanto, los genes relevantes se clonan en el vector seleccionado y a continuacion se usan para transformar la celula diana de interes.
El lentitivirus recombinante capaz de infectar una celula que no esta en division en el que una celula hospedadora adecuada se transfecta con dos o mas vectores que portan las funciones de empaquetamiento, es decir, gag, pol y env, asf como rev y tat se describen en el documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.994.136. Este describe un primer vector que puede proporcionar un acido nucleico que codifica un gag vmco y un gen pol y otro vector que puede proporcionar un acido nucleico que codifica un env vmco para producir una celula de empaquetamiento. La introduccion de un vector que proporciona un gen heterologo en esa celula de empaquetamiento proporciona una celula productora que libera partmulas vmcas infecciosas que portan el gen extrano de interes. El env es preferentemente una protema de envoltura anfotropica que permite la transduccion de celulas de especies humanas y de otras especies.
Vectores de Virus Vaccinia
Los vectores de virus vaccinia se han usado ampliamente debido a la facilidad de su construccion, niveles relativamente altos de expresion obtenidos, amplia gama de osciladores y gran capacidad para portar el ADN. Vaccinia contiene un gen de ADN de doble helice de aproximadamente 186 kb que presenta una preferencia notable
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de "A-T". El extremo terminal invertido reproduce aproximadamente el flanco de 10,5 kb del genoma. Parece que la mayona de los genes esenciales forman un mapa dentro de la region central, que esta mas altamente conservada entre los virus de la viruela. Un calculo de los marcos de lectura abiertos en el virus vaccinia da un numero de 150 a 200. Aunque ambas cadenas son codificante es, la amplia superposicion de marcos de lectura no es comun.
Al menos 25 kb se pueden insertar en el genoma del virus vaccinia. Los vectores de vaccinia prototipicos contienen transgenes insertados en el gen de la timidina quinasa vmca mediante recombinacion homologa. Los vectores se seleccionan sobre la base de un fenotipo tk. La inclusion de la secuencia lfder no traducida del virus de la encefalomiocarditis da como resultado un nivel de expresion que es mayor que el de los vectores convencionales, con los transgenes acumulandose en un 10 % o mas de la protema de la celula infectada en 24 h.
Vectores de Virus de Polioma
Las capsides vacfas de papovavirus, tales como el virus del polioma de raton, han recibido atencion como posibles vectores para transferencia genetica. El uso de polioma vacfo se describio por primera vez cuando el ADN de polioma y capsides vacfas purificadas se incubaron en un sistema libre de celulas. El ADN de la nueva partfcula se protegio de la accion de la DNasa pancreatica. Las partmulas reconstituidas se usaron para transferir un fragmento de ADN de polioma transformante a celulas FIII de rata. Las capsides vacfas y las partfculas reconstituidas consisten en los tres antfgenos de la capside de polioma, VP1, VP2 y VP3. El documento de Patente de Estados Unidos N.° 6.046.173, desvela el uso de una pseudocapside formada a partir del antfgeno de la capside principal de papovavirus y excluyendo antfgenos menores de la capside, que incorpora material exogeno para transferencia genetica.
Otros Vectores Vmcos
Otros vectores vmcos se pueden emplear como construcciones de expresion tales como vectores obtenidos a partir de virus tales como virus sindbis o citomegalovirus. Estos ofrecen caractensticas atractivas para diversas celulas de mairnfero (vease, por ejemplo, Friedmann, Science, 1989; 244: 1275-1281; Horwich et al., J. Virol., 1990; 64: 642650).
Con el reconocimiento de los virus defectuosos de la hepatitis B, se obtuvo una nueva vision de la relacion estructura-funcion de diferentes secuencias vmcas. Los estudios in vitro demostraron que el virus podfa conservar la capacidad de empaquetamiento dependiente de auxiliar y transcripcion inversa a pesar de la delecion de hasta un 80 % de su genoma (Horwich et al., J. Virol. 64: 642-650 (1990)). Esto sugena que grandes porciones del genoma se podnan sustituir con material genetico extrano. Chang et al., introdujeron el gen de la cloramfenicol acetiltransferasa (CAT) en el genoma del virus de la hepatitis R de pato en el lugar de las secuencias codificantes de polimerasa, superficie y/o presuperficie. Se cotransfecto con el virus de tipo silvestre en una lmea de celulas de hepatoma aviar. Se usaron medios de cultivo que conteman tttulos altos del virus recombinante para infectar hepatocitos de patito primario. La expresion del gen de CAT estable se detecto durante al menos 24 dfas despues de la transfeccion (Chang et al., Hepatology 14: 134A (1991)).
Virus Modificados
Los acidos nucleicos a suministrar se pueden alojar dentro de un virus infeccioso que se ha modificado por ingeniena para expresar un ligando de union espedfico. La partfcula del virus se unira de ese modo de forma espedfica a los receptores afines de la celula diana y suministrara los contenidos a la celula. Un nuevo enfoque disenado para permitir el direccionamiento espedfico de vectores de retrovirus se desarrollo basandose en la modificacion qmmica de un retrovirus mediante la adicion qmmica de restos de lactosa a la envoltura vmca. Esta modificacion puede permitir la infeccion espedfica de hepatocitos a traves de receptores de sialoglicoprotema.
Se diseno otro enfoque para dirigir retrovirus recombinantes en el que se usaron anticuerpos biotinilados contra una protema de la envoltura retrovmca o contra un receptor celular espedfico. Los anticuerpos se acoplaron a traves de los componentes de biotina usando estreptavidina. Usando anticuerpos contra antfgenos del complejo de histocompatibilidad principal de clase I y/o de clase II, estos demostraron la infeccion de una diversidad de celulas humanas que portaban esos antfgenos de superficie con un virus ecotropico in vitro.
Transferencia no v^rica
En el presente documento se desvelan varios metodos no vmcos para la transferencia de construcciones de expresion en celulas de mai^ero cultivadas. Los metodos adecuados para la administracion de acidos nucleicos incluyen metodos como se describe en el presente documento o como podna conocer una persona con una experiencia habitual. Los metodos de este tipo incluyen, pero no se limitan a, administracion directa de plasmido de aDn "desnudo" a traves de la vasculatura (documento de Patente de Estados Unidos N.° 6.867.196); mediante transfeccion mediada por liposomas (Nicolau y Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991) y transfeccion mediada por receptor (Wu y Wu, 1987; Wu y Wu, 1988); mediante agitacion con fibras de carburo de silicio (Kaeppler et al., 1990; documentos de Patente de Estados Unidos
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N.° 5.302.523 y 5.464.765); uso de Kpidos cationicos; ADN desnudo; o mediante ADN microencapsulado (Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2005/0037085). Mediante la aplicacion de tecnicas de este tipo, las celulas o tejido diana se pueden transformar de forma estable o transitoria.
Una vez que la construccion se ha suministrado en la celula, el acido nucleico que codifica el gen terapeutico se puede colocar y expresar en diferentes sitios. El acido nucleico que codifica el gen terapeutico se puede integrar de forma estable en el genoma de la celula. Esta integracion se puede producir en la posicion y orientacion similares a traves de recombinacion homologa (reemplazo genetico) o se puede integrar en una posicion aleatoria, no espedfica (aumento genetico). El acido nucleico se preve mantener de forma estable en la celula como un segmento de ADN episomico, separado. Tales segmentos de acido nucleico o "episomas" codifican secuencias suficientes para permitir el mantenimiento y la replicacion independiente o en sincronizacion con el ciclo de la celula hospedadora. Como se administra la construccion de expresion a una celula y en que sitio de la celula permanece el acido nucleico depende del tipo de construccion de expresion empleada.
La construccion de expresion puede estar atrapada en un liposoma. Los liposomas son estructuras vesiculares caracterizadas por una membrana de bicapa fosfolipfdica y un medio acuoso interno. Los liposomas multilamelares tienen multiples capas lipfdicas separadas por medio acuoso. Se forman de manera espontanea cuando los fosfolfpidos se suspenden en un exceso de solucion acuosa. Los componentes lipfdicos se someten a autorreordenamiento antes de la formacion de estructuras cerradas y atrapan agua y solutos disueltos entre las bicapas lipfdicas. La adicion de ADN a liposomas cationicos provoca una transicion topologica de liposomas a globulos condensados de cristalino lfquido opticamente birrefringentes. Estos complejos de ADN-lfpido son vectores no vmcos potenciales para uso en terapia genetica.
La administracion de acido nucleico mediada por liposomas y la expresion de ADN extrano in vitro ha sido muy satisfactoria. Usando el gen de p-lactamasa, los investigadores demostraron la viabilidad de la administracion mediada por liposomas y la expresion de ADN extrano en celulas de embrion de pollo cultivadas, HeLa y celulas de hepatoma. Tambien se ha logrado una transferencia genetica de liposomas con exito en ratas despues de inyeccion intravenosa. Tambien se incluyen diversos enfoques comerciales relacionados con la tecnologfa de "lipofeccion".
El liposoma puede formar complejo con un virus hemaglutinante (HVJ). Se ha demostrado que esto facilita la fusion con la membrana celular y estimular la entrada de celulas de ADN encapsulado en liposomas. El liposoma puede formar complejo o se puede usar en conjunto con protemas cromosomicas nucleares no histonas (HMG-1). El liposoma puede formar complejo o se puede usar en conjunto tanto con HVJ como con HMG-I. Para esto se han usado las construcciones de expresion de este tipo de forma satisfactoria en transferencia y expresion de acido nucleico in vitro e in vivo, por lo tanto se pueden aplicar para la presente invencion.
Otros sistemas de administracion de vectores que se pueden emplear para suministrar un acido nucleico que codifica un gen terapeutico en celulas son vehmulos de administracion mediados por receptor. Estos aprovechan de la absorcion selectiva de macromoleculas por endocitosis mediada por receptor en casi todas las celulas eucariotas. Debido a la distribucion espedfica del tipo de celula de diversos receptores, la administracion puede ser altamente espedfica (Wu y Wu, 1993). Cuando se emplean liposomas, se pueden usar otras protemas que se unen a una protema de membrana de superficie celular asociada con endocitosis para dirigir y/o para facilitar la absorcion, por ejemplo, protemas de la capside o fragmentos de la misma para un tipo de celula en particular, anticuerpos para protemas que experimentan internalizacion en el ciclado y protemas que se dirigen a la localizacion intracelular y aumentan la semivida intracelular.
Los vehmulos de direccionamiento genetico mediados por receptores por lo general estan formados por dos componentes: un ligando espedfico de receptor celular y un agente de union a ADN. Para transferencia genetica mediada por receptores se han usado varios ligandos. Los ligandos mas ampliamente caracterizados son asialoorosomucoide (ASOR) y transferencia (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (9): 3410-14 (1990)). Como vehmulo de administracion genetica se ha usado una neoglicoprotema sintetica, que reconoce el mismo receptor que ASOR. El factor de crecimiento epidermico (EGF) tambien se ha usado para administrar genes a celulas de carcinoma escamoso.
En otras realizaciones, el vehmulo de administracion puede comprender un ligando y un liposoma. Por ejemplo, los investigadores han empleado lactosil-ceramida, un asialgangliosido galactosa-terminal, incorporado en liposomas y ha observado un aumento de la absorcion del gen de la insulina por los hepatocitos. Por lo tanto, es factible que un acido nucleico que codifica un gen terapeutico tambien se pueda suministrar de forma espedfica en un tipo de celula tal como celulas cardiacas, mediante cualquier numero de sistemas de receptor-ligando con o sin liposomas.
La construccion de expresion puede consistir simplemente en ADN o plasmidos recombinantes desnudos. La transferencia de la construccion se puede realizar mediante cualquiera de los metodos mencionados anteriormente que permeabilizan ffsica o qmmicamente la membrana celular. Esto se puede aplicar en particular para transferencia in vitro, sin embargo, tambien se puede aplicar para uso in vivo. Se preve que el ADN terapeutico tambien se pueda transferir de una manera similar in vivo. Wolff et al., (documento de Patente de Estados Unidos N.° 6.867.196) ensenan que la transferencia genetica eficaz en el tejido cardiaco se puede obtener mediante inyeccion de
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soluciones de ADN plasirndico en una vena o arteria del corazon. Wolff tambien ensena la administracion de ARN, ADN no plasirndico y vectores vmcos.
Los vectores utiles en la presente invencion tienen diferentes eficiencias de transduccion. Como resultado, el vector de expresion de AAV transduce mas de, igual a, o al menos aproximadamente un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 %, un 100 % de las celulas del territorio vascular al que se dirige. Se puede usar mas de un vector de expresion de AAV de forma simultanea, en forma secuencial. Esto se puede usar para transferir mas de un polinucleotido, y/o diana a mas de un tipo de celula. Cuando se usan multiples vectores o multiples agentes, se puede obtener mas de una transduccion/transfeccion.
En la presente invencion se incluyen diversas secuencias de acidos nucleicos. Como se usa en el presente documento, secuencia de "acido nucleico" o equivalentes de la misma se refiere a una secuencia de ADN o ARN. La expresion capta secuencias que incluyen cualquiera de los analogos conocidos de base de ADN y ARN tales como, pero no limitados a, 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5- (carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-fluorouracilo 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetil- aminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1- metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metil-guanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7- metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiamino-metil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'- metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ester de metilo del acido uracil-5- oxiacetico, acido uracil-5-oxiacetico, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2- tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, ester de metilo del acido -uracil-5-oxiacetico, acido uracil-5-oxiacetico, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, y 2,6-diaminopurina.
Otras secuencias de acidos nucleicos incluyen "secuencias de control", que se denominan de forma colectiva secuencias promotoras, senales de poliadenilacion, secuencias de terminacion de la transcripcion, dominios reguladores cadena arriba, ongenes de replicacion, sitios internos de entrada de ribosomas (IRES), potenciadores y similares, que de forma colectiva proporcionan la replicacion, transcripcion y traduccion de una secuencia codificante en una celula receptora. No es necesario que todas estas secuencias de control esten siempre presentes siempre y cuando la secuencia de codificacion seleccionada sea capaz de ser replicada, transcrita y traducida en una celula hospedadora apropiada.
Otra secuencia de acidos nucleicos es una secuencia "promotora" que se usa en el presente documento en su sentido habitual para hacer referencia a una region del nucleotido que comprende una secuencia reguladora de ADN, en la que la secuencia reguladora se obtiene a partir de un gen que es capaz de unirse a la ARN polimerasa y de iniciar la transcripcion de una secuencia codificante cadena abajo (direccion en la posicion 3'). Los promotores de transcripcion pueden incluir "promotores inducibles" (en los que la expresion de una secuencia de polinucleotidos relaciona de forma operativa con el promotor esta inducida por un analito, cofactor, protema reguladora, etc.), "promotores reprimibles" (en los que la expresion de una secuencia de polinucleotidos relaciona de forma operativa con el promotor esta inducida por un analito, cofactor, protema reguladora, etc.), y "promotores constitutivos".
Los acidos nucleicos incorporados en la presente invencion pueden estar "unidos de forma operativa" entre sf o unidos a una protema o peptido. Como se usa en el presente documento, "unido de forma operativa" se refiere a una disposicion de elementos en la que los componentes descritos de ese modo se configuran de manera que puedan realizar su funcion habitual. Por lo tanto, las secuencias de control unidas de forma operativa a una secuencia codificante son capaces de efectuar la expresion de la secuencia codificante. No es necesario que las secuencias de control sean contiguas a la secuencia codificante, siempre y cuando funcionen para dirigir su expresion. Por lo tanto, por ejemplo, las secuencias intermedias no traducidas aunque transcritas pueden estar presentes entre una secuencia promotora y la secuencia codificante y aun se puede considerar que la secuencia promotora esta "unida de forma operativa" a la secuencia codificante.
"Sinergico" o tener "sinergia" se refiere a una actividad de administrar combinaciones de protemas, lfpidos, acidos nucleicos, carbohidratos, o compuestos qmmicos que es superior a la actividad aditiva de las protemas, lfpidos, acidos nucleicos, carbohidratos o compuestos qmmicos si se administran de forma individual.
Las realizaciones de la presente invencion se pueden "coadministrar", lo que se refiere a dos o mas protemas, lfpidos, acidos nucleicos, carbohidratos, o compuestos qmmicos de una combinacion que se administran de manera que los efectos terapeuticos o profilacticos de la combinacion son superiores al efecto terapeutico de cualquiera de las protemas, lfpidos, acidos nucleicos, carbohidratos, o compuestos qmmicos administrados solos. Las dos o mas protemas, lfpidos, acidos nucleicos, carbohidratos, o compuestos qmmicos se pueden administrar de forma simultanea o de forma secuencial. Las protemas, lfpidos, acidos nucleicos, carbohidratos o compuestos qmmicos coadministrados de forma simultanea se pueden proporcionar en una o mas composiciones farmaceuticamente aceptables. La coadministracion secuencial incluye, pero no se limita a, casos en los que las protemas, lfpidos, acidos nucleicos, carbohidratos, o compuestos qmmicos se administran de un modo tal que cada protema, lfpido, acido nucleico, carbohidrato, o compuesto qmmico pueda estar presente en el sitio de tratamiento al mismo tiempo.
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Otro aspecto de la presente invencion administra un "adyuvante" o equivalentes del mismo, lo que se refiere a un compuesto o mezcla que mejora la respuesta inmunologica a un antigeno. Un adyuvante puede servir como un deposito de tejido que libera el antigeno lentamente y tambien como un activador del sistema linfoide que no aumenta la respuesta inmune de forma espedfica. A menudo, una estimulacion primaria solamente con un antigeno, en ausencia de un adyuvante, no conseguira obtener una respuesta inmunologica humoral o celular. Los adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, adyuvante de Freund completo, adyuvante de Freund incompleto, saponina, geles minerales tales como hidroxido de aluminio, sustancias activas superficiales tales como lisolecitina, polioles pluronicos, polianiones, peptidos, emulsiones de aceite o hidrocarburo, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente utiles tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Preferentemente, el adyuvante es farmaceuticamente aceptable.
En un aspecto relacionado, la expresion "adyuvante molecular" se define como una protema, lfpido, acido nucleico, carbohidrato, o compuesto qmmico para el que las celulas dendnticas (DC), macrofagos, linfocitos B, linfocitos T, y/o linfocitos NK tienen un receptor conocido cuya ocupacion conduce a una secuencia definida de transduccion de de senales intracelulares y un cambio en el fenotipo dando como resultado una mejora en la cantidad o calidad de la respuesta inmunologica resultante. En un aspecto relacionado, las celulas, como se ha descrito anteriormente, de forma colectiva se denominan "celulas inmunes".
Los polinucleotidos que se describen en el presente documento codifican un "polipeptido", por ejemplo, SERCA2 o isomeros del mismo. "Polipeptido" se usa en su sentido convencional, es decir, como una secuencia de aminoacidos. Los polipeptidos no estan limitados a una longitud espedfica del producto; por lo tanto, los peptidos, oligopeptidos y protemas estan incluidos dentro de la definicion de polipeptido, y dichos terminos se pueden usar indistintamente en el presente documento a menos que se indique lo contrario de forma espedfica. Este termino tampoco hace referencia o excluye modificaciones posteriores a la expresion del polipeptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares, asf como otras modificaciones conocidas en la tecnica, tanto de origen natural como de origen no natural. Un polipeptido puede ser una protema completa, o una subsecuencia de la misma. Los polipeptidos de interes en particular en el contexto de la presente invencion son subsecuencias de aminoacidos que comprenden epftopos, es decir, determinantes antigenicos sustancialmente responsables de las propiedades inmunogenicas de un polipeptido y que son capaces de evocar una respuesta inmunologica.
Por consiguiente, la presente invencion utiliza polinucleotidos que codifican un polipeptido denominado isoforma 2a de Ca2+-ATPasa del Retmulo Sarco/Endoplasmatico (SERCA2a). SERCA reside en el retmulo sarcoplasmatico (SR) dentro de las celulas musculares. Se informa que la vasoconstriccion (por ejemplo, celulas del musculo liso vascular o VSMC) depende de la movilizacion de Ca2+ desde los almacenes intracelulares del SR. SERCA es una Ca2+ ATPasa que transfiere Ca2+ desde el citosol de la celula hasta el lumen del retmulo sarcoplasmatico (SR) a expensas de la hidrolisis del ATP. Las protemas SERCA estan codificadas por tres genes (SERCA 1, 2 y 3) situados en cromosomas separados. Las transcripciones de SERCA se expresan y como alternativa se cortan y empalman de una manera dependiente del tejido. Las especies de ARNm resultantes codifican diferentes isoformas de protema SERCA y difieren en las regiones sin traducir en la posicion 3' (UTR). Las isoformas de la protema SERCA se diferencian en su afinidad por their Ca2+, resistencia al estres oxidativo y modulacion por sarcolipin, sarcolipina fosfolambano (PLB/PLN), y Ca2+/calmodulina quinasa II.
En una realizacion, los polipeptidos se definen por dominios estructurales. Por ejemplo, el dominio de senalizacion, que esta asociado con la transduccion despues de la union del receptor y se encuentra en el compartimento citoplasmatico de las celulas, se define como una region de una molecula de protema delimitada basandose en la funcion y esta relacionado con un sustrato citoplasmico de un receptor.
En otro aspecto, la presente invencion usa variantes de las composiciones polipeptfdicas que se describen en el presente documento. Las variantes de polipeptidos incluidas generalmente en la presente invencion presentaran de forma habitual una identidad de al menos aproximadamente un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o un 99 % o superior, a lo largo de su longitud, con respecto a una secuencia polipeptfdica establecida en el presente documento.
Los polipeptidos SERCA2, incluyen pero no se limitan a, secuencias de GenBank humanas tales como AAB29701 (Wuytack et al., J Biol Chem (1994) 269 (2): 1410-1416); NP_733765 (Lytton y MacLennan, J Biol Chem (1988) 263 (29): 15023-15031); NP_001672 (Otsu et al., Genomics (1993) 17 (2): 507-509); AAH35588 (Strausberg et al., Proc Natl Acad Sci USA (2002) 99 (26): 16899-16903); y secuencias de GenBank de raton incluyendo AAD01889 (vease Heyen et al., Mamm Genome (2000) 11 (2): 159-163); NP_033852 (Hsu et al., Biochem Biophys Res Comm (1993) 197 (3): 1483-1491); CAB41018 (vease Heyen et al., Mamm Genome (2000) 11 (2): 159-163); CAB41017 (Id.); CAB72436 (Id.); CAA11450 (Id.); AAH54531 (Strasberg et al., Proc Natl Acad Sci USA (2002) 99 (26): 1689916903); AAH54748 (Id.); y otras especies incluyendo NP_957259 (Ebert et al., Proc Natl Acad Sci USA (2005) 102 (49): 17705-17710); aBg90496 (Wu et al., Silurus lanzhouensis SERCA2, presentacion directa (23 de junio de 2006), Departamento de Qmmica Aplicada, College of Science, China Agricultural University, N.° 2, Yuanmigyuan West Road, Haidian, Beijing, 100094, China); NP_001025448 (Sehra H., Danio rerio SERCA2, presentacion directa (7-AUG-2005), Welcome Trust Sanger Institute, Hixton, Cambridgeshire, CB10 1SA, UK); NP_001009216 (Gambel
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et al., Biochem Biophys Acta (1992) 1131 (2): 203-206); NP_999030 (Eggermont et al., Biochem J (1989) 260 (3): 757-761); NP_058986 (Gunteski-Hamblin et al., J Biol Chem (1988) 263 (29): 15032-15040); CAA37784 (Eggermont et al., Biochem J (1989) 260 (3): 757-761); y CAA37783 (Id.). Todas las secuencias mencionadas anteriormente estan disponibles al publico.
En otras realizaciones ilustrativas, un polipeptido SERCA2 puede ser un polipeptido de fusion que comprende multiples polipeptidos SERCA2 como se describe en el presente documento, o que comprende al menos un polipeptido SERCA2 como se describe en el presente documento y una secuencia no relacionada, tal como una protema vftica conocida. Un companero de fusion puede, por ejemplo, ayudar a proporcionar epftopos (un companero de fusion inmunologico), preferentemente epftopos reconocidos por seres humanos, o puede ayudar a expresar la protema (un potenciador de expresion) con mayores rendimientos que la protema recombinante nativa. Ciertos socios de fusion mejoran la formacion de multimeros.
Los polipeptidos de fusion por lo general se pueden preparar usando tecnicas convencionales, incluyendo la conjugacion qmmica. Preferentemente, un polipeptido de fusion SERCA2 se expresa como un polipeptido recombinante, permitiendo la produccion de niveles aumentados de SERCA2, en relacion con un polipeptido no fusionado, en un sistema de expresion. En resumen, las secuencias de ADN que codifican los componentes polipeptfdicos se pueden ensamblar por separado, y se pueden ligar en un vector de expresion apropiado. El extremo en la posicion 3' de la secuencia de ADN que codifica un componente polipeptfdico se liga, con o sin un conector peptfdico, al extremo en la posicion 5' de una secuencia de ADN que codifica el segundo componente polipeptfdico de modo que los marcos de lectura de las secuencias esten en fase. Esto permite la traduccion en un unico polipeptido de fusion que retiene la actividad biologica de ambos polipeptidos componentes.
La presente invencion tambien incluye "peptido" o "porcion de peptido" o "fragmento" o "fragmento de peptido" y equivalentes de los mismos, que se usan ampliamente en el presente documento para hacer referencia a dos o mas aminoacidos unidos por un enlace peptfdico. La expresion "fragmento proteolftico" tambien se usa en el presente documento para hacer referencia a un producto que se puede producir mediante una reaccion proteolftica sobre un polipeptido, es decir, un peptido producido por escision de un enlace peptfdico en el polipeptido. Aunque la expresion "fragmento proteolftico" por lo general se usa en el presente documento para hacer referencia a un peptido que se puede producir mediante una reaccion proteolftica, se debena reconocer que no es necesario que el fragmento se produzca mediante por una reaccion proteolftica, sino que tambien se puede producir usando metodos de smtesis qmmica o metodos de tecnologfa de ADN recombinante, como se discute con mayor detalle a continuacion, para producir un peptido sintetico que es equivalente a un fragmento proteolftico.
Ademas, la expresion "fragmento funcional" o "porcion funcional" o equivalentes de las mismas se refiere a que el fragmento o peptido de SERCA2 tiene actividad funcional de SERCA2, por ejemplo, un fragmento funcional o fragmento proteolftico funcional de SERCA2 o SERCA2a tiene una actividad funcional de SERCA2 o SERCA2a.
Por lo general, un peptido contiene al menos aproximadamente seis aminoacidos, normalmente contiene unos diez aminoacidos y puede contener quince o mas aminoacidos, en particular veinte o mas aminoacidos. Se debena reconocer que el termino "peptido" no se utiliza en el presente documento para sugerir un tamano o numero de aminoacidos en particular que comprende la molecula, y que un peptido de la invencion puede contener hasta varios restos de aminoacidos o mas.
Ademas, como se usa en el presente documento, el "producto de traduccion" o "polipeptido" se refiere a peptidos, polipeptidos, oligopeptidos y protemas o fragmentos de protemas que tienen un efecto biologico deseado in vivo o in vitro. Como se usa en el presente documento, el termino "fragmento" se refiere a una molecula o cualquier subconjunto de peptidos de la molecula; mientras que una "variante" de una molecula de ese tipo se refiere a una molecula natural (por ejemplo, isoforma tal como SERCA2a) sustancialmente similar a la molecula entera, o a un fragmento de la misma. Por el contrario, un "analogo" de una molecula se refiere a una molecula no natural sustancialmente similar a la molecula entera o a un fragmento de la misma. Todos estos se contemplan en el presente documento siempre y cuando la administracion in vivo de la composicion terapeutica que contiene el polipeptido SERCA2, fragmento, o variante a un sujeto que padece de hipertension pulmonar mejore o trate de forma eficaz al sujeto con necesidad del mismo.
Una secuencia de conector peptfdico se puede usar para separar el primer y segundo componentes polipeptfdicos con una distancia suficiente para asegurar que cada polipeptido se pliegue en sus estructuras secundarias y terciarias. Una secuencia de conector peptfdico de este tipo se incorpora en el polipeptido de fusion usando tecnicas convencionales bien conocidas en la tecnica. Las secuencias de conector peptfdico adecuadas se pueden elegir basandose en los siguientes factores: (1) su capacidad para adoptar una conformacion extendida flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que pudiera interactuar con epftopos funcionales sobre el primer y el segundo polipeptidos; y (3) la falta de restos hidrofobos o cargados que pudieran reaccionar con los epftopos funcionales de polipeptido. Las secuencias de conector peptfdico preferentes contienen restos de Gly, Asn, y Ser. Otros aminoacidos casi neutros, tales como Thr y Ala tambien se pueden usar en la secuencia conectora. Por lo general, en la tecnica se conocen algunas secuencias de aminoacidos que se pueden usar de forma util. La secuencia conectora por lo general puede tener una longitud de 1 a aproximadamente 50 aminoacidos. Las
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secuencias colectoras no son necesarias cuando el primer y el segundo polipeptidos tienen regiones de aminoacidos N-terminales no esenciales que se pueden usar para separar los dominios funcionales y prevenir la interferencia esterica.
Las secuencias de ADN ligadas estan unidas de forma operativa a elementos reguladores de la transcripcion de la traduccion adecuados. Los elementos reguladores responsables de la expresion del ADN estan situados solo en la posicion 5' de la secuencia de ADN que codifica los primeros polipeptidos. De forma analoga, los codones de parada requeridos para terminar la traduccion y las senales de terminacion de la transcripcion solo estan presentes en la secuencia de ADN que codifica el polipeptido secundario, terciario, cuaternario, etc., (es decir, un codon de parada estara presente en el polipeptido final dependiendo del numero de polipeptidos distintos que componen una molecula de protema quimerica).
Ademas de los polipeptidos SERCA2, la presente divulgacion proporciona composiciones de polinucleotidos que contienen SERCA2 y SERCA2. Los terminos "ADN" y "polinucleotido" se usan indistintamente en el presente documento para hacer referencia a una molecula de ADN que se ha aislado libre de ADN genomico total de una especie en particular. "Aislado", como se usa en el presente documento, se refiere al que un polinucleotido esta sustancialmente alejado de otras secuencias codificantes, y que la molecula de ADN no contiene grandes porciones de ADN codificante no relacionado, tales como grandes fragmentos cromosomicos u otros genes funcionales o polipeptido codificante es de polipeptidos. Por supuesto, esto se refiere a la molecula de ADN tal como se afsla originalmente, y no excluye genes o regiones codificantes anadidos posteriormente al segmento por la mano del hombre.
La expresion "gen de SERCA2" o "transgen de SERCA2" u otros isomeros de SERCA de los mismos, se refiere a un ADN o ARN y puede incluir hebras sentido y antisentido segun sea apropiado para los objetivos de la terapia practicada de acuerdo con la invencion. Ademas, como se usa en el presente documento, "polinucleotido" se refiere a un polfmero de desoxiribonucleotidos o ribonucleotidos, en forma de un fragmento separado o como un componente de una construccion mas grande. Los polinucleotidos de la invencion incluyen derivados funcionales de polinucleotidos conocidos que codifican de forma operativa la protema SERCA2a.
La secuencia de polinucleotidos se puede deducir a partir del codigo genetico, sin embargo, la degeneracion del codigo se debe tener en cuenta. Los polinucleotidos utiles en la invencion incluyen secuencias que se degeneran como resultado del codigo genetico, secuencias que los expertos en la materia pueden determinar facilmente.
Ademas, el termino "heterologo" dado que se refiere a secuencias de acidos nucleicos tales como secuencias codificantes y secuencias de control, representa secuencias normalmente no se unen entre sf y/o normalmente no se asocian con una celula en particular. Por lo tanto, una region "heterologa" de una construccion de acido nucleico o un vector es un segmento de acido nucleico que esta dentro o se une a otra molecula de acido nucleico que no se encuentra en asociacion con la otra molecula en naturaleza. Por ejemplo, una region heterologa de una construccion de acido nucleico podna incluir una secuencia codificante flanqueada por secuencias no encontradas en asociacion con la secuencia codificante en naturaleza. Otro ejemplo de una secuencia codificante heterologa es una construccion en la que la secuencia codificante por sf misma no se encuentra en naturaleza (por ejemplo, secuencias sinteticas que tienen codones diferentes del gen nativo). De forma analoga, una celula transformada con una construccion que normalmente no esta presente en la celula se podna considerar heterologa para fines de la presente invencion. La variacion alelica o los sucesos mutacionales de origen natural no dan lugar a ADN heterologo, como se usa en el presente documento.
Por consiguiente, una "secuencia codificante" o una secuencia que "codifica" una protema en particular, es una secuencia de acidos nucleicos que se transcribe (en el caso del ADN) y se traduce (en el caso del ARNm) en un polipeptido in vitro o in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los lfmites de la secuencia codificante se determinan mediante un codon de iniciacion en el extremo en la posicion 5' (amino) y un codon de terminacion de la traduccion en el extremo en la posicion 3' (carboxi). Una secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a, ADNc de ARNm procariota o eucariotica, secuencias de ADN genomico de ADN procariotico o eucariotico e incluso secuencias de ADN sintetico. Una secuencia de terminacion de la transcripcion normalmente se situara en la posicion 3' con respecto a la secuencia codificante.
La secuencia de nucleotidos del SERCA2 y sus isoformas esta conservada en aproximadamente un 90 %+ entre especies de mairnferos. Por lo tanto, SERCA2 se ha identificado y secuenciado a partir de diversas especies de mairnferos, incluyendo las secuencias de GenBank humanas NM_170665 (Lytton y MacLennan, J Biol Chem (1998) 263 (29): 15024-15031); NM_001681 (Id.); NM_006241 (Park et al., J Biol Chem (1994) 269 (2): 944-954); NM_001003214 (Autry y Jones, J Biol Chem (1997) 272 (25): 15872-15880); BC035588 (Strausberg et al., Proc Natl Acad Sci USA (2002) 99 (26): 16899-16903); AY186578 (Gelebart et al., Biochem Biophys Res Comm (2003) 303 (2): 676-684); y secuencias de GenBank de raton NM_026482 (Du et al., Arch Biochem Biophys (1995) 316 (1): 302310); NM_213616 (Hunter et al., Genomics (1993) 18 (3): 510-519); NM_009722 (Hsu et al., Biochem Biophys Res Comm (1993) 197 (3): 1483-1491); AJ131870 (vease Heyen et al., Mamm Genome (2000) 11 (2): 159-163); BC054531 (Strausberg et al., Proc Natl Acad Sci USA (2002) 99 (26): 16899-16903); BC054748 (Id.); AJ131821 (vease Heyen et al., Mamm Genome (2000) 11 (2): 159-163); AJ223584 (Id.); AF029982 (Id.); y AF039893
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(Schoenfeld y Lowe, presentacion directa (18 de diciembre de 1997), Cardiovascular Research, Genentech, 1 DNA Way, South San Francisco, CA 94080, USA). Todas las secuencias anteriores estan disponibles al publico.
Aunque los expertos en la materia reconoceran que el uso del polinucleotido de SERCA2a humano podna ser preferente en terapias humanas, por ejemplo, terapias geneticas humanas, el polinucleotido de SERCA2a de rata tambien se puede usar para los fines de la invencion que se describen en el presente documento. Por lo tanto, los polinucleotidos que son estructural o funcionalmente similares, por ejemplo, altamente homologos con respecto al SERCA2a humano estan incluidos dentro de la invencion.
Para un experto en la materia sera evidente que para obtener y usar secuencias de SERCA2 incluidas en la presente divulgacion y las conocidas en la tecnica, el ADN y el ARN tambien se pueden sintetizar usando smtesis de acidos nucleicos automatizada con cualquier metodo conocido hasta la fecha o descubierto posteriormente (por ejemplo, PCR, smtesis de ADNc (vease, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 2001, y Current Protocols in Molecular Biology, M. Ausubel et al., eds., (Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., Suplemento mas reciente)).
Como entenderan los expertos en la materia, las composiciones de polinucleotidos utiles en la presente invencion pueden incluir secuencias genomicas, secuencias extragenomicas y codificadas en plasmidos y segmentos geneticos modificados por ingeniena mas pequenos que expresan, o que se pueden adaptar para que expresen, protemas, polipeptidos, peptidos y similares. Los segmentos de este tipo se pueden aislar de forma natural, o se puede modificar por via sintetica por la mano del hombre.
Como tambien reconocera un experto en la materia, los polinucleotidos utiles en la invencion pueden ser monocatenarios o bicatenarios y pueden ser ADN (genomico, ADNc o sintetico) o moleculas de ARN. Las moleculas de ARN pueden incluir moleculas de HnARN, que contienen intrones y que corresponden a una molecula de ADN en una molecula de una manera exclusiva, y moleculas de ARNm, que no contienen intrones. Pueden estar presentes, pero no necesariamente, secuencias codificantes o no codificantes adicionales dentro de un polinucleotido util en la presente invencion, y un polinucleotido puede, aunque no necesariamente, estar unido a otras moleculas y/o materiales de soporte.
Los polinucleotidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endogena que codifica un polipeptido/protema de la invencion o una porcion de los mismos) o puede comprender una secuencia que codifique una variante o derivado, incluyendo una variante o derivado inmunogenicos de dicha secuencia. Ademas, los polinucleotidos pueden codificar una combinacion de diferentes secuencias, por ejemplo, un transgen, un polinucleotido vmco, un acido nucleico que codifica un marcador seleccionable y similares.
Como se ha discutido anteriormente, los polipeptidos de de SERCA2 estan altamente conservados, por lo que el experto en la materia puede realizar un alineamiento optimo de las secuencias de polipeptidos o de acidos nucleicos para su comparacion usando el programa Megalign en el conjunto de software de bioinformatica Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, Wis.), usando parametros por defecto. Este programa incorpora varios esquemas de alineacion que se describen en las siguientes referencias: Dayhoff, M. O. (1978) A model of evolutionary change in proteins -- Matrices for detecting distant relationships. En Dayhoff, M. O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington D.C. Vol. 5, Supl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Higgins, D. G. y Sharp, P. M. (1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E. W. y Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E. D. (1971) Comb. Theor 11:105; Saitou, N. Nei, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P. H. A. y Sokal, R. R. (1973) Numerical Taxonomy -- the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, Calif.; Wilbur, W. J. y Lipman, D. J. (1983) Proc. Natl. Acad., Sci. USA 80: 726-730.
Como alternativa, el alineamiento optimo de las secuencias para comparacion se puede realizar con el algoritmo de identidad local de Smith y Waterman (1981) Add. APL. Math 2: 482, con el algoritmo de alineamiento de identidad de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, mediante la busqueda de metodos de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, mediante implementaciones informaticas de estos algoritmos (Gap, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis.), o mediante inspeccion.
Un ejemplo de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencias y similitud de secuencias son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., (1977) Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 y en Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410, respectivamente. BLAST y BLAST 2.0 se pueden usar, por ejemplo con los parametros que se describen en el presente documento, para determinar el porcentaje de identidad de secuencias de los polinucleotidos y polipeptidos que se desvelan en el presente documento. El software para realizar los analisis BLAST esta disponible al publico a traves del Centro Nacional de Informacion Biotecnologica. Para las secuencias de aminoacidos, para calcular la puntuacion acumulada se puede usar una matriz de puntuacion. La extension de las coincidencias de palabras en cada direccion se detiene cuando: la puntuacion de alineamiento acumulativa disminuye en la cantidad X de su valor maximo alcanzado; la puntuacion
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acumulativa va a cero o por debajo, debido a la acumulacion de uno o mas alineamientos de restos de puntuacion negativa; o se alcanza el final de cada secuencia. Los parametros del algoritmo BLAST, W, T y X, determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento.
En las composiciones utiles en la presente invencion, el polinucleotido o acido nucleico puede ser cualquiera de ADN o ARN. Las secuencias en cuestion pueden ser de origen natural o artificial y, en particular, ADN genomico, ADNc, ARNm, ARNt, ARNr, secuencias hubridas o secuencias sinteticas o semisinteticas. Ademas, el acido nucleico puede ser de tamano muy variable, que va desde el oligonucleotido hasta el cromosoma. Estos acidos nucleicos pueden ser de origen humano, animal, vegetal, bacteriano, vmco y similares. Se pueden obtener mediante cualquier tecnica conocida por un experto en la materia, y en particular mediante la identificacion sistematica de bibliotecas, mediante smtesis qmmica o como alternativa con metodos mixtos que incluyen la modificacion qmmica o enzimatica de secuencias obtenidas mediante la identificacion sistematica de bibliotecas. Ademas, se pueden incorporar en vectores, tales como vectores plasmfdicos.
Para expresar un polipeptido deseado, las secuencias de nucleotidos que codifican el polipeptido, por ejemplo, SERCA2, o equivalentes funcionales, se pueden insertar en un vector de expresion apropiado, es decir, un vector que contenga los elementos necesarios para la transcripcion y traduccion de la secuencia codificante insertada. Se pueden usar metodos que son bien conocidos por los expertos en la materia para construir vectores de expresion que contienen secuencias que codifican un polipeptido de interes y elementos de control de la transcripcion y de la traduccion apropiados. Estos metodos incluyen tecnicas de aDn recombinante in vitro, tecnicas sinteticas y recombinacion genetica in vivo. Tales tecnicas se describen, por ejemplo, en Sambrook, J. et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., y en Ausubel, F. M. et al., (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.
La expresion "codificacion de forma operativa" se refiere a un polinucleotido que se ha modificado para que incluya la secuencia de promotor y otras secuencias necesarias para la expresion y, cuando se desee, la secrecion del producto de traduccion deseado; por ejemplo, un peptido o protema. Todas las realizaciones de la invencion se pueden poner en practica usando vectores de expresion de AAV conocidos. Preferentemente, estos vectores incluiran ADNc(s) que codifica el producto de traduccion deseado. Por lo tanto, a menos que el contexto lo requiera de otro modo, se supondra que "polinucleotido" se refiere a secuencias que codifican de forma operativa contenidas en un vector de expresion recombinante adecuado, ejemplos de las cuales se proporcionan en el presente documento.
Los "elementos de control" o "secuencias reguladoras" presentes en un vector de expresion son aquellas regiones no traducidas del vector (por ejemplo, potenciadores, promotores, regiones sin tradudan las posiciones 5' y 3' y similares), que interactuan con protemas de celulas hospedadoras para llevar a cabo la transcripcion y la traduccion. Los elementos de este tipo pueden variar en su fuerza y especificidad. Dependiendo del sistema de vector y hospedador usados, se puede usar cualquier numero de elementos de transcripcion y traduccion adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clonan sistemas bacterianos, se pueden usar promotores inducibles tales como el promotor hubrido lacZ del fagemido pBLUESCRIPT (Stratagene La Jolla, Calif.) o el plasmido pSPORTI (Gibco BRL, Gaithersburg, Md.) y similares. En sistemas de celulas de mairnferos, por lo general se prefieren promotores de genes de marnfferos o de virus de mamfferos. A modo de ejemplos no limitantes, los promotores incluyen los de promotores de CMV, beta-actina, EF2alfa, LTR de RSV, LTR de VIH, LTR de HTLV-1 y promotores compuestos (D.H. Barouch et al., A human T-cell leukemia virus type 1 regulatory element enhances the immunogenicity of human immunodeficiency virus type 1 DNA vaccines in mice and nonhuman primates, J. Virol. 79: 8828-8834, 2005). En un aspecto, el promotor es un promotor de CMV o un promotor que comprende porciones del promotor de beta-actina de pollo (H. Niwa et al., Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector, Gene 108: 193-199, 1991). En otro aspecto, el promotor es un promotor de CMV, promotor de Sm22, o promotor de Tie2. Si es necesario generar una lmea celular que contenga multiples copias de la secuencia que codifica un polipeptido, de forma ventajosa se pueden usar vectores basados en based SV40 o EBV con un marcador seleccionable apropiado.
Las senales de iniciacion espedficas tambien se pueden usar para conseguir una traduccion mas eficaz de secuencias que codifican un polipeptido de interes. Las senales de este tipo incluyen el codon de iniciacion de ATG y secuencias adyacentes. En los casos en los que las secuencias que codifican el polipeptido, su codon de iniciacion y secuencias cadena arriba se insertan en el vector de expresion apropiado, no se necesitaran senales adicionales de control transcripcional o de traduccion. Sin embargo, en los casos en los que solo se inserta la secuencia de codificacion, o una parte de la misma, se deben proporcionar senales de control de traduccion exogenas incluyendo el codon de iniciacion ATG. Ademas, el codon de iniciacion debe estar en el marco de lectura correcto para asegurar la traduccion de toda la insercion. Los elementos de traduccion exogenos y los codones de iniciacion pueden ser de diversos ongenes, tanto naturales como sinteticos. La eficacia de la expresion se puede mejorar mediante la inclusion de potenciadores que sean apropiados para el sistema celular que se usa en particular, tales como los se describen en la bibliograffa (Scharf, D. et al., (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 125-162).
Ademas, una cepa de celula hospedadora se puede elegir por su capacidad para modular la expresion de las secuencias insertadas o para procesar la protema expresada de la manera deseada. Tales modificaciones del
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polipeptido incluyen, pero no se limita, acetilacion, carboxilacion, glicosilacion, fosforilacion, lipidacion y acilacion. El procesamiento posterior a la traduccion que escinde una forma "prepro" de la protema tambien se puede usar para facilitar la insercion, plegamiento y/o funcion correctos. Se pueden elegir diferentes celulas hospedadoras tales como CHO, COS, HeLa, MDCK, HEK293 y WI38, que tengan una maquinaria celular espedfica y mecanismos caractensticos para tales actividades posteriores a la traduccion, para asegurar la correcta modificacion y procesamiento de la protema extrana.
Ademas, la administracion genetica implica poUmeros que forman complejos, nanopartmulas (definidas como con un diametro inferior a 1 micrometro), o incluso micropartmulas (definidas como con un diametro superior a 1 micrometro) con plasmidos de ADN y otros acidos nucleicos. Se han descrito muchos tipos de poKmeros que mejoran la expresion de genes codificados por acidos nucleicos en las celulas.
Por ejemplo, los polfmeros cationicos tales como poli-L-lisina, poli-L-glutamato, o copolfmeros en bloque tambien pueden ser agentes de administracion de acidos nucleicos. Ademas, se ha utilizado el uso de poli[acido alfa-(4- aminobutil)-1-glicolico] (PAGA) para suministrar ADN de plasmido a ratones portadores de tumores. Ademas, tambien se ha descrito el uso de lipopolfmero soluble en agua (WSLP), usando polietilenimina ramificada y cloroformiato de colesterilo. Ademas se encontro la administracion genetica hfbrida de polfmero de vesroula basado en polietilenimina como otra forma de administrar vectores de expresion de ADN de plasmido, incluyendo el uso de dendnmeros de poli(propilenimina) como agentes de administracion. Ademas se encontro que los copolfmeros de polietilenglicol (PEG) mejoran la administracion del ADN de plasmido DNA, incluyendo diversos tipos de polfmeros que se pueden usar para la liberacion controlada del ADN de plasmido y otros acidos nucleicos. Las moleculas de este tipo incluyen poli(acido lactico) y sus derivados, poli(acido lactico) PEGilado, poli(acido lactico-co-glicolico) y sus derivados, poli(orto esteres) y sus derivados, poli(orto esteres) PEGilados, poli(caprolactona) y sus derivados, poli(caprolactona) PEGilada, poli-lisina y sus derivados, polilisina PEGilada, poli(etilenimina) y sus derivados, poli(etilenimina) PEGilada, poli(acido acnlico) y sus derivados, poli(acido acnlico) PEGilado, poli(uretano) y sus derivados, poli(uretano) PEGilado, y combinaciones de todos los mismos. En el presente documento se desvela el uso de micropartroulas polimericas de lfpido-protema-azucar para la administracion de acidos nucleicos. Estos y otros polfmeros se conocen bien en la tecnica.
Las composiciones de acido nucleico se creen administrar mediante electroporacion. La electroporacion usa pulsos electricos para introducir protemas, acidos nucleicos, lfpidos, carbohidratos, o mezclas de los mismos en el hospedador para producir un efecto. Un uso habitual de la electroporacion es introducir un acido nucleico en el hospedador de manera que la protema codificada por el acido nucleico se produzca de forma eficaz.
Las composiciones de acido nucleico se pueden administrar mediante bombardeo de partroulas. Powderject (Norvartis Pharmaceutical Corporation) ha desarrollado metodos para revestir partroulas de oro con acidos nucleicos y otras sustancias y a continuacion introducirlas forzosamente en el hospedador mediante bombardeo de partroulas. Para los acidos nucleicos que codifican anrtgenos, esto da como resultado un aumento de la respuesta inmunologica con respecto a los anrtgenos.
La presente invencion tambien incluye la administracion de entidades y composiciones moleculares "farmaceuticamente aceptables" que se pueden tolerar fisiologicamente y por lo general no producen una reaccion alergica o reaccion no deseada similar, tal como malestar gastrico, mareos y similares, cuando se administran a un ser humano. Por lo tanto, como se usa en el presente documento, la expresion "farmaceuticamente aceptable" se refiere a aprobado por una agencia reguladora del gobierno Federal o estatal o que se enumera en la Farmacopea de Estados Unidos u otra farmacopea reconocida generalmente para uso en animales, y mas particularmente en seres humanos. El termino "vehroulo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, vehroulo con el que se administra el compuesto. Tales vehroulos farmaceuticos pueden ser lfquidos esteriles, tales como agua y aceites, incluyendo los de origen en petroleo, animal, vegetal o sintetico, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sesamo y similares. Las soluciones salinas de a solucion en agua o acuosas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol se emplean preferentemente como vehfculos, en particular para soluciones inyectables. Algunos vehfculos farmaceuticos aceptables se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin.
Por consiguiente, como se usa en el presente documento, la expresion "composicion terapeutica" se define como la que comprende al menos un gen que codifica la isoforma 2a de SERCA (SERCA2a). La composicion terapeutica tambien puede contener otras moleculas de acido nucleico (por ejemplo, un vector vrnco) y entidades farmaceuticamente aceptables, y sustancias tales como agua, minerales, vehfculos tales como protemas y otros excipientes conocidos por un experto en la materia.
La invencion se refiere a tratar o proporcionar tratamiento a un sujeto que padece hipertension pulmonar. Como se usa en el presente documento, "tratar" o "tratamiento" del sujeto es un enfoque para obtener resultados clmicos beneficiosos o deseados. Los resultados clmicos deseados incluyen, pero no se limitan a, prevencion de la remodelacion de celulas de musculo liso en arterias pulmonares, restablecimiento de la funcion pulmonar, y/o reduccion de la gravedad o inhibicion de smtomas asociados con la hipertension pulmonar. Los smtomas asociados con la hipertension pulmonar a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, dolor de pecho, mareos, desmayos,
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fatiga, hinchazon de las piernas, sensacion de mareo durante el ejercicio o esfuerzo, dificultad para respirar durante la actividad y debilidad. Los beneficios o resultados clmicos deseados dependen del mecanismo, aunque el mecanismo de actividad esta incluido dentro del resultado. Como entendera una persona con experiencia en la materia, los smtomas particulares que conducen al tratamiento con la invencion dependeran de la gravedad de la hipertension pulmonar que se esta tratando.
En un aspecto de la invencion, la composicion terapeutica usada para tratar la hipertension pulmonar incluye un vector de expresion de AAV o virion de AAV y un gen que codifica la isoforma 2a de SERCA. Como se ha discutido previamente, el transgen SERCA2a de la invencion, cuando esta contenido en una composicion terapeutica, por lo general se une de forma operativa a diversos elementos reguladores que se han modificado para que incluyan secuencias de promotor y otras secuencias necesarias para la expresion y, cuando se desee, la secrecion del producto de traduccion deseado (por ejemplo, un peptido o protema). Por ejemplo, los polinucleotidos de SERCA2a se pueden conjugar o usar en asociacion con otros polinucleotidos que codifican de forma operativa las protemas reguladoras que controlan la expresion de estos polipeptidos o pueden contener secuencias de reconocimiento, promotoras y de secrecion. Las personas con experiencia en la materia seran capaces de seleccionar polinucleotidos reguladores e incorporarlos en los polinucleotidos SERCA2a de la invencion sin experimentacion indebida.
Una composicion terapeutica para tratar o reducir los smtomas asociados con la hipertension pulmonar puede incluir un polinucleotido que codifica una protema capaz de modular indirectamente el Ca2+ del musculo liso y la contractilidad. Como se sabe en la tecnica, la protema cardiaca fosfolambano inhibe la actividad de SERCA2a. Por consiguiente, en el presente documento se desvelan metodos para disminuir el nivel o la actividad del fosfolambano en una celula de musculo liso pulmonar. En una realizacion, la expresion de un mutante pseudofosforilado de fosfolambano aumenta. En otra realizacion, un mutante tiene sustitucion del sitio de fosforilacion 16 de serina con el aminoacido basico glutamina, introduciendo de ese modo una carga negativa en la posicion 16 (mutante de fosfolambano S16E). Esta forma pseudofosforilada de fosfolambano compite con el fosfolambano natural para unirse a SERCA, disminuyendo de ese modo la oportunidad para que la protema natural influya de forma negativa en la actividad de SERcA. Vease, por ejemplo, el documento WO 2000/025804.
En el presente documento se desvelan metodos que incluyen la administracion, a un sujeto con necesidad del mismo, de una cantidad terapeuticamente eficaz de un ARNsi en un vector vmco, en la que el ARNi disminuye la expresion y/o actividad del fosfolambano PLB), en una cantidad eficaz para transducir celulas del musculo liso pulmonar del sujeto, dando como resultado de ese modo la expresion del ARNi y para tratar la hipertension pulmonar en el sujeto. El PLB no fosforilado mantiene baja la afinidad del Ca2+ de SERCA2a, lo que da como resultado una disminucion de la absorcion del Ca2+ del SR, una relajacion mas lenta y una reduccion de la carga de Ca2+ del SR.
Los acidos nucleicos de PLB, incluyen, pero no se limitan a, los N.° de Registro en GenBank NM_02667 (Simmerman et al., J Biol Chem (1986) 261 (28): 13333-13341); NM_023129 (Ganim et al., Cir Res (1992) 71 (5): 1021-1030); NM_022707 (Wang y Nadal-Ginard, Adv Exp Med Biol (1991) 304: 387-395); BC134584 (Moore et al., presentacion directa (17-MAR-2007), BC Cancer Agency, Canada's Michael Smith Genome Sciences Centre, Suite 100, 570 West 7th Avenue, Vancouver, British Columbia V5Z 4S6, Canada); y NM_214213 (Verboomen et al., Biochem J (1989) 262 (1): 353-356). Todas las secuencias mencionadas anteriormente estan disponibles al publico.
La expresion "ARN de interferencia" se refiere por lo general a un proceso en el que una molecula de ARN bicatenario cambia la expresion de una secuencia de acido nucleico con la que la molecula de ARN de doble hebra ARN horquillado corto comparte una homologfa sustancial o total. Aunque no esta ligado por la teona, el mecanismo de accion puede incluir, pero no se limita, regulacion cadena abajo directa o indirecta de la expresion del gen PLB, disminucion del ARNm de PLB, y/o una disminucion de la actividad PLB. El termino "ARNi", incluyendo "ARN inhibidor corto (ARNsi)", se refiere a secuencias de ARN que provocan el ARN de interferencia, y que se transcribe a partir de un vector. Las expresiones "ARN horquillado corto" o "ARNhc" se refieren a una estructura de ARN que tiene una region duplex y una region de lazo. Tambien se debe entender que esta expresion es especifica para las moleculas de ARN con estructuras secundarias de tallo-lazo o saliente. Los ARNi se pueden expresar inicialmente como los ARNsh.
Por lo general, el ARNi se optimiza con secuencias identicas entre la diana y el ARNi. El fenomeno de ARN de interferencia se puede observar con una homologfa inferior a un 100 %, pero las regiones complementarias deben ser suficientemente homologas entre sf para formar las regiones de hebra doble espedficas. Las reglas estructurales precisas para conseguir una region de doble cadena eficaz para dar como resultado una ARN de interferencia no se han identificado completamente, pero por lo general es suficiente una identidad de aproximadamente un 70 %. Por consiguiente, en algunas realizaciones de la invencion, la homologfa entre el ARNi y PLB tiene una identidad de secuencias de nucleotidos de al menos un 70 %, y puede tener una identidad de secuencias de nucleotidos de al menos un 75 %. La homologfa incluye, pero no se limita a, una identidad de secuencia de nucleotidos de al menos un 85 % o una identidad de secuencias de nucleotidos de incluso un 90 %. En una realizacion, la homologfa de secuencias entre la secuencia diana y la hebra sentido del ARNi tiene una identidad de secuencias de nucleotidos de al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un
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Otra consideracion es que el emparejamiento de bases en el ARN es sutilmente diferente del ADN en que G se emparejara con U, aunque no tan fuertemente como lo hace con C, en duplex de ARN. Ademas, para la eficacia de ARNi, es mas importante que la cadena antisentido sea homologa a la secuencia diana. En algunas circunstancias, se sabe que 17 de 21 nucleotidos son suficientes para iniciar el ARNi, pero en otras circunstancias, se requiere una identidad de 19 o 20 nucleotidos de 21. Aunque no esta limitado por la teona, a nivel general, se requiere mayor homologfa en la parte central de una region de doble cadena que en sus extremos. Un cierto grado predeterminado de falta de homoiogfa perfecta se puede disenar en una construccion en particular para reducir su actividad de ARNi lo que podna dar como resultado un silenciamiento parcial o represion del producto del gen diana, en circunstancias en las que solo se buscaba un grado de silenciamiento. En tal caso, solo se pueden cambiar una o dos bases de la secuencia antisentido. Por otro lado, la hebra sentido es mas tolerante a las mutaciones. Aunque no esta limitado por la teona, esto puede ser debido a que la cadena antisentido es la que es cataltticamente activa. Por lo tanto, menos identidad entre la cadena de sentido y la transcripcion de una region de un gen diana no necesariamente reducira la actividad del ARNi, en particular cuando la cadena antisentido se hibrida perfectamente con esa transcripcion. Las mutaciones en la cadena sentido (de modo que no es identica a la transcripcion de la region del gen diana) pueden ser utiles para ayudar en la secuenciacion de construcciones horquilladas y potencialmente para otros fines, tales como la modulacion del procesamiento del corte de una transcripcion de horquilla u otros aspectos de la via del ARNi.
Los terminos "hibridacion" y "emparejamiento", incluyendo equivalentes gramaticales de los mismos, se usan indistintamente en la presente memoria descriptiva con respecto a secuencias de nucleotidos y se refieren a secuencias de nucleotidos que son capaces de formar pares de bases de Watson-Crick debido a su complementariedad. La persona experta en la materia podna entender que tambien es posible el emparejamiento de pares de bases no Watson-Crick, especialmente en el contexto de las secuencias de ARN. Por ejemplo, un denominado "par oscilante" se puede formar entre restos de guanosina y uracilo en el ARN.
Los productos de expresion de ARN del casete de expresion de ARNi conducen a la generacion de un complejo de ARN bicatenario (ARNds) para inducir la ARN de interferencia y, de ese modo regular cadena abajo o disminuir la expresion de un gen de mairnfero. "ARNds" se refiere a un complejo de acido ribonucleico que comprende dos cadenas de ARN complementarias con bases emparejadas de Watson-Crick. El complejo de ARNds comprende una primera secuencia de nucleotidos que se hibrida en condiciones rigurosas, incluyendo una etapa de lavado de 0,2 x SSC a 65 °C, a una secuencia de nucleotidos de al menos un gen de marnffero y una segunda secuencia de nucleotidos que es complementaria a la primera secuencia de nucleotidos. La primera secuencia de nucleotidos podna estar unida a la segunda secuencia de nucleotidos por una tercera secuencia de nucleotidos (por ejemplo, un lazo de ARN) de manera que la primera secuencia de nucleotidos y la segunda secuencia de nucleotidos formen parte de la misma molecula de aRN; como alternativa, la primera secuencia de nucleotidos podna ser parte de una molecula de ARN y la segunda secuencia de nucleotidos podna ser parte de otra molecula de ARN. Por lo tanto, se puede formar un complejo de ARNds mediante hibridacion o emparejamiento intramolecular o el complejo de ARNds se forma por hibridacion o emparejamiento intermolecular.
Ademas, otros acidos nucleicos (transgenes) y protemas de SERCA, fosfolambano, inhibidor-1 de la fosfatasa de tipo 1, S100A1 y sarcolipina, asf como acidos nucleicos y protemas relacionados que desempenan un papel en Ca2+, son dianas para los polinucleotidos que se desvelan en el presente documento.
Por ejemplo, en un aspecto de la invencion, un vector y transgen vmco es AAV2/1/SERCA2a, que esta constituido por una capside vinca del serotipo 1 de AAV que contiene un ADN de cadena sencilla de 4486 nucleotidos que contiene el casete de expresion SERCA2a humano flanqueado por las ITR obtenidas a partir del serotipo 2 de AAV. La capside icosaedrica consta de tres protemas de la capside de serotipo 1 de AAV relacionadas, VP1, VP2 y VP3. El aDn de AAV2/1/SERCA2a contiene los siguientes componentes: ITR basada en serotipo 2 de AAV en los extremos en las posiciones 3' y 5' terminales, flanqueando el casete de expresion CMV-hSERCA2a-poliA. El casete de expresion contiene el potenciador/promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMVie) que conduce la transcripcion de secuencias que incluyen un intron hubrido del plasmido comercial pCI (Promega - GenBank U47119), el ADNc de hSERCA2A (secuencia codificante identica a GenBank NM-001681), y una senal de poliadenilacion de hormona de crecimiento bovino (BGHpA, (GenBank M57764)). El intron tubrido se diseno usando el sitio donante en la posicion 5' desde el primer intron de la p-globina humana y el sitio aceptor en la posicion 3' a partir del intron situado entre el lfder y el cuerpo de una region variable de cadena pesada del gen de la inmunoglobulina.
El vector o construccion AAV2/1/SERCA2a incorpora menos de 300 nucleotidos de las secuencias de AAV (wtAAV) de tipo silvestre en el genoma del vector. Las secuencias de wtAAV son las ITR obtenidas a partir del serotipo 2 de AAV que proporcionan en cis la senal de empaquetamiento que permite la insercion del aDn de SERCA2a en la capside.
Los agentes terapeuticos, incluyendo polinucleotidos, polinucleotidos en combinacion con un vector, tanto vmcos como no vmcos, tal como se ha discutido anteriormente, se pueden usar en la preparacion de un medicamento para
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el tratamiento de la enfermedad pulmonar (por ejemplo, hipertension pulmonar) en el que el medicamento se administra por infusion directa en el sistema circulatorio o por administracion intratraqueal o inhalacion. Los procedimientos para la administracion por inhalacion se discuten por ejemplo en Moss, et al., Human Gene Therapy, 18: 726-732 (agosto de 2007).
Las composiciones terapeuticas utiles en la presente invencion se suministran a una "celula diana" o "celula hospedadora" o "tejido diana" y equivalentes de los mismos, que se refieren a la celula, tejido del hospedador en el que se busca la expresion del polinucleotido que codifica de forma operativa. Por ejemplo, las composiciones de SERCA2 vmco adeno-asociado se administran en una celula muscular o tejido muscular.
En el presente documento se desvela el empaquetamiento de los viriones de AAV-SERCA2 como se ha discutido anteriormente. El crecimiento y propagacion de los viriones requerira "condiciones de medio definido", que se refieren a entornos para el cultivo de celulas en los que se detalla la concentracion de componentes en los mismos requerida para un crecimiento optimo. Por ejemplo, dependiendo del uso de las celulas (por ejemplo, aplicaciones terapeuticas), la eliminacion de las celulas de las condiciones que contienen protemas xenogenicas son importantes; es decir, las condiciones de cultivo por lo general son condiciones sin animales o sin protemas animales no humanas.
La presente invencion proporciona vectores de expresion de AAV o viriones rAAV para su uso en el tratamiento de "hipertension pulmonar", que por lo general se refiere a una presion sangumea anormalmente elevada en las arterias de los pulmones. Hace que el lado derecho del corazon necesita trabajar con mas esfuerzo de lo normal.
La hipertension pulmonar, como se describe en el presente documento, se diagnostica comunmente usando una diversidad de metodos, incluyendo un examen ffsico realizado para buscar algunos signos habituales de hipertension pulmonar. En este examen un medico busca sonidos cardiacos alterados, tales como una S2 ampliamente separada o segundo sonido del corazon, un fuerte sonido P2 o cierre de la valvula pulmonar (parte del segundo sonido cardiaco), jadeo (para)esternal, posible S3 o tercer sonido cardiaco, y regurgitacion pulmonar. Para confirmar la presencia de hipertension pulmonar y excluir otros posibles diagnosticos se necesitan procedimientos adicionales. Por lo general, estos incluyen pruebas de funcion pulmonar; analisis de sangre para excluir VIH, enfermedades autoinmunes, y enfermedad hepatica; electrocardiograma (ECG); mediciones de gas en sangre arterial; rayos X del torax (seguido de barrido CT de alta resolucion si se sospecha de enfermedad pulmonar intersticial); y ventilacion-perfusion o exploracion V/Q para excluir la hipertension pulmonar tromboembolica cronica. La biopsia del pulmon no suele estar indicada a menos que se considere que la hipertension pulmonar se debe a una enfermedad pulmonar intersticial subyacente. Pero las biopsias de pulmon presentan multitud de riesgos de hemorragia debido a la alta presion sangumea intrapulmonar. La mejona clmica a menudo se mide con un "ensayo de seis minutos de marcha", es decir, la distancia que un paciente puede caminar en seis minutos. La estabilidad y la mejora de esta medida se correlacionan con una mejor supervivencia. En la actualidad tambien se esta usando el nivel de BNP en sangre para seguir la evolucion de los pacientes con hipertension pulmonar.
En un aspecto relacionado, las composiciones terapeuticas de la presente invencion se administran un sujeto como una modalidad de mejora. Como se usa en el presente documento, "de mejora", se refiere a que mejora o alivia los smtomas de un sujeto asociados con un trastorno, e incluye la cura de un trastorno de ese tipo.
Se entendera que, si se desea, una composicion, como se desvela en el presente documento, se puede administrar en combinacion con otros agentes asf como, tal como, por ejemplo, otras protemas o polipeptidos o diversos agentes farmaceuticamente activos. De hecho, practicamente no hay lfmite para otros componentes que tambien se puedan incluir, dado que los agentes adicionales no causan un efecto significativo adverso despues del contacto con las celulas diana o tejidos hospedadores. De este modo, las composiciones se pueden administrar en combinacion con otros agentes si fuera necesario en el caso en particular. Las composiciones de este tipo se pueden purificar a partir de celulas hospedadoras u otras fuentes biologicas, o como alternativa se pueden sintetizar por via qmmica como se describe en el presente documento. De forma analoga, las composiciones de este tipo pueden comprender adicionalmente composiciones de ARN o ADN sustituido o derivatizado.
Sera evidente que cualquiera de las composiciones farmaceuticas descritas en el presente documento puede contener sales farmaceuticamente aceptables de los polinucleotidos y polipeptidos de la invencion. Las sales de este tipo se pueden preparar, por ejemplo, a partir de bases no toxicas farmaceuticamente aceptables, incluyendo bases organicas (por ejemplo, sales de aminas primarias, secundarias y terciarias y aminoacidos basicos) y bases inorganicas (por ejemplo, sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio y magnesio).
Previamente se describieron realizaciones que describen sistemas vmcos adeno-asociados y vectores de expresion. Sin embargo, el termino "vector" se refiere a cualquier elemento genetico, tal como un plasmido, fago, transposon, cosmido, cromosoma, virus, virion, etc., que es capaz de replicacion cuando se asocia con los elementos de control apropiados y que puede transferir secuencias geneticas entre celulas. Por lo tanto, el termino incluye vehmulos de clonacion y expresion, asf como vectores vmcos discutidos previamente v. De forma analoga, "vector de expresion recombinante" se refiere a sistemas de polinucleotido(s) que codifican de manera operativa polipeptidos expresables en eucariotas o procariotas. Los metodos para expresar secuencias de ADN que tienen secuencias eucariotas o
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vmcas en procariotas se conocen bien en la tecnica. En la tecnica tambien se conocen bien los vectores de ADN vmico y plasmido biologicamente funcionales capaces de expresion y replicacion en un hospedador. Los hospedador es pueden incluir organismos microbianos, levaduras, insectos y mairnferos.
Los vectores o vectores de expresion recombinantes proporcionados en el presente documento se preparan facilmente y combinan las ventajas de los adenovirus (alta titulacion, capacidad de infeccion elevada, capacidad grande, falta de asociacion con neoplasia humana) pero con la capacidad de integracion de AAV, haciendo que sean particularmente adecuados para la transferencia genetica estable que es util, por ejemplo, en enfoques de terapia genetica tal como se describe en el presente documento. Una ventaja adicional de los vectores AAV descritos es que, debido a que contiene TR o ITR de AAV y secuencias D que flanquean el gen de interes, se espera que se integren en el ADN cromosomico celular. La integracion es importante para transferencia genetica estable en celulas. Por lo tanto, los vectores AAV descritos en el presente documento son preferentes, por ejemplo, con respecto a vectores de adenovirus, ya que son episomicos y se podnan perder despues de varias divisiones celulares. Otra ventaja de los vectores AAV proporcionados en el presente documento es que se empaquetan de forma eficaz en partmulas de virus estables aunque se usen polinucleotidos pequenos o grandes. Ademas, otra ventaja de los vectores AAV proporcionados en el presente documento es que son menos citotoxicos que los vectores de adenovirus de primera generacion ya que no se expresan genes de adenovirus dentro de las celulas translucidas.
Los viriones que contienen vector AAV y/o AAV-SERCA2 descritos en el presente documento se "transfectan", lo que se refiere a la absorcion del ADN extrano por una celula. Es decir, una celula se "transfecta" con ADN exogeno y el ADN se introduce dentro de la membrana celular. Por lo general en la tecnica se conoce un numero de tecnicas de transfeccion. Vease, por ejemplo, Graham et al., (1973) Virology, 52: 456, Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al., (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, y Chu et al., (1981) Gene 13: 197. Las tecnicas de este tipo se pueden usar para introducir uno o mas restos de ADN exogeno, tales como un vector de integracion de nucleotido y otras moleculas de acido nucleico, en celulas hospedadoras adecuadas.
La expresion "celular hospedadora" u "hospedador" se refiere a, por ejemplo, celulas de marnffero, que se pueden usar, o se han usado como receptores de una construccion auxiliar de AAV, un plasmido de vector AAV, un vector de funcion auxiliar, u otro ADN de transferencia. De forma analoga, los terminos "sujeto", "individuo" o "paciente" se usan indistintamente en el presente documento para hacer referencia a un vertebrado, preferentemente un mamffero. Los mamfferos incluyen, pero no se limitan a, murinos, simios, seres humanos, animales de granja, animales para deportes y mascotas. El termino incluye la progenie de la celula original que se ha transfectado. Por lo tanto, una "celular hospedadora" u "hospedador", como se usa el presente documento, por lo general se refiere a una celula que se ha transfectado con una secuencia de ADN exogeno. Se entiende que la progenie de una sola celula progenitora puede no necesariamente puede tener una morfologfa completamente identica o en complemento de ADN genomico o total como el progenitor original, debido a mutacion natural, accidental, o deliberada.
Como se usa en el presente documento, la expresion "lmea celular" se refiere a una poblacion de es capaz de crecimiento y division continuos o prolongados in vitro. A menudo, las lmeas celulares son poblaciones clonales obtenidas a partir de una sola celula progenitora. Ademas, en la tecnica se sabe que se pueden producir cambios espontaneos o inducidos en el cariotipo durante el almacenamiento o transferencia de las poblaciones clonales de este tipo. Por lo tanto, las celulas obtenidas a partir de la lmea celular mencionada pueden no ser precisamente identicas a las celulas o cultivos ancestrales, y la lmea celular mencionada para incluir las variantes de este tipo.
Los vectores vmcos adicionales utiles para suministrar los polinucleotidos que codifican polipeptidos desvelados en el presente documento mediante transferencia genetica incluyen los obtenidos a partir de la familia de virus de la viruela, tales como virus vaccinia y virus de la viruela aviar. A modo de ejemplo, los recombinantes del virus vaccinia que expresan las nuevas moleculas se pueden construir como sigue a continuacion. El ADN que codifica un polipeptido se inserta primero en un vector apropiado de manera que quede adyacente a un promotor de vaccinia y secuencias de ADN de vaccinia flanqueante, tal como la secuencia que codifica la timidina quinasa (TK). A continuacion, este vector se usa para transfectar celulas que se infectan de forma simultanea con vaccinia. La recombinacion homologa sirve para insertar el promotor de vaccinia mas el gen que codifica el polipeptido de interes en el genoma vmco. El recombinante TK(-) resultante se puede seleccionar cultivando las celulas en presencia de 5- bromodesoxiuridina y recogiendo placas vmcas resistentes a la misma.
Un sistema de infeccion/transfeccion basado en vaccinia se puede usar de forma conveniente para proporcionar expresion o coexpresion transitoria, inducible de una o mas polipeptidos que se describen en el presente documento en celulas hospedadoras de un organismo. En este sistema en particular, las celulas se infectan primero in vitro con un virus vaccinia recombinante que codifica la ARN polimerasa de T7 de bacteriofago. Esta polimerasa muestra una especificidad excelente porque solo transcribe moldes que portan promotores de T7. Despues de la infeccion, las celulas se transfectan con el polinucleotido o polinucleotidos de interes, impulsado por un promotor T7. La polimerasa expresada en el citoplasma del recombinante del virus vaccinia transcribe el ADN transfectado en ARN que a continuacion se traduce en polipeptido mediante la maquinaria de traduccion del hospedador. El metodo proporciona produccion citoplasmica transitoria de alto nivel de grandes cantidades de ARN y sus productos de
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traduccion. Vease, por ejemplo, Elroy-Stein y Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87: 6743-6747; Fuerst et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83: 8122-8126.
Como alternativa, los virus de la viruela aviar, tales como la viruela de aves de corral y virus de la viruela del canario, tambien se pueden usar para suministrar las secuencias codificantes de interes. Se sabe que los virus de la viruela aviar recombinantes, que expresan inmunogenos de agentes patogenos de mairnfero, confieren inmunidad protectora cuando se administran a especies no aviares. El uso de un vector de Avipox es particularmente deseable en seres humanos y otras especies de mamnferos, ya que los miembros del genero Avipox solo se pueden replicar de forma productiva en especies aviares susceptibles y por lo tanto no son infecciosos en celulas de mamnfero. Los metodos para producir virus de la viruela aviar recombinantes se conocen en la tecnica y emplean recombinacion genetica, con respecto a la produccion de virus vaccinia. Veanse, por ejemplo, los documentos WO 91/12882; WO 89/03429; y WO 92/03545.
Cualquiera de un numero de vectores de alfavirus tambien se puede usar para el suministro de composiciones de polinucleotidos de la presente invencion, tales como los vectores que se describen en los documentos de Patente de Estados Unidos N.° 5.843.723; 6.015.686; 6.008.035 y 6.015.694. Tambien se pueden usar ciertos vectores basados en la Encefalitis Equina Venezolana (VEE), ejemplos ilustrativos de los cuales se pueden encontrar en los documentos de Patente de Estados Unidos N.° 5.505.947 y 5.643.576.
Ademas, para administracion genetica bajo la invencion tambien se pueden usar vectores conjugados moleculares, tales como los vectores quimericos de adenovirus que se describen en Michael et al., J. Biol. Chem. (1993) 268: 6866-6869 y Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 6099-6103.
En ciertas realizaciones, un polinucleotido se puede integrar en el genoma de una celula diana. Esta integracion se puede situar en la localizacion y orientacion espedficas mediante recombinacion homologa (sustitucion genetica) o se puede integrar en una localizacion aleatoria no espedfica (aumento genetico). Ademas, en realizacion adicionales, el polinucleotido se puede mantener de forma estable en la celula como un segmento episomico de ADN. Los segmentos de polinucleotidos o "episomas" de este tipo codifican secuencias suficientes para permitir el mantenimiento y la replicacion independiente o en sincronizacion con el ciclo de la celula hospedadora. La forma en que la construccion de expresion se suministra a una celula y en que sitio permanece el polinucleotido en la celula depende del tipo de construccion de expresion empleada.
En una realizacion relacionada, otros dispositivos y metodos que pueden ser utiles para inyeccion sin aguja accionada por gas de composiciones de la presente invencion incluyen los proporcionados Bioject, Inc. (Portland, Oreg.), algunos ejemplos de los cuales se describen en los documentos de Patente de Estados Unidos N.° 4.790.824; 5.064.413; 5.312.335; 5.383.851; 5.399.163; 5.520.639 y 5.993.412.
La presente invencion se suministrar de diversos modos. Para la administracion oral las composiciones de la presente invencion se pueden incorporar como alternativa con uno o mas excipientes en forma de un enjuague bucal, dentffrico, comprimido bucal, pulverizacion oral o una formulacion sublingual administrada por via oral. Como alternativa, el principio activo se puede incorporar en una solucion oral tal como una que contiene borato sodico, glicerina y bicarbonato potasico, o se puede dispersar en un dentffrico, o se puede anadir en una cantidad terapeuticamente eficaz a una composicion que puede incluir agua, agentes aglutinantes, agentes abrasivos, agentes aromatizantes, agentes espumantes y humectantes. Como alternativa, las composiciones se pueden producir en una forma de comprimido o solucion que se puede colocar debajo de la lengua o de otra manera se puede disolver en la boca. Las formulaciones de vacuna tambien se pueden administrar a la mucosa nasal, se pueden proporcionar en aerosol para suministro mediante inhalacion, o se pueden suministrar a las superficies mucosas de la zona genital femenina y masculina o del recto. Las formaciones de vacuna tambien se pueden formular para administracion transdermica.
En determinadas circunstancias, sera deseable suministrar las composiciones farmaceuticas desveladas en el presente documento por via parenteral, por via intravenosa, por via intramuscular, por via intratraqueal o incluso por via intraperitoneal. Tales enfoques son bien conocidos por el experto en la materia, algunos de los cuales se describen adicionalmente, por ejemplo, en el documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.543.158; documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.641.515 y documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.399.363. Como tal, en una realizacion, las composiciones de la invencion se pueden suministrar a traves de inhalacion, inyeccion intravenosa, inyeccion intracardiaca, por via intratraqueal. En otra realizacion, las composiciones de la invencion se administran mediante ventilacion mecanica. En ciertas realizaciones, se pueden preparar soluciones de los compuestos activos en forma de base libre o sales farmacologicamente aceptables en agua mezcladas de forma adecuada con un agente tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones tambien se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles lfquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones habituales de almacenamiento y uso, estas preparaciones por lo general contendran un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.
Las formas farmaceuticas ilustrativas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles (por
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ejemplo, vease el documento de patentes de Estados Unidos N.° 5.466.468). En todos los casos, la forma debe ser esteril y debe ser fluida en la medida en que exista una facilidad de inyeccion. Debe ser estable en las condiciones de fabricacion y almacenamiento y se debe conservar previamente contra la accion contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehnculo puede ser un disolvente o medio de dispersion que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol lfquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y/o aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de dispersion y/o mediante el uso de agentes tensioactivos. La prevencion de la accion de microorganismos puede ser facilitada por diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico, timerosal, y similares. En muchos casos, sera preferente incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares o cloruro sodico. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede ser provocada por el uso en las composiciones de agentes retardadores de la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
En una realizacion, para administracion parenteral en una solucion acuosa, la solucion se debena tampon a de forma adecuada, si fuera necesario y el diluyente lfquido primero se hace isotonico con suficiente solucion salina o glucosa. Estas soluciones acuosas en particular son especialmente adecuadas para administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea e intraperitoneal. En este sentido, un medio acuoso esteril que se puede emplear sera conocido por los expertos en la materia a la vista de la presente divulgacion. Por ejemplo, una dosificacion se puede disolver en 1 ml de solucion isotonica de NaCl y se puede anadir a 1000 ml del fluido de hipodermoclisis o se puede inyectar en el sitio de infusion propuesto (vease por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15a Edicion, paginas 1035-1038 y 1570-1580). Alguna variacion en la dosificacion se producira necesariamente dependiendo del estado del sujeto que se esta tratando. Ademas, para administracion humana, las preparaciones por supuesto y preferentemente cumpliran con los requisitos de esterilidad, pirogenicidad y los estandares generales de seguridad y pureza de acuerdo con lo requerido por los estandares de la Office of Biologics de la FDA.
Las composiciones desveladas en la presente invencion se pueden formular en una forma neutra o de sal. Las sales farmaceuticamente aceptables ilustrativas incluyen las sales de adicion de acido (formadas con los grupos amino libres de la protema) y que se forman con acidos inorganicos tales como, por ejemplo, acidos fosforico o clorhndrico o acidos organicos tales como acetico, oxalico, tartarico, mandelico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres tambien se pueden obtener a partir de bases inorganicas tales como, por ejemplo, hidroxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, ferrico, y bases organicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procama y similares. Despues de la formulacion, las soluciones se administraran de una manera compatible con la formulacion de la dosificacion y en una cantidad de modo que sea terapeuticamente eficaz.
Los vehnculos pueden comprender adicionalmente todos y cada uno de disolventes, medios de dispersion, vehnculos, revestimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardadores de la absorcion, tampones, soluciones vehnculo, suspensiones, coloides y similares. El uso de los medios y agentes de este tipo para sustancias farmaceuticas activas se conoce bien en la tecnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el principio activo, su uso se contempla en las composiciones terapeuticas. En las composiciones tambien se pueden incorporar principios activos suplementarios. La expresion "farmaceuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reaccion alergica o inapropiada similar cuando se administran a un ser humano.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmaceuticas se pueden suministrar mediante pulverizacion de agentes intranasales, inhalacion, y/u otras administracion mediante vehnculos de aerosoles. Se han descrito metodos para administrar genes, acidos nucleicos y composiciones de peptidos directamente a los pulmones a traves de pulverizaciones de aerosol nasal, por ejemplo, en el documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.756.353 y en el documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.804.212. De forma analoga, la administracion de polinucleotidos (por ejemplo, vectores vmcos) usando resinas de micropartfculas intranasales (Takenaga et al., J Controlled Release (1998) 52 (1-2): 81-7; y Moss, et al., Human Gene Therapy, 18: 726-732 (agosto de 2007)) y compuestos de
lisofosfatidil-glicerol (documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.725.871) tambien son bien conocidos en las
tecnicas farmaceuticas. De forma analoga, en el documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.780.045 se describe la administracion de farmaco transmucosal ilustrativa en forma de una matriz de soporte de politetrafluoroetileno.
En ciertas realizaciones, se usan liposomas, nanocapsulas, micropartfculas, partfculas lipfdicas, vesfculas, y similares, para la introduccion de vectores/viriones de la presente invencion en celulas/organismos hospedadores adecuados. En particular, los vectores/viriones de la presente invencion se pueden formular para su administracion ya sea encapsulados en una partfcula lipfdica, un liposoma, una vesfcula, una nanoesfera, o una nanopartfcula o
similar. Como alternativa, los vectores/viriones de la presente invencion se pueden unir de forma covalente o no
covalente a la superficie de tales vehnculos de transporte.
La formacion y uso de liposomas y preparaciones similares a liposomas como vehnculos potenciales de farmaco potencial por lo general son conocidos por los expertos en la materia (vease por ejemplo Lasic, Trends Biotechnol (1998) 16 (7): 307-21; Takakura, Nippon Rinsho (1998) 56 (3): 691-5; Chandran et al., Indian J Exp Biol (1997) 35
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(8): 801-9; Margalit, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst (1995) 12 (2-3): 233-61; documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.567.434; documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.552.157; documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.565.213; documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.738.868 y documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.795.587.
Como alternativa, en el presente documento se desvelan formulaciones de nanocapsulas farmaceuticamente aceptables de las combinaciones desveladas en el presente documento. Por lo general, las nanocapsulas pueden atrapar compuestos de una manera estable y reproducible (vease, por ejemplo, Quintanar-Guerrero et al., Drug Dev India Pharm (1998) 24 (12): 1113-28). Para evitar efectos secundarios debidos a la sobrecarga polimerica intracelular, tales partfculas ultrafinas (con un tamano de aproximadamente 0,1 pm) se pueden disenar usando polfmeros que se pueden degradar in vivo. Dichas partfculas se pueden preparar como se describe, por ejemplo, en Couvreur et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1988; 5 (1): 1-20; en Muhlen et al., Eur J Pharm Biopharm (1998) 45 (2): 149-55; Zambaux et al., J Controlled Release (1998) 50 (1-3): 31-40; y documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.145.684.
La presente invencion contempla una diversidad de programas de dosificacion que se describen en el presente documento, asf como otros que no se describen en el presente documento, pero de otro modo podnan ser conocidos por un experto en la materia. La invencion incluye programas de dosificacion continua, en los que un vector o virion de la invencion se administra de forma regular (diaria, semanal, mensual, dependiendo de la dosis y forma de dosificacion) sin pausas sustanciales. Los programas de dosificacion continua preferentes incluyen una administracion continua diaria en la que un vector o virion de la invencion se administra cada dfa, y programas de administracion continua de bolo, en los que un vector o virion se administra al menos una vez al dfa mediante inyecciones intravenosas o subcutaneas. Los ejemplos de programas de administracion continua incluyen, pero no se limitara, al menos 2, 3, 4, 5, 6, o 7 dfas, al menos 1,2, 3, 4, 5 o 6 semanas o mas, o cualquier combinacion de los mismos.
La invencion tambien incluye programas de dosificacion discontinua. Los parametros exactos de los esquemas de administracion discontinua variaran de acuerdo con la formulacion, metodo de administracion y las necesidades clmicas del sujeto. Por ejemplo, si se administra el vector o virion de la invencion mediante inhalacion, no se administran programas de administracion que comprenden un primer periodo de administracion seguido de un segundo periodo en el que el vector o virion de la invencion, que es mayor que, igual a, o menor que el periodo en el que se administra el vector o virion de la invencion. Los ejemplos de programas de administracion discontinua para administracion por inhalacion incluyen, pero no se limitan a, programas que comprenden periodos seleccionados entre 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 dfas, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o mas semanas, o cualquier combinacion de los mismos, y penodos de descanso seleccionados entre 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 dfas, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o mas semanas.
Los programas de administracion continua y discontinua mediante cualquier metodo tambien incluyen programas de dosificacion en los que la dosis se modula a lo largo del periodo eficaz, de modo que, al principio del periodo de
administracion del vector o del virion de la invencion; la dosis es baja y aumenta hasta el final del periodo de
administracion del vector o virion de la invencion; la dosis es inicialmente alta y disminuye durante el periodo de
administracion del vector o virion de la invencion; la dosis es inicialmente baja, aumenta hasta un nivel maximo,
luego se reduce hacia el final del periodo de administracion del vector o virion de la invencion; y cualquier combinacion de los mismos. Ademas, los programas de dosificacion se pueden preparar usando cualquier metodo convencional en la tecnica, tal como un sistema de cateter.
Las composiciones comprenderan material genetico suficiente para producir una cantidad terapeuticamente eficaz de SERCA2 o porciones o fragmentos o fragmentos funcionales de interes, es decir, una cantidad suficiente para reducir o mejorar los smtomas del estado patologico en cuestion o una cantidad suficiente para conferir el beneficio deseado. Las composiciones tambien pueden contener un excipiente farmaceuticamente aceptable. Tales excipientes incluyen cualquier agente farmaceutico que no induzca por sf mismo la produccion de anticuerpos daninos para el individuo que recibe la composicion, y que se puedan administrar sin toxicidad indebida. Los excipientes farmaceuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sorbitol, cualquiera de los diversos compuestos TWEEN, y lfquidos tales como agua, solucion salina, glicerol y etanol. En los mismos se pueden incluir sales farmaceuticamente aceptables, por ejemplo, sales de acidos minerales tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de acidos organicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos, y similares. Ademas, en los vehfculos de este tipo pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulgentes, sustancias tamponadoras de pH, y similares. Una discusion minuciosa de excipientes farmaceuticamente aceptables esta disponible en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991).
Una formulacion particularmente util incluye viriones de AAV recombinante en combinacion con uno o mas alcoholes dihfdricos o polihudricos, y, opcionalmente, un agente, tal como ester de sorbitan. Vease, por ejemplo, la Publicacion Internacional N.°WO 00/32233.
Como es evidente para los expertos en la materia a la vista de las ensenanzas de la presente memoria descriptiva, una cantidad eficaz de vector vmco que se debe anadir se puede determinar de forma empmca. La administracion
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se puede realizar en una dosis, de forma continua o intermitente a lo largo del periodo de duracion del tratamiento. Los metodos para determinar el medio y las dosis mas eficaces de administracion son bien conocidos por los expertos en la materia y variaran con el vector vmco, la composicion de la terapia, las celulas diana y el sujeto que se esta tratando. Se pueden realizar administraciones unicas y multiples con el nivel y el patron de dosis seleccionados por el medico tratante.
Se debena entender que mas de un transgen se puede expresar por el virion recombinante suministrado. Como alternativa, tambien se pueden suministrar vectores separados, cada uno de los cuales expresa uno o mas transgenes diferentes, como se describe en el presente documento. Ademas, tambien esta previsto que los vectores vmcos suministrados por los metodos de la presente invencion se combinen con otras composiciones y terapias adecuadas. Cuando el transgen esta fuera del control de un promotor inducible, ciertos compuestos administrados por via sistemica tales como muristerona, ponasterona, tetracilina o aufina se pueden administrar para regular la expresion del transgen.
Por consiguiente, las composiciones terapeuticas de la presente invencion pueden contener el transgen de SERC2a unido de forma operativa a diversos elementos reguladores en un vector AAV, sustancialmente similares a los que se han descrito anteriormente, incluyendo cualquier excipiente o vehmulo o agente necesario para efectuar una administracion eficaz, pero no toxica de las composiciones terapeuticas. Tambien se produciran composiciones de AAV de control, por ejemplo construcciones de aAV-GFP.
Ademas, con el fin de distinguir entre SERCA2a suministrado con AAV y su homologo endogeno, se puede construir un vector AAV que codifica una SERCA2a recombinante unido de forma operativa con una etiqueta de protema fluorescente de color verde (GFP) (AAV-SERCA2a-GFP) para su reconocimiento.
La celula hospedadora (o celula de empaquetamiento) tambien debe ser capaz de proporcionar funciones no obtenidas a partir de VAA, o "funciones auxiliares", con el fin de producir viriones de rAAV. Las funciones auxiliares son funciones vmcas y/o celulares no obtenidas a partir de VAA sobre las que depende el AAV para su replicacion, incluyendo al menos las protemas que no son AAV y los ARN que se necesitan en la replicacion de AAV, incluyendo los implicados en la activacion de la transcripcion genetica de AAV, corte y empalme de ARNm de AAV espedfico de la etapa, replicacion de ADN de AAV, smtesis de productos de expresion de Cap y ensamblaje de la capside de AAV. Las funciones auxiliares basadas en virus se pueden obtener a partir de cualquiera de los virus auxiliares conocidos.
En particular, se pueden introducir funciones auxiliares y a continuacion expresarse en celulas hospedadoras usando metodos conocidos por los expertos en la materia. Por lo general, las funciones auxiliares se proporcionan mediante la infeccion de las celulas hospedadoras con un virus auxiliar no unido. Se conoce una serie de virus auxiliares adecuados, incluyendo adenovirus; virus del herpes, por ejemplo, los tipos 1 y 2 del virus del herpes simple; y virus vaccinia. Las funciones auxiliares no vmcas tambien encontraran uso en la presente invencion, tales como las proporcionadas por la sincronizacion celular usando cualquiera de diversos agentes conocidos. Vease, por ejemplo, Buller et al., (1981) J. Virol. 40: 241 247; McPherson et al., (1985) Virology 147: 217 222; Schlehofer et al., (1986) Virology 152: 110 117.
Como alternativa, se pueden proporcionar funciones auxiliares usando un vector de funcion auxiliar como se ha definido anteriormente. Vease, por ejemplo, documento de Patente de Estados Unidos N.° 6.004.797 y Publicacion Internacional N.° WO 01/83797. Las secuencias de acidos nucleicos que proporcionan las funciones auxiliares se pueden obtener a partir de fuentes naturales, tales como del genoma de una partmula de adenovirus, o construidas usando metodos recombinantes o sinteticos conocidos en la tecnica. Ademas, el complemento completo de genes de adenovirus no es necesario para las funciones auxiliares accesorias. De hecho, se ha mostrado que los mutantes de adenovirus incapaces de replicacion de ADN y smtesis tardfa de genes se pueden permitir para la replicacion de AAV. Ito et al., (1970) J. Gen. Virol. 9: 243; Ishibashi et al., (1971) Virology 45: 317; y Carter et al., (1983) Virology 126: 505. Por ejemplo, los informes muestran que las regiones E1A y e4 son probablemente necesarias para la replicacion de AAV, ya sea directa o indirectamente. Laughlin et al., (1982) J. Virol 41: 868; Janik et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1925; Carter et al., (1983) Virology 126: 505. Ademas, Publicacion Internacional N.°WO 97/17458 y Matshushita et al., (1998) Gene Therapy 5: 938 945, describen vectores de funcion auxiliar que codifican diversos genes adenovmcos.
La infeccion de la hospedadora con un virus auxiliar, o transfeccion de la celula hospedadora con un vector de funcion auxiliar, permite la expresion de las funciones auxiliares que transactivan la construccion auxiliar de AAV para producir protemas Rep y/o Cap de AAV. Los productos de expresion de Rep, a su vez escinden el ADN recombinante (incluyendo el ADN de interes, por ejemplo, SERCA2) del vector de expresion de AAV. Las protemas Rep tambien sirven para duplicar el genoma del AAV. Las protemas Cap expresadas se ensamblan en capsides y el genoma del AAV recombinante se empaqueta en las capsides, la replicacion de AAV avanza y el ADN se empaqueta en viriones de rAAV.
Despues de la replicacion de AAV recombinante, los viriones de rAAV se pueden purificar a partir de la celula hospedadora usando una diversidad de metodos de purificacion convencionales, tales como cromatograffa en
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columna, gradientes de CsCI, y similares. Por ejemplo, se puede usar una pluralidad de etapas de purificacion en columna, tales como purificacion sobre una columna de intercambio anionico, una columna de afinidad y/o Una columna de intercambio cationico. Vease, por ejemplo, la Publicacion Internacional N.° WO 02/12455. Ademas, si la infeccion se emplea para expresar las funciones auxiliares, el virus auxiliar residual sector inactivar usando metodos conocidos. Por ejemplo, el adenovirus se puede inactivar calentando a temperaturas de aproximadamente 60 °C durante, por ejemplo, 20 minutos o mas. Este tratamiento inactiva de forma eficaz solamente al virus auxiliar ya que el AAV es extremadamente estable al calor mientras que el adenovirus auxiliar es termolabil.
Los viriones de rAAV resultantes que contienen la secuencia de nucleotidos de SERCA2a de interes, o fragmento, o fragmento funcional, o porcion del mismo se pueden usar a continuacion para administracion genetica usando las tecnicas que se describen a continuacion.
Los viriones de rAAV recombinantes se puede introducir en celulas de musculo liso usando cualquier tecnica de transduccion in vivo o in vitro (tambien denominado ex vivo). Si se transduce in vitro, la celula receptora deseada, preferentemente una celula muscular, se retirara del sujeto, se transducira con viriones de rAAV y se volvera a introducir en el sujeto. Como alternativa, se pueden usar celulas singeneicas o xenogeneicas en las que esas celulas no generaran una respuesta inmunologica inapropiada en el sujeto.
Se han descrito metodos adecuados para la administracion e introduccion de celulas transducidas en un sujeto. Por ejemplo, las celulas se pueden transducir in vitro combinando viriones de AAV recombinante (rAAV) con celulas a transducir en medios apropiados, y aquellas celulas que albergan el ADN de interes se pueden identificar sistematicamente utilizando tecnicas convencionales tales como transferencias de Southern y/o PCR, o usando marcadores seleccionables. A continuacion, las celulas transducidas se pueden formular en composiciones farmaceuticas, como se ha descrito anteriormente, y la composicion se puede introducir en el sujeto mediante diversas tecnicas tal como se describe a continuacion, en una o mas dosis.
Los viriones de AAV recombinante (rAAV) o celulas transducidas in vitro se pueden administrar directamente al musculo por inyeccion con una aguja, cateter o dispositivo relacionado, usando tecnicas conocidas en la materia. Para la administracion in vivo, los viriones de rAAV se formularan en composiciones farmaceuticas y una o mas dosificaciones se pueden administrar directamente de la manera indicada. Una dosis terapeuticamente eficaz se incluira del orden de aproximadamente 108/kg a 1016/kg de los viriones de rAAV, mas preferentemente de 1010/kg a 1014/kg, e incluso mas preferentemente de aproximadamente 1011/kg a 1013/kg de los viriones de rAAV (o genomas vmcos, tambien denominados "vg" o "v.g."), o cualquier valor dentro de estos intervalos.
Un modo de administracion de viriones de AAV recombinante usa un sistema de administracion potenciado por conveccion (CED). De esta manera, los viriones recombinantes se pueden administrar a muchas celulas sobre grandes areas de musculo. Ademas, los vectores suministrados expresan de forma eficaz transgenes en celulas musculares. Cualquier dispositivo de administracion potenciado por conveccion puede ser apropiado para la administracion de vectores vmcos. En una realizacion preferente, el dispositivo es una bomba osmotica o una bomba de infusion. Tanto las bombas osmoticas como las de infusion estan disponibles en el mercado en una diversidad de proveedores, por ejemplo Alzet Corporation, Hamilton Corporation, Alza, Inc., Palo Alto, Calif.). Por lo general, un vector vmco se administra a traves de dispositivos CED como sigue a continuacion. Un cateter, canula u otro dispositivo de inyeccion se inserta en el tejido muscular apropiado en el sujeto elegido, tal como musculo esqueletico. Para una descripcion detallada con respecto a la administracion con CED, vease el documento de Patente de Estados Unidos N.° 6.309.634.
Aunque en el presente documento se describe un metodo de perfusion, se dispone de diversos metodos de perfusion y son convencionales en la tecnica, y sin quedar relacionado con un metodo cualquiera, se preve cualquier metodo de perfusion que de el resultado deseado, tal como un metodo que utiliza un cateter. El objetivo de los metodos de perfusion es aumentar el tiempo de contacto entre el vector (por ejemplo, vectores de adenovirus, AAV, lentivirus) y las celulas diana (por ejemplo, celulas de musculo liso). Por lo tanto, la invencion incluye metodos de perfusion tales como metodos de perfusion en circuito cerrado realizados a temperatura corporal, y en condiciones definidas, por ejemplo, 37 °C, durante aproximadamente 2, 5, 10, 12, 15, 30, 60 o mas minutos, en animales superiores o seres humanos durante aproximadamente 2, 4, 6, 8, 10, 12 o mas horas, permitiendo la entrada vmca en las celulas diana y crear condiciones optimas para expresion genetica y smtesis de protemas. Por esta razon, se pueden anadir diversos excipientes, aminoacidos naturales y no naturales, factores de crecimiento y similares para proporcionar material suficiente para la smtesis de protemas.
Para determinar la eficacia en los modelos animales que recibieron las composiciones de AAV-SERCA2 o AAV- SERCA2a, el efecto sobre la presion de la arteria pulmonar y la funcion cardiaca se puede determinar usando un sistema de medicion del volumen de presion despues de la inyeccion, por ejemplo, una semana o un mes despues de la inyeccion. Las mediciones repetidas se pueden continuar con el fin de supervisar los efectos a corto y largo plazo y la eficacia de la terapia. Por ejemplo, si despues de una semana se considera que los resultados no son significativos, entonces se pueden realizar nuevos ensayos usando dosificaciones mas altas (o mas bajas), o dosificaciones multiples.
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Se pueden realizar estudios para determinar la expresion genetica que incluyen la eliminacion de tejidos pulmonares que reciben la perfusion, asf como los tejidos circundantes y/o de control. Los tejidos se pueden procesar por via histologica con metodos convencionales en la tecnica, por ejemplo, metodos de fijacion, metodos de vibratomo o corte, etc. Por ejemplo, para estudiar la expresion genetica de SERCA2 o SERCA2a u otras isoformas de SERCA2, se puede realizar inmunohistoqmmica usando un SERCA2 o polinucleotidos o anticuerpos de SERCA2a que son inmunogenicos contra SERCA2 o polipeptidos de SERCA2. Ademas, para aquellos animales que reciben las composiciones de AAV-GFP, la expresion de GFP en los tejidos se puede medir usando microscopfa de fluorescencia o cualquier otro metodo convencional en la materia que pueda medir y detectar fluorescencia.
La presente invencion se describe mas particularmente en los siguientes ejemplos que se pretende que sean solamente ilustrativos ya que numerosas modificaciones y variaciones en los mismos eran evidentes para los expertos en la materia. Se pretende que los siguientes ejemplos ilustren pero que no limiten la invencion.
EJEMPLO 1
La transferencia genetica (introduccion de genes exogenos usando vector vmco o no vmco) usando virus adeno- asociado (AAV: tipo de virus) se conoce bien por su seguridad y capacidad para expresar genes exogenos durante un largo periodo de tiempo. La sobreexpresion de SERCA2a usando adenovirus mostro que gritaba la remodelacion de celulas del musculo liso en la arteria coronaria y aumentada la relajacion y produccion de eNOS, que es un vasodilatador bien conocido. (Hadri L, Circ Res 2007; 101: E65-E65). Como tal, se plantea la hipotesis de que la sobreexpresion de SERCA2a en la arteria pulmonar usando un virus adeno-asociado previene la remodelacion de celulas de musculo liso en la arteria pulmonar y la produccion de eNOS para disminuir la vasoconstriccion.
El experimento se realiza sobre el control y la hipertension pulmonar, asf como la hipertension pulmonar con terapia genetica o inyeccion de virus de control, mide la contractilidad cardiaca y hemodinamica, incluyendo la resistencia arterial pulmonar y la resistencia arterial sistemica. La PAH inducida por monocrotalina (MCT) es un modelo de PAH clmicamente relevante y facil de realizar en ratas.
La hipertension pulmonar se indujo en las ratas Sprague-Dawley macho (intervalo de peso de 250-300 g) mediante inyeccion subcutanea de monocrotalina (MCT), que se disolvera en HCl 0,1 N y se neutralizara con NaOH 1 N (pH = 7,4) y se administrara a una dosis de 50 mg/kg. Al mismo tiempo, AAV1.SERCA2a se administro a traves de un cateter dentro del tubo traqueal en el pulmon mientras que el animal respiraba de forma espontanea. El efecto en la presion arterial pulmonar y la funcion cardiaca se determino un mes despues con un sistema de medicion de presion-volumen. El tampon HN se usara para el control de MCT, y la solucion salina se usara para el control de AAV.
El control (n = 8) y los grupos de tratamiento (n = 8) eran comparables en su peso corporal en la medida inicial. La transfeccion eficaz se confirmo con inmunohistoqmmica. El cateterismo de la arteria pulmonar y del ventnculo derecho mostraba una presion significativamente mayor en los animales tratados (4,9 ± 0,5 kPa con respecto a 6,1 ± 0,6 kPa, P < 0,05) (veanse las Figuras 1A-1D) asf como las presiones diastolicas ventriculares (0,4 ± 0,1 kPa con respecto a 0,6 ± 0,2 kPa, P < 0,05). Las presiones del ventnculo izquierdo permanecieron sin cambios (sistolica: 12,6 ± 0,8 kPa con respecto a 13,5 ± 0,7 kPa) asf como dP/dtMax (769,9 ± 78,6 kPa con respecto a 853,8 ± 109,2 kPa/s). El peso del ventnculo derecho en el momento del sacrificio al mes se redujo de forma significativa en el grupo de SERCA2a (0,32 ± 0,02 con respecto a 0,39 ± 0,03 g, P < 0,05). El peso del ventnculo izquierdo ajustado al peso corporal no difena entre los grupos.
EJEMPLO 2
Los estudios con animales fueron aprobados por el Comite Institucional para Cuidado y Uso de Animales (IACUC). Todos los procedimientos relacionados con animales se realizaron de acuerdo con las Directrices del IACUC. Las ratas Sprague-Dawley macho (intervalo de peso de 250-300 g) o ratas Wistar (intervalo de peso de 90-150 g) se dividiran en grupos de Inyeccion o Perfusion por el metodo de transfeccion y se subdividiran en 4 subgrupos: Control + Solucion Salina (Grupo de control, n = 4), Control + AAV1. GFP (grupo GFP, n = 4), PH + AAV1.SERCA2a inducido por MCT (grupo de SERCA2a, n = 6) y PH + Solucion Salina inducido por MCT (Grupo de Solucion Salina, n = 6).
Se realizara un estudio adicional en el que los animales se dividen como sigue a continuacion:
(A) Grupo de PAH con MCT con Inyeccion intratraqueal
Grupo de AAV.SERCA2a (n = 40)
Grupo de AAV.eNOS (n = 40)
Grupo de AAV. GFP o beta-gal (n = 40)
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(B) Grupo de PAH con MCT con inyeccion en la vena yugular
Grupo de AAV.SERCA2a (n = 40)
Grupo de AAV.eNOS (n = 40)
Grupo de AAV.GFP o beta-gal (n = 40)
Administracion Intra-Traqueal de AAV - El procedimiento se realiza en ratas Wistar macho (BW = 100 g) o Ratas Sprague-Dawley (BW = 250-300 g). Las ratas reciben anestesia general (isoflurano al 0,5-1,5 % en oxfgeno al 100 % a traves de mascara). Despues de la intubacion endotraqueal, se inicia la ventilacion mecanica. Despues de estabilizar el estado general, se colocara un pequeno cateter de elastomero de silicona a traves del tubo de intubacion y se usara para administrar AAV en los pulmones.
Administracion de AAV en la Vena Yugular - Como se ha mencionado anteriormente, el procedimiento se realiza en ratas Wistar macho de 100 gramos. Sin embargo, en lugar de usar administracion intra-traqueal, el AAV se administrara mediante inyeccion en la vena yugular. El cuello se preparara con alcohol isopropflico al 70 % seguido de providona yodada. Se realizara un corte para exponer la vena yugular y la vena yugular se pinchara con la aguja de calibre 26 G. El AAV (400 jl) se inyectara lentamente en la vena yugular.
Induccion de PAH - Los animales recibiran MCT (40 mg/kg) a traves de inyeccion subcutanea el Dfa 28.
Ecocardiograffa - Los animales recibiran sedacion con 80-100 mg/kg de ketamina IP ya que no hay dolor en este procedimiento, la sedacion solamente se necesita para evitar el artefacto de movimiento y otros agentes anestesicos pueden interferir de forma significativa con el ritmo cardiaco o la contractilidad y la carga cardiaca. La funcion cardiaca se evaluara mediante ecocardiograffa. Desde la pared toracica anterior izquierda, se aplicara una sonda de eco. Se evaluaran la dilatacion de las camaras cardiacas y la disminucion de la contractilidad cardiaca.
Entre las semanas 4 y 12 los animales se supervisaran dos veces a la semana y se evaluaran para detectar signos de insuficiencia cardiaca severa y disnea, tales como 1) actividad alterada, 2) renuencia a moverse, 3) agitacion, 4) disminucion de la ingesta oral, 5) espuma en la boca, 6) sibilancias audibles, 7) ascitis masiva. Si presentan alguno de los signos cffnicos mencionados anteriormente, se sacrificaran. La expresion maxima de una protema exogena se consigue de 6 a 8 semanas despues de la administracion de AAV. El mCT-PAH se desarrolla completamente de 3 a 4 semanas despues de la inyeccion de MCT. Como tal, son necesarios al menos 28 dfas para obtener la expresion maxima de protema exogena en el momento en el que la rata inyectada con MCT comienza a presentar smtomas. Ademas, los inventores tienen que esperar de 28 a 56 dfas despues de la inyeccion de MCT para obtener PAH clmicamente significativa.
Medicion hemodinamica usando cateteres Scisense de presion-volumen - La anestesia se induce en una camara de isoflurano y, despues de la induccion, los animales se ventilan con una mezcla de oxfgeno e isoflurano al 2-5 % a traves de un cono en la nariz. Despues de obtener una anestesia profunda estable, los animales se intuban y se administra isoflurano al 2-5 % a traves de ventilacion mecanica, junto con oxfgeno. Se abrira la caja toracica. En el ventriculo izquierdo y derecho se introducira un cateter Scisense de presion-volumen o un cateter Millar. La medicion de la auricula derecha media, arteria pulmonar, auricula izquierda y aorta se realizara con este cateter. El gasto cardiaco se medira al mismo tiempo usando este cateter. Durante las mediciones hemodinamicas, el isoflurano se valorara tanto para mantener la anestesia general como para conseguir una frecuencia cardiaca lo mas cercana posible a las frecuencias cardiacas fisiologicas. A menudo, esto es posible solamente con un 1 % de isoflurano. Al final del procedimiento se pone una canula en la vena yugular izquierda o derecha y se inyectan 50 microlitros de cloruro sodico al 30 % para calibrar los sensores de volumen. Los animales se sacrifican al final del procedimiento; siendo el corazon y los pulmones extirpados quirurgicamente con anestesia general profunda con isoflurano al 5 %. PVR (dinas s cm-5) = (mPAP-mLA)/ CO*80; SVR (dinasscm'5) = (mSAP-mRA)/CO*80.
La supervision del peso corporal despues de la terapia genetica (si fuera aplicable) y la administracion de MCT se produce durante todo el experimento. El peso corporal se mide y se registra antes de cada cirugfa, terapia genetica y antes de cada ecocardiograffa para supervisar el crecimiento y el bienestar de los animales y para tener un mdice del tamano cardiaco
Aunque la presente invencion se ha descrito con referencia a detalles espedficos de ciertas realizaciones de los mismos, se entendera que las modificaciones y variaciones estan incluidas dentro del alcance de la invencion. Por consiguiente, la invencion esta limitada unicamente por las reivindicaciones que siguen a continuacion.

Claims (14)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un vector de expresion vmco adeno-asociado (AAV) para su uso en el tratamiento de hipertension pulmonar, que comprende un transgen de calcio++ ATPasa del retmulo sarcoplasmatico (SR) (SERCA), en el que el transgen es la isoforma 2a de SERCA (SERCA2a) y modula al transporte de iones Ca2+, y en el que la expresion del transgen aumenta la funcion de la celula hospedadora en un sujeto.
  2. 2. El vector para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que las celulas hospedadoras estan asociadas a la funcion pulmonar.
  3. 3. El vector para su uso de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que las celulas hospedadoras se seleccionan entre el grupo que consiste en celulas musculares de la arteria pulmonar, celulas musculares de la vena pulmonar, celulas musculares de capilar pulmonar, arteriolas pulmonares, alveolos, y celulas de musculo liso vascular.
  4. 4. El vector para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, 2 o 3, en el que el vector es de serotipo 1 (AAV1), serotipo 2 (aAv2) o serotipo 8 (AAV8).
  5. 5. El vector para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el tratamiento disminuye la presion sangumea en la arteria pulmonar o la vena pulmonar, da como resultado una disminucion de la presion sistolica y la presion diastolica ventricular, mejora la remodelacion vascular pulmonar, disminuye la proliferacion de celulas del musculo liso vascular, o aumenta la produccion de eNOS a partir de celulas endoteliales.
  6. 6. El vector para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el sujeto es un mairnfero.
  7. 7. El vector para su uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que el marnffero es un ser humano.
  8. 8. El vector para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 6, en el que el vector se administra mediante un metodo seleccionado entre el grupo que consiste en pulverizacion intranasal, inhalacion y administracion por aerosol.
  9. 9. El vector para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, 6 y 7, en el que el vector se administra en forma de una micropartmula.
  10. 10. Un virion de virus adeno-asociado (AAV) recombinante para su uso en el tratamiento de hipertension pulmonar, en el que (a) el virion comprende un vector AAV que comprende un transgen unido de forma operativa a elementos de control que dirigen la expresion del transgen en una celula hospedadora, (b) la expresion del transgen mejora la funcion pulmonar, y (c) el transgen es la isoforma 2a (SERCA2a) de calcio++ ATPasa (SERCA) del retmulo sarcoplasmatico (SR).
  11. 11. Un virion de AAV recombinante (rAAV) para su uso en el tratamiento de hipertension pulmonar, rAAV que comprende un polinucleotido que codifica una protema, en el que (a) el polinucleotido esta unido de forma operativa a un elemento de control capaz de dirigir la expresion de la protema, (b) el virion rAAV se administra directamente en una celula muscular pulmonar de un sujeto mamffero, (c) la protema es la isoforma 2a (SERCA2a) de calcio++ ATPasa del retmulo sarcoplasmatico (SR) y (d) la protema se expresa a un nivel terapeuticamente eficaz en la celula muscular.
  12. 12. El virion de AAV recombinante para su uso de acuerdo con la reivindicacion 11, en el que el sujeto es un ser humano.
  13. 13. El virion de AAV recombinante para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en el que el virion se administra mediante un metodo seleccionado entre el grupo que consiste en pulverizacion intranasal, inhalacion y administracion por aerosol.
  14. 14. El virion de AAV recombinante para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10-13, en el que el virion se administra en forma de una micropartmula.
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