ES2907768T3 - Micropéptidos y su utilización para la modulación de la expresión de genes - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulada por un microARN en una célula eucariota vegetal, que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación de un miPEP en dicha célula eucariota vegetal y teniendo dicho miPEP: - un tamaño de 3 a 100 aminoácidos, preferentemente de 4 a 20 aminoácidos, y - una secuencia peptídica idéntica a la codificada por una secuencia de nucleótidos contenida en la transcripción primaria de un microARN que regula la expresión de dicho gen, y - que es capaz de modular la acumulación de dicho microARN, en el que, la acumulación de dicho miPEP en dicha célula eucariota vegetal induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho miPEP.

Description

DESCRIPCIÓN
Micropéptidos y su utilización para la modulación de la expresión de genes
La presente invención se refiere a micropéptidos (péptidos codificados por microARN o "miPEP") y su utilización para la modulación de la expresión de genes.
Los microARN (miR) son pequeños ARN no codificantes, de aproximadamente 21 nucleótidos después de la maduración, que controlan la expresión de genes diana a nivel postranscripcional, degradando el ARNm diana o inhibiendo su traducción. Los miR se encuentran en las plantas y los animales.
Los genes diana están seguidos de genes clave en los procesos del desarrollo. Codifican por ejemplo los factores de transcripción o las proteínas del proteasoma.
La regulación de la expresión de los miR es muy poco conocida, pero se sabe principalmente que puede intervenir, del mismo modo que en la mayoría de los genes codificantes, una ARN polimerasa II: esta enzima produce una transcripción primaria, denominada "pri-miR", que a continuación madura por un complejo proteico que contiene principalmente enzimas tipo Dicer. Esta maduración conduce en primer lugar a la formación de un precursor de miR denominado "pre-miR', que tiene una estructura secundaria de tallo-bucle que contiene el miR y su secuencia miR* complementaria. Después, el precursor madura, lo que conduce a la formación de un ARN bicatenario más corto que contiene el miR y el miR*. Entonces el complejo RISC se hace cargo del miR que escinde el ARN del gen diana o bien inhibe su traducción.
Por otra parte, se ha demostrado que la presencia de intrones en la transcripción primaria del microARN aumenta la expresión del microARN maduro (Schwab y col., EMBO Rep., 14(7):615-21, 2013). Sin embargo, debido a las dificultades experimentales, las transcripciones primarias de los microARN, o pri-miR están poco estudiadas.
Aproximadamente un 50 % de los genes de eucariotas poseen, en el seno de su región UTR 5' (Región no Traducida 5') corriente arriba de la secuencia codificante, pequeñas fases de lectura abierta. Estas pequeñas fases de lectura abierta (o "uORF" del inglés upstream, corriente arriba), pueden tener un papel regulador de la traducción, principalmente en cis, modulando la fijación y la velocidad de los ribosomas sobre el ARNm, pero igualmente en trans según un mecanismo aún desconocido, por medio de péptidos codificados por dichas uORF (Combier y col., Gene Dev, 22:1549-1559, 2008). Por definición, las uORF están presentes corriente arriba de los genes codificantes. Recientemente, se han descubierto igualmente pequeñas ORF en los ARN largos intergénicos no codificantes (lincARN) de las que su supuesta función, si es que existe, no se conoce (Ingolia y col., Cell, 147(4):789-802, 2011; Guttman & Rinn, Nature, 482(7385):339-46, 2012). Sin embargo, no se ha expuesto ningún ejemplo con respecto a la existencia de ORF que codifiquen péptidos en el seno de microARN no codificantes. Hasta el presente, los microARN, y por extensión su transcripción primaria, siempre se han considerado, por su modo de acción particular, como ARN reguladores no codificantes que no producen ningún péptido.
Uno de los aspectos de la invención es proporcionar péptidos capaces de modular la expresión de los microARN.
Otro aspecto de la invención es proporcionar un medio que permita modular la expresión de uno o varios genes diana de un microARN.
La presente invención presenta la ventaja de permitir un control más fácil y eficaz de la expresión de genes diana por los microARN, con ayuda de un medio distinto del microARN.
También se describe un procedimiento de detección e identificación de un micropéptido (miPEP) codificado por una secuencia de nucleótidos contenida en la secuencia de la transcripción primaria de un microARN, que comprende:
- a) una etapa de detección de una fase de lectura abierta de 12 a 303 nucleótidos contenida en la secuencia de la transcripción primaria de dicho microARN, después
- b) una etapa de comparación entre:
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota determinada que expresa dicho microARN, en presencia de un péptido codificado por una secuencia de nucleótidos idéntica o degenerada con respecto a la de dicha fase de lectura abierta, estando dicho péptido presente en la célula independientemente de la transcripción de la transcripción primaria de dicho microARN, y
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada que expresa dicho microARN,
en ausencia de dicho péptido,
en el que, una modulación de la acumulación de dicho microARN en presencia de dicho péptido con respecto a la acumulación de dicho microARN en ausencia de dicho péptido indica la existencia de un micropéptido codificado por dicha fase de lectura abierta.
En particular se describe un procedimiento de detección e identificación de un micropéptido (miPEP) codificado por una secuencia de nucleótidos contenida en la secuencia de la transcripción primaria de un microARN, que comprende: - a) una etapa de detección de una fase de lectura abierta de 15 a 303 nucleótidos contenida en la secuencia de la transcripción primaria de dicho microARN, después
- b) una etapa de comparación entre:
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota determinada que expresa dicho microARN, en presencia de un péptido codificado por una secuencia de nucleótidos idéntica o degenerada con respecto a la de dicha fase de lectura abierta, estando dicho péptido presente en la célula independientemente de la transcripción de la transcripción primaria de dicho microARN, y
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada que expresa dicho microARN,
en ausencia de dicho péptido,
en el que, una modulación de la acumulación de dicho microARN en presencia de dicho péptido con respecto a la acumulación de dicho microARN en ausencia de dicho péptido indica la existencia de un micropéptido codificado por dicha fase de lectura abierta.
En particular se describe un procedimiento de detección e identificación de un micropéptido (miPEP) codificado por una secuencia de nucleótidos contenida en la secuencia de la transcripción primaria de un microARN,
que comprende:
a) una etapa de detección de una fase de lectura abierta de 15 a 303 nucleótidos o de 12 nucleótidos, contenida en la secuencia de la transcripción primaria de dicho microARN, después
b) una etapa de comparación entre:
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota determinada que expresa dicho microARN, en presencia de un péptido codificado por una secuencia de nucleótidos idéntica o degenerada con respecto a la de dicha fase de lectura abierta, estando dicho péptido presente en la célula independientemente de la transcripción de la transcripción primaria de dicho microARN, y
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada que expresa dicho microARN,
en ausencia de dicho péptido,
en el que, una modulación de la acumulación de dicho microARN en presencia de dicho péptido con respecto a la acumulación de dicho microARN en ausencia de dicho péptido indica la existencia de un micropéptido codificado por dicha fase de lectura abierta.
En particular se describe un procedimiento de detección e identificación de un micropéptido (miPEP) codificado por una secuencia de nucleótidos contenida en la secuencia de la transcripción primaria de un microARN,
que comprende:
a) una etapa de detección de una fase de lectura abierta de 12 nucleótidos contenida en la secuencia de la transcripción primaria de dicho microARN, después
b) una etapa de comparación entre:
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota determinada que expresa dicho microARN, en presencia de un péptido codificado por una secuencia de nucleótidos idéntica o degenerada con respecto a la de dicha fase de lectura abierta, estando dicho péptido presente en la célula independientemente de la transcripción de la transcripción primaria de dicho microARN, y
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada que expresa dicho microARN,
en ausencia de dicho péptido,
en el que, una modulación de la acumulación de dicho microARN en presencia de dicho péptido con respecto a la acumulación de dicho microARN en ausencia de dicho péptido indica la existencia de un micropéptido codificado por dicha fase de lectura abierta.
En una primera etapa, el procedimiento de detección e identificación de un micropéptido consiste por tanto en la detección de la existencia en la transcripción primaria de un microARN de una fase de lectura abierta que codifica potencialmente un péptido.
La segunda etapa permite, por su parte, caracterizar dicho péptido, es decir, determinar si dicho péptido corresponde realmente a un péptido producido por la célula, investigando un efecto de dicho péptido sobre la acumulación de dicho microARN.
Para poner en evidencia un efecto del péptido sobre la acumulación del microARN, se introduce una cantidad importante de péptido en una primera célula que expresa dicho microARN. Después, la acumulación del microARN en esta primera célula se mide y se compara con la acumulación del microARN en una segunda célula idéntica a la primera, pero que no contiene dicho péptido.
La observación de una variación de las cantidades de microARN entre las células en presencia y ausencia del péptido indica también (i) que existe un péptido codificado por la transcripción primaria de dicho microARN, (ii) que la secuencia de este péptido está codificada por la fase de lectura abierta identificada en la transcripción primaria de dicho microARN, y (iii) que dicho péptido actúa sobre la acumulación de dicho microARN.
La invención se basa en la doble observación inesperada hecha por los inventores de que, por una parte, existen fases de lectura abierta que puedan codificar los micropéptidos presentes en las transcripciones primarias de microARN, y por otra parte que dichos micropéptidos son capaces de modular la acumulación de dichos microARN.
En particular, se describe un procedimiento de detección e identificación de un micropéptido (miPEP) codificado por una secuencia de nucleótidos contenida en la secuencia de la transcripción primaria de un microARN, que comprende:
- a) una etapa de detección de una fase de lectura abierta de 15 a 303 nucleótidos contenida en la secuencia de la transcripción primaria de dicho microARN, después
- b) una etapa de comparación entre:
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota determinada que expresa la transcripción primaria de dicho microARN,
en presencia de un péptido codificado por una secuencia de nucleótidos idéntica o degenerada con respecto a la de dicha fase de lectura abierta, estando dicho péptido presente en la célula independientemente de la transcripción de la transcripción primaria de dicho microARN, y
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada que expresa la transcripción primaria de dicho microARN, en ausencia de dicho péptido,
en el que, una modulación de la acumulación de dicho microARN en presencia de dicho péptido con respecto a la acumulación de dicho microARN en ausencia de dicho péptido indica la existencia de un micropéptido codificado por dicha fase de lectura abierta.
En particular, se describe un procedimiento de detección e identificación de un micropéptido (miPEP) codificado por una secuencia de nucleótidos contenida en la secuencia de la transcripción primaria de un microARN,
que comprende:
a) una etapa de detección de una fase de lectura abierta de 15 a 303 nucleótidos o de 12 nucleótidos, contenida en la secuencia de la transcripción primaria de dicho microARN, después
b) una etapa de comparación entre:
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota determinada que expresa la transcripción primaria de dicho microARN,
en presencia de un péptido codificado por una secuencia de nucleótidos idéntica o degenerada con respecto a la de dicha fase de lectura abierta, estando dicho péptido presente en la célula independientemente de la transcripción de la transcripción primaria de dicho microARN, y
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada que expresa la transcripción primaria de dicho microARN, en ausencia de dicho péptido,
en el que, una modulación de la acumulación de dicho microARN en presencia de dicho péptido con respecto a la acumulación de dicho microARN en ausencia de dicho péptido indica la existencia de un micropéptido codificado por dicha fase de lectura abierta.
En particular, se describe un procedimiento de detección e identificación de un micropéptido (miPEP) codificado por una secuencia de nucleótidos contenida en la secuencia de la transcripción primaria de un microARN,
que comprende:
a) una etapa de detección de una fase de lectura abierta de 12 nucleótidos contenida en la secuencia de la transcripción primaria de dicho microARN, después
b) una etapa de comparación entre:
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota determinada que expresa la transcripción primaria de dicho microARN,
en presencia de un péptido codificado por una secuencia de nucleótidos idéntica o degenerada con respecto a la de dicha fase de lectura abierta, estando dicho péptido presente en la célula independientemente de la transcripción de la transcripción primaria de dicho microARN, y
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada que expresa la transcripción primaria de dicho microARN,
en ausencia de dicho péptido,
en el que, una modulación de la acumulación de dicho microARN en presencia de dicho péptido con respecto a la acumulación de dicho microARN en ausencia de dicho péptido indica la existencia de un micropéptido codificado por dicha fase de lectura abierta.
En la invención, las expresiones "microARN", "microARN no codificante" y "miR" son equivalentes y pueden utilizarse indistintamente. Definen pequeñas moléculas de ARN de aproximadamente 21 nucleótidos, que no se traducen y no dan lugar a un péptido o una proteína.
Sin embargo, bajo esta forma madura, los microARN aseguran una función de regulación de ciertos genes mediante mecanismos postranscripcionales, como por ejemplo, por la intervención del complejo RISC.
La transcripción primaria del microARN o "pri-miR" corresponde a la de la molécula de ARN obtenida directamente de la transcripción de la molécula de ADN. Generalmente, esta transcripción primaria se somete a una o más modificaciones postranscripcionales, que dan lugar, por ejemplo, a una estructura particular del ARN o a una escisión de ciertas partes del ARN por fenómenos de corte y empalme, y que conducen a la forma precursora del microARN o "pre-miR", y después a la forma madura del microARN o "miR".
Los términos "micropéptidos" y "miPEP' (PÉPtidos codificados por microARN) son equivalentes y pueden utilizarse indistintamente. Definen un péptido que está codificado por una fase de lectura abierta presente en la transcripción primaria de un microARN, y que es capaz de modular la acumulación de dicho microARN. Los micropéptidos de acuerdo con la presente invención no se deben considerar como que son necesariamente péptidos de tamaño pequeño, de manera que "micro" no se corresponde con el tamaño del péptido.
Según la invención, un miPEP puede considerarse un modulador de la transcripción, y principalmente un activador transcripcional. Dicho modulador de la transcripción puede actuar a nivel de la transcripción para modular la acumulación de pri-miR, de pre-miR y de miR. Teniendo en cuenta la degeneración del código genético, un mismo micropéptido puede estar codificado por varias secuencias de nucleótidos. Dichas secuencias de nucleótidos, diferentes entre ellas al menos en un nucleótido pero que codifican un mismo péptido, se llaman "secuencias degeneradas".
Las expresiones "fase de lectura abierta" u "ORF ' (por las siglas del inglés open reading frame) son equivalentes y pueden utilizarse indistintamente. Se corresponden con una secuencia de nucleótidos en una molécula de ADN o ARN que pueden potencialmente codificar un péptido o una proteína: dicha fase de lectura abierta comienza con un codón de inicio (el codón de inicio codifica generalmente una metionina), seguido por una serie de codones (cada codón codifica un aminoácido) y se termina con un codón de parada (el codón de parada no se traduce).
En la invención, las ORF pueden ser denominadas de manera específica "miORF ' cuando están presentes en las transcripciones primarias de microARN.
Las miORF como se definen en la invención particular pueden tener un tamaño de 12 a 303 nucleótidos y codificar péptidos de 3 a 100 aminoácidos.
En particular, las miORF como se definen en la invención pueden tener un tamaño de 15 a 303 nucleótidos. Como un aminoácido está codificado por un codón de 3 nucleótidos, las miORF de 15 a 303 nucleótidos codifican miPEP de 4 a 100 aminoácidos.
En particular, las miORF tienen un tamaño de:
15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 47, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 138, 141, 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258, 261, 264, 267, 270, 273, 276, 279, 282, 285, 288, 291, 294, 297, 300 o 303 nucleótidos, y codifican respectivamente miPEP que tienen un tamaño de: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 aminoácidos.
En la invención, por "acumulación", se entiende la producción de una molécula, tal como un microARN o un micropéptido, en la célula.
De esta manera, la "modulación" de la acumulación de una molécula en una célula corresponde a una modificación de la cantidad de dicha molécula presente en la célula.
Por otra parte, el efecto de un miPEP puede observarse mediante la modulación de la acumulación del miR, pero también a través de la modulación de la acumulación del pri-miR o del pre-miR correspondiente.
En una realización, se describe un procedimiento de detección e identificación de un miPEP como se ha definido anteriormente, en el que la modulación de la acumulación de dicho microARN es una disminución o un aumento de la acumulación de dicho microARN, en particular un aumento.
Una "disminución de la acumulación" corresponde a una bajada de la cantidad de dicha molécula en la célula.
Por el contrario, un "aumento de la acumulación" corresponde a una subida de la cantidad de dicha molécula en la célula.
En una realización ventajosa, se describe un procedimiento de detección e identificación de un miPEP como se ha definido anteriormente, en el que la modulación de la acumulación de dicho microARN es un aumento de la acumulación de dicho microARN. En una realización, la invención se refiere a un procedimiento de detección e identificación de un miPEP como se ha definido anteriormente, en el que la presencia de dicho péptido en la célula es el resultado de:
- la introducción en la célula de un ácido nucleico que codifica dicho péptido, o
- la introducción en la célula de dicho péptido.
Para caracterizar un miPEP, es necesario disponer de un modelo celular que exprese un microARN y en el que dicho péptido a ensayar esté presente. Para esto, es posible introducir un péptido en la célula, poniendo la célula en contacto con dicho péptido, o introduciendo en la célula un ácido nucleico que codifique dicho péptido, de manera que el ácido nucleico se traduzca entonces en un péptido en el interior de la célula.
En una realización, se describe un procedimiento de detección e identificación de un miPEP como se ha definido anteriormente, en el que dicha fase de lectura abierta de la etapa a) está contenida en la parte 5' o 3' de dicha transcripción primaria de microARN, preferentemente en la parte 5'.
Las partes 5' o 3' de la transcripción primaria del microARN se corresponden con las partes terminales de la molécula del ARN que son escindidas en el curso de la maduración del microARN.
En una realización, se describe un procedimiento de detección e identificación de un miPEP como se ha definido anteriormente, en el que dicho microARN está presente en una célula vegetal natural.
Una célula vegetal natural corresponde a una célula vegetal que no ha sido modificada genéticamente por el hombre.
En una realización, se describe un procedimiento de detección e identificación de un miPEP como se ha definido anteriormente, en el que dicho microARN está presente en una célula animal natural, y principalmente una célula humana natural o una célula de drosófila natural.
Una célula animal natural corresponde a una célula animal, y principalmente humana, que no ha sido modificada genéticamente por el hombre.
En una realización, se describe un procedimiento de detección e identificación de un miPEP como se ha definido anteriormente, en el que dicha célula eucariota determinada y dicha célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada, que se utilizan en la etapa b, son células vegetales de una planta crucífera tal como Arabidopsis thaliana, de una planta leguminosa tal como Glycine max (soja), Medicago truncatula y Medicago sativa (alfalfa) o de una planta solanácea tal como Nicotiana benthamiana (tabaco), Solanum tuberosum (patata), Solanum lycopersicum (tomate) o Solanum melongena (berenjena).
En una realización, se describe un procedimiento de detección e identificación de un miPEP como se ha definido anteriormente, en el que dicha célula eucariota determinada y dicha célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada, que se utilizan en la etapa b, son células vegetales, preferentemente células de Medicago truncatula, de Nicotiana benthamiana o de Arabidopsis thaliana.
En una realización, se describe un procedimiento de detección e identificación de un miPEP como se ha definido anteriormente, en el que dicha célula eucariota determinada y dicha célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada, que se utilizan en la etapa b, son células animales, preferentemente células humanas o de drosófila. En el procedimiento de detección e identificación de un micropéptido como se ha definido anteriormente, después de haber identificado una ORF que pueda codificar un péptido en la transcripción primaria de un microARN, es necesario proporcionar un modelo celular que posea dicho microARN y dicho péptido, para poder demostrar un eventual efecto del péptido sobre dicho microARN. Por lo tanto, se pueden prever dos opciones:
- el modelo celular en el que se ha identificado la miORF y en el que se ha puesto en evidencia el efecto del péptido sobre el miR son idénticos, o
- el modelo celular en el que se ha identificado la miORF y en el que se ha puesto en evidencia el efecto del péptido sobre el miR son diferentes.
En la primera opción, el modelo celular que se utiliza para observar un efecto del péptido es el mismo que en el que se aísla la transcripción primaria de dicho microARN. En este modelo celular, las células eucariotas determinadas contienen naturalmente dicho microARN y solo se debe introducir el péptido a ensayar en estas células. En este contexto, dicho microARN se califica como de "origen endógeno" ya que existe naturalmente en las células. No obstante, en una célula, pueden añadirse otras copias de un microARN de origen endógeno, como por ejemplo, introduciendo en la célula un vector que codifique dicho microARN de origen endógeno.
En la segunda opción, el modelo celular que se utiliza para observar un efecto del péptido es diferente del que se aísla la transcripción primaria de dicho microARN. En este modelo celular, las células eucariotas determinadas no contienen ni el microARN, ni el péptido a ensayar. Estos dos elementos deberán introducirse entonces en esas células. En este contexto, dicho microARN se califica como de "origen exógeno" ya que no existe naturalmente en las células.
En una realización, se describe un procedimiento de detección e identificación de un miPEP como se ha definido anteriormente, en el que dicho microARN es de origen endógeno en dicha célula eucariota y en dicha célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada, que se utilizan en la etapa b).
En una realización, se describe un procedimiento de detección e identificación de un miPEP como se ha definido anteriormente, en el que dicho microARN es de origen exógeno en dicha célula eucariota y en dicha célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada, que se utilizan en la etapa b), conteniendo dichas células un vector que permite la expresión de dicho microARN.
En una realización, se describe un procedimiento de detección e identificación de un miPEP como se ha definido anteriormente, en el que la acumulación de dicho microARN se determina llevando a cabo una RT-PCR cuantitativa o una transferencia de Northern.
En una realización, se describe un procedimiento de detección e identificación de un miPEP como se ha definido anteriormente, en el que la acumulación de dicho microARN se determina llevando a cabo un chip de ADN o ARN.
La acumulación de dicho microARN puede determinarse con la ayuda de técnicas de biología molecular que permiten la dosificación de moléculas de ácido nucleico específicas.
En otro aspecto, también se describe un procedimiento de detección e identificación de un microARN cuya secuencia de transcripción primaria contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un miPEP,
que comprende:
- a) una etapa de detección de una fase de lectura abierta de 15 a 303 nucleótidos contenida en la secuencia de la transcripción primaria de dicho microARN, después
- b) una etapa de comparación entre:
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota determinada que expresa dicho microARN, en presencia de un péptido codificado por una secuencia de nucleótidos idéntica o degenerada con respecto a la de dicha fase de lectura abierta, estando dicho péptido presente en la célula independientemente de la transcripción de la transcripción primaria de dicho microARN, y
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota, que expresa dicho microARN,
en ausencia de dicho péptido,
en el que, una modulación de la acumulación de dicho microARN en presencia de dicho péptido con respecto a la acumulación de dicho microARN en ausencia de dicho péptido indica la existencia de un microARN en el que la transcripción primaria contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un micropéptido.
En particular, se describe un procedimiento de detección e identificación de un microARN cuya secuencia de transcripción primaria contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un miPEP, que comprende:
- a) una etapa de detección de una fase de lectura abierta de 15 a 303 nucleótidos contenida en la secuencia de la transcripción primaria de dicho microARN, después
- b) una etapa de comparación entre:
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota determinada que expresa la transcripción primaria de dicho microARN,
en presencia de un péptido codificado por una secuencia de nucleótidos idéntica o degenerada con respecto a la de dicha fase de lectura abierta, estando dicho péptido presente en la célula independientemente de la transcripción de la transcripción primaria de dicho microARN, y
• la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota, del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada que expresa la transcripción primaria de dicho microARN, en ausencia de dicho péptido,
en el que, una modulación de la acumulación de dicho microARN en presencia de dicho péptido con respecto a la acumulación de dicho microARN en ausencia de dicho péptido indica la existencia de un microARN en el que la transcripción primaria contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un micropéptido.
En una realización, se describe un procedimiento de detección e identificación de un microARN como se ha definido anteriormente, en el que la modulación de la acumulación de dicho microARN es una disminución o un aumento de la acumulación de dicho microARN, en particular un aumento.
En una realización, se describe un procedimiento de detección e identificación de un microARN como se ha definido anteriormente, en el que la presencia de dicho péptido en la célula es el resultado de:
- la introducción en la célula de un ácido nucleico que codifica dicho péptido, o
- la introducción en la célula de dicho péptido.
En una realización, se describe un procedimiento de detección e identificación de un microARN como se ha definido anteriormente, en el que dicha fase de lectura abierta de la etapa a) está contenida en la parte 5' o 3' de dicha transcripción primaria de microARN, preferentemente en la parte 5'.
En una realización, se describe un procedimiento de detección e identificación de un microARN como se ha definido anteriormente, en el que dicho microARN está presente en una célula vegetal natural.
En una realización, se describe un procedimiento de detección e identificación de un microARN como se ha definido anteriormente, en el que dicho microARN está presente en una célula animal, y principalmente humana, natural.
En una realización, se describe un procedimiento de detección e identificación de un microARN como se ha definido anteriormente, en el que dicha célula eucariota y dicha célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada, que se utilizan en la etapa b), son células vegetales, preferentemente células de Medicago truncatula.
En una realización, se describe un procedimiento de detección e identificación de un microARN como se ha definido anteriormente, en el que dicha célula eucariota y dicha célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada, que se utilizan en la etapa b), son células animales, preferentemente células de drosófila.
En una realización, se describe un procedimiento de detección e identificación de un microARN como se ha definido anteriormente, en el que dicho microARN es de origen endógeno en dicha célula eucariota y en dicha célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada, que se utilizan en la etapa b).
En una realización, se describe un procedimiento de detección e identificación de un microARN como se ha definido anteriormente, en el que dicho microARN es de origen exógeno en dicha célula eucariota y en dicha célula eucariota del mismo tipo que dicha célula eucariota determinada, que se utilizan en la etapa b), conteniendo dichas células un vector que permite la expresión de dicho microARN.
En una realización, se describe un procedimiento de detección e identificación de un microARN como se ha definido anteriormente, en el que la acumulación de dicho microARN se determina llevando a cabo una RT-PCR cuantitativa o una transferencia de Northern.
En una realización, se describe un procedimiento de detección e identificación de un microARN como se ha definido anteriormente, en el que la acumulación de dicho microARN se determina llevando a cabo un chip de ADN o ARN.
En otro aspecto, se describe un miPEP como el obtenido llevando a cabo el procedimiento definido anteriormente.
De manera más particular, se describe un miPEP codificado por una secuencia de nucleótidos como la obtenida llevando a cabo el procedimiento definido anteriormente. En otras palabras, la invención se refiere a un miPEP codificado por una secuencia de nucleótidos detectada e identificada llevando a cabo el procedimiento definido anteriormente.
Otro aspecto también describe un miPEP de 3 a 100 aminoácidos, en particular de 4 a 100 aminoácidos, principalmente de 4 a 60 aminoácidos, preferentemente de 4 a 40 aminoácidos, codificado por una secuencia de nucleótidos contenida en la transcripción primaria de un microARN, siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota.
Otro aspecto también describe un miPEP de 4 a 100 aminoácidos, o de 3 aminoácidos, codificado por una secuencia de nucleótidos contenida en la transcripción primaria de un microARN, siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota.
Otro aspecto también describe un miPEP de 3 aminoácidos, codificado por una secuencia de nucleótidos contenida en la transcripción primaria de un microARN, siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota.
En particular, el miPEP como se define en la invención, está codificado por una miORF de 15 a 303 nucleótidos y un tamaño de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64,
65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95,
96, 97, 98, 99 o 100 aminoácidos, en particular de 5, 8, 10, 18, 19, 23, 37, 50 o 59 aminoácidos.
En particular, el miPEP tiene un tamaño que varía de 4 a 10 aminoácidos, 4 a 20 aminoácidos, 4 a 30 aminoácidos, 4 a 40 aminoácidos, 4 a 50 aminoácidos, 4 a 60 aminoácidos, 4 a 70 aminoácidos, 4 a 80 aminoácidos, 4 a 90 aminoácidos, o 4 a 100 aminoácidos.
Por otra parte, conviene señalar que se pueden identificar varias miORF en la transcripción primaria de un microARN, indicando que una transcripción primaria de microARN puede potencialmente codificar varios miPEP.
Conviene igualmente señalar que el efecto de un miPEP es generalmente específico de un solo microARN, a saber, del que resulta de la transcripción primaria que codifica dicho miPEP.
La modulación del microARN por dicho miPEP puede ponerse en evidencia después de la observación de una variación de las cantidades de microARN entre las células en presencia y ausencia del miPEP.
En una realización, se describe un miPEP como se ha definido anteriormente, estando dicha secuencia de nucleótidos contenida en la parte 5' o 3' de dicha transcripción primaria de un microARN, preferentemente en la parte 5'.
En una realización, se describe un miPEP como se ha definido anteriormente, correspondiendo dicha secuencia de nucleótidos a la primera fase de lectura abierta presente en dicha transcripción primaria de un microARN.
En una realización, se describe un miPEP como se ha definido anteriormente, teniendo dicho miPEP un punto isoeléctrico básico, preferentemente superior a 8.
En una realización, se describe un miPEP como se ha definido anteriormente, teniendo dicho miPEP un punto isoeléctrico ácido.
En una realización, se describe un miPEP como se ha definido anteriormente, seleccionándose dicho miPEP entre el grupo de péptidos que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 375 a SEQ ID NO: 386, y SEQ ID NO: 355 (Tabla 1).
En una realización, se describe un miPEP como se ha definido anteriormente, seleccionándose dicho miPEP entre el grupo de péptidos que consiste en:
- SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 104 y SEQ ID NO: 355,
- SEQ ID NO: 375 a SEQ ID NO: 386, o
- SEQ ID NO: 424.
En una realización se describe un miPEP como se ha definido anteriormente, que consiste en la secuencia de aminoácidos MVT.
En otro aspecto, se describe una molécula de ácido nucleico que codifica un miPEP como se ha definido anteriormente.
En una realización, se describe una molécula de ácido nucleico como se ha definido anteriormente, seleccionándose dicha molécula entre el grupo de ácidos nucleicos que consiste en SEQ ID NO: 105 a SEQ ID NO 208, SEQ ID NO: 387 a SEQ ID NO: 399 y SEQ ID NO: 356 (Tabla 2).
En una realización, se describe una molécula de ácido nucleico como se ha definido anteriormente, seleccionándose dicha molécula entre el grupo de ácidos nucleicos que consiste en:
- SEQ ID NO: 105 a SEQ ID NO: 208 y SEQ ID NO: 356,
- SEQ ID NO: 387 a SEQ ID NO: 399, o
- SEQ ID NO: 425.
En una realización particular, se describe el MtmiPEP171b1 (SEQ ID NO: 59) codificado por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 163) contenida en la transcripción primaria del miR171b (SEQ ID NO: 319), siendo capaz dicho MtmiPEP171b1 de modular la acumulación de dicho miR171b en una célula eucariota.
En una realización particular, se describe el AtmiPEP164a1 (SEQ ID NO: 24) codificado por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 128) contenida en la transcripción primaria del miR164a (SEQ ID NO: 297), siendo capaz dicho AtmiPEP164a1 de modular la acumulación de dicho miR164a en una célula eucariota.
En una realización particular, se describe el AtmiPEP165a (SEQ ID NO: 43) codificado por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 147) contenida en la transcripción primaria del miR165a (SEQ ID NO: 305), siendo capaz dicho miPEP165a de modular la acumulación de dicho miR165a en una célula eucariota.
En una realización particular, se describe el AtmiPEP319a1 (SEQ ID NO: 76) codificado por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 180) contenida en la transcripción primaria del miR319a (SEQ ID NO: 331), siendo capaz dicho AtmiPEP319a1 de modular la acumulación de dicho miR319a en una célula eucariota.
En una realización particular, se describe el AtmiPEP319a2 (SEQ ID NO: 77) codificado por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 181) contenida en la transcripción primaria del miR319a (SEQ ID NO: 331), siendo capaz dicho AtmiPEP319a2 de modular la acumulación de dicho miR319a en una célula eucariota.
En una realización particular, se describe el AtmiPEP160b1 (SEQ ID NO: 14) codificado por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 118) contenida en la transcripción primaria del miR160b (SEQ ID NO: 291), siendo capaz dicho AtmiPEP160b1 de modular la acumulación de dicho miR160b en una célula eucariota.
En una realización particular, se describe el MtmiPEP169d (SEQ ID NO: 424) codificado por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 425) contenida en la transcripción primaria del miR169d (SEQ ID NO: 427), siendo capaz dicho MtmiPEP169d de modular la acumulación de dicho miR169d en una célula eucariota.
En una realización particular, se describe el MtmiPEP171e (SEQ ID NO: 63) codificado por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 167) contenida en la transcripción primaria del miR171e (SEQ ID NO: 322), siendo capaz dicho MtmiPEP171e de modular la acumulación de dicho miR171e en una célula eucariota.
En una realización particular, se describe el DmmiPEPla (SEQ ID NO: 102) codificado por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 206) contenida en la transcripción primaria del miR1 (SEQ iD NO: 353), siendo capaz dicho dmmiPEPla de modular la acumulación de dicho miR1 en una célula eucariota.
En una realización particular, se describe el DmmiPEPlb (SEQ ID NO: 103) codificado por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 207) contenida en la transcripción primaria del miR1 (SEQ ID NO: 353), siendo capaz dicho DmmiPEPlb de modular la acumulación de dicho miR1 en una célula eucariota.
En una realización particular, se describe el dmmiPEP8 (SEQ ID NO: 104) codificado por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 208) contenida en la transcripción primaria del miR8 (SEQ iD NO: 354), siendo capaz dicho dmmiPEP8 de modular la acumulación de dicho miR8 en una célula eucariota.
En una realización particular, se describe el HsmiPEP155 (SEQ ID NO: 355) codificado por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 356) contenida en la transcripción primaria del miR155 (SEQ ID NO: 358), siendo capaz dicho HsmiPEP155 de modular la acumulación de dicho miR155 en una célula eucariota.
En otro aspecto, se describe un péptido aislado, o un péptido aislado y purificado, o un péptido sintético o un péptido recombinante, que comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de un miPEP, estando dicho miPEP principalmente presente de manera natural en una planta, o en un animal, tal como un ser humano.
En otro aspecto, se describe un vector que comprende al menos una molécula de ácido nucleico como se ha definido anteriormente.
En otro aspecto, también se describe la utilización de al menos:
- un miPEP como se ha definido anteriormente,
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico,
para modular la expresión de al menos un gen en una célula eucariota determinada, siendo capaz dicha célula eucariota determinada de expresar un microARN, en el que la transcripción primaria contiene al menos una secuencia de nucleótidos que codifica dicho al menos un miPEP y en el que la acumulación es modulada por dicho al menos un miPEP, estando regulada la expresión de dicho al menos un gen por dicho microARN.
En otro aspecto, también se describe la utilización de al menos:
- un miPEP de 4 a 100 aminoácidos, preferentemente de 4 a 40 aminoácidos, codificado por una secuencia de nucleótidos contenida en la transcripción primaria de un microARN, siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota,
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico,
para modular la expresión de al menos un gen en una célula eucariota determinada, siendo capaz dicha célula eucariota determinada de expresar un microARN, en el que la transcripción primaria contiene al menos una secuencia de nucleótidos que codifica dicho al menos un miPEP y en el que la acumulación es modulada por dicho al menos un miPEP, estando regulada la expresión de dicho al menos un gen por dicho microARN.
En otro aspecto, también se describe la utilización de al menos:
- un miPEP de 4 a 100 aminoácidos, o de 3 aminoácidos, codificado por una secuencia de nucleótidos contenida en la transcripción primaria de un microARN, siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota,
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico,
para modular la expresión de al menos un gen en una célula eucariota determinada, siendo capaz dicha célula eucariota determinada de expresar un microARN, en el que la transcripción primaria contiene al menos una secuencia de nucleótidos que codifica dicho al menos un miPEP y en el que la acumulación es modulada por dicho al menos un miPEP, estando regulada la expresión de dicho al menos un gen por dicho microARN.
En otro aspecto, también se describe la utilización de al menos:
- un miPEP de 3 aminoácidos, codificado por una secuencia de nucleótidos contenida en la transcripción primaria de un microARN, siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota,
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico,
para modular la expresión de al menos un gen en una célula eucariota determinada, siendo capaz dicha célula eucariota determinada de expresar un microARN, en el que la transcripción primaria contiene al menos una secuencia de nucleótidos que codifica dicho al menos un miPEP y en el que la acumulación es modulada por dicho al menos un miPEP, estando regulada la expresión de dicho al menos un gen por dicho microARN.
La invención se basa en la observación sorprendente de los inventores de que es posible modular la expresión de uno o varios genes diana de un mismo microARN modulando la acumulación de dicho microARN con la ayuda de un miPEP.
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicha célula eucariota determinada es una célula vegetal.
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicha célula eucariota determinada es una célula vegetal de una planta crucífera tal como Arabidopsis thaliana, de una planta leguminosa tal como Glycine max (soja), Medicago truncatula y Medicago sativa (alfalfa) o de una planta solanácea tal como Nicotiana benthamiana (tabaco), Solanum tuberosum (patata), Solanum lycopersicum (tomate) o Solanum melongena (berenjena).
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicha célula eucariota determinada es una célula animal, principalmente humana.
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicha célula eucariota determinada es una célula animal, principalmente humana, no siendo utilizado dicho miPEP para el tratamiento quirúrgico o terapéutico del cuerpo humano o animal, ni para modificar la identidad genética del ser humano.
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicha célula eucariota determinada es una célula animal, utilizándose dicho miPEP para el tratamiento quirúrgico o terapéutico del cuerpo humano o animal.
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho microARN y dicho gen son de origen endógeno en dicha célula eucariota determinada.
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho microARN y dicho gen son de origen exógeno en dicha célula eucariota determinada, conteniendo dicha célula eucariota determinada al menos un vector que permite la expresión de dicho microARN de dicho gen.
En la invención, las expresiones "de origen endógeno" y "de origen exógeno", se utilizan para distinguir dichos microARN y/o los genes de especies diferentes, dada la conservación de secuencias entre especies.
De esta manera, la expresión "de origen endógeno" indica que el microARN y/o el gen pueden estar presentes de manera natural en la célula en cuestión. No obstante, a la célula en cuestión, pueden añadirse de manera artificial otras copias del microARN y/o del gen de origen endógeno, como por ejemplo, por clonación.
Por el contrario, la expresión "de origen exógeno" indica que el microARN y/o el gen no están nunca presentes de manera natural en la célula en cuestión. Se trata de un microARN y/o de un gen identificado en otro tipo celular o en un organismo de otra especie, por tanto este microARN y/o este gen se introduce necesariamente de manera artificial en la célula en cuestión.
En la invención, una célula transformada genéticamente puede contener por tanto 2 grupos de microARN y/o genes potencialmente próximos en términos de secuencia, uno de origen endógeno y el otro de origen exógeno.
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que la transcripción primaria del microARN y dicho gen son de origen exógeno en dicha célula eucariota determinada, conteniendo dicha célula eucariota determinada al menos un vector que permite la expresión de la transcripción primaria del microARN.
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que la transcripción primaria del microARN está codificada por un vector introducido artificialmente en la célula.
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho miPEP se selecciona entre el grupo de péptidos que consiste en la SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 104, SEQ iD NO: 375 a SEQ ID NO: 386 y SEQ ID NO: 355 (Tabla 1).
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho miPEP se selecciona entre el grupo de péptidos que consiste en:
- SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 104 y SEQ ID NO: 355,
- SEQ ID NO: 375 a SEQ ID NO: 386, o
- SEQ ID NO: 424.
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho miPEP se selecciona entre el MtmiPEP171b1 (SEQ ID NO: 59), el AtmiPEP164a1 (SEQ ID NO: 24), el AtmiPEP165a (SEQ ID NO: 43), el AtmiPEP319a1 (SEQ ID NO: 76) y el AtmiPEP319a2 (SEQ ID NO: 77).
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho miPEP se selecciona entre: el MtmiPEP171b1 (SEQ ID NO: 59), el AtmiPEP164a1 (SEQ ID NO: 24), el AtmiPEP165a (SEQ ID NO: 43), el AtmiPEP319a1 (SEQ ID NO: 76), el AtmiPEP319a2 (SEQ ID NO: 77), el AtmiPEP160b1 (SEQ ID NO: 14), el MtmiPEP171e (SEQ ID NO: 63) y el MtmiPEP169d (SEQ ID NO: 424).
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho miPEP se selecciona entre el DmmiPEPla (SEQ ID NO: 102), el DmmiPEPlb (SEQ ID NO: 103) y el DmmiPEP8 (SEQ ID NO: 104).
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho miPEP es el HsmiPEP155a (SEQ ID NO: 355).
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho ácido nucleico se selecciona entre el grupo de ácidos nucleicos que consiste en la SEQ ID NO: 105 a SEQ ID NO: 208 y SEQ ID NO: 356 (Tabla 2).
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho ácido nucleico se selecciona entre el grupo de ácidos nucleicos que consiste en:
- SEQ ID NO: 105 a SEQ ID NO: 208 y SEQ ID NO: 356,
- SEQ ID NO: 387 a SEQ ID NO: 399, o
- SEQ ID NO: 425.
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho ácido nucleico se selecciona entre la miORF171b (SEQ ID NO: 163), la miORF164a1 (SEQ ID NO: 128), la miORF165a (SEQ ID NO: 147), la miORF319a1 (SEQ ID NO: 180) y la miORF319a2 (SEQ ID NO: 181).
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho ácido nucleico se selecciona entre la miORF171b (SEQ ID NO: 163), la miORF164a1 (SEQ ID NO: 128), la miORF165a (SEQ ID NO: 147), la miORF319a1 (SEQ ID NO: 180), la miORF319a2 (SEQ ID NO: 181), la miORF160b1 (SEQ ID NO: 118), la miORF169d (SEQ ID NO: 425) y la miORF171e (SEQ ID NO: 167).
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho ácido nucleico se selecciona entre la miORF1a (SEQ ID NO: 206), la miORF1b (SEQ ID NO: 207) y la miORF8 (SEQ ID NO: 208). En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho ácido nucleico se selecciona entre la miORF155 (SEQ ID NO: 356).
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho microARN se selecciona entre el grupo de ácidos nucleicos que consiste en la SEQ ID NO: 282 a SEQ ID NO: 354 y SEQ ID NO: 358.
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho microARN se selecciona entre el grupo de ácidos nucleicos que consiste en:
- SEQ ID NO: 282 a SEQ ID NO: 354 y SEQ ID NO: 358,
- SEQ ID NO: 412 a SEQ ID NO: 423, o
- SEQ ID NO: 427.
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho microARN se selecciona entre el miR171b (SEQ ID NO: 319), la miR165a (SEQ ID NO: 305) y la miR319a (SEQ ID NO: 331). En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho microARN se selecciona entre el miR171b (SEQ ID NO: 319), la miR164a (SEQ ID NO: 297), la miR165a (SEQ ID NO: 305), la miR319a (SEQ ID NO: 331), la miR160b (SEQ ID NO: 291), la miR171e (SEQ ID NO: 322) y la miR169d (SEQ ID NO: 427).
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho microARN se selecciona entre el miRla (SEQ ID NO: 353) y la miR8 (SEQ ID NO: 354).
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho microARN se selecciona entre el miR155 (SEQ ID NO: 358).
En otro aspecto, la invención se refiere, en particular, a un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulada por un microARN en una célula eucariota,
que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación de un miPEP en dicha célula eucariota,
teniendo dicho miPEP:
- un tamaño de 3 a 100 aminoácidos, preferentemente de 4 a 20 aminoácidos, y
- una secuencia peptídica idéntica a la codificada por una secuencia de nucleótidos contenida en la transcripción primaria de un microARN que regula la expresión de dicho gen, y
- que es capaz de modular la acumulación de dicho microARN,
en el que, la acumulación de dicho miPEP en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho miPEP.
En una realización, se describe un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulada por un microARN en una célula eucariota, que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación de un miPEP en dicha célula eucariota,
teniendo dicho miPEP:
- un tamaño de 4 a 100 aminoácidos, o de 3 aminoácidos, y
- una secuencia peptídica idéntica a la codificada por una secuencia de nucleótidos contenida en la transcripción primaria de un microARN que regula la expresión de dicho gen, y
- que es capaz de modular la acumulación de dicho microARN,
en el que, la acumulación de dicho miPEP en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho miPEP.
En una realización, se describe un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulada por un microARN en una célula eucariota, que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación de un miPEP en dicha célula eucariota,
teniendo dicho miPEP:
- un tamaño de 3 aminoácidos, y
- una secuencia peptídica idéntica a la codificada por una secuencia de nucleótidos contenida en la transcripción primaria de un microARN que regula la expresión de dicho gen, y
- que es capaz de modular la acumulación de dicho microARN,
en el que, la acumulación de dicho miPEP en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho miPEP.
En una realización, se describe un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulada por un microARN en una célula eucariota, que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación de un miPEP en dicha célula eucariota,
teniendo dicho miPEP:
- un tamaño de 4 a 100 aminoácidos, preferentemente de 4 a 20 aminoácidos, y
- una secuencia peptídica idéntica a la codificada por una secuencia de nucleótidos contenida en la transcripción primaria de un microARN que regula la expresión de dicho gen, y
- que es capaz de modular la acumulación de dicho microARN,
en el que, la acumulación de dicho miPEP en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho miPEP.
En una realización se describe un procedimiento de modulación de la expresión de un gen como se ha definido anteriormente, en el que la acumulación de dicho miPEP en la célula es el resultado de:
- la introducción en la célula de un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- la introducción en la célula de dicho miPEP.
En una realización se describe un procedimiento de modulación de la expresión de un gen como se ha definido anteriormente, en el que dicha célula eucariota es una célula vegetal.
En una realización, se describe un procedimiento de modulación de la expresión de un gen como se ha definido anteriormente, en el que dicha célula eucariota es una célula animal y principalmente humana.
En una realización, se describe un procedimiento de modulación de la expresión de un gen como se ha definido anteriormente, en el que dicha célula eucariota es una célula animal y principalmente humana, no siendo utilizado dicho procedimiento para el tratamiento quirúrgico o terapéutico del cuerpo humano o animal, ni para modificar la identidad genética del ser humano.
En una realización, se describe un procedimiento de modulación de la expresión de un gen como se ha definido anteriormente, en el que dicho microARN y dicho gen son de origen endógeno en dicha célula eucariota.
En una realización, se describe un procedimiento de modulación de la expresión de un gen como se ha definido anteriormente, en el que dicho microARN y dicho gen son de origen exógeno en dicha célula eucariota, conteniendo dicha célula eucariota al menos un vector que permite la expresión de dicho microARN de dicho gen.
En una realización, se describe un procedimiento de modulación de la expresión de un gen como se ha definido anteriormente, en el que dicho miPEP se selecciona entre el grupo de péptidos que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 375 a SEQ ID NO: 386 y SEQ ID NO: 355.
En una realización, se describe un procedimiento de modulación de la expresión de un gen como se ha definido anteriormente, en el que dicho miPEP se selecciona entre el grupo de péptidos que consiste en:
- SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 104 y SEQ ID NO: 355,
- SEQ ID NO: 375 a SEQ ID NO: 386, o
- SEQ ID NO: 424.
En una realización, se describe un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por el miR171b (SEQ ID NO: 319) en una célula eucariota, que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación del MtmiPEP171b1 (SEQ ID NO: 59) en dicha célula eucariota, en el que, la acumulación de dicho MtmiPEP171b1 en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho MtmiPEP171b1.
En una realización, se describe un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por el miR171b (SEQ ID NO: 319) en una célula eucariota, que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación del MtmiPEP171b1 (SEQ ID NO: 59) en dicha célula eucariota, en el que, la acumulación de dicho MtmiPEP171b1 en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho MtmiPEP171b1, en el que dicho gen se selecciona entre los genes HAM1 (n.° de referencia MtGI9-TC114268) y HAM2 (n.° de referencia MtGI9-TC120850) (números de referencia según el banco de datos del Gene Expression Atlas de Medicago truncatula "MtGEA").
En una realización, se describe un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por el miR164a (SEQ ID NO: 297) en una célula eucariota, que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación del AtmiPEP165a1 (SEQ ID NO: 24) en dicha célula eucariota, en el que, la acumulación de dicho AtmiPEP164a1 en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho AtmiPEP164a1.
En una realización, se describe un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por el miR165a (SEQ ID NO: 305) en una célula eucariota, que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación del AtmiPEP165a (SEQ ID NO: 43) en dicha célula eucariota, en el que, la acumulación de dicho AtmiPEP165a en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho AtmiPEP165a.
En una realización, se describe un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por el miR319a (SEQ ID NO: 331) en una célula eucariota, que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación del AtmiPEP319a1 (SEQ ID NO: 76) en dicha célula eucariota, en el que, la acumulación de dicho AtmiPEP319a1 en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho AtmiPEP319a1.
En una realización, se describe un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por el miR319a (SEQ ID NO: 331) en una célula eucariota, que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación del AtmiPEP319a2 (SEQ ID NO: 77) en dicha célula eucariota, en el que, la acumulación de dicho AtmiPEP319a2 en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho AtmiPEP319a2.
En una realización, se describe un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por el miR160b (SEQ ID NO: 291) en una célula eucariota, que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación del AtmiPEP160b1 (SEQ ID NO: 14) en dicha célula eucariota, en el que, la acumulación de dicho AtmiPEP160b1 en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho AtmiPEP160b1.
En una realización, se describe un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por el miR169d (SEQ ID NO: 427) en una célula eucariota, que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación del MtmiPEP169d (SEQ ID NO: 424) en dicha célula eucariota, en el que, la acumulación de dicho MtmiPEP169d en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho MtmiPEP169d.
En una realización, se describe un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por el miR171e (SEQ ID NO: 322) en una célula eucariota, que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación del MtmiPEP171e (SEQ ID NO: 63) en dicha célula eucariota, en el que, la acumulación de dicho MtmiPEP171e en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho MtmiPEP171e.
En una realización, se describe un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por el miR1 (SEQ ID NO: 353) en una célula eucariota, que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación del DmmiPEPla (SEQ ID NO: 102) en dicha célula eucariota, en el que, la acumulación de dicho DmmiPEPla en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho DmmiPEPla.
En una realización, se describe un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por el miR1 (SEQ ID NO: 353) en una célula eucariota, que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación del DmmiPEPlb (SEQ ID NO: 103) en dicha célula eucariota, en el que, la acumulación de dicho DmmiPEP1b en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho DmmiPEP1b.
En una realización, se describe un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por el miR8 (SEQ ID NO: 354) en una célula eucariota, que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación del DmmiPEP8 (SEQ ID NO: 104) en dicha célula eucariota, en el que, la acumulación de dicho DmmiPEP8 en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho DmmiPEP8.
En una realización, se describe un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulado por el miR155 (SEQ ID NO: 358) en una célula eucariota, que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación del hsmiPEP155 (SEQ ID NO: 355) en dicha célula eucariota, en el que, la acumulación de dicho hsmiPEP155 en dicha célula eucariota induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho hsmiPEP155.
En otro aspecto, se describe una célula eucariota modificada que contiene un péptido idéntico a un miPEP como se ha definido anteriormente, en el que el péptido está presente en dicha célula eucariota independientemente de la transcripción de la transcripción primaria del microARN que tiene la secuencia de nucleótidos que codifica dicho miPEP. la expresión "célula eucariota modificada" significa que dicha célula eucariota contiene un miPEP introducido artificialmente en la célula, bien como péptido, o bien a través de vector que codifique dicho miPEP. Además de un miPEP introducido artificialmente en la célula, una célula eucariota modificada también contiene al menos un ácido nucleico correspondiente a una miORF que codifica dicho miPEP.
Además de un miPEP introducido artificialmente en la célula y de la miORF, una célula eucariota modificada según la invención contiene igualmente al menos un miR, cuya transcripción primaria contiene dicha miORF.
En una realización, se describe una célula eucariota modificada como se ha definido anteriormente, en la que dicho microARN es de origen endógeno.
En otra realización, se describe una célula eucariota modificada como se ha definido anteriormente, en la que dicho microARN es de origen exógeno, conteniendo dicha célula eucariota modificada un vector que permite la expresión de dicho microARN.
En una realización, se describe una célula eucariota modificada como se ha definido anteriormente, siendo dicha célula una célula vegetal.
En una realización, se describe una célula eucariota modificada como se ha definido anteriormente, en la que dicha célula vegetal es una célula de Medicago truncatula o Arabidopsis thaliana, seleccionándose dicho péptido entre el grupo de péptidos que consiste en:
- SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 101,
- SEQ ID NO: 375 a SEQ ID NO: 386, o
- SEQ ID NO: 424.
En una realización, se describe una célula eucariota modificada como se ha definido anteriormente, en la que dicha célula vegetal es una célula de Medicago truncatula o Arabidopsis thaliana, seleccionándose dicho péptido entre el grupo de péptidos que consiste en SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 77.
En una realización, se describe una célula eucariota modificada como se ha definido anteriormente, en la que dicha célula vegetal es una célula de Medicago truncatula o Arabidopsis thaliana, seleccionándose dicho péptido entre el grupo de péptidos que consiste en SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 424 y SEQ ID NO: 63
En una realización, se describe una célula eucariota modificada como se ha definido anteriormente, siendo dicha célula una célula animal.
En una realización, se describe una célula eucariota modificada como se ha definido anteriormente, en la que dicha célula animal es una célula de drosófila y dicho péptido se selecciona entre el grupo de péptidos que consiste en SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 104.
En una realización, se describe una célula eucariota modificada como se ha definido anteriormente, en la que dicha célula animal es una célula humana y dicho péptido consiste en la SEQ ID NO: 355.
En otro aspecto, se describe una planta que comprende al menos una célula eucariota modificada como se ha definido anteriormente.
En otro aspecto, también describe un organismo animal no humano que comprende al menos una célula eucariota modificada como se ha definido anteriormente.
En otro aspecto, se describe una composición que comprende al menos:
- un miPEP como se ha definido anteriormente,
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico.
En otro aspecto, se describe una composición que comprende al menos un miPEP seleccionado entre el grupo que consiste en:
- SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 101,
- SEQ ID NO: 375 a SEQ ID NO: 386, o
- SEQ ID NO: 424.
En otro aspecto, se describe una composición plaguicida que comprende al menos:
- un miPEP como se ha definido anteriormente,
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición fitofarmacéutica que comprende al menos:
- un miPEP como se ha definido anteriormente,
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico.
En una realización, se describe una composición desencadenante que comprende al menos:
- un miPEP como se ha definido anteriormente,
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico.
Por "composición desencadenante", se designa una composición capaz de conferir a la planta una mejor aptitud a la simbiosis o una mayor resistencia a diferentes tensiones, sean de naturaleza térmica, hídrica o química.
Para ello, la invención se refiere igualmente a composiciones que tratan sobre el crecimiento (inhibición del crecimiento o por el contrario, aumento del crecimiento) y la fisiología (mejor aptitud a micorrizar, formación de nudos, mejor tolerancia a diferentes tensiones) de la planta.
En particular, la invención se refiere a composiciones para favorecer el crecimiento de las plantas.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición herbicida que comprende al menos:
- un miPEP como se ha definido anteriormente,
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico.
En otro aspecto, se describe una composición insecticida que comprende al menos:
- un miPEP como se ha definido anteriormente,
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico.
En una realización, se describe una composición, en particular una composición fitosanitaria, que comprende el miPEP164a como principio activo, consistiendo dicho miPEP164a preferentemente en la SEQ ID NO: 24.
En una realización, se describe una composición, en particular una composición fitosanitaria, que comprende el miPEP319a como principio activo, consistiendo dicho miPEP319a preferentemente en la SEQ ID NO: 76.
En una realización, se describe una composición, en particular una composición fitosanitaria, que comprende el miPEP171b como principio activo, consistiendo dicho miPEP171b preferentemente en la SEQ ID NO: 59.
En una realización, se describe una composición, en particular una composición fitosanitaria, que comprende el miPEP165a como principio activo, consistiendo dicho miPEP165a preferentemente en la SEQ ID NO: 43.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición, en particular una composición fitosanitaria, que comprende el miPEP319a2 como principio activo, consistiendo dicho miPEP319a2 preferentemente en la SEQ ID NO: 77.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición, en particular una composición fitosanitaria, que comprende el miPEP160b1 como principio activo, consistiendo dicho miPEP160b1 preferentemente en la SEQ ID NO: 14.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición, en particular una composición fitosanitaria, que comprende el miPEP169d como principio activo, consistiendo dicho miPEP169d preferentemente en la SEQ ID NO: 424.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición, en particular una composición fitosanitaria, que comprende el miPEP171e como principio activo, consistiendo dicho miPEP171e preferentemente en la SEQ ID NO: 63.
Las propiedades solubles de los miPEP se determinan principalmente por su composición en aminoácidos. Los miPEP hidrófilos pueden ser solubles y acondicionarse en soluciones acuosas, tales como el agua. Los miPEP hidrófilos pueden ser solubles y acondicionarse en disolventes, tales como los disolventes orgánicos.
Para el tratamiento de las plantas con los miPEP, los disolventes orgánicos son disolventes no tóxicos para las plantas en pequeñas cantidades, es decir que no tienen efectos perjudiciales sobre el desarrollo de la planta. De manera no limitante, los disolventes orgánicos pueden seleccionarse entre acetonitrilo y ácido acético.
Los miPEP hidrófilos pueden ser solubles y acondicionarse en mezclas de disolventes orgánicos, como por ejemplo una mezcla de acetonitrilo y de ácido acético. En particular, los miPEP pueden solubilizarse en una solución que comprenda un 50% de acetonitrilo, un 10% de ácido acético y un 40% de agua (volumen/volumen/volumen).
Preferentemente, los miPEP, 164a y 165a se disuelven en agua, y los miPEP 171b y 319a se disuelven en una solución que comprende un 50% de acetonitrilo, un 10% de ácido acético y un 40% de agua (volumen/volumen/volumen). De manera no limitante, las composiciones, las composiciones plaguicidas, las composiciones fitofarmacéuticas, las composiciones herbicidas y las composiciones insecticidas definidas anteriormente pueden comprender 10-9 M a 10-4 M de miPEP, principalmente 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M, 10-5 M o 10-4 M de miPEP.
También pueden proporcionarse composiciones más o menos concentradas según las aplicaciones contempladas. Por ejemplo, pueden contemplarse composiciones que comprendan de 10-1 M a 10-3 M de miPEP, principalmente 10­ 1 M, 10-2 M o 10-3 M de miPEP, cuando el miPEP vaya a administrarse a la planta por fumigación.
En otro aspecto, la invención se refiere a la utilización de una composición como se ha definido anteriormente, como un herbicida para eliminar las plantas o ralentizar su crecimiento, preferentemente como un herbicida específico de una especie o de un género de plantas.
En otro aspecto, la invención se refiere a la utilización de una composición como se ha definido anteriormente, como agente fitofarmacéutico,
- para favorecer el crecimiento y/o el desarrollo de las plantas,
principalmente para la modulación de los parámetros fisiológicos de una planta, en particular la biomasa, la superficie foliar, la floración, el calibre del fruto, la producción y/o la selección de semillas vegetales, en particular para controlar la partenocarpia o la monoecia de una planta, o para la modificación de los parámetros fisiológicos de semillas vegetales, en particular la germinación, la implantación radicular y la resistencia al estrés hídrico, - o para prevenir o tratar las enfermedades de las plantas,
en particular para favorecer la resistencia a las enfermedades infecciosas.
En otro aspecto, se describe la utilización de una composición como se ha definido anteriormente, para modular los parámetros fisiológicos de una planta, en particular la biomasa, la superficie foliar, o el calibre del fruto.
En una realización, se describe la utilización de una composición como se ha definido anteriormente, para el aclareo de vergeles con el fin de aumentar el calibre de los frutos. En una realización, la invención se refiere a la utilización de una composición como se ha definido anteriormente, para la producción y/o la selección de semillas vegetales, utilizándose dicha composición para controlar la partenocarpia y la monoecia de una planta.
En una realización, se describe la utilización de una composición como se ha definido anteriormente, administrándose dicha composición a dicha planta por vía foliar o vía radicular.
En una realización, la invención se refiere a la utilización de una composición como se ha definido anteriormente, para la producción y/o la selección de semillas vegetales.
En una realización, la invención se refiere a la utilización de una composición como se ha definido anteriormente, en la que dicha composición se utiliza para modificar los parámetros fisiológicos de dichas semillas vegetales, en particular la implantación radicular, la germinación y la resistencia al estrés hídrico.
En una realización, la invención se refiere a la utilización de una composición como se ha definido anteriormente, en la que dicha composición se aplica por revestimiento o formación de una película sobre dichas semillas vegetales.
En otro aspecto, se describe la utilización de una composición como se ha definido anteriormente, como un plaguicida, para eliminar los organismos perjudiciales para las plantas o susceptibles de clasificarse como tales, principalmente como insecticida, aracnicida, limacida o rodenticida.
En una realización, se describe la utilización de una composición como se ha definido anteriormente, como insecticida.
En una realización, se describe la utilización de una composición como se ha definido anteriormente, para eliminar los insectos devastadores.
En una realización, se describe la utilización de una composición como se ha definido anteriormente, para eliminar las especies animales clasificadas como perjudiciales o susceptibles de clasificarse como tales, en particular los murinos, principalmente las ratas.
En una realización, se describe la utilización de una composición como se ha definido anteriormente, como plaguicida para eliminar los organismos perjudiciales para las plantas o susceptibles de clasificarse como tales, principalmente como insecticida, aracnicida, limacida o rodenticida,
en particular para la aplicación de dicha composición sobre una planta o sobre un soporte en contacto con la planta.
En otro aspecto, se describe la utilización de una composición como se ha definido anteriormente, en la que dicha composición se aplica sobre una planta para protegerla de insectos devastadores.
En otro aspecto, se describe la utilización de un péptido para favorecer el crecimiento de una planta, introduciéndose dicho péptido en la planta, teniendo dicho péptido una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de un miPEP presente naturalmente en dicha planta,
siendo dicho miPEP presente de manera natural en dicha planta un péptido de 4 a 100 aminoácidos cuya secuencia está codificada por una fase de lectura abierta situada sobre la transcripción primaria de un miR, siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho miR en dicha planta, en el que el miR regula la expresión de al menos un gen implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de la planta, principalmente las raíces, el tallo, las hojas o las flores.
Los inventores han constatado de manera sorprendente que la utilización de péptidos en los que la secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de los miPEP codificados por las transcripciones primarias de los miR, permiten favorecer el crecimiento de las plantas.
El término "planta" se refiere, en general, a toda la planta, o a una parte de ella, en cualquier fase de desarrollo (incluida la planta en forma de semilla o de brote joven), a uno o varios órganos de la planta (como por ejemplo, las hojas, las raíces, el tallo, las flores), a una o varias células de la planta, o incluso a un conjunto de células de la planta.
El término "crecimiento" se refiere al desarrollo de toda la planta, o a una parte de ella, a lo largo del tiempo. El crecimiento de la planta puede determinarse y cuantificarse así siguiendo los parámetros evolutivos que se pueden observar en ciertas partes, células u órganos de la planta, tales como las hojas, las raíces, los tallos o incluso las flores.
De manera no limitante, los parámetros que permiten determinar y cuantificar el crecimiento de una planta pueden ser principalmente:
- el tamaño, la superficie, el volumen, la masa y el número de hojas,
- el tamaño y el número de flores,
- el tamaño del tallo (o del tallo floral),
- la longitud y número de raíces,
- la precocidad de germinación,
- la precocidad de los brotes,
- la precocidad de la inducción floral (o transición floral),
- o incluso el número de células.
En el caso de las plantas leguminosas, el crecimiento de la planta puede estar ligado igualmente a la velocidad de nodulación, o incluso al tamaño y número de nódulos en las raíces.
Por otra parte, la expresión "favorecer el crecimiento de la planta" o "mejorar el crecimiento de la planta", indica:
- sea una aceleración del desarrollo (como por ejemplo un tamaño de las hojas más importante para la planta en un momento dado con respecto a una planta de referencia),
- sea un aumento del desarrollo (como por ejemplo, un tamaño de las hojas más importante en una planta, que no pueda alcanzar una planta de referencia),
- sea una aceleración y un aumento del desarrollo de la planta.
Es importante señalar que la utilización según la invención tiene la ventaja de ser ecológica, en comparación con los procedimientos químicos utilizados clásicamente en la industria botánica o en la agricultura, ya que el miPEP es un péptido que está presente naturalmente en la planta.
También se describe la utilización de un miPEP introducido en una planta para favorecer el crecimiento, siendo dicho miPEP introducido, un péptido que comprende o consiste en, una secuencia idéntica a la de un miPEP que está presente naturalmente en dicha planta,
en el que el miPEP presente naturalmente es un péptido de 4 a 100 aminoácidos, en el que la secuencia está codificada por una fase de lectura abierta situada en 5' de la transcripción primaria de un miR,
siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho miR en dicha planta, en el que el miR regula la expresión de al menos un gen implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de la planta, principalmente las raíces, el tallo, las hojas o las flores,
siendo la suma de la cantidad de dicho miPEP introducido y la de dicho miPEP presente naturalmente estrictamente superior a la cantidad de dicho miPEP naturalmente presente.
La expresión "miPEP introducido" se refiere a un miPEP introducido artificialmente en la planta a diferencia de "miPEP naturalmente presente en la planta". La introducción de un miPEP en la planta implica entonces una etapa técnica, en la que la etapa no es un fenómeno natural y no corresponde ni a un cruzamiento, ni a una selección.
El miPEP introducido puede ser o bien un péptido producido fuera de la planta (como por ejemplo un péptido aislado y/o purificado, un péptido sintético o un péptido recombinante), o bien un péptido producido por la planta después de la introducción no natural de un ácido nucleico que codifique dicho miPEP en dicha planta.
La planta en la que no se ha introducido el miPEP posee una cantidad basal de dicho miPEP, que corresponde a la de dicho miPEP presente naturalmente. La utilización de un miPEP que comprende, o consiste en, una secuencia idéntica a la de dicho miPEP conlleva un aumento de la cantidad total de miPEP, lo que modula la acumulación el miR cuya transcripción primaria contiene la secuencia codificante de dicho miPEP.
Por otra parte, el miPEP introducido se encuentra en la planta y su introducción no tiene un impacto sobre su estabilidad.
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho gen, implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de la planta, se selecciona entre el grupo que consiste en: NACI (n.° de referencia AT1G56010.1), NAC4 (n.° de referencia AT5G07680.1), NAC5 (n.° de referencia AT5G61430.1), CUC1 (n.° de referencia AT3G15170.1), CUC2 (n.° de referencia AT5G53950.1), TCP3 (n.° de referencia AT1G53230.1) y TCP4 (n.° de referencia AT3G15030.1) (números de referencia según el banco de datos The Arabidopsis Information Resource "TAIR").
En particular, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho gen, implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de la planta, se selecciona entre el grupo que consiste en: NAC1, NAC4, NAC5, CUC1 y CUC2. En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho gen, implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de la planta, se selecciona entre el grupo que consiste en: TCP3 y TCP4.
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho miARN se selecciona entre el miR164a y el miR319a.
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho miARN se selecciona entre el miR164a, el miR319a, el miR171b, el miR165a, el miR160b, el miR169d y el miR171e.
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho miPEP se selecciona entre el AtmiPEP164a1, el AtmiPEP319a1, el AtmiPEP319a2, el MtmiPEP171b1, el AtmiPEP165a1, el AtmiPEP160b1, el MtmiPEP169d, el MtmiPEP171e.
En particular, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que, dicho miR164a tiene una secuencia de nucleótidos que consiste en la SEQ ID NO: 297.
En particular, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho miR164a tiene una secuencia de nucleótidos que presenta al menos un 80% de identidad, preferentemente al menos un 90% de identidad, con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 297. En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho miPEP es el AtmiPEP164a1, en particular, en la que dicho AtmiPEP164a1 tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 24.
En particular, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que, dicho miR319a tiene una secuencia de nucleótidos que consiste en la SEQ ID NO: 331.
En particular, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho miR319a tiene una secuencia de nucleótidos que presenta al menos un 80% de identidad, preferentemente al menos un 90% de identidad, con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 331. En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho miPEP es el AtmiPEP319a1, en particular, en la que dicho AtmiPEP319a1 tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 76.
En una realización, la invención se refiere a la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicha planta es una planta crucífera tal como Arabidopsis thaliana, una planta leguminosa tal como Glycine max (soja), Medicago truncatula y Medicago sativa (alfalfa) o una planta solanácea tal como Nicotiana benthamiana (tabaco), Solanum tuberosum (patata), Solanum lycopersicum (tomate) o Solanum melongena (berenjena). En una realización, la invención se refiere a la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicha planta es una planta crucífera.
En una realización, la invención se refiere a la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicha planta es Arabidopsis thaliana.
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, para favorecer el crecimiento de una planta de Arabidopsis thaliana, en la que el AtmiPEP164a1 se introduce en dicha planta de Arabidopsis thaliana, estando dicho AtmiPEP164a1 igualmente presente de manera natural en dicha planta de Arabidopsis thaliana, siendo dicho AtmiPEP164a1 introducido, un péptido cuya secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de dicho AtmiPEP164a1 presente naturalmente, estando dicha secuencia del AtmiPEP164a1 presente naturalmente, codificada por una fase de lectura abierta situada en 5' de la transcripción primaria de miR164a, en el que el miR164a regula la expresión de al menos un gen implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de Arabidopsis thaliana,
siendo la suma de la cantidad de dicho AtmiPEP164a1 introducido y la de dicho AtmiPEP164a1 presente naturalmente estrictamente superior a la cantidad de dicho AtmiPEP164a1 naturalmente presente en dicha planta de Arabidopsis thaliana.
En una realización, se describe la utilización como se ha definido anteriormente, para favorecer el crecimiento de una planta de Arabidopsis thaliana, en la que el AtmiPEP319a1 se introduce en dicha planta de Arabidopsis thaliana, estando dicho AtmiPEP319a1 igualmente presente de manera natural en dicha planta de Arabidopsis thaliana, siendo dicho AtmiPEP319a1 introducido, un péptido cuya secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de dicho AtmiPEP319a1 presente naturalmente, estando dicha secuencia del AtmiPEP319a1 presente naturalmente, codificada por una fase de lectura abierta situada en 5' de la transcripción primaria de miR319a, en el que el miR319a regula la expresión de al menos un gen implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de Arabidopsis thaliana, siendo la suma de la cantidad de dicho AtmiPEP319a1 introducido y la de dicho AtmiPEP319a1 presente naturalmente estrictamente superior a la cantidad de dicho AtmiPEP319a1 naturalmente presente en dicha planta de Arabidopsis thaliana.
En una realización, la invención se refiere a la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho miPEP se introduce por vía externa en la planta, preferentemente por riego, por pulverización o con la adición de un fertilizante, de tierra, de un sustrato de cultivo o de un soporte inerte.
En una realización, la invención se refiere a la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho miPEP se introduce por riego y pulverización.
En una realización, la invención se refiere a la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho miPEP se introduce por riego y por la adición de un fertilizante.
En una realización, la invención se refiere a la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho miPEP se introduce por pulverización y por la adición de un fertilizante.
En una realización, la invención se refiere a la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho miPEP se introduce, por riego, por pulverización y por adición de un fertilizante.
Los inventores han constatado en efecto de manera inesperada que es posible aplicar directamente una composición que comprende un miPEP sobre la planta para modular la acumulación del miR correspondiente en la planta, lo que indica que el miPEP es captado por la planta.
En una realización, la invención se refiere a la utilización como se ha definido anteriormente, en la que la planta se trata con una composición que comprende de 10-9 M a 10-4 M de dicho miPEP, principalmente 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M, 10-5 M o 10-4 M de dicho miPEP.
Preferentemente, las composiciones tienen de 10-8 M a 10-5 M para una aplicación por riego o por pulverización sobre la planta.
De manera complementaria, pueden contemplarse composiciones más o menos concentradas para tratar la planta con el miPEP. Por ejemplo, y de manera no limitante, pueden utilizarse composiciones más concentradas que comprendan de 10-1 M a 10-3 M de miPEP, principalmente 10-2 M, cuando el miPEP introducido por vía exógena se administre a la planta por fumigación.
En una realización, la invención se refiere a la utilización como se ha definido anteriormente, en la que dicho miPEP se introduce en la planta por medio de un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, introduciéndose dicho ácido nucleico en la planta.
En una realización, la invención se refiere a la utilización como se ha definido anteriormente, en la que el tamaño del tallo aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al tamaño del tallo de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto al tamaño del tallo de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, la invención se refiere a la utilización como se ha definido anteriormente, en la que el número de hojas aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al número de hojas de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto al número de hojas de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, la invención se refiere a la utilización como se ha definido anteriormente, en la que el tamaño de las hojas aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al tamaño de las hojas de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto al tamaño de las hojas de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, la invención se refiere a la utilización como se ha definido anteriormente, en la que el número de raíces aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al número de raíces de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto al número de raíces de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, la invención se refiere a la utilización como se ha definido anteriormente, en la que la longitud de las raíces aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto a la longitud de las raíces de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto a la longitud de las raíces de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido. En una realización, la invención se refiere a la utilización como se ha definido anteriormente, en la que la velocidad de nodulación aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto a la velocidad de nodulación de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto a la velocidad de nodulación de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, la invención se refiere a la utilización como se ha definido anteriormente, en la que el número de nódulos aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al número de nódulos de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto al número de nódulos de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido. El aumento de los parámetros que permiten determinar y cuantificar el crecimiento de la planta en la que se ha introducido el miPEP (tales como el tamaño del tallo, el número y tamaño de las hojas, el número y la longitud de las raíces, la velocidad de nodulación o incluso el número de nódulos en las raíces) se pone en evidencia preferentemente por comparación con una planta idéntica (es decir, una planta de la misma especie y/o variedad), de la misma edad y cultivada en las mismas condiciones pero en la que no se ha introducido ningún miPEP. En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para favorecer el crecimiento de una planta, que comprende una etapa de introducción de un miPEP en una planta, estando dicho miPEP igualmente presente de manera natural en dicha planta,
siendo dicho miPEP introducido un péptido de 4 a 100 aminoácidos en el que la secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de dicho miPEP presente naturalmente, en el que la secuencia del miPEP presente naturalmente está codificada por una fase de lectura abierta situada en 5' de la transcripción primaria de un miR, siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho miR, en el que el miR regula la expresión de al menos un gen implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de la planta, principalmente las raíces, el tallo, las hojas o las flores, siendo la suma de la cantidad de dicho miPEP introducido y la de dicho miPEP presente naturalmente estrictamente superior a la cantidad de dicho miPEP naturalmente presente.
En una realización, se describe un procedimiento como se ha definido anteriormente, en el que dicho gen, implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de la planta, se selecciona entre el grupo que consiste en: NACI (n.° de referencia AT1G56010.1), Na C4 (n.° de referencia AT5G07680.1), NAC5 (n.° de referencia AT5G61430.1), CUC1 (n.° de referencia AT3G15170.1), CUC2 (n.° de referencia AT5G53950.1), TCP3 (n.° de referencia AT1G53230.1) y TCP4 (n.° de referencia AT3G15030.1).
En particular, se describe un procedimiento como se ha definido anteriormente, en el que dicho gen, implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de la planta, se selecciona entre el grupo que consiste en: NACI, NAC4, NAC5, CUC1 y CUC2.
En una realización, se describe un procedimiento como se ha definido anteriormente, en el que dicho gen, implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de la planta, se selecciona entre el grupo que consiste en: TCP3 y TCP4.
En una realización, se describe un procedimiento como se ha definido anteriormente, en el que dicho miR se selecciona entre el miR164a, el miR319a, el miR171b, el miR165a, el miR160b, el miR169d y el miR171e.
En una realización, se describe un procedimiento como se ha definido anteriormente, en el que dicho miR se selecciona entre el AtmiPEP164a1, el AtmiPEP319a1, el AtmiPEP319a2, el MtmiPEP171b1, el AtmiPEP165a1, el AtmiPEP160b1, el MtmiPEP169d, el MtmiPEP171e.
En una realización, se describe un procedimiento como se ha definido anteriormente, en el que dicho miARN es el miR164a, en particular, en el que dicho miR164a tiene una secuencia de nucleótidos que consiste en la SEQ ID NO: 297.
En una realización, se describe un procedimiento como se ha definido anteriormente, en el que dicho miPEP es el AtmiPEP164a1, en particular, en el que dicho AtmiPEP164a1 tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO: 24. En una realización, se describe un procedimiento como se ha definido anteriormente, en el que dicho miARN es el miR319a, en particular, en el que dicho miR319a tiene una secuencia de nucleótidos que consiste en la SEQ ID NO: 331.
En una realización, se describe un procedimiento como se ha definido anteriormente, en el que dicho miPEP es el AtmiPEP319a1, en particular, en el que dicho AtmiPEP319a1 tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 76.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento como se ha definido anteriormente, en el que dicha planta es una planta crucífera tal como Arabidopsis thaliana, una planta leguminosa tal como Glycine max (soja), Medicago truncatula y Medicago sativa (alfalfa) o una planta solanácea tal como Nicotiana benthamiana (tabaco), Solanum tuberosum (patata), Solanum lycopersicum (tomate) o Solanum melongena (berenjena). En una realización, la invención se refiere a un procedimiento como se ha definido anteriormente, en el que dicha planta es una planta crucífera.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento como se ha definido anteriormente, en el que dicha planta es Arabidopsis thaliana.
En una realización, se describe un procedimiento como se ha definido anteriormente, para favorecer el crecimiento de una planta de Arabidopsis thaliana, en el que el AtmiPEP164a1 se introduce en dicha planta de Arabidopsis thaliana, estando dicho AtmiPEP164a1 igualmente presente de manera natural en dicha planta de Arabidopsis thaliana, siendo dicho AtmiPEP164a1 introducido un péptido que comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de dicho AtmiPEP164a1 presente naturalmente, en el que dicho AtmiPEP164a1 presente naturalmente es un péptido de 4 a 100 aminoácidos cuya secuencia está codificada por una fase de lectura abierta situada en 5' de la transcripción primaria del miR164a,
siendo capaz dicho AtmiPEP164a1 de modular la acumulación de dicho miR164a, en el que dicho miR164a regula la expresión de al menos un gen implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de Arabidopsis thaliana,
siendo la suma de la cantidad de dicho AtmiPEP164a1 introducido y la de dicho AtmiPEP164a1 presente naturalmente estrictamente superior a la cantidad de dicho AtmiPEP164a1 presente de manera natural.
En una realización, se describe un procedimiento como se ha definido anteriormente, para favorecer el crecimiento de una planta de Arabidopsis thaliana, en el que el AtmiPEP319a1 se introduce en dicha planta de Arabidopsis thaliana, estando dicho AtmiPEP319a1 igualmente presente de manera natural en dicha planta de Arabidopsis thaliana, siendo dicho AtmiPEP319a1 introducido un péptido que comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de dicho AtmiPEP319a1 presente naturalmente, en el que el AtmiPEP319a1 presente naturalmente es un péptido de 4 a 100 aminoácidos cuya secuencia está codificada por una fase de lectura abierta situada en 5' de la transcripción primaria del miR319a,
siendo capaz dicho AtmiPEP319a1 de modular la acumulación de dicho miR319a, en el que el miR319a regula la expresión de al menos un gen implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de Arabidopsis thaliana,
siendo la suma de la cantidad de dicho AtmiPEP319a1 introducido y la de dicho AtmiPEP319a1 presente naturalmente estrictamente superior a la cantidad de dicho AtmiPEP319a1 presente de manera natural.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento como se ha definido anteriormente, en el que dicho miPEP se introduce por vía externa en la planta, preferentemente por riego, por pulverización o con la adición de un fertilizante, de tierra, de un sustrato de cultivo o de un soporte inerte.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento como se ha definido anteriormente, en el que dicho miPEP se administra a la planta en forma de una composición que comprende de 10-9 M a 10-4 M de dicho miPEP, en
particular 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 M o 10-4 M de dicho miPEP. En una realización, la invención se refiere a un
procedimiento como se ha definido anteriormente, en el que dicho miPEP se introduce en la planta por medio de un
ácido nucleico que codifica dicho miPEP, introduciéndose dicho ácido nucleico en la planta.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento como se ha definido anteriormente, en la que el tamaño
del tallo aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al tamaño del tallo de una planta
idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto al tamaño del tallo de
una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento como se ha definido anteriormente, en la que el número
de hojas aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al número de hojas de una planta
idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto al número de hojas de
una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento como se ha definido anteriormente, en la que el tamaño
de las hojas aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al tamaño de las hojas de
una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto al tamaño
de las hojas de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento como se ha definido anteriormente, en la que el número
de raíces aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al número de raíces de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto al número de raíces de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento como se ha definido anteriormente, en la que la longitud
de las raíces aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto a la longitud de las raíces
de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto a la
longitud de las raíces de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido. En una
realización, la invención se refiere a un procedimiento como se ha definido anteriormente, en la que la velocidad de
nodulación aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto a la velocidad de nodulación
de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto a la
velocidad de nodulación de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento como se ha definido anteriormente, en la que el número
de nódulos aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al número de nódulos de una
planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto al número de nódulos de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En otro aspecto, la invención se refiere a una planta en la que se ha introducido un miPEP según la utilización o el
procedimiento para favorecer el crecimiento de una planta descrita posteriormente. En otro aspecto, se describe un
procedimiento de producción de una planta transgénica que comprende:
a) una etapa de introducción de un ácido nucleico que codifica un miPEP de 4 a 100 aminoácidos en una planta,
o en al menos una célula de dicha planta, en condiciones que permiten la expresión de dicho miPEP, estando
dicho miPEP igualmente presente de manera natural en dicha planta, siendo dicho miPEP presente naturalmente
un péptido cuya secuencia está codificada por una fase de lectura abierta situada en 5' de la transcripción primaria
de un miR, siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho miR en la planta, en el que el miR
regula la expresión de al menos un gen implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de la
planta, principalmente las raíces, el tallo, las hojas o las flores, y
b) una etapa de cultivo de la planta, o de al menos una célula de dicha planta, obtenidas en la etapa a) en
condiciones que permitan la obtención de una planta transgénica.
En otro aspecto, se describe un procedimiento de producción de una planta transgénica que comprende:
a) una etapa de introducción de un ácido nucleico que codifica un miPEP de 4 a 100 aminoácidos, o de 3
aminoácidos, en una planta, o en al menos una célula de dicha planta, en condiciones que permiten la expresión
de dicho miPEP,
estando dicho miPEP igualmente presente de manera natural en dicha planta, siendo dicho miPEP presente
naturalmente un péptido cuya secuencia está codificada por una fase de lectura abierta situada en 5' de la
transcripción primaria de un miR, siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho miR en la planta,
en el que el miR regula la expresión de al menos un gen implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o
reproductoras de la planta, principalmente las raíces, el tallo, las hojas o las flores, y
b) una etapa de cultivo de la planta, o de al menos una célula de dicha planta, obtenidas en la etapa a) en
condiciones que permitan la obtención de una planta transgénica.
En otro aspecto, se describe un procedimiento de producción de una planta transgénica que comprende:
a) una etapa de introducción de un ácido nucleico que codifica un miPEP de 3 aminoácidos, en una planta, o en al menos una célula de dicha planta, en condiciones que permiten la expresión de dicho miPEP,
estando dicho miPEP igualmente presente de manera natural en dicha planta, siendo dicho miPEP presente naturalmente un péptido cuya secuencia está codificada por una fase de lectura abierta situada en 5' de la transcripción primaria de un miR, siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho miR en la planta, en el que el miR regula la expresión de al menos un gen implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de la planta, principalmente las raíces, el tallo, las hojas o las flores, y
b) una etapa de cultivo de la planta, o de al menos una célula de dicha planta, obtenidas en la etapa a) en condiciones que permitan la obtención de una planta transgénica.
En una realización, se describe un procedimiento de producción de una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en el que dicha planta transgénica obtenida en la etapa b) tiene un mejor crecimiento con respecto a una planta idéntica en la que no se ha introducido dicho ácido nucleico.
En una realización, se describe un procedimiento de producción de una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en el que la expresión de dicho miPEP codificado por el ácido nucleico introducido en la planta produce un mejor crecimiento con respecto a una planta idéntica en la que no se ha introducido dicho ácido nucleico.
En una realización, se describe un procedimiento de producción de una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en el que la etapa a) se realiza con la ayuda de un vector que contiene dicho ácido nucleico, preferentemente un plásmido.
En una realización, se describe un procedimiento de producción de una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en el que la expresión de dicho ácido nucleico de la etapa a) está situado bajo el control de un promotor fuerte, preferentemente un fuerte promotor constitutivo tal como el promotor 35S.
En una realización, se describe un procedimiento de producción de una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en el que dicho gen, implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de la planta, se selecciona entre el grupo que consiste en: NACI (n.° de referencia AT1G56010.1), NAC4 (n.° de referencia AT5G07680.1), NAC5 (n.° de referencia AT5G61430.1), CUC1 (n.° de referencia AT3G15170.1), CUC2 (n.° de referencia At 5g 53950.1), TCP3 (n.° de referencia AT1G53230.1) y TCP4 (n.° de referencia AT3G15030.1).
En una realización, se describe un procedimiento de producción de una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en el que dicho miPEP tiene una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia escogida de entre el grupo constituido por la SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 101 y SEQ ID NO: 375 a SEQ ID NO: 386.
En una realización, se describe un procedimiento de producción de una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en el que dicho miPEP tiene una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia escogida de entre el grupo constituido por:
- SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 101,
- SEQ ID NO: 375 a SEQ ID NO: 386, o
- SEQ ID NO: 424.
En una realización, se describe un procedimiento de producción de una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en el que dicho miARN es el miR164a, en particular, en el que dicho miR164a tiene una secuencia de nucleótidos que consiste en la SEQ ID NO: 297.
En una realización, se describe un procedimiento de producción de una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en el que dicho miPEP es el AtmiPEP164a1, en particular, en el que dicho AtmiPEP164a1 tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 24.
En una realización, se describe un procedimiento de producción de una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en el que dicho miARN es el miR319a, en particular, en el que dicho miR319a tiene una secuencia de nucleótidos que consiste en la SEQ ID NO: 331.
En una realización, se describe un procedimiento de producción de una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en el que dicho miPEP es el AtmiPEP319a1, en particular, en el que dicho AtmiPEP319a1 tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 76.
En una realización, se describe un procedimiento de producción de una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en el que dicho ácido nucleico introducido en la etapa a) comprende una secuencia de nucleótidos escogida entre las SEQ ID NO: 128 y SEQ ID NO: 180.
En una realización, se describe un procedimiento de producción de una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en el que dicha planta es una planta crucifera tal como Arabidopsis thaliana, una planta leguminosa tal como Glycine max (soja), Medicago truncatula y Medicago sativa (alfalfa) o una planta solanácea tal como Nicotiana benthamiana (tabaco), Solanum tuberosum (patata), Solanum lycopersicum (tomate) o Solanum melongena (berenjena).
En una realización, se describe un procedimiento de producción de una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en el que dicha planta transgénica es una planta crucífera. En una realización, se describe un procedimiento de producción de una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en el que dicha planta transgénica es Arabidopsis thaliana. En una realización, se describe un procedimiento de producción de una planta transgénica como se ha definido anteriormente, que comprende:
a) una etapa de introducción de un ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 128, que codifica el AtmiPEP164a1 que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 24, en una planta de Arabidopsis thaliana, o en al menos una célula de dicha planta de Arabidopsis thaliana, en condiciones que permiten la expresión de dicho AtmiPEP164a1,
estando dicho AtmiPEP164a1 igualmente presente de manera natural en dicha planta de Arabidopsis thaliana, siendo dicho miPEP presente naturalmente un péptido cuya secuencia está codificada por una fase de lectura abierta situada en 5' de la transcripción primaria de un miR164a, siendo capaz dicho AtmiPEP164a1 de modular la acumulación de dicho miR164, en el que el miR164a regula la expresión de al menos un gen implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de Arabidopsis thaliana, y
b) una etapa de cultivo de la planta, o de al menos una célula de dicha planta, obtenidas en la etapa a) en condiciones que permitan la obtención de una planta transgénica de Arabidopsis thaliana.
En una realización, se describe un procedimiento de producción de una planta transgénica como se ha definido anteriormente, que comprende:
a) una etapa de introducción de un ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 180, que codifica el AtmiPEP319a1 que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 76, en una planta de Arabidopsis thaliana, o en al menos una célula de dicha planta de Arabidopsis thaliana, en condiciones que permiten la expresión de dicho AtmiPEP319a1,
estando dicho AtmiPEP319a1 igualmente presente de manera natural en dicha planta de Arabidopsis thaliana, siendo dicho miPEP presente naturalmente un péptido cuya secuencia está codificada por una fase de lectura abierta situada en 5' de la transcripción primaria de un miR319a, siendo capaz dicho AtmiPEP319a1 de modular la acumulación de dicho miR319, en el que el miR319a regula la expresión de al menos un gen implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de Arabidopsis thaliana, y
b) una etapa de cultivo de la planta, o de al menos una célula de dicha planta, obtenidas en la etapa a) en condiciones que permitan la obtención de una planta transgénica de Arabidopsis thaliana.
En una realización, se describe un procedimiento de producción como se ha definido anteriormente, en el que dicho miPEP se introduce en la planta por medio de un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, introduciéndose dicho ácido nucleico en la planta.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento de producción de una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en la que el tamaño del tallo aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al tamaño del tallo de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto al tamaño del tallo de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, se describe un procedimiento de producción de una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en la que el número de hojas aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al número de hojas de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto al número de hojas de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, se describe un procedimiento de producción de una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en la que el tamaño de las hojas aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al tamaño de las hojas de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto al tamaño de las hojas de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, se describe un procedimiento de producción de una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en la que el número de raíces aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al número de raíces de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto al número de raíces de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, se describe un procedimiento de producción de una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en la que la longitud de las raíces aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto a la longitud de las raíces de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto a la longitud de las raíces de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, se describe un procedimiento de producción de una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en la que la velocidad de nodulación aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto a la velocidad de nodulación de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto a la velocidad de nodulación de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En una realización, se describe un procedimiento de producción de una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en la que el número de nódulos aumenta en la planta en la que se ha introducido dicho miPEP con respecto al número de nódulos de una planta idéntica y de la misma edad en la que no se ha introducido ningún miPEP, o bien con respecto al número de nódulos de una planta idéntica y de la misma edad en la que dicho miPEP no se ha introducido.
En un aspecto, también se describe una planta transgénica como la que se obtiene mediante el procedimiento de producción como definido anteriormente.
En otro aspecto, se describe una planta transgénica que contiene un vector que codifica un miPEP, estando dicho miPEP igualmente presente de manera natural en dicha planta,
siendo dicho miPEP presente naturalmente un péptido cuya secuencia está codificada por una fase de lectura abierta situada en 5' de la transcripción primaria de un miR, siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho miR en la planta, en el que el miR regula la expresión de al menos un gen,
produciendo la expresión de dicho miPEP codificado por el vector introducido en la planta una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a una planta idéntica en la que no se ha introducido dicho ácido nucleico.
En una realización, se describe una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en la que dicho gen está implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de la planta, principalmente las raíces, el tallo, los hojas o las flores, y la expresión de dicho miPEP codificado por el ácido nucleico introducido en la planta produce un mejor crecimiento de la planta transgénica con respecto a una planta idéntica en la que no se ha introducido dicho ácido nucleico.
En una realización, se describe una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en la que dicho miPEP se selecciona entre el grupo que consiste en:
- SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 101,
- SEQ ID NO: 375 a SEQ ID NO: 386, o
- SEQ ID NO: 424.
En otro aspecto, se describe una planta transgénica que comprende un vector,
conteniendo dicho vector un ácido nucleico que permite la expresión de una transcripción primaria de miR, conteniendo dicha transcripción primaria del miR una fase de lectura abierta que codifica un miPEP, siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho miR en dicha planta, en el que el miR regula la expresión de al menos un gen en dicha planta, la expresión de dicho miPEP codificado por el vector introducido en la planta produce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a una planta idéntica en la que no se ha introducido dicho vector.
En una realización, se describe una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en la que dicho ácido nucleico es de origen endógeno.
Si dicho ácido nucleico es de origen endógeno, al menos una copia de dicho ácido nucleico ya está presente de manera natural en la planta, independientemente del vector introducido en la planta.
En una realización, se describe una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en la que dicho ácido nucleico es de origen exógeno.
Si dicho ácido nucleico es de origen exógeno, ninguna copia de dicho ácido nucleico está presente de manera natural en la planta.
En una realización, se describe una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en la que dicho gen está implicado en el desarrollo de las partes vegetativas o reproductoras de la planta, principalmente las raíces, el tallo, los hojas o las flores, y la expresión de dicho miPEP codificado por el ácido nucleico introducido en la planta produce un mejor crecimiento de la planta transgénica con respecto a una planta idéntica en la que no se ha introducido dicho ácido nucleico.
En una realización, se describe una planta transgénica como se ha definido anteriormente, en la que dicho miPEP se selecciona entre el grupo que consiste en:
- SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 101,
- SEQ ID NO: 375 a SEQ ID NO: 386, o
- SEQ ID NO: 424.
En otro aspecto, se describe una composición que comprende, en combinación, una cantidad de semillas de una planta y una cantidad de un péptido cuya secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de un miPEP presente de manera natural en dicha planta.
En una realización, se describe una composición como se ha definido anteriormente, en la que dicho miPEP se selecciona entre el grupo que consiste en:
- SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 101,
- SEQ ID NO: 375 a SEQ ID NO: 386, o
- SEQ ID NO: 424.
En una realización, se describe una composición que comprende, en combinación, una cantidad de semillas de una planta, principalmente de A. thaliana, y una cantidad de un péptido cuya secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la del AtmiPEP164a1. En una realización, se describe una composición que comprende, en combinación, una cantidad de semillas de una planta, principalmente de A. thaliana, y una cantidad de un péptido cuya secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la del AtmiPEP319a1. En una realización, se describe una composición que comprende, en combinación, una cantidad de semillas de una planta, principalmente de M. truncatula, y una cantidad de un péptido cuya secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la del MtmiPEP171b. En una realización, se describe una composición como se ha definido anteriormente, formulada de manera que forme una semilla recubierta.
El revestimiento se puede realizar según los procedimientos utilizados clásicamente en la industria agroalimentaria y se puede obtener utilizando un material apto para disgregarse en un disolvente o en la tierra, tal como un aglutinante o arcilla.
Según la invención, el revestimiento puede utilizarse para, por ejemplo, conferir propiedades particulares a una composición de miPEP, o también a una composición de semillas en combinación con un miPEP.
En una realización, se describe una composición como se ha definido anteriormente, formulada de manera que forme una semilla recubierta que comprenda el MtmiPEP171b.
En una realización, se describe una composición como se ha definido anteriormente, formulada de manera que forme una semilla recubierta que comprenda el AtmiPEP164a1.
En una realización, se describe una composición como se ha definido anteriormente, formulada de manera que forme una semilla recubierta que comprenda el AtmiPEP319a1.
En otro aspecto, se describe una composición farmacéutica que comprende al menos:
- un miPEP como se ha definido anteriormente,
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico,
y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, se describe una composición que comprende al menos:
- un miPEP tal como se define posteriormente
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico.
para su utilización como un medicamento, principalmente para el ser humano o para los animales. La utilización de las composiciones de la invención se puede aplicar en medicina humana y en medicina veterinaria.
En otro aspecto, se describe una composición que comprende al menos:
- un miPEP tal como se define posteriormente
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico.
para su utilización en la prevención y/o el tratamiento de una patología que implica la desregulación de la expresión de un gen del paciente,
estando regulada la expresión de dicho gen por un microARN cuya acumulación está modulada por dicho miPEP.
En una realización, se describe la composición como se ha definido anteriormente, en la que dicha patología se selecciona entre el cáncer, la diabetes, la obesidad, las enfermedades infecciosas y las enfermedades neurodegenerativas.
En una realización, se describe la composición como se ha definido anteriormente, en la que dicha patología se selecciona entre: el cáncer, la diabetes, la obesidad, las enfermedades infecciosas, las enfermedades neurovegetativas, las enfermedades cardiovasculares y las enfermedades autoinmunitarias.
En una realización, se describe la composición como se ha definido anteriormente, en la que dicha patología se selecciona entre: el cáncer, la diabetes, la obesidad, las enfermedades infecciosas y las enfermedades neurovegetativas, o se selecciona entre las enfermedades cardiovasculares y las enfermedades autoinmunitarias. En una realización, se describe la composición como se ha definido anteriormente, en la que dicha patología se selecciona entre las enfermedades cardiovasculares y las enfermedades autoinmunitarias.
En otro aspecto, se describe una composición que comprende al menos:
- un miPEP como se ha definido anteriormente,
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico.
para su utilización en la prevención y/o el tratamiento de una infección en un animal o un ser humano por un organismo parasitario,
teniendo dicho organismo parasitario un gen cuya expresión está regulada por un micro ARN cuya acumulación está modulada por dicho miPEP.
En otro aspecto, se describe un miPEP de 4 a 100 aminoácidos, o de 3 aminoácidos, codificado por una secuencia de nucleótidos contenida en la transcripción primaria de un microARN, siendo capaz dicho miPEP de modular la acumulación de dicho microARN en una célula eucariota, para su utilización como un medicamento.
En otro aspecto, se describe un anticuerpo que reconoce específicamente un miPEP.
En particular, se describe un anticuerpo que reconoce específicamente el AtmiPEP165a.
En particular, se describe un anticuerpo que reconoce específicamente el MtmiPEP171b.
En particular, se describe un anticuerpo que reconoce específicamente el AtmiPEP164a1.
En particular, se describe un anticuerpo que reconoce específicamente el AtmiPEP319a1.
Dicho anticuerpo puede obtenerse a partir de un procedimiento conocido por el experto, como por ejemplo, inyectando dicho miPEP a un animal no humano para desencadenar una reacción de inmunización y la producción de anticuerpos por dicho animal.
En otro aspecto, la solicitud también describe un procedimiento de inmunolocalización de un miPEP que comprende una etapa de marcado de una muestra biológica de una planta con un anticuerpo que reconoce específicamente un miPEP.
En particular, se describe un procedimiento de inmunolocalización del AtmiPEP165a con la ayuda de un anticuerpo que reconoce específicamente el AtmiPEP165a.
En particular, se describe un procedimiento de inmunolocalización del MtmiPEP171b con la ayuda de un anticuerpo que reconoce específicamente el MtmiPEP171b.
En particular, se describe un procedimiento de inmunolocalización del AtmiPEP164a1 con la ayuda de un anticuerpo que reconoce específicamente el AtmiPEP164a1.
En particular, se describe un procedimiento de inmunolocalización del MtmiPEP319a1 con la ayuda de un anticuerpo que reconoce específicamente el AtmiPEP319a1.
En otro aspecto, se describe un anticuerpo que reconoce específicamente un miPEP según la invención, para su utilización como un medicamento.
En otro aspecto, se describe una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo que reconoce específicamente un miPEP según la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, se describe un protocolo de producción de un péptido recombinante, cuya secuencia comprende o consiste en una secuencia idéntica a la de un miPEP como se ha definido anteriormente, que comprende una etapa de transformación de un organismo con un vector de expresión que codifica dicho péptido recombinante.
En una realización, dicho organismo se selecciona entre el grupo que comprende las bacterias, las levaduras, los hongos (distintos de levaduras), las células animales, las plantas y los animales.
En una realización, dicho organismo es Escherichia coli.
En particular, se describe un protocolo de producción de un péptido recombinante como se ha definido anteriormente, que comprende las siguientes etapas:
- el ácido nucleico que codifica dicho péptido recombinante se une a un ácido nucleico que codifica una etiqueta, tal como la GST,
- el vector de expresión que contiene dicho ácido nucleico que codifica dicho péptido recombinante se introduce en la bacteria E. coli,
- la bacteria E. coli que contiene el vector de expresión se cultiva en un medio LB de preferencia hasta una DO que comprende entre 0,2 y 0,4,
- la producción del péptido recombinante se induce con IPTG, preferentemente durante 4 a 5 horas,
- las bacterias E. coli se centrifugan y se lisan,
- el sobrenadante se filtra,
- dicho péptido recombinante se purifica sobre una columna de sepharose de afinidad con glutatión,
- si es necesario, escindir la GST con una proteasa.
El conjunto de secuencias de miPEP, miORF, miR y las transcripciones primarias de los miR se indican en las tablas 1, 2, 3, 4, 5 y 6.
La tabla 7 presenta un análisis del polimorfismo de la secuencia de ADN de diferentes regiones del pri-miR171b se define un haplotipo cuando difiere al menos un aminoácido de otros haplotipos).
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Tabla 4. Lista de microARN (miR)
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continuación
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continuación
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Tabla 6. Lista de los miR de control
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Tabla 7. Polimorfismo de la secuencia de ADN de diferentes regiones de pri-miR171b
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Las figuras y los ejemplos siguientes ilustran mejor la invención, sin por ello limitar su ámbito.
Leyendas de las figuras
FIGURA 1. Efectos de la sobreexpresión del MtmiR171b (miR171b identificado en Medicago truncatula) sobre la expresión de los genes HAM1 y HAM2 (A) o sobre el número de raíces laterales (B) en M. truncatula.
(A) El eje de ordenadas indica la expresión relativa del MtmiR171b (columnas de la izquierda), de HAM1 (columnas del centro) o de HAM2 (columnas de la derecha) en una planta de control (columnas blancas) o en una planta en la que se expresa negativamente MtmiR171b (columnas negras). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 10). La sobreexpresión de MtmiR171b induce una disminución de la expresión de los genes HAM1 y HAM2.
(B) El eje de ordenadas indica el número medio de raíces laterales observados en una planta de control (columna blanca) o en una planta en la que MtmiR171b se sobre expresa (columna negra). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 100). La sobreexpresión de MtmiR171b produce una reducción del número de raíces laterales.
FIGURA 2. Efectos de la sobreexpresión del MtmiPEP171b1 sobre la expresión del MtmiR171b y de los genes HAM1 y HAM2 (A) o sobre el número de raíces laterales (B) en M. truncatula.
(A) El eje de ordenadas indica la expresión relativa del MtmiPEP171b1 (gráfico de la izquierda), del miR171b (gráfico de la derecha, columnas de la izquierda), de HAM1 (n.° de referencia MtGI9-TC114268) (gráfico de la derecha, columnas del centro) o de HAM2 (n.° de referencia MtGI9-TC120850) (gráfico de la derecha, columnas de la derecha) en una planta de control (columnas blancas) o en una planta en la que se sobre expresa MtmiPEP171b1 (columnas negras). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 10). La sobreexpresión del MtmiPEP171b1 induce un aumento de la acumulación del MtmiR171b, así como una disminución de la expresión de los genes HAM1 y HAM2.
(B) El eje de ordenadas indica el número medio de raíces laterales observados en una planta de control (columna blanca) o en una planta en la que MtmiPEP171b1 se sobre expresa (columna negra). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 100). La sobreexpresión del MtmiPEP171b1 produce una reducción del número de raíces laterales.
FIGURA 3. Efectos del MtmiPEP171b1 sobre la expresión del MtmiR171b y de los genes HAM1 y HAM2 (A) o sobre el número de raíces laterales (B) en M. truncatula.
(A) El eje de ordenadas indica la expresión relativa del MtmiR171b (columnas de la izquierda), de HAM1 (columnas del centro) o de HAM2 (columnas de la derecha) en una planta de control (columnas blancas) o en una planta tratada por riego durante 5 días y 1 vez por día con el MtmiPEP171b1 a 0,01 pM (columnas gris claro), 0,1 pM (columnas gris oscuro) o 1 pM (columnas negras). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 10). La aplicación del MtmiPEP171b1 a diferentes concentraciones induce un aumento de la acumulación del MtmiR171b, así como una disminución de la expresión de los genes HAM1 y HAM2.
(B) El eje de ordenadas indica el número medio de raíces laterales observado en una planta de control (columna blanca) o en una planta tratada por riego con el MtmiPEP171b1 a 0,1 pM durante 5 días y 1 vez al día (columna negra). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 100). La aplicación del MtmiPEP171b1 a 0,1 pM produce una reducción del número de raíces laterales.
(C) El eje de ordenadas indica la expresión relativa del MtmiR171b (columnas de la izquierda), de HAM1 (columnas del centro) o de HAM2 (columnas de la derecha) en una planta de control (columnas blancas) o en una planta tratada por riego durante 5 días y 1 vez por día con el MtmiPEP171b1 a 0,01 pM (columnas grises), 0,1 pM (columnas gris oscuro) o 1 pM (columnas negras) o con 0,01 pM de un péptido mixto (LIVSHlYs EKFDCMRKILRI, SeQ ID NO: 428) (columnas gris claro) cuya composición en aminoácidos es idéntica al miPEP171b aunque la secuencia es diferente. La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 10).
FIGURA 4. Efectos del MtmiPEP171b1 sobre la expresión del pre-MtmiR171b (A) y del MtmiR171b (B) en M. truncatu la .
El eje de ordenadas indica la expresión relativa de los precursores de diferentes formas del microARN en las plantas de control (columna de la izquierda) o de las plantas tratadas por riego durante 5 días y 1 vez al día con el MtmiPEP171bl a 0,01 pM, 0,1 pM o 1 pM (columnas de la derecha). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 200). La aplicación del MtmiPEP171b1 a diferentes concentraciones produce un aumento de la acumulación del pre-MtmiR171b (A) y del MtmiR171b (B).
FIGURA 5. Efectos de la sobreexpresión del MtmiPEP171b1 (A) y efectos del MtmiPEP171b1 (B) sobre la expresión de diferentes precursores de miARN en M. truncatu la .
El eje de ordenadas indica la relación de la expresión de los precursores de los microARN en plantas que sobreexpresan el MtmiPEP171b1 sobre la expresión de estos mismos precursores de microARN en raíces de control (A), o la relación de la expresión de precursores de los microARN en plantas tratadas con el MtmiPEP171b1 (0,1 pM) sobre la expresión de estos mismos precursores en raíces de control (B). Los diferentes precursores de los microARN ensayados se indican de izquierda a derecha en el eje de abscisas, a saber, pre-MtmiR171b (SEQ ID NO: 246), pre-MtmiR169 (SEQ ID NO: 359), pre-MtmiR169a (SEQ ID NO: 360), pre-MtmiR171a (SEQ ID NO: 361), pre-MtmiR171h (SEQ ID NO: 362), pre-MtmiR393a (SEQ ID NO: 363), pre-MtmiR393b (SEQ ID NO: 364), pre-MtmiR396a (SEQ ID NO: 365) y pre-MtmiR396b (SEQ ID NO: 366). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 10). Se constata que el MtmiPEP171b1 produce un efecto solo en la acumulación del MtmiR171b y no sobre los otros miR.
FIGURA 6. Efectos de la traducción del MtmiPEP171b1 sobre la expresión del MtmiR171b puestos en evidencia en la planta modelo N icotiana bentham iana . El eje de ordenadas indica la expresión relativa de MtmiR171b en plantas de tabaco transformadas para que expresen el pri-MtmiR171b (columna blanca) o un pri-MtmiR171b mutado en el que el codón ATG se ha sustituido por ATT (columna negra). El pri-MtmiR171b mutado es por lo tanto incapaz de producir el MtmiPEP171b1. La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 30). Se constata que la ausencia de la traducción del MtmiPEP171b1 produce una fuerte disminución la acumulación del miR171b.
FIGURA 7. Efectos de la sobreexpresión del MtmiPEP171b1 sobre la expresión del pre-MtmiR171b puestos en evidencia en la planta modelo Nicotiana bentham iana .
El eje de ordenadas indica la expresión relativa del pre-MtmiR171b en plantas de tabaco que se han transformado para que expresen el MtmiR171b (columna de la izquierda), el MtmiR171b y el MtmiPEP171b1(columna del centro), o el MtmiR171b y una versión mutada del MtmiORF171b en la que el codón de inicio ATG se ha sustituido por ATT (coluna de la derecha). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 30). Se constata que la expresión del MtmiPEP171b1 aumenta la expresión del MtmiR171b y este efecto depende de la traducción de la MtmiORF171b en MtmiPEP171b1.
FIGURA 8. Efectos del MtmiPEP171b1 sobre la expresión del pre-MtmiR171b puestos en evidencia en la planta modelo Nicotiana bentham iana.
El eje de ordenadas indica la expresión relativa del MtmiR171b en plantas de tabaco transformadas para que expresen el MtmiR171b sobre las que se pulverizó 2 veces (0,1 pM) el MtmiPEP171b1, 12 h y 30 min antes de la toma de muestras (columna de la derecha) o no (columna de la izquierda). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 6). El péptido MtmiPEP171b1 utilizado por pulverización induce un aumento de la acumulación del MtmiR171b.
FIGURA 9. Efectos del MtmiPEP171b1 sobre la expresión del pri-miR171b (A), del pre-MtmiR171b (B) y del MtmiR171b (C) puestos en evidencia en la planta modelo N icotiana b entham iana .
El eje de ordenadas indica la expresión relativa de precursores de diferentes formas de microARN en plantas de tabaco modificadas para que expresen el MtmiR171b (columna de la izquierda) o modificadas para que expresen el MtmiR171b y sobreexpresen el MtmiPEP171b1 (columnas de la derecha, fig. 9A) o tratadas con 0,1 pM de miPEP171b1 (Fig. 9B y C). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 30). La sobreexpresión del MtmiPEP171b1 o la aplicación del miPEP171b1 aumenta la acumulación del pri-MtmiR171b (A), del pre-MtmiR171b (B) y del MtmiR171b (C).
FIGURA 10. Localización del MtmiPEP171b1 en las células de las hojas de tabaco que se han modificado para que expresen el MtmiPEP171b1.
Las fotografías representan las células de las hojas de tabaco modificadas para que expresen la proteína GFP solo (cuadro de la derecha) o la proteína GFP fusionada con el MtmiPEP171b1 (cuadro de la derecha). Estas observaciones indican que el MtmiPEP171b1 está localizado en pequeños cuerpos nucleares.
FIGURA 11. Efectos de la expresión del AtmiPEP165a (identificado en Arabidopsis thaliana sobre la expresión del AtmiR165a (A) y de la expresión de AtmiPEP319a2 (identificado en Arabidopsis thaliana) sobre el AtmiR319a (B), puesto en evidencia en la planta modelo de tabaco.
(A) El eje de ordenadas indica la expresión relativa del AtmiR165a en plantas de tabaco modificadas para que expresen el AtmiR165a (columna de la izquierda) o para que expresen el AtmiR165a y el AtmiPEP165a (columna de la derecha).
(B) El eje de ordenadas indica la expresión relativa del AtmiR319a en plantas de tabaco modificadas para que expresen el AtmiR319a (columna de la izquierda) o para que expresen el AtmiR319a y el AtmiPEP319a (columna de la derecha).
La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 30). En los dos casos, se constata que la expresión de la miORF, y por tanto la producción del miPEP, produce un aumento de la acumulación del pre-miR.
FIGURA 12. Efectos del tratamiento con el AtmiPEP165a sobre el crecim iento de las raíces de Arabidopsis thaliana .
La fotografía presenta dos plantas de la misma edad: una planta de control (planta de la izquierda) y una planta tratada con el AtmiPEP165a (planta de la derecha). El tratamiento con el AtmiPEP165a produce un fenotipo de crecimiento radicular muy acelerado en Arabidopsis thaliana. El gráfico muestra la expresión del pre-miR165 en respuesta al tratamiento con dosis crecientes de AtmiPEP165a.
FIGURA 13. Conservación de la secuencia del miPEP8 identificado en drosófila. Las secuencias del miPEP8 (SEQ ID NO: 104) se dedujeron a partir de las secuencias de la miORF8 (SEQ ID NO: 208) de 12 especies de drosófila diferentes y se alinearon. Un histograma representa la conservación de cada aminoácido entre las secuencias de la miORF8 en las 12 especies analizadas.
FIGURA 14. Evolución de la masa (kDa) y del punto isoeléctrico (pI) del miPEP8 en las especies de drosófila. El eje de ordenadas de la izquierda indica el tamaño del miPEP8 (en kD). El eje de ordenadas de la derecha indica el punto isoeléctrico del miPEP. El eje de abscisas indica el origen del miPEP, es decir, las especies de drosófila. Se constata que a pesar de una modificación importante de su tamaño (más de un factor 3), la carga de los miPEP se mantiene muy básica (>9,8) en las 12 especies estudiadas.
FIGURA 15. Efecto de la adición de secuencias sobre la función del miPEP.
Las hojas de tabaco se transformaron par que sobre expresaran el miPEP171b. Estos gráficos muestran que la adición de secuencias (marcador His, HA o GFP) no altera la función del miPEP. El eje de ordenadas indica la expresión relativa del pre-MtmiR171b en plantas de tabaco que se han transformado para que expresen el MtmiR171b (columna de la izquierda), el MtmiR171b y el MtmiPEP171b1. con o sin la adición de marcadores proteicos (columnas de la derecha). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 6). Se constata que la expresión del MtmiPEP171b1 aumenta la expresión del MtmiR171b y este efecto es independiente de la presencia de marcadores.
FIGURA 16. Expresión del MtmiPEP171b1 en el sistema radicular de Medicago truncatula.
Las raíces de Medicago truncatula se transformaron para que expresaran fusiones entre la proteína GUS (en azul) y el promotor del miR17b (A, E), el ATG del miPEP171bl (B, F), el miPEP171bl completo (C, G) o bien el ATG2 (segundo ATG que se encuentra en el precursor, después del miPEP) (D, H). La expresión de miR en las puntas de las raíces (A) y en las raíces laterales (E) es claramente visible. Las fusiones transcripcionales (B, F) y traduccionales (C, G) muestran una expresión del miPEP171b en los mismos tejidos, aunque el ATG siguiente no está activo (D, H).
FIGURA 17. Expresión de DmmiPEP8 en células de Drosophila melanogaster Se transfectaron células de Drosophila melanogaster para sobreexpresar DmmiPEP8 (OE miPEP8) o bien miPEP8 cuyos codones de inicio de la traducción estaban mutados (OE miPEP8 mut). El eje de ordenadas indica la expresión relativa del pre-miR8. La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de experimentos independientes = 6). Se constata que la expresión del DmmiPEP8 aumenta la expresión del DmmiR8 y este efecto está unido a la traducción del ARNm.
FIGURA 18. Impacto del DmmiPEP8 sobre la acumulación del DmmiR8 en las células de D. melanogaster Las células de Drosophila melanogaster se transfectaron para que sobreexpresaran el DmmiR8 natural (OE miR8) o bien el DmmiR8 en el que los codones de inicio de la traducción estaban mutados (OE miR8 miPEP8 mut). El eje de ordenadas indica la expresión relativa del Pre-miR8. La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de experimentos independientes = 2). Se constata que la presencia del DmmiPEP8 aumenta la expresión del DmmiR8.
FIGURA 19. Impacto del HsmiPEP155 sobre la acumulación del HsmiR155 en las células de Homo sapiens Las células HeLa de Homo sapiens se transfectaron para que sobre expresaran e1HsmiPEP155 (OE miPEP155). El eje de ordenadas indica la expresión relativa del pre-miR155. La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de experimentos independientes = 2). Se constata que la expresión de1HsmiPEP155 aumenta la expresión del HsmiR155.
FIGURA 20. Efectos de la traducción del MtmiPEP171b1 sobre la expresión del MtmiR171b puestos en evidencia en la planta modelo Nicotiana benthamiana.
El eje de ordenadas indica la expresión relativa del MtmiR171b en plantas de tabaco que se han transformado para que expresen el pri-MtmiR171b (columna de la izquierda), un pri-miR171b en el que la miORF171b se ha eliminado (columna del centro) o un pri-miR171b mutado en el que el codón ATG se ha sustituido por ATT (columna de la derecha). El pri-primiR171b mutado es por lo tanto incapaz de producir el miPEP171b1. La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 30). Se constata que la ausencia de la traducción del miPEP171b1 produce una fuerte disminución la acumulación del miR171b.
FIGURA 21. Efectos de la sobreexpresión del MtmiPEP171b1 sobre la expresión del MtmiR171b puestos en evidencia en la planta modelo Nicotiana benthamiana.
El eje de ordenadas indica la expresión relativa del MtmiR171b en plantas de tabaco que se han transformado con un vector que permite la expresión del miPEP171b y con un segundo vector vacío (columna blanca), que sea un vector que permita la expresión del mtmiPEP171b (columna negra de la izquierda), que sea un vector en el que el codón de la ORF que codifica el mtmiPEP171b se ha sustituido por ATT (columna negra del centro), que sea un vector en el que la secuencia de nucleótidos de la ORF se ha mutado sin modificar la secuencia de aminoácidos del péptido traducido (miPEP codificado por una ORF degenerada) (columna negra de la derecha). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 30). Se constata que la expresión del MtmiPEP171b1 aumenta la expresión del MtmiR171b y este efecto depende de la traducción de la MtmiORF171b en MtmiPEP171b1.
FIGURA 22. Efectos del AtmiPEP165a sobre la acumulación del AtmiR165a y de sus genes diana (PHAVOLUTA: PHV, PHABOLUSA: PHB y REVOLUTA: REV).
El eje de ordenadas indica la expresión relativa de AtmiR165a, PHV, PHB y REV en raíces de Arabidopsis thaliana tratadas con agua (control) o con diferentes concentraciones de AtmiPEP165a (0,01 j M, 0,1 j M, 1 j M o 10 j M). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 10).
El tratamiento de las plantas con concentraciones más y más importantes de AtmiPEP165a pone en evidencia un efecto dependiente de la dosis de la acumulación del AtmiR165a y de la regulación negativa de sus genes diana en función de la cantidad de AtmiPEP165a.
FIGURA 23. Efectos de un tratamiento con el AtmiPEP164a sobre la expresión del AtmiR164a en A. thaliana. Las fotografías representan los resultados de un análisis mediante transferencia de Northern de la acumulación del AtmiR164a en las raíces tratadas con agua (control, fotografía de la izquierda) o con 0,1 j M de un péptido sintético, que tiene una secuencia idéntica a la del AtmiPEP164a, disuelto en agua (0,1 j M de miPEP164a). El ARN U6 se utiliza como control de carga que permite cuantificar la cantidad de AtmiR164a.
Este experimento se repitió 4 veces de manera independiente y dio resultados similares.
El tratamiento de brotes de A. thaliana con 0,1 j M de miPEp164a produce un aumento de la acumulación de miR164a.
FIGURA 24. Efectos del tratam iento con el AtmiPEP164a sobre el crecim iento de Arabidopsis thaliana. Las fotografías presentan dos plantas (vistas desde arriba y de perfil) después de 3 semanas de crecimiento: una planta de control regada con agua (A) y una planta regada con una composición de 0,1 j M de péptido sintético correspondiente al AtmiPEP164a (B). El riego de las plantas de Arabidopsis thaliana con AtmiPEP164a aumenta significativamente el crecimiento de la planta.
FIGURA 25. Efectos de un tratamiento con el AtmiPEP165a sobre la expresión del AtmiR165a en A. thaliana. Las fotografías representan los resultados de un análisis mediante transferencia de Northern de la acumulación del AtmiR165a en las raíces tratadas con agua (control, fotografía de la izquierda) o con 0,1 j M de un péptido sintético, que tiene una secuencia idéntica a la del AtmiPEP165a, disuelto en agua (0,1 j M de miPEP165a). El ARN U6 se utiliza como control de carga que permite cuantificar la cantidad de AtmiR165a.
Este experimento se repitió 4 veces de manera independiente y dio resultados similares.
El tratamiento de brotes de A. thaliana con 0,1 j M de miPEp165a produce un aumento de la acumulación de miR165a.
FIGURA 26. Efectos de la sobreexpresión del AtmiPEP319a1 sobre la expresión del AtmiR319a en A. thaliana .
El eje de ordenadas indica la expresión relativa del AtmiR319a en una planta de control (columna de la izquierda) o en una planta en la que se sobreexpresa AtmiPEP319a1 (columna de la derecha). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 10). La sobreexpresión del AtmiPEP319a1 induce un aumento de la acumulación del Atmir319a.
FIGURA 27. Efectos del tratam iento con el AtmiPEP319a sobre el crecim iento de Arabidopsis thaliana. Las fotografías presentan dos plantas (vistas desde arriba y de perfil) después de 3 semanas de crecimiento: una planta de control regada con agua (A) y una planta regada con una composición de 0,1 pM de péptido sintético correspondiente al AtmiPEP319a1 (B). El riego de las plantas de Arabidopsis thaliana con AtmiPEp3l9a1 aumenta significativamente el crecimiento de la planta.
FIGURA 28. Inmunolocalización.
Las raíces de Medicago truncatula se transformaron para que expresaran fusiones entre la proteína GUS (en azul) y el ATG del miPEP171b (PromiRi7ib-ATG1:GUS) o bien el ATG2 (segundo ATG que se encuentra en el precursor, después del miPEP) (PromiRi7ib-ATG2:GUS). También se realizó un marcado con un anticuerpo anti-miPEP171b (mipEP171b). La inmunolocalización del miPEP171b en las raíces de M. truncatula revelan la presencia del miPEP171b en los sitios de inicio de las raíces laterales, mostrando una co-localización entre el microARN y el miPEP correspondiente.
FIGURA 29. Efectos de la sobreexpresión del AtmiPEP160b1 sobre la expresión del AtmiR160b en A. thaliana .
El eje de ordenadas indica la expresión relativa del AtmiR160b en una planta de control (barra de la izquierda) o en una planta en la que se sobreexpresa AtmiPEP160b1 (barra de la derecha). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 10).
La sobreexpresión del AtmiPEP160b1 produce un aumento de la expresión relativa del AtmiR160b.
FIGURA 30. Efectos del AtmiPEP164a1 sobre la expresión del pri-AtmiR164a.
El eje de ordenadas indica la expresión relativa del AtmiR164a en una planta de control (barra de la izquierda) o en una planta tratada por riego 1 vez al día con el AtmiPEP164a1 a 0,1 pM (barra de la derecha). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 10).
La adición de AtmiPEP164a1 produce un aumento de la expresión relativa del AtmiR164a.
FIGURA 31. Efectos de la sobreexpresión del AtmiPEP319a1 sobre la expresión del AtmiR319a en A. thaliana .
El eje de ordenadas indica la expresión relativa del AtmiR319a en una planta de control (barra de la izquierda) o en una planta en la que se sobre expresa AtmiPEP319a1 (barra de la derecha). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 10).
La sobreexpresión del AtmiPEP319a1 produce un aumento de la expresión relativa del AtmiR319a.
FIGURA 32. Efectos de la sobre expresión del MtmiPEP169d sobre la expresión del MtmiR169d en M. truncatula.
El eje de ordenadas indica la expresión relativa del MtmiR169d en una planta de control (barra de la izquierda) o en una planta tratada por riego 1 vez al día con el MtmiPEP169d a 0,1 pM (barra de la derecha). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 10).
La adición de MtmiPEP169d produce un aumento de la expresión relativa del MtmiR169d.
FIGURA 33. Efectos de la sobreexpresión del MtmiPEP171e sobre la expresión del MtmiR171e en M. truncatula
El eje de ordenadas indica la expresión relativa del MtmiR171e en una planta de control (barra de la izquierda) o en una planta en la que se sobreexpresa MtmiPEP171e (barra de la derecha). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 10).
La sobreexpresión del MtmiPEP171e produce un aumento de la expresión relativa del MtmiR171e.
FIGURA 34. Localización del MtmiPEP171b1 en una planta natural de M. truncatula.
A través de inmunotransferencia, se analizaron diferentes cantidades de péptidos sintéticos MtmiPEP171b1 (1, 0,5, o 0,1 nmol) y un extracto total de raíces de M. truncatula, con un anticuerpo específico del MtmiPEP171b1. El MtmiPEP171bl se produce de manera natural en las raíces de M. truncatula.
FIGURA 35. Presencia del AtmiPEP165a en una planta natural de A. thaliana.
La fotografía superior corresponde a un análisis por transferencia de Western de la cantidad de AtmiPEP165a en una planta joven natural de A. thaliana Col-0 (izquierda) y en una planta joven de A. thaliana que sobreexpresa AtmiPEP165a (derecha).
La fotografía de abajo corresponde al análisis por transferencia de western de la cantidad de una proteína de control, la tubulina, en una planta joven natural de A. thaliana Col-0 (izquierda) y en una planta joven de A. thaliana que sobreexpresa AtmiPEp165a (derecha).
El AtmiPEP165a se produce de manera natural en A. thaliana y está presente en mayor cantidad en las plantas que sobreexpresan AtmiPEP165a.
FIGURA 36. Modo de acción del AtmiPEP165a en A. thaliana.
(A) El eje de ordenadas indica la expresión relativa del miR165a en raíces de control (barra de la izquierda) o tratadas por riego 1 vez al día con el AtmiPEP165a a 10 pM (barra de la derecha). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 10).
La adición de AtmiPEP165a produce un aumento de la expresión relativa del AtmiR165a.
(B) El eje de ordenadas indica la expresión relativa del pri-miR165a, en presencia de cordicepina (inhibidor de la síntesis de ARN), en las raíces de control (curva gris) o tratadas por riego 1 vez al día con el AtmiPEP165a a 10 pM (curva negra). El eje de abscisas indica la duración del tratamiento con cordicepina.
La adición de AtmiPEP165a no produce una mayor estabilidad del pri-miR165a.
(C) El eje de ordenadas indica la expresión relativa del pri-miR165a, en las plantas naturales (Col-0) o mutadas con un alelo débil de la segunda subunidad grande de la ARN polimerasa II (nrpb2-3). El eje de abscisas indica si las plantas se han regado con agua o con el AtmiPEP165a a 10 pM.
Las plantas mutadas, a diferencia de las plantas naturales, no son capaces de acumular el AtmiR165a en respuesta al AtmiPEP165a.
FIGURA 37. Efectos del pri-miR171b sobre el número de raíces laterales en M. truncatula.
El eje de ordenadas indica el número medio de raíces laterales observadas en una planta de control (barra blanca) o en una planta en la que se sobreexpresa el pri-miR171b (barra negra). La barra de error se corresponde con el error típico de la media (número de individuos = 100).
La sobreexpresión del pri-miR171b produce una reducción del número de raíces laterales.
FIGURA 38. Posibilidad de traducción del DmmiPEP8 en las células de Drosophila melanogaster.
Las células de Drosophila melanogaster se transfectaron para que sobre expresaran el DmmiPEP8 (miPEP8::GF) o bien el DmmiPEP8 mt (en el que los codones de inicio de la traducción estaban mutados(miPEP8 mt::GFP)). Como control de la transfección, se cotransfectó un plásmido que producía la proteína moesina-RFP (imágenes de abajo) con los plásmidos codificantes de los DmmiPEP8 (imagen de la izquierda) y DmmiPEP 8 mt (imagen de la derecha). Se constata que los codones de inicio presentes en la secuencia de DmmiPEP8 son funcionales ya que permiten la síntesis de la GFP (imagen de arriba a la izquierda) mientras que las construcciones mutadas en los ATG no producen casi nada de GFP (imagen de arriba a la derecha).
Estos resultados sugieren por tanto que la ORF del miPEP es funcional.
Ejemplos
A: Análisis de los miPEP en las plantas
Ejemplo 1 - Caracterización en la planta modelo Medicago truncatula
Ejemplo 1A - MtmiPEP171bl
a) Identificación y caracterización del MtmiPEP171bl (miPEP171bl identificado en Medicago truncatula)
El microARN MtmiR171b se expresa en la región meristemática de las raíces. La sobreexpresión de este microARN conduce principalmente a una reducción de la expresión de los genes HAM1 (n.° de referencia MtGI9-TC114268) y HAM2 (n.° de referencia MtGI9-TC120850) (Figura 1A), así como una reducción del número de raíces laterales (Figura 1B). La sobreexpresión del pri-miR171b también produce una reducción del número de raíces laterales (Figura 37).
La secuencia de la transcripción primaria del MtmiR171b se determinó utilizando la técnica RACE-PCR. El análisis de la secuencia de la transcripción primaria ha permitido identificar la presencia de varias pequeñas fases de lectura abierta (ORF) completamente inesperadas. Estas ORF se han denominado miORF por "ORF de microARN'. Estas miORF codifican potencialmente péptidos cortos, de aproximadamente 4 a 100 aminoácidos. No se ha encontrado ninguna homología significativa respecto a estas miORF en las bases de datos.
La sobreexpresión de la primera miORF, llamada MtmiORF171b, da lugar a un aumento de la acumulación del MtmiR171b y una reducción de la expresión de los genes HAM1 y HAM2 (ver Figura 2A), así como una reducción del número de raíces laterales (Figura 2B), como la que se había observado durante la sobreexpresión del MtmiR171b.
Para determinar si la MtmiORF171b da lugar a la producción real de un péptido y si la función de regulación observada anteriormente se lleva a cabo por dicho péptido, se aplicó un péptido sintético, en el que la secuencia era idéntica a la codificada potencialmente por la MtmiORF171b, se aplicó en las raíces del Medicago truncatula. La aplicación de este péptido produce el fenotipo ya observado anteriormente durante la sobreexpresión del MtmiORF171b, es decir, que produce un aumento de la acumulación del MtmiR171b y una reducción de la expresión de los genes HAM1 y HAM2 (véase la Figura 3A), así como una reducción del número de raíces laterales (Figura 3B).
Los resultados de estos experimentos demuestran que la MtmiORF171b codifica un péptido capaz de modular la acumulación del MtmiR171b y la expresión de genes diana del MtmiR171b: HAM1 y HAM2. Dicho péptido se denominó MtmiPEP171bl ("miPEP" correspondiente a un PÉPtido codificado por un microARN).
Por otra parte, el MtPEP171b1 produce un aumento de la acumulación del MtmiR171b (Figura 4A) y del pre-MtmiR171b (Figura 4B).
b) Especificidad del miPEP171b1
Se determinó y comparó la expresión de diferentes microARN de Medicago truncatula (MtmiR171b SEQ ID NO: 319, MtmiR169 (SEQ ID NO: 367, MtmiR169a (SEQ ID NO: 368, MtmiR171a (SEQ ID NO: 369, MtmiR171h (SEQ ID NO: 370, MtmiR393a (SEQ ID NO: 371, MtmiR393b (SEQ ID NO: 372, MtmiR396a (SEQ ID NO: 373 y MtmiR396b (SEQ ID NO: 374) entre plantas de control y plantas en las que se sobre expresa la MtmiORF171b que codifica el MtmiPEP171bl (Figura 5A), o entre plantas de control y plantas cultivadas en un medio de cultivo que contenía el MtmiPEP171bl (Figura 5B).
Los resultados obtenidos indican que el MtmiPEP171bl solo produce un aumento de la acumulación del MtmiR171b y no en otros miR, lo que indica que un miPEP solo tiene efecto sobre el microARN del que procede.
c) Localización del miPEP171bl
Por otra parte, la inmunolocalización del miPEP171b1 en las raíces de M. truncatula revelan la presencia del miPEP171b1 en los sitios de inicio de las raíces laterales, mostrando una co-localización entre el microARN y el miPEP correspondiente (Figuras 28 y 34).
Ejemplo 1B - MtmiPEP169d
En referencia al MtmiPEP169d, se ha demostrado in vivo en M. truncatula que la adición de MtmiPEP169d produce una acumulación del MtmiR169d (Figura 32).
Ejemplo 1C - MtmiPEP171e
En referencia al MtmiPEP171e, se ha demostrado in vivo en M. truncatula que la sobreexpresión de este miPEP produce una acumulación del MtmiR171e (Figura 33).
Ejemplo 2 - Caracterización en la planta modelo del tabaco
a) Conservación del mecanismo en el tabaco
Para determinar si el mecanismo de regulación de los microARN se conserva en otras especies de plantas, se ensayó la regulación del MtmiR171b por el MtmiPEP171bl en un modelo celular diferente. Para esto, se introdujeron el MtmiR171b y el MtmiPEP171bl en las hojas de tabaco.
La acumulación del MtmiR171b se midió en hojas de tabaco transformadas para que expresen el MtmiR171b de Medicago truncatula a partir del pri-miR natural capaz de producir el MtmiPEP171b1 o a partir de una versión mutada del pri-miR incapaz de producir el MtmiPEP171b1 (en la que el codón de inicio ATG de la MtmiORF171b se ha sustituido por ATT) (Figura 6 y Figura 20). La ausencia de traducción del MtmiPEP171bl da lugar a una fuerte disminución de la acumulación del MtmiR171b.
La acumulación del pre-MtmiR171b se ha medido en las hojas de tabaco transformadas para que expresen el MtmiR171b de Medicago truncatula solo (control), o para que expresen además MtmiORF171b natural de Medicago truncatula (35SmiPEP171b1 ATG), o una versión mutada de MtmiORF171b en la que el codón de inicio ATG se ha reemplazado por ATT (35SmiPEP171b1 ATT) (Figura 7 y Figura 21). La expresión de MtmiORF171b produce un aumento de la acumulación del pre-miR171b, y esta acumulación del pre-miR171b depende de la traducción de la MtmiORF171b en micropéptido.
Del mismo modo, en las hojas de tabaco transformadas para que expresen el MtmiR171b de Medicago truncatula, tratadas o no por pulverización con el MtmiPEP171bl (0,1 pM) una primera vez 12 h antes de la toma de muestras y después una segunda vez 30 minutos antes de la toma de muestras, se ha observado que el MtmiPEP171bl puede utilizarse directamente en forma de péptido por medio de pulverizaciones foliares (Figura 8).
Por otra parte, se ha observado en el tabaco (como en Medicago truncatula) que el MtmiPEP171b1 produce un aumento de la acumulación del mtmiR171b (Figura 9A), y del pre-MtmiR171b (Figura 9B), pero disminuye la acumulación del pri-MtmiR171b (Figura 9C).
El conjunto de estos resultados indica que el mecanismo de regulación de los microARN y de sus genes diana bajo el control de los miPEP está conservado entre especies.
b) Localización intracelular del MtmiPEP171bl
Las hojas de tabaco se transformaron para que sobre expresaran el MtmiPEP171bl de Medicago truncatula fusionado con una proteína fluorescente (GFP) (Figura 10). Los resultados obtenidos indican que el miPEP está localizado en pequeños cuerpos nucleares.
c) Identificación de los miPEP a partir de bases de datos
A partir de las bases de datos genómicas de plantas, se ha investigado la presencia de fases de lectura abierta en el seno de las trascripciones primarias de 70 miR, los inventores han identificado 101 miORF susceptibles de codificar un miPEP.
A día de hoy, los AtmiPEP165a y AtmiPEP319a2, identificados en Arabidopsis thaliana, ya se han caracterizado. Los experimentos realizados en la planta modelo de tabaco han permitido demostrar que la sobreexpresión de AtmiORF165a o de AtmiORF319a produce respectivamente un aumento de la acumulación de AtmiR165a o del AtmiR319a (Figura 11).
El miR165a regula factores de transcripción como Revoluta, Phavoluta y Phabulosa. El miR319 regula genes de la familia TCP.
Ejemplo 3 - Caracterización en la planta modelo Arabidopsis thaliana
Ejemplo 3A - AtmiPEP165a
En referencia al AtmiPEP165a, se ha demostrado in vivo en Arabidopsis thaliana que el tratamiento con el AtmiPEP165a produce un fenotipo de crecimiento radicular muy acelerado (Figura 12).
Por otra parte, el tratamiento de las plantas con concentraciones más y más importantes de miPEP165a indica un efecto dependiente de la dosis de la acumulación del miR165a y de la regulación negativa de sus genes diana (PHAVOLUTA: PHV, PHABOLUSA: PHB y REVOLUTA: REV) en función de la cantidad de miPEP165A (véase la Figura 22).
Ejemplo 3B - AtmiPEP164a
En referencia al AtmiPEP164a, éste se sintetizó y utilizó para investigar un aumento de la acumulación de miR164a en las raíces de A. thaliana tratadas con el péptido sintético.
Los análisis por transferencia de Northern indican que el tratamiento de la planta con el péptido miPEP164a produce un aumento de la acumulación del miR164a (Figura 23).
El mismo tipo de resultados se obtuvo por qRT-PCR (Figura 30).
Igualmente se ha demostrado in vivo en Arabidopsis thaliana que el tratamiento de la planta con el AtmiPEP164a aumenta significativamente el crecimiento de la planta (Figura 24).
Ejemplo 3C - AtmiPEP165a
En referencia al AtmiPEP165a, éste se sintetizó y utilizó para investigar un aumento de la acumulación de miR165a en las raíces de A. thaliana tratadas con el péptido sintético.
Los análisis por transferencia de Northern indican que el tratamiento de la planta con el péptido miPEP165a produce un aumento de la acumulación del miR165a (Figura 25).
Por otra parte, para determinar el modo de acción de los miPEP con respecto a la acumulación de sus propios miR, la expresión del pri-miR165a se ha analizado en plantas naturales y en plantas transformadas para que sobreexpresen el miPEP165a (Figura 35).
La expresión del pri-miR165a está favorecida en las plantas que sobre expresan el miPEP165a (Figura 36A).
En presencia de cordicepina, un inhibidor de la síntesis de ARN, la cantidad de pri-miR165a es idéntica en las plantas naturales y en las plantas transformadas (Figura 36B), lo que indica que el miPEP165a no actúa como un estabilizador del ARN, sino más bien como un activador transcripcional del pri-miR165a.
Además, la expresión del pri-miR165a se analizó en plantas naturales (Col-0) y en plantas mutadas portadoras de un alelo débil de la segunda subunidad grande de la ARN polimerasa II (plantas nrpb2-3). Los resultados obtenidos indican que las plantas mutadas no presentan un aumento de la acumulación del pri-miR165 en respuesta al miPEP165a, a diferencia de las plantas naturales. Esto parece indicar que el miPEP actúa como un regulador transcripcional.
Ejemplo 3D - AtmiPEP319al
En referencia al AtmiPEP319a1, éste también se sintetizó y se utilizó para investigar un aumento de la acumulación de miR319a en las raíces de A. thaliana tratadas con el péptido sintético.
Los análisis por qRT-PCR indican que la sobreexpresión del AtmiPEP319a1 produce un aumento de la acumulación del miR319a (Figuras 26 y 31).
Igualmente se ha demostrado in vivo en Arabidopsis thaliana que el tratamiento de la planta con el AtmiPEP319a1 aumenta significativamente el crecimiento de la planta (Figura 27).
Ejemplo 3E - AtmiPEP160bl
En referencia al AtmiPEP160b1, se ha demostrado in vivo en A. thaliana que la sobreexpresión de este miPEP produce una acumulación del AtmiR160b (Figura 29).
Materiales y procedimientos
Material biológico
La superficie de granos de M. truncatula se esterilizó y se dejaron germinar sobre placas de agar durante 5 días a 4 °C en oscuridad. A continuación, los brotes se cultivaron en placas cuadradas de 12 cm llenadas de medio Fahraeus sin nitrógeno y que contenían fosfato 7,5 pM (Lauresergues y col., Plant J., 72(3):512-22, 2012). Se hizo el recuento de las raíces laterales cada día. En los tiestos, las plantas se regaron cada dos días con medio Long Ashton modificado que contenía poco fósforo (Balzergue y col., Journal of experimental botany, (62):1049-1060, 2011).
Los péptidos se sintetizaron en Eurogentec o Smartox-Biotech. El MtmiPEP171bl se dejó en suspensión en una solución de agua, un 40% de acetonitrilo, un 50% de ácido acético, un 10% (v/v/v), y otros péptidos se dejaron en suspensión en agua.
El riego de las hojas por pulverización con los péptidos se realizó utilizando soluciones de péptidos a diferentes concentraciones (0,01, 0,1, 1 pM), una primera vez 12 h antes de la toma de muestras y después una segunda vez 30 min antes de la toma de muestras.
Transcripción inversa de los microARN
El ARN se extrajo utilizando el reactivo Tri-Reagent (MRC) según las instrucciones del fabricante, a excepción de la precipitación del ARN que se llevó a cabo con 3 volúmenes de etanol. La transcripción inversa del ARN se llevó a cabo utilizando el cebador específico RTprimer171b en tallo lazo en combinación con hexámeros para efectuar la transcripción inversa del ARN de alto peso molecular.
En resumen, se añadió 1 pg de ARN al cebador en tallo lazo MIR171b (0,2 pM), el hexámero (500 ng), el tampón RT (1X), la enzima transcriptasa inversa SuperScript (SSIII) (una unidad), los dNTP (0,2 mM cada uno), el DDT (0,8 mM), en una mezcla de reacción final de 25 pl. Para efectuar la transcripción inversa, se llevó a cabo una reacción de transcripción inversa pulsada (40 repeticiones del siguiente ciclo: 16 °C durante 2 minutos, 42 °C durante un minuto y 50 °C durante un segundo, seguidos por una inactivación final de la transcripción inversa a 85 °C durante 5 minutos). Análisis por RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR)
El ARN total de las raíces de M. truncatula o de las hojas de tabaco se extrajeron utilizando el kit de extracción RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen). La transcripción inversa se realizó utilizando la transcriptasa inversa SuperScript II (Invitrogen) a partir de 500 ng de Ar N total.
Se realizaron tres repeticiones (n=3) con dos repeticiones técnicas cada una. Cada experimento se repitió de dos a tres veces. Las amplificaciones por qPCR se realizaron utilizando un termociclador LightCycler 480 System (Roche Diagnostics) según el procedimiento descrito en Lauressergues y col. (Plant J., 72(3):512-22, 2012).
Análisis estadísticos
Los valores medios de la expresión relativa de los genes o de la producción de raíces laterales se analizaron utilizando el ensayo de Student o el ensayo de Kruskal-Wallis. Las barras de error representan la desviación típica de la media (SEM, Error Típico de la Media). Los asteriscos indican una diferencia significativa (p<0,05).
Construcciones plasmídicas
Los fragmentos de ADN de interés se amplificaron con la polimerasa Pfu (Promega). Los fragmentos de ADN se clonaron con la ayuda de las enzimas XhoI y NotI en un plásmido pPEX-DsRED para una sobreexpresión bajo el control del fuerte promotor constitutivo 35S, y con la ayuda de las enzimas KpnI-NcoI en un plásmido pPEX GUS para los genes indicadores, según el procedimiento descrito en Combier y col. (Genes & Dev, 22: 1549-1559, 2008). Para los miPEP 165a y 319a, las miORF correspondientes se clonaron en el pBIN19 según el procedimiento descrito en Combier y col. (Genes & Dev, 22: 1549-1559, 2008).
Transformación de las plantas
Las plantas compuestas que poseían raíces transformadas con Agrobacterium rhizogenes se obtuvieron por el procedimiento descrito en Boisson-Dernier y col. (Mol Plant-Microbe Interact, 18:1269-1276, 2005). Las raíces transformadas se verificaron y seleccionaron mediante la observación del DsRED con una lupa binocular fluorescente.
Las raíces de control correspondían a raíces transformadas con A. Rhizogenes que no contenían el vector pPEXDsRED. La transformación de las hojas de tabaco se llevó a cabo según el procedimiento descrito en Combier y col. (Genes & Dev, 22: 1549-1559, 2008).
Transferencia de Northern
El análisis por transferencia de Northern se llevó a cabo según el protocolo descrito por Lauressergues y col. Plant J, 72(3):512-22, 2012.
Las muestras biológicas se homogeneizaron en un tampón que contenía 0,1 M de NaCl, un 2 % de SDS, 50 mM de Tris-HCl (pH 9), 10 mM de EDTA (pH 8) y 20 mM de mercaptoetanol, y se extrajo el ARN 2 veces con una mezcla de fenol/cloroformo y se precipitó en etanol.
El ARN se cargó sobre gel PAGE al 15% y se transfirió sobre una membrana de nylon (HybondNX, Amersham). El ARN se hibridó con una sonda de oligonucleótidos, se marcó de manera radioactiva en su extremidad, para detectar el ARN U6 o para el miR164a.
Las hibridaciones se llevaron a cabo a 55 °C. Las señales de hibridación se cuantificaron utilizando un phosphoroimager (Fuji) y se normalizaron con la señal de la sonda específica del ARN U6.
Estabilidad del ARN
Para cada condición, las plantas de 2 semanas y cultivadas verticalmente sobre medio MS sólido se transfirieron en placas de 6 pocillos que contenían 1 ml de medio MS líquido. Después de 16 horas de incubación con 1 mM de miPEP, las plantas se trataron con 100 pg/ml de cordicepina o con agua (utilizada como control), y se recogieron a diferentes momentos para extraer y cuantificar el ARN. Cada experimento se llevó a cabo 3 veces.
Marcado histoquímico
El marcado con GUS se realizó según el procedimiento descrito en Combier y col., (Genes & Dev, 22: 1549-1559, 2008). Las muestras se observaron con un microscopio (axiozoom).
Inmunolocalización
Las raíces o las plántulas de tejido de Medicago se fijaron durante 2 horas en formol al 4 % (v/v) con 50 mM de tampón de fosfato (pH 7,2), y después se incluyeron en agarosa LMP al 5 % en agua (por debajo del punto de fusión). Se obtuvieron cortes finos (100 um) y se colocaron en Pbi (tampón de fosfato para inmunología) sobre láminas revestidas de teflón, se bloquearon en Pbi, Tween al 2 % y seroalbúmina bovina al 1 % durante 2 horas (PbiT-BSA), y después se marcaron durante una noche (12 h) a 4 °C con el anticuerpo primario diluido en BSA-PbiT. Los cortes se lavaron con PBiT y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 h con un anticuerpo secundario diluido en PbiT-BSA. A continuación, las láminas se lavaron en Pbi durante 30 min y se montaron en un citifluor (medio de montaje). Los anticuerpos primarios y las diluciones eran los siguientes: 1716a (1:500, v/v). El anticuerpo secundario era un anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo acoplado a la sonda fluorescente Alexa Fluor 633 (Molecular Probes), y se utilizó a una dilución de 1:1000 (v/v).
Transferencia de Western
Se obtuvo un extracto total de proteínas según el procedimiento descrito en Combier y col., (Genes & Dev, 22: 1549­ 1559, 2008) y se separó por s DS-PAGE. La transferencia se llevó a cabo en un tampón de fosfato durante una noche a 4 °C, a 15V, y después se incubó la membrana durante 45 min a temperatura ambiente en una solución de glutaraldehído al 0,2 % (v/v). Los anticuerpos primarios se utilizaron a una dilución de 1: 1000 (v/v) y los anticuerpos de cabra anti-IgG de conejo conjugados con HRP se utilizaron como anticuerpos secundarios a una dilución de 1: 40.000 (v/v).
Tabla 8. Lista de cebadores
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(continuación)
Figure imgf000105_0001
(continuación)
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B: Análisis de los miPEP en los animales
Ejemplo 4 - Identificación de miPEP candidatos en la drosófila
a) Identificación de miPEP candidatos
Un primer estudio realizado por RACE-PCR en el modelo animal Drosophila melanogaster muestra la existencia de miR que se expresan a lo largo de la embriogénesis, miR1 y miR8.
Como en las plantas, se ha identificado miORF en cada uno de los dos miR estudiados. Por ejemplo, el miR8, conocido por su papel en la regulación del crecimiento de insectos, presenta una miORF que potencialmente codifica el miPEP8. El DmmiR1 (identificado en Drosophila melanogaster) presenta por su parte dos DmmiORF que posiblemente codifican el DmmiPEP1a y el DmmiPEP1b.
Un análisis filogenético muestra la conservación evolutiva de la presencia de las miORF a través unas doce especies de drosófila analizadas, es decir desde su divergencia hace más de 60 millones de años (Figura 13).
Asimismo, los miPEP identificados en drosófila presentan muchas similitudes con los miPEP de plantas. Si su secuencia primaria y por tanto su tamaño evolucionan rápidamente entre especies, se encuentra un tamaño reducido (de 32 a 104 aa), así como una fuerte conservación por una carga global básica (pHi de 9,5 a 12) (Figura 14).
El conjunto de estos resultados indican por tanto la existencia de miPEP reguladores, codificados por las transcripciones primarias de los microARN, a través de un gran intervalo de especies eucariotas. Estos péptidos descubiertos representan un depósito aún sin explorar de moléculas naturales, susceptibles de regular una variedad de funciones biológicas fundamentales, también tanto en los vegetales como en los animales.
b) Expresión de los miPEP
Unas células de Drosophila melanogaster se transfectaron para que sobre expresaran el DmmiPEP8 (a partir de la SEQ ID NO: 494) o bien el DmmiPEP8 mt en el que los codones de inicio de la traducción se han mutado (a partir de la secuencia SEQ ID NO: 495). Como control de la transfección, se cotransfectó un plásmido que producía la proteína moesina-RFP con los plásmidos codificantes de los DmmiPEP8 y DmmiPEP 8 mt. Se constata que los codones de inicio presentes en la secuencia de DmmiPEP8 son funcionales ya que permiten la síntesis de una proteína de fusión miPEP-GFP visualizada por la GFP mientras que la construcciones mutadas en los ATG no producen casi nada de GFP.
Estos resultados sugieren por tanto que la ORF del miPEP es funcional (Figura 38).
Materiales y procedimientos
Células de Drosophila melanogaster
Las células S2 se cultivan en un matraz T75 en 12 ml de medio de Schneider (GIBCO), que contenía un 1 % de penicilina, 100U/ml de estreptavidina a 100 mg/ml (Sigma) y 10 % de suero bovino fetal sin complemento (30' a 56 °C).
Se llevan a cabo transfecciones transitorias con la ayuda de un kit de transfección FuGENE® HD (Roche), según sus recomendaciones. De la manera habitual, 1,5 millones de células S2, previamente sembradas en placas de 6 pocillos (3 ml de medio por pocillo), se transfectan con 250 ng de ADN plasmídico total. El ADN se pone en contacto con el Fugene (3 ^l) en 100 ^l de OPTIMEM (GIBCO). Después de 20 minutos, el reactivo de transfección se pone en contacto con las células en el medio de cultivo. El ARN de las células se extrae 66 h después de la transfección.
Clonación de los fragmentos codificantes de DmmiPEP8 y DmmiPEP8. mutado
Los fragmentos de ADN correspondientes a las secuencias del DmmiPEP8 (SEQ ID NO: 494) y del DmmiPEP8 mutado en los codones de inicio (SEQ ID NO: 495) se amplificaron por PCR para clonarse en fase con la GFP en un plásmido pUAS. Las células de insecto S2 se cotransfectaron con una mezcla de plásmidos (relación 1/1/1,300 ng en total) que codifican el DmmiPEP8::GFP o su versión mutada DmmiPEP8 mt::GFP, un pACT-GAL4 que permite su sobreexpresión por medio del factor de transcripción GAL4 producido bajo el control del promotor de actina y de un vector de expresión que codifica la proteína moesina-RFP utilizada como control de la transfección, esta también se coloca bajo el control del promotor de activa. 48 h después de la transfección, las células se fijaron durante 10 min añadiendo, al medio de cultivo final, formaldehído al 4 % (p/v). A continuación, las células se aclararon 2X con PBS1X y se montaron en portaobjetos para observarlas al microscopio (Leica SPE).
Tabla 9. Secuencias clonadas
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C: Caracterización de los miPEP en el ser humano

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de modulación de la expresión de un gen regulada por un microARN en una célula eucariota vegetal,
que comprende llevar a cabo una etapa de acumulación de un miPEP en dicha célula eucariota vegetal y teniendo dicho miPEP:
- un tamaño de 3 a 100 aminoácidos, preferentemente de 4 a 20 aminoácidos, y
- una secuencia peptídica idéntica a la codificada por una secuencia de nucleótidos contenida en la transcripción primaria de un microARN que regula la expresión de dicho gen, y
- que es capaz de modular la acumulación de dicho microARN,
en el que, la acumulación de dicho miPEP en dicha célula eucariota vegetal induce una modulación de la expresión de dicho gen con respecto a la expresión de dicho gen sin acumulación de dicho miPEP.
2. Un procedimiento para modular la expresión de un gen según la reivindicación 1, en el que dicha célula eucariota vegetal se selecciona entre una célula eucariota vegetal que pertenece a Arabidopsis cebennensis, Arabidopsis helleri, Arabidopsis lyrate, Arabidopsis thaliana, Brassica carinata, Brassica júncea, Brassica napus, Brassica olerácea, Brassica rapa, Capsella rubella, Carica papaya, Eucalyptus grandis, Glycine max, Gossypium raimondii, Medicago sativa, Medicago truncatula, Nicotiana benthamiana, Oryza sativa, Physcomitrella patens, Solanum lycopersicum, Solanum melongena, Solanum tuberosum, Thellungiella halophila y Zea mays.
3. Un procedimiento para modular la expresión de un gen según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho miPEP se selecciona entre el grupo de péptidos que consiste en las secuencias SEQ ID NO: 1-23, 27-42, 44-58, 61-75, 77-101, 375-386 y 424.
4. La utilización de una composición que comprende al menos:
- un miPEP,
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico,
como agente fitofarmacéutico,
- para favorecer el crecimiento y/o el desarrollo de las plantas,
principalmente para la modulación de los parámetros fisiológicos de una planta, en particular la biomasa, la superficie foliar, la floración, el tamaño del fruto, o para la modificación de los parámetros fisiológicos de las semillas vegetales, en particular la germinación, la implantación radicular y la resistencia al estrés hídrico, aplicándose dicha composición por revestimiento o formación de una película sobre dichas semillas vegetales; - o para prevenir o tratar las enfermedades de las plantas,
en particular para favorecer la resistencia a las enfermedades infecciosas,
teniendo dicho miPEP:
- un tamaño de 3 a 100 aminoácidos, preferentemente de 4 a 20 aminoácidos, y
- una secuencia peptídica idéntica a la codificada por una secuencia de nucleótidos contenida en la transcripción primaria de un microARN que regula la expresión de dicho gen, y
- que es capaz de modular la acumulación de dicho microARN.
5. La utilización de una composición según la reivindicación 4, en la que dicha planta se selecciona entre: Arabidopsis cebennensis, Arabidopsis helleri, Arabidopsis lyrate, Arabidopsis thaliana, Brassica carinata, Brassica juncea, Brassica napus, Brassica oleracea, Brassica rapa, Capsella rubella, Carica papaya, Eucalyptus grandis, Glycine max, Gossypium raimondii, Medicago sativa, Medicago truncatula, Nicotiana benthamiana, Oryza sativa, Physcomitrella patens, Solanum lycopersicum, Solanum melongena, Solanum tuberosum, Thellungiella halophila y Zea mays.
6. La utilización de una composición que comprende al menos:
- un miPEP,
- un ácido nucleico que codifica dicho miPEP, o
- un vector que contiene dicho ácido nucleico,
como un herbicida, para eliminar las plantas o ralentizar su crecimiento,
teniendo dicho miPEP:
- un tamaño de 3 a 100 aminoácidos, preferentemente de 4 a 20 aminoácidos, y
- una secuencia peptídica idéntica a la codificada por una secuencia de nucleótidos contenida en la transcripción primaria de un microARN que regula la expresión de dicho gen, y
- que es capaz de modular la acumulación de dicho microARN.
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Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150121569A1 (en) * 2013-10-31 2015-04-30 Centre National De La Recherche Scientifique Micropeptides and use thereof for modulating gene expression
ES2834576T3 (es) * 2014-06-03 2021-06-17 Univ Toulouse 3 Paul Sabatier Uso de micropéptidos para favorecer el crecimiento de las plantas
CA2951018C (fr) * 2014-06-03 2023-11-14 Universite Toulouse Iii-Paul Sabatier Utilisation de micropeptides pour favoriser la symbiose mycorhizienne
FR3061179A1 (fr) * 2016-12-22 2018-06-29 Universite Toulouse Iii-Paul Sabatier Peptides therapeutiques
JP2020513192A (ja) * 2017-03-29 2020-05-07 中国医学科学院基礎医学研究所 低分子ｒｎａ、並びに線維増殖性疾患及び／又は症候群の予防及び／又は治療におけるその応用
EP3539975A1 (en) * 2018-03-15 2019-09-18 Fundació Privada Institut d'Investigació Oncològica de Vall-Hebron Micropeptides and uses thereof
CN108690123B (zh) * 2018-06-21 2021-11-19 上海交通大学医学院 短肽在制备免疫调节药物中的应用
CN110540589B (zh) * 2019-01-08 2021-07-20 西南大学 一种多肽、多肽修饰的脂质载体及应用
CN112301029B (zh) * 2019-07-31 2023-02-24 上海交通大学医学院附属仁济医院 靶向调节miRNA的功能性小肽、其获得方法及其应用
CN111500579A (zh) * 2020-04-23 2020-08-07 九圣禾种业股份有限公司 棉花miR164a和NAC100L及其在调控植物黄萎病抗性中的应用
EP4066629A1 (en) * 2021-04-02 2022-10-05 Université de Rennes 1 Methods for altering the microbiome influenced by roots of a plant using micropeptides
CN115093484B (zh) * 2022-06-27 2024-06-25 苏州乙水茉生物科技有限公司 miPEP156a与噁霉灵偶联体及其制备方法和应用
CN115772526B (zh) * 2022-07-20 2025-01-24 西北农林科技大学 西瓜ClmiR159-3P及其前体基因的应用
FR3141177A1 (fr) 2022-10-19 2024-04-26 Université Toulouse III - Paul Sabatier Nouveaux peptides et leur utilisation pour moduler l’accumulation d’une proteine
FR3141176A1 (fr) 2022-10-19 2024-04-26 Université Toulouse III - Paul Sabatier Nouveaux peptides et leur utilisation pour moduler l’accumulation d’une proteine
CN115710588B (zh) * 2022-11-10 2024-05-03 西南大学 超量表达bna-miR166f在改良油菜收获指数等复杂数量性状中的应用
EP4676936A1 (en) * 2023-03-08 2026-01-14 Universite Toulouse Iii - Paul Sabatier Micropeptides and use of the same for inhibiting the growth of parasitic plants
CN118955674A (zh) * 2023-05-15 2024-11-15 南京安吉生物科技有限公司 一种新型微肽hmbj及其应用
CN117683103B (zh) * 2023-11-24 2024-05-14 南京林业大学 一种小肽miPEP166i及其在植物组织培养中的应用
CN118684748B (zh) * 2024-01-25 2026-04-14 华中农业大学 一种微肽及其应用
CN119241643B (zh) * 2024-12-06 2025-04-22 杭州康源食品科技有限公司 一种促进骨骼生长的四肽

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US50106A (en) * 1865-09-26 Combined knife
CA2492917C (en) * 2002-07-19 2011-10-18 University Of South Carolina Compositions and methods for the modulation of gene expression in plants
US20080227085A1 (en) * 2003-01-17 2008-09-18 Pellegrini Matthew C Methods and Systems for the Identification of Rna Regulatory Sequences and Compounds that Modulate their Function
CN101203611B (zh) * 2005-04-19 2013-08-14 巴斯福植物科学有限公司 控制基因表达的改良方法
CN101747417B (zh) * 2008-12-22 2012-12-26 浙江省农业科学院 调节植物光能利用及油脂积累的基因及其应用
WO2013096567A2 (en) * 2011-12-21 2013-06-27 Duke University The hsf-like transcription factor, tbf1, is a major molecular switch for growth-to-defense transition in plants
US20150121569A1 (en) * 2013-10-31 2015-04-30 Centre National De La Recherche Scientifique Micropeptides and use thereof for modulating gene expression

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