RS58834B1 - Mikropeptidi i njihova upotreba za modulaciju ekspresije gena - Google Patents

Mikropeptidi i njihova upotreba za modulaciju ekspresije gena

Info

Publication number
RS58834B1
RS58834B1 RS20190705A RSP20190705A RS58834B1 RS 58834 B1 RS58834 B1 RS 58834B1 RS 20190705 A RS20190705 A RS 20190705A RS P20190705 A RSP20190705 A RS P20190705A RS 58834 B1 RS58834 B1 RS 58834B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
mipep
plant
microrna
accumulation
Prior art date
Application number
RS20190705A
Other languages
English (en)
Inventor
Jean-Philippe Combier
Dominique Lauressergues
Guillaume Becard
François Payre
Serge Plaza
Jérôme Cavaille
Original Assignee
Univ Toulouse 3 Paul Sabatier
Centre Nat Rech Scient
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR1360727A external-priority patent/FR3012471A1/fr
Application filed by Univ Toulouse 3 Paul Sabatier, Centre Nat Rech Scient filed Critical Univ Toulouse 3 Paul Sabatier
Publication of RS58834B1 publication Critical patent/RS58834B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/44—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a nitrogen atom attached to the same carbon skeleton by a single or double bond, this nitrogen atom not being a member of a derivative or of a thio analogue of a carboxylic group, e.g. amino-carboxylic acids
    • A01N37/46—N-acyl derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N57/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds
    • A01N57/10—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds
    • A01N57/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds containing heterocyclic radicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A01N65/20—Fabaceae or Leguminosae [Pea or Legume family], e.g. pea, lentil, soybean, clover, acacia, honey locust, derris or millettia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A01N65/28—Myrtaceae [Myrtle family], e.g. teatree or clove
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/40—Liliopsida [monocotyledons]
    • A01N65/44—Poaceae or Gramineae [Grass family], e.g. bamboo, lemon grass or citronella grass
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/1013—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing O or S as heteroatoms, e.g. Cys, Ser
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)

Description

Predmetni pronalazak se odnosi na mikropeptide (peptidi kodirani sa mikroRNK ili "miPEPs") i njihovu upotrebu za modulaciju ekspresije gena.
MikroRNK (miRNKs) su mali nekodirani RNK, dužine oko 21 nukleotid nakon maturacije (sazrevanja), koji kontrolišu ekspresiju ciljanih gena na post-transkripcionom nivou, degradiranjem ciljane mRNK ili inhibicijom njenu tranlsaciju. miRNKs se nalaze u biljkama i životinjama.
Ciljani geni su često ključni geni u postupku razvoja. Na primer, oni kodiraju faktore transkripcije ili proteina u protezoama.
Regulacija ekspresije za miRNKs je vrlo malo poznata, ali je konkretno poznata zato što kasnije uključuje, kao većina kodiranih gena, RNK polimeraze II: ovaj enzim proizvodi primarni transkript, pod nazivom "pri-miRNK", koji zatim sazreva uz kompleks proteina koji konkretno sadrži enzime tipa Dicer. Ovo sazrevanje vodi prvo do formiranja prekursora miRNK pod nazivom "pre-miRNK", koji ima sekundarnu strukturu u obliku matične petlje koja sadrži miRNK i njen komplementarni niz miRNK*. Zatim prekursor sazreva, što dovodi do formiranja kraće, dvočlane RNK koja sadrži miRNK i miRNK*. Zatim se obavlja manipulacija za miRNK pomoću RISC kompleksa, koji cepa mRNK ciljanog gena ili inhibira njenu translaciju.
Pored toga, prikazano je da prisustvo introna u primarnom transkriptu za mikroRNK povećava ekspresiju sazrelih mikroRNK (Schwab et al., EMBO Rep., 14(7): 615-21, 2013). Ipak, zbog eksperimentalnih poteškoća, primarni transkripti mikroRNK ili pri-miRNKs, su veoma malo istraživani.
Oko 50% eukariotskih gena ima male otvorene okvire čitanja u okviru svojih 5'UTR regiona (5' UnTranslated region) u gornjem toku niza za kodiranje. Mali otvoreni okviri čitanja (ili "uORFs" za ORF-ove u gornjem toku) mogu da obavljaju ulogu regulatora translacije, pacijalno u cis, podešavajući fiksiranja i brzinu ribozoma na mRNK, ali takođe i u trans uz do sada nepoznati mehanizam, pomoću peptida kodiranih navedenim uORF-a (Combier et al., Gene Dev, 22: 1549-1559, 2008). Po definiciji, uORFS su prisutni u na vrhu kodirajućij gena.
U skorije vreme, mali ORF-ovi su takođe otkriveni u dugim nekodirajućim intergenskim RNK-ovima (lincRNK-ovi), čija navoda funkcija, ako postoji, nije poznata (Ingolia et al., Cell, 147(4): 789-802, 2011; Guttman & Rinn, Nature, 482(7385): 339-46, 2012).
Ipak, još uvek nije prijavljen primer koji se odnosi na postojanje ORF-ova za kodiranje peptida sa nekodiranim mikroRNK--ovima. Sve do sada, mikroRNK-ovi, i ekstenzija njihovih primarnih transkripta, uzimani su u obzir, na osnovu njihovih konkretnih režima postupaka, kao što je nekodirajući regulatorni RNK-ovi koji uopšte ne proizvode peptide.
Jedan od aspekata izuma je predlog peptida koji su sposobni za promenu ekspresije za mikroRNK.
Još jedan aspekt izuma je pružanje mogućnosti za modulaciju ekspresije jednog ili više ciljanih gena za mikroRNK.
Trenutni izum nudi prednost jer omogućava lakšu i efikasniju kontrolu ekspresije gena ciljanih od strane mikroRNK, pomoću načina koji nije vezan za mikroRNK.
Izum je upisan u priloženim tvrdnjama. Izum je vezan za postupak detekcije i identifikacije mikropeptida (miPEP) kodiranih nukleotidnim nizom koji se nalazi u mizu primarnog transkripta za mikroRNK,
koji se sastoji od:
- a) koraka za detekciju otvorenog okvira čitanja od 12 do 303 nukleotida u dužini koji se nalaze u nizu primarnog transkripta navedenog mikroRNK, zatim
- b) korak poređenja između:
• akumulacije navedenih mikroRNK u određenoj eukariotskoj ćeliji koja eksprimira navedeni mikroRNK,
prisustvo peptida kodiranih nukleotidnim nizom koji je identičan ili degenerativno vezan za navedeni otvoreni okvira čitanja , navedeni peptidi su prisutni u ćeliji nezavisno od transkripcije primarnog transkripta navedenog mikroRNK, i
• akumulacija navedene mikroRNK u eukariotskoj ćeliji iste vrste kao gorenavedena eukariotska ćelija koja eksprimira navedeni mikroRNK,
u odsustvu navedenog peptida,
u kom je modulacija akumulacije navedenih mikroRNK u prisustvu navedenih peptida vezana za akumulaciju navedenih mikroRNK u odsustvu navedenih peptida označava postojanje mikropeptida kodiranih otvorenim okvirom za čitanje.
Izum je povezan konkretno za postupak detekcije i identifikacije mikropeptida (miPEP) kodiranih od strane nukleotidnog niza koji se nalazi u primarnom transkriptu mikroRNK, koji se sastoji od:
- a) koraka za detekciju otvorenog okvira čitanja od 15 do 303 nukleotida u dužini koji se nalaze u nizu primarnog transkripta navedenog mikroRNK, zatim
- b) korak poređenja između:
• akumulacije navedenih mikroRNK u određenoj eukariotskoj ćeliji koja eksprimira navedeni mikroRNK,
prisustvo peptida kodiranih nukleotidnim nizom koji je identičan ili degenerativno vezan za navedeni otvoreni okvira čitanja , navedeni peptidi su prisutni u ćeliji nezavisno od transkripcije primarnog transkripta navedenog mikroRNK, i
• akumulacija navedene mikroRNK u eukariotskoj ćeliji iste vrste kao gorenavedena eukariotska ćelija koja eksprimira navedeni mikroRNK,
u odsustvu navedenog peptida,
u kom je modulacija akumulacije navedenih mikroRNK u prisustvu navedenih peptida vezana za akumulaciju navedenih mikroRNK u odsustvu navedenih peptida označava postojanje mikropeptida kodiranih otvorenim okvirom za čitanje.
Aplikacija takođe opisuje postupak za detekciju i identifikaciju mikropeptida (miPEP) kodiranih nukleotidnim nizom koji se nalazi u nizu primarnog transkripta mikroRNK, koji se sastoji od:
a) koraka za detekciju otvorenog rama za čitanje od 15 do 303 nukleotida u dužini, ili od 12 nukleotida u dužini, koji se nalaze u nizu primarnog transkripta navedene mikroRNK, tada b) korak za upoređivanje između:
• akumulacije navedenih mikroRNK u određenoj eukariotskoj ćeliji koja eksprimira navedeni mikroRNK,
prisustvo peptida kodiranih nukleotidnim nizom koji je identičan ili degenerativno vezan za navedeni otvoreni okvira čitanja , navedeni peptidi su prisutni u ćeliji nezavisno od transkripcije primarnog transkripta navedenog mikroRNK, i
• akumulacija navedene mikroRNK u eukariotskoj ćeliji iste vrste kao gorenavedena eukariotska ćelija koja eksprimira navedeni mikroRNK,
u odsustvu navedenog peptida,
u kom je modulacija akumulacije navedenih mikroRNK u prisustvu navedenih peptida vezana za akumulaciju navedenih mikroRNK u odsustvu navedenih peptida označava postojanje mikropeptida kodiranih otvorenim okvirom za čitanje.
Aplikacija takođe opisuje postupak za detekciju i identifikaciju mikropeptida (miPEP) kodiranih nukleotidnim nizom koji se nalazi u nizu primarnog transkripta mikroRNK, koji se sastoji od:
- a) korak za detekciju otvorenog rama za čitanje od 12 nukleotida u dužini koji se nalaze u nizu primarnog transkripta navedene mikroRNK, tada
- b) korak poređenja između:
• akumulacije navedenih mikroRNK u određenoj eukariotskoj ćeliji koja eksprimira navedeni mikroRNK,
prisustvo peptida kodiranih nukleotidnim nizom koji je identičan ili degenerativno vezan za navedeni otvoreni okvira čitanja , navedeni peptidi su prisutni u ćeliji nezavisno od transkripcije primarnog transkripta navedenog mikroRNK, i
• akumulacija navedene mikroRNK u eukariotskoj ćeliji iste vrste kao gorenavedena eukariotska ćelija koja eksprimira navedeni mikroRNK,
u odsustvu navedenog peptida,
u kom je modulacija akumulacije navedenih mikroRNK u prisustvu navedenih peptida vezana za akumulaciju navedenih mikroRNK u odsustvu navedenih peptida označava postojanje mikropeptida kodiranih otvorenim okvirom za čitanje.
U prvom koraku, postupak za detekciju i identifikaciju mikropeptida sastoji se od detekcije, na primarnom transkriptu za mikroRNK, za postojanje otvorenog okvira čitanja za potencijalno kodiranje peptida.
Za svoj deo, drugi korak omogućava karakterizaciju navedenog peptida, tj. određivanje da li navedeni peptid odgovara peptidu koji se stvarno proizvodi u ćeliji, pretragom za efektom za navedeni peptid za akumulaciju navedene mikroRNK.
Da bi se prikazao uticaj peptida na akumulaciju mikroRNK, velika količina peptida uvodi se u ekspresiju prve ćelije navedenog mikroRNK: AKumulacija mikroRNK u ovoj prvoj ćeliji se zatim meri i upoređuje sa akumulacijom mikroRNK u drugoj ćeliji koja je identična kao prva, ali ne sadrži navedene peptide.
Praćenjem varijacije količine mikroRNK izzmeđu ćelija u prisustvu i odsustvu peptida označava (i) da postoji peptid kodiran u primarni transkript navedene mikroRNK, (ii) da je niz za ovaj peptid kodiran od strane okvira čitanja identifikovanog na primarnom transkriptu navedene mikroRNK, i (iii) da navedeni peptid ima efekat akumulacije navedene mikroRNK.
Izum je zbog toga zasnovan na neočekivanoj duploj opservaciji obavljenoj od strane izumitelja kod koje, sa jedne strane, postoje otvoreni okviri za čitanje koji mogu da kodiraju mikropeptide koji se nalaze u primarnim transkriptima mikroRNK-ova, a sa druge strane ti navedeni mikropeptidi imaju mogućnost akumulacije za navedene mikroRNK-ove.
U izumu, termini "mikroRNK", "nekodirani mikroRNK" i "miRNK" imaju isto značenje i mogu se koristiti naizmenično. Oni definišu male molekule RNK od otprilike 21 nukleotida, koje nisu prevedene i ne vode u peptid ili protein.
Ipak, u ovom zrelom obliku, mikroRNK obavlja funkciju regulacije određenih gena preko post-transkripcionih mehanizama, na primer, pomoću RISC kompleksa.
Primarni transkript mikroRNK ili "pri-miRNK" odgovara RNK molekulu dobijenom direktno iz transkripta DNK molekula. Uopšteno, ovaj primarni transkript podlazi pod jednu ili više post-transkripcionih modifikacija, u koju spada na primer, određena struktura RNK ili otvor za određene delove RNK usled fenomena deljenja, a to dovodi do formiranja perkusora mikroRNK ili "pre-miRNK", a zatim zreli oblik mikroRNK ili "miRNK".
Termini "mikropeptides" i "miPEPs" (mikroRNK enkodirani PEPtidi) su ekvivalenti i mogu se koristiti naizmenično. Oni definišu peptid koji je kodiran otvorenim okvirom za čitanje koji je prisutan na primarnom transkriptu mikroRNK, i koji su sposobni za modulaciju akumulacije navedenih mikroRNK. Mikropeptidi u okviru značenja trenutnog izuma ne treba da se smatraju kao obavezno mali peptidi, jer "mikro" ne označava veličinu peptida. U skladu sa izumom, miPEP može takođe da se smatra kao modulator transkripcije, i konkretno kao aktivator transkripcije. Takav modulator transkripcije može da upravlja nivoom transkripcije za modulaciju akumulacije pri-miR, pre-miR i miR.
Uzimajući u obzir degeneraciju genetskog koda, isti mikropeptidi mogu biti kodirani od strane nekoliko nukleotidnih nizova. Nukleotidni nizovi ove vrste, koji se međusobno razlikuju za bar po jedan nukleotid ali kodiraju jedan isti peptid, nazivaju se "degenerativni nizovi".
Termini "otvoreni okvira čitanja " ili "ORF" su isti i mogu se koristiti naizmenično. Oni odgovaraju nukleotidnom nizu u DNK ili RNK molekulu koji može potencijalno da kodira peptid ili protein: navedeni otvoreni kod za čitanje počinje početnim kodonom (početni kodon koji uopšteno kodira metionin), a zatim sledi niz kodona (svaki kodon kodira aminokiselinu) i završava se završnim kodonom (završni kodon nije preveden).
U izumu, ORF-ovi mogu da se nazivaju "miORF-ovi" kada su prisutni u primarnim transkriptima mikroRNK.
MiORF-ovi na način definisan u ovom izumu mogu da budu veličine od 12 do 303 nukleotida i mogu da kodiraju peptide od 3 do 100 aminokiselina.
Konkretno, miORF-ovi na način koji su definisani u izumu mogu da budu veličine od 15 do 303 nukleotida. Pošto je aminokiselina kodirana kodonom od 3 nukleotida, miORF-ovi od 15 do 303 nukleotida kodiraju miPEPS od 4 do 100 aminokiselina.
Konkretno, miORF-ovi su veličine od:
15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 47, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 138, 141, 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258, 261, 264, 267, 270, 273, 276, 279, 282, 285, 288, 291, 294, 297, 300 ili 303 nukleotida, i kodirani odgovarajući miPEP-ovi veličine od:
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ili 100 aminokiselina.
U izumu, termin "akumulacija" označava proizvodnju molekula, kao što su mikroRNK ili mikropeptid, u ćeliji.
Zbog toga, "modulacija" akumulacije molekula u ćeliji odgovara modifikaciji u kvantitetu ovog molekula prisutnog u ćeliji.
Pored toga, efekat miPEP može se osmatrati kroz modulaciju akumulacije miR, ali takođe i preko modulacije akumulacije odgovarajućeg pri-miR ili pre-miR.
U prikazu, izum je vezan za postupak detekcije i identifikacije miPEP na način definisan iznad, u čijoj modulaciji akumulacije navedenih mikroRNK se smanjuje ili povećava u akumulaciji navedenih mikroRNK, konkretno, za povećanje.
"Smanjenje akumulacije" odgovara smanjenju količine navedenih molekula u ćeliji.
Suprotno tome, "povećanje u akumulaciji" odgovara povećanju količine navedenih molekula u ćeliji.
U naprednom prikazu, izum je vezan za postupak za detekciju vezan je za postupak za detekciju i identifikaciju miPEP kao što je definisano iznad, u kom je modulacija akumulacije navedenog mikroRNK predstavljaju povećanje akumulacije navedenog mikroRNK.
U prikazu, izum se odnosi na postupak za detekciju i identifikaciju miPEP na način definisan iznad, u kom prisustvo navedenih peptida u ćeliji zavisi od:
- uvoda nukleinske kiseline koja kodira navedeni peptid u ćeliju, ili
- uvod navedenih peptida u ćeliji.
Da bi se obavila karakterizacija miPEP, neophodno je da postoji ćelijski model koji eksprimira mikroRNK u kom se nalazi navedani peptid koji se testira. Za ovo je moguće uvesti peptid u ćeliju, bilo dovođenjem ćelije u kontakt sa navedenim peptidom ili uvodom nukleinske kiseline koja kodira peptid u ćeliji a nukleinska kiselina biće prevedena u peptid u okviru ćelije.
U prikazu, izum je vezan za postupak za detekciju i identifikaciju miPEP na način definisan iznad, u kome se otvoreni okvira čitanja u koraku a) nalazi 5' ili 3' dela navedenog primarnog transkripta mikroRNK, deo 5' bi bio poželjan.
Delovi 5' ili 3' primarnog transkripta mikroRNK odgovara terminalnim delovima RNK molekula koji su otvoreni tokom sazrevanja mikroRNK.
U prikazu, izum se odnosi na postupak za detekciju i identifikaciju miPEP na način definisan iznad, u kome je navedeni mikroRNK pisutan u biljnoj ćeliji divljeg tipa.
U izumu, tip ćelije divljeg tipa odgovara ćeliji biljke koja nije genetski modifikovana od strane ljudi.
U prikazu, izum se odnosi na postupak za detekciju i identifikaciju miPEP na način opisan iznad, u kome se nalaze navedeni mikroRNK koji su prisutni u životinjskim ćelijama divljeg tipa, i u konkretnim ljudskim ćelijama divljeg tipa ili ćeliji Drosfilije divljeg tipa.
U izumu, životinjska ćelija divljeg tipa odgovara ćeliji životinja i određenim ljudskim ćelijama, koje nisu modifikovane od strane ljudi.
U prikazu, izum se odnosi na postupak za detekciju i identifikaciju miPEP na način definisan iznad, u kome se navedena eukariotska ćelija i navedena eukariotska ćelija istog tipa kao gorenavedena eukariotska ćelija, upotrebljena u koraku b, su ćelije krstonosnih biljaka kao što su Arabidopsis thaliana, il grupe biljaka mahunarki Glycine max (soja), Medicago truncatula i Medicago sativa (alfalfa) il biljke iz porodice Solanaceae kao što su Nicotiana benthamiana (duvan), Solanum tuberosum (krompir), Solanum lycopersicum (paradajz) ili Solanum melongena (plavi patlidžan).
U prikazu, izum se odnosi na postupak za detekciju i identifikaciju miPEP na način opisan iznad, u kome su navedene eukariotske ćelije i navedene eukariotske ćelije istog tipa kao gorepomenute eukariotske ćelije, upotrebljene u koraku b, koje su ćelije biljaka, ako je moguće, ćelije Medicago truncatula, Nicotiana benthamiana ili Arabidopsis thaliana. U prikazu, izum se odnosi na postupak za detekciju i identifikaciju miPEP na način definisan iznad, u kome su navedene eukariotske ćelije i navedene eukariotske ćelije istog tipa kao gorenavedene eukariotske ćelije, upotrebljeni u koraku b, koje su ćelije životinja, ako je moguće ljudske ćelije i ćelije Drosophila.
U postupku detekcije i identifikacije mikropeptida na način definisan iznad, nakon identifikacije ORF koji može da kodira peptid za primarni transkript mikroRNK, neophodno je da postoji ćelijski model koji ima navedeni mikroRNK i navedene peptide, tako da bude moguće da se demonstrira mogući efekat peptida na navedeni mikroRNK.
Zbog toga postoje dve moguće opcije:
- ćelijski model po kome je miORF identifikovan i onaj u kom uticaj peptida za miRNK je prikazan kao identičan, ili
- ćelijski model u kome je miORF identifikovan i oni u kojima je uticaj peptida na miRNK prikazan kao različiti.
U prvoj opciji, ćelijski model upotrebljen za posmatranje efekta peptida isti je kao i onaj kod primarnog transkripta za izolirani navedeni mikroRNK. U ovom ćelijskom modelu, navedene eukariotske ćelije sadrže navedeni mikroRNK prirodno i samo peptidi koje treba testirati treba da se uvedu u ove ćelije. U ovom kontekstu, navedeni mikroRNK kvalifikovan je kao "endogenog porekla" jer postoji prirodno u ćelijama. Ipak, druge kopije mikroRNK endogenog porekla mogu se dodati ćelijama, na primer, uvodom vektora kodiranja navedenih mikroRNK endogenog porekla u ćelije.
U drugoj opciji, ćelijski model koji je upotrebljen za posmatranje efekta peptida razlikuje se od onih koji se nalaze u primarnom transkriptu izolovane navedene mikroRNK. U ovom ćelijskom modelu, navedene eukariotske ćelije ne sadrže mikroRNK, ni peptide za testiranje. Ova dva elementa moraju zbog toga da se uvedu u ćelije. U ovom kontekstu, navedena mikroRNK kvalifikovana je kao "egzogenog porekla" jer ne postoje prirodno u ćelijama. U prikazu, izum se odnosi na postupak za detekciju i identifikaciju miPEP na način opisan iznad, gde je navedeni mikroRNK endogenog porekla u navedenoj eukariotskoj ćeliji i u navedenoj eukariotskoj ćeliji istog tipa kao navedena eukariotska ćelija, upotrebljena u koraku b).
U prikazu, izum se odnosi na postupak za detekciju i identifikaciju miPEP na način opisan iznad gde je navedena mikroRNK egzogenog porekla u navedenoj eukariotskoj ćeliji i eukariotskoj ćeliji istog tipa kao gorenavedena eukariotska ćelija, upotrebljena u koraku b), navedene eukariotske ćelije koje sadrže vektor koji dozvoljava ekspresiju navedene mikroRNK.
U prikazu, pronalazak se odnosi na postupak za detekciju i identifikaciju miPEP kao što je gore definisano, u kome se akumulacija navedene mikroRNK određuje korišćenjem kvantitativne RT-PCR ili Northern blot.
U prikazu, pronalazak se odnosi na postupak za detekciju i identifikaciju miPEP-a, kao što je definisano u prethodnom tekstu, u kome se akumulacija navedene mikroRNK određuje korišćenjem DNK ili RNK čipa.
Akumulacija navedene mikroRNK može se odrediti korišćenjem tehnika molekularne biologije za određivanje specifičnih molekula nukleinske kiseline.
Aplikacija takođe opisuje postupak za detekciju i identifikaciju mikroRNK u kojoj sekvenca primarnog transkripta sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira miPEP,
koji se sastoji od:
- a) koraka za detekciju otvorenog okvira čitanja od 15 do 303 nukleotida u dužini koji se nalaze u nizu primarnog transkripta navedenog mikroRNK, zatim
- b) korak poređenja između:
• akumulacije navedenih mikroRNK u određenoj eukariotskoj ćeliji koja eksprimira navedeni mikroRNK,
prisustvo peptida kodiranih nukleotidnim nizom koji je identičan ili degenerativno vezan za navedeni otvoreni okvira čitanja , navedeni peptidi su prisutni u ćeliji nezavisno od transkripcije primarnog transkripta navedenog mikroRNK, i
• akumulacija pomenute mikroRNK u eukariotskoj ćeliji, istog tipa kao prethodno pomenuta eukariotska ćelija koja eksprimira pomenutu mikroRNK,
u odsustvu navedenog peptida,
u kome modulacija akumulacije navedene mikroRNK u prisustvu navedenog peptida u odnosu na akumulaciju navedene mikroRNK u odsustvu navedenog peptida ukazuje na postojanje mikroRNK čiji primarni transkript sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira mikropeptid.
Konkretno, aplikacija takođe opisuje postupak za detekciju i identifikaciju mikroRNK u kojoj sekvenca primarnog transkripta sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira miPEP, koji se sastoji od:
- a) koraka za detekciju otvorenog okvira čitanja od 15 do 303 nukleotida u dužini koji se nalaze u nizu primarnog transkripta navedenog mikroRNK, zatim
- b) korak poređenja između:
1
• akumulacija navedene mikroRNK u specifičnoj eukariotskoj ćeliji koja eksprimira primarni transkript navedene mikroRNK,
prisustvo peptida kodiranih nukleotidnim nizom koji je identičan ili degenerativno vezan za navedeni otvoreni okvira čitanja , navedeni peptidi su prisutni u ćeliji nezavisno od transkripcije primarnog transkripta navedenog mikroRNK, i
• akumulacija pomenute mikroRNK u eukariotskoj ćeliji, istog tipa kao prethodno pomenuta eukariotska ćelija koja eksprimira primarni transkript navedene mikroRNK, u odsustvu navedenog peptida,
u kome modulacija akumulacije navedene mikroRNK u prisustvu navedenog peptida u odnosu na akumulaciju navedene mikroRNK u odsustvu navedenog peptida ukazuje na postojanje mikroRNK čiji primarni transkript sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira mikropeptid.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za detekciju i identifikaciju mikroRNK kao što je definisano u prethodnom tekstu, u kojoj je modulacija akumulacije pomenute mikroRNK smanjenje ili povećanje akumulacije navedene mikroRNK, posebno povećanje. U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za detekciju i identifikaciju mikroRNK kao što je definisano gore, u kojoj prisustvo navedenog peptida u ćeliji rezultira iz:
- uvoda nukleinske kiseline koja kodira navedeni peptid u ćeliju, ili
- uvod navedenih peptida u ćeliji.
U prikazu, pronalazak se odnosi na postupak za detekciju i identifikaciju mikroRNK kao što je definisano u prethodnom tekstu, gde je pomenuti otvoreni okvira čitanja u koraku a) sadržan u 5' ili 3' delu pomenutog primarnog transkripta mikroRNK, poželjno u 5' deo. U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za detekciju i identifikaciju mikroRNK kao što je definisano gore, u kojoj je navedena mikroRNK prisutna u biljnoj ćeliji divljeg tipa. U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za detekciju i identifikaciju mikroRNK, kao što je definisano gore, u kojoj je navedena mikroRNK prisutna u divljim tipovima životinjskih ćelija, a naročito u divljoj humanoj ćeliji.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za detekciju i identifikaciju mikroRNK kao što je definisano gore, u kojoj rečena eukariotska ćelija, i pomenuta eukariotska ćelija istog tipa kao prethodno pomenuta eukariotska ćelija, korišćena u koraku b) su biljne ćelije, poželjno ćelije Medicago truncatula.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za detekciju i identifikaciju mikroRNK, kao što je definisano gore, u kojoj rečena eukariotska ćelija, i pomenuta eukariotska ćelija istog tipa kao prethodno pomenuta eukariotska ćelija, korišćena u koraku b) su životinjske ćelije, poželjno Drosophila ćelije.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za detekciju i identifikaciju mikroRNK kao što je definisano gore, u kojoj je navedena mikroRNK endogenog porekla u navedenoj eukariotskoj ćeliji i u navedenoj eukariotskoj ćeliji istog tipa kao prethodno pomenuta eukariotska ćelija, korišćena u korak b).
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za detekciju i identifikaciju mikroRNK kao što je definisano u prethodnom tekstu, u kojoj je navedena mikroRNK egzogenog porekla u navedenoj eukariotskoj ćeliji i u navedenoj eukariotskoj ćeliji istog tipa kao gore pomenuta eukariotska ćelija, korišćena u koraku b) navedene eukariotske ćelije sadrže vektor koji dozvoljava ekspresiju pomenute mikroRNK.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za detekciju i identifikaciju mikroRNK kao što je definisano gore, u kojoj se akumulacija navedene mikroRNK određuje korišćenjem kvantitativne RT-PCR ili Northern blot.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za detekciju i identifikaciju mikroRNK kao što je definisano u prethodnom tekstu, u kojoj se akumulacija navedene mikroRNK određuje korišćenjem DNK ili RNK čipa.
U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na miPEP koji se dobija primenom postupka kao što je gore definisano.
Određenije, pronalazak se odnosi na miPEP kodiran nukleotidnom sekvencom kao što je dobijeno primenom postupka kao što je gore definisano. Drugim rečima, pronalazak se odnosi na miPEP kodiran nukleotidnom sekvencom koja je detektovana i identifikovana primenom postupka kao što je gore definisano.
Drugi aspekt pronalaska se takođe odnosi na miPEP od 3 do 100 aminokiselina, naročito od 4 do 100 aminokiselina, naročito od 4 do 60 aminokiselina, poželjno od 4 do 40 aminokiselina, kodiranih sa nukleotidnom sekvencom koja je sadržana u primarnom transkriptu mikroRNK, navedeni miPEP je sposoban da modulira akumulaciju pomenute mikroRNK u eukariotskoj ćeliji.
Drugi aspekt pronalaska se takođe odnosi na miPEP od 4 do 100 aminokiselina, ili od 3 aminokiseline, kodirane sa nukleotidnom sekvencom koja je sadržana u primarnom transkriptu mikroRNK, a navedeni miPEP je sposoban da modulira akumulaciju navedene mikroRNK u eukariotska ćelija.
Drugi aspekt pronalaska se takođe odnosi na miPEP od 3 aminokiseline kodirane sa nukleotidnim niyom koji je sadržan u primarnom transkriptu mikroRNK, a navedeni miPEP je sposoban da modulira akumulaciju pomenute mikroRNK u eukariotskoj ćeliji.
Konkretno, miPEP je definisan u izumu koji je kodiran preko miORF od 15 do 303 nukleotida i ima veličinu od 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ili 100 aminokiselina, konkretno 5, 8, 10, 18, 19, 23, 37, 50 ili 59 aminokiselina.
Posebno, miPEP pronalaska ima veličinu u opsegu od 4 do 10 aminokiselina, 4 do 20 aminokiselina, 4 do 30 aminokiselina, 4 do 40 aminokiselina, 4 do 50 aminokiselina, 4 do 60 aminokiselina 4 do 70 aminokiselina, 4 do 80 aminokiselina, 4 do 90 aminokiselina, ili 4 do 100 aminokiselina.
Štaviše, treba napomenuti da se nekoliko miORFS može identifikovati na primarnom transkriptu mikroRNK, što ukazuje da primarni transkript mikroRNK može potencijalno kodirati nekoliko miPEP-ova.
Takođe treba napomenuti da je efekat miPEP-a generalno specifičan za jednu mikroRNK, naime da je rezultat primarnog transkripta koji kodira pomenuti miPEP.
Modulacija mikroRNK navedenim miPEP-om može se pokazati nakon posmatranja varijacija u količinama mikroRNK između ćelija u prisustvu i u odsustvu miPEP-a.
U prikazu, izum se odnosi na miPEP kao što je gore definisano, pri čemu je navedena nukleotidna sekvenca sadržana u 5' ili 3' delu navedenog primarnog transkripta mikroRNK, poželjno u 5' delu.
U prikazu, pronalazak se odnosi na miPEP kao što je definisano gore, nukleotidnu sekvencu koja odgovara prvom otvorenom okviru čitanja prisutnom na pomenutom primarnom transkriptu mikroRNK.
U prikazu, pronalazak se odnosi na miPEP kao što je gore definisano, pri čemu miPEP ima osnovnu izoelektričnu tačku, poželjno iznad 8.
U prikazu, pronalazak se odnosi na miPEP kao što je gore definisano, a miPEP ima kiselinsku izoelektričnu tačku.
U prikazu, pronalazak se odnosi na miPEP kao što je gore definisano, pri čemu je miPEP izabran iz grupe peptida koja se sastoji od SEQ ID NO: 1 do SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 375 do SEQ ID NO: 386, i SEQ ID NO: 355 (Tabela 1).
1
U prikazu, izum se odnosi na miPEP na način opisan iznad, navedeni miPEP koji je bio izabran iz grupe peptida koji se sastoji od:
- SEQ ID NO: 1 do SEQ ID NO: 104 i SEQ ID NO: 355,
- SEQ ID NO: 375 do SEQ ID NO: 386, ili
- SEQ ID NO: 424.
U prikazu, izum se odnosi na miPEP na način definisan iznad, koji se sastoji iz niza aminokiselina MVT.
U drugom aspektu, izum se odnosi na molekule nukleinske kiseline kodirane u miPEP na način definisan iznad.
U prikazu, izum se odnosi na molekule nukleinske kiseline koji je definisan iznad, navedeni molekul se bira iz grupe nukleinske kiseline koja se sastoji od SEQ ID NO: 105 do SEQ ID NO 208, SEQ ID NO: 387 do SEQ ID NO: 399 i SEQ ID NO: 356 (Tabela 2).
U prikazu, izum se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji je definisan iznad, a navedeni molekul je izabran iz grupe nukleinskih kiselina koje se sastoje od:
- SEQ ID NO: 105 do SEQ ID NO: 208 i SEQ ID NO: 356,
- SEQ ID NO: 387 do SEQ ID NO: 399, ili
- SEQ ID NO: 425.
U prikazu, izum se odnosi na MtmiPEP171b1 (SEQ ID NO: 59) kodiran nukleotidnom sekvencom (SEQ ID NO: 163) sadržan u primarnom transkriptu miR171b (SEQ ID NO: 319), navedeni MtmiPEP171b1 je sposoban da modulira akumulaciju navedenog miR171b u eukariotskoj ćeliji.
U navedenom prikazu, pronalazak se odnosi na AtmiPEP164a1 (SEQ ID NO: 24) kodiran nukleotidnom sekvencom (SEQ ID NO: 128) sadržan u primarnom transkriptu miR164a (SEQ ID NO: 297), navedeni AtmiPEP164a1 je sposoban da modulira akumulaciju navedenog miR164a u eukariotskoj ćeliji.
U prikazu, izum se odnosi na AtmiPEP165a (SEQ ID NO: 43) kodiran nukleotidnom sekvencom (SEQ ID NO: 147) sadržan u primarnom transkriptu miR165a (SEQ ID NO: 305), navedeni miPEP165a je sposoban da modulira akumulaciju navedenog miR165a u eukariotskoj ćeliji.
U navedenom prikazu, pronalazak se odnosi na AtmiPEP319a1 (SEQ ID NO: 76) kodiran nukleotidnom sekvencom (SEQ ID NO: 180) sadržan u primarnom transkriptu miR319a (SEQ ID NO: 331), navedeni AtmiPEP319a1 je sposoban da modulira akumulaciju navedenog miR319a u eukariotskoj ćeliji.
U navedenom prikazu, pronalazak se odnosi na AtmiPEP319a2 (SEQ ID NO: 77) kodiran nukleotidnom sekvencom (SEQ ID NO: 181) sadržan u primarnom transkriptu miR319a (SEQ ID NO: 331), navedeni AtmiPEP319a2 je sposoban da modulira akumulaciju navedenog miR319a u eukariotskoj ćeliji.
U navedenom prikazu, izum se odnosi na AtmiPEP160b1 (SEQ ID NO: 14) kodiran nukleotidnom sekvencom (SEQ ID NO: 118) sadržan u primarnom transkriptu miR160b (SEQ ID NO: 291), navedeni AtmiPEP160b1 je sposoban da modulira akumulaciju navedenog miR160b u eukariotskoj ćeliji.
U navedenom prikazu, pronalazak se odnosi na MtmiPEP169d (SEQ ID NO: 424) kodiran nukleotidnom sekvencom (SEQ ID NO: 425) sadržan u primarnom transkriptu od miR169d (SEQ ID NO: 427), navedeni MtmiPEP169d je sposoban da modulira akumulaciju navedenog miR169d u eukariotskoj ćeliji.
U navedenom prikazu, izum se odnosi na MtmiPEP171e (SEQ ID NO: 63) kodiran nukleotidnom sekvencom (SEQ ID NO: 167) sadržan u primarnom transkriptu miR171e (SEQ ID NO: 322), navedeni MtmiPEP171e je sposoban da modulira akumulaciju navedenog miR171e u eukariotskoj ćeliji.
U posebnoj realizaciji, pronalazak se odnosi na DmmiPEP1a (SEQ ID NO: 102) kodiran nukleotidnom sekvencom (SEQ ID NO: 206) sadržan u primarnom transkriptu miR1 (SEQ ID NO: 353), navedeni dmmiPEP1a je sposoban da modulira akumulaciju navedenog miR1 u eukariotskoj ćeliji.
U navedenom prikazu, pronalazak se odnosi na DmmiPEP1b (SEQ ID NO: 103) kodiran nukleotidnom sekvencom (SEQ ID NO: 207) sadržan u primarnom transkriptu miR1 (SEQ ID NO: 353), navedeni dmmiPEP1b je sposoban da modulira akumulaciju navedenog miR1 u eukariotskoj ćeliji.
U navedenom prikazu, pronalazak se odnosi na dmmiPEP8 (SEQ ID NO: 104) kodiran nukleotidnom sekvencom (SEQ ID NO: 208) sadržan u primarnom transkriptu miR8 (SEQ ID NO: 354), navedeni dmmiPEP8 je sposoban da modulira akumulaciju navedenog miR8 u eukariotskoj ćeliji.
U navedenom prikazu, pronalazak se odnosi na HsmiPEP155 (SEQ ID NO: 355) kodiran nukleotidnom sekvencom (SEQ ID NO: 356) sadržan u primarnom transkriptu miR155 (SEQ ID NO: 358), navedeni HsmiPEP155 je sposoban da modulira akumulaciju navedenog miR155 u eukariotskoj ćeliji.
U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na izolovani peptid, ili izolovani i prečišćeni peptid, ili sintetski peptid ili rekombinantni peptid, koji sadrži ili se sastoji od sekvence identične
1
onoj u miPEP, pri čemu je miPEP posebno prisutan prirodno u biljkama ili životinjama, kao što su ljudi.
U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na vektor koji sadrži najmanje jedan molekul nukleinske kiseline kao što je gore definisano.
U drugom aspektu, pronalazak se takođe odnosi na upotrebu najmanje:
- miPEP kao što je gore definisano,
- nukleinske kiseline koja kodira pomenuti miPEP, ili
- vektor koji sadrži navedenu nukleinsku kiselinu,
za modulaciju ekspresije najmanje jednog gena u specifičnoj eukariotskoj ćeliji, pomenuta specifična eukariotska ćelija je sposobna za ekspresiju mikroRNK, čiji primarni transkript sadrži najmanje jednu nukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti najmanje jedan miPEP i čija se akumulacija modulira pomoću navedenog najmanje jednog miPEP, ekspresija navedenog bar jednog gena je regulisana navedenom mikroRNK.
U drugom aspektu, pronalazak se takođe odnosi na upotrebu najmanje:
miPEP od 4 do 100 aminokiselina, poželjno od 4 do 40 aminokiselina, kodiranih nukleotidnom sekvencom koji je sadržan u primarnom transkriptu mikroRNK, a navedeni miPEP je sposoban da modulira akumulaciju pomenute mikroRNK u eukariotskoj ćeliji - nukleinske kiseline koja kodira pomenuti miPEP, ili
- vektor koji sadrži navedenu nukleinsku kiselinu,
za modulaciju ekspresije najmanje jednog gena u specifičnoj eukariotskoj ćeliji, pomenuta specifična eukariotska ćelija je sposobna za ekspresiju mikroRNK, čiji primarni transkript sadrži najmanje jednu nukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti najmanje jedan miPEP i čija se akumulacija modulira pomoću navedenog najmanje jednog miPEP, ekspresija navedenog bar jednog gena je regulisana navedenom mikroRNK.
U drugom aspektu, pronalazak se takođe odnosi na upotrebu najmanje:
- miPEP od 4 do 100 aminokiselina, ili od 3 aminokiseline, kodirane nukleotidnom sekvencom koji je sadržan u primarnom transkriptu mikroRNK, a navedeni miPEP je sposoban da modulira akumulaciju navedene mikroRNK u eukariotskoj ćeliji,
- nukleinske kiseline koja kodira pomenuti miPEP, ili
- vektor koji sadrži navedenu nukleinsku kiselinu,
za modulaciju ekspresije najmanje jednog gena u specifičnoj eukariotskoj ćeliji, pomenuta specifična eukariotska ćelija je sposobna za ekspresiju mikroRNK, čiji primarni transkript sadrži najmanje jednu nukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti najmanje jedan miPEP i čija se akumulacija modulira pomoću navedenog najmanje jednog miPEP,
1
ekspresija navedenog bar jednog gena je regulisana navedenom mikroRNK.
U drugom aspektu, pronalazak se takođe odnosi na upotrebu najmanje:
- miPEP od 3 aminokiseline, kodirane nukleotidnom sekvencom koja je sadržana u primarnom transkriptu mikroRNK, pri čemu je miPEP sposoban da modulira akumulaciju navedene mikroRNK u eukariotskoj ćeliji,
- nukleinske kiseline koja kodira pomenuti miPEP, ili
- vektor koji sadrži navedenu nukleinsku kiselinu,
za modulaciju ekspresije najmanje jednog gena u specifičnoj eukariotskoj ćeliji, pomenuta specifična eukariotska ćelija je sposobna za ekspresiju mikroRNK, čiji primarni transkript sadrži najmanje jednu nukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti najmanje jedan miPEP i čija se akumulacija modulira pomoću navedenog najmanje jednog miPEP, ekspresija navedenog bar jednog gena je regulisana navedenom mikroRNK.
Pronalazak se zasniva na iznenađujućem zapažanju pronalazača da je moguće modulirati ekspresiju jednog ili više ciljnih gena jedne i iste mikroRNK moduliranjem akumulacije navedene mikroRNK koristeći miPEP.
U jednom prikazu, pronalazak se odnosi na upotrebu definisanu iznad, u kojoj je navedena specifična eukariotska ćelija biljne ćelija.
U prikazu, izum je zasnovan na upotrebi na način definisan iznad kod kojih je navedena eukariotska ćelija biljke krstača kao što su Arabidopsis thaliana, mahunarke, kao što su Glycine max (soja), Medicago truncatula i Medicago sativa (alfalfa) ili biljke iz porodice Solanaceae kao što su Nicotiana benthamiana (duvan), Solanum tuberosum (krompir), Solanum lycopersicum (paradajz) ili Solanum melongena (patlidžan).
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu definisanu iznad u kojoj je navedena specifična eukariotska ćelija životinje, konkretno, čoveka.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu definisanu iznad u kojoj je navedena specifična eukariotska ćelija životinje, konkretno, čoveka, pri čemu se miPEP ne koristi za hirurško ili terapeutsko lečenje ljudskog tela ili tela životinje, niti za modifikovanje genetskog identiteta ljudskog bića.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu definisanu iznad u kojoj je navedena specifična eukariotska ćelija životinjska ćelija, pri čemu se pomenuti miPEP koristi za hirurško ili terapeutsko lečenje ljudskog tela ili tela životinje.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu definisanu iznad u kojoj su pomenuta mikroRNK i navedeni gen endogenog porekla u navedenoj specifičnoj eukariotskoj ćeliji.
1
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu definisanu iznad u kojoj su pomenuta mikroRNK i pomenuti gen egzogenog porekla u navedenoj specifičnoj eukariotskoj ćeliji, navedena specificirana eukariotska ćelija sadrži najmanje jedan vektor koji dozvoljava ekspresiju pomenute mikroRNK i navedenog gena.
U izumu, izrazi "endogenog porekla" i "egzogenog porekla" se koriste za razlikovanje pomenutih mikroRNK i / ili gena različitih vrsta, u pogledu očuvanja sekvenci između vrsta.
Prema tome, termin "endogenog porekla" označava da mikroRNK i / ili gen mogu biti prisutni prirodno u ćeliji o kojoj se radi. Druge kopije mikroRNK i/ili gena endogenog porekla mogu se, međutim, veštački dodati u dotičnu ćeliju, na primer kloniranjem.
Nasuprot tome, termin "egzogenog porekla" ukazuje da mikroRNK i/ili gen nikada nisu prirodno prisutni u ćeliji o kojoj se radi. To je mikroRNK i/ili gen identifikovan u drugom ćelijskom tipu ili u organizmu druge vrste; ova mikroRNK i/ili ovaj gen su stoga neophodno umetnuti u veštačku ćeliju.
U pronalasku, genetski transformisana ćelija može stoga sadržati 2 grupe mikroRNK i/ili gena potencijalno sličnih u smislu sekvence, jedan endogenog porekla i drugi egzogenog porekla.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu definisanu iznad u kojoj su primarni transkript miRNK i navedenog gena egzogenog porekla u navedenoj specifičnoj eukariotskoj ćeliji, navedena specificirana eukariotska ćelija sadrži najmanje jedan vektor koji dozvoljava ekspresiju primarnog transkripta mikroRNK.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu definisanu iznad u kojoj je primarni transkript miRNK kodiran vektorom koji je umetan u ćeliju veštački.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu definisanu iznad u kojoj je pomenuti miPEP izabran iz grupe peptida koja se sastoji od SEQ ID NO: 1 do SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 375 do SEQ ID NO: 386 i SEQ ID NO: 355 (Tabela 1).
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu koja je definisana iznad u kojoj je navedeni miPEP izabran iz grupe peptida koji se sastoje od:
- SEQ ID NO: 1 do SEQ ID NO: 104 i SEQ ID NO: 355,
- SEQ ID NO: 375 do SEQ ID NO: 386, ili
- SEQ ID NO: 424.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu definisanu iznad u kojoj je navedeni miPEP izabran iz MtmiPEP171b1 (SEQ ID NO: 59), AtmiPEP164a1 (SEQ ID NO: 24), AtmiPEP165a (SEQ ID NO: 43), AtmiPEP319a1 (SEQ ID NO: 76) i AtmiPEP319a2 (SEQ ID NO: 77).
1
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu definisanu iznad u kojoj je navedeni miPEP izabran iz MtmiPEP171b1 (SEQ ID NO: 59), AtmiPEP164a1 (SEQ ID NO: 24), AtmiPEP165a (SEQ ID NO: 43), AtmiPEP319a1 (SEQ ID NO: 76), AtmiPEP319a2 (SEQ ID NO: 77), AtmiPEP160b1 (SEQ ID NO: 14), MtmiPEP171e (SEQ ID NO: 63) i MtmiPEP169d (SEQ ID NO: 424). U prikazu, izum se odnosi na upotrebu koja je definisana iznad u kojoj je navedeni miPEP izabran iz DmmiPEP1a (SEQ ID NO: 102), DmmiPEP1b (SEQ ID NO: 103) i DmmiPEP8 (SEQ ID NO: 104).
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu definisanu iznad u kojoj je navedeni miPEP HsmiPEP155a (SEQ ID NO: 355).
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu koja je definisana iznad u kojoj je navedena nukleinska kiselina izabrana iz grupe nukleinskih kiselina koje se sastoje iz SEQ ID NO: 105 do SEQ ID NO: 208 i SEQ ID NO: 356 (Tabela 2).
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu koja je definisana iznad u kojoj je navedena nukleinska kiselina izabrana iz grupe nukleinskih kiselina koje se sastoje iz:
- SEQ ID NO: 105 do SEQ ID NO: 208 i SEQ ID NO: 356,
- SEQ ID NO: 387 do SEQ ID NO: 399, ili
- SEQ ID NO: 425.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu definisanu iznad u kojoj je navedena nukleinska kiselina izabrana iz miORF171b (SEQ ID NO: 163), miORF164a1 (SEQ ID NO: 128), miORF165a (SEQ ID NO: 147), miORF319a1 (SEQ ID NO: 180) i miORF319a2 (SEQ ID NO: 181).
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu definisanu iznad u kojoj je navedena nukleinska kiselina izabrana iz miORF171b (SEQ ID NO: 163), miORF164a1 (SEQ ID NO: 128), miORF165a (SEQ ID NO: 147), miORF319a1 (SEQ ID NO: 180), miORF319a2 (SEQ ID NO: 181), miORF160b1 (SEQ ID NO: 118), miORF169d (SEQ ID NO: 425) i miORF171e (SEQ ID NO: 167).
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu definisanu iznad u kojoj je navedena nukleinska kiselina izabrana iz miORF1a (SEQ ID NO: 206), miORF1b (SEQ ID NO: 207) i miORF8 (SEQ ID NO: 208).
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu definisanu iznad u kojoj se navedena nukleinska kiselina bira iz miORF155 (SEQ ID NO: 356).
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu definisanu iznad u kojoj se navedena mikroRNK bira iz grupe nukleinskih kiselina koje se sastoje iz SEQ ID NO: 282 do SEQ ID NO: 354 i SEQ ID NO: 358.
1
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu definisanu iznad u kojoj se navedena mikroRNK bira iz grupe nukleinskih kiselina koje se sastoje iz:
- SEQ ID NO: 282 do SEQ ID NO: 354 i SEQ ID NO: 358,
- SEQ ID NO: 412 do SEQ ID NO: 423, ili
- SEQ ID NO: 427.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu definisanu iznad u kojoj se navedena mikroRNK bira iz miR171b (SEQ ID NO: 319), miR165a (SEQ ID NO: 305) i miR319a (SEQ ID NO: 331). U prikazu, izum se odnosi na upotrebu definisanu iznad u kojoj se navedena mikroRNK bira iz miR171b (SEQ ID NO: 319), miR164a (SEQ ID NO: 297), miR165a (SEQ ID NO: 305), miR319a (SEQ ID NO: 331), miR160b (SEQ ID NO: 291), miR171e (SEQ ID NO: 322) i miR169d (SEQ ID NO: 427).
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu definisanu iznad u kojoj se navedena mikroRNK bira iz miR1a (SEQ ID NO: 353) i miR8 (SEQ ID NO: 354).
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu definisanu iznad u kojoj se navedena mikroRNK bira iz miR155 (SEQ ID NO: 358).
U drugom aspektu, izum se posebno odnosi na postupak za modulaciju ekspresije gena regulisanog mikroRNK u eukariotskoj ćeliji,
koji obuhvata sprovođenje koraka akumulacije miPEP-a u navedenoj eukariotskoj ćeliji, navedeni miPEP:
- veličina od 3 do 100 aminokiselina, poželjno 4 do 20 aminokiselina, i
- peptidne sekvence identične onom koji kodira nukleotidna sekvenca sadržana u primarnom transkriptu mikroRNK koja reguliše ekspresiju pomenutog gena, i - sposobni su da moduliraju akumulaciju pomenute mikroRNK,
u kojoj akumulacija navedenog miPEP-a u navedenoj eukariotskoj ćeliji indukuje modulaciju ekspresije navedenog gena u odnosu na ekspresiju navedenog gena bez akumulacije navedenog miPEP-a.
U drugom aspektu, izum se posebno odnosi na postupak za modulaciju ekspresije gena regulisanog mikroRNK u eukariotskoj ćeliji,
koji obuhvata sprovođenje koraka akumulacije miPEP-a u navedenoj eukariotskoj ćeliji, navedeni miPEP:
- veličine od 4 do 100 aminokiselina, ili od 3 aminokiseline, i
- peptidne sekvence identične onom koji kodira nukleotidna sekvenca sadržana u primarnom transkriptu mikroRNK koja reguliše ekspresiju pomenutog gena, i - sposobni su da moduliraju akumulaciju pomenute mikroRNK,
2
u kojoj akumulacija navedenog miPEP-a u navedenoj eukariotskoj ćeliji indukuje modulaciju ekspresije navedenog gena u odnosu na ekspresiju navedenog gena bez akumulacije navedenog miPEP-a.
U drugom aspektu, izum se posebno odnosi na postupak za modulaciju ekspresije gena regulisanog mikroRNK u eukariotskoj ćeliji,
koji obuhvata sprovođenje koraka akumulacije miPEP-a u navedenoj eukariotskoj ćeliji, navedeni miPEP:
- veličinu od 3 aminokiseline, i
- peptidne sekvence identične onom koji kodira nukleotidna sekvenca sadržana u primarnom transkriptu mikroRNK koja reguliše ekspresiju pomenutog gena, i - sposobni su da moduliraju akumulaciju pomenute mikroRNK,
u kojoj akumulacija navedenog miPEP-a u navedenoj eukariotskoj ćeliji indukuje modulaciju ekspresije navedenog gena u odnosu na ekspresiju navedenog gena bez akumulacije navedenog miPEP-a.
Konkretno, izum se odnosi na postupak za modulaciju ekspresije gena regulisanog mikroRNK u eukariotskoj ćeliji, koji obuhvata sprovođenje koraka akumulacije miPEP-a u navedenoj eukariotskoj ćeliji, koji obuhvata sprovođenje koraka akumulacije miPEP-a u navedenoj eukariotskoj ćeliji, navedeni miPEP:
- veličina od 4 do 100 aminokiselina, poželjno 4 do 20 aminokiselina, i
- peptidne sekvence identične onom koji kodira nukleotidna sekvenca sadržana u primarnom transkriptu mikroRNK koja reguliše ekspresiju pomenutog gena, i - sposobni su da moduliraju akumulaciju pomenute mikroRNK,
u kojoj akumulacija navedenog miPEP-a u navedenoj eukariotskoj ćeliji indukuje modulaciju ekspresije navedenog gena u odnosu na ekspresiju navedenog gena bez akumulacije navedenog miPEP-a.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za modulaciju ekspresije gena kao što je gore definisano, u kome se akumulacija navedenog miPEP u ćeliji dobija iz:
- uvođenja nukleinske kiseline koja kodira spomenuti miPEP u ćeliju, ili
- uvođenjem pomenutog miPEP-a u ćeliju.
U prikazu, izum se odnosi na postupak za modulaciju ekspresije gena kao što je definisano gore u kome je navedena eukariotska ćelija biljna ćelija.
U prikazu, izum se odnosi na postupak za modulaciju ekspresije gena kao što je gore definisano u kome je navedena eukariotska ćelija životinjska ćelija, i određena ljudska ćelija.
U prikazu, izum se odnosi na postupak za modulaciju ekspresije gena kao što je gore definisano u kome je navedena eukariotska ćelija životinjska ćelija i konkretna ljudska ćelija, pri čemu se navedeni postupak ne koristi za hirurško ili terapeutsko lečenje ljudskog tela. ili životinjskog tela, niti za modifikovanje genetskog identiteta ljudskog bića.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za modulaciju ekspresije gena kao što je gore definisano u kojem su pomenuta mikroRNK i navedeni gen endogenog porekla u navedenoj eukariotskoj ćeliji.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za modulaciju ekspresije gena kao što je gore definisano u kome su pomenuta mikroRNK i navedeni gen egzogenog porekla u navedenoj eukariotskoj ćeliji, pri čemu navedena eukariotska ćelija sadrži najmanje jedan vektor koji dozvoljava ekspresiju navedene mikroRNK i navedenog gena.
U prikazu, pronalazak se odnosi na postupak za modulaciju ekspresije gena kao što je definisano gore u kome je pomenuti miPEP izabran iz grupe peptida koja se sastoji od SEQ ID NO: 1 do SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 375 do SEQ ID NO: 386 i SEQ ID NO: 355. U prikazu, izum se odnosi na postupak za modulaciju ekspresije gena kao što je definisano gore u kome je pomenuti miPEP izabran iz grupe peptida koja se sastoji od:
- SEQ ID NO: 1 do SEQ ID NO: 104 i SEQ ID NO: 355,
- SEQ ID NO: 375 do SEQ ID NO: 386, ili
- SEQ ID NO: 424.
U prikazu, izum se odnosi na postupak za modulaciju ekspresije gena koji je regulisan sa miR171b (SEQ ID NO: 319) u eukariotskoj ćeliji,
koji obuhvata sprovođenje koraka akumulacije MtmiPEP171b1 (SEQ ID NO: 59) u navedenoj eukariotskoj ćeliji,
u kojoj akumulacija navedenog MtmiPEP171b1 u navedenoj eukariotskoj ćeliji indukuje modulaciju ekspresije navedenog gena u odnosu na ekspresiju navedenog gena bez akumulacije rečenog MtmiPEP171b1.
U prikazu, izum se odnosi na postupak za modulaciju ekspresije gena koji je regulisan sa miR171b (SEQ ID NO: 319) u eukariotskoj ćeliji,
koji obuhvata sprovođenje koraka akumulacije MtmiPEP171b1 (SEQ ID NO: 59) u navedenoj eukariotskoj ćeliji,
u kojima akumulacija pomenutog MtmiPEP171b1 u navedenoj eukariotskoj ćeliji indukuje modulaciju ekspresije navedenog gena u odnosu na ekspresiju navedenog gena bez akumulacije rečenog MtmiPEP171b1,
u kojoj je navedeni gen izabran iz gena HAM1 (pristupni broj MtGI9-TC114268) i HAM2 (pristupni broj MtGI9-TC120850) (pristupni brojevi prema bazi podataka Medicago truncatula Atlas ekspresije gena "MtGEA").
U posebnoj realizaciji, izum se odnosi na postupak za modulaciju ekspresije gena koji je regulisan sa miR164a (SEQ ID NO: 297) u eukariotskoj ćeliji,
koji obuhvata sprovođenje koraka akumulacije AtmiPEP165a1 (SEQ ID NO: 24) u navedenoj eukariotskoj ćeliji,
u kojoj akumulacija pomenutog AtmiPEP164a1 u navedenoj eukariotskoj ćeliji indukuje modulaciju ekspresije navedenog gena u odnosu na ekspresiju navedenog gena bez akumulacije pomenutog AtmiPEP164a1.
U posebnoj realizaciji, pronalazak se odnosi na postupak za modulaciju ekspresije gena regulisanog sa miR165a (SEQ ID NO: 305) u eukariotskoj ćeliji,
koji obuhvata sprovođenje koraka akumulacije AtmiPEP165a (SEQ ID NO: 43) u navedenoj eukariotskoj ćeliji,
u kojoj akumulacija pomenutog AtmiPEP165a u navedenoj eukariotskoj ćeliji indukuje modulaciju ekspresije navedenog gena u odnosu na ekspresiju navedenog gena bez akumulacije navedenog AtmiPEP165a.
U posebnoj realizaciji, pronalazak se odnosi na postupak za modulaciju ekspresije gena koji je regulisan sa miR319a (SEQ ID NO: 331) u eukariotskoj ćeliji,
koji obuhvata sprovođenje koraka akumulacije AtmiPEP319a1 (SEQ ID NO: 76) u navedenoj eukariotskoj ćeliji,
U kojoj akumulacija navedenog AtmiPEP319a1 u navedenoj eukariotskoj ćeliji indukuje modulaciju ekspresije navedenog gena u odnosu na ekspresiju navedenog gena bez akumulacije navedenog AtmiPEP319a1.
U posebnoj realizaciji, pronalazak se odnosi na postupak za modulaciju ekspresije gena koji je regulisan sa miR319a (SEQ ID NO: 331) u eukariotskoj ćeliji,
koji obuhvata sprovođenje koraka akumulacije AtmiPEP319a2 (SEQ ID NO: 77) u navedenoj eukariotskoj ćeliji,
u kojoj akumulacija pomenutog AtmiPEP319a2 u navedenoj eukariotskoj ćeliji indukuje modulaciju ekspresije navedenog gena u odnosu na ekspresiju navedenog gena bez akumulacije navedenog AtmiPEP319a2.
U posebnoj realizaciji, izum se odnosi na postupak za modulaciju ekspresije gena koji je regulisan sa miR160b (SEQ ID NO: 291) u eukariotskoj ćeliji,
2
koji obuhvata sprovođenje koraka akumulacije AtmiPEP160b1 (SEQ ID NO: 14) u navedenoj eukariotskoj ćeliji,
u kojoj akumulacija navedenog AtmiPEP160b1 u navedenoj eukariotskoj ćeliji indukuje modulaciju ekspresije navedenog gena u odnosu na ekspresiju navedenog gena bez akumulacije navedenog AtmiPEP160b1.
U posebnoj realizaciji, izum se odnosi na postupak za modulaciju ekspresije gena koji je regulisan sa miR169d (SEQ ID NO: 427) u eukariotskoj ćeliji,
koji obuhvata sprovođenje koraka akumulacije MtmiPEP169d (SEQ ID NO: 424) u navedenoj eukariotskoj ćeliji,
u kojoj akumulacija pomenutog MtmiPEP169d u navedenoj eukariotskoj ćeliji indukuje modulaciju ekspresije navedenog gena u odnosu na ekspresiju navedenog gena bez akumulacije navedenog MtmiPEP169d.
U posebnoj realizaciji, pronalazak se odnosi na postupak za modulaciju ekspresije gena koji je regulisan sa miR171e (SEQ ID NO: 322) u eukariotskoj ćeliji,
koji obuhvata sprovođenje koraka akumulacije MtmiPEP171e (SEQ ID NO: 63) u navedenoj eukariotskoj ćeliji,
u kojoj akumulacija pomenutog MtmiPEP171e u navedenoj eukariotskoj ćeliji indukuje modulaciju ekspresije navedenog gena u odnosu na ekspresiju navedenog gena bez akumulacije pomenutog MtmiPEP171e.
U prikazu, izum se odnosi na postupak za modulaciju ekspresije gena koji je regulisan sa miR1 (SEQ ID NO: 353) u eukariotskoj ćeliji,
koji obuhvata sprovođenje koraka akumulacije DmmiPEP1a (SEQ ID NO: 102) u navedenoj eukariotskoj ćeliji,
u kojoj akumulacija pomenutog DmmiPEP1a u navedenoj eukariotskoj ćeliji indukuje modulaciju ekspresije navedenog gena u odnosu na ekspresiju navedenog gena bez akumulacije pomenutog DmmiPEP1a.
U prikazu, izum se odnosi na postupak za modulaciju ekspresije gena koji je regulisan sa miR1 (SEQ ID NO: 353) u eukariotskoj ćeliji,
koji obuhvata sprovođenje koraka akumulacije DmmiPEP1b (SEQ ID NO: 103) u navedenoj eukariotskoj ćeliji,
u kojoj akumulacija pomenutog DmmiPEP1b u navedenoj eukariotskoj ćeliji indukuje modulaciju ekspresije navedenog gena u odnosu na ekspresiju navedenog gena bez akumulacije pomenutog DmmiPEP1b.
U posebnoj realizaciji, pronalazak se odnosi na postupak za modulaciju ekspresije gena regulisanog sa miR8 (SEQ ID NO: 354) u eukariotskoj ćeliji,
koji obuhvata sprovođenje koraka akumulacije DmmiPEP8 (SEQ ID NO: 104) u navedenoj eukariotskoj ćeliji,
u kojoj akumulacija pomenutog DmmiPEP8 u navedenoj eukariotskoj ćeliji indukuje modulaciju ekspresije navedenog gena u odnosu na ekspresiju navedenog gena bez akumulacije pomenutog DmmiPEP8.
U posebnoj realizaciji, pronalazak se odnosi na postupak za modulaciju ekspresije gena koji je regulisan sa miR155 (SEQ ID NO: 358) u eukariotskoj ćeliji,
koji obuhvata sprovođenje koraka akumulacije hsmiPEP155 (SEQ ID NO: 355) u navedenoj eukariotskoj ćeliji,
u kojima akumulacija pomenutog hsmiPEP155 u navedenoj eukariotskoj ćeliji indukuje modulaciju ekspresije navedenog gena u odnosu na ekspresiju navedenog gena bez akumulacije pomenutog hsmiPEP155.
U drugom aspektu primena takođe opisuje modifikovanu eukariotsku ćeliju koja sadrži peptid identičan miPEP-u kao što je gore definisano, pri čemu je navedeni peptid prisutan u navedenoj eukariotskoj ćeliji nezavisno od transkripcije primarnog transkripta mikroRNK koji nosi nukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti miPEP.
U izumu, pod pojmom "modifikovana eukariotska ćelija" podrazumeva se da navedena eukariotska ćelija sadrži miPEP uveden u ćeliju na umetan način, bilo kao peptid, ili preko vektora koji kodira pomenuti miPEP.
Pored miPEP-a koji je umetno uveden u ćeliju, modifikovana eukariotska ćelija prema izumu takođe sadrži najmanje jednu nukleinsku kiselinu koja odgovara miORF-u koji kodira miPEP.
Dodatni miPEP-u koji je umetno uveden u ćeliju i miORF, modifikovana eukariotska ćelija prema pronalasku takođe sadrži najmanje jedan miR, čiji primarni transkript sadrži navedeni miORF.
U jednom izvođenju, aplikacija takođe opisuje modifikovanu eukariotsku ćeliju kako je gore definisana, u kojoj je navedena mikroRNK endogenog porekla.
U još jednom prikazu, aplikacija takođe opisuje modifikovanu eukariotsku ćeliju kako je gore definisana u kojoj je navedena mikroRNK egzogenog porekla, a navedena modifikovana eukariotska ćelija sadrži vektor koji dozvoljava ekspresiju navedene mikroRNK.
2
U prikazu, aplikacija takođe opisuje modifikovanu eukariotsku ćeliju kako je gore definisana, pri čemu je navedena ćelija biljna ćelija.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje modifikovanu eukariotsku ćeliju na način definisan iznad, u kom je navedena ćelija biljke ćelija Medicago truncatula ili Arabidopsis thaliana, a navedeni peptid se bira iz grupe peptida koji se sastoje od:
- SEQ ID NO: 1 do SEQ ID NO: 101,
- SEQ ID NO: 375 do SEQ ID NO: 386, ili
- SEQ ID NO: 424.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje modifikovane eukariotske ćelije na način definisan iznad, gde je navedena ćelija biljke ćelija Medicago truncatula ili Arabidopsis thaliana, a navedeni peptid je izabran iz grupe koja se sastoji iz: SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 59 i SEQ ID NO: 77.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje modifikovane eukariotske ćelije na način definisan iznad, gde je navedena ćelija biljke ćelija Medicago truncatula ili Arabidopsis thaliana, a navedeni peptid je izabran iz grupe koja se sastoji iz: SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 424 i SEQ ID NO: 63.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje modifikovanu eukariotsku ćeliju na način opisan iznad, a navedena ćelija je životinjska ćelija.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje modifikovanu eukariotsku ćeliju definisanu iznad, gde je navedena ćelija životinje ćelija Drosophila a navedeni peptid je izabran iz grupe peptida koja se sastoji od SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 i SEQ ID NO: 104.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje modifikovane eukariotske ćelije na način opisan iznad, gde je navedena životinjska ćelija ljudskog porekla i sastoji se od peptida sa SEQ ID NO: 355.
U drugom aspektu, aplikacija takođe opisuje biljku koja se sastoji od bar jedne modifikovane eukariotske ćelije na način opisan iznad.
U drugom aspektu, aplikacija takođe opisuje životinjski organizam koji nije ljudskog porekla koji se sastoji od bar jedne eukariotske ćelije definisane iznad.
U drugom aspektu, aplikacija takođe opisuje sastav na nivou:
- miPEP kao što je gore definisano,
- nukleinske kiseline koja kodira pomenuti miPEP, ili
- vektor koji sadrži navedenu nukleinsku kiselinu.
2
U drugom aspektu, izum je povezan sa sastavom koji čini bar jedan miPEP izabran iz grupe koja se sastoji iz:
- SEQ ID NO: 1 do SEQ ID NO: 101,
- SEQ ID NO: 375 do SEQ ID NO: 386, ili
- SEQ ID NO: 424.
U drugom aspektu, izum se odnosi na sastav pesticida koji se sastoji od:
- miPEP kao što je gore definisano,
- nukleinske kiseline koja kodira pomenuti miPEP, ili
- vektor koji sadrži navedenu nukleinsku kiselinu.
U drugom aspektu, izum se odnosi na fitofarmaceutski sastav koji se sastoji od bar:
- miPEP kao što je gore definisano,
- nukleinske kiseline koja kodira pomenuti miPEP, ili
- vektor koji sadrži navedenu nukleinsku kiselinu.
U drugom aspektu, izum je povezan sa sastavom elicitora, koji se sastoji od:
- miPEP kao što je gore definisano,
- nukleinske kiseline koja kodira pomenuti miPEP, ili
- vektor koji sadrži navedenu nukleinsku kiselinu.
"Sastav elicitora" označava kompoziciju sposobnu da biljci obezbedi bolji kapacitet za simbiozu ili bolju otpornost na različite stresove, bez obzira da li su nastali od termičkog naprezanja, vodenog stresa ili hemijskog stresa.
U tu svrhu, izum se takođe odnosi na kompozicije koje deluju na rast (inhibiciju rasta ili obrnuto) i fiziologiju (bolji kapacitet za mikorizaciju, formiranje nodula, bolju toleranciju različitih stresova) biljke.
Konkretno, izum se odnosi na kompozicije za promovisanje rasta biljaka.
U drugom aspektu, izum se odnosi na herbicidnu kompoziciju koja sadrži najmanje
- miPEP kao što je gore definisano,
- nukleinske kiseline koja kodira pomenuti miPEP, ili
- vektor koji sadrži navedenu nukleinsku kiselinu.
U drugom aspektu, izum se odnosi na sastav insekticida koji se sastoji od:
- miPEP kao što je gore definisano,
- nukleinske kiseline koja kodira pomenuti miPEP, ili
- vektor koji sadrži navedenu nukleinsku kiselinu.
2
U drugom aspektu, izum se odnosi na sastav, naročito na fitosanitarni sastav, koji sadrži miPEP164a kao aktivni sastojak, pri čemu se miPEP164a preferirano sastoji SEQ ID NO: 24.
U drugom aspektu, izum se odnosi na sastav, naročito na fitosanitarni sastav, koji sadrži miPEP319a kao aktivni sastojak, pri čemu se miPEP319a preferirano sastoji SEQ ID NO: 76.
U drugom aspektu, izum se odnosi na sastav, naročito na fitosanitarni sastav, koji sadrži miPEP171b kao aktivni sastojak, pri čemu se miPEP171b preferirano sastoji SEQ ID NO: 59.
U drugom aspektu, izum se odnosi na sastav, naročito na fitosanitarni sastav, koji sadrži miPEP165a kao aktivni sastojak, pri čemu se miPEP165a preferirano sastoji SEQ ID NO: 43.
U drugom aspektu, izum se odnosi na sastav, naročito na fitosanitarni sastav, koji sadrži miPEP319a2 kao aktivni sastojak, pri čemu se miPEP319a2 preferirano sastoji SEQ ID NO: 77.
U drugom aspektu, izum se odnosi na sastav, naročito na fitosanitarni sastav, koji sadrži miPEP160b1 kao aktivni sastojak, pri čemu se miPEP160b1 preferirano sastoji SEQ ID NO: 14.
U drugom aspektu, izum se odnosi na sastav, naročito na fitosanitarni sastav, koji sadrži miPEP169d kao aktivni sastojak, pri čemu se miPEP169d preferirano sastoji SEQ ID NO: 424.
U drugom aspektu, izum se odnosi na kompoziciju, naročito na fitosanitarni sastav, koji sadrži miPEP171e kao aktivni sastojak, pri čemu se miPEP171e preferirano sastoji od SEQ ID NO: 63. Svojstva rastvorljivosti miPEP-ova su posebno određena njihovim aminokiselinskim sastavom. Hidrofilni miPEP mogu biti rastvoreni i upakovani u vodene rastvore, kao što je voda. Hidrofobni miPEP mogu da se rastvore i pakuju u rastvaračima, kao što su organski rastvarači.
Za tretiranje biljaka sa miPEPS, organski rastvarači su rastvarači koji nisu toksični za biljke u malim količinama, tj. nemaju nikakav štetan uticaj na razvoj biljke. Bez ograničenja, organski rastvarači mogu biti acetonitril i sirćetna kiselina.
MiPEP se takođe mogu rastvoriti i upakovati u smeše organskih rastvarača, kao što je na primer smeša acetonitrila i sirćetne kiseline. Konkretno, miPEP se mogu rastvoriti u rastvoru koji sadrži 50% acetonitrila, 10% sirćetne kiseline i 40% vode (zapremina/zapremina/zapremina).
2
Poželjno je da se miPEP-ovi 164a i 165a rastvore u vodi, a da se miPEP-ovi 171b i 319a rastvore u rastvoru koji sadrži 50% acetonitrila, 10% sirćetne kiseline i 40% vode (zapremina/zapremina/zapremina).
Bez ograničenja, sastavi, sastavi pesticida, fitofarmacijski sastavi, sastav herbicida i sastav insekticida je definisan i može da se sastoji od 10<-9>M do 10<-4>M miPEP, konkretno 10<-9>M, 10<-8>M, 10<-7>M, 10<-6>M, 10<-5>M ili 10<-4>M miPEP.
Sastavi više i niže koncentracije mogu se takođe obezbediti, u zavisnosti od upotrebljene aplikacije. Na primer, sastav od 10<-1>M do 10<-3>M miPEP, konkretno 10<-1>M, 10<-2>M ili 10<-3>M miPEP, mogu se upotrebiti u slučaju kada miPEP treba da se primenina biljku širenjem. U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na upotrebu kompozicije kao što je gore definisano, kao herbicida za iskorenjivanje biljaka ili usporavanje njihovog rasta, poželjno kao herbicid specifičan za vrstu ili za rod biljaka.
U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na upotrebu kompozicije kao što je gore definisano, kao fitofarmaceutsko sredstvo,
- za promovisanje rasta i/ili razvoja biljaka,
posebno za modulaciju fizioloških parametara biljke, posebno biomase, površine lišća, cvetanja, veličine ploda, proizvodnje i/ili selekcije semena biljaka, posebno za kontrolu partenokarpije ili monoecizma biljke, ili za modifikovanje fiziološki parametri semena biljaka, posebno klijanje, uspostavljanje korenovog sistema i otpornost na vodeni stres, - ili za sprečavanje ili lečenje biljnih bolesti,
posebno za promovisanje otpornosti na zarazne bolesti.
U drugom aspektu, izum se odnosi na upotrebu kompozicije kao što je definisano gore, za modulaciju fizioloških parametara biljke, posebno biomase, površine lišća ili veličine ploda. U prikazu, izum se odnosi na upotrebu kompozicije kao što je gore definisana, za stanjivanje voćnjaka kako bi se povećala veličina ploda.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu kompozicije kao što je gore definisana, za proizvodnju i/ili selekciju semena biljaka, pri čemu se navedena kompozicija koristi za kontrolu partenokarpije ili monoecizma biljke.
U prikazu, pronalazak se odnosi na upotrebu kompozicije kao što je gore definisana, pri čemu se pomenuta kompozicija primenjuje u navedenoj biljci preko listova ili preko korena. U prikazu, pronalazak se odnosi na upotrebu kompozicije kao što je gore definisana, za proizvodnju i/ili selekciju semena biljaka.
U prikazu, pronalazak se odnosi na upotrebu kompozicije kao što je definisano u prethodnom tekstu, u kojoj se pomenuta kompozicija koristi za modifikovanje fizioloških parametara
2
pomenutog semena biljke, posebno uspostavljanje sistema korena, klijanje i otpornost na vodeni stres.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu kompozicije kao što je definisano gore, u kojoj se pomenuta kompozicija nanosi oblaganjem ili oblaganjem filmom pomenutog semena biljaka.
U drugom aspektu, izum se odnosi na upotrebu kompozicije kao što je gore definisana, kao pesticida, za iskorenjivanje organizama koji su štetni za biljke ili koji mogu biti klasifikovani kao takvi,
posebno kao insekticid, araknicid, moluskicid ili rodenticid.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu kompozicije kao što je gore definisana kao insekticid. U prikazu, izum se odnosi na upotrebu kompozicije kao što je gore definisana, za iskorenjivanje insekata štetočina.
U jednom izvođenju, izum se odnosi na upotrebu kompozicije kao što je gore definisana, za iskorjenjivanje životinjskih vrsta klasifikovanih kao štetne ili podložne klasifikaciji kao takve, posebno Muridae, konkretno kod pacova.
U jednoj realizaciji, izum se odnosi na upotrebu kompozicije kao što je definisano gore, kao pesticida za iskorjenjivanje organizama štetnih za biljke ili koji se mogu klasifikovati kao takvi,
posebno kao insekticid, araknicid, moluskicid ili rodenticid,
posebno primenom pomenutog sastava na biljku ili na nosač u kontaktu sa biljkom.
U drugom aspektu, izum se odnosi na upotrebu kompozicije kao što je definisano gore, u kojoj se pomenuta kompozicija nanosi na biljku da bi se zaštitila od insekata.
U drugom aspektu, ovaj izum se odnosi na upotrebu peptida za promovisanje rasta biljke, pri čemu se navedeni peptid uvodi u biljku, pri čemu navedeni peptid ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se sastoji od sekvence identične onoj koju ima miPEP prirodno prisutan u pomenutoj biljci,
spomenuti miPEP prirodno prisutan u navedenoj biljci je peptid od 4 do 100 aminokiselina čija je sekvenca kodirana otvorenim okvirom za čitanje smeštenim na primarnom transkriptu miRNK, pri čemu je miPEP sposoban da modulira akumulaciju navedene miRNK u navedenoj biljci, pomenuta miRNK reguliše ekspresiju najmanje jednog gena koji je uključen u razvoj vegetativnih ili reproduktivnih delova biljke, posebno korena, stabljika, listova ili cvetova.
Kreatori izuma su iznenađujuće otkrili da upotreba peptida čija sekvenca sadrži ili se sastoji od sekvence identične onoj za miPEP-ova kodiranih na primarnim transkriptima miRNK, omogućava promovisanje rasta biljaka.
U izumu, izraz "biljka" se generalno odnosi na celu biljku ili njen deo, bez obzira na njen stadijum razvoja (uključujući biljku u obliku semena ili mladog izdanka), na jedan ili više organa biljke (na primer, lišće, korenje, stabljike, cveće), jednu ili više ćelija biljke, ili grupu ćelija biljke.
U izumu, termin "rast" odnosi se na razvoj cele ili dela biljke tokom vremenskog perioda. Rast biljke se stoga može odrediti i kvantifikovati praćenjem razvojnih parametara koji su uočljivi za određene delove, ćelije ili organe biljke, kao što su listovi, koreni, stabljike ili cvetovi.
Bez ograničenja, parametri za određivanje i kvantifikaciju rasta biljke mogu biti:
- veličina, površina, zapreminu, masa i broj listova,
- veličinu i broj cvetova,
- veličina stabla (ili osnove),
- dužina i broj korena,
- ranost klijanja,
- ranost pupljenja,
- ranost cvetne indukcije (ili cvetna tranzicija),
- ili broj ćelija.
U slučaju mahunastih biljaka, rast biljaka može biti povezan sa stopom nodulacije, ili takođe sa veličinom i brojem kvržica na korenu.
Pored toga, u izumu, izraz "podsticanje rasta biljaka" ili "poboljšanje rasta biljaka", označava:
- ili ubrzanje razvoja (kao što je na primer veća površina lista za biljku u datom trenutku u odnosu na referentnu biljku),
- ili povećanje razvoja (kao što je, na primer, veća površina lista za biljku koje ne može da dostigne referentna biljka),
- ili ubrzanje i povećanje razvoja biljke.
Važno je napomenuti da je upotreba prema izumu prednost u tome što je ekološka, u poređenju sa hemijskim metodama koje se konvencionalno koriste u hortikulturi ili u poljoprivredi, pošto je miPEP peptid koji je prirodno prisutan u biljci.
Izum se takođe odnosi na upotrebu miPEP-a uvedenog u biljku za unapređenje njegovog rasta,
1
navedeni miPEP je uveden kao peptid koji sadrži, ili se sastoji od sekvence identične onoj od miPEP prirodno prisutnog u pomenutoj biljci,
spomenuti miPEP je prirodno prisutan peptid od 4 do 100 aminokiselina, čija je sekvenca kodirana otvorenim okvirom čitanja lociranim na 5' na primarnom transkriptu miRNK, navedeni miPEP je sposoban da modulira akumulaciju navedene miRNK u pomenutoj biljci, pri čemu miRNK reguliše ekspresiju najmanje jednog gena uključenog u razvoj vegetativnih ili reproduktivnih delova biljke, posebno korena, stabljike, listove ili cvetove,
ukupna količina pomenutog miPEP-a i ona u kojoj je pomenuti miPEP prirodno prisutan je uvek veća od količine pomenutog miPEP koji je prirodno prisutan.
U izumu, izraz "uvedeni miPEP" odnosi se na miPEP koji je veštački uveden u biljku za razliku od "miPEP koji je prirodno prisutan u biljci". Uvođenje miPEP-a u biljku uključuje tehnološki korak, koji nije prirodni fenomen i ne nije ukrštanje ni selekcija.
Uveden miPEP može biti ili peptid proizveden izvan biljke (na primer izolovani i/ili pročišćeni peptid, sintetički peptid ili rekombinovani peptid), ili peptid proizveden u biljci nakon veštačkog uvođenja nukleinske kiseline za kodiranje navedenog miPEP-a u navedenu biljku.
Biljka u koju miPEP nije uveden ima bazalnu količinu navedenog miPEP-a, što odgovara količini pomenutog miPEP-a koji je prirodno prisutan. Upotreba miPEP-a, koji sadrži, ili se sastoji od sekvence identične navedenoj miPEP-u, dovodi do povećanja ukupne količine miPEP-a, koji modulira akumulaciju miRNK čiji primarni transkript sadrži sekvencu koji kodira pomenuti miPEP.
Štaviše, uveden miPEP je prisutan u biljci i njegovo uvođenje nema uticaja na njegovu stabilnost.
U jednoj realizaciji, izum se odnosi na upotrebu koja je definisana iznad, u kojoj je navedeni gen, koji je uključen u razvoj vegetativnih ili reproduktivnih delova biljke, izabran iz grupe koja se sastoji od: NAC1 (Pristup br. AT1G56010.1), NAC4 (Pristup br. AT5G07680.1), NAC5 (Pristup br. AT5G61430.1), CUC1 (Pristup br. AT3G15170.1), CUC2 (Pristup br. AT5G53950.1), TCP3 (Pristup br. AT1G53230.1) i TCP4 (Pristup br. AT3G15030.1) (brojevi pristupa u skladu sa bazom podataka Arabidopsni izvor informacija "TAIR"). Konkretno, izum se odnosi na upotrebu koja je definisana iznad, gde je uključeni gen u razvoj vegetativnih ili reproduktivnih delova biljke izabran iz grupe koja se sastoji iz:
NAC1, NAC4, NAC5, CUC1 i CUC2.
2
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu koja je definisana iznad, gde je navedeni gen uključen u razvoj vegetativnih ili reproduktivnih delova biljke i izabran je iz grupe koja se sastoji iz: TCP3 i TCP4.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu definisanu iznad, u kojoj je pomenuta miRNK izabrana od miR164a i mir319a.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu koja je definisana iznad, u kojoj je navedeni miR izabran od miR164a, miR319a, miR171b, miR165a, miR160b, miR169d i miR171e.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu koja je definisana iznad, u kojoj je pomenuti miPEP izabran od AtmiPEP164a1, AtmiPEP319a1, AtmiPEP319a2, MtmiPEP171b1, AtmiPEP165a1, AtmiPEP160b1, MtmiPEP169d, MtmiPEP171e.
Konkretno, izum se odnosi na upotrebu koja je gore definisana, gde pomenuti miR164a ima nukleotidnu sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 297.
Konkretno, izum se odnosi na upotrebu koja je definisana iznad, u kojoj pomenuti miR164a ima nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 80% identiteta, poželjno najmanje 90% identiteta, sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 297.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu koja je definisana iznad, u kojoj je pomenuti miPEP AtmiPEP164a1, konkretno kada pomenuti AtmiPEP164a1 ima aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 24.
Konkretno, pronalazak se odnosi na upotrebu koja je definisana iznad, gde pomenuti miR319a ima nukleotidnu sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 331.
Naročito, izum se odnosi na upotrebu koja je definisana iznad, u kojoj pomenuti miR319a ima nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 80% identiteta, poželjno najmanje 90% identiteta, sa nukleotidnim sekvencom SEQ ID NO: 331.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu koja je definisana iznad, u kojoj je pomenuti miPEP AtmiPEP319a1, naročito gde pomenuti AtmiPEP319a1 ima aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 76.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu koja je gore definisana, u kojoj je pomenuta biljka krucifer, kao što je Arabidopsis thaliana, biljka mahunarke kao što je Glycine max (soja), Medicago truncatula i Medicago sativa (lucerka) ili biljka iz porodice Solanaceae, kao što su Nicotiana benthamiana (duvan), Solanum lycopersicum (krompir), Solanum lycopersicum (paradajz) ili Solanum melongena (patlidžan).
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu koja je gore definisana, u kojoj je navedena biljka krstaš.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu koja je definisana iznad, u kojoj je navedena biljka Arabidopsis thaliana.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu kako je gore definisano, za promovisanje rasta biljke Arabidopsis thaliana, u kojoj je AtmiPEP164a1 uveden u pomenutu biljku Arabidopsis thaliana, pri čemu je navedeni AtmiPEP164a1 takođe prirodno prisutan u navedenoj biljci Arabidopsis thaliana,
pomenuti AtmiPEP164a1 je predstavljen kao peptid čija sekvenca sadrži ili se sastoji od sekvence identične prirodno prisutnoj u AtmiPEP164a1, a navedena sekvenca AtmiPEP164a1 je prirodno prisutna sa kodiranim otvorenim okvirom čitanja koji se nalazi na 5' na primarnom transkriptu miR164a, gde miR164a kontroliše ekspresiju najmanje jednog gena uključenog u razvoj vegetativnih ili reproduktivnih delova Arabidopsis thaliana,
ukupna količina količine pomenutog AtmiPEP164a1 koja je uvedena i ona pomenutog AtmiPEP164a1 koja je prirodno prisutna je uvek veća od količine pomenutog AtmiPEP164a1 prirodno prisutnog u navedenoj biljci Arabidopsis thaliana.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu na način koji je gore definisan, za promovisanje rasta biljke Arabidopsis thaliana, u kojoj je AtmiPEP319a1 uveden u pomenutu biljku Arabidopsis thaliana, pri čemu je AtmiPEP319a1 takođe prirodno prisutan u pomenutoj biljci Arabidopsis thaliana,
pomenuti AtmiPEP319a1 je predstavljen kao peptid čija sekvenva sadrži ili se sastoji od sekvence identične onoj kod AtmiPEP319a1 koji je prirodno prisutan, a navedena sekvnva AtmiPEP319a1 je prirodno prisutna sa kodirana otvorenim okvirom čitanja koji se nalazi na 5' na primarnom transkriptu miR319a za koji miR319a kontroliše ekspresiju najmanje jednog gena uključenog u razvoj vegetativnih ili reproduktivnih delova Arabidopsis thaliana,
zbir ukupne količine navedenog AtmiPEP319a1 koji je uveden i AtmiPEP319a1 koji je prirodno prisutan je strogo veća od količine pomenutog AtmiPEP319a1 koji je prirodno prisutan u navedenoj biljci Arabidopsis thaliana.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu koja je gore definisana, u kojoj se pomenuti miPEP unosi u biljku spolja, poželjno je zalivanjem, raspršivanjem ili dodavanjem đubriva, komposta, supstrata kulture ili inertnog nosača.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu koja je definisana gore, u kojoj se pomenuti miPEP unosi zalivanjem i raspršivanjem.
4
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu koja je gore definisana, u kojoj se pomenuti miPEP unosi zalivanjem i dodavanjem đubriva.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu koja je gore definisana, u kojoj se pomenuti miPEP unosi raspršivanjem i dodavanjem đubriva.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu koja je gore definisana, u kojoj se pomenuti miPEP uvodi, zalivanjem, prskanjem i dodavanjem đubriva.
Pronalazači su u stvari neočekivano otkrili da je moguće primeniti kompoziciju koja sadrži miPEP direktno na biljku da bi se modulirala akumulacija odgovarajuće miRNK u biljci, što ukazuje da je miPEP zarobljen u biljci.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu koja je definisana gore, u kojoj je biljka tretirana sa kompozicijom koja sadrži 10<-9>M do 10<-4>M navedenog miPEP, konkretno 10<-9>M, 10<-8>M, 10<-7>M, 10<-6>M, 10<-5>M ili 10<-4>M navedenog miPEP.
Poželjno je da kompozicije imaju koncentraciju od 10<-8>M do 10<-5>M za primenu zalivanjem ili prskanjem na biljku.
Pored toga, mogu se predvideti kompozicije veće ili niže koncentracije za tretiranje biljke sa miPEP. Kao neograničavajući primer, kompozicije veće koncentracije koje sadrže 10<-1>M do 10<-3>M, naročito 10<-2>M miPEP, mogu da se koriste u slučaju kada se miPEP uvodi egzogeno u biljku širenjem.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu koja je definisana gore, u kojoj je pomenuti miPEP uveden u biljku pomoću nukleinske kiseline koja kodira pomenuti miPEP, a navedena nukleinska kiselina se unosi u biljku.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu koja je gore definisana, u kojoj je veličina stabljike povećana u biljci u koju je uveden miPEP u odnosu na veličinu stabljike identične biljke istog uzrasta u koju je nije uveden miPEP, ili u odnosu na veličinu stabljike identične biljke istog uzrasta u koju miPEP nije uveden.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu koja je definisana gore, u kojoj je broj listova povećan u biljci u koju je uveden miPEP u odnosu na broj listova identične biljke istog uzrasta u koji nema miPEP je uveden, ili u odnosu na broj listova identične biljke istog uzrasta u koji nije uveden miPEP.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu koja je gore definisana, u kojoj je veličina listova povećana u biljci u koju je uveden miPEP u odnosu na veličinu listova identične biljke istog uzrasta u koje nije uveden miPEP, ili u odnosu na veličinu lišća identične biljke istog uzrasta u koju miPEP nije uveden.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu koja je definisana gore, u kojoj je broj korena povećan u biljci u koju je uveden miPEP u odnosu na broj korena identične biljke istog uzrasta u koji nema miPEP je uveden, ili u odnosu na broj korijena identične biljke istog uzrasta u koju nije uveden spomenuti miPEP.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu koja je gore definisana, u kojoj se dužina korena povećava u biljci u koju je uveden miPEP u odnosu na dužinu korena identične biljke istog uzrasta u koju nije uveden miPEP, ili u odnosu na dužinu korijena identične biljke iste starosti u koju miPEP nije uveden.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu koja je gore definisana, u kojoj je brzina nodulacije povećana u biljci u koju je spomenuti miPEP uveden u odnosu na brzinu nodulacije identične biljke istog uzrasta u kojoj nije uveden miPEP, ili u odnosu na brzinu nodulacije identične biljke istog uzrasta u koju spomenuti miPEP nije uveden.
U prikazu, izum se odnosi na upotrebu koja je gore definisana, u kojoj se povećava broj nodula u biljci u koju je uveden miPEP u odnosu na broj nodula identične biljke istog uzrasta u koje nije uočen miPEP je uveden, ili u odnosu na broj kvržica identične biljke istog uzrasta u koje nije spomenut miPEP.
Povećanje parametara za određivanje i kvantifikovanje rasta u biljci u koju je uveden miPEP (kao što su veličina stabljike, broj i veličina listova, broj i dužina korena, brzina nodulacije ili takođe broj kvržica na korenu) je poželjno prikazan upoređivanjem sa identičnom biljkom (tj. biljkom iste vrste i/ili sorte), istog uzrasta i uzgojenom pod istim uslovima, ali u koju nije uveden miPEP.
U drugom aspektu, izum se odnosi na postupak za podsticanje rasta biljke, koji sadrži korak uvođenja miPEP-a u biljku, pri čemu je miPEP takođe prirodno prisutan u navedenoj biljci, spomenuti miPEP je uveden kao peptid od 4 do 100 amino kiselina čija sekvenca sadrži ili se sastoji od sekvence identične onoj kod miPEP koji je prirodno prisutan, pri čemu je sekvenca miPEP koja je prirodno prisutana sa kodiranim otvorenim okvirom čitanja na 5' primarnog transkripta miRNK, navedeni miPEP je sposoban da modulira akumulaciju pomenutog miRNK, a miRNK reguliše ekspresiju najmanje jednog gena uključenog u razvoj vegetativnih ili reproduktivnih delova biljke, posebno korena, stabljike, lišće ili cveća, ukupna količina pomenutog miPEP-a i ona u kojoj je pomenuti miPEP prirodno prisutan je uvek veća od količine pomenutog miPEP koji je prirodno prisutan.
U prikazu, izum se odnosi na postupak koji je gore definisan, u kome je navedeni gen uključen u razvoj vegetativnih ili reproduktivnih delova biljke izabran iz grupe koja se sastoji od: NAC1 (Pristup br. AT1G56010.1), NAC4 (Pristup br. AT5G07680.1), NAC5 (Pristup br.
AT5G61430.1), CUC1 (Pristup br. AT3G15170.1), CUC2 (Pristup br. AT5G53950.1), TCP3 (Pristup br. AT1G53230.1) i TCP4 (Pristup br. AT3G15030.1).
Konkretno, izum se odnosi na postupak koji je gore definisan, u kome je navedeni gen uključen u razvoj vegetativnih ili reproduktivnih delova biljke izabran iz grupe koja se sastoji od: NAC1, NAC4, NAC5, CUC1 i CUC2.
U prikazu, izum se odnosi na postupak koji je gore definisan, u kome je navedeni gen uključen u razvoj vegetativnih ili reproduktivnih delova biljke izabran iz grupe koja se sastoji od: TCP3 i TCP4.
U prikazu, izum se odnosi na postupak koji je gore definisan, gde je navedeni miR izabran od miR164a, miR319a, miR171b, miR165a, miR160b, miR169d i miR171e.
U prikazu, izum se odnosi na postupak koji je gore definisan, u kome je pomenuti miPEP izabran od AtmiPEP164a1, AtmiPEP319a1, AtmiPEP319a2, MtmiPEP171b1, AtmiPEP165a1, AtmiPEP160b1, MtmiPEP169d, MtmiPEP171e.
U prikazu, izum se odnosi na postupak koji je gore definisan, u kome je pomenuta miRNK miR164a, konkretno, u kojoj pomenuti miR164a ima nukleotidnu sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 297.
U prikazu, izum se odnosi na postupak koji je gore definisan, u kome je pomenuti miPEP AtmiPEP164a1, konkretno, u gde pomenuti AtmiPEP164a1 ima aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 24.
U prikazu, izum se odnosi na postupak koji je gore definisan, u kome je pomenuta miRNK miR319a, konkretno, gde pomenuti miR319a ima nukleotidnu sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 331.
U prikazu, izum se odnosi na postupak koji je gore definisan, u kome je pomenuti miPEP AtmiPEP319a1, konkretno, AtmiPEP319a1 ima aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 76.
U prikazu, izum se odnosi na postupak koji je gore definisan, u kome je pomenuta biljka krucifer, kao što je Arabidopsis thaliana, mahunasta biljka kao što je Glycine max (soja), Medicago truncatula i Medicago sativa (lucerka) ili biljke iz porodice Solanaceae, kao što su Nicotiana benthamiana (duvan), Solanum tuberosum (krompir), Solanum licopersicum (paradajz) ili Solanum melongena (patlidžan).
U prikazu, izum se odnosi na postupak koji je gore definisan, u kome je navedena biljka krstaš.
U prikazu, izum se odnosi na postupak kako je gore definisan, u kome je navedena biljka Arabidopsis thaliana.
U prikazu, izum se odnosi na postupak koji je gore definisan, za podsticanje rasta biljke Arabidopsis thaliana, u kojoj je AtmiPEP164a1 uveden u pomenutu biljku Arabidopsis thaliana, pri čemu je AtmiPEP164a1 takođe prirodno prisutan u pomenutoj biljci Arabidopsis thaliana,
pomenuti AtmiPEP164a1 je predstavljen kao peptid koji sadrži ili se sastoji od sekvence identične onoj koja je prisutna u AtmiPEP164a1, gde je AtmiPEP164a1 prirodno prisutan peptid od 4 do 100 aminokiselina čiji je sekvenca kodirana otvorenim okvirom čitanja koji se nalazi na 5' primarnom transkriptu miR164a,
pomenuti AtmiPEP164a1 je sposoban da poveća akumulaciju navedenog miR164a, gde pomenuti miR164a reguliše ekspresiju najmanje jednog gena uključenog u razvoj vegetativnih ili reproduktivnih delova Arabidopsis thaliana,
ukupna količina navedenog AtmiPEP164a1 koja je uvedena i ona za navedeni AtmiPEP164a1 koja je prirodno prisutna je strogo veća od količine navedenog AtmiPEP164a1 koji je prirodno prisutan.
U prikazu, izum se odnosi na postupak kako je gore definisan, za promovisanje rasta biljke Arabidopsis thaliana, u kojoj je AtmiPEP319a1 uveden u pomenutu biljku Arabidopsis thaliana, pri čemu je AtmiPEP319a1 takođe prirodno prisutan u pomenutoj biljci Arabidopsis thaliana,
pomenuti AtmiPEP319a1 je predstavljen kao peptid koji sadrži ili se sastoji od sekvence identične onoj koja je prisutna u AtmiPEP319a1, gde je AtmiPEP319a1 prirodno prisutan peptid od 4 do 100 aminokiselina čija je sekvenca kodirana otvorenim okvirom čitanja koji se nalazi na 5' primarnom transkriptu miR319a,
pomenuti AtmiPEP319a1 je sposoban da poveća akumulaciju navedenog miR319a, gde miR319a reguliše ekspresiju najmanje jednog gena uključenog u razvoj vegetativnih ili reproduktivnih delova Arabidopsis thaliana,
zbir ukupne količine navedenog AtmiPEP319a1 koji je uveden i navedenog AtmiPEP319a1 koji je prirodno prisutan je strogo veća od količine navedenog AtmiPEP319a1 koji je prirodno prisutan.
U prikazu, izum se odnosi na postupak koji je gore definisan, u kome se pomenuti miPEP uvodi u biljku spolja, poželjno zalivanjem, raspršivanjem ili dodavanjem đubriva, komposta, supstrata kulture ili inertnog nosača.
U prikazu, izum se odnosi na postupak koji je gore definisan, u kome se pomenuti miPEP primenjuje u biljci u obliku kompozicije koja sadrži 10<-9>M do 10<-4>M navedenog miPEP, konkretno 10<-9>, 10<-8>, 10<-7>, 10<-6>, 10<-5>ili 10<-4>M navedenog miPEP.
U prikazu, izum se odnosi na postupak koji je gore definisan, u kome je pomenuti miPEP uveden u biljku pomoću nukleinske kiseline koja kodira pomenuti miPEP, pri čemu se navedena nukleinska kiselina uvodi u biljku.
U prikazu, izum se odnosi na postupak koji je gore definisan, u kome se veličina stabljike povećava u biljci u koju je uveden miPEP u odnosu na veličinu stabljike identične biljke istog uzrasta u koju nije uveden miPEP, ili u odnosu na veličinu stabljike identične biljke istog uzrasta u koju nije uveden miPEP.
U prikazu, izum se odnosi na postupak koji je gore definisan, u kome je broj listova povećan u biljci u koju je uveden miPEP u odnosu na broj listova identične biljke istog uzrasta u bez uvođenja miPEP, ili u odnosu na broj listova identične biljke istog uzrasta u koji nije uveden miPEP.
U prikazu, izum se odnosi na postupak koji je gore definisan, u kome se veličina lišća povećava u biljci u koju je uveden miPEP u odnosu na veličinu listova identične biljke istog uzrasta u koju nije uveden miPEP, ili u odnosu na veličinu lišća identične biljke istog uzrasta u koju miPEP nije uveden.
U prikazu, izum se odnosi na postupak koji je gore definisan, u kome se broj korena povećava kod biljke u koju je uveden miPEP u odnosu na broj korena identične biljke istog uzrasta u koju nije uveden miPEP, ili u odnosu na broj koriena identične biljke istog uzrasta u koju nije uveden spomenuti miPEP.
U prikazu, izum se odnosi na postupak koji je gore definisan, u kome se dužina korena povećava kod biljke u koju je uveden miPEP u odnosu na dužinu korena identične biljke istog uzrasta u koju nije uveden miPEP, ili u odnosu na dužinu koriena identične biljke iste starosti u koju miPEP nije uveden.
U prikazu, izum se odnosi na postupak koji je gore definisan, u kome je brzina nodulacije povećana u biljci u koju je uveden miPEP u odnosu na brzinu nodulacije identične biljke istog uzrasta u koju nije uveden miPEP, ili u odnosu na brzinu nodulacije identične biljke istog uzrasta u koju spomenuti miPEP nije uveden.
U prikazu, izum se odnosi na postupak koji je gore definisan, u kome se povećava broj nodula u biljci u koju je uveden miPEP u odnosu na broj nodula identične biljke istog uzrasta u koji nijedan miPEP nije uveden, ili u odnosu na broj nodula identične biljke istog uzrasta u koje nije uveden navedeni miPEP.
U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na biljku u koju je uveden miPEP u skladu sa upotrebom ili postupkom za podsticanje rasta biljke opisane gore.
U drugom aspektu, aplikacija takođe opisuje postupak za proizvodnju transgenske biljke koja sadrži:
a) korak uvođenja nukleinske kiseline koja kodira miPEP od 4 do 100 aminokiselina u biljku, ili u najmanje jednu ćeliju pomenute biljke, pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju pomenutog miPEP,
spomenuti miPEP je takođe prirodno prisutan u pomenutoj biljci, pri čemu je miPEP prirodno prisutan peptid čija je sekvenca kodirana otvorenim okvirom čitanja lociranim na 5' primarnom transkriptu miR, a miPEP je sposoban da modulira akumulaciju navedenog miR u biljci, navedeno miR reguliše ekspresiju najmanje jednog gena uključenog u razvoj vegetativnih ili reproduktivnih delova biljke, posebno korena, stabljike, listove ili cvetove, i b) korak kultivisanja biljke, ili najmanje jedne ćelije pomenute biljke, dobijene u koraku a) pod uslovima koji omogućavaju dobijanje transgene biljke.
U drugom aspektu, aplikacija takođe opisuje postupak za proizvodnju transgenske biljke koja sadrži:
a) korak uvođenja nukleinske kiseline koja kodira miPEP od 4 do 100 amino kiselina, ili od 3 aminokiseline, u biljku, ili u najmanje jednu ćeliju pomenute biljke, pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju pomenutog miPEP,
spomenuti miPEP je takođe prirodno prisutan u pomenutoj biljci, pri čemu je miPEP prirodno prisutan peptid čija je sekvenca kodirana otvorenim okvirom čitanja lociranim na 5' primarnom transkriptu miR, a miPEP je sposoban da modulira akumulaciju navedenog miR u biljci, navedeno miR reguliše ekspresiju najmanje jednog gena uključenog u razvoj vegetativnih ili reproduktivnih delova biljke, posebno korena, stabljike, listove ili cvetove, i b) korak kultivisanja biljke, ili najmanje jedne ćelije pomenute biljke, dobijene u koraku a) pod uslovima koji omogućavaju dobijanje transgene biljke.
U drugom aspektu, aplikacija takođe opisuje postupak za proizvodnju transgenske biljke koja sadrži:
a) korak uvođenja nukleinske kiseline koja kodira miPEP od 3 aminokiseline, u biljku, ili u najmanje jednu ćeliju pomenute biljke, pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju pomenutog miPEP,
spomenuti miPEP je takođe prirodno prisutan u pomenutoj biljci, pri čemu je miPEP prirodno prisutan peptid čija je sekvena kodirana otvorenim okvirom čitanja lociranim na 5' primarnom transkriptu miR, a miPEP je sposoban da modulira akumulaciju navedenog miR u biljci, navedeno miR reguliše ekspresiju najmanje jednog gena uključenog u razvoj vegetativnih ili reproduktivnih delova biljke, posebno korena, stabljike, listove ili cvetove, i
4
b) korak kultivisanja biljke, ili najmanje jedne ćelije pomenute biljke, dobijene u koraku a) pod uslovima koji omogućavaju dobijanje transgene biljke.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za proizvodnju transgene biljke kao što je definisano gore, gde je pomenuta transgena biljka dobijena u koraku b) poboljšala rast u odnosu na identičnu biljku u kojoj nukleinska kiselina nije uvedena.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za proizvodnju transgene biljke kao što je definisano gore, u kojoj je ekspresija navedenog miPEP-a kodirana nukleinskom kiselinom uvedenom u biljku, i rezultira poboljšanim rastom u odnosu na identičnu biljku u kojoj rečena nukleinska kiselina nije uveden.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za proizvodnju transgene biljke kao što je definisano gore, u kojoj se korak a) izvodi koristeći vektor koji sadrži navedenu nukleinsku kiselinu, poželjno plazmid.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za proizvodnju transgene biljke kao što je definisano gore, u kojoj se ekspresija navedene nukleinske kiseline iz koraka a) stavlja pod kontrolu jakog promotora, poželjno konstitutivnog jakog promotora kao što je 35S promoter.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za proizvodnju transgenske biljke kao što je definisano gore, u kojoj je navedeni gen uključen u razvoj vegetativnih ili reproduktivnih delova biljke izabran iz grupe koju čine: NAC1 (Pristup br. AT1G56010.1), NAC4 (Pristup br. AT5G07680.1), NAC5 (Pristup br. AT5G61430.1), CUC1 (Pristup br. AT3G15170.1), CUC2 (Pristup br. AT5G53950.1), TCP3 (Pristup br. AT1G53230.1) and TCP4 (Pristup br. AT3G15030.1).
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za proizvodnju transgenske biljke kao što je definisano gore, u kojoj pomenuti miPEP ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1 do SEQ ID NO: 101 i SEQ ID NO: 375 do SEQ ID NO: 386.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za proizvodnju transgenske biljke kao što je definisano gore, u kojoj pomenuti miPEP ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ili se sastoji od od sekvence izabrane koja se sastoji od:
- SEQ ID NO: 1 do SEQ ID NO: 101,
- SEQ ID NO: 375 do SEQ ID NO: 386, ili
- SEQ ID NO: 424.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za proizvodnju transgene biljke kao što je definisano gore, u kojoj je pomenuta miRNK miR164a, naročito u kojoj pomenuti miR164a ima nukleotidnu sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 297.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za proizvodnju transgene biljke kao što je definisano gore, u kojoj je pomenuti miPEP AtmiPEP164a1, naročito u kojem pomenuti AtmiPEP164a1 ima aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 24.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za proizvodnju transgenske biljke kao što je definisano gore, u kojoj je pomenuta miRNK miR319a, naročito u kojoj pomenuti miR319a ima nukleotidnu sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 331.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za proizvodnju transgenske biljke, kao što je definisano gore, u kojoj je pomenuti miPEP AtmiPEP319a1, naročito u kojem pomenuti AtmiPEP319a1 ima aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 76.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za proizvodnju transgenske biljke kao što je definisano gore, u kojoj navedena nukleinska kiselina uvedena u koraku a) sadrži nukleotidnu sekvencu odbranu od SEQ ID NO: 128 i SEQ ID NO: 180.
U jednoj realizaciji, aplikacija takođe opisuje postupak za proizvodnju transgene biljke kao što je gore definisano, u kojoj je pomenuta biljka krstašica, kao što je Arabidopsis thaliana, mahunasta biljka kao što je Glycine max (soja), Medicago truncatula i Medicago sativa (lucerka) ili biljka iz porodice Solanaceae kao što je Nicotiana benthamiana (duvan), Solanum tuberosum (krompir), Solanum licopersicum (paradajz) ili Solanum melongena (patlidžan).
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za proizvodnju transgenske biljke kao što je gore definisano, u kojoj je pomenuta transgenska biljka krstaš.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za proizvodnju transgenske biljke kao što je definisano gore, u kojoj je pomenuta transgenska biljka Arabidopsis thaliana.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za proizvodnju transgenske biljke kao što je definisano gore, koja sadrži:
a) korak uvođenja nukleinske kiseline koja sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 128, kodirajući AtmiPEP164a1 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 24, u biljku Arabidopsis thaliana, ili u najmanje jednu ćeliju pomenute biljke Arabidopsis thaliana, pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju AtmiPEP164a1,
spomenuti AtmiPEP164a1 je takođe prirodno prisutan u pomenutoj biljci Arabidopsis thaliana, pri čemu je miPEP prirodno prisutan peptid čija je sekvenca kodirana otvorenim okvirom čitanja lociranim na 5' primarnom transkriptu miR164a, pri čemu je AtmiPEP164a1 sposoban da modulira akumulaciju navedene miR164, gde miR164a kontroliše ekspresiju najmanje jednog gena uključenog u razvoj vegetativnih ili reproduktivnih delova Arabidopsis thaliana, i
b) korak kultivisanja biljke, ili najmanje jedne ćelije pomenute biljke, dobijene u koraku a) pod uslovima koji omogućavaju dobijanje transgene biljke Arabidopsis thaliana. U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za proizvodnju transgenske biljke kao što je definisano gore, koja sadrži:
a) korak uvođenja nukleinske kiseline koja sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 180, kodirajući AtmiPEP319a1 koji se sastoji od aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 76, u biljku Arabidopsis thaliana, ili u najmanje jednu ćeliju pomenute biljke Arabidopsis thaliana, pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju AtmiPEP319a1,
spomenuti AtmiPEP319a1 je takođe prirodno prisutan u pomenutoj biljci Arabidopsis thaliana, pri čemu je miPEP prirodno prisutan peptid čija je sekvenca kodirana otvorenim okvirom za čitanje smeštenim na 5' primarnom transkriptu miR319a, pri čemu je AtmiPEP319a1 sposoban da modulira akumulaciju navedenog miR319, gde miR319a reguliše ekspresiju najmanje jednog gena uključenog u razvoj vegetativnih ili reproduktivnih delova Arabidopsis thaliana, i
b) korak kultivisanja biljke, ili najmanje jedne ćelije pomenute biljke, dobijene u koraku a) pod uslovima koji omogućavaju dobijanje transgene biljke Arabidopsis thaliana. U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak proizvodnje koji je definisan gore, u kome je pomenuti miPEP uveden u biljku pomoću nukleinske kiseline koja kodira pomenuti miPEP, a navedena nukleinska kiselina se unosi u biljku.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za proizvodnju transgenske biljke kao što je gore definisano, u kojoj je veličina stabljike povećana u biljci u koju je uveden miPEP u odnosu na veličinu stabljike identične biljke, iste starosti u koju nije uveden miPEP, ili u odnosu na veličinu stabljike identične biljke iste starosti u koju navedeni miPEP nije uveden. U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za proizvodnju transgenske biljke kao što je definisano gore, u kojoj je broj listova povećan kod biljke u koju je uveden miPEP u odnosu na broj listova identične biljke istog starost u koju nije uveden miPEP, ili u odnosu na broj listova identične biljke istog uzrasta u koji nije uveden navedeni miPEP.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za proizvodnju transgene biljke kao što je gore definisano, u kojoj se veličina listova povećava kod biljke u koju je uveden miPEP u odnosu na veličinu listova identične biljke iste starosti u koju nije uveden miPEP, ili u odnosu na veličinu lišća identične biljke istog uzrasta u koju navedeni miPEP nije uveden.
4
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za proizvodnju transgenske biljke kao što je definisano gore, u kojoj je broj korena povećan kod biljke u koju je uveden miPEP u odnosu na broj korena identične biljke iste starost u koju nije uveden miPEP, ili u odnosu na broj korena identične biljke istog uzrasta u koju nije uveden navedeni miPEP.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za proizvodnju transgenske biljke kao što je definisano gore, u kojoj se dužina korena povećava kod biljke u koju je uveden miPEP u odnosu na dužinu korena identične biljke iste starosti u koju nije uveden miPEP, ili u odnosu na dužinu korena identične biljke istog uzrasta u koju spomenuti miPEP nije uveden.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za proizvodnju transgenske biljke kao što je definisano gore, u kojoj je brzina nodulacije povećana kod biljke u koju je uveden miPEP u odnosu na brzinu nodulacije identične biljke iste starost u koju nije uveden miPEP, ili u odnosu na brzinu nodulacije identične biljke istog uzrasta u koju nije uveden navedeni miPEP.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje postupak za proizvodnju transgenske biljke kao što je definisano gore, u kojoj je broj nodula povećan kod biljke u koju je uveden miPEP u odnosu na broj nodula identične biljke iste starosti u koju nije uveden miPEP, ili u odnosu na broj nodula identične biljke istog uzrasta u koju nije uveden navedeni miPEP.
U prikazu, prijava takođe opisuje transgensku biljku koja je dobijena u postupaku proizvodnje, kao što je gore definisano.
U drugom aspektu, aplikacija takođe opisuje transgensku biljku koja sadrži vektor koji kodira miPEP, pri čemu je miPEP takođe prirodno prisutan u navedenoj biljci, spomenuti miPEP je prirodno prisutan peptid čija je sekvenca kodirana otvorenim okvirom čitanja smeštenim u 5' delu na primarnom transkriptu miR, pri čemu je miPEP sposoban da modulira akumulaciju spomenutog miR u biljci, pri čemu miR reguliše ekspresija najmanje jednog gena,
ekspresija navedenog miPEP kodiranog vektorom koji je uveden u biljci rezultira modulacijom ekspresije navedenog gena u odnosu na identičnu biljku u kojoj nukleinska kiselina nije uvedena.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje transgensku biljku kao što je definisano gore, u kojoj je navedeni gen uključen u razvoj vegetativnih ili reproduktivnih delova biljke, posebno korena, stabljika, lišća ili cvetova, i ekspresija navedenog miPEP je kodirana nukleinskom kiselinom uvedenom u biljku što rezultira poboljšanim rastom transgenske biljke u odnosu na identičnu biljku u kojoj nukleinska kiselina nije uvedena.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje transgensku biljku kao što je definisano gore, u kojoj je pomenuti miPEP izabran iz grupe koju čine:
- SEQ ID NO: 1 do SEQ ID NO: 101,
- SEQ ID NO: 375 do SEQ ID NO: 386, ili
- SEQ ID NO: 424.
U drugom aspektu, aplikacija takođe opisuje transgensku biljku koja sadrži vektor, navedeni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu omogućava ekspresiju primarnog transkripta miR,
pomenuti primarni transkript miR koji sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira miPEP, navedeni miPEP je sposoban da modulira akumulaciju pomenutog miR u pomenutoj biljci, pri čemu miR reguliše ekspresiju najmanje jednog gena u navedenoj biljci,
ekspresija miPEP-a kodiranog vektorom koji je uveden u biljku rezultira modulacijom ekspresije navedenog gena u odnosu na identičnu biljku u kojoj nukleinska kiselina nije uvedena.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje transgensku biljku kao što je definisano gore u kojoj je navedena nukleinska kiselina endogenog porekla.
Ako je navedena nukleinska kiselina endogenog porekla, najmanje jedna kopija navedene nukleinske kiseline je već prirodno prisutna u biljci, nezavisno od vektora koji je uveden u biljku.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje transgensku biljku kao što je definisano gore u kojoj je navedena nukleinska kiselina egzogenog porekla.
Ako je navedena nukleinska kiselina egzogenog porekla, nijedna kopija navedene nukleinske kiseline nije već prirodno prisutna u biljci
U prikazu, aplikacija takođe opisuje transgensku biljku kao što je definisano gore u kojoj je navedeni gen uključen u razvoj vegetativnih ili reproduktivnih delova biljke, posebno korena, stabljika, listova ili cvetova, i ekspresija pomenutog miPEP-a. kodirana nukleinskom kiselinom uvedenom u biljku, rezultira poboljšanim rastom transgenske biljke u odnosu na identičnu biljku u kojoj navedena nukleinska kiselina nije uvedena.
U prikazu, aplikacija takođe opisuje transgensku biljku kao što je definisano gore u kojoj je pomenuti miPEP izabran iz grupe koju čine:
- SEQ ID NO: 1 do SEQ ID NO: 101,
- SEQ ID NO: 375 do SEQ ID NO: 386, ili
- SEQ ID NO: 424.
4
U drugom aspektu, izum se odnosi na kompoziciju koja sadrži, u kombinaciji, količinu semena biljke i količinu peptida čija sekvenca sadrži ili se sastoji od sekvence identične onoj kod miPEP prirodno prisutnog u pomenutoj biljci.
U prikazu, izum se odnosi na kompoziciju koja je definisana gore u kojoj je pomenuti miPEP izabran iz grupe koju čine:
- SEQ ID NO: 1 do SEQ ID NO: 101,
- SEQ ID NO: 375 do SEQ ID NO: 386, ili
- SEQ ID NO: 424.
U prikazu, izum se odnosi na kompoziciju koja sadrži, u kombinaciji, količinu semena biljke, konkretno A. thaliana, i količinu peptida čija sekvenca sadrži ili se sastoji od sekvence identične onoj za AtmiPEP164a1.
U prikazu, izum se odnosi na kompoziciju koja sadrži, u kombinaciji, količinu semena biljke, konkretno A. thaliana, i količinu peptida čija sekvenca sadrži ili se sastoji od sekvence identične onoj za AtmiPEP319a1.
U prikazu, izum se odnosi na kompoziciju koja sadrži, u kombinaciji, količinu semena biljke, konkretno M. truncatula, i količinu peptida čija sekvenca sadrži ili se sastoji od sekvence identične onoj za MtmiPEP171b.
U prikazu, izum se odnosi na kompoziciju koja je gore definisana, formulisana tako da formira obloženo seme.
Obloga se može izvesti postupcima koji se konvencionalno koriste u agro-prehrambenoj industriji i mogu se dobiti upotrebom materijala koji je u stanju da disagregira u rastvaraču ili u zemlji, kao što je vezivo ili glina.
Prema izumu, oblaganje se može koristiti na primer za davanje određenih svojstava kompoziciji miPEP-a, ili na kompoziciju semena u kombinaciji sa miPEP-om.
U prikazu, izum se odnosi na kompoziciju koja je gore definisana, formulisana tako da formira obloženo seme koje sadrži MtmiPEP171b.
U prikazu, izum se odnosi na kompoziciju koja je gore definisana, formulisana tako da formira obloženo seme koje sadrži AtmiPEP164a1.
U prikazu, izum se odnosi na kompoziciju kao što je definisano, prethodno formulisanu tako da formira obloženo seme koje sadrži AtmiPEP319a1.
U drugom aspektu, izum se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži najmanje:
- miPEP kao što je gore definisano
- nukleinske kiseline koja kodira pomenuti miPEP, ili
4
- vektor koji sadrži navedenu nukleinsku kiselinu.
i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent. U drugom aspektu, izum se odnosi na kompoziciju koja sadrži najmanje:
- miPEP kao što je gore definisano
- nukleinske kiseline koja kodira pomenuti miPEP, ili
- vektor koji sadrži navedenu nukleinsku kiselinu.
za upotrebu u vidu leka, naročito za ljude ili za životinje.
Upotreba kompozicija izuma je primenljiva u humanoj medicini i veterinarskoj medicini. U drugom aspektu, izum se odnosi na kompoziciju koja sadrži najmanje:
- miPEP kao što je gore definisano
- nukleinske kiseline koja kodira pomenuti miPEP, ili
- vektor koji sadrži navedenu nukleinsku kiselinu,
za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju bolesti koja uključuje deregulaciju ekspresije gena pacijenta,
ekspresija navedenog gena je regulisana pomoću mikroRNK čija se akumulacija modulira pomoću navedenog miPEP-a.
U prikazu, izum se odnosi na kompoziciju koja je gore definisana u kojoj je navedena bolest rak, dijabetes, gojaznost, infektivnih bolesti i neurodegenerativnih bolesti.
U prikazu, izum se odnosi na kompoziciju koja je gore definisana u kojoj je navedena bolest: rak, dijabetes, gojaznost, infektivne bolesti, neurodegenerativne bolesti, kardiovaskularne bolesti i autoimune bolesti.
U prikazu, izum se odnosi na kompoziciju koja je gore definisana u kojoj je navedena bolest: rak, dijabetes, gojaznost, infektivne bolesti, neurodegenerativne bolesti ili kardiovaskularne bolesti i autoimune bolesti.
U prikazu, izum se odnosi na kompoziciju koja je gore definisana u kojoj je navedena bolest izabrana od kardiovaskularnih bolesti i autoimunih bolesti.
U drugom aspektu, izum se odnosi na kompoziciju koja sadrži najmanje:
- miPEP kao što je gore definisano,
- nukleinske kiseline koja kodira pomenuti miPEP, ili
- vektor koji sadrži navedenu nukleinsku kiselinu,
za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju infekcije kod životinja ili čoveka sa parazitskim organizmom,
gde navedeni parazitni organizam ima gen čija je ekspresija regulisana mikroRNK čija se akumulacija modulira pomoću pomenutog miPEP-a.
4
U drugom aspektu, izum se odnosi na miPEP od 4 do 100 aminokiselina, ili 3 aminokiseline, kodirane nukleotidnom sekvencom sadržana u primarnom transkriptu mikroRNK, a navedeni miPEP je sposoban da modulira akumulaciju navedene mikroRNK u eukariotske ćelije, za upotrebu leka.
U drugom aspektu, aplikacija takođe opisuje antitelo koje specifično prepoznaje miPEP. Posebno, aplikacija takođe opisuje antitelo koje specifično prepoznaje AtmiPEP165a. Posebno, aplikacija takođe opisuje antitelo koje specifično prepoznaje MtmiPEP171b. Posebno, aplikacija takođe opisuje antitelo koje specifično prepoznaje AtmiPEP164a1. Posebno, aplikacija takođe opisuje antitelo koje specifično prepoznaje AtmiPEP319a1. Takvo antitelo se može dobiti postupkom koji je poznat ekspertu, kao što je, na primer, ubrizgavanjem pomenutog miPEP-a u životinju, nije ljudskog porekla, da bi se izazvala reakcija imunizacije i proizvodnja antitela od strane navedene životinje.
U drugom aspektu, aplikacija takođe opisuje postupak imunolokalizacije miPEP-a koji sadrži korak obeležavanja biološkog uzorka iz biljke sa antitelom koji specifično prepoznaje miPEP.
Posebno, aplikacija takođe opisuje postupak imunolokalizacije AtmiPEP165a upotrebom antitela koje specifično prepoznaje AtmiPEP165a.
Posebno, aplikacija takođe opisuje postupak imunolokalizacije MtmiPEP171b upotrebom antitela koje specifično prepoznaje MtmiPEP171b.
Posebno, aplikacija takođe opisuje postupak imunolokalizacije AtmiPEP164a1 korišćenjem antitela koje specifično prepoznaje AtmiPEP164a1.
Posebno, aplikacija takođe opisuje postupak imunolokalizacije MtmiPEP319a1 korišćenjem antitela koje specifično prepoznaje AtmiPEP319a1.
U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na antitelo koje specifično prepoznaje miPEP prema pronalasku, za njegovu upotrebu u vidu leka.
U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo koje specifično prepoznaje miPEP prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent. U drugom aspektu, aplikacija takođe opisuje protokol za proizvodnju rekombinantnog peptida, čija sekvenca sadrži ili se sastoji od sekvence identične onoj u miPEP kao što je definisano gore, koji sadrži korak transformisanja organizma sa ekspresionim vektorom koji kodira pomenuti rekombinantni peptid.
U prikazu, navedeni organizam je izabran iz grupe koja sadrži bakterije, kvasce, gljivice (osim kvasaca), životinjske ćelije, biljke i životinje.
U prikazu, navedeni organizam je Escherichia coli.
4
Konkretno, aplikacija takođe opisuje protokol za proizvodnju rekombinantnog peptida kao što je definisano gore, koji sadrži sledeće korake:
- vezivanje nukleinske kiseline koja kodira rekombinantni peptid za nukleinsku kiselinu koja kodira oznaku, kao što je GST,
- uvođenje ekspresionog vektora koji sadrži navedenu nukleinsku kiselinu koja kodira navedeni rekombinantni peptid u bakteriju E. coli,
- kultivisanje bakterije E. coli koja sadrži ekspresioni vektor u LB sredini poželjno do OD između 0.2 i 0.4,
- indukovanje proizvodnje rekombinantnog peptida sa IPTG, poželjno 4 do 5 sati, - centrifugiranje i liziranje bakterije E. coli,
- filtriranje supernatanta,
- prečišćavanje navedenog rekombinantnog peptida na afinitetnoj koloni glutationskog sefaroze,
- ako je potrebno, odvajanje GST sa proteazom.
Sve sekvence miPEP-ova, miORF-ova, miRNK i primarnih transkripata miRNK-ova su prikazane u Tabelama 1, 2, 3, 4, 5 i 6.
Tabela 7 prikazuje analizu polimorfizma sekvenci DNK različitih regiona pri-miR171b (haplotip je definisan kada se razlikuje za najmanje jednu aminokiselinu od drugih haplotipova).
4
i)
P-ov
iPE
a(mv
P-oE
iP m
lnih
cij<a>
otenap
Lis<t>1.
ela ab T
va -oRF
iO m
Lis<t>a 2.
ela ab T
i)
-ov
K
N
iR mri-(p taripnsktraih rn am pri
<t>apLis
3.
ela ab T
a)v -o
K
N
iR
a(m -ov
K
N
roRik m<t>a Lis
4.
a elab T
K
N
iR m a
trolon k<t>a Lis
6.
ela ab Tb
71
<m>iR1ri-ipstla it<e>ob
zli<č>ra za niza
K
N
D
m i<z>arf olim Po
7.
ela ab TSledeće slike i primeri ilustrovaće izum bolje, ali bez ograničavanja njegovog opsega.
LEGENDE ZA SLIKE
SLIKA 1. Uticaj prekomerne ekspresije MtmiR171b (miR171b identifikovan kod Medicago truncatula) na ekspresiju HAM1 i HAM2 gena (A) ili na broj lateralnih korena (B) kod M. truncatula.
(A) Y-osa označava relativnu ekspresiju MtmiR171b (leve kolone), HAM1 (srednje kolone) ili HAM2 (desne kolone) u kontrolnoj biljci (bele kolone) ili u biljci u kojoj je MtmiR171b prekomerno eksprimiran (crne kolone). Linija grešaka odgovara standardnoj grešci srednje vrednosti (broj pojedinaca = 10). Prekomerna ekspresija MtmiR171b indukuje smanjenje ekspresije HAM1 i HAM2 gena.
(B) Y-osa označava srednji broj bočnih korena posmatranih u kontrolnoj biljci (bela kolona) ili u biljci u kojoj je MtmiR171b prekomerno eksprimiran (crna kolona). Linija grešaka odgovara standardnoj grešci srednje vrednosti (broj pojedinaca = 100). Preterana ekspresija MtmiR171b dovodi do smanjenja broja lateralnih korena.
SLIKA 2. Efekti prekomerne ekspresije MtmiPEP171b1 na ekspresiju MtmiR171b i za HAM1 i HAM2 gena (A) ili na broj lateralnih korena (B) kod M. truncatula.
(A) y-osa označava relativnu ekspresiju MtmiPEP171b1 (grafik na levoj strani), miR171b (grafik na desnoj strani, leva kolona), za HAM1 (pristupni broj MtGI9-TC114268) (grafik na desnoj strani, srednja kolona) ili za HAM2 (pristupni br. MtGI9-TC120850) (grafik na desnoj strani, desna kolona) u kontrolnoj biljci (bele kolone) ili u postrojenju u kojem je MtmiPEP171b1 preterano izložen (crne kolone). Linija grešaka odgovara standardnoj grešci srednje vrednosti (broj pojedinaca = 10). Preterana ekspresija MtmiPEP171b1 dovodi do povećanja akumulacije MtmiR171b, kao i smanjenja ekspresije HAM1 i HAM2 gena.
(B) Y-osa označava srednji broj bočnih korena posmatranih u kontrolnoj biljci (bela kolona) ili u biljci u kojoj je MtmiPEP171b1 prekomerno eksprimiran (crna kolona). Linija grešaka odgovara standardnoj grešci srednje vrednosti (broj pojedinaca = 100). Preterana ekspresija MtmiPEP171b1 dovodi do smanjenja broja lateralnih korena.
1
SLIKA 3. Efekti MtmiPEP171b1 na ekspresiju MtmiR171b i HAM1 i HAM2 gena (A) i na broj lateralnih korena (B) kod M. truncatula.
(A) Y-osa označava relativnu ekspresiju MtmiR171b (leve kolone), HAM1 (srednje kolone) ili HAM2 (desne kolone) u kontrolnoj biljci (bele kolone) ili u biljci tretiranoj zalivanjem jednom dnevno tokom 5 dana sa MtmiPEP171b1 na 0,01 µM (svetlo sive kolone), 0,1 µM (tamno sive kolone) ili 1µM (crne kolone). Linija grešaka odgovara standardnoj grešci srednje vrednosti (broj pojedinaca = 10). Primena MtmiPEP171b1 u različitim koncentracijama indukuje povećanje akumulacije MtmiR171b, kao i smanjenje ekspresije HAM1 i HAM2 gena.
(B) Y-osa označava srednji broj bočnih korena posmatranih u kontrolnoj biljci (bela kolona) ili u biljci tretiranoj zalivanjem sa MtmiPEP171b1 u 0,1 µM jednom dnevno tokom 5 dana (crna kolona). Linija grešaka odgovara standardnoj grešci srednje vrednosti (broj pojedinaca = 100). Primena MtmiPEP171b1 na 0,1 µM dovodi do smanjenja broja lateralnih korena. (C) i-osa označava relativnu ekspresiju MtmiR171b (leve kolone), HAM1 (srednje kolone) ili HAM2 (desne kolone) u kontrolnoj biljci (bele kolone) ili u biljci tretiranoj zalivanjem jednom dnevno tokom 5 dana sa MtmiPEP171b1 na 0,01 µM (sive kolone), 0,1 µM (tamno sive kolone) ili 1µM (crne kolone) ili sa 0.01 µM skrembl peptida (LIVSHLISEKFDCMRKILRI, SEQ ID NO: 428) (svetlo sive kolone) čiji je aminokiselinski sastav identičan miPEP171b, ali je sekvenca različita. Linija grešaka odgovara standardnoj grešci srednje vrednosti (broj pojedinaca = 10).
SLIKA 4. Efekti MtmiPEP171b1 na ekspresiju pre-MtmiR171b (A) i MtmiR171b (B) u M. truncatula.
Y-osa označava relativnu ekspresiju prekursora različitih oblika mikroRNK u kontrolnim biljkama (leva kolona) ili u biljkama koje se tretiraju zalivanjem jednom dnevno tokom 5 dana sa MtmiPEP171b1 pri 0,01 µM, 0,1 µM ili 1 µM (desna kolona). Linija grešaka odgovara standardnoj grešci srednje vrednosti (broj pojedinaca = 200). Primena MtmiPEP171b1 u različitim koncentracijama dovodi do povećanja akumulacije pre-MtmiR171b (A) i MtmiR171b (B).
SLIKA 5. Efekti prekomerne ekspresije MtmiPEP171b1 (A) i efekata MtmiPEP171b1 (B) na ekspresiju različitih prekursora mikroRNK u M. truncatula.
Y-osa označava odnos ekspresije prekursora mikroRNK u biljkama koje prekomerno eksprimiraju MtmiPEP171b1 na ekspresiju tih istih prekursora u kontrolnim korenima (A),
1 4
ili odnos ekspresije prekursora mikroRNK u biljkama tretiranim sa MtmiPEP171b1 (0,1 µM) do ekspresije tih istih prekursora u kontrolnim korenima (B). Različiti prekursori testiranih mikroRNK označeni su s leva na desno na k-osi, naime pre-MtmiR171b (SEQ ID NO: 246), pre-MtmiR169 (SEQ ID NO: 359), pre-MtmiR169a (SEQ ID NO: 360), pre-MtmiR171a (SEQ ID NO: 361), pre-MtmiR171h (SEQ ID NO: 362), pre-MtmiR393a (SEQ ID NO: 363), pre-MtmiR393b (SEQ ID NO: 364), pre-MtmiR396a (SEQ ID NO: 365) and pre-MtmiR396b (SEQ ID NO: 366). Linija grešaka odgovara standardnoj grešci srednje vrednosti (broj pojedinaca = 10). Primećeno je da MtmiPEP171b1 samo dovodi do efekta akumulacije MtmiR171b i ne i za ostale miRNK-ove.
SLIKA 6. Efekti translacije MtmiPEP171b1 na ekspresiju MtmiR171b prikazani su u modelnoj biljci Nicotiana benthamiana. Y-osa označava relativnu ekspresiju MtmiR171b u biljkama duvana transformisanim da bi se eksprimirala pri-MtmiR171b (bela kolona) ili mutirana pri-MtmiR171b u kojoj je kodon ATG zamenjen sa ATT (crna kolona). Mutirana pri-MtmiR171b je stoga nesposobna za proizvodnju MtmiPEP171b1. Linija grešaka odgovara standardnoj grešci srednje vrednosti (broj pojedinaca = 30). Primećeno je da odsustvo translacije MtmiPEP171b1 dovodi do značajnog smanjenja akumulacije miR171b.
SLIKA 7. Efekti prekomerne ekspresije MtmiPEP171b1 na ekspresiju pre-MtmiR171b prikazani su u modelnoj biljci Nicotiana benthamiana.
Y-osa označava relativnu ekspresiju pre-MtmiR171b u biljkama duvana koje su transformisane da bi eksprimirale MtmiR171b (leva kolona), MtmiR171b i MtmiPEP171b1 (srednja kolona), ili MtmiR171b i mutiranu verziju MtmiORF171b u kojoj je početni kodon ATG zamenjen sa ATT (desna kolona). Linija grešaka odgovara standardnoj grešci srednje vrednosti (broj pojedinaca = 30). Primećeno je da ekspresija MtmiPEP171b1 povećava ekspresiju MtmiR171b, i ovaj efekat zavisi od translacije MtmiORF171b u MtmiPEP171b1.
SLIKA 8. Efekti MtmiPEP171b1 na ekspresiju pre-MtmiR171b prikazani su u modelnoj biljci Nicotiana benthamiana.
Y-osa označava relativnu ekspresiju MtmiR171b u biljkama duvana transformisanim kako bi se eksprimirao MtmiR171b na koji je MtmiPEP171b1 prskan (0,1 µM) dva puta, 12 sati i zatim 30 min pre uzorkovanja (desna kolona) ili ne (leva kolona). Linija grešaka odgovara standardnoj grešci srednje vrednosti (broj pojedinaca = 6). Peptid MtmiPEP171b1, primenjen raspršivanjem, indukuje povećanje akumulacije MtmiR171b.
1
SLIKA 9. Efekti MtmiPEP171b1 na ekspresiju pri-miR171b (A), pre-MtmiR171b (B) i MtmiR171b (C) prikazani su u modelnoj biljci Nicotiana benthamiana.
Y-osa označava relativnu ekspresiju prekursora različitih oblika mikroRNK u biljkama duvana modifikovanim da bi se eksprimirao MtmiR171b (leva kolona) ili modifikovanim da bi se eksprimirali MtmiR171b i prekomerno eksprimiranje MtmiPEP171b1 (desna kolona, slika 9A) ili tretirano sa 0,1 µM miPEP171b1 (Slika 9B i C). Linija grešaka odgovara standardnoj grešci srednje vrednosti (broj pojedinaca = 30). Prekomerna ekspresija MtmiPEP171b1 ili primena miPEP171b1 povećava akumulaciju pri-MtmiR171b (A), pre-MtmiR171b (B) i MtmiR171b (C).
SLIKA 10. Lokalizacija MtmiPEP171b1 u ćelijama lista duvana koje su modifikovane da bi se eksprimirao MtmiPEP171b1.
Fotografije prikazuju ćelije listova duvana modifikovane da bi eksprimirale sam protein GFP (levi panel) ili protein GFP fuzionisan sa MtmiPEP171b1 (desni panel). Ova zapažanja ukazuju da je MtmiPEP171b1 lokalizovan u malim nuklearnim telima.
SLIKA 11. Efekti ekspresije AtmiPEP165a (identifikovani u Arabidopsis thaliana) na ekspresiju AtmiR165a (A), i na ekspresiju AtmiPEP319a2 (identifikovani u Arabidopsis thaliana) na AtmiR319a (B), prikazani u modelnoj biljci duvana.
(A) Y-osa označava relativnu ekspresiju AtmiR165a u biljkama duvana modifikovanim da bi se eksprimirao AtmiR165a (leva kolona) ili da se eksprimiraju AtmiR165a i AtmiPEP165a (desna kolona).
(B) Y-osa označava relativnu ekspresiju AtmiR319a u biljkama duvana modifikovanim da bi se eksprimirao AtmiR319a (leva kolona) ili da bi se eksprimirali AtmiR319a i AtmiPEP319a (desna kolona).
Linija grešaka odgovara standardnoj grešci srednje vrednosti (broj pojedinaca = 30).
U oba slučaja, primećeno je da ekspresija miORF, a time i proizvodnja miPEP, dovodi do povećanja akumulacije pre-miRNK.
SLIKA 12. Efekti tretmana sa AtmiPEP165a na rast korena u Arabidopsis thaliana.
Na fotografiji su prikazane dve biljke iste starosti: kontrolna biljka (biljka sa leve strane) i biljka tretirana AtmiPEP165a (biljka sa desne strane). Tretman sa AtmiPEP165a dovodi do
1
fenotipa sa značajno ubrzanim rastom korena u Arabidopsis thaliana. Grafikon prikazuje ekspresiju pre-miR165 kao odgovor na tretman sa povećanim dozama AtmiPEP165a.
SLIKA 13. Očuvanje niza miPEP8 identifikovanog u Drosophila.
Nizovi miPEP8 (SEQ ID NO: 104) su izvedeni iz nizova miORF8 (SEQ ID NO: 208) od 12 različitih vrsta Drosophila i poravnati. Histogram pokazuje konzervaciju svake aminokiseline između nizova miORF8 u 12 analiziranih vrsta.
SLIKA 14. Evolucija mase (kDa) i izoelektrične tačke (pI) miPEP8 u vrstama Drosophila.
Y-osa na levoj strani pokazuje veličinu miPEP8 (u kD). Y-osa na desnoj strani označava izoelektričnu tačku miPEP-a. Ks-osa označava poreklo miPEP-a, tj. vrste Drosophila. Primećeno je da uprkos značajnoj promeni u njihovoj veličini (za više od faktora 3), naboj miPEP-a i dalje ostaje veoma bazičan (> 9,8) u 12 ispitivanih vrsta.
SLIKA 15. Efekat dodavanja niza na funkciju miPEP-a.
Listovi duvana su transformisani da bi se povećala ekspresija miPEP171b. Ovi grafikoni pokazuju da dodavanje nizova (oznaka His, HA ili GFP) ne menja funkciju miPEP-a. Y-osa označava relativnu ekspresiju pre-MtmiR171b u biljkama duvana koje su transformisane da bi eksprimirale MtmiR171b (leva kolona), MtmiR171b i MtmiPEP171b1 sa ili bez dodavanja proteinskih oznaka (desne kolone). Linija grešaka odgovara standardnoj grešci srednje vrednosti (broj pojedinaca = 6). Primećeno je da ekspresija MtmiPEP171b1 povećava ekspresiju MtmiR171b, i ovaj efekat je nezavisan od prisustva oznaka.
SLIKA 16. Ekspresija MtmiPEP171b1 u korenovom sistemu Medicago truncatula. Koreni Medicago truncatula su transformisani da bi eksprimirali fuzije između GUS proteina (u plavom) i promotora miR17b (A, E), ATG miPEP171b1 (B, F), celog miPEP171b1 (C, G) ili ATG2 (drugi ATG koji se nalazi na prekursoru, posle miPEP) (D, H). Jasno je da postoji ekspresija miRNK u vrhovima korena (A) kao i bočnim korenima (E). Transkripcione (B, F) i translacione (C, G) fuzije pokazuju ekspresiju miPEP171b u istim tkivima, dok sledeći ATG nije aktivan (D, H).
SLIKA 17. Ekspresija DmmiPEP8 u ćelijama Drosophila melanogaster
1
Ćelije Drosphile melanogaster su transfektovane da bi se prekomerno eksprimirale DmmiPEP8 (OE miPEP8) ili miPEP8 od kojih su mutirani početni kodoni translacije (OE miPEP8 mut). Y-osa označava relativnu ekspresiju Pre-miR8. Linija greške odgovara standardnoj grešci srednje vrednosti (broj nezavisnih eksperimenata = 6). Primećeno je da ekspresija DmmiPEP8 povećava ekspresiju DmmiR8, i ovaj efekat je povezan sa translacijom mRNK.
SLIKA 18. Uticaj DmmiPEP8 na akumulaciju DmmiR8 u ćelijama D. melanogaster Ćelije Drosphile melanogaster su transfektovane za prekomernu ekspresije divlji tip DmmiR8 (OE miR8) ili DmmiR8, čiji početni kodoni za translaciju su mutirani (OE miR8 miPEP8 mut). Y-osa označava relativnu ekspresiju Pre-miR8. Linija greške odgovara standardnoj grešci srednje vrednosti (broj nezavisnih eksperimenata = 2). Primećeno je da prisustvo DmmiPEP8 povećava ekspresiju DmmiR8.
SLIKA 19. Uticaj HsmiPEP155 na akumulaciju HsmiR155 u ćelijama Homo sapiensa HeLa ćelije Homo sapiensa su transfektovane kako bi se prekomerno eksprimirala HsmiPEP155 (OE miPEP155). Y-osa označava relativnu ekspresiju Pre-miR155. Linija greške odgovara standardnoj grešci srednje vrednosti (broj nezavisnih eksperimenata = 2). Primećeno je da ekspresija HsmiPEP155 povećava ekspresiju HsmiR155.
SLIKA 20. Efekti translacije MtmiPEP171b1 na ekspresiju MtmiR171b prikazani su u modelnoj biljci Nicotiana benthamiana.
Y-osa označava relativnu ekspresiju MtmiR171b u biljkama duvana transformisanim da bi se eksprimirala pri-miR171b (leva kolona), pri-miR171b u kojoj je miORF171b izbrisan (srednja kolona) ili mutirani pri-miR171b u koji je kodon ATG zamenjen sa ATT (desna kolona). Mutirana pri-miR171b je stoga nesposobna za proizvodnju miPEP171b1. Linija grešaka odgovara standardnoj grešci srednje vrednosti (broj pojedinaca = 30). Primećeno je da odsustvo translacije miPEP171b1 dovodi do značajnog smanjenja akumulacije miR171b.
SLIKA 21. Efekti prekomerne ekspresije MtmiPEP171b1 na ekspresiju MtmiR171b prikazani su u modelnoj biljci Nicotiana benthamiana.
Y-osa označava relativnu ekspresiju MtmiR171b u biljkama duvana koje su transformisane sa vektorom koji dozvoljava ekspresiju miPEP171b i bilo drugi prazni vektor (bela kolona),
1
ili vektor koji dozvoljava ekspresiju mtmiPEP171b (leva crna kolona), ili vektor u kome je kodon ATG ORF koji kodira mtmiPEP171b zamenjen sa ATT (srednja crna kolona), ili vektor u kome je nukleotidni niz ORF mutiran bez modifikovanja aminokiselinskog niza prevedenog peptida (miPEP) kodiran degenerisanim ORF-om (desna crna kolona). Linija grešaka odgovara standardnoj grešci srednje vrednosti (broj pojedinaca = 30). Primećeno je da ekspresija MtmiPEP171b1 povećava ekspresiju MtmiR171b, i ovaj efekat zavisi od translacije MtmiORF171b u MtmiPEP171b1.
SLIKA 22. Uticaji AtmiPEP165a na akumulaciju AtmiR165a i ciljanih gena (PHAVOLUTA: PHV, PHABOLUSA: PHB i REVOLUTA: REV).
Y-osa označava relativna ekspresiju AtmiR165a, PHV, PHB i REV u korenima Arabidopsis thaliana tretiranim vodom (kontrola) ili različitim koncentracijama AtmiPEP165a (0,01 µM, 0,1 µM, 1 µM ili 10 µM). Linija grešaka odgovara standardnoj grešci srednje vrednosti (broj pojedinaca = 10).
Tretman biljaka sa višim i višim koncentracijama AtmiPEP165a pokazuje doza zavisni efekat akumulacije AtmiR165a i negativne regulacije njegovih ciljnih gena kao funkciju količine AtmiPEP165a.
SLIKA 23. Efekti tretmana sa AtmiPEP164a na ekspresiju AtmiR164a u A. thaliana.
Na fotografijama su prikazani rezultati Northern blot analize akumulacije AtmiR164a u korenima tretiranim vodom (kontrola, fotografija levo) ili sa 0,1 µM sintetskog peptida, koji ima niz identičan AtmiPEP164a, rastvoren u vodi (0,1 µM miPEP164a). RNK U6 se koristi kao kontrola punjenja, što omogućava kvantifikaciju količine AtmiR164a.
Ovaj eksperiment je ponovljen 4 puta nezavisno i doveo je do sličnih rezultata.
Tretman izdanaka A. thaliana sa 0,1 µM miPEP164a dovodi do povećanja akumulacije miR164a.
SLIKA 24. Efekti tretmana sa AtmiPEP164a na rast Arabidopsis thaliana.
Na fotografijama su prikazane dve biljke (prikaz odozgo i sa strane) nakon 3 nedelje rasta: kontrolna biljka zalivana vodom (A), i biljka zalepljena sa kompozicijom od 0,1 µM sintetičkog peptida koji odgovara AtmiPEP164a (B). Zalivanje biljke Arabidopsis thaliana sa AtmiPEP164a značajno povećava rast biljaka.
SLIKA 25. Efekti tretmana sa AtmiPEP165a na ekspresiju AtmiR165a u A. thaliana.
1
Fotografije pokazuju rezultate Northern blot analize akumulacije AtmiR165a u korenima tretiranim vodom (kontrola, fotografija na levoj strani) ili sa 0,1 µM sintetičkog peptida, koji ima niz identičan onom kod AtmiPEP165a, rastvoren u vodi (0,1 µM miPEP165a). RNK U6 se koristi kao kontrola punjenja što omogućava kvantifikaciju količine AtmiR165a.
Ovaj eksperiment je ponovljen 4 puta nezavisno i doveo je do sličnih rezultata.
Tretman A. thaliana izdanaka sa 0.1 µM miPEP165a dovodi do povećanja akumulacije miR165a.
SLIKA 26. Efekti prekomerne ekspresije AtmiPEP319a1 na ekspresiju AtmiR319a u A. thaliana.
Y-osa označava relativnu ekspresiju AtmiR319a u kontrolnoj biljci (leva kolona) ili u biljci u kojoj je AtmiPEP319a1 prekomerno eksprimiran (desna kolona). Linija grešaka odgovara standardnoj grešci srednje vrednosti (broj pojedinaca = 10). Prekomerna ekspresija AtmiPEP319a1 indukuje povećanje akumulacije AtmiR319a.
SLIKA 27. Efekti tretmana sa AtmiPEP319a na rast Arabidopsis thaliana.
Na fotografijama su prikazane dve biljake (prikaz odozgo i sa strane) nakon 3 nedelje rasta: kontrolna biljka zalivana vodom (A), i biljka zalivana sa kompozicijom od 0,1 µM sintetičkog peptida koji odgovara AtmiPEP319a1 (B). Zalivanje biljaka Arabidopsis thaliana sa AtmiPEP319a1 značajno povećava rast biljaka.
SLIKA 28. Imunolokalizacija.
Korenje Medicago truncatula je transformisano da bi došlo do eksprimiranj fuzije između GUS proteina (plavo) i ATG iz miPEP171b (PromiR171b-ATG1:GUS) ili ATG2 (drugi ATG koji se nalazi na prekursoru, nakon miPEP) (PromiR171b-ATG2:GUS). Označavanje je obavljeno uz anti-miPEP171b antitelo (miPEP171b). Imunolokalizacija miPEP171b u korenju M. truncatula otkriva prisustvo miPEP171b bočnim korenim inicijalnim lokacijama, i prikazuje ko-lokalizaciju između mikroRNK i odgovarajućeg miPEP.
SLIKA 29. Efekti prekomerne ekspresije AtmiPEP160b1 na ekspresiju AtmiR160b u A. thaliana.
Y-osa označava relativnu ekspresiju AtmiR160b u kontrolnoj biljci (leva kolona) ili u biljci u kojoj je AtmiPEP160b1 prekomerno eksprimiran (desna kolona). Linija grešaka odgovara standardnoj grešci srednje vrednosti (broj pojedinaca = 10).
11
Prekomerna ekspresija AtmiPEP160b1 indukuje povećanje relativne ekspresije AtmiR160b.
SLIKA 30. Efekti AtmiPEP164a1 na ekspresiju AtmiR164a.
Y-osa označava relativnu ekspresiju AtmiR164a u kontrolnoj biljci (leva kolona) ili u biljci koja je jednom dnevno zalivana sa AtmiPEP164a1 pri 0,1 µM (desna kolona). Linija grešaka odgovara standardnoj grešci srednje vrednosti (broj pojedinaca = 10).
Dodatak AtmiPEP164a1 pokreće povećanja relativne ekspresije AtmiR164a.
SLIKA 31. Efekti prekomerne ekspresije AtmiPEP319a1 na ekspresiju AtmiR319a u A. thaliana.
Y-osa označava relativnu ekspresiju AtmiR319a u kontrolnoj biljci (leva kolona) ili u biljci u kojoj je AtmiPEP319a1 prekomerno eksprimiran (desna kolona). Linija grešaka odgovara standardnoj grešci srednje vrednosti (broj pojedinaca = 10).
Prekomerna ekspresija AtmiPEP319a1 pokreće povećanje relativne ekspresije AtmiR319a.
SLIKA 32. Efekti MtmiPEP169d na ekspresiju MtmiR169d u M. truncatula.
Y-osa označava relativnu ekspresiju MtmiR169d u kontrolnoj biljci (levoj kolona) ili u biljci koja je zalivana jednom dnevno sa MtmiPEP169d na 0,1 µM (desna kolona).
Linija grešaka odgovara standardnoj grešci srednje vrednosti (broj pojedinaca = 10).
Dodatak MtmiPEP169d pokreće povećanje relativne ekspresije MtmiR169d.
SLIKA 33. Efekti prekomerne ekspresije MtmiPEP171e na ekspresiju MtmiR171e u M. truncatula.
Y-osa označava relativnu ekspresiju MtmiR171e u kontrolnoj biljci (leva kolona) ili u biljci u kojoj je MtmiPEP171e prekomerno eksprimiran (desna kolona). Linija grešaka odgovara standardnoj grešci srednje vrednosti (broj pojedinaca = 10).
Prekomerna ekspresija MtmiPEP171e indukuje povećanje relativne ekspresije MtmiR171e.
SLIKA 34. Lokalizacija MtmiPEP171b1 u biljci divljeg tipa M. truncatula.
Različite količine sintetskih peptida MtmiPEP171b1 (1, 0,5 ili 0,1 nmol) i ukupnog ekstrakta korena iz M. truncatula su analizirane imunoblotingom sa antitelom specifičnim za MtmiPEP171b1.
MtmiPEP171b1 se prirodno proizvodi u korenu M. truncatula.
SLIKA 35. Prisustvo AtmiPEP165a u biljci divljeg tipa A. thaliana.
Gornja slika odgovara Vestern blot analizi količine AtmiPEP165a u biljci divljeg tipa A. thaliana Col-0 (leva strana) i posejane biljke A. thaliana sa prekomernom ekspresijom AtmiPEP165a (desna strana). odgovara Vestern blot analizi količine kontrolnog proteina (tubulina) u biljci divljeg tipa A. thaliana Col-0 (leva strana) i posejanoj biljci A. thaliana sa prekomernom ekspresijom AtmiPEP165a (desna strana). AtmiPEP165a je prirodno proizveden u A. thaliana i prisutan je u većim količinama u biljkama koje prekomerno eksprimiraju AtmiPEP165a.
SLIKA 36. Akcija AtmiPEP165a u A. thaliana.
(A) Y-osa označava relativnu ekspresiju pri-miR165a u kontrolnim korenima (kolona sa leve strane) ili uz zalivanje jednom dnevno sa AtmiPEP165a na 10 µM (desna kolona). Linija grešaka odgovara standardnoj grešci srednje vrednosti (broj pojedinaca = 10).
Dodatak AtmiPEP165a indukuje povećanje relativne ekspresije AtmiR165a.
(B) Y-osa označava relativnu ekspresiju pri-miR165a, u prisustvu kordicepina (inhitor RNK sinteze), u kontrolnim korenima (siva kriva) ili uz zalivanje jednom na dan sa AtmiPEP165a na 10 µM (crna kriva). X-osa označava trajanje tretmana sa kordicepinom.
Dodatak AtmiPEP165a ne stvara bolju stabilnost za pri-miR165a.
(C) Y-osa označava relativnu ekspresiju pri-miR165a, u biljkama divljeg tipa (Col-0) ili u biljkama mutiranim sa niskim alelom druge velike podjedinice RNK polimeraze II (nrpb2-3). X-osa označava da li su biljke zalivane vodom ili sa AtmiPEP165a u 10 na 10 µM. Mutirane biljke, za razliku od biljaka divljeg tipa, nisu sposobne da akumuliraju AtmiR165a kao odgovor na AtmiPEP165a.
SLIKA 37. Efekti pri-miR171b na broj lateralnih korena u M. truncatula.
Y-osa označava srednji broj bočnih korena posmatranih u kontrolnoj biljci (bela kolona) ili u biljci u kojoj je pri-miR171b prekomerno eksprimiran (crna kolona). Linija grešaka odgovara standardnoj grešci srednje vrednosti (broj pojedinaca = 100).
Prekomerna ekspresija pri-miR171b indukuje smanjenje broja lateralnih korena.
SLIKA 38. Translatabilnost DmmiPEP8 u Drosophila melanogaster ćelijama Neke Drosophila melanogaster ćelije su transfektovane da prekomerno eksprimiraju DmmiPEP8 (miPEP8::GFP) ili DmmiPEPmt (od kojih su startni kodoni mutirani (miPEP8 mt::GFP). Kao kontrola transfekcije, plazmid koji proizvodi moesin-RFP protein (donja slika) je ko-transfektovan sa plazmidima koji kodiraju DmmiPEP8 (slika sa leve strane) i DmmiPEP8 mt (slika sa desne strane). Primećeno je da su startni kodoni niza DmmiPEP8 funkcionalni jer dozvoljavaju sintezu GFP-a (gornja leva slika), dok konstrukcije sa mutiranim ATG-om ne proizvode gotovo nikakav GFP (gornja desna slika).
Prema tome, ovi rezultati sugerišu da je ORF miPEP-a funkcionalan.
PRIMERI
A: Analiza miPEPS u biljkama
PRIMER 1 - Karakterizacija u modelnoj biljci Medicago truncatula
a) Identifikacija i karakterizacija MtmiPEP171b1 (miPEP171b1 identifikovan u Medicago truncatula)
MikroRNK MtmiR171b je eksprimiran u meristematičnom regionu korena. Prekomerna ekspresija ove mikroRNK posebno dovodi do smanjenja ekspresije gena HAM1 (br. pristupa MtGI9-TC114268) i HAM2 (br. pristupa MtGI9-TC120850) (slika 1A), kao i do smanjenja broja bočnih korena (slika 1B). Prekomerna ekspresija pri-miR171b takođe indukuje smanjenje broja lateralnih korena (Slika 37).
Niz primarnog transkripta MtmiR171b je određen korišćenjem RACE-PCR tehnike. Analiza niza primarnog transkripta omogućila je da se identifikuje prisustvo nekoliko potpuno neočekivanih malih otvorenih okvira čitanja (sORF). Ovi sORF-ovi su nazvani miORFs za "mikroRNK ORFs". Ovi miORF potencijalno kodiraju kratke peptide, od oko 4 do 100 aminokiselina. U bazama podataka nije pronađena značajna homologija koja se odnosi na ove miORFS.
Pretjerana ekspresija prvog miORF, nazvanog MtmiORF171b, dovodi do povećanja akumulacije MtmiR171b i smanjenja ekspresije HAM1 i HAM2 gena (pogledajte sliku 2A), kao i do smanjenja broja lateralnih korena (slika 2B), kao što je već uočeno kod prekomerne ekspresije MtmiR171b.
Da bi se odredilo da li MtmiORF171b dovodi do stvarne proizvodnje peptida i da li je regulisana funkcija koja je gore uočena zaista prihvaćena od navedenog peptida, sintetički peptid, niz identičan onom koji potencijalno kodira MtmiORF171b, je primenjen na korene Medicago truncatula. Primena ovog peptida dovodi do fenotipa koji je već uočen u preteranoj ekspresiji MtmiORF171b, tj. dovodi do povećanja akumulacije MtmiR171b i
11
smanjenja ekspresije HAM1 i HAM2 gena (pogledajte sliku 3A), kao i smanjenje broja bočnih korena (slika 3B).
Rezultati ovih eksperimenata pokazuju da MtmiORF171b kodira peptid sposoban da modulira akumulaciju MtmiR171b, i ekspresiju ciljnih gena MtmiR171b: HAM1 i HAM2. Pomenuti peptid je nazvan MtmiPEP171b1 ("miPEP" odgovara mikroRNK kodiranom PEPtide).
Štaviše, MtPEP171b1 dovodi do povećanja akumulacije MtmiR171b (Slika 4A) i pre-MtmiR171b (Slika 4B).
b) Specifičnost miPEP171b1
Ekspresija različitih mikroRNK prekursora Medicago truncatula (MtmiR171b SEQ ID NO: 319, MtmiR169 SEQ ID NO: 367, MtmiR169a SEQ ID NO: 368, MtmiR171a SEQ ID NO: 369, MtmiR171h SEQ ID NO: 370, MtmiR393a SEQ ID NO: 371, MtmiR393b SEQ ID NO: 372, MtmiR396a SEQ ID NO: 373 and MtmiR396b SEQ ID NO: 374) je određen i upoređen između kontrolnih biljaka i biljaka u kojima je MtmiORF171b koji kodira MtmiPEP171b1 bio prekomerno eksprimiran (slika 5A), ili između kontrolnih biljaka i biljaka uzgajanih u medijumu kulture koji sadrži MtmiPEP171b1 (Slika 5B).
Dobijeni rezultati ukazuju da MtmiPEP171b1 dovodi samo do povećanja akumulacije MtmiR171b, a ne drugih miRNK, što ukazuje da miPEP ima efekat samo na mikroRNK iz koje je izveden.
c) Lokalizacija miPEP171b1
Štaviše, imunolokalizacija miPEP171b1 u korenu M. truncatula otkriva prisustvo miPEP171b1 u lokacijama inicijalne inicijacije korena, pokazujući ko-lokalizaciju između mikroRNK i odgovarajućeg miPEP-a (Slike 28 i 34).
PRIMER 1B - MtmiPEP169d
Što se tiče MtmiPEP169d, pokazano je in vivo kod M. truncatula da prekomerna ekspresija ovog miPEP-a indukuje akumulaciju MtmiR169d (Slika 32).
PRIMER 1C - MtmiPEP171e
Što se tiče MtmiPEP171e, pokazano je in vivo kod M. truncatula da preterana ekspresija ovog miPEP-a indukuje akumulaciju MtmiR171e (Slika 33).
PRIMER 2 - Karakterizacija u modelnoj biljci duvana
a) Očuvanje mehanizma u duvanu
Da bi se utvrdilo da li je mehanizam regulacije mikroRNK konzerviran u drugim biljnim vrstama, regulacija MtmiR171b pomoću MtmiPEP171b1 je testirana u drugom ćelijskom modelu. Za to, MtmiR171b i MtmiPEP171b1 su uvedeni u listove duvana.
Akumulacija MtmiR171b je izmerena u listovima duvana transformisanim da bi se eksprimirao MtmiR171b od Medicago truncatula počevši od divljeg tipa pri-miRNK sposobnog da proizvede MtmiPEP171b1, ili počevši od mutirane verzije pri-miRNK nesposobne za proizvodnju MtmiPEP171b1 (u kojoj je početak kodon ATG MtmiORF171b je zamenjen sa ATT) (Slika 6 i Slika 20). Odsustvo translacije MtmiPEP171b1 dovodi do značajnog smanjenja akumulacije MtmiR171b.
Akumulacija pre-MtmiR171b je merena u transformisanim listovima duvana da bi se eksprimirao MtmiR171b samog Medicago truncatula (kontrola), ili dodatno eksprimiranje divljeg tipa MtmiORF171b iz Medicago truncatula (35SmiPEP171b1 ATG), ili mutirana verzija MtmiORF171b u kojoj je startni kodon ATG je zamenjen sa ATT (35SmiPEP171b1 ATT) (Slika 7 i Slika 21). Ekspresija MtmiORF171b dovodi do povećanja akumulacije premiR171b, i ova akumulacija pre-miR171b zavisi od translacije MtmiORF171b u mikropeptid.
Štaviše, u listovima duvana koji su transformisani da bi eksprimirali MtmiR171b Medicago truncatula, neobrađeni ili tretirani prskanjem sa MtmiPEP171b1 (0,1 µM) po prvi put 12 sati pre uzorkovanja i zatim drugi put 30 minuta pre uzorkovanja, primijećeno je da MtmiPEP171b1 može mogu se koristiti direktno u obliku peptida pomoću folijarnih prskanja (Slika 8).
Štaviše, u duvanu (kao u Medicago truncatula) primećeno je da MtmiPEP171b1 dovodi do povećanja akumulacije MtmiR171b (Slika 9A) i pre-MtmiR171b (Slika 9B), ali smanjuje akumulaciju pri-MtmiR171b (Slika 9C) ).
Uzeti zajedno, ovi rezultati ukazuju da je mehanizam regulacije mikroRNK i njihovih ciljnih gena pod kontrolom miPEP-a sačuvan između vrsta.
b) Intracelularna lokalizacija MtmiPEP171b1
Listovi duvana su transformisani da bi se prekomerno eksprimirao MtmiPEP171b1 Medicago truncatula spojen sa fluorescentnim proteinom (GFP) (Slika 10). Dobijeni rezultati ukazuju da je miPEP lokalizovan u malim nuklearnim telima.
11
c) Identifikacija miPEPS iz baza podataka
Pretraživane su genomske baze podataka biljaka za prisustvo otvorenih okvira čitanja unutar primarnih transkripata od 70 miRNK, i identifikovano je 101 miORFs sposobnih da kodiraju miPEP.
Trenutno su AtmiPEP165a i AtmiPEP319a2, identifikovani u Arabidopsis thaliana, već okarakterisani. Eksperimenti sprovedeni u modelnoj biljci duvana omogućili su da se pokaže da prekomerna ekspresija AtmiORF165a ili AtmiORF319a dovodi do povećanja akumulacije AtmiR165a ili AtmiR319a, respektivno (Slika 11).
miR165a reguliše transkripcione faktore kao što su Revoluta, Phavoluta i Phabulosa. miR319 reguliše gene iz TCP porodice.
PRIMER 3 - Karakterizacija u biljci modelu Arabidopsis thaliana
Primer 3A - AtmiPEP165a
Što se tiče AtmiPEP165a, pokazano je in vivo kod Arabidopsis thaliana da tretman sa AtmiPEP165a dovodi do fenotipa sa značajno ubrzanim rastom korena (Slika 12).
Štaviše, tretman biljaka sa višim i višim koncentracijama miPEP165a pokazuje zavisno od doze efekat na akumulaciju miR165a i negativnu regulaciju njegovih ciljnih gena (PHAVOLUTA: PHV, PHABOLUSA: PHB i REVOLUTA: REV) kao funkcija količine miPEP165A (pogledajte sliku 22).
Primer 3B - AtmiPEP164a
Što se tiče AtmiPEP164a, ovo je sintetizovano i korišćeno je za istraživanje povećanja akumulacije miR164a u korenima A. thaliana tretiranih sa sintetskim peptidom.
Northern blot analize ukazuju da tretman biljke peptidom miPEP164a dovodi do povećanja akumulacije miR164a (Slika 23).
Isti tip rezultata je dobijen pomoću kRT-PCR (Slika 30).
Takođe je pokazano in vivo u Arabidopsis thaliana da tretman biljke sa AtmiPEP164a značajno povećava rast biljaka (Slika 24).
Primer 3C - AtmiPEP165a
Što se tiče AtmiPEP165a, ovo je sintetizovano i korišćeno je za istraživanje povećanja akumulacije miR165a u korenima A. thaliana tretiranih sa sintetičkim peptidom.
11
Northern blot analize ukazuju da tretman biljke peptidom miPEP165a dovodi do povećanja akumulacije miR165a (Slika 25).
Štaviše, da bi se odredio način delovanja miPEP-a u vezi sa akumulacijom sopstvenih miRs, ekspresija pri-miR165a je analizirana u biljkama divljeg tipa i u biljkama koje su transformisane da prekomerno eksprimiraju miPEP165a (Slika 35).
Prekomerna ekspresija pri-miR165a je pojačana u biljkama koje prekomerno eksprimiraju miPEP165a (Slika 36A).
U prisustvu kordicepina, inhibitora sinteze RNK, količina pri-miR165a je identična u biljkama divljeg tipa i u transformisanim biljkama (slika 36B), ona ukazuje da miPEP165a ne funkcioniše kao RNK stabilizator, već pre kao aktivator transkripcije od pri-miR165a.
Štaviše, ekspresija pri-miR165a je analizirana u biljkama divljeg tipa (Col-0 biljke) i u mutiranim biljkama koje imaju nizak alel druge velike podjedinice RNK polimeraze II (nrpb2-3 biljke). Dobijeni rezultati ukazuju da mutirane biljke ne pokazuju povećanje akumulacije pri-miR165 kao odgovor na miPEP165a, za razliku od biljki divljeg tipa. Izgleda da miPEP funkcioniše kao regulator transkripcije.
Primer 3D - AtmiPEP319a1
Što se tiče AtmiPEP319a1, ovo je takođe sintetizovano i korišćeno je za istraživanje povećanja akumulacije miR319a u korenima A. thaliana tretiranih sa sintetičkim peptidom. Analize sa kRT-PCR pokazuju da prekomerna ekspresija AtmiPEP319a1 dovodi do povećanja akumulacije miR319a (Slike 26 i 31).
Takođe je pokazano in vivo u Arabidopsis thaliana da tretman biljke sa AtmiPEP319a1 značajno povećava rast biljaka (Slika 27).
Primer 3E - AtmiPEP160b1
Što se tiče AtmiPEP160b1, pokazano je in vivo kod A. thaliana da prekomerna ekspresija ovog miPEP-a indukuje akumulaciju AtmiR160b (Slika 29).
Materijal i metode
Biološki materijal
Površina semena M. truncatula je sterilizovana i ostavljena je da klija na agar pločama tokom 5 dana na 4 °C u mraku. Mladi izdanci su zatim uzgajani na 12 cm kvadratnim pločama ispunjenim Fahraeus medijumom bez azota i sadrži 7,5 µM fosfata (Lauressergues et al., Plant J., 72(3): 512-22, 2012). Bočni koreni su brojani svaki dan. U posudama, biljke su
11
navodnjavane svaki drugi dan sa modifikovanim Long Ashton medijumom sa niskim sadržajem fosfora (Balzergue et al., Journal of Experimental Botany, (62)1049-1060, 2011). Peptidi su sintetisani od strane Eurogentec ili Smartok-Biotech. MtmiPEP171b1 je resuspendovan u rastvoru 40% vode /50% acetonitril/ 10% sirćetne kiseline (v/v/v), a drugi peptidi su resuspendovani u vodi.
Listovi su zalivani prskanjem peptidima upotrebom peptidnih rastvora u različitim koncentracijama (0,01, 0,1, 1 µM), prvo 12 sati pre uzimanja uzoraka, a zatim drugi put 30 minuta pre uzorkovanja.
Obrnuta transkripcija mikroRNK
RNK je ekstraktovana korišćenjem reagensa Tri-Reagens (MRC) prema uputstvima proizvođača, osim za taloženje RNK, koja je izvedena sa 3 zapremine etanola. Eversna transkripcija RNK je izvedena korišćenjem specifičnog prajmera osnovnog omotača RTprimer171b u kombinaciji sa heksamerima za izvođenje reverzne transkripcije RNK visoke molekulske težine.
Ukratko, 1 mg RNK je dodat u matični prajmer MIR171b (0,2 µM), heksamer (500 ng), pufer RT (1X), enzim SuperScript Reverse transkriptaza (SSIII) (jedna jedinica), dNTPs (0,2 mM svaki), DTT (0,8 mM) u konačnoj reakcionoj smeši od 25 µl. Da bi se izvršila reverzna transkripcija, izvršena je reakcija pulsne reverzne transkripcije (40 ponavljanja sledećeg ciklusa: 16 °C tokom 2 minuta, 42 °C tokom jednog minuta i 50 °C tokom jedne sekunde, nakon čega sledi završna inaktivacija reverzne transkripcije na 85 °C tokom 5 minuta). Analize pomoću kvantitativne RT-PCR (kRT-PCR)
Ukupna RNK je ekstrahovana iz korena M. truncatula ili iz listova duvana pomoću kompleta za ekstrakciju RNeasi Plant Mini Kit (Kiagen). Reverzna transkripcija je izvedena korišćenjem SuperScript II reverzne transkriptaze (Invitrogen) počevši od 500 ng ukupne RNK. Izvršena su tri ponavljanja (n = 3), svaki sa dva tehnička ponavljanja. Svaki eksperiment je ponovljen od dva do tri puta. Amplifikacije pomoću kPCR-a izvršene su korišćenjem termociklera sistema LightCicler 480 (Roche Diagnostics) metodom opisanom u Lauressergues et al. (Plant J., 72(3): 512-22, 2012).
Statističke analize
Srednje vrednosti relativne ekspresije gena ili proizvodnje lateralnih korena su analizirane korišćenjem Student testa ili Kruskal-Vallis testa. Trake grešaka predstavljaju SEM (standardna greška srednje vrednosti). Zvezdice ukazuju na značajnu razliku (p<0,05). Plazmidne konstrukcije
11
DNK fragmenti od interesa su amplifikovani sa Pfu polimerazom (Promega). Fragmenti DNK su klonirani korišćenjem KshoI i NotI enzima u pPEKS-DsRED plazmidu za prekomernu ekspresiju pod kontrolom konstitutivnog jakog promotora 35S, i korišćenjem KpnI-NcoI enzima u pPEKS GUS plazmid za reporterske gene, metodom opisano u Combier et al. (Genes & Dev, 22: 1549-1559, 2008).
Za miPEPs 165a i 319a, odgovarajući miORF su klonirani u pBIN19 postupkom opisanim u Combier et al. (Genes & Dev, 22: 1549-1559, 2008).
Transformacija biljaka
Kompozitne biljke koje imaju korene transformisane sa Agrobacterium rhizogenes su dobijene metodom opisanom u Boisson-Dernier et al. (Mol Plant-Microbe Interact, 18: 1269-1276, 2005). Transformisani koreni su verifikovani i odabrani posmatranjem DsRED-a sa binokularnom fluoroscentnom uveličavanjem. Kontrolni koreni odgovaraju korenima transformisanim sa A. rhizogenes koji ne sadrže pPEKS-DsRED vektor. Transformacija listova duvana je izvedena metodom opisanom u Combier et al. (Genes & Dev, 22: 1549-1559, 2008).
Northern blot
Northern blot analiza je izvedena prema protokolu opisanom u Lauressergues et al. Plant J, 72(3): 512-22, 2012.
Biološki uzorci su homogenizovani u puferu koji sadrži 0,1 M NaCl, 2% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 9), 10 mM EDTA (pH 8) i 20 mM merkaptoetanola, i RNK je ekstraktovana dva puta sa smešom fenol / hloroform i taloži se sa etanolom.
RNK je stavljena na PAGE 15% gel i prebačena u najlonsku membranu (HibondNKS, Amersham). RNK je hibridizovana sa radioaktivnom oligonukleotidnom sondom obeleženom na njegovom kraju, da bi se detektovala RNK U6 ili za miR164a.
Hibridizacije su izvedene na 55 °C. Signali hibridizacije su kvantifikovani korišćenjem fosforimmera (Fuji) i normalizovani signalom specifične sonde RNK U6.
RNK stabilnost
Za svako stanje, dve nedelje stare biljke koje su kultivisane vertikalno na čvrstom MS sredstvu su prebačene u ploče sa 6 ležišta koje sadrže 1 ml tečnog MS medijuma. Posle 16-časovne inkubacije sa 1 µM miPEP-a, biljke su tretirane sa 100 ug / ml cordicepina ili sa vodom (kao kontrola), i sakupljene u različitim vremenima da bi se ekstraktovala i kvantifikovala RNK. Svaki pojedinačni eksperiment je napravljen 3 puta.
Histokemijsko označavanje
11
Obeležavanje sa GUS je izvedeno postupkom opisanim u Combier et al., (Genes & Dev, 22: 1549-1559, 2008). Uzorci su posmatrani mikroskopom (aksiozoom).
Imunolokalizacija
Koreni ili planteli tkiva biljke Medicago fiksirani su 2 sata 4% formolu (v/v) sa 50 mM fosfatnim puferom (pH 7,2), a zatim su stavljeni u agarosu LMP 5% u vodi (uz nisku tačku topljenja). Tanki delovi (100 µm) su kreirani i postavljeni u Pbi (fosfatni pufer za imunologiju) na podmetačima obloženim teflonom, blokiranim u Pbi, 2% Tween i 1% bovinskog seruma albumila u trajanju od 2 sata (PbiT-BSA), a zatim obeleženi preko noći (12 sati) na 4°C sa primarnim antitelom razblaženim u BSA-PbiT. Podmetači su isprani sa PBiT i inkubirani na ambijentalnoj temperaturi u trajanju od 2 sata uz sekundarno antitelo razblaženo u PbiT-BSA. Podmetači su zatim oprani u Pbi u trajanju od 30 minuta i montirani na Citifluor (medij za montiranje). Primarna antitela i rastvori su sledeći: 1716a (1:500, v/v). Sekundarno antitelo je bilo kozije anti-zečije IgG antitelo spojeno sa the Alexa Fluor 633 fluorescentnom sondom (molekularne sonde), i upotrebljeno je uz rastvaranje od 1:1000 (v/v).
Western blotovanje
Ukupan ekstrakt proteina je pripremljen korišćenjem metode opisane u Combier et al., (Genes & Dev, 22: 1549-1559, 2008) i razdvojen pomoću SDS-PAGE. Prenos je izvršen korišćenjem fosfatnog pufera preko noći na 4 °C, na 15V, zatim je membrana inkubirana 45 min na sobnoj temperaturi u rastvoru glutaraldehida 0,2% (v/v). Primarna antitela su korišćena u razblaženju 1: 1000 (v/v) i HRP-konjugovana kozja anti-zečja Ig antitela su korišćena kao sekundarna antitela u 1:40000 (v/v) razblaženju.
12
Tabela 8. Lista prajmera
B: Analiza miPEP-ova kod životinja
PRIMER 4 - Identifikacija kandidata za mIPEP u Drosophila
a) Identifikacija miPEP kandidata
Prva studija koju je sprovela RACE-PCR u modelnoj životinji Drosophila melanogaster pokazuje postojanje miRNK koje se eksprimiraju tokom embriogeneze, miR1 i miR8.
Kao u biljkama, miORF-i su identifikovani u svakoj od dve proučene miRNK. Na primer, miR8, poznat po svojoj ulozi u regulaciji rasta kod insekata, ima miORF koji potencijalno kodira miPEP8.
Što se tiče DmmiR1 (identifikovanog u Drosophila melanogaster), on ima dva DmmiORF-a koji potencijalno kodiraju DmmiPEP1a i DmmiPEP1b.
Filogenetska analiza pokazuje evolucijsku konzervaciju prisustva miORF-a među desetinama analiziranih vrsta Drosophila, tj. Od njihove razlike pre više od 60 miliona godina (Slika 13).
Štaviše, miPEP-ovi identifikovani kod Drosophila imaju nekoliko sličnosti sa biljnim miPEP-ovima. Ako njihov primarni niz i stoga njihova veličina brzo evoluira između vrsta, pronađena je smanjena veličina (od 32 do 104 AA), kao i jaka konzervacija za osnovni ukupni naboj (pHi od 9,5 do 12) (Slika 14).
Uzeti zajedno, ovi rezultati ukazuju na postojanje regulatornih miPEP-ova, kodiranih primarnim transkriptom mikroRNK, preko širokog spektra eukariotskih vrsta. Ovi otkriveni peptidi predstavljaju još neistraženi rezervoar prirodnih molekula koji mogu regulisati različite osnovne biološke funkcije, kako u biljkama tako iu životinjama.
b) Eksprimiranje miPEP-ova
Ćelije Drosophila melanogaster su transfektovane da prekomerno eksprimiraju DmmiPEP8 (iz sekvence SEQ ID NO: 494) ili DmmiPEP mt od kojih su mutirani startni kodoni (iz sekvence SEQ ID NO: 495). Kao transfekciona kontrola, jedan plazmid koji proizvodi moesin-RFP je ko-transfektovan sa plazmidima koji kodiraju DmmiPEP8 i DmmiPEP8 mt. Primećeno je da su startni kodoni u DmmiPEP8 nizu funkcionalni jer dozvoljavaju sintezu miPEP::GFP fuzionog proteina koji pokazuje GFP, dok konstrukcije sa mutiranim ATG-om ne proizvode gotovo nikakav GFP.
Ovi rezultati ukazuju na to da je ORF miPEP-a funkcionalan (Slika 38).
Materijal i metode
Ćelije Drosophila melanogaster
S2 ćelije se kultivišu u T75 posudi u 12 mL Schneider-ovog medija (GIBCO), koji sadrži 1% penicilina 100 U/mL i streptavidina 100 mg/mL (Sigma) i 10% dekomplementovanog fetalnog telećeg seruma (30 min na 56 °C).
Prolazne transfekcije se vrše korišćenjem FuGENE® HD transfekcije (Roche), u skladu sa preporukama. Uobičajeno, 1,5 miliona S2 ćelija, prethodno zasađenih u pločama sa 6 ležišta
12
(3 ml medijuma po ležištu), transfektuju se sa 250 ng ukupne plazmidne DNK. DNK se dovodi u kontakt sa Fugenom (3 µl) u 100 µl OPTIMEM-a (GIBCO). Posle 20 minuta, formirani transfekcioni reagens se dovodi u kontakt sa ćelijama u medijumu kulture. RNK ćelija se ekstraktuje 66h nakon transfekcije.
Kloniranje DmmiPEP8- i mutiranih DmmiPEP8-fragmenata
Fragmenti DNK, koji odgovaraju sekvenci DmmiPEP8 (SEQ ID NO: 494) i DmmiPEP8 mutirani u startnim kodonima (SEQ ID NO: 495), su amplifikovane pomoću PCRin da bi se kloniralo u skladu sa GFP u pUAS plazmidu. SE ćelije insekata su ko-transfektovane sa mešavinom plazmida (odnos 1/1/1, ukupno 300 ng) koji kodiraju DmmiPEP8::GFP ili njegovu mutiranu formu DmmiPEP8 mt::GFP, pACT-GAL4 koji omogućava njihovu prekomernu ekspresiju pomoću GAL4 transkripcionog faktora proizvedenog pod kontrolom aktin promotora i ekspresionog vektora koji kodira moesin-RFP protein koji se koristi kao kontrola transfekcije, takođe pod kontrolom aktin promotora. 48h nakon transfekcije, ćelije su fiksirane dodavanjem formaldehida u konačnoj kulturi medija 4% (V/V) tokom 10 min. Zatim su ćelije isprane sa 2X uz PBS1X i obložene na slajdovima kako bi se posmatrale pod mikroskopom (Leica SPE).
Tabela 9. Klonirani nizovi.
C: Karakterizacija miPEP-ova kod ljudi
PRIMER 5 - Karakterizacija HsmiPEP155
Fragmenti DNK od interesa (HsmiPEP155 i mutirani miPEP) su sintetisani ili amplifikovani PCR-om korišćenjem specifičnih prajmera, i zatim klonirani upotrebom enzima KshoI i NotI u pUAS plazmidu koji dozvoljava njihovu prekomernu ekspresiju pomoću GAL4 transkripcionog faktora, čija ekspresija kontroliše konstitutivni jak promotor.
Različiti konstrukti su proizvedeni bilo PCR amplifikacijom na genomskoj DNK HeLa ćelija, ili pomoću RT-PCR na ukupnim RNK L428 humanih ćelija. Pojačani PCR fragmenti su digestirani sa HindIII / EcoRI restrikcionim enzimima i zatim klonirani u vektor pcDNK3.1. DH5α soj Escherichia coli je elektroporiran i zatim kultivisan na čvrstoj podlozi (2YT agar ampicilin). Plazmidna DNK iz različitih klonova je zatim pripremljena i sekvencirana za verifikaciju. Konstrukti se zatim pripremaju koristeći KIAfilter Plasmid Midi kit (KIAGEN) i čuvaju se na -20 °C.
HeLa ćelije (uspostavljena tumorska linija, ATCC CCL-2.2) su kultivisane u ploči sa 6 ležišta u kompletnom mediju [(DMEM (1x) Glutamak 4,5g/L glukoza bez piruvata 1x penicilin/streptomicin 1 mM Na- piruvat 10% teleći serum] i stavljen u inkubator na 37 °C i 5% CO2.
Ćelije se transfektuju kada su na 50% konfluentnosti. Na početku eksperimenta, kompletan medijum koji sadrži antibiotike zamenjuje se kompletnim medijumom bez antibiotika. Za svako ležište, pripremljena je mešavina A [250 µl Optimem (+ Glutamak) (Gibco) 2µg DNK] i mešavina B [250 µl Optimem 4 µl Lipofectamine 2000 (Invitrogen)] i ostavljena za 5 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim se smeša B meša u kapima u smešu A i ostavi da se inkubira 25 min na sobnoj temperaturi. Smeša se zatim deponuje kap po kap u ležište.4-5 sati kasnije, medijum se menja i zamenjuje kompletnim medijem sa antibioticima.48 sati nakon transfekcije, stanice su zaustavljene. Medijum se aspirira i odbacuje; ćelije se ispraju sa PBS 1X. Tada je moguće skladištiti ćelije na -20 °C ili direktno ekstraktovati ukupnu RNK.
Za svako ležište, RNK se ekstrahuju deponovanjem 1 ml Tri-Reagenta (Euromedek) na ćelije. Tri-reagens se aspirira i vraća nekoliko puta, tako da se ćelije liziraju ispravno, a zatim se prenese u tubu od 1,5 ml. Dodaje se 0,2 ml hloroforma zasićenog vodom. Meša se vorteksovanjem, a zatim ostavi 2 do 3 minuta na sobnoj temperaturi. Centrifugira se 5 minuta na 15300 o/min. i na 4 °C. Vodena faza se istaloži iz 0,5 ml izopropanola nakon inkubacije tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi i centrifugiranjem tokom 15 minuta na 15300 o/min. i na 4 °C. Supernatant se odbacuje i pelet se ispira sa 1 ml 70% etanola, centrifugiranjem 5
12
minuta na 15300 o/min. na 4 °C. Supernatant se ponovo odbacuje i pelet se suši nekoliko minuta u vazduhu.
Za najbolje moguće uklanjanje genomske DNK koja potencijalno ostaje, RNK se tretiraju sa DNazom. Za ovo, pelet se resuspenduje u 170 µl ultra čiste vode, 20 µl DNaza pufera 10x i 10 µl RQ1 RNaze-slobodne DNaze i drži se na 37 °C tokom 30 minuta. Zatim se 20 µl SDS10% i 5 µl proteinaze K (20 mg / ml) dodaju tokom 20 minuta na 37 °C.
Poslednja ekstrakcija fenola je izvedena sa 225 µl smeše fenola/H2O/hloroforma i centrifugiranjem tokom 5 minuta na 15300 o/min. na 4 °C.
Vodena faza se zatim istaloži iz 20 µl 3M natrijum acetata i 600 µl 100% etanola tokom 20 minuta na -80 °C. Zatim se centrifugira 15 minuta na 4 ° C na 15300 o/min. Supernatant se odbacuje. Pelet se ispira u 1 ml 70% etanola, centrifugira 5 min na 15300 o/min. na 4 °C, supernatant se ponovo odbacuje i pelet se ostavlja da se suši nekoliko minuta na vazduhu. Zatim se pelet unosi u 15-20 µl ultra-čiste vode, a RNK se analiziraju.
10-15 µg ukupnih RNK se zatim analizira Northern blot analizom na 15% akrilamidnom gelu [rastvor akrilamida /40% bis-akrilamida, odnos 19: 1], 7M urea u TBE 1x. Migracija se izvodi na 400V, u TBE1x kao puferu za migraciju, posle predgrevanja gela. RNK se zatim elektro-prenose na Biodine Plus 0.45 µm najlonsku membranu, tokom 2 sata, na 1V i 4 °C u transfernoj posudi. Na kraju prenosa, membrana je ozračena UV zračenjem od 0,124 J/cm<2>. Membrana je zatim pre-hibridizovana u puferu 5kSSPE, 1xDenhardt, 1% SDS i 150 µg / ml kvasca tRNK, tokom 1 sata na 50 °C u hibridizacionoj peći. Zatim se doda nukleotidna proba, obeležena na 5' sa ᵞ-<32>P-ATP (0.5 to 1.10<6>cpm/ml hibridizacionog pufera) i hibridizuje preko noći na 50 °C. Membrana se zatim dvaput opere u 0,1xSSPE/0,1%SDS na sobnoj temperaturi i izloži u kaseti za autoradiografiju koja sadrži BioMak HE ekran (Kodak) i BioMak MS film (Kodak), da bi se detektovala mikroRNK, za 24-48 sati, na -80 °C.
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14
14
14
14
14
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
21
21
21
21
21
21
21
22
22
22
22
22
22
22
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
24
24
24
24
24
24
24
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2

Claims (21)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Postupak za detekciju i identifikaciju mikropeptida (miPEP) kodiranog nukleotidnim nizom sadržanim u sekvenci primarnog transkripta mikroRNK,
koji se sastoji od:
a) koraka detekcije otvorenog okvira čitanja od 12 do 303 nukleotida koji se nalaze u sekvenci primarnog transkripta navedene mikroRNK, a zatim
- b) korak poređenja između:
• akumulacije navedene mikroRNK u specifičnoj eukariotskoj ćeliji koja eksprimira pomenutu mikroRNK,
u prisustvu peptida kodiranog nukleotidnomm sekvencom koja je identična ili degenerisana u odnosu na dati otvoreni okvir čitanja, navedeni peptid je prisutan u ćeliji nezavisno od transkripcije primarnog transkripta navedene mikroRNK, i
• akumulacije date mikroRNK u eukariotskoj ćeliji istog tipa kao prethodno naznačena eukariotska ćelija koja eksprimira datu mikroRNK, u odsustvu navedenog peptida,
u kojima modulacija akumulacije date mikroRNK u prisustvu navedenog peptida u odnosu na akumulaciju navedene mikroRNK u odsustvu datog peptida ukazuje na postojanje mikropeptida kodiranog navedenim otvorenim okvirom čitanja.
2. Postupak za detekciju i identifikaciju miPEP prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što modulacija akumulacije pomenute mikroRNK je smanjenje ili povećanje akumulacije date mikroRNK, a posebno povećanje.
3. Postupak za detekciju i identifikaciju miPEP prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što je prisutnost peptida u ćeliji rezultat:
- uvođenja u ćeliju nukleinske kiseline koja kodira navedeni peptid, ili
- uvođenja navedenog peptida u ćeliju.
4. Postupak za detekciju i identifikaciju miPEP prema jednom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što se navedeni otvoreni okvir čitanja u koraku a) nalazi u 5' ili 3' delu pomenutog primarnog transkripta mikroRNK, poželjno u 5' delu.
5. Postupak za detekciju i identifikaciju miPEP prema jednom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što navedena mikroRNK je prisutna u biljnoj ćeliji divljeg tipa
2
ili u divljem tipu životinjske ćelije, i gde navedena eukariotska ćelija korišćena u koraku b) je biljna ćelija ili životinjska ćelija.
6. Postupak za detekciju i identifikaciju miPEP prema patentnom zahtevu 5, naznačen time, što navedena eukariotska ćelija korišćena u koraku b) je biljna ćelija biljke kupusnjače, leguminozne biljke ili biljke pomoćnice.
7. Postupak za detekciju i identifikaciju miPEP prema zahtevu 5, u kome navedena eukariotska ćelija upotrebljena u koraku b) je životinjska ćelija izabrana iz humane ćelije ili ćelije Drosophila.
8. MiPEP je izabran iz grupe peptida koja se sastoji od:
- SEQ ID NO: 1 do SEQ ID NO: 104 i SEQ ID NO: 355,
- SEQ ID NO: 375 do SEQ ID NO: 386, ili
- SEQ ID NO: 424.
9. Molekul nukleinske kiseline koji kodira miPEP kao što je definisano u patentnom zahtevu 8, pri čemu je navedeni molekul nukleinske kiseline izabran iz grupe nukleinskih kiselina koja se sastoji od:
- SEQ ID NO: 105 do SEQ ID NO: 208 i SEQ ID NO: 356,
- SEQ ID NO: 387 do SEQ ID NO: 399, ili
- SEQ ID NO: 425.
10. Upotreba najmanje:
- miPEP kao što je definisano prema zahtevu 8,
- nukleinske kiselina prema zahtevu 9 koja kodira pomenuti miPEP, ili
- vektora koji sadrži navedenu nukleinsku kiselinu,
za modulaciju ekspresije gena u određenoj eukariotskoj biljnoj ćeliji,
pomenuta specifična eukariotska biljna ćelija je sposobna da eksprimira mikroRNK, čiji primarni transkript sadrži najmanje jednu nukleotidnu sekvencu koja kodira najmanje jedan pomenuti miPEP i čija se akumulacija modulira najmanje jednim navedenim miPEP, ekspresija navedenog gena je regulisana navedenom mikroRNK, pri čemu je pomenuti miPEP izabran iz grupe peptida koja se sastoji od:
SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 76,
navedena nukleinska kiselina je izabrana iz grupe nukleinskih kiselina koja se sastoji od: SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 180,
pomenuta mikroRNK je izabrana iz grupe nukleinskih kiselina koja se sastoji od:
SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO: 331.
11. Postupak modulacije ekspresije gena regulisanog pomoću mikroRNK u eukariotskoj biljnoj ćeliji,
koji obuhvata izvođenje koraka akumulacije miPEP-a u eukariotskoj ćeliji, dati miPEP je izabran iz grupe peptida koja se sastoji od: SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 76
u kojem akumulacija navedenog miPEP-a u navedenoj eukariotskoj ćeliji indukuje modulaciju ekspresije navedenog gena u odnosu na ekspresiju datog gena bez akumulacije datog miPEP-a.
12. Upotreba kompozicije koja sadrži najmanje:
- miPEP kao što je definisano u skladu sa zahtevom 8, sa izuzetkom miPEP sekvenci SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104 i SEQ ID NO: 355, - nukleinska kiselina prema zahtevu 9 koja kodira pomenuti miPEP, sa izuzetkom nukleinskih kiselina sekvenci SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208 i SEQ ID NO: 356, ili
- vektora koji sadrži navedenu nukleinsku kiselinu,
kao fitofarmaceutsko sredstvo,
- za promovisanje rasta i/ili razvoja biljaka,
- ili za modifikovanje fizioloških parametara semena biljaka
- ili za sprečavanje ili lečenje biljnih bolesti,
data kompozicija se nanosi oblaganjem ili oblaganjem filmom semena biljaka.
13. Upotreba kompozicije prema zahtevu 12 za modulaciju fizioloških parametara biljke.
14. Upotreba kompozicije prema zahtevu 13 za modulaciju fizioloških parametara biljke, pri čemu su navedeni parametri izabrani od biomase, površine lišća, cvetanja i veličine ploda.
2
15. Upotreba kompozicije prema zahtevu 12 za modulaciju fizioloških parametara semena biljaka, pri čemu su navedeni parametri izabrani od klijanja, razvoja korena i otpornosti na vodeni stres.
16. Upotreba kompozicije prema patentnom zahtevu 12, naznačena time, što se koristi za poboljšanje otpornosti na infektivne bolesti.
17. Upotreba kompozicije koja sadrži najmanje:
- miPEP kao što je definisano u skladu sa patentnim zahtevom 8 sa izuzetkom miPEP-ova niza SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104 i SEQ ID NO: 355,
- nukleinsku kiselinu prema zahtevu 9 koja kodira dati miPEP, sa izuzetkom nukleinskih kiselina sa sekvencama SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208 i SEQ ID NO: 356, ili
- vektor koji sadrži navedenu nukleinsku kiselinu,
kao herbicid, za iskorenjivanje biljaka ili usporavanje njihovog rasta, ili
kao pesticid za iskorenjivanje organizama koji su štetni za biljke ili koji se mogu klasifikovati kao takvi.
18. Upotreba kompozicije prema zahtevu 17, naznačena time, što se navedeni pesticid bira iz grupe koju čine: insekticid, araknicid, moluskicid i rodenticid.
19. Upotreba kompozicije prema bilo kom od patentnih zahteva 17 ili 18, pri čemu pomenuta kompozicija se kao pesticid nanosi na biljku ili na nosač u kontaktu sa biljkom.
20. Kompozicija, koja sadrži kombinaciju količine semena biljke i količine peptida, čija sekvenca sadrži ili se sastoji od sekvence identične onoj u kojoj je miPEP prirodno prisutan u navedenoj biljci,
dati miPEP je izabran iz grupe peptida koja se sastoji od: SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 76.
21. Kompozicija prema zahtevu 20, naznačena time, što je navedena kompozicija formulisana tako da formira obloženo seme.
2
RS20190705A 2013-10-31 2014-10-31 Mikropeptidi i njihova upotreba za modulaciju ekspresije gena RS58834B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1360727A FR3012471A1 (fr) 2013-10-31 2013-10-31 Micropeptides et leur utilisation pour moduler l'expression de genes
FR1455044 2014-06-03
EP14809449.3A EP3063300B1 (fr) 2013-10-31 2014-10-31 Micropeptides et leur utilisation pour moduler l'expression de gènes
PCT/FR2014/052781 WO2015063431A1 (fr) 2013-10-31 2014-10-31 Micropeptides et leur utilisation pour moduler l'expression de gènes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS58834B1 true RS58834B1 (sr) 2019-07-31

Family

ID=52016107

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190705A RS58834B1 (sr) 2013-10-31 2014-10-31 Mikropeptidi i njihova upotreba za modulaciju ekspresije gena

Country Status (14)

Country Link
US (5) US20150121569A1 (sr)
EP (3) EP3063300B1 (sr)
JP (2) JP6506278B2 (sr)
CN (2) CN113430295B (sr)
BR (1) BR112016009697A2 (sr)
CA (1) CA2927427C (sr)
DK (3) DK3536804T3 (sr)
ES (3) ES2983744T3 (sr)
HU (1) HUE044944T2 (sr)
LT (1) LT3063300T (sr)
PL (3) PL4032985T3 (sr)
PT (3) PT3063300T (sr)
RS (1) RS58834B1 (sr)
WO (1) WO2015063431A1 (sr)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150121569A1 (en) * 2013-10-31 2015-04-30 Centre National De La Recherche Scientifique Micropeptides and use thereof for modulating gene expression
ES2834576T3 (es) * 2014-06-03 2021-06-17 Univ Toulouse 3 Paul Sabatier Uso de micropéptidos para favorecer el crecimiento de las plantas
CA2951018C (fr) * 2014-06-03 2023-11-14 Universite Toulouse Iii-Paul Sabatier Utilisation de micropeptides pour favoriser la symbiose mycorhizienne
FR3061179A1 (fr) * 2016-12-22 2018-06-29 Universite Toulouse Iii-Paul Sabatier Peptides therapeutiques
JP2020513192A (ja) * 2017-03-29 2020-05-07 中国医学科学院基礎医学研究所 低分子ｒｎａ、並びに線維増殖性疾患及び／又は症候群の予防及び／又は治療におけるその応用
EP3539975A1 (en) * 2018-03-15 2019-09-18 Fundació Privada Institut d'Investigació Oncològica de Vall-Hebron Micropeptides and uses thereof
CN108690123B (zh) * 2018-06-21 2021-11-19 上海交通大学医学院 短肽在制备免疫调节药物中的应用
CN110540589B (zh) * 2019-01-08 2021-07-20 西南大学 一种多肽、多肽修饰的脂质载体及应用
CN112301029B (zh) * 2019-07-31 2023-02-24 上海交通大学医学院附属仁济医院 靶向调节miRNA的功能性小肽、其获得方法及其应用
CN111500579A (zh) * 2020-04-23 2020-08-07 九圣禾种业股份有限公司 棉花miR164a和NAC100L及其在调控植物黄萎病抗性中的应用
EP4066629A1 (en) * 2021-04-02 2022-10-05 Université de Rennes 1 Methods for altering the microbiome influenced by roots of a plant using micropeptides
CN115093484B (zh) * 2022-06-27 2024-06-25 苏州乙水茉生物科技有限公司 miPEP156a与噁霉灵偶联体及其制备方法和应用
CN115772526B (zh) * 2022-07-20 2025-01-24 西北农林科技大学 西瓜ClmiR159-3P及其前体基因的应用
FR3141177A1 (fr) 2022-10-19 2024-04-26 Université Toulouse III - Paul Sabatier Nouveaux peptides et leur utilisation pour moduler l’accumulation d’une proteine
FR3141176A1 (fr) 2022-10-19 2024-04-26 Université Toulouse III - Paul Sabatier Nouveaux peptides et leur utilisation pour moduler l’accumulation d’une proteine
CN115710588B (zh) * 2022-11-10 2024-05-03 西南大学 超量表达bna-miR166f在改良油菜收获指数等复杂数量性状中的应用
EP4676936A1 (en) * 2023-03-08 2026-01-14 Universite Toulouse Iii - Paul Sabatier Micropeptides and use of the same for inhibiting the growth of parasitic plants
CN118955674A (zh) * 2023-05-15 2024-11-15 南京安吉生物科技有限公司 一种新型微肽hmbj及其应用
CN117683103B (zh) * 2023-11-24 2024-05-14 南京林业大学 一种小肽miPEP166i及其在植物组织培养中的应用
CN118684748B (zh) * 2024-01-25 2026-04-14 华中农业大学 一种微肽及其应用
CN119241643B (zh) * 2024-12-06 2025-04-22 杭州康源食品科技有限公司 一种促进骨骼生长的四肽

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US50106A (en) * 1865-09-26 Combined knife
CA2492917C (en) * 2002-07-19 2011-10-18 University Of South Carolina Compositions and methods for the modulation of gene expression in plants
US20080227085A1 (en) * 2003-01-17 2008-09-18 Pellegrini Matthew C Methods and Systems for the Identification of Rna Regulatory Sequences and Compounds that Modulate their Function
CN101203611B (zh) * 2005-04-19 2013-08-14 巴斯福植物科学有限公司 控制基因表达的改良方法
CN101747417B (zh) * 2008-12-22 2012-12-26 浙江省农业科学院 调节植物光能利用及油脂积累的基因及其应用
WO2013096567A2 (en) * 2011-12-21 2013-06-27 Duke University The hsf-like transcription factor, tbf1, is a major molecular switch for growth-to-defense transition in plants
US20150121569A1 (en) * 2013-10-31 2015-04-30 Centre National De La Recherche Scientifique Micropeptides and use thereof for modulating gene expression

Also Published As

Publication number Publication date
DK4032985T3 (da) 2024-06-17
US20240301014A1 (en) 2024-09-12
CN105874083B (zh) 2021-08-20
JP6506278B2 (ja) 2019-04-24
EP3536804B1 (fr) 2022-01-05
BR112016009697A2 (pt) 2017-12-05
ES2983744T3 (es) 2024-10-24
PT4032985T (pt) 2024-06-19
EP3063300A1 (fr) 2016-09-07
CA2927427A1 (fr) 2015-05-07
US20200031884A1 (en) 2020-01-30
PT3063300T (pt) 2019-07-05
ES2729402T3 (es) 2019-11-04
DK3063300T3 (da) 2019-06-17
EP3536804A1 (fr) 2019-09-11
US12024543B2 (en) 2024-07-02
CN105874083A (zh) 2016-08-17
CA2927427C (fr) 2023-09-19
CN113430295B (zh) 2025-07-18
PL3536804T3 (pl) 2022-06-27
DK3536804T3 (da) 2022-02-21
CN113430295A (zh) 2021-09-24
WO2015063431A1 (fr) 2015-05-07
LT3063300T (lt) 2019-06-10
ES2907768T3 (es) 2022-04-26
JP2017504308A (ja) 2017-02-09
PL4032985T3 (pl) 2024-08-05
JP2019170379A (ja) 2019-10-10
PL3063300T3 (pl) 2019-08-30
EP4032985B1 (fr) 2024-03-13
HUE044944T2 (hu) 2019-11-28
EP4032985A1 (fr) 2022-07-27
EP3063300B1 (fr) 2019-03-06
US20200131234A1 (en) 2020-04-30
PT3536804T (pt) 2022-02-09
US20150121569A1 (en) 2015-04-30
US20160251402A1 (en) 2016-09-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240301014A1 (en) Micropeptides and use of same for modulating gene expression
KR102266402B1 (ko) 신규한 해충 제어 방법
WO2019219015A1 (zh) 对蚜虫高效致死的RNAi靶标基因及其应用
US20250127136A1 (en) Novel method for promoting nodulation in plants
TW201623612A (zh) 授予對鞘翅目及半翅目害蟲之抗性的ｓｅｃ２３核酸分子
US10920236B2 (en) Use of micropeptides in order to stimulate mycorrhizal symbiosis
US10563214B2 (en) Use of micropeptides for promoting plant growth
CN110747199A (zh) 蜜蜂抗逆相关基因nf-y及其应用
KR101869779B1 (ko) 선충저항성 박 대목 및 이의 제조방법
KR20090049668A (ko) 식물의 환경 스트레스 및 병원균 저항성에 관여하는 고추유전자 ＣａＮＡＣ２
FR3012471A1 (fr) Micropeptides et leur utilisation pour moduler l&#39;expression de genes
CN113278056A (zh) 一种耐盐cin转录因子基因与应用
CN119040390B (zh) 苹果MdIAMT基因在提高苹果花青素含量中的应用
FR3021503A1 (fr) Utilisation de micropeptides pour favoriser la croissance des plantes
BR122023021437B1 (pt) Método para promover nodulação em plantas
BR112017020057B1 (pt) Método para promover nodulação em plantas