ES2908415T3

ES2908415T3 - Composición y método para la síntesis y amplificación de ácidos nucleicos mediante el uso de RT

Info

Publication number: ES2908415T3
Application number: ES16169491T
Authority: ES
Inventors: Cora Woo; Jennifer Berkman; Priscilla Yim
Original assignee: Life Technologies Corp
Current assignee: Life Technologies Corp
Priority date: 2010-06-21
Filing date: 2011-06-20
Publication date: 2022-04-29
Anticipated expiration: 2031-06-20
Also published as: DK3109326T3; EP3109326B1; US20120003645A1; CN103038366A; EP3109326A1; US20210292812A1; US9005895B2; CN107760770A; CN107760770B; US20150184228A1; DK2582839T3; EP2582839A1; EP2582839B1; WO2011163120A1

Abstract

Un método para amplificar una molécula de ácido nucleico a partir de una muestra biológica extraída de una fuente que puede comprender uno o más inhibidores de la PCR, el método comprende: mezclar una plantilla de ácido nucleico con una composición que comprende una o más ADN polimerasas, y una combinación de agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR que consisten esencialmente en gelatina de pescado y albúmina de suero bovino (BSA), para formar una mezcla de reacción, en donde la combinación de agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR aumenta la tolerancia a los uno o más inhibidores de la PCR si están presentes en la muestra biológica; y amplificar una molécula de ácido nucleico complementaria a la totalidad o a una parte de la plantilla de ácido nucleico; en donde la gelatina de pescado está a una concentración de 0,2 % p/v-4,0 % p/v y en donde la BSA está a una concentración de aproximadamente 500 ng/μL a 6000 ng/μL.

Description

DESCRIPCIÓN

Composición y método para la síntesis y amplificación de ácidos nucleicos mediante el uso de RT

Campo:

La descripción se refiere a composiciones, métodos y kits útiles para la síntesis de ácidos nucleicos. Más específicamente, se proporcionan composiciones, métodos y kits para la amplificación de moléculas de ácido nucleico en un procedimiento de RT-PCR de un solo paso que comprende uno o más agentes usados para aumentar la tolerancia a los inhibidores de la PCR.

Antecedentes:

La detección, análisis, transcripción y amplificación de ácidos nucleicos son algunos de los procedimientos más importantes en la biología molecular moderna. La aplicación de dichos procedimientos para el análisis de ácidos nucleicos es especialmente importante en la investigación de la expresión génica, el diagnóstico de agentes infecciosos o enfermedades genéticas, la generación de ADNc y el análisis de retrovirus, por nombrar sólo algunas aplicaciones. La transcripción inversa del ARN, seguida de la amplificación del ADNc mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), comúnmente denominada como RT-PCR o ARN-PCR, se ha vuelto ampliamente usada para la detección y cuantificación de ácidos nucleicos objetivos y es particularmente importante para el análisis de genes virales.

El estudio de los oncovirus y su papel en la patogénesis de los carcinomas puede tener importantes implicaciones en el diagnóstico y tratamiento del cáncer. Sin embargo, la variabilidad en la detección de los oncovirus puede dificultar estos estudios. La sensibilidad y la especificidad del método de detección son preocupaciones clave. Puede lograrse una detección más temprana mediante el uso de técnicas de biología molecular para detectar ácidos nucleicos oncovirales en muestras que no han experimentado seroconversión, y estas técnicas son aplicables a virus que no pueden propagarse en cultivos de tejidos. Tradicionalmente, los métodos de detección inmunológica se han usado para detectar la presencia de oncovirus, pero estos métodos tienen varios inconvenientes. En el caso del virus del papiloma humano (VPH), que puede provocar cáncer de cuello uterino, la detección es difícil debido a la baja expresión de proteínas virales tempranas y la ausencia de anticuerpos sensibles y específicos de alta calidad que puedan discriminar los tipos de VPH (Villa y Denny, International Journal of Gynecology and Obstetrics, 94(Supl. 1):S71-S80 (2006)). Los resultados también pueden ser equívocos o no concluyentes cuando una muestra exhibe niveles residuales de anticuerpos debido a una infección que puede haberse producido meses o años antes de la recolección de la muestra, como en el caso del virus de Epstein-Barr (EBV), que está asociado con el linfoma de Hodgkin y otros carcinomas (National Center for Infectious Diseases. "Epstein-Barr Virus and Infectious Mononucleosis," CDC. http://www.cdc.gov/ncidod/diseases/ebv.htm (noviembre de 2010)). La detección de ácidos nucleicos virales basada en PCR no solo tiene la ventaja de ser altamente específica debido a la unión de cebadores específicos de secuencia, sino que también es menos engorrosa y más sensible que otras técnicas de hibridación, tales como las transferencias de ARN y ADN, debido a su capacidad para amplificar fragmentos de ácido nucleico más cortos. La unión por sondas específicas de secuencia añade una capa adicional de especificidad a la PCR en tiempo real y tiene la ventaja adicional de proporcionar información sobre la carga viral.

La RT-PCR involucra típicamente dos síntesis moleculares separadas: (i) la síntesis de ADNc a partir de una plantilla de ARN; y (ii) la replicación del ADNc recién sintetizado mediante la amplificación por PCR. La rT-PCR puede realizarse mediante métodos de RT-PCR de un solo paso (o acoplada) mediante el uso de dos o más enzimas, en los que se emplean al menos dos enzimas separadas (por ejemplo, una transcriptasa inversa y una polimerasa) para la síntesis inicial de ADNc y la posterior amplificación, respectivamente.

En la RT-PCR de un solo paso, la transcripción inversa y la amplificación por PCR se combinan en una sola mezcla de reacción que proporciona numerosas ventajas sobre la RT-PCR de dos pasos (donde los pasos de síntesis y amplificación se realizan mediante el uso de dos reacciones diferentes o separadas). La RT-PCR de un solo paso requiere menos manipulación de los reactivos de la mezcla de reacción y los productos de ácido nucleico que la RT-PCR de dos pasos (por ejemplo, la apertura del tubo de reacción para añadir el componente o la enzima entre los dos pasos de la reacción) y, por lo tanto, es menos laboriosa y requiere menos tiempo. La RT-PCR de un solo paso también permite usar menos muestra si es necesario y reduce el riesgo de contaminación (Sellner y Turbett, Biotechniques 25:234-238 (1998)).

Sin embargo, el uso de métodos de RT-PCR de un solo paso tiene algunos inconvenientes. Por ejemplo, la optimización individual de la relación entre la transcriptasa inversa y la ADN polimerasa no es factible generalmente para composiciones listas para usar o kits para RT-PCR de un solo paso. Varios informes también han documentado la interferencia entre la transcriptasa inversa y la ADN polimerasa cuando se usan en combinación en una reacción de RT-PCR en un solo tubo, lo que da como resultado una baja sensibilidad o ausencia de resultados (Sellner, L. N. y otros, Nucl. Acids Res. 20:1487-1490 (1992)).

Además, las muestras de las que se extraen los ácidos nucleicos virales a menudo contienen compuestos adicionales que inhiben la PCR. El ácido húmico en el suelo y las heces, la hematina en la sangre, la inmunoglobina G en el suero y diversos anticoagulantes sanguíneos, como la heparina y el citrato, son todos ejemplos de dichos inhibidores. Es posible que dichos inhibidores no se eliminen por completo durante el proceso de extracción y purificación de ácidos nucleicos, lo que impacta por tanto negativamente en la amplificación por PCR aguas abajo, como se refleja en un aumento en el Ct (es decir, ciclo umbral) y una disminución en la dRn (es decir, diferencia en la señal indicadora normalizada) cuando se analiza mediante PCR en tiempo real.

Un Ct alto junto con una dRn baja indica generalmente una concentración baja de ácido nucleico objetivo en reacciones para aplicaciones de PCR cuantitativa (qPCR) y transcriptasa inversa-qPCR (RT-qPCR). Una reacción que muestra una amplificación reducida o nula indica que el ácido nucleico objetivo está ausente, o presente en cantidades tan pequeñas que no es detectable. Una reacción que contiene cantidades detectables del objetivo, pero que está inhibida por la presencia de inhibidores de la PCR, puede mostrar un Ct artificialmente alto y una dRn baja, lo que puede conducir al usuario a creer que la cantidad de ácido nucleico objetivo es menor que la cantidad real presente. Si el nivel de inhibición es lo suficientemente grave, es posible que la reacción no se amplifique por completo, lo que conduce por tanto a un resultado falso negativo.

Debido a la importancia de las aplicaciones de la síntesis de ácidos nucleicos en los campos de la biología molecular y la biología celular, un sistema de RT-PCR de un solo paso, en forma de una composición generalizada lista para usar, que muestre una alta sensibilidad, no esté restringido por la cantidad de muestra, reduzca la cantidad de manipulación por el especialista, minimice los riesgos de contaminación, minimice el gasto de reactivos y maximice la cantidad de producto final de ácido nucleico, es necesario en la técnica. Además, es necesario un método para reducir o eliminar los efectos negativos de los inhibidores de la PCR, especialmente cuando se analizan objetivos virales donde las fuentes de muestras a menudo contienen dichos inhibidores, para garantizar resultados precisos.

Anteriormente, se usaba BSA para reducir o eliminar los efectos negativos de los inhibidores en la PCR (documento WO2008144556, Nagai y otros, 1998, Biochem & Mol Biol. Int. 44, 157-163; Al-Soud y otros, 2000, J. Clin Microbiol. 38, 4463-4470), y la RT-PCR (documento US2004219595) mientras que la gelatina de pescado servía para estabilizar las composiciones de PCR liofilizadas (documento WO2008155524).

Resumen de la descripción:

La presente descripción se dirige generalmente a composiciones, métodos y kits útiles para la síntesis de ácidos nucleicos. Más específicamente, se proporcionan composiciones, métodos y kits para la amplificación de moléculas de ácido nucleico en un procedimiento de PCR o RT-PCR de un solo paso mediante el uso de una o más transcriptasas inversas, tales como la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MLV), en combinación con una o más ADN polimerasas, tales como la ADN polimerasa de Thermophilus aquaticus (Taq). Las composiciones comprenden además uno o más agentes usados para aumentar la tolerancia (es decir, bloquear o aliviar la inhibición de la PCR) a una variedad de compuestos que se encuentran a menudo en muestras de las que se extraen ácidos nucleicos, especialmente ácidos nucleicos virales (por ejemplo, heces, sangre, suelo, etc). Dichos agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR son la albúmina de suero bovino (BSA) y la gelatina de pescado. Las presentes enseñanzas facilitan por tanto la amplificación rápida y eficiente de moléculas de ácido nucleico y la detección y cuantificación de secuencias objetivo que pueden usarse para una variedad de fines industriales, médicos, forenses y de diagnóstico. Las modalidades descritas en la presente descripción son especialmente útiles para la amplificación y detección rápida de genes virales, lo que incluye tanto objetivos de ARN como de ADN.

En particular, la presente invención se refiere a un método para amplificar una molécula de ácido nucleico a partir de una muestra biológica extraída de una fuente que puede comprender uno o más inhibidores de la PCR, el método comprende:

mezclar una plantilla de ácido nucleico con una

composición que comprende una o más ADN polimerasas, y una combinación de agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR que consisten esencialmente en gelatina de pescado y albúmina de suero bovino (BSA), para formar una mezcla de reacción, en donde la combinación de agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR aumenta la tolerancia a los uno o más inhibidores de la PCR si están presentes en la muestra biológica; y amplificar una molécula de ácido nucleico complementaria a la totalidad o una parte de la plantilla de ácido nucleico; en donde la gelatina de pescado está a una concentración de 0,2 % p/v-4,0 % p/v y

en donde la BSA está a una concentración de aproximadamente 500 ng/pL a 6000 ng/pL.

La composición puede comprender una o más transcriptasas inversas que pueden ser termoestables. Por ejemplo, las transcriptasas inversas termoestables pueden ser transcriptasas inversas de M-MLV, mutantes, variantes o derivados de las mismas. En algunas modalidades, las RT de M-MLV pueden comprender una o más mutaciones. Dichas mutaciones pueden incluir, por ejemplo: Y64, R116, D124, H126, Y133, K152, Q190, T197, H204, V223, M289, T306 o F309. En algunas modalidades, la concentración de la(s) transcriptasa(s) inversa(s) está entre aproximadamente 0,5 U/pL a aproximadamente 5 U/pL.

En algunas modalidades, las polimerasas de las presentes composiciones son ADN polimerasas. En algunas modalidades preferidas, las ADN polimerasas son ADN polimerasas termoestables. Por ejemplo, las ADN polimerasas termoestables pueden ser ADN polimerasas Taq, mutantes, variantes o derivados de las mismas. En algunas modalidades, la concentración de la(s) ADN polimerasa(s) está entre aproximadamente 0,005 U/pL a aproximadamente 0,5 U/pL

Los agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR de las presentes composiciones son gelatina de pescado y albúmina de suero bovino (BSA), en donde la concentración de BSA en las presentes composiciones puede ser de aproximadamente 500 ng/pL a aproximadamente 6000 ng/pL. La concentración final de gelatina de pescado en las presentes composiciones es 0,2 % a 4 %.

En algunas modalidades, los inhibidores de la PCR, si están presentes en las composiciones, pueden ser hematina, ácido húmico, heparina, EDTA, citrato de sodio o inmunoglobulina G (IgG).

En algunas modalidades, las presentes composiciones pueden ser un líquido o un gel a -20 °C. En otras modalidades, las composiciones pueden no ser sólidas a aproximadamente -20 °C. En aún otras modalidades, las composiciones pueden no congelarse a aproximadamente -20 °C. En algunas modalidades preferidas, las composiciones no requieren descongelación antes de su uso.

En algunas modalidades, las presentes composiciones pueden comprender además uno o más nucleótidos (dNTP). Dichos nucleótidos pueden ser, por ejemplo, dTTP, dATP, dCTP, dGTP o dUTP. En algunas modalidades, la concentración de cada uno de los nucleótidos en la composición es de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 5 mM.

En algunas modalidades, las presentes composiciones pueden comprender además glicerol. En algunas modalidades, la concentración de glicerol está entre aproximadamente 5 % a aproximadamente 50 %.

En algunas modalidades de las presentes composiciones, las composiciones pueden comprender además proteína inhibidora de ARNasa (RIP). En algunas modalidades, la concentración de RIP está entre aproximadamente 0,1 U/pL a aproximadamente 1,0 U/pL.

En algunas modalidades, las presentes composiciones pueden comprender además uno o más detergentes. En algunas modalidades, la concentración de los uno o más detergentes está entre aproximadamente 0,005 % a aproximadamente 0,05 %. En algunas modalidades, el uno o más detergentes pueden ser catiónicos, zwitteriónicos, aniónicos o no iónicos. En algunas modalidades, los detergentes no iónicos pueden ser, por ejemplo, detergente Nonidet P-40 (NP-40) o detergente TWEEN 20.

En algunas modalidades, las presentes composiciones pueden comprender además uno o más controles de referencia pasivos. En algunas modalidades, el uno o más controles de referencia pasivos pueden ser, por ejemplo, un colorante ROX.

En algunas modalidades, las presentes composiciones pueden formularse como soluciones madre concentradas. En algunas modalidades, dichas soluciones madre concentradas pueden ser una solución madre de aproximadamente 2X a aproximadamente 6X. En algunas modalidades, dichas soluciones madre pueden diluirse para su uso posterior, por ejemplo, en métodos de síntesis de ácidos nucleicos. En algunas modalidades preferidas, las composiciones pueden formularse como una solución madre de al menos 4X.

Las presentes enseñanzas también se dirigen a una composición que comprende

una o más ADN polimerasas, y una combinación de agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR que consisten esencialmente en gelatina de pescado y albúmina de suero bovino (BSA), para formar una mezcla de reacción, en donde la combinación de agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR aumenta la tolerancia al uno o más inhibidores de la PCR si está presente en la muestra biológica; y

amplificar una molécula de ácido nucleico complementaria a la totalidad o a una parte de la plantilla de ácido nucleico;

en donde la gelatina de pescado está a una concentración de 0,2 % p/v-4,0 % p/v, y en donde la BSA está a una concentración de aproximadamente 500 ng/pL a 6000 ng/pL.

En algunas modalidades de los presentes métodos, la muestra de ácido nucleico puede extraerse de fuentes tales como, por ejemplo, sangre, sudor, lágrimas, suelo, saliva, orina o heces.

En algunas modalidades de los presentes métodos, la RT-PCR puede realizarse en un solo recipiente (por ejemplo, tubo, compartimento, pocillo) o en una sola mezcla de reacción.

En algunas modalidades de los presentes métodos, las composiciones que comprenden al menos una transcriptasa inversa, al menos una ADN polimerasa y al menos un agente bloqueador de inhibidores de la PCR se mezclan con (a) una muestra de ácido nucleico; (b) una o más sondas marcadas; o (c) uno o más cebadores. En algunas modalidades de los presentes métodos, la una o más sondas marcadas pueden ser una sonda TaqMan®. En algunas modalidades de los presentes métodos, las composiciones no se descongelan antes de mezclarlas con (a), (b) o (c).

En algunas modalidades de los presentes métodos, el uso de composiciones que comprenden al menos un agente bloqueador de inhibidores de la PCR puede aumentar la tolerancia a diversos inhibidores de la PCR (denominados en la presente descripción "tolerancia al inhibidor"), si están presentes. En algunas modalidades, el aumento de la tolerancia al inhibidor puede indicarse por una disminución del Ct. En algunas modalidades preferidas de los presentes métodos, el Ct disminuye en al menos aproximadamente un 10 % en comparación con los métodos que usan composiciones que no comprenden ningún agente bloqueador de inhibidores de la PCR. En algunas modalidades, el Ct puede disminuirse en al menos 1. En algunas modalidades, el uso de composiciones que comprenden al menos 500 ng/pL de BSA puede disminuir el Ct en al menos 8 para las reacciones que contienen al menos 40 pM de hematina, o en al menos 7 para las reacciones que contienen al menos 10 ng/pL de ácido húmico. En otras modalidades, el uso de composiciones que comprenden al menos 1 % de gelatina de pescado puede disminuir el Ct en al menos 3 para las reacciones que contienen al menos 10 ng/pL de ácido húmico, o en al menos 6 para las reacciones que contienen al menos 0,06 U de heparina.

En otro aspecto, las presentes enseñanzas se dirigen a métodos para amplificar una molécula de ácido nucleico. Los métodos para la amplificación pueden comprender los pasos de: (i) mezclar una plantilla de ácido nucleico con una composición que comprende una o más transcriptasas inversas, una o más ADN polimerasas y uno o más agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR, para formar una mezcla de reacción; e (ii) incubar la mezcla de reacción en condiciones suficientes para amplificar una molécula de ácido nucleico complementaria a la totalidad o a una parte de dicha plantilla de ácido nucleico. En algunas modalidades, la plantilla de ácido nucleico puede ser ARN o ADN.

En algunas modalidades de los presentes métodos, la amplificación de ácidos nucleicos puede realizarse mediante PCR. En algunas modalidades, la PCR puede ser qPCR. En otras modalidades, la qPCR puede realizarse mediante PCR en tiempo real. En otras modalidades, la PCR puede ser PCR de punto final. En algunas otras modalidades, la PCR puede ser PCR en formato múltiple. En aún otras modalidades, la PCR puede comprender ciclos térmicos. En algunas modalidades, el ciclo térmico puede optimizarse para lograr un ciclo térmico rápido.

En otro aspecto, las presentes enseñanzas se dirigen a métodos para la síntesis de ácidos nucleicos. En algunas modalidades, los métodos para la síntesis de ácidos nucleicos pueden comprender: (i) mezclar una o más primeras moléculas de ácido nucleico con una o más transcriptasas inversas, una o más polimerasas y uno o más agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR; e (ii) incubar la mezcla en condiciones suficientes para hacer que una o más segundas moléculas de ácido nucleico sean complementarias a la totalidad o a una parte de una o más primeras moléculas de ácido nucleico. En algunas modalidades, las primeras moléculas de ácido nucleico son moléculas de ARN. En algunas modalidades, la primera y la segunda molécula de ácido nucleico son moléculas de ADN. En otras modalidades, la primera o la segunda molécula de ácido nucleico son moléculas de ADN. En algunas modalidades, los métodos para la síntesis de ácidos nucleicos pueden comprender además incubar una o más primeras moléculas de ácidos nucleicos en condiciones suficientes para hacer que una o más segundas moléculas de ácidos nucleicos sean complementarias a la totalidad o a una parte de una o más primeras moléculas de ácido nucleico.

La invención también describe mezclas de reacción que comprenden: (a) al menos una transcriptasa inversa; (b) al menos una polimerasa; (c) al menos un agente bloqueador de inhibidores de la PCR; y (d) al menos un cebador. En algunas modalidades, la mezcla de reacción puede comprender además una plantilla de ácido nucleico (por ejemplo, ARN o ADN). En aún otras modalidades, las mezclas de reacción pueden comprender además una sonda marcada (por ejemplo, sonda TaqMan®).

La invención también se dirige a kits que comprenden, por ejemplo, en un solo contenedor, una composición que tiene al menos una transcriptasa inversa, al menos una ADN polimerasa y al menos un agente bloqueador de inhibidores de la PCR. En algunas modalidades, la composición puede alojarse en un solo tubo o recipiente. En otras modalidades, la composición puede ser un líquido o un gel (por ejemplo, no sólida o no congelada) a -20 °C.

En algunas modalidades de los presentes kits, las composiciones pueden formularse como soluciones madre 4X. En algunas modalidades preferidas de los kits, las composiciones pueden usarse para métodos de RT-PCR, métodos de síntesis de ácidos nucleicos o métodos de amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, PCR). En algunas modalidades, los métodos de PCR o RT-PCR pueden comprender formato múltiple.

Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada siguiente son solamente ilustrativas y explicativas y no son restrictivas de la invención, como se reivindica.

Breve descripción de los dibujos:

Los dibujos adjuntos, que se incorporan y constituyen una parte de esta memoria descriptiva, muestran varias modalidades ilustrativas de la descripción y, junto con la descripción, sirven para explicar ciertas enseñanzas. El experto en la técnica entenderá que los dibujos que se describen son solo para fines ilustrativos. Los dibujos no pretenden limitar el alcance de las presentes enseñanzas de ninguna manera.

La Figura 1 muestra que la gelatina de pescado es eficaz para aumentar la tolerancia al inhibidor a la inhibición por heparina y ácido húmico. Cuanto mayor sea la concentración de gelatina de pescado usada, más tolerante (es decir, menor el Ct) será la reacción a la inhibición por heparina y ácido húmico.

La Figura 2 muestra que la BSA es eficaz para aliviar la inhibición por ácido húmico y hematina. A 2000 ng/pL de BSA, la inhibición por hematina y ácido húmico se elimina por completo, como se refleja en los valores de Ct comparables con los de los controles negativos (agua).

La Figura 3 muestra que la dRn disminuye con cantidades crecientes de BSA. Sorprendentemente, los valores de dRn para las reacciones de control también disminuyen al aumentar las concentraciones de BSA.

La Figura 4 muestra que la señal de referencia aumenta con cantidades crecientes de BSA.

La Figura 5 muestra que la gelatina de pescado es eficaz para aliviar la inhibición por ácido húmico y heparina (a las concentraciones de inhibidor sometidas a prueba) como lo indican los valores de Ct más bajos.

La Figura 6 muestra que la dRn disminuye gradualmente con cantidades crecientes de gelatina de pescado. Sorprendentemente, los valores de dRn para las reacciones de control también disminuyen al aumentar las concentraciones de gelatina de pescado.

La Figura 7 muestra que el uso de gelatina de pescado y BSA en concentraciones más bajas, cuando se usan juntas, logra niveles comparables o mejores de tolerancia al inhibidor, en comparación con las reacciones que usan gelatina de pescado o BSA individualmente en concentraciones más altas. A modo de ejemplo no limitativo, una combinación de gelatina de pescado al 0,8 % y 500 ng/pL de BSA es más eficaz que usar solo gelatina de pescado al 0,8 % sola para la inhibición por ácido húmico o 500 ng/pL de BSA sola para la inhibición por hematina y ácido húmico. Al usar menos de cada agente inhibidor de la PCR, cuando se combinan, se minimizan la disminución de dRn y el desplazamiento en las señales de referencia.

La Figura 8 muestra que la gelatina de pescado y la BSA, especialmente cuando se combinan, son eficaces para aliviar la inhibición de diversos inhibidores, lo que incluye la inhibición por hematina, heparina, ácido húmico, ^eD^tA, citrato de sodio e inmunoglobulina G.

La Figura 9 muestra una fotografía de un gel teñido con bromuro de etidio que demuestra que las formulaciones que comprenden tanto gelatina de pescado como BSA también pueden usarse para aumentar la tolerancia a diversos inhibidores de la PCR en aplicaciones basadas en PCR.

La Figura 10 muestra que las mezclas maestras de RT-PCR de un solo paso (es decir, composiciones que comprenden tanto transcriptasa(s) inversa(s) como ADN polimerasa(s) en una sola reacción) proporcionan una sensibilidad de ensayo comparable cuando se usan para la amplificación de plantillas de ácido nucleico de ADN o ARN.

La Figura 11 muestra que las mezclas maestras de RT-PCR de un solo paso (es decir, que comprenden tanto transcriptasa(s) inversa(s) como ADN polimerasa(s) en una sola reacción) pueden usarse para ensayos de amplificación en formato múltiples.

La Figura 12 representa el efecto de inhibidores de la PCR comunes sobre la amplificación de adenovirus.

La Figura 13 representa el efecto de inhibidores de la PCR comunes en la amplificación de un ensayo de control positivo interno (IPC) de ARN.

La Figura 14 representa la factibilidad de formato múltiple de la mezcla maestra en la amplificación doble de adenovirus con ⁱP^c.

Descripción detallada:

Descripción general

La presente descripción se dirige a composiciones, métodos y kits para su uso en la producción o análisis de ácidos nucleicos. En particular, las presentes enseñanzas ofrecen varias ventajas en comparación con las composiciones o métodos conocidos para la generación o amplificación de ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante RT-PCR. Estas ventajas incluyen, pero no se limitan a:

a) proporcionar un verdadero procedimiento de "un tubo/un solo paso" para RT-PCR (frente a tener dos reacciones separadas para la síntesis de ADN a partir de una plantilla de ARN y la posterior amplificación del ADN), que elimina los pasos de premezcla o de generación de alícuotas adicional ya que la transcriptasa inversa y la ADN polimerasa están contenidas juntas en la mezcla maestra y los usuarios no tienen que añadir la transcriptasa inversa a la mezcla maestra antes de realizar la RT-PCR;

b) proporcionar composiciones para su uso en la síntesis de ácidos nucleicos (por ejemplo, RT-PCR) que están en forma líquida o de gel (es decir, no sólidas) a -20 °C, lo que elimina los problemas asociados con múltiples ciclos de congelación-descongelación del uso repetido;

c) proporcionar composiciones más concentradas para su uso en la síntesis de ácidos nucleicos (por ejemplo, RT-PCR), que permiten una entrada de muestra de mayor volumen si o cuando las concentraciones de la plantilla de muestra son bajas (lo que es a menudo el caso para objetivos virales o el análisis forense);

d) proporcionar composiciones para su uso en la síntesis de ácidos nucleicos (por ejemplo, RT-PCR) que tienen una mayor tolerancia a diversos inhibidores de la PCR;

e) proporcionar composiciones para su uso en la síntesis de ácidos nucleicos (por ejemplo, RT-PCR) que proporcionan la máxima especificidad y sensibilidad;

f) proporcionar composiciones y métodos de síntesis de ácidos nucleicos (por ejemplo, RT-PCR) que pueden usarse con protocolos de ciclos térmicos rápidos para lecturas más rápidas;

e) proporcionar composiciones y métodos de síntesis de ácidos nucleicos (por ejemplo, RT-PCR) que permitan la capacidad de adaptar a formato múltiple (por ejemplo, amplificar una multiplicidad de objetivos mediante el uso de una sola muestra (por ejemplo, dos objetivos en una muestra) o múltiples muestras (por ejemplo, dos objetivos en dos muestras diferentes) en una sola reacción sustancialmente al mismo tiempo); y

f) proporcionar composiciones y métodos de síntesis de ácidos nucleicos en formato múltiples (por ejemplo, RT-PCR) que permitan la cuantificación e identificación del tipo de ácidos nucleicos (por ejemplo, ácido nucleico oncoviral) en una sola reacción, lo que reduce de esta manera la cantidad de muestra usada así como también reducir los costos y la cantidad de tiempo que lleva obtener resultados.

Composiciones

Las presentes enseñanzas proporcionan composiciones que comprenden una variedad de componentes en diversas combinaciones. Dichos componentes pueden incluir una o más enzimas que tienen actividad de transcriptasa inversa, una o más ADN polimerasas, una combinación de agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR, tales como albúmina de suero bovino (BSA) y gelatina de pescado. Los componentes adicionales también pueden incluir, por ejemplo, uno o más cebadores, uno o más desoxirribonucleósidos trifosfatos, proteínas inhibidoras de ARNasa (RIP), tensioactivos o detergentes (tales como, por ejemplo, TWEEN 20, NP-40 o CHAPS) o uracil ADN glicosilasa (UDG), así como también componentes de tampón de ^pC^radecuados, lo que incluye, pero no se limita a, DMSO, glicerol y Mg2+.

Dichas composiciones pueden formularse como soluciones madre concentradas (por ejemplo, 2X, 3X, 4X, 6X, 10X, etc.) o como soluciones de trabajo (por ejemplo, IX). En algunas modalidades, tener la composición como una solución madre concentrada (por ejemplo, 4X) permite añadir una mayor cantidad de muestra de ácido nucleico (tal como, por ejemplo, cuando las composiciones se usan para la síntesis de ácidos nucleicos). Estas composiciones pueden usarse en los presentes métodos para producir, analizar, cuantificar y de cualquier otra manera manipular moléculas de ácido nucleico mediante el uso de un procedimiento de RT-PCR de un solo paso (o acoplada).

En algunas modalidades, las composiciones de las presentes enseñanzas pueden formularse como mezclas maestras. Las mezclas maestras mejoran la eficiencia y reducen los errores asociados con el ensamblaje de una gran cantidad de reacciones necesarias para el análisis de alto rendimiento. En algunas modalidades, las mezclas maestras pueden contener una combinación de reactivos comunes a todas las reacciones. Por ejemplo, la mezcla maestra puede contener un tampón, una sal, tal como MgCh, desoxinucleósidos trifosfatos (dNTP), un colorante o una sonda marcada, una transcriptasa inversa, una ADN polimerasa termoestable y un agente bloqueador de inhibidores de la PCR. Cada reacción contendría entonces una alícuota de la mezcla maestra común y un par de ácido nucleico objetivo específico y un cebador. Las mezclas maestras pueden fabricarse y distribuirse como una solución concentrada. La mezcla maestra puede diluirse después cuando se ensamblan las reacciones finales.

En algunas modalidades, las presentes composiciones pueden empaquetarse en un contenedor o recipiente adecuado capaz de contener la composición y que no interactuará significativamente con los componentes de la composición. El contenedor o recipiente puede diseñarse para permitir la fácil dispensación de la forma de dosificación por los individuos o mediante un instrumento de manipulación de líquidos. Los contenedores o recipientes de dicha composición pueden empaquetarse posteriormente en unidades de paquetes múltiples.

Transcriptasas inversas

Las composiciones de las presentes enseñanzas pueden comprender polipéptidos que tienen actividad de transcriptasa inversa (es decir, transcriptasas inversas). En algunas modalidades preferidas, los polipéptidos que tienen actividad de transcriptasa inversa son termoestables. Como se usa en la presente descripción, el término "termoestable" se refiere a una enzima que es estable al calor o resistente al calor. Para los fines de esta descripción, un polipéptido termoestable que tiene actividad de transcriptasa inversa también puede definirse como un polipéptido que tiene actividad de transcriptasa inversa que conserva un mayor porcentaje de su actividad después de un tratamiento con calor que el que conserva un polipéptido que tiene actividad de transcriptasa inversa que tiene termoestabilidad de tipo silvestre después de un tratamiento idéntico.

De acuerdo con algunas modalidades, las enzimas que tienen actividad de transcriptasa inversa pueden ser, por ejemplo, transcriptasas inversas retrovirales tales como transcriptasa inversa de M-MLV, transcriptasa inversa del virus del sarcoma de Rous (RSV), transcriptasa inversa del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV), transcriptasa inversa del virus asociado a Rous (RAV), transcriptasa inversa del virus asociado a mieloblastosis (MAV), transcriptasa inversa del virus de la leucosis del sarcoma aviar (ASLV), así como también transcriptasas inversas de lentivirus, o mutantes, variantes o derivados correspondientes de las mismas que tienen actividad de transcriptasa inversa. Como se usa en la presente descripción, "mutantes, variantes o derivados" se refiere a todas las permutaciones de una especie química, que pueden existir o producirse, que aún conservan la actividad química definitiva de esa especie química. Algunas modalidades preferidas incluyen enzimas que son enzimas ARNasa H+ tales como, por ejemplo, transcriptasas inversas ARNasa H+ de M-MLV o ARNasa H+ de AMV. De manera alternativa, las transcriptasas inversas usadas en las presentes composiciones pueden tener una actividad de ARNasa H reducida, sustancialmente reducida o eliminada (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 7,078,208). La ARNasa H es una ribonucleasa procesiva 5' y 3' que es específica para la cadena de ARN de los híbridos ARN-ADN (Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, New York: Wiley & Sons, págs. 23-24 (1984)). La actividad de ARNasa H puede determinarse por una variedad de ensayos, tales como los que se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos núm. 5,244,797, en Kotewicz, y otros, Nucl. Acids Res. 16:265-277 (1988) y en Gerard, y otros, FOCUS (Life Technologies) 14:91-93 (1992).

Pueden usarse enzimas adicionales que tienen actividad de transcriptasa inversa de acuerdo con las presentes enseñanzas, tal como la transcriptasa inversa de Thermus thermophilus (Tth), que tiene actividad de transcriptasa inversa en presencia de Mn2+ y actividad de ADN polimerasa en presencia de Mg2+ (Myers y Gelfand, Biochemistry 30:7661-7666 (1991)). Se han descrito métodos para el aislamiento o purificación de transcriptasas inversas, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos núms. 4,943,531 y 5,017,492. Dichas enzimas también pueden estar disponibles comercialmente (por ejemplo, SUPERSCRIPT II™, SUPERSCRIPT III™ y ArrayScript disponibles en Life Technologies, Carlsbad, CA). Debe entenderse que puede usarse una variedad de transcriptasas inversas en las presentes enseñanzas, lo que incluye las transcriptasas inversas no descritas específicamente anteriormente, sin apartarse del alcance o las modalidades preferidas de las mismas.

De acuerdo con las presentes enseñanzas, puede realizarse cualquier cantidad de mutaciones en las transcriptasas inversas y, en una modalidad preferida, pueden realizarse múltiples mutaciones que den como resultado una mayor estabilidad o funcionalidad de la transcriptasa inversa. Las enzimas para su uso en la presente descripción también pueden incluir aquellas en las que la actividad de desoxinucleotidil transferasa (TdT) terminal se ha reducido, reducido sustancialmente o eliminado. Las transcriptasas inversas que muestran dichas funcionalidades aumentadas o disminuidas se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos núms. 7,056,716 y 7,078,208. En algunas modalidades, dichas transcriptasas inversas mutadas pueden incluir transcriptasas inversas con una o más alteraciones en posiciones de aminoácidos equivalentes o correspondientes a Y64, R116, D124, H126, Y133, K152, Q190, T197, H204, V223, M289, T306 o F309 de transcriptasa inversa de M-MLV. Dichas mutaciones pueden incluir mutaciones puntuales, mutaciones de desplazamiento de marco, eliminaciones e inserciones, donde se prefieren una o más (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, diez, doce, quince, veinte, treinta, etc.) mutaciones puntuales.

Pueden introducirse mutaciones en las transcriptasas inversas de las presentes enseñanzas mediante el uso de cualquier metodología conocida por los expertos en la técnica. En una modalidad, las transcriptasas inversas mutantes o modificadas pueden prepararse mediante técnicas recombinantes. Varios genes de transcriptasa inversa clonados están disponibles o pueden obtenerse mediante el uso de técnicas recombinantes estándar (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 5,668,005 y la publicación PCT núm. WO 98/47912). Por ejemplo, puede usarse la mutagénesis dirigida al sitio de oligonucleótidos para crear una polimerasa mutante que permita todas las clases posibles de cambios de pares de bases en cualquier sitio determinado a lo largo de la molécula de ADN codificante. De manera alternativa, las mutaciones también pueden introducirse aleatoriamente, por ejemplo, al realizar una reacción de PCR en presencia de manganeso como cofactor de iones metálicos divalentes.

Pueden añadirse polipéptidos que tienen actividad de transcriptasa inversa a las presentes composiciones para dar una concentración final en una solución de trabajo de aproximadamente 0,001 U/pL a aproximadamente 500 U/pL, aproximadamente 0,005 U/pL a aproximadamente 100 U/pL, aproximadamente 0,01 U/pL a aproximadamente 50 U/pL, aproximadamente 0,05 U/pL a aproximadamente 20 U/pL, aproximadamente 0,1 U/pL a aproximadamente 10 U/pL, aproximadamente 0,2 U/pL a aproximadamente 5 U/pL, o preferentemente, a una concentración de aproximadamente 0,2 U/pL, aproximadamente 0,4 U/pL, aproximadamente 0,8 U/pL, aproximadamente 1,0 U/pL, aproximadamente 1,2 U/pL, aproximadamente 1,4 U/pL, aproximadamente 1,8 U/pL, aproximadamente 2 U/pL, aproximadamente 3 U/pL, aproximadamente 4 U/pL o aproximadamente 5 U/pL.

Polimerasas

Las composiciones de las presentes enseñanzas también pueden comprender una o más polimerasas. Dichas polimerasas pueden ser cualquier enzima capaz de replicar una molécula de ADN. Preferentemente, las ADN polimerasas son ADN polimerasas termoestables. Las ADN polimerasas termoestables, como se usan en la presente descripción, no se inactivan de forma irreversible cuando se someten a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para efectuar la desestabilización de los ácidos nucleicos monocatenarios o la desnaturalización de los ácidos nucleicos bicatenarios durante la amplificación por PCR. La desnaturalización irreversible de la enzima se refiere a la pérdida sustancial de la actividad enzimática. Preferentemente, una ADN polimerasa termoestable no se desnaturalizará irreversiblemente a aproximadamente 90 °C-100 °C en condiciones tales como las que se requieren típicamente para la amplificación por PCR.

Las ADN polimerasas de acuerdo con las presentes enseñanzas pueden aislarse de fuentes naturales o recombinantes, mediante técnicas que se conocen bien en la técnica (ver, por ejemplo, las publicaciones PCT núms. WO 92/06200; WO 96/10640; patentes de Estados Unidos núms. 5,455,170; 5,912,155; y 5,466,591), de una variedad de bacterias termófilas que están disponibles comercialmente (por ejemplo, en la American Type Culture Collection, Rockville, Md.) o pueden obtenerse mediante técnicas de ADN recombinante (ver, por ejemplo, la publicación PCT núm. WO 96/10640 y la patente de Estados Unidos núm. 5,912,155). Son adecuadas para su uso como fuentes de polimerasas termoestables o los genes de las mismas para la expresión en sistemas recombinantes, por ejemplo, las bacterias termófilas Thermus thermophilus, Thermococcus litoralis, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus woosii y otras especies del género Pyrococcus, Bacillus sterothermophilus, Sulfolobus acidocaldarius, Thermoplasma acidophilum, Thermus flavus, Thermus ruber, Thermus brockianus, Thermotoga neapolitana, Thermotoga marítima y otras especies del género Thermotoga, y Methanobacterium thermoautotrophicum, y mutantes, variantes o derivados de las mismas. Debe entenderse, sin embargo, que las ADN polimerasas de otros organismos también pueden usarse en la presente descripción sin apartarse del alcance o las modalidades preferidas de las mismas. Como alternativa al aislamiento, las ADN polimerasas están disponibles comercialmente en, por ejemplo, Life Technologies (Carlsbad, CA), New England BioLabs (Beverly, ^mA), Finnzymes Oy (Espoo, Finlandia), Stratagene (La Jolla, CA), Boehringer Mannheim Biochemicals (Indianápolis, IN) y Perkin Elmer Cetus (Norwalk CT).

Las ADN polimerasas termoestables particularmente preferidas para su uso en las presentes composiciones y métodos incluyen, pero no se limitan a, ADN polimerasas Taq, Tne, Tma, Tfi/VENT, DEEPVENT, Pfu, Pwo, Tfi o Tth, o mutantes, variantes o derivados de las mismas que tiene actividad de ADN polimerasa. La ADN polimerasa Taq y formas mutantes de la misma están disponibles comercialmente, por ejemplo, en Life Technologies (Carlsbad, CA), o pueden aislarse de su fuente natural, la bacteria termófila Thermus aquaticus, como se describió anteriormente (ver, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núms. 4,889,818 y 4,965,188). La ADN polimerasa puede aislarse de su fuente natural, la bacteria termófila Thermotoga neapolitana (ver, por ejemplo, la publicación PCT núm. WO 96/10640 y la patente de Estados Unidos núm. 5,912,155), y la ADN polimerasa Tma puede aislarse de su fuente natural, la bacteria termófila Thermotoga marítima (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 5,374,553). Debe entenderse que puede usarse una variedad de ADN polimerasas en las presentes composiciones, métodos y kits, lo que incluye las polimerasas no descritas específicamente en la presente descripción, sin apartarse del alcance o las modalidades preferidas de las mismas.

Los métodos para producir mutantes y derivados de ADN polimerasas termófilas, particularmente de polimerasas Tne y Tma se describen, por ejemplo, en las solicitudes de Estados Unidos núms. 08/689,807 y 08/689,818, ambas presentadas el 6 de septiembre de 1996. Tfi, Tli/VENT y DEEPVENT están disponibles comercialmente (por ejemplo, en New England BioLabs; Beverly, MA), o pueden producirse como se describe (Bej y Mahbubani, en: pCr Technology: Current Innovations, Griffin, H. G. y Griffin, A. M., eds., CRC Press, págs. 219-237 (1994) para Tli/VENT; Flaman y otros, Nucl. Acids Res. 22:3259-3260 (1994) para DEEPVENT). Las ADN polimerasas termoestables de la presente invención pueden añadirse a las presentes composiciones para dar una concentración final en una solución de trabajo de aproximadamente 0,0001 U/pL a aproximadamente 50 U/pL, aproximadamente 0,0005 U/pL a aproximadamente 10 U/pL, aproximadamente 0,001 U/pL a aproximadamente 5 U/pL, aproximadamente 0,005 U/pL a aproximadamente 2 U/pL, aproximadamente 0,01 U/pL a aproximadamente 1 U/pL, aproximadamente 0,02 U/pL a aproximadamente 0,5 U/pL, o preferentemente, a una concentración de aproximadamente 0,02 U/pL, aproximadamente 0,04 U/pL, aproximadamente 0,08 U/pL, aproximadamente 0,1 U/pL, aproximadamente 0,12 U/pL, aproximadamente 0,14 U/pL, aproximadamente 0,18 U/pL, aproximadamente 0,2 U/pL, aproximadamente 0,3 U/pL, aproximadamente 0,4 U/pL o aproximadamente 0,5 U/pL.

En algunas modalidades, la concentración de las ADN polimerasas puede determinarse como una relación entre la concentración de las enzimas que tienen actividad de transcriptasa inversa y la concentración de las enzimas que tienen actividad de ADN polimerasa. Por tanto, en algunas composiciones, la relación unitaria entre las enzimas transcriptasas inversas y las enzimas ADN polimerasas puede variar de aproximadamente 500 U/pL a aproximadamente 0,001 U/pL, aproximadamente 250 U/pL a aproximadamente 0,005 U/pL, aproximadamente 100 U/pL a aproximadamente 0,01 U/pL, aproximadamente 50 U/pL a aproximadamente 0,05 U/pL, aproximadamente 25 U/pL a aproximadamente 0,1 U/pL, o preferentemente, aproximadamente 5 U/pL a aproximadamente 0,5 U/pL. Por supuesto, otras relaciones adecuadas de actividades unitarias entre enzimas transcriptasas inversas y ADN polimerasas adecuadas para su uso en las presentes composiciones, métodos y kits serán evidentes para un experto en la técnica.

Agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR

De acuerdo con las presentes enseñanzas, pueden añadirse uno o más agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR a las presentes composiciones para ayudar a superar la inhibición de las reacciones de PCR por una variedad de compuestos que se encuentran a menudo en muestras usadas para la preparación, aislamiento o purificación de ácidos nucleicos. Dichos inhibidores incluyen, por ejemplo, heparina (sangre); hematina (sangre); e DtA (sangre); citrato (sangre); inmunoglobulina G (sangre, suero); ácido húmico (suelo, heces); lactoferrina (leche, saliva, otros fluidos secretores); urea (orina); polisacáridos vegetales (plantas); melanina (piel, cabello); mioglobina (tejido); y colorante índigo (textiles). La adición de agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR, tanto individualmente como en combinación, puede aumentar la tolerancia a dichos contaminantes inhibidores de la PCR. Por tanto, las presentes composiciones pueden comprender además agentes que funcionan solos o en combinación para aumentar la tolerancia a diversos inhibidores de la PCR, lo que incluye, por ejemplo, ácido húmico, hematina y heparina.

Dichos agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR para su uso en las presentes enseñanzas pueden incluir proteínas tales como, pero no limitadas a, albúmina (por ejemplo, albúmina de suero bovino (BSA), BSA recombinante y albúminas derivadas de otras especies), gelatina (por ejemplo, gelatina recombinante humana, gelatina de pescado y gelatinas derivadas de otras especies), y proteínas de unión al ADN (por ejemplo, gen 32 del fago T4 (T4gP32)), o variantes, fragmentos o derivados peptídicos o polipeptídicos de las mismas. Otros agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR no basados en proteínas para su uso en las presentes enseñanzas incluyen, por ejemplo, mesilato de deferoxamina. Algunas proteínas preferidas para uso como agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR incluyen albúmina de suero bovino (BSA), gelatina de pescado y proteínas T4gP32. Particularmente preferidas para su uso en las presentes composiciones y métodos son las combinaciones de los agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR, BSA y gelatina de pescado.

En algunas modalidades, la gelatina de pescado es eficaz para reducir la inhibición de la PCR por al menos ácido húmico y heparina, y la BSA es eficaz para reducir la inhibición de la PCR por al menos ácido húmico y hematina. En algunas modalidades, este fenómeno se demuestra por valores de Ct más bajos. Como se usa en la presente descripción, el término "Ct" o "valor de Ct" se refiere al ciclo umbral y significa el ciclo de un ensayo de amplificación por PCR en el que la señal de un indicador que indica la generación del amplicón (por ejemplo, fluorescencia) primero se vuelve detectable por encima de un nivel de fondo. En algunas modalidades, el ciclo umbral o "Ct" es el número de ciclos al cual la amplificación por PCR se vuelve exponencial.

De acuerdo con diversas modalidades, un valor de Ct puede determinarse mediante el uso de una derivada de una curva de PCR. Por ejemplo, puede realizarse un método de derivada de primer, segundo o n-ésimo orden en una curva de PCR para determinar un valor de Ct. En diversas modalidades, puede usarse una característica de una derivada en la determinación de un valor de Ct. Dichas características pueden incluir, pero no se limitan a, una inflexión positiva de una segunda derivada, una inflexión negativa de una segunda derivada, un cruce por cero de la segunda derivada o una inflexión positiva de una primera derivada. En diversas modalidades, puede determinarse un valor de Ct mediante el uso de un método de umbralización y creación de línea de base. Por ejemplo, puede establecerse un límite superior para una fase exponencial de una curva de PCR mediante el uso de un método de derivada, mientras que puede determinarse una línea base para una curva de PCR para establecer un límite inferior para una fase exponencial de una curva de PCR. A partir de los límites superior e inferior de una curva de PCR, puede establecerse un valor de umbral a partir del cual se determina un valor de C^t. Otros métodos para la determinación de un valor de Ct incluyen, pero no se limitan a, diversas modalidades de un método de punto de ajuste y diversas modalidades de un método sigmoidal (ver, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núms. 6,303,305; 6,503,720; 6,783,934; 7,228,237 y la publicación de solicitud de Estados Unidos núm. 2004/0096819).

En algunas modalidades, cuanto mayor sea la concentración de BSA usada, más tolerante es la reacción a la inhibición por hematina y ácido húmico. Sin embargo, en algunas modalidades con cantidades crecientes de BSA, la dRn disminuye y aumenta el valor de referencia (o señal de fondo). Como se usa en la presente descripción, el término "dRn" o "delta Rn" se refiere a la diferencia en la señal indicadora normalizada (Rn) restada de la señal de fondo (línea de base) que después se normaliza mediante una señal de referencia pasiva. Delta Rn puede determinarse mediante la fórmula [Rn⁺- Rn-], donde Rn⁺es el valor de Rn para una reacción que involucra a todos los componentes, lo que incluye la plantilla, y Rn^'es el valor para una muestra sin reaccionar.

Sorprendentemente, mediante el uso combinado de dichos agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR, tales como gelatina de pescado y BSA, se mejora el nivel de tolerancia al inhibidor sin una reducción significativa en el rendimiento de la PCR. Esta propiedad permite el uso de una cantidad menor de cada agente, cuando se combinan, para lograr el mismo nivel de tolerancia al inhibidor en comparación con el uso de cualquiera de los agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR individualmente, lo que maximiza por tanto la tolerancia (como lo demuestra un Ct más bajo), y minimiza la reducción de dRn y el aumento de los valores de referencia. Por tanto, la adición de agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR, lo que incluye, pero no se limita a, gelatina de pescado, BSA o combinaciones de los mismos, es eficaz para aliviar o eliminar la inhibición por una variedad de inhibidores de la PCR que se encuentran típicamente en las muestras usadas para el análisis de ácidos nucleicos.

Pueden añadirse compuestos o agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR a las presentes composiciones para dar una concentración final en una solución de trabajo de aproximadamente 1 ng/pL a aproximadamente 10 000 ng/pL, aproximadamente 50 ng/pL a aproximadamente 8000 ng/pL, aproximadamente 100 ng /pL a aproximadamente 6000 ng/pL, aproximadamente 200 ng/pL a aproximadamente 3000 ng/pL, o preferentemente, de aproximadamente 500 ng/pL a aproximadamente 1000 ng/pL. Los agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR también pueden añadirse como un porcentaje de la concentración final en una solución de trabajo, por ejemplo, de aproximadamente 0,001 % a aproximadamente 15 %, de aproximadamente 0,05 % a aproximadamente 10 %, de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 5 %, o preferentemente, de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 1 %.

En algunos aspectos, los agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR pueden reducir la cantidad de inhibición de la PCR por dichos inhibidores de la PCR en al menos 1 a 100 % en comparación con el nivel de inhibición observado en ausencia de dichos agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR. Por ejemplo, la inhibición se puede reducir en al menos aproximadamente 1 %, aproximadamente 2 %, aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 100 % o cualquier porcentaje intermedio.

Nucleótidos

Las composiciones de las presentes enseñanzas pueden comprender además uno o más nucleótidos (por ejemplo, desoxinucleósidos trifosfatos (dNTP)). Los componentes nucleotídicos de las presentes composiciones sirven como "bloques de construcción" para los ácidos nucleicos recién sintetizados, y se incorporan en ellos por la acción de las transcriptasas inversas o las ADN polimerasas. Los ejemplos de nucleótidos adecuados para su uso en las presentes composiciones incluyen, pero no se limitan a, dUTP, dATP, dTTP, dCTP, dGTP, dITP, 7-deaza-dGTP, a-thio-dATP, athio-dTTP, a-thio-dGTP, a-thio-dCTP o derivados de los mismos, todos los cuales están disponibles comercialmente de fuentes, lo que incluye Life Technologies (Carlsbad, CA), New England BioLabs (Beverly, MA) y Sigma Chemical Company (Saint Louis, MO). Dichos dNTP pueden no estar marcados o pueden estar marcados de forma detectable al acoplarlos mediante métodos conocidos en la técnica con radioisótopos (por ejemplo, 3H, 14C, 32P o 35S), vitaminas (por ejemplo, biotina), restos fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rodamina, rojo Texas o ficoeritrina), marcadores quimioluminiscentes, dioxigenina (DIG) y similares. Los dNTP marcados también pueden obtenerse comercialmente, por ejemplo, en Life Technologies (Carlsbad, CA) o Sigma Chemical Company (Saint Louis, MO).

Los ejemplos específicos de nucleótidos marcados con fluorescencia incluyen [R6G]dUTP, [TAMRA]dUTP, [R110]dCTP, [R6G]dCTP, [TAMRA]dCTP, [JOE]ddATP, [R6G]ddATP, [FAM]ddCTP, [R110]ddCTP, [TAMRA]ddGTP, [ROX]ddTTP, [dR6G]ddATP, [dR110]ddCTP, [dTAMRA]ddGTP y [dROX]ddTTP, disponibles en Life Technologies, Foster City, CA. Desoxinucleótidos FluoroLink™, FluoroLink Cy3-dCTP, FluoroLink Cy5-dCTP, FluoroLink Fluor X-dCTP, FluoroLink Cy3-dUTP y FluoroLink Cy5-dUTP disponibles en Amersham Arlington Heights, IL; Fluoresceína-15-dATP, Fluoresceína-12-dUTP, Tetrametil-rodamina-6-dUTP, IR.sub.770-9-dATP, Fluoresceína-12-ddUTP, Fluoresceína-12-UTP y Fluoresceína-15-2'-dATP disponibles en Boehringer Mannheim Indianápolis, IN; y nucleótidos marcados ChromaTide™, BODIPY-FL-14-UTP, BODIPY-FL-4-UTP, BODIPY-TMR-14-UTP, BODIPY-TMR-14-dUTP, BODIPY-TR-14-UTP, BODIPY-TR-14-dUTP, azul Cascade-7-UTP, azul Cascade-7-dUTP, fluoresceína-12-UTP, fluoresceína-12-dUTP, verde de Oregón 488-5-dUTP, verde rodamina-5-UTP, verde rodamina-5-dUTP, tetrametilrodamina-6-UTP, tetrametilrodamina-6-dUTP, rojo Texas-5-UTP, rojo Texas-5-dUTP y rojo Texas-12-dUTP disponibles en Molecular Probes, Eugene, OR. Los marcadores de DIG incluyen digoxigenina-11-UTP disponible en Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN, y los marcadores de biotina incluyen biotina-21-UTP y amino-7-dUTP disponible en Clontech, Palo Alto, CA. El término nucleótido incluye nucleótidos modificados. Muchos ejemplos de nucleótidos modificados se describen en la patente de Estados Unidos 6,200,757 ().

En algunas modalidades de las presentes composiciones, pueden añadirse dNTP para dar una concentración final en una solución de trabajo de cada dNTP de aproximadamente 0,001 mM a aproximadamente 100 mM, aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 10 mM, aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 1 mM, o preferentemente, de aproximadamente 0,2 mM a aproximadamente 0,6 mM.

Cebadores

Además de los nucleótidos, las presentes composiciones pueden comprender uno o más cebadores que facilitan la síntesis de una primera molécula de ADN complementaria a la totalidad o a una parte de una plantilla de ARN (por ejemplo, una molécula de ADNc monocatenario). Dichos cebadores también pueden usarse para sintetizar una molécula de ADN complementaria a la totalidad o a una parte de la primera molécula de ADN, lo que forma de esta manera una molécula de ADNc bicatenario. Adicionalmente, estos cebadores pueden usarse para amplificar moléculas de ácido nucleico de acuerdo con las presentes enseñanzas. Los cebadores oligonucleotídicos pueden ser cualquier oligonucleótido de dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 10, 20, etc.) nucleótidos de longitud. Dichos cebadores incluyen, pero no se limitan a, cebadores específicos de objetivo (que son, preferentemente, cebadores específicos de genes), cebadores oligo (dT), cebadores aleatorios o cebadores arbitrarios. Cebadores adicionales que pueden usarse para la amplificación de las moléculas de ADN de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción serán evidentes para los expertos en la técnica. Debe entenderse que una amplia gama de cebadores puede ser útil en las presentes composiciones, métodos y kits, lo que incluye los que no se describen específicamente en la presente descripción, sin apartarse del alcance o las modalidades preferidas de los mismos.

En algunas modalidades de las composiciones descritas, la concentración final de cebadores en una solución de trabajo puede variar de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 2000 nM, tal como de aproximadamente 50 nM a 1700 nM, aproximadamente 75 nM a 1500 nM, aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1200 nM, aproximadamente 200 nM a aproximadamente 1000 nM, o cualquier intervalo intermedio. En algunas modalidades ilustrativas, la concentración de los cebadores está entre aproximadamente 400 nM a aproximadamente 900 nM.

Sondas

De acuerdo con las presentes enseñanzas, las composiciones pueden comprender además sondas para la detección de ácidos nucleicos objetivo. Se conocen en la técnica diversas sondas, por ejemplo, las sondas TaqMan® (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 5,538,848) diversas balizas moleculares de tallo-lazo (ver, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núms. 6,103,476 y 5,925,517 y Tyagi y Kramer, Nature Biotechnology 14:303-308 (1996)), las balizas sin tallo o lineales (ver, por ejemplo, la publicación PCT núm. WO 99/21881), las PNA Molecular Beacons™ (ver, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núms. 6,355,421 y 6,593,091), las balizas de PNA lineales (ver, por ejemplo, Kubista y otros, Proceedings in SPIE 4264:53-58 (2001)), las sondas que no son de FRET (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 6,150,097), las sondas Sunrise®/Amplifluor® (patente de Estados Unidos núm.

6,548,250), las sondas de tallo-lazo y dobles Scorpion™ (ver, por ejemplo, Solinas y otros, Nucleic Acids Research 29:E96 (2001) y la patente de Estados Unidos núm. 6,589,743), las sondas de lazo abultado (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 6,590,091), las sondas de pseudonudo (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 6,589,250), los ciclicones (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 6,383,752), las sondas MGB Eclipse™ (Epoch Biosciences, Bothell, WA), las sondas en horquilla (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 6,596,490), las sondas light-up de ácido nucleico peptídico (PNA), las sondas de nanopartículas autoensambladas y las sondas modificadas con ferroceno que se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos núm. 6,485,901; Mhlanga y otros, Methods 25:463-471 (2001); Whitcombe y otros, Nature Biotechnology, 17:804-807 (1999); Isacsson y otros, Molecular Cell Probes 14:321-328 (2000); Svanvik y otros, Anal. Biochem. 281:26-35 (2000); Wolffs y otros, Biotechniques 766:769-771 (2001); Tsourkas y otros, Nucleic Acids Research 30:4208-4215 (2002); Riccelli y otros, Nucleic Acids Research 30:4088-4093 (2002); Zhang y otros, Shanghai 34:329-332 (2002); Maxwell y otros, J. Am. Chem. Soc. 124:9606-9612 (2002); Broude y otros, Trends Biotechnol. 20:249-56 (2002); Huang y otros, Chem Res. Toxicol. 15:118-126 (2002); y Yu y otros, J. Am. Chem. Soc. 14:11155-11161 (2001). Las sondas pueden comprender colorantes indicadores tales como, por ejemplo, 6-carboxifluoresceína (6-FAM) o tetraclorofluorescina (TET) y similares. Las sondas detectoras también pueden comprender restos inactivadores tales como tetrametilrodamina (TAMRA), inactivadores Black Hole (Biosearch Technologies, Novato, CA), Iowa Black (IDT, Coralville, IA), inactivador QSY (Molecular Probes, Eugene, OR) e inactivadores de sulfonato/carboxilato DABSYL y DABCEL (Epoch Biosciences, Bothell, WA) y similares. La sondas también pueden comprender dos sondas, en donde, por ejemplo, un fluoróforo está en una sonda y un inactivador en la otra, en donde la hibridación de las dos sondas juntas en un objetivo inactiva la señal, o en donde la hibridación en un objetivo altera la firma de la señal a través de un cambio en la fluorescencia.

Los marcadores detectables ilustrativos incluyen, por ejemplo, un colorante fluorescente o fluoróforo (por ejemplo, un grupo químico que puede excitarse por la luz para emitir fluorescencia o fosforescencia), los "colorantes aceptores" capaces de inactivar una señal fluorescente de un colorante donante fluorescente, y similares. Los marcadores detectables adecuados pueden incluir, por ejemplo, fluoresceínas (por ejemplo, 5-carboxi-2,7-diclorofluoresceína; 5-carboxifluoresceína (5-FAM); 5-HAT (hidroxitriptamina); 6-HAT; 6-^jO^e; 6-carboxifluoresceína (6-FAM); FITC); Alexa Fluor (por ejemplo, 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 635, 647, 660, 680, 700, 750); fluoróforos BODIPY® (por ejemplo, 492/515, 493/503, 500/510, 505/515, 530/550, 542/563, 558/568, 564/570, 576/589, 581/591, 630/650-X, 650/665-X, 665/676, FL, FL ATP, FI-Ceramida, R6G SE, TMR, conjugado de TMR-X, TMR-X, SE, TR, TR ATP, TR-X SE), cumarinas (por ejemplo, 7-amino-4-metilcumarina, AMC, AMCA, AMCA-S, AMCA-X, ABQ, metilcumarina CPM, cumarina de faloidina, hidroxicumarina, CMFDA, metoxicumarina), calceína, calceína AM, azul calceína, colorantes de calcio (por ejemplo, calcio carmesí, verde calcio, naranja calcio, blanco calcofluor), azul Cascade, amarillo Cascade; colorantes CyTM (por ejemplo, 3, 3.18, 3.5, 5, 5.18, 5.5, 7), GFP cian, fluorosensor AMP cíclico (FiCRhR), proteínas fluorescentes (por ejemplo, proteína fluorescente verde (por ejemplo, GFP. EGFP), proteína fluorescente azul (por ejemplo, BFP, EBFP, EBFP2, Azurite, mKalamal), proteína fluorescente ciano (por ejemplo, ECFP, Cerulean, CyPet), proteína fluorescente amarilla (por ejemplo, YFP, Citrine, Venus, YPet), pares donante/aceptor de FRET (por ejemplo, fluoresceína/tetrametilrodamina, IAEDANS/fluoresceína, EDANS/dabcilo, fluoresceína/fluoresceína, BODIPY® FL/^bO^dIPY® FL, Fluoresceína/QSY7 y QSY9), LysoTracker y LysoSensor (por ejemplo, Azul DND-22 LysoTracker, Azul-Blanco DPX LysoTracker, Amarillo HCK-123LysoTracker, Verde DND-26 LysoTracker, Rojo DND-99 LysoTracker, Azul DND-167 LysoSensor, Verde DND-189 LysoSensor, Verde DND-153 LysoSensor, Amarillo/Azul DND-160 LysoSensor, LysoSensor Amarillo/Azul dextrano de P^m10000), verde de Oregón (por ejemplo, 488, 488-X, 500, 514); rodaminas (por ejemplo, 110, 123, B, B 200, BB, BG, B extra, 5-carboxitetrametilrodamina (5-T^aMRA), 5 GLD, 6-carboxirrodamina 6G, lisamina, lisamina rodamina B, falicidina, faloidina, rojo, Rhod-2, 5-ROX (carboxi-X-rodamina), sulforrodamina B can C, sulforrodamina G Extra, tetrametilrodamina (TRITC), WT), rojo Texas, rojo Texas-X, VIC y otros marcadores descritos en, por ejemplo, la publicación de Estados Unidos núm. 2009/0197254), entre otros, como conocerá el experto en la técnica.

En algunas modalidades, las sondas se diseñan de acuerdo con los métodos y principios descritos en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 6,727,356. Algunas sondas pueden estar basadas en secuencias, por ejemplo, sondas de nucleasa 5' y algunas, tales como SYBR® Green, pueden ser colorantes de unión a ADN no específicos de secuencia. En algunas modalidades preferidas, la sonda detectora es una sonda TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA). Debe entenderse que se conoce en la técnica una amplia variedad de sondas que pueden usarse en las presentes composiciones, métodos y kits, lo que incluye las que no se describen específicamente en la presente descripción.

En algunas modalidades de las composiciones descritas, la concentración final de la sonda en una solución de trabajo puede variar de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 750 nM, tal como de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 600 nM, aproximadamente 25 nM a aproximadamente 500 nM, aproximadamente 50 nM a aproximadamente 400 nM, aproximadamente 75 nM a aproximadamente 300 nM, o cualquier número intermedio. En algunas modalidades ilustrativas, la concentración de la sonda está entre aproximadamente 100 nM a aproximadamente 250 nM.

Componentes adicionales/aditivos

Se conocen en la técnica otros aditivos capaces de facilitar o potenciar la transcripción inversa, la amplificación o una combinación de ambas reacciones (por ejemplo, agentes para facilitar o potenciar la RT-PCR), distintos de los descritos en la presente descripción. De acuerdo con las presentes composiciones y métodos, pueden incorporarse uno o más de estos aditivos en las presentes composiciones para optimizar la generación y replicación de ácidos nucleicos a partir de plantillas de ácido ribonucleico o ácido desoxirribonucleico. Los aditivos pueden ser compuestos orgánicos o inorgánicos. Algunos aditivos útiles en las presentes composiciones, métodos y kits incluyen polipéptidos así como también aditivos no polipeptídicos. Dichos aditivos pueden incluir, por ejemplo, proteína inhibidora de ARNasa (RIP), uracilo ADN glicosilasa (UDG), lectinas, proteína de unión monocatenaria (SSB) de E. coli, ARNt, ARNr, 7-deaza-2'-desoxiguanosina (dC7GTP), compuestos que contienen azufre, compuestos que contienen acetato, dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol, formamida, betaína, cloruro de tetrametilamonio (TMAC), polietilenglicol (PEG), diversos tensioactivos o, en general, cualquier detergente zwitteriónico, catiónico, aniónico o no iónico (por ejemplo, TWEEN 20, NP-40, Tritin X-100 y CHAPS), ectoína, azida de sodio, kathon y polioles, por nombrar solo algunos. Los expertos en la técnica podrán identificar aditivos adicionales para su uso de acuerdo con las presentes composiciones, métodos y kits.

Las composiciones y métodos de acuerdo con las presentes enseñanzas también pueden incluir componentes o etapas de PCR de "arranque en caliente" adicionales, como un medio para prevenir, reducir o eliminar aún más la síntesis de ácidos nucleicos no específicos. El término "arranque en caliente", como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier forma modificada de PCR que evita la amplificación no específica del ADN al inactivar la actividad polimerasa a temperaturas de hibridación más bajas y reactivar o activar la actividad polimerasa a temperaturas más altas durante la fase de extensión. Muchos mecanismos de arranque en caliente se conocen bien por los expertos en la técnica y serán fácilmente seleccionables basado en su capacidad para funcionar de acuerdo con las presentes enseñanzas. En algunas modalidades, los componentes de arranque en caliente que pueden añadirse opcionalmente a las presentes composiciones pueden incluir, por ejemplo, un anticuerpo o anticuerpos, cebadores especialmente diseñados, oligonucleótidos competitivos o aptámeros, proteínas de unión a polimerasa o perlas de secuestro. Perlas de cera de secuestro para la PCR de arranque en caliente están disponibles comercialmente, por ejemplo, AmpliWax® PCR Gem 100 y AmpliWax® PCR Gem 50 (Applied Biosystems, Foster City, CA). La selección de un aptámero adecuado puede realizarse mediante un método conocido en la técnica o puede usarse un aptámero disponible comercialmente. De manera similar, la selección de un cebador adecuado puede realizarse mediante un método conocido en la técnica o puede usarse un cebador disponible comercialmente. En algunos casos, un cebador adecuado puede ser un cebador especialmente diseñado para tener estructuras secundarias que impidan que los cebadores se hibriden hasta que las temperaturas cíclicas los desnaturalicen. Los anticuerpos para la PCR de arranque en caliente pueden generarse o seleccionarse mediante un método conocido en la técnica. De manera alternativa, puede usarse un anticuerpo comercialmente disponible, por ejemplo, el anticuerpo TaqStart® (Clontech, Mountain View, CA) que es eficaz con cualquier ADN polimerasa derivada de Taq, lo que incluye mutantes de eliminación nativos, recombinantes, y N-terminales. Puede determinarse una concentración apropiada del reactivo para la PCR de arranque en caliente en la PCR ensamblada mediante un método conocido en la técnica o, para un producto comercial, como lo sugiera el fabricante. Se conocen en la técnica otros ejemplos de componentes o mecanismos de arranque en caliente usados para este fin (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 6,403,341 y la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2009/0269766).

Las composiciones y métodos de acuerdo con las presentes enseñanzas también pueden incluir un control de referencia pasivo. En algunas modalidades, el control de referencia pasivo se usa para minimizar las variaciones de muestra a muestra o de pocillo a pocillo en ensayos cuantitativos de detección de ácidos nucleicos en tiempo real y puede incluirse en una concentración que permita su uso como control detectable. En una modalidad, se incluye un cromóforo de referencia, específicamente un fluoróforo, como el control de referencia pasivo. En una modalidad, el cromóforo de referencia es el colorante ROX (Invitrogen, Carlsbad, CA). En una modalidad, ROX puede incluirse en la composición a una concentración en una solución de trabajo de aproximadamente 40 nM a aproximadamente 80 nM, específicamente, aproximadamente 60 nM.

Debe entenderse que pueden ser útiles en las presentes composiciones, métodos y kits, una amplia variedad de componentes adicionales conocidos en la técnica, lo que incluye aquellos que no se describen específicamente en la presente descripción. Los expertos en la técnica también comprenderán los métodos necesarios para determinar las condiciones o concentraciones particulares para el uso de cada componente de acuerdo con las presentes enseñanzas.

Tampones y sales

Para formar las composiciones de las presentes enseñanzas, se mezclan, preferentemente, una o más transcriptasas inversas y una o más ADN polimerasas en una solución salina tamponada. De acuerdo con las enseñanzas, los agentes tampón o las soluciones salinas usadas en las presentes composiciones y mezclas de reacción proporcionan condiciones iónicas y de pH apropiadas para mantener la estabilidad de las enzimas que tienen actividad de transcriptasa inversa o actividad de ADN polimerasa. Los términos "estable" y "estabilidad", como se usan en la presente descripción, significan generalmente la retención por parte de una composición, tal como una composición enzimática, de al menos el 70 %, preferentemente, al menos el 80 % y, con la máxima preferencia, al menos el 90 %, de la actividad enzimática original (en unidades) después de que la enzima o la composición que contiene la enzima se ha almacenado durante aproximadamente 3 días a una temperatura de aproximadamente temperatura ambiente (por ejemplo, de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 25 °C), aproximadamente una semana a una temperatura de aproximadamente 4 °C, aproximadamente dos a seis meses a una temperatura de aproximadamente -20 °C, y aproximadamente seis meses o más a una temperatura de aproximadamente -80 °C. Los ejemplos de dichos agentes tampones pueden incluir, por ejemplo, TRIS, TRICINE, BIS-TRICINE, HEPES, MOPS, TES, TAPS, PIPES y CAPS. Los ejemplos de dichas soluciones salinas pueden incluir, por ejemplo, cloruro de potasio, acetato de potasio, sulfato de potasio, sulfato de amonio, cloruro de amonio, acetato de amonio, cloruro de magnesio, acetato de magnesio, sulfato de magnesio, cloruro de manganeso, acetato de manganeso, sulfato de manganeso, cloruro de sodio, acetato de sodio, cloruro de litio y acetato de litio. Debe entenderse que se conoce en la técnica una amplia variedad de tampones y soluciones salinas que pueden usarse en las presentes composiciones, métodos y kits, lo que incluye aquellos que no se describen específicamente en la presente descripción.

En algunas modalidades, las composiciones pueden proporcionarse como una solución madre concentrada. Como se usa en la presente descripción, el término "solución madre concentrada" significa una concentración que requiere una dilución adicional para lograr una concentración óptima para su uso en una solución para realizar una función particular (tal como la transcripción inversa de ácidos nucleicos). Como se usa en la presente descripción, "solución de trabajo" puede usarse para referirse a la solución que tiene una concentración óptima para realizar una función particular. Por ejemplo, las composiciones de las presentes enseñanzas pueden ser soluciones madre de aproximadamente 2X, aproximadamente 3X, aproximadamente 4X, aproximadamente 5X, aproximadamente 6X, aproximadamente 10X, etc. En algunas modalidades preferidas, las composiciones pueden requerir una dilución superior a 2X, superior a 3X, superior a 4X, superior a 5X, superior a 6X, superior a 10X, etc., para estar en la concentración de trabajo u óptima para su uso en métodos de síntesis de ácidos nucleicos.

Muestras de ácido nucleico

Las muestras de ácido nucleico adecuadas para su uso de acuerdo con las presentes enseñanzas pueden incluir cualquier cantidad de una o más moléculas de ácido nucleico. En algunas modalidades, dichas moléculas de ácido nucleico pueden ser moléculas de ácido nucleico extracelulares. En otras modalidades, dichas moléculas de ácido nucleico pueden derivarse de células. En general, dichas células pueden incluir, por ejemplo, cualquier célula procariota, eucariota o vegetal. Dichas células pueden ser células normales, células enfermas, células transformadas, células establecidas, células progenitoras, células precursoras, células fetales, células embrionarias, células bacterianas, células de levadura, células animales (lo que incluye células humanas), células aviares, células vegetales y similares, o de tejido aislado de una planta o un animal (por ejemplo, ser humano, vaca, cerdo, ratón, oveja, caballo, mono, canino, felino, rata, conejo, pájaro, pez, insecto, etc.). En algunas modalidades preferibles, las moléculas de ácido nucleico también pueden aislarse de virus. De acuerdo con los presentes métodos, dichas muestras de ácido nucleico pueden extraerse de una variedad de fuentes. Estas incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, ropa, tierra, piel, cabello, sangre, suero, heces, leche, saliva, orina u otros fluidos secretores. Estas fuentes también pueden contener compuestos que inhiben la amplificación por PCR.

De acuerdo con las presentes enseñanzas, las muestras o plantillas de ácido nucleico pueden ser cualquier ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN) de interés, conocido o desconocido, para el especialista. Las muestras de ácido nucleico pueden sintetizarse artificialmente o aislarse de fuentes naturales. En algunas modalidades preferidas, la muestra de ácido nucleico es monocatenaria. De manera alternativa, la muestra de ácido nucleico puede ser bicatenaria. En algunas modalidades, la muestra de ácido nucleico puede ser ARN mensajero (ARNm), ARN, ADN genómico (ADNg) o ADNc. En la técnica se conocen muchos métodos de preparación o aislamiento de muestras de ácidos nucleicos. Una variedad de kits de preparación o aislamiento de ácidos nucleicos también están disponibles comercialmente, por ejemplo, MagMAX™ (Applied Biosystems, Foster City, CA), iPrep™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) y QIAmp MinElute (Qiagen, San Diego, CA).

Métodos de síntesis de ácidos nucleicos

De acuerdo con las presentes enseñanzas, las composiciones anteriores pueden usarse en métodos para la síntesis de ácidos nucleicos de una o más (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, diez, doce, quince, veinte, etc.) moléculas de ácido nucleico que comprenden mezclar una o más (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, diez, doce, quince, veinte, etc.) plantillas de ácido nucleico. En algunas modalidades, el ARN o el ARNm pueden servir como plantilla para la síntesis de ácidos nucleicos por una o más transcriptasas inversas. De manera alternativa, el ADNc o ADNg pueden servir como plantilla para la síntesis de ácidos nucleicos por una o más polimerasas. En algunas modalidades, dichos métodos pueden comprender incubar la mezcla que comprende una o más transcriptasas inversas o una o más polimerasas en condiciones suficientes para hacer que una molécula o moléculas de ácido nucleico sean complementarias a la totalidad o a una parte de una o más (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, diez, doce, quince, veinte, treinta, etc.) plantillas. Para hacer que la molécula o moléculas de ácido nucleico sean complementarias a una o más plantillas, se usan, preferentemente, un cebador (por ejemplo, un cebador oligo(dT)) y uno o más nucleótidos para la síntesis de ácido nucleico en la dirección 5' a 3'.

Modalidades adicionales proporcionan métodos para amplificar una molécula de ácido nucleico que comprenden poner en contacto la molécula de ácido nucleico con una polimerasa. En algunas modalidades, las reacciones de amplificación simple (es decir, única) se realizan al mismo tiempo en una sola reacción o recipiente. En otras modalidades, las reacciones de amplificación en formato múltiples (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 10, 100, 1000, etc.) se realizan al mismo tiempo en una sola reacción o recipiente. Como se usa en la presente descripción, "en formato múltiple" o "formato múltiple" se refiere a la amplificación o análisis esencialmente simultáneos de múltiples objetivos en una sola reacción. En algunas modalidades, la formato múltiple puede implicar la amplificación de uno o varios objetivos de una o varias entradas de muestra y un objetivo de control exógeno de una plantilla de control exógena dentro del mismo recipiente de reacción (por ejemplo, tubo, compartimento, pocilio). En algunas modalidades preferidas, dichos métodos pueden comprender una o más reacciones en cadena de la polimerasa (PCR). Por ejemplo, dichas reacciones de PCR en formato múltiples pueden comprender la amplificación esencialmente simultánea de más de 1, más de 2, más de 3, más de 5, más de 10, más de 20, más de 50, más de 100, más de 1000, etc., ácidos nucleicos objetivo dentro de la misma reacción.

En algunas modalidades, dichos métodos de PCR pueden ser métodos de amplificación por PCR cuantitativa (qPCR) o de punto final. En algunas modalidades preferidas, dichos métodos de PCR son métodos de amplificación por PCR en tiempo real. En algunas modalidades, dichos métodos de PCR pueden comprender ciclos térmicos, que pueden comprender alternar el calentamiento y el enfriamiento de la mezcla lo suficiente como para amplificar la molécula de ADN y que, con la máxima preferencia, comprenden alternar desde un primer intervalo de temperatura de aproximadamente 90 °C a aproximadamente 100 °C, a un segundo intervalo de temperatura de aproximadamente 45 °C a aproximadamente 75 °C, de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 70 °C, de aproximadamente 55 °C a aproximadamente 65 °C, o preferentemente, a aproximadamente 58 °C, a aproximadamente 59 °C, a aproximadamente 60 °C, a aproximadamente 61 °C o a aproximadamente 62 °C. En algunas modalidades, el ciclo térmico puede realizarse cualquier número de veces, tal como cualquier número superior a aproximadamente 10 veces, superior a aproximadamente 20 veces, superior a aproximadamente 30 veces, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 80 veces, aproximadamente 10 a aproximadamente 70 veces, aproximadamente 20 a aproximadamente 60 veces, o preferentemente, de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 veces. En algunas otras modalidades, el ciclo térmico se puede optimizar para lograr un ciclo térmico rápido. Dichos protocolos y aparatos para ciclos térmicos rápidos pueden encontrarse, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos núm. 6,210,882, o Kopp, y otros, Science 280:1046-1048 (1998); Chiou y otros, Anal. Chem. 73:2018-2021 (2001) (para elementos de calentamiento eléctricos modificados); Kalinina y otros, Nucleic Acids Res. 25:1999-2004 (1997) (para cicladores de aire caliente); y Giordano, y otros, Anal. Biochem. 291:124-132 (2001) (para reacciones controladas por infrarrojos).

Dicho ciclo térmico de PCR puede realizarse en una variedad de instrumentos conocidos por los expertos en la técnica. Algunos instrumentos pueden estar disponibles comercialmente, por ejemplo, en Applied Biosystems (por ejemplo, AB SDS Instruments 7300 Real-Time PCR System, Sistema de PCR en tiempo real 7500, Sistema de PCR en tiempo real rápido 7500, Sistema de PCR en tiempo real 7900HT, Sistema de PCR en tiempo real StepOne y Sistema de PCR en tiempo real StepOne Plus, o Sistema de PCR en tiempo real ViiA 7. Debe entenderse que se conocen en la técnica una amplia variedad de instrumentos que pueden ser útiles en los presentes métodos, lo que incluye aquellos que no se describen específicamente en la presente descripción.

En otras modalidades, las presentes composiciones pueden usarse en métodos para RT-PCR de un solo paso (o acoplada). En algunas modalidades, las mezclas de reacción de RT-PCR se incuban a una temperatura suficiente para sintetizar una molécula de ADN complementaria a la totalidad o a una parte de una plantilla de ARN (por ejemplo, ADNc) y después se incuban a una segunda temperatura suficiente para amplificar las moléculas de ADNc recién sintetizadas. De acuerdo con los presentes métodos, dichas temperaturas usadas para la síntesis de ADNc pueden variar de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 75 °C, aproximadamente 35 °C a aproximadamente 70 °C, aproximadamente 40 °C a aproximadamente 60 °C, o preferentemente, de aproximadamente 45 °C a aproximadamente 55 °C. De acuerdo con los presentes métodos, dichas temperaturas usadas para la amplificación de ADNc pueden variar de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 80 °C, de aproximadamente 45 °C a aproximadamente 75 °C, de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 70 °C, o preferentemente, de aproximadamente 55 °C a aproximadamente 65 °C.

En algunas modalidades de los presentes métodos (lo que incluye, por ejemplo, los métodos para la síntesis de ácidos nucleicos, la amplificación de ácidos nucleicos o la RT-PCR), el uso de al menos un agente bloqueador de inhibidores de la PCR puede aumentar la tolerancia a uno o más inhibidores de la PCR. En algunas modalidades, el aumento de la tolerancia puede indicarse, por ejemplo, por una disminución en el Ct o un aumento de la dRn (por ejemplo, cuando se analiza mediante PCR en tiempo real) o por un aumento en la cantidad de producto amplificado (por ejemplo, cuando se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa).

En algunas modalidades de los presentes métodos, la tolerancia al inhibidor de la PCR (determinada por Ct) puede aumentarse en al menos aproximadamente 10 % (por ejemplo, aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 80 %, etc.) cuando se usa al menos un agente bloqueador de inhibidores de la PCR en comparación con los métodos que no lo hacen. En otras modalidades de los presentes métodos, el valor de Ct se disminuye al menos uno (por ejemplo, al menos 1, al menos 2, al menos 3 al menos 5, al menos 10, etc.) en comparación con el valor de Ct logrado para los métodos que emplean composiciones sin agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR. En otras modalidades, los métodos que utilizan composiciones que comprenden al menos 500 ng/pL de BSA pueden disminuir el Ct en al menos 8 para las reacciones que comprenden al menos 40 pM de hematina, o en al menos 7 para las reacciones que comprenden al menos 10 ng/pL de ácido húmico. En aún otras modalidades, los métodos que utilizan composiciones que comprenden al menos 1 % de gelatina de pescado disminuyen el Ct en al menos 3 para las reacciones que contienen al menos 10 ng/pL de ácido húmico, o en al menos 6 para las reacciones que contienen al menos 0,06 U de heparina.

Kits

En otra modalidad, las presentes composiciones y métodos pueden ensamblarse en kits para su uso en la transcripción inversa o amplificación de una molécula de ácido nucleico. Los kits de acuerdo con esta modalidad pueden comprender un medio portador, tal como una caja, cartón, tubo o similar, que tiene en confinamiento cerrado en él uno o más medios contenedores, tales como viales, tubos, ampollas, placas, botellas y similares, en donde un primer medio contenedor contiene uno o más polipéptidos de las presentes enseñanzas que tienen actividad de transcriptasa inversa y una o más ADN polimerasas. Cuando se usan más de una transcriptasa inversa o ADN polimerasa, pueden estar en un solo contenedor como mezclas de dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, etc.) transcriptasas inversas o ADN polimerasas, o en contenedores separados. Los kits proporcionados en la presente descripción también pueden comprender (en el mismo contenedor o en contenedores separados), un tampón adecuado, uno o más nucleótidos, uno o más agentes bloqueadores de inhibidores de la ^pC^r, una o más sondas o uno o más cebadores. En algunas modalidades preferibles, la(s) transcriptasa(s) inversa(s), la(s) ADN polimerasa(s), el(los) agente(s) bloqueador(s) de inhibidores de la PCR, los nucleótidos y un tampón adecuado se combinan en un único tubo o contenedor.

En una modalidad específica, los kits de transcripción inversa y amplificación pueden comprender uno o más componentes (en mezclas o por separado), lo que incluye uno o más polipéptidos que tienen actividad de transcriptasa inversa y una o más ADN polimerasas. Dichos kits de amplificación y transcripción inversa pueden comprender además uno o más nucleótidos necesarios para la síntesis de una molécula de ácido nucleico, una o más sondas o uno o más cebadores (por ejemplo, oligo(dT) para la transcripción inversa). Los polipéptidos preferidos que tienen actividad de transcriptasa inversa, ADN polimerasas, nucleótidos, sondas, cebadores y otros componentes adecuados para su uso en los kits de amplificación y transcripción inversa proporcionados en la presente descripción incluyen aquellos descritos anteriormente. Los kits abarcados por esta modalidad pueden comprender además reactivos y compuestos adicionales necesarios para llevar a cabo protocolos estándar de transcripción inversa y/o amplificación de ácidos nucleicos. Dichos polipéptidos que tienen actividad de transcriptasa inversa, ADN polimerasas, agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR, nucleótidos, sondas, cebadores y reactivos, componentes o compuestos adicionales pueden estar contenidos en uno o más contenedores, y pueden estar contenidos en dichos contenedores en una mezcla de dos o más de los componentes mencionados anteriormente o pueden estar contenidos en los presentes kits en contenedores separados. Los expertos en la técnica comprenderán que también pueden incluirse en el kit otros componentes, ya sea en el mismo tubo o en tubos separados, para facilitar o mejorar aún más la transcripción inversa o la amplificación. Dichos componentes o aditivos pueden incluir, por ejemplo, Mg2+, uracilo ADN glicosilasa, un control de referencia pasivo para minimizar las variaciones de muestra a muestra o de pocillo a pocillo en ensayos cuantitativos de detección de ADN en tiempo real (por ejemplo, colorantes tales como ROX) y diversos componentes de arranque en caliente (por ejemplo, anticuerpos, oligonucleótidos, perlas, etc.).

En otra modalidad, los presentes kits pueden comprender composiciones para su uso en la síntesis de ácidos nucleicos (por ejemplo, RT-PCR). Dichas composiciones pueden formularse como soluciones madre concentradas (por ejemplo, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, etc.). En algunas modalidades, las composiciones pueden formularse como soluciones madre concentradas en un solo tubo o contenedor, que comprenden uno o más polipéptidos que tienen actividad de transcriptasa inversa y una o más ADN polimerasas. En algunas modalidades preferidas, dichas composiciones madre concentradas pueden comprender además uno o más agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR, uno o más nucleótidos, uno o más componentes de arranque en caliente, uno o más controles de referencia pasivos, o una o más proteínas inhibidoras de ARNasa (RIP) en una solución tamponada. En algunas modalidades preferidas adicionales, dichas soluciones tampón pueden comprender glicerol, DMSO, Mg2+ o un detergente (tal como TWEEN 20 o NP-40). Colectivamente, los componentes de la presente composición pueden formularse juntos para crear una mezcla maestra.

Típicamente, las mezclas maestras para su uso en métodos de síntesis o amplificación de ácidos nucleicos se almacenan a temperaturas de congelación para mantener la estabilidad de las enzimas (por ejemplo, de las transcriptasas inversas o las ADN polimerasas) y después se descongelan y diluyen para ensamblarlas posteriormente en las mezclas de reacción finales. Sin embargo, los ciclos repetidos de congelación y descongelación de la mezcla maestra a lo largo del tiempo pueden conducir a la degradación de las enzimas, lo que da como resultado una disminución de la estabilidad o la funcionalidad. En un aspecto, las composiciones, kits o mezclas maestras incluidas en los kits descritos en la presente descripción pueden almacenarse a aproximadamente -16 °C, aproximadamente -18 °C, aproximadamente -20 °C, aproximadamente -22 °C, aproximadamente -24 °C, aproximadamente -26 °C, aproximadamente -28 °C, aproximadamente -30 °C sin congelar. En algunas modalidades preferibles, las composiciones de los kits se almacenan a aproximadamente -20 °C sin congelar. En algunas modalidades, la presente composición puede almacenarse a temperaturas de congelación (por ejemplo, por debajo de 0 °C, por debajo de -5 °C, por debajo de -20 °C, por debajo de -30 °C, por debajo de -40 °C, etc.) sin tener que descongelarse antes de su uso. Como se usa en la presente descripción, el término "descongelar", "descongelamiento" o "descongelado" se refiere al proceso por el cual el calor cambia algo de un sólido (por ejemplo, congelado) a un gel o líquido. En algunas modalidades, las presentes composiciones pueden ser un líquido o un gel (o líquido viscoso) a temperaturas de congelación. En algunas modalidades, dichas composiciones, especialmente si están en forma de gel, pueden incubarse a aproximadamente 4 °C antes del uso posterior para asegurar una mezcla adecuada, pero no requieren descongelación de por sí.

Los componentes del kit que no sean las composiciones descritas en la presente descripción pueden proporcionarse en contenedores individuales o en un solo contenedor, según corresponda. Pueden proporcionarse instrucciones y protocolos para el uso ventajoso del kit.

A continuación, se describen en la presente descripción ejemplos que se incluyen en la presente solo con fines ilustrativos y no pretenden ser limitativos de la presente descripción.

Ejemplo 1

Una mezcla maestra ilustrativa para su uso en reacciones de RT-PCR/PCR

Se formuló una composición ilustrativa como una solución madre concentrada cuatro veces (4X) que comprende 4 U/ul de transcriptasa inversa termoestable (por ejemplo, M-MLV), 0,4 U/pL de ADN polimerasa termoestable (por ejemplo, Taq), /- agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR (como se indica a continuación), nucleótidos a 3,2 mM cada uno (por ejemplo, dTTP, dATP, dCTP, dGTP), 0,8 U/pL de proteína inhibidora de ARNasa (RIP), 152 nM de componente de arranque en caliente, 24 % de glicerol, 0,04 % de detergente no iónico y 240 nM de colorante de referencia pasivo en una solución salina tamponada. La mezcla maestra ilustrativa se sometió a prueba en una serie de ensayos como se describe en los siguientes ejemplos a continuación.

Ejemplo 2

El efecto de la concentración de gelatina de pescado en la inhibición de la PCR por ácido húmico y heparina

Se realizó RT-PCR (TaqMan Gene Expression Assays Hs00817723_g1 (ACADVL)) mediante el uso de 1 ng de ARN UHR (Stratagene, La Jolla, CA) en reacciones de 20 pL IX mediante el uso de la mezcla maestra ilustrativa descrita anteriormente. Los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante o con los cambios indicados a continuación, excepto que se usó 0,5X del ensayo por reacción. Se añadieron 10 ng/pL de ácido húmico (Fluka 53680) y de 0,01 U a 0,1 U de heparina (Sigma H3393) a tubos de reacción de RT-PCR separados en presencia de 0-1 % de gelatina de pescado. Se usó agua en lugar de un inhibidor en las reacciones de control. Todas las combinaciones de gelatina de pescado e inhibidores se ejecutaron en 4 repeticiones técnicas. La RT-PCR se realizó en un sistema de PCR en tiempo real rápido 7900HT (Life Technologies, Foster City, CA) mediante el uso de las siguientes condiciones térmicas: 50 °C durante 5 m, 95 °C durante 20 s, (95 °C durante 15 s, 60 °C durante 60 s) x 40 ciclos. Cada combinación inhibidor/gelatina de pescado se evaluó basado en el valor de Ct.

Como se muestra en la Figura 1, las reacciones de RT-PCR con 10 ng/pL fueron completamente inhibidas por el ácido húmico cuando se añadió 0-0,6 % de gelatina de pescado a la mezcla de reacción. Esto se mostró por un Ct de 40 en comparación con un Ct de aproximadamente 30 observado en reacciones sin ningún inhibidor. Sin embargo, se observó una mayor tolerancia al ácido húmico (a 10 ng/pL) cuando se añadió a la reacción 0,8 % y 1 % de gelatina de pescado, como se muestra por valores de Ct de 35,99 y 31,90, respectivamente. Con la excepción de las reacciones que comprenden las concentraciones de heparina más altas (0,08 U y mayores), se encontró una disminución de la inhibición por heparina con la adición de gelatina de pescado tan bajo como a partir de un 0,2 % (para 0,04 U de heparina).

Ejemplo 3

El efecto de BSA en la inhibición por ácido húmico, hematina y heparina

Se realizó RT-PCR (TaqMan Gene Expression Assays Hs00817723_g1 (ACADVL) PN 4331182, Life Technologies, Foster City, CA) mediante el uso de 1 ng de ARN UHR (Stratagene, La Jolla, CA) en reacciones de 20 ul IX mediante el uso de la mezcla maestra ilustrativa descrita anteriormente. Los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante o con los cambios indicados a continuación, excepto que se usó 0,5X del ensayo por reacción. Se añadieron 10 ng/pL de ácido húmico (Fluka 53680), 40 pM de hematina (Sigma H3281), 0,01 U o 0,1 U de heparina (Sigma H3393) en reacciones de RT-PCR separadas con la adición de 0-8000 ng/pL de BSA. Se usó agua en lugar de un inhibidor en las reacciones de control. Todas las combinaciones de BSA e inhibidores se ejecutaron en 4 repeticiones técnicas. La RT-PCR se realizó en un sistema de PCR en tiempo real rápido 7900HT (Life Technologies, Foster City, CA) en las siguientes condiciones térmicas: 50 °C durante 5 m, 95 °C durante 20 s, (95 °C durante 15 s, 60 °C durante 60 s) x 40 ciclos. Cada combinación de inhibidor/BSA se evaluó basado en los valores de Ct y dRn.

Como se muestra en la Figura 2, se observó que 0,01 U de heparina no inhibía ninguna de las reacciones de RT-PCR sometidas a prueba, como lo demuestra un Ct comparable al de los controles con agua. Sin embargo, se observó que 0,1 U de heparina inhibía completamente las reacciones para todas las concentraciones de BSA sometidas a prueba. La inhibición se redujo en gran medida para la hematina y el ácido húmico con la adición de 500 ng/pL de BSA, como lo muestra los valores de Ct que van de 40, que indica una inhibición completa, a 31,3 y 32,7, respectivamente. Con la adición de 2000 ng/pL de BSA, la inhibición por hematina y ácido húmico se eliminó por completo, como lo demuestra los valores de Ct de ~30 comparables al del control con agua.

Como se muestra en la Figura 3, la disminución de dRn también se correlacionó con una amplificación exitosa. Para la hematina y el ácido húmico, las reacciones que comprenden 2000 ng/pL de BSA mostraron una dRn más alta que las reacciones que tenían solo 500 ng/pL de ^bS^a, lo que indica una menor inhibición con concentraciones más altas de BSA añadidas. En comparación con los valores de Ct para los controles con agua en la Figura 2, donde los valores fueron consistentes para todas las concentraciones de BSA añadidas (lo que indica la ausencia de inhibición), los valores de dRn disminuyeron al aumentar la concentración de BSA. Como se muestra en la Figura 4, existió una correlación entre la señal sin procesar no normalizada y el aumento de la línea base, como resultado del aumento de las concentraciones de BSA.

Ejemplo 4

Determinación de una concentración eficaz de gelatina de pescado como agente bloqueador de inhibidores de la PCR para ácido húmico, hematina y heparina

Se realizó RT-PCR (TaqMan Gene Expression Assay Hs00817723_g1 (ACADVL) PN 4331182, Life Technologies, Foster City, CA) mediante el uso de 1 ng de ARN UHR (Stratagene, La Jolla, CA) en reacciones de 20 pL IX mediante el uso de la mezcla maestra ilustrativa descrita anteriormente. Los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante o con los cambios indicados a continuación, excepto que se usó 0,5X del ensayo por reacción. Se añadieron 10 ng/pL de ácido húmico (Fluka 53680), 40 pM de hematina (Sigma H3281), 0,06 U y 0,08 U de heparina (Sigma H3393) en RT-PCR separadas con la presencia de 0-5 % de gelatina de pescado. Se usó agua en lugar de un inhibidor en las reacciones de control. Todas las combinaciones de gelatina de pescado e inhibidores se ejecutaron en 4 repeticiones técnicas. La RT-PCR se realizó en un sistema de PCR en tiempo real rápido 7900HT (Life Technologies, Foster City, CA) en las siguientes condiciones térmicas: 50 °C durante 5 m, 95 °C durante 20 s, (95 °C durante 15 s, 60 °C durante 60 s) x 40 ciclos. Cada combinación inhibidor/gelatina de pescado se evaluó basado en Ct y dRn.

Como se muestra en la Figura 5, las reacciones con la adición de 10 ng/pL de ácido húmico demostraron una disminución constante en el Ct con el aumento de gelatina de pescado hasta al menos aproximadamente 2-3 % de gelatina de pescado, donde los valores de Ct fueron los más bajos a 30,6-30,7. Los valores de Ct aumentaron ligeramente hasta 32,6 con la adición de 5 % de gelatina de pescado.

Como se muestra en la Figura 5, cuanto mayor fue la concentración de heparina, mayor fue la concentración de gelatina de pescado necesaria para contrarrestar la inhibición. Por ejemplo, se observó amplificación con 1 % de gelatina de pescado cuando se añadieron 0,06 U de heparina en las reacciones, mientras que se necesitó 1,5 % de gelatina de pescado para observar la amplificación cuando se añadieron 0,08 U de heparina en las reacciones. Los valores de Ct fueron más bajos a 31,2, con la adición de 2-3 % de gelatina de pescado para 0,06 U de heparina, y más bajos a 33,4, con la adición de 3 % de gelatina de pescado para 0,08 U de heparina. Se observaron valores de Ct aumentados cuando las concentraciones de gelatina de pescado aumentaron hasta 5 % para ambas concentraciones de heparina sometidas a prueba.

Se observó una disminución de la inhibición de la PCR con el aumento de las concentraciones de gelatina de pescado, como lo demuestran los valores de Ct disminuidos. Como se demuestra en la Figura 6, este efecto fue un corolario del aumento de los valores de dRn para todas las reacciones que comprenden los diversos inhibidores sometidos a prueba. Sin embargo, en las reacciones de control con agua (en ausencia de cualquier inhibidor), también se observó que los valores de dRn disminuían con cantidades crecientes de gelatina de pescado.

Ejemplo 5

El efecto de gelatina de pescado y BSA en la inhibición por ácido húmico, hematina y heparina

Se realizó RT-PCR (TaqMan Gene Expression Assay Hs00817723_g1 (ACADVL) PN 4331182, Life Technologies, Foster City, CA) mediante el uso de 1 ng de ARN UHR (Stratagene, La Jolla, CA) en reacciones de 20 pL IX mediante el uso de la mezcla maestra ilustrativa descrita anteriormente. Los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante o con los cambios indicados a continuación, excepto que se usó 0,5X del ensayo por reacción. Se añadieron 10 ng/pL de ácido húmico (Fluka 53680) y 40 pM de hematina (Sigma H3281) en reacciones de RT-PCR separadas con una titulación de 0-1 % de gelatina de pescado, 0-8000 ng/pL de BSA o una titulación cruzada de gelatina de pescado y BSA. Se usó agua en lugar de un inhibidor en las reacciones de control. Todas las combinaciones de gelatina de pescado/BSA e inhibidores se ejecutaron en 4 repeticiones técnicas. La RT-PCR se realizó en un sistema de PCR en tiempo real rápido 7900HT (Life Technologies, Foster City, CA) en las siguientes condiciones térmicas: 50 °C durante 5 m, 95 °C durante 20 s, (95 °C durante 15 s, 60 °C durante 60 s) x 40 ciclos. Cada combinación de inhibidor/gelatina de pescado y/o BSA se evaluó basado en los valores de Ct y dRn.

La Figura 7 muestra que, mediante el uso de cantidades crecientes de gelatina de pescado combinadas con cantidades decrecientes de BSA, la tolerancia a la hematina y al ácido húmico aumentó en comparación con el nivel de inhibición de la PCR para las reacciones que comprenden solo BSA. Una combinación de 0,8 % de gelatina de pescado y 500 ng/pL de BSA eliminó casi por completo la inhibición por hematina y ácido húmico, mientras que se necesitaron 2000 ng/pL de BSA, sola, para lograr el mismo efecto. Todas las reacciones que comprenden diversas combinaciones de gelatina de pescado y BSA mostraron una eliminación completa de la inhibición por hematina y ácido húmico.

Ejemplo 6

El efecto de gelatina de pescado y BSA, individualmente y en combinación, sobre otros inhibidores de la PCR

Se realizó RT-PCR (TaqMan Gene Expression Assays Hs99999903_m1 (ACTB) PN 4331182, Life Technologies, Foster City, CA) mediante el uso de 1 ng de ARN UHR (Stratagene, La Jolla, EE. UU.) en reacciones de 20 pL IX mediante el uso de la mezcla maestra ilustrativa descrita anteriormente. Los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante o con los cambios indicados a continuación, excepto que se usó 0,5X del ensayo por reacción. Se prepararon diversos tubos de reacción, que comprenden los siguientes agentes bloqueadores de la PCR, en combinación o solos: (1) sin gelatina de pescado (Fg ) ni BSA; (2) 0,5 % de FG solamente; (3) 800 ng/pL de BSA solamente; (4) 0,5 % de FG 800 ng/ul de BSA. A continuación, a las diversas reacciones se les añadieron los siguientes inhibidores de la PCR: (1) agua (control); (2) 40 pM de hematina (Sigma H3281); (3) 0,04 U/reacción de Heparina (Sigma H3393); (4) 10 ng/pL de ácido húmico (Fluka 53680); (5) 7,2 pg/reacción de EDTA (Ambion AM9262); (6) 6,5 mM de citrato de sodio (dos lotes hechos de Sigma S4641); y (7) 0,825 pg/reacción de inmunoglobulina G (IgG) (Sigma 18640). Cada formulación de reacción se ejecutó en 4 réplicas técnicas. La RT-PCR se realizó en un sistema de PCR en tiempo real rápido 7900HT (Life Technologies, Foster City, CA) en las siguientes condiciones térmicas: 50 °C durante 5 m, 95 °C durante 20 s, (95 °C durante 3 s, 60 °C durante 30 s) x 40 ciclos. Los resultados se evaluaron basado en los valores de Ct y la presencia de producto de amplicón, detectado por electroforesis en gel mediante el uso de e-gel de agarosa al 4 % (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Sin FG o BSA:

Como se muestra en la Figura 8, las reacciones de RT-PCR se inhibieron completamente por la hematina, la heparina y el ácido húmico en ausencia de cualquier agente bloqueador de inhibidores de la PCR, como lo muestran los valores de Ct de 40. Para las formulaciones de reacción particulares sometidas a prueba, el citrato de sodio (tanto el lote 1 como el lote 2) y la IgG inhibieron parcialmente la RT-PCR, como lo demuestra un aumento en los valores de Ct de aproximadamente 24 y 23 respectivamente, en comparación con un valor de Ct de aproximadamente 21 en el caso de las reacciones de control. En este experimento en particular, el EDTA (a 7,2 pg/reacción) no pareció inhibir ninguna de las condiciones de reacción sometidas y, por lo tanto, no se evaluó más.

FG solamente:

Como se muestra en la Figura 8, las reacciones de RT-PCR se inhibieron completamente por la hematina y el ácido húmico incluso en presencia de 0,5 % de gelatina de pescado. Para todos los demás inhibidores, se observó una disminución en el valor de Ct, en comparación con las reacciones de control, lo que indica diversos grados de tolerancia a los diferentes inhibidores mediante la adición solamente de gelatina de pescado.

BSA solamente:

Como se muestra en la Figura 8, la presencia de 800 ng/pL de BSA mitigó parcialmente la inhibición de la mayoría de los inhibidores sometidos a prueba, y mitigó completamente la inhibición por IgG. BSA también pareció ser más eficaz que la FG para todos los inhibidores sometidos a prueba, con la excepción de la heparina, como lo muestran los valores de Ct más bajos de las reacciones que comprenden BSA solamente en comparación con las que contienen solamente FG.

FG y BSA:

Como se muestra en la Figura 8, la reacción que comprende una combinación de FG y BSA confirió una tolerancia al citrato de sodio e IgG comparable a la de las reacciones que comprenden FG o BSA solamente, como lo muestran los valores de Ct similares para las reacciones con FG solamente, BSA solamente o FG BSA. Para los otros inhibidores, la combinación de FG y BSA fue más eficaz que usar FG o BSA solamente. Los valores más bajos de Ct se observaron cuando se usó una combinación de FG BSA en las reacciones en comparación con todas las demás formulaciones de reacción sometidas a prueba.

La Figura 9 representa además el efecto de FG y BSA, cuando se usan juntos, sobre los inhibidores hematina, heparina y ácido húmico. Como se muestra, en cada ejemplo, el uso de FG BSA redujo el nivel de inhibición de estos inhibidores en la RT-PCR, como lo demuestra la detección del producto amplificado mediante electroforesis en gel. Ejemplo 7

La factibilidad de usar mezclas maestras que comprenden transcriptasa inversa y polimerasa en una sola reacción para la síntesis de ácidos nucleicos de plantillas de ADN o ARN

Se realizaron ensayos de síntesis de ácidos nucleicos (TaqMan Gene Expression Assays Hs99999903_m1 (ACTB) PN 4331182, Life Technologies, Foster City, CA), ensayo de virus de ARN personalizado (EV1) (ver, Noble, y otros, Appl Environ Microbiol. 72:1604-1612 (2006)), ensayo de virus de ADN personalizado (ADV) (Jothikumar y otros, Applied and Enviromental Mircobiology, 71:3131-3136 (2005)), ensayo de ARN personalizado (BTV - PN 4415207, VetMax BTV Reagents, Life Technologies, Austin, TX), ensayo de ARN personalizado (VLA-A) y ensayo de control personalizado (XenolPC) en reacciones de 20 pL IX mediante el uso de la mezcla maestra ilustrativa descrita anteriormente. Se analizaron tres ensayos de ARN objetivo no viral (ACTB, GPX4 y Xeno), cuatro ensayos de ARN objetivo viral (EV1-Poliovirus, BTV-Virus de lengua azul, VLA-A - Virus de influenza A) y un ensayo de ADN objetivo viral (ADV -Adenovirus) a los diversos números de copias o concentraciones indicadas en la Tabla 1. Los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (o con cualquier otro cambio indicado en la presente descripción), mediante el uso de las siguientes concentraciones de ensayo:

ACTB: 0,5X;

EV1 [F/R/Pb]: 400 nM, 400 nM, 200 nM;

ADV [F/R/Pb]: 400 nM, 400 nM, 200 nM;

BTV: IX;

VLA-A [F/R/Pb]: 400 nM, 400 nM, 200 nM; y

Xeno [F/R/Pb]: 400 nM, 400 nM, 200 nM

El número de diluciones dependió de las concentraciones de plantilla madre disponibles. Los ensayos se ejecutaron mediante el uso de las siguientes condiciones de termociclador: 50 °C durante 5 min, 95 °C durante 20 s (95 °C durante 3 s, 60 °C durante 30 s) x 40 ciclos en 7900HT en formato de placa 384.

Como se muestra en la Figura 10, se observó una eficiencia consistente de la PCR (como se representa por la linealidad sobre la entrada de diferentes plantillas) en todas las muestras y ensayos sometidos a prueba, lo que indica que las mezclas de reacción que comprenden tanto transcriptasa inversa como polimerasa son igualmente robustas para la amplificación de objetivos de ARN y ADN.

La Figura 10 muestra que se observó una eficiencia consistente de la PCR para ACTB, como indica la linealidad en los puntos de dilución, de 0,0001 ng a 10 ng de entrada de ARN por reacción; de 0,01 ng a 100 ng de entrada de ARN por reacción para GPX4; de 0,01 ng a 100 ng de entrada de ARN por reacción para EV1; de 0,0001X a IX de entrada de ADN por reacción para ADV; de 50 copias a 5000000 de copias de ARN por reacción para Xeno; de 72 copias a 720 000 copias de ARN por reacción para BTV y de 10 copias a 10000 copias de ARN por reacción para VLA.

Tabla 1. Concentraciones/Números de copias de diversas plantillas de ácido nucleico analizadas

Ejemplo 8

La factibilidad de usar mezclas maestras que comprenden tanto transcriptasa inversa como polimerasa en una sola reacción para amplificación en formato múltiple

Los ensayos de RT-PCR (reactivos TaqMan NA y EU PRRSV, PN 4405547 y Controles XenoRNA, PN 4405548, Life Technologies, Austin, TX) se realizaron en reacciones de 20 pL IX mediante el uso de la mezcla maestra ilustrativa descrita anteriormente. Los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante o con cualquier cambio adicional indicado a continuación. El virus de ARN objetivo PRRSV (Virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino) se analizó en triple. El ensayo incluyó cebadores y sondas para 2 objetivos marcados con colorantes indicadores FAM y VIC (NA y EU, respectivamente) y 1 IPC objetivo exógeno marcado con colorante indicador NED (Xeno). Se hicieron siete diluciones (de 10 millones de copias a 10 copias por reacción) de las plantillas NA y EU mediante dilución con agua. Se añadieron 1000 copias de la plantilla IPC Xeno en cada reacción. La RT-PCR se ejecutó en las siguientes condiciones: 50 °C durante 5 min, 95 °C durante 20 s (95 °C durante 3 s, 60 °C durante 30 s) x 40 ciclos en 7900HT en formato 384.

Como se muestra en la Figura 11, se observó una amplificación lineal para dos objetivos a través de las diferentes entradas de plantilla sin afectar la consistencia del IPC exógeno. Tanto las plantillas NA como las EU mostraron una amplificación lineal desde 10 millones de copias hasta 1000 copias de plantilla por reacción. No se registraron valores de Ct con la plantilla de NA a concentraciones inferiores a 1000 copias/reacción. La desviación estándar de los valores de Ct Xeno a través de las diferentes concentraciones de la plantilla objetivo fue consistente con una desviación estándar de solo aproximadamente 0,125 con un valor de Ct promedio de 32,44.

Ejemplo 9

Detección de ácidos nucleicos virales

Los controles de prueba de ácido nucleico del virus del papiloma humano (VPH), el virus de Epstein-Barr (EBV), los virus de la hepatitis B y C (VHB y VHC) se purificaron mediante el uso de métodos de columna de centrifugación convencionales y las muestras purificadas se amplificaron en una serie de diluciones mediante el uso de una mezcla maestra ilustrativa 4X, indicada en la presente descripción "FVMM", para evaluar la sensibilidad, basada en Cq (que es equivalente a Ct), la linealidad y la eficiencia. Se añadieron en las reacciones inhibidores de la PCR comunes, lo que incluye heparina, EDTA, hematina y ácido húmico, para evaluar la tolerancia del sistema basado en delta Cq (ACq) entre las muestras con adición de inhibidor y las muestras de control.

Todas las reacciones de RT-PCR se realizaron con volúmenes de reacción de 20 pL con el siguiente perfil de ciclo térmico: 50 °C durante 5 min, 95 °C durante 20 s (95 °C durante 3 s, 60 °C durante 30 s) x 40 ciclos. La configuración de la reacción de muestra fue la siguiente (todos los volúmenes son por una reacción):

Mezcla Maestra 4x (FVMM) 5 pL

PPMix Objetivo 20x 1 pL

Muestra1" 5 pL

Agua* 9 pL

Volumen total___________________________________ 20 pL

1El volumen de muestra puede ser tanto como el volumen máximo permitido por la reacción (volumen de reacción (es decir, 20 pL) menos la suma del volumen de FVMM PPMix.

*El volumen de agua se calcula como el volumen de reacción menos la suma del volumen de todos los demás componentes (es decir, FVMM PPMix Muestra).______________________________________________________ Las muestras purificadas de HBV y HCV de controles de prueba de ácido nucleico (NAT) y controles NAT no purificados de EBV y HPV se obtuvieron en AcroMetrix (Benicia, ^cA). Los controles de EBV y HPV no purificados se purificaron mediante el uso de un método de centrifugación convencional con una entrada de muestra de 200 pL y un volumen de elución de 60 pL. A continuación, se amplificaron diluciones en serie de las muestras purificadas. Se evaluó el límite de detección, la eficiencia de la PCR y la linealidad (R2). Los ensayos se obtuvieron en Applied Biosystems (Foster City, CA).

La amplificación de los diversos ácidos nucleicos se realizó en los siguientes instrumentos: Applied Biosystems 7900HT (HBV), Applied Biosystems 7500 Fast (HCV) y Applied Biosystems ViiA™ 7 (EBV y HPV). La Tabla 2 muestra las concentraciones y el número de copias de cada muestra de ácido nucleico sometida a prueba.

Tabla 2: Concentraciones/Números de copias de diversas plantillas de ácido nucleico analizadas

Como se muestra en la Tabla 2, la formulación de FVMM mostró una eficiencia de la PCR de aproximadamente el 100 % con valores de R2 cercanos a 1.

El control NAT no purificado de adenovirus (ADV) tipo 1 se obtuvo en ZeptoMetrix (Buffalo, NY) y se purificó mediante el uso de un método de columna de centrifugación convencional con una entrada de muestra de 500 pL y un volumen de elución de 50 pL. La muestra purificada se cribó previamente para determinar un factor de dilución que generaría un Cq de aproximadamente 35 y se añadieron diferentes cantidades de inhibidores de la PCR comunes a las reacciones. Las secuencias del ensayo de ADV se obtuvieron de la literatura (Gu y otros, J. Clin. Microbiol. 41:4636-4641 (2003). El efecto de la inhibición se evaluó mediante el cálculo de ACq entre las muestras con adición de inhibidor y las muestras de control con agua. La misma prueba de inhibidor también se ejecutó con muestras de control positivo interno (IPC) de ARN dirigidas a un C^qde aproximadamente 29 como referencia.

Como se muestra en la Figura 12, se ejecutaron cuatro configuraciones de reacción separadas de cuatro réplicas técnicas cada una para cada combinación de inhibidor-concentración. AC^qse calculó de la siguiente manera: C^tde reacciones con adición de inhibidor menos C^tde las reacciones de control con agua. Cuanto mayor sea el AC^q, más se inhibió la muestra. Aunque los valores de AC^qfueron algo variables entre las 16 réplicas, todos estaban dentro de |1 C^t|, lo que sugiere que no hubo una diferencia significativa entre las muestras añadidas y los controles.

Mediante el uso de la misma configuración y evaluación que se describe en la Figura 12, los ensayos de IPC de ARN mostraron una mayor sensibilidad a la inhibición que el ensayo de ADV (ver la Figura 13); sin embargo, los AC^qtodavía estaban dentro de |1 C^q|, lo que indica que la formulación FVMM era tolerante a los cuatro inhibidores en las concentraciones sometidas a prueba.

Se amplificó una dilución en serie del ADN de ADV purificado (ver arriba) en una reacción doble con el IPC de ARN y se evaluaron la eficiencia y la linealidad (R2) de la PCR. Como se muestra en la Figura 14, se duplicó una serie de diluciones 6-log de ADN puro de ADV con una entrada constante de plantilla de IPC de ARN. La formato múltiple no afectó la eficiencia de la PCR ni la linealidad de las reacciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para amplificar una molécula de ácido nucleico a partir de una muestra biológica extraída de una fuente que puede comprender uno o más inhibidores de la PCR, el método comprende:

mezclar una plantilla de ácido nucleico con una

composición que comprende una o más ADN polimerasas, y una combinación de agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR que consisten esencialmente en gelatina de pescado y albúmina de suero bovino (BSA), para formar una mezcla de reacción, en donde la combinación de agentes bloqueadores de inhibidores de la PCR aumenta la tolerancia a los uno o más inhibidores de la PCR si están presentes en la muestra biológica; y

en donde la gelatina de pescado está a una concentración de 0,2 % p/v-4,0 % p/v y

2. El método de la reivindicación 1, en donde el aumento de la tolerancia se indica por una disminución de Ct de al menos un 10 % o de al menos 1 Ct.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la plantilla de ácido nucleico y/o la molécula de ácido nucleico es ADN.

4. El método de la reivindicación 1, en donde el uno o más inhibidores de la PCR se seleccionan del grupo que consiste en hematina, ácido húmico y heparina.

5. El método de la reivindicación 1, en donde la composición comprende además una o más transcriptasas inversas.

6. El método de la reivindicación 5, en donde la plantilla de ácido nucleico es ARN.

7. El método de la reivindicación 1 o 5, en donde la composición comprende glicerol.

8. El método de la reivindicación 1 o 5, en donde la composición comprende además uno o más componentes de arranque en caliente que evitan la amplificación no específica del ADN al inactivar la actividad de polimerasa a temperaturas de hibridación más bajas y reactivar o activar la actividad de polimerasa a temperaturas más altas durante la fase de extensión.

9. El método de la reivindicación 8, en donde el componente de arranque en caliente se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo o anticuerpos, un cebador especialmente diseñado, un oligonucleótido o aptámero competitivo, una proteína de unión a polimerasa y una perla de secuestro.

10. El método de la reivindicación 1 o 5, en donde la una o más polimerasas comprenden una ADN polimerasa termoestable.

11. El método de la reivindicación 10, en donde la ADN polimerasa termoestable es una polimerasa Taq.

12. El método de la reivindicación 5, en donde la una o más transcriptasas inversas (RT) comprenden una RT termoestable.

13. El método de la reivindicación 12, en donde la RT termoestable es una RT de M-MLV.

14. El método de la reivindicación 7, en donde la concentración de glicerol es de aproximadamente 5 a 50 %.

15. Una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 5, y 7 a 14.