ES2908734T3 - Bacterias probióticas para peces - Google Patents

Abstract

Un método no terapéutico para aumentar el peso de los peces, comprendiendo dicho método las etapas de a) añadir una o más especies de bacterias probióticas al agua, en donde las especies de bacterias comprenden o consisten en Aliivibrio njordis, Aliivibrio balderis y/o Aliivibrio nannie; y b) exponer los peces al agua que contiene las una o más especies de bacterias probióticas, tal como durante un periodo de tiempo de 1 segundo a 5 horas, tal como de 1 segundo a 2 horas, tal como de 1 segundo a 1 hora, tal como de 30 segundos a 1 hora o de 1 minuto a 30 minutos.

Description

DESCRIPCIÓN

Bacterias probióticas para peces

El presente documento se dirige a la piscicultura. Más particularmente, el presente documento se dirige a medios y métodos para aumentar el crecimiento de peces mediante el uso de bacterias probióticas. El presente documento también desvela medios y métodos para tratar y/o prevenir infecciones microbianas, tales como infecciones bacterianas, en peces mediante el uso de bacterias probióticas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La piscicultura implica criar peces en tanques o recintos. En acuicultura, las poblaciones de agua dulce y salada, tales como peces, crustáceos y moluscos, se crían en condiciones controladas. La maricultura es una subrama secundaria de la acuicultura donde los organismos marinos se cultivan en mar abierto o en una sección cerrada del océano, o alternativamente en estanques, tanques y similares llenos de agua de mar.

El crecimiento y la salud de los peces criados mediante acuicultura intensiva depende de que pueda proporcionarse suficiente oxígeno y agua limpia con niveles óptimos de dióxido de carbono, amoniaco y con un pH factible. Además, una cantidad suficiente de alimento con un alto contenido de proteínas y un suministro bien equilibrado de aminoácidos es crucial para obtener un resultado comercialmente duradero. Los intentos de aumentar el crecimiento de los peces de piscifactoría se han centrado generalmente en cambiar los contenidos del alimento usado.

Los peces de piscifactoría suelen estar contenidos en altas concentraciones, lo que aumenta el riesgo de infecciones, por ejemplo, con parásitos como piojos de peces, lombrices intestinales, hongos, virus y bacterias. Para controlar tales infecciones, la industria de la piscicultura se basa a menudo en el uso de antibióticos y agentes de control químico, lo cual no es deseable, por ejemplo, debido a la propagación de estos agentes tóxicos al medio ambiente y al temor de desarrollo de resistencia a antibióticos en la sociedad.

Un problema particular con los peces de piscifactoría son las bacterias que causan heridas y úlceras en la piel del pez que reducen la calidad del pez sacrificado incluso si sobrevive a la infección debido al tejido cicatricial y que causa sufrimiento al pez. Las bacterias de la úlcera también causan septicemia que aumenta el porcentaje de peces que mueren debido a la infección. Ejemplos de bacterias que se han asociado a tal enfermedad son M. viscosa, Bizionia piscinecroseptica, Aliivibrio friggiae, Tenacibaculum dicentrarchi, Aliivibrio wodanis. También se espera que la aparición de heridas en la piel de los peces presente una vía de entrada para otros organismos patógenos. Las infecciones bacterianas agudas en peces de piscifactoría que provocan brotes con gran pérdida de población en un tiempo limitado crean una alta concentración de patógenos bacterianos que causan la propagación efectiva de la infección entre los individuos de la población. Algunos de los patógenos de peces que causan brotes epidémicos son Aliivibrio salmonicida, Aeromonas salmonicida, Vibrio anguillarum, Edwardsiella piscicida, y Aeromonas hydrophila. Los puertos de infección para patógenos bacterianos no están bien estudiados, pero tanto las branquias como el intestino y la piel se consideran importantes.

La vacunación se ha usado o propuesto como medio para tratar y prevenir este tipo de infecciones bacterianas. El documento de patente WO2015/074946A1 desvela el uso médico de Aliivibrio friggiae para vacunar peces contra la enfermedad friggiosis. El tratamiento con antibióticos de los brotes de infecciones bacterianas agudas se usa a menudo en muchos países. El uso rutinario de antibióticos a menudo causa patógenos de peces bacterianos resistentes a antibióticos.

Debido a los problemas discutidos anteriormente, entre otros, las industrias de piscifactoría se enfrentan a menudo a una gran pérdida de peces de la piscifactoría con consecuencias económicas negativas para el piscicultor. Por tanto, es muy deseable aumentar la supervivencia de los peces y aumentar la producción neta en relación con la cantidad de alimento usado.

El objeto de la presente invención es superar o al menos atenuar algunos de los problemas asociados al estado de la técnica anterior.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Los problemas anteriores ahora se han atenuado o superado mediante aislamiento y caracterización de tres nuevas especies del género Aliivibrio, concretamente Aliivibrio njordis, Aliiivibrio balderis y Aliivibrio nannie que se ha mostrado que tienen un efecto probiótico en peces, tales como peces de la familia Salmonidae y peces limpiadores marinos como lábridos y rémoras. En el contexto del presente documento las bacterias de las especies Aliivibrio njordis, Aliiivibrio balderis y Aliivibrio nannie pueden denominarse "bacterias probióticas", "bacteria probiótica" y similares.

El presente documento se dirige por tanto a un método no terapéutico para aumentar la tasa de crecimiento y/o peso de los peces mediante la administración de bacterias probióticas a los peces, tal como por ejemplo mediante administración tópica (es decir, administración mediante inmersión, baño o técnicas de inmersión similares), administración a través de las branquias y/o el intestino.

El presente documento también se dirige por tanto a un método no terapéutico para aumentar el peso de los peces, comprendiendo dicho método las etapas de

a) añadir una o más especies de bacterias probióticas al agua, en donde las especies de bacterias comprenden o consisten en Aliivibrio njordis, Aliivibrio balderis y/o Aliivibrio nannie; y

b) exponer los peces al agua que contiene las una o más especies de bacterias probióticas.

El presente documento también se dirige simultáneamente a un método para aumentar la tasa de crecimiento de los peces.

El presente documento se dirige además a una bacteria probiótica de la especie Aliivibrio njordis, Aliivibrio balderis y/o Aliivibrio nannie para uso en el tratamiento y/o prevención de una infección microbiana en peces.

El presente documento también se dirige a una bacteria probiótica de la especie Aliivibrio njordis, Aliivibrio balderis y/o Aliivibrio nannie para uso en el tratamiento y/o prevención de una infección microbiana en peces y para el uso simultáneo para aumentar la tasa de crecimiento y/o peso de dichos peces.

La infección microbiana que puede tratarse y/o prevenirse con las bacterias probióticas del presente documento puede ser una infección bacteriana. La infección bacteriana puede ser una infección que cause heridas, úlceras y/o lesiones en la piel de los peces, y/o septicemia. Ejemplos de bacterias cuya infección puede tratarse y/o prevenirse mediante las bacterias probióticas del presente documento incluyen, pero no se limitan a, bacterias seleccionadas entre el grupo que comprende M. viscosa, Bizionia piscinecroseptica, Aliivibrio friggiae, Tenacibaculum dicentrarchi, Aliivibrio wodanis, Aliivibrio salmonicida, Aeromonas salmonicida, Vibrio anguillarum, Edwardsiella piscicida, Aeromonas hydrophila, Flavobacterium psychrophilum, y Aliivibrio salmonicida.

Las bacterias probióticas pueden administrarse a los peces mediante

a) adición de una o más especies de una bacteria probiótica al agua; y

b) exposición de los peces al agua que contiene las una o más especies de una bacteria probiótica.

Las especies bacterianas pueden usarse solas o en cualquier combinación. También, puede usarse más de una cepa de cada especie. Además, si se usa más de una especie y/o cepa, puede usarse cualquier proporción entre las diferentes especies y/o cepas. Habitualmente las diferentes especies y/o cepas bacterianas se usan en una proporción de 1:10 a 10:1 o en cantidades iguales.

Cuando las bacterias probióticas del presente documento se administran a peces por exposición de los peces al agua que contiene bacterias probióticas, el agua puede tener una concentración de sal de un 0 a aproximadamente un 4 % en peso, tal como de aproximadamente un 0,5 a aproximadamente un 4 %, tal como de aproximadamente un 2 a aproximadamente un 4 % en peso. El agua puede ser, por ejemplo, agua de mar natural. Como ejemplo, puede añadirse agua dulce al cultivo con bacterias probióticas en una concentración lo suficientemente alta como para mantener la concentración salina sobre cero debido a la mayor concentración salina en los medios de cultivo.

Los peces pueden exponerse a las bacterias probióticas durante un periodo de tiempo de 1 segundo a 5 horas, tal como de 1 segundo a 2 horas, tal como de 1 segundo a 1 hora, tal como de 30 segundos a 1 hora o de 1 minuto a 30 minutos cuando se exponen mediante baño en agua que contiene las bacterias probióticas. El baño puede repetirse una o más veces, tal como 1-20 veces. Los peces pueden exponerse a las bacterias por ejemplo 1-20 veces, 1­ 10 veces, 1-5 veces, 1-4 veces, 1-3 veces o 1-2 veces.

Los peces a los que pueden administrarse las bacterias probióticas son peces de la familia Salmonidae, tales como salmón, trucha, salvelinos, corégonos de agua dulce o tímalos. Los peces también pueden ser peces limpiadores marinos como lábridos y rémoras. Los peces pueden ser peces de piscifactoría.

El presente documento también se dirige a una cepa ejemplar de una composición probiótica que comprende una o más de una bacteria probiótica seleccionada entre el grupo que consiste en Aliivibrio njordis, Aliivibrio balderis y Aliivibrio nannie.

El presente documento también se dirige a una cepa ejemplar aislada y biológicamente pura de la nueva especie Aliivibrio njordis cuya cepa es la cepa Aliivibrio njordis B1-25, 18-1/2013 mandib V11, que se ha depositado en la National Collection of Industrial and Marine Bacteria y a la que se le ha asignado el número de acceso NCIMB 42593.

El presente documento también se dirige a una cepa ejemplar aislada y biológicamente pura de la nueva especie Aliivibrio balderis cuya cepa es Aliivibrio balderis B1-24, 18-1/2013 kidn V12, que se ha depositado en la National Collection of Industrial and Marine Bacteria y a la que se le ha asignado el número de acceso NCIMB 42592.

El presente documento también se dirige a una cepa ejemplar aislada y biológicamente pura de la nueva especie Aliivibrio nannie cuya cepa es Aliivibrio nannie B8-24, 313/2013 kidn V13, que se ha depositado en la National Collection of Industrial and Marine Bacteria y a la que se le ha asignado el número de acceso NCIMB 42594.

Cuando el presente documento se refiere a una bacteria de la especie Aliivibrio njordis, Aliivibrio balderis y/o Aliivibrio nannie se entiende que dicha bacteria tiene una actividad biológica comparable a la de las respectivas cepas ejemplares depositadas anteriormente de dichas bacterias Aliivibrio njordis, Aliivibrio balderis y/o Aliivibrio nannie.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, dibujos, ejemplos y las reivindicaciones.

DEFINICIONES

"Salmonidae" es una familia de peces con aletas radiadas, que es la única familia viva situada actualmente en el orden Salmoniformes. En el presente documento éstos también se denominan salmónidos. Salmonidae incluye salmón, trucha, salvelinos, corégonos de agua dulce y tímalos.

Un "cultivo" incluye todas las formas de cultivo, tanto en caldo, sobre agar y en cualquier otro medio como cultivos de células eucariotas, tejido eucariota/animal/pez dentro de animales de investigación o cualquier otra medida física. Un "cultivo único" se refiere a un cultivo que contiene solo una cepa bacteriana, es decir, un cultivo puro. Un "cultivo mixto" se refiere a un cultivo en donde crecen juntas dos o más cepas bacterianas, especies y/o general. Las condiciones de temperatura y concentración salina (por ejemplo, NaCl) para cada cultivo pueden determinarse separadamente, dependiendo de las circunstancias y los materiales usados.

La "úlcera de invierno" es una enfermedad que se caracteriza por úlceras cutáneas que se desarrollan a partir de hinchazones cutáneas en úlceras abiertas y posteriormente en áreas de piel ulceradas más grandes donde el tejido muscular subyacente queda expuesto y, a menudo, destruido por necrosis. La úlcera de invierno ocurre principalmente a temperaturas del agua de mar de <6 a 15 °C, tal como de <6 a 8 °C. A estas temperaturas, M. viscosa es clínicamente más activa y ataca agresivamente la piel del pez directamente creando pequeñas úlceras, además de infectar al pez de forma septicémica, principalmente a través del epitelio branquial (Lunder et al. 1995, L0voll et al. 2009, Karlsen et al. 2012).

Por los términos herida, úlcera, lesión y similares se entienden, en el contexto del presente documento, daños al tejido cutáneo. Tales lesiones pueden estar causadas por traumatismos y/o por infección microbiana, tal como por infección bacteriana.

Por el término "piel" y similares se entiende la cubierta exterior de un cuerpo. La piel de un pez comprende generalmente una cubierta exterior de escamas bajo la cual se sitúan la epidermis y la dermis. Una herida, úlcera o lesión puede afectar a las tres capas o solo a una o dos de las capas externas.

"Piscicultura", "peces de piscifactoría" y expresiones similares se refieren a la cría comercial de peces. A menudo, este tipo de piscicultura se realiza en espacios cerrados, tales como jaulas, tanques o estanques.

La "bizioniosis" es una enfermedad caracterizada por pudrición de cola y aleta, infección en la punta de la mandíbula, en particular, pero también en la punta del maxilar que puede extenderse caudalmente a lo largo de la mandíbula, infección ocular, úlceras detrás de las aletas pectorales y junto al cuerpo, y/o septicemia (léase el documento de patente WO 2015/074943). En particular, la bizioniosis se caracteriza porque estos síntomas están causados por bacterias del género Bizionia, tal como Bizionia piscinecroseptica, tal como Bizionia piscinecroseptica 130524K2F7.

La "friggiosis" es una enfermedad caracterizada por septicemia (en particular con un alto número de bacterias en cabeza, riñón e hígado), hemorragias moteadas en un hígado graso degenerado, ascitis en el abdomen, úlceras en la piel (tal como detrás de las aletas pectorales o diseminadas por el cuerpo), pero a menudo ninguna o menos úlceras en el cuerpo en comparación con las úlceras en úlcera de invierno y wodanosis, infección ocular (que puede conducir a punción ocular), una infección de la punta de la mandíbula y/o la punta del maxilar (véase el documento de patente WO 2015/074946). La friggiosis puede caracterizarse por ser causada por bacterias de la nueva especie Aliivibrio friggiae, tal como Aliivibrio friggiae 130206K7F2506.

La flexibacteriosis (marina) está causada por Tenacibaculum maritimum (anteriormente, Cytophaga marina, Flexibacter marinus y F. maritimus) y para el salmón del Atlántico, Tenacibaculum dicentrarchi es la causa más común de pudrición de aletas y úlceras entre bacterias del género Tenacibaculum. Varios otros nombres como enfermedades bacterianas deslizantes de peces marinos, síndrome de boca erosionada y necrosis de parche negro se han usado para designar la enfermedad causada por esta bacteria. La flexibacteriosis marina está ampliamente distribuida en peces criados y silvestres en Europa, Japón, Norteamérica y Australia. La enfermedad se ha informado entre peces de cría como rodaballo, lenguado, dorada, lubina, pargo, pargo negro (Acanthopagrus schlegeli), lenguado y salmónidos. Aunque tanto los adultos como los juveniles pueden verse afectados por la flexibacteriosis marina, los peces más jóvenes sufren una forma más grave de la enfermedad. Se observa una mayor prevalencia y gravedad de la enfermedad a mayores temperaturas (por encima de 15 °C). La enfermedad está influenciada por muchos factores ambientales (estrés) y relacionados con el hospedador (estado cutáneo). En general, los peces afectados tienen boca erosionada y hemorrágica, lesiones cutáneas ulcerativas, aletas deshilacliadas y pudrición de la cola. Una enfermedad sistémica puede ocurrir implicando diferentes órganos internos. La pérdida de la superficie epitelial del pez, un cambio habitual de la enfermedad, es probablemente la puerta de entrada de otros patógenos bacterianos o parasitarios (Toranzo et al. 2005).

Enfermedad bacteriana del agua fría (BCWD) (Cipriano y Holt 2005). Los peces infectados con BCWD habitual tienen lesiones en piel y aletas. Las aletas pueden aparecer, partidas, desgarradas, irregulares, deshilacliadas e incluso erosionadas por completo. Los peces afectados a menudo están letárgicos y dejan de alimentarse. La infección puede diseminarse septicémicamente. Los peces salmónidos pueden desarrollar una forma crónica de recuperación después de BCWD de la BCWD habitual. Se caracteriza por nadar en "sacacorchos", colas ennegrecidas y deformidades en la columna. Se considera que Flavobacterium psychrophilum es el agente causante tanto de BCWD como del síndrome del alevín de la trucha arcoíris.

El síndrome del alevín de la trucha arcoíris es una enfermedad aguda con altas tasas de mortalidad. Los peces infectados pueden mostrar signos de letargo, inapetencia y exoftalmos antes de morir (Nematollahi et al. 2003). Los signos clínicos de las infecciones por F. psychrophilum así como la tasa de mortalidad, dependen del tamaño de los peces afectados. En el salmón coho, que es muy susceptible, la mortalidad puede llegar a un 50 %. En los alevines vesiculados, una pigmentación oscura en un lado del cuerpo y la erosión del área del pedúnculo con exposición simultánea de la médula espinal y pérdida de la cola son hallazgos comunes.

La wodanosis se caracteriza por una infección septicémica que da como resultado ascitis, hígado moteado, bazo hinchado, úlceras cutáneas, y/o podredumbre de las aletas habitualmente en la base de la aleta caudal y la aleta dorsal. La wodanosis puede estar causada por Aliivibrio wodanis. La wodanosis se describe además en el documento de patente WO2013/171236.

La vibriosis de agua fría en salmón del Atlántico puede estar causada por la bacteria gramnegativa Aliivibrio salmonada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1: peso medio de esguines bañados en cantidades iguales de Aliivibrio njordis (B1-25, 18-1/2013 mandib VI1), Aliivibrio balderis (B1-24, 18-1/2013 kidn VI2) y Aliivibrio nannie (B8-24, 31-3/2013 kidn VI3) de acuerdo con el Ejemplo 1.

Figura 2: peso medio de esguines bañados en cantidades iguales de Aliivibrio njordis (B1-25, 18-1/2013 mandib VI1), Aliivibrio balderis (B1-24, 18-1/2013 kidn VI2) y Aliivibrio nannie (B8-24, 31-3/2013 kidn VI3) de acuerdo con el Ejemplo 2.

Figura 3: peso medio de esguines bañados en diferentes combinaciones de Aliivibrio njordis (B1-25, 18-1/2013 mandib VI1), Aliivibrio balderis (B1-24, 18-1/2013 kidn VI2) y Aliivibrio nannie (B8-24, 31-3/2013 kidn VI3) de acuerdo con el Ejemplo 3.

Figura 4: Muerte acumulada de peces en el Ejemplo 4.

Figura 5: Crecimiento medio de peces en el Ejemplo 4.

Figura 6: Mortalidad de peces en el Ejemplo 4.

Figura 7: Crecimiento diario de peces en el Ejemplo 4.

Figura 8: Tasa de crecimiento específica (SGR) en los diversos tanques y en los puntos temporales de muestreo variables en el Ejemplo 4.

Figura 9: Distribución de úlceras; activas y curadas en el Ejemplo 4.

Figura 10: Tasa de crecimiento específica (SGR) en los grupos de ensayo compilados en el Ejemplo 5.

Figura 11: Peso medio de los post esguines en los cuatro corrales cerrados en diversos puntos de muestreo en el Ejemplo 6.

Figura 12: Tasa de crecimiento específica (SGR) en los diversos corrales cerrados y en los puntos temporales de muestreo variables en el Ejemplo 6.

Figura 13: Visión de conjunto del diseño experimental y configuración del tanque en el Ejemplo 7. Ejemplo: los peces de la fila 1 eran el grupo de placebo, los peces de la fila 2 recibieron un tratamiento combinado con una vacuna de inmersión y bacterias beneficiosas, los peces de la fila 3 recibieron solo bacterias beneficiosas y la fila 4 eran los controles. A y B (verde) eran duplicados y todos tienen un periodo de inmunización de 21 días antes de someterlos al agua de mar. C y D (azul) eran duplicados y se pusieron en agua de mar inmediatamente después de la exposición. Todas las exposiciones fueron ocultadas de acuerdo con el programa de ocultación a continuación (tabla 3). *Vacuna o placebo. **Probiótico o placebo.

Figura 14: Bosquejo detallado del protocolo experimental en el Ejemplo 7.

Figura 15: Pesos en promedio en la parte de agua dulce (FW) del Ejemplo 7.

Figura 16: Pesos en promedio en la parte de agua salada (SW) del Ejemplo 7.

Figura 17: Curvas de supervivencia de los diversos grupos de la parte de agua dulce (FW) del Ejemplo 7.

Figura 18: Curvas de supervivencia de los diversos grupos de la parte de agua salada (SW) del Ejemplo 7.

Figura 19: Visión de conjunto del diseño experimental en el Ejemplo 8.

Figura 20: Bosquejo detallado del protocolo experimental en el Ejemplo 8.

Figura 21: Curvas de mortalidad acumulada de los diversos grupos de ensayo en el Ejemplo 8.

Figura 22: Número de post esguines por encima de 200 gramos en los distintos grupos de ensayo en el Ejemplo 8. DESCRIPCIÓN DETALLADA

El presente documento se dirige a aumentar la tasa de crecimiento y/o peso y/o mejorar la salud del peces de piscifactoría mediante el uso de nuevas bacterias probióticas del género Aliivibrio que habitualmente se administran mediante exposición de los peces al agua a la que se han añadido las bacterias probióticas. Las bacterias probióticas desveladas en el presente documento por primera vez son de la nueva especie Aliivibrio njordis, Aliivibrio balderis y Aliivibrio nannie. En Noruega se han aislado y depositado tres nuevas especies ejemplares de Aliivibrio de acuerdo con el Tratado de Budapest el 17 de junio, 2016, en la National Collection of Industrial and Marine Bacteria (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Escocia, Reino Unido). Estas cepas ejemplares son A. njordis (B1-25, 18-1/2013 mandib V11) que recibe el número de acceso NCIMB 42593, Aliivibrio balderis (B1-24, 18-1/2013 kidn V12) que recibe el número de acceso NCIMB 42592, y Aliivibrio nannie (B8-24, 313/2013 kidn V13) que recibe el número de acceso NCIMB 42594.

Los probióticos se han usado anteriormente en piscicultura principalmente como complemento alimentario para peces de piscifactoría como los salmónidos. La administración de bacterias probióticas mediante procedimientos de baño se ha aplicado principalmente para gambas, mariscos y etapas tempranas de alimentación e incluso antes de la alimentación de peces con aletas como halibut y bacalao del Atlántico. Sin embargo, ahora se ha descubierto que es posible administrar bacterias probióticas a través del agua en la que se encuentran los peces para obtener un efecto beneficioso en los peces, tal como salmón del Atlántico, incluso en la etapa de esguín.

Aunque se ha demostrado previamente que las bacterias patógenas, tales como Moritella viscosa y Aliivibrio salmonicida entran en los peces a través de la piel como principal puerto de infección además de absorción a través del intestino y branquias, no se ha demostrado previamente que el crecimiento de los peces (tasa de aumento de peso) pueda aumentarse mediante administración tópica (es decir, por ejemplo, mediante inmersión como inmersión ligera o baño) de bacterias probióticas en la piel del pez. Además, no se ha demostrado previamente que la formación de heridas en la piel del pez pueda tratarse y/o prevenirse mediante administración tópica de bacterias probióticas en la piel del pez. Además del efecto tópico, las bacterias probióticas están atravesando la piel de los peces como lo están haciendo sus parientes genéticos cercanos que son patógenos, como Aliivibrio salmonicida. Un efecto de esta entrada en los peces es que las bacterias probióticas también pueden prevenir infecciones septicémicas en los peces. El presente documento demuestra por primera vez que es posible administrar bacterias probióticas a peces, tales como esguines de salmón del Atlántico, proporcionando las bacterias al agua y exponiendo a los peces al agua que contiene bacterias. Mediante esta administración, la principal vía de entrada de las bacterias probióticas es a través de la piel del pez (es decir, tópicamente).

Se ha observado que ocurren dos efectos principales tras la administración de las bacterias probióticas por exposición a las bacterias probióticas a través del agua circundante. Uno es el efecto no médico de un mayor crecimiento de los peces, como se demuestra mediante un aumento de peso en comparación con peces no tratados. El otro es el efecto médico de prevención y/o tratamiento de heridas cutáneas (úlceras, lesiones), como lo demuestra un número reducido de heridas en la piel en comparación con peces no tratados. No se ha demostrado previamente que tales efectos beneficiosos ocurran después de la administración de bacterias probióticas mediante adición de bacterias probióticas al agua y exposición de los peces al agua que contiene bacterias.

El presente documento desvela tres especies bacterianas nuevas, que se ha encontrado que influyen beneficiosamente en los peces cuando se administran a través del agua que los rodea. Estas especies bacterianas son Allivibrio njordis, Allivibrio balderis y Allivibrio nannie, que además se desvelan a continuación. En el contexto del presente documento, estas bacterias pueden denominarse bacterias probióticas.

La bacteria puede administrarse a los peces exponiendo a los peces al agua a la que se hayan añadido las bacterias probióticas. Tal administración da como resultado una administración tópica de las bacterias probióticas a los peces. Sin embargo, también pueden usarse otros medios y vías de administración.

Las bacterias probióticas desveladas en el presente documento pueden administrarse separadamente o en cualquier combinación de dos o más de las especies y/o diferentes cepas de las diferentes especies. Las tres especies de bacterias probióticas desveladas en el presente documento tienen efectos beneficiosos en el crecimiento (aumento de peso) y la prevención/tratamiento de infecciones microbianas, independientemente de si se usan o no por separado o en cualquier combinación. Por ejemplo, A. njordis, A. balderis o A. nannie pueden usarse solas. También, A. njordis puede usarse en combinación con A. balderis, en combinación con A. nannie o en combinación con A. balderis y A. nannie. Además, A. balderis puede usarse en combinación con A. nannie. Pueden usarse bacterias de diferentes géneros y/o diferentes cepas en cualquier proporción relativa. Sin embargo, habitualmente, la proporción es de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1 entre dos especies/cepas cualesquiera cuando las bacterias se usan en combinación. Por ejemplo, la proporción entre dos especies/cepas cualesquiera cuando las bacterias se usan en combinación puede ser de 1:4 a 4:1, 1:3 a 3:1, 1:2 a 2:1 o 1:1. Sin embargo, también puede ser de 1:100 a 100:1.

Para administrar las bacterias probióticas a los peces, las bacterias probióticas se cultivan de manera adecuada y a continuación, por ejemplo, se añaden al agua, tras lo cual, los peces se exponen al agua que contiene bacterias, es decir, los peces se bañan en el agua. El agua a la que se añaden las bacterias puede ser el agua en la que ya están contenidos los peces o puede ser agua de otro tanque, jaula o similar a la que se transfieren los peces. El agua es habitualmente el mismo tipo de agua en la que se encuentran los peces, dependiendo de su etapa de crecimiento. Por ejemplo, para salmones en la etapa post esguín, el agua es habitualmente agua de mar natural. Sin embargo, también es posible transferir los peces a otro tipo de agua durante el tratamiento. Por ejemplo, para salmones en la etapa pre esguín, que viven en agua dulce, pueden ser transferidos a agua salada, tal como agua de mar natural, durante la exposición a las bacterias probióticas y a continuación devolverlos al agua dulce. El agua a la que se añaden las bacterias normalmente tiene una salinidad de aproximadamente un 0,5 a aproximadamente un 4 % en peso, tal como de aproximadamente un 2 a aproximadamente un 4 % en peso, aunque el agua también puede ser agua dulce que tiene una salinidad mucho menor. Por tanto, es posible usar células vivas ya propagadas para bañar peces a concentraciones salinas menores hasta agua dulce a intervalos de tiempo más cortos habituales sin destruir las bacterias probióticas.

Los peces se exponen al agua de baño que contiene las bacterias probióticas durante un tiempo suficiente para administrar suficientes bacterias a los peces para obtener los efectos deseados. Este tiempo dependerá, por ejemplo, de la concentración de bacterias usadas, tipo y estado de los peces que van a exponerse, etc. Habitualmente, puede usarse un tiempo de exposición de varios segundos a un par de horas, tal como de 1 segundo a 5 horas, tal como de 1 segundo a 2 horas, tal como de 1 segundo a 1 hora, tal como de 30 segundos a 1 hora o de 1 minuto a 30 minutos. El aumento de la concentración de bacterias en el agua generalmente disminuirá el tiempo de exposición necesario.

Los peces pueden exponerse a las bacterias probióticas una sola vez o la exposición puede repetirse una o más veces con diferentes intervalos de tiempo.

La concentración total de bacterias probióticas añadidas en el agua del baño está habitualmente en el intervalo de aproximadamente 104 a 108 CFU/ml, tal como de 105 a 107, cuando se aplica un baño durante un breve intervalo de tratamiento único, tal como un baño que dura de aproximadamente 15 a 60 minutos. Si los peces van a sumergirse en un baño probiótico, la concentración bacteriana puede aumentarse tal como de 107 a 1012 CFU/ml. Los cultivos bacterianos preparados en fermentadores pueden tener una concentración de aproximadamente 1013 CFU/ml. Una dilución de aproximadamente 1:100 a 1:600 del cultivo bacteriano preparado puede ser adecuada para aplicación mediante baño y una dilución de aproximadamente 1:10 para aplicación mediante inmersión. La adición de bacterias probióticas a intervalos repetidos en concentraciones menores hasta el nivel natural en el agua de mar puede ser beneficiosa para los peces bañados. Una infusión continua de bacterias probióticas a niveles menores de concentración hasta una célula/ml de agua puede ser beneficiosa para los peces.

Las bacterias probióticas pueden añadirse al agua con o sin su medio de cultivo usado. Si las bacterias van a añadirse sin su medio de crecimiento usado, las células bacterianas pueden separarse del medio de crecimiento, por ejemplo, mediante centrifugación o filtración y a continuación resuspenderse en medio de crecimiento fresco o un tampón adecuado (tal como solución salina tamponada con fosfato) o solución salina (solución una solución de sal sódica).

También es posible usar bacterias probióticas liofilizadas o sistemas recirculación en acuicultura (RAS).

Las bacterias probióticas de las diferentes especies desveladas en el presente documento y/o diferentes cepas dentro de la misma especie pueden mezclarse antes de añadirlas al agua. Las diferentes especies de bacterias probióticas y/o diferentes cepas dentro de la misma especie también pueden cultivarse juntas en el mismo cultivo. Por ejemplo, las tres especies o en cualquier mezcla de dos de las especies pueden cultivarse juntas. También es posible cultivar dos o más cepas de la misma especie juntas o en combinación con una o más cepas de otra especie. Por tanto, el presente documento también se dirige a una composición probiótica que comprende una o más bacterias probióticas seleccionadas entre el grupo que consiste en Aliivibrio njordis, Aliivibrio balderis y Aliivibrio nannie. Las bacterias probióticas de las diferentes especies y/o diferentes cepas dentro de la misma especie también pueden añadirse por separado pero al mismo volumen de agua para los peces a exponer a las diferentes bacterias simultáneamente. También es posible exponer los peces a bacterias probióticas de las diferentes especies desveladas en el presente documento y/o cepas de una o más de las especies secuencialmente añadiendo una o más especies/cepas bacterianas probióticas antes de añadir una o más especies bacterianas probióticas adicionales. Si se va a usar tal adición secuencial de las bacterias probióticas, es posible añadir las bacterias secuencialmente pero sin retirar las bacterias añadidas previamente o efectuar la retirada de bacterias añadidas previamente antes de añadir nuevas bacterias, por ejemplo, intercambiando el volumen de bacterias que contienen agua por agua nueva antes de añadir más bacterias.

Cepas de bacterias probióticas ejemplares de las especies A. njordis, A. balderis y A. nannie que pueden usarse para los fines del presente documento son Aliivibrio njordis cepa B1-25, 18-1/2013 mandib VI1, Aliivibrio balderis B1-24, 18-1/2013 kidn VI2, y Aliivibrio nannie B8-24, 31-3/2013 kidn VI3. Sin embargo, el presente documento no se limita al uso de estas cepas específicas, sino que puede usarse cualquier cepa de las tres especies siempre que tenga una actividad probiótica similar a la respectiva cepa ejemplar de cada especie.

Los peces que van a exponerse a las bacterias probióticas desveladas en el presente documento son cualquier tipo de pez, en particular peces de piscifactoría y más particularmente peces de la familia Salmonidae, tales como salmón, trucha, salvelinos, corégonos de agua dulce o tímalos. Como se mencionó anteriormente, los peces pueden exponerse a las bacterias probióticas una o más veces, por ejemplo, durante las diferentes etapas de crecimiento. Además, las especies de peces marinos como las diversas especies de lábridos y rémoras usados como peces limpiadores para controlar las plagas de piojos de mar en los corrales de red marinos pueden tener efectos beneficiosos de las tres bacterias probióticas, ya que también están infectados con varios de los mismos patógenos de heridas y úlceras como peces salmónidos. Lo mismo se aplicará a muchas especies marinas diferentes como, por ejemplo, especies de calamar.

Cepas bacterianas

A continuación se describe el aislamiento y la caracterización de cepas ejemplares de bacterias de las especies A. njordis, A. balderis y A. nannie. Sin embargo, el presente documento no se limita al uso de estas cepas específicas, sino a cualquier cepa de bacterias de las especies A. njordis, A. balderis y A. nannie, que tienen un efecto comparable en el aumento del peso de los peces y/o en el tratamiento/prevención de la infección microbiana ya que estas cepas ejemplares, pueden usarse para los fines del presente documento.

Aliivibrio njordis

Aliivibrio njordis (B1-25, 18-1/2013 mandib V11) se aisló de la mandíbula (mandíbula inferior) de un salmón del Atlántico que murió el 18 de enero de 2013 en un tanque experimental en Solbergstrand, NIVA, Noruega, usando agua de mar natural. El aislado creció en agar sangre con adición de NaCl al 2,5 % y se incubó durante cuatro días a 10 °C. Las colonias tienen habitualmente 2 - 3 mm de ancho con una superficie uniforme, húmeda, un color amarillento y no hemolíticas. Las células bacterianas son gram-negativas con una longitud habitual de 2 a 5 |jm y un diámetro de 1 |jm. La forma de las células puede ser de cocoide a células vibrio habituales rectas o en forma de coma. A. njordis utiliza NO3 pero no degrada L-triptófano, D-glucosa, L-arginina, urea, esculina, gelatina o PNPG.

Aliivibrio balderis

Aliivibrio balderis (B1-24, 18-1/2013 kidn V12) se aisló del riñón cefálico de un salmón del Atlántico que murió el 18 de enero de 2013 en un tanque experimental en Solbergstrand, NIVA, Noruega, usando agua de mar natural. El aislado creció en agar sangre con adición de NaCl al 2,5 % y se incubó durante cuatro días a 10 °C. Las colonias tienen habitualmente 2 - 3 mm de ancho con una superficie uniforme, húmeda, un color amarillento y no hemolíticas. Las células bacterianas son gram-negativas con una longitud habitual de 2 a 5 jm y un diámetro de 1 jm . La forma de las células puede ser de cocoide a células vibrio habituales rectas o en forma de coma. A. balderis utiliza NO3 y fermenta D-glucosa y degrada esculina y PNPG pero no degrada L-triptófano, L-arginina, urea, o gelatina.

Aliivibrio nannie

Aliivibrio nannie (B8-24, 313/2013 kidn V13) se aisló del riñón cefálico de un salmón del Atlántico que murió el 31 de marzo de 2013 en un tanque experimental en Solbergstrand, NIVA, Noruega, usando agua de mar natural. El aislado creció en agar sangre con adición de NaCl al 2,5 % y se incubó durante cuatro días a 10 °C. Las colonias tienen habitualmente 2 - 3 mm de ancho con una superficie uniforme, húmeda, un color amarillento y no hemolíticas. Las células bacterianas son gram-negativas con una longitud habitual de 2 a 5 |jm y un diámetro de 1 |jm. La forma de las células puede ser de cocoide a células vibrio habituales rectas o en forma de coma. A. nannie utiliza NO3 y degrada PNPG pero no degrada L-triptófano, D-glucosa, L-arginina, urea, esculina, o gelatina.

Crecimiento de A. njordis, A. balderis y A. nannie

Las condiciones de crecimiento de las bacterias no son críticas siempre que se obtengan células viables.

El medio usado para el crecimiento de bacterias no es crítico, pero puede usarse cualquier medio nutriente que contenga todos los elementos que necesitan la mayoría de las bacterias para crecer y que no sea selectivo, Tal como caldo Luria, agar de soja Trypticase o agar nutriente.

La temperatura para el crecimiento de las bacterias tampoco es crítica. Habitualmente, las bacterias crecen a una temperatura entre 2 y 25 °C, tal como de aproximadamente de 4 a 18 °C.

Las bacterias pueden crecer en condiciones aeróbicas, microaerófilas o incluso anaeróbicas. Las condiciones aeróbicas pueden lograrse, por ejemplo, mediante agitación vigorosa de los cultivos bacterianos mientras que las condiciones microaerófilas pueden lograrse, por ejemplo, girando cuidadosamente los matraces de cultivo bacteriano durante el crecimiento. En los experimentos desvelados en el presente documento se ha usado el crecimiento bacteriano en condiciones tanto microaerófilas como aeróbicas, pero pueden referirse otras condiciones cuando las bacterias van a usarse para los fines desvelados en el presente documento.

Si se van a usar bacterias de más de una especie y/o cepa, las bacterias pueden crecer por separado (es decir, en cultivos individuales) o en el mismo cultivo (es decir, en cultivos mixtos). Si crecen separadamente, las bacterias de los diferentes cultivos pueden mezclarse antes de añadirlas al agua o a las bacterias de los diferentes cultivos. Por tanto, el presente documento también se dirige a una composición probiótica que comprende una o más bacterias seleccionadas entre el grupo que consiste en Aliivibrio njordis, Aliivibrio balderis y Aliivibrio nannie. Las bacterias probióticas obtenidas de diferentes cultivos (independientemente de si son cultivos únicos o mixtos) también pueden añadirse separadamente pero al mismo volumen de agua para que los peces estén expuestos a las diferentes bacterias simultáneamente.

Usos médicos y no médicos de las bacterias probióticas

Uso no médico de las bacterias probióticas

El presente documento desvela el uso de las bacterias probióticas para aumentar la tasa de crecimiento (peso) en comparación con peces no tratados con las bacterias probióticas. Este efecto está causado por la administración de las bacterias probióticas al exponer los peces a agua a la que se han añadido las bacterias probióticas. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, se espera que el efecto principal lo contribuya la administración tópica de la bacteria a la piel del pez. A continuación la bacteria atraviesa eficazmente la piel del pez y termina en los tejidos subcutáneos y los vasos sanguíneos del cuerpo transportando las bacterias por todo el cuerpo del pez.

El presente documento se dirige por tanto a un método para aumentar la tasa de crecimiento (peso) de los peces, comprendiendo dicho método las etapas de

a) añadir una o más especies de bacterias probióticas al agua, en donde la especie de bacteria probiótica comprende o consiste en Aliivibrio njordis, Aliivibrio balderis y/o Aliivibrio nannie; y

b) exponer los peces al agua que contiene las una o más especies de bacterias probióticas.

Como se menciona en cualquier parte en el presente documento, las bacterias probióticas de las tres especies diferentes y las diferentes cepas dentro de tales especies pueden usarse en cualquier combinación. Un ejemplo de tal combinación es la combinación de bacterias de las especies A. njordis y A. balderis. por tanto, las especies bacterianas pueden usarse solas por diferentes combinaciones de dos o más especies y/o cepas de una especie. En cualquier parte en el presente documento serán detalles adicionales con respecto a las condiciones durante la exposición de los peces a las bacterias probióticas, etc.

Los peces a los que se les administran las bacterias probióticas para obtener un efecto potenciador del crecimiento son habitualmente peces sanos.

Usos médicos de las bacterias probióticas

Las bacterias probióticas del presente documento también pueden usarse para tratar y/o prevenir infecciones microbianas en peces. Las infecciones microbianas incluyen, por ejemplo, infecciones virales, fúngicas y bacterianas, en particular infecciones bacterianas. Por ejemplo, las bacterias probióticas pueden prevenir y/o tratar infecciones causadas por bacterias que causan heridas, úlceras y/o lesiones en los peces, tal como en la piel de los peces. Otros ejemplos de infecciones que pueden tratarse y/o prevenirse son infecciones que causan septicemia. Las infecciones bacterianas que causan heridas, úlceras y lesiones en la piel de los peces también pueden causar septicemia cuando la bacteria entra en el pez a través de la piel. Ejemplos de bacterias que se han asociado con tales heridas/úlceras/lesiones y/o septicemia son M. viscosa, Bizionia piscinecroseptica, Aliivibrio friggiae, Tenacibaculum maritimum, y Aliivibrio wodanis.

Aunque el presente documento se refiere generalmente a "heridas" y al tratamiento/prevención de "heridas", el término herida (heridas) también incluye úlcera (úlceras), lesión (lesiones) y similares que pueden tratarse y/o prevenirse igualmente bien mediante la administración de las bacterias probióticas como se desvela en el presente documento. Pueden producirse heridas en la piel de los peces, por ejemplo, por infección bacteriana como se desvela además en cualquier parte del presente documento. También, las heridas pueden estar causadas por lesiones en los peces, por ejemplo, lesiones causadas por contacto estrecho entre individuos en jaulas, tanques, etc. que pueden hacer que, por ejemplo, las aletas de un pez dañen a los peces cercanos.

También se espera que la creación de heridas/úlceras/lesiones en la piel de los peces presente una vía de entrada para otros organismos patógenos. Las infecciones bacterianas agudas en peces de piscifactoría que provocan brotes con alta pérdida de la población en un tiempo limitado crea una alta concentración de patógenos bacterianos que causa la propagación efectiva de la infección entre los individuos de la población. Algunos de los patógenos de peces que causan brotes epidémicos e infecciones que pueden tratarse y/o prevenirse mediante las bacterias priobióticas del presente documento son Aliivibrio salmonicida, Aeromonas salmonicida, Vibrio anguillarum, Edwardsiella piscicida, y Aeromonas hydrophila. Los puertos de infección de los patógenos bacterianos no están bien estudiados, pero tanto las branquias como el intestino y la piel se consideran importantes.

Por tanto el presente documento también desvela las especies bacterianas Aliivibrio njordis, Aliivibrio balderis y/o Aliivibrio nannie para uso médico. Las especies bacterianas pueden usarse solas o en diferentes combinaciones de dos o más especies y/o cepas de una especie.

El presente documento se dirige además a una bacteria de la especie Aliivibrio njordis, Aliivibrio balderis y/o Aliivibrio nannie para uso en el tratamiento y/o prevención de una infección microbiana en peces. Las especies bacterianas pueden usarse solas o en diferentes combinaciones de dos o más especies y/o cepas de una especie.

También, el presente documento desvela el uso de Aliivibrio njordis, Aliivibrio balderis y/o Aliivibrio nannie para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una infección microbiana en peces. Las especies bacterianas pueden usarse solas o en diferentes combinaciones de dos o más especies y/o cepas de una especie.

Además, el presente documento desvela un método para tratar y/o prevenir una infección microbiana en peces, comprendiendo dicho método las etapas de

a) añadir una o más especies de bacterias probióticas al agua, en donde la especie de bacteria probiótica comprende o consiste en Aliivibrio njordis, Aliivibrio balderis y/o Aliivibrio nannie; y

b) exponer los peces al agua que contiene las una o más especies de bacterias probióticas.

Las infecciones bacterianas que pueden tratarse y/o prevenirse mediante el uso de las bacterias probióticas desveladas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, úlcera de invierno, friggiosis, wodanosis, bizioniosis, síndrome del alevín de la trucha arcoíris, enfermedad bacteriana de agua fría, vibriosis de agua fría, y flexibacteriosis.

Las bacterias probióticas del presente documento pueden administrarse por tanto a la piel de los peces, es decir, tópicamente, o a través de las branquias para tratar y/o prevenir la infección por otros microorganismos. Tal aplicación puede efectuarse bañando a los peces en agua que contenga las bacterias probióticas no se desvela en cualquier parte del presente documento. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, las bacterias probióticas del presente documento pueden tratar y/o prevenir infecciones ocupando nichos en la piel, evitando de ese modo que las bacterias patógenas infecten a los peces. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, se espera que el principal efecto de tratamiento/preventivo en la infección microbiana lo contribuya la administración tópica de las bacterias probióticas a la piel de los peces. La bacteria a continuación atraviesa eficazmente la piel de los peces y termina en los tejidos subcutáneos y los vasos sanguíneos del cuerpo transportando la bacteria por todo el cuerpo del pez.

Más detalles con respecto a las condiciones durante la exposición de los peces a las bacterias probióticas, infecciones microbianas, etc., se proporcionan en cualquier parte del presente documento.

La invención se describirá además en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

SECCIÓN EXPERIMENTAL

En la sección experimental se usaron las tres cepas bacterianas Aliivibrio njordis (B1-25, 18-1/2013 mandib VI1), Aliivibrio balderis (B1-24, 18-1/2013 kidn VI2) y Aliivibrio nannie (B8-24, 31-3/2013 kidn VI3).

Las células bacterianas se cultivaron a una temperatura entre 8 y 16 °C en caldo Luria con NaCI al 2,5 % si no se indica otra cosa. La preparación de cultivos necesitó aproximadamente 14 días y los cultivos fueron semicontinuos ya que se añadió caldo fresco estéril cuando los cultivos alcanzaron el final del crecimiento exponencial. El crecimiento fue relativamente lento debido a la falta de agitación y otros movimientos de los cultivos.

Para el baño se usó un 2,55 % de sal marina natural durante el baño en los Ejemplos 1, 3 y 4, mientras que en el Ejemplo 2 se usó agua de mar completa (3,4 %).

Ejemplo 1

Periodo de tiempo:

1 de octubre de 2014 - 27 de enero de 2015 (117 días)

Tjeldbergodden settefisk AS (Njord Salmon AS), Aure, Noruega.

Baño Stembiont (probiótico) usado:

Se usaron tres especies bacterianas diferentes del género Aliivibrio en una mezcla con cantidades iguales de cada especie bacteriana. Las nuevas especies bacterianas fueron 1. Aliivibrio njordis (B1-25, 18-1/2013 mandib VI1), 2. Aliivibrio balderis (B1-24, 18-1/2013 kidn VI2) y 3. Aliivibrio nannie (B8-24, 31-3/2013 kidn VI3).

Los cultivos de las tres especies bacterianas se realizaron en matraces de un litro hasta el punto directamente antes de un transporte de 9 horas desde Oslo a Tjeldbergodden. Justo antes del transporte (temperatura mantenida entre 8 y 15 °C durante el transporte) todos los matraces se mezclaron en un recipiente de plástico con un volumen de 25 litros, es decir, 24 litros en el recipiente de 25 litros. Justo antes de mezclar los frascos de cultivo, se alimentaron con caldo fresco estéril para que el cultivo pudiera crecer hasta el sitio de aplicación.

Los esguines de salmón del Atlántico en el tanque A4 se bañaron durante 1 hora en una concentración de 1/208 de la mezcla igual (5 x 108cfu/ml en los 24 litros de cultivo de reserva mixto se mezclaron con 5 m3 de agua salada salobre al 2,55 %) de la tres bacterias beneficiosas simultáneamente el día 0. Esto da una concentración total calculada de las tres bacterias de 2,4 x 106 cfu/ml (es decir, la concentración total de bacterias) y una concentración cultivada de 1 x 107 cfu/ml directamente del agua de baño según lo estimado después del crecimiento en agar sangre. El grupo A3 eran peces de control y no tratados.

Post esguines:

Se usaron post esguines de salmón del atlántico de Marine Harvest vacunados intraperitonealmente con una vacuna comercial 8 semanas (450-grados Celsius día) antes de transferirlos al agua de mar en las instalaciones de producción de esguines de agua dulce. Los esguines tenían un peso promedio de 80 gramos cuando se transfirieron al mar desde la planta de esguines el 1 de octubre de 2014.

Se usaron N = 9800 peces (Salmo salar) en dos grupos, A3 (control) y A4 (tratado) (4900 cada uno) en tanques interiores de 150 m3. Los peces se mantuvieron en tanques durante todo el periodo de estudio de 117 días.

Se pesó un subconjunto de 42 post esguines de A4 y 37 post esguines de A3 después del transporte a las instalaciones de investigación del acuario después de 110 días.

El peso promedio de los 42 post esguines del tanque A4 fue de 550,5 gramos mientras que los 37 post esguines del tanque A3 tenían un peso promedio de 376,0 gramos. Esto le da a los 42 esguines muestreados después de 110 días de A4 un aumento de peso promedio de un 46,4 % más que los 37 post esguines muestreados al mismo tiempo del tanque control A3 que no se dañaron en un cultivo bacteriano.

Un subconjunto de 150 peces en cada grupo se pesó, se midió y se puntuó para úlceras después de 117 días (A3) y 116 (A4) días (véase la Figura 1).

Tabla 1.

La mortalidad de los peces medida por muestreo diario de los post esguines muertos hasta el día 117 del periodo de ensayo fue menor en A4; 140 post esguines muertos (2,86 %) que en el tanque de control A3; 188 post esguines muertos (3,83 %).

Resultados

Las concentraciones de bacterias elegidas produjeron un efecto significativo y medible en el aumento de peso y número de úlceras. El tiempo de baño de 1 hora parece suficiente para lograr estos efectos con esta concentración de bacterias.

La diferencia en peso y el número de úlceras puede observarse después de 117 días dadas las condiciones específicas del tanque.

El método de muestreo fue el mismo tanto a los 110 días como a una semana/6 días después y dado que se capturaron los mismos post esguines representativos, el control ganó casi la misma cantidad de peso durante una semana después de 110 días. La explicación podría estar en el alimento disponible para los dos tanques, ya que el software de la instalación que calcula la cantidad de alimento puede haber subestimado el crecimiento en A4. Los post esguines en ambos tanques ganaron más de 20 gramos de peso al día esta semana, pero la alimentación limitada podría haber restringido el crecimiento en particular en A4 donde los post esguines habían tenido hasta un 46 % más de crecimiento que en A3 en el periodo de aproximadamente 60 días a 110 días del ensayo.

Ejemplo 2

Periodo de tiempo:

15 de marzo de 2015 - 2 de julio de 2015 (105 días)

Tjeldbergodden settefisk AS, Aure, Noruega.

Baño Stembiont (probiótico):

Se usaron tres especies bacterianas diferentes del género Aliivibrio en una mezcla con cantidades iguales de cada especie bacteriana. Las nuevas especies bacterianas fueron 1. Aliivibrio njordis (B1-25, 18-1/2013 mandib VI1), 2. Aliivibrio balderis (B1-24, 18-1/2013 kidn VI2) y 3. Aliivibrio nannie (B8-24, 31-3/2013 kidn VI3).

Los cultivos se mezclaron en un recipiente de líquido grande de 1000 litros consiguiendo un volumen total de 600 litros, incluyendo el caldo recién añadido, justo antes del envío en un camión durante 9 horas (la temperatura se mantuvo entre 8 y 15 °C durante el transporte). Antes de combinarlos en el tanque contenedor grande de 1 m3, los tres cultivos se habían incubado en contenedores de plástico de 25 litros que primero estaban de pie cuando el volumen era pequeño y a continuación se colocaron a un lado cuando aumentaba el volumen. De esta manera, la superficie de los cultivos debería captar aire más fácilmente. La idea del cultivo no es agitar o tener un alto nivel de aire en el cultivo, sino tener una condición más microaerófila en un cultivo en pie sin agitar, solo volteando los bidones de plástico 3 veces durante el día.

Los peces en los dos tanques de tratamiento (E2 y E3) se bañaron durante 1 hora en una dilución de bacterias beneficiosas de aproximadamente 1/666 (E3) y 1/1333 (E2) el día 0, que es 1/3 y 1/6 de la diluciones de cultivo usadas en el Estudio 1. Los peces del tercer tanque (E1) eran peces de control y no tratados.

Post esguines:

Se usaron post esguines de salmón del atlántico de la planta de producción de esguines de Belsvik (propiedad de Ler0y Midt) vacunados intraperitonealmente con una vacuna comercial 8 semanas (450-día grados Celsius) antes de transferirlos al agua de mar en las instalaciones de producción de esguines de agua dulce.

N = 99.622 peces (Salmo salar) en E1, N = 109.300 en E2, N = 98.754 en E3, es decir, la densidad de los post esguines es un 10 % mayor en E2 en comparación con E1 y E3. Los peces se mantuvieron en los mismos tanques durante todo el periodo de estudio de 105 días. Un subconjunto de 100 peces en cada grupo se pesó, se midió y se puntuó para úlceras el día 73 y el día 105 (véase la Figura 2).

Tabla 2.

Resultados

Aunque la reducción de la concentración de bacterias en el baño bacteriano reduce la eficacia del tratamiento, al 33 % de la concentración usada en el Ejemplo 1 todavía pudo observarse un aumento de peso (no estadísticamente significativo) y una reducción de úlceras (estadísticamente significativa) en comparación con los peces no tratados. Ejemplo 3

Periodo de tiempo:

Primavera 2016 (126 días)

Tjeldbergodden, Njord Salmon, Noruega.

Baño Stembiont (probiótico):

Se usaron tres especies diferentes de Aliivibrio sp. (Tanque A2: Aliivibrio nannie, Tanque A3: Aliivibrio njordis, Aliivibrio balderis y Aliivibrio nannie al 33 % v/v y Tanque A4: Aliivibrio njordis, Aliivibrio balderis, 50 % v/v) en las mismas concentraciones que en el Ejemplo 1.

Los cultivos crecieron en bidones de plástico separados de 25 litros hasta el envío (temperatura mantenida entre 8 y 15 °C durante el transporte) cuando los cultivos para cada tanque A2, A3 y A4 se mezclaron en un recipiente de 25 litros y caldo fresco.

Los peces se bañaron durante 1 hora en una dilución 1/210 de cultivos de bacterias beneficiosas que da una concentración de baño de 1 x 107 cfu/ml el día 0. Los peces del tercer tanque (A1) eran peces de control y no tratados. Post esguines:

Se usaron post esguines de salmón del atlántico de la planta de producción de esguines de Belsvik (propiedad de Ler0y Midt) vacunados intraperitonealmente con una vacuna comercial 8 semanas (450-grados Celsius día) antes de transferirlos al agua de mar en las instalaciones de producción de esguines de agua dulce.

Los peces se mantuvieron en tanques durante todo el periodo de estudio de 126 días. Al principio eran 4000 peces en cada uno de los 4 tanques. Un subconjunto de peces en cada grupo se pesó, se midió y se puntuó para úlceras los días 72 y 126 durante el estudio. Resultados en la tabla desde el final del estudio (Día 126) (véase también la Figura 3).

Tabla 3.

Resultados

Todas las combinaciones de cepas sometidas a ensayo mostraron un beneficio significativo de aumento de peso sobre los controles. Aliivibrio nannie usada sola o Aliivibrio njordis y Aliivibrio balderis usadas en combinación (1:1) mostraron un beneficio de supervivencia significativo sobre controles y cuando las tres cepas se usaron en combinación (1:1:1).

Ejemplo 4

En este estudio 2 x 100000 esguines se bañaron en A. njordis y A. balderis en una mezcla igual (96,7 %) y A. nannie (3,3 %) durante 1 hora en tanques interiores más pequeños y se transfirieron a E4 y F3 el 10 de mayo de 2016, y 2 x 100000 esguines se bañaron en A. njordis y A. balderis en una mezcla igual (96,7 %) y A. nannie (3,3 %) durante 1 hora en tanques interiores más pequeños y se transfirieron a E3 y F2 después de baño de vacunación en los mismos tanques durante los últimos 15 minutos.

Para obtener los 720 litros de cultivos necesarios, los cultivos crecieron en 39 x bidones de plástico de 25 litros hasta el transporte (la temperatura se mantuvo entre 8 y 15 °C durante el transporte) y se añadió caldo fresco justo antes del envío. Los bidones no se mezclaron sino que se transportaron con 20 litros cada uno en el suelo del camión de transporte. Los bidones se abrieron una vez para dejar entrar aire durante el transporte a 1036 metros sobre el nivel del mar a la temperatura de 12 °C durante 30 minutos. Los cultivos se planificaron para dos días de uso con un desfase temporal.

El cultivo bacteriano de todos los volúmenes usados en los tanques interiores pequeños (150 m3) usados para bañarse demostraron un crecimiento de la combinación de A. njordis y A. balderis (96,7 %) y A. nannie (3,3 %) que varía de 6 x 105 a 1,0 x 106 cfu/ml de agua de baño.

El día 0, (19 de mayo), día 22 (10 de junio), día 49 (7 de julio), día 75 (2 de agosto), día 99 (26 de agosto) y día 120 (16 de septiembre) tras el tratamiento y transferencia a agua de mar, se muestrearon 80 post esguines, se sacrificaron con baño anestésico antes de la pesada, se midió la longitud y autopsia (10 individuos de cada tanque). Había un pequeño nivel de pudrición de las aletas en todos los tanques el día 22, que se redujo principalmente a pudrición de las aletas en la aleta trasera el día 49. El día 22, la causa de la pudrición de las aletas fueron otras dos bacterias vibrio, Vibrio splendidus / V. tasmaniensis) que estaban incluidas en las vacunas (vacuna intraperitoneal comercial el día menos 65 en la planta de esguines y baño de autovacunación en cuatro de los ocho tanques el día 0 frente a Aliivibrio wodanis y Aliivibrio friggiae).

Dos tanques fueron tanques de control, dos tanques recibieron probiótico solo, dos tanques recibieron bacterias probióticas más autovacunación (añadiendo bacterias muertas los últimos 15 minutos de la hora completa como autovacuna) en el baño simultáneamente y por último dos tanques recibieron solo autovacunación.

Después de los tres primeros muestreos, el último el día 49, se evidencia que los post esguines de control tienen un buen crecimiento pero empiezan a tener hemorragias y pequeñas úlceras en la parte ventral del cuerpo. Los grupos autovacunados crecen casi tan bien como los de los tanques de control. Los tanques tratados con probióticos muestran menor crecimiento, estadísticamente significativo en comparación con los tanques de control. Sin embargo, el consumo de alimento es tan alto como en los post esguines en los tanques de control. Esto indica que las bacterias probióticas dentro de los post esguines demandan energía a los post esguines en mayor medida que para los post esguines de control y los post esguines autovacunados.

Los muestreos los días 75, 99 y 120 siguen mostrando que los tanques de control no expuestos crecían bien y tenían los mayores pesos, aunque no significativamente mayores que los otros grupos. Hacia el final del periodo post esguín, antes de transferir los post esguines mediante barco vivero a jaulas de mar abierto, los grupos bañados respondían mejor que antes en el ensayo, pero no superaban a los grupos de control en peso promedio.

El crecimiento diario esperado en %, es decir, tasa de crecimiento específica (SGR) estimada a partir de los 6 muestreos en el ensayo muestra que los dos tanques de post esguines tratados con probióticos tienen una SGR uniforme y relativamente alta en los cuatro últimos muestreos en comparación con los tanques de control y los tanques vacunados con baño. Se calcula que la SGR en los tanques vacunados con baño es particularmente alta durante un brote de enfermedad ulcerosa entre los días 49 y 75 y relativamente baja durante un segundo periodo con úlceras alrededor de los días 75 a 99 en el ensayo. A partir de la autopsia y los cultivos, esta variación en los grupos vacunados por baño indica que A. wodanis es importante en el primer brote de úlcera, mientras que Vibrio splendidus/tasmaniensis es más dominante durante el segundo brote de úlcera.

Véanse las Figuras 4 a 8.

Resultados

a. Los post esguines de control (E1 y F4) tienen úlceras más pequeñas y hemorragias en la piel que los 6 tanques tratados en la segunda y tercera veces de muestreo.

b. Los tanques bañados con probióticos (E4 y F3) tienen el peso menor pero el mayor consumo de alimento en la primera parte del ensayo, pero hacia el final del ensayo, el peso comienza a aumentar con respecto a los otros grupos. Esto indica que los post esguines usan energía adicional para manejar las bacterias buenas transferidas a través de la piel el día 0 (10 de mayo). Esto indica que las bacterias se transfirieron realmente a los peces. La tasa de conversión de alimento es

alta para los peces tratados con probióticos y combinados con más úlceras y hemorragias en el control en algunas partes del ensayo se ajusta a datos similares de los ensayos anteriores en Tjeldbergodden.

La tasa de crecimiento específica (SGR) es muy estable en los post esguines bañados con probióticos desde antes de 50 días en el ensayo y hasta el final del ensayo el día 120. La SGR en los otros grupos en el ensayo, incluyendo los grupos de control, varía habitualmente con respecto al tipo de patógenos bacterianos que causan desafío de infección en los tanques de flujo continuo con los post esguines.

Ejemplo 5

En una instalación de post esguines con toma de agua marina a 50 metros de profundidad y con sistema de flujo continuo con desinfección UV del agua de toma. Esta instalación es la misma que en los Ejemplos 2 y 4.

En este estudio 2 x 100.000 esguines (tanque E4 y F1) se bañaron en A. njordis y A. balderis en una mezcla igual (96,7 %) durante 1 hora en una concentración de 1:600 mientras el volumen del tanque se reducía a la mitad, se detenía el agua de entrada y se proporcionaba oxígeno. A estos dos tanques bañados con probióticos se les añadió vacuna de baño durante los 20 últimos minutos del periodo de baño de una hora con bacterias probióticas. Además, dos tanques con 100.000 esguines cada uno (E1 y F3) se vacunaron por baño con la misma vacuna que se usó en la exposición combinada con la exposición probiótica. La vacuna de baño se aplicó además de la vacuna comercial ip, que se administró a todos los esguines en la planta de esguines de Belsvika. La vacuna del baño fue la misma que la usada en el Ejemplo 4 y contenía antígenos contra Aliivibrio wodanis y Aliivibrio friggiae que se ha aislado en los post esguines con úlcera en la planta la temporada anterior. A. wodanis fue el patógeno dominante en los post esguines con úlceras en esta instalación de post esguines durante algunos años.

Los cultivos probióticos necesarios para este ensayo y para el ensayo en el Ejemplo 6 se prepararon durante los últimos tres días en un fermentador de 750 litros como un solo lote de 500 litros para cada ensayo. Estos cultivos se prepararon con aire soplado en el medio de cultivo. Los cultivos se drenaron en un contenedor cisterna de 1000 litros de calidad alimentaria y se transportaron con un camión pequeño la primera quincena de noviembre cuando la temperatura exterior estaba entre 5 y 10 °C en la ruta usada.

El día 0 (2 de noviembre de 2016), día 15 (17 de noviembre) y día 128 (10 de marzo) después de la exposición y transferencia al agua de mar, se tomaron muestras de 80 post esguines de cada tanque, se sacrificaron con baño anestésico antes de la pesada, se midió la longitud y autopsia (10 individuos de cada tanque).

Cuatro tanques eran tanques de control (E2, E3, F2 y F4).

Resultados

Después de 10 días desde el traslado al mar, se produjo en los tanques un brote de pudrición de las aletas y mortalidad causada por Tenacibaculum dicentrarchi, el tanque F1 (vacuna de probiótico y baño) estaba perdiendo la mayoría de los post esguines, pero el brote finalizaba una semana después comenzar y los post esguines se recuperaron rápido. Los peces tenían buen apetito y tasa de crecimiento en todos los tanques hasta el final del ensayo cuando comenzó un brote de úlcera y mortalidad la última semana antes de que se planificara la transferencia de los post esguines a corrales de red abiertos en el mar. El brote fue causado por la variante de trucha de Moritella viscosa que no está incluida en la vacuna comercial ip, lo que probablemente explica por qué ocurrió el brote. Todos los tanques fueron tratados con antibiótico en la alimentación y trasladados al mar después de una semana adicional. Después de transferirse al mar hubo un aumento de la mortalidad, en particular en los grupos vacunados. Esto puede deberse a la vacunación contra A. wodanis que produce una bacteriocina que inhibe a M. viscosa y otras bacterias en los niveles salinos fisiológicos en el cuerpo del pez. La vacunación frente a A. wodanis hace necesario controlar mediante vacunas u otros medios los patógenos que son inhibidos por la bacteriocina producida por A. wodanis.

Los tanques expuestos a probióticos tuvieron menos post esguines con úlcera que los tanques de control y los tanques de vacunas. En el último muestreo (17 de marzo-17) los tanques con exposición a probióticos presentaron un 5 % menos de úlceras que los otros tanques (véanse las Figuras 9 y 10).

Ejemplo 6

Exposición a bacterias marinas probióticas en el lanzamiento al mar después de vacunación por baño frente a Aliivibrio wodanis cuatro semanas antes

Este ensayo industrial se realizó con vacunación y tratamiento con probióticos en la planta de esguines antes de mantener los esguines 5 meses en 4 jaulas de mar cerradas de 3000 m3 para evitar la exposición a piojos de mar. El agua de mar se bombeó desde una profundidad de 26 metros y se usó sin desinfectar.

Resumen de diseño y exposición.

Se vacunaron alevines de salmón con una vacuna intraperitoneal comercial 8 semanas antes del lanzamiento al mar. Además, se vacunaron por baño en tanques de agua dulce en la planta de esguines cuando tenían un tamaño aproximado de 40 gramos, 4 semanas antes del lanzamiento al mar. Cuando los esguines pesaban más de 80 gramos y habían desarrollado la inmunidad adicional del baño de vacunación donde se sumergieron en bacterias probióticas a la concentración de 1:600 con una mezcla a partes iguales de las especies bacterianas Aliivibrio njordis y Aliivibrio balderis durante una hora antes de ser transportados una corta distancia en un barco vivero a los corrales de red cerrados. Cada uno de los cuatro tanques contenía 100 000 esguines y los esguines combinados expuestos a probióticos y vacunados en baño se mantuvieron en dos tanques (M1 y m 2), mientras que los tanques de control no fueron vacunados en baño ni expuestos a bacterias probióticas.

Resultados

Los grupos vacunados por baño tuvieron una tasa de crecimiento significativamente mayor las cuatro semanas antes del lanzamiento al mar. En teoría, puede especularse que esto se debe a la exposición a agua salobre que contiene el patógeno de las úlceras Aliivibrio wodanis 6 días antes de transferencia al mar.

Después de bañar los grupos vacunados por inmersión en bacterias probióticas, la tasa de crecimiento fue mayor en los grupos expuestos hasta la última parte del ensayo. Los últimos 2 meses del ensayo dieron como resultado una mortalidad baja entre un 1 y un 2 por ciento a partir del corral de control M3. Un par de semanas después se produjeron úlceras y un ligero aumento de la mortalidad en los otros tres corrales cerrados. En el último mes del ensayo, el grupo de control M3 se recuperó muy bien de las úlceras y la tasa de crecimiento aumentó mucho. M3 solía tener la mayor pérdida de esguines desde el inicio el ensayo antes de que la tasa de crecimiento fuera la menor durante la mayor parte de la primera parte del ensayo antes de compensar la pérdida de crecimiento al final del ensayo. El otro grupo de control siguió teniendo una tasa de crecimiento menor en comparación con los grupos expuestos a la vacuna del baño y al probiótico.

Después de la transferencia a corrales de red abiertos en el mar, la mortalidad en las cuatro poblaciones siguió aumentando a más del 4 por ciento, siendo más elevada en los post esguines vacunados y tratados con probióticos. Podría especularse que la razón del aumento de la mortalidad después del traslado a los corrales marinos está causada por el transporte en un periodo con aumento de infecciones. La causa del aumento de mortalidad en el mar fue Alivibrio wodanis contra el que se preparó la vacuna por baño para proteger a los post esguines. También puede especularse que la duración de la vacuna se redujo después de más de 7 meses desde la vacunación por baño. Normalmente, el efecto de una vacuna por baño será bueno durante al menos cuatro meses (véanse las Figuras 11 y Ejemplo 7

Requisitos de inicio y eficacia del tratamiento del salmón mediante el uso de potenciación biótica en combinación con vacuna de inmersión

Para determinar si se necesita un periodo de inicio para la vacuna de inmersión para el efecto completo del tratamiento y si está presente un efecto adicional del tratamiento biótico y si esto difiere entre peces con periodo de inicio y peces sin periodo de inicio. La seguridad y la eficacia por supervivencia, número de úlceras, aumento de peso e índice de conversión alimentaria de salmón del Atlántico bañado en una preparación biótica de una mezcla de dos cultivos bacterianos vivos inocuos de Aliivibrio spp. (A. njordis y A. balderis) en combinación con una vacuna de inmersión se compararán entre dos grupos de tratamientos y dentro de subgrupos que reciben diferentes tratamientos. Los comparadores fueron controles no tratados y controles tratados con vacuna de inmersión o tratamiento biótico como agente único. Un grupo de peces fue expuesto al agua salada natural inmediatamente después del tratamiento, mientras que a un segundo grupo se le dio un periodo de 21 días en agua dulce antes de exponerse al agua de mar.

Este estudio fue una confirmación del beneficio de un tratamiento de inmersión estática de 60 segundos con vacuna de inmersión, una combinación de vacuna de inmersión y tratamiento biótico o tratamiento biótico solo en comparación con controles no tratados.

La vacuna de inmersión consistió en 11 patógenos bacterianos diferentes, incluyendo los patógenos conocidos que causan infecciones epidémicas como vibriosis, vibriosis de agua fría y furunculosis, además de bacterias patógenas conocidas y nuevas que causan úlceras y podredumbre de las aletas.

Objetivos:

1. investigar si el cotratamiento con una vacuna de inmersión y una mezcla de bacterias probióticas es seguro 2. investigar si se necesita un periodo de inicio para alcanzar un efecto significativamente mejor (mortalidad, morbilidad y peso) del tratamiento elegido (ver criterios de valoración) en comparación con peces tratados sin periodo de inicio 3. investigar si el tratamiento con una vacuna de inmersión, o una mezcla de bacterias beneficiosas o una combinación de los dos da como resultado mayores tasas de supervivencia, y/o aumento de peso, y/o menores tasas de signos moribundos, incluyendo oscurecimiento, letargo y presencia de signos específicos de enfermedad, tal como formación de úlceras, pudrición de aletas o pudrición de boca en comparación con controles no tratados.

Puntos finales:

Los puntos finales del primer objetivo fueron supervivencia (días), formación de úlceras (tabla de puntuación 4) y peso (gramos) durante los primeros 21 días de tratamiento sin exposición al agua de mar. Los criterios de valoración para el segundo objetivo fueron supervivencia, peso y formación de úlceras (número y gravedad) durante el periodo posterior al agua de mar. El criterio de valoración para el tercer objetivo fueron signos de morbilidad, incluyendo, pero sin limitarse a, úlceras, oscurecimiento de la piel, podredumbre de aletas, anorexia y podredumbre de boca. Las úlceras se puntuaron por tamaño (diámetro mayor) y gravedad.

Producto de ensayo

Las cepas de bacterias que se usarán como potenciadores fueron dos cepas de Aliivibrio spp. no patógenas (A. njordis y A. balderis) producidas de tal manera que se usan ciertos métodos patentados para manifestar características de cultivo deseables.

La vacuna de inmersión contenía una selección de bacterias inactivadas producidas de tal manera que se usan ciertos métodos patentados para manifestar las características de cultivo deseables.

T l 4: D ri i n x rim n l

Se documentó que las poblaciones inscritas en el estudio estaban exentas de exposición a la enfermedad confirmada en la fuente/antes de entrar en el estudio. Se anticipó que los peces tendrán una densidad de población de aproximadamente 20 g/litro y al final del estudio la densidad será de aproximadamente 40 g/litro.

Gestión de la cría

Los peces y los tanques fueron atendidos y monitorizados diariamente por un biólogo especialista en medicina acuática.

Se recogieron peces muertos diariamente. Los parámetros ambientales se registraron diariamente. Se informaron comportamientos anómalos o moribundos, pérdida de apetito, aumento del apetito o aumento inesperado de la mortalidad.

Los peces se alimentaron manualmente. La cantidad se ajustó mediante cálculos de biomasa una vez a la semana y se ajustó mediante pesada después de 40 días.

T l : Vi i n n n i n

Principales criterios de inclusión y retirada post exclusión

Salmón del Atlántico (Salmo salar) clínicamente sano en buen estado de salud y estado de vacunación conocido. El tamaño medio fue aproximadamente 50 g.

Se registró peso medio de 100 peces se registró en el momento de la inscripción. La mortalidad en los tanques se registró diariamente. Los peces muertos se evaluaron por supuesta causa de muerte y se clasificaron por la supuesta causa. Según lo definido por los investigadores, se censuraron los periodos discretos de pérdida explicada y no relacionada, tal como daño físico, agotamiento de oxígeno, inanición o cualquier otra incidencia no relacionada. Los peces muertos se mantuvieron para determinar qué investigación adicional era necesaria. La mortalidad se confirmó mediante necropsia, y por patología y/o un resultado bacteriológico positivo se consideró pérdida específica.

El estudio se realizó en Solbergstrand en Frogn en el condado de Akershus y se ejecutó desde aproximadamente mediados de junio de 2016 y durante 110 días.

Resumen del diseño

El estudio debería durar 111 días (21 días 90 días) o hasta que la biomasa alcance 50 kg pr. tanque - lo que suceda primero. Se incluyeron ochenta peces en cada uno de los dieciséis grupos de tratamiento hasta un total de 1280 peces. La configuración consistía en dos grupos principales con dos subgrupos que recibieron un periodo de inmunización de 21 días después de exponerlos a agua corriente antes de ponerlos en agua de mar el día 21 (Grupo 1 - A y B), o sin periodo de inmunización pero sometido a agua de mar inmediatamente después de la exposición (Grupo 2 - C y D).

Cada subgrupo A/B/C/D se dividió en 4 grupos de los cuales 3 recibieron un tratamiento diferente y un cuarto fue un grupo control (Figura 1).

Todos los peces recibieron exposición cuando estaban en agua dulce. Los grupos A y B permanecieron en agua dulce durante 21 días después de la exposición mientras que el grupo C y D entraron en SW inmediatamente después de la exposición. La exposición de todos los grupos se produjo durante un breve periodo en agua salobre.

Los tanques A y B, y los tanques C y D eran duplicados para compensar la variabilidad de tanque a tanque.

Volumen usado: 500 ml de probiótico/placebo y 500 ml de vacuna/placebo y 4 litros de agua por tanque/cuba de inmersión.

Se sumergieron cinco peces durante 60 segundos cada vez. Esto se repitió 32 veces para que los 160 peces de dos tanques (por ejemplo, A1 y B1) se trataran en el mismo baño.

El estudio durará aproximadamente 111 días con un análisis intermedio después de 40 días. Se predice que la tasa de mortalidad acumulada sea del 16 % en los grupos de tratamiento y del 40 % en los grupos de control.

Definición de Día 0 y Día -21

El Día 0 es el día en que todos los peces se ponen en agua salada/de mar. Para el grupo A y B el Día -21 es el inicio del tratamiento con el baño biótica y/o de inmersión. Para los grupos C y D, el tratamiento comienza el Día 0.

Todos los grupos se tratarán en SW, también los grupos tratados con dos probióticos, antes de volver a poner los peces en tanques de crianza con agua dulce (A y B) o directamente en agua salada/mar (C y D).

Ocultación y marcado

Los peces de los grupos de tratamiento se mantendrán en tanques separados durante el experimento. El estudio tendrá doble ocultación y los peces se seleccionarán aleatoriamente para cada tanque. Las personas no implicadas en el tratamiento diario de los peces o en el análisis de los datos realizarán la ocultación del tratamiento. Se guardarán dos sobres con los códigos y no se abrirán hasta el final del análisis de datos.

Tabla 6: Los volúmenes añadidos de placebo/vacuna/ambiotica fueron 1500 ml cada uno en 12 litros de agua. La persona responsable de realizar la exposición no sabía qué había en los frascos. La tabla es solo un ejemplo de m rí r r l m in i n.

Ejemplo: Letras griegas para exposición y mayúsculas para tanque. La combinación a (que puede contener cualquiera de los tratamientos) se le dio a un tanque aleatorio en los grupos A, B, C y D.

Lo mismo sucedió para los otros tratamientos. La persona que ocultó el estudio registró en qué tanque se realizó el tratamiento y almacenó el código en un sobre con sello. El ocultador estuvo implicado en la exposición durante el estudio o en la manipulación de datos después del estudio.

Probiótico/placebo se identificaron con los números correspondientes (Aa, Ap, Ay o Ao) de los cuales solo dos contenían medio sin bacterias vivas. Los frascos con vacunas se identificaron con una letra (Ba, Bp, By o Bo), de los cuales dos contenían placebo y dos contenían vacuna. Todos los frascos estaban cubiertos con papel de aluminio. Un tubo de vacuna iba con un frasco de probiótico y presentaba ocultación (tabla 3 anterior).

Todos los peces se marcaron con PIT antes del inicio del estudio.

Observaciones y análisis provisional

Durante el periodo de observación se clasificaron todas las mortalidades. Los registros de alimentación se mantuvieron para cada tanque en estudio. Se midió la concentración de bacterias beneficiosas en 5 peces en 4 momentos para todos los grupos extrayendo sangre de 5 peces. La primera vez fue 5 minutos después del primer tratamiento para todos los grupos que recibieron tratamiento con probióticos antes de colocarlos en los tanques. La segunda vez el Día 0 y la tercera vez en el momento del análisis provisional el Día 40. Se analizaron al menos 5 peces al final del Día 90. Peso

Los peces se pesaron y se midieron al inicio con un promedio de 100 peces y cada individuo al final del estudio en los 16 tanques. El día 40 se realizó un análisis provisional donde se calculó el peso medio y la supervivencia para cada tanque basándose en los peces enfermos hasta el día 40.

Examen bacteriológico durante y al final del estudio.

Los peces que murieron durante el periodo de observación y se clasificaron como mortalidades y enfermedad (MD), se midió el peso y la longitud y se mantuvieron refrigerados para cultivo y examen bacteriológico. La cuantificación de la carga bacteriana se realizó en 5 peces de cada uno de los 16 tanques de tratamiento el día -21, día 0, día 40 y en todos los peces supervivientes al final del estudio. Al final del estudio, se extrajo sangre de todos los peces vivos y se pesaron, se midieron y se cultivaron bacterias.

Resultados

Cuando el probiótico se aplica en una concentración de 1:8 como una inmersión de 30 segundos en agua dulce 3 semanas antes de soltar los esguines al agua de mar, hay una tasa de crecimiento mejorada en comparación con el grupo de control. La combinación de inmersión en bacterias probióticas y vacunación por inmersión también aumenta la tasa de crecimiento en comparación con la vacunación sola. El grupo de control no expuesto tiene los esguines con la menor tasa de crecimiento entre los grupos de ensayo.

Si la exposición al probiótico y la vacuna por baño se realiza en el momento de la suelta al mar, las diferencias en la tasa de crecimiento entre los grupos experimentales tienen la misma tendencia, pero las diferencias son mínimas, lo que subraya que es beneficioso sumergir el salmón en probióticos y baño de vacuna algunas semanas antes de la suelta al mar (véanse las Figuras 13, 14, 15, 16, 17 y 18).

Ejemplo 8

Efectos de diferentes combinaciones de A. njordis, A. balderis y A. nannie y efectos de diversas concentraciones de las bacterias probióticas

Objetivos del estudio

Para determinar qué combinación de tres cepas diferentes de Aliivibrio sp. inocua en la combinación 1 (A. njordis) y 2 (A. balderis), y 2 (A. balderis) y 3 (A. nannie), con un tratamiento de baño estático de 30 minutos, la vacuna de inmersión dará como resultado la menor mortalidad y el mayor aumento de peso frente a controles no tratados para un periodo total de 65 días. A todos los grupos se les dio un periodo de 95 días (aproximadamente 950 atu) en agua dulce antes de la exposición al agua de mar.

Subobjetivos

1. Investigar si y qué combinación de dos cepas y concentraciones de bacterias probióticas serán más eficaces para aumentar el peso en comparación con los controles.

2. Investigar qué y si el tratamiento con una mezcla de bacterias probióticas dará como resultado mayores tasas de supervivencia, y/o aumento de peso, y/o tasas menores de signos moribundos, incluyendo oscurecimiento, letargo y presencia de signos de enfermedades específicas, tal como formación de úlceras, pudrición de aletas o pudrición de la boca en comparación con los controles no tratados.

Criterios de valoración del estudio

Los criterios de valoración para los objetivos fueron supervivencia, formación de úlceras, peso, tasa de crecimiento específico y tasa de conversión alimentaria. Los signos de morbilidad incluyen, sin limitarse a, úlceras, oscurecimiento de la piel, podredumbre de aletas, anorexia y podredumbre de la boca. Las úlceras se puntuaron por tamaño y gravedad.

Producto de ensayo

Las cepas de bacterias usadas como potenciador son tres Aliivibrio sp. no patógenas producidas de manera que se usan ciertos métodos patentados para manifestar las características de cultivo deseables (Tabla 5 Lista de Sustancias) Las cepas serán una combinación de la cepa 1 (A. njordis) y 2 (A. balderis) (tratamiento A), y cepa 2 (A. balderis) y 3 (A. nannie) (tratamiento B).

Descripción de peces experimentales

Especie Salmón del Atlántico (Salmo salar)

Cepa Mowi

Origen Huevas de Tveitevág, Preesguín de Fister Smolt AS

Peso promedio Promedio = aproximadamente 50 gramos (intervalo de peso 40 - 60 g)

Estado fisiológico Esguines L:D = 24:0

Número de peces 80 peces en cada uno de los diez grupos de tratamiento hasta un total

de 640 peces

Resumen del diseño

El estudio duró 160 días (95 días 65 días). Se incluirán cien peces en cada uno de los 8 grupos de tratamiento para un total de 800 peces. La configuración consistió en dos grupos principales, A y B, que recibieron bacterias probióticas Aliivibrio spp. en agua salobre en diferentes concentraciones, y un periodo de inmunización de 95 días (950 au) después del tratamiento en agua dulce. Aproximadamente el día 80 (cuando la biomasa alcanzó la densidad máxima, que es de unos 40 g/litro), todos los peces se juntaron en un tanque grande con agua de mar durante el resto del estudio (Figura 1). Los peces del grupo de control se trataron con placebo (solución sin bacterinas/bacterias).

Los volúmenes de Stembiont™ para cada dilución se describen en la tabla 3. Se predijo que la tasa de mortalidad acumulada sería 10 % en los grupos de tratamiento y 20 % en los grupos de control. Los peces muertos por cualquier causa no se repondrán en los grupos separados después del estudio.

El día 0 fue el día en que todos los peces recibieron agua salina/de mar. Para los grupos A y B el Día -95 es el inicio del tratamiento con el baño biótico.

Los peces de los grupos de tratamiento se marcaron con PIT y se mantuvieron en tanques separados durante el experimento. El estudio presentaba doble ocultación y los peces se seleccionaron aleatoriamente para cada tanque. Las personas no implicadas en el tratamiento diario de los peces o el análisis de los datos realizan la ocultación del tratamiento. Se guardaron dos sobres con los códigos y no se abrieron hasta el final del análisis de datos. Todos los peces se pesaron en el momento en que se marcaron con PIT.

Cuando los peces se trataron, el agua dulce de los tanques de 200 litros, con 180 litros de agua, se redujo a 90 litros. Los tanques se llenaron inmediatamente con agua salada hasta aproximadamente 180 litros (véase la tabla 3 para los volúmenes exactos) para obtener aproximadamente 17 ppt de concentración salina que es la concentración salina de Stembiont™ preferente. Los peces permanecieron en el tratamiento de agua durante 30 minutos antes de que el agua salobre se reemplazara por agua dulce fresca. Se midió la salinidad durante los 30 minutos de tratamiento y se oxigenó el agua.

Todos los peces se pesaron y midieron al inicio y al final del estudio. Cuando la biomasa alcanzó aproximadamente 40 g/litro, que fue aproximadamente el día 40, todos los peces se transfirieron a un tanque grande.

Los peces que murieron durante el periodo de observación se clasificaron como mortalidad y enfermedad (MD), se midieron peso y talla y se mantuvieron refrigerados para cultivo y examen bacteriológico. Al final del estudio se pesaron todos los peces, se midieron y se cultivaron bacterias.

Se calcularon mortalidad, peso medio, aumento de peso, tamaño, porcentaje relativo de supervivencia, curvas de supervivencia y número de úlceras de los peces supervivientes y se compararon entre todos los grupos. Todas las variables se calcularon desde el inicio hasta el traslado al tanque grande, desde el inicio hasta el final del estudio y desde el traslado al tanque grande hasta el final del estudio.

Resultados

El peso medio al final del ensayo fue de 169 (-3/+5) gramos en los ocho grupos. Solo 6 días después de cambiar de agua dulce a agua salada al 2,5 %, comenzó un brote causado por Moritella viscosa en el tanque común y la mortalidad aumentó durante dos semanas antes de disminuir gradualmente. Después de tres semanas de mortalidad tanto M. viscosa como Aliivibrio wodanis se aislaron de úlceras y el riñón cefálico durante las siguientes 3 a 4 semanas. Este brote de enfermedad fue un brote de úlcera de invierno clásico que se produjo de forma natural incluso si el agua de entrada se desinfectaba con UV. La mortalidad varió de un 20 a más de un 35 % entre los 8 grupos en un mismo tanque. Ambos grupos con probiótico diluido 1:100 tuvieron una mortalidad cercana al 20 % mientras que un grupo control tuvo una mortalidad del 34 %, el otro grupo control tuvo una mortalidad del 26 %. Se observó tanto un efecto de dosis en la mortalidad como un efecto de combinación de cepas probióticas en la mortalidad.

El número de salmones con peso superior al promedio en el grupo fue mayor en el grupo sumergido 30 minutos en la combinación de cepas 1 y 2 en comparación con la combinación de las cepas 2 y 3 lo cual está de acuerdo con los resultados para la tasa de crecimiento en el Ejemplo 3. Esta tendencia para un mayor número de peces con peso superior al peso medio del grupo en comparación con los dos grupos control es similar en las tres diluciones de bacterias probióticas usadas para el baño (véanse las Figuras 18, 19, 20 y 21).

Ejemplo 9

Ensayos de diversos parámetros físicos y biológicos que interactúan con la absorción de bacterias probióticas en la sangre del salmón del Atlántico

Salmón atlántico (Salmo salar) 30 - 60 gramos de pinto no esguinado y 80 - 100 gramos de esguines, en total 426 peces.

Criterios de inclusión/exclusión

Morfología de los criterios de inclusión: en el ensayo solo se usaron peces sanos, intactos y sexualmente inmaduros sin deformidades visuales aparentes ni anomalías de comportamiento.

Gestión de la cría antes de iniciar el estudio

Los peces se aclimataron de acuerdo con los requisitos del protocolo local (NIVA). Los peces y tanques se atendieron y monitorizaron diariamente. Los peces muertos se recogieron diariamente y los parámetros ambientales se registraron diariamente. Se informó de inmediato sobre comportamiento anómalo o inesperado, pérdida de apetito o cualquier aumento inesperado de la mortalidad.

T l 7: Vi i n n n i n

El protocolo está diseñado para cumplir con las monografías de la Farmacopea Europea.

Resumen del diseño

Los esguines (o alevines) de salmón atlántico se mantienen en agua dulce. Las bacterias se diluyeron en agua de mar donde se usaron bacterias de agua salada. Los esguines o alevines se dejaron durante un tiempo determinado en bacterias (se establece a continuación). Los peces se normalizaron en una mezcla de agua de mar antes de devolverlos a agua dulce donde Stembiont™ donde están muriendo en agua. Muestreo de sangre tras 5 min en agua dulce. Para la toma de muestras de sangre se usa benzocaína como anestesia. Salmón sacrificado por sobredosis. Para los ensayos A a D se usaron 165 peces.

A partir del cultivo de la sangre de 3 esguines y 6 pintos como controles negativos se obtuvo un crecimiento de un promedio de 36 cfu/ml de sangre con 9 de los 18 controles con 0, 10 o 20 cfu/ml (es decir, 0, 1 o 2 colonias por placa). A. Tiempo de baño; como concentración total usar log 7 (se usará una dilución 1:10, aprox. log 7) y A. njordis, A. balderis y A. nannie como combinación bacteriana (Ensayo 2). Se usaron seis peces en cada momento. Se incluyen 3 controles para el valor de referencia.

60 min 8836 cfu/ml sangre

45 min 9020 cfu/ml sangre

30 min 9723 cfu/ml sangre

15 min 4123 cfu/ml sangre

10 min 4283 cfu/ml sangre

5 min 893 cfu/ml sangre

3 min 2858 cfu/ml sangre

1 min 4383 cfu/ml sangre

30 s 607 cfu/ml sangre

Los resultados indican que el tiempo mínimo de baño de salmón en bacterias probióticas para obtener la máxima concentración de bacterias probióticas en sangre es aproximadamente 30 minutos. La mitad de esa concentración se logra después de 10 a 15 minutos. A menores intervalos de tiempo de 30 segundos a 5 minutos, la absorción de bacterias parece variar más, pero se produce una absorción de aproximadamente un tercio de la absorción que ocurre después de 30 minutos.

B. Concentración de Stembiont™; se usó 5 min y la combinación 1, 2, y 3 (Ensayo 3). Se usaron seis peces en cada momento.

log 4 130 cfu/ ml sangre

log 5 122 cfu/ml sangre

log 6 1890 cfu/ml sangre (615 cfu/ml de sangre del baño 2, 3166 cfu/ml de sangre del baño 1

log 7 893 cfu/ml sangre (de A)

(log 8) (cultivo no diluido aprox. log 7)

Los resultados muestran una clara dependencia de la dosis del agua de baño en la absorción de bacterias probióticas en sangre, a mayor concentración mayor tasa de absorción.

C. Concentración salina en el agua de baño; se usó 10 min y combinación 1, 2, y 3 (dilución de la combinación 1, 2, 3 del Ensayo 1 en 1:10 en mezclas frescas y saladas hechas primero) (Ensayo 4). Se usaron seis peces en cada momento.

Crecimiento

0 ppt 3+

5 ppt 4+

10 ppt 3+

15 ppt 4+

20 ppt 5+

25 ppt 4+

30 ppt 4+

Clasificación del crecimiento de sangre después de bañar salmón en cultivos bacterianos de salinidad variable: 5+ significa número regular en la mayoría de los peces y alta densidad, 4+ alta densidad de bacterias en sangre pero densidad variable entre diversos peces, 3+ menor densidad y número variable en diversos individuos de peces.

Los resultados indican que puede usarse un amplio intervalo de salinidad en la solución de inmersión desde agua dulce hasta agua marina pero con unos resultados más óptimos al bañar los peces en 20 ppt en comparación con concentraciones salinas menores y mayores.

D. Combinación Stembiont™; se usó 5 min y log 7 (se usó cultivo no diluido) como concentración total (Ensayo 1), Se usaron seis peces en cada momento. La cepa 1 es Aliivibrio njordis, la cepa 2 es Aliivibrio balderis y la cepa 3 es Aliivibrio nannie.

Cepa probiótica Cfu/ml de sangre

1, 2, 3 3000 y 2500

1, 2 3000 y 2000

3 400 y 1500

1, 3 60 y 1000

2, 3 200 y 2500

1 2500 y 200

2 3500 y 1000

Los resultados de las combinaciones de cepas en la concentración de bacterias en sangre indican que el uso de las tres cepas o las cepas 1 y 2 dan las concentraciones mayores y más regulares de bacterias probióticas en la sangre del salmón. Parece que la cepa 1 domina en el cultivo mixto por encima de las cepas 2 y 3. Parece que la cepa 2 domina en el cultivo mixto con la cepa 3.

Para los ensayos E, F, G y H se usarán 3 esguines o alevines por parámetro 29 x 3 = 87. Muestreo de sangre con Vacutainer y siembra en 2 placas de sangre con NaCl al 2,5 % de cada muestra de sangre, es decir, 87 placas de muestras de sangre x 2 = 174 placas de sangre, incubadas a 10 °C de 3-7 días.

Se usó un conjunto completo de parámetros para las tres categorías E, F y G 87 x 3 = 261 peces.

E. Estado diferente del esguín con respecto al agua de mar (Ensayo 5).

I. Esguín directamente de agua dulce; resultado: aprox. 3000 cfu/ml de sangre pero distribución más irregular. II. Esguín del mismo lote pero mantenido durante 7 días en agua de mar completa; resultado: aprox. 2000 cfu/ml de sangre.

III. Post esguín mantenido en agua de mar completa desde julio de 2016; Aprox. 1000 cfu/ml de sangre.

Los resultados indican que la etapa pre-esguín puede estar absorbiendo números elevados de bacterias probióticas pero con una distribución más desigual. Parece que el salmón esguinado listo absorbe una concentración alta y uniforme de bacterias en sangre. Parece que el esguín que ha estado 7 días en agua de mar completa está algo "saturado" de bacterias probióticas o similares pero aún así absorberá aproximadamente la mitad de las bacterias que se absorben en el lanzamiento al mar.

F. Diferentes temperaturas del agua de baño; usar un baño de 5 min, cultivo no diluido (log 7) de 1,2 y 3, agua de mar completa (Ensayo 6). Se usaron dos tipos de salmón, un esguín de 120 gramos, que permanece en agua dulce, listo para agua de mar y un pinto (35 g) que permanece en agua dulce. Se usaron seis de cada tipo para cada temperatura, un total de 12 peces y 12 placas sembradas con 0,1 ml de sangre sobre la superficie.

Esguín Pinto

1430 3824

1620 1630

1318 6325

1993 413

782 1023

633 382

627 6923

913 417

1540 12600

Los resultados indican que el salmón esguinado grande absorbe mejor las bacterias sobre la piel a temperaturas inferiores a 10 °C, por encima de 10 °C parece que el número de bacterias absorbidas en la sangre se reduce a la mitad. El pinto puede absorber mayores concentraciones de bacterias pr. ml de sangre posiblemente por el menor tamaño del cuerpo del pez. Sin embargo, parece que la variación en la absorción es mayor que con el esguín.

G. Cultivo antiguo (VI1 y VI2 de Bindalssmolt producido en Glycanova, 0ra, Fredrikstad, transportado a Bindal el 20-21/11-16, usado el 22/11-16 y devuelto el 22/11-16 a Oslo a través de Tjeldbergodden y a continuación almacenado en un contenedor vacío al aire libre con congelación, etc., hasta 20/12-16, a continuación diluido 1:2 en tanque con agua dulce estéril y seleccionado y almacenado a 6 °C) (Ensayo 7).

Se necesitan 3 x 2 Salmón de Fister en agua salada = 6 salmones de Fister.

Se necesitan 6 x 2 placas de agar sangre con NaCl = 12 placas de agar sangre con NaCl.

Resultados (6 salmones, 2 placas de agar de cada pez)

a. Glycanova (fermentador) cultivo de 9 semanas, dilución 1:100: 182 cfu/ml de sangre

b. Glycanova (fermentador) cultivo de 9 semanas, dilución 1:600: 508 cfu/ml de sangre

c. Glycanova, cultivo de 1 semana (18 °C) de A. njordis y A. balderis: 55 cfu/ml de sangre

d. Glycanova, cultivo fresco de A. njordis y A. balderis: 469 cfu/ml de sangre

e. Cultivo en laboratorio, A. njordis, cultivo fresco: 77,5 cfu/ml

f. Cultivo en laboratorio, A. balderis, cultivo fresco: 182 cfu/ml

g. Cultivo en laboratorio, A. njordis, una semana: 57,5 cfu/ml

h. Cultivo en laboratorio, A. balderis, una semana: 57,5 cfu/ml.

Los cultivos a y b están posiblemente contaminados con diferentes bacterias que crecen en el cultivo de 9 semanas.

Hay un claro aumento de bacterias probióticas en sangre cuando el cultivo es fresco en comparación con una semana, algo más del doble en la sangre cuando el cultivo es fresco en comparación con una semana.

H. Diversos cultivos bacterianos; usar baño de 5 min, cultivo no diluido (log 7).

El examen bacteriológico de muestras de sangre se realizó en el 100 % de los peces.

No se tomaron otras muestras.

Las muestras de sangre (0,1 ml) de cada pez se sembraron en dos placas de agar. El número medio de CFU será la unidad usada para el cálculo de diferencias en la absorción de bacterias entre peces tratados.

Resultados

Los diversos factores a establecer para un uso optimizado de las bacterias probióticas A. njordis, A. balderis Y A. nanniae parecen mapeados. Parece que la solidez del sistema biológico relacionado con estas bacterias y el contacto íntimo con los peces son elevados. Pueden esperarse buenos resultados del uso de probióticos en un amplio espectro de muchos parámetros sometidos a ensayo en el Ejemplo 9. Posiblemente uno de los parámetros más importantes es la concentración del cultivo probiótico, es decir, a mayores concentraciones de bacterias, mayor número de bacterias se absorbe dentro de los minutos habituales a media hora como el periodo de tiempo óptimo. Sin embargo, las diluciones de cultivos hasta 1:1000 pueden producir efectos positivos medibles. La combinación de salinidad, temperatura de la cepa no tiene un impacto muy fuerte, por lo que es necesario ser estricto con estos parámetros en los protocolos usados.

Conclusiones

Las bacterias probióticas denominadas Aliivibrio njordis, Aliivibrio balderis y Aliivibrio nannie están implicadas separadamente o en diferentes combinaciones en los 9 estudios (Ejemplos 1 a 9) de esta aplicación. La aplicación de estas bacterias probióticas se ha sometido a ensayo hasta ahora en acuarios de investigación con grupos de /-100 peces y en instalaciones industriales de tamaño intermedio con 4.500 individuos habituales en los grupos finalmente en piscifactoría industrial de post esguines que implica grupos habitualmente de 100.000 peces en cada tanque.

En los acuarios de investigación se han establecido intervalos importantes para diversos parámetros necesarios para protocolos prácticos para el uso de las tres especies de bacterias probióticas en la industria de piscicultura.

A partir del Ejemplo 9 es evidente que las bacterias probióticas pueden ser beneficiosas en todo intervalo de tiempo sometido a ensayo para la aplicación del baño de 30 segundos hasta una hora. Exposiciones menores a 3 minutos parecen ser suficientes para obtener un tercio de la transferencia de las bacterias probióticas a la sangre del salmón en comparación con 30 minutos que parece ser el periodo de tiempo menor y óptimo para obtener una alta absorción de las bacterias probióticas a la sangre del salmón del Atlántico.

Los experimentos con baño de salmón apuntan claramente que hay una mayor absorción de bacterias probióticas a la sangre de salmones cuanto mayor es la concentración de las bacterias probióticas en el agua de inmersión. Parece ser beneficioso bañar los peces en todas las concentraciones de las bacterias probióticas y sumergir los peces en concentraciones densas de bacterias, ya que se ha mostrado que la dilución 1:10 es eficaz cuando la inmersión se produce solo durante 30 segundos. Diseñar buenas y prácticas estrategias de baño basadas en variar la concentración de las bacterias probióticas y el tiempo de inmersión hace que los protocolos que pueden desarrollarse sean aplicables a muchos procedimientos operativos industriales diferentes de piscicultura.

Parece que diversas concentraciones salinas de la inmersión para baño o inmersión con las bacterias probióticas no tienen mayor impacto ya que pueden realizarse baños eficaces en diversas concentraciones de sal desde agua salada marina hasta agua dulce. Aparentemente, puede ser un pequeño óptimo usar un 2 % de sal en la solución de baño en comparación con concentraciones salinas mayores o menores.

Tanto de los experimentos de acuario con baño de peces como de los estudios industriales en la aplicación parece que la combinación de A. njordis y A. balderis es más eficaz que incluir A. nannie en las exposiciones probióticas.

El salmón del Atlántico puede bañarse eficazmente en todo tipo de etapas de la vida con un buen efecto en el crecimiento y la prevención de enfermedades. Sin embargo, parece que los esguines listos para el mar/agua bañados antes o al transferirlos al mar están absorbiendo las bacterias probióticas más uniformemente que antes en la fase de agua dulce en la planta de esguines. Además, parece haber una absorción reducida de estas bacterias probióticas después de algunos días en el agua de mar. Es potencialmente una competencia entre bacterias en el mar para acercarse y conectarse a la microbiota del salmón del Atlántico.

La temperatura de inmersión con bacterias probióticas no tiene un impacto importante en la absorción de bacterias a la sangre. Se han sometido a ensayo temperaturas entre 4 y 20 °C y puede haber una absorción ligeramente mayor en el intervalo de temperatura es menor que de 10 °C y hasta 20 °C. Sin embargo, estas diferencias parecen ser menores y pueden estar relacionadas con variaciones de pez a pez individuales cuando la temperatura está en el intervalo mayor.

No parece que la edad del cultivo probiótico tenga un impacto importante en la absorción de bacterias probióticas dentro del intervalo de una semana cuando el cultivo se almacena a 18 °C. Sin embargo, cuando el cultivo se hace denso en una atmósfera aeróbica como en un fermentador, una absorción reducida puede ser importante para el almacenamiento. Esta diferencia no se ve tan claramente cuando se usan cultivos de laboratorio con menor densidad.

De todos los ensayos y ejemplos parece que los protocolos de probióticos son sólidos, pero que las concentraciones de baño de 1:600 están en el intervalo más bajo para obtener resultados que sean económicamente sólidos para que la industria de la piscicultura pueda usar exposiciones de probióticos. Sin embargo, cuando parece que la dilución es 1:200 o 1:100 o concentraciones de inmersión de 1:10 son valiosas para la industria tanto para la prevención de enfermedades como para una mayor tasa de crecimiento.

Es claramente una indicación de que puede ser más beneficioso aplicar los probióticos en la fase de agua dulce en la planta de esguines unas semanas antes del lanzamiento al mar, pero los resultados beneficiosos también son claramente evidentes cuando se aplican en el lanzamiento al mar.

Parece que las bacterias probióticas ayudan a los peces a estabilizar la situación relacionada con los desafíos de las bacterias patógenas y parecen respaldar los mecanismos de defensa, como las diversas partes del sistema inmunitario. Entre los factores que revelan esto, están las estimaciones de SGR en los ensayos industriales más grandes.

Uno de los ejemplos más sorprendentes y fuertes en esta aplicación es el ensayo donde un baño de 30 min en la fase de agua dulce como pinto reduce la mortalidad causada por la úlcera de invierno clásica 4 a 5 meses después en agua salobre y salada. Además, hay una clara estimulación de la tasa de crecimiento de 4 a 5 meses más tarde en el agua de mar. Para poder conseguir resultados tan sólidos en la industria piscícola con aplicaciones de probióticos, parece óptimo intentar diseñar protocolos que empleen y combinen las combinaciones más óptimas de parámetros con impacto sobre el efecto de las bacterias probióticas en el salmón. Esta aplicación demuestra algunos de los factores más importantes que deben ajustarse para las diversas adaptaciones industriales necesarias para los protocolos de exposición.

Debe entenderse que aunque la invención se ha descrito junto con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la invención, que está definido por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

A menos que se describa expresamente lo contrario, cada una de las características preferentes descritas en el presente documento puede usarse en combinación con todas y cada una de las otras características preferentes descritas en el presente documento.

REFERENCIAS

1. Toranzo, A. E., Magariños, B., Romalde, J. L. 2005. A review of the main bacterial fish diseases in mariculture systems. Aquaculture 246 (2005) 37 - 61.

2. Karlsen, C., S0rum, H., Willassen, N. P., Ásbakk, K. 2012. Moritella viscosa bypasses Atlantic salmon epidermal keratocyte clearing activity and might use skin surfaces as a port of infection. Vet Microbiol, 154(3-4): 353-62. Epub 30 de julio de 2011.

3. Lunder, T., Evensen, 0. Holstad, G., y Hástein, T. 1995. "Winter ulcer" in the Atlantic salmón Salmo salar. Pathological and bacteriological investigations and transmission experiments. Dis. Aquat. Org. 23: 39 - 49.

4. L0voll, M., Wiik-Nielsen, C. R., Tunsj0, H. S., Colquhoun, D., Lunder, T., S0rum, H., Grove, S. 2009. Atlantic salmon bath challenged with Moritella viscosa - Pathogen invasion and host response. Fish Shellfish Immunol, 26: 877-884.

5. Cipriano, R.C. y R.A. Holt. 2005. Flavobacterium psychrophilum, cause of Bacterial Cold-Water Disease and Rainbow Trout Fry Syndrome. Fish Disease Leaflet No. 86. United States Dept. of the Interior. U.S. Geological Service, National Fish Health Research Laboratory, Kearneysville, WV.

6. Nematollahi A, Decostere A, Pasmans F, Haesebrouck F. 2003. Flavobacterium psychrophilum infections in salmonid fish. J Fish Dis.; 26(10): 563-74.

7. Verschuere, L, Rombaut, G, Sorgeloos, P., Verstraete, W. 2000. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64: 655-671.

8. Kashulin A. y S0rum H. 2014. A novel in vivo model for rapid evaluation of Aliivibrio salmonicida infectivity in Atlantic salmon. Aquaculture 420, 112-118.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un método no terapéutico para aumentar el peso de los peces, comprendiendo dicho método las etapas de a) añadir una o más especies de bacterias probióticas al agua, en donde las especies de bacterias comprenden o consisten en Aliivibrio njordis, Aliivibrio balderis y/o Aliivibrio nannie; y

b) exponer los peces al agua que contiene las una o más especies de bacterias probióticas, tal como durante un periodo de tiempo de 1 segundo a 5 horas, tal como de 1 segundo a 2 horas, tal como de 1 segundo a 1 hora, tal como de 30 segundos a 1 hora o de 1 minuto a 30 minutos.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 para aumentar simultáneamente la tasa de crecimiento de los peces.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde dichos peces son peces de la familia Salmonidae, tales como salmón, trucha, salvelinos, corégonos de agua dulce o tímalos.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el agua tiene una concentración salina de aproximadamente un 0 a aproximadamente un 4 % en peso, tal como de aproximadamente un 2 a aproximadamente un 4 % en peso.

5. Una bacteria probiótica de la especie Aliivibrio njordis, Aliivibrio balderis y/o Aliivibrio nannie para uso en el tratamiento y/o prevención de una infección microbiana en peces, tal como una infección bacteriana, tal como una infección bacteriana que causa heridas, úlceras y/o lesiones en la piel de los peces, y/o septicemia, tal como una infección bacteriana causada por una de más de una bacteria seleccionada entre el grupo que comprende M. viscosa, Bizionia piscinecroseptica, Aliivibrio friggiae, Tenacibaculum dicentrarchi, Aliivibrio wodanis, Aliivibrio salmonicida, Aeromonas salmonicida, Vibrio anguillarum, Edwardsiella piscicida, Aeromonas hydrophila, Flavobacterium psychrophilum, y Aliivibrio salmonicida.

6. La bacteria probiótica de la especie Aliivibrio njordis, Aliivibrio balderis y/o Aliivibrio nannie para uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la bacteria probiótica se administra a los peces mediante

a) adición de una o más especies de la bacteria probiótica al agua; y

b) exposición de los peces al agua que contiene las una o más especies de la bacteria probiótica.

7. La bacteria probiótica de la especie Aliivibrio njordis, Aliivibrio balderis y/o Aliivibrio nannie para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5-6, en donde el agua tiene una concentración salina de aproximadamente un 0 a aproximadamente un 4 % en peso, tal como de aproximadamente 2 a aproximadamente 4.

8. La bacteria probiótica de la especie Aliivibrio njordis, Aliivibrio balderis y/o Aliivibrio nannie para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en donde los peces se exponen a las especies de bacterias probióticas durante un periodo de tiempo de 1 segundo a 5 horas, tal como de 1 segundo a 2 horas, tal como de 1 segundo a una 1 hora, tal como de 30 segundos a 1 hora o de 1 minuto a 30 minutos.

9. La bacteria probiótica de la especie Aliivibrio njordis, Aliivibrio balderis y/o Aliivibrio nannie para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5-8, en donde dichos peces son peces de la familia Salmonidae, tales como salmón, trucha, salvelinos, corégonos de agua dulce o tímalos.

10. La bacteria probiótica de la especie Aliivibrio njordis, Aliivibrio balderis y/o Aliivibrio nannie para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5-9 y para el uso simultáneo para aumentar el peso de dichos peces.

11. La bacteria probiótica de la especie Aliivibrio njordis, Aliivibrio balderis y/o Aliivibrio nannie para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5-10 y para el uso simultáneo para aumentar la tasa de crecimiento de dichos peces.

12. Una cepa aislada y biológicamente pura de la cepa Aliivibrio njordis B1-25, 18-1/2013 mandib V11, que se ha depositado en la National Collection of Industrial and Marine Bacteria y a la que se ha asignado el número de acceso NCIMB 42593.

13. Una cepa aislada y biológicamente pura de Aliivibrio balderis B1-24, 18-1/2013 kidn V12, que se ha depositado en la National Collection of Industrial and Marine Bacteria y a la que se ha asignado el número de acceso NCIMB 42592.

14. Una cepa aislada y biológicamente pura de Aliivibrio nannie B8-24, 313/2013 kidn V13, que se ha depositado en la National Collection of Industrial and Marine Bacteria y a la que se ha asignado el número de acceso NCIMB 42594.