ES2909014T3 - Composiciones y métodos para modular una respuesta inmunitaria - Google Patents

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Kristi Baker
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Abstract

Un método para determinar la eficacia de tratamiento en un sujeto que tiene una enfermedad autoinmunitaria, en donde al sujeto se le ha administrado un tratamiento que comprende una composición que comprende un anticuerpo anti-FcRn que inhibe la señalización mediada por interacción entre FcRn e IgG; el método comprende: a. proporcionar una muestra obtenida del sujeto; b. ensayar el nivel de TNF-α en la muestra; y c. determinar que el tratamiento es eficaz si el nivel de TNF-α en la muestra del sujeto es menor relativo al nivel en una muestra de referencia, o determinar que el tratamiento no es eficaz si el nivel de TNF-α en la muestra del sujeto es mayor relativo al nivel en una muestra de referencia.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para modular una respuesta inmunitaria
Referencia cruzada a solicitud relacionada
Esta solicitud reivindica beneficio bajo 35 U.S.C. §119(e) de la solicitud provisional en EE UU No. 61/909.229 presentada el 26 de noviembre, 2013.
Derechos del Gobierno
La invención se hizo con apoyo gubernamental con la subvención No. DK53056 concedida por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno tiene ciertos derechos hacia la invención.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a inmunología molecular y biología celular. Específicamente, en el presente documento se describen composiciones para aumentar la producción de IL-12 regulando las interacciones entre IgG y FcRn y métodos de usar la composición para tratar cáncer y enfermedades infecciosas en un sujeto. También se describen en el presente documento composiciones para disminuir la producción de IL-12 regulando las interacciones entre IgG y FcRn y métodos de usar la composición para tratar enfermedades autoinmunitarias en un sujeto. También se proporcionan en el presente documento métodos para evaluar la eficacia del tratamiento en un sujeto siguiendo los niveles de varias citoquinas.
Antecedentes de la invención
La siguiente descripción incluye información que puede ser útil en entender la presente invención. No es una admisión de que ninguna de la información proporcionada en el presente documento es estado de la técnica o relevante para la invención presentemente reivindicada, o que cualquier publicación especifica o implícitamente referenciada es estado de la técnica.
Los cánceres que surgen en sitios de la barrera de mucosa, en particular el pulmón, intestino grueso (IG), estómago y cuello uterino, representan una fracción considerable de neoplasias malignas humanas (Siegel et al., 2012). Un factor que contribuye a la susceptibilidad del colon a la transformación maligna es su entorno inmunosupresor (MacDonald et al., 2011) que es necesario para la tolerancia hacia antígenos microbianos y de la dieta, pero también produce respuestas inmunitarias anticancerosas disminuidas (Revatz y Nardelli-Haefliger, 2005; Saleh y Trinchieri, 2011). Identificar factores patofisiológicos capaces de contrarrestar esta desventaja inherente de la tolerancia local es crítico para entender y manipular la carcinogénesis en este, y posiblemente otros, sitios de mucosa.
La producción y manejo de IgG son componentes críticos de la inmunidad de mucosas, en particular en el IG donde la IgG representa una gran fracción de secreción de inmunoglobulina de mucosa homeostática (Kozlowski et al., 1997). La presencia de IgG en la luz intestinal se asocia con las acciones del receptor de transporte de IgG bidireccional, FcRn (receptor de Fc neonatal para IgG), que se expresa de por vida en la mayoría de las células endoteliales, epiteliales y hematopoyéticas murinas y humanas (Claypool et al., 2004; Zhu et al., 2001). FcRn es singularmente capaz de administrar IgG en la luz y también de retirar IgG luminal e inmunocomplejos que contienen IgG (IgG IC) que se administran al sistema inmunitario local de la lámina propia (LP) (Claypool et al., 2004; Yoshida et al., 2004). FcRn en células presentadoras de antígeno tal como células dendríticas (CD) también desempeña un papel crítico en el procesamiento de antígenos administrados como IgG IC y fomenta activamente respuestas de células T restringidas por el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I y clase II (Baker et al., 2011; Qiao et al., 2008) que pueden alternativamente fomentar colitis dirigida por IgG antibacteriana (Kobayashi et al., 2009) y protege de patógenos de la mucosa (Qiao et al., 2008; Yoshida et al., 2006).
Está bien aceptado que las respuestas mediadas por células T CD8+ citotóxicas son críticas para la inmunidad antitumoral eficaz (Pages et al., 2005) y se ha mostrado recientemente que FcRn permite presentación cruzada muy eficaz de antígenos en complejo con IgG por CD CD8-CD11b+ (Baker et al., 2011). Dada la abundancia tanto de IgG como CD derivadas de monocitos CD8-CD11b+ en tejidos de mucosa, especialmente en el contexto de neoplasia maligna (Kozlowski et al., 1997; Ma et al., 2011; MacSween y Eastwood, 1980), se examinó el papel de FcRn en respuestas de células T CD8+ homeostáticas y como un efector de vigilancia inmunitaria anticáncer. En el presente documento se describen hallazgos que muestran que la ligación de FcRn con inmunocomplejos que contienen IgG (IgG IC) está directamente implicada en la producción de IL-12, un regulador clave de una respuesta inmunitaria. La producción de IL-12 puede ser, por tanto, objetivo de agentes que aumentan la producción de IL-12 a través de interacciones FcRn/IgG alteradas de modo que se trata cáncer y/o enfermedades infecciosas o con agentes que disminuyen la producción de IL-12 a través de interacciones FcRn/IgG alteradas de modo que se tratan enfermedades autoinmunitarias, por tanto, satisfaciendo una necesidad para agentes terapéuticos para tratar cáncer, enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunitarias.
Los documentos WO 2006/118772, WO 2005/013912 y WO 2012/167039 divulgan métodos de tratar enfermedades autoinmunitarias usando anticuerpos contra el recetor de Fc neonatal.
Compendio de la invención
Las siguientes formas de realización y aspectos se describen e ilustran junto con sistemas, composiciones y métodos que se pretende sean ejemplares e ilustrativos, no limitantes en ámbito.
En un aspecto, la invención proporciona un método para determinar la eficacia de tratamiento en un sujeto que tiene una enfermedad autoinmunitaria, en donde al sujeto se le ha administrado un tratamiento que comprende una composición que comprende un anticuerpo anti-FcRn que inhibe la señalización mediada por la interacción entre FcRn e IgG; el método comprende proporcionar un muestra obtenida del sujeto; ensayar el nivel de TNF-a en la muestra; y determinar que el tratamiento es eficaz si el nivel de TNF-a en la muestra del sujeto es menor relativo al nivel en una muestra de referencia, o determinar que el tratamiento no es eficaz si el nivel de TNF-a en la muestra del sujeto es mayor relativo al nivel en una muestra de referencia. También se proporcionan en el presente documento composiciones y métodos para aumentar la producción de IL-12 en un sujeto en necesidad de ello. También se proporcionan en el presente documento composiciones y métodos para disminuir la producción de IL-12 en un sujeto en necesidad de ello.
En algunos aspectos, se describe, pero no reivindica, en el presente documento una composición para aumentar la producción de IL-12, la composición comprende inmunoglobulina G (IgG) o una variante de la misma o un fragmento de la misma.
En una forma de realización, la composición que comprende inmunoglobulina G (IgG) o una variante de la misma o un fragmento de la misma aumenta la señalización medida por interacción entre IgG y FcRn.
En una forma de realización, la composición que comprende inmunoglobulina G (IgG) o una variante de la misma o un fragmento de la misma aumenta una respuesta inmunitaria contra un antígeno.
En una forma de realización, la IgG puede ser cualquier isotipo de IgG incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 y/o IgG4.
En una forma de realización, la variante de IgG comprende una sustitución de metionina a leucina en la posición 428 y una sustitución de asparragina a serina en la posición 434.
En una forma de realización, la composición que comprende inmunoglobulina G (IgG) o una variante de la misma o un fragmento de la misma comprende además un antígeno conjugado a IgG o una variante de la misma o un fragmento de la misma de modo que se crea una estructura multimérica que puede entrecruzar FcRn.
En una forma de realización, la composición que comprende inmunoglobulina G (IgG) o una variante de la misma o un fragmento de la misma comprende además un antígeno acomplejado con IgG o una variante de la misma o un fragmento de la misma de modo que se crea una estructura monomérica o multimérica que puede entrecruzar FcRn.
En varias formas de realización, el antígeno es un antígeno tumoral, un antígeno endógeno, un antígeno asociado a célula, un cuerpo apoptótico, un antígeno microbiano, un antígeno vírico, un antígeno parasítico o una combinación de los mismos.
En varias formas de realización, el antígeno es una proteína o un proteomimético de la misma, un péptido o un peptidomimético del mismo, un lípido o una combinación de los mismos.
En algunas formas de realización, la IgG o una variante de la misma o un fragmento de la misma es de mamífero.
En algunas formas de realización, la IgG o una variante de la misma o un fragmento de la misma es humana.
En algunos aspectos, se describen, pero no reivindican, en el presente documento composiciones para disminuir la producción de IL-12 que comprende un agente que inhibe la señalización mediada por interacción entre FcRn e IgG.
En algunas formas de realización, el agente que inhibe la señalización mediada por interacción entre FcRn e IgG es uno cualquiera o más de un péptido, proteína, molécula pequeña, ácido nucleico, aptámero, oligonucleótido, anticuerpo o una combinación de los mismos.
En algunas formas de realización, el agente ácido nucleico que inhibe la señalización mediada por interacción entre FcRn e IgG es un ARNip específico para FcRn.
En algunas formas de realización, el agente anticuerpo que inhibe la señalización mediada por interacción entre FcRn e IgG se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo, un anticuerpo policlonal o un fragmento del mismo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado y anticuerpo monocatenario.
En algunas formas de realización, el agente que inhibe la señalización mediada por interacción entre FcRn e IgG es un agente biespecífico que comprende sitios de unión para IgG y FcRn.
En algunas formas de realización, el agente que inhibe la señalización mediada por interacción entre FcRn e IgG es una porción Fc recombinante de IgG o porción biológicamente activa de la misma o un proteomimético de la misma.
En algunas formas de realización, el agente que inhibe la señalización mediada por interacción entre FcRn e IgG es una porción Fc recombinante de IgG o porción biológicamente activa de la misma o un proteomimético de la misma, en donde la porción Fc de IgG o porción biológicamente activa de la misma es de mamífero.
En algunas formas de realización, el agente que inhibe la señalización mediada por interacción entre FcRn e IgG es una porción Fc recombinante de IgG o porción biológicamente activa de la misma o un proteomimético de la misma, en donde la porción Fc de IgG o porción biológicamente activa de la misma es humana.
También se describen, pero no reivindican, métodos para modular la interacción entre FcRn e IgG. El método comprende poner en contacto una célula con un agente que se une a FcRn y/o IgG y modula la unión de FcRn a IgG.
En algunas formas de realización, el agente para uso en el método para modular la interacción entre FcRn e IgG, aumenta la señalización mediada por interacción de FcRn e IgG.
En algunas formas de realización, el agente para uso en el método para modular la interacción entre FcRn e IgG, disminuye la señalización mediada por interacción de FcRn e IgG.
En algunas formas de realización, el agente para uso en el método para modular la interacción entre FcRn e IgG comprende sitios de unión específicos para IgG y FcRn.
En algunas formas de realización, el agente para uso en el método para modular la interacción entre FcRn e IgG comprende sitios de unión específicos para IgG y FcRn.
En algunas formas de realización, el agente para uso en el método para modular la interacción entre FcRn e IgG comprende sitios de unión específicos para la porción Fc de IgG.
En algunas formas de realización, el agente para uso en el método para modular la interacción entre FcRn e IgG comprende un agente polipéptido biespecífico que comprende sitios de unión específicos para IgG y FcRn.
En algunas formas de realización el agente polipéptido biespecífico para uso en el método para modular la interacción entre FcRn e IgG comprende un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a FcRn y un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a IgG.
También se describen, pero no reivindican, en el presente documento métodos para tratar, inhibir, prevenir metástasis de o prevenir recaída de cáncer en un sujeto en necesidad de ello. Los métodos comprenden proporcionar una composición que comprende inmunoglobulina G (IgG) o una variante de la misma o un fragmento de la misma y administrar una cantidad eficaz de la composición al sujeto para tratar, inhibir, prevenir metástasis de o prevenir recaída de cáncer en el sujeto.
En algunas formas de realización, la composición para uso en los métodos para tratar, inhibir, prevenir metástasis de o prevenir recaída de cáncer en un sujeto en necesidad de ello aumenta la señalización mediada por la interacción de IgG y FcRn.
En algunas formas de realización, la composición para uso en los métodos para tratar, inhibir, prevenir metástasis de o prevenir recaída de cáncer en un sujeto en necesidad de ello aumenta una respuesta inmunitaria contra el antígeno.
En algunas formas de realización, la composición para uso en los métodos para tratar, inhibir, prevenir metástasis de o prevenir recaída de cáncer en un sujeto en necesidad de ello comprende una IgG variante que tiene una sustitución de metionina a leucina en la posición 428 y una sustitución de asparragina a serina en la posición 434.
En algunas formas de realización, la composición que comprende inmunoglobulina G (IgG) o una variante de la misma o un fragmento de la misma para tratar, inhibir, prevenir metástasis de o prevenir recaída de cáncer en un sujeto en necesidad de ello comprende además un antígeno. En algunas formas de realización, el antígeno está conjugado a la IgG o una variante de la misma o un fragmento de la misma. En algunas formas de realización, el antígeno está acomplejado con la IgG o una variante de la misma o un fragmento de la misma.
También se describen, pero no reivindican, en el presente documento métodos para tratar, inhibir, o reducir la gravedad de enfermedades infecciosas en un sujeto en necesidad de ello. Los métodos comprenden proporcionar una composición que comprende inmunoglobulina G (IgG) o una variante de la misma o un fragmento de la misma y administrar una cantidad eficaz de la composición al sujeto para tratar, inhibir, o reducir la gravedad de enfermedades infecciosas en el sujeto.
En algunas formas de realización, la composición para uso en los métodos para tratar, inhibir, o reducir la gravedad de enfermedades infecciosas en un sujeto en necesidad de ello aumenta la señalización mediada por la interacción de IgG y FcRn.
En algunas formas de realización, la composición para uso en los métodos para tratar, inhibir, o reducir la gravedad de enfermedades infecciosas en un sujeto en necesidad de ello aumenta una respuesta inmunitaria contra el antígeno.
En algunas formas de realización, la composición para uso en los métodos para tratar, inhibir, o reducir la gravedad de enfermedades infecciosas en un sujeto en necesidad de ello comprende una IgG variante que tiene una sustitución de metionina a leucina en la posición 428 y una sustitución de asparragina a serina en la posición 434.
En algunas formas de realización, la composición que comprende inmunoglobulina G (IgG) o una variante de la misma o un fragmento de la misma para tratar, inhibir o reducir la gravedad de enfermedades infecciosas en un sujeto en necesidad de ello comprende además un antígeno. En algunas formas de realización, el antígeno está conjugado a la IgG o una variante de la misma o un fragmento de la misma. En algunas formas de realización, el antígeno está acomplejado con la IgG o una variante de la misma o un fragmento de la misma.
En varias formas de realización de los métodos, el antígeno es un antígeno tumoral, un antígeno endógeno, un antígeno asociado a célula, un cuerpo apoptótico, un antígeno microbiano, un antígeno vírico, un antígeno parasítico o una combinación de los mismos.
También se describen, pero no reivindican, en el presente documento métodos para tratar, inhibir, o reducir la gravedad de enfermedades autoinmunitarias en un sujeto en necesidad de ello. Los métodos comprenden proporcionar una composición que comprende un agente que inhibe la señalización mediada por la interacción entre FcRn e IgG y administrar una cantidad eficaz de la composición al sujeto para tratar, inhibir, o reducir la gravedad de enfermedades autoinmunitarias en el sujeto.
En algunas formas de realización, la composición para uso en los métodos para tratar, inhibir, o reducir la gravedad de enfermedades autoinmunitarias en un sujeto en necesidad de ello reduce o inhibe la producción de IL-12.
En algunas formas de realización, el agente para uso en los métodos para tratar, inhibir, o reducir la gravedad de enfermedades autoinmunitarias en un sujeto en necesidad de ello es uno cualquiera o más de un péptido, proteína, molécula pequeña, ácido nucleico, aptámero, oligonucleótido, anticuerpo o una combinación de los mismos.
En algunas formas de realización, el agente ácido nucleico para uso en los métodos para tratar, inhibir, o reducir la gravedad de enfermedades autoinmunitarias en un sujeto en necesidad de ello es un ARNip específico para FcRn.
En algunas formas de realización, el agente anticuerpo para uso en los métodos para tratar, inhibir, o reducir la gravedad de enfermedades autoinmunitarias en un sujeto en necesidad de ello se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo, un anticuerpo policlonal o un fragmento del mismo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado y anticuerpo monocatenario.
En algunas formas de realización, el agente para uso en los métodos para tratar, inhibir, o reducir la gravedad de enfermedades autoinmunitarias en un sujeto en necesidad de ello es un agente biespecífico que comprende sitios de unión para IgG y FcRn.
En algunas formas de realización, el agente para uso en los métodos para tratar, inhibir, o reducir la gravedad de enfermedades autoinmunitarias en un sujeto en necesidad de ello es una porción Fc recombinante de IgG o una porción biológicamente activa de la misma o un proteomimético de la misma.
Se describe además, pero no reivindica, en el presente documento un método para determinar la eficacia de tratamiento en un sujeto en necesidad de ello. El método incluye proporcionar una muestra de un sujeto, en donde al sujeto se le ha administrado una cantidad eficaz de una composición que comprende inmunoglobulina G (IgG) o una variante de la misma o un fragmento de la misma y ensayar los niveles de uno cualquiera o más de IL-12, IL-2, TNF-a, IFN-y, GM-CSF, IL-3, granzima B, Tbet o una combinación de los mismos en la muestra. En una forma de realización, el tratamiento es eficaz si los niveles de uno cualquiera o más de IL-12, IL-2, TNF-a, IFN-y, GM-CSF, IL-3, granzima B, Tbet o una combinación de los mismos en la muestra del sujeto son mayores relativos a los niveles en una muestra de referencia. En otra forma de realización, el tratamiento no es eficaz si los niveles de uno cualquiera o más de IL-12, IL-2, TNF-a, IFN-y, GM-CSF, IL-3, granzima B, Tbet o una combinación de los mismos en la muestra del sujeto son menores relativos a los niveles en una muestra de referencia. En una forma de realización, el sujeto tiene cáncer o una enfermedad infecciosa. En algunas formas de realización, la muestra es sangre, plasma o tejido.
También se describe, pero no reivindica, en el presente documento un método para determinar la eficacia de tratamiento en un sujeto en necesidad de ello. El método incluye proporcionar una muestra de un sujeto, en donde al sujeto se le ha administrado una composición que comprende un agente que inhibe la señalización mediada por la interacción entre FcRn e IgG y ensayar los niveles de uno cualquiera o más de IL-12, IL-2, TNF-a, IFN-y, GM-CSF, IL-3, granzima B, Tbet o una combinación de los mismos en la muestra. En una forma de realización, el tratamiento es eficaz si los niveles de uno cualquiera o más de IL-12, IL-2, TNF-a, IFN-y, GM-CSF, IL-3, granzima B, Tbet o una combinación de los mismos en la muestra del sujeto son menores relativos a los niveles en una muestra de referencia. En otra forma de realización, el tratamiento no es eficaz si los niveles de uno cualquiera o más de IL-12, IL-2, TNF-a, IFN-y, GM-CSF, IL-3, granzima B, Tbet o una combinación de los mismos en la muestra del sujeto son mayores relativos a los niveles en una muestra de referencia. En una forma de realización, el sujeto tiene una enfermedad autoinmunitaria. En algunas formas de realización, la muestra es sangre, plasma o tejido.
Breve descripción de las figuras
Las formas de realización ejemplares se ilustran en las figuras referenciadas. Se pretende que las formas de realización y figuras divulgadas en el presente documento se consideren ilustrativas más que restrictivas.
Las figuras 1A-1G representan, según varias formas de realización de la presente invención que FcRn protege contra el desarrollo de cáncer colorrectal mediante un mecanismo independiente de la microbiota intestinal. (Fig. 1A) Incidencia de tumores del intestino grueso (IG) a 5 meses de edad e histología tumoral representativa en ratones ApcMin/+ y ApcMin/+ Fcgrt-/\ Barra de escala = 100 pm. (Fig. 1B) Incidencia tumoral en hermanos de camada WT y Fcgrt-'' tratados con 8 dosis de azoximetano (AOM). (Fig. 1C) Incidencia tumoral en hermanos de camada WT y Fcgrt-A tratados con AOM/DSS. (Fig. 1D) Incidencia tumoral y diámetro de tumor máximo en hermanos de camada WT y Fcgrt-A en cada uno de cuatro experimentos independientes con n > 3 ratones por grupo por experimento. (Fig. 1E) Porcentaje de supervivencia de hermanos de camada WT y Fcgrt-A tratados con AOM/DSS. La significancia se evaluó por prueba del orden logarítmico. (Fig. 1F) Índices de riqueza de microbiota asociada con el IG distal de hermanos de camada WT y Fcgrt-A de 8 semanas de edad sin tratar, revelado por análisis de T-RFLP. n = 3-5 ratones por grupo. (Fig. 1G) Abundancia de especies microbianas específicas en el IG distal de hermanos de camada WT y Fcgrt-A de 7 semanas de edad sin tratar evaluado por qPCR. n = 9 ratones por grupo. Resultados representativos de dos (1A, 1B, 1E) o cuatro (1D) experimentos independientes cada uno con n = 4-10 ratones por grupo. Todos los datos representan la media ± e.e.m. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,005.
Las figuras 2A-2D representan, según varias formas de realización de la presente invención que FcRn dirige la activación y retención de células T CD8+ citotóxicas reactivas con tumor que confieren protección tumoral. (Fig. 2A) Frecuencia de células T CD8+ en la fracción de linfocitos de lámina propia (LPL) del tejido del IG tumoral y adyacente en hermanos de camada WT y Fcgrt-A (paneles superiores) después de tratamiento con AOM/DSS. El potencial citotóxico de células en el portal CD3+CD8+ se evaluó por tinción intracelular con granzima B (paneles medios) o tinción de superficie de LAMP1 (paneles inferiores). (Fig. 2B) Frecuencia media de células T CD8+ y potencial citotóxico en ratones WT y Fcgrt-A, evaluado por citometría de flujo en cada uno de tres experimentos independientes. (Fig. 2C) Secreción de citoquinas de células CD8+ CD44+CD62L- efectoras separadas de la LP de tejido tumoral y adyacente de ratones WT y Fcgrt-A tratados con AOM/DSS después de 24 h de reestimulación con anti-CD3 y anti-CD8. (Fig.
2D) Incidencia tumoral y carga tumoral (suma de diámetros de todos los tumores) en ratones receptores adoptivamente transferidos con células T CD8+ de donantes WT o Fcgrt-A tratados con AOM/DSS. La significancia se evaluó por la prueba de Mann-Whitney. Resultados representativos de tres experimentos independientes con n > 4 ratones por grupo por experimento. Todos los datos representan la media ± e.e.m. NS = no significativo * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,005.
Las figuras 3A-3G representan, según varias formas de realización de la presente invención que CD CD8-CD11b+ utilizan FcRn para sensibilizar de forma eficaz respuestas de células T CD8+ antitumorales. (Fig. 3A) IgG específica de antígeno tumoral en el suero u homogenizados de MLN e IG de ratones WT o Fcgrt-A tratados con AOM/DSS. Se ensayaron placas de ELISA recubiertas con lisados de epitelio tumoral con diluciones de suero u homogenizados de tejido de ratones portadores de tumores. (Fig. 3B) Perfiles de transcritos de subconjuntos de CD CD8-CD11b+ y CD8+CD11b' separados, aislados del compartimento de tejido indicado de hermanos de camada WT y Fcgrt-A tratados con AOM/DSS. (Fig. 3C) Incidencia tumoral y supervivencia en receptores Fcgrt-A transferidos adoptivamente con CD del MLN y PL de donantes WT o Fcgrt-A tratados con AOM/DSS. Se evaluó la supervivencia en el punto final usando una prueba Chi cuadrado. (Fig. 3D) Frecuencia de células T CD8+ en la LP del IG después de transferencia de DC WT a receptores Fcgrt-A tratados con AOM/DSS. (Fig. 3E) Incidencia tumoral y frecuencia de células T CD8+ en la LP del IG en ratones ItgaxcreFcgrtFl/Fl y sus controles FcgrtFl/Fl hermanos de camada tras tratamiento con AOS/DSS. (Fig.
3E-3G) Incidencia tumoral (Fig. 3F) y supervivencia (Fig. 3G) de ratones Fcgrt-A con células T CD8+ eliminadas adoptivamente transferidos con DC WT. Las células T CD8+ se eliminaron por administración i.p. crónica de anticuerpo anti-CD8 (o isotipo control). Resultados representativos de tres (Fig. 3B-3E) o dos (Fig. 3A, 3F) experimentos independientes con n 3-6 ratones por grupo por experimento. Todos los datos representan la media ± e.e.m. NS = no significativo. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,005.
Las figuras 4A-4F representan, según varias formas de realización de la presente invención que FcRn dirige la inducción de células T CD8+ reactivas al tumor endógenas y se pueden dirigir terapéuticamente. (Fig. 4A) Incidencia de nódulos metastásicos pulmonares formados por células de melanoma B16 que sobreexpresan OVA (OVA-B16) administradas i.v. en ratones WT o Fcgrt-/- o ratones Fcgrt-/- preinmunizados con CD WT o Fcgrt-/-. (Fig.4B) Frecuencia de células T CD8+ específicas de OVA-B16 que se producen endógenamente en ratones portadores de metástasis WT y Fcgrt-/-. El panel izquierdo demuestra resultados de animales individuales en un único experimento. El panel derecho muestra los resultados de tres experimentos independientes cada uno con n = 3-6 animales por grupo. (Fig.
4C) Frecuencia de metástasis pulmonares de ratones tratados como en (Fig. 4A) y dados o bien anticuerpo que elimina células T CD8+ o isotipo control. (Fig. 4D) Frecuencia de nódulos metastásicos pulmonares y células T c D8+ específicas de OVA en los pulmones de hermanos de camada FcgrtFl/Fl y ItgaxcreFcgrtFl/Fl. (Fig. 4E) Incidencia de nódulos metastásicos pulmonares en ratones WT o Fcgrt-/- o ratones Fcgrt-/- adoptivamente transferidos con células T CD8+ específicas de OVA sensibilizadas ex vivo por CD cargadas con IgG IC que contienen OVA, IHH-IgG IC que no se une a FcRn u OVA soluble. (Fig.4F) Incidencia de nódulos pulmonares en ratones WT y Fcgrt-/- tratados con OVA-B16 preinmunizados con CD WT cargadas ex vivo con IC que contiene OVA formados con IgG o LS-IgG de unión a FcRn aumentada. Resultados representativos de tres (Fig. 4A, 4B, 4D) o dos (Fig. 4C, 4E, 4F) experimentos independientes con n 3-6 ratones por grupo por experimento. Todos los datos representan la media ± e.e.m. NS = no significativo. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,005.
Las figuras 5A-5G representan, según varias formas de realización de la presente invención que FcRn en CD permite activación homeostática de células T CD8+ y producción de IL-12 en el IG. (Fig. 5A) Contenido de isotipo IgG del suero y homogenizados de IG o MLN en hermanos de camada WT y Fcgrt-/-. sin tratar. (Fig. 5B) Frecuencia de células T CD8+ de la fracción LPL del IG de hermanos de camada WT y Fcgrt-/- sin tratar en un único experimento (paneles izquierdos) o a través de tres repeticiones experimentales independientes (panel derecho). (Fig. 5C) Frecuencia de células T CD8+ en la fracción LPL del IG de hermanos de camada FcgrtFl/Fl e ItgaxcreFcgrtFl/Fl. (Fig. 5D) Secreción de citoquinas por células T CD8+ separadas de la LP de IG de ratones WT y Fcgrt-/- sin tratar después de 24 horas de reestimulación con anti-CD3 y anti-CD28. (Fig. 5E) Perfiles de transcritos de células T CD8+ separadas de la LP de IG de ratones control hermanos de camada sin tratar. (Fig. 5F) Secreción de citoquinas de cultivos de explantes de tejido de 24 h de MNL e IG de ratones WT y Fcgit/- sin tratar. (Fig. 5G) Perfiles de transcritos de CD CD8'CD11b+ separadas de MLN de hermanos de camada sin tratar. Resultados representativos de tres experimentos independientes con n = 3-5 ratones por grupo por experimento. Todos los datos representan la media ± e.e.m. NS = no significativo. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,005.
Las figuras 6A-6F representan, según varias formas de realización de la presente invención que la ligación por IgG IC de FcRn en CD CD8'CD11b+ indujo la producción de IL-12 a través de la activación de una cascada de señalización. (Fig. 6A) Inducción de IL-12p35 tras la estimulación ex vivo de CD CD8'CD11b+ WT del bazo o MLN con IgG IC o IHH-IgG IC que no se une a FcRn durante 6 h. (Fig.6B) Secreción de IL-12 después de 24 h de estimulación con IgG IC de DC CD8'CD11b+ y CD8+CD11b' separadas de MNL de ratones WT y Fcgrt-/- tratados con AOM/DSS. (Fig. 6C) Fosforilación de STAT-1 y translocación nuclear de IRF-1 y NF-kB p65 tras estimulación con IgG IC de CD aisladas de ratones WT y Fcgrt-/-. (Fig. 6D) Producción de transcrito de IL-12 por CD CD8'CD11b+ WT o Stat-1-A después de estimulación con IgG o IHH-IgG IC durante 6 h. (Fig. 6E) Unión de IRF-1 y NF-kB p65 a los promotores de IL-12p35 e IL-12p40 tras estimulación de DC WT o Fcgrt-/- con IgG IC o IHH-IgG IC durante 4 h. (Fig.6F) Incidencia tumoral en ratones adoptivamente transferidos con CD WT y tratados con un anticuerpo neutralizante anti-IL-12 o isotipo control. Resultados representativos de tres ((Fig. 6A-6E) o uno (Fig. 6F) experimentos independientes con n 3-7 ratones por grupo por experimento. Todos los datos representan la media ± e.e.m. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,005.
Las figuras 7A-7F representan, según varias formas de realización de la presente invención que CD que expresan FcRn predicen la supervivencia en CRC humano y secretan IL-12 tras estimulación con FcRn. (Fig. 7A) Tinción inmunohistoquímica doble para CD FcRn+CD11c+ en el estroma de CRC (paneles superiores) e IG normal adyacente a CRC (paneles inferiores). FcRn = marrón, CD11c = rojo. Barra de escala de los paneles izquierdos = 100 pm. Barra de escala de los paneles derechos = 20 pm. (Fig. 7B) Colocalización de CD FcRn+ y células T CD8+ en estroma de CRC (paneles superiores) e IG normal adyacente a CRC (paneles inferiores). Las puntas de flecha indican áreas de colocalización. (Fig. 7C) Curvas de supervivencia de Kaplan Meier de 183 pacientes con infiltración tumoral alta (> 10 por núcleo) y baja (< 10 por núcleo) por células CD11c+FcRn+. (Fig. 7D) Incidencia de tumores en ratones quiméricos tratados con a Om /DSS. Los receptores WT se reconstituyeron con médula ósea WT. Los receptores Fcgrt-/- se reconstituyeron con médula ósea Fcgrt-/-, WT o hFCGRT-hB2M-mFcgrt-/'. Resultado representativo de dos experimentos independientes con n = 4-5 ratones por grupo por experimento. (Fig. 7E) Expresión de transcritos hIL-12p35 y hIL-12-p40 en hMoDC tras estimulación con inmunocomplejos (IgG IC) que se unen a FcRn o (IHH IgG IC) que no se unen a FcRn. (Fig. 7F) Translocación nuclear de IRF-1 y fosforilación STAT-1 en hMoDC tras estimulación con IgG IC o IHH IgG IC. Los datos en los paneles de Fig. 7A-7B son representativos de un total de 50 pares de CRC e IG normal adyacentes concordantes. Los datos en los paneles de Fig. 7E-7F son representativos de seis donantes procesados en pares en cada uno de tres experimentos independientes. Todos los datos representan la media ± e.e.m. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,005.
Las figuras 8A-8K representan, según varias formas de realización de la presente invención que la pérdida de FcRn predispone al desarrollo de cáncer colorrectal (CRC) asociado con inflamación y sin inflamación más grave a través de un mecanismo que es independiente de la microbiota intestinal. (Fig. 8A) Clasificación histológica de adenomas presentes en el intestino grueso (IG) de ratones ApcMin/+ y ApcMin/+Fcgrt-/' evaluados a los 5 meses de edad. (Fig. 8B) Frecuencia de adenomas en el intestino delgado (ID) de ratones ApcMin/+ y ApcMin/+Fcgrt-/~. n = 4-6 ratones por grupo en cada uno de dos experimentos independientes. (Fig. 8C) Diámetro de tumor máximo medido en ratones WT y Fcgrt-/- tratados con ocho dosis semanales de azoximetano (AOM) en un experimento representativo con n > 3 ratones por grupo. (Fig. 8D) Detalles del tratamiento azoximetano/sulfato sódico de dextrano (AOM/DSS) usado para la inducción de cáncer colorrectal asociado con inflamación. Los ratones se trataron con una única dosis 10 mg/kg de AOM por inyección i.p. (día -7). Siete días después (día 0), se dio a los ratones DSS al 1,5 % en su agua de beber durante un periodo de siete días. DSS se retiró y se dejó que los ratones bebieran agua regular durante 14 días (días 7-21). El ciclo de una semana en DSS (día 21-28) y dos semanas en agua regular (días 28-42) se repitió una vez. Los ratones se sacrificaron el día 42. (Fig. 8E) Histología representativa de los tumores presentes tanto en ratones WT como Fcgrt-A que muestran displasia grave e invasión (flechas) a través de la lámina propia en una lesión de un ratón Fcgrt-A. Barra de escala = 100 pm. (Fig. 8F) Curvas de peso durante los primeros 20 días de tratamiento de ratones que experimentan pauta AOM/DSS. Los ratones se pesaron cada 1-2 días. Los datos son representativos de dos experimentos independientes con n = 5 ratones por grupo por experimento. (Fig. 8G) Índices de riqueza de la microbiota encontrada en las heces de hermanos de camada WT y Fcgrt-A de 8 semanas de edad sin tratar, revelado por análisis de T-RFLP. n = 3-5 ratones por grupo. (Fig. 8H) Índices de riqueza de la microbiota encontrada asociada con el IG distal o en las heces de hermanos de camada WT y Fcgrt-A de 2 semanas de edad sin tratar, revelado por análisis de T-RFLP. n = 4-9 ratones por grupo. (Fig.8I) Gráficos de escalado multidimensional (MDS) que demuestran la composición de la comunidad microbiana en cada uno de los compartimentos de tejido indicados de ratones WT y Fcgrt-A de 8 semanas de edad y 2 semanas de edad sin tratar evaluado por T-RFLP. El análisis ANOSIM de matrices de similitud de Bray Curtis no reveló diferencias significativas entre ratones WT y Fcgrt-A para ninguna edad o compartimento de tejido. (Fig. 8J) Resultados de ANOSIM para el análisis de diferencias microbianas entre compartimentos de tejido dentro de cada grupo de edad, independientemente del genotipo. (Fig. 8K) Abundancia de especies microbianas específicas asociadas con las heces de ratones WT y Fcgrt-A de 7 semanas de edad sin tratar evaluado por qPCR. Los valores de cada especie se han normalizado a bacterias totales (16S). Cada punto representa un animal individual. n = 9 ratones por grupo. Todos los datos representan la media ± e.e.m. ND = no detectado. * p < 0,05.
Las figuras 9A-9G representan, según varias formas de realización de la presente invención que la vigilancia inmunitaria de tumor mediada por FcRn está mediada por activación selectiva y retención de células T CD8+ en la LP intestinal. (Fig.9A) Análisis de citometría de flujo de la frecuencia de células I CD4+, células NK (NK1.1) o macrófagos (F4/80) en la fracción de linfocitos de lámina propia (LPL) de tumor y tejido de IG adyacente en ratones WT y Fcgrt-A después de tratamiento con AOM/DSS. (Fig. 9B) Número absoluto de células I CD8+ aisladas del tejido LP del IG adyacente, tumoral o sin tratar (basal) en ratones tratados con AOM/DSS evaluado por tinción de citometría de flujo y adquisición de volúmenes fijos de muestra. (Fig. 9C-9D) Análisis de citometría de flujo de la frecuencia de células I CD8+ en la fracción de lámina propia (LP) de tejido IG adyacente al tumor en ratones ApcMin/+ y ApcMin/+Fcgrt-A sin tratar (Fig. 9C) y hermanos de camada WT y Fcgrt-A tratados con AOM/DSS (Fig. 9D). Resultados representativos de uno de tres experimentos con n = 3 ratones por grupo por experimento. (Fig. 9E) Análisis de citometría de flujo del nivel de proliferación de células I CD8+ (Ki-67) y apoptosis (anexina V) en la fracción LP de tejido del IG tumoral y adyacente en hermanos de camada WT y Fcgrt-A después de tratamiento con AOM/DSS. Los gráficos representan células en portal CD3+CD8+ de células. Gráficos representativos de tres experimentos independientes con n = 3 ratones por grupo por experimento. (Fig. 9F) Fenotipo de células I CD8+ en el compartimento de tejido indicado de hermanos de camada WT y Fcgrt-A tratados con AOM/DSS. Gráficos representativos de tres experimentos independientes con n = 3-4 ratones por grupo por experimento. (Fig. 9G) Tasas de supervivencia de ratones receptores tratados con AOM/DSS adoptivamente transferidos con células I CD4+ tomadas de MLN y LP de IG de donantes WT y Fcgrt-A tratados con AOM/DSS. Resultados representativos de uno de dos experimentos independientes con n = 4 ratones por grupo por experimento. La significación de las curvas de supervivencia se evaluó por la prueba del orden logarítmico. Todos los datos representan la media ± e.e.m. * p < 0,05.
Las figuras 10A-10L representan, según varias formas de realización de la presente invención que la protección tumoral mediada por células dendríticas (CD) dependiente de FcRn está asociada con la presencia de IgG reactiva con antígeno tumoral en tejidos intestinales y la generación de un entorno de citoquina polarizante Th1/Tc1. (Fig. 10A) Distribución de isotipos de IgG específica de antígeno tumoral en el suero u homogenizados de IG de ratones WT y Fcgrt-A tratados con AOM/DSS. Se ensayaron placas de ELISA recubiertas con lisados de epitelio tumoral con diluciones de suero u homogenizados de tejido de ratones portadores de tumores y se revelaron con anticuerpos secundarios específicos de isotipo. (Fig. 10B) Inmunotransferencias que demuestran IgG específica de antígeno tumoral en el suero y homogenizados de IG de cada uno de ochos ratones tratados con AOM/DSS. Los lisados con IgG eliminada preparados de células epiteliales intestinales (IEC) tumorales o IEC control no tumorales se resolvieron en condiciones reductoras por SDS-PAGE y las membranas de los lisados transferidos se ensayaron con suero u homogenizados de IG de ratones portadores de tumor. Membranas representativas de dos experimentos independientes con n = 4 ratones por grupo por experimento. Ac 2° = anti-IgG de ratón-HRP. (Fig. 10C) Veces de aumento sobre valores basales de contenido de IgG anti-fosfatidilserina (a-PS) y anti-cardiolipina (a-CL) en suero en hermanos de camada WT y Fcgrt-A. (Fig. 10D) Contenido de isotipo de IgG del suero, homogenizados de IG y homogenizados de MLN en ratones WT y Fcgrt-A tratados con AOM/DSS. (Fig. 10E) Análisis de citometría de flujo de la frecuencia de CD CD8+ frente a CD11b+ (fila superior, separadas en células CD11c+) y caracterización de las CD CD11c+CD8'CD11b+ (cuatro filas inferiores) en los tejidos de mucosa de hermanos de camada WT y Fcgrt-A tratados con AOM/DSS. (Fig. 10F-10H) Perfiles de transcritos de citoquinas de tejidos totales en los compartimentos de tejidos indicados de hermanos de camada WT y Fcgrt-A tratados con AOM/DSS (Fig. 10F), hermanos de camada ApcMin/+ y ApcMin/+Fcgrt-/- sin tratar (Fig. 10G) y hermanos de camada WT y Fcgit/- tratados con AOM (Fig. 10H). Resultados representativos de 2-4 experimentos independientes con n = 3-6 ratones por grupo por experimento. Los datos representan la media ± e.e.m. (Fig. 10I) Pureza (panel superior) y distribución de subconjuntos (panel inferior) de las c D transferidas en las Fig. 3C, 3F. (Fig. 10J) Frecuencia de c D WT o Fcgrt-/- congénicas (CD45.2) en MLN y LP de IG de ratones receptores (CD45.1) 3 días y 7 días después de transferencia intraperitoneal. Los ratones receptores inyectados con PBS se muestran como controles. (Fig. 10K) Presentación cruzada de antígenos ex vivo con CD aisladas de los MLN de los ratones receptores de CD tratados con AOM/DSS indicados y cargadas con IC que contienen inmunocomplejos (IC) de (IgG) que se unen a FcRn, (IHH-IgG) IC que no se unen a FcRn o antígeno soluble (OVA) y cocultivadas con células T CD8+OT-I. (Fig. 10L) Niveles de transcrito Fcgrt relativos evaluados por qPCR en CD (CD11c), macrófagos (CD11b) y hepatocitos purificados de ratones WT, Fcgrt--, FcgrtFl/Fl o ItgaxcreFcgrtFl/Fl. Los datos son representativos de dos experimentos independientes con n = 3-5 ratones por grupo por experimento. Todos los datos representan la media ± e.e.m. * p 50,05, ** p 50,01, *** p 50,005.
Las figuras 11A-11F representan, según varias formas de realización de la presente invención que se requieren tanto las células T CD8+ como IgG específicas de tumor para la protección mediada por FcRn de metástasis pulmonares. (Fig. 11A) Frecuencia de células T CD8+ en los pulmones de ratones WT o Fcgrt-/- sin tratar. (Fig. 11B-l1C ) IgG anti­ OVA específica de tumor en homogenizados pulmonares (Fig. 11B) o suero (Fig. 11C) de hermanos de camada WT y Fcgrt-/- portadores de metástasis pulmonares. Los pulmones se recogieron 2 semanas después de inyección i.v. de 0,5 x 106 células de melanoma B16 que expresa OVA (OVA-B16). El contenido de IgG anti-OVA se evaluó por ELISA y se normalizó al contenido de proteína de los homogenizados para (Fig. 11B). (Fig. 11D) Frecuencia de células B productoras de IgG específica de OVA en los ganglios linfáticos (LN) o bazos de ratones WT y Fcgrt-/- portadores de metástasis pulmonares OVA-B16. Las células B se aislaron y cultivaron en placas ELISpot recubiertas con OVA durante 24 h. (Fig. 11E) Lóbulos representativos de ratones inmunizados o sin inmunizar estimulados con inmunocomplejos (IC) formados con NIP-OVA e (IgG IC) que se une a FcRn, (IHH-IgG IC) que no se une a FcRn o (LS-IgG IC) de unión a FcRn aumentada y cocultivados con células CD8+OT-I. Todos los datos son representativos de los resultados de uno de tres experimentos con n = 3-6 ratones por grupo por experimento. Los datos representan la media ± e.e.m. NS = no significativo. * p < 0,05.
Las figuras 12A-12E representan, según varias formas de realización de la presente invención que FcRn en CD dirige activación local homeostática de células T CD8+ y la polarización Th1 de células T CD4+ en la Lp del IG facilitando la producción de citoquinas polarizantes Tc1 y Th1. (Fig. 12A) Frecuencia (paneles superiores) y estado efector (paneles inferiores) de células T CD8+ congénicas adoptivamente transferidas (CD45.1) en la LP de IG y MLN de ratones receptores WT y Fcgrt-/- sin tratar (CD45.2). 1 x 106 células I CD8+ se transfirieron a ratones receptores a través de inyección i.v. y su distribución y fenotipo se evaluó 10 días después. (Fig. 12B) Frecuencia de células I CD8+ adoptivamente transferidas de ratones donantes WT y Fcgrt-/- (CD45.2) en la LP del IG y MLN de ratones receptores sin tratar (CD45.1) 7 días después de la transferencia. (Fig. 12 C) Perfiles de transcritos de tejido entero del IG de hermanos de camada WT y Fcgrt-/- sin tratar (panel izquierdo) o hermanos de camada FcgrtFl/Fl e ItgaxcreFcgrtFl/Fl (panel derecho), evaluado por qPCR. (Fig. 12 D) Secreción de citoquinas por células I CD4+ aisladas a través de separación magnética de la LP del IG de ratones WT y Fcgrt-/- sin tratar y reestimuladas durante 24 h con anti-CD3 (aCD3) y anti-CD28 (aCD28). (Fig. 12 E) Frecuencia de células I CD4+ en la LP del IG de ratones WT y Fcgrt-/- sin tratar (paneles izquierdos) o ratones FcgrtFl/Fl e ItgaxcreFcgrtFl/Fl (paneles derechos). Resultados representativos de tres experimentos independientes con n = 3-5 ratones por grupo por experimento. Los datos representan la media ± e.e.m. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,005.
Las figuras 13A-13C representan, según varias formas de realización de la presente invención que la inducción de IL-12 dependiente de FcRn no depende de MYD88 y no se requiere para la sensibilización cruzada dependiente de FcRn. (Fig. 13A) Inducción de IL-12p35 tras estimulación ex vivo de CD Myd88-/-CD8-CD11b+ con IC que se unen a FcRn (IgG IC) o IC que no se unen a FcRn (IHH-IgG IC) durante 6 h. (Fig. 13 B) Unión de IRF-1 al promotor de IL-12p35 tras estimulación de CD Myd88-/-CD8-CD11b+ con IgG IC o IHH-IgG IC durante 4 h. (Fig. 13 C) Presentación cruzada de antígeno ex vivo en presencia de un anticuerpo neutralizante de IL-12 (aIL-12) o isotipo control. Las CD se estimularon con IgG IC o IHH-IgG IC y se cocultivaron con células T CD8+OT-I. Datos representativos mostrados de uno de tres experimentos independientes. Los datos representan la media ± e.e.m. * p < 0,05, ** p < 0,01.
Las figuras 14A-14H representan, según varias formas de realización de la presente invención que CD humanas expresan fuertemente FcRn y se localiza en el estroma de IG tanto normal como asociado con CRC. (Fig. 14A) Tinción inmunohistoquímica doble de CD FcRn+CD11c+ en el estroma de IG portador de CRC (paneles superiores) y normal adyacente al tumor (paneles inferiores) de casos adicionales de CRC humano. Véase también la figura 7A. Barra de escala de los paneles izquierdos = 100 pm. Barra de escala de los paneles derechos = 20 pm. (Fig. 14B) Colocalización de CD FcRn+ y células T CD8+ en estroma IG portador de CRC (paneles superiores) y normal adyacente a tumor (paneles inferiores) de casos adicionales de CRC humano. Las puntas de flecha indican áreas de colocalización. Véase también la figura 7B. Los datos en las Fig. 14A-14B son representativos de 50 IG normales y CRC emparejados evaluados. (Fig. 14 C) Correlación entre el número de CD FcRn+CD11c+ y células T CD8+ en el estroma de IG normal adyacente a CRC. La significancia se evaluó usando una correlación de orden de Spearman. (Fig. 14D) Análisis multivariable del impacto de células CD11c+FcRn+ de LP colónica en la supervivencia de pacientes en 183 pacientes de CRC humanos. Un número creciente de células CD11c+FcRn+ tiene un efecto positivo en la supervivencia del paciente (análisis univariable p = 0,0333) y este efecto se mantiene en análisis multivariable con los parámetros indicados. Véase también la figura 7C. (Fig. 14E) Frecuencia de células T CD8+ en la LP tumoral de ratones quiméricos tratados con AOM/DSS. Los receptores WT se reconstituyeron con médula ósea de donantes WT. Los receptores Fcgrt-/- se reconstituyeron con médula ósea de donantes Fcgrt-/-, WT o hFCGRT-hB2M-mFcgrt-/-. Resultados representativos de uno de dos experimentos independientes con n = 4-5 ratones por grupo por experimento. (Fig. 14F) Fenotipo de DC derivadas de monocitos humanos (hMoDC) determinado por análisis de citometría de flujo. La curva sombreada representa el isotipo control. (Fig. 14G) Expresión de FcRn en hMoDC, evaluado por el mismo anticuerpo utilizado para la tinción inmunohistoquímica de casos de CRC. (Fig. 14H) Análisis densitométrico de las inmunotransferencias de hMoDC estimuladas con IgG IC representado en la figura 7B. Los datos en los paneles de las Fig. 14F-14H son representativos de seis donantes procesados en pares en cada uno de tres experimentos independientes. Todos los datos representan la media ± e.e.m.
Las figuras 15A-15B representan, según varias formas de realización de la presente invención que el bloqueo mediado por anticuerpo de FcRn disminuye los niveles de transcritos de citoquinas Th1 durante la colitis mediada por IgG. (Fig.
15A) Niveles de transcrito de citoquinas de colon entero de ratones quiméricos hFCGRT/hB2M/mFcgrt-/- inmunizados con flagelina tratados con DVN24 o un isotipo control antes y durante el inicio de colitis por DSS. (Fig. 14B) Niveles de transcrito de citoquinas de células T CD8+ aisladas de la lámina propia de quimeras hFCGRT/hB2M/mFcgrt-/- BM tratadas con DVN24 o un isotipo control o quimeras mFcgrt-/- BM tratadas con PBS durante la colitis por DSS. * P < 0,05. ** P < 0,01.
La figura 16 representa, según varias formas de realización de la presente invención, que el aumento mediado por FcRn de IL-12p35 es dependiente de ERK y calmodulina, pero no de reorganizaciones citoesqueléticas. Células dendríticas de ratón primarias se estimularon con inmunocomplejos que comprenden IgG contra ovoalbúmina de pollo que eran de tipo salvaje y capaces de unirse a FcRn o mutantes e incapaces de unirse a FcRn (IHH-IC) debido a tres mutaciones en el dominio Fc de IgG. Se aisló ARN después de 5 u 11 horas de tales células tratadas con inhibidores para el citoesqueleto (citocalasina D y latrunculina), calmodulina (W7) o ERK. El ARN se sometió a transcripción inversa y se cuantificó IL-12p35 por qPCR.
Descripción detallada
A menos que se defina de otra manera, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen los mismos significados que comúnmente entiende un experto en la materia a la que pertenece la invención. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3a ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, NY 2001); March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 5a ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, NY 2001); y Sambrook y Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2001), proporcionan a un experto en la materia con una guía general de los términos usados en la presente solicitud.
Un experto en la materia reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, que se podrían usar en la práctica de la presente invención. En efecto, la presente invención no está en modo alguno limitada a los métodos y materiales descritos. Para los fines de la presente invención, los siguientes términos se definen a continuación.
Como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” se refiere a una inmunoglobulina intacta o a un fragmento de unión a antígeno monoclonal o policlonal con la región Fc (fragmento cristalizable) o fragmento de unión a FcRn de la región Fc, denominado en el presente documento como el “fragmento Fc” o “dominio Fc”. Los fragmentos de unión a antígeno se pueden producir por técnicas de ADN recombinante o por corte enzimático o químico de anticuerpos intactos. Los fragmentos de unión a antígeno incluyen, entre otros, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb, y región determinante de complementariedad (CDR), anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpo de dominio único, anticuerpos quiméricos, diacuerpos, tetracuerpos y otras fracciones scFv multimerizadas, y polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión a antígeno específica al polipéptido. El dominio Fc incluye porciones de dos cadenas pesadas que contribuyen a dos o tres clases del anticuerpo. El dominio Fc se puede producir por técnicas de ADN recombinante o por corte enzimático (por ejemplo, corte con papaína) o químico de anticuerpos intactos. La secuencia de aminoácidos del dominio Fc se puede modificar para aumentar su afinidad con FcRn para permitir mejor inducción de proteínas secretadas tal como IL-12, interferón gamma, IL-2, factor de necrosis tumoral, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, IL-3 y granzima B o factores de transcripción tal como t-bet o modificar para disminuir su afinidad por FcRn y la inducción de las citoquinas y factores de transcripción anteriormente mencionados.
El término “fragmento de anticuerpo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un fragmento de proteína que comprende solo una porción de un anticuerpo intacto, en general incluye un sitio de unión a antígeno del anticuerpo intacto y por tanto retiene la capacidad de unirse al antígeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo abarcados por la presente definición incluyen: (i) el fragmento Fab, que tiene dominios VL, CL, VH y CH1; (ii) el fragmento Fab', que es un fragmento Fab que tiene uno o más residuos de cisteína en el extremo C del dominio CH1; (iii) el fragmento Fd que tiene dominios VH y CH1; (iv) el fragmento Fd' que tiene dominios VH y CH1 y uno o más residuos de cisteína en el extremo C del dominio CH1; (v) el fragmento Fv que tiene los dominios Vl y VH de un único brazo de un anticuerpo; (vi) el fragmento dAb (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)) que consiste en un dominio VH; (vii) regiones CDR aisladas; (viii) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab' unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (ix) moléculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, Fv monocatenario; scFv) (Bird et al., Science 242:423-426 (1988); y Huston et al., PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988));
(x) "diacuerpos" con dos sitios de unión a antígeno, que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (véase, por ejemplo, los documentos EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); (xi) "anticuerpos lineales" que comprenden un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con polipéptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión a antígeno (Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995); y patente en EE UU No. 5.641.870).
Como se describe en el presente documento, un “antígeno” es una molécula que se une por un sitio de unión en un agente polipéptido, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo. Típicamente, los antígenos se unen por ligandos anticuerpos y son capaces de generar una respuesta de anticuerpos in vivo. Un antígeno puede ser un polipéptido, proteína, ácido nucleico, lípido u otra molécula. En el caso de anticuerpos convencionales y fragmentos de los mismos, el sitio de unión del anticuerpo definido por los bucles variables (L1, L2, L3 y H1, H2, H3) es capaz de unirse al antígeno. El término “determinante antigénico” se refiere a un epítopo en el antígeno reconocido por una molécula que se une a antígeno, y más particularmente, por el sitio de unión a antígeno de dicha molécula.
Un “fragmento Fv” es un fragmento de anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento y unión a antígeno completo.
Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de una cadena pesada y una ligera en asociación estrecha, que puede ser de naturaleza covalente, por ejemplo, en scFv. Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL.
Colectivamente, las seis CDR o un subconjunto de las mismas confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad para reconocer y unirse al antígeno, aunque habitualmente a una afinidad menor que el sitio de unión entero.
Un “cáncer” o “tumor” como se usa en el presente documento se refiere a un crecimiento incontrolado de células que interfiere con el funcionamiento normal de los órganos y sistemas corporales. Un sujeto que tiene un cáncer o un tumor es un sujeto que tiene objetivamente células neoplásicas medibles presentes en el cuerpo del sujeto. En esta definición se incluyen cánceres benignos y malignos, así como tumores latentes o micrometástasis. Los cánceres que migran de su localización original y colonizan órganos vitales pueden eventualmente producir la muerte del sujeto mediante el deterioro funcional de los órganos afectados. Los cánceres hematopoyéticos, tal como leucemia, son capaces de desplazar los compartimentos hematopoyéticos normales en un sujeto, produciendo de esta manera insuficiencia hematopoyética (en forma de anemia, trombocitopenia y neutropenia) produciendo finalmente la muerte.
Como se usa en el presente documento “acomplejado” se refiere a las interacciones no covalentes entre cualesquiera dos moléculas. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a complejos formados entre y un antígeno y un anticuerpo (por ejemplo, IgG a una variante de la misma o un fragmento de la misma) en donde el antígeno y el anticuerpo interaccionan a través de enlaces no covalentes. Los ejemplos de interacciones no covalentes incluyen, pero no están limitadas a interacciones electrostáticas (por ejemplo, interacciones iónicas, enlaces de hidrógeno, enlaces de halógeno), fuerzas de van der Waals (dipolo-dipolo, inducidas por dipolo, fuerzas de dispersión de London), efectos pi (interacciones pi-pi, catión-pi, anión-pi, polar-pi) y/o interacciones hidrofóbicas. En varias formas de realización, el complejo entre la IgG o un fragmento de la misma o una variante de la misma y el antígeno forma estructuras multiméricas que pueden entrecruzar/unirse con FcRn.
Como se usa en el presente documento “conjugado” se refiere a interacciones covalentes entre cualesquiera dos moléculas. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a proteínas de fusión que comprenden un antígeno y un anticuerpo (por ejemplo, IgG o una variante de la misma o un fragmento de la misma) o cualquier otro complejo antígeno-anticuerpo que pueda estar covalentemente unido. En varias formas de realización, la conjugación entre IgG o un fragmento de la misma o una variante de la misma y el antígeno forma estructuras monoméricas o multiméricas que pueden entrecruzar/unirse con FcRn.
Como se usa en el presente documento, un “epítopo” puede estar formado tanto de aminoácidos contiguos como aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados de aminoácidos contiguos típicamente se retienen en exposición a solventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario típicamente se pierden en el tratamiento con solventes desnaturalizantes. Un epítopo típicamente incluye al menos 3, y más habitualmente, al menos 5, aproximadamente 9, o aproximadamente 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única. Un “epítopo” incluye la unidad de estructura convencionalmente unida por un par VH/VL de inmunoglobulina. Los epítopos definen el sitio de unión mínimo para un anticuerpo, y por tanto representa la diana de especificidad de un anticuerpo. En el caso de un anticuerpo de dominio único, un epítopo representa la unidad de estructura unida por un dominio variable en aislamiento. Los términos “determinante antigénico” y “epítopo” también se pueden usar de forma intercambiable en el presente documento. En varias formas de realización, un epítopo puede ser una proteína, péptido, ácido nucleico, lípido, u otras moléculas o combinaciones de las mismas.
Como se usa en el presente documento, una “respuesta inmunitaria” que se modula se refiere a una respuesta por una célula del sistema inmunitario, tal como una célula B, célula T (CD4 o CD8), célula T reguladora, célula presentadora de antígenos, célula dendrítica, monocito, macrófago, célula NKT, célula NK, basófilo, eosinófilo, o neutrófilo, a un estímulo. En algunas formas de realización, la respuesta es específica para un antígeno particular (una “respuesta específica de antígeno”), y se refiere a una respuesta por una célula T CD4, célula T CD8, o célula B a través de un receptor específico de antígenos. En algunas formas de realización, una respuesta inmunitaria es una respuesta de células T, tal como una respuesta CD4+ o una respuesta CD8+. Tales respuestas por estas células pueden incluir, por ejemplo, citotoxicidad, proliferación, producción de citoquinas o quimioquinas, tráfico, o fagocitosis, y puede ser dependiente de la naturaleza de la célula inmunitaria que experimenta la respuesta. En algunas formas de realización de las composiciones y métodos descritos en el presente documento, una respuesta inmunitaria que se modula es tolerancia de células T.
Mediante “metástasis” se quiere decir propagación de cáncer desde su sitio primario a otros lugares en el cuerpo. Las células cancerosas pueden separarse del tumor primario, penetrar en los vasos linfáticos y sanguíneos, circular a través del torrente sanguíneo, y crecer en un foco distante (metastatizar) en tejidos normales en otro sitio en el cuerpo. La metástasis puede ser local o distante. La metástasis es un proceso secuencial, condicionado a que las células tumorales se separen del tumor primario, viajen a través del torrente sanguíneo, y paren en un sitio distante. En el sitio nuevo, las células establecen un suministro de sangre y pueden crecer para formar una masa potencialmente mortal. Rutas moleculares tanto estimuladoras como inhibidoras en la célula tumoral regulan su comportamiento, y las interacciones entre la célula tumoral y las células huéspedes en el sitio distante también son significativas.
El término “anticuerpo monoclonal” como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que componen la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, estando dirigidos contra un único antígeno. Además, en contraste con preparaciones de anticuerpos policlonales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno. El modificador “monoclonal” no se debe interpretar como que requiere producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar según la invención se pueden hacer por el método del hibridoma primero descrito por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), o se pueden hacer por métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente en EE UU No. 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpos en fagos usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) o Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), por ejemplo.
Como se usa en el presente documento, “se une selectivamente”, o “se une específicamente” se refiere a la capacidad de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo descrito en el presente documento para unirse a una diana, tal como una molécula presente en la superficie celular con una KD de 10-5 M (10000 nM) o menos, por ejemplo, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10'1° M, 10'11 M, 10-12 M, o menos. La unión específica puede estar influida por, por ejemplo, la afinidad y avidez del agente polipéptido y la concentración del agente polipéptido. El experto en la materia puede determinar condiciones apropiadas en las que los agentes polipéptidos descritos en el presente documento se unen selectivamente a las dianas usando cualquier método adecuado, tal como titulación de un agente polipéptido en un ensayo de unión celular adecuado.
“Sujeto” o “individuo” o “animal” o “paciente” o “mamífero” quiere decir cualquier sujeto, en particular un sujeto mamífero, del que se desea diagnóstico, pronóstico o terapia. En algunas formas de realización, el sujeto tiene cáncer. En algunas formas de realización, el sujeto tuvo cáncer en algún punto en la vida del paciente. En varias formas de realización, el cáncer del sujeto está en remisión, es recurrente o es no recurrente. En algunas formas de realización el sujeto tiene una enfermedad infecciosa. En algunas formas de realización el sujeto tiene una enfermedad autoinmunitaria.
“Mamífero” como se usa en el presente documento se refiere a cualquier miembro de la clase Mammalia, incluyendo, sin limitación, seres humanos, animales domésticos, animales de granja, animales de zoo, animales deportivos, mascotas tal como perros, gatos, cobayas, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado, vacas; primates tal como simios, monos, orangutanes, y chimpancés; cánidos tal como perros y lobos; félidos tal como gatos, leones, y tigres; équidos tal como caballos, burros y cebras; animales alimentarios tal como vacas, cerdos, y ovejas; ungulados tal como ciervo y jirafas; roedores tal como ratones, ratas, hámsteres y cobayas; y demás. En ciertas formas de realización, el mamífero es un sujeto humano. El término no indica una edad o sexo particular. Por tanto, se pretende que sujetos adultos y recién nacidos, así como fetos, sean machos o hembras, estén incluidos en el ámbito de este término.
Como se usa en el presente documento, el término “diana” se refiere a una molécula biológica (por ejemplo, péptido, polipéptido, proteína, lípido, hidrato de carbono) a la que un dominio polipeptídico que tiene un sitio de unión se puede unir selectivamente. La diana puede ser, por ejemplo, una diana intracelular (por ejemplo, una diana proteína intracelular) o una diana de superficie celular (por ejemplo, una proteína de membrana, una proteína receptor). Preferiblemente, una diana es una diana de superficie celular, tal como una proteína de superficie celular.
Como se usa en el presente documento, los términos “tratar”, “tratamiento”, “que trata” o “mejora” se refieren a tratamientos terapéuticos, en donde el objeto es revertir, aliviar, mejorar, inhibir, ralentizar o parar la evolución o gravedad de un estado asociado con, una enfermedad o trastorno. El término “que trata” incluye reducir o aliviar al menos un efecto adverso o síntoma de una afección, enfermedad o trastorno, tal como una enfermedad autoinmunitaria, una infección crónica o un cáncer. El tratamiento es en general “eficaz” si uno o más síntomas o marcadores clínicos se reducen. Alternativamente, el tratamiento es “eficaz” si la evolución de una enfermedad se reduce o para. Es decir, “tratamiento” incluye no solo la mejora de síntomas o marcadores, sino también una cesación de al menos ralentización de la evolución o empeoramiento de los síntomas que se esperaría en ausencia de tratamiento. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no están limitados a, alivio de uno o más síntoma(s), disminución del grado de enfermedad, estado estabilizado (es decir, sin empeoramiento) de enfermedad, retraso o ralentización de la evolución de la enfermedad, mejora o paliación del estado de enfermedad, y remisión (sea parcial o completa), sea detectable o indetectable. El término “tratamiento” de una enfermedad también incluye proporcionar alivio de los síntomas o efectos secundarios de la enfermedad (incluyendo tratamiento paliativo).
Se han identificado un número de antígenos tumorales que están asociados con cánceres específicos. Como se usa en el presente documento, los términos “antígeno tumoral” y “antígeno de cáncer” se usan de forma intercambiable para referirse a antígenos que se expresan diferencialmente por células neoplásicas y pueden de esta manera ser explotados con el fin de dirigirse a células neoplásicas. Los antígenos de cáncer son antígenos que pueden potencialmente estimular respuestas inmunitarias aparentemente específicas de tumor. Algunos de estos antígenos están codificados, aunque no necesariamente expresados, por células normales. Estos antígenos se pueden caracterizar como los que son normalmente silencioso (es decir, no expresados) en células normales, los que se expresan solo en ciertas fases de la diferenciación y los que se expresan temporalmente tal como antígenos embrionarios y fetales. Otros antígenos de cáncer están codificados por genes celulares mutados, tal como oncogenes (por ejemplo, oncogén ras activado), genes supresores (por ejemplo, p53 mutante), proteínas de fusión resultantes de deleciones internas o translocaciones cromosómicas. Aún otros antígenos de cáncer pueden estar codificados por genes víricos tal como los portados en virus tumorales de ARN y ADN. Muchos antígenos tumorales se han definido en términos de múltiples tumores sólidos: MAGE 1, 2 & 3, definidos por inmunidad; MART-1/melan-A, gp100, antígeno carcinoembrionario (CEA), HER-2, mucinas (es decir, MUC-1), antígeno específico de próstata (PSA) y fosfatasa de ácido prostático (PAP). Además, se ha mostrado que proteínas víricas tal como hepatitis B (VHB), Epstein-Barr (VEB) y papiloma humano (VPH) son importantes en el desarrollo de carcinoma hepatocelular, linfoma y cáncer cervical, respectivamente. Sin embargo, debido a la inmunosupresión de pacientes diagnosticados con cáncer, los sistemas inmunitarios de esos pacientes con frecuencia no pueden responder a los antígenos tumorales.
“Antígeno endógenos” como se usa en el presente documento se refiere a antígenos que se han generado en el cuerpo. Incluyen antígenos xenogénicos (heterólogos), autólogos, idiotípicos y autoantígenos.
FcRn es el receptor de Fc neonatal. Es de estructura similar al complejo principal de histocompatibilidad I (MHC I). FcRn humano es muy riguroso respecto a su especificidad y se une a Fc humano, pero no Fc de ratón, bovino, u oveja. El FcRn se puede unir a dos sitios de la IgG (Sanchez et al., 1999; Schuck et al., 1999; West A.P. y Bjorkman, 2000). Aunque las IgG de ratón no se unen de forma eficaz a FcRn humano y por tanto tienen una semivida corta en seres humanos (Frodin et al., 1990), la IgG de ratón como un inmunocomplejo es capaz de unirse a FcRn humano e inducir señalización. En contraste, FcRn de ratón se une a IgG de cada especie analizada (Ober et al., 2001).
La mayoría de las proteínas del suero tienen una semivida en suero corta (aproximadamente 1-2 días). Sin embargo, dos tipos de proteínas de suero, es decir, albúmina y anticuerpos de la clase IgG, tienen semividas en suero muy extendidas. Por ejemplo, la mayoría de las subclases de IgG tienen semividas de aproximadamente 10-20 días en seres humanos. La región Fc de IgG se requiere para esta extensión de la semivida. Por tanto, polipéptidos IgG truncados que portan solo la región Fc, y potencialmente también proteínas que portan una secuencia de péptido de unión a FcRn corta (FcBP) (Sockolosky et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2012, 109, 16095-100), también muestran tal semivida en suero extendida. Además, cuando la región Fc se fusiona con un compañero de fusión (por ejemplo, una proteína biológicamente activa), esta proteína de fusión de Fc muestra una semivida en suero extendida debido a su interacción con FcRn.
El mecanismo por el que FcRn extiende la semivida en suero de IgG y proteínas de fusión de Fc de IgG está bien establecido (Ghetie y Ward, 2000, 2002; Roopenian y Akilesh, 2007). FcRn se localiza en los compartimentos endosómicos de muchos tipos celulares, incluyendo endotelio vascular. Las proteínas del suero son endocitadas constantemente y dirigidas a las vesículas endosómicas tempranas. FcRn está albergado principalmente en esta vesícula acidificada. En este medio acidificado, la región Fc se une a FcRn, y el complejo IgG/FcRn se recicla después sea por vía apical o basolateral de vuelta a la membrana plasmática, en donde la exposición al medio extracelular de pH 7,2 neutro produce su liberación en la circulación. En contraste, otras proteínas endocitadas que no se unen a FcRn no son rescatadas, y por tanto siguen a través de la ruta endosómica a la eliminación catabólica, lo que produce su corta semivida. El mecanismo bioquímico por el que la región Fc de IgG se une a FcRn en un medio ácido está bien entendido. La región CH2-CH3-bisagra de la región Fc contiene residuos de histidina expuestos al solvente, que cuando se protonan, captan residuos en FcRn con suficiente afinidad para permitir que IgG explote la ruta de reciclado de FcRn para escapar la eliminación catabólica.
Como se describe en el presente documento, los inventores descubrieron que entrecruzar FcRn en células dendríticas con inmunocomplejos antígeno/anticuerpo, que funcionan como ligandos para FcRn, lleva directamente a la producción de IL-12 por estas células, así como interferón gamma, factor de necrosis tumoral, granzima B y t-bet por células T CD8+. FcRn funciona como una molécula de señalización organizando las proteínas necesarias, incluyendo elementos del citoesqueleto y proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK) para fomentar directamente la transcripción de IL-12 mediante factores tales como IRF-1 y NF-kB. Como se demuestra en el presente documento, el aumento mediado por FcRn de IL-12p35 depende de ERK y calmodulina, pero no reorganizaciones citoesqueléticas.
La producción de IL-12 dependiente de FcRn es esencial para la generación de células T CD8+ efectoras y su función efectora mediante factores tales como interferón gamma, factor de necrosis tumoral, granzima B y t-bet. Tales células T efectoras median inmunidad antiinfecciosa y median vigilancia y erradicación inmunitaria tumoral. Si IL-12 se neutraliza, los efectos mediados por FcRn en las funciones de células T CD8+ efectoras que se asocian con la erradicación del tumor se pierden.
De una manera homóloga, el bloqueo de la función de FcRn se asocia con transducción de señales mediada por FcRn disminuida y por tanto producción disminuida de IL-12 y factores relacionados que se asocia con protección de trastornos autoinmunitarios como se muestra en modelos animales de enfermedad intestinal inflamatoria. Sin querer estar vinculado por ningún mecanismo o teoría particular, los aspectos y formas de realización descritos en el presente documento se basan en el hallazgo de que la unión de FcRn a inmunocomplejos antígeno/anticuerpo regula la producción de IL-12 por células dendríticas, que se puede manipular para fines terapéuticos. Puesto que IL-12 es un regulador maestro de respuestas inmunitarias asociadas con inmunidad tumoral y antiinfecciosa, por una parte, e inflamación inapropiada por otra, es deseable aumentar IL-12 para inmunidad antitumoral y disminuir IL-12 para fines antiinflamatorios. Según esto, en el presente documento se describen composiciones y métodos para incrementar/potenciar/aumentar la producción de IL-12 para tratar cáncer y enfermedades infecciosas y composiciones y métodos para disminuir la producción de IL-12 para tratar trastornos autoinmunitarios.
Composiciones y métodos para tratar cáncer y/o enfermedades infecciosas
En algunos aspectos, las composiciones y métodos descritos en el presente documento aumentan/incrementan/potencian la producción de IL-12 al incrementar/potenciar la interacción entre IgG y FcRn (por ejemplo, en respuesta a un antígeno unido a la IgG, o debido a mutaciones en IgG que aumentan la unión entre IgG y FcRn). Las interacciones entre IgG y FcRn dan señales que resultan en la producción de IL-12 por células dendríticas. Las composiciones proporcionadas en el presente documento comprenden IgG o una variante de la misma o un fragmento de la misma de modo que aumentan la producción de IL-12. Como se describe en el presente documento, las composiciones además pueden comprender antígenos, incluyendo, pero no limitados a, antígenos tumorales, antígenos bacterianos, antígenos víricos, antígenos parasíticos o combinaciones de los mismos, de modo que se aumenta la producción de IL-12. Como se usa en el presente documento, “ IgG” se puede referir a cualquier isotipo de IgG incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 y/o IgG4.
En algunas formas de realización, las variantes de IgG en las composiciones y métodos descritos en el presente documento son variantes funcionales, no naturales de IgG que aumentan la unión entre IgG y FcRn, de modo que se aumenta la producción de IL-12. “Variantes funcionales de IgG” como se usa en el presente documento, útiles con las composiciones y métodos descritos en el presente documento incluyen moléculas que comprenden mutaciones, tal como inserciones, deleciones y truncamientos en IgG de longitud completa, o la región constante de una molécula de IgG, siempre que tales moléculas retengan la capacidad de unirse a FcRn y aumentar la producción de IL-12. Un ejemplo de tal variante incluye, pero no está limitado a, una IgG que comprende una sustitución de metionina a leucina en la posición 428 y una sustitución de asparragina a serina en la posición 434 según el esquema de numeración de Kabat. Otro ejemplo de una variante de IgG funcional útil con las composiciones y métodos descritos en el presente documento es una variante manipulada de IgG humana que comprende mutaciones de Met 252, Ser254, Thr256, His433, y Asn434 a Tyr252, Thr254, Glu256, Lys433, y Phe434, como se describe en "Engineering the Fc region of immunoglobulin G to modulate in vivo antibody levels," Nature Biotechnology, 2005 (23):10, pp 1283-88. Otras variantes de IgG funcionales útiles con las composiciones y métodos descritos en el presente documento se describen en los documentos US8188231, US8802823, US2011025068, US20060235208, WO2012106578 A1.
Por ejemplo, las variantes de IgG funcionales pueden comprender modificaciones de aminoácidos en las posiciones de Fc 230, 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 273, 275, 299, 302, 313, 323, 325, 328, y 332, en donde la numeración de los residuos en la región Fc es la del índice EU como en Kabat. En algunas formas de realización, las variantes de IgG funcionales pueden comprender al menos una sustitución de aminoácido en la región Fc en una posición seleccionada del grupo que consiste en 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 255, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 285,
Figure imgf000014_0001
286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, y 337, en donde la numeración de los residuos en la región Fc es la del índice EU como en Kabat.
En algunas formas de realización, dichas variantes de IgG comprenden al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en D221K, D221Y, K222E, K222Y, T223E, T223K, H224E, H224Y, T225E, T225K, T225W, P227E, P227G, P227K, P227Y, P228E, P228G, P228K, P228Y, P230A, P230E, P230G, P230Y, A231E, A231G, A231K, A231P, A231Y, P232E, P232G, P232K, P232Y, E233A, E233D, E233F, E233G, E233H, E2331, E233K, E233L, E233M, E233N, E233Q, E233R, E233S, E233T, E233V, E233W, E233Y, L234A, L234D, L234E, L234F, L234G, L234H, L2341, L234K, L234M, L234N, L234P, L234Q, L234R, L234S, L234T, L234V, L234W, L234Y, L235A, L235D, L235E, L235F, L235G, L235H, L2351, L235K, L235M, L235N, L235P, L235Q, L235R, L235S, L235T, L235V, L235W, L235Y, G236A, G236D, G236E, G236F, G236H, G236I, G236K, G236L, G236M, G236N, G236P, G236Q, G236R, G236S, G236T, G236V, G236W, G236Y, G237D, G237E, G237F, G237H, G237I, G237K, G237L, G237M, G237N, G237P, G237Q, G237R, G237S, G237T, G237V, G237W, G237Y, P238D, P238E, P238F, P238G, 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H268V, H268W, E269F, E269G, E269H, E2691, E269K, E269L, E269M, E269N, E269P, E269R, E269S, E269T, E269V, E269W, E269Y, D270F, D270G, D270H, D270I, D270L, D270M, D270P, D270Q, D270R, D270S, D270T, D270W, D270Y, P271A, P271D, P271E, P271F, P271G, P271H, P271I, P271K, P271L, P271M, P271N, P271Q, P271R, P271S, P271T, P271V, P271W, P271Y, E272D, E272F, E272G, E272H, E272I, E272K, E272L, E272M, E272P, E272R, E272S, E272T, E272V, E272W, E272Y, V273I, K274D, K274E, K274F, K274G, K274H, K274I, K274L, K274M, K274N, K274P, K274R, K274T, K274V, K274W, K274Y, F275L, F275W, N276D, N276E, N276F, N276G, N276H, N276I, N276L, N276M, N276P, N276R, N276S, N276T, N276V, N276W, N276Y, Y278D, Y278E, Y278G, Y278H, Y278I, Y278K, Y278L, Y278M, Y278N, Y278P, Y278Q, Y278R, Y278S, Y278T, Y278V, Y278W, D280G, D280K, D280L, D280P, D280W, G281D, G281E, G281K, G281N, G281P, G281Q, G281Y, V282E, V282G, V282K, V282P, V282Y, E283G, E283H, E283K, E283L, E283P, E283R, E283Y, V284D, V284E, V284L, V284N, V284Q, V284T, V284Y, H285D, H285E, H285K, H285Q, H285W, H285Y, N286E, N286G, N286P, N286Y, K288D, K288E, K288Y, K290D, K290H, K290L, K290N, K290W, P291D, P291E, P291G, P291H, P291I, P291Q, P291T, R292D, R292E, R292T, R292Y, E293F, E293G, E293H, E293I, E293L, E293M, E293N, E293P, E293R, E293S, E293T, E293V, E293W, E293Y, E294F, E294G, E294H, E294I, E294K, E294L, E294M, E294P, E294R, E294S, E294T, E294V, E294W, E294Y, Q295D, Q295E, Q295F, Q295G, Q295H, Q295I, Q295M, Q295N, Q295P, Q295R, Q295S, Q295T, Q295V, Q295W, Q295Y, Y296A, Y296D, Y296E, Y296G, Y296H, Y296I, Y296K, Y296L, Y296M, Y296N, Y296Q, Y296R, Y296S, Y296T, Y296V, N297D, N297E, N297F, N297G, N297H, N297I, N297K, N297L, N297M, N297P, N297Q, N297R, N297S, N297T, N297V, N297W, N297Y, S298D, S298E, S298F, S298H, S298I, S298K, S298M, S298N, S298Q, S298R, S298T, S298W, S298Y, T299A, T299D, T299E, T299F, T299G, T299H, T299I, T299K, T299L, T299M, T299N, T299P, T299Q, T299R, T299S, T299V, T299W, T299Y, Y300A, Y300D, Y300E, Y300G, Y300H, Y300K, Y300M, Y300N, Y300P, Y300Q, Y300R, Y300S, Y300T, Y300V, Y300W, R301D, R301E, R301H, R301Y, V302I, V303D, V303E, V303Y, S304D, S304H, S304L, S304N, S304T, V305E, V305T, V305Y, W313F, K317E, K317Q, E318H, E318L, E318Q, E318R, E318Y, K320D, K320F, K320G, K320H, K320I, K320L, K320N, K320P, K320S, K320T, K320V, K320W, K320Y, K322D, K322F, K322G, K322H, K322I, K322P, K322S, K322T, K322V, K322W, K322Y, V323I, S324D, S324F, S324G, S324H, S324I, S324L, S324M, S324P, S324R, S324T, S324V, S324W, S324Y, N325A, N325D, N325E, N325F, N325G, N325H, N3251, N325K, N325L, N325M, N325P, N325Q, N325R, N325S, N325T, N325V, N325W, N325Y, K326I, K326L, K326P, K326T, A327D, A327E, A327F, A327H, A327I, A327K, A327L, A327M, A327N, A327P, A327R, A327S, A327T, A327V, A327W, A327Y, L328A, L328D, L328E, L328F, L328G, L328H, L328I, L328K, L328M, L328N, L328P, L328Q, L328R, L328S, L328T, L328V, L328W, L328Y, P329D, P329E, P329F, P329G, P329H, P329I, P329K, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329R, P329S, P329T, P329V, P329W, P329Y, A330E, A330F, A330G, A330H, A330I, A330L, A330M, A330N, A330P, A330R, A330S, A330T, A330V, A330W, A330Y, P331D, P331F, P331H, P331I, P331L, P331M, P331Q, P331R, P331T, P331V, P331W, P331Y, I332A, I332D, I332E, I332F, I332H, I332K, I332L, I332M, I332N, I332P, I332Q, I332R, I332S, I332T, I332V, I332W, I332Y, E333F, E333H, E333I, E333L, E333M, E333P, E333T, E333Y, K334F, K334I, K334L, K334P, K334T, T335D, T335F, T335G, T335H, T335I, T335L, T335M, T335N, T335P, T335R, T335S, T335V, T335W, T335Y, I336E, I336K, I336Y, S337E, S337H, y S337N, en donde la numeración de los residuos en la región Fc es la del índice EU como en Kabat.
En algunas formas de realización, dichas variantes de IgG comprenden cualquiera de las siguientes combinaciones de sustituciones: S239D/A330L/I332E, S239D/A330Y/I332E/L234I, S239D/A330Y/I332E/L266I, S239D/D265F/N297D/I332E, S239D/D265H/N297D/I332E, S239D/D265I/N297D/I332E, S239D/D265L/N297D/I332E, S239D/D265T/N297D/I332E, S239D/D265Y/N297D/I332E, S239D/E272I/A330L/I332E, S239D/E272I/I332E, S239D/E272K/A330L/I332E, S239D/E272K/I332E, S239D/E272S/A330L/I332E, S239D/E272S/I332E, S239D/E272Y/A330L/I332E, S239D/E272Y/I332E, S239D/F241S/F243H/V262T/V264T/N297D/A330Y/I332E, S239D/H268D, S239D/H268E, S239D/I332D, S239D/I332E, S239D/I332E/A327D, S239D/I332E/A330I, S239D/I332E/A330Y, S239D/I332E/E272H, S239D/I332E/E272R, S239D/I332E/E283H, S239D/I332E/E283L, S239D/I332E/G236A, S239D/I332E/G236S, S239D/I332E/H268D, S239D/I332E/H268E, S239D/I332E/K246H, S239D/I332E/R255Y, S239D/I332E/S267E, S239D/I332E/V264I, S239D/I332E/V264I/A330L, S239D/I332EN2641/S298A, S239D/I332EN284D, S239D/I332E/V284E, S239D/I332E/V284E, S239D/I332N, S239D/I332D, S239D/K274E/A330L/I332E, S239D/K274E/I332E, S239D/K326E/A330L/I332E, S239D/K326E/A330Y/I332E, S239D/K326E/I332E, S239D/K326T/A330Y/I332E, S239D/K326T/I332E, S239D/N297D/A330Y/I332E, S239D/N297D/I332E, S239D/N297D/K326E/I332E, S239D/S267E/A330L/I332E, S239D/S267E/I332E, S239D/S298A/K326E/I332E, S239D/S298A/K326T/I332E, S239DV/240I/A330Y/I332E, S239DN264T/A330Y/I332E, S239D/Y278T/A330L/I332E, S239D/Y278T/I332E, S239E, S239E/D265G, S239E/D265N, S239E/D265Q, S239E/I332D, S239E/I332E, S239E/I332N, S239E/I332Q, S239E/N297D/I332E, S239EN2641/A330Y/I332E, S239E/V264I/I332E, S239E/V264I/S298A/A330Y/I332E, S239F, S239G, S239H, S239I, S239K, S239L, S239M, S239N, S239N/I332D, S239N/I332E, S239N/I332E/A330L, S239N/I332E/A330Y, S239N/I332N, S239N/I332Q, S239P, S239Q, S239Q/I332D, S239Q/I332E, S239Q/I332N, S239Q/I332Q, S239Q/V2641/I332E, S239R, S239T, S239V, S239W, S239Y, V240A, V240I, V240I/V266I, V240M, V240T, F241D, F241E, F241E/F243Q/V262T/V264E/I332E, F241E/F243Q/V262T/V264E, F241E/F243R/V262E/V264R/I332E, F241E/F243R/V262E/V264R, F241E/F243Y/V262T/V264R/I332E, F241E/F243Y/V262T/V264R, F241L, F241L/F243L/V262I/V264I, F241L/V262I, F241R/F243Q/V262T/V264R/I332E, F241R/F243Q/V262T/V264R, F241W, F241W/F243W, F241W/F243W/V262A/V264A, F241Y, F241Y/F243Y/V262T/V264T/N297D/I332E, F241Y/F243Y/V262T/V264T, F243E, F243L, F243L/V262I/V264W, F243L/V264I, F243W, P244H, P244H/P245A/P247V, P245A, K246D, K246E, K246H, K246Y, P247G, P247V, D249H, D249Q, D249Y, R255E, R255Y, E258H, E258S, E258Y, T260D, T260E, T260H, T260Y, V262E, V262F, V263A, V2631, V263M, V263T, V264A, V264D, V264E, V264E/N297D/I332E, V264F, V264G, V264H, V264I, V264I/A330L/I332E, V264I/A330Y/I332E, V264I/I332E, V264K, V264L, V264M, V264N, V264P, V264Q, V264R, V264S, V264T, V264W, V264Y, D265F, D265F/N297E/I332E, D265G, D265H, D265I, D265K, D265L, D265M, D265N, D265P, D265Q, D265R, D265S, D265T, D265V, D265W, D265Y, D265Y/N297D/I332E, D265Y/N297D/T299L/I332E, V266A, V266I, V266M, V266T, S267D, S267E, S267E, S267E/A327D, S267E/P331D, S267E/S324I, S267E/V282G, S267F, S267H, S267I, S267K, S267L, S267L/A327S, S267M, S267N, S267P, S267Q, S267Q/A327S, S267R, S267T, S267V, S267W, S267Y, H268D, H268E, H268F, H268G, H268I, H268K, H268L, H268M, H268P, H268Q, H268R, H268T, H268V, H268W, E269F, E269G, E269H, E269I, E269K, E269L, E269M, E269N, E269P, E269R, E269S, E269T, E269V, E269W, E269Y, D270F, D270G, D270H, D270I, D270L, D270M, D270P, D270Q, D270R, D270S, D270T, D270W, D270Y, P271A, P271D, P271E, P271F, P271G, P271H, P271I, P271K, P271L, P271M, P271N, P271Q, P271R, P271S, P271T, P271V, P271W, P271Y, E272D, E272F, E272G, E272H, E272I, E272K, E272L, E272M, E272P, E272R, E272S, E272T, E272V, E272W, E272Y, V273I, K274D, K274E, K274F, K274G, K274H, K274I, K274L, K274M, K274N, K274P, K274R, K274T, K274V, K274W, K274Y, F275L, F275W, N276D, N276E, N276F, N276G, N276H, N276I, N276L, N276M, N276P, N276R, N276S, N276T, N276V, N276W, N276Y, Y278D, Y278E, Y278G, Y278H, Y278I, Y278K, Y278L, Y278M, Y278N, Y278P, Y278Q, Y278R, Y278S, Y278T, Y278V, Y278W, Y278W, Y278W/E283R/V302I, Y278W/V302I, D280G, D280K, D280L, D280P, D280W, G281D, G281D/V282G, G281E, G281K, G281N, G281P, G281Q, G281Y, V282E, V282G, V282G/P331D, V282K, V282P, V282Y, E283G, E283H, E283K, E283L, E283P, E283R, E283R/V302I/Y278W/E283R, E283Y, V284D, V284E, V284L, V284N, V284Q, V284T, V284Y, H285D, H285E, H285K, H285Q, H285W, H285Y, N286E, N286G, N286P, N286Y, K288D, K288E, K288Y, K290D, K290H, K290L, K290N, K290W, P291D, P291E, P291G, P291H, P291I, P291Q, P291T, R292D, R292E, R292T, R292Y, E293F, E293G, E293H, E293I, E293L, E293M, E293N, E293P, E293R, E293S, E293T, E293V, E293W, E293Y, E294F, E294G, E294H, E294I, E294K, E294L, E294M, E294P, E294R, E294S, E294T, E294V, E294W, E294Y, Q295D, Q295E, Q295F, Q295G, Q295H, Q295I, Q295M, Q295N, Q295P, Q295R, Q2955, Q295T, Q295V, Q295W, Q295Y, Y296A, Y296D, Y296E, Y296G, Y296I, Y296K, Y296L, Y296M, Y296N, Y296Q, Y296R, Y296S, Y296T, Y296V, N297D, N297D/I332E, N297D/I332E/A330Y, N297D/I332E/S239D/A330L, N297D/I332E/S239D/D265V, N297D/I332E/S298A/A330Y, N297D/I332E/T299E, N297D/I332E/T299F, N297D/I332E/T299H, N297D/I332E/T2991, N297D/I332E/T299L, N297D/I332E/T299V, N297D/I332E/Y296D, N297D/I332E/Y296E, N297D/I332E/Y296H, N297D/I332E/Y296N, N297D/I332E/Y296Q, N297D/I332E/Y296T, N297E/I332E, N297F, N297G, N297H, N297I, N297K, N297L, N297M, N297P, N297Q, N297R, N297S, N297S/I332E, N297T, N297V, N297W, N297Y, S298A/I332E, S298A/K326E, S298A/K326E/K334L, S298A/K334L, S298D, S298E, S298F, S298H, S298I, S298K, S298M, S298N, S298Q, S298R, S298T, S298W, S298Y, T299A, T299D, T299E, T299F, T299G, T299H, T299I, T299K, T299L, T299M, T299N, T299P, T299Q, T299R, T299S, T299V, T299W, T299Y, Y300A, Y300D, Y300E, Y300G, Y300H, Y300K, Y300M, Y300N, Y300P, Y300Q, Y300R, Y300S, Y300T, Y300V, Y300W, R301D, R301E, R301H, R301Y, V302I, V303D, V303E, V303Y, S304D, S304H, S304L, S304N, S304T, V305E, V305T, V305Y, W313F, K317E, K317Q, E318H, E318L, E318Q, E318R, E318Y, K320D, K320F, K320G, K320H, K320I, K320L, K320N, K320P, K320S, K320T, K320V, K320W, K320Y, K322D, K322F, K322G, K322H, K322I, K322P, K322S, K322T, K322V, K322W, K322Y, V323I, S324D, S324F, S324G, S324H, S324I, S324I/A327D, S324L, S324M, S324P, S324R, S324T, S324V, S324W, S324Y, N325A, N325D, N325E, N325F, N325G, N325H, N325I, N325K, N325L, N325M, N325P, N325Q, N325R, N325S, N325T, N325V, N325W, N325Y, K326I, K326L, K326P, K326T, A327D, A327E, A327F, A327H, A327I, A327K, A327L, A327M, A327N, A327P, A327R, A327S, A327T, A327V, A327W, A327Y, L328A, L328D, L328D/I332E, L328E, L328E/I332E, L328F, L328G, L328H, L328H/I332E, L328I, L328I/I332E, L328I/I332E, L328K, L328M, L328M/I332E, L328N, L328N/I332E, L328P, L328A, L328Q/I332E, L328Q/I332E, L328R, L328S, L328T, L328T/I332E, L328V, L328V/I332E, L328W, L328Y, P329D, P329E, P329F, P329G, P329H, P329I, P329K, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329R, P329S, P329T, P329V, P329W, P329Y, A330E, A330F, A330G, A330H, A330I, A330L, A330L/I332E, A330M, A330N, A330P, A330R, A330S, A330T, A330V, A330W, A330Y, A330Y/I332E, P331D, P331F, P331H, P331I, P331L, P331M, P331Q, P331R, P331T, P331V, P331W, P331Y, I332A, I332D, I332E, I332E/G281D, I332E/H268D, I332E/H268E, I332E/S239D/S298A, I332E/S239N/S298A, I332E/V264I/S298A, I332E/V284E, I332F, I332H, I332K, I332L, I332M, I332N, I332P, I332Q, I332R, I332S, I332T, I332V, I332W, I332Y, E333F, E333H, E333I, E333L, E333M, E333P, E333T, E333Y, K334F, K334I, K334P, K334T, T335D, T335F, T335G, T335H, T335I, T335L, T335M, T335N, T335P, T335R, T335S, T335V, T335W, T335Y, 1336E, I336K, 1336Y, S337E, S337H, y S337N, en donde la numeración de los residuos en la región Fc es la del índice EU como en Kabat.
Las variantes de IgG o Fc descritas en el presente documento se definen según las modificaciones de aminoácidos que las componen. Así, por ejemplo, I332E es una variante de Fc con la sustitución I332E relativa al polipéptido Fc parental. Asimismo, S239D/A330L/I332E (también denominada 239D/330L/332E) define una variante de Fc con las sustituciones S239D, A330L, e I332E (239D, 330L, y 332E) relativas al polipéptido Fc parental. Se indica que el orden en que se proporcionan las sustituciones es arbitrario, es decir que, por ejemplo, S239D/A330L/I332E es la misma variante de Fc que S239D/I332E/A330L, y así sucesivamente. Para todas las posiciones discutidas en la presente invención, la numeración es según el índice EU o esquema de numeración EU (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda). El índice EU o índice EU como en Kabat se refiere a la numeración de anticuerpo EU (Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85).
Cualquier otro mutante/variante de IgG (tal como inserciones, deleciones, sustituciones, truncamientos o mutaciones de cambio de fase) que aumenten las interacciones entre la IgG y FcRn y aumenten la producción de IL-12 se pueden usar en las composiciones y métodos descritos en el presente documento. En algunas formas de realización, la IgG o una variante de la misma o un fragmento de la misma es de mamífero. En algunas formas de realización, la IgG o una variante de la misma o un fragmento de la misma es humana. En algunas formas de realización, la IgG o una variante de la misma o un fragmento de la misma es recombinante.
En algunas formas de realización, los fragmentos de IgG que se pueden usar en las composiciones descritas en el presente documento incluyen fragmentos Fc de tipo salvaje de IgG o fragmentos Fc mutantes de IgG, siempre que tales moléculas retengan la capacidad para unirse a FcRn y aumentar la producción de IL-12.
En algunas formas de realización, la composición que comprende IgG o una variante de la misma o un fragmento de la misma comprende la región variable de un anticuerpo específico para FcRn o una forma multimérica (tal como un triacuerpo) de la región variable. En algunas formas de realización, la composición que comprende IgG o una variante de la misma o un fragmento de la misma comprende estructuras scFv multimerizadas tal como tetracuerpos.
En algunas formas de realización, las composiciones que comprenden IgG o una variante de la misma o un fragmento de la misma comprenden un antígeno que se puede conjugar a o acomplejar con la IgG o una variante de la misma o un fragmento de la misma. La interacción entre FcRn y la IgG acomplejada con un antígeno o la IgG conjugada a un antígeno resulta en la producción aumentada de IL-12 en respuesta al antígeno. En varias formas de realización, el antígeno es un antígeno tumoral, un antígeno microbiano, un antígeno vírico, un antígeno parasítico o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el antígeno es una proteína o un proteomimético de la misma, un péptido o un peptidomimético del mismo, un lípido o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, una composición en la que la IgG o una variante de la misma o un fragmento de la misma está acomplejada a un antígeno, el antígeno está unido de forma no covalente a la IgG o un fragmento de la misma o una variante de la misma. En algunas formas de realización, una composición en la que la IgG o una variante de la misma o un fragmento de la misma está conjugada a un antígeno, el antígeno está unido de forma covalente a la IgG o un fragmento de la misma o una variante de la misma.
Como se usa en el presente documento, en varias formas de realización, la producción de IL-12 está “aumentada” si los niveles de IL-12 están aumentados en una cantidad estadísticamente significativa, por ejemplo, en al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o más, hasta e incluyendo al menos el 100 % o más, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces o más, en presencia de un agente o estímulo, relativo a la ausencia de tal agente o estímulo. El agente o estímulo puede ser la unión de FcRn a la IgG o un fragmento de la misma o una variante de la misma de modo que se aumenta la producción de IL-12. En algunas formas de realización, IgG o un fragmento de la misma o una variante de la misma puede estar acomplejada o conjugada a un antígeno, como se describe en el presente documento.
Las composiciones descritas en el presente documento se usan para tratar, inhibir, prevenir la recaída de y/o prevenir metástasis de cáncer en un sujeto en necesidad de ello. Los métodos para tratar, inhibir, prevenir la recaída de y/o prevenir metástasis de cáncer en un sujeto comprenden proporcionar una composición que comprende IgG o una variante de la misma o un fragmento de la misma y administrar una cantidad eficaz de la composición al sujeto. En algunas formas de realización, la variante de IgG comprende una sustitución de metionina a leucina en la posición 428 y una sustitución de asparragina a serina en la posición 434 según el esquema de numeración de Kabat. Las composiciones pueden además comprender un antígeno conjugado o acomplejado con la IgG o una variante de la misma o un fragmento. En algunas formas de realización, la IgG o una variante de la misma o un fragmento de la misma es de mamífero. En algunas formas de realización, la IgG o una variante de la misma o un fragmento de la misma es humana. En algunas formas de realización, la IgG o una variante de la misma o un fragmento de la misma es recombinante. En algunas formas de realización, los métodos para tratar, inhibir, prevenir la recaída de y/o prevenir metástasis de cáncer en un sujeto comprenden además administrar al sujeto un agente quimioterapéutico y/o terapia de radiación, al mismo tiempo o secuencialmente con la composición.
Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no están limitados a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de cánceres incluyen, pero no están limitados a, carcinoma de células basales, cáncer del conducto biliar; cáncer de vejiga; cáncer de hueso; cáncer de cerebro y SNC; cáncer de mama; cáncer del peritoneo; cáncer cervical; coriocarcinoma; cáncer de colon y recto; cáncer de tejido conjuntivo; cáncer del sistema digestivo; cáncer endometrial; cáncer esofágico; cáncer de ojo; cáncer de la cabeza y el cuello; cáncer gástrico (incluyendo cáncer gastrointestinal); glioblastoma; carcinoma hepático; hepatoma; neoplasia intra-epitelial; cáncer de riñón o renal; cáncer de laringe; leucemia; cáncer de hígado; cáncer de pulmón (por ejemplo cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, adenocarcinoma de pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón); linfoma incluyendo linfoma de Hodgkin y no hodgkiniano; melanoma; mieloma; neuroblastoma; cáncer de la cavidad oral (por ejemplo, labio, lengua, boca y faringe); cáncer ovárico; cáncer pancreático; cáncer de próstata; retinoblastoma; rabdomiosarcoma; cáncer rectal; cáncer del sistema respiratorio; carcinoma de glándula salivar; sarcoma; cáncer de piel; cáncer de células escamosas; cáncer de estómago; cáncer testicular; cáncer tiroideo; cáncer uterino o endometrial; cáncer del sistema urinario; cáncer vulval; así como otros carcinomas y sarcomas; así como linfoma de células B (incluyendo linfoma no hodgkiniano (NHL) de bajo grado/folicular; NHL linfocítico pequeño (SL); NHL de grado intermedio/folicular; NHL difuso de grado intermedio; n Hl inmunoblástico de alto grado; NHL linfoblástico de alto grado; NHL de células microcíticas no cortadas de alto grado; NHL voluminoso; linfoma de células del manto; linfoma relacionado son SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crónica (LLC); leucemia linfoblástica aguda (LLA); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD), así como proliferación vascular anómala asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores cerebrales), y síndrome de Meigs.
En algunas formas de realización descritas en el presente documento, los métodos además comprenden administrar un antígeno tumoral o de cáncer a un sujeto al que se administra la composición para aumentar las interacciones de IgG y FcRn descrita en el presente documento. En formas de realización ejemplares, los antígenos específicos de tumor que pueden estar conjugados o acomplejados con IgG o una variante de la misma o un fragmento de la misma incluyen, pero no están limitados a, uno cualquiera o más de 4-1BB, 5T4, antígeno de adenocarcinoma, alfafetoproteína, BAFF, célula de linfoma B, antígeno C242, CA-125, anhidrasa carbónica 9 (CA-IX), C-MET, CCR4, CD152, CD19, CD20, CD200, CD22, CD221, CD23 (receptor de IgE), CD28, CD30 (TNFRSF8), CD33, CD4, CD40, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CEA, CNT0888, CTLA-4, DRS, EGFR, EpCAM, CD3, FAP, dominio-B extra de fibronectina, receptor de folato 1, GD2, gangliósido GD3, glucoproteína 75, GPNMB, HER2/neu, HGF, receptor quinasa del factor de dispersión humano, receptor de IGF-I, IGF-I, IgG1, L1-CAM, IL-13, IL-6, receptor del factor de crecimiento de tipo insulínico I, integrina a5p1, integrina avp3, MORAb-009, MS4A1, MUC1, mucina CanAg, ácido N-glicolilneuramínico, NPC-1C, PDGF-R a, PDL192, fosfatidilserina, células de carcinoma prostático, RANKL, RON, ROR1, SCH 900105, SDC1, SLAMF7, TAG-72, tenascina C, TGF beta 2, TGF-p, TRAIL-R1, TRAIL-R2, antígeno tumoral CTAA16.88, VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2 o vimentina. Otros antígenos específicos para cáncer serán aparentes a los expertos en la materia y se pueden usar en relación con formas de realización alternativas.
En algunas formas de realización de los métodos descritos en el presente documento, los métodos además comprenden administrar un agente quimioterapéutico al sujeto al que se administra una composición para aumentar las interacciones de IgG y FcRn. Los ejemplos no limitantes de agentes quimioterapéuticos pueden incluir agentes alquilantes tal como tiotepa y CYTOXAN® ciclosfosfamida; alquilsulfonatos tal como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tal como benzodopa, carbocona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenemelamina, trietilenefosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecano); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (en particular criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tal como clorambucilo, clornafacina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, óxido de mecloretamina clorhidrato, melfalán, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamide, mostaza de uracilo; nitrosoureas tal como carmustina, chorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, y ranimnustina; antibióticos tal como los antibióticos de enediína (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gammalI y caliqueamicina omegaIl (véase, por ejemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos, tal como clodronato; una esperamicina; así como cromóforo neocarzinostatina y crómoforos de antibiótico de cromoproteína enediínina relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMYCIN® doxorrubicina (incluyendo morfolinodoxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tal como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos tal como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólicotal como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purinatal como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tal como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tal como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostana, testolactona; antisuprarrenales tal como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; regenerador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diacicona; elformitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides tal como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; ácido podopfilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK® complejo de polisacáridos (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoxana; rizoxina; sizofuran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, TAXOL® paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE® Cremophor-free, formulación de nanopartícula manipulada de albúmina de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.), y TAXOTERE® doxetaxel (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); cloranbucilo; GEMZAR® gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tal como cisplatino, oxaliplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; NAVELBINE; vinorelbina; novantrona; teniposido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecano (Camptosar, CPT-11) (incluyendo la pauta de tratamiento de irinotecano con 5-FU y leucovorina); inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tal como ácido retinoico; capecitabina; combretastatina; leucovorina (LV); oxaliplatino, incluyendo la pauta de tratamiento con oxaliplatino (f Ol FOX); lapatinib (Tykerb); inhibidores de PKC-alfa, Raf, H-Ras, EGFR (por ejemplo, erlotinib (Tarceva®)) y Ve GF-A que reducen la proliferación celular y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores. Además, los métodos de tratamiento pueden además incluir el uso de terapia de radiación.
Las composiciones descritas en el presente documento también se usan para tratar, inhibir y/o reducir la gravedad de enfermedades infecciosas en un sujeto en necesidad de ello. Los métodos para tratar, inhibir y/o reducir la gravedad de enfermedades infecciosas en el sujeto incluyen proporcionar una composición que comprende IgG o una variante de la misma o un fragmento de la misma y administrar una cantidad eficaz de la composición al sujeto. Las composiciones pueden además comprender una antígeno conjugado o acomplejado con la IgG o la variante de la misma o un fragmento, como se describe en el presente documento. En algunas formas de realización, la IgG o una variante de la misma o un fragmento de la misma es de mamífero. En algunas formas de realización, la IgG o una variante de la misma o un fragmento de la misma es humana. En algunas formas de realización, la IgG o una variante de la misma o un fragmento de la misma es recombinante.
En varias formas de realización, los antígenos bacterianos pueden ser cualquier antígeno presente en una bacteria infecciosa y que induce una respuesta inmunitaria en un sujeto. Los ejemplos de bacterias infecciosas incluyen: Helicobacterpyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (tal como M tuberculosis, M avium, M intracellulare, M kansaii, M gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Streptococcus del grupo A), Streptococcus agalactiae (Streptococcus de grupo B), Streptococcus (grupo viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (anaerobios sps.), Streptococcus pneumoniae, Campylobacter sp. patógenas, Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus anthracis, corynebacterium diphtheriae, corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, y Actinomyces israeli. Las composiciones y métodos descritos en el presente documento se contemplan para uso en tratar infecciones con estos agentes bacterianos. Otros organismos infecciosos (tal como protistas) incluyen: Plasmodium falciparum y Toxoplasma gondii. Las composiciones y métodos descritos en el presente documento se contemplan para uso en tratar infecciones con estos agentes.
En varias formas de realización, los antígenos víricos pueden ser cualquier antígeno presente en virus infecciosos y que inducen una respuesta inmunitaria en un sujeto. los ejemplos de virus infecciosos incluyen: Retroviridae (por ejemplo, VIH); Picornaviridae (por ejemplo, virus de la polio, virus de la hepatitis A; enterovirus, virus coxsackie humanos, rinovirus, echovirus); Calciviridae (tal como cepas que producen gastroenteritis); Togaviridae (por ejemplo, virus de la encefalitis equina, virus de la rubeola); Flaviridae (por ejemplo, virus del dengue, virus de encefalitis, virus de la fiebre amarilla); Coronaviridae (por ejemplo, coronavirus); Rhabdoviridae (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia); Filoviridae (por ejemplo, virus del ébola); Paramyxoviridae (por ejemplo, virus parainfluenza, virus de las paperas, virus del sarampión, virus respiratorio sincitial); Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus de la gripe); Bungaviridae (por ejemplo, virus Hantaan, bungavirus, flebovirus y virus Nairo); Arena viridae (virus de la fiebre hemorrágica); Reoviridae (por ejemplo, reovirus, orbivirus y rotavirus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (virus de la hepatitis B); Parvoviridae (parvovirus); Papovaviridae (virus del papiloma, virus del polioma); Adenoviridae (la mayoría de los adenovirus); Herpesviridae (virus herpes simplex (HSV) 1 y HSV-2, virus varicela zoster, citomegalovirus (CMV), virus del herpes); Poxviridae (virus de la varicela, virus vaccinia, poxvirus); e Iridoviridae (tal como el virus de la fiebre porcina africana); y virus sin clasificar (por ejemplo, los agentes etiológicos de encefalitis espongiforme, el agente de la hepatitis delta (pensado que era un satélite defectuoso del virus de la hepatitis B), los agentes de la hepatitis no A, no B (clase 1 = transmitido internamente; clase 2 = transmitido por vía parenteral (es decir, hepatitis C); virus de Norwalk y relacionados, y astrovirus). Las composiciones y métodos descritos en el presente documento se contemplan para uso en tratar infecciones con estos agentes víricos.
Los ejemplos de infecciones fúngicas que se pueden tratar con las composiciones y métodos descritos en el presente documento incluyen, pero no están limitadas a: aspergilosis; candidiasis (causado por Candida albicans); criptococosis (causado por Cryptococcus); e histoplasmosis. Por tanto, los ejemplos de hongos infecciosos incluyen, pero no están limitados a, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans. Las composiciones y métodos descritos en el presente documento se contemplan para uso en tratar infecciones con estos agentes fúngicos.
En algunas formas de realización de los aspectos descritos en el presente documento, los métodos además comprenden administrar una cantidad eficaz de un antígeno vírico, bacteriano, fúngico o parasítico junto con las composiciones que comprenden IgG o una variante de la misma o un fragmento de la misma. Los ejemplos no limitantes de tales antígenos víricos incluyen: antígenos de la gripe HA, NA, M, NP y NS; p24, pol, gp41 y gp120 de VIH; proteínas F y G de Metapneumovirus (hMNV); proteínas E1, E2 y del núcleo del virus de la Hepatitis C (HCV); proteínas E1, E2 y del núcleo del virus del Dengue virus (DEN1-4); proteína L1 del virus del papiloma humano; gp220/350 y péptido EBNA-3A del virus de Epstein Barr; glucoproteína gB, glucoproteína gH, pp65, IE1 (exón 4) y pp 150 de Citomegalovirus (CMV); péptido IE62 y epítopos de la glucoproteína E del virus Varicela Zoster (VZV); epítopos de la glucoproteína D del virus del herpes simple, entre muchos otros. Los polipéptidos antigénicos pueden corresponder a polipéptidos de aislados víricos animales o humanos naturales, o se pueden manipular para que incorporen una o más sustituciones de aminoácidos en comparación con un aislado natural (patógeno o no patógeno).
Composiciones y métodos para tratar enfermedades autoinmunitarias
En algunos aspectos, en el presente documento se describen composiciones para disminuir/bajar la producción de IL-12 alterando o inhibiendo interacciones entre IgG y FcRn. Las composiciones comprenden agentes que inhiben (reducen o bloquean) la señalización mediada por la interacción entre FcRn e IgG. Tales agentes incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos (“anticuerpos” incluye porciones de unión a antígeno de anticuerpos tal como péptidos de unión a epítopo o antígeno, paratopos, CDR funcionales; anticuerpos recombinantes; anticuerpos quiméricos; tricuerpos; midicuerpos; o derivados, análogos, variantes, porciones o fragmentos de unión a antígeno de los mismos), agentes de unión a proteínas, moléculas pequeñas, proteína recombinante, péptidos, aptámeros, avímeros y derivados, porciones o fragmentos de unión a proteína de los mismos. En algunas formas de realización, la composición comprende agentes que inhiben la señalización posterior mediada por FcRn tal como señalización mediada por interacciones entre, por ejemplo, FcRn y WAVE2, o FcRn y calmodulina.
Los oligonucleótidos antisentido representan otra clase de agentes que son útiles en las composiciones y métodos descritos en el presente documento, en particular como antagonistas de IgG y/o FcRn. Esta clase de agentes y métodos para prepararlos y usarlos se conocen bien en la técnica, como son ribozimas y moléculas de miARN. Véase, por ejemplo, el documento PCT US20007/024067 para una discusión exhaustiva. Alternativamente, un agente que inhibe interacciones entre IgG y FcRn puede, en algunas formas de realización de las composiciones y métodos descritos en el presente documento, incluir Fc recombinante o conjugados, o proteína o anticuerpo, ARN interferente pequeño específico para o dirigido al ARNm de FcRn, y ARN antisentido que hibrida con el ARNm de FcRn, por ejemplo.
Otros agentes para uso en las composiciones y métodos descritos en el presente documento que inhiben la interacción de IgG con FcRn incluyen, por ejemplo, anticuerpos contra FcRn específicamente reactivos o que se unen específicamente a FcRn. En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo bloqueante y puede ser cualquiera de un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo, un anticuerpo policlonal o un fragmento del mismo, un anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado o un anticuerpo monocatenario. En algunas formas de realización, el agente es un agente biespecífico que comprende sitios de unión para IgG y FcRn. En algunas formas de realización, el agente es una porción de Fc recombinante de IgG o una porción biológicamente activa de la misma o un proteomimético de la misma. La porción Fc o una porción biológicamente activa de la misma puede ser de mamífero. La porción Fc o una porción biológicamente activa de la misma puede ser humana.
Como se usa en el presente documento, un anticuerpo “bloqueante” o un anticuerpo “antagonista” es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno(s) a que se une. Por ejemplo, un anticuerpo bloqueante o antagonista biespecífico IgG/FcRn se une a IgG y FcRn e inhibe la capacidad de IgG y FcRn para inducir la producción de IL-12 por células dendríticas. En ciertas formas de realización, los anticuerpos bloqueantes o anticuerpos antagonistas o porciones de los mismos descritos en el presente documento inhiben completamente la interacción entre IgG y FcRn. En ciertas formas de realización, los anticuerpos bloqueantes o anticuerpos antagonistas o porciones de los mismos descritos en el presente documento reducen/disminuyen la interacción entre IgG y FcRn. En una forma de realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que específicamente se une a FcRn. En una forma de realización, el anticuerpo monoclonal que específicamente se une a FcRn es DVN24. En otra forma de realización, DVN24 es humanizado.
Se pueden usar ensayos de unión sencillos para cribar o detectar agentes que se unen a FcRn o IgG, o rompen la interacción entre un FcRn e IgG. Además, los agentes que inhiben la interacción FcRn/IgG para uso en las composiciones y métodos descritos en el presente documento, incluyendo FcRn recombinante o peptidomiméticos de IgG, se pueden identificar, por ejemplo, transfectando células con vectores de expresión que expresan FcRn o IgG o porciones de las mismas; poniendo en contacto las células con un agente; lisando las células; y caracterizando la interacción FcRn/IgG en comparación con células no puestas en contacto con el agente. Las células se pueden caracterizar usando, por ejemplo, coinmunoprecipitación.
Otra variación de ensayos para determinar la unión de una proteína FcRn a una proteína IgG es mediante el uso de métodos de biosensores de afinidad. Tales métodos se pueden basar en el efecto piezoeléctrico, electroquímica, o métodos ópticos, tal como elipsometría, guía de ondas ópticas, y resonancia de plasmón de superficie (SPR). Por ejemplo, la eficacia de un ARNip en la expresión de FcRn o IgG se puede seguir usando métodos conocidos en la técnica tal como RT-PCR cuantitativa con cebadores oligonucleotídicos específicos para cada gen respectivamente, o ELISA para FcRn y/o IgG de una muestra de sangre periférica. Alternativamente, la población de células sanguíneas se puede determinar por análisis FACS usando marcadores característicos de poblaciones particulares y subpoblaciones conocidos en la técnica o divulgados en el presente documento.
En algunos aspectos, en el presente documento se proporcionan métodos para suprimir una respuesta inmunitaria in vivo (por ejemplo, disminuyendo la producción de IL-12), que comprenden administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de interacción entre FcRn e IgG, o un inhibidor de la generación de su señalización posterior, como se describe en el presente documento. Reducir o inhibir la interacción entre IgG y FcRn es útil para suprimir específicamente una respuesta inmunitaria in vivo, que puede ser útil para el tratamiento de afecciones relacionadas con la función inmunitaria incluyendo enfermedad autoinmunitaria y trasplante (por ejemplo, médula ósea u órganos). Los inhibidores que disminuyen las interacciones IgG/FcRn se pueden usar solos como una terapia primaria o en combinaciones con otros agentes terapéuticos como una terapia de combinación para aumentar los beneficios terapéuticos de otros tratamientos médicos.
En varias formas de realización, como se usa en el presente documento, la interacción entre IgG y FcRn está “disminuida” si una o más actividades de señalización o lecturas posteriores de la actividad de FcRn, tal como la producción de IL-12, está reducida en una cantidad estadísticamente significativa, por ejemplo, en al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o más, hasta e incluyendo al menos el 100 % o más, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces o más, en presencia de un inhibidor, relativo a la ausencia de tal inhibidor. En varias formas de realización, el inhibidor altera la señalización mediada por FcRn/IgG de modo que se disminuye la producción de IL-12.
En algunas formas de realización de los métodos descritos en el presente documento, el sujeto al que se administra un inhibidor para disminuir las interacciones IgG/FcRn está diagnosticado con, tiene, o padece una enfermedad autoinmunitaria. Según esto, en el presente documento se proporcionan, en algunos aspectos, métodos de tratar un sujeto que tiene o está diagnosticado con un trastorno autoinmunitario que comprende administrar una cantidad eficaz de un agente para disminuir las interacciones FcRn/IgG. También se proporcionan en el presente documento métodos para inhibir o reducir la gravedad de un trastorno autoinmunitario en un sujeto administrando una cantidad eficaz de un agente para disminuir las interacciones FcRn/IgG.
“Enfermedad autoinmunitaria” se refiere a una clase de enfermedades en las que los propios anticuerpos del sujeto reaccionan con tejido huésped o en la que las células T efectoras son autorreactivas a autopéptidos endógenos y producen destrucción de tejido. Por tanto, se monta una respuesta inmunitaria contra los propios antígenos del sujeto, denominados autoantígenos. Un “autoantígeno” como se usa en el presente documento se refiere a un antígeno de un tejido huésped normal. El tejido huésped normal no incluye células neoplásicas.
Según esto, en algunas formas de realización, las enfermedades autoinmunitarias que se van a tratar o prevenir usando los métodos descritos en el presente documento incluyen, pero no están limitadas a: artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, esclerosis múltiple, colangitis esclerosante primaria, lupus eritematoso sistémico (LES), encefalomielitis autoinmunitaria, miastenia grave (MG), tiroiditis de Hashimoto, síndrome de Goodpasture, pénfigo (por ejemplo pénfigo vulgar), enfermedad de Grave, anemia hemolítica autoinmunitaria, purpura trombocitopénica autoinmunitaria, esclerodermia con anticuerpos anti-colágeno, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, polimiositis, anemia perniciosa, enfermedad de Addison idiopática, infertilidad asociada con autoinmunidad, enfermedad de Kawasaki, glomerulonefritis (por ejemplo glomerulonefritis semilunar, glomerulonefritis proliferativa), pénfigo bulloso, síndrome de Sjogren, resistencia a insulina, y diabetes mellitus autoinmunitaria (diabetes mellitus de tipo 1; diabetes mellitus dependiente de insulina). Se ha reconocido que la enfermedad autoinmunitaria también abarca aterosclerosis y enfermedad de Alzheimer. En una forma de realización de los aspectos descritos en el presente documento, la enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en esclerosis múltiple, diabetes de tipo-I, tiroiditis de Hashinoto, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, gastritis, hepatitis autoinmunitaria, anemia hemolítica, hemofilia autoinmunitaria, síndrome linfoproliferativo autoinmunitario (ALPS), uveorretinitis autoinmunitaria, glomerulonefritis, síndrome de Guillain-Barre, psoriasis y miastenia grave.
El término “cantidad eficaz” como se usa en el presente documento se refiere a la cantidad de un agente para modular (aumentar o disminuir) las interacciones entre FcRn e IgG o un fragmento de la misma o una variante de la misma necesaria para aliviar al menos uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno, y se refiere a una cantidad suficiente de composición farmacológica para proporcionar el efecto deseado, por ejemplo, aumentar la producción de IL-12 de modo que se trata cáncer o enfermedades infecciosas o disminuir la producción de IL-12 de modo que se tratan enfermedades autoinmunitarias. El término “cantidad terapéuticamente eficaz” por tanto se refiere a una cantidad de un agente para modular las interacciones entre FcRn e IgG o un fragmento de la misma o una variante de la misma usando los métodos divulgados en el presente documento, que es suficiente para efectuar un efecto particular cuando se administra a un sujeto típico. Una cantidad eficaz como se usa en el presente documento también incluiría una cantidad suficiente para retrasar el desarrollo de un síntoma de la enfermedad, alterar el curso de un síntoma de enfermedad (por ejemplo, pero no limitado a, ralentizar la evolución de un síntoma de la enfermedad), o revertir un síntoma de enfermedad. Por tanto, no es posible especificar la “cantidad eficaz” exacta. Sin embargo, para cualquier caso determinado, una “cantidad eficaz” apropiada la puede determinar un experto en la materia usando solo experimentación rutinaria.
Se pueden determinar cantidades eficaces, toxicidad y eficacia terapéutica por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 (dosis letal para el 50 % de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La dosis puede variar dependiendo de la forma farmacéutica empleada y la ruta de administración utilizada. El cociente de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como el cociente DL50/DE50. Las composiciones y métodos que muestran índices terapéuticos grandes son preferidos. Se puede estimar una dosis terapéuticamente eficaz inicialmente de ensayos de cultivos celulares. Además, una dosis se puede formular en modelos animales para lograr un intervalo de concentración circulante en plasma que incluya la CI50 (es decir, la concentración del agente para modular interacciones entre FcRn e IgG o un fragmento de la misma o una variante de la misma, que alcanza una inhibición semimáxima de síntomas) determinado en cultivo celular, o en un modelo animal apropiado. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, por cromatografía líquida de alto rendimiento. Los efectos de cualquier dosis particular se pueden seguir por un bioensayo adecuado. La dosis la puede determinar un médico y ajustar, según sea necesario, para adaptarse a efectos observados del tratamiento.
Los agentes útiles según las composiciones y métodos descritos en el presente documento, incluyendo anticuerpos y otros polipéptidos, son agentes aislados, lo que significa que los agentes son sustancialmente puros y están esencialmente libres de otras sustancias con las que se pueden encontrar en la naturaleza o en sistemas in vivo a un grado práctico y apropiado para su uso pretendido. En particular, los agentes son lo suficientemente puros y están lo suficientemente libres de otros constituyentes biológicos de sus células huéspedes para ser útiles en, por ejemplo, producir preparaciones farmacéuticas. Puesto que un agente aislado se puede mezclar con un soporte farmacéuticamente aceptable en una preparación farmacéutica, los agentes pueden comprender solo un pequeño porcentaje en peso de la preparación.
Los agentes descritos en el presente documento para modular las interacciones entre FcRn e IgG o un fragmento de la misma o una variante de la misma se pueden administrar a un sujeto en necesidad de ello por cualquier ruta apropiada que produce un tratamiento eficaz en el sujeto. Como se usa en el presente documento, los términos “administrar” e “introducir” se usan de forma intercambiable y se refieren a la colocación de un agente polipeptídico en un sujeto por un método o ruta que produce al menos localización parcial de tales agentes en un sitio deseado, tal como un sitio de inflamación, de modo que se produce un efecto(s) deseado(s).
En algunas formas de realización, los agentes descritos en el presente documento para modular las interacciones entre FcRn e IgG o un fragmento de la misma o una variante de la misma se administran a un sujeto por cualquier modo de administración que administra el agente sistémicamente o a una superficie o diana deseada, y puede incluir, pero no está limitado a, administración por inyección, infusión, instilación e inhalación. Al nivel que los agentes polipeptídicos pueden estar protegidos de inactivación en el intestino, también se contemplan formas de administración oral. “ Inyección” incluye, sin limitación inyección intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intraventricular, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intrarraquídea, intracerebroespinal, e intrasternal e infusión. En formas de realización preferidas, los agentes para modular interacciones entre FcRn e IgG o un fragmento de la misma o una variante de la misma para uso en los métodos descritos en el presente documento se administran por infusión o inyección intravenosa.
Las frases “administración parenteral” y “administrado por vía parenteral” como se usan en el presente documento, se refieren a modos de administración diferentes de la administración entérica y tópica, habitualmente por inyección. Las frases “administración sistémica”, “administrado sistémicamente”, “administración periférica” y “administrado periféricamente” como se usan en el presente documento, se refieren a modos de administración de un agente para modular las interacciones entre FcRn e IgG o una fragmento de la misma o una variante de la misma, diferentes de directamente en un sitio, tejido u órgano diana, tal como un sitio tumoral, de modo que entra en el sistema circulatorio del sujeto y, por tanto, está sometida a metabolismo y otros procesos similares.
Para el uso clínico de los métodos descritos en el presente documento, la administración de un agente para modular interacciones entre FcRn e IgG o un fragmento de la misma o una variante de la misma puede incluir formulación en composiciones farmacéuticas o formulaciones farmacéuticas para administración parenteral, por ejemplo, intravenosa; mucosa, por ejemplo, intranasal; ocular; u otro modo de administración. En algunas formas de realización, un agente para modular interacciones entre FcRn e IgG o un fragmento de la misma o una variante de la misma descrito en el presente documento se puede administrar junto con cualquier compuesto, material o composición soporte farmacéuticamente aceptable que produzca un tratamiento eficaz en el sujeto. Por tanto, una formulación farmacéutica para uso en los métodos descritos en el presente documento puede contener un agente para modular interacciones entre FcRn e IgG o un fragmento de la misma o una variante de la misma como se describe en el presente documento en combinación con uno o más ingredientes farmacéuticamente aceptables.
La frase “farmacéuticamente aceptable” se refiere a esos compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmacéuticas que son, en el ámbito del juicio médico válido, adecuados para uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica, u otro problema o complicación, proporcional con una razón riesgo/beneficio razonable. La frase “soporte farmacéuticamente aceptable” como se usa en el presente documento significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un relleno líquido o sólido, diluyente, excipiente, solvente, medio, material de encapsulación, ayuda de fabricación (por ejemplo, lubricante, talco magnesio, estearato de calcio o cinc, o ácido esteárico), o material encapsulante solvente, implicado en mantener la estabilidad, solubilidad, o actividad de, un agente para modular interacciones entre FcRn e IgG o un fragmento de la misma o una variante de la misma. Cada soporte debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no lesivo para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como soportes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tal como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tal como almidón de maíz y fécula de patata; (3) celulosa, y sus derivados, tal como carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, etilcelulosa, celulosa microcristalina y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) excipientes, tal como manteca de cacao y ceras de supositorios; (8) aceites, tal como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (9) glicoles, tal como propilenglicol; (10) polioles, tal como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol (PEG); (11) ésteres, tal como oleato de etilo y laurato de etilo; (12) agar; (13) agentes tamponantes, tal como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (14) ácido algínico; (15) agua sin pirógenos; (16) solución salina isotónica); (17) solución de Ringer; (19) soluciones con pH tamponado; (20) poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos; (21) agentes de carga, tal como polipéptidos y aminoácidos; (22) componentes del suero, tal como seroalbúmina, HDL y LDL; (23) alcoholes de C2-C12, tal como etanol; y (24) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas. También pueden estar presentes agentes de liberación, agentes de recubrimiento, conservantes y antioxidantes en la formulación. Los términos tal como “excipiente”, “soporte”, “soporte farmacéuticamente aceptable” o similares se usan de forma intercambiable en el presente documento.
Los agentes para modular (aumentar o disminuir) las interacciones entre FcRn e IgG o un fragmento de la misma o una variante de la misma se pueden formular especialmente para la administración del compuesto a un sujeto en forma sólida, líquida o de gel, incluyendo las adaptadas para lo siguiente: (1) administración parenteral, por ejemplo, por inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa o epidural como, por ejemplo, una solución o suspensión estéril, o formulación de liberación sostenida; (2) aplicación tópica, por ejemplo, como una crema, pomada, o un parche o espray de liberación controlada aplicado a la piel; (3) por vía intravaginal o intrarrectal, por ejemplo, como un óvulo vaginal, crema o espuma; (4) por vía ocular; (5) por vía transdérmica; (6) por vía transmucosa; o (7) por vía nasal. Además, un agente polipeptídico biespecífico o multiespecífico se puede implantar en un paciente o inyectar usando un sistema de administración de fármacos. Véase, por ejemplo, Urquhart, et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24: 199-236 (1984); Lewis, ed. "Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals" (Plenum Press, Nueva York, 1981); la patente en EE UU No. 3.773.919; y la patente en EE UU No. 353.270.960.
Formas de realización adicionales de las formulaciones y modos de administración de un agente para modular interacciones entre FcRn e IgG o un fragmento de la misma o una variante de la misma que se pueden usar en los métodos descritos en el presente documento se ilustran a continuación.
Formas farmacéuticas parenterales. Las formas farmacéuticas parenterales de un agente para modular (aumentar o disminuir) las interacciones entre FcRn e IgG o un fragmento de la misma o una variante de la misma también se pueden administrar a un sujeto por varias rutas incluyendo, pero no limitado a, subcutánea, intravenosa (incluyendo inyección en embolada), intramuscular, e intraarterial. Puesto que la administración de formas farmacéuticas parenterales típicamente evita las defensas naturales del paciente contra contaminantes, las formas farmacéuticas parenterales preferiblemente son estériles o capaces de ser esterilizadas antes de la administración al paciente. Los ejemplos de formas farmacéuticas parenterales incluyen, pero no están limitados a, soluciones listas para inyección, productos secos listos para disolverse o suspenderse en un vehículo farmacéuticamente aceptable para inyección, suspensiones listas para inyección, formas farmacéuticas parenterales de liberación controlada y emulsiones.
Los vehículos adecuados que se pueden usar para proporcionar formas farmacéuticas parenterales de la divulgación los conocen bien los expertos en la materia. Los ejemplos incluyen, sin limitación; agua estéril; agua para inyección USP; solución salina; solución de glucosa; vehículos acuosos tal como, pero no limitados a, inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de dextrosa, inyección de dextrosa y cloruro de sodio, e inyección de Ringer con lactato; vehículos miscibles en agua tal como, pero no limitado a, alcohol etílico, polietilenglicol, y propilenglicol; y vehículos no acuosos tal como, pero no limitado a, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, oleato de etilo, miristato de isopropilo y benzoato de bencilo.
Formulaciones en aerosol. Un agente para modular (aumentar o disminuir) las interacciones entre FcRn e IgG o un fragmento de la misma o una variante de la misma también se puede embalar en un envase aerosol presurizado junto con propelentes adecuados, por ejemplo, propelentes hidrocarburos como propano, butano, o isobutano con adyuvantes convencionales. Un agente para modular interacciones entre FcRn e IgG o un fragmento de la misma o una variante de la misma también se puede administrar en una forma no presurizada tal como en un nebulizador o atomizador. Un agente para modular interacciones entre FcRn e IgG o un fragmento de la misma o una variante de la misma también se puede administrar directamente a las vías respiratorias en forma de un polvo seco, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador.
Las composiciones en polvo adecuadas incluyen, a modo de ilustración, preparaciones en polvo de un agente para modular interacciones entre FcRn e IgG o un fragmento de la misma o una variante de la misma entremezcladas exhaustivamente con lactosa, u otros polvos inertes aceptables para la administración intrabronquial. Las composiciones en polvo se pueden administrar a través de un dispensador aerosol o encerrar en una cápsula rompible que el sujeto puede insertar en un dispositivo que perfora la cápsula y hace volar el polvo fuera en una corriente estable adecuada para inhalación. Las composiciones pueden incluir propelentes, tensioactivos, y cosolventes y se pueden cargar en envases de aerosoles convencionales que se cierran por una válvula de medida adecuada.
Los aerosoles para la administración al aparato respiratorio se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Adjei, A. y Garren, J. Pharm. Res., 1: 565-569 (1990); Zanen, P. y Lamm, J.-W. J. Int. J. Pharm., 114: 111-115 (1995); Gonda, I. "Aerosols for delivery of therapeutic an diagnostic agents to the respiratory tract," en Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 6:273-313 (1990); Anderson et al., Am. Rev. Respir. Dis., 140: 1317-1324 (1989)) y tienen potencial para la administración sistémica de peptídos y proteínas también (Patton y Platz, Advanced Drug Delivery Reviews, 8:179196 (1992)); Timsina et. al., Int. J. Pharm., 101: 1-13 (1995); y Tansey, I. P., Spray Technol. Market, 4:26-29 (1994); French, D. L., Edwards, D. A. y Niven, R. W., Aerosol Sci., 27: 769-783 (1996); Visser, J., Powder Technology 58: 1-10 (1989)); Rudt, S. y R. H. Muller, J. Controlled Release, 22: 263-272 (1992); Tabata, Y, y Y. Ikada, Biomed. Mater. Res., 22: 837-858 (1988); Wall, D. A., Drug Delivery, 2: 101-201995); Patton, J. y Platz, R., Adv. Drug Del. Rev., 8: 179196 (1992); Bryon, P., Adv. Drug. Del. Rev., 5: 107-132 (1990); Patton, J. S., et al., Controlled Release, 28: 1579-85 (1994); Damms, B. y Bains, W., Nature Biotechnology (1996); Niven, R. W., et al., Pharm. Res., 12(9); 1343-1349 (1995); y Kobayashi, S., et al., Pharm. Res., 13(1): 80-83 (1996).
Las formulaciones de los agentes para modular (aumentar o disminuir) las interacciones entre FcRn e IgG o un fragmento de la misma o una variante de la misma descritas en el presente documento además abarcan composiciones farmacéuticas y formas farmacéuticas anhidras que comprenden los compuestos divulgados como principios activos, ya que el agua puede facilitar la degradación de algunos compuestos. Por ejemplo, la adición de agua (por ejemplo, el 5 %) está muy aceptada en las técnicas farmacéuticas como un medio de simular almacenamiento a largo plazo con el fin de determinar características tal como el periodo de validez o la estabilidad de las formulaciones durante el tiempo. Véase, por ejemplo, Jens T. Carstensen, Drug Stability: Principles & Practice, 379-80 (2a ed., Marcel Dekker, NY, N.Y.: 1995). Las composiciones farmacéuticas y formas farmacéuticas anhidras de la divulgación se pueden preparar usando ingredientes anhidros o que contienen baja hidratación y condiciones de baja hidratación o baja humedad. Las composiciones farmacéuticas y formas farmacéuticas que comprenden lactosa y al menos un principio activo que comprende una amina primaria o secundaria son preferiblemente anhidras si se espera contacto sustancial con hidratación y/o humedad durante la fabricación, embalaje y/o almacenamiento. Las composiciones anhidras preferiblemente se embalan usando materiales que se sabe previenen la exposición a agua de modo que se pueden incluir en kits de formulación adecuados. Los ejemplos de embalaje adecuado incluyen, pero no están limitados a, hojas selladas herméticamente, plásticos, envases unidosis (por ejemplo, viales) con o sin desecantes, blísteres, y paquetes continuos.
Formas farmacéuticas de liberación controlada y retrasada. En algunas formas de realización de los métodos descritos en el presente documento, un agente para modular (aumentar o disminuir) las interacciones entre FcRn e IgG o un fragmento de la misma o una variante de la misma se puede administrar a un sujeto por medios de liberación controlada o retrasada. Idealmente, el uso de una preparación de liberación controlada óptimamente diseñada en tratamiento médico se caracteriza por emplear un mínimo de fármaco para curar o controlar la afección en una mínima cantidad de tiempo. Las ventajas de las formulaciones de liberación controlada incluyen: 1) actividad extendida del fármaco; 2) frecuencia de dosis reducida; 3) cumplimiento del paciente aumentado; 4) uso de menos fármaco total; 5) reducción en efectos secundarios locales o sistémicos; 6) minimización de la acumulación de fármaco; 7) reducción en las fluctuaciones del nivel en sangre; 8) mejora en la eficacia del tratamiento; 9) reducción de la potenciación o pérdida de actividad del fármaco; y 10) mejora en la velocidad de control de enfermedades o afecciones. (Kim, Cherngju, Controlled Release Dosage Form Design, 2 (Technomic Publishing, Lancaster, Pa.: 2000)). Las formulaciones de liberación controlada se pueden usar para controlar el inicio de acción de un compuesto, duración de acción, niveles en plasma en la ventana terapéutica y niveles en sangre pico. En particular, las formas farmacéuticas o formulaciones de liberación controlada o extendida se pueden usar para asegurar que se alcanza la máxima eficacia de un compuesto de fórmula (I) mientras se minimizan los potenciales efectos adversos y problemas de seguridad, que se pueden producir tanto de infradosificar un fármaco (es decir, ir por debajo de los niveles terapéuticos mínimos) así como de superar el nivel de toxicidad para el fármaco.
Una variedad de formas farmacéuticas, formulaciones y dispositivos de liberación controlada o extendida conocidos se pueden adaptar para uso con los agentes para modular las interacciones entre FcRn e IgG o un fragmento de la misma o una variante de la misma descritos en el presente documento. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a, los descritos en las patentes en EE UU No. 3.845.770; 3.916.899; 3.536.809; 3.598.123; 4.008.719; 5674.533; 5.059.595; 5.591 .767; 5.120.548; 5.073.543; 5.639.476; 5.354.556; 5.733.566; y 6.365.185 B1. Estas formas farmacéuticas se pueden usar para proporcionar liberación lenta o controlada de uno o más principios activos usando, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa, otras matrices poliméricas, geles, membranas permeables, sistemas osmóticos (tal como OROS® (Alza Corporation, Mountain View, Calif. EE UU)), recubrimientos multicapa, micropartículas, liposomas, o microesferas o una combinación de los mismos para proporcionar el perfil de liberación deseado en proporciones variables. Además, se pueden usar materiales de intercambio iónico para preparar formas de sal inmovilizadas, adsorbidas de los compuestos divulgados y por tanto efectuar administración controlada del fármaco. Los ejemplos de intercambiadores de aniones específicos incluyen, pero no están limitados a, Duolite® A568 y Duolite® AP143 (Rohm&Haas, Spring House, Pa. EE u U).
En algunas formas de realización, un agente para modular (aumentar o disminuir) las interacciones entre FcRn e IgG o un fragmento de la misma o una variante de la misma para uso en los métodos descritos en el presente documento se administra a un sujeto por liberación sostenida o en pulsos. La terapia de pulsos no es una forma de administración discontinua de la misma cantidad de una composición durante el tiempo, sino que comprende administración de la misma dosis de la composición a una frecuencia reducida o administración de dosis reducidas. La liberación sostenida o administraciones en pulsos son particularmente preferidas cuando el trastorno se produce continuamente en el sujeto, por ejemplo, donde el sujeto tiene síntomas continuos o crónicos de una infección vírica. Cada dosis en pulso se puede reducir y la cantidad total del agente para modular las interacciones entre FcRn e IgG o un fragmento de la misma o una variante de la misma administrada durante el curso de tratamiento al paciente se minimiza.
El intervalo entre pulsos, cuando es necesario, lo puede determinar un experto en la materia. Con frecuencia, el intervalo entre pulsos se puede calcular administrando otra dosis de la composición cuando la composición o el componente activo de la composición ya no es detectable en el sujeto antes de la administración del siguiente pulso. Los intervalos también se pueden calcular de la semivida in vivo de la composición. Los intervalos se pueden calcular tan grandes como la semivida in vivo, o 2, 3, 4, 5, e incluso 10 veces mayores que la semivida de la composición. Varios métodos y aparatos para pulsar composiciones por infusión u otras formas de administración al paciente se divulgan en las patentes en EE UU No. 4.747.825; 4.723.958; 4.948.592; 4.965.251 y 5.403.590.
Ensayos para evaluar la eficacia de agentes terapéuticos
En el presente documento se proporcionan métodos para determinar la eficacia de un tratamiento en un sujeto en necesidad de ello. El método incluye proporcionar una muestra de un sujeto, ensayar la muestra para los niveles de uno cualquiera o más de IL-12, TNF-a, IFN-y, GM-CSF, IL-3, IL-2, granzima B, Tbet o una combinación de los mismos y determinar si el tratamiento es eficaz.
En una forma de realización, el sujeto está diagnosticado con cáncer o una enfermedad infecciosa y recibe o ha recibido un tratamiento que incluye una composición que comprende inmunoglobulina G (IgG) o una variante de la misma o un fragmento de la misma. En el sujeto que recibe una composición que comprende inmunoglobulina G (IgG) o una variante de la misma o un fragmento de la misma, se determina que el tratamiento es eficaz si los niveles de uno cualquiera o más de IL-12, TNF-a, IFN-y, GM-CSF, IL-3, IL-2, granzima B, Tbet o una combinación de los mismos en la muestra del sujeto son mayores relativos a los niveles en una muestra de referencia. En el sujeto que recibe una composición que comprende inmunoglobulina G (IgG) o una variante de la misma o un fragmento de la misma, se determina que el tratamiento no es eficaz si los niveles de uno cualquiera o más de IL-12, TNF-a, IFN-y, GM-CSF, IL-3, IL-2, granzima B, Tbet o una combinación de los mismos en la muestra del sujeto son menores relativos a los niveles en una muestra de referencia.
En una forma de realización, el sujeto está diagnosticado con una enfermedad autoinmunitaria y recibe o ha recibido un tratamiento que incluye una composición que comprende un agente que inhibe la señalización mediada por interacción entre FcRn e IgG. En el sujeto que recibe una composición que comprende un agente que inhibe la señalización mediada por interacción entre FcRn e IgG, se determina que el tratamiento es eficaz si los niveles de uno cualquiera o más de iL-12, TNF-a, IFN-y, GM-CSF, IL-3, IL-2, granzima B, Tbet o una combinación de los mismos en la muestra del sujeto son menores relativos a los niveles en una muestra de referencia. En el sujeto que recibe una composición que comprende un agente que inhibe la señalización mediada por interacción entre FcRn e IgG, se determina que el tratamiento no es eficaz si los niveles de uno cualquiera o más de IL-12, TNF-a, IFN-y, GM-CSF, IL-3, IL-2, granzima B, Tbet o una combinación de los mismos en la muestra del sujeto son mayores relativos a los niveles en una muestra de referencia.
En varias formas de realización, la muestra es sangre, plasma o tejido.
En varias formas de realización, los métodos de evaluar los niveles de IL-12, TNF-a, IFN-y, GM-CSF, IL-3, IL-2, granzima B, o Tbet en una muestra serán aparentes a un experto en la materia. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos específicos para detectar la presencia de una o más proteínas de interés. Cualquier método de inmunoensayo adecuado se puede utilizar, incluyendo los que están comercialmente disponibles, para determinar la presencia de, y opcionalmente cuantificar la cantidad de, la proteína de interés presente en la muestra. En varias formas de realización, el anticuerpo es uno cualquiera o más de un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo, un anticuerpo policlonal o un fragmento del mismo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, y un anticuerpo monocatenario. No se requiere aquí discusión exhaustiva de las técnicas de inmunoensayo conocidas ya que estas las conocen los expertos en la materia. Las técnicas de inmunoensayo adecuadas típicas incluyen inmunotransferencias, inmunoensayos ligados a enzimas (ELISA) sándwich, radioinmunoensayos (RIA), ensayos de unión competitivos, ensayos homogéneos, ensayos heterogéneos, etc. Se revisan varios métodos de inmunoensayos conocidos, por ejemplo, en Methods in Enzymology, 70, pp. 30-70 y 166-198 (1980).
Además, se pueden usar ensayos “de tipo sándwich” con los métodos descritos en el presente documento. Algunos ejemplos de ensayos de tipo sándwich se describen en la patente en EE UU No. 4.168.146 y la patente en EE UU No.
4.366.241. Alternativamente, se pueden usar ensayos “de tipo competitivo” con los métodos descritos en el presente documento. En un ensayo competitivo, la sonda marcada en general se conjuga con una molécula que es idéntica a, o un análogo del analito. Por tanto, la sonda marcada compite con el analito de interés para el material receptivo disponible. Los ejemplos de dispositivos de inmunoensayos competitivos se describen en la patente en EE UU No.
4.235.601, la patente en EE UU No. 4.442.204, y la patente en EE UU No. 4.208.535.
Las técnicas que se pueden usar para evaluar la cantidad de ácido nucleico que codifica uno cualquiera o más de IL-12, TNF-a, IFN-y, GM-CSF, IL-3, IL-2, granzima B, o Tbet de una muestra obtenida de un sujeto incluyen, pero no están limitadas a hibridación in situ (por ejemplo, Angerer (1987) Meth. Enzymol 152: 649). Los ensayos basados en hibridación preferidos incluyen, pero no están limitados a, métodos de “sonda directa” tradicionales tal como hibridación Southern o hibridación in situ (por ejemplo, FISH y FISH más SKY), y métodos de "sonda comparativa” tal como hibridación genómica comparativa (CGH), por ejemplo, CGH basada en ADNc o basada en oligonucleótidos. Los métodos se pueden usar en una amplia variedad de formatos incluyendo, pero no limitados a, métodos unidos a sustrato (por ejemplo, membrana o vidrio) o enfoques basados en matrices. Las sondas que se pueden usar en análisis de ácidos nucleicos típicamente están marcadas, por ejemplo, con radioisótopos o indicadores fluorescentes. Las sondas preferidas son los suficientemente largas para hibridar específicamente con el ácido(s) nucleico(s) diana en condiciones rigurosas. El intervalo de tamaños preferido es desde aproximadamente 200 bases hasta aproximadamente 1000 bases. Los protocolos de hibridación adecuados para uso con los métodos de la invención se describen, por ejemplo, en Albertson (1984) EMBO J. 3: 1227-1234; Pinkel (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9138­ 9142; Pub. EPO No. 430.402; Methods in Molecular Biology, Vol. 33: In situ Hybridization Protocols, Choo, ed., Humana Press, Totowa, N.J. (1994), Pinkel, et al. (1998) Nature Genetics 20: 207-211, y/o Kallioniemi (1992) Proc. Natl Acad Sci USA 89:5321-5325 (1992).
Los métodos de amplificación “cuantitativa” los conocen bien los expertos en la materia. Por ejemplo, la PCR cuantitativa implica coamplificar simultáneamente una cantidad conocida de una secuencia control usando los mismos cebadores. Esto proporciona un estándar interno que se puede usar para calibrar la reacción de PCR. Se proporcionan protocolos detallados para PCR cuantitativa en Innis, et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y.). La medida del número de copia de ADN en loci de microsatélite usando análisis de PCR cuantitativa se describe en Ginzonger, et al. (2000) Cancer Research 60:5405-5409. La secuencia de ácido nucleico conocida para los genes es suficiente para permitir a un experto en la materia seleccionar rutinariamente cebadores para amplificar cualquier porción del gen. También se puede usar PCR cuantitativa fluorogénica en los métodos de la invención. En p Cr cuantitativa fluorogénica, la cuantificación se basa en la cantidad de señales de fluorescencia, por ejemplo, TaqMan y sybr green.
Otros métodos de amplificación adecuados incluyen, pero no están limitados a, reacción en cadena de la ligasa (LCR) (véase, Wu y Wallace (1989) Genomics 4: 560, Landegren, et al. (1988) Science 241:1077, y Barringer et al. (1990) Gene 89: 117), amplificación por transcripción (Kwoh, et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173), replicación de secuencia autosostenida (Guatelli, et al. (1990) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: 1874), PCR en mancha, y PCR con adaptador enlazador, etc.
En ciertas formas de realización se pueden usar otras técnicas para determinar la expresión de un producto génico de polinucleótido, incluyendo análisis de micromatrices (Han, M., et al., Nat Biotechnol, 19: 631-635, 2001; Bao, P., et al., Anal Chem, 74: 1792-1797, 2002; Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-19, 1996; y Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-55, 1997) y SAGE (análisis de expresión génica en serie). Como MPSS, SAGE es digital y puede generar un gran número de secuencias firma (véase, por ejemplo, Velculescu, V. E., et al., Trends Genet, 16: 423-425., 2000; Tuteja R. y Tuteja N. Bioessays. Ag. 2004; 26(8):916-22), aunque órdenes de magnitud menores que eso están disponibles de técnicas tal como MPSS. Los ejemplos de micromatrices de ácidos nucleicos se pueden encontrar, por ejemplo, en las patentes en EE UU Nos. 6.391.623, 6.383.754, 6.383.749, 6.380.377, 6.379.897, 6.376.191, 6.372.431, 6.351.7126.344.316, 6.316.193, 6.312.906, 6.309.828, 6.309.824, 6.306.643, 6.300.063.
En varias formas de realización de los métodos descritos en el presente documento, el valor de referencia se basa en la presencia y/o cantidad de proteína de interés incluyendo uno cualquiera o más de IL-12, TNF-a, IFN-y, GM-CSF, IL-3, IL-2, granzima B, o Tbet de una muestra obtenida de un sujeto (por ejemplo, un sujeto que tiene cáncer, enfermedades infecciosas o enfermedades autoinmunitarias).
En algunas formas de realización, el valor de referencia es la media o mediana de la presencia de la proteína de interés (o ácido nucleico que codifica la proteína de interés) en una población de sujetos que no tienen un estado de enfermedad. Por ejemplo, en sujetos con cáncer, el valor de referencia es la media o mediana de la presencia de uno cualquiera o más de IL-12, TNF-a, IFN-y, GM-CSF, IL-3, IL-2, granzima B, o Tbet en una población de sujetos que no tienen el cáncer. Por ejemplo, en sujetos con una enfermedad infecciosa, el valor de referencia es la media o mediana de la presencia de uno cualquiera o más de IL-12, TNF-a, IFN-y, GM-CSF, IL-3, IL-2, granzima B, o Tbet en una población de sujetos que no tienen la enfermedad infecciosa. Por ejemplo, en sujetos con una enfermedad autoinmunitaria, el valor de referencia es la media o mediana de la presencia de uno cualquiera o más de IL-12, TNF-a, IFN-y, GM-CSF, IL-3, IL-2, granzima B, o Tbet en una población de sujetos que no tienen la enfermedad autoinmunitaria. En varias formas de realización, los niveles presencia de uno cualquiera o más de IL-12, TNF-a, IFN-Y, GM-CSF, IL-3, IL-2, granzima B, o Tbet están alterados (aumentados si el sujeto tiene cáncer o una enfermedad infecciosa y disminuidos si el sujeto tiene una enfermedad autoinmunitaria) relativos al valor de referencia en al menos o aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %. En varias formas de realización, los niveles de uno cualquiera o más de IL-12, TNF-a, IFN-y, GM-CSF, IL-3, IL-2, granzima B, o Tbet están alterados (aumentados si el sujeto tiene cáncer o una enfermedad infecciosa y disminuidos si el sujeto tiene una enfermedad autoinmunitaria) relativos al valor de referencia en al menos o aproximadamente 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 35 veces, 40 veces, 45 veces, 50 veces, 55 veces, 60 veces, 65 veces, 70 veces, 75 veces, 80 veces, 85 veces, 90 veces, 95 veces, 100 veces o una combinación de las mismas.
Mientras formas de realización particulares de varios aspectos divulgados en el presente documento se han mostrado y descrito, será obvio para los expertos en la materia, basado en las enseñanzas en el presente documento, que se pueden hacer cambios y modificaciones sin separarse de esta invención y sus aspectos más amplios y, por tanto, las reivindicaciones adjuntas van a abarcar en su ámbito todos tales cambios y modificaciones.
Todas las patentes y otras publicaciones identificadas son para el fin de describir y divulgar, por ejemplo, las metodologías descritas en tales publicaciones que se podrían usar en relación con la presente invención. Estas publicaciones se proporcionan solamente por su divulgación anterior a la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada a este respecto se debe interpretar como una admisión de que los inventores no están autorizados a preceder tal divulgación en virtud de la anterior invención o por cualquier otra razón. Todas las manifestaciones respecto a la fecha o representación respecto a los contenidos de estos documentos se basan en la información disponible a los solicitantes y no constituye ninguna admisión respecto a la corrección de las fechas o contenidos de estos documentos.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar mejor la invención reivindicada y no se deben interpretar como que limitan el ámbito de la invención. Al nivel que se mencionan materiales específicos, es solamente para fines de ilustración y no se pretende que limite la invención. Un experto en la materia puede desarrollar medios o reactivos equivalentes sin el ejercicio de capacidad inventiva y sin separarse del ámbito de la invención.
Ejemplo 1
Métodos experimentales
Ratones y modelos tumorales. Los ratones Fcgrt-/- (Roopeninan et al., 2003), deficientes en FcRn, en un marco C57BL/6 se compraron originalmente de The Jackson Laboratory. Los ratones FcgrtFl/Fl fueron un amable regalo de Dr. E. Sally Ward (University of Texas Southwestern Medical Center) (Montoyo et al., 2009). Los ratones hFCGRT-hB2M-mFcgrt-/- se han descrito previamente (Yoshida et al., 2004) Todos los procedimientos fueron aprobados por la Junta Permanente del Área Médica de Harvard sobre Animales. AOM, AOM/DSS, Apcmin/+ y modelos tumorales de metástasis de pulmón se realizaron usando protocolos previamente descritos (LeibundGut-Landmann et al., 2008; Meunier et al., 2009; Wirtz et al., 2007).
Inducción de cáncer colorrectal
Se indujo CRC asociado con inflamación por una única dosis i.p. de azoximetano (AOM) (Sigma Aldrich) 10 mg/kg y la posterior administración de dos cursos de 7 días de sulfato sódico de dextrano (DSS) (MP Biochemicals) en el agua de beber, como se esboza en la figura 8D y se describe previamente (Wirtz et al., 2007). La carga tumoral se evaluó dos semanas después de la retirada del curso final de DSS. La carga tumoral se calculó como la suma de todos los diámetros de tumores, como se describe previamente (Grivennikov et al., 2012). Se generaron quimeras de médula ósea por irradiación letal de receptores (2 x 6 Gy) seguido por reconstitución con 1x106 células de médula ósea del donante apropiado. El tratamiento de las quimeras con AOM/DSS se empezó 8 semanas después de la reconstitución. Se indujo CRC no asociado con inflamación por ochos inyecciones i.p. semanales de AOM 10 mg/kg. La carga tumoral se evaluó 12 semanas después de la administración de la dosis final de AOM. La carga tumoral en ratones ApcMin/+ y ApcMin/+Fcgrt-/- se evaluó a los 5-6 meses de edad en ratones sin tratar. En todos los experimentos, la evaluación tumoral 14 se llevó a cabo de forma enmascarada contando tumores macroscópicamente visibles (> 1 mm de diámetro) y midiendo el diámetro más largo de cada lesión con compás calibrador digital.
Experimentos de transferencia adoptiva
Se aislaron células T CD8+ o CD de MLN y la lámina propia del IG de ratones donantes el día 21 del curso de tratamiento de AOM/DSS (véase la figura 8D). El aislamiento de las células se llevó a cabo por digestiones con colagenasa secuenciales, como se ha descrito previamente (Baker et al., 2011). Las células T CD8+ se purificaron posteriormente usando selección magnética negativa (Miltenyi Biotec). Las CD se purificaron usando selección magnética positiva con microperlas de CD11c (Miltenyi Biotec) y dieron predominantemente CD CD8-CD11b+ (Fig. 10I). 1x106 células T CD8+ o CD se transfirieron adoptivamente a ratones receptores mediante inyección i.p., los días 0 y 21 para células T CD8+ y los días -7 y 14 para CD. La localización apropiada de las células transferidas a los MLN y lámina propia del IG de los ratones receptores se verificó en experimentos separados usando ratones congénicos para expresión de Ly5.1 (Fig. 10J). Para eliminación de células T CD8+, los ratones se trataron inicialmente i.p. en días consecutivos con tres dosis de 0,5 mg de un anticuerpo anti-CD8 (clon 53-6.72, BWHBRI Antibody Core Facility) (o isotipo control) empezando 3 días antes de la transferencia inicial de CD (Kruisbeek, 1991). Después de ello, la eliminación de células T CD8+ se mantuvo por administración de anticuerpo anti-CD8 (o isotipo) 0,5 mg cada tres días hasta la terminación del experimento. Para la neutralización de IL-12, los ratones se trataron inicialmente en días consecutivos con tres dosis i.p. de 0,5 mg de un anticuerpo anti-IL-12p40 (clon C17.8) (amablemente proporcionado por Dr. Giorgio Trinchieri; Instituto Nacional del Cáncer) (o isotipo control) empezando 3 días antes de la transferencia inicial de CD. La neutralización se mantuvo por administración de 0,5 mg de anticuerpo anti-IL-12p40 (o isotipo) dos veces a la semana hasta la terminación del experimento.
Experimentos de metástasis pulmonar
Se indujeron metástasis pulmonares por la inyección i.p. de 0,5x106 células de melanoma B16 transfectadas con OVA (células OVA-B16, un regalo generoso del Dr. Kenneth Rock, Facultad de Medicina de la Universidad de Massachusetts) en crecimiento en fase logarítmica (Falo et al., 1995; LeibundGut-Landmann et al., 2008). La evaluación de los nódulos pulmonares se llevó a cabo después de inflación pulmonar y fijación en formalina al 10 %. Para experimentos de inmunización con CD, las CD se aislaron por digestión con colagenasa del pulmón y ganglios linfáticos drenantes de ratones donantes portadores de metástasis y se inyectaron 1x106 CD s.c. en la almohadilla plantar trasera de ratones receptores. Dos semanas después, a los receptores se les dio células OVA-B16, como anteriormente. Para experimentos de protección de células T CD8+, células T CD8+ OT-I específicas de OVA se estimularon con CD pulsadas con IgG IC o IHH-IgG IC, como se ha descrito anteriormente, en presencia de IL-220 U/ml antes de la purificación e inyección i.v. de 1x106 células T en ratones receptores que habían recibido células OVA-B1624 h antes. Para la inmunización con CD cargadas ex vivo, se generó LS-IgG y Cd WT se cargaron durante 3 h ex vivo con IgG IC o LS-IgG que contenían OVA y después se lavaron extensivamente antes de inyección s.c. en la almohadilla plantar. Para la cuantificación de células T CD8+ específicas para el antígeno tumoral OVA, los pulmones se digirieron con colagenasa II como se ha descrito previamente (Olszak et al., 2012) con el fin de crear una suspensión celular única. Las células se tiñeron con anti-CD3, anti-CD8 y el tetrámero SIINFEKL-H2-Kb o un tetrámero LCMV-H2Kb control (Beckman-Coulter). La frecuencia de células positivas para el tetrámero SIINFEKL-H2-Kb en el portal CD+CD8+ se evaluó por citometría de flujo.
Análisis de microbiota
El análisis de la microbiota se realizó usando métodos previamente publicados (Uronis et al., 2011). Brevemente, para análisis de T-RFLP, se recogieron muestras de las heces, IG proximal o IG distal de hermanos de camada adultos (8 semanas de edad) y pre-destete (2 semanas de edad) y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. Las muestras se procesaron para análisis de T-RFLP como se ha descrito previamente (Uronis et al., 2011). El análisis se realizó usando Sequentix Gelquest para asignar tamaño (longitud de fragmento) y altura de pico (abundancia) a cada TRF. Usando PRIMER v6, la abundancia de TRF se estandarizó por total y se transformó por raíz cuadrada. Las abundancias transformadas estandarizadas se compilaron en una matriz de similitud de Bray Curtis y se usó análisis de similitud (ANOSIM) para ensayar diferencias estadísticamente significativas en composición de comunidad global entre genotipos. La diversidad se midió usando los índices de diversidad de Shannon (H), riqueza de Margalef (d) y equidad de Pielou (J) y las diferencias se evaluaron por la prueba de t de Student. Para qPCR, se recogieron muestras de las heces, IG proximal o IG distal de hermanos de camada de 7 semanas de edad y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. Las muestras se procesaron como se ha descrito anteriormente. Se realizó qPCR usando conjuntos de cebadores previamente publicados (Arthur et al., 2012; Miyamoto et al., 2002; Periasamy y Kolenbrander, 2009; Rabizadeh et al., 2007; Shames et al., 1995).
CD humanas y experimentos tisulares
Se obtuvieron de paquetes leucocitarios humanos de Kraft Family Blood Donor Center del Instituto de Cáncer Dana-Farber y Brigham and Women's Hospital. Se derivaron hMoDC como se ha descrito previamente (Zeissig et al., 2010) durante 5 días en hGM-CSF 1000 U/ml y hIL-4500 U/ml. Durante las 24 h finales de cultivo, se añadió IFN-y 100 U/ml. Las estimulaciones con IgG e IHH-IgG se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente. Un conjunto de micromatrices de tejido CRC humano que contenían 50 muestras de tumor y tejido normal adyacente emparejados de los mismos donantes se obtuvieron de BioMax USA. Una segunda TMA que contenía múltiples perforaciones de cada uno de 220 pacientes y para los que los datos de supervivencia estaban disponibles se ha descrito previamente (Karamitopoulou et al., 2011). El tejido se tiñó usando el sistema de doble tinción EnVision G2, kit de conejo/ratón (DAB+/rojo permanente) de Dako después de eliminación de epítopo inducida por calor en citrato 10 mM, EDTA 1 mM, Tween al 0,05 % (pH 6,0). Los anticuerpos primarios fueron anti-hFCGRT (HPA012122, Sigma Aldrich), antihCD11c (Novocastra) y anti-hCD8 (Dako) todos los cuales se usaron a 1/50. Los experimentos se realizaron con la aprobación de la Junta del Revisión del Brigham and Women's Hospital.
Métodos bioquímicos
Se realizaron experimentos de citometría de flujo, análisis de ARN, cuantificación de IgG, ChIP, inmunotransferencia, ELISpot y cocultivo como se describe en el presente documento y como se ha descrito previamente (Baker et al., 20 11 ).
Citometría de flujo
Las células se aislaron del bazo, MLN o colon usando digestión con colagenasa, como se ha descrito previamente (Baker et al., 2011). Todos los anticuerpos usados para tinción de citometría de flujo se compraron de BioLegend excepto los siguientes: Ki67 (BD Pharmingen), granzima B (eBiosciences), FCGR4 (Sino Biologicals). La tinción intracelular para granzima B se llevó a cabo usando el kit Cytofix/Cytoperm (BD Pharmingen) después de una reestimulación de 4 h por PMA (30 ng/ml) e ionomicina (2 pg/ml) (Sigma) y GolgiStop (BD Pharmingen).
Aislamiento de ARN y qPCR
El ARN se aisló directamente de poblaciones celulares separadas por citometría de flujo (células T CD8+ o CD) usando un RNeasy MicroKit (Qiagen) o de tejido congelado rápidamente usando un RNeasy MiniKit (Qiagen). El ARN se sometió a transcripción inversa usando SuperScriptlII (Life Technologies) y se cuantificó por qPCR usando tecnología SYBR Green (Roche).
Cultivos in vitro y ex vivo
La activación de células T CD8+ o CD4+ se evaluó después de 24 h de reestimulación con anti-CD3 y anti-CD28 unidos a placa usando un haz de perlas citométricas (BD Pharmingen). Los inmunocomplejos se formaron usando ovoalbúmina conjugada al hapteno NIP (ácido 4-hidroxi-3-yodo-5-nitrofenilacético) e IgG quimérica específica de NIP (IgG), IHH-IgG o LS-IgG. IHH-IgG es una variante mutacional de la proteína IgG quimérica que contiene un fragmento Fab de ratón específico de NIP y un fragmento Fc de IgG1 humana y que se ha hecho incapaz de unirse a FcRn debido a la introducción de mutaciones en tres aminoácidos críticos en la región Fc que se requieren para la ligación a FcRn como se ha descrito previamente (Baker et al., 2011). LS-IgG se generó por introducción de las mutaciones M428L/N434S que se sabe aumentan la unión de FcRn (Zalevsky et al., 2010) en un anticuerpo quimérico previamente descrito específico para el hapteno ácido 4-hidroxi-3-yodo-5-nitrofenilacético (NIP) y que contiene una Fc de IgG1 humana (Ober et al., 2001) usando el kit de mutagénesis dirigida QuikChange (Stratagene). Los ensayos de presentación cruzada in vitro se llevaron a cabo pulsando 1x105 CD aisladas con inmunocomplejos preformados (OVA conjugado a NIP 0,5 pg/ml IgG anti-NIP o IHH-IgG anti-NIP 100 pg/ml) durante 2-3 h seguido por lavado extensivo y la adición de 2x105 células T CD8+ OT-I purificadas (Baker et al., 2011). La secreción de citoquinas se midió después de 24 h o 48 h por ELISA (BD Pharmingen). Para los experimentos de neutralización de IL-12, la concentración indicada de IgG de cabra neutralizante de IL-12 (RnD Systems) o IgG isotipo control de cabra (RnD Systems) se añadió a las CD después de pulsar con IgG IC. Las CD se incubaron en presencia del anticuerpo neutralizante durante 1 h antes de la adición de las células T CD8+ OT-I.
Análisis de IgG
Se cuantificaron los isotipos de IgG en el suero de ratones sin tratar o tratados usando ELISA específicos de isotipo (Southern Biotech). Para la cuantificación de IgG de tejido, el tejido rápidamente congelado se descongeló brevemente y después se homogenizó en PBS que contenía inhibidores de proteasas (Roche). El material insoluble se eliminó por centrifugación y la concentración de proteína en el sobrenadante clarificado se evaluó por ensayo BCA (Thermo Scientific). Se usaron cantidades equivalentes de proteína en los ELISA de isotipo de IgG y la concentración de IgG se normalizó a mg de proteína total. Se evaluó IgG específica de tumor usando lisados hechos de células epiteliales tumorales purificadas, aisladas por digestión con dispasa y colagenasa (Baker et al., 2011; Olszak et al., 2012). Se eliminó IgG de lisados tumorales por incubación durante la noche con perlas de proteína G Sepharosa (GE Healthcare Life Science) a 4°C. Para inmunotransferencia, se resolvieron 10 pg de lisado de epitelio tumoral o epitelio intestinal normal por SDS-PAGE en condiciones reductoras y se transfirió a membranas de nitrocelulosa. Se ensayaron después tiras de membrana con diluciones 1/10 de suero u homogenizados intestinales de ratones individuales y se reveló con anti-IgG de ratón-HRP. Las membranas se revelaron con el reactivo ECL Western Blotting (GE Healtcare). Para ELISA, las placas se recubrieron con diluciones 1/10 de lisado tumoral en tampón de recubrimiento antes de la aplicación de diluciones en serie de suero u homogenizados de tejido y se reveló con anti-IgG de ratón-HRP. Se cuantificaron células B secretoras de IgG específicas de OVA de ratones portadores de metástasis OVA-B16 por ELISpot (mAbTech) según las instrucciones del fabricante después del aislamiento de células B con microperlas CD19 (Miltenyi Biotech).
Translocación nuclear y ChIP
La translocación nuclear de factores de transcripción se evaluó después de estimulación de CD aisladas con IgG IC (formados como antes con IgG que se une a FcRn o IHH-IgG que no se unen a FcRn y NIP-OVA) durante los tiempos indicados. Las fracciones nuclear y citoplásmica se aislaron usando el kit de extracción nuclear y citoplásmico NE-PER (Thermo Scientific). Los anticuerpos anti-NF-KB p65, anti-IRF-1 y anti-HDAC se compraron todos de Cell Signaling Technologies. Se realizó ChIP después de estimulación de IC con el kit SimpleChIP Plus Enzymatic Chromatin IP (perlas magnéticas) de Cell Signaling Technologies.
Análisis estadísticos
Todos los datos se expresan como media ± e.e.m. A menos que se especifique de otra manera, los datos se analizaron usando pruebas de la t de Student de datos independiente bilateral. La significancia de los resultados a través de experimentos independientes se evaluó por prueba de la t de Student de datos emparejados. Como se indica donde es relevante, los datos no normalmente distribuidos se evaluaron usando la prueba de Mann-Whitney y la supervivencia para experimentos de ratones se evaluó usando la prueba del orden logarítmico o la prueba Chi cuadrado. El análisis de supervivencia humana se realizó con el método de Kaplan-Meier y las dos curvas se compararon con la prueba del orden logarítmico. Posteriormente, el estado FcRn+CDl1c+ se introdujo en análisis de regresión Cox uni- y multivariable. Se usaron cocientes de riesgo (HR) e intervalos de confianza (IC) al 95 % para determinar el efecto pronóstico de los números de células FcRn+CD11c+ en el tiempo de supervivencia. Todos los análisis se llevaron a cabo usando el software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.).
Ejemplo 2
FcRn protege contra el desarrollo de cáncer colorrectal
La mayoría de los cánceres colorrectales (CRC) esporádicos surgen después de una serie definida de sucesos mutacionales que con frecuencia implican la inactivación del gen adenomatous polyposis coli (APC) (Walther et al., 2009). Por tanto, empezamos investigando si FcRn podría contribuir al desarrollo de CRC en ratones ApcMin/+ que poseen una copia anómala de Apc y espontáneamente desarrollan grandes números de adenomas del intestino delgado (Saleh y Trinchieri, 2011). Típicamente, los ratones ApcMin/+ no desarrollan lesiones colónicas en ausencia de más agresiones, tal como la pérdida adicional de un gen supresor tumoral (Aoki et al., 2003; Saleh y Trinchieri, 2011). Sin embargo, ratones ApcMin/+ cruzados con ratones deficientes de FcRn (Fcgrt-/-) espontáneamente desarrollan significativamente más tumores en el IG que sus hermanos de camada ApcMin/+ (Fig. 1A). De forma importante, se detectaron alto grado de displasia e invasión local a través de la LP solo en lesiones de animales ApcMin/+Fcgrt-/-, pero no ApcMin/+ (Fig. 1A y 8A). No se detectaron diferencias en la frecuencia de tumores en el intestino delgado (ID) (Fig. 8B), donde el desarrollo de tumores en ratones ApcMin/+ no depende de un segundo suceso genético (Aoki et al., 2003; Saleh y Trinchieri, 2011). A continuación, se investigó el papel de FcRn en el desarrollo de CRC inducido por la administración crónica de un carcinógeno químico, azoximetano (AOM), que, tras administración repetida, dirige el desarrollo de neoplasias malignas colorrectales (Meunier et al., 2009). Observamos que los ratones Fcgrt-/- sometidos a una pauta estándar de administración de AOM desarrollaron significativamente tumores más abundantes y mayores (Fig. 1B y 8C) que los hermanos de camada WT. Estos datos demuestran la importancia de FcRn en determinar la susceptibilidad al desarrollo de CRC esporádico.
Sabiendo que la enfermedad intestinal inflamatoria se asocia con un riesgo aumentado de CRC y que la inflamación desempeña un papel importante en dirigir incluso neoplasias esporádicas (Coghill et al., 2012, Herrinton et al., 2012), examinamos si la protección tumoral mediada por FcRn se extendía a CRC asociado con inflamación. Se encontró que ratones Fcgrt-/- tratados con AOM y sulfato sódico de dextrano (AOM/DSS) (Fig. 8D) (Wirtz et al., 2007) desarrollaron adenocarcinomas colorrectales significativamente mayores y más abundantes que los hermanos de camada WT (Fig. 1C, 1D, 8E). Además, a mayores concentraciones de DSS, los ratones Fcgrt-/- experimentaron tasas de supervivencia significativamente peores comparados con sus hermanos de camada WT (Fig. 1E), lo que indica que la inmunidad antitumoral mediada por FcRn es suficientemente potente para influir el desenlace de la enfermedad. La pérdida de peso inicial menor en los ratones Fcgrt-/- comparados con controles WT (Fig. 8F) era consistente con hallazgos previos que los ratones Fcgrt-/- están protegidos de colitis inducida por IgG (Kobayashi et al., 2009), lo que sugiere que el desarrollo tumoral en el contexto de deficiencia en FcRn no se debe sencillamente a inflamación aumentada.
Ciertos microbios intestinales pueden desempeñar un papel en fomentar el desarrollo de CRC (Arthur y Jobin, 2011; Arthur et al., 2012). Por tanto, se realizó el perfil de la microbiota intestinal en los ratones de la misma camada WT y Fcgrt-/- con el fin de determinar si FcRn estaba ejerciendo protección tumoral mediante la regulación de la composición microbiana del intestino. El análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción terminal (T-RFLP) de la composición de la comunidad microbiana global y la diversidad de hermanos de camada WT y Fcgrt-/- no reveló diferencias significativas en ratones tras el destete, ocho semanas de edad, o ratones antes del destete, dos semanas de edad (Fig. 1F y 8G, 8H) en ninguno de tres compartimentos asociados con el intestino separados (IG proximal, IG distal y heces). Sin embargo, independientemente del genotipo, se encontró que la microbiota se diferenciaba entre estos tres sitios de tejido, confirmando de esta manera que nuestro análisis tenía suficiente potencia para detectar diferencias en composición microbiana (Fig. 8I, 8J). Con el fin de excluir diferencias en organismos específicos previamente asociados con el desarrollo de CRC (Arthur y Jobin, 2011), también evaluamos la abundancia de estos microbios en una cohorte separada de ratones de siete semanas de edad usando qPCR específica de género o especie y no encontramos diferencias significativas en el IG distal (Fig. 1G) o heces (Fig. 8K) de hermanos de camada WT y Fcgrt-/-. En conjunto, estos datos demuestran que FcRn no protege contra el desarrollo de tumor colorrectal regulando la diversidad microbiana intestinal o disminuyendo la presencia de microbios que fomentan tumores.
Ejemplo 3
FcRn fomenta la retención y activación de células T CD8+ protectoras de tumor en el intestino grueso
Al buscar entender mejor la naturaleza de la inmunidad antitumoral dirigida por FcRn, examinamos la composición inmunológica de linfocitos de la LP (LPL) tanto en tumores disecados como en tejido adyacente macroscópicamente libre de tumor. Mientras no se notaron diferencias en los números de células T CD4+, células citolíticas naturales (NK) o macrófagos (Fig. 9A), se encontraron consistentemente números significativamente mayores de células T CD8+ tanto en tejido tumoral como en tejido adyacente de ratones WT tratados con AOM/DSS en comparación con sus hermanos de camada Fcgrt-/-(Fig. 2A, 2B, paneles superiores, y Fig. 9B). Esta misma deficiencia en infiltración de células T CD8+ en el microentorno del tumor de ratones deficientes en FcRn también se vio en animales ApcMin/+Fcgrt-/- en comparación con sus hermanos de camada ApcMin/+ (Fig. 9C) así como en ratones Fcgrt-/-tratados con AOM solo (Fig. 9D). Además, un mayor porcentaje de las células T CD8+ de los animales WT tratados con AOM/DSS expresaba granzima B intracelular o proteína-1 de membrana asociada a lisosomas (LAMP1) en la superficie (Fig. 2A, 2B, paneles inferiores) que las de sus hermanos de camada Fcgrt-/-. Confirmamos esto usando reestimulación con anti-CD3 y anti-CD28 de células T CD8+CD44+CD62L- efectoras separadas del IG de ratones tratados con AOM/DSS (Fig. 2C). Las células T CD8+ de ratones portadores de tumores Fcgrt-/- secretaban solo pequeñas cantidades de interferón y (IFN-y), factor de necrosis tumoral (TNF) e interlequina-10 (IL-10), la última de las cuales se ha mostrado recientemente que es crítica para la inmunidad antivírica y antitumoral mediada por células T CD8+ citotóxicas eficaz (Mumm et al., 2011; Zhang y Bevan, 2011). Mientras no se vieron diferencias en las tasas de proliferación de células T CD8+ o apoptosis, evaluadas por tinción con Ki-67 y anexina V, respectivamente (Fig. 9E), tanto el aumento de CD103, una integrina asociada con la retención de células T (Le Floc'h et al., 2007), como expresión aumentada de CD44 asociada con activación en células T CD62L+CD8+ se observaron en células T CD8+ que infiltran la LP de hermanos de camada WT, pero no Fcgrt-/-(Fig. 9F). Esto era específico para tejidos asociados a tumor, ya que estas diferencias no se observaron en los ganglios linfáticos mesentéricos (MLN) (Fig. 9f ) y es notable porque la presencia de altos números de células CD8+CD44+CD62L+ que portan un fenotipo de célula de memoria efectora (TEM) se ha asociado con pronóstico mejorado en pacientes de CRC humanos (Pages et al., 2005). Estos datos son, por tanto, consistentes con un papel para FcRn en dirigir inmunidad antitumoral al fomentar la retención y activación de células T citotóxicas que tienen migración selectiva al IG.
A continuación, buscamos confirmar que la activación mediada por FcRn de células T CD8+ era crítica para su función protectora tumoral usando transferencia adoptiva de células T CD8+ aisladas de MLN o LP de ratones WT o Fcgrt-/-tratados con AOM/DSS en animales Fcgrt-/- tratados con AOM/DSS receptores. Al transferir células T CD8+ aisladas tanto de MLN como de LP del IG total, nos dirigimos a minimizar el número de células T probablemente expuestas a un microentorno tumoral tolerizante (Chen y Mellman, 2013). Los ratones receptores Fcgrt-/- que recibieron células T CD8+ de donantes WT desarrollaron significativamente menos tumores que ratones Fcgrt-/- control no tratados (PBS) con células T (Fig. 2D). Mientras la transferencia de células T CD8+ de donantes Fcgrt-/- a receptores Fcgrt-/- ejerció una disminución no significativa en la frecuencia de tumores comparados con controles Fcgrt-/-, también produjo un aumento significativo en el tamaño tumoral y, por tanto, de carga tumoral total, medida por la superficie total del colon que era neoplásica (Fig. 2D) (Grivennikov et al., 2012). Experimentos similares realizados con células T CD4+ adoptivamente transferidas revelaron que las células T CD4+ no son suficientes para la protección tumoral mediada por FcRn. Más bien, nuestros datos son consistentes con que la activación de células T CD8+ citotóxicas es un mecanismo primario por el que opera la vigilancia inmunitaria tumoral dirigida por FcRn.
Ejemplo 4
La sensibilización cruzada dependiente de FcRn por células dendríticas induce respuestas de células T CD8+ antitumorales eficaces
A la luz de nuestra reciente demostración de que FcRn en CD CD8-CD11b+, en las que el pH ácido del endosoma y fagosoma favorece la unión FcRn-IgG, dirige la presentación cruzada de antígenos administrados por IgG IC y la activación resultante de células T CD8+ (Baker et al., 2011), que carecen de FcRn, buscamos determinar si la sensibilización cruzada dependiente de FcRn por CD se requería para sus efectos antitumorales. Dado que este mecanismo necesitaría la presencia de IgG reactiva con tumor para formar IC y que la IgG reactiva con tumor se ha documentado previamente en CRC humano (Auer et al., 1988; Kijanka et al., 2010), primero confirmamos la presencia de estas moléculas efectoras en nuestro modelo. Ensayos tanto ELISA (Fig. 3A y 10A) como de inmunotransferencia (Fig. 10B) usando lisados de epitelio tumoral con IgG eliminada de ratones tratados con AOM/DSS verificaron que IgG reactiva con tumor estaba presente en el suero, así como en MLN y homogenizados de tejido del IG de hermanos de camada WT y Fcgrt-/-tratados con AOM/DSS, pero no controles que no portan tumores. También notamos aumentos de magnitud similar en IgG anti-fosfatisilserina y anti-cardiolipina, que podrían fomentar la formación de IC que contienen cuerpos apoptóticos o mitocondrias liberadas por células tumorales que mueren (Kepp et al., 2009), en el suero de hermanos de camada tanto WT como Fcgrt-/-(Fig. 10C). Además, tanto IgG reactiva a tumor (Fig. 3A y 10A) como IgG total (Fig. 10D) también estaban presentes a niveles similares en los MLN y tejidos intestinales de ratones WT y Fcgrt-/- tratados con AOM/DSS. Por tanto, aunque FcRn es críticamente importante en proteger IgG circulante de catabolismo y nuestros ratones Fcgrt-/- eran predeciblemente hipogammaglobulinémicos sistémicamente (Fig. 10D) (Roopenian et al., 2003), este no era el caso en tejidos para IgG total (Fig. 10D) o IgG específica de tumor (Fig. 3A) donde la producción de IgG local por células plasmáticas residentes es probablemente suficiente para normalizar niveles de IgG tisular. Por tanto, la extrema susceptibilidad de ratones Fcgrt-/- al desarrollo de tumores no se puede atribuir sencillamente a deficiencia local en el ligando IgG para FcRn.
Habiendo confirmado la presencia de IgG capaz de unirse a antígenos tumorales en ratones tanto WT como Fcgrt-/-, verificamos que no había diferencias en la distribución de subconjuntos de CD o expresión de FcyR en CD en la LP del IG de hermanos de camada WT y Fcgrt-/-(Fig. 10E). Esto era particularmente importante dado que la presentación cruzada dependiente de FcRn requiere FcyR para la internalización inicial de IgG IC (Baker et al., 20l1). La evaluación de las características funcionales de CD CD8-CD11b+ y CD8+CD11b- separadas de los MLN, tejidos adyacentes y tumorales de ratones tratados con AOM/DSS reveló que los ratones Fcgrt-/- eran significativamente deficientes en la producción de citoquinas (IFN-y, IL-12) y factores de transcripción (T-bet) que se sabe dirigen la inmunidad mediada por células citotóxicas eficaz (Fig. 3B) (Garrett et al., 2009, Gerosa et al., 1996, Trinchieri, 2003; Zhan y Bevan, 2011). Estas diferencias eran las mayores en el subconjunto CD CD8-CD11b+ que son muy eficaces en la presentación cruzada dependiente de FcRn (Baker et al., 2011). Además, el análisis de transcritos de tejido completo tomados de tejido tumoral y adyacente de ratones portadores de tumores (Fig. 10F-10H) claramente demostró transcritos disminuidos a nivel tisular de estas citoquinas pro-citotóxicas en animales deficientes de FcRn. Estos datos, por tanto, indican que se requiere FcRn en CD para el establecimiento de un entorno de citoquina a nivel tisular en el IG que conduce a activación eficaz de células T CD8+.
Con el fin de demostrar que CD suficientes en FcRn estaban directamente implicadas en dirigir la inmunidad antitumoral, primero realizamos una serie de experimentos de transferencia adoptiva. Ratones Fcgrt-/- que recibieron CD CD8-CD11b+ (Fig. 10I) de donantes WT tratados con AOM/DSS desarrollaron significativamente menos tumores que ratones Fcgrt-/-tratados con PBS control o ratones Fcgrt-/- a los que se dio CD de Fcgrt-/-(Fig. 3C, izquierda) a pesar de migración dirigida equivalente y persistencia de CD donantes de ambos genotipos (Fig. 10J). Además, la administración de CD WT, pero no CD Fcgrt-/-, protegía a receptores Fcgrt-/- de mortalidad inducida por AOM/DSS (Fig. 3C, derecha). La transferencia de incluso un pequeño número de CD CD8-CD11b+ WT suficientes en FcRn pudo normalizar la infiltración de células T CD8+ en tejido del IG adyacente y tumoral de ratones Fcgrt-/- (Fig. 3D), confirmando de esta manera que ningún defecto primario en células T CD8+ está operando en ratones Fcgrt-/-. Ensayos ex vivo en CD aisladas de MLN de receptores Fcgrt-/- 7 días después de la transferencia de CD WT confirmó además que la capacidad de sensibilización cruzada dependiente de FcRn se había restablecido (Fig. 10K). Validamos estos hallazgos usando ratones que portan un gen Fcgrt flanqueado por sitios lox (FcgrtFl/Fl) (Montoyo et al., 2009) que se cruzaron con animales Itgaxcre con el fin de delecionar específicamente FcRn en CD (Fig. 10L). El tratamiento de ratones ItgaxcreFcgrtFl/Fl con AOM/DSS indujo significativamente más tumores colorrectales que los que se encontraron en sus hermanos de camada FcgrtFl/Fl (Fig. 3E). Los ratones ItgaxcreFcgrtFl/Fl también eran deficientes en infiltración de células T CD8+ en la LP del IG comparado (Fig. 3E, abajo), soportando además mediante ello nuestra hipótesis de que FcRn específicamente en CD podría orquestar la activación de células T CD8+ en el intestino. Validamos esto realizando experimentos de transferencia de CD y eliminación de células T CD8+ simultánea que revelaron que la eliminación de células T CD8+ de receptores Fcgrt-/- de CD CD8-CD11b+ WT que experimentan tratamiento con AOM/DSS anuló la mejora en incidencia tumoral y supervivencia a cáncer conferida por las CD WT (Fig. 3F, G). Estos datos, por tanto, confirman que un importante mecanismo de protección tumoral mediada por FcRn es la activación dependiente de CD de células T CD8+ a través de sensibilización cruzada de antígenos tumorales administrados por IgG IC y acondicionamiento del entorno de citoquinas.
Ejemplo 5
FcRn en CD permite la activación de células T CD8+ endógenas hacia antígenos tumorales análogos definidos
Para confirmar los componentes individuales de la vigilancia inmunitaria tumoral mediada por FcRn en un sistema específico de antígeno y demostrar la eficacia de dirigirse a un único antígeno tumoral definido para una ruta permitida por FcRn, usamos un modelo de metástasis pulmonar usando una línea de células de melanoma (B16) que expresa el antígeno OVA (OVA-B16) (Falo et al., 1995). Sabiendo que FcRn se expresa mucho en el pulmón (Spiekemann et al., 2002), primero verificamos que los pulmones de ratones WT estaban enriquecidos en células T CD8+ en comparación con los de sus hermanos de camada Fcgrt-/-(Fig. 11A). Estos datos extienden la gama de respuestas de células T CD8+ de mucosa reguladas por FcRn a un segundo sitio que frecuentemente está afectado por cáncer (Siegel et al., 2012) y se sabe que se involucra tanto en respuestas inmunitarias dependientes de FcRn (Yoshida et al., 2004) como en intercomunicación inmunológica con el intestino (Keely et al., 2011). Posterior a la administración i.v. de OVA-B16, observamos una subida en IgG anti-OVA en homogenizados de pulmón y suero de hermanos de camada tanto WT como Fcgrt-/-(Fig. 11B, 11C) y detectamos números equivalentes de células B que secretan IgG anti-OVA en los LN y bazos de ratones WT y Fcgrt-/-(Fig. 11D), confirmando de esta manera que no hay defecto en la producción local de IgG específica de antígenos tumorales en animales deficientes en FcRn. Los ratones WT desarrollaron considerablemente menos nódulos pulmonares que los ratones Fcgrt-/- y la vacunación subcutánea con CD WT, pero no CD Fcgrt-/-confirió protección de siembra metastásica pulmonar a receptores Fcgrt-/-(Fig. 4A y 11E). Usando tinción del tetrámero SIINFEKL/H2kb, establecimos que una mayor proporción de células T CD8+ endógenas con especificidad de antígeno tumoral OVA surgió en los pulmones de ratones WT que recibieron células tumorales OVA-B16 que en sus hermanos de camada Fcgrt-/-(Fig. 4B). Con el fin de confirmar que la protección tumoral basada en CD, mediada por FcRn era dependiente de la activación de células T CD8+, administramos crónicamente un anticuerpo anti-CD8 eliminador a receptores Fcgrt-/- inmunizados con CD CD8-CD11b+ WT y dados OVA-B16. Mientras la transferencia de CD WT significativamente disminuyó la incidencia de nódulos pulmonares metastásicos en receptores Fcgrt-/-, esta protección se anuló por eliminación de células T CD8+ (Fig. 4C). Confirmamos además que el locus principal de vigilancia inmunitaria tumoral mediada por FcRn era la CD al mostrar que ratones ItgaxcreFcgrtFl/Fl desarrollaron mayores números de nódulos pulmonares que sus hermanos de camada FcgrtFl/Fl y eran menos eficaces en dirigir la expansión de células T CD8+ específicas de tumor (Fig. 4D). Estos hallazgos identifican tanto IgG reactivas al tumor que surgen endógenamente como células T CD8+ endógenamente derivadas análogas como componentes importantes del mecanismo por el que las CD ejercen vigilancia inmunitaria tumoral dependiente de FcRn.
A continuación, buscamos demostrar que dirigirse a la presentación cruzada mediada por FcRn con un único antígeno tumoral acomplejado con IgG podría ser una estrategia viable y atractiva para inmunoterapia antitumoral. Con el fin de hacerlo, hicimos uso de una IHH-IgG que no se une a FcRn que contiene tres mutaciones puntuales en el dominio Fc que desactiva la unión a FcRn, pero no al receptor Fcy (Baker et al., 2011) y una LS-IgG con unión a FcRn aumentada que contiene la mutación 'LS' (M428L/N434S), que aumenta la unión a FcRn mientras mantiene la dependencia del pH (Claypool et al., 2004; Zalevsky et al., 2010). Cuando células T CD8+ OT-I reactivas con OVA se estimularon ex vivo con CD WT sensibilizadas con IgG o IHH-IgG IC que contienen OVA y se transfirieron adoptivamente a ratones receptores Fcgrt-/- 24 h después de la administración i.v. de células OVA-B16, solo células T CD8+ sensibilizadas por CD pulsadas con IgG IC protegieron contra el desarrollo de metástasis pulmonares (Fig. 4E). Además, inmunizar ratones con CD cargadas con LS-IgG IC que contienen OVA confirió significativamente mayor protección del desarrollo de metástasis que la inmunización con CD cargadas con IgG IC (Fig. 4F). Esto es consistente con nuestro hallazgo de que LS-IgG IC era más potente que IgG IC nativos en inducir sensibilización cruzada de baja dosis de antígeno in vitro (Fig. 11F). En conjunto, estos datos demuestran que dirigirse al potencial inmunoestimulador de FcRn usando complejos formados de un único antígeno tumoral definido e IgG o IgG con unión aumentada a FcRn es un enfoque terapéutico antitumoral manejable y eficaz.
Ejemplo 6
FcRn de células dendríticas permite la activación homeostática de células T CD8+ y secreción de citoquinas Tc1 en el IG
Nuestro descubrimiento de que la inmunidad antitumoral mediada por FcRn surge en el IG en ausencia de inflamación preexistente sugería que FcRn podría estar desempeñando un papel activo en vigilancia inmunitaria intestinal antes del inicio del desarrollo del cáncer y por tanto nos llevó a investigar si FcRn regula la activación de células T CD8+ en el IG en condiciones homeostáticas. Similar a nuestra observación en ratones tratados con AOM/DSS, y a pesar de las diferencias bien conocidas en concentraciones de IgG circulantes (Roopenian et al., 2003), cantidades similares de IgG estaban presentes en los tejidos del IG y MLN de hermanos de camada tanto WT como Fcgrt-/- en condiciones de estado estacionario (Fig. 5A). Estos resultados confirmaron que la susceptibilidad de ratones Fcgrt-/- a desarrollo de tumores no podría atribuirse a deficiencia en IgG local homeostática. A pesar de estas cantidades de IgG de tejido comparables, sin embargo, la LP del IG de ratones WT contenía mayores cantidades de células T CD8+, pero no de otros subconjuntos de linfocitos, relativo a lo observado en ratones Fcgrt-/- (Fig. 5B). Una deficiencia similar en infiltración de células T CD8+ en la LP del IG estaba presente en ratones ItgaxcreFcgrtFl/Fl sin tratar comparado con sus controles de camada (Fig. 5C). Además, células T CD8+ de la LP del IG de ratones WT secretaron más IFN-y, IL-10 y TNF tras reestimulación en comparación con células T obtenidas de hermanos de camada Fcgrt-/-(Fig. 5D) y expresaron más citoquinas de activación y asociadas con citotoxicidad cuando se evaluó inmediatamente después del aislamiento (Fig. 5E). La transferencia adoptiva de células T CD8+ congénicas en receptores WT y Fcgrt-/- indicó que no solo se acumuló un mayor número de células T transferidas en la LP del IG de ratones WT 10 días después de la transferencia, sino que estas también aumentaron significativamente más del marcador de activación CD44 (Fig. 12A), consistente con nuestros hallazgos de células T CD8+CD44+CD62L+ deficientes en ratones portadores de tumores Fcgrt-/-(Fig. 9F). En contraste, células T CD8+ de donantes WT o Fcgrt-/- transferidas a receptores WT congénicos migraron de forma dirigida igual de bien a la LP del IG (Fig. 12B), confirmando de esta manera que el efecto de FcRn está en el microentorno tisular local más que ser intrínseco a las células T.
Dado que la activación de células T CD8+ eficaz requiere un entorno de citoquinas apropiado, a continuación, examinamos el medio de citoquinas de tejido local de ratones Fcgrt-/- en condiciones homeostáticas (Gerosa et al., 1996; Zhang y Bevan, 2011). Cultivos de explantes de tejido (Fig. 5F) y análisis de transcritos de ARN de tejidos (Fig. 12C) indicaron que en ausencia de FcRn, los MLN e IG eran deficientes en su capacidad para producir IL-12 y TNF que fomentan la citotoxicidad. Al examinar los perfiles de citoquinas de CD separadas de MLN de hermanos de camada WT y Fcgrt-/- sin tratar, observamos una dependencia similar para FcRn en la expresión de IFN-y, IL-12p35, T-bet y TNF, pero no IL-23p19 en CD CD8-CD11b+ (Fig. 5G). Esto sugiere que FcRn en el subconjunto CD8-CD11b+ de c D asociadas a tejido es responsable de establecer un medio de citoquinas que conduce a la activación de células T CD8+ y por tanto fomenta la vigilancia inmunitaria tumoral en el IG. De forma similar, las células T CD4+ del IG de ratones Fcgrt-/- sin tratar eran deficientes en la secreción de citoquinas asociadas a células Th1 tras reestimulación con anti-CD3 y anti-CD28 a pesar de estar presentes en cantidades iguales en ratones WT y Fcgrt-/- (Fig. 12D, 12E). Estos datos sugieren que la ligación por IgG IC de FcRn en CD contribuye al establecimiento de polarización de células Th1 homeostáticas y T citotóxicas-1 (Tc1), así como función de células T CD8+ en el IG.
Ejemplo 7
La ligación por IgG IC multimérico de FcRn en CD induce la producción de IL-12
Sabiendo que IL-12 es un potente potenciador de la inmunidad mediada por células T CD8+ (Gerosa et al., 1996; Trinchieri et al., 2003) y habiendo consistentemente observado mayores cantidades de IL-12 en CD, en particular el subconjunto CD8-CD11b+, de los tejidos de mucosa de hermanos de camada WT comprados con Fcgrt-/-, a continuación, investigamos los efectos de ligación de FcRn por IgG IC o IgG IC incapaz de unirse a FcRn (IHH-IgG IC) en la secreción de IL-12. La incubación de CD CD8-CD11b+ WT de MLN y bazo de ratones WT sin tratar con IgG IC que se une a FcRn, pero no de IHH-IgG IC que no se une a FcRn, llevó a la inducción directa de transcritos de IL-12p35 (Fig. 6A). De forma similar, la estimulación con IgG IC de CD CD8-CD11b+ WT, pero no Fcgrt-/- aisladas de los MLN de ratones tratados con AOM/DSS produjo secreción de IL-12 aumentada (Fig. 6B). Observamos que la estimulación de CD Fcgrt-/- con IgG IC produjo considerablemente menos fosforilación del factor de transcripción asociado a células Th1 STAT-1 (Antonios et al., 2010) de la que se vio en CD WT (Fig. 6C). Confirmamos que la activación de STAT-1 era un componente importante de la producción de IL-12 inducida por FcRn al tratar CD CD8-CD11b+ aisladas de ratones Stat1-/- con IgG IC que se une a FcRn e IHH-IgG IC que no se une a FcRn y observar que IgG IC no pudo inducir IL-12p35 en ausencia de STAT1 (Fig. 6D). Mostramos además que (Liu et al., 2003, Murphy et al., 1995) la estimulación de Cd CD8-CD11b+ WT con IgG IC produjo translocación nuclear y unión al promotor de IL-12p35 significativamente mayor de tanto el factor-1 regulador de interferón (IRF-1) como NF-kB p65 de la que se observó en CD Fcgrt-/- o tras estimulación con IHH-IgG IC (Fig. 6C, 6E) y confirmamos que esto era independiente de MYD88 (FIG. 13A, 13B). La ligación por IgG IC de FcRn en CD es por tanto capaz de inducir directamente la producción de la potente citoquina IL-12 asociada a células Th1 y Tc1.
Con el fin de demostrar que la inducción mediada por FcRn de IL-12 por CD contribuye a la capacidad de este receptor para fomentar vigilancia inmunitaria antitumoral, a continuación, realizamos un experimento de neutralización de IL-12 en el que ratones Fcgrt-/-transferidos adoptivamente con CD WT se sometieron a tratamiento con AOM/DSS en presencia de un anticuerpo anti-IL-12 neutralizante o isotipo control (Wysocka et al., 1995). Mientras las CD WT eran capaces de disminuir la incidencia de tumores colorrectales en receptores Fcgrt-/- hasta los números vistos para ratones control WT, esta protección estaba completamente anulada cuando los ratones se trataban con anti-IL-12 (Fig. 6F). Sin embargo, ensayos de cocultivo in vitro demostraron que la sensibilización de células T CD8+ dependiente de FcRn era independiente de la producción de IL-12 (Fig. 13C) lo que indica que la presentación cruzada y funciones de inducir citoquinas de FcRn son independientes entre sí. En conjunto, estos datos indican que la protección tumoral mediada por CD dirigida por FcRn resulta de una capacidad dual para fomentar la presentación cruzada de antígeno administrado por IgG IC a células T CD8+, así como para inducir la secreción de IL-12 que, notablemente, puede aumentar la capacidad citotóxica de las células T sensibilizadas.
Ejemplo 8
CD que expresan FcRn predicen supervivencia en CRC humano y secretan IL-12 dependiente de FcRn
Para establecer definitivamente que nuestras observaciones en ratones eran relevantes al desarrollo de CRC humano, evaluamos la presencia de CD que expresan FcRn en 50 casos de CRC humano y tejido normal adyacente emparejado utilizando tinción inmunohistoquímica para FcRn y CD11c. Como se muestra en las figuras 7A y 14A, las células FcRn+CD11c+ estaban claramente presentes en el estroma de tanto IG tumoral (paneles superiores) como IG normal adyacente (paneles inferiores) de pacientes de CRC. Además, se observó una interacción directa de las células del estroma FcRn+ con células T CD8+ en tanto IG tumoral (paneles superiores) como IG normal adyacente a CRC (paneles inferiores) (Fig. 7B y 14B). De forma importante, la frecuencia de CD FcRn+CD11c+ se correlacionaba positivamente con la presencia de células T CD8+ en el estroma normal adyacente a CRC (Fig. 14C). Con el fin de determinar si la presencia de células FcRn+CD11c+ en el microentorno tumoral tenía un impacto en la supervivencia del paciente, teñimos una micromatriz de tejido bien caracterizada de 183 casos de CRC humano para estas células y analizamos su impacto en el desenlace de la enfermedad. Las curvas de supervivencia Kaplan-Meier indicaban que pacientes con > 10 células FcRn+CD11c+ por perforación tuvieron supervivencia significativamente más larga durante un seguimiento de 70 meses que esos con < 10 células FcRn+CD11c+ (Fig. 7C). Además, se encontró que números crecientes de células FcRn+CD11c+ tenían un efecto positivo en la supervivencia del paciente en análisis de riesgos proporcional univariable (p = 0,0333), un efecto que se mantuvo en un análisis multivariable (p = 0,0388) cuando se ajusta para los parámetros clínicos indicados (Fig. 14D). En conjunto, estos estudios demuestran que CD que expresan FcRn se localizan tanto en el microentorno de CRC como el adyacente asociado con CRC, se correlacionan con la infiltración de células T CD8+ en el tejido tumoral y predicen pronóstico mejorado para pacientes de CRC.
Con el fin de demostrar un enlace causante directo entre FcRn humana y vigilancia inmunitaria antitumoral, generamos ratones quiméricos en los que receptores Fcgrt-/- irradiados se reconstituyeron con médula ósea de donantes que eran WT, Fcgrt-/-, o expresaban FcRn humana y p2-microglobulina (p2M) en un marco Fcgrt-/- (hFCGRT-hB2M-mFcgrt-/-) y por tanto poseen solo la forma humana del receptor (Roopenian et al., 2003). Cuando las quimeras se sometieron a tratamiento con AOM/DSS, los ratones Fcgrt-/- reconstituidos con médula ósea Fcgrt-/- desarrollaron números mucho mayores de tumores colorrectales que los ratones Fcgrt-/- reconstituidos con médula ósea WT o hFCGRT-hB2M-mFcgrt-/-(Fig. 7D). Además, la infiltración de células T CD8+ en la LP del IG de ratones portadores de tumores se restableció a niveles WT en ratones Fcgrt-/- que poseen células hematopoyéticas que expresan FcRn humano (Fig. 14E). Por tanto, FcRn humano es igualmente capaz de orquestar vigilancia inmunitaria antitumoral como lo es su ortólogo murino.
Por último, buscamos confirmar que los mecanismos intracelulares que habíamos demostrado en CD de ratón también eran operativos en sus equivalentes humanos usando CD derivadas de monocitos humanas (hMoDC), que fenotípicamente son parecidas al subconjunto CD CD8-CD11b+ murino que se involucra en sensibilización cruzada dependiente de FcRn eficaz (Fig. 14F, 14G) (Baker et al., 2011; Colin et al., 2011). Como se muestra en la figura 7E, la estimulación de hMoDC por IgG IC lleva a una mayor producción tanto de IL-12p35 como IL-12p40 que la estimulación con IHH-IgG iC que no se une a FcRn. Además, IgG IC indujo mayor fosforilación de STAT-1 y translocación nuclear de IRF-1 después de tanto 1 h como 3 h que IHH-IgG IC (Fig. 7F y 14H). En conjunto, apoyan la importancia de la función de FcRn humano en CD en permitir inmunidad antitumoral mediante su capacidad para regular la producción de IL-12 y la activación de células T CD8+.
Ejemplo 9
Como se muestra en la figura 15, el bloqueo con el anticuerpo monoclonal específico de FcRn DVN24 disminuye los niveles de citoquinas Th1.
Los hallazgos presentados aquí identifican un papel fisiológico clave para la sensibilización cruzada mediada por FcRn en dirigir activación homeostática de células T CD8+ y en vigilancia inmunitaria antitumoral mediada por células T CD8+ en el IG y el pulmón. Hemos establecido claramente en múltiples modelos tumorales que la deleción genética de FcRn aumenta la susceptibilidad a carcinogénesis en estos sitios de mucosa. La transferencia de células T CD8+ sensibilizadas en condiciones suficientes de FcRn o de CD portadoras de FcRn WT fue capaz de rescatar animales deficientes en FcRn de tanto una alta carga tumoral como mortalidad inducida por tumor. Esto dependía de la ligación mediada por IgG IC de FcRn en CD de mucosa que permitió la sensibilización de células T CD8+ endógenas específicas de antígeno tumoral a través de su inducción dual de presentación cruzada de antígeno y la producción de citoquinas de aumento inmunitario tal como IL-12. También hemos demostrado la relevancia humana de nuestros hallazgos al demostrar que CD humanas que expresan FcRn responden a estimulación con IgG IC con la producción de IL-12 que fomenta la citotoxicidad, que CD FcRn+ se localizan en el microentorno de CRC donde su capacidad para inducir inmunidad antitumoral contribuye a supervivencia del paciente mejorada y que FcRn humano en células hematopoyéticas puede sustituir a su ortólogo de ratón en proteger contra el desarrollo de carcinoma colorrectal. Nuestros hallazgos son además consistentes con un modelo en el que la unión de IgG IC a FcRn en CD de mucosa dirige no solo el tráfico intracelular de IgG IC, sino también la organización previamente no reconocida de una cascada de señalización que aumenta la secreción de citoquinas que fomentan la citotoxicidad. Estas características de biología de FcRn permiten singularmente vigilancia inmunitaria antitumoral potente que requiere solo pequeñas cantidades de antígeno y capaz de superar las características del entorno inmunorregulador de tejidos intestinales y, potencialmente, otros de mucosa (MacDonald et al., 2011). Además, nuestra demostración de que la deficiencia en FcRn no produce niveles disminuidos de IgG asociada a tejido, sino que más bien niveles disminuidos de células T CD8+ y función de células T CD8+ disminuida en condiciones homeostáticas sugiere además que una función principal de FcRn en tejidos es en la regulación de inmunidad celular más que solamente la protección de IgG de catabolismo que se observa sistémicamente.
Un prerrequisito importante para la protección tumoral mediada por FcRn es la presencia de IgG capaz de reconocer un antígeno tumoral e iniciar una cascada de respuestas antitumorales dependientes de FcRn que alimentan al recientemente descrito “Ciclo Cáncer-Inmunidad” (Brichory et al., 2001; Chen y Mellman, 2013, Desmetz et al., 2011). La presencia de cantidades apreciables de autoanticuerpos IgG endógenos reactivos o que dan reacción cruzada hacia antígenos tumorales alterados o anómalamente expresados está bien documentada y estos probablemente sirven como los iniciadores para la protección tumoral mediada por FcRn. Específicamente, la liberación acelerada de antígenos asociados a tumor, sean solos o como parte de restos celulares o cuerpos apoptóticos causada por tasas crecientes de muerte de células tumorales (Kepp et al., 2009), fomentará la formación de inmunocomplejos con autoanticuerpo endógenos reactivos a tumor o específicos de fosfolípidos. Posteriormente, la inducción concomitante de la producción de IL-12 resultante de la ligación de FcRn por IgG IC se puede esperar que amplifique las respuestas inmunitarias antitumorales dependientes de FcRn locales incluso más ya que IL-12 misma es un potente inductor de inmunidad humoral (Metzger, 2010). Un papel fisiológico clave para FcRn en las CD parece por tanto ser la integración de las respuestas inmunitarias adaptativas humoral y celular, capaces de dirigirse a neoplasias malignas de mucosa y, sin duda, un huésped de infecciones microbianas intracelulares.
Varios aspectos intrigantes de la biología de FcRn surgen de nuestro trabajo. El primero de estos es que la regulación inmunitaria dependiente de FcRn es operativa en condiciones homeostáticas y es crítica para establecer activación y función de células T CD8+ colónicas basal. Predecimos que tales respuestas homeostáticas están en gran parte dirigidas a antígenos microbianos dado que IgG con especificidades antibacterianas están abundantemente presentes en el intestino (Macpherson et al., 1996) y que las rutas descritas aquí también pueden desempeñar un papel crítico en vigilancia inmunitaria contra infecciones microbianas agudas y crónicas (Yoshida et al., 2006). En segundo lugar, nuestro trabajo subraya el papel diferencial desempeñado por FcRn en diferentes compartimentos del cuerpo. Mientras FcRn es crítico para mantener persistencia de IgG en el sistema circulatorio (Roopenian et al., 2003), nuestras observaciones indican que, en los tejidos, FcRn está predominantemente implicado en la regulación de respuestas inmunitarias locales. Además de la activación inmunitaria inadecuada vista en los intestinos de ratones Fcgrt-/-, esta idea está apoyada por nuestros hallazgos de que ratones Fcgrt-/- solo eran mínimamente deficientes en cantidades de IgG en los tejidos donde cantidades iguales de células productoras de IgG eran capaces de compensar por la falta de protección de IgG mediada por FcRn. Por último, hemos demostrado la viabilidad y eficacia de dirigirse a rutas de inmunovigilancia anticáncer mediadas por FcRn usando un único antígeno tumoral definido en complejo con IgG nativa o IgG manipulada para unión a FcRn aumentada. Además de permitir la inmunidad mediada por células T CD8+ específica de antígeno después del inicio del tumor, tales terapias también tienen el potencial de fomentar vigilancia inmunitaria tumoral en individuos sanos de alto riesgo al aumentar el potencial citotóxico basal del intestino. Mientras un gran cuerpo de conocimiento existe referente a la dinámica de la interacción FcRn-IgG (Vaughn et al., 1997) y la capacidad de manipular IgG con afinidad aumentada para FcRn está actualmente disponible (Mi et al., 2008; Zalevsky et al., 2010), dirigirse a FcRn no se ha explotado aun por estrategias de vacunación basadas en CD actuales (Tacken et al., 2007) a pesar del interés creciente en vacunas de anticuerpo de CD (Palucka y Banchereau, 2013).
La naturaleza pleiotrópica de FcRn y su influencia de largo alcance en fisiología normal permanece poco entendida. Mientras la función principal de FcRn sistémicamente es la protección de IgG monomérica de catabolismo (Roopenian et al., 2003), un papel principal en tejidos, particularmente en tejidos de mucosa repletos con IgG, parece ser uno de activación inmunológica tras ligación por IgG IC multimérica. A este efecto, FcRn participa en la organización no solo de una cascada de presentación de antígenos, sino también de una cascada de señalización que está asociada con la función inmunitaria efectora innata. Como se muestra aquí, una consecuencia principal de este papel para FcRn es la inducción eficaz de inmunidad antitumoral. Estos estudios muestran que FcRn funciona en inmunidad antitumoral mediante la inducción (a través de IL-12) e instrucción (a través de presentación cruzada) de células T CD8+. Desarrollar un mayor entendimiento de los matices de la activación inmunitaria modulada por FcRn, en particular a nivel de tejido donde FcRn en células dendríticas fomenta el catabolismo inmunogénico de antígenos acomplejados con IgG, mantiene considerable promesa para el desarrollo de nuevas terapias contra enfermedades de la mucosa.
Referencias
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Los varios métodos y técnicas descritos anteriormente proporcionan un número de maneras para llevar a cabo la solicitud. Por supuesto, se debe entender que no necesariamente todos los objetivos o ventajas descritas se pueden lograr según cualquier forma de realización particular descrita en el presente documento. Así, por ejemplo, los expertos en la materia reconocerán que los métodos se pueden realizar de una manera que logre u optimice una ventaja o grupo de ventajas como se enseña en el presente documento sin necesariamente lograr otros objetivos o ventajas enseñadas o sugeridas en el presente documento. Una variedad de alternativas se menciona en el presente documento. Se debe entender que algunas formas de realización preferidas específicamente incluyen una, otra o varias características, mientras que otras específicamente excluyen una, otra o varias características, mientras que aún otras mitigan una característica particular por inclusión de una, otra o varias características ventajosas.
Además, el experto en la materia reconocerá la aplicabilidad de varias características de diferentes formas de realización. De forma similar, los varios elementos, características y etapas discutidos anteriormente, así como otros equivalentes conocidos de tales elementos, características o etapas, las puede emplear en varias combinaciones un experto en la materia para realizar los métodos según los principios descritos en el presente documento. Entre los varios elementos, características y etapas algunos estarán específicamente incluidos y otros específicamente excluidos en diversas formas de realización.
Aunque la solicitud se ha divulgado en el contexto de ciertas formas de realización y ejemplos, los expertos en la materia entenderán que las formas de realización de la solicitud se extienden más allá de las formas de realización específicamente divulgadas a otras formas de realización alternativas y/o usos y modificaciones y equivalentes de las mismas.
En algunas formas de realización, los términos “un” y “una” y “el” y “ la” y referencias similares usadas en el contexto de describir una forma de realización particular de la solicitud (especialmente en el contexto de ciertas de las siguientes reivindicaciones) se pueden interpretar que cubre tanto el singular como el plural. La enumeración de intervalos de valores en el presente documento simplemente se pretende que sirva como un método abreviado de referirse individualmente a cada valor separado que está en el intervalo. A menos que se indique otra cosa en el presente documento, cada valor individual se incorpora a la especificación como si estuviera individualmente enumerado en el presente documento. Todos los métodos descritos en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique otra cosa en el presente documento o claramente se contradiga por el contexto. El uso de cualquiera de los ejemplos, o vocabulario ejemplar (por ejemplo, “tal como”) proporcionado con respecto a ciertas formas de realización en el presente documento se pretende solamente que ilumine mejor la solicitud y no plantea una limitación en el ámbito de la solicitud de otra manera reivindicada. No se debe interpretar el vocabulario en la especificación como que indica cualquier elemento no reivindicado esencial para la práctica de la invención.
Las formas de realización preferidas de esta solicitud se describen en el presente documento, incluyendo el mejor modo conocido para los inventores para llevar a cabo la solicitud. Las variaciones en esas formas de realización preferidas serán aparentes para los expertos en la materia tras leer la descripción anterior. Se contempla que los expertos en la materia puedan emplear tales variaciones según sea apropiado, y la solicitud se pueda practicar de otra manera que la específicamente descrita en el presente documento. Según esto, muchas formas de realización de esta solicitud incluyen todas las modificaciones y equivalentes del objeto enumerado en las reivindicaciones adjuntas al presente documento según permiten la ley aplicable. Además, cualquier combinación de los elementos anteriormente descritos en todas las posibles variaciones de los mismos está abarcada por la solicitud a menos que se indique de otra manera en el presente documento o se contradiga claramente de otra manera por el contexto.
Se debe entender que las formas de realización de la solicitud divulgadas en el presente documento son ilustrativas de los principios de las formas de realización de la solicitud. Otras modificaciones que se pueden emplear pueden estar en el ámbito de la solicitud. Por tanto, a modo de ejemplo, pero no de limitación, se pueden utilizar configuraciones alternativas de las formas de realización de la solicitud según las enseñanzas en el presente documento. Según esto, las formas de realización de la presente solicitud no están limitadas a esa con precisión como se muestra y describe.

Claims (3)

REIVINDICACIONES
1. Un método para determinar la eficacia de tratamiento en un sujeto que tiene una enfermedad autoinmunitaria, en donde al sujeto se le ha administrado un tratamiento que comprende una composición que comprende un anticuerpo anti-FcRn que inhibe la señalización mediada por interacción entre FcRn e IgG; el método comprende:
a. proporcionar una muestra obtenida del sujeto;
b. ensayar el nivel de TNF-a en la muestra; y
c. determinar que el tratamiento es eficaz si el nivel de TNF-a en la muestra del sujeto es menor relativo al nivel en una muestra de referencia, o determinar que el tratamiento no es eficaz si el nivel de TNF-a en la muestra del sujeto es mayor relativo al nivel en una muestra de referencia.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo, un anticuerpo policlonal o un fragmento del mismo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado y anticuerpo monocatenario.
3. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra es sangre, plasma o tejido.
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