ES2909799T3 - Derivados aminoacídicos de triptólido esterificados en el hidroxilo C14 y método de preparación y uso de los mismos - Google Patents
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Abstract
Un derivado aminoacídico de triptólido esterificado en el hidroxilo C14 seleccionado de los siguientes compuestos: **(Ver fórmula)** y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
Description
DESCRIPCIÓN
Derivados aminoacídicos de triptólido esterificados en el hidroxilo C14 y método de preparación y uso de los mismos
Campo técnico
La presente invención se refiere a un derivado aminoacídico de triptólido esterificado en el hidroxilo C14, a una composición farmacéutica que comprende el derivado aminoacídico de triptólido esterificado en el hidroxilo C14 y al derivado aminoacídico de triptólido esterificado en el hidroxilo C14 para su uso en un método para tratar a un paciente que tiene un tumor, o una enfermedad inmunitaria.
Antecedentes de la invención
El triptólido (TPL) es un compuesto de abietano diterpeno lactona con una configuración única que contiene 3 grupos epoxi y una estructura de anillo de lactona de cinco miembros a,p-insaturada, que se aísla de Tripterygium wilfordii Hook. f., una planta del género Tripterygium de la familia Celastraceae. Tiene una fórmula molecular de C20H24O6, un peso molecular de 360,4 y una fórmula estructural que se muestra a continuación.
Numerosos estudios in vivo e in vitro han demostrado que el triptólido tiene actividades biológicas significativas, tales como actividad antitumoral, actividad antiinflamatoria, actividad inmunosupresora y actividad contra la fertilidad masculina. Triptólido puede prolongar significativamente el tiempo de supervivencia de los ratones con leucemia L615 y también muestra un efecto terapéutico significativo para la leucemia humana con una tasa de remisión completa de hasta el 40% (18/45) [Xia Zhi-Lin et al., "Estudios farmacológicos y clínicos de triptólido". Acta Pharmacologica Sinica, 1992, (6) 427-431]. Se usa clínicamente para el tratamiento de la psoriasis, la artritis reumatoide, la leucemia, la nefropatía, etc. Sin embargo, los estudios sobre la toxicidad del triptólido demuestran que el triptólido tiene una alta toxicidad y una ventana terapéutica estrecha, y tiene efectos secundarios tóxicos graves en el sistema digestivo, sistema urogenital y sistema hematológico, etc. Por lo tanto, la investigación de desarrollo clínico de triptólido está limitada hasta cierto punto. Debido a su estructura química y actividades biológicas únicas, el triptólido ha acaparado un gran interés por parte de químicos y farmacólogos de varios países. Con el fin de revelar el mecanismo de acción y la relación estructura-actividad del triptólido y encontrar sus derivados con alta actividad y baja toxicidad, varios grupos de estudio han realizado estudios sistemáticos sobre el triptólido y sus análogos y han sintetizado una serie de derivados de triptólido [Zhang Fan et al., "Progreso en la modificación de la estructura de triptólido". Acta Pharmacologica Sinica, 2004, 39(10):857-864; y Tai Ting et al., "Avance en la farmacocinética de triptólido". Pharmaceutical and Clinical Research, 2012, 20(3):229-235]. Algunos de ellos han entrado en ensayos clínicos. Por ejemplo, Minnelide, un profármaco soluble en agua de triptólido, sintetizado por científicos de la Universidad de Minnesota, EE. UU., puede convertirlo en triptólido tanto in vivo como in vitro. En algunos modelos animales, Minnelide mostró un buen efecto anticanceroso y una reacción poco tóxica. Por ejemplo, en un modelo de cáncer de páncreas en ratón atímico, Minnelide prolongó la supervivencia de los ratones al reducir el volumen del tumor y la diseminación del tumor, y Minnelide no mostró ningún efecto tóxico significativo a una dosis eficaz para la regresión del tumor. Minnelide ahora está entrando en ensayos clínicos de fase I [Chugh R, et al., "Una evaluación preclínica de Minnelide como agente terapéutico contra el cáncer de páncreas". Sci. Transl. Med., 2012; 4(156): 156ra139]. Desafortunadamente, hasta el momento no se ha encontrado ningún triptólido o derivado que haya entrado en ensayos clínicos de fase II. Por lo tanto, los investigadores aún deben realizar más estudios para explorar métodos relacionados con la aplicación clínica segura de triptólido, así como nuevos derivados de triptólido con alta actividad y baja toxicidad. Además, las características farmacocinéticas del triptólido tanto para inyección oral como intravenosa sugieren que el triptólido tiene una semivida de eliminación corta, se absorbe, distribuye, metaboliza y elimina rápidamente en el cuerpo, y las concentraciones plasmáticas y tisulares del fármaco fluctúan mucho con el tiempo. Por lo tanto, el triptólido no tiene propiedades farmacocinéticas ideales y es desfavorable para la aplicación clínica y podría aumentar la incidencia de reacciones adversas clínicas. Por lo tanto, es muy importante explorar nuevos derivados de triptólido y formulaciones relevantes con buenas características farmacocinéticas [Tai Ting et al., "Avance en la farmacocinética de triptólido". Pharmaceutical and Clinical Research, 2012, 20(3):229-235].
Por lo tanto, todavía existe una necesidad en el mercado de fármacos triptólidos con buenas actividades biológicas y características farmacocinéticas y poca toxicidad. Hasta el momento, aún no existen informes sobre la síntesis y aplicación de derivados de triptólido con estas características.
Sumario de la invención
La invención es como se define en las reivindicaciones 1-8.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a nuevos derivados aminoacídicos de triptólido esterificados en el hidroxilo C14 que tienen por fórmula:
y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
En la siguiente tabla se muestran algunos datos de los compuestos enumerados anteriormente.
Como se usa aquí, el término "sales farmacéuticamente aceptables del derivado aminoacídico de triptólido esterificado en hidroxilo C14" se refiere a sales de ácidos orgánicos formadas por el derivado aminoacídico de triptólido esterificado en el hidroxilo C14 y ácidos orgánicos que tienen aniones farmacéuticamente aceptables. La sal de ácido orgánico incluye, pero no se limita a, tosilato, mesilato, malato, acetato, citrato, malonato, tartrato, succinato, benzoato, ascorbato, lactato, a-cetoglutarato y a-glicerofosfato; también se pueden formar sales inorgánicas adecuadas, incluidas, pero sin limitación, hidrocloruro, sulfato, nitrato, bicarbonato y carbonato, fosfato, hidrobromuro, hidroyoduro y similares.
Las sales farmacéuticamente aceptables se pueden obtener utilizando procedimientos clásicos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante la reacción de una cantidad suficiente de un compuesto básico y un ácido adecuado que proporciona un anión farmacéuticamente aceptable.
El término "tratamiento" utilizado en el presente documento generalmente se refiere a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevención total o parcial de una enfermedad o un síntoma de la misma; y/o puede ser terapéutico en términos de una estabilización o cura parcial o completa de una enfermedad y/o un efecto adverso causado por la enfermedad. El "tratamiento" utilizado en el presente documento abarca cualquier tratamiento de una enfermedad en un paciente, que incluye: (a) prevenir una enfermedad o un síntoma, cuando la enfermedad o el síntoma se produce en un paciente que aún no ha sido diagnosticado con la enfermedad; (b) inhibir el síntoma de una enfermedad, es decir, detener el desarrollo del síntoma; o (c) aliviar el síntoma de una enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad o el síntoma.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el derivado aminoacídico de triptólido esterificado en el hidroxilo C14 o su sal farmacéuticamente aceptable de la presente invención.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende al menos un derivado aminoacídico de triptólido esterificado en el hidroxilo C14 o su sal farmacéuticamente aceptable como se ha descrito anteriormente, y un excipiente farmacéuticamente aceptable opcional.
Los métodos para preparar diversas composiciones farmacéuticas que contienen una cierta cantidad de un ingrediente activo son conocidos, o son evidentes a la luz de la invención aquí descrita, para los expertos en la técnica, como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences, Martin, E.W., ed., Mack Publishing Company, 19a ed. (1995). Los métodos para preparar dichas composiciones farmacéuticas comprenden incorporar un excipiente, vehículo, diluyente, etc. farmacéutico apropiado.
Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención se fabrican por métodos conocidos, incluidos los métodos convencionales de mezcla, disolución o liofilización.
Los compuestos de la presente invención pueden prepararse como una composición farmacéutica y administrarse a un paciente por varias vías adecuadas para un modo de administración seleccionado, por ejemplo, por vía oral o parenteral (vía intravenosa, intramuscular, local o subcutánea).
Por lo tanto, los compuestos de la presente invención pueden administrarse sistémicamente, por ejemplo, por vía oral, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable (p. ej., un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable). Pueden encapsularse en una cápsula de gelatina dura o blanda y pueden prensarse en un comprimido. Para la administración oral, los compuestos activos pueden combinarse con uno o más excipientes y usarse en forma de comprimidos para tragar, comprimidos bucales, pastillas, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, discos y similares. Tales composiciones y formulaciones deberían comprender al menos 0,01% de un compuesto activo. Por supuesto, la proporción de dichas composiciones y formulaciones puede variar y puede estar comprendida entre aproximadamente el 0,1% y aproximadamente el 99% del peso de la forma de dosificación unitaria dada. La cantidad de un compuesto activo en esta composición terapéuticamente útil es tal que se obtendrá un nivel de dosis efectivo.
Los comprimidos, pastillas, píldoras, cápsulas y similares también pueden comprender: aglutinante, como tragacanto, goma arábiga, almidón de maíz o gelatina; excipiente, como fosfato de calcio dibásico; disgregante, tal como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico y similares; lubricante, como estearato de magnesio; y edulcorante, como sacarosa, fructosa, lactosa o aspartamo; o agente aromatizante, tal como menta, aceite de gaulteria o aroma de cereza. Cuando la forma de dosificación unitaria es una cápsula, además de los tipos de materiales anteriores, también puede comprender un vehículo líquido, como aceite vegetal o polietilenglicol. Varios otros materiales pueden presentarse como recubrimientos o para modificar de otro modo la forma física de la forma de dosificación unitaria sólida. Por ejemplo, los comprimidos, las píldoras o las cápsulas se pueden recubrir con gelatina, cera, goma laca o azúcar y similares. Un jarabe o elixir puede comprender un compuesto activo, sacarosa o fructosa como edulcorante, parahidroxibenzoato de metilo o propilo como conservante, un colorante y un agente saborizante (como sabor a cereza o naranja). Por supuesto, cualquier material usado en la preparación de cualquier forma de dosificación unitaria debe ser farmacéuticamente aceptable y sustancialmente no tóxico en las cantidades aplicadas. Además, el compuesto activo puede incorporarse en formulaciones y dispositivos de liberación sostenida.
El compuesto activo también puede administrarse por vía intravenosa o intraperitoneal mediante infusión o inyección. Se puede preparar una disolución acuosa del compuesto activo o sales del mismo, opcionalmente mezclada con un tensioactivo no tóxico. Alternativamente, se puede preparar una dispersión en glicerol, polietilenglicol líquido, triacetina y una mezcla de los mismos y en aceite. En condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas formulaciones contienen conservantes para evitar el crecimiento de microorganismos.
Las formas de dosificación farmacéutica adecuadas para inyección o infusión pueden incluir una disolución o dispersión acuosa estéril o polvos estériles que comprenden ingredientes activos (opcionalmente encapsulados en liposomas), que se adaptan para la preparación extemporánea de la disolución o dispersión inyectable o infundible estéril. En todos los casos, la forma farmacéutica final debe ser estéril, líquida y estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento. El vehículo líquido puede ser un disolvente o un medio de dispersión líquido, que incluye, por ejemplo, agua, etanol, un poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y similares), aceite vegetal, glicérido no tóxico, y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante la formación de liposomas, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula deseado en el caso de la dispersión, o mediante el uso de un tensioactivo. La prevención de microorganismos puede llevarse a cabo mediante diversos agentes antibacterianos y agentes antifúngicos (tales como parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, tiomersal y similares). En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, como azúcar, tampones o cloruro de sodio. La absorción prolongada de la composición inyectable puede lograrse mediante el uso de una composición de agentes para retrasar la absorción (por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina).
Se puede preparar una disolución inyectable estéril incorporando una cantidad requerida del compuesto activo en un disolvente adecuado con una variedad de otros ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. En el caso de polvos estériles utilizados para preparar una disolución inyectable estéril, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y la liofilización, que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado presentado en una disolución previamente filtrada estéril.
Los vehículos sólidos útiles incluyen sólidos finamente divididos (tales como talco, arcilla, celulosa microcristalina, sílice, alúmina y similares). Los vehículos líquidos útiles incluyen agua, etanol o glicol o una mezcla de aguaetanol/glicol, en la que los presentes compuestos pueden disolverse o dispersarse en un contenido eficaz, opcionalmente con la ayuda de un tensioactivo no tóxico. Se puede agregar un adyuvante, tal como un saborizante, y un agente antimicrobiano adicional para optimizar las propiedades para un uso dado.
También se puede usar un espesante (como polímeros sintéticos, ácidos grasos, sales y ésteres de ácidos grasos, alcoholes grasos, celulosas modificadas o materiales inorgánicos modificados) con un vehículo líquido para formar una pasta, un gel, un ungüento, un jabón y similares revestibles, para aplicación directamente sobre la piel de un usuario.
La cantidad del compuesto, o una sal activa o derivado del mismo, requerida para su uso en el tratamiento variará dependiendo no solo del ingrediente activo particular seleccionado sino también de la vía de administración, la naturaleza de la enfermedad a tratar y la edad. y condición del paciente, y en última instancia, dependerá del criterio del médico o clínico responsable del tratamiento.
La formulación anterior puede estar presente en una forma de dosificación unitaria, que es una unidad físicamente discreta que contiene una dosis unitaria, adecuada para la administración en seres humanos u otros mamíferos. La forma de dosificación unitaria puede ser una cápsula o un comprimido, o varias cápsulas o comprimidos. La cantidad del ingrediente activo en una dosis unitaria se puede variar o ajustar desde alrededor de 0,01 hasta alrededor de 1.000 miligramos o más según el tratamiento particular implicado.
En los siguientes ejemplos, la presente invención se explicará con más detalle. Debe entenderse, sin embargo, que los siguientes ejemplos pretenden ilustrar la invención sin limitar su alcance de ningún modo.
Breve descripción de los dibujos
Fig. 1 muestra los resultados del análisis de inmunotransferencia de los niveles de las proteínas XPB y Pol II en células tumorales y células sanas.
Fig. 2 muestra los resultados del análisis de inmunotransferencia de los efectos inhibidores de 14-D-Valina-TPL sobre las actividades de XPB y Pol II en células de leucemia THP-1 humana.
Fig. 3 muestra los resultados del análisis de inmunotransferencia de los efectos inhibidores de 14-D-Valina-TPL sobre la actividad de c-myc en células de leucemia K562 humana.
Descripción detallada de la invención
Las materias primas químicas utilizadas en los siguientes ejemplos están todas disponibles en el mercado o se obtienen mediante métodos de síntesis bien conocidos en la técnica.
Ejemplo 1: Síntesis e identificación del compuesto 14-D-Valina-TPL (14-Dextro-Valina-Triptólido)
14-D-Valina-TPL
En el esquema, TPL: triptólido; D-Boc-Valina: Dextro-(N-Boc)-Valina; DIC: N,N'-diisopropilcarbodiimida; DMAP: 4-dimetilaminopiridina; DCM: diclorometano; TFA: ácido trifluoroacético.
Etapa 1: Se disolvieron triptólido TPL (500 mg, 1,39 mmol, 1,0 eq.) y dextro-(N-Boc)-valina (1500 mg, 6,91 mmol, 5 eq.) en diclorometano (20 ml) y la disolución se enfrió a 0°C. Se añadieron N,N'-diisopropilcarbodiimida (4 ml, 13 mmol, 9,35 eq.) y 4-dimetilaminopiridina (130 mg, 1,07 mmol, 0,8 eq.) a la disolución mixta a 0 °C y se hizo reaccionar durante 24 horas a 25°C. La disolución de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con agua y luego se lavó con cloruro de amonio saturado, se secó y se concentró para dar un producto bruto. El producto bruto se purificó en una columna de gel de sílice preparativa para producir D-Boc-Valina-TPL (14-Dextro-Boc-Valina-Triptólido) como un sólido blanco (250 mg), con un rendimiento del 32,2 %.
Etapa 2: El producto D-Boc-Valina-TPL (14-D-Boc-Valina-Triptólido) (200 mg) de la etapa anterior se disolvió en
diclorometano (15 mL), y se añadieron gota a gota 3 mL de ácido trifluoroacético. Después de la adición, la disolución de reacción se hizo reaccionar a 25°C durante 3,5 horas. La disolución de reacción se diluyó con diclorometano y se lavó con una disolución acuosa de bicarbonato de sodio y luego se secó y concentró para dar un producto bruto. El producto bruto se purificó mediante cromatografía líquida preparativa de alta redisolución para producir D-Valina-TPL (14-Dextro-Valina-Triptólido) como un sólido blanco (120 mg), con un rendimiento del 73 %.
LC-MS: Tiempo de retención: 0,83 min (UV220: 97,8%), m/z: 460,28 (M+H).
RMN 1H (400 MHz, CDCla) 55,11 (s, 1H), 4,78 - 4,62 (m, 2H), 4,01 (s, 1H), 3,86 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 3,58 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 3,52 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 2,72 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 2,47 (s, 1H), 2,33 (d, J = 16,3 Hz, 1H), 2,26 - 2,08 (m, 2H), 1,94 (dd, J = 36,2, 22,1 Hz, 2H), 1,58 (dd, J = 12,0, 4,5 Hz, 1H), 1,23 (d, J = 5,6 Hz, 4H), 1,16 ( d, J = 4,8 Hz, 3H), 1,03 (s, 3H), 0,93 (d, J = 6,4 Hz, 3H), 0,81 (d, J = 6,5 Hz, 3H).
Ejemplo 2: Síntesis e identificación del compuesto 14-L-Valina-D-Valina-TPL (14-Levo-Valina-Dextro-Valina-Triptólido)
En el esquema, D-Valina-TPL: 14-Dextro-Valina-Triptólido; L-Boc-Valina: Levo-(N-Boc)-Valina; HATU: hexafluorofosfato de 2-(7-aza-benzotriazol)-N,N,N',N'-tetrametiluronio; DIPEA: N,N-diisopropiletilamina; DCM: diclorometano; TFA: ácido trifluoroacético.
Etapa 1: Se disolvieron D-Valina-TPL (14-Dextro-Valina-Triptólido) (110 mg, Ejemplo 1) y Levo-(N-Boc)-Valina (1,2 eq.) en diclorometano (10 mL), y se añadieron HATU (hexafluorofosfato de (2-(7-aza-benzotriazol)-N,N,N',N'-tetrametiluronio, 1,5 eq.) y DIPEA (N,N-diisopropiletilamina, 2 eq.) a la disolución mixta y se hicieron reaccionar a 25°C durante media hora. La disolución de reacción se lavó con una disolución de carbonato de potasio 1 M y se secó y concentró para dar un producto bruto. El producto bruto se purificó en una columna de gel de sílice preparativa para producir 14-L-Boc-Valina-D-Valina-TPL (14-Levo-(N-Boc)-Valina-Dextro-Valina-Triptólido) como un sólido blanco (85 miligramos).
Etapa 2: El producto 14-L-Boc-Valina-D-Valina-TPL (14-Levo-(N-Boc)-Valina-Dextro-Valina-Triptólido) (85 mg) de la etapa anterior se disolvió en diclorometano ( 5 mL), y se le añadió gota a gota 1 mL de ácido trifluoroacético. Después de la adición, la disolución de reacción se hizo reaccionar a 25°C durante 3,5 horas. La disolución de reacción se diluyó con diclorometano y se lavó con una disolución acuosa de bicarbonato de sodio y luego se secó y concentró para dar un producto bruto. El producto bruto se purificó mediante cromatografía líquida de alta resolución preparativa para producir 14-L-Valina-D-Valina-TPL (14-Levo-Valina-Dextro-Valina-Triptólido) como un sólido blanco (51,5 mg).
LC-MS: Tiempo de retención: 0,96 min (UV220: 97,7%), m/z: 559,44 (M+H).
RMN 1H (400 MHz, CDCla) 57,52 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 5,60 (b, 3H), 5,06 (s, 1H), 4,80 - 4,65 (m, 2H), 4,58 (dd, J = 7,8, 4,0 Hz, 1H), 4,20 (s, 1H), 3,88 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 3,57 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 3,50 (d, J = 5,3 Hz, 1H) , 2,72 (d, J = 11,7 Hz, 1H), 2,47 - 2,09 (m, 5H), 1,92 (dd, J = 17,9, 10,2 Hz, 2H), 1,57 (dd, J = 11,5, 5,1 Hz, 1H), 1,25 (dd, J = 12,2, 5,5 Hz, 2H), 1,13 - 1,04 (m, 11H), 1,02 (s, 3H), 0,92 (t, J = 8,4 Hz, 3H), 0,83 (d, J = 6,7 Hz) , 3H).
Ejemplo 3: Síntesis e identificación del compuesto 14-D-Valina-D-Valina-TPL (14-Dextro-Valina-Dextro-Valina-Triptólido)
El compuesto 14-D-Valina-D-Valina-TPL (14-Dextro-Valina-Dextro-Valina-Triptólido) se sintetizó siguiendo el método del Ejemplo 2, reemplazando L-Boc-Valina-TPL (Levo-N-Boc-Valina) con D-Boc-Valina (Dextro-N-Boc-Valina).
LC-MS: Tiempo de retención: 1,95 min (ELSD: 98,0%), m/z: 559,50 (M+H).
RMN 1H (400 MHz, CDCla) 57,81 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 5,08 (s, 1H), 4,69 (s, 2H), 4,61 (dd, J = 8,8, 4,5 Hz, 1H), 3,84 (d, J = 3,2 Hz, 1H), 3,57 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 3,49 (d, J = 5,8 Hz, 2H), 2,74 - 2,68 (m, 1H), 2,39 - 2,27 (m, 3H), 2,22 - 2,10 (m, 2H), 1,94 (ddd, J = 25,7, 16,2, 10,6 Hz, 2H), 1,59 (dd, J = 12,4, 4,6 Hz, 1H), 1,28 - 1,20 (m, 1H) , 1,06 (dt, J = 12,6, 6,1 Hz, 12H), 0,95 (dd, J = 12,7, 6,9 Hz, 6H), 0,85 (d, J = 6,9 Hz, 3H).
Ejemplo 4: Comparación de ventanas terapéuticas entre el compuesto 14-D-Valina-TPL de la invención y triptólido (TPL)
(1) Materiales Experimentales
Cepas de células leucémicas: Sup-B15 (Ph leucemia linfoblástica aguda), CEM (leucemia linfoblástica aguda, ALL) y Molt-4 (leucemia linfoblástica aguda, ALL). Muestras de células sanguíneas normales: sangre periférica de voluntarios sanos.
Reactivo primario: 14-D-Valina-TPL de la invención. Instrumentos primarios: incubadora de células y lector de microplacas.
(2) Método experimental
Se tomaron 5.000 células de leucemia bien desarrolladas o células sanguíneas humanas normales y se sembraron en pocillos de una placa de cultivo celular de 96 pocillos. El medio era medio celular 1640 que contenía suero bovino fetal al 10%. Se añadió 14-D-Valina-TPL en diferentes concentraciones y después de mezclar uniformemente, la placa se colocó en una incubadora de células con dióxido de carbono (5% de CO2) y se incubó a 37°C durante 72 horas. A continuación, se determinó la concentración de células vivas utilizando el ensayo MTT. En este experimento, la viabilidad celular en el grupo de control (sin el tratamiento con el compuesto) se fijó en 100%, y se calcularon la viabilidad celular (%) después de la acción del compuesto, la concentración semimáxima inhibidora del crecimiento de células leucémicas a las 72 horas (el valor IC50 a las 72 horas) y el índice de ventana terapéutica. Índice de ventana terapéutica = valor IC50 de células sanguíneas normales/valor IC50 de células leucémicas. El índice de ventana terapéutica < (menor que) o = (igual a) 1 indica que no hay ventana terapéutica, y el compuesto no es selectivo con la misma toxicidad para las células normales y las células tumorales. El índice de ventana terapéutica > 1 indica que existe una ventana terapéutica y que el compuesto es más tóxico para las células tumorales que para las células normales. Una ventana terapéutica más grande indica una mejor selectividad del compuesto para las células tumorales.
(3) Resultados experimentales
Los resultados experimentales se muestran en la Tabla 1, que indica que el compuesto 14-D-Valina-TPL de la invención tiene una mejor ventana terapéutica, mientras que el triptólido no tiene sustancialmente ninguna ventana terapéutica. La Tabla 1 muestra que el triptólido (TPL) tenía una ventana terapéutica pequeña (2,0) solo para las células Molt-4, mientras que sus ventanas terapéuticas para otras 3 células leucémicas, Jurkat, CEM y Sup-B15, eran todas <1, que eran 0,64, 0,93 y 0,94, respectivamente. Esto indica que el triptólido no tiene sustancialmente selectividad por las células normales y las células tumorales, lo que es consistente con el resultado dado a conocer en la literatura de que el TPL sustancialmente no tiene una ventana terapéutica. Por el contrario, la 14-D-Valina-TPL de la invención tiene índices de ventana terapéutica de 5,54 a 18,58 para 4 tipos diferentes de células de leucemia humana que se han analizado, lo que indica que la 14-D-Valina-TPL tiene una ventana terapéutica mayor para los 4 tipos de leucemia, con un índice de ventana terapéutica para las células Molt-4 de hasta 18,58.
Tabla 1. Comparación de ventanas terapéuticas entre 14-D-Valina-TPL y triptólido (TPL)
Ejemplo 5: Determinación de la actividad in vitro del compuesto 14-D-Valina-TPL de la invención frente a la leucemia
(1) Materiales Experimentales
Cepas de células leucémicas: KG-1a humana (leucemia mielógena aguda, AML-M0), THP-1 (leucemia mielógena aguda, AML-M5), NB4 (leucemia promielocítica aguda, AML), Kasumi-1 (leucemia mielógena aguda tipo M2, AML-M2), KG-1 (leucemia mielógena aguda, AML), Jurkat (leucemia linfoblástica aguda, ALL) y H9 (leucemia linfoblástica aguda, ALL).
Reactivo primario: 14-D-Valina-TPL de la invención. Instrumentos primarios: incubadora de células y lector de microplacas.
(2) Método experimental
Se tomaron 5000 células de leucemia bien desarrolladas y se sembraron en pocillos de una placa de cultivo celular de 96 pocillos. El medio era medio celular 1640 que contenía suero bovino fetal al 10%. Se añadió 14-D-Valina-TPL en diferentes concentraciones y después de mezclar uniformemente, la placa se colocó en una incubadora de células en atmósfera de dióxido de carbono (5% CO2), y se incubaron a 37°C durante 72 horas. A continuación, se determinó la concentración de células vivas usando el ensayo MTT. En este experimento, la viabilidad celular en el grupo de control (sin el tratamiento del compuesto) se fijó en 100%, y se calcularon la viabilidad celular (%) después de la acción del compuesto y la concentración semimáxima inhibidora del crecimiento de células leucémicas a las 72 horas (valor IC50 a las 72 horas).
(3) Resultados experimentales
Los resultados experimentales se muestran en la Tabla 2. La Tabla 2 muestra que la 14-D-Valina-TPL de la invención puede inducir la muerte de células de leucemia mielógena aguda humana y células de leucemia linfoblástica aguda e inhibir el crecimiento de estas células de leucemia.
Tabla 2. Efectos inhibidores de los derivados de la invención sobre el crecimiento de diferentes tipos de células leucémicas
Ejemplo 6: Determinación de la actividad in vivo del compuesto 14-D-Valina-TPL de la invención frente a la leucemia humana en ratones
(1) Materiales Experimentales
Animal de experimentación: ratones NOD/SCID obtenidos del Centro de Animales de Shanghai de la Academia China de Ciencias (CAS).
Cepas de células leucémicas: KG-1a humanas (leucemia mielógena aguda, AML-M0) y THP-1 (leucemia monocítica aguda, AML-M5), obtenidas de la Colección ATCC. Reactivo: Trifluoroacetato de 14-D-Valina-TPL de la invención, disuelto con PBS estéril a una concentración de 10 mg/ml y luego diluido con agua desionizada estéril a la concentración de trabajo requerida.
Instrumentos primarios: incubadora de células y lector de microplacas.
(2) Método experimental
Se tomaron ratones hembra NOD/SCID de 7 semanas de vida y se les inocularon por vía subcutánea 1 x 107 células (0,2 ml) por ratón en las axilas, las células de leucemia mielógena aguda humana KG-1 a en la izquierda y las células de leucemia monocítica aguda humana THP-1 en la derecha. Cuando los tumores crecieron hasta un tamaño tumoral de alrededor de 0,5 cm, los ratones se distribuyeron aleatoriamente en grupos de 3 ratones cada uno. Se utilizó una cantidad equivalente de PBS para el grupo de control, y el grupo de 14-D-Valina-TPL se dividió en dos grupos, uno con 0,2 mg/kg de peso corporal y el otro 0,4 mg/kg de peso corporal: administración intragástrica 2 veces al día (una a las 8 am y otra a las 4 pm) durante 14 días consecutivos de tratamiento. Se hizo una observación durante un total de 30 días, durante los cuales se midieron las condiciones de los ratones tales como el tamaño del tumor, el peso, la actividad, la dieta y similares. Al final del experimento, se sacrificaron los ratones, se extrajeron tejidos tumorales y se pesaron los tumores, y se examinaron los principales órganos y tejidos de los ratones, como hígado, bazo, corazón, pulmón, intestino grueso, intestino delgado y similares.
(3) Resultados experimentales
Los resultados experimentales se muestran en la Tabla 3 y la Tabla 4.
Tabla 3. Efectos de 14-D-Valina-TPL (DV) sobre el crecimiento de células KG-1a de leucemia mielógena aguda humana en ratones in vivo
Tabla 4. Efectos de 14-D-Valina-TPL (DV) sobre el crecimiento de células THP-1 de leucemia mielógena aguda humana en ratones in vivo
La Tabla 3 y la Tabla 4 muestran que la 14-D-Valina-TPL de la invención puede inhibir significativamente el crecimiento de dos tipos diferentes de líneas celulares de leucemia mielógena aguda humana KG-1a y THP-1 en ratones in vivo, y exhibe un efecto dependiente de la dosis significativo. La 14-D-Valina-TPL con una dosis de 0,4 mg por kilogramo de peso corporal permite una regresión completa de los tumores de xenoinjerto KG-1 a y THP-1, sin pérdidas de peso significativas en los ratones. Además, no se observaron anomalías significativas en órganos principales tales como corazón, pulmón, hígado, bazo, intestino grueso, intestino delgado y similares en el examen anatómico de los ratones. Estos resultados indican que la 14-D-Valina-TPL de la invención tiene una actividad significativa contra diferentes tipos de leucemia mielógena aguda humana y no muestra una reacción tóxica significativa.
Ejemplo 7: Determinación de la actividad in vivo de 14-L-Valina-L-Valina-TPL (14-LLV-TPL) contra la leucemia humana en ratones
(1) Materiales Experimentales
Animal de experimentación: ratones NOD/SCID obtenidos del Centro de Animales de Shanghai de la Academia China de Ciencias (CAS).
Cepa de células leucémicas: KG-1 a humana (leucemia mielógena aguda, AML-M0), obtenida de la Colección ATCC. Reactivo: trifluoroacetato de 14-LLV-TPL de la invención, disuelto con PBS estéril a una concentración de 10 mg/ml y luego diluido con agua desionizada estéril a la concentración de trabajo requerida.
Instrumentos primarios: incubadora de células y lector de microplacas.
(2) Método experimental
Se tomaron ratones hembra NOD/SCID de 7 semanas de vida y se les inocularon por vía subcutánea 1 x 107 células (0,2 ml) por ratón en la axila, células de leucemia mielógena aguda humana KG-1 a en la izquierda. Cuando los tumores crecieron a un tamaño de tumor de alrededor de 50-100 mm3, los ratones se aleatorizaron en grupos de 3 ratones cada uno. Se utilizó una cantidad equivalente de PBS para el grupo control, y el grupo TPL-LLV se dividió en dos grupos con 0,23 mg/kg de peso corporal y 0,46 mg/kg de peso corporal: administración intragástrica, 2 veces al día (una a las 8 am y otra a las 4 pm) durante 14 días consecutivos de tratamiento. Se hizo una observación durante un total de 30 días, durante los cuales se midieron las condiciones de los ratones tales como el tamaño del tumor, el peso, la actividad, la dieta y similares. Al final del experimento, se sacrificaron los ratones, se extrajeron tejidos tumorales y se pesaron los tumores, y se examinaron los principales órganos y tejidos de los ratones, como hígado, bazo, corazón, pulmón, intestino grueso, intestino delgado y similares.
(3) Resultados experimentales
Los resultados experimentales se muestran en la Tabla 5. La Tabla 5 muestra que el 14-LLV-TPL de la invención puede inhibir significativamente el crecimiento de la línea celular de leucemia mielógena aguda humana KG-1a en ratones in vivo y muestra un efecto dependiente de la dosis significativo.
Tabla 5. Efectos de 14-LLV-TPL en el crecimiento de células KG-1a de leucemia mielógena aguda humana en ratones in vivo
Ejemplo 8: Determinación de la actividad in vivo de 14-L-Valina-D-Valina-TPL (14-DLV-TPL) contra la leucemia humana en ratones
(1) Materiales Experimentales
Animal de experimentación: ratones NOD/SCID obtenidos del Centro de Animales de Shanghai de la Academia China de Ciencias (CAS).
Cepa de células leucémicas: KG-1 a humana (leucemia mielógena aguda, AML-M0), obtenida de la Colección ATCC. Reactivo: trifluoroacetato de 14-DLV-TPL de la invención, disuelto con PBS estéril a una concentración de 10 mg/ml y
luego diluido con agua desionizada estéril a la concentración de trabajo requerida.
Instrumentos primarios: incubadora de células y lector de microplacas.
(2) Método experimental
Se tomaron ratones hembra NOD/SCID de 7 semanas de vida y se les inoculó por vía subcutánea 1 x 107 células (0,2 ml) por ratón en la axila, con células de leucemia mielógena aguda humana KG-1 a en la izquierda. Cuando los tumores crecieron a un tamaño de tumor de alrededor de 50-100 mm3, los ratones se aleatorizaron en grupos de 3 ratones cada uno. Se utilizó una cantidad equivalente de PBS para el grupo control, y el grupo TPL-DLV se dividió en dos grupos con 0,23 mg/kg de peso corporal y 0,46 mg/kg de peso corporal: administración intragástrica, 2 veces al día (una a las 8 a.m. y otra a las 4 p.m.) durante 14 días consecutivos de tratamiento. Se hizo una observación durante un total de 30 días, durante los cuales se midieron las condiciones de los ratones tales como el tamaño del tumor, el peso, la actividad, la dieta y similares. Al final del experimento, se sacrificaron los ratones, se extrajeron tejidos tumorales y se pesaron los tumores, y se examinaron los principales órganos y tejidos de los ratones, como hígado, bazo, corazón, pulmón, intestino grueso, intestino delgado y similares.
(3) Resultados experimentales
Los resultados experimentales se muestran en la Tabla 6. La Tabla 6 muestra que el 14-DLV-TPL de la invención puede inhibir significativamente el crecimiento de la línea celular de leucemia mielógena aguda humana KG-1a en ratones in vivo y muestra un efecto dependiente de la dosis significativo.
Tabla 6. Efectos de 14-DLV-TPL en el crecimiento de células KG-1a de leucemia mielógena aguda humana en ratones in vivo
Ejemplo 9: Determinación de la actividad in vivo de 14-L-fenilalanil-L-tirosina-TPL (14-LPT-TPL) contra la leucemia humana en ratones
(1) Materiales Experimentales
Animal de experimentación: ratones NOD/SCID obtenidos del Centro de Animales de Shanghai de la Academia China de Ciencias (CAS).
Cepa de células leucémicas: KG-1 a humana (leucemia mielógena aguda, AML-M0), obtenida de la Colección ATCC. Reactivo: trifluoroacetato de 14-LPT-TPL de la invención, disuelto con PBS estéril a una concentración de 10 mg/ml y luego diluido con agua desionizada estéril a la concentración de trabajo requerida.
Instrumentos primarios: incubadora de células y lector de microplacas.
(2) Método experimental
Se tomaron ratones hembra NOD/SCID de 7 semanas de vida y se les inocularon por vía subcutánea 1 x 107 células (0,2 ml) por ratón en la axila, con células de leucemia mielógena aguda humana KG-1a en la izquierda. Cuando los tumores crecieron a un tamaño de tumor de alrededor de 50-100 mm3, los ratones se aleatorizaron en grupos de 3 ratones cada uno. Se utilizó una cantidad equivalente de PBS para el grupo control, y el grupo TPL-DLV se dividió en dos grupos con 0,32 mg/kg de peso corporal y 0,64 mg/kg de peso corporal: administración intragástrica, 2 veces al día (una a las 8 a.m. y otra a las 4 p.m.) durante 14 días consecutivos de tratamiento. Se hizo una observación durante un total de 30 días, durante los cuales se midieron las condiciones de los ratones tales como el tamaño del tumor, el peso, la actividad, la dieta y similares. Al final del experimento, se sacrificaron los ratones, se extrajeron tejidos tumorales y se pesaron los tumores, y se examinaron los principales órganos y tejidos de los ratones, como hígado, bazo, corazón, pulmón, intestino grueso, intestino delgado y similares.
(3) Resultados experimentales
Los resultados experimentales se muestran en la Tabla 7. La Tabla 7 muestra que la 14-LPT-TPL de la invención puede inhibir significativamente el crecimiento de la línea celular de leucemia mielógena aguda humana KG-1a en
ratones in vivo y muestra un efecto dependiente de la dosis significativo.
Tabla 7. Efectos de 14-LPT-TPL sobre el crecimiento de células KG-1a de leucemia mielógena aguda humana en ratones in vivo
Ejemplo 10: Determinación de la actividad in vivo de 14-D-Valina-D-Valina-TPL (14-DDV-TPL) contra la leucemia humana en ratones
(1) Materiales Experimentales
Animal de experimentación: ratones NOD/SCID obtenidos del Centro de Animales de Shanghai de la Academia China de Ciencias (CAS). Cepa de células leucémicas: K562/ADR humana (leucemia mielógena crónica, LMC), obtenida de la Colección ATCC. Reactivo: trifluoroacetato de 14-DDV-TPL de la invención, disuelto con PBS estéril a una concentración de 10 mg/ml y luego diluido con agua desionizada estéril a la concentración de trabajo requerida. Instrumentos primarios: incubadora de células y lector de microplacas.
(2) Método experimental
Se tomaron ratones hembras NOD/SCID de 7 semanas de vida y se les inoculó por vía subcutánea 1 x 107 células (0,2 ml) por ratón en la axila, con células K562/ADR humanas en la izquierda. Cuando los tumores crecieron a un tamaño de tumor de alrededor de 50-100 mm3, los ratones se aleatorizaron en grupos de 3 ratones cada uno. Se utilizó una cantidad equivalente de PBS para el grupo control, y el grupo TPL-DDV se dividió en dos grupos con 0,23 mg/kg de peso corporal y 0,46 mg/kg de peso corporal: administración intragástrica, 2 veces al día (una a las 8 a.m. y otra a las 4 p.m.) durante 14 días consecutivos de tratamiento. Se hizo una observación durante un total de 30 días, durante los cuales se midieron las condiciones de los ratones tales como el tamaño del tumor, el peso, la actividad, la dieta y similares. Al final del experimento, se sacrificaron los ratones, se extrajeron tejidos tumorales y se pesaron los tumores, y se examinaron los principales órganos y tejidos de los ratones, como hígado, bazo, corazón, pulmón, intestino grueso, intestino delgado y similares.
(3) Resultados experimentales
Los resultados experimentales se muestran en la Tabla 8. La Tabla 8 muestra que el 14-DDV-TPL de la invención puede inhibir significativamente el crecimiento de células K562/ADR de la línea celular de leucemia mielógena crónica humana en ratones in vivo, y muestra un efecto dependiente de la dosis significativo.
Tabla 8. Efectos de 14-DDV-TPL sobre el crecimiento de células de leucemia mielógena crónica humana K562/ADR en ratones in vivo
Ejemplo 11: Determinación de la Actividad in vivo de 14-L-Valina-TPL (14-LV-TPL) contra la leucemia humana en ratones (1) Materiales Experimentales
Animal de experimentación: ratones NOD/SCID obtenidos del Centro de Animales de Shanghai de la Academia China de Ciencias (CAS).
Cepa de células leucémicas: K562/ADR humano (leucemia mielógena crónica, LMC), obtenida de la Colección ATCC.
Reactivo: trifluoroacetato de 14-LV-TPL de la invención, disuelto con PBS estéril a una concentración de 10 mg/ml y luego diluido con agua desionizada estéril a la concentración de trabajo requerida.
Instrumentos primarios: incubadora de células y lector de microplacas.
(2) Método experimental
Se tomaron ratones hembra NOD/SCID de 7 semanas de vida y se les inoculó por vía subcutánea 1 x 107 células (0,2 ml) por ratón en la axila, con células K562/ADR humanas en la izquierda. Cuando los tumores crecieron a un tamaño de tumor de alrededor de 50-100 mm3, los ratones se aleatorizaron en grupos de 3 ratones cada uno. Se utilizó una cantidad equivalente de PBS para el grupo control, y el grupo TPL-LV se dividió en dos grupos con 0,2 mg/kg de peso corporal y 0,4 mg/kg de peso corporal: administración intragástrica, 2 veces al día (una a las 8 a.m. y otra a las 4 p.m.) durante 14 días consecutivos de tratamiento. Se hizo una observación durante un total de 30 días, durante los cuales se midieron las condiciones de los ratones tales como el tamaño del tumor, el peso, la actividad, la dieta y similares. Al final del experimento, se sacrificaron los ratones, se extrajeron tejidos tumorales y se pesaron los tumores, y se examinaron los principales órganos y tejidos de los ratones, como hígado, bazo, corazón, pulmón, intestino grueso, intestino delgado y similares.
(3) Resultados experimentales
Los resultados experimentales se muestran en la Tabla 9. La Tabla 9 muestra que el 14-LV-TPL de la invención puede inhibir significativamente el crecimiento de células K562/ADR de la línea celular de leucemia mielógena crónica humana en ratones in vivo, y muestra un efecto dependiente de la dosis significativo.
Tabla 9. Efectos de 14-LV-TPL sobre el crecimiento de células de leucemia mielógena crónica humana K562/ADR en ratones in vivo
Ejemplo 12: Determinación de la actividad de 14-D-Valina-TPL para inhibir linfocitos T y linfocitos B in vitro
(1) Materiales Experimentales
Cepas de células leucémicas: Jurkat (linfocitos T), H9 (linfocitos T), CEM (linfocitos B) y Sup-B15 (linfocitos B). Reactivo primario: 14-D-Valina-TPL de la invención.
Instrumentos primarios: incubadora de células y lector de microplacas.
(2) Método experimental
Se tomaron 5000 linfocitos bien desarrollados y se sembraron en pocillos de una placa de cultivo celular de 96 pocillos. El medio era medio celular 1640 que contenía suero bovino fetal al 10%. Se añadió 14-D-Valina-TPL en diferentes concentraciones y después de mezclar uniformemente, la placa se colocó en una incubadora de células con dióxido de carbono (5% CO2), y se incubaron a 37°C durante 72 horas. A continuación, se determinó la concentración de células vivas utilizando el ensayo MTT. En este experimento, la viabilidad celular en el grupo de control (sin el tratamiento del compuesto) se fijó en 100%, y se calcularon la viabilidad celular (%) después de la acción del compuesto y la mitad de la concentración inhibidora del crecimiento máximo de células leucémicas a las 72 horas (IC50 valor a las 72 horas).
(3) Resultados experimentales
Los resultados experimentales se muestran en la Tabla 10. La Tabla 10 muestra que la 14-D-Valina-TPL de la invención puede inhibir significativamente el crecimiento de estos linfocitos T y linfocitos B.
Tabla 10. Efectos iinhibidores de la 14-D-Valina-TPL sobre la proliferación de linfocitos T/B
Ejemplo 13: Expresión del factor de transcripción TFIIH subunidad XPB y ARN polimerasa II (Pol II) en diferentes tipos de células tumorales y células normales
Se ha dado a conocer en algunas publicaciones que la subunidad XPB del factor de transcripción TFIIH (xeroderma pigmentoso grupo B) y la ARN polimerasa II (Pol II) son las moléculas diana clave para que el triptólido ejerza su efecto farmacológico [Titov DV, et al., "XPB, una subunidad de TFIIH, es una diana del producto natural triptólido". Nature Chemical Biology. 2011, 7:182-188]. Para saber si los niveles de expresión de XPB y Pol II en células tumorales y células normales son diferentes, la presente invención adopta la técnica de inmunotransferencia para detectar los niveles de proteína de XPB y Pol II en diferentes tipos de células tumorales y células normales.
(1) Materiales Experimentales
Cepas de células leucémicas: Nalm6 (linfoma), Jurkat (leucemia linfoblástica aguda), THP-1 (leucemia monocítica aguda), KG-1a (leucemia mielógena aguda), HL-60 (leucemia mielógena aguda), NB4 (leucemia promielocítica aguda), y U937 (leucemia monocítica aguda). Se obtuvieron muestras de células sanguíneas normales de voluntarios.
(2) Método experimental: La técnica de inmunotransferencia convencional.
Las proteínas celulares de células de leucemia y muestras de células normales se extrajeron de acuerdo con métodos convencionales, se separaron mediante electroforesis de proteínas SDS-PAGE y luego se transfirieron a una membrana NC. Los procedimientos experimentales tales como incubación con anticuerpo primario y anticuerpo secundario, desarrollo, exposición y similares se realizaron de acuerdo con métodos convencionales. GAPDH sirvió como una proteína de referencia interna. Resultados: Como se muestra en la FIG. 1, las proteínas XPB y Pol II se expresaron en gran medida en la mayoría de las células tumorales y se expresaron en niveles bajos o no se expresaron en las células sanguíneas normales. Este resultado indica que las enfermedades relacionadas con la expresión anormalmente alta de XPB y Pol II pueden servir como indicaciones de triptólido y derivados de la misma.
La figura 1 muestra los resultados de los niveles de expresión de XPB y Pol II en diferentes tipos de células tumorales y células normales detectadas mediante la adopción de la técnica de inmunotransferencia. 1: células sanguíneas normales; 2: Nalm6; 3: Jurkat; 4: THP-1; 5: KG-1a; 6: HL-60; 7: NB4; 8: U937.
Ejemplo 14: Efectos inhibidores de 14-D-Valina-TPL sobre las actividades de XPB y Pol II en células de leucemia THP-1 humana
Se sabe que XPB y Pol II son las moléculas diana clave para que el triptólido ejerza su efecto farmacológico [Titov DV, et al., "XPB, una subunidad de TFIIH, es una diana del producto natural triptólido". Nature Chemical Biology. 2011, 7:182-188]. Para saber si los compuestos de la invención tienen actividad para inhibir estas dos moléculas diana, la presente invención adopta la técnica de cultivo celular y la técnica de inmunotransferencia para detectar el efecto de la 14-D-Valina-TPL sobre las actividades de XPB y Pol. II en células de leucemia.
(1) Materiales Experimentales
Cepa de células de leucemia: cepa de células de leucemia THP-1 humana (leucemia mielógena aguda-M5, AML-M5).
Reactivo: 14-D-Valina-TPL.
(2) Método experimental
Se tomaron células de leucemia bien desarrolladas y se sembraron en pocillos de una placa de cultivo celular de 6 pocillos, con una densidad de 1 x 106/ml. El medio era medio celular 1640 que contenía suero bovino fetal al 10%. Se añadió 14-D-Valina-TPL con diferentes concentraciones y después de mezclar uniformemente, la placa se colocó en una incubadora de células con dióxido de carbono (5% CO2), y se incubaron a 37°C durante 48 horas. A continuación, se extrajeron las proteínas celulares y se utilizó la técnica de inmunotransferencia para detectar los niveles de expresión de XPB y Pol II.
(3) Resultados experimentales
Los resultados experimentales se muestran en la FIG. 2. 14-D-Valina-TPL reguló a la baja los niveles de XPB y Pol II de manera dependiente de la dosis. Se puede observar que la 14-D-Valina-TPL inhibió significativamente los niveles de XPB y Pol II en las células THP-1 a una concentración de 160 nM. Estos resultados indican que el compuesto 14-D-Valina-TPL de la invención puede inhibir las actividades de XPB y Pol II y es útil para las enfermedades relacionadas con expresiones anormalmente altas de XPB y Pol II.
La Fig. 2 presenta los resultados de los efectos inhibidores de 14-D-Valina-TPL sobre las actividades de XPB y Pol II en células de leucemia THP-1 humanas detectadas adoptando la técnica de cultivo celular y la técnica de inmunotransferencia.
Ejemplo 15: Efectos inhibidores de 14-D-Valina-TPL sobre la actividad del oncogén c-myc en células de leucemia K562 humana
Se sabe que el oncogén c-myc también es una de las moléculas diana clave para que el triptólido ejerza su efecto farmacológico [Stéphane Vispé, et al., "Triptólido es un inhibidor de la transcripción dependiente de la ARN polimerasa I y II que conduce predominantemente a la regulación a la baja del ARNm de vida corta". Mol Cancer Ther 2009; 8:2780-2790]. Para saber si los compuestos de la invención tienen actividad inhibidora de c-myc, la presente invención adopta la técnica de cultivo celular y la técnica de inmunotransferencia para detectar el efecto de la 14-D-Valina-TPL sobre la actividad de c-myc en células de leucemia.
(1) Materiales Experimentales
Cepa de células de leucemia: cepa de células de leucemia K562 humana (transformación aguda de leucemia mielógena crónica).
Reactivo: 14-D-Valina-TPL.
(2) Método experimental
Se tomaron células de leucemia bien desarrolladas y se sembraron en pocillos de una placa de cultivo celular de 6 pocillos, con una densidad de 1 x 106/ml. El medio era medio celular 1640 que contenía suero bovino fetal al 10%. Se añadió 14-D-Valina-TPL con diferentes concentraciones y después de mezclar uniformemente, la placa se colocó en una incubadora de células con dióxido de carbono (5% CO2), y se incubaron a 37°C durante 48 horas. A continuación, se extrajeron las proteínas celulares y se utilizó la técnica de inmunotransferencia para detectar el nivel de expresión de c-myc.
(3) Resultados experimentales
Los resultados experimentales se muestran en la FIG. 3. 14-D-Valina-TPL reguló a la baja el nivel de proteína c-myc de una manera dependiente de la dosis. Puede verse que 14-D-Valina-TPL inhibió significativamente el nivel de c-myc en células K562 a una concentración de 80 nM. Este resultado indica que el compuesto 14-D-Valina-TPL de la invención puede inhibir la actividad del oncogén c-myc en células tumorales y es útil para las enfermedades relacionadas con una expresión anormalmente alta de c-myc.
Claims (8)
1. Un derivado aminoacídico de triptólido esterificado en el hidroxilo C14 seleccionado de los siguientes compuestos:
y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
2. Una composición farmacéutica, que comprende el derivado aminoacídico de triptólido esterificado en el hidroxilo C14 o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo según la reivindicación 1, y un excipiente farmacéuticamente aceptable opcional.
3. El derivado aminoacídico de triptólido esterificado en el hidroxilo C14 o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo según la reivindicación 1 para uso en un método para tratar a un paciente que tiene un tumor.
4. El derivado aminoacídico de triptólido esterificado en el hidroxilo C14 o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo para uso según la reivindicación 3, en donde el tumor se selecciona de leucemia, mieloma múltiple, linfoma, cáncer de hígado, cáncer de estómago, cáncer de mama, colangiocarcinoma, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, osteosarcoma, cáncer de cuello uterino humano, glioma, carcinoma nasofaríngeo, cáncer de laringe, cáncer de esófago, tumor del oído medio, melanoma y cáncer de próstata.
5. El derivado aminoacídico de triptólido esterificado en el hidroxilo C14 o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo según la reivindicación 1 para uso en un método para tratar una enfermedad inmunitaria.
6. El derivado aminoacídico de triptólido esterificado en el hidroxilo C14 o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo para uso según la reivindicación 5, en donde la enfermedad inmunitaria se selecciona de enfermedades autoinmunitarias relacionadas con la disfunción de las células inmunitarias.
7. El derivado aminoacídico de triptólido esterificado en el hidroxilo C14 o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo para uso según la reivindicación 6, en el que las células inmunitarias son células T o células B.
8. El derivado aminoacídico de triptólido esterificado en el hidroxilo C14 o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo para uso según la reivindicación 6, en el que la enfermedad inmunitaria se selecciona del grupo que comprende artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, psoriasis y nefropatía.
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