ES2910207T3 - Proteínas de fusión escindibles proteolíticamente que comprenden un factor de coagulación de la sangre - Google Patents

Abstract

Proteína de fusión terapéutica para su uso en el tratamiento o prevención de un trastorno de la coagulación sanguínea que comprende (a) un factor de coagulación, en el que el factor de coagulación se selecciona de la lista que consiste en Factor IX, Factor VIII, Factor de van Willebrand, Factor V, Factor X, Factor XI, Factor XII, Factor XIII, Factor I, Factor II (Protrombina ), Proteína C, Proteína S, GAS6 y Proteína Z, (b) un polipéptido potenciador de la semivida, y (c) un péptido enlazador que une el factor de coagulación y el polipéptido potenciador de la semivida; en la que el enlazador peptídico se puede escindir mediante proteasas implicadas en la coagulación o se activa mediante enzimas de coagulación y en que la proteína de fusión terapéutica tiene, en comparación con la proteína de fusión terapéutica respectiva, enlazada por un enlazador no escindible que tiene la secuencia de aminoácidos GGGGGGV una tasa de eliminación aumentada del factor de coagulación activado después de que el enlazador peptídico se escinde proteolíticamente en un modo relacionado con la coagulación.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de fusión escindibles proteolíticamente que comprenden un factor de coagulación de la sangre

Introducción

La presente invención se refiere al campo de las proteínas de fusión terapéuticas modificadas con semivida aumentada comparada con sus polipéptidos terapéuticos precursores no modificados. La invención se refiere específicamente a factores de coagulación fusionados a polipéptidos mejoradores de la semivida (HLEPs), que están conectadas por péptidos enlazadores que son escindibles proteolíticamente para su uso en el tratamiento o prevención de un trastorno de la coagulación sanguínea. La escisión de tales enlazadores libera el polipéptido terapéutico de cualquier impedimento estérico comprometedor de la actividad causado por el HLEP y permite por tanto la generación de proteínas de fusión, que retienen una actividad molar específica alta del factor de coagulación. En el caso en que las proteínas de fusión terapéuticas son zimógenos, se prefieren especialmente aquellos enlazadores que liberan el polipéptido terapéutico de modo esencialmente simultáneo con su activación in vivo después de exposición a la o las proteasas correspondientes. Otro aspecto de la presente invención es una tasa de inactivación más rápida de un factor de coagulación dado una vez que se activa el factor de coagulación y el enlazador peptídico se escinde proteolíticamente en un modo relacionado con la coagulación y/ o una tasa de eliminación más rápida de un factor de coagulación dado una vez que el factor de coagulación se activa y el enlazador peptídico se escinde proteolíticamente de un modo relacionado con la coagulación comparado con la proteína de fusión correspondiente sin el enlazador escindible.

La idea de la invención se demuestra en particular por los polipéptidos dependientes de la vitamina K humana Factor IX, Factor VII, y Factor VIIa, pero el concepto puede aplicarse también a otros factores de la coagulación. Cualquier polipéptido potenciador de la semivida (HLEP) puede estar conectado al polipéptido terapéutico mediante un péptido enlazador escindible, pero albúmina o inmunoglobulinas o fragmentos derivados de las mismas como el fragmento Fc sin un dominio de fijación de antígeno son HLEPs preferidos.

Antecedentes de la invención

Están disponibles comercialmente varios polipéptidos terapéuticos recombinantes para uso terapéutico y profiláctico en humanos. Los pacientes se benefician en general del modo de acción específico de los ingredientes activos recombinantes, pero una desventaja en muchos casos es su disponibilidad limitada debido a sus procesos de fabricación costosos y complejos. Una reducción de la dosis o la frecuencia de administración necesarias de tales productos podría mejorar esta situación. Una frecuencia reducida de administración podría mejorar la comodidad para el paciente y, por tanto, también la aceptación de la terapia. Se han descrito varias soluciones para alcanzar la meta de una semivida in vivo aumentada después de la administración. Soluciones propuestas recientemente incluyen la formación de proteínas de fusión, especialmente en el caso de polipéptidos con una semivida in vivo breve que puede aumentarse significativamente por fusión a un HLEP.

Ballance et al. (WO 01/79271) han descrito polipéptidos de fusión de una multitud de polipéptidos terapéuticos diferentes que, cuando se fusionan a seroalbúmina humana, se predice que tienen una semivida funcional in vivo aumentada y vida útil prolongada. Se han descrito largas listas de socios potenciales de fusión sin demostración por datos experimentales para prácticamente cualquiera de estos polipéptidos de que las respectivas proteínas de fusión de albúmina retengan realmente actividad biológica y tengan propiedades mejoradas. Entre la lista de polipéptidos terapéuticos mencionados como Ejemplos se encuentran Factor IX y FVII/FVIIa. Se han descrito también fusiones de FIX y FVII/FVIIa en las cuales existe un enlazador peptídico entre albúmina y FIX o FVII/FVIIa. Sin embargo, no se sugiere el uso de péptidos enlazadores escindibles.

Sheffield et al. (Sheffield W. P. et al. (2004), Br. J. Haematol. 126: 565-573) expresaron una proteína de fusión de albúmina con Factor IX murino compuesta de FIX murino, un enlazador de 8 aminoácidos (GPG4TM), albúmina murina y un marcador peptídico de 22 aminoácidos, y también una proteína de fusión de albúmina con Factor IX humano compuesta de Factor IX humano, un enlazador de 7 aminoácidos (GeV) y albúmina humana. Utilizando un ensayo de coagulación de una sola etapa, dependiente de FIX, las actividades molares específicas de la proteína de fusión FIX murino-albúmina (MFUST) y la proteína de fusión FIX humano-albúmina (HFUS) eran al menos 2 a 3 veces menores que la de sus homólogos no fusionados, un efecto atribuido al menos parcialmente a un proceso de activación proteolítica más lento por FXIa. Sheffield no utilizó ni sugirió la utilización de un enlazador escindible entre FIX y albúmina.

Varias solicitudes de patente describen la fusión de polipéptidos terapéuticos a regiones constantes de inmunoglobulina para prolongar la semivida de polipéptidos terapéuticos in vivo. WO 2002/04598, WO 2003/059935, WO 2004/081053, WO 2004/101740 y WO 2005/001025 incluyen FIX como ejemplos para el resto del polipéptido terapéutico. Las dos últimas solicitudes de patente describen también FVII/FVIIa fusionado a regiones constantes de inmunoglobulina y encuentran que los homodímeros de proteínas de fusión tienen actividad de coagulación inferior comparados con proteínas de fusión constituidas por un monómero/dímero. Una vez más, no se sugiere el uso de péptidos enlazadores escindibles.

En WO 91/09125 se describen proteínas de fusión que están unidas por enlazadores que son escindibles por proteasas de la cascada de coagulación de la sangre, pero las proteínas de fusión están limitadas a las que comprenden proteínas fibrinolíticas o antitrombóticas.

En WO 03/068934 se describen moléculas quiméricas que están compuestas de al menos una primera molécula componente, al menos un enlazador y al menos una segunda molécula, en donde el enlazador comprende un sitio de escisión enzimática para producir un enlace no existente naturalmente y un sitio de escisión entre la primera y la segunda moléculas componentes y en donde, después de la escisión de la molécula quimérica en el sitio de escisión, al menos una de las moléculas componentes es funcionalmente activa. Las proteasas de escisión pueden ser factores de coagulación como trombina. Moléculas componentes descritas entre muchas otras son FIX y FVIIa. Sin embargo, no se describen las proteínas de fusión terapéuticas de la presente invención, ni las propiedades mejoradas de las proteínas de fusión terapéuticas de la presente invención tales como actividad molar específica aumentada, velocidad de desactivación y/o velocidades de eliminación aumentadas en comparación con la proteína terapéutica sin enlazadores escindibles. El documento EP1444986 describe una preparación farmacéutica para el tratamiento de trastornos de la coagulación sanguínea. El documento WO96/01653 describe métodos y composiciones para la coagulación específica de la vasculatura. El documento WO2004/101740 describe proteínas quiméricas de factor de coagulación-Fc para tratar la hemofilia. El documento EP1816201 describe un factor VIIa de coagulación 20 modificado con una vida media extendida. El documento WO2004/101739 describe procedimiento para sintetizar químicamente proteínas quiméricas de inmunoglobina. El documento WO2004/021861 describe moléculas que inhiben compuestos biológicamente activos y comprenden fracciones específicamente escindibles por un reactivo producido por una célula objetivo.

Descripción de la invención

Existe una gran necesidad médica de factores de coagulación que tengan una semivida larga. En la técnica anterior, se han sugerido fusiones de factores de coagulación con polipéptidos mejoradores de la semivida para alcanzar este objetivo. Sin embargo, una vez que un factor de coagulación se activa durante la coagulación, sea por escisión proteolítica del zimógeno (como FIX) o por contacto de un Factor ya "pre"- activado proteolíticamente con un segundo polipéptido (como la fijación de FVIIa a Factor Tisular), ya no es deseable mantener la semivida larga del factor de coagulación ahora activado, dado que esto podría conducir a complicaciones trombóticas, como es ya el caso para un factor de coagulación de tipo salvaje como FVIIa (Aledort L. M., J Thromb Haemost 2(10): 1700-1708 (2004)) y podría ser incluso más relevante si el Factor activado tuviera una semivida aumentada. Por consiguiente, un objetivo de la presente invención es proporcionar factores de coagulación de vida larga, que después de la activación o después de la disponibilidad de un cofactor tengan una semivida comparable a la de un factor de coagulación no modificado.

Las fusiones de los factores de coagulación a polipéptidos mejoradores de la semivida como se describen en la técnica anterior y como se muestran también en los ejemplos 6 y 7 adolecen en general de una actividad molar específica reducida del factor de coagulación fusionado. Otro aspecto de la presente invención proporciona factores de coagulación con semivida mejorada, que muestran actividad molar específica aumentada comparados con la proteína de fusión terapéutica correspondiente sin un enlazador escindible.

La invención se refiere por tanto a proteínas de fusión terapéuticas para su uso en el tratamiento o prevención de un trastorno de la coagulación sanguínea que comprende

a) un factor de coagulación, en el que el factor de coagulación se selecciona de la lista que consiste en Factor IX, Factor VIII, Factor de van Willebrand, Factor V, Factor X, Factor XI, Factor XII, Factor XIII, Factor I, Factor II (Protrombina), Proteína C, Proteína S, GAS6 y Proteína Z,

b) un polipéptido aumentador de la semivida, y

c) un enlazador peptídico que une el factor de coagulación y el polipéptido aumentador de la semivida;

en el que el enlazador peptídico es escindido por proteasas implicadas en la coagulación o activadas por enzimas de la coagulación y en el que la proteína de fusión terapéutica tiene, en comparación con la proteína de fusión terapéutica respectiva enlazada por un enlazador no-escindible que tiene la secuencia de aminoácidos GGGGGGV una velocidad de eliminación aumentada del factor de coagulación activado después que el enlazador peptídico es escindido proteolíticamente en un procedimiento relacionado con la coagulación.

La invención proporciona también las proteínas de fusión terapéutica para su uso de acuerdo con la invención formulada como composición farmacéutica.

Como consecuencia del enlazador escindible, después de la escisión del enlazador peptídico en un modo relacionado con la coagulación, el factor de coagulación se asemeja más estrechamente al comportamiento del Factor nativo no fusionado y no exhibe una semivida aumentada del Factor activo con efecto potencialmente protrombótico.

La escisión proteolítica en un modo relacionado con la coagulación en el sentido de la invención, es cualquier escisión proteolítica que ocurre como consecuencia de la activación de al menos un Factor de la coagulación o cofactor de la coagulación.

La expresión "factor de coagulación activado después que el enlazador peptídico es escindido proteolíticamente en un modo relacionado con la coagulación" en el sentido de la invención significa que el factor de coagulación se activa prácticamente en paralelo con la escisión proteolítica del péptido enlazador, o que el factor de coagulación estaba ya activado ya antes de la escisión proteolítica del péptido enlazador. La activación puede ocurrir, por ejemplo, por escisión proteolítica del factor de coagulación o por fijación a un cofactor.

La proteína de fusión terapéutica puede tener una recuperación mejorada in vivo en comparación con la recuperación in vivo del factor de coagulación no modificado.

Se prefieren proteínas de fusión terapéuticas que tengan una recuperación mejorada in vivo, comparadas con el factor de coagulación no modificado en al menos 10%, más preferentemente en al menos 25% y muy preferentemente en 40% o más.

Los HLEP preferidos son la albúmina y sus fragmentos e inmunoglobulinas que incluyen fragmentos de los mismos.

La región enlazadora en una realización preferida comprende una secuencia del polipéptido terapéutico a administrar o una variante del mismo, que debería dar como resultado un riesgo disminuido de propiedades neoantigénicas (formación de un nuevo epítopo potencialmente inmunógeno debido a la existencia de un péptido en el antígeno terapéutico que no existe en proteínas humanas) de la proteína de fusión expresada. Asimismo, en el caso en que la proteína terapéutica es un zimógeno (por ejemplo necesita ser activada proteolíticamente) la cinética de la escisión del enlazador peptídico reflejará más estrechamente la cinética de activación del zimógeno relacionada con la coagulación. Así, en tales realizaciones preferidas un zimógeno y un enlazador correspondiente se activan y se escinden respectivamente, con cinéticas comparables. Por esta razón, la presente invención se refiere también particularmente a proteínas de fusión de un zimógeno y un HLEP, donde la cinética de la escisión del enlazador por proteasas relevantes no se retarda en más de un Factor de 3, y muy preferentemente no en más de un Factor de 2 comparada con la cinética de la activación del zimógeno.

En una realización adicional, el péptido enlazador comprende sitios de escisión para más de una proteasa. Esto puede conseguirse por un péptido enlazador que puede ser escindido en la misma posición por diferentes proteasas o por un péptido enlazador que proporciona dos o más sitios de escisión diferentes. Esto puede ser ventajoso en circunstancias en las que la proteína de fusión terapéutica tiene que ser activada por escisión proteolítica para conseguir actividad enzimática y en las que proteasas diferentes puedan contribuir a este paso de activación. Éste es el caso, por ejemplo, después de la activación de FIX, que puede ser conseguida por FXIa o por FVIIa/Factor Tisular (TF).

Realizaciones preferidas de la invención son proteínas de fusión terapéuticas en las cuales el enlazador es escindible por la proteasa, que activa el factor de coagulación, asegurando con ello que la escisión del enlazador está unida a la activación del factor de coagulación en un sitio en el que ocurre coagulación.

Otras proteínas de fusión terapéuticas preferidas conforme a la invención son aquéllas en las cuales el enlazador es escindible por el factor de coagulación que forma parte de la proteína de fusión terapéutica una vez que se activa la misma, asegurando así también que la escisión de la proteína de fusión está conectada con un evento de coagulación.

Otras proteínas de fusión terapéuticas preferidas conforme a la invención son aquéllas en las cuales enlazador es escindible por una proteasa, que es activada por sí misma directamente o indirectamente por la actividad del factor de coagulación que forma parte de la proteína de fusión terapéutica, asegurando así también que la escisión de la proteína de fusión está conectada con un evento de coagulación.

Una clase de proteínas de fusión terapéuticas muy preferidas son aquéllas en las cuales el enlazador es escindible por FXIa y/o por FVIIa/TF y el factor de coagulación es FIX.

La esencia de la invención se demuestra en particular por el factor IX polipeptídico dependiente de vitamina K, enlazadores escindibles y albúmina como HLEP así como sus correspondientes secuencias de ADNc.

Proteínas de fusión terapéuticas preferidas conforme a la invención son aquéllas que tienen una actividad molar específica, en particular una actividad molar específica en al menos un ensayo relacionado con la coagulación que está aumentada al menos 25% comparada con la de una proteína de fusión terapéutica sin un enlazador escindible. Son más preferidas proteínas de fusión terapéuticas en las cuales la actividad molar específica está aumentada al menos un 50%, y son aún más preferidas aquéllas en las cuales la actividad molar específica está aumentada al menos un 100%, en al menos uno de los diferentes ensayos disponibles relacionados con la coagulación.

Realizaciones preferidas adicionales de la presente invención son proteínas de fusión terapéuticas, en las cuales la velocidad de desactivación del factor de coagulación activado después de escisión del enlazador peptídico que une el factor de coagulación al polipéptido mejorador de la semivida está aumentada en al menos 10% comparada con la velocidad de desactivación del factor de coagulación activado en una proteína de fusión terapéutica correspondiente sin un enlazador escindible. Son más preferidas proteínas de fusión terapéuticas en las cuales la velocidad de desactivación está aumentada en al menos 25%, y aún más preferidas aquéllas en las cuales la velocidad de desactivación está aumentada en al menos 50%.

Realizaciones preferidas adicionales de la presente invención son proteínas de fusión terapéuticas, en las cuales la velocidad de eliminación del factor de coagulación después de escisión del enlazador peptídico que une el factor de coagulación al polipéptido mejorador de la semivida está aumentada en al menos 10% comparada con la velocidad de eliminación del factor de coagulación en una proteína de fusión terapéutica correspondiente sin un enlazador escindible. Son más preferidas proteínas de fusión terapéuticas en las cuales la velocidad de eliminación está aumentada en al menos 25%, y aún más preferidas aquéllas en las cuales la velocidad de eliminación está aumentada en al menos 50%.

Descripción detallada de la invención

Polipéptidos dependientes de vitamina K

Polipéptidos dependientes de vitamina K como un grupo de los polipéptidos terapéuticos son polipéptidos que se carboxilan enzimáticamente en posición y en el hígado utilizando vitamina K como cofactor. Tales polipéptidos dependientes de vitamina K son por ejemplo los factores II, VII, IX, X, Proteína C, Proteína S, GAS6, y Proteína Z.

FIX humano

FIX humano, un miembro del grupo de polipéptidos dependientes de vitamina K, es una glicoproteína monocatenaria con un peso molecular de 57 kDa, que es secretada por las células del hígado en el torrente sanguíneo como un zimógeno inactivo de 415 aminoácidos. El mismo contiene 12 residuos de ácido y-carboxiglutámico localizados en el dominio GIa N-terminal del polipéptido. Los residuos GIa requieren vitamina K para su biosíntesis. Después del dominio GIa existen dos dominios de Factor de crecimiento epidérmico, un péptido de activación, y un dominio de serina-proteasa tipo tripsina. Modificaciones adicionales posteriores a la traducción de FIX abarcan hidroxilación (Asp 64), N-(Asnl57 y Asn167) así como glicosilación tipo O (Ser53, Ser61, Thr159, Thr169, y Thr172), sulfatación (Tyr155), y fosforilación (Ser158).

FIX se convierte en su forma activa, Factor IXa, por proteólisis del péptido de activación en Arg145-Ala146 y Arg180-Val181 que conduce a la formación de dos cadenas polipeptídicas, una cadena ligera N-terminal (18 kDa) y una cadena pesada C-terminal (28 kDa), que se mantienen unidas por un puente disulfuro. La escisión de activación del Factor IX puede ocurrir in vitro e. g. por Factor XIa o Factor Vlla/TF. El Factor IX está presente en el plasma humano en una concentración de of 5-10 pg/ml. Se ha encontrado que la semivida terminal en plasma del Factor IX en humanos es aproximadamente 15 a 18 horas (White GC et al. 1997. Recombinant Factor IX. Thromb Haemost. 78: 261-265; Ewenstein BM et al. 2002. Pharmacokinetic analysis of plasma-derived and recombinant FIX concentrates in previously treated patients with moderate or severe hemophilia B. Transfusion 42:190-197).

La hemofilia B está causada por Factor IX no funcional o ausente, y se trata con concentrados de Factor IX de plasma o una forma recombinante de Factor IX. Dado que los pacientes de hemofilia B reciben a menudo al menos administraciones profilácticas bisemanales de Factor IX a fin de evitar hemorragias espontáneas, es deseable aumentar los intervalos entre administraciones por aumento de la semivida del producto Factor IX aplicado. Una mejora de la semivida en plasma podría aportar un beneficio importante al paciente. Hasta ahora no está disponible comercialmente ninguna preparación farmacéutica de un Factor IX con semivida en plasma mejorada ni se ha publicado dato alguno que exhiba variantes de FIX con semivida in vivo prolongada y actividad molar específica prácticamente inalterada en ensayos basados en coagulación. Por tanto, existe todavía una gran necesidad médica de desarrollar formas de Factor IX que tengan una semivida funcional in vivo más larga.

Factor VII y Factor VIIa

FVII es una glicoproteína monocatenaria que tiene un peso molecular de 50 kDa, que es secretada por las células del hígado en el torrente sanguíneo como un zimógeno inactivo de 406 aminoácidos. FVII se convierte en su forma activa Factor VIIa, por proteólisis del enlace peptídico simple en Arg152-Ile153 conduciendo a la formación de dos cadenas polipeptídicas, una cadena ligera N-terminal (24 kDa) y una cadena pesada C-terminal (28 kDa), que se mantienen unidas por un puente disulfuro. En contraste con otros factores de la coagulación dependientes de vitamina K, no se escinde péptido de activación alguno durante la activación. La escisión de activación del Factor VII puede lograrse in vitro, por ejemplo, por Factor Xa, Factor IXa, Factor VIIa, Factor XIIa, Proteasa Activadora del Factor Siete (FSa P), y trombina. Mollerup et al. (Biotechnol. Bioeng. (1995) 48: 501-505) consignaron que ocurre también cierta escisión en la cadena pesada en Arg290 y/o Arg315.

El Factor VII está presente en plasma en una concentración de 500 ng/ml. Aproximadamente 1% o 5 ng/ml de Factor VII está presente como Factor VIIa activado. Se ha encontrado que la semivida terminal en plasma del Factor VII es aproximadamente 4 horas y la del Factor VIIa aproximadamente 2 horas.

Por administración de concentraciones suprafisiológicas de Factor VIIa puede conseguirse la hemostasis obviando la necesidad de Factor VIIIay Factor IXa. La clonación del ADNc para Factor VII (US 4. 784. 950) hizo posible desarrollar Factor VII activado como producto farmacéutico. El Factor VIIa se administró con éxito por primera vez en 1988. Desde entonces el número de indicaciones de Factor VIIa ha aumentado constantemente exhibiendo un potencial para llegar a ser un agente hemostático universal para la detención de las hemorragias (Erhardtsen, 2002). Sin embargo, la corta semivida terminal de Factor VIIa de aproximadamente 2 horas y su reducida recuperación in vivo están limitando su aplicación. Por tanto, existe todavía una gran necesidad médica de desarrollar formas de Factor VIIa que tengan una semivida mejorada, pero por otra parte actividad molar específica, cinética de desactivación, y/o cinética de eliminación prácticamente inalterables después del comienzo de la coagulación.

Proteínas de fusión terapéuticas

Las "proteínas de fusión terapéuticas" en el sentido de esta invención son factores de coagulación seleccionados de la lista que consiste en Factor IX, Factor VIII, Factor de van Willebrand, Factor V, Factor X, Factor XI, Factor XII, Factor XIII, Factor I, Factor II (Protrombina), Proteína C, Proteína S, GAS6 y Proteína Z fusionados a un polipéptido mejorador de la semivida que, después de la administración a un humano o animal, pueden producir un efecto profiláctico o terapéutico. Estas proteínas de fusión terapéuticas pueden administrarse a un humano o un animal por vía intravenosa, intramuscular, oral, tópica, parenteral u otras rutas. Clases específicas de proteínas de fusión terapéuticas abarcadas, a saber, por los ejemplos de esta invención, son factores de coagulación como por ejemplo polipéptidos dependientes de vitamina K enlazados a polipéptidos mejoradores de la semivida como por ejemplo albúmina e inmunoglobinas y sus fragmentos o derivados. La expresión "proteína de fusión terapéutica" se utiliza de modo intercambiable con "proteína de fusión".

Polipéptido mejorador de la semivida (HLEP)

Albúmina, miembros de la familia de albúmina e inmunoglobulinas y sus fragmentos o derivados se han descrito arriba como ejemplos de polipéptidos mejoradores de la semivida (HLEPs). Las expresiones "seroalbúmina humana" (HSA) y "albúmina humana" (HA) se utilizan intercambiablemente en esta solicitud. Los términos "albúmina" y "seroalbúmina" son más amplios, y abarcan seroalbúmina humana (y fragmentos y variantes de la misma) así como albúmina de otras especies (y fragmentos y variantes de la misma).

Como se utiliza en este documento, "albúmina" se refiere colectivamente al polipéptido o secuencia de aminoácidos de albúmina, o un fragmento o variante de albúmina que tiene una o más actividades funcionales (por ejemplo, actividades biológicas) de albúmina. En particular, "albúmina" se refiere a albúmina humana o fragmentos de la misma, especialmente la forma madura de albúmina humana como se muestra en SEQ ID No:1 en este documento o albúmina de otros vertebrados o fragmentos de la misma, o análogos o variantes de estas moléculas o fragmentos de los mismos.

La porción albúmina de las proteínas de fusión de albúmina puede comprender la longitud total de la secuencia HA como se ha descrito arriba, o puede incluir uno o más fragmentos de la misma que son capaces de estabilizar o prolongar la actividad terapéutica. Tales fragmentos pueden ser de 10 o más aminoácidos de longitud o pueden incluir aproximadamente 15, 20, 25, 30, 50, o más aminoácidos contiguos de la secuencia HA o pueden incluir parte o la totalidad de dominios específicos de HA.

El término "variantes" incluye inserciones, deleciones, y sustituciones, sean conservadoras o no-conservadoras, naturales o artificiales, donde tales cambios no alteran sustancialmente el sitio activo, o dominio activo que confiere las actividades terapéuticas de los polipéptidos terapéuticos.

La albúmina puede derivarse de cualquier vertebrado, especialmente de cualquier mamífero, por ejemplo, humano, vaca, oveja, o cerdo. Albúminas no de mamífero incluyen, pero sin carácter limitante, gallina y salmón. La porción albúmina del polipéptido unido a albúmina puede ser de un animal diferente que la porción del polipéptido terapéutico.

Hablando en términos generales, un fragmento o variante de albúmina tendrá al menos 10, preferentemente al menos 40, y muy preferentemente más de 70 aminoácidos de longitud. La variante de albúmina puede estar constituida preferentemente por o comprender alternativamente al menos un dominio completo de albúmina o fragmentos de dichos dominios, por ejemplo los dominios 1 (aminoácidos 1-194 de SEQ ID NO:1), 2 (aminoácidos 195-387 de SEQ ID NO: 1), 3 (aminoácidos 388-585 de SEQ ID NO: 1), 1 2 (1-387 de SEQ ID NO: 1), 2 3 (195-585 de SEQ ID NO: 1) ó 1 3 (aminoácidos 1-194 de SEQ ID NO: 1 aminoácidos 388-585 de SEQ ID NO: 1). Cada dominio está constituido en sí mismo por dos subdominios homólogos, a saber 1-105, 120-194, 195-291, 316-387, 388-491 y 512­ 585, con regiones enlazadoras flexibles inter-subdominios que comprenden los residuos Lys106 a Glu119, Glu292 a Val315, y Glu492 a Ala511.

La porción albúmina de una proteína de fusión de albúmina de la invención puede comprender al menos un subdominio o dominio de HA o modificaciones conservadoras del mismo.

Todos los fragmentos y variantes de albúmina están abarcados por la invención como socios de fusión de un factor de coagulación con tal que los mismos conduzcan a un aumento de la semivida de la proteína terapéutica de fusión en plasma de al menos 25% comparado con el factor de coagulación no fusionado.

Además de la albúmina, se ha reivindicado que la alfa-fetoproteína, otro miembro de la familia de albúmina, mejora la semivida in vivo de un polipéptido terapéutico unido (WO 2005/024044). La familia de albúmina de proteínas, proteínas de transporte del suero evolutivamente afines, está constituida por albúmina, alfa-fetoproteína (AFP; Beattie & Dugaiczyk 1982. Gene 20:415-422), afamina (AFM; Lichenstein et al. 1994. J. Biol. Chem. 269:18149-18154) y proteína de fijación de vitamina D (DBP; Cooke & David 1985. J. Clin. Invest. 76:2420-2424). Sus genes representan un grupo multigénico con semejanzas estructurales y funcionales que mapean en la misma región cromosómica en humanos, ratones y ratas. La semejanza estructural de los miembros de la familia de albúmina sugiere su utilidad como HLEPs. Por lo tanto, otro objeto de la invención es utilizar dichos miembros de la familia de la albúmina y fragmentos de los mismos como HLEPs. El término "variantes" incluye inserciones, deleciones y sustituciones, sean conservadoras o no-conservadoras, con tal que esté presente todavía la función deseada.

Los miembros de la familia de albúmina pueden comprender la longitud total de la proteína AFP, AFM y DBP respectiva, o pueden incluir uno o más fragmentos de la misma que son capaces de estabilizar o prolongar la actividad terapéutica. Tales fragmentos pueden ser de 10 o más aminoácidos de longitud, o pueden incluir aproximadamente 15, 20, 25, 30, 50, o más aminoácidos contiguos de la secuencia proteínica respectiva o pueden incluir parte o la totalidad de dominios específicos de la proteína respectiva, con tal que los fragmentos HLEP proporcionen una prolongación de la semivida de al menos 25% en comparación con el factor de coagulación no fusionado. Los miembros de la familia de albúmina de las proteínas de fusión terapéuticas de la invención pueden incluir variantes polimórficas de AFP, AFM y DBP existentes naturalmente.

Pueden utilizarse también como HLEPs IgG y fragmentos de IgG, con tal que los fragmentos HLEP proporcionen una extensión de la semivida de al menos 25% en comparación con el factor de coagulación no fusionado. La porción del polipéptido terapéutico está conectada a la IgG o los fragmentos de IgG por un enlazador escindible que permite actividades molares específicas altas de la proteína de fusión. Ejemplos para moléculas de fusión Factor VII/VIIa y Factor IX IgG se encuentran, por ejemplo, en WO 2005/001025. Dicho documento da a conocer, a saber, un homodímero que comprende dos moléculas de Factor VII (Factor VIIa) y dos moléculas Fc y un híbrido monómero/dímero constituido por una molécula FVII (FVIIa) y dos moléculas Fc, exhibiendo el monómero/dímero una actividad de coagulación aproximadamente cuatro veces mayor que el homodímero. Una secuencia enlazadora de la presente invención que libere las moléculas FVII (FVIIa) después de escisión por una proteasa de la cascada de coagulación como, por ejemplo, FXIa, FXa, o FIXa podría aumentar la actividad de coagulación de los constructos y especialmente la del homodímero hasta un nivel de actividad comparable al homodímero/dímero o incluso mayor. Una proteína de fusión FIX-Fc con enlazador escindible se muestra ilustrativamente en SEQ ID No 93. En este caso pueden aplicarse enlazadores escindibles tales como los representados en la Tabla 3a y 3b.

La invención se refiere específicamente a proteínas de fusión que comprenden enlazar un factor de coagulación al término N o C de un HLEP o fragmento o variante del mismo tal que se introduce un enlazador peptídico escindible interpuesto entre el polipéptido terapéutico y el HLEP de tal manera que la proteína de fusión formada tiene una semivida in vivo aumentada comparada con el factor de coagulación que no se ha enlazado a un HLEP y que la proteína de fusión tiene una actividad molar específica al menos 25% mayor comparada con la proteína de fusión correspondiente con enlazador no-escindible en al menos uno de los diferentes ensayos relacionados con la coagulación disponibles.

La expresión "factor de coagulación" como se utiliza en esta solicitud incluye, pero sin carácter limitante, polipéptidos constituidos por Factor IX, Factor VII, Factor VIII, Factor von Willebrand, Factor V, Factor X, Factor XI, Factor XII, Factor XIII, Factor I, Factor II (Protrombina), Proteína C, Proteína S, GAS6, o Proteína Z, así como sus formas activadas. Adicionalmente, polipéptidos terapéuticos útiles pueden ser polipéptidos de tipo salvaje o pueden contener mutaciones. El grado y la localización de la glicosilación u otras modificaciones posteriores a la traducción pueden variar dependiendo de las células hospedadoras seleccionadas y de la naturaleza del entorno celular del hospedador. Cuando se hace referencia a secuencias de aminoácidos específicas, están abarcadas en esta solicitud modificaciones posteriores a la traducción de tales secuencias.

La expresión "factor de coagulación" dentro de la definición anterior incluye polipéptidos que tienen la secuencia natural de aminoácidos que incluye cualesquiera polimorfismos naturales. La misma incluye también polipéptidos con una secuencia de aminoácidos ligeramente modificada, por ejemplo, un extremo N-terminal o C-terminal modificado que incluye deleciones o adiciones de aminoácidos terminales, con tal que dichos polipéptidos retengan sustancialmente la actividad del polipéptido terapéutico respectivo. Las variantes incluidas difieren en uno o más residuos de aminoácido de secuencia de tipo salvaje. Ejemplos de tales diferencias pueden incluir truncación del término N y/o C en uno o más residuos de aminoácido (por ejemplo, preferentemente 1 a 30 residuos de aminoácido), o la adición de uno o más residuos extra en el término N y/o C, así como sustituciones de aminoácidos conservadoras, es decir sustituciones realizadas en grupos de aminoácidos con características similares, por ejemplo (1) aminoácidos pequeños, (2) aminoácidos de carácter ácido, (3) aminoácidos polares, (4) aminoácidos de carácter básico, (5) aminoácidos hidrófobos, y (6) aminoácidos aromáticos. Ejemplos de tales sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla siguiente.

Tabla 1

La semivida in vivo de las proteínas de fusión de la invención, determinada en general como semivida terminal o semivida p, es por lo general al menos aproximadamente 25%, con preferencia al menos aproximadamente 50%, y de modo más preferible más de 100% mayor que la semivida in vivo del polipéptido no fusionado.

Las proteínas de fusión de la presente invención puede tener al menos un 25%, con preferencia al menos un 50%, con más preferencia una actividad molar específica aumentada al menos 100% en comparación con las proteínas de fusión correspondientes sin enlazadores escindibles.

A este respecto, la actividad molar específica (o actividad molar específica relacionada con la coagulación como se considera en particular aquí) se define como la actividad expresada por mol (o por ejemplo nmol) del polipéptido terapéutico o proteína de fusión terapéutica de interés. El cálculo de la actividad molar específica permite una comparación directa de la actividad de los diferentes constructos que no se ve afectada por los diferentes pesos moleculares o densidades ópticas de los polipéptidos estudiados. La actividad molar específica puede calcularse como se ilustra en la Tabla 2 a continuación para FIX y una proteína de fusión FIX-HSA.

Tabla 2: Cálculo de la actividad molar específica como se muestra para una proteína de fusión FIX-HSA

Con objeto de determinar una actividad molar específica relacionada con la coagulación, puede utilizarse cualquier ensayo que determine las actividades enzimáticas o de cofactor que son relevantes para el proceso de coagulación.

En este caso, "ensayo relacionado con la coagulación" en el sentido de la invención es cualquier ensayo que determine las actividades enzimáticas o de cofactor que son de relevancia en el proceso de coagulación o que son capaces de determinar que se ha activado la cascada de coagulación intrínseca o la extrínseca. El ensayo "relacionado con la coagulación" puede ser por tanto un ensayo de coagulación directa como aPTT, PT, o los ensayos de generación de trombina. Sin embargo, están incluidos también otros ensayos tales como, por ejemplo, ensayos cromógenos aplicados para factores de coagulación específicos. Ejemplos de tales ensayos o reactivos correspondientes son Pathromtin® SL (ensayo aPTT, Dade Behring) o Thromborel® S (ensayo de Tiempo de Protrombina, Dade Behring) con plasma deficiente en el factor de coagulación correspondiente (Dade Behring), kits de ensayos de generación de trombina (Technoclone, Thrombinoscope) que utilizan por ejemplo plasma deficiente en factores de coagulación, ensayos cromógenos como Biophen Factor IX (Hyphen BioMed), Staclot® FVIIa-rTF (Roche Diagnostics GmbH), Coatest® Factor VIII:C/4 (Chromogenix), u otros.

Para los propósitos de esta invención, un aumento en uno cualquiera de los ensayos anteriores o un ensayo equivalente relacionado con la coagulación se considera que exhibe un aumento en la actividad molar específica. Por ejemplo, un aumento de 25% se refiere a un aumento de 25% en cualquiera de los ensayos anteriores o un ensayo equivalente.

Para determinar si las proteínas de fusión terapéuticas caen dentro del alcance de la presente invención, el estándar contra el cual se compara la actividad molar específica de estas proteínas es un constructo en el cual el factor de coagulación respectivo y el HLEP respectivo están unidos por un enlazador no-escindible que tiene la secuencia de aminoácidos GGGGGGV.

En el caso de FIX, se utilizan a menudo ensayos aPTT para la determinación de la actividad de coagulación. Un ensayo de coagulación de este tipo (ensayo aPTT) se describe en el ejemplo 5 con más detalle. Sin embargo, pueden aplicarse otros ensayos o principios de ensayo relacionados con la coagulación a fin de determinar la actividad molar específica para FIX.

Los fármacos constituidos por polipéptidos terapéuticos recombinantes son usualmente caros y no todos los países pueden proporcionar terapias costosas basadas en tales fármacos. El aumento de la recuperación in vivo de tales fármacos podría hacer más barato el uso de estos productos y subsiguientemente podrían beneficiarse de ellos más pacientes. En el caso de las proteínas de fusión de la presente invención, una mayor recuperación in vivo sería también una ventaja deseable. "Recuperación in vivo" en el sentido de la invención significa la cantidad de producto encontrada en sangre o plasma poco después de la administración del producto. Por tanto, para la detección de la recuperación in vivo en general se determina el contenido en plasma unos pocos minutos (por ejemplo 5 ó 15 minutos) después de la administración del producto.

Aunque es deseable lograr una recuperación in vivo alta y una semivida larga para un factor de coagulación noactivado, es ventajoso limitar la semivida de un factor de coagulación después de su activación o de la activación de su cofactor a fin de evitar un riesgo protrombótico. Por tanto, después que se ha iniciado el proceso de coagulación, debería reducirse de nuevo la semivida del factor de coagulación activo. Esto puede lograrse por aumento de la desactivación de un modo relacionado con la coagulación o por eliminación del factor de coagulación.

La desactivación conforme a la presente invención significa la disminución de actividad del polipéptido terapéutico que puede estar causada, por ejemplo, por formación de un complejo entre un factor de coagulación y un inhibidor del factor de coagulación correspondiente o por escisión proteolítica ulterior como se conoce, por ejemplo, en el caso de FVIII y FV.

La velocidad de desactivación de una proteína de fusión terapéutica activada se define como la velocidad de disminución de la actividad, por ejemplo, por reacción con inhibidores o por desactivación proteolítica. La velocidad de desactivación puede medirse siguiendo la actividad molar específica del factor de coagulación activado a lo largo del tiempo en presencia de cantidades fisiológicas de inhibidores de este factor de coagulación. Alternativamente, la velocidad de desactivación puede determinarse después de la administración del producto activado a un animal seguido por ensayo de muestras de plasma en un marco de tiempo apropiado utilizando ensayos de actividad y antígeno.

Cuando en el caso de las proteínas de fusión terapéuticas es necesaria una determinación de si estas proteínas caen dentro del alcance de la presente invención, el estándar contra el cual se compara la velocidad de desactivación de estas proteínas terapéuticas es un constructo en el cual el factor de coagulación respectivo y e1HLEP respectivo están unidos por un enlazador no-escindible que tiene la secuencia de aminoácidos GGGGGGV.

La velocidad de eliminación de una proteína de fusión terapéutica activada se define como la velocidad a la que el polipéptido se elimina de la circulación de humanos o animales. La velocidad de eliminación puede determinarse por medida de la farmacocinética de la proteína de fusión terapéutica activada después de administración intravenosa. Utilizando un ensayo de antígeno, la eliminación puede determinarse por retirada directa de la circulación. Utilizando adicionalmente un ensayo de actividad, puede determinarse una velocidad específica de eliminación y desactivación.

Cuando, en el caso de las proteínas de fusión terapéuticas es necesaria una determinación de si estas proteínas caen dentro del alcance de la presente invención, el estándar contra el cual se compara la velocidad de desactivación de estas proteínas terapéuticas es un constructo en el cual el factor de coagulación respectivo y e1HLEP respectivo están unidos por un enlazador no-escindible que tiene la secuencia de aminoácidos GGGGGGV.

Conforme a esta invención, el resto del polipéptido terapéutico está acoplado al resto HLEP por un enlazador peptídico escindible. El enlazador debería ser no-inmunógeno y debería ser suficientemente flexible para permitir la escisión por proteasas. La escisión del enlazador debería transcurrir con rapidez comparable a la activación del polipéptido terapéutico dentro de la proteína de fusión, si la proteína de fusión es un zimógeno.

El enlazador escindible comprende preferentemente una secuencia derivada

a) del polipéptido terapéutico a administrar propiamente dicho si el mismo contiene sitios de escisión proteolítica que se escinden proteolíticamente durante la activación del polipéptido terapéutico, b) de un polipéptido sustrato de este polipéptido terapéutico, o

c) de un polipéptido sustrato escindido por una proteasa que se activa o se forma por la implicación directa o indirecta del polipéptido terapéutico.

En una realización más preferida, la región enlazadora comprende una secuencia del polipéptido terapéutico a aplicar, lo cual debería dar como resultado un riesgo disminuido de propiedades neoantigénicas de la proteína de fusión expresada. Asimismo, en el caso en que la proteína terapéutica es un zimógeno (por ejemplo necesita ser activada proteolíticamente) la cinética de la escisión del enlazador peptídico reflejará más estrechamente la cinética de activación del zimógeno relacionada con la coagulación.

En una realización preferida, el polipéptido terapéutico es zimógeno FIX y e1HLEP es albúmina. En este caso, la secuencia enlazadora se deriva, o bien de las secuencias de las regiones de activación de FIX, de la región de escisión de cualquier sustrato de FIX como FX o FVII o de la región de escisión de cualquier polipéptido sustrato que es escindido por una proteasa en cuya activación está implicado FIXa.

En una realización muy preferida, el péptido enlazador se deriva de FIX propiamente dicho. En otra realización preferida, el péptido enlazador se deriva de FX o FVII. En otra realización preferida, la secuencia enlazadora comprende dos secuencias de escisión que pueden ser escindidas por FXIa o FVIIa/TF, dos activadores de FIX fisiológicamente relevantes.

Combinaciones ejemplares de polipéptido terapéutico, enlazador escindible y HLEP con factores de coagulación seleccionados de la lista que consiste en Factor IX, Factor VIII, Factor de van Willebrand, Factor V, Factor X, Factor XI, Factor XII, Factor XIII, Factor I, Factor II ( Protrombina), Proteína C, Proteína S, GAS6 y Proteína Z se incluyen en los constructos enumeradas en las tablas 3a y 3b, pero no se limitan a estas:

Tabla 3a: Ejemplos de constructos posibles

(continuación)

(continuación)

En el caso de enlazadores derivados de la región N-terminal del péptido de activación de FIX, conforme al polimorfismo natural T148-A148, las secuencias pueden contener también A en lugar de T en esta posición.

Tabla 3b: Ejemplos de constructos posibles con dos o más sitios de escisión

Variantes y fragmentos de los enlazadores descritos están abarcadas también en la presente invención con tal que el enlazador pueda ser escindido todavía por la proteasa o las proteasas, que escinden los enlazadores de las tablas 3a y 3b o por el tipo de proteasas definido anteriormente. El término "variantes" incluye inserciones, deleciones y sustituciones, sean conservadoras o no-conservadoras.

Otras combinaciones de las secuencias de escisión arriba descritas y sus variantes pueden incluirse en la presente invención.

En otra realización, se incluyen sustituciones de aminoácidos que cambian el patrón de modificación del enlazador peptídico posterior a la traducción. Éstas pueden ser, por ejemplo, sustituciones de aminoácidos que están glicosilados, sulfatados, o fosforilados.

En otra realización de la invención, el enlazador peptídico entre el polipéptido terapéutico y el resto HLEP contiene sitios de consenso para la adición de modificaciones posteriores a la traducción. Tales modificaciones están constituidas preferentemente por sitios de glicosilación. Más preferentemente, tales modificaciones están constituidas por al menos un sitio de glicosilación en N de la estructura Asn - X - Ser/Thr, donde X designa cualquier aminoácido excepto prolina. Aún más preferentemente, tales sitios de glicosilación en N se insertan próximos al término amino y/o carboxi del enlazador peptídico de tal modo que los mismos son capaces de proteger neoepítopos potenciales que podrían desarrollarse en las secuencias en las que el resto del polipéptido terapéutico está experimentando transición al enlazador peptídico, o donde el péptido enlazador está pasando a la secuencia del resto de albúmina.

Breve descripción de las Figuras

Figura 1: Activación in vitro de proteínas de fusión FIX-albúmina por FXIa a 37 °C para una relación molar de FXIa a proteína de fusión de aproximadamente 1:500. Se utilizaron una sola proteína de fusión con enlazador no-escindible (1478/797) y dos proteínas de fusión con enlazador escindible (1088/797 y 1089/797). Las muestras se analizaron por SDS/PAGE en condiciones reductoras seguido por tinción con azul Coomassie.

Figura 2: Farmacocinética de las proteínas de fusión rec FIX y FIX-albúmina activadas con y sin enlazador escindible comparadas con proteínas de fusión no activadas.

Figura 3 : Desactivación de las proteínas de fusión rec FIX o FIX-albúmina activadas por AT. La actividad residual de FIX se determinó después de 120 minutos utilizando un ensayo de tiempo parcial de tromboplastina no-activado.

Ejemplos:

Ejemplo 1: Generación de ADNcs codificantes de proteínas de fusión FIX y FlX-albúmina

La secuencia codificante de Factor IX se amplificó por PCR a partir de una biblioteca de ADNc de hígado humano (ProQuest, Invitrogen) utilizando los cebadores We1403 y We1404 (SEQ ID NO 5 y 6). Después de una segunda tanda de PCR utilizando los cebadores We1405 y We1406 (SEQ ID NO 7 y 8), el fragmento resultante se clonó en pCR4TOPO (Invitrogen). Desde éste, el ADNc FIX se transfirió como un fragmento EcoRI al sitio EcoRI de pIRESpuro3 (BD Biosciences) en el que se había delecionado previamente un sitio Xhol interno. El plásmido resultante se designó pFIX-496 y fue el vector de expresión para el Factor IX tipo salvaje.

Para la generación de constructos de fusión de albúmina se reamplificó ADNc FIX por PCR en condiciones estándar utilizando los cebadores We2610 y We2611 (SEQ ID NO 9 y 10) delecionando el codón de parada e introduciendo un sitio Xhol en su lugar. El fragmento FIX resultante se digirió con las endonucleasas de restricción EcoRI y Xhol y se ligó a un pIRESpuro3 digerido con EcoRI / BamH1 junto con un fragmento enlazador digerido con Xhol / BamH1 como se describe más adelante.

Se generaron dos fragmentos enlazadores glicina/serina sin sitios de escisión internos: los oligonucleótidos We2148 y We2150 (SEQ ID NO 11 y 12) se reasociaron en concentraciones equimolares (10 pmol) en condiciones estándar PCR, se rellenaron y se amplificaron utilizando un protocolo PCR de una desnaturalización inicial de 2 minutos a 94°C seguida por 7 ciclos de desnaturalización durante 15 sec. a 94°C, 15 sec. de reasociación a 55°C y 15 sec. de elongación a 72°C, y finalizada por un paso de extensión de 5 min a 72°C. Se llevó a cabo el mismo procedimiento utilizando los oligonucleótidos We2156 y We2157 (SEQ ID NO 13 y 14). Los fragmentos enlazadores resultantes se digirieron con las endonucleasas de restricción Xhol y BamH1 y se utilizaron por separado en la reacción de ligación descrita anteriormente. Los plásmidos resultantes contenían por tanto la secuencia codificante para FIX y una extensión C-terminal de un enlazador glicina/serina.

Se generaron dos fragmentos enlazadores escindibles diferentes derivados de los sitios de activación de FIX: los oligonucleótidos We2335 y We2336 (SEQ ID NO 15 y 16), que contenían el sitio de escisión de activación de la cadena ligera de FIX/región de borde del péptido de activación, se reasociaron, rellenaron, y amplificaron como se ha descrito arriba. El fragmento enlazador resultante se digirió con las endonucleasas de restricción Xhol y BamH1 y se utilizó en la reacción de ligación descrita anteriormente. El plásmido resultante contenía por tanto la secuencia codificante para FIX y una extensión C-terminal de una secuencia FIX escindible (aminoácidos 136 a 154 de SEQ ID NO 2). En una reacción subsiguiente de mutagénesis orientada con un kit de mutagénesis disponible comercialmente (QuickChange XL Site Directed Mutagenesis Kit, Stratagene) utilizando los oligonucleótidos We2636 y We2637 (SEQ ID NO 17 y 18) se delecionó el sitio XhoI.

Para la generación del segundo fragmento enlazador escindible derivado de FIX, se llevó a cabo el mismo procedimiento utilizando los oligonucleótidos We2337 y We2338 (SEQ ID NO 19 y 20) para construcción de enlazadores. El fragmento enlazador resultante se digirió con las endonucleasas de restricción Xhol y BamH1 y se utilizó en la reacción de ligación arriba descrita. El plásmido resultante contenía ahora la secuencia codificante para FIX y una extensión C-terminal de una secuencia FIX escindible derivada del sitio de escisión de activación del péptido de activación de FIX / región borde de la cadena pesada (aminoácidos 173 a 186 de SEQ ID NO 2). Para la deleción del sitio XhoI se utilizaron los oligonucleótidos We2638 y We2639 (SEQ ID NO 21 y 22) como se ha descrito arriba.

En el paso de clonación siguiente, los plásmidos generados anteriormente se digirieron con BamH1 y se insertó un fragmento BamH1 que contenía el ADNc de albúmina humana madura. Este fragmento había sido generado por PCR en una secuencia de ADNc de albúmina utilizando los cebadores We1862 y We1902 (SEQ ID NO 23 y 24) en condiciones estándar.

Los plásmidos finales con enlazadores glicina/serina no-escindibles se designaron pFIX-980 (SEQ ID NO 30) y pFIX-986 (SEQ ID NO 31), respectivamente. Los plásmidos finales con enlazadores escindibles derivados de las secuencias de FIX se designaron pFIX-1088 (SEQ ID NO 40) y pFIX-1089 (SEQ ID NO 49), respectivamente. Sus secuencias enlazadoras y las secuencias C-terminal de FIX y N-terminal de albúmina se reseñan a continuación. Los sitios de escisión proteolítica en los enlazadores se indican con flechas, y las secuencias enlazadoras derivadas de FIX están subrayadas.

Para la expresión en células CHO, las secuencias codificantes para la proteína de fusión de albúmina FIX se transfirieron a vectores pIRESneo3 (BD Biosciences) o pADNc3.1 (Invitrogen), respectivamente.

Para procesamiento eficiente del propéptido en células que expresan FIX en cantidades altas se requiere la coexpresión de furina (Wasley LC et al. 1993. PACE/Furin can process the vitamin K-dependent pro-Factor IX precursor within the secretory pathway. J. Biol. Chem. 268:8458-8465). Se amplificó furina a partir de una biblioteca de ADNc de hígado (Ambion) utilizando los cebadores We1791 y We1792 (Se Q ID NO 25 y 26). Una segunda tanda de PCR utilizando los cebadores We1808 y We1809 (SEQ ID NO 27 y 28) proporcionó un fragmento de furina en el cual se delecionó el dominio transmembranal del terminal carboxi (TM) y se introdujo un codón de parada; este fragmento se clonó en pCR4TOPO (Invitrogen). A partir de ello se transfirió el ADNc furinaATM como un fragmento EcoRI/NotI en los sitios EcoRI/NotI de pIRESpuro3 (BD Biosciences) en los que se había delecionado previamente un sitio Xhol interno. El plásmido resultante se designó pFu-797. Este plásmido se cotransfectó con todos los constructos FIX en una ratio molar 1:5 (pFu-797: pFIX-xxx). La secuencia de aminoácidos de la furina secretada codificada por pFu-797 se da como SEQ-ID NO 29.

Ejemplo 2: Transfección y expresión de proteínas de fusión FIX y FlX-albúmina

Se cultivaron plásmidos en E. coli TOP10 (Invitrogen) y se purificaron utilizando protocolos estándar (Qiagen). Se transfectaron células HEK-293 utilizando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) y se cultivaron en medio exento de suero (Invitrogen 293 Express) en presencia de 50 ng/ml de vitamina K y 4 pg/ml de puromicina. Las poblaciones de células transfectadas se extendieron por medio de matraces T en frascos rotativos o fermentadores de pequeña escala a partir de los cuales se recogieron los sobrenadantes para purificación.

Alternativamente, se transfectaron células CHO K1 o DG44 (Invitrogen) utilizando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) y se cultivaron en medio exento de suero (Invitrogen CD-CHO) en presencia de 50 ng/ml de vitamina K y 500-750 ng/ml de geneticina. Se seleccionaron clones de alta expresión y se extendieron por medio de matraces T en frascos rotativos o fermentadores de pequeña escala a partir de los cuales se recogieron los sobrenadantes para purificación.

Ejemplo 3: Purificación de proteínas de fusión FIX y FIX-albúmina

La cosecha del cultivo de células que contenían proteína de fusión FIX o FIX-albúmina se aplicó a una columna Q-Sepharose FF equilibrada previamente con tampón 50 mM TrisxHCl / 100 mM NaCl 20 de pH 8,0. Subsiguientemente, la columna se lavó con tampón de equilibración que contenía 200 mM NaCl. La elución de la proteína FIX fijada o proteína de fusión de FIX se realizó por medio de un gradiente salino utilizando tampón 50 mM TrisxHCl / 200 mM NaCl de pH 8,0 como base. El producto eluido se purificó ulteriormente por cromatografía en columna sobre una resina de hydroxilapatito. Para este propósito, el eluato de la columna Q-Sepharose FF se cargó en una columna de cromatografía de hidroxilapatito con tampón 50 mM TrisxHCl / 100 mM NaCl de pH 7, 2. La columna se lavó con el mismo tampón, y se eluyeron FIX o FIX-HSA utilizando un gradiente de fosfato de potasio a pH 7,2. El eluato se dializó para reducir la concentración de sal y se utilizó para análisis bioquímico así como para la determinación de los parámetros farmacocinéticos. El antígeno de FIX y la actividad se determinaron como se describe en el ejemplo 5.

Ejemplo 4: Esquema de purificación alternativo de las proteínas de fusión FIX y FIX-albúmina

Como se describe en el ejemplo 3, la cosecha del cultivo de células que contenían proteína de fusión FIX o FIX-albúmina se purificó por cromatografía en Q-Sepharose FF. El eluato de Q-Sepharose se purificó ulteriormente por cromatografía en una columna Heparin-Fractogel. Para este propósito, la columna Heparin-Fractogel se equilibró utilizando tampón 50 mM Tris x HCl, 50 mM NaCl de pH 8,0 (EP), se aplicó el eluato de Q-Sepharose FF y se lavó la columna con tampón de equilibración que contenía 75 mM NaCl. La proteína de fusión FIX o FIX-albúmina, respectivamente, se eluyó utilizando EP ajustado a 300 mM NaCl. El eluato de Heparin-Fractogel se purificó ulteriormente por cromatografía en una columna de cromatografía de hidroxilapatito como se describe en el ejemplo 3. El concentrado purificado de proteína de fusión FIX o respectivamente FlX-albúmina se sometió a determinación de la actividad y antígeno de FIX conforme al ejemplo 5 y se caracterizó por investigaciones ulteriores in vitro e in vivo.

Ejemplo 5: Determinación de la actividad y el antígeno de FIX

La actividad de FIX se determinó como actividad de formación de coágulo o coagulación (FIX: C) utilizando reactivos de aPTT disponibles comercialmente (Pathromtin SL y plasma empobrecido en FIX, Dade Behring). Como referencia se utilizó un subestándar interno calibrado contra el estándar concentrado de FIX WHO International (96/854).

El antígeno de FIX (FIX:Ag) se determinó por un ensayo ELISA conforme a protocolos estándar conocidos por los expertos en la técnica. Resumidamente, se incubaron placas de microtitulación con 100 pL por pocillo del anticuerpo de captura (anticuerpos apareados para FIX ELISA 1:200, Cedarlane, si bien pueden aplicarse también otras fuentes de anticuerpos apropiados) durante una noche a la temperatura ambiente. Después de lavar 3 veces las placas con tampón de lavado B (Sigma P3563), se incubó cada pocillo con 200 pL de tampón de bloqueo C (Sigma P3688) durante una hora a la temperatura ambiente. Después de otros 3 pasos de lavado con tampón B, diluciones seriadas de la muestra de test en tampón B, así como diluciones seriadas de un subestándar (SHP) en tampón B (volúmenes por pocillo: 100 pL) se incubaron durante 2 horas a la temperatura ambiente. Después de 3 pasos de lavado con tampón B, se añadieron a cada pocillo 100 pL de una dilución 1:200 del anticuerpo de detección (anticuerpos apareados para FIX ELISA, marcados con peroxidasa, Cedarlane) en tampón B y se incubaron durante 2 horas más a la temperatura ambiente. Después de 3 pasos de lavado con tampón B, se añadieron 100 pL de solución sustrato (TMB, Dade Behring, OUVF) por pocillo y se incubaron durante 30 minutos a la temperatura ambiente en la oscuridad. La adición de 100 pl de solución de parada sin diluir (Dade Behring, OSFA) preparó las muestras para lectura en un lector de microplacas adecuado a longitud de onda de 450 nm. Las concentraciones de las muestras de test se calcularon luego utilizando la curva estándar con plasma humano estándar como referencia.

Ejemplo 6: Comparación de la ratio actividad de FIX/antígeno de FIX de diferentes proteínas de fusión FIX-albúmina en el sobrenadante de cultivo de células

Sobrenadantes de cultivo celular de células HEK transfectadas con constructos de DNA que codificaban proteínas de fusión FIX-albúmina que contenían péptidos enlazadores diferentes se sometieron a tests de actividad y antígeno de FIX como se ha descrito arriba (véase ejemplo 5). Se calculó la ratio de FIX:C a FIX:Ag, que representaba una medida directamente proporcional a la actividad molar específica de los diferentes constructos.

Los resultados presentados en la Tabla 4 indican que se produce un aumento en la ratio actividad/antígeno después de la introducción de enlazadores escindibles en la molécula FIX-HSA. Se muestra también que el péptido enlazador escindible debería tener una longitud mayor que dos aminoácidos a fin de proporcionar ratios actividad/antígeno claramente aumentadas.

Tabla 4: Ratios FIX:C/FIX:Ag de proteínas de fusión FIX-albúmina que contienen péptidos enlazadores diferentes

(continuación)

Ejemplo 7: Comparación de las proteínas de fusión FIX y FlX-albúmina con respecto a actividad molar específica, semivida terminal in vivo y recuperación in vivo en ratas o conejos

Proteínas de fusión tipo salvaje recombinantes purificadas FIX (rFIX 496/797) y FlX-albúmina (rFIX 980/797, rFIX 986/797, rFIX- 1088/797 y rFIX 1089/797) se testaron respecto a actividad de FIX en un ensayo de formación de coágulo como se ha descrito arriba. En paralelo, se determinó la diferencia de densidad óptica a 280 y 320 nm como medida de la concentración de proteína (DO280-320). Se calcularon las ratios de actividad por DO280-320 y, basándose en las densidades ópticas molares, se calcularon las actividades molares específicas. En la Tabla 5 siguiente se resumen los resultados.

Tabla 5: Actividades molares específicas de FIX tipo salvaje comparada con las fusiones FIX-albúmina

Teniendo en cuenta los resultados resumidos en la Tabla 5, es sorprendente que dos constructos que se generaron de acuerdo con la presente invención exhiben actividades molares específicas muy aumentadas comparados con las proteínas de fusión con enlazadores no-escindibles. Adicionalmente, la actividad molar específica de estos constructos era sólo moderadamente reducida comparada con rFIX tipo salvaje.

Investigaciones in vitro de las reacciones de escisión proteolítica por el Factor XIa (FXIa) confirmaron que las proteínas de fusión FIX-albúmina que contienen un enlazador escindible como por ejemplo el constructo No. 1088/797 ó 1089/797 están activadas y, en paralelo, el enlazador se escinde dando como resultado la liberación del resto albúmina (Fig. 1). La proteína de fusión con enlazador no-escindible no exhibía una liberación correspondiente del resto albúmina.

En el caso de FVIIa como proteasa de escisión en presencia de Factortisular, las proteínas de fusión FlX-albúmina 1088/797 o 1089/797 que contenían un enlazador escindible exhibían también liberación del resto albúmina en paralelo con la liberación del péptido de activación de FIX (datos no presentados).

Además de la determinación de la actividad molar específica de coagulación, los polipéptidos número 496/797, 980/797, 986/797, 1088/797 y 1089/797 descritos anteriormente se administraron por vía intravenosa a ratas CD / Lewis (6 ratas por sustancia) y/o conejos (4 conejos por sustancia) con una dosis de 50 UI/kg de peso corporal. Se extrajeron muestras de sangre antes de la administración de la sustancia de test y a intervalos apropiados comenzando a los 5 minutos después de la administración de las sustancias de test. El contenido de antígeno de FIX se cuantificó subsiguientemente por un ensayo ELISA específico para Factor IX humano (véase anteriormente). Los valores medios de los grupos respectivos se utilizaron para calcular la recuperación in vivo al cabo de 5 minutos. Se calcularon las semividas para cada proteína utilizando los valores puntuales de la fase beta de eliminación (semivida terminal) conforme a la fórmula t-i/2 = ln2/k, en donde k es la pendiente de la línea de regresión obtenida representando los niveles FIX:Ag en escala logarítmica y el tiempo en escala lineal.

Las semividas in vivo calculadas se resumen en la Tabla 6. Se encontró que tanto en las ratas como en los conejos las semividas in vivo de las proteínas de fusión FIX-albúmina aumentaban significativamente en comparación con el FIX recombinante tipo salvaje no fusionado preparado en el laboratorio de los inventores o en comparación con el producto FIX recombinante disponible comercialmente BeneFIX®. Las semividas in vivo de las proteínas de fusión de albúmina comparadas con BeneFIX® se incrementaban a aproximadamente 200-400%, dependiendo de la especie animal o constructo utilizado (Tabla 6).

Para evaluar la recuperación in vivo, los niveles de antígeno de FIX medidos por ml de plasma a sus concentraciones máximas después de administración intravenosa (t = 5 min) estaban relacionados con la cantidad de producto aplicada por kg. Alternativamente, se calculó un porcentaje relacionando el nivel de antígeno determinado (UI/ml) 5 min después de la infusión con el nivel teórico de producto esperado para 100% de recuperación (producto aplicado por kg dividido por un volumen supuesto de plasma de 40 ml por kg). Las recuperaciones in vivo (IVR) de las proteínas de fusión FIX-albúmina eran significativamente mayores que las recuperaciones in vitro de rFIX (496/797) o BeneFIX® (Tabla 7).

Tabla 6:

Tabla 7:

Ejemplo 8: Activación in vitro de proteínas de fusión FlX-albúmina con/sin enlazador escindible (1088/797 y 980/797) y determinación de la farmacocinética en ratas

Proteínas de fusión FlX-albúmina y rec FIX se activaron in vitro utilizando Factor Xla disponible comercialmente (Kordia). Resumidamente, se activaron cantidades molares idénticas de proteína de fusión FIX o FIX-albúmina (3,0 x 10-6 moles/litro) a 37 °C en solución en presencia de FXIa (1,9 x 10-8 mol/litro) y CaCh (1,5 mmol/litro) tamponada a pH 6,8. Después de activación completa como se mostró por SDS-PAGE, la reacción se paró por adición de un exceso molar 5 x de inhibidor C1 (Berinert P) basado en la cantidad de FXIa. Las muestras se guardaron congeladas por debajo de -70 °C hasta el comienzo de la investigación farmacocinética.

Se realizó una investigación farmacocinética de las proteínas de fusión FIX y FIX-albúmina activadas en ratas como se describe en el ejemplo 7 y los resultados se compararon con un resultado farmacocinético que abarcaba proteínas de fusión no activadas.

Se encontró que las proteínas de fusión activadas demostraban semividas, así como valores AUC significativamente reducidos comparadas con las moléculas no activadas (Figura 2). Después de la activación, la proteína de fusión FIX con enlazador escindible (1088/797) exhibía un comportamiento farmacocinético muy similar a rec FIX activada (BeneFIX), mientras que la proteína de fusión activada con enlazador no-escindible (980/797) daba como resultado una semivida mayor tanto inicial como terminal comparada con la proteína de fusión activada 1088/797 con enlazador escindible. Por tanto, los resultados demuestran claramente que el enlazador escindible da como resultado la eliminación aumentada del factor de coagulación después de la activación y, por consiguiente, evita la acumulación de proteínas de fusión activadas potencialmente trombógenas con semividas aumentadas.

Ejemplo 9: comparación de las proteínas de fusión FIX-albúmina con/sin enlazador escindible con respecto a la velocidad de desactivación de los factores de coagulación activados por antitrombina III (AT)

Se activaron proteínas de fusión FIX con (1088/797) y sin (980/797) enlazador escindible por incubación con FXIa como se describe en el ejemplo 8. Los factores activados se incubaron con AT durante 120 min y se determinó la actividad residual de FIXa utilizando un procedimiento manual de ensayo de coagulación de FIX sin activación (naPTT, véase más adelante) de acuerdo con Schnitger y Gross. Como muestras de control se utilizaron las proteínas de fusión FIX-albúmina activadas en presencia de la misma cantidad de AT, pero sin incubación.

Se determinó la actividad de FIX con ayuda de un ensayo de tiempo parcial de tromboplastina no-activado (naPTT) utilizando plasma deficiente en FIX de Dade Behring. Las muestras se diluyeron previamente en un tampón de pH 6,8 que contenía His, Gly, sacarosa, y Tween 80. La determinación completa se realizó utilizando coagulómetros de acuerdo con Schnitger & Gross. Una mezcla de 0,1 ml de plasma deficiente en FIX, 0,1 ml de muestra, y 0,1 ml de fosfolípidos al 0,1% (Rhone-Poulenc-Nattermann, prediluidos 1:3 en tampón de imidazol suplementado con 1% HSA) se incubó durante 2 minutos a 37 °C. La reacción de coagulación se inició por adición de 0,1 ml de solución de 0,025 mol/l CaCl2 y se determinó el tiempo de coagulación.

La Figura 3 muestra los resultados de un experimento de desactivación correspondiente. En el caso de la proteína de fusión con enlazador escindible (1088/797) un aumento en el tiempo de coagulación desde 210 a 540 sec (Factor de 2,57x) demostró un proceso de desactivación acelerado de la actividad de FIXa por AT comparado con una proteína de fusión con enlazador no-escindible (980/797) que exhibía solamente un aumento desde 196 a 411 sec (Factor de 2,10x). Muy probablemente, el residuo albúmina afecta estéricamente al proceso de desactivación dependiente de AT en el caso de la proteína de fusión con enlazador no-escindible, mientras que en el caso de la proteína de fusión con enlazador escindible el residuo albúmina se escinde dando como resultado una desactivación acelerada por AT.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Proteína de fusión terapéutica para su uso en el tratamiento o prevención de un trastorno de la coagulación sanguínea que comprende

(a) un factor de coagulación, en el que el factor de coagulación se selecciona de la lista que consiste en Factor IX, Factor VIII, Factor de van Willebrand, Factor V, Factor X, Factor XI, Factor XII, Factor XIII, Factor I, Factor II (Protrombina ), Proteína C, Proteína S, GAS6 y Proteína Z,

(b) un polipéptido potenciador de la semivida, y

(c) un péptido enlazador que une el factor de coagulación y el polipéptido potenciador de la semivida;

en la que el enlazador peptídico se puede escindir mediante proteasas implicadas en la coagulación o se activa mediante enzimas de coagulación y en que la proteína de fusión terapéutica tiene, en comparación con la proteína de fusión terapéutica respectiva, enlazada por un enlazador no escindible que tiene la secuencia de aminoácidos GGGGGGV una tasa de eliminación aumentada del factor de coagulación activado después de que el enlazador peptídico se escinde proteolíticamente en un modo relacionado con la coagulación.

2. La proteína de fusión terapéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha proteína de fusión tiene:

(a) una mayor recuperación in vivo en comparación con la recuperación in vivo del factor de coagulación respectivo que no está fusionado con un polipéptido potenciador de la semivida; y/o

(b) una semivida aumentada en plasma en comparación con la semivida en plasma del factor de coagulación respectivo que no está fusionado con un polipéptido potenciador de la semivida.

3. La proteína de fusión terapéutica para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en la que el factor de coagulación es FIX.

4. La proteína de fusión terapéutica para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en la que el factor de coagulación es FVIII.

5. La proteína de fusión terapéutica para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, en la que el enlazador se puede escindir mediante:

(a) la proteasa o proteasas, que activan el factor de coagulación; y/o

(b) la proteasa o proteasas que se activan tras la participación del factor de coagulación.

6. La proteína de fusión terapéutica para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, en la que el enlazador se puede escindir por FXIa y/o FVIIa/TF.

7. La proteína de fusión terapéutica para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, en la que el polipéptido potenciador de la semivida se selecciona del grupo que consiste en albúmina, polipéptidos de la familia de albúmina e inmunoglobulinas sin dominio de unión al antígeno.

8. La proteína de fusión terapéutica para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, en la que:

(a) la tasa de inactivación del factor de coagulación después de la escisión del enlazador peptídico que enlaza el factor de coagulación al polipéptido potenciador de la semivida aumenta en al menos un 10% en comparación con la tasa de inactivación del factor de coagulación en una fusión terapéutica correspondiente enlazada por un enlazador no escindible que tiene la secuencia de aminoácidos GGGGGGV; y/o

(b) la tasa de eliminación del factor de coagulación después de la escisión del enlazador peptídico que enlaza el factor de coagulación con el polipéptido potenciador de la semivida aumenta en al menos un 10% en comparación con la tasa de eliminación del factor de coagulación en una proteína de fusión terapéutica correspondiente enlazada por un enlazador no escindible que tiene la secuencia de aminoácidos GGGGGGV.

9. La proteína de fusión terapéutica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la proteína de fusión se formula como una composición farmacéutica.

10. La proteína de fusión terapéutica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o la composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 9, en la que el trastorno de la coagulación sanguínea es (a) hemofilia B, o (b) hemofilia A.