ES2910699T3 - Inmunoglobulinas conjugadas con lisina C-terminal - Google Patents

Inmunoglobulinas conjugadas con lisina C-terminal Download PDF

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Jared Spidel
Earl Albone
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Abstract

Un método para generar una inmunoglobulina conjugada, comprendiendo el método: (1) incubar una inmunoglobulina con una transglutaminasa microbiana y un agente funcional que comprende un sustrato donante de acilo, a) en donde la inmunoglobulina comprende al menos un residuo de aminoácido pero menos de 13 residuos de aminoácidos después de una lisina 447 (K447) en una cadena pesada de la inmunoglobulina, en donde los residuos de aminoácidos están numerados de acuerdo con el sistema de numeración de la UE, i) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende un residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el residuo de un aminoácido después de la lisina C-terminal es glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, tirosina, triptófano, serina, treonina, cisteína, asparagina, glutamina o histidina, ii) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende dos residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal es cualquier residuo de aminoácido excepto ácido aspártico, ácido glutámico o prolina; y el segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, iii) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende tres residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, iv) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende cuatro residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, v) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende cinco residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un quinto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el quinto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, o vi) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende menos de 13 residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, el último residuo de aminoácido después de la lisina C- terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, b) en donde el sustrato donante de acilo comprende un residuo de glutamina, y c) en donde el agente funcional es un agente terapéutico o un agente de diagnóstico, en donde la transglutaminasa microbiana conjuga K447 con el residuo de glutamina del sustrato donante de acilo en el agente funcional, o (2) (i) incubar una inmunoglobulina con una transglutaminasa microbiana y un sustrato donante de acilo, a) en donde la inmunoglobulina comprende al menos un aminoácido pero menos de 13 residuos de aminoácidos después de la lisina 447 (K447) en una cadena pesada de la inmunoglobulina, I) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende un residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el residuo de un aminoácido después de la lisina C-terminal es glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, tirosina, triptófano, serina, treonina, cisteína, asparagina, glutamina o histidina, II) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende dos residuos de aminoácido después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el primer residuo de aminoácido después de la lisina C- terminal es cualquier residuo de aminoácido excepto ácido aspártico, ácido glutámico o prolina; y el segundo residuo de aminoácido después de la lisina C- terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, III) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende tres residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, IV) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende cuatro residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, V) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende cinco residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un quinto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el quinto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina o VI) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende menos de 13 residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, el último residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, y b) en donde el sustrato donante de acilo comprende un residuo de glutamina y un grupo reactivo, en donde la transglutaminasa microbiana conjuga K447 con el residuo de glutamina del sustrato donante de acilo, y ii) conjugar un agente funcional con el grupo reactivo del sustrato donante de acilo, en donde el agente funcional es un agente terapéutico o un agente de diagnóstico; opcionalmente, en donde el grupo reactivo del sustrato donante de acilo se conjuga con el agente funcional mediante química de clic, generando con ello la inmunoglobulina conjugada.

Description

DESCRIPCIÓN
Inmunoglobulinas conjugadas con lisina C-terminal
SOLICITUDES RELACIONADAS
La presente solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional de EE.UU. N° 62/269.138, presentada el 18 de diciembre de 2015.
CAMPO TÉCNICO
En esta memoria se proporcionan inmunoglobulinas conjugadas con lisina C-terminal y métodos de crear las mismas.
ANTECEDENTES
Biotechnology Advances, 33, 775-784, (2015) se refiere a métodos para la síntesis de conjugados homogéneos de anticuerpo-fármaco. El documento describe la conjugación de fármacos a residuos de lisina del mAb (siglas inglesas de anticuerpo monoclonal).
Nature Biotechnology, 30, 631-637, (2012) se refiere al descubrimiento y desarrollo de brentuximab vedotina para uso en el linfoma de Hodgkin recidivante y el linfoma anaplásico de células grandes sistémico. El documento describe la conjugación de fármacos enlazados a través de residuos de lisina del mAb.
Pharm Res, 32, 3480-3493, (2015) se refiere a métodos para hacer conjugados homogéneos de anticuerpos y fármacos. El documento menciona la transglutaminación de glutaminas ubicadas en las regiones flexibles de una cadena pesada de IgG.
J. Biochem, 128, 415-425, (2000) se refiere al análisis de la especificidad para el sustrato de transglutaminasa microbiana utilizando inhibidores de proteasa proteica como sustratos de modelo natural. El documento describe estudios destinados a definir la especificidad para el sustrato de MTG de Streptomyces mobaraensis (anteriormente clasificada como streptoverticillium) utilizando homólogos del inhibidor de subtilisina (SSI) de Streptomyces como sustratos.
Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 64, 2608-2613, (2014) se refiere a una comparación de especificidades para el sustrato de transglutaminasas utilizando péptidos sintéticos como donantes de acilo. El documento describe un estudio para identificar los efectos del contexto de la secuencia alrededor del residuo de glutamina en un sustrato sobre el reconocimiento del sustrato por la MTG de Streptoverticilllium mobaraense.
La utilidad de anticuerpos monoclonales se extiende desde la investigación básica hasta las aplicaciones terapéuticas y diagnósticas. La capacidad de conjugar anticuerpos con agentes funcionales amplía adicionalmente su funcionalidad. La fabricación de anticuerpos conjugados implica habitualmente la conjugación de un enlazador, fármaco u otro agente funcional para reactivar residuos de lisina cisteína en las cadenas pesada (HC) y ligera (LC) de un anticuerpo monoclonal (mAb). Véase Deonarain, et al., "Emerging formats for next-generation antibody drug conjugates", Expert Opinion in Drug Discovery (2015), 10(5): 463-481. La conjugación de lisina es mediada típicamente por química basada en succinimida (NHS) o basada en isotiocianato. La conjugación basada en cisteína requiere una reducción parcial del anticuerpo para romper algunos de los enlaces disulfuro entre cadenas, creando con ello cadenas laterales de tiol libres. Los agentes funcionales reactivos con tiol pueden reaccionar luego con los grupos tiol libres en el anticuerpo para generar conjugados de anticuerpo-fármaco (ADCs, por sus siglas en inglés). Ambos métodos dan como resultado la modificación de múltiples lisinas o cisteínas que conducen a mezclas heterogéneas de ADCs con una distribución de relaciones de fármaco a anticuerpo (DAR, por sus siglas en inglés) y modificaciones de fármacos en posiciones aleatorias.
Un impulso reciente para utilizar tecnologías de conjugación específicas para el sitio como una forma de producir un producto de ADC homogéneo con una DAR definida ha producido varios métodos que incluyen la ingeniería de cisteínas desapareadas, la incorporación de aminoácidos no naturales y la modificación enzimática específica para el sitio. Si bien estos métodos proporcionan productos homogéneos, cada uno tiene sus desventajas. La conjugación basada en cisteína requiere una etapa añadida para eliminar una cisteína de remate, glutatión o incluso una cadena ligera de la cisteína no apareada. Véase, p. ej., Junutula, et al., "Site-Specific Conjugation of a Cytotoxic Drug to an Antibody Improves Therapeutic Index", Nature Biotechnology, (2008) 26:925-932; Chen, et al., "Charge-based Analysis of Antibodies with Engineered Cysteines", MAbs (2009) 1(6): 563-571; Gomez, et al., "Effect of temperature, pH, dissolved oxygen, and hydrolysate on the formation of triple light chain antibodies in cell culture" Biotechnol Progress (2010), 26: 1438-1445. Además, se ha demostrado que la inestabilidad sérica de la química basada en maleimida actualmente utilizada para conjugados basados en cisteína genera preocupación por la pérdida de potencia o la toxicidad fuera del objetivo. Alley, et al., "Contribution of Linker Stability to the Activities of Anticancer Immunoconjugates", Bioconjugate Chemistry (2008) 19(3): 759-765; Shen, et al., "Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates", Nature Biotechnology (2012) 30: 184-189. La incorporación de aminoácidos no naturales requiere la expresión en un sistema basado en células modificadas genéticamente o en un sistema libre de células. Hallam, et al., "Unnatural Amino Acids in Novel Antibody Conjugates", Future Med. Chem. (2014) 6(11): 1309-1324. Además, la presencia de un aminoácido no natural podría desencadenar una respuesta inmunogénica en los pacientes. Sin embargo, las modificaciones enzimáticas específicas para el sitio podrían utilizar potencialmente un aminoácido nativo de tipo salvaje en la secuencia del anticuerpo, minimizando con ello la posibilidad de inmunogenicidad. Además, los enlaces post-traduccionales formados típicamente por enzimas modificadoras de proteínas son muy estables.
Se ha explorado la modificación enzimática específica para el sitio de las proteínas utilizando una familia de proteínas denominadas transglutaminasas que catalizan la formación de un enlace isopeptídico estable entre el grupo ycarboxiamida (donante de acilo) de una glutamina y el grupo £-amino (aceptor de acilo) de una lisina (véase la Figura 1) (véase, p. ej., Yokoyama, et al., "Properties and Applications of Microbial Transglutaminase", Appl. Microbiol. Biotech. (2004) 64: 47-454; Strop, "Versatility of Microbial Transglutaminase", Bioconjugate Chemistry, (2014) 25(5): 855-862; Kieliszek et al., "Microbial Transglutaminase and its Application in the Food Industry", Folia Microbiol (2014) 59:241-250). Recientemente, varios grupos han explorado la utilización de transglutaminasa como un medio para producir ADCs (véase, p. ej., Josten et al., "Use of Microbial Transglutaminase for the Enzymatic Biotinylation of Antibodies", J. Immunol Methods, (2000) 240:47-54; Mindt et al., "Modification of Different IgG1 Antibodies via Glutamine and Lysine Using Bacterial and Human Tissue Transglutaminase", Bioconjugate Chemistry (2008) 19(1): 271-278); Jeger, et al., "Site-specific and stoichiometric modification of antibodies by bacterial transglutaminase" Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (2010) 49: 9995-9997; Strop et al., "Location Matters: Site of Conjugation Modulates Stability and Pharmacokinetics of Antibody Drug Conjugates", Chem Biol (2013) 20(2):161 -167; Dennler et al., "Transglutaminase-Based Chemo-Enzymatic Conjugation Approach Yields Homogeneous Antibody-Drug Conjugates", Bioconjugate Chemistry (2014) 25(3): 569-578; Siegmund, et al., "Locked by Design: A Conformationally Constrained Transglutaminase Tag Enables Efficient Site-Specific Conjugation", Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (2015) 54(45):13420-13424). Las transglutaminasas se encuentran en organismos que van desde bacterias hasta seres humanos que están relacionados estructural y funcionalmente, pero cada uno está implicado en procesos celulares específicos. Una transglutaminasa microbiana (transglutaminasa microbiana) aislada de la bacteria Streptomyces mobaraensis se ha utilizado ampliamente en toda la industria alimentaria para reticular proteínas para diversas aplicaciones. Además de su bajo costo de fabricación, es una técnica de conjugación atractiva debido a su capacidad de funcionar en un amplio intervalo de condiciones de pH, sal y temperatura.
A pesar de más de dos décadas de investigación, la especificidad para el sustrato de la transglutaminasa microbiana no se ha definido claramente. En general, tienden a preferirse glutaminas o lisinas en bucles expuestos con residuos adyacentes hidrófobos o cargados positivamente. Véase, Taguchi et al., "Substrate specificity analysis of microbial transglutaminase using proteinaceous protease inhibitors as natural model substrates", J. Biochem. (2000) 128:415-425; Sugimura et al., "Identification of preferred substrate sequences of microbial transglutaminase from Streptomyces mobaraensis using a phage-displayed peptide library", Arch. Biochem. Biophys. (2008) 477:379-383; Tagami et al., "Substrate specificity of microbial transglutaminase as revealed by three-dimensional docking simulation and mutagenesis", Protein Eng. Des Sel. (2009) 22:747-752. Se ha encontrado que el contexto de la glutamina donante de acilo es más crítico que el del aceptor de acilo lisina. Véase, p. ej., Ohtsuka et al., "Substrate specificities of microbial transglutaminase for primary amines", J. Agric. Food Chem. (2000) 48: 6230-6233; Ohtsuka et al., "Comparison of substrate specificities of transglutaminases using synthetic peptides as acyl donors", Biosci. Biotechnol. Biochem. (2000) 64: 2608-2613; Gundersen et al., "Microbial transglutaminase displays broad acyl-acceptor substrate specificity", Appl. Microbiol. Biotechnol. (2013) 98:219-230.
Debido a una menor especificidad para la amina aceptora de acilo por parte de la transglutaminasa microbiana, la investigación hasta ahora se ha centrado solo en la transamidación de los residuos de glutamina del anticuerpo. Véase, Josten et al., Mindt et al., Jeger et al., Strop et al., Dennler et al. y Siegmund et al., arriba referenciados. La IgG humana se compone de un promedio de 80 lisinas, de las cuales se prevé que entre el 80 % y el 90 % estén expuestas a disolventes (Gautier et al., "Lysine Conjugated Properties in Human IgGs Studied by Integrating High-Resolution Native Mass Spectrometry and Bottom-Up Proteomics", Proteomics (2015) 15(16):2756-2765; datos no mostrados), y el codón C-terminal de IgG1, IgG2, IgGs e IgG4 es una lisina (Ellison et al., d Na (1981) 1:11-18; Ellison et al.. ("Ellison et al. 2"), Proc. Nat. Acad. Sci. USA, (1982) 79:1984-1988; Ellison et al., Nucleic Acid Res. (1982) 10:4071-4079). Sin embargo, la IgG derivada del suero carece de lisina (Wang et al., J. Immunol. (1980) 125:1048-1054; Edelman et al., Proc Natl Acad. Sci. USA (1969) 63:78-85; Frangione et al, Biochemistry (1980) 19:4304-4308; Pink et al., Biochem. J. (1970) 117:33-47). Lo mismo se ha observado para IgD (White et al., Science (1985) 228:733-737; Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1981) 78:504-508; Shinoda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981) 78:785-789). La expresión recombinante de IgG 1 en células HEK293 y CHO también da como resultado una proteína que carece de Lys447 C-terminal (Ellison et al.; Harris et al., Eur. J. Biochem. (1990) 194:611-620; Harris, J. Chromatogr. A (1995) 705:129-134; Dick et al., Biotechnol. Bioeng. (2008) 100:1132-1143).
Hasta la fecha, los expertos ordinarios en la técnica pensaban que utilizar un sustrato basado en un donante de amina para transamidar una lisina podría proporcionar un producto ADC heterogéneo debido a la plétora de lisinas reactivas en la superficie de una IgG (Josten et al y Jeger et al.) y, por lo tanto, se desaconseja el uso de un sustrato basado en un donante de amina para transamidar residuos de lisina en las inmunoglobulinas.
Por lo tanto, existe la necesidad de modificaciones enzimáticas específicas para el sitio de inmunoglobulinas para crear conjugados que tengan una tasa de conjugación predecible. Esto permitirá la creación de ADCs con una DAR relativamente homóloga.
SUMARIO
La presente invención describe sorprendentemente que, si bien no se observó modificación alguna de las lisinas de inmunoglobulina de tipo salvaje por parte de la transglutaminasa microbiana, cuando un residuo de lisina de inmunoglobulina C-terminal se protegió de la escisión por parte de carboxipeptidasas utilizando una extensión de aminoácido C-terminal, la transglutaminasa microbiana era capaz de utilizar la lisina C-terminal nativa como un aceptor de acilo. Sorprendentemente, la conjugación de la lisina C-terminal utilizando transglutaminasa microbiana condujo a la incorporación predecible y específica para el sitio de agentes funcionales conjugados.
En un aspecto, en esta memoria se describe un método para generar una inmunoglobulina conjugada, comprendiendo el método incubar una inmunoglobulina con una transglutaminasa microbiana y un agente funcional que comprende un sustrato donante de acilo, a) en donde la inmunoglobulina comprende al menos un residuo de aminoácido pero menos de 13 residuos de aminoácidos después de una lisina 447 (K447) en una cadena pesada de la inmunoglobulina, en donde los residuos de aminoácidos están numerados de acuerdo con el sistema de numeración de la UE, i) en donde cuando la inmunoglobulina comprende un residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el residuo de un aminoácido después de la lisina C-terminal es glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, tirosina, triptófano, serina, treonina, cisteína, asparagina, glutamina o histidina, ii) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende dos residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal es cualquier residuo de aminoácido excepto ácido aspártico, ácido glutámico o prolina; y el segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, iii) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende tres residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, iv) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende cuatro residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, v) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende cinco residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un quinto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el quinto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, o vi) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende menos de 13 residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, el último residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, b) en donde el sustrato donante de acilo comprende un residuo de glutamina, y c) en donde el agente funcional es un agente terapéutico o un agente de diagnóstico, en donde la transglutaminasa microbiana conjuga K447 con el residuo de glutamina del sustrato donante de acilo en el agente funcional, o (2) i) incubar una inmunoglobulina con una transglutaminasa microbiana y un sustrato donante de acilo, a) en donde la inmunoglobulina comprende al menos un aminoácido pero menos de 13 residuos de aminoácidos después de la lisina 447 (K447) en una cadena pesada de la inmunoglobulina, I) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende un residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el residuo de un aminoácido después de la lisina C-terminal es glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, tirosina, triptófano, serina, treonina, cisteína, asparagina, glutamina o histidina, II) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende dos residuos de aminoácido después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal es cualquier residuo de aminoácido excepto ácido aspártico, ácido glutámico o prolina; y el segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, III) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende tres residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, IV) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende cuatro residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, V) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende cinco residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un quinto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el quinto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina o VI) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende menos de 13 residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, el último residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, y b) en donde el sustrato donante de acilo comprende un residuo de glutamina y un grupo reactivo, en donde la transglutaminasa microbiana conjuga K447 con el residuo de glutamina del sustrato donante de acilo, y ii) conjugar un agente funcional con el grupo reactivo del sustrato donante de acilo, en donde el agente funcional es un agente terapéutico o un agente de diagnóstico; opcionalmente, en donde el grupo reactivo del sustrato donante de acilo se conjuga con el agente funcional mediante química de clic, generando con ello la inmunoglobulina conjugada.
En otro aspecto, en esta memoria se describe una inmunoglobulina conjugada que comprende una inmunoglobulina y un agente funcional, en donde a) la inmunoglobulina comprende al menos un residuo de aminoácido pero menos de 13 residuos de aminoácidos después de la Lisina 447 (K447) en una cadena pesada de la inmunoglobulina, en donde los residuos de aminoácidos se numeran de acuerdo con el sistema de numeración de la UE, i) en donde cuando la inmunoglobulina comprende un residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el residuo de un aminoácido después de la lisina C-terminal es glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, tirosina, triptófano, serina, treonina, cisteína, asparagina,
glutamina o histidina, ii) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende dos residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal es cualquier residuo de aminoácido excepto ácido aspártico, ácido glutámico o prolina; y el segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, iii) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende tres residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, iv) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende cuatro residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, v) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende cinco residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un quinto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el quinto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, o vi) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende menos de 13 residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, el último residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, y b) el agente funcional comprende un sustrato donante de acilo, en donde el sustrato donante de acilo comprende un residuo de glutamina, y c) el agente funcional es un agente terapéutico o un agente de diagnóstico, en donde K447 se conjuga con el residuo de glutamina del sustrato donante de acilo; o en donde a) la inmunoglobulina comprende al menos un residuo de aminoácido pero menos de 13 aminoácidos después de Lisina 447 (K447) en una cadena pesada de la inmunoglobulina, i) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende un residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el residuo de un aminoácido después de la lisina C-terminal es glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, tirosina, triptófano, serina, treonina, cisteína, asparagina, glutamina o histidina, ii) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende dos residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal es cualquier residuo de aminoácido excepto ácido aspártico, ácido glutámico o prolina; y el segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, iii) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende tres residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, iv) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende cuatro residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, v) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende cinco residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un quinto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el quinto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina o vi) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende menos de 13 residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, el último residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, b) K 447 se conjuga a un residuo de glutamina en un sustrato donante de acilo, en donde el sustrato donante de acilo comprende, además, un grupo reactivo, y c) el grupo reactivo se conjuga a un agente funcional, en donde el agente funcional es un agente terapéutico o un agente de diagnóstico.
En una realización, el agente funcional que comprende el sustrato donante de acilo está de acuerdo con una fórmula (I) o (II):
(Z)m-Gln-(L)n-(Y) (I)
(Y)-(L)n-Gln-(Z)m (II)
en donde Z es un grupo carboxilbenciloxi (CBZ) o un residuo de aminoácido; Gln es un residuo de aminoácido de glutamina; cada uno de los L es independientemente un enlazador lineal o ramificado de 1 a 20 átomos de carbono, en donde uno o más de los átomos de carbono pueden estar opcional e independientemente reemplazados por un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre, y en donde cada uno de los átomos de carbono y nitrógeno puede estar opcionalmente sustituido; o cada uno de los L es opcional e independientemente un residuo de aminoácido; m es un número entero de 0 a 5; n es un número entero de 0 a 5; e Y es un agente funcional.
En una realización, el agente funcional que comprende el sustrato donante de acilo está de acuerdo con la fórmula (I), y en donde Z es un grupo CBZ; en donde L es un resto de polietilenglicol (PEG) (-O((CH2)2)-), etil amina (-NH((CH2)2)-) o propil amina (-NH((CH2)3)-); y en donde n es 0, 1,2 o 3. En una realización, L es un resto de polietilenglicol (PEG). En otra realización, L comprende uno o más aminoácidos y un resto de polietilenglicol (PEG). En otra realización, el agente funcional que comprende el sustrato donante de acilo está de acuerdo con la fórmula (I), en donde Z es un grupo CBZ y en donde L es un aminoácido. En una realización, L es Gly; m es 1; y n es 1. En otra realización, el agente funcional que comprende el sustrato donante de acilo está de acuerdo con la fórmula (II), en donde Z es un grupo CBZ; m es 1; n es 2, 3 o 4; y al menos un L es Gly; y al menos un L es un resto de PEG. En una realización adicional, el agente funcional que comprende el sustrato donante de acilo está de acuerdo con la fórmula (II), en donde Z es un grupo CBZ; m es 1; n es 4; un L es Gly y los tres grupos L restantes son cada uno restos de PEG.
En una realización, el sustrato donante de acilo está de acuerdo con una de las Fórmulas (III) o (IV):
(Z)m-Gln-(L)n-(X) (III)
(X)-(L)n-Gln-(Z)m (IV)
en donde Z es un grupo carboxilbenciloxi (CBZ) o un residuo de aminoácido; Gln es un residuo de aminoácido de glutamina; cada uno de los L es independientemente un enlazador lineal o ramificado de 1 a 20 átomos de carbono, en donde uno o más de los átomos de carbono pueden estar opcional e independientemente reemplazados por un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre, y en donde cada uno de los átomos de carbono y nitrógeno puede estar opcionalmente sustituido; o cada uno de los L es opcional e independientemente un residuo de aminoácido; m es un número entero de 0 a 5; n es un número entero de 0 a 5; y X es un grupo reactivo.
En una realización, L es un resto de polietilenglicol (PEG). En otra realización, cuando n es 2-5, al menos un L comprende uno o más aminoácidos y otro L es un resto de polietilenglicol (PEG). En una realización, el sustrato donante de acilo está de acuerdo con la fórmula (III), y en donde Z es un grupo CBZ; en donde L es un resto de polietilenglicol (PEG) (-O((CH2)2)-), etil amina (-NH((CH2)2)-) o propil amina (-NH((CH2)3)-); y en donde n es 0, 1, 2 o 3. En otra realización, el sustrato donante de acilo está de acuerdo con la fórmula (III), en donde Z es un grupo CBZ y en donde L es un aminoácido. En una realización, L es Gly; n es 1; y m es 1. En otra realización, el sustrato donante de acilo está de acuerdo con la fórmula (IV), en donde Z es un grupo CBZ; m es 1; n es 1, 2 o 3; y al menos un L es Gly.
En otra realización, X es un grupo reactivo seleccionado del grupo que consiste en (1 R,8S,9s)-biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilmetanol (BCN),
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(DBCO), trans-cicloocteno (TCO), azido (N3), alquino, tetrazina, metilciclopropeno, norborneno, hidrazida/hidrazina y aldehído.
En una realización, el agente terapéutico es un anticuerpo o una parte del mismo que se une al antígeno, un agente quimioterapéutico, un agente farmacológico, un agente radiactivo, un agente citotóxico, un antibiótico, una molécula pequeña, un ácido nucleico o un polipéptido. En otra realización, el agente de diagnóstico es un fluoróforo, un colorante fluorescente, un radionucleido o una enzima.
En una realización, la inmunoglobulina tiene dos residuos de aminoácido después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal. En una realización, el primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal es cualquier residuo de aminoácido excepto ácido aspártico, ácido glutámico o prolina, y en donde el segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina. En otra realización, el primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal es lisina o arginina. En otra realización, el primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, lisina, cisteína, triptófano, arginina, serina y glicina.
En una realización, la inmunoglobulina tiene tres residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, en donde el tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina. En una realización, el primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal no es ácido aspártico, ácido glutámico o prolina. En una realización, el primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, lisina, cisteína, triptófano, arginina, serina y glicina. En una realización, el segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal no es ácido aspártico, ácido glutámico o prolina. En una realización, el segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, lisina, cisteína, triptófano, arginina, serina y glicina.
En una realización, la inmunoglobulina tiene cuatro residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, en donde el cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina. En una realización, el primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal no es ácido aspártico, ácido glutámico o prolina. En una realización, el primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, lisina, cisteína, triptófano, arginina, serina y glicina. En una realización, el segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal no es ácido aspártico, ácido glutámico o prolina. En una realización, el segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, lisina, cisteína, triptófano, arginina, serina y glicina. En una realización, el tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal no es ácido aspártico, ácido glutámico o prolina. En una realización, el tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, lisina, cisteína, triptófano, arginina, serina y glicina.
En una realización, la inmunoglobulina tiene cinco residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un quinto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, en donde el quinto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina. En una realización, el primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal no es ácido aspártico, ácido glutámico o prolina. En una realización, el primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, lisina, cisteína, triptófano, arginina, serina y glicina. En una realización, el segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal no es ácido aspártico, ácido glutámico o prolina. En una realización, el segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, lisina, cisteína, triptófano, arginina, serina y glicina. En una realización, el tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal no es ácido aspártico, ácido glutámico o prolina. En una realización, el tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, lisina, cisteína, triptófano, arginina, serina y glicina. En una realización, el cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal no es ácido aspártico, ácido glutámico o prolina. En una realización, el cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, lisina, cisteína, triptófano, arginina, serina y glicina.
En una realización, la inmunoglobulina tiene menos de 9 residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, y en donde el último residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina.
En una realización, la inmunoglobulina tiene menos de 13 residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, y en donde el último residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina.
En una realización, la transglutaminasa microbiana es de Streptomyces mobarensis.
En una realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina IgG1. En otra realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina IgG2, IgG3 o IgG4. En una realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina IgA1, una inmunoglobulina IgA2 o una inmunoglobulina IgM que no comprende un trozo de cola. En una realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina IgD o IgE.
En una realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana o una inmunoglobulina humanizada. En una realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina quimérica o una inmunoglobulina no humana.
En una realización, la inmunoglobulina comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. En una realización, no hay entrecruzamiento intramolecular entre las dos cadenas pesadas de la inmunoglobulina.
En una realización, la relación de agente funcional a inmunoglobulina es de 1:1 a 2:1.
En una realización, el agente funcional es un anticuerpo, o una parte del mismo que se une al antígeno, y en donde la inmunoglobulina y el agente funcional se unen al mismo antígeno o se unen a diferentes antígenos.
En esta memoria se describe un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina conjugada. En esta memoria se describe un plásmido que comprende un ácido nucleico. En esta memoria se describe una célula aislada que comprende un plásmido.
En otro aspecto, en esta memoria se describe una composición farmacéutica que comprende una inmunoglobulina conjugada y un soporte farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto, en esta memoria se describe una inmunoglobulina conjugada producida por cualquiera de los métodos descritos en esta memoria.
En una realización, el método comprende, además, una etapa de purificación de la inmunoglobulina conjugada con el residuo de glutamina del sustrato donante de acilo antes de conjugar el agente funcional con el grupo reactivo del sustrato donante de acilo. En una realización, la etapa de purificación comprende métodos basados en el tamaño, tales como cromatografía o diafiltración. En otra realización, la etapa de purificación incluye la separación basada en la carga, tal como cromatografía de intercambio de aniones o de intercambio de cationes. En otra realización, la etapa de purificación comprende una etapa basada en la afinidad, tal como cromatografía de Proteína A o Proteína G. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
El sumario, así como la siguiente descripción detallada, se entienden mejor cuando se leen junto con los dibujos adjuntos. Con el fin de ilustrar los métodos descritos y las inmunoglobulinas conjugadas, en los dibujos se muestran realizaciones ejemplares; sin embargo, los métodos y las inmunoglobulinas conjugadas no se limitan a las realizaciones específicas descritas. En los dibujos:
FIG. 1, muestra una reacción de transglutaminasa, en donde la transglutaminasa cataliza la formación de un enlace isopeptídico entre una glutamina donante de acilo y una lisina aceptora de acilo con liberación de una molécula de amoníaco.
FIG. 2, muestra las estructuras de sustratos donantes de acilo Z-Gln-Gly ejemplares.
FIG.3, muestra rutas posibles para sintetizar algunos de los sustratos donantes de acilo Z-Gln-Gly ejemplares.
FIG. 4, que comprende las FIGS. 4A, 4B, and 4C, muestra lisinas expuestas a disolvente en estructuras cristalinas Fab y Fc de IgG1 humana; (A) Fab VH-CH1 y Vk-Ck, (B) Fab VH-CH1 y VA-CA, y (C) Fc CH2 y CH3 se determinaron utilizando Discovery Studio 4.5 con un radio de sonda de 1,4 Á y resaltados en amarillo.
FIG. 5, muestra secuencias de dominios constantes de IgG1 humana (SEQ ID NO: 40), kappa (SEQ ID NO: 41), y lambda (SEQ ID NO: 42). Las lisinas de dominio constante expuestas a disolvente basadas en 1FC1 (Fcy), 4F3F (CH1 y Ck) y 4HK0 (CA) están resaltadas en rojo; las lisinas dentro de los bucles están subrayadas. Los dominios constantes se numeran de acuerdo con el sistema de numeración de la UE. FIG. 6, que comprende las FIGS. 6A, 6B, 6C, 6D, 6E y 6F, muestra el análisis ESI-MS de anticuerpos incubados con un donante de acilo y transglutaminasa microbiana. Los anticuerpos se incubaron con un exceso molar de 50 veces Z-Gln-Gly-CAD-biotina y 1 U/mL de transglutaminasa microbiana durante la noche a 37 °C. Después de la digestión y reducción de IdeS, las masas de LC, Fd y Fc se determinaron mediante ESI-MS.
FIG. 7 muestra el análisis ESI-MS de las reacciones de transglutaminasa microbiana del Anticuerpo 01 y K-Tag. Los mAbs se incubaron con Z-Gln-Gly-CAD-biotina y transglutaminasa microbiana durante la noche a 37 °C. Después de la desglicosilación y reducción, las masas de HC y LC de (A) Anticuerpo 01, (B) Anticuerpo 01-HC-KTag y (C) Anticuerpo 01-LC-KTag se determinaron mediante ESI-MS.
FIG. 8, que comprende las FIGS. 8A, 8B y 8C, ilustra el análisis ESI-MS de extensiones C-terminales del Anticuerpo 01. (A) Anticuerpo 01 MAbs, (B) Anticuerpo 01-L y (C) Anticuerpo 01-LL se incubaron con Z-Gln -Gly-CAD-biotina y transglutaminasa microbiana durante la noche a 37 °C y las masas se analizaron mediante ESI-MS como en la Figura 7.
FIG. 9, que comprende las FIGS. 9A-9B, ilustra la conjugación de fármacos en una sola etapa con Lys447. (A) Anticuerpo 01-L y (B) Anticuerpo 01-L incubados con Z-Gln-Gly-PEG2-AuF y transglutaminasa microbiana a 37 °C durante la noche se digirieron con IdeS y se redujeron con DTT para generar fragmentos LC, Fd y Fc. La absorbancia a 280 nm (AU280) y la corriente iónica total (TIC, por sus siglas en inglés) de las muestras se controlaron mediante LC-MS de fase inversa como en los Métodos.
FIG. 10, muestra SDS-PAGE de mAbs diméricos. El anticuerpo 01-L transamidado con Z-Gln-Gly-N3 o Z-Gln-Gly-PEG3-BCN se mezcló y se incubó durante la noche a 22 °C. Las muestras se redujeron y analizaron por SDS-PAGE utilizando un gel de poliacrilamida Bis-Tris al 4-12 %. La masa del dímero HC-HC es de aproximadamente 110 kDa.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Los métodos y las inmunoglobulinas conjugadas descritos pueden entenderse más fácilmente con referencia a la siguiente descripción detallada tomada en relación con las figuras adjuntas, que forman parte de esta divulgación. Debe entenderse que los métodos y las inmunoglobulinas conjugadas descritos no se limitan a las realizaciones específicas descritas y/o mostradas en esta memoria, y que la terminología utilizada en esta memoria tiene el propósito de describir realizaciones particulares solo a modo de ejemplo y no pretende ser limitante de los métodos o inmunoglobulinas conjugadas reivindicados.
A menos que se indique específicamente lo contrario, cualquier descripción de un posible mecanismo o modo de acción o razón de la mejora pretende ser solo ilustrativa, y los métodos y las inmunoglobulinas conjugadas descritos no deben estar limitados por la corrección o incorrección de cualquier mecanismo o modo de acción o motivo de mejora sugerido.
A lo largo de este texto, las descripciones se refieren a inmunoglobulinas conjugadas y a métodos para generarlas. En los casos en los que la divulgación describa o reivindique una característica o realización asociada con una inmunoglobulina conjugada, una característica o realización de este tipo es igualmente aplicable a los métodos para generar la misma. Asimismo, cuando la divulgación describa o reivindique una característica o realización asociada con un método de generar una inmunoglobulina conjugada, una característica o realización de este tipo es igualmente aplicable a la inmunoglobulina conjugada.
La referencia a un valor numérico particular incluye al menos ese valor particular, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Cuando se expresa un intervalo de valores, otra realización incluye desde un valor particular y/o hasta el otro valor particular. Además, la referencia a valores establecidos en intervalos incluye todos y cada uno de los valores dentro de ese intervalo. Todos los intervalos son inclusivos y combinables.
Cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del antecedente "aproximadamente", se entenderá que el valor particular forma otra realización.
Debe apreciarse que determinadas características de los métodos e inmunoglobulinas conjugadas descritos que, para mayor claridad, se describen en esta memoria en el contexto de realizaciones separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una única realización. A la inversa, diversas características de los métodos y las inmunoglobulinas conjugadas descritos que, por razones de brevedad, se describen en el contexto de una sola realización, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier sub-combinación.
Tal como se utiliza en esta memoria, las formas en singular "un", "una" y "el", “la” incluyen el plural.
A lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones se utilizan diversos términos y expresiones relacionados con aspectos de la descripción. A términos y expresiones de este tipo se les debe dar su significado ordinario en la técnica, a menos que se indique lo contrario. Otros términos y expresiones específicamente definidos deben interpretarse de manera consistente con las definiciones proporcionadas en esta memoria.
El término "aproximadamente", cuando se utiliza en referencia a intervalos numéricos, cortes o valores específicos, se utiliza para indicar que los valores indicados pueden variar hasta en un 10 % del valor indicado. Por lo tanto, el término "aproximadamente" se utiliza para abarcar variaciones de ± 10 % o menos, variaciones de ± 5 % o menos, variaciones de ± 1 % o menos, variaciones de ± 0,5 % o menos, o variaciones de ± 0,1 % o menos del valor especificado.
"Aminoácido de carácter ácido" se refiere a un aminoácido que exhibe una carga negativa a pH fisiológico. Aminoácidos hidrófobos codificados genéticamente incluyen aspartato, glutamato, asparagina y glutamina.
La expresión "sustrato donante de acilo" se refiere a un grupo con un grupo acilo terminal en él. Preferiblemente, el "sustrato donante de acilo" comprende un residuo de glutamina. Un sustrato donante de acilo puede contener opcionalmente un grupo reactivo adicional. En una primera realización, el sustrato donante de acilo está conectado covalentemente a un agente funcional. En una segunda realización, el sustrato donante de acilo no está conectado covalentemente a un agente funcional. En una realización, el sustrato donante de acilo comprende un residuo de glutamina y un grupo reactivo. En otra realización, el sustrato donante de acilo comprende uno o más enlazadores, como se describe más adelante en esta memoria. En cualquiera de las realizaciones anteriores, existe opcionalmente un enlazador entre el sustrato donante de acilo y el agente funcional o entre el sustrato donante de acilo y el grupo reactivo.
El término "anticuerpo", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere ampliamente a cualquier molécula de inmunoglobulina (Ig) compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L). El término "anticuerpo", tal como se utiliza en esta memoria, también se refiere a cualquier porción de unión a antígeno, mutante, variante o derivado de una molécula de inmunoglobulina, que conserva las características esenciales de unión al epítopo de una molécula de Ig. Formatos de anticuerpos mutantes, variantes o derivados de este tipo son conocidos en la técnica y sus realizaciones no limitantes se discuten en esta memoria. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico. En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo no humano.
En un anticuerpo de longitud completa, cada una de las cadenas pesadas se compone de una región variable de la cadena pesada (abreviada en esta memoria como HCVR o VH) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada está compuesta por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada una de las cadenas ligeras se compone de una región variable de la cadena ligera (abreviada en esta memoria como LCVR o VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está compuesta por un dominio, CL. Las regiones VH y VL se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR, por sus siglas en inglés). Cada una de las VH y VL se compone de tres CDRs y cuatro FRs, dispuestos desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (p. ej., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase.
La expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo"), tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Realizaciones de anticuerpos de este tipo también pueden ser formatos biespecíficos, doblemente específicos o multi-específicos; específicamente, unión a dos o más antígenos diferentes. Ejemplos de fragmentos de unión abarcados por la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab’)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546, Winter et al., publicación PCT WO 90/05144 A1), que comprende un solo dominio variable; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, pueden unirse utilizando métodos recombinantes mediante un enlazador sintético que les permite formar como una única cadena proteica en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véase, p. ej., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Anticuerpos de cadena sencilla de este tipo también pretenden estar abarcados por la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. También quedan abarcadas otras formas de anticuerpos de cadena sencilla tales como los diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes y biespecíficos en los que los dominios VH y VL se expresan en una sola cadena polipeptídica, pero utilizando un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, lo que obliga a los dominios a emparejarse con dominios complementarios. de otra cadena y creando dos sitios de unión al antígeno (véase, p. ej., Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123). Porciones de unión a anticuerpos de este tipo son conocidas en la técnica (Kontermann y Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. Nueva York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5).
"Aminoácido de carácter básico" se refiere a un aminoácido que exhibe una carga positiva a pH fisiológico. Aminoácidos hidrófobos codificados genéticamente incluyen histidina, lisina y arginina.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "muestra biológica" se refiere a una muestra obtenida de un sujeto, incluida una muestra de tejido biológico o de origen fluido obtenida in vivo o in vitro. Muestras de este tipo pueden ser, pero no se limitan a, fluidos corporales (p. ej., sangre, plasma sanguíneo, suero, leche, líquido cefalorraquídeo, ascitis u orina), órganos, tejidos, fracciones y células aisladas de mamíferos, incluyendo seres humanos. Las muestras biológicas también pueden incluir secciones de la muestra biológica que incluyen tejidos (p. ej., porciones de secciones de un órgano o tejido). Muestras biológicas también pueden incluir extractos de una muestra biológica, por ejemplo, un antígeno de un fluido biológico (p. ej., sangre u orina).
La expresión "lisina C-terminal" se refiere al extremo C-terminal de la cadena pesada de una inmunoglobulina. Preferiblemente, hay al menos un residuo de aminoácido después de una lisina C-terminal. En una realización, en la que solo hay un residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal (posición de aminoácido 1), el residuo de aminoácido directamente adyacente a la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, tirosina, triptófano, serina, treonina, cisteína, asparagina, glutamina e histidina. En el caso de que se añada más de un residuo de aminoácido a la lisina C-terminal (posición de aminoácido 1, 2, etc.), el residuo de aminoácido directamente adyacente a la lisina C-terminal (posición de aminoácido 1) puede seleccionarse de cualquier aminoácido excepto ácido aspártico, ácido glutámico o prolina. En una realización, en el caso de que se añadan dos residuos de aminoácidos a la lisina C-terminal, el residuo de aminoácido directamente adyacente a la lisina C-terminal (posición de aminoácido 1) es cualquier aminoácido excepto ácido aspártico, ácido glutámico o prolina, y el segundo residuo de aminoácido (posición de aminoácido 2) después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina. En una realización, en los casos en los que se añadan dos residuos de aminoácidos a la lisina C-terminal, el primer residuo de aminoácido adyacente a la lisina C-terminal (posición de aminoácido 1) es lisina o arginina.
En una realización, hay un residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal (posición de aminoácido 1). En otra realización, hay dos residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal (posiciones de aminoácidos 1 y 2). En aún otra realización, hay tres (posiciones de aminoácidos 1, 2 y 3), cuatro (posiciones de aminoácidos 1, 2, 3 y 4), cinco (posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4 y 5), seis (posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5 y 6), siete (posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7), ocho (posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8), nueve (posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9), diez (posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9 y 10), once (posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11), doce (posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12) , trece (posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13), catorce (posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14), quince (posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 15), dieciséis (posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 y 16), diecisiete (posiciones de aminoácidos 1, 2 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 y 17), dieciocho ( posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 , 17 y 18), diecinueve (posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 y 19) o veinte (posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20) residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal.
En una realización, los residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal no incluyen GTYFQAYGT (SEQ ID NO: 1). En una realización, los residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal no incluyen GECTYFQAYGCTE (SEQ ID NO: 2). En una realización, los residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal no incluyen GENTYFQAYGNTE (SEQ ID NO: 3).
En una realización, la lisina C-terminal es Lisina 447 de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En otra realización, la lisina C-terminal es la lisina C-terminal de IgD o IgE. En otra realización, la expresión "lisina C-terminal" se refiere al último residuo de lisina antes del trozo de cola de IgA1, IgA2 o IgM. En una realización, se elimina el trozo de cola de IgA1, IgA2 o IgM. En una realización, no se elimina el trozo de cola de IgA1, IgA2 o IgM. Las secuencias de trozos de cola para los anticuerpos se exponen a continuación:
IgA1 PTHVNVSVVMAEVDGTCY (SEQ ID NO: 4)
IgA2 PTHVNVSVVMAEVDGTCY (SEQ ID NO: 4)
IgM PTLYNVSLVMSDTAGTCY (SEQ ID NO: 5)
En otra realización, se pueden eliminar uno o más residuos de aminoácidos, p. e j, se pueden suprimir del extremo C de la cadena pesada de una inmunoglobulina, y se puede añadir a la inmunoglobulina un residuo de lisina C-terminal, seguido de al menos un residuo de aminoácido adicional. Por ejemplo, se pueden eliminar los residuos de aminoácidos 446 y 447 de una inmunoglobulina IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 y se puede añadir una lisina C-terminal seguida de al menos un residuo de aminoácido adicional, en donde una transglutaminasa microbiana puede luego conjugar la lisina C-terminal de la inmunoglobulina a un residuo de glutamina de un sustrato donante de acilo. En otras palabras, la lisina C-terminal puede estar presente, por ejemplo, en la posición de aminoácido 446 de una inmunoglobulina si la inmunoglobulina ha sido mutada para eliminar las posiciones de aminoácido de tipo salvaje 446 y 447. Uno o más residuos de aminoácidos adicionales pueden luego añadirse a la lisina C-terminal en, por ejemplo, las posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4, etc., como se describe en esta memoria. En una realización, se pueden eliminar uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez residuos de aminoácidos, p. ej., se pueden suprimir del extremo C de la cadena pesada de una inmunoglobulina, y un residuo de lisina C-terminal, seguido de al menos un residuo de aminoácido adicional se puede añadir a la inmunoglobulina en, por ejemplo, las posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4, etc., como se describe en esta memoria.
En otra realización, el dominio CH3 se elimina del extremo C de la cadena pesada de una inmunoglobulina, y a la inmunoglobulina se puede añadir un residuo de lisina C-terminal, seguido de al menos un residuo de aminoácido adicional. En otra realización, tanto el dominio CH2 como el dominio CH3 se eliminan del extremo C de la cadena pesada de una inmunoglobulina, y se puede añadir a la inmunoglobulina un residuo de lisina C-terminal, seguido de al menos un residuo de aminoácido adicional. En otra realización, la región bisagra, el dominio CH2 y el dominio CH3 se eliminan del extremo C de la cadena pesada de una inmunoglobulina, y a la inmunoglobulina se puede añadir un residuo de lisina C-terminal, seguido de al menos un residuo de aminoácido adicional. En aún otra realización, el dominio CHI, la región bisagra, el dominio CH2 y el dominio CH3 se eliminan del extremo C de la cadena pesada de una inmunoglobulina y a la inmunoglobulina se puede añadir un residuo de lisina C-terminal, seguido de al menos un residuo de aminoácido adicional.
La expresión "química de clic" se refiere a reacciones particulares para la síntesis y/o conjugación de proteínas que son de alto rendimiento, altamente selectivas, fiables y limpias. Véase, p. ej., King et al., "Developments in the Field of Bioorthagonal Bond Forming Reactions - Past and Present Trends", Bioconjug. Chem., (2014) 25(5): 825-839; McKay et al., "Click Chemistry in Complex Mixtures: Bioorthagonal Bioconjugation", Chem. Biol., (2014) 21(9): 1075­ 1101.
El término "quimerizado", "quimérico", la expresión "anticuerpo quimérico" y términos y expresiones similares se refieren a una inmunoglobulina que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, es decir, una región de unión a antígeno, de una fuente o especie y al menos una porción de una región constante de la cadena pesada y una región constante de la cadena ligera derivadas de una fuente o especie diferente. Estas porciones pueden unirse químicamente mediante técnicas convencionales (p. ej., sintéticas) o pueden prepararse como un polipéptido contiguo utilizando técnicas de ingeniería genética (p. ej., ADN que codifica las porciones de proteína del anticuerpo quimérico puede expresarse para producir una cadena polipeptídica contigua). Otras formas de "inmunoglobulinas quiméricas" abarcadas por la presente divulgación son aquellas en las que la clase o subclase se ha modificado o cambiado respecto de la inmunoglobulina original (a las que también se alude como "inmunoglobulinas con cambio de clase"). A lo largo de la divulgación, las inmunoglobulinas quiméricas se denominan "xi." En esta memoria, "inmunoglobulina quimérica" y expresiones similares se refieren a la secuencia de la inmunoglobulina en lugar del procedimiento utilizado para generar el anticuerpo.
Tal como se utiliza en esta memoria, "Lys447" o "Lisina 447" se refiere a un residuo de lisina en la posición de aminoácido 447 de la región constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina (numerada utilizando el sistema de numeración de la UE), y que es, por ejemplo, el codón C-terminal en IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD e IgE.
Tal como se utiliza en esta memoria, "agente funcional" se refiere a un agente que tiene una propiedad o propiedades terapéuticas, de diagnóstico u otras propiedades funcionales. En una realización, un agente funcional puede ser un agente terapéutico. En otra realización, un agente funcional puede ser un agente de diagnóstico. Los agentes funcionales pueden ser moléculas grandes o moléculas pequeñas. Los agentes funcionales de moléculas grandes incluyen, pero no se limitan a un anticuerpo y porciones de unión a antígeno del mismo. Agentes funcionales de moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a agentes quimioterapéuticos, agentes citotóxicos, antibióticos, otros compuestos orgánicos que pueden regular el proceso biológico (p. ej., fármacos) y polipéptidos.
El término "humanizado", la expresión "inmunoglobulina humanizada" y términos y expresiones similares se refieren a inmunoglobulinas en las que el marco o las "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR) han sido modificados para comprender la CDR de una inmunoglobulina de diferente especificidad en comparación con la de la inmunoglobulina precursora. En su mayor parte, las inmunoglobulinas humanizadas son inmunoglobulinas humanas (inmunoglobulina receptora) en las que los residuos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (inmunoglobulina donante), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de FWR de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Además, las inmunoglobulinas humanizadas pueden comprender residuos que no se encuentran en la inmunoglobulina del receptor o en la inmunoglobulina del donante. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el rendimiento de las inmunoglobulinas. En general, la inmunoglobulina humanizada comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos los FWRs son los de una secuencia de inmunoglobulina humana. La inmunoglobulina humanizada también puede comprender opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Véase, p. ej., Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; y Neuberger, M. S., et al., Nature 314 (1985) 268-270. A lo largo de la divulgación, las "inmunoglobulinas humanizadas" se denominan "zu." En esta memoria, "inmunoglobulina humanizada" y expresiones similares se refieren a la secuencia de la inmunoglobulina en lugar del procedimiento utilizado para generar la inmunoglobulina.
La expresión "agente de diagnóstico" se refiere a un compuesto que puede ser útil para estudios de formación de imágenes in vivo tales como CT, MRI y rayos X y/o estudios de formación de imágenes in vitro. Ejemplos no limitantes de agentes de diagnóstico incluyen un fluoróforo, un colorante fluorescente, un radionucleido y una enzima.
La expresión "inmunoglobulina donante" se refiere a una inmunoglobulina no humana que aporta las secuencias de aminoácidos de sus regiones variables, CDRs u otros fragmentos funcionales o análogos de los mismos a la inmunoglobulina humanizada y, con ello, proporciona a la inmunoglobulina humanizada la especificidad antigénica y la actividad característica neutralizante de la inmunoglobulina donante.
La expresión "inmunoglobulina receptora" se refiere a una inmunoglobulina heteróloga a la inmunoglobulina donante, que proporciona las secuencias de aminoácidos de sus regiones marco de la cadena pesada y/o ligera y/o sus regiones constantes de la cadena pesada y/o ligera a la inmunoglobulina humanizada. La inmunoglobulina receptora puede derivarse de cualquier mamífero. En realizaciones preferidas, la inmunoglobulina receptora no es inmunogénica en seres humanos. Preferiblemente, la inmunoglobulina receptora es una inmunoglobulina humana.
"Humanizar" se refiere a un procedimiento de generar una inmunoglobulina humanizada e incluye cualquier procedimiento para generar inmunoglobulinas humanizadas que tengan las características anteriores, que incluyen, pero no se limitan a la humanización in silico, la ingeniería de CDRs de especie/huésped en inmunoglobulinas humanas, la sustitución de residuos de la región marco de una inmunoglobulina quimérica para que coincida con una región marco humana correspondiente, etc.
"Inmunoglobulina", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una proteína que consiste en uno o más polipéptidos codificados sustancialmente por genes de inmunoglobulina que incluyen las cadenas ligeras kappa y lambda y las cadenas pesadas alfa, gamma, delta, épsilon y mu. Las "cadenas ligeras" de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente de 25 Kd o 214 aminoácidos) son codificadas por un gen de la región variable en el extremo NH2 (aproximadamente de 110 aminoácidos) y un gen de la región constante kappa o lambda en el extremo COOH. Las "cadenas pesadas" de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente de 50 Kd o 446 aminoácidos) son codificadas de manera similar por un gen de la región variable (aproximadamente de 116 aminoácidos) y uno de los otros genes de la región constante antes mencionados, p. ej., gamma (que codifica aproximadamente 330 aminoácidos). "Inmunoglobulinas" incluyen: (a) polipéptidos de inmunoglobulina, es decir, polipéptidos de la familia de las inmunoglobulinas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno específico, incluyendo todos los isotipos de inmunoglobulina (IgG, IgA, IgE, IgM, IgD e IgY), clases (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), subclases y diversas otras formas monoméricas y poliméricas de cada uno de los isotipos, a menos que se especifique lo contrario; y (b) variantes sustituidas de forma conservadora de polipéptidos de inmunoglobulinas de este tipo que se unen inmunoespecíficamente al antígeno. Las inmunoglobulinas se describen generalmente, por ejemplo, en Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988).
Una forma de inmunoglobulina descrita en esta memoria constituye la unidad estructural básica de un anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo puede incluir un tetrámero y puede consistir en dos pares idénticos de cadenas de inmunoglobulina, teniendo cada uno de los pares una cadena ligera y una cadena pesada. Generalmente, en cada uno de los pares, las regiones variables de la cadena ligera y la cadena pesada son juntas responsables de la unión a un antígeno, y las regiones constantes son responsables de las funciones efectoras del anticuerpo.
Además de los anticuerpos, las inmunoglobulinas pueden existir en una diversidad de otras formas que incluyen, por ejemplo: fragmentos de unión a antígeno o porciones de una inmunoglobulina de longitud completa, tales como fragmentos Fv, Fab, (Fab’)2 y Fv; y formatos de anticuerpos alternativos, tales como inmunoglobulinas de cadena sencilla (scFV y scFab), diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, anticuerpos lineales y anticuerpos multiespecíficos, por nombrar unos pocos. Véase, por ejemplo, James D. Marks, Antibody Engineering, Capítulo 2, Oxford University Press (1995) (Carl K. Borrebaeck, Ed.).
En una realización, una inmunoglobulina puede comprender un fragmento Fab. En otra realización, una inmunoglobulina puede comprender un dominio CH3. En otra realización, una inmunoglobulina puede comprender una cadena pesada.
Tal como se utiliza en esta memoria, el término "inmunoespecíficamente" se refiere a la capacidad de una inmunoglobulina de unirse específicamente a un antígeno contra el que se generó la inmunoglobulina y no unirse específicamente a otros péptidos o proteínas. Una inmunoglobulina que se une inmunoespecíficamente a un antígeno contra el cual se generó la inmunoglobulina puede no unirse a otros polipéptidos o proteínas, o puede unirse a otros polipéptidos o proteínas con una afinidad de unión más baja que el antígeno contra el cual se generó la inmunoglobulina según se determina, por ejemplo, por inmunoensayos, BIAcore u otros ensayos conocidos en la técnica Una inmunoglobulina se une inmunoespecíficamente a un antígeno contra el cual se generó la inmunoglobulina cuando se une al antígeno con una mayor afinidad de unión que a cualquier antígeno de reactividad cruzada, según se determina utilizando técnicas experimentales, tales como, pero no limitadas a radioinmunoensayos (RIA) y ensayos por inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISAs) (Véase, por ejemplo, Paul, ed., Fundamental Immunology, 2a ed., Raven Press, Nueva York, páginas 332-336 (1989) para una discusión sobre la especificidad del anticuerpo).
"Enlazador", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un espaciador, que puede ser una cadena lineal o ramificada, para conectar una inmunoglobulina (a través de un sustrato donante de acilo) a un agente funcional o un grupo reactivo. Enlazadores de este tipo pueden ser escindibles (p. ej., lábiles a ácidos o escindibles por proteasas) o no escindibles. En una realización, un enlazador es un resto de polietilenglicol (PEG). En otra realización, un enlazador comprende uno o más aminoácidos y un resto de polietilenglicol (PEG).
La expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de un solo clon de células, incluyendo cualquier clon de células eucariotas o procariotas, o un clon de fagos, y no al método por el cual se produce. Un anticuerpo monoclonal muestra una única especificidad de unión y afinidad por un epítopo particular. La expresión "anticuerpo monoclonal" no se limita a anticuerpos producidos a través de la tecnología de hibridomas.
"Nativa" se refiere a la secuencia de inmunoglobulina de tipo salvaje de la especie de la que se deriva la inmunoglobulina.
Tal como se utiliza en esta memoria, "porcentaje de identidad" y expresiones similares se utilizan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos, polinucleótidos, proteínas o polipéptidos, y se entiende en el contexto y en unión con las expresiones que incluyen: (a) secuencia de referencia, (b) ventana de comparación, (c) identidad de secuencia y (d) porcentaje de identidad de secuencia.
(a) Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida que se utiliza como base para la comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, un segmento de una secuencia de ADNc o génica de longitud completa, o la secuencia de ADNc o génica completa. Para los polipéptidos, longitudes ejemplares de la secuencia polipeptídica de referencia incluyen al menos aproximadamente 16 aminoácidos, al menos aproximadamente 20 aminoácidos, al menos aproximadamente 25 aminoácidos, al menos aproximadamente 35 aminoácidos, al menos aproximadamente 50 aminoácidos o al menos aproximadamente 100 aminoácidos. Para los ácidos nucleicos, la longitud ejemplar de la secuencia de ácidos nucleicos de referencia incluye al menos aproximadamente 50 nucleótidos, al menos aproximadamente 60 nucleótidos, al menos aproximadamente 75 nucleótidos, al menos aproximadamente 100 nucleótidos o al menos aproximadamente 300 nucleótidos, o cualquier número entero alrededor de o entre ellos. .
(b) Una "ventana de comparación" incluye la referencia a un segmento contiguo y especificado de una secuencia polinucleotídica o polipeptídica, en donde la secuencia polinucleotídica o polipeptídica puede compararse con una secuencia de referencia y en donde la porción de la secuencia polinucleotídica o polipeptídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones, sustituciones o eliminaciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones, sustituciones o deleciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. Ventanas de comparación ejemplares pueden tener una longitud de al menos 20 nucleótidos o aminoácidos contiguos y, opcionalmente, pueden tener 30, 40, 50, 100 o más. Los expertos en la técnica entienden que para evitar una similitud engañosamente alta con una secuencia de referencia debido a la inclusión de huecos en la secuencia polinucleotídica o polipeptídica, normalmente se introduce una penalización por huecos y se resta del número de coincidencias.
(c) Métodos de alineamiento de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. El alineamiento óptimo de las secuencias para la comparación puede realizarse mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math., 2: 482, 1981; por el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443, 1970; por el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8: 2444, 1988; mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos, que incluyen, pero no se limitan a: CLUSTAL en el programa PC/Gene de Intelligenetics, Mountain View, Calif., GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 7 Science Dr., Madison, Wis., USA; el programa CLUSTAL se describe bien por Higgins y Sharp, Gene, 73: 237-244, 1988; Corpet, et al., Nucleic Acids Research, 16:881 -90, 1988; Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences, 8:1 -6, 1992; y Pearson, et al., Methods in Molecular Biology, 24:7-331, 1994. La familia de programas BLAST que puede utilizarse para búsquedas de similitud en bases de datos incluye: BLASTN para secuencias de consulta de nucleótidos frente a secuencias de bases de datos de nucleótidos; BLASTX para secuencias de consulta de nucleótidos frente a secuencias de bases de datos de proteínas; BLASTP para secuencias de consulta de proteínas frente a secuencias de bases de datos de proteínas; TBLASTN para secuencias de consulta de proteínas frente a secuencias de bases de datos de nucleótidos; y TBLASTX para secuencias de consulta de nucleótidos frente a secuencias de bases de datos de nucleótidos. Véase, Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 19, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York, 1995. Indudablemente, en el futuro estarán disponibles nuevas versiones de los programas anteriores o programas completamente nuevos. y pueden utilizarse con la presente divulgación.
(d) "Porcentaje de identidad" significa el valor determinado al comparar dos secuencias alineadas de manera óptima en una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos o polipéptidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones, sustituciones o deleciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones, sustituciones o deleciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que aparece la base de ácido nucleico o el residuo de aminoácido idénticos en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de la secuencia.
"Cantidad farmacéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de una inmunoglobulina que trata a un sujeto.
"Soporte farmacéuticamente aceptable" se refiere a componentes de una formulación farmacéutica para una inmunoglobulina como se describe en esta memoria para la administración a un sujeto. Por ejemplo, un soporte farmacéuticamente aceptable puede estar basado en liposomas, lípidos y/o nanopartículas.
La expresión "grupo reactivo", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un grupo funcional químico que puede reaccionar con otros compuestos, tales como agentes funcionales, para formar al menos un enlace covalente. En una realización, los grupos reactivos son reactivos en reacciones de acoplamiento de química de clic. Ejemplos no limitantes de grupos reactivos incluyen (1 R,8S,9s)-biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilmetanol (BCN),
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(DBCO), trans-cicloocteno (TCO), azido (N3), alquino, tetrazina, metilciclopropeno, norborneno, hidrazida/hidrazina y aldehído.
El término "sujeto", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un organismo humano o no humano. Por lo tanto, los métodos, las inmunoglobulinas y las inmunoglobulinas conjugadas descritos en esta memoria son aplicables a enfermedades y afecciones tanto humanas como veterinarias. Los sujetos pueden ser "pacientes", es decir, seres humanos u organismos no humanos vivos que reciben atención médica por una enfermedad o afección, o seres humanos u organismos no humanos sin una enfermedad definida que están siendo investigados en busca de signos de patología o presencia/ausencia de una afección particular.
"Sustituir" se refiere al reemplazo de un residuo de aminoácido por otro. "Sustituir" incluye, por ejemplo, mutaciones sin sentido en uno o más pares de bases de ADN que codifican el residuo de aminoácido o modifican la proteína para intercambiar un aminoácido por otro.
Tal como se utiliza en esta memoria, "tratar" y términos similares se refieren a reducir la gravedad y/o la frecuencia de los síntomas de la enfermedad, eliminar los síntomas de la enfermedad y/o la causa subyacente de dichos síntomas, reducir la frecuencia o probabilidad de los síntomas de la enfermedad y/o su causa subyacente y mejorar o remediar el daño causado, directa o indirectamente, por la enfermedad.
La expresión "agente terapéutico" significa una molécula grande o pequeña que puede administrarse a un sujeto que lo necesite para tratar una afección. Los agentes terapéuticos pueden administrarse para tratar o prevenir el inicio, ralentizar la progresión o mejorar uno o más síntomas de una afección médica en sujetos que padecen la misma. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a un anticuerpo o una parte del mismo que se une al antígeno, un agente quimioterapéutico, un agente radiactivo, un agente citotóxico, un antibiótico, etc. En una realización, el agente terapéutico es una molécula pequeña. En otra realización, el agente terapéutico es un polipéptido.
Tal como se utiliza en esta memoria, "90 % idéntico a" abarca al menos 90 % idéntico, 91 % idéntico, 92 % idéntico, 93 % idéntico, 94 % idéntico, 95 % idéntico, 96 % idéntico, 97 % idéntico, 98 % idéntico, 99 % idéntico idéntico o 100% idéntico al elemento de referencia (p. ej., una secuencia biológica).
Las siguientes abreviaturas se utilizan a lo largo de la divulgación: conjugados de anticuerpos y fármacos (ADCs); relación fármaco-a-anticuerpo (DAR); región marco (FWR); región determinante de la complementariedad (CDR); auristatina F (AuF); región pesada variable (VH); región clara variable (VL); kappa variable (Vk); región constante gamma (Cy); región constante kappa (Ck); anticuerpo monoclonal (mAb); lisina en la posición de aminoácido 447 de la cadena pesada de la inmunoglobulina, numerada utilizando el sistema de numeración de la UE (Lys447).
Generación de inmunoglobulinas conjugadas
En esta memoria se describen métodos para generar una inmunoglobulina conjugada, comprendiendo los métodos: incubar una inmunoglobulina con una transglutaminasa microbiana y un agente funcional que comprende un sustrato donante de acilo, a) en donde la inmunoglobulina comprende al menos un residuo de aminoácido después de una lisina C-terminal, b) en donde el sustrato donante de acilo comprende un residuo de glutamina y c) en donde el agente funcional es un agente terapéutico o un agente de diagnóstico, en donde la transglutaminasa microbiana conjuga la lisina C-terminal de la inmunoglobulina con el residuo de glutamina del sustrato donante de acilo sobre el agente funcional, generando con ello la inmunoglobulina conjugada.
En esta memoria se describen también métodos para generar una inmunoglobulina conjugada, comprendiendo los métodos: i) incubar una inmunoglobulina con una transglutaminasa microbiana y un sustrato donante de acilo, a) en donde la inmunoglobulina comprende al menos un residuo de aminoácido después de una lisina C-terminal, b) en donde el sustrato donante de acilo comprende un residuo de glutamina y un grupo reactivo, en donde la transglutaminasa microbiana conjuga la lisina C-terminal de la inmunoglobulina con el residuo de glutamina del sustrato donante de acilo, y ii) conjugar un agente funcional con el grupo reactivo del sustrato donante de acilo, en donde el agente funcional es un agente terapéutico o un agente de diagnóstico, generando con ello la inmunoglobulina conjugada.
La conjugación se puede realizar disolviendo un agente funcional que comprende un sustrato donante de acilo en una solución de disolución e incubando el agente funcional disuelto con la inmunoglobulina y la transglutaminasa microbiana en un tampón de conjugación. La conjugación también se puede realizar disolviendo un sustrato donante de acilo en una solución de disolución e incubando el sustrato donante de acilo con la inmunoglobulina y la transglutaminasa microbiana en un tampón de conjugación.
Para agentes funcionales insolubles en agua y sustratos donantes de acilo, soluciones de disolución adecuadas incluyen disolventes orgánicos miscibles en agua tal como dimetilsulfóxido (DMSO). Para agentes funcionales solubles en agua y sustratos donantes de acilo, soluciones de disolución adecuadas incluyen, pero no se limitan a agua o soluciones acuosas tamponadas tal como solución salina tamponada con fosfato, pH 7,2 (1 x PBS) o DPBS.
Concentraciones adecuadas del agente funcional o del sustrato donante de acilo incluyen de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 800 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 55 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 70 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 90 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 75 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 60 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 40 mM o de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 30 mM.
En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 10 pM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 25 pM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 50 pM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 100 pM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 250 pM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 500 pM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 750 pM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 1 mM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 10 mM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 20 mM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 30 mM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 40 mM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 50 mM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 60 mM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 70 mM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 80 mM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 90 mM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 100 mM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 150 mM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 200 mM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 250 mM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 300 mM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 350 mM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 400 mM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 450 mM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 500 mM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 550 mM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 600 mM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 650 mM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 700 mM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 750 mM. En algunas realizaciones, la concentración del agente funcional o del sustrato donante de acilo puede ser de aproximadamente 800 mM.
Concentraciones adecuadas de inmunoglobulina incluyen de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 12 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg /ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml o de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml. En algunas realizaciones, la concentración de inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 0,1 mg/ml. En algunas realizaciones, la concentración de inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 0,5 mg/ml. En algunas realizaciones, la concentración de inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 1 mg/ml. En algunas realizaciones, la concentración de inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 2 mg/ml. En algunas realizaciones, la concentración de inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 5 mg/ml. En algunas realizaciones, la concentración de inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 10 mg/ml. En algunas realizaciones, la concentración de inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 15 mg/ml. En algunas realizaciones, la concentración de inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 20 mg/ml.
Relaciones adecuadas de un agente funcional o un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina incluyen de aproximadamente 1:1 a 100:1. En una realización, la relación de agente funcional a sustrato donante de acilo:inmunoglobulina es de aproximadamente 25:1 a aproximadamente 75:1. En otra realización, la relación de agente funcional a sustrato donante de acilo:inmunoglobulina es de aproximadamente 40:1 a aproximadamente 60:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 1:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 2:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 3:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 4:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 5:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 6:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 7:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 8:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 9:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 10:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 11:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 12:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 13:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 14:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 15:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 16:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 17:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 18:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 19:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 20:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 25:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 30:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 35:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 40:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 45:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 50:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 60:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 70:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 80:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 90:1. En algunas realizaciones, la relación de un agente funcional o de un sustrato donante de acilo:inmunoglobulina puede ser de 100:1.
La incubación se puede realizar en un cierto número de tampones de conjugación adecuados que incluyen, por ejemplo, DPBS, 1xPBS, pH 7,2, fosfato de sodio, fosfato de potasio, borato de sodio, Tris y HEPES, por nombrar unos pocos. La concentración de tampón de conjugación incluyen de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 2 M, de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 1 M, de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 45 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 60 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 75 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 90 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 75 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 60 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 45 mM o de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 30 mM. En algunas realizaciones, la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 10 mM. En algunas realizaciones, la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 20 mM. En algunas realizaciones, la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 30 mM. En algunas realizaciones, la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 40 mM. En algunas realizaciones, la concentración del tampón
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de conjugación puede ser de aproximadamente 50 mM. En algunas realizaciones, la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 60 mM. En algunas realizaciones, la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 70 mM. En algunas realizaciones, la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 80 mM. En algunas realizaciones, la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 90 mM. En algunas realizaciones, la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 100 mM. En algunas realizaciones, la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 250 mM. En algunas realizaciones, la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 500 mM. En algunas realizaciones, la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 750 mM. En algunas realizaciones, la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 1 M. En algunas realizaciones, la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 1,25 M. En algunas realizaciones, la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 1,5 M. En algunas realizaciones, la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 1,75 M. En algunas realizaciones, la concentración del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 2 M.
El tampón de conjugación puede incluir, además, cloruro de sodio. Concentraciones adecuadas de cloruro de sodio incluyen de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 2 M, de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 1 M, de aproximadamente 1 M a aproximadamente 2 M, de aproximadamente 500 mM a aproximadamente 1,5 M, de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 75 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 150 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 200 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 250 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 300 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 350 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 400 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 400 mM, de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 350 mM, de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 300 mM, de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 250 mM, de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 200 mM, de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 150 mM, de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 50 mM o de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 25 mM. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 25 mM. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 50 mM. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 75 mM. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 100 mM. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 150 mM. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 200 mM. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 250 mM. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 300 mM. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 350 mM. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 400 mM. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 500 mM. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 750 mM. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 1 M. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 1,25 M. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 1,5 M. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 1,75 M. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio puede ser de aproximadamente 2 M.
El pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 4 a aproximadamente 9. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 5 a aproximadamente 8. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 6 a aproximadamente 7. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 4. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 4,5. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 5. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 5,5. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 6,0. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 6,5. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 6,6. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 6,7. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 6,8. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 6,9. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 7,0. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 7,1. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 7,2. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 7,3. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 7,4. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 7,5. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 7,6. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 7,7. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 7,8. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 7,9. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 8,0. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 8,1. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 8,2. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 8,3. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 8,4. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 8,5. En algunas realizaciones, el pH del tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 9.
Para facilitar la solubilidad de un agente funcional o un sustrato donante de acilo en el tampón de conjugación, una concentración final de disolvente orgánico miscible en agua en el tampón de conjugación puede ser de aproximadamente 0 % a aproximadamente 20 %, de aproximadamente 2 % a aproximadamente 20 %, de aproximadamente 5 % a aproximadamente 20 %, de aproximadamente 8 % a aproximadamente 20 %, de aproximadamente 11 % a aproximadamente 20 %, de aproximadamente 16 % a aproximadamente 20 %, de aproximadamente 0 % a aproximadamente 18 %, de aproximadamente 0 % a aproximadamente 15 %, de aproximadamente 0 % a aproximadamente 12 %, de aproximadamente 0 % a aproximadamente 10 %, de aproximadamente 0 % a aproximadamente 8 %, de aproximadamente 0 % a aproximadamente 6 % o de aproximadamente 0 % a aproximadamente 2 %.
El tampón de conjugación puede comprender, además, propilenglicol para facilitar la solubilidad del compuesto reactivo con tiol en el tampón de conjugación. Concentraciones adecuadas de propilenglicol incluyen de aproximadamente 1 % a aproximadamente 50 %, de aproximadamente 20 % a aproximadamente 50 %, de aproximadamente 30 % a aproximadamente 50 %, de aproximadamente 40 % a aproximadamente 50 %, de aproximadamente 10 % a aproximadamente 40 %, de aproximadamente 10 % a aproximadamente 30 % o de aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 %. En algunas realizaciones, la concentración de propilenglicol puede ser de aproximadamente 1 % o de aproximadamente 5 %. En algunas realizaciones, la concentración de propilenglicol puede ser de aproximadamente 10 %. En algunas realizaciones, la concentración de propilenglicol puede ser de aproximadamente 20 %. En algunas realizaciones, la concentración de propilenglicol puede ser de aproximadamente 30 %. En algunas realizaciones, la concentración de propilenglicol puede ser de aproximadamente 40 %. En algunas realizaciones, la concentración de propilenglicol puede ser de aproximadamente 50 %.
El tampón de conjugación puede comprender, además, un detergente no ióni
inmunoglobulina conjugada en el tampón de conjugación. Detergentes no iónicos ejemplares incluyen, pero no se limitan a polisorbato-20 o polisorbato-80. Concentraciones adecuadas de detergente no iónico incluyen de aproximadamente 0 % a aproximadamente 1 %, de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 1 %, de aproximadamente 0,3 % a aproximadamente 1 %, de aproximadamente 0,5 % a aproximadamente 1 %, de aproximadamente 0,7 % a aproximadamente 1 %, de aproximadamente 0 % a aproximadamente 0,8 %, de aproximadamente 0 % a aproximadamente 0,6 %, de aproximadamente 0 % a aproximadamente 0,4 % o de aproximadamente 0 % a aproximadamente 0,2 %. En algunas realizaciones, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 0,1 %. En algunas realizaciones, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 0,2 %. En algunas realizaciones, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 0,3 algunas realizaciones, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 0,4 algunas realizaciones, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 0,5 algunas realizaciones, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 0,6 algunas realizaciones, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 0,7 algunas realizaciones, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 0,8 algunas realizaciones, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 0,9
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algunas realizaciones, la concentración de detergente no iónico puede ser de aproximadamente 1,0
La incubación se puede realizar durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 48 horas, durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas, durante aproximadamente 2 horas a aproximadamente 24 horas, durante aproximadamente 24 horas a aproximadamente 48 horas, durante aproximadamente 30 horas a aproximadamente 48 horas, durante aproximadamente 36 horas a aproximadamente 48 horas, durante aproximadamente 42 horas a aproximadamente 48 horas, durante aproximadamente 2 horas a aproximadamente 42 horas, durante aproximadamente 2 horas a aproximadamente 36 horas, durante aproximadamente 2 horas a aproximadamente 30 horas, durante aproximadamente 2 horas a aproximadamente 24 horas, durante aproximadamente 2 horas a aproximadamente 18 horas, durante aproximadamente 2 horas a aproximadamente 12 horas, aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 1 hora, aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 2 horas o durante aproximadamente 2 horas a aproximadamente 6 horas. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar durante aproximadamente 30 minutos. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar durante aproximadamente 1 hora. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar durante aproximadamente 1,5 horas. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar durante 2 horas. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar durante 6 horas. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar durante 12 horas. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar durante 18 horas. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar durante 24 horas. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar durante 30 horas. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar durante 36 horas. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar durante 42 horas. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar durante 48 horas.
La temperatura de incubación puede ser de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 50 °C, de aproximadamente 18 °C a aproximadamente 37 °C, de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 37 °C, de aproximadamente 22 °C a aproximadamente 37 °C, de aproximadamente 24 °C a aproximadamente 37 °C, de aproximadamente 26 °C a aproximadamente 37 °C, de aproximadamente 28 °C a aproximadamente 37 °C, de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 37 °C, de aproximadamente 32 °C a aproximadamente 37 °C, de aproximadamente 34 °C a aproximadamente 37 °C, de aproximadamente 18 °C a aproximadamente 34 °C, de aproximadamente 18 °C a aproximadamente 32 °C, de aproximadamente 18 °C a aproximadamente 30 °C, de aproximadamente 18 °C a aproximadamente 28 °C, de aproximadamente 18 °C a aproximadamente 26 °C o de aproximadamente 18 °C a aproximadamente 24 °C. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar a 4 °C. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar a 18 °C. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar a 20 °C. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar a 22 °C. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar a 24 °C. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar a 26 °C. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar a 28 °C. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar a 30 °C. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar a 32 °C. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar a 34 °C. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar a 37 °C. En algunas realizaciones, la incubación se puede realizar a 50 °C.
El agente funcional no incorporado o el sustrato donante de acilo se pueden separar de la inmunoglobulina conjugada mediante cromatografía de desalinización utilizando un cierto número de resinas adecuadas que incluyen, pero no se limitan a resina G-25, resina G-50, Biogel P10 u otras resinas con límites de exclusión de intervalos 5.000-10.000 Da. La cromatografía se puede realizar en formato de columna o en formato de columna por rotación, dependiendo de la escala. Tampones adecuados para la desalinización incluyen, por ejemplo, DPBS, 1xPBS, fosfato de sodio, fosfato de potasio, borato de sodio, Tris o tampones basados en HEPES que pueden sustituir a 1x PBS.
En una primera realización, el agente funcional comprende un sustrato donante de acilo que comprende un residuo de glutamina conjugado con la lisina C-terminal a través del sustrato donante de acilo. En esta primera realización, el agente funcional se combina con el sustrato donante de acilo antes de la conjugación con la inmunoglobulina, haciendo reaccionar el grupo reactivo en el sustrato donante de acilo con el agente funcional. En una segunda realización, el sustrato donante de acilo que comprende un residuo de glutamina y un grupo reactivo se conjuga primero con la inmunoglobulina y luego el grupo reactivo se une a un agente funcional.
Los sustratos donantes de acilo pueden comprender un enlazador, "L". Los enlazadores pueden ser enlazadores no escindibles o enlazadores escindibles. Enlazadores ejemplares incluyen, por ejemplo, enlazadores que contienen disulfuro, enlazadores basados en acetal y enlazadores basados en cetal. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador no escindible. Enlazadores no escindibles adecuados incluyen, pero no se limitan a uno o más aminoácidos, polietilenglicol (PEG) o un alquilo. En algunas realizaciones, el enlazador puede comprender PEG. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador escindible. Enlazadores escindibles adecuados incluyen, por ejemplo, valina-citrulina-para aminobencilo. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador que contiene disulfuro. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador basado en acetal. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador basado en cetal. Un enlazador también puede ser uno o más aminoácidos, solos o en combinación con otro enlazador, tal como uno o más grupos PEG.
El sustrato donante de acilo que comprende un residuo de glutamina puede estar presente en un agente funcional, formar parte de él o unirse a él. Agentes funcionales adecuados incluyen, por ejemplo, fluoróforos, colorantes fluorescentes, polipéptidos, inmunoglobulinas, antibióticos, ácidos nucleicos, radionucleidos, enlazadores químicos, moléculas pequeñas, quelantes, lípidos, ácidos nucleicos (tales como ADN o ARN) y fármacos. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un fluoróforo. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un colorante fluorescente. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un polipéptido. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender una inmunoglobulina. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un antibiótico. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un ácido nucleico (tal como ADN o ARN). En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un radionucleido. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender una molécula pequeña. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un quelante (por ejemplo, DOTA, CHX-A"-DTPA, NOTA, entre otros). En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un lípido. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un fármaco. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender una combinación de cualquiera de los agentes funcionales arriba enumerados.
El sustrato donante de acilo (es decir, un primer sustrato donante de acilo) se puede unir a un segundo sustrato donante de acilo o enlazador, estando unido el segundo sustrato donante de acilo o enlazador a una segunda inmunoglobulina que tiene una segunda región variable de la cadena pesada y una segunda región variable de la cadena ligera, teniendo la segunda región variable de la cadena pesada una lisina C-terminal, en donde la lisina C-terminal tiene al menos un residuo de aminoácido después de la lisina. Por ejemplo, el primer sustrato donante de acilo y el segundo sustrato donante de acilo pueden tener un primer y segundo enlazador químico como el primer y segundo agentes funcionales, respectivamente. Los primer y segundo enlazadores químicos pueden unirse entre sí por un cierto número de medios adecuados que incluyen, por ejemplo, química de clic.
En una realización, el agente funcional que comprende el sustrato donante de acilo está de acuerdo con una de las fórmulas (I) o (II):
(Z)m-Gln-(L)n-(Y) (I)
(Y)-(L)n-Gln-(Z)m (II)
en donde Z es un grupo carboxilbenciloxi (CBZ) o un residuo de aminoácido; Gln es un residuo de aminoácido de glutamina; cada uno de los L es independientemente un enlazador lineal o ramificado de 1 a 20 átomos de carbono, en donde uno o más de los átomos de carbono pueden estar opcional e independientemente reemplazados por un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre, y en donde cada uno de los átomos de carbono y nitrógeno puede estar opcionalmente sustituido; o cada uno de los L es opcional e independientemente un residuo de aminoácido; m es un número entero de 0 a 5; n es un número entero de 0 a 5; e Y es un agente funcional.
En otra realización, el sustrato donante de acilo está de acuerdo con una de las fórmulas (III) o (IV):
(Z)m-Gln-(L)n-(X) (III)
(X)-(L)n-Gln-(Z)m (IV)
en donde
Z es un grupo carboxilbenciloxi (CBZ) o un residuo de aminoácido; Gln es un residuo de aminoácido de glutamina; cada uno de los L es independientemente un enlazador lineal o ramificado de 1 a 20 átomos de carbono, en donde uno o más de los átomos de carbono pueden estar opcional e independientemente reemplazados por un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre, y en donde cada uno de los átomos de carbono y nitrógeno puede estar opcionalmente sustituido; o cada uno de los L es opcional e independientemente un residuo de aminoácido; m es un número entero de 0 a 5; n es un número entero de 0 a 5; y X es un grupo reactivo.
En una realización, Z es un grupo CBZ. En otra realización, Z es un residuo de aminoácido.
En una realización, L es un residuo de aminoácido. En una realización, n es 2-5 y cada uno de los L es independientemente un residuo de aminoácido. En otra realización, L es un enlazador lineal o ramificado de 1 a 20 átomos de carbono, en donde uno o más de los átomos de carbono pueden reemplazarse opcional e independientemente por un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre, y en donde cada uno de los átomos de carbono y nitrógeno puede estar opcionalmente sustituido. En otra realización, L es un resto de polietilenglicol (PEG). En otra realización, n es 2-5, y uno o más L comprende uno o más aminoácidos y uno o más grupos L adicionales comprende un resto de polietilenglicol (PEG).
En una realización, m es 0. En otra realización, m es 1. En otra realización, m es 2. En otra realización, m es 3. En otra realización, m es 4. En otra realización, m es 5.
En una realización, n es 0. En otra realización, n es 1. En otra realización, n es 2. En otra realización, n es 3. En otra realización, n es 4. En otra realización, n es 5.
En una realización, X es (1 R,8S,9s)-biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilmetanol (BCN). En otra realización, X es
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(DBCO). En otra realización, X es trans-cicloocteno (TCO). En otra realización, X es azido (N3). En otra realización, X es alquino. En otra realización, X es tetrazina metilciclopropeno. En otra realización, X es norborneno. En otra realización, X es hidrazida/hidrazina. En otra realización, X es aldehído.
En una realización, para un sustrato donante de acilo de acuerdo con la fórmula (I), Z es un grupo CBZ; L es un resto de polietilenglicol (PEG) (-O((CH2)2)-), etil amina (-NH((CH2)2)-) o propil amina (-NH((CH2)3)-); y n es 0, 1,2 o 3.
En otra realización, el sustrato donante de acilo está de acuerdo con la fórmula (I), en donde Z es un grupo CBZ y L es un aminoácido. En una realización, L es Gly. En un aspecto de esta realización, m es 1 y n es 1.
En una realización, el sustrato donante de acilo está de acuerdo con la fórmula (II), en donde Z es un grupo CBZ; m es 1; n es 1, 2 o 3; y al menos un L es una Gly.
En una realización, para un sustrato donante de acilo de acuerdo con la fórmula (III), Z es un grupo CBZ; L es un resto de polietilenglicol (PEG) (-O((CH2)2)-), etil amina (-NH((CH2)2)-) o propil amina (-n H((CH2)3)-); y n es 0, 1,2 o 3.
En otra realización, el sustrato donante de acilo está de acuerdo con la fórmula (III), en donde Z es un grupo CBZ y L es un aminoácido. En una realización, L es Gly. En un aspecto de esta realización, m es 1 y n es 1.
En una realización, el sustrato donante de acilo está de acuerdo con la fórmula (IV), en donde Z es un grupo CBZ; m es 1; n es 1, 2 o 3; y al menos un L es una Gly.
En una realización, la inmunoglobulina tiene de 1 a 20 residuos de aminoácidos añadidos después de la lisina C-terminal (p. e j, Lys447). En una realización, en donde se añade 1 residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el residuo de aminoácido añadido adyacente a la lisina C-terminal (posición de aminoácido 1) se selecciona del grupo que consiste en glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, tirosina, triptófano, serina, treonina, cisteína, asparagina, glutamina e histidina. En una realización, en donde se añade 1 residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el residuo de aminoácido añadido adyacente a la lisina C-terminal (posición de aminoácido 1) no es prolina, ácido aspártico o ácido glutámico. En una realización, en donde se añade 1 residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el residuo de aminoácido añadido adyacente a la lisina C-terminal (posición de aminoácido 1) no es lisina ni arginina.
En una realización, la inmunoglobulina tiene de 2 residuos de aminoácidos (posiciones de aminoácidos 1 y 2) añadidos después de la lisina C-terminal (p. ej., Lys447). En una realización, la inmunoglobulina tiene 3 residuos de aminoácidos (posiciones de aminoácidos de 1, 2, 3) añadidos después de la lisina C-terminal (p. ej., Lys447). En una realización, la inmunoglobulina tiene 4 residuos de aminoácidos (posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4) añadidos después de la lisina C-terminal (p. ej., Lys447). En una realización, la inmunoglobulina tiene 5 residuos de aminoácidos (posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4 y 5) añadidos después de la lisina C-terminal (p. ej., Lys447). En una realización, la inmunoglobulina tiene 6 residuos de aminoácidos (posiciones de aminoácidos de 1, 2, 3, 4, 5 y 6) añadidos después de la lisina C-terminal (p. ej., Lys447). En una realización, la inmunoglobulina tiene 7 residuos de aminoácidos (posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7) añadidos después de la lisina C-terminal (p. ej., Lys447). En una realización, la inmunoglobulina tiene 8 residuos de aminoácidos (posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8) añadidos después de la lisina C-terminal (p. ej., Lys447). En una realización, la inmunoglobulina tiene 9 residuos de aminoácidos (posiciones de aminoácidos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9) añadidos después de la lisina C-terminal (p. ej., Lys447). En una realización, la inmunoglobulina tiene 10 residuos de aminoácidos (posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6. 7, 8, 9 y 10) añadidos después de la lisina C-terminal (p. ej., Lys447). En una realización, la inmunoglobulina tiene 11 residuos de aminoácidos (posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11) añadidos después de la lisina C-terminal (p. ej., Lys447). En una realización, la inmunoglobulina tiene 12 residuos de aminoácidos (posiciones de aminoácidos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12) añadidos después de la lisina C-terminal (p. ej., Lys447). En una realización, la inmunoglobulina tiene 13 residuos de aminoácidos (posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9. 10, 11, 12 y 13) añadidos después de la lisina C-terminal (p. ej., Lys447). En una realización, la inmunoglobulina tiene 14 residuos de aminoácidos (posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14) añadidos después de la lisina C-terminal (p. ej., Lys447). En una realización, la inmunoglobulina tiene 15 residuos de aminoácidos (posiciones de aminoácidos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 15) añadidos después de la lisina C-terminal (p. ej., Lys447). En una realización, la inmunoglobulina tiene 16 residuos de aminoácidos (posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, +15 y 16) añadidos después de la lisina C-terminal (p. ej., Lys447). En una realización, la inmunoglobulina tiene 17 residuos de aminoácidos (posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 y 17) añadidos después de la lisina C-terminal (p. ej., Lys447). En una realización, la inmunoglobulina tiene 18 residuos de aminoácidos (posiciones de aminoácidos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18) añadidos después de la lisina C-terminal (p. ej., Lys447). En una realización, la inmunoglobulina tiene 19 residuos de aminoácidos (posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 y 19) añadidos después de la lisina C-terminal (p. ej., Lys447). En una realización, la inmunoglobulina tiene 20 residuos de aminoácidos (posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20) añadidos después de la lisina C-terminal (p. ej., Lys447).
En una realización, la inmunoglobulina tiene menos de 9 residuos de aminoácidos añadidos después de la lisina C-terminal (p. ej., Lys447). En una realización, la inmunoglobulina tiene menos de 13 residuos de aminoácidos añadidos después de la lisina C-terminal (p. ej., Lys447). En una realización, la inmunoglobulina no tiene la secuencia: GTYFQAYGT (SEQ ID NO: 1), GECTYFQAYGCTE (SEQ ID NO: 2) o GENTYFQAYGNTE (SEQ ID NO: 3) añadida después de la lisina C-terminal, p. ej., Lys447).
En una realización, en donde dos o más residuos de aminoácidos se añaden o están presentes después de la lisina C-terminal, el último residuo de aminoácido añadido o presente después de la lisina C-terminal (es decir, el residuo de aminoácido añadido más alejado de la lisina C-terminal) se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina. En una realización, en donde se añaden o están presentes dos o más residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, el último residuo de aminoácido añadido o presente después de la lisina C-terminal no es lisina ni arginina.
Los métodos descritos se pueden realizar en una inmunoglobulina humanizada. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la inmunoglobulina puede ser una inmunoglobulina humanizada.
Los métodos descritos se pueden realizar en una inmunoglobulina humanizada. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la inmunoglobulina puede ser una inmunoglobulina humana. En otra realización, la inmunoglobulina puede ser una inmunoglobulina no humana.
En una realización, los métodos descritos se pueden realizar en una inmunoglobulina IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En una realización, el método se realiza en una inmunoglobulina IgG1. En una realización, el método se realiza en una inmunoglobulina IgG2. En una realización, el método se realiza en una inmunoglobulina IgG3. En una realización, el método se realiza en una inmunoglobulina IgG4.
En una realización, los métodos descritos se pueden realizar en una inmunoglobulina IgA1, IgA2 o IgM. En una realización, el método se realiza en una inmunoglobulina IgA1. En una realización, el método se realiza en una inmunoglobulina IgA2. En una realización, el método se realiza en una inmunoglobulina IgM. En una realización, la inmunoglobulina IgA o IgM tiene un trozo de cola. En otra realización, la inmunoglobulina IgA o IgM tiene el trozo de cola eliminado.
En una realización, el método se realiza en una inmunoglobulina IgD o IgE. En una realización, el método se realiza en una inmunoglobulina IgD. En una realización, el método se realiza en una inmunoglobulina IgE.
Para los métodos descritos en esta memoria, en una realización, la transglutaminasa microbiana es de Actinomadura sp. T-2, Bacillus circulans BL32, Bacillus subtilis spores, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium glutamicum, Enterobacter sp. C2361, Providencia sp. C1112, Streptoverticillium mobaraense (aka Streptomyces mobarensis), Streptomyces platensis M5218, Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces lividans, Streptomyces lividans JT46/pAE053, Streptomyces lydicus, Streptomyces platensis, Streptomyces sioyansis, Streptoverticillium griseocarneum, Streptoverticillium ladakanum NRRL-3191, Streptoverticillium sp. s-8112 o Streptococcus suis. En una realización, la transglutaminasa microbiana es de Streptomyces mobarensis.
Para los métodos descritos en esta memoria, en una realización, la transglutaminasa se aísla de una planta seleccionada del grupo que consiste en Medicago sativa, Beta vulgaris, Helianthus tuberosus, Zea mays, Glycine max, Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Chlamydomonas reinhardtii, Dunaliella salina, Oryza sativa y Rosmarinus officinalis L.
Para los métodos descritos en esta memoria, en una realización, la transglutaminasa es de mamífero y se aísla de Transglutaminasa 1 a 7 y Factor XIII.
En una realización, la transglutaminasa es al menos 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una transglutaminasa microbiana descrita en esta memoria. En una realización, la transglutaminasa es al menos 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la transglutaminasa microbiana de Streptomyces mobarensis. Las enzimas transglutaminasa se pueden adquirir de Ajinomoto® o Zedira (Número de producto T001). En otra realización, la transglutaminasa está purificada. En otra realización, la transglutaminasa se expresa de forma recombinante y posteriormente se purifica utilizando métodos conocidos por un experto ordinario en la técnica.
En una realización, la enzima transglutaminasa está presente en los métodos descritos en esta memoria en una concentración de aproximadamente 0,1 unidades/mL a aproximadamente 250 unidades/mL. En una realización, la enzima transglutaminasa está presente en los métodos descritos en esta memoria en una concentración de aproximadamente 1 unidad/mL a aproximadamente 25 unidades/mL. En una realización, la enzima transglutaminasa está presente en los métodos descritos en esta memoria en una concentración de aproximadamente 1 unidad/mL a aproximadamente 25 unidades/mL. En una realización, la enzima transglutaminasa está presente en los métodos descritos en esta memoria en una concentración de aproximadamente 0,1 unidades/mL. En una realización, la enzima transglutaminasa está presente en los métodos descritos en esta memoria en una concentración de aproximadamente 0,5 unidades/mL. En una realización, la enzima transglutaminasa está presente en los métodos descritos en esta memoria en una concentración de aproximadamente 1 unidades/mL. En una realización, la enzima transglutaminasa está presente en los métodos descritos en esta memoria en una concentración de aproximadamente 5 unidades/mL. En una realización, la enzima transglutaminasa está presente en los métodos descritos en esta memoria en una concentración de aproximadamente 10 unidades/mL. En una realización, la enzima transglutaminasa está presente en los métodos descritos en esta memoria en una concentración de aproximadamente 15 unidades/mL. En una realización, la enzima transglutaminasa está presente en los métodos descritos en esta memoria en una concentración de aproximadamente 20 unidades/mL. En una realización, la enzima transglutaminasa está presente en los métodos descritos en esta memoria en una concentración de aproximadamente 25 unidades/mL. En una realización, la enzima transglutaminasa está presente en los métodos descritos en esta memoria en una concentración de aproximadamente 50 unidades/mL. En una realización, la enzima transglutaminasa está presente en los métodos descritos en esta memoria en una concentración de aproximadamente 75 unidades/mL. En una realización, la enzima transglutaminasa está presente en los métodos descritos en esta memoria en una concentración de aproximadamente 100 unidades/mL. En una realización, la enzima transglutaminasa está presente en los métodos descritos en esta memoria en una concentración de aproximadamente 150 unidades/mL, 200 unidades/mL o 250 unidades/mL.
Para los métodos proporcionados en esta memoria, en una realización, la relación de agente funcional a inmunoglobulina es de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 2:1. En una realización, la relación de agente funcional a inmunoglobulina es de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 2:1. En una realización, la relación de agente funcional a inmunoglobulina es de aproximadamente 1:1. En una realización, la relación de agente funcional a inmunoglobulina es de aproximadamente 2:1. En una realización, la relación de agente funcional a inmunoglobulina es conocida y es consistentemente reproducible siguiendo los métodos descritos en esta memoria. La relación de agente funcional a inmunoglobulina, tal como se utiliza en esta memoria, se calcula en base a un promedio de la relación de conjugación del agente funcional a una inmunoglobulina en un conjunto de anticuerpos en una composición.
En realizaciones proporcionadas en esta memoria, en donde al menos dos residuos de aminoácidos adicionales están presentes después de la lisina C-terminal, y en donde uno de los al menos dos residuos de aminoácidos adicionales comprende una lisina, la relación de agente funcional a inmunoglobulina aumenta en función del número de residuos de aminoácidos adicionales que son lisina. Por ejemplo, en donde dos residuos de aminoácidos adicionales están presentes después de una lisina C-terminal, y uno de los residuos de aminoácidos adicionales también es una lisina, hay dos residuos de lisina presentes, lo que da como resultado un anticuerpo con cuatro sitios de transamidación y una relación de agente funcional a inmunoglobulina de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 4:1. Como otro ejemplo, en donde cinco residuos de aminoácidos adicionales están presentes después de una lisina C-terminal, y dos de los residuos de aminoácidos adicionales son lisinas, hay (total) tres residuos de lisina presentes, lo que da como resultado un anticuerpo con seis sitios de transamidación y una relación de agente funcional a inmunoglobulina de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 6:1.
Inmunoglobulinas conjugadas
También se describen en esta memoria inmunoglobulinas conjugadas que comprenden cualquiera de las inmunoglobulinas descritas en esta memoria, en donde la lisina en la posición C-terminal (por ejemplo, la lisina en la posición 447 o "Lys447") tiene al menos un residuo de aminoácido adicional después de la lisina C-terminal, y se conjuga con un agente funcional que comprende un sustrato donante de acilo, en donde el sustrato donante de acilo comprende un residuo de glutamina. Realizaciones adicionales incluyen inmunoglobulinas conjugadas que comprenden cualquiera de las inmunoglobulinas descritas en esta memoria, en donde la lisina en la posición C-terminal (por ejemplo, la lisina en la posición 447 o "Lys447") tiene al menos un residuo de aminoácido adicional después de la lisina C-terminal, y se conjuga con un sustrato donante de acilo, en donde el sustrato donante de acilo comprende un residuo de glutamina y un grupo reactivo, en donde el grupo reactivo puede reaccionar con un agente funcional después de la conjugación del sustrato donante de acilo con la inmunoglobulina.
En una realización, el residuo de aminoácido adyacente a la lisina C-terminal (posición de aminoácido 1) comprende glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, tirosina, triptófano, serina, treonina, cisteína, asparagina, glutamina o histidina. En una realización, el residuo de aminoácido adyacente a la lisina C-terminal (posición de aminoácido 1) comprende glicina. En una realización, el residuo de aminoácido adyacente a la lisina C-terminal (posición de aminoácido 1) comprende alanina. En una realización, el residuo de aminoácido adyacente a la lisina C-terminal (posición de aminoácido 1) comprende valina. En una realización, el residuo de aminoácido adyacente a la lisina C-terminal (posición de aminoácido 1) comprende leucina. En una realización, el residuo de aminoácido adyacente a la lisina C-terminal (posición de aminoácido 1) comprende isoleucina. En una realización, el residuo de aminoácido adyacente a la lisina C-terminal (posición de aminoácido 1) comprende metionina. En una realización, el residuo de aminoácido adyacente a la lisina C-terminal (posición de aminoácido 1) comprende fenilalanina. En una realización, el residuo de aminoácido adyacente a la lisina C-terminal (posición de aminoácido 1) comprende tirosina. En una realización, el residuo de aminoácido adyacente a la lisina C-terminal (posición de aminoácido 1) comprende triptófano. En una realización, el residuo de aminoácido adyacente a la lisina C-terminal (posición de aminoácido 1) comprende serina. En una realización, el residuo de aminoácido adyacente a la lisina C-terminal (posición de aminoácido 1) comprende treonina. En una realización, el residuo de aminoácido adyacente a la lisina C-terminal (posición de aminoácido 1) comprende cisteína. En una realización, el residuo de aminoácido adyacente a la lisina C-terminal (posición de aminoácido 1) comprende asparagina. En una realización, el residuo de aminoácido adyacente a la lisina C-terminal (posición de aminoácido 1) comprende glutamina. En una realización, el residuo de aminoácido adyacente a la lisina C-terminal (posición de aminoácido 1) comprende histidina. En una realización, en donde se añade 1 residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el residuo de aminoácido añadido adyacente a la lisina C-terminal (posición de aminoácido 1) no es prolina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina o arginina.
En otra realización, si se añade más de un aminoácido a la lisina C-terminal, el último aminoácido adicional (es decir, el aminoácido localizado en el extremo C de los residuos de aminoácidos añadidos) puede ser cualquier aminoácido, excepto lisina o arginina. Por ejemplo, donde se añaden dos residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, la secuencia comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal (posición de aminoácido 1) y un segundo aminoácido después de la lisina C-terminal (posición de aminoácido 2), en donde el primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal (posición de aminoácido 1) es cualquier residuo de aminoácido excepto ácido aspártico, ácido glutámico o prolina, y en donde el segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal (posición de aminoácido 2) se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina. En una realización, el primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal es lisina o arginina. En otra realización, el segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal (posición de aminoácido 2) no es lisina o arginina.
Como otro ejemplo, en donde se añaden cinco residuos de aminoácidos después de una lisina C-terminal (posiciones de aminoácidos 1, 2, 3, 4 y 5), la secuencia comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal (posición de aminoácido 1), un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal (posición de aminoácido 2), un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal (posición de aminoácido 3), un cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal (posición de aminoácido 4) y un quinto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal (posición de aminoácido 5). El primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal puede ser cualquier residuo de aminoácido excepto ácido aspártico, ácido glutámico o prolina. Los residuos de aminoácidos segundo, tercero y cuarto después de la lisina C-terminal pueden ser cualquier aminoácido. Sin embargo, el quinto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal (posición de aminoácido 5) se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina. En otra realización, el quinto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal (posición de aminoácido 5) no es lisina o arginina. En otra realización, el o los residuos de aminoácidos primero, segundo, tercero o cuarto (posiciones de aminoácidos 1, 2, 3 y/o 4) después de la lisina C-terminal pueden ser en cada caso lisina o arginina.
En algunas realizaciones, la inmunoglobulina puede estar humanizada. En otras realizaciones, la inmunoglobulina es humana. En otra realización, la inmunoglobulina es quimérica.
El sustrato donante de acilo que comprende un residuo de glutamina y un grupo reactivo también puede comprender un enlazador, "L". Igualmente, los agentes funcionales que contienen un sustrato donante de acilo que comprende un residuo de glutamina pueden tener un enlazador entre el agente funcional y la porción de sustrato donante de acilo de la molécula. Los enlazadores pueden ser enlazadores no escindibles o enlazadores escindibles. Enlazadores ejemplares incluyen, por ejemplo, enlazadores que contienen disulfuro, enlazadores basados en acetal y enlazadores basados en cetal. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador no escindible. Enlazadores no escindibles adecuados incluyen, pero no se limitan a polietilenglicol (PEG) o un alquilo. En algunas realizaciones, el enlazador puede comprender PEG. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador escindible. Enlazadores escindibles adecuados incluyen, por ejemplo, valina-citrulina-para aminobencilo. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador que contiene disulfuro. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador basado en acetal. En algunos aspectos, el enlazador puede ser un enlazador basado en cetal.
Las inmunoglobulinas conjugadas de la invención comprenden un agente funcional. Agentes funcionales adecuados incluyen, por ejemplo, un agente terapéutico o un agente de diagnóstico. Agentes funcionales adecuados incluyen, por ejemplo, fluoróforos, colorantes fluorescentes, polipéptidos, inmunoglobulinas, antibióticos, ácidos nucleicos, radionucleidos, enlazadores químicos, moléculas pequeñas, quelantes, lípidos y fármacos. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un fluoróforo. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un colorante fluorescente. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un polipéptido. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender una inmunoglobulina. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un antibiótico. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un ácido nucleico (tal como ADN o ARN). En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un radionucleido. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender una molécula pequeña. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un quelante (por ejemplo, DOTA, CHX-A"-DTPA, NOTA, entre otros). En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un lípido. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender un fármaco. En algunos aspectos, el agente funcional puede comprender una combinación de cualquiera de los agentes funcionales arriba enumerados.
Por consiguiente, las inmunoglobulinas conjugadas descritas incluyen, pero no se limitan a conjugados de lisina C-terminal de inmunoglobulina-fluoróforo, conjugados de lisina C-terminal de inmunoglobulina-colorante fluorescente, conjugados de lisina C-terminal de inmunoglobulina-polipéptido, conjugados de lisina C-terminal de inmunoglobulinainmunoglobulina, conjugados de lisina C-terminal de inmunoglobulina-antibiótico, conjugados de lisina C-terminal de inmunoglobulina-ácido nucleico, conjugados de lisina C-terminal de inmunoglobulina-radionucleido, conjugados de lisina C-terminal de inmunoglobulina-enlazador químico, conjugados de lisina C-terminal de inmunoglobulina-molécula pequeña, conjugados de lisina C-terminal de inmunoglobulina-quelante, conjugados de lisina C-terminal de inmunoglobulina-lípido y conjugados de lisina C-terminal de inmunoglobulina-fármaco.
Cualquiera de las inmunoglobulinas descritas en esta memoria puede conjugarse con cualquiera de los agentes funcionales descritos en esta memoria. Por ejemplo, la inmunoglobulina conjugada puede comprender un fluoróforo, un colorante fluorescente, un polipéptido, una inmunoglobulina, un antibiótico, un ácido nucleico, un radionucleido, un enlazador químico, una molécula pequeña, un quelante, un lípido o un fármaco.
En algunas realizaciones, la inmunoglobulina se puede conjugar con un agente antineoplásico de molécula pequeña tal como una auristatina. En algunos aspectos, el agente funcional puede ser auristatina F (AuF). Por lo tanto, las inmunoglobulinas conjugadas descritas incluyen cualquiera de las inmunoglobulinas arriba descritas conjugadas con auristatina F (conjugado AuF Lys447).
Composiciones farmacéuticas
También se proporcionan en esta memoria composiciones farmacéuticas. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden comprender cualquiera de las inmunoglobulinas descritas en esta memoria. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden comprender cualquiera de las inmunoglobulinas conjugadas descritas en esta memoria. En una realización, la composición farmacéutica comprende la inmunoglobulina conjugada y un soporte farmacéuticamente aceptable.
Moléculas de ácido nucleico que codifican inmunoglobulinas y células huésped que comprenden las mismas
También se proporcionan en esta memoria moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las inmunoglobulinas descritas en esta memoria. Como ejemplo, en una realización, la molécula de ácido nucleico codifica una inmunoglobulina que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, teniendo la región variable de la cadena ligera una lisina en la posición C-terminal (por ejemplo, posición 447 o "Lys447") y uno o más aminoácidos después de la lisina C-terminal seleccionados de glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, tirosina, triptófano, serina, treonina, cisteína, asparagina, glutamina e histidina.
También se describen células huésped que comprenden cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas. Células huésped adecuadas incluyen, pero no se limitan a células de mamífero, células bacterianas, células de levadura, células de insecto, por nombrar unas pocas.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir adicionalmente algunas de las realizaciones descritas en esta memoria. Los ejemplos pretenden ilustrar, no limitar, las realizaciones descritas.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Materiales y Métodos
Mutagénesis
Las mutaciones se generaron utilizando QuikChange XL de Stratagene de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las mutaciones deseadas fueron confirmadas por secuenciación de ADN.
Transfección y generación de líneas celulares estables
Por cada mililitro de células a transfectar con ExpiFectamine se incubaron 333,3 ng de plásmido HC y 333,3 ng de plásmido LC durante 5 - 10 min en 50 pL de Opti-MEM (ThermoFisher). Asimismo, se incubaron 2,67 pL de ExpiFectamine en 50 pL de Opti-MEM. La solución de ExpiFectamine se añadió a la mezcla de ADN y se incubó durante 20-30 min a temperatura ambiente. La mezcla de ADN:ExpiFectamine se añadió a las células mientras se agitaba y se incubaba a 37°C, 8 % de CO2, agitando a 125 rpm. Al día siguiente, se añadieron a la transfección 5 pL de potenciador 1 y 50 pL de potenciador 2 por mL de células y se continuó con la incubación durante otros 7-10 días.
Los grupos estables que expresan anticuerpos se seleccionaron añadiendo 1 mL de transfectantes a 14 mL de DMEM en un matraz T75 con 5 pg/mL de blasticidina y 400 pg/mL de zeocina (Invivogen) uno a tres días después de la transfección. Después de que las células resistentes a los fármacos crecieran hasta la confluencia, el medio se reemplazó por medio de expresión FreeStyle 293 durante 24 a 48 h. Las células se expulsaron físicamente golpeando el matraz (la tripsinización resultó en una baja viabilidad, datos no mostrados) y luego se sembraron a razón de 6 x 105 células/mL en 30 mL de medio de expresión FreeStyle 293 en un matraz agitado de 125 mL. Los cultivos se incubaron a 37 °C en 8 % de CO2 con agitación a 125 rpm.
Producción de mAb
Grupos de líneas celulares transfectadas de forma estable se sembraron a razón de 0,6 a 1 x 106 células/mL en medio de expresión FreeStyle 293. Las células se incubaron a 37 °C, 8 % de CO2 agitando a 125 rpm. Dos días después de que el cultivo alcanzara una densidad de 1 x 106 células/mL, los cultivos se alimentaron con concentraciones finales de 10 g/L de Select Soytone (BD Biosciences), ácido valérico 5 mM (Sigma Aldrich) y Concentrado de CD Lipid 1:100 (ThermoFisher). Cuando la viabilidad celular fue inferior al 50 % (7-10 días), los cultivos se centrifugaron durante 1 h a 8000 rpm en un rotor Beckman JLA8.1000. A continuación, el sobrenadante se filtró a través de un filtro PES de 0,2 pm y se almacenó a 4 °C o -20 °C hasta la purificación.
Purificación de mAb
MAbs se purificaron utilizando uno de dos métodos. Para sobrenadantes de mAb de menos de 10 mL se realizó una cromatografía de afinidad utilizando un método de purificación discontinua con resina de proteína A. Sobrenadantes de MAb superiores a 25 mL se purificaron utilizando columnas de proteína A pre-empaquetadas.
Purificación discontinua
Resina Prosep-vA High Capacity Protein A (Millipore) se equilibró con DPBS y se añadieron 100 pL a 3 a 6 mL de muestra. Después de la incubación a 4 °C durante 1 hora o toda la noche, la resina se lavó tres veces con 1 mL de DPBS y se centrifugó a 18000 x g durante 30 s. La muestra se eluyó de la resina mediante la adición de 400 pL de glicina 0,1 M, pH 2,9, seguido de centrifugación a 18.000 x g durante 30 s. La muestra se neutralizó con 40 pL de Tris 1 M, pH 8,0. El tampón se intercambió utilizando 0,5 mL de Amicon Ultra, filtros de corte 10 k (Millipore) concentrando la muestra a ~ 100 pL mediante centrifugación a 18.000 x g durante 3 a 5 minutos. La muestra concentrada se diluyó en 400 pL de DPBS, seguido de centrifugación. El proceso se repitió un total de cuatro veces.
Purificación de la columna
Se equilibró una columna de proteína A (GE Healthcare) con 10 volúmenes de columna (CV, por sus siglas en inglés) de fosfato sódico 20 mM, EDTA 10 mM, pH 7,2. Luego se cargó la muestra, seguido de lavado del material no unido con 10 CV de tampón de equilibrio. La muestra se eluyó utilizando 5 CV de glicina 0,1 M, pH 2,9. Las fracciones que contenían el mAb se agruparon y dializaron en DPBS utilizando un aparato MWCO 20K Slide-A-Lyzer (ThermoFisher).
Síntesis de sustrato Z-Gln-Gly
Z-Gln-Gly-OH se adquirió de Bachem y Z-Gln-Gly-CAD-biotina se adquirió de Zedira (Figura 2).
La síntesis del éster de Z-Gln-Gly-pentafluorofenilo (Z-Gln-Gly-PFP) fue de Pasternack et al. {Pasternack, 1997 15 /id}, con modificaciones (Figura 3). Se disolvieron Z-Gln-Gly-OH (328,8 mg, 0,975 mmol) y pentafluorofenol (Sigma, 183,3 mg, 0,996 mmol) en 10 mL de W,W-dimetilformamida (DMF). Luego se añadió EDAC-HCl (Sigma, 201 mg, 1,04 mmol) y la reacción se incubó a temperatura ambiente bajo N2 durante 2 h. Se añadieron a la reacción 100 mL de dietil éter frío y se precipitó durante la noche a -80 °C. El producto bruto se recogió por centrifugación y se recristalizó en 20 mL de metanol a 60 °C. El producto final se lavó con dietil éter frío y se secó sobre una corriente de N2. El rendimiento final fue de 219,04 mg (44,7%). ESI-MS (infusión directa en acetonitrilo al 50 % en ácido fórmico al 0,1 %) m/z 504,0 ([M+H], 86 %), 526,0 ([M+Na], 100 %), 542,0 ([M+K] , 22%).
Z-GIn-Gly-propil azida (Z-Gln-Gly-N3)
Z-Gln-Gly-PFP (21,24 mg, 4,22 x 10-5 mol) y azidopropilamina (Click Chemistry Tools, 42,2 pL de una solución madre 0,91 M en DMF, 3,84 x 10-5 mol) se disolvieron en un volumen final de 0,42 mL de DMF. La reacción se agitó bajo N2 durante la noche a temperatura ambiente. El producto se purificó por HPLC utilizando una fase móvil de ácido fórmico al 0,1 % en H2Ü/ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo. El producto se secó in vacuo. El rendimiento final fue de 10,7 mg (60,4%). ESI-MS (purificación en gradiente) m/z 420,2 ([M+H], 100 %), 442,1 ([M+Na], 32 %).
Z-Gln-Glv-PEG3-enoto-bic¡clonon¡na (Z-Gln-Glv-PEG3-BCN)
Z-Gln-Gly-PFP (18,4 mg, 3,66 x 10-5 mol) y endo-biciclo[6,1,0]non-4-in-9-il-PEG3-amina (Conju-Probe, 175 pL de una solución madre 0,27 M en DMF, 4,75 x 10-5 mol) se disolvieron en un volumen final de 0,37 mL de DMF. La reacción se agitó bajo N2 durante la noche a temperatura ambiente. El producto se purificó por HPLC utilizando una fase móvil de ácido fórmico al 0,1 % en H2Ü/ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo. El producto se secó in vacuo. El rendimiento final fue de 0,6 mg (2%). ESI-MS (purificación en gradiente) m/z 688,2 ([M+H], 100 %), 710,2 ([M+Na], 69 %).
Z-Gln-Glv-PEG2-Auristatina F (Z-Gln-Glv-PEG2-AuF)
Z-Gln-Gly-PFP (22,2 mg, 4,37 x 10-5 mol) se disolvió en 0,85 mL de DMF y se añadió 1,2-etilendiamina (2,3 x 10-5 L, 3,5 x 10-4 mol) y se mezcló. La reacción se agitó bajo N2 durante la noche a temperatura ambiente. El producto se purificó por HPLC utilizando una fase móvil de ácido fórmico al 0,1 % en H2Ü/ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo. El producto se secó in vacuo. El rendimiento final de Z-Gln-Gly-NH2 fue de 3,8 mg (23 %). ESI-MS (purificación en gradiente) m/z 380,1 ([M+H], 100 %). Z-Gln-Gly-NH2 (3,8 mg, 1,01 x 10-5 mol) y NHS-PEG2-AuF (10,3 mg, 1,03 x 10­ 5 mol) se disolvieron en 0,2 mL de DMF. Se añadió trietilamina (14 pL, 1 x 10-4 mol) y la reacción se incubó bajo N2 durante la noche a temperatura ambiente. La mitad de la reacción se purificó por HPLC utilizando una fase móvil de ácido fórmico al 0,1 % en H2Ü/ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo. El producto se secó in vacuo. El rendimiento final de CBZ-Gln-Gly-PEG2-AuF fue de 3,8 mg (60 %). ESI-MS (purificación en gradiente) m/z 634,0 ([M+H]2+,100 %), 645,1 ([M+Na]2+,45 %). 1267,0 ([M+H], 16 %).
Reacción de transglutaminasa microbiana
Se incubaron mAbs en concentraciones de 100 pg/mL a 2,5 mg/mL con 785 pM de Z-Gln-Gly-biotina (Zedira), Z-Gln-Gly-N3, Z-Gln-Gly-BCN o Z-Gln-Gly-PEG2-AuF con 1 U/mL de transglutaminasa microbiana (Zedira) en DPBS durante al menos 16 h a 37 °C.
Cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC)/análisis ESI-MS de conjugación de mAb
Anticuerpos purificados se diluyeron a 1 mg/mL en DPBS (si las muestras se dejaban en la concentración original por debajo de 1,0 mg/mL). Las reacciones que contenían dimetilsulfóxido (DMSO) se desalinizaron utilizando una columna de desalinización por rotación Zeba. A continuación, los mAbs se desglicosilaron utilizando PNGase F (NEB) o se digirieron en fragmentos Fab’2 y Fc mediante IdeS (Promega). Para desglicosilar los mAbs, se añadieron tampón G7 (5 o 10 pL) y PNGase F (1 o 2 pL) al mAb (50 o 100 pL). La reacción se incubó en un microondas Discover (CEM) durante 2 ciclos: 1.) potencia de microondas 10 W, 37 °C, 10 min, y luego esperar de 3 a 5 min; 2.) potencia de microondas 2 W, 37°C, 10 min. Se redujo una porción de la muestra desglicosilada añadiendo ditiotreitol (DTT) a una concentración final de 20 mM, seguido de incubación a 60 °C durante 3 min. Para generar fragmentos Fab’2 y Fc, se añadieron 50 U/pL de IdeS a 0,5 mg/mL de mAb y se incubaron a 37 °C durante 0,5-1 h. Las muestras de IdeS no se redujeron, excepto el Anticuerpo 01-C, que se redujo como se indicó anteriormente.
A continuación, las muestras se analizaron utilizando un espectrómetro de masas Waters Acquity UPLC y Q-Tof Premier. Las muestras (0,5-2 pg cada una) se inyectaron en una microcolumna de desalinización MassPrep a 65 °C, se eluyeron de la columna con un equilibrio de 5 min en el 95 % de la fase móvil A, un gradiente de 10 min (5-90 % de B), y un reequilibrio de 10 min en el 95 % de la fase móvil A, a 0,05 mL/min. La fase móvil A era ácido fórmico al 0,1 % en agua. La fase móvil B era ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo. El espectrómetro de masas Q-Tof se hizo funcionar en modo V de iones positivos con detección en el intervalo de 500-4000 m/z. Los parámetros de la fuente fueron los siguientes: tensión capilar, 2,25 kV (anticuerpo intacto)-2,50 kV (anticuerpo reducido); tensión del cono de muestreo, 65,0 V (anticuerpo intacto) o 50,0 V (anticuerpo reducido); temperatura de la fuente, 100 °C; temperatura de desolvatación, 250 °C; flujo de gas de desolvatación, 550 L/h. El pico de proteína se desconvolucionó utilizando la función MassLynx MaxEnt 1.
Cromatografía líquida de fase inversa (LC)-MS
El anticuerpo 01 -L (1 mg/mL) se incubó durante la noche con un exceso molar de 50 veces de Z-Gln-Gly-PEG2-AuF en presencia de 1 U/mL de TGase a 37 °C. El mAb se digirió en fragmentos Fab’2 y Fc mediante IdeS y se redujo con DTT como antes. La muestra se analizó utilizando HPLC de Waters Alliance con detectores SQD y PDA. La muestra (0,5-2 pg) se inyectó en una columna Proteomix RP-1000 (4,6 x 50 mm, Sepax) a 65 °C. La separación de los fragmentos LC, Fc y Fd se produjo con un equilibrio de 1,5 minutos en el 75 % de la fase móvil A (TFA al 0,1 % en agua), y un gradiente de 13,5 minutos [25-65 % de fase móvil B (TFA al 0,1 % en acetonitrilo)] a un caudal de 1 mL/min.
El espectrómetro de masas SQD se hizo funcionar en modo V de iones positivos con detección en el intervalo de 200­ 2000 m/z. Los parámetros de la fuente fueron los siguientes: tensión capilar, 3,00 kV; tensión del cono de muestreo, 40°C; temperatura de la fuente, 120 °C; temperatura de desolvatación, 250 °C; flujo de gas de desolvatación, 800 L/h. Tiempo de escaneo, 1 segundo. El pico de proteína se desconvolucionó mediante la función MassLynx MaxEnt 1. El detector de PDA estaba a 280 nm.
Ejemplo 2: Análisis de Lisinas Expuestas a Disolventes en Anticuerpos IgG
Se examinaron las estructuras cristalinas de un Fab de IgG1-kappa (Anticuerpo 01, 4F3F), un Fab de IgG1-lambda (4HK0) y Fc de IgG 1 (1FC1) en cuanto a sitios aceptores de acilo potenciales. Dado que la transglutaminasa microbiana tiende a preferir las glutaminas y lisinas de sustrato expuestas a disolventes dentro de los bucles {Spolaore, 2012 17 /id}, las lisinas expuestas a disolventes se resaltaron utilizando Discovery Studio v4.5 con un radio de sonda de 1,4 Á (Figura 4). Hay 7 lisinas expuestas a disolventes en el Anticuerpo 01 VH con bucles de 3 pulgadas (7,6 cm). Dado que el número de lisinas puede variar entre los mAbs debido a la utilización de diferentes familias de regiones variables y la hipermutación somática, también se analizó la exposición a disolventes de las lisinas en la región VH de otros cinco anticuerpos en función de posiciones análogas de residuos en la estructura 4F3F. Estas regiones VH contienen potencialmente de 1-5 lisinas expuestas a disolventes con 1 o 2 presentes en un bucle. En el Anticuerpo 01 Vk hay 6 lisinas expuestas a disolventes y 4 están en bucles. Las regiones VK de otros cuatro anticuerpos contienen potencialmente 3-5 lisinas expuestas a disolventes con un bucle de 2 pulgadas (7,6 cm). El anticuerpo 05 utiliza una cadena lambda y la exposición de las lisinas al disolvente se determinó utilizando la estructura cristalina de 4HK0 en función de la similitud de secuencia de la cadena ligera. El anticuerpo 05 tiene potencialmente 2 lisinas expuestas a disolventes en el dominio VA con solo 1 en un bucle.
Los dominios constantes de CH1 y kappa, Fc y lambda se analizaron utilizando las estructuras cristalinas de 4F3F, 1FC1 y 4HK0, respectivamente. Los dominios constantes de IgG1 tienen 23 lisinas expuestas a disolventes con bucles de 13 pulgadas (33 cm). La región constante kappa tiene 8 lisinas con un bucle de 5 pulgadas (12,7 cm). La lambda tiene 6 lisinas expuestas a disolventes con la mitad en bucles. En total, los anticuerpos analizados varían de 42 a 50 lisinas expuestas a disolventes en bucles por mAb.
Para determinar si la transglutaminasa microbiana puede transamidar un residuo de lisina nativo en un anticuerpo IgG, los anticuerpos se incubaron con un exceso molar de 50 veces de Z-Gln-Gly-CAD-biotina y 1 U/mL de transglutaminasa microbiana a 37 °C durante la noche. Las muestras se digirieron con IdeS y se redujeron con DTT, y las masas de los fragmentos LC, Fd y Fc se analizaron mediante espectrometría de masas. Las muestras no se desglicosilaron y se observaron dos picos de masa correspondientes a las glicoformas G0F (+1445 Da) y GIF (+1608 Da) para cada uno de los Fc. El anticuerpo 04 también contiene un sitio de glicosilación enlazado a N en VH y se observaron dos especies de glicano, G2FS y G2FS2. Todas las muestras carecían de lisina C-terminal (128 Da), como se evidencia por la diferencia de -130 a -132 Da entre la masa observada y la teórica para el Fc. Aunque hay 42-50 lisinas aceptoras de acilo potenciales en los diferentes anticuerpos, ni la HC ni la LC fueron modificadas por el sustrato donante de acilo (Figura 6, Tabla 1).
Tabla 1 - Análisis ESI-MS de anticuerpos incubados con un donante de acilo y
transglutaminasa microbiana
ZQG-CAD-biotina 631 Da
Figure imgf000031_0001
Tabla 1: Las masas de LC, Fd y Fe se determinaron por ESI-MS en la Figura 6. La masa
teórica de cada fragmento se determinó por la secuencia de aminoácidos restada de la
masa observada para determinar el cambio en masa (Amasa). Una Amasa de -128 Da se
debe a la escisión de Lys447. El Fe está glicosilado con uno o dos oligosacáridos, GOF o
G1F.
También se analizaron dos controles positivos generados que contenían un péptido con dos sitios aceptores de acilo de lisina conocidos (GGSTKHKIPGGS (SEQ ID NO: 6); {Takazawa, 200423 /id} genéticamente fusionados al extremo C del Anticuerpo 01 HC o LC (HC-KTag o LC -KTag, respectivamente). Los mAbs KTag se incubaron con Z-Gln-Gly-CAD-biotina y transglutaminasa microbiana.
Las muestras se desglicosilaron con PNGase F y se redujeron con DTT. Las masas de las cadenas pesada y ligera se analizaron por espectrometría de masas. El mAb LC-KTag se modificó con hasta dos moléculas de Z-Gln-Gly-CAD-biotina, de acuerdo con la modificación de las dos lisinas en el KTag (Figura 7, Tabla 2).
Tabla 2 - Transamidación de un K-Tag C-terminal
Z-GIn-Gl -CAD-biotina: 631 Da
Figure imgf000031_0002
Figure imgf000031_0003
Las masas de HC y LC se determinaron mediante ESI-MS en la Figura 7. La masa teórica de cada uno de los fragmentos se determinó restando la secuencia de aminoácidos de la masa observada para determinar el cambio de masa (Amasa). Una Amasa de -128 Da se debe a la escisión de Lys447, y una Amasa de 631 Da indica la adición de una Z-Gln-Gly-CAD-biotina. El número de moléculas de Z-Gln-Gly-CAD-biotina conjugadas en HC o LC se determinó dividiendo el cambio de masa por la masa de Z-Gln-Gly-CAD-biotina. El porcentaje de conjugación se determinó dividiendo la intensidad de la señal de un único pico HC o LC por la suma de las intensidades de todos los picos HC o LC de la muestra.
Sorprendentemente, la adición de KTag a HC dio como resultado la adición no solo de dos, sino de hasta tres moléculas de Z-Gln-Gly-CAD-biotina a HC. Dado que solo hay dos lisinas en el KTag, una lisina en el mAb fue el tercer sitio aceptor de acilo. Dada la proximidad al KTag, el sitio aceptor de lisina mAb más probable era la cadena pesada Lys447.
Ejemplo 3: Una Extensión de un Solo Aminoácido es Suficiente para la Transamidación de Lys447 Lys447 se escinde típicamente mediante carboxipeptidasa B durante la expresión de IgG recombinante en células HEK293 y CHO {Harris, 19907 /id; Harris, 19956 /id; Dick, 20083 /id}. Sin embargo, la adición de KTag al extremo C de HC bloquea la eliminación de Lys447, permitiendo con ello que la transglutaminasa microbiana utilice Lys447 como un sitio aceptor de acilo. Para determinar si la transglutaminasa microbiana podría utilizar Lys447 como aceptor de acilo sin una KTag, se bloqueó la escisión de Lys447 mediante la adición de una o dos leucinas en el extremo C del Anticuerpo 01 (Anticuerpo 01-HC-L o Anticuerpo 01-HC- LL, respectivamente). MAbs purificados se incubaron con Z-Gln-Gly-CAD-biotina y transglutaminasa microbiana y se analizó la masa de HC desglicosilada. De hecho, la adición de una o dos leucinas retuvo Lys447, y la HC se modificó con un solo sustrato donante de acilo consistente con la transamidación de Lys447 (Figura 8 ; Tabla 3).
Tabla 3 - Transamidación de Anticuerpo 01 con una leucina C-terminal
Z-Gln-Gly-CAD-biotina: 631 Da
%
Extremo C Calculado Observado AMasa conjugado
Anticuerpo 01 ...SPGK 48803 -134 0.0%
Anticuerpo 01-FIC-L — S P C p K - L 49674 624 100.09Í
Anticuerpo 01-FIC-LL ...SPGK-LL
Figure imgf000032_0001
49788 624 100.0%
Las masas de HC y LC se determinaron mediante ESI-MS. El porcentaje de conjugación de Z-Gln-Gly-CAD-biotina (Amass = 631 Da) a un mAb se determinó como en la Tabla 2.
Se añadió una leucina C-terminal a otros dos mAbs. Los mAbs de tipo salvaje y mutantes se incubaron con transglutaminasa microbiana y Z-Gln-Gly-CAD-biotina durante la noche a 37 °C. El fragmento Fc de cada una de las muestras se analizó mediante espectrometría de masas como arriba. Al igual que con el Anticuerpo 01, la adición de una leucina C-terminal dio como resultado la transamidación del mAb mutante, pero no del tipo salvaje (Tabla 4).
Tabla 4 -Transamidación de Anticuerpos Monoclonales con una Leucina C-terminal
Z-Gln-Gly-CAD-biotina: 631 Da
Figure imgf000032_0002
MAbs se incubaron con Z-Gln-Gly-CAD-biotina y transglutaminasa microbiana a 37 °C durante
la noche, seguido de digestión con IdeS para generar fragmentos Faby Fc. Las masas de los
fragmentos Fc generados con IdeS se analizaron por ESI-MS como en la Figura 6 y el
porcentaje de conjugación a Z-Gln-Gly-CAD-biotina (Amasa = 631 Da) se determinó como en
la Tabla 2.
Para determinar si otros aminoácidos podían bloquear la escisión de Lys447 y si proporcionaban el contexto adecuado para que la transglutaminasa microbiana modificara Lys447, se añadieron los aminoácidos restantes como una extensión de un solo residuo al extremo C. Se analizó la modificación de las muestras por transglutaminasa microbiana utilizando Z-Gln-Gly-CAD-biotina. La masa del fragmento Fc se analizó mediante espectrometría de masas como arriba. Como era de esperar, una lisina o arginina C-terminal adicional no protegió la escisión de Lys447, ya que son sustratos para la carboxipeptidasa B (Tabla 5). De los aminoácidos restantes, solo la prolina C-terminal y los residuos de carácter ácido no facilitaron el 100 % de la conjugación con el sustrato. Además de un cambio promedio de 628 Da asociado con la conjugación con Z-Gln-Gly-CAD-biotina (+631 Da), también se observó un desplazamiento de masa de 400 Da. Esto probablemente se deba a un pequeño porcentaje de Z-Gln-Gly-CAD de la síntesis de Z-Gln-Gly-CAD-biotina o de la degradación de esta última.
Tabla 5 E fe c to d e a m in o á c id o s C term inales sobre Ja transamidacion de Lys447 Z Gln El CAD 404 Da
Z Gln Gl CAD: biotina: - 631 Da
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Figure imgf000034_0001
MAbs se incubaron con Z-GIn-Gly-CAD-biotina y transglutaminasa microbiana a 37 °C
durante la noche, seguido de digestión con IdeS para generar fragmentos Fab y Fe. Las
masas de los fragmentos Fe generados con IdeS se analizaron por ESI-MS como en la
Figura 6 (datos no mostrados) y el porcentaje de conjugación a Z-GIn-Gly-CAD-biotina y
Z-GIn-Gly-CAD (Amasa = 631 Da y 404 Da respectivamente) se determinó como en la
Tabla 2. '
Debido a la escisión de la adición de un solo aminoácido C-terminal de lisina o arginina, no se pudo acceder al efecto de cualquiera de los aminoácidos sobre la transamidación en Lys447. Por lo tanto, se añadió una leucina al extremo C de las variantes de lisina y arginina. Además, también se investigó el efecto de una leucina C-terminal adicional con las variantes de prolina, aspartato y glutamato. La leucina adicional tuvo un efecto positivo sobre la transamidación de todas las variantes C-terminales testadas (Tabla 6). Al bloquear la escisión de la lisina o la arginina, Lys447 se transamidó al 100 %. Además, también se transamidó la lisina adicional en la variante KL, produciendo un anticuerpo con 4 sitios de transamidación. La leucina C-terminal también aumentó la transamidación de la variante de prolina al 61,3 %, y las variantes de residuos de carácter ácido estaban moderadamente transamidadas (Tabla 6).
Tabla 6- Efecto de dos aminoácidos C-terminales sobre la transamidación de Lys 447
Z-Gin-Gly-CAD-biotina: - 631 Da
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Tabla 6: MAbs se incubaron con Z-Gln-Gly-CAD-biotina y transglutaminasa
m icrobiana a 37 °C durante la noche, seguido de digestión con IdeS para
generar fragmentos Fab y Fc. Las masas de los fragmentos Fc generados
con IdeS se analizaron por ESI-MS como en la Figura 6 (datos no
mostrados) y el porcentaje de conjugación a Z-Gln-Gly-CAD-biotina y Z-Gln-Gly-CAD (Amasa = 631 Da y 404 Da, respectivamente) se determ inó
como en la Tabla 2.
Ejemplo 4: Transamidación de la lisina C-terminal de diversos isotipos de anticuerpos
El residuo C-terminal de CH3 (o CH4 en los casos de IgE e IgM) es una lisina para todos los isotipos humanos (Tabla 7). Por lo tanto, es posible que esta lisina se pueda utilizar como sitio de conjugación en otros isotipos. Las versiones IgG2, IgG3 e IgG4 de Anticuerpo 01 se prepararon con o sin una leucina o aspartato C-terminal adicional. Los mAbs se incubaron con transglutaminasa microbiana y Z-Gln-Gly-CAD-biotina durante la noche a 37 °C y las masas de los fragmentos Fc se analizaron mediante espectrometría de masas como arriba. Al igual que con IgG1, las lisinas C-terminales se eliminaron durante la expresión en células HEK293 a menos que hubiera un residuo C-terminal adicional (Tabla 8). No se observó transamidación con IgG2, IgG3 o IgG4 de tipo salvaje o con un aspartato C-terminal, pero una leucina C-terminal facilitó la transamidación de los mAbs.
Tabla 7 - Alineamiento de codones C-terminales de CH3 o CH4 de diferentes isotipos humanos
IgG1 LSLSPGK*
IgG2 LSLSPGK*
IgG3 LSLSPGK*
IgG4 LSLSLGK*
IgA1y2 IDRLAGKPTH.
IgD VSVNPGK*
IgE TDHGPMK*
IgM VDKSTGKPTL
Se alinearon los codones C-terminales de CH3 (CH4 para IgE e IgM). Se incluyen los tres codones N-terminales del trozo de cola de IgA e IgM.
Figure imgf000036_0001
MAbs se incubaron con Z-GIn-Gly-CAD-biotina y transglutaminasa
microbiana a 37 °C durante la noche, seguido de digestión con IdeS para
generar fragmentos Fab y Fe. Las masas de los fragmentos Fe generados
con IdeS se analizaron por ESI-MS como en la Figura 6 (datos no
mostrados) y el porcentaje de conjugación a Z-GIn-Gly-CAD-biotina (Amasa
= 631 Da) se determinó como en la Tabla 2
Ejemplo 5: Sustratos Donantes de Acilo
Una utilidad de las conjugaciones con la lisina C-terminal es la fabricación de ADCs específicos para el sitio. La conjugación de agentes funcionales con la lisina C-terminal podría lograrse mediante uno de dos métodos. En primer lugar, un método de 2 etapas requeriría la conjugación de transglutaminasa microbiana de la lisina C-terminal a un donante de acilo sintetizado con un grupo reactivo tal como BCN, DBCO, TCO, azido (N3), alquino, tetrazina o maleimida. La segunda etapa implicaría la conjugación de un agente funcional con el grupo reactivo utilizando, por ejemplo, química de clic exenta de cobre o química reactiva con tiol. Por lo tanto, se añadió amino-PEG3-BCN o aminopropil-N3 al grupo hidroxilo de Z-Gln-Gly como se detalla en la sección de Métodos. El anticuerpo 01-HC-L se incubó con Z-Gln-Gly, Z-Gln-Gly-CAD-biotina, Z-Gln-Gly-N3 o Z-Gln-Gly-PEG3-BCN y transglutaminasa microbiana como arriba. Las muestras se desalinizaron, desglicosilaron, redujeron y analizaron mediante ESI-MS para determinar la adición del sustrato al mAb. Los cuatro sustratos se conjugaron eficientemente con el Anticuerpo 01-HC-L (Tabla 9).

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un método para generar una inmunoglobulina conjugada, comprendiendo el método:
(1) incubar una inmunoglobulina con una transglutaminasa microbiana y un agente funcional que comprende un sustrato donante de acilo,
a) en donde la inmunoglobulina comprende al menos un residuo de aminoácido pero menos de 13 residuos de aminoácidos después de una lisina 447 (K447) en una cadena pesada de la inmunoglobulina, en donde los residuos de aminoácidos están numerados de acuerdo con el sistema de numeración de la UE,
i) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende un residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el residuo de un aminoácido después de la lisina C-terminal es glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, tirosina, triptófano, serina, treonina, cisteína, asparagina, glutamina o histidina,
ii) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende dos residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal es cualquier residuo de aminoácido excepto ácido aspártico, ácido glutámico o prolina; y el segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina,
iii) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende tres residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina,
iv) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende cuatro residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina,
v) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende cinco residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un quinto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el quinto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, o
vi) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende menos de 13 residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, el último residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina,
b) en donde el sustrato donante de acilo comprende un residuo de glutamina, y
c) en donde el agente funcional es un agente terapéutico o un agente de diagnóstico, en donde la transglutaminasa microbiana conjuga K447 con el residuo de glutamina del sustrato donante de acilo en el agente funcional, o
(2)
(i) incubar una inmunoglobulina con una transglutaminasa microbiana y un sustrato donante de acilo, a) en donde la inmunoglobulina comprende al menos un aminoácido pero menos de 13 residuos de aminoácidos después de la lisina 447 (K447) en una cadena pesada de la inmunoglobulina,
I) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende un residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el residuo de un aminoácido después de la lisina C-terminal es glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, tirosina, triptófano, serina, treonina, cisteína, asparagina, glutamina o histidina, II) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende dos residuos de aminoácido después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal es cualquier residuo de aminoácido excepto ácido aspártico, ácido glutámico o prolina; y el segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, III) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende tres residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina,
IV) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende cuatro residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina,
V) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende cinco residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un quinto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el quinto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina o
VI) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende menos de 13 residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, el último residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, y
b) en donde el sustrato donante de acilo comprende un residuo de glutamina y un grupo reactivo, en donde la transglutaminasa microbiana conjuga K447 con el residuo de glutamina del sustrato donante de acilo, y
ii) conjugar un agente funcional con el grupo reactivo del sustrato donante de acilo, en donde el agente funcional es un agente terapéutico o un agente de diagnóstico; opcionalmente, en donde el grupo reactivo del sustrato donante de acilo se conjuga con el agente funcional mediante química de clic,
generando con ello la inmunoglobulina conjugada.
2. Una inmunoglobulina conjugada que comprende una inmunoglobulina y un agente funcional, en donde
a) la inmunoglobulina comprende al menos un residuo de aminoácido pero menos de 13 residuos de aminoácidos después de una lisina 447 (K447) en una cadena pesada de la inmunoglobulina, en donde los residuos de aminoácidos están numerados de acuerdo con el sistema de numeración de la UE,
i) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende un residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el residuo de un aminoácido después de la lisina C-terminal es glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, tirosina, triptófano, serina, treonina, cisteína, asparagina, glutamina o histidina,
ii) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende dos residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal es cualquier residuo de aminoácido excepto ácido aspártico, ácido glutámico o prolina; y el segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina,
iii) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende tres residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina,
iv) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende cuatro residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, v) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende cinco residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un quinto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el quinto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, o
vi) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende menos de 13 residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, el último residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, y
b) el agente funcional comprende un sustrato donante de acilo, en donde el sustrato donante de acilo comprende un residuo de glutamina, y
c) el agente funcional es un agente terapéutico o un agente de diagnóstico, en donde K447 se conjuga con el residuo de glutamina del sustrato donante de acilo; o
en donde
a) la inmunoglobulina comprende al menos un residuo de aminoácido pero menos de 13 residuos de aminoácidos después de la lisina 447 (K447) en una cadena pesada de la inmunoglobulina, i) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende un residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el residuo de un aminoácido después de la lisina C-terminal es glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, tirosina, triptófano, serina, treonina, cisteína, asparagina, glutamina o histidina,
ii) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende dos residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal es cualquier residuo de aminoácido excepto ácido aspártico, ácido glutámico o prolina; y el segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina,
iii) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende tres residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina,
iv) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende cuatro residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina,
v) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende cinco residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, que comprende un primer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un segundo residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un tercer residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, un cuarto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal y un quinto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal, el quinto residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina, o
vi) en donde, cuando la inmunoglobulina comprende menos de 13 residuos de aminoácidos después de la lisina C-terminal, el último residuo de aminoácido después de la lisina C-terminal se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina, serina, prolina, treonina, alanina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, triptófano y glicina,
b) K 447 se conjuga con un residuo de glutamina en un sustrato donante de acilo, en donde el sustrato donante de acilo comprende además un grupo reactivo, y
c) el grupo reactivo se conjuga con un agente funcional, en donde el agente funcional es un agente terapéutico o un agente de diagnóstico.
3. El método de la reivindicación 1 o la inmunoglobulina conjugada de la reivindicación 2, en donde el agente funcional que comprende el sustrato donante de acilo es de acuerdo con una de las Fórmulas (I) o (II):
(Z)m-Gln-(L)n-(Y) (I)
(Y)-(L)n-Gln-(Z)m (II)
en donde
Z es un grupo carboxilbenciloxi (CBZ) o un residuo de aminoácido;
Gln es un residuo de aminoácido de glutamina;
cada uno de los L es independientemente un enlazador lineal o ramificado de 1 a 20 átomos de carbono, en donde uno o más de los átomos de carbono pueden estar opcional e independientemente reemplazados por un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre, y en donde cada uno de los átomo de carbono y nitrógeno puede estar opcionalmente sustituido; o cada uno de los L es opcional e independientemente un residuo de aminoácido;
m es un número entero de 0 a 5;
n es un número entero de 0 a 5; e
Y es un agente funcional;
opcionalmente en donde el agente funcional que comprende el sustrato donante de acilo está:
(a) de acuerdo con la fórmula (I), y en donde Z es un grupo CBZ; en donde cada uno de los L es un resto de polietilenglicol (PEG) (-O((CH2)2)-), etil amina (-NH((CH2)2)-) o propil amina (-NH((CH2)3)-); y en donde n es 0, 1, 2, 3, 4 o 5; o
(b) de acuerdo con la fórmula (I), en donde Z es un grupo CBZ y L es un aminoácido; donde L es opcionalmente Gly; m es 1; y n es 0 o 1;
(c) de acuerdo con la fórmula (II), en donde Z es un grupo CBZ; m es 1; n es 1,2 o 3; y al menos un L es Gly.
4. El método de la reivindicación 1 o la inmunoglobulina conjugada de la reivindicación 2, en donde el sustrato donante de acilo es de acuerdo con una de las Fórmulas (III) o (IV):
(Z)m-Gln-(L)n-(X) (III)
(X)-(L)n-Gln-(Z)m (IV)
en donde
Z es un grupo carboxilbenciloxi (CBZ) o un residuo de aminoácido;
Gln es un residuo de aminoácido de glutamina;
cada uno de los L es independientemente un enlazador lineal o ramificado de 1 a 20 átomos de carbono, en donde uno o más de los átomos de carbono pueden estar opcional e independientemente reemplazados por un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre, y en donde cada uno de los átomo de carbono y nitrógeno puede estar opcionalmente sustituido; o cada uno de los L es opcional e independientemente un residuo de aminoácido;
m es un número entero de 0 a 5;
n es un número entero de 0 a 5; e
X es un grupo reactivo;
opcionalmente, en donde
(a) el sustrato donante de acilo es de acuerdo con la fórmula (III), y en donde Z es un grupo CBZ; en donde cada uno de los L es independientemente un resto de polietilenglicol (PEG) (-O((CH2)2)-), etil amina (-NH((CH2)2)-) o propil amina (-NH((CH2)3)-); y en donde n es 0, 1,2, 3, 4 o 5; o
(b) el sustrato donante de acilo es de acuerdo con la fórmula (III), en donde Z es un grupo CBZ y en donde uno o más de L es un aminoácido; opcionalmente, en donde
(i) L es Gly; m es 1; y n es 1; o
(ii) m es 1; y n es 0; o
(c) el sustrato donante de acilo es de acuerdo con la fórmula (IV), en donde Z es un grupo CBZ; m es 1; n es 1,2 o 3; y al menos un L es Gly; o
(d) X es un grupo reactivo seleccionado del grupo que consiste en (1R,8S,9s)-biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilmetanol (BCN),
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(DBCO), trans-cicloocteno (TCO), azido (N3), alquino, tetrazina, metilciclopropeno, norborneno, hidrazida/hidrazina y aldehído.
5. El método de la reivindicación 1 o la inmunoglobulina conjugada de la reivindicación 2, en donde
(a) el agente terapéutico es un anticuerpo o una parte del mismo que se une al antígeno, un agente quimioterapéutico, un agente farmacológico, un agente radiactivo, un agente citotóxico, un antibiótico, una molécula pequeña, un ácido nucleico o un polipéptido; o
(b) el agente de diagnóstico es un fluoróforo, un colorante fluorescente, un radionucleido o una enzima.
6. El método de la reivindicación 1 o la inmunoglobulina conjugada de la reivindicación 2, en donde la transglutaminasa microbiana es una transglutaminasa microbiana de Streptomyces mobarensis.
7. El método de la reivindicación 1 o la inmunoglobulina conjugada de la reivindicación 2, en donde la inmunoglobulina es (a) una inmunoglobulina IgG1; o (b) una inmunoglobulina IgG2, IgG3 o IgG4; o (c) una inmunoglobulina IgA1, una inmunoglobulina IgA2 o una inmunoglobulina IgM que no comprende un trozo de cola; o (d) una inmunoglobulina IgD o IgE.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-7 o la inmunoglobulina conjugada de una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3-7, en donde la inmunoglobulina
(a) es una inmunoglobulina humana o una inmunoglobulina humanizada; y/o
(b) es una inmunoglobulina quimérica o una inmunoglobulina no humana; y/o
(c) comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras; opcionalmente, en donde no hay entrecruzamiento entre las dos cadenas pesadas de la inmunoglobulina.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-7 o la inmunoglobulina conjugada de una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3-7, en donde la relación de agente funcional a inmunoglobulina es de 1:1 a 2:1.
10. La inmunoglobulina conjugada de la reivindicación 2, en donde el agente funcional es un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, y en donde la inmunoglobulina y el agente funcional se unen al mismo antígeno o se unen a antígenos diferentes.
11. Una composición farmacéutica que comprende la inmunoglobulina conjugada de una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3-10 y un soporte farmacéuticamente aceptable.
12. Una inmunoglobulina conjugada producida por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-9.
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