ES2911505T3 - Método para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de la metástasis de cáncer de mama - Google Patents

Abstract

Un método in vitro para el diagnóstico de la metástasis ósea en un sujeto con cáncer de mama ER+ y/o para el pronóstico de la tendencia a desarrollar metástasis ósea en un sujeto con cáncer de mama ER+, que comprende (i) cuantificar el nivel de expresión del gen c-MAF o el número de copias en una muestra de tejido tumoral de dicho sujeto y (ii) comparar el nivel de expresión o el número de copias obtenido previamente con el nivel de expresión o el número de copias de dicho gen en una muestra de control, en donde si el nivel de expresión o el número de copias de dicho gen aumenta con respecto a la muestra de control, entonces dicho sujeto tiene un diagnóstico positivo para metástasis ósea o una mayor tendencia a desarrollar metástasis ósea.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de la metástasis de cáncer de mama

Campo de la invención

La presente invención se refiere al diagnóstico o al pronóstico de la metástasis ósea en cáncer de mama ER+ basándose en la determinación del nivel de expresión o el número de copias del gen c-MAF en una muestra de tejido tumoral. Asimismo, la invención también se refiere a un método para el diagnóstico o el pronóstico de metástasis en cáncer de mama, así como a un método para diseñar una terapia personalizada en un sujeto con cáncer de mama, que comprende determinar el nivel de expresión del gen c-MAF. Por último, la invención se refiere al uso de un agente capaz de evitar o prevenir la degradación ósea como diana terapéutica para el tratamiento de la metástasis de cáncer de mama.

Antecedentes de la invención

El cáncer de mama es el segundo tipo de cáncer más común en todo el mundo (10,4%; después del cáncer de pulmón) y el quinto caso de muerte por cáncer más común (después del cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de hígado y cáncer de colon). Entre las mujeres, el cáncer de mama es el caso más común de muerte por cáncer. En 2005, el cáncer de mama causó 502.000 muertes en todo el mundo (el 7 % de las muertes por cáncer; casi el 1 % de todas la muertes). El número de casos en todo el mundo ha aumentado significativamente desde la década de 1970, un fenómeno que es en parte debido al estilo de vida moderno en el mundo occidental.

El cáncer de mama se clasifica en estadios de acuerdo con el sistema TNM. El pronóstico está estrechamente relacionado con los resultados de la clasificación en estadios, y la clasificación en estadios también se usa para asignar pacientes a tratamientos tanto en ensayos clínicos como en la práctica médica. La información para la clasificación en estadios es la siguiente:

• TX: No se puede evaluar el tumor primario. T0: no hay evidencia de tumor. Tis: carcinoma in situ, no hay invasión. T1: El tumor es de 2 cm o inferior. T2: El tumor es mayor de 2 cm pero menor de 5 cm. T3: El tumor es mayor de 5 cm. T4: Tumor de cualquier tamaño que crece en la pared de la mama o la piel, o cáncer de mama inflamatorio.

• NX: No se pueden evaluar los ganglios linfáticos cercanos. N0: El cáncer no se ha diseminado a los ganglios linfáticos regionales. N1: El cáncer se ha diseminado a 1 a 3 ganglios linfáticos axilares o a un ganglio linfático mamario interno. N2: El cáncer se ha diseminado a 4 a 9 ganglios linfáticos axilares o a ganglios linfáticos mamarios internos. N3: Una de las siguientes aplicaciones:

■ El cáncer se ha diseminado a 10 o más ganglios linfáticos axilares, o el cáncer se ha diseminado a los ganglios linfáticos infraclaviculares, o el cáncer se ha diseminado a los ganglios linfáticos supraclaviculares o el cáncer afecta a los ganglios linfáticos axilares y se ha diseminado a los ganglios linfáticos mamarios internos, o el cáncer afecta a 4 o más ganglios linfáticos axilares y las cantidades mínimas de cáncer están en los ganglios mamarios internos o en la biopsia del ganglio linfático centinela.

• MX: No se puede evaluar la presencia de diseminación lejana (metástasis). M0: No hay diseminación lejana. M1: se ha producido diseminación a órganos lejanos que no incluyen el ganglio linfático supraclavicular.

El hecho de que la mayoría de los pacientes con cáncer de tumor sólido mueren después de la metástasis significa que es crucial entender los mecanismos moleculares y celulares que permiten que un tumor metastatice. Publicaciones recientes han demostrado cómo la metástasis es causada por medio de mecanismos complejos pero aún poco conocidos y también cómo los diferentes tipos de células metastásicas presentan un tropismo hacia órganos específicos. Estas células metastásicas específicas de tejido tienen una serie de funciones adquiridas que les permiten colonizar órganos específicos.

Todas las células tienen receptores en su superficie, en su citoplasma y el núcleo celular. Determinados mensajeros químicos tales como las hormonas se unen a dichos receptores y esto causa cambios en la célula. Existen tres receptores significativos que pueden afectar a las células del cáncer de mama: receptor de estrógenos (ER), receptor de progesterona (PR) y HER2/neu. Con el fin de nombrar las células que tienen cualquiera de estos receptores, se coloca al mismo un signo positivo cuando el receptor está presente y un signo negativo si está ausente: positivo para ER (ER+), negativo para Er (ER-), PR+ (positivo), negativo para PR (PR-), HER2+ (positivo) y negativo para HER2 (HER2-). El estado del receptor ha llegado a ser una valoración crítica para todos los cánceres de mama puesto que determina la idoneidad de usar tratamientos específicos, por ejemplo, tamoxifeno o trastuzumab. La isoforma alfa del receptor de estrógenos (ER) se sobreexpresa en aproximadamente el 65 % de los casos diagnosticados de cáncer de mama. Este tipo de cáncer de mama se denomina "ER positivo" (ER+). En este caso la unión del estrógeno al ER estimula la proliferación de las células mamarias. Las células tumorales ER+ son altamente dependientes de este estímulo para proliferar, por lo tanto, en la actualidad se usa ER como agente terapéutico.

La clave para tratar el cáncer de mama es cirugía cuando el tumor se localiza con posible terapia hormonal adyuvante (con tamoxifeno o un inhibidor de aromatasa), quimioterapia y/o radioterapia. En la actualidad, las recomendaciones para el tratamiento después de la cirugía (terapia adyuvante) siguen un patrón. Este patrón se somete a cambio debido a que cada dos años, tiene lugar una conferencia internacional en St. Gallen, Suiza, para discutir los resultados reales de los estudios multicéntricos internacionales. Asimismo, dicho patrón también es revisado de acuerdo con los criterios consenso del "National Institute of Healh" (NIH). Basándose en estos criterios, más del 85-90 % de los pacientes que no tienen metástasis en los ganglios linfáticos serían candidatos para recibir terapia sistémica adyuvante.

En la actualidad, los ensayos por PCR tales como Oncotype DX o ensayos con micromatriz tales como MammaPrint pueden predecir el riesgo de recidiva según la expresión de los genes específicos. En febrero de 2007, el ensayo con MammaPrint llegó a ser el primer indicador de cáncer de mama que conseguía autorización oficial de la "Food and Drug Administration".

La solicitud de patente EP1961825-A1 describe un método para predecir la aparición de metástasis de cáncer de mama en hueso, pulmón, hígado o cerebro, que comprende determinar en una muestra de tejido tumoral el nivel de expresión de uno o más marcadores con respecto a su correspondiente nivel de expresión en una muestra de control, entre los que se incluyen c-MAF. Sin embargo, el presente documento requiere determinar varios genes simultáneamente para ser capaz de determinar la supervivencia de los pacientes con cáncer de mama y la correlación entre la capacidad de la firma génica para predecir la supervivencia sin metástasis ósea no fue estadísticamente significativa.

Bos, P.D., et al. [Nature, 2009, 459:1005-1009] describen genes implicados en la metástasis de cáncer de mama en el cerebro.

La solicitud de patente US2005/0181375 describe métodos para detectar cáncer de mama metastásico basándose en la detección de los niveles de expresión de una serie de genes que están regulados aleatoriamente o regulados a la baja en tumores metastásicos y particularmente en tumores que metastatizan en el cerebro.

La solicitud de patente internacional WO2010/000907 describe una firma génica útil como indicador genómico para la metástasis distal en los pacientes con cáncer de mama.

Sin embargo, no hay marcadores genéticos, en el estado de la técnica, que permitan el diagnóstico y/o el pronóstico de si un paciente que padece un cáncer de mama específico, tal como cáncer de mama ER- o ER+, experimentará o no metástasis, por tanto, una terapia adecuada que se puede aplicar al sujeto que padece dicho cáncer. Por lo tanto, existe una necesidad de identificar nuevos marcadores que permitan diagnosticar la presencia de metástasis en sujetos que padecen cáncer de mama ER+ o ER- y/o predecir la probabilidad de un sujeto que padece cáncer de mama ER+ o ER- de desarrollar metástasis. La identificación de nuevos factores de pronóstico servirá como guía para seleccionar los tratamientos más adecuados.

Sumario de la invención

Los autores de la presente invención han identificado y validado c-MAF como marcador asociado a una mayor tendencia del cáncer de mama ER+ a causar metástasis y, particularmente, metástasis ósea. Esta sobreexpresión se debe en parte a una amplificación del locus 16q22-q24 en el que está situado el gen c-MAF. Sin pretender quedar ligado a teoría alguna, se cree que la ruta de señalización del receptor de estrógenos (ER) contribuye a la metástasis de cáncer de mama que conduce a los acontecimientos moleculares para causar dicha metástasis.

Los inventores han caracterizado el papel del gen c-MAF en la metástasis del cáncer de mama ER+ por medio de inoculación de la línea celular MCF7 (línea celular de cáncer de mama ER+ humano) en ratones inmunodeficientes, para obtener, a continuación, el perfil de expresión asociado a las líneas celulares obtenidas de la metástasis ósea de dichas células MCF7. A partir de dicho perfil de expresión y aplicando diferentes criterios, se seleccionó el gen c-MAF, demostrándose las variaciones en los niveles de expresión que predicen la recurrencia de los tumores de cáncer de mama primarios en hueso. Posteriormente, se estudiaron los niveles de expresión de c-MAF en dos bases de datos diferentes que contenían los perfiles de expresión y las notas clínicas de tumores primarios de pacientes con cáncer de mama y de metástasis de pacientes con cáncer de mama, la expresión del gen c-MAF se correlaciona de manera positiva con diferentes parámetros clínicos, incluidos la recurrencia y la metástasis que se observaron. Adicionalmente, se determinaron los niveles de expresión de c-MAF en la metástasis ósea del cáncer de mama, observándose altos niveles de c-MAF en metástasis que tiene su origen en tumores ER+ y ER-. Por último, el gen c-MAF se validó de manera individual por medio de ensayo de colonización de metástasis in vivo seguido de experimentos de ganancia de función por medio de vectores lentivirales y experimentos de pérdida de función por medio del uso de ARN de interferencia (ARNip). Estos estudios han demostrado el papel de c-MAF como marcador para el pronóstico y como gen diana en la metástasis de cáncer de mama, particularmente, la metástasis ósea del cáncer de mama. Asimismo, los inventores han asociado la amplificación del locus 16q22-q24, que incluye el gen c-MAF, con la presencia de metástasis en sujetos con cáncer de mama y la amplificación del gen c-MAF en las líneas celulares de cáncer de mama con tendencia a formar metástasis ósea.

Por tanto, en un primer aspecto, la invención se refiere al diagnóstico de la metástasis ósea en un sujeto con cáncer de mama ER+ y/o para el pronóstico de la tendencia a desarrollar metástasis ósea en un sujeto con cáncer de mama ER+, que comprende

(i) cuantificar el nivel de expresión del gen c-MAF o el número de copias en una muestra de tejido tumoral de dicho sujeto y

(ii) comparar el nivel de expresión o el número de copias obtenido previamente con el nivel de expresión o el número de copias de dicho gen en una muestra de control, en donde si el nivel de expresión o el número de copias de dicho gen aumenta con respecto a la muestra de control, entonces dicho sujeto tiene un diagnóstico positivo para metástasis ósea o una mayor tendencia a desarrollar metástasis ósea.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para diseñar una terapia personalizada para un sujeto con cáncer de mama ER+, que comprende

(i) cuantificar el nivel de expresión del gen c-MAF, la amplificación o el número de copias en una muestra de tejido tumoral de dicho sujeto y

(ii) comparar el nivel de expresión, la amplificación o el número de copias obtenido en la etapa (i) con el nivel de expresión, la amplificación o el número de copias de dicho gen en una muestra de control, en donde si el nivel de expresión del gen c-MAF, la amplificación o el número de copias aumenta con respecto a la muestra de control, entonces dicho sujeto es susceptible de recibir una terapia con el objetivo de prevenir la degradación ósea.

En un tercer aspecto, la invención se refiere al uso de un agente capaz de evitar o prevenir la degradación ósea en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la metástasis ósea en un sujeto que padece cáncer de mama en donde se ha identificado que el sujeto tiene un elevado nivel de expresión de c-MAF, amplificación o número de copias en una muestra de tejido tumoral con respecto a una muestra de control, en donde el agente capaz de evitar o prevenir la degradación ósea es un bifosfonato o un inhibidor de RANKL.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 (A) muestra la representación gráfica del proceso de selección in vivo de las subpoblaciones metastásicas específicas de tejido. Cada una de las posteriores generaciones metastásicas óseas se designan BoM0, BoM1 y BoM2. La capacidad metastásica de estos tipos celulares se analizó por medio de inyección intracardiaca en un modelo de injerto en ratón inmunodeprimidos. (B) muestra el agrupamiento jerárquico obtenido a partir de los perfiles transcripcionales de las células de cáncer de mama ER+ progenitoras y su posteriores líneas celulares derivadas metastásicas BoM0, BoM1 y BoM2. (C) muestra las curvas de Kaplan-Meier donde los grupos de pacientes se separan de acuerdo con los niveles de expresión de c-MAF y se indica la probabilidad para cada grupo de pacientes de recidiva y de experimentar metástasis ósea en función del tiempo. El conjunto de datos incluye 56o tumores de cáncer de mama primarios. Los análisis se restringieron a los tumores ER+ y ER, respectivamente, (base de datos Gene Expression Omnibus, número de acceso GSE 2603, 2034 y 12276) (D) muestra que los niveles de expresión de c-MAF se usaron para separar los perfiles de expresión de los 338 tumores de cáncer de mama primarios descritos en la cohorte de NKI. La probabilidad de supervivencia de los pacientes de cada grupo en función del tiempo se muestra comparativamente por medio de la curva de Kaplan-Meier. Los datos del valor de p mostrados en C y D indican que la intersección entre la expresión del gen c-MAF y el ER, usando estos valores como variables continuas, predice de una manera independiente y significativa la recurrencia o la metástasis usando un modelo multivariante tipo COX (valor de p <0,01).

La Figura 2 (A) muestra los niveles de expresión del gen c-MAF normalizados en metástasis ósea que tiene su origen en el cáncer de mama en comparación con otros sitios metastásicos (cerebro, hígado y pulmón) (GSE14020). (B) muestra los niveles de expresión del gen c-MAF normalizados en diferentes subpoblaciones con diferente capacidad de colonización ósea y derivados celulares del cáncer de mama (ER-) MDA-MB-231. (C) muestra los niveles de expresión del gen CTGF normalizados (gen inducido por la actividad transcripcional de c-MAF) en diferentes subpoblaciones con diferente capacidad de colonización ósea y derivados celulares del cáncer de mama (ER-) MDA-MB-231 o con la sobreexpresión exógena del ADNc que codifica el gen MAF (isoforma larga). La Figura 3 (A) muestra el análisis de los niveles de expresión de c-MAF en las células de cáncer de mama ER+ MCF7 y sus derivados metastásicos (BoM) por medio de RT-PCR Cuantitativa. (B) y (C) muestran los experimentos de pérdida de función y ganancia de función de c-MAF. La pérdida y ganancia de c-MAF se ha presentado en células altamente y menos metastásicas en hueso, respectivamente. Los derivados de líneas celulares con y sin expresión de c-MAf se inyectan en el ventrículo izquierdo de los ratones inmunodeprimidos y se analiza la colonización en hueso in vivo en tiempo real por medio de la técnica de imágenes por bioluminiscencia para validar la contribución de c-MAF a la metástasis ósea en cáncer de mama ER+. MAF-sho indica c-MAF corto (isoforma corta).

La Figura 4 muestra el ensayo de diferenciación de osteoclastos a partir de las células precursoras derivadas de la médula ósea, del medio condicionado procedente de las células progenitoras MCF7 o células que sobreexpresan cualquiera de las isoformas de c-MAF (corto - isoforma corta y largo - isoforma larga). El número de osteoclastos se mide por medio de la técnica TRAP. Las diferencias estadísticas entre los grupos se evalúan por medio del ensayo de Wilcoxon bilateral.

La Figura 5 (A) muestra el análisis del número de copias de los niveles de expresión génica en células BoM2 en comparación con células MCF7, en el cromosoma 16. La parte superior muestra un indicador de expresión. La parte central de la figura muestra las secuencias de referencia de los productos transcritos o los genes para los que se proporcionan los valores de expresión (Ref. de sec. de los productos transcritos), que están ordenados de acuerdo con su posición genómica; (B) muestra el análisis ACE (análisis de alteración por número de copias en función de los datos de expresión) que identifica una ganancia genómica recurrente en la región 16q12-q24 en pacientes con cáncer de mama con metástasis en 348 tumores de cáncer de mama ER+ primarios. Dicha región incluye el locus 16q22-q24 que contiene el gen c-MAF. La expresión génica y el desarrollo de la metástasis se han asociado aplicando el modelo de "log del cociente de riesgos instantáneos (CRI) de Cox". La significancia estadística se ha obtenido permutando (1.000 permutaciones) el logaritmo de CRI en el genoma completo, ajustando los valores de p por Benjamini-Hochberg para controlar una FDR (tasa de falsos descubrimientos) al nivel de 0,05. Solo aquellas regiones con al menos 15 genes significativos consecutivos se muestran en gris. La Figura 6 A) muestra la detección del número de copias del gen MAF y IGH por medio de hibridación in situ por fluorescencia (FISH) usando una sonda específica al gen c-MAF (flecha con asterisco) y una sonda específica al gen IGH (flechas). El gen IGH se usa como control. Escala: 25 pm. B) muestra la cuantificación del porcentaje de células con la razón indicada entre el número de copias del gen MAF en comparación con el número de copias del gen IGH. (se indica el número total de células recontadas para cada grupo).

Descripción detallada de la invención

Métodos para el diagnóstico y pronóstico de metástasis de cáncer de mama basándose en los niveles de expresión de c-MAF

Los inventores han mostrado que el gen c-MAF se sobreexpresa en la metástasis de cáncer de mama particularmente en tumores ER+, y que los niveles de expresión de c-MAF en tumores primarios están correlacionados con diferentes parámetros clínicos del cáncer de mama, particularmente con la probabilidad de recurrencia y de metástasis. Por tanto, como se puede ver en los ejemplos de la presente invención (véase el Ejemplo 2), la sobreexpresión de c-MAF está correlacionada con la aparición de metástasis del tumor de mama ER+ en hueso (véase la Figura 1). Por lo tanto, c-MAF se puede usar como marcador para el diagnóstico y/o pronóstico de la metástasis en un sujeto con cáncer de mama ER+.

Por tanto, en un aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para el diagnóstico de metástasis en un sujeto con cáncer de mama ER+ y/o para el pronóstico de la tendencia a desarrollar metástasis en un sujeto con cáncer de mama ER+ (a continuación en el presente documento, primer método de la invención), que comprende

(i) cuantificar el nivel de expresión del gen c-MAF en una muestra de tejido tumoral de dicho sujeto y

(ii) comparar el nivel de expresión obtenido previamente con el nivel de expresión de dicho gen en una muestra de control,

en donde si los niveles de expresión de dicho gen aumentan con respecto a los niveles de expresión de dicho gen en la muestra de control, entonces dicho sujeto tiene un diagnóstico positivo para metástasis o una mayor tendencia a desarrollar metástasis.

El gen c-MAF (homólogo del oncogén de fibrosarcoma musculoaponeurótico v-maf (aviar) también conocido como MAF o MGC71685) es un factor de transcripción que contiene una cremallera de leucina que actúa como un homodímero o un heterodímero. Dependiendo del sitio de unión al ADN, la proteína codificada puede ser un activador o un represor transcripcional. La secuencia de ADN que codifica c-MAF se describe en la base de datos NCBI con el número de acceso n G_016440 (SEQ ID NO: 1). Dos ARN mensajeros se transcriben a partir de dicha secuencia de ADN, cada uno de las cuales dará lugar a una de las dos isoformas de la proteína c-MAF, la isoforma a y la isoforma p. Las secuencias de ADN complementarias para cada una de dichas isoformas se describen, respectivamente, en la base de datos NCBI con los números de acceso NM_005360.4 (SEQ ID NO: 2) y NM_001031804.2 (SEQ ID NO: 3).

En el contexto de la presente invención, por "metástasis" se entiende la propagación de un cáncer desde el órgano donde comenzó a un órgano diferente. Generalmente se produce a través de la sangre o del sistema linfático. Cuando las células cancerosas se diseminan y forman un nuevo tumor, este último se denomina tumor secundario o metastásico. Las células cancerosas que forman el tumor secundario son como las del tumor original. Si un cáncer de mama, por ejemplo, se disemina (metastatiza) al pulmón, el tumor secundario está formado por células malignas de cáncer de mama. La enfermedad en el pulmón es cáncer de mama metastásico y no cáncer de pulmón. En una realización particular del método de la invención, la metástasis es cáncer de mama ER+ que se ha diseminado (metastatizado) al hueso.

En la presente invención, por "cáncer de mama ER+" se entiende el cáncer de mama cuyas células tumorales expresan el receptor de estrógenos (ER). Esto hace a dichos tumores sensibles a estrógenos, lo que significa que el estrógeno hace que crezca el tumor del cáncer de mama. Por el contrario, por "cáncer de mama ER-" se entiende el cáncer de mama cuyas células tumorales no expresan el receptor de estrógenos (ER).

En la presente invención, por "diagnóstico de metástasis en un sujeto con cáncer de mama" se entiende la identificación de una enfermedad (metástasis) por medio del estudio de sus signos, es decir, en el contexto de la presente invención por medio de niveles de expresión del gen c-MAF aumentados (es decir, sobreexpresión) en el tejido tumoral del cáncer de mama con respecto a una muestra de control.

En la presente invención, por "pronóstico de la tendencia a desarrollar metástasis en un sujeto con cáncer de mama ER+" se entiende saber basándose en los signos si el cáncer de mama ER+ que dicho sujeto tiene metastatizará en el futuro. En el contexto de la presente invención, el signo es la sobreexpresión del gen c-MAF en tejido tumoral.

El método de la invención comprende en una primera etapa cuantificar el nivel de expresión del gen c-MAF en una muestra de tejido tumoral de un sujeto.

En una realización preferida, el primer método de la invención comprende cuantificar solo el nivel de expresión del gen c-MAF como un marcador único, es decir, el método no implica determinar el nivel de expresión de ningún marcador adicional.

Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" o "paciente" se refiere a todos los animales clasificados como mamíferos e incluye, aunque sin limitación, animales domésticos y de granja, primates y humanos, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores. Preferentemente, el sujeto es un hombre o mujer humana de cualquier edad o raza.

En la presente invención, por "muestra de tejido tumoral" se entiende la muestra de tejido del tumor de cáncer de mama ER+ primario. Dicha muestra se puede obtener mediante métodos convencionales, por ejemplo, biopsia, usando métodos bien conocidos por los expertos en técnicas médicas relacionadas. Los métodos para obtener una muestra de biopsia incluyen dividir un tumor en trozos grandes, o microdisección, u otros métodos de separación de células conocidos en la técnica. Las células tumorales pueden obtenerse adicionalmente mediante citología a través de aspiración con una aguja de pequeño calibre. Para simplificar la conservación y el manejo de la muestra, las muestras pueden fijarse en formalina y empaparse en parafina o primero congelarse y luego empaparse en un medio de congelación de tejidos tal como el compuesto OCT por medio de inmersión en un medio altamente criogénico que permite una congelación rápida.

Como lo entiende el experto en la materia, los niveles de expresión del gen pueden cuantificarse midiendo los niveles de ARN mensajero de dicho gen o de la proteína codificada por dicho gen.

Para este fin, la muestra biológica puede tratarse para romper física o mecánicamente el tejido o la estructura celular, liberando los componentes intracelulares en una solución acuosa u orgánica para preparar ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos se extraen mediante métodos disponibles en el mercado conocidos por el experto en la materia (Sambroock, J., et al., "Molecular cloning: a Laboratory Manual", 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., vol. 1-3)

Por tanto, el nivel de expresión del gen c-MAF se puede cuantificar a partir del ARN resultante de la transcripción de dicho gen (ARN mensajero o ARNm) o, como alternativa, del ADN complementario (ADNc) de dicho gen. Por lo tanto, en una realización particular de la invención, la cuantificación de los niveles de expresión del gen c-MAF comprende la cuantificación del ARN mensajero del gen c-MAF o un fragmento de dicho ARNm, el ADN complementario del gen c-MAF o un fragmento de dicho ADNc o sus mezclas.

Prácticamente puede usarse cualquier método convencional dentro del alcance de la invención para detectar y cuantificar los niveles de ARNm codificado por el gen c-MAF o de su correspondiente ADNc. A modo de ilustración no limitante, los niveles de ARNm codificado por dicho gen pueden cuantificarse usando métodos convencionales, por ejemplo, métodos que comprenden amplificación de ARNm y la cuantificación de dicho producto de amplificación de ARNm, tales como electroforesis y tinción, o como alternativa, mediante transferencia de Southern y usando sondas adecuadas, transferencia de Northern y usando sondas específicas del ARNm del gen de interés (c-MAF) o de su correspondiente ADNc, mapeo con nucleasa S1, RT-PCR, hibridación, micromatrices, etc., preferentemente por medio de PCR cuantitativa en tiempo real usando un marcador adecuado. Asimismo, los niveles de ADNc correspondiente a dicho ARNm codificado por el gen c-MAF también se pueden cuantificar mediante el uso de técnicas convencionales; en este caso, el método de la invención incluye una etapa para sintetizar el ADNc correspondiente por medio de transcripción inversa (RT) del ARNm correspondiente, seguida de la amplificación y cuantificación de dicho producto de amplificación de ADNc. Los métodos convencionales para cuantificar los niveles de expresión se pueden encontrar, por ejemplo, en Sambrook et al., 2001. (mencionado anteriormente).

En una realización particular, los niveles de expresión del gen c-MAF se cuantifican por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa o una matriz de ADN o ARN.

Además, el nivel de expresión del gen c-MAF también se puede cuantificar por medio de la cuantificación de los niveles de expresión de la proteína codificada por dicho gen, es decir, la proteína c-MAF (c-MAF) [NCBI, número de acceso O75444], o cualquier otra variante funcionalmente equivalente de la proteína c-MAF. Hay dos isoformas de la proteína c-MAF, la isoforma a (NCBI, NP_005351.2) compuesta por 403 aminoácidos (SEQ ID NO: 4) y la isoforma p (NP_001026974.1) compuesta por 373 aminoácidos (SEQ ID NO: 5). El nivel de expresión del gen c-MAF se puede cuantificar por medio de la cuantificación de los niveles de expresión de cualquiera de las isoformas de la proteína c-MAF. Por tanto, en una realización particular, la cuantificación de los niveles de la proteína codificada por el gen c MAF comprende la cuantificación de la proteína c-MAF.

En el contexto de la presente invención, por "variante funcionalmente equivalente de la proteína c-MAF" se entiende (i) variantes de la proteína c-MAF (SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5) en las que uno o más de los residuos de aminoácidos están sustituidos por un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferentemente un residuo de aminoácido conservado), en donde dicho residuo de aminoácido sustituido puede o no estar codificado por el código genético, o (ii) variantes que comprenden una inserción o una deleción de uno o más aminoácidos y que tienen la misma función que la proteína c-MAF, es decir, que actúan como un factor de transcripción de unión al ADN. Las variantes de la proteína c-MAF se pueden identificar usando métodos basados en la capacidad de c-MAF para promover la proliferación celular in vitro como se muestra en la solicitud de patente internacional WO2005/046731, basándose en la capacidad del llamado inhibidor para bloquear la capacidad de transcripción de un gen indicador bajo el control del promotor de ciclina D2 o de un promotor que contiene la región sensible a c-MAF (elemento sensible a MARE o c-MAF) en células que expresan c-MAF como se describe en el documento WO2008098351, o basándose en la capacidad del llamado inhibidor para bloquear la expresión del gen indicador bajo el control del promotor de IL-4 en respuesta a la estimulación con PMA/ionomicina en células que expresan NFATc2 y c-MAF como se describe en el documento US2009048117A.

Las variantes de acuerdo con la divulgación (no cubiertas por la invención reivindicada) tienen preferentemente una similitud de secuencias con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las isoformas de la proteína c-MAF (SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5) de al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %. El grado de similitud entre las variantes y las secuencias de proteínas específicas de c-MAF definidas previamente se determina usando algoritmos y procesos informáticos que son ampliamente conocidos por los expertos en la materia. La similitud entre dos secuencias de aminoácidos se determina preferentemente usando el algoritmo BLASTP [BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)].

El nivel de expresión de la proteína c-MAF se puede cuantificar mediante cualquier método convencional que permita detectar y cuantificar dicha proteína en una muestra de un sujeto. A modo de ilustración no limitante, dichos niveles de proteína se pueden cuantificar, por ejemplo, usando anticuerpos con capacidad de unión a c-MAF (o un fragmento del mismo que contiene un determinante antigénico) y la posterior cuantificación de los complejos formados. Los anticuerpos usados en estos ensayos pueden o no estar etiquetados. Ejemplos ilustrativos de marcadores que se pueden usar incluyen isótopos radiactivos, enzimas, fluoróforos, reactivos de quimioluminiscencia, sustratos o cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, partículas, colorantes, etc. Hay una amplia gama de ensayos conocidos que se pueden usar en la presente divulgación que usan anticuerpos no etiquetados (anticuerpo primario) y anticuerpos etiquetados (anticuerpo secundario); estas técnicas incluyen Western blot o transferencia de Western, ELISA (enzimoinmunoanálisis de adsorción), RIA (radioinmunoensayo), EIA competitivo (inmunoensayo enzimático competitivo), DAS-ELISA (ELISA tipo sándwich de doble anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el uso de micromatrices o biochips de proteínas, incluyendo anticuerpos específicos o ensayos basados en la precipitación coloidal en formatos tales como tiras reactivas. Otras formas de detectar y cuantificar dicha proteína c-MAF incluyen técnicas de cromatografía por afinidad, ensayos de unión a ligandos, etc. Cuando se usa un método inmunológico, puede usarse cualquier anticuerpo o reactivo que se sepa que se une a la proteína c-MAF con una alta afinidad para detectar la cantidad de los mismos. No obstante, el uso de un anticuerpo, por ejemplo, sueros policlonales, sobrenadantes de hibridomas o anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpo, Fv, Fab, Fab' y F(ab')2, scFv, diacuerpos humanizados, triacuerpos, tetracuerpos y anticuerpos. Hay anticuerpos anti-proteína c-MAF en el mercado que se pueden usar en el contexto de la presente invención, tales como, por ejemplo, los anticuerpos ab427, ab55502, ab55502, ab72584, ab76817, ab77071 (Abcam plc, 330 Science Park, Cambridge CB4 OFL, Reino Unido), el anticuerpo monoclonal 075444 (anticuerpo monoclonal anti-MAF humana de ratón libre de azida, no conjugado, clon 6b8) de AbD Serotec, etc. Hay muchas compañías comerciales que ofrecen anticuerpos anti-c-MAF, tales como Abnova Corporation, Bethyl Laboratories, Bioworld Technology, GeneTex, etc.

En una realización particular, los niveles de proteína c-MAF se cuantifican por medio de transferencia de Western, ELISA o una matriz de proteínas.

El primera método de la invención comprende en una segunda etapa que compara el nivel de expresión del gen c-MAF obtenido en la muestra de tumor del sujeto con el nivel de expresión de dicho gen en una muestra de control.

Una vez que los niveles de expresión del gen c-MAF en una muestra de tejido tumoral de un sujeto con cáncer de mama ER+ se haya medido y comparado con la muestra de control, si los niveles de expresión de dicho gen aumentan con respecto a su nivel de expresión en la muestra de control, entonces se puede concluir que dicho sujeto tiene un diagnóstico positivo para metástasis o una mayor tendencia a desarrollar metástasis.

La determinación de los niveles de expresión del gen c-MAF debe correlacionarse con los valores de una muestra de control o una muestra de referencia. Dependiendo del tipo de tumor a analizar, la naturaleza exacta de la muestra de control puede variar. Por tanto, en el caso de que se vaya a evaluar un diagnóstico, entonces la muestra de referencia es una muestra de tejido tumoral de un sujeto con cáncer de mama ER+ que no ha metastatizado o que corresponde al valor mediano de los niveles de expresión del gen c-MAF medidos en una colección de tejido tumoral en muestras de biopsia de sujetos con cáncer de mama ER+ que no ha metastatizado.

Dicha muestra de referencia se obtiene normalmente combinando cantidades iguales de muestras de una población de sujetos. Generalmente, las muestras de referencia típicas se obtendrán de sujetos que están clínicamente bien documentados y en los que la ausencia de metástasis está bien caracterizada. En dichas muestras, las concentraciones normales (concentración de referencia) del biomarcador (gen c-MAF) se pueden determinar, por ejemplo, proporcionando la concentración media en la población de referencia. Se tienen en cuenta diversas consideraciones al determinar la concentración de referencia del marcador. Entre dichas consideraciones están la edad, el peso, el sexo, la condición física general del paciente y similares. Por ejemplo, cantidades iguales de un grupo de al menos 2, al menos 10, al menos 100 a preferentemente más de 1.000 sujetos, preferentemente clasificados de acuerdo con las consideraciones anteriores, por ejemplo, de acuerdo con diversas categorías de edad, se toman como grupo de referencia. La colección de muestras de la que se deriva el nivel de referencia estará formada preferentemente por sujetos que padecen el mismo tipo de cáncer que el paciente objeto del estudio.

Una vez que se ha establecido este valor mediano, se puede comparar el nivel de este marcador expresado en tejidos tumorales de pacientes con este valor mediano y, por lo tanto, asignarse al nivel de expresión "aumentado". Debido a la variabilidad entre los sujetos (por ejemplo, aspectos relacionados con la edad, raza, etc.) es muy difícil (si no prácticamente imposible) establecer valores de referencia absolutos de la expresión de c-MAF. Por tanto, en una realización particular, los valores de referencia para la expresión "aumentada" o "reducida" de la expresión de c-MAF se determinan calculando los percentiles mediante medios convencionales, lo que implica realizar ensayos en una o varias muestras aisladas de sujetos cuya enfermedad está bien documentada mediante cualquiera de los métodos mencionados anteriormente para los niveles de expresión de c-MAF. Los niveles "reducidos" de c-MAF pueden asignarse entonces preferentemente a muestras en las que los niveles de expresión de c-MAF son iguales o inferiores al percentil 50 en la población normal, incluyendo, por ejemplo, niveles de expresión iguales o inferiores al percentil 60 en la población normal, iguales o inferiores al percentil 70 en la población normal, iguales o inferiores al percentil 80 en la población normal, iguales o inferiores al percentil 90 en la población normal, e iguales o inferiores al percentil 95 en la población normal. Los niveles de expresión del gen c-MAF "aumentados" puede asignarse entonces preferentemente a muestras en las que los niveles de expresión del gen c-MAF son iguales o superiores al percentil 50 en la población normal, incluyendo, por ejemplo, niveles de expresión iguales o superiores al percentil 60 en la población normal, iguales o superiores al percentil 70 en la población normal, iguales o superiores al percentil 80 en la población normal, iguales o superiores al percentil 90 en la población normal, e iguales o superiores al percentil 95 en la población normal.

En la presente invención, por "niveles de expresión aumentados" se entiende el nivel de expresión cuando se refiere a los niveles del gen c-MAF mayores que aquellos en una muestra de referencia o muestra de control. Particularmente, se puede considerar que una muestra tiene altos niveles de expresión de c-MAF cuando los niveles de expresión en la muestra de referencia son al menos 1,1 veces, 1,5 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso más con respecto a la muestra aislada del paciente.

En el contexto de la presente invención, se entiende que "un sujeto tiene un diagnóstico positivo para metástasis" cuando el cáncer de mama ER+ padecido por dicho sujeto ha metastatizado a otros órganos del cuerpo, en una realización particular, al hueso.

En una realización aún más preferida, la metástasis al hueso es una metástasis ósea osteolítica. Como se usa en el presente documento, la expresión "metástasis ósea osteolítica" se refiere a un tipo de metástasis en la que se produce una resorción ósea (pérdida progresiva de la densidad ósea) en las inmediaciones de la metástasis que resulta de la estimulación de la actividad de los osteoclastos por las células tumorales y se caracteriza por dolor severo, fracturas patológicas, hipercalcemia, compresión de la médula espinal y otros síndromes resultantes de la compresión nerviosa.

Por otra parte, en la presente invención se entiende que "un sujeto tiene una mayor tendencia a desarrollar metástasis" cuando las probabilidades de que el cáncer de mama ER+ padecido por el sujeto metastatice en el futuro son altas.

El experto en la materia entenderá que la predicción de la tendencia de un tumor de mama primario a metastatizar no pretende ser correcta para todos los sujetos a identificar (es decir, para el 100 % de los sujetos). No obstante, el término requiere permitir la identificación de una parte estadísticamente significativa de los sujetos (por ejemplo, una cohorte en un estudio de cohortes). El experto en la materia puede determinar de manera sencilla si una parte es estadísticamente significativa, usando diversas herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, la determinación de los intervalos de confianza, la determinación de los valores de p, la prueba de la T de Student, la prueba de Mann-Whitney, etc. Los detalles se proporcionan en Dowdy y Wearden, "Statistics for Research", John Wiley and Sons, Nueva York 1983. Los intervalos de confianza preferidos son de al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %. Los valores de p son preferentemente 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 o 0,0001. Más preferentemente, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 % o al menos el 90 % de los sujetos de una población se pueden identificar adecuadamente mediante el método de la presente invención.

Método para diseñar una terapia personalizada de la invención en pacientes con tumores de mama ER+

Como se conoce en el estado de la técnica, el tratamiento que se administrará a un sujeto que padece cáncer depende de si este último es un tumor maligno, es decir, si tiene altas probabilidades de experimentar metástasis o si este último es un tumor benigno. En el primer supuesto, el tratamiento de elección es un tratamiento sistémico tal como quimioterapia y, en el segundo supuesto, el tratamiento de elección es un tratamiento localizado tal como radioterapia.

Por lo tanto, como se describe en la presente invención, dado que la sobreexpresión del gen c-MAF en células de cáncer de mama está relacionada con la presencia de metástasis, los niveles de expresión del gen c-MAF permiten tomar decisiones en términos de la terapia más adecuada para el sujeto que padece dicho cáncer.

Por tanto, en otro aspecto la invención se refiere a un método in vitro para diseñar una terapia personalizada para un sujeto con cáncer de mama ER+, a continuación en el presente documento, el segundo método de la invención, que comprende

(i) cuantificar el nivel de expresión del gen c-MAF, la amplificación o el número de copias en una muestra de tejido tumoral de dicho sujeto y

(ii) comparar el nivel de expresión, la amplificación o el número de copias previamente obtenido con el nivel de expresión, la amplificación o el número de copias de dicho gen en una muestra de control,

en donde si los niveles de expresión, la amplificación o el número de copias aumentan con respecto a los niveles de expresión, la amplificación o el número de copias de dicho gen en la muestra de control, entonces dicho sujeto es susceptible de recibir una terapia con el objetivo de prevenir la degradación ósea.

En una realización particular, la metástasis es una metástasis ósea. En una realización más preferida, la metástasis ósea es metástasis osteolítica.

Los términos y expresiones "sujeto", "cáncer de mama ER+", "muestra de tejido tumoral", "metástasis", "determinación de los niveles de expresión", "gen c-MAF", "niveles de expresión aumentados" y "muestra de control" se han descrito en detalle en relación con el primer método de la invención y son igualmente aplicables al segundo y al tercer método de la invención.

El segundo método de la invención comprende en una primera etapa cuantificar el nivel de expresión del gen c-MAF, la amplificación o el número de copias en una muestra de tejido tumoral en un sujeto que padece cáncer de mama ER+.

En una realización preferida, el segundo método de la invención comprende cuantificar solo el nivel de expresión del gen c-MAF como un marcador único, es decir, el método no implica determinar el nivel de expresión de ningún marcador adicional.

En el caso del segundo método de la invención la muestra es una muestra de tejido tumoral primario del sujeto. En una segunda etapa, el nivel de expresión del gen c-MAF obtenido en la muestra de tumor del sujeto se compara con el nivel de expresión de dicho gen en una muestra de control. La determinación de los niveles de expresión del gen c-MAF debe estar relacionada con los valores de una muestra de control o una muestra de referencia. Dependiendo del tipo de tumor a analizar, la naturaleza exacta de la muestra de control puede variar. Por tanto, preferentemente, la muestra de referencia es una muestra de tejido tumoral de un sujeto con cáncer de mama ER+ que no ha metastatizado o que corresponde al valor mediano de los niveles de expresión del gen c-MAF medidos en una colección de tejido tumoral en muestras de biopsia de sujetos con cáncer de mama ER+ que no ha metastatizado.

Una vez que los niveles de expresión del gen c-MAF en la muestra se han medido y comparado con la muestra control, si los niveles de expresión de dicho gen aumentan con respecto a sus niveles de expresión en la muestra control, entonces se puede concluir que dicho sujeto es susceptible de recibir terapia con el objetivo de prevenir (si el sujeto todavía tiene que experimentar metástasis) y/o tratar la metástasis (si el sujeto ya ha experimentado metástasis).

Cuando el cáncer ha metastatizado, se usan tratamientos sistémicos que incluyen, aunque sin limitación, quimioterapia, tratamiento hormonal, inmunoterapia o una combinación de los mismos. Adicionalmente, se puede usar radioterapia y/o cirugía. La elección del tratamiento generalmente depende del tipo de cáncer primario, el tamaño, la ubicación de la metástasis, la edad, la salud general del paciente y los tipos de tratamientos usados anteriormente.

Los tratamientos sistémicos son los que llegan a todo el cuerpo:

- La quimioterapia es el uso de medicamentos para destruir las células cancerosas. Los medicamentos se administran generalmente por vía oral o intravenosa. Algunas veces, la quimioterapia se usa junto con el tratamiento con radiación.

- La terapia hormonal se basa en el hecho de que algunas hormonas promueven el crecimiento de algún cáncer.

Por ejemplo, el estrógeno en las mujeres producido por los ovarios a veces promueve el crecimiento del cáncer de mama. Hay varias formas de detener la producción de estas hormonas. Una forma es extirpar los órganos que las producen: los ovarios en el caso de las mujeres, los testículos en el caso de los hombres. Con más frecuencia, se pueden usar medicamentos para evitar que estos órganos produzcan hormonas o para evitar que las hormonas actúen sobre las células cancerosas.

- La inmunoterapia es un tratamiento que ayuda al sistema inmunitario del paciente a combatir el cáncer. Hay varios tipos de inmunoterapia que se usan para tratar pacientes con metástasis. Estos incluyen, aunque sin limitación, citocinas, anticuerpos monoclonales y vacunas antitumorales.

Método para diseñar terapia personalizada en pacientes con cáncer de mama con metástasis ósea (Aspecto no cubierto por la invención reivindicada)

Los autores de la presente invención han demostrado claramente que el medio condicionado de líneas celulares derivadas de tumores de mama primarios que tienen alta capacidad de causar metástasis y que sobreexpresan c-MAF es capaz de inducir la formación de osteoclastos en un mayor grado que las células que no sobreexpresan c-MAF. Por tanto, los pacientes que padecen cáncer de mama ER que ya ha metastatizado al hueso y en los que hay niveles elevados de c-MAF pueden beneficiarse particularmente de terapias con el objetivo de prevenir la degradación ósea causada por el aumento de la actividad osteoclástica.

Por tanto, en otros aspectos no cubiertos por la invención reivindicada, la divulgación se refiere a un método in vitro para diseñar una terapia personalizada para un sujeto con cáncer de mama ER- con metástasis ósea (a continuación en el presente documento, el tercer método de la divulgación), que comprende

(i) cuantificar el nivel de expresión del gen c-MAF en una muestra de tejido tumoral metastásico de hueso de dicho sujeto, y

(ii) comparar el nivel de expresión obtenido previamente con el nivel de expresión de dicho gen en una muestra de control,

en donde si los niveles de expresión aumentan con respecto a los niveles de expresión de dicho gen en la muestra de control, entonces dicho sujeto es susceptible de recibir una terapia con el objetivo de prevenir la degradación ósea.

Los términos y expresiones "sujeto", "cáncer de mama ER+", "muestra de tejido tumoral", "metástasis", "determinación de los niveles de expresión", "gen c-MAF", "niveles de expresión aumentados" y "muestra de control" se han descrito en detalle en relación con el primer método de la invención y son igualmente aplicables al segundo y al tercer método de la divulgación.

En un aspecto preferido, la metástasis ósea es metástasis osteolítica.

El tercer método de la divulgación comprende en una primera etapa, cuantificar el nivel de expresión del gen c-MAF en una muestra de tejido tumoral en un sujeto que padece cáncer de mama. En el caso del tercer método de la divulgación, la muestra es una muestra de tejido de metástasis ósea.

En un aspecto preferido, el tercer método de la divulgación comprende cuantificar solo el nivel de expresión del gen c-MAF como un marcador único, es decir, el método no implica determinar el nivel de expresión de ningún marcador adicional.

En una segunda etapa, el nivel de expresión del gen c-MAF obtenido en la muestra de tumor del sujeto se compara con el nivel de expresión de dicho gen en una muestra de control. La determinación de los niveles de expresión del gen c-MAF debe correlacionarse con los valores de una muestra de control o una muestra de referencia. Dependiendo del tipo de tumor a analizar, la naturaleza exacta de la muestra de control puede variar. Por tanto, en el caso que implica el tercer método de la divulgación, entonces la muestra de referencia es una muestra de tejido tumoral de un sujeto con cáncer de mama que no ha experimentado metástasis o que corresponde al valor mediano de los niveles de expresión del gen c-MAF medidos en una colección de tejido tumoral en muestras de biopsia de sujetos con cáncer de mama que no han experimentado metástasis.

Una vez que los niveles de expresión del gen c-MAF en la muestra se miden y se comparan con la muestra control, si los niveles de expresión de dicho gen aumentan con respecto a su nivel de expresión en la muestra de control, entonces se puede concluir que dicho sujeto es susceptible de recibir una terapia con el objetivo de evitar o prevenir la degradación ósea.

Como se usa en el presente documento, un "agente para evitar o prevenir la degradación ósea" se refiere a cualquier molécula capaz de tratar o detener la degradación ósea, ya sea estimulando la proliferación de osteoblastos o inhibiendo la proliferación de osteoclastos. Los ejemplos ilustrativos de agentes usados para evitar y/o prevenir la degradación ósea incluyen, aunque sin limitación:

- Hormona paratiroidea (PTH) o formas recombinantes de la misma (teriparatida correspondiente a los aminoácidos 1-34 de la PTH). Esta hormona actúa estimulando los osteoblastos y aumentando su actividad.

- Ranelato de estroncio: es un tratamiento oral alternativo, y forma parte del grupo de fármacos llamados "agentes óseos de doble acción" (DABA) porque estimulan la proliferación de osteoblastos e inhiben la proliferación de osteoclastos.

- "Moduladores de los receptores de estrógenos" (SERM) se refiere a compuestos que interfieren o inhiben la unión de los estrógenos al receptor, independientemente del mecanismo. Los ejemplos de los moduladores de los receptores de estrógenos incluyen, entre otros, estrógenos, progestágeno, estradiol, droloxifeno, raloxifeno, lasofoxifeno, TSE-424, tamoxifeno, idoxifeno, L Y353381, LY117081, toremifeno, fluvestrant, 4-[7-(2,2-dimetil-1-oxopropoxi-4-metil-2-[4-[2-(1-piperidinil)etoxi]fenil]-2H-1-benzopiran-3-il]-fenil-2,2-dimetilpropanoato 4,4'dihidroxibenzofenona-2,4-dinitrofenil-hidrazona y SH646.

- Calcitonina: inhibe directamente la actividad de los osteoclastos a través del receptor de calcitonina. Los receptores de calcitonina se han identificado en la superficie de los osteoclastos.

- Bifosfonatos: son un grupo de medicamentos usados para la prevención y el tratamiento de enfermedades con resorción y reabsorción ósea, tales como osteoporosis y cáncer con metástasis ósea, siendo este último con o sin hipercalcemia, asociadas al cáncer de mama y al cáncer de próstata. Los ejemplos de bifosfonatos que pueden usarse en la terapia diseñada por medio del tercer método de la divulgación incluyen, aunque sin limitación, bifosfonatos nitrogenados (tales como pamidronato, neridronato, olpadronato, alendronato, ibandronato, risedronato, incadronato, zoledronato o ácido zoledrónico, etc.) y bifosfonatos no nitrogenados (tales como etidronato, clodronato, tiludronato, etc.).

- "Inhibidores de catepsina K" se refiere a compuestos que interfieren en la actividad de la cisteína proteasa catepsina K. Los ejemplos no limitantes de los inhibidores de catepsina K incluyen los derivados de 4-aminopirimidina-2-carbonitrilo (descritos en la solicitud de patente internacional WO 03/020278 con el nombre de Novartis Pharma GMBH), pirrolopirimidinas descritas en la publicación WO 03/020721 (Novartis Pharma GMBH) y la publicación WO 04/000843 (ASTRAZENECA AB), así como los inhibidores descritos en las publicaciones Pc T WO 00/55126 de Axys Pharmaceuticals, WO 01/49288 de Merck Frosst Canada & Co. y Axys Pharmaceuticals. - "Inhibidores de RANKL", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier compuesto que sea capaz de reducir la actividad de RANK. RANKL se encuentra en la superficie de la membrana de osteoblastos del estroma y las células de linfocitos T, y estas células de linfocitos T son las únicas que han demostrado la capacidad de secretarlo. Su función principal es la activación de los osteoclastos, células implicadas en la resorción ósea. Los inhibidores de RANKL pueden actuar bloqueando la unión de RANKL a su receptor (RANK), bloqueando la señalización mediada por RANK o reduciendo la expresión de RANKL bloqueando la transcripción o la traducción de RANKL. Los antagonistas o inhibidores de RANKl adecuados para su uso en la presente divulgación incluyen, sin limitación:

o una proteína RANK adecuada que es capaz de unirse a RANKL y que comprende la totalidad o un fragmento del dominio extracelular de una proteína RANK. La RANK soluble puede comprender el péptido señal y el dominio extracelular de los polipéptidos RANK humanos o murinos, o como alternativa, se puede usar la forma madura de la proteína con el péptido señal eliminado.

o Osteoprotegerina o una variante de la misma con capacidad de unión a RANKL o moléculas antisentido específicas a RANKL

o Ribozimas capaces de procesar los productos transcritos de RANKL

o Anticuerpos anti-RANKL específicos. Por "anticuerpo anti-RANKL o anticuerpo dirigido contra RANKL" se entiende en el presente documento todo aquel anticuerpo que es capaz de unirse específicamente al ligando del receptor activador para el factor nuclear kB (RANKL) que inhibe una o más funciones de RANKL. Los anticuerpos pueden prepararse usando cualquiera de los métodos que son conocidos por el experto en la materia. Por tanto, los anticuerpos policlonales se preparan por medio de la inmunización de un animal con la proteína a inhibir. Los anticuerpos monoclonales se preparan usando el método descrito por Kohler, Milstein et al. (Nature, 1975, 256: 495). Los anticuerpos adecuados en el contexto de la presente divulgación incluyen anticuerpos intactos que comprenden una región de unión a antígeno variable y una región constante, fragmentos "Fab", "F(ab')2" y "Fab", Fv, scFv, diacuerpos y anticuerpos biespecíficos.

En un aspecto preferido, el anticuerpo anti-RANKL es un anticuerpo monoclonal. En un aspecto aún más preferido, el anticuerpo anti-RANKL es Denosumab (Pageau, Steven C. (2009). mAbs 1 (3): 210-215, número CAS 615258-40-7). En el contexto de la presente divulgación, Denosumab es un anticuerpo monoclonal que se une a RANKL y evita su activación (no se une al receptor RANK).

En un aspecto preferido, el agente que previene la degradación ósea es un bifosfonato. En un aspecto aún más preferido, el bifosfonato es el ácido zoledrónico.

Como alternativa, se puede llevar a cabo un tratamiento combinado en el que más de un agente de los mencionados anteriormente se combinan para tratar y/o prevenir la metástasis o dichos agentes se pueden combinar con otros suplementos, tales como calcio o vitamina D o con un tratamiento hormonal.

Método de diagnóstico o pronóstico de metástasis en cáncer de mama basándose en la detección de la amplificación del gen c-MAF

Los autores de la invención han identificado que las líneas celulares derivadas de tumores de mama ER+ que tienen una alta capacidad metastásicas muestran amplificación del locus 16q22-q24, que incluye el locus que corresponde al gen c-MAF y una amplificación del gen c-MAF.

Por tanto, en un aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para el diagnóstico de metástasis en un sujeto con cáncer de mama ER+ (a continuación en el presente documento, cuarto método de diagnóstico de la invención) y/o para el pronóstico de la tendencia a desarrollar metástasis en un sujeto con cáncer de mama ER+ que comprende cuantificar el número de copias del gen c-MAF en una muestra de tejido tumoral de dicho sujeto y comparar el número de copias obtenido con el número de copias de dicho gen en una muestra control; en donde si el número de copias aumenta con respecto a la muestra de control, entonces dicho sujeto tiene un diagnóstico positivo para metástasis o una mayor tendencia a desarrollar metástasis.

Las expresiones "gen c-MAF", "metástasis", "muestra de tejido tumoral", "cáncer de mama ER+", "diagnóstico de metástasis en un sujeto con cáncer de mama ER+", "pronóstico de la tendencia a desarrollar metástasis en un sujeto con cáncer de mama ER+", "sujeto", "paciente", "sujeto que tiene un diagnóstico positivo de metástasis", "sujeto que tiene una mayor tendencia a desarrollar metástasis" se han descrito en detalle en el contexto del primer método de la invención y son igualmente aplicables al cuarto método de la invención.

En un aspecto particular, el grado de amplificación del gen c-MAF se puede determinar por medio de la determinación de la amplificación de una región cromosómica que contiene dicho gen. Preferentemente, la región cromosómica cuya amplificación es indicativa de la existencia de la amplificación del gen c-MAF es el locus 16q22-q24 que incluye el gen c-MAF. El locus 16q22-q24 está situado en el cromosoma 16, en el brazo largo de dicho cromosoma y en un intervalo entre la banda 22 y la banda 24. Esta región corresponde en la base de datos NCBI con los cóntigos NT_010498.15 y NT_010542.15. En otra realización preferida, el grado de amplificación del gen c-MAF se puede determinar por medio del uso de una sonda específica para dicho gen.

La expresión "amplificación de un gen" como se entiende en el presente documento se refiere a un proceso a través del cual se forman diversas copias de un gen o de un fragmento de gen en una célula individual o una línea celular. Las copias del gen no están necesariamente situadas en el mismo cromosoma. La región duplicada a menudo se llama un "amplicón". Normalmente, la cantidad de ARNm producido, es decir, el nivel de expresión génica también aumenta en proporción al número de copias de un gen particular.

La muestra de control se refiere a una muestra de tejido tumoral de un sujeto con cáncer de mama ER+ que no ha experimentado metástasis o que corresponde al valor mediano del número de copias del gen c-MAF medido en una colección de tejidos tumorales en muestras de biopsia de sujetos con cáncer de mama ER+ que no han experimentado metástasis. Dicha muestra de referencia se obtiene normalmente combinando cantidades iguales de muestras de una población de sujetos. Si el número de copias del gen c-MAF aumenta con respecto al número de copias de dicho gen en la muestra de control, entonces el sujeto tiene un diagnóstico positivo para metástasis o una mayor tendencia a desarrollar metástasis.

Como se usa en el presente documento, el término "número de copias del gen" se refiere al número de copias de una molécula de ácido nucleico en una célula. El número de copias del gen incluye el número de copias del gen en el ADN genómico (cromosómico) de una célula. En una célula normal (célula no tumoral), el número de copias del gen es normalmente dos copias (una copia en cada miembro del par de cromosomas). El número de copias del gen a veces incluye la mitad del número de copias del gen tomado de muestras de una población celular.

En la presente invención, por "número de copias del gen aumentado" se entiende cuando el número de copias del gen c-MAF es mayor que el número de copias que tiene una muestra de referencia o muestra de control. En particular, se puede considerar que una muestra tiene un número de copias de c-MAF aumentado cuando el número de copias es más de 2 copias, por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 copias, e incluso más de 10 copias del gen c-MAF.

En una realización particular, la amplificación o el número de copias se determina por medio de hibridación in situ o PCR.

Métodos para determinar si el gen c-MAF o la región cromosómica 16q22-q24 están amplificados son ampliamente conocidos en el estado de la técnica. Dichos métodos incluyen, sin limitación, hibridación in situ (ISH) (tal como hibridación in situ con fluorescencia (FISH), hibridación in situ cromogénica (CISH) o hibridación in situ con plata (SISH)), hibridación comparativa genómica o reacción en cadena de la polimerasa (tal como PCR cuantitativa en tiempo real). Para cualquier método de ISH, la amplificación o el número de copias se pueden determinar contando el número de puntos fluorescentes, puntos de color o puntos con plata en los cromosomas o en el núcleo.

La hibridación in situ con fluorescencia (FISH) es una técnica citogenética que se usa para detectar y ubicar la presencia o ausencia de secuencias específicas de ADN en los cromosomas. FISH usa sondas de fluorescencia que solo se unen a algunas partes del cromosoma con las que muestran un alto grado de similitud de secuencia. En un método típico de FISH, la sonda de ADN está etiquetada con una molécula fluorescente o un hapteno, normalmente en forma de flúor-dUTP, digoxigenina-dUTP, biotina-dUTP o hapteno-dUTP, que se incorpora en el ADN usando reacciones enzimáticas, tales como translación de mella o PCR. La muestra que contiene el material genético (los cromosomas) se coloca en portaobjetos de vidrio y se desnaturaliza mediante un tratamiento con formamida. La sonda etiquetada se híbrida, a continuación, con la muestra que contiene el material genético en condiciones adecuadas que serán determinadas por el experto en la materia. Después de la hibridación, la muestra se observa directamente (en el caso de una sonda etiquetada con flúor) o indirectamente (usando anticuerpos marcados con fluorescencia para detectar el hapteno).

En el caso de CISH, la sonda se etiqueta con digoxigenina, biotina o fluoresceína y se hibrida con la muestra que contiene el material genético en condiciones adecuadas.

Se puede usar cualquier molécula de marcado o etiquetado que pueda unirse a un ADN para etiquetar las sondas usadas en el cuarto método de la invención, permitiendo de este modo la detección de moléculas de ácido nucleico. Los ejemplos de etiquetas para el etiquetado incluyen, aunque sin limitación, isótopos radiactivos, sustratos enzimáticos, cofactores, ligandos, agentes de quimioluminiscencia, fluoróforos, haptenos, enzimas y combinaciones de los mismos. Los métodos de etiquetado y las directrices para seleccionar etiquetas adecuadas para diferentes fines se pueden encontrar, por ejemplo, en Sambrook et al. ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989) y Ausubel et al. (En "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Nueva York, 1998).

Una vez que se determina la existencia de la amplificación, ya sea determinando directamente la amplificación del gen c-MAF o determinando la amplificación del locus 16q22-q24, y después de haberla comparado con la amplificación de dicho gen en la muestra de control, si se detecta la amplificación en el gen c-MAF, esto es indicativo del hecho de que el sujeto tiene un diagnóstico positivo para metástasis o una mayor tendencia a desarrollar metástasis.

Es necesario que la determinación de la amplificación del gen c-MAF se correlacione con los valores de una muestra de control o muestra de referencia que correspondan al nivel de amplificación del gen c-MAF medido en una muestra de tejido tumoral de un sujeto con cáncer de mama que no ha experimentado metástasis o correspondan al valor mediano de la amplificación del gen c-MAF medido en una colección de tejido tumoral en muestras de biopsia de sujetos con cáncer de mama que no han experimentado metástasis. Dicha muestra de referencia se obtiene normalmente combinando cantidades iguales de muestras de una población de sujetos. En general, las muestras de referencia típicas se obtendrán de sujetos que están clínicamente bien documentados y en los que la ausencia de metástasis está bien caracterizada. La colección de muestras de la que se deriva el nivel de referencia estará compuesta preferentemente por sujetos que padecen el mismo tipo de cáncer que el paciente objeto del estudio. Una vez que se ha establecido este valor mediano, el nivel de amplificación de c-MAF en tejidos tumorales de pacientes se puede comparar con este valor mediano y, por tanto, si hay amplificación, el sujeto tiene un diagnóstico positivo de metástasis o una mayor tendencia a desarrollar metástasis.

En una realización preferida, la metástasis es metástasis ósea. En una realización aún más preferida, la metástasis ósea es metástasis ósea osteolítica. Como se usa en el presente documento, la expresión "metástasis ósea osteolítica" se refiere a un tipo de metástasis en la que se produce una resorción ósea (pérdida progresiva de la densidad ósea) en las inmediaciones de la metástasis que resulta de la estimulación de la actividad de los osteoclastos por las células tumorales y se caracteriza por dolor severo, fracturas patológicas, hipercalcemia, compresión de la médula espinal y otros síndromes resultantes de la compresión nerviosa.

Métodos terapéuticos

Tratamiento de la metástasis ósea usando agentes inhibidores de c-MAF (aspecto no cubierto por la invención reivindicada)

Los autores de la presente invención han demostrado claramente que la inhibición de la expresión de c-MAF en células de cáncer de mama causa una reducción estadísticamente significativa en la formación de metástasis ósea de dichas células, usando para ese fin un modelo de xenotrasplante experimental. En cambio, la sobreexpresión de c-MAF en células tumorales en ese mismo sistema aumenta la capacidad metastásica de dichas células. Por tanto, se puede usar un agente inhibidor de la expresión del gen c-MAF o un agente inhibidor de la proteína codificada por dicho gen en el tratamiento y/o la prevención de la metástasis de cáncer de mama.

Por lo tanto, en otro aspecto, la divulgación se refiere al uso de un agente inhibidor de la expresión del gen c-MAF o un agente inhibidor de la proteína codificada por dicho gen (a continuación en el presente documento, agente inhibidor de la divulgación) en la preparación de un medicamento para tratar y/o prevenir la metástasis de cáncer de mama. Como alternativa, la divulgación se refiere a un agente inhibidor de la expresión del gen c-MAF o un agente inhibidor de la proteína codificada por dicho gen para su uso en el tratamiento y/o la prevención de la metástasis de cáncer de mama. Como alternativa, la divulgación se refiere a un método para tratar la metástasis de cáncer de mama en un sujeto que comprende administrar un inhibidor de c-MAF a dicho sujeto.

Como se usa en el presente documento, un "agente inhibidor de c-MAF" se refiere a cualquier molécula capaz de inhibir total o parcialmente la expresión del gen c-MAF, tanto impidiendo que se produzca el producto de expresión de dicho gen (interrumpiendo la transcripción del gen c-MAF y/o bloqueando la traducción del ARNm procedente de la expresión del gen c-MAF) como inhibiendo directamente la actividad de la proteína c-MAF. Los inhibidores de la expresión del gen c-MAF se pueden identificar usando métodos basados en la capacidad del llamado inhibidor para bloquear la capacidad de c-MAF de promover la proliferación celular in vitro, como se muestra en la solicitud de patente internacional WO2005/046731, basándose en la capacidad del llamado inhibidor para bloquear la capacidad de transcripción de un gen indicador bajo el control del promotor de la ciclina D2 o de un promotor que contiene la región de respuesta a c-MAF (elemento sensible a MARE o c-MAF) en células que expresan c-MAF tal como se describe en el documento WO2008098351 o basándose en la capacidad del llamado inhibidor para bloquear la expresión de un gen indicador bajo el control del promotor de IL-4 en respuesta a la estimulación con PMA/ionomicina en células que expresan NFATc2 y c-MAF tal como se describe en el documento US2009048117A.

A modo de ilustración no limitante, los agentes inhibidores de c-MAF adecuados para su uso en la presente divulgación incluyen oligonucleótidos antisentido, ARN de interferencia (ARNip), ARN catalíticos o ribozimas específicas y anticuerpos inhibidores.

Oligonucleótidos antisentido

Un aspecto adicional de la divulgación se refiere al uso de ácidos nucleicos "antisentido" aislados para inhibir la expresión, por ejemplo, para inhibir la transcripción y/o la traducción de un ácido nucleico que codifica c-MAF, cuya actividad debe inhibirse. Los ácidos nucleicos antisentido se pueden unir a la potencial diana del fármaco por medio de complementariedad de bases convencional o, por ejemplo, en el caso de la unión al ADN bicatenario a través de la interacción específica en el surco grande de la doble hélice. Generalmente, estos métodos se refieren a una gama de técnicas generalmente usadas en la técnica e incluyen cualquier método que se basa en la unión específica a secuencias de oligonucleótidos.

Una construcción antisentido de la presente divulgación se puede distribuir, por ejemplo, como un plásmido de expresión que, cuando se transcribe en la célula, produce ARN complementario a al menos una parte única del ARNm celular que codifica c-MAF. Como alternativa, la construcción antisentido es una sonda oligonucleotídica generada ex vivo que, cuando se introduce en la célula, produce inhibición de la expresión génica hibridando con el ARNm y/o las secuencias genéticas de un ácido nucleico diana. Dichas sondas oligonucleotídicas son preferentemente oligonucleótidos modificados que son resistentes a las nucleasas endógenas, por ejemplo, exonucleasas y/o endonucleasas y, por lo tanto, son estables in vivo. Ejemplos de moléculas de ácidos nucleicos para su uso como oligonucleótidos antisentido son análogos de ADN de fosforamidato, fosfotionato y metilfosfonato (véase también las patentes de Estados Unidos n.° 5176996; 5264564; y 5256775). Adicionalmente, las aproximaciones generales para construir oligómeros útiles en la terapia antisentido se han revisado, por ejemplo, en Van der Krol et al., BioTechniques 6: 958-976, 1988; y Stein et al., Cáncer Res 48: 2659-2668, 1988.

Con respecto al oligonucleótido antisentido, se prefieren las regiones oligodesoxirribonucleótidas derivadas del sitio de partida de la traducción, por ejemplo, entre -10 y 10 del gen diana. Las aproximaciones antisentido implican el diseño de oligonucleótidos (ADN o ARN) que son complementarios al ARNm que codifica el polipéptido diana. El oligonucleótido antisentido se unirá al ARNm transcrito y se evitará la traducción.

Los oligonucleótidos que son complementarios al extremo 5' del ARNm, por ejemplo, la secuencia 5' no traducida hasta e incluyendo el codón de inicio AUG deben funcionar de la manera más eficiente para inhibir la traducción. No obstante, recientemente se ha demostrado que las secuencias complementarias a las secuencias 3' no traducidas del ARNm también son eficientes para inhibir la traducción del ARNm (Wagner, Nature 372: 333, 1994). Por lo tanto, podrían usarse oligonucleótidos complementarios en las regiones 5' o 3' no traducidas, regiones no codificantes de un gen en una aproximación antisentido para inhibir la traducción de ese ARNm. Los oligonucleótidos complementarios a la región 5' no traducida del ARNm deben incluir el complemento del codón de inicio AUG. Los oligonucleótidos complementarios a la región codificante del ARNm son inhibidores de la traducción menos eficientes, pero también podrían usarse de acuerdo con la divulgación. Si están diseñados para hibridar con la región 5', la región 3' o la región codificante del ARNm, los ácidos nucleicos antisentido deben tener al menos seis nucleótidos de longitud y, preferentemente, tener menos de aproximadamente 100 y, más preferentemente, menos de aproximadamente 50, 25, 17 o 10 nucleótidos de largo.

Preferentemente, se realizan estudios in vitro primero para cuantificar la capacidad de los oligonucleótidos antisentido para inhibir la expresión génica. Preferentemente, estos estudios usan controles que distinguen entre la inhibición del gen antisentido y los efectos biológicos no específicos de los oligonucleótidos. También preferentemente, estos estudios compararon los niveles de ARN o proteína diana con los de un control interno de ARN o proteína. Los resultados obtenidos usando los oligonucleótidos antisentido se pueden comparar con los obtenidos usando un oligonucleótido de control. Preferentemente, el oligonucleótido de control es de aproximadamente la misma longitud que el oligonucleótido a ensayar y que la secuencia de oligonucleótidos no difiere de la secuencia antisentido más de lo que se considera necesario para evitar la hibridación específica con la secuencia diana.

El oligonucleótido antisentido puede ser un ADN o ARN mono o bicatenario o mezclas quiméricas o derivados o versiones modificadas de los mismos. El oligonucleótido puede modificarse en el grupo base, el grupo azúcar o el esqueleto de fosfato, por ejemplo, para mejorar la estabilidad de la molécula, su capacidad de hibridación, etc. El oligonucleótido puede incluir otros grupos de unión, tales como péptidos (por ejemplo, para dirigirlos a los receptores de las células huésped) o agentes para facilitar el transporte a través de la membrana celular (véase, por ejemplo, Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6553-6556, 1989; Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648-652, 1987; la publicación PCT N.° WO 88/09810) o la barrera hematoencefálica (véase, por ejemplo, la publicación PCT N.° WO 89/10134), agentes intercalantes (véase, por ejemplo, Zon, Pharm. Res. 5: 539-549, 1988). Para este fin, el oligonucleótido puede conjugarse con otra molécula, por ejemplo, un péptido, un agente de transporte, un agente de escisión activado por hibridación, etc.

Los oligonucleótidos antisentido pueden comprender al menos un grupo de base modificada. El oligonucleótido antisentido también puede comprender al menos un grupo azúcar modificado seleccionado del grupo que incluye, aunque sin limitación, arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa y hexosa. El oligonucleótido antisentido también puede contener un esqueleto similar a un péptido neutro. Dichas moléculas se conocen como oligómeros de ácido péptido nucleico (APN) y se describen, por ejemplo, en Perry-O'Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 14670, 1996, y en Eglom et al., Nature 365: 566, 1993.

En otro aspecto más, el oligonucleótido antisentido comprende al menos un esqueleto de fosfato modificado. En otro aspecto más, el oligonucleótido antisentido es un oligonucleótido alfa anomérico.

Aunque se pueden usar oligonucleótidos antisentido complementarios a la región codificante de la secuencia de ARNm diana, también se pueden usar aquellos complementarios a la región no traducida transcrita.

En algunos casos, puede ser difícil alcanzar las concentraciones intracelulares suficientes del antisentido para suprimir la traducción de ARNm endógeno. Por lo tanto, una aproximación preferida usa una construcción de ADN recombinante en la que el oligonucleótido antisentido se coloca bajo el control de un promotor fuerte pol III o pol II.

Como alternativa, la expresión del gen diana puede reducirse dirigiendo secuencias de desoxirribonucleótidos complementarias a la región reguladora del gen (es decir, el promotor y/o los potenciadores) para formar estructuras de triple hélice que impiden la transcripción del gen en las células diana en el cuerpo (véase, en general, Helene, Anticancer Drug Des. 6(6): 569-84, 1991). En determinados aspectos, los oligonucleótidos antisentido son morfolinas antisentido.

ARNip

El ARN de interferencia pequeño o ARNip son agentes capaces de inhibir la expresión de un gen diana mediante la interferencia de ARN. Un ARNip puede sintetizarse químicamente, puede obtenerse mediante transcripción in vitro o puede sintetizarse in vivo en la célula diana. Normalmente, el ARNip consiste en un ARN bicatenario de entre 15 y 40 nucleótidos de longitud y puede contener una región sobresaliente 3' y/o 5' de 1 a 6 nucleótidos. La longitud de la región sobresaliente es independiente de la longitud total de la molécula de ARNip. El ARNip actúa degradando o silenciando al mensajero diana después de la transcripción.

Los ARNip de la divulgación son sustancialmente homólogos al ARNm del gen que codifica c-MAF o a la secuencia génica que codifica dicha proteína. Por "sustancialmente homólogo" se entiende que tiene una secuencia que es suficientemente complementaria o similar al ARNm diana, de modo que el ARNip es capaz de degradar este último a través de interferencia de ARN. El ARNip adecuado para causar dicha interferencia incluye ARNip formado por ARN, así como ARNip que contiene diferentes modificaciones químicas, tales como:

- ARNip en el que los enlaces entre los nucleótidos son diferentes de los que aparecen en la naturaleza, tales como enlaces de fosforotionato.

- Conjugados de la cadena de ARN con un reactivo funcional, tal como un fluoróforo.

- Modificaciones de los extremos de las cadenas de ARN, particularmente del extremo 3' mediante la modificación con diferentes grupos funcionales hidroxilo en posición 2'.

- Nucleótidos con azúcares modificados tales como los residuos O-alquilados en la posición 2' como 2'-O-metilrribosa o 2'-O-fluororribosa.

- Nucleótidos con bases modificadas, tales como bases halogenadas (por ejemplo, 5-bromouracilo y 5-yodouracilo), bases alquiladas (por ejemplo, 7-metilguanosina).

El ARNip se puede usar como tal, es decir, en forma de un ARN bicatenario con las características mencionadas anteriormente. Como alternativa, el uso de vectores que contienen la secuencia de la cadena sentido y antisentido del ARNip es posible bajo el control de promotores adecuados para la expresión de los mismos en la célula de interés.

Los vectores adecuados para expresar ARNip son aquellos en los que las dos regiones de ADN que codifican las dos cadenas de ARNip están dispuestas en tándem en una misma cadena de ADN separada por una región espaciadora que, tras la transcripción, forma un bucle y en donde un único promotor dirige la transcripción de la molécula de ADN que da lugar a ARNhc.

Como alternativa, es posible el uso de vectores en los que cada una de las cadenas que forman el ARNip se forme a partir de la transcripción de una unidad transcripcional diferente. Estos vectores se dividen, a su vez, en vectores de transcripción divergentes y convergentes. En vectores de transcripción divergentes, las unidades transcripcionales que codifican cada una de las cadenas de ADN que forman el ARNip están ubicadas en tándem en un vector de modo que la transcripción de cada cadena de ADN depende de su propio promotor, que puede ser el mismo o diferente (Wang, J. et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100:5103-5106 y Lee, N.S., et al., 2002, Nat. Biotechnol., 20:500-505). En los vectores de transcripción convergentes, las regiones de ADN que dan lugar al ARNip forman las cadenas sentido y antisentido de una región de ADN que están flanqueadas por dos promotores inversos. Después de la transcripción de las cadenas de ARN sentido y antisentido, este último formará el híbrido para formar un ARNip funcional. Se han descrito vectores con sistemas promotores inversos en los que se usan 2 promotores U6 (Tran, N. et al., 2003, BMC Biotechnol., 3:21), un promotor U6 de ratón y un promotor H1 humano (Zheng, L., et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 135-140 y WO 2005026322) y un promotor U6 humano y un promotor H1 de ratón (Kaykas, A. y Moon, R., 2004, BMC Cell Biol, 5:16).

Los promotores adecuados para su uso en la expresión de ARNip a partir de vectores de expresión convergentes o divergentes incluyen cualquier promotor o par de promotores compatibles con las células en las que se va a expresar el ARNip. Por tanto, los promotores adecuados para la presente divulgación incluyen, aunque sin limitación, promotores constitutivos, tales como los derivados de los genomas de virus eucariotas, tales como el virus del polioma, adenovirus, SV40, CMV, virus del sarcoma aviar, virus de la hepatitis B, el promotor del gen de la metalotioneína, el promotor del gen de la timidina cinasa del virus del herpes simple, las regiones LTR del retrovirus, el promotor del gen de la inmunoglobulina, el promotor del gen de la actina, el promotor del gen EF-1 alfa así como los promotores inducibles en los que la expresión de la proteína depende de la adición de un molécula o una señal exógena tal como el sistema de tetraciclina, el sistema de NFkappaB/luz UV, el sistema Cre/Lox y el promotor del gen de choque térmico, los promotores de la ARN polimerasa II regulables descritos en el documento WO/2006/135436, así como los promotores específicos de tejidos (por ejemplo, el promotor de PSA descrito en el documento WO2006012221). En un aspecto preferido, los promotores son promotores de ARN polimerasa III que actúan constitutivamente. Los promotores de la ARN polimerasa III se encuentran en un número limitado de genes tales como ARN 5S, ARNt, ARN 7SL y ARNnp U6. A diferencia de otros promotores de ARN polimerasa III, los promotores de tipo III no requieren ninguna secuencia intragénica, sino que necesitan secuencias en la dirección 5' que comprendan una caja TATA en las posiciones -34 y -24, un elemento de secuencia proximal o PSE entre -66 y -47 y, en algunos casos, un elemento de secuencia distal o DSE entre las posiciones -265 y -149. En un aspecto preferido, los promotores de la ARN polimerasa III de tipo III son los promotores génicos H1 y U6 humanos o murinos. En un aspecto aún más preferido, los promotores son 2 promotores U6 humanos o murinos, un promotor U6 de ratón y un promotor H1 humano o un promotor U6 humano y un promotor H1 de ratón. En el contexto de la presente divulgación, los promotores del gen ER alfa o los promotores del gen de la ciclina D1 son especialmente adecuados y, por lo tanto, son especialmente preferidos para expresar específicamente los genes de interés en los tumores de mama, preferentemente en tumores de mama Er .

El ARNip puede generarse intracelularmente a partir del llamado ARNhc (ARN horquillado corto) caracterizado por que las cadenas antiparalelas que forman el ARNip están conectadas por un bucle o región de horquilla. Los ARNhc pueden ser codificados por plásmidos o virus, particularmente retrovirus, y están bajo el control de un promotor. Los promotores adecuados para expresar ARNhc son aquellos indicados en el párrafo anterior para expresar ARNip.

Los vectores adecuados para expresar ARNip y ARNhc incluyen vectores de expresión procariotas tales como pUC18, pUC19, Bluescript y sus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, CoIEl, pCRl, RP4, fagos y vectores lanzadera tales como pSA3 y pAT28, vectores de expresión en levaduras, tales como vectores de tipo plásmido de 2 micrones, plásmidos de integración, vectores de YEP, plásmidos centroméricos y similares, vectores de expresión en células de insecto tales como vectores de la serie pAC y vectores de la serie pVL, vectores de expresión en plantas tales como pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, vectores de la serie pORE y similares y basados en vectores virales (adenovirus, virus asociados con adenovirus, así como retrovirus y particularmente lentivirus) vectores de expresión en células eucariotas superiores o vectores no virales tales como pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, pZeoSV2, pCI, pSVL y pKSV-10, pBPV-1, pML2d y pTDTl. En un aspecto preferido, los vectores son vectores lentivirales.

Los ARNip y ARNhc de la divulgación se pueden obtener usando una serie de técnicas conocidas por los expertos en la materia. La región de la secuencia de nucleótidos tomada como base para diseñar el ARNip no es limitante y puede contener una región de la secuencia codificante (entre el codón de inicio y el codón de terminación) o puede contener como alternativa secuencias de la región 5' o 3' no traducida, preferentemente entre 25 y 50 nucleótidos de longitud y en cualquier posición en la posición en dirección 3' con respecto al codón de inicio. Una forma de diseñar un ARNip implica la identificación de los motivos AA(N19)TT en los que N puede ser cualquier nucleótido en la secuencia del gen c-MAF, y la selección de aquellos que tienen un alto contenido de G/C. Si no se encuentra dicho motivo, es posible identificar el motivo NA(N21) en el que N puede ser cualquier nucleótido.

Los ARNip específicos de c-MAF incluyen el ARNip descrito en el documento WO2005046731, una de las cadenas del cual es ACGGCUCGAGCAGCGACAA (SEQ ID NO: 6). Otras secuencias de ARNip específico de c-MAF incluyen, aunque sin limitación, CUUACCAGUGUGUUCACAA (SEQ ID NO: 7), UGGAAGACUACUACUGGAUG (SEQ ID NO: 8), AUUUGCAGUCAUGGAGAACC (SEQ ID NO: 9), CAAGGAGAAAUACGAGAAGU (SEQ ID NO: 10), ACAAGGAGAAAUACGAGAAG (SEQ ID NO: 11) y ACCUGGAAGACUACUACUGG (SEQ ID NO: 12).

Enzimas de ADN

Por otra parte, la divulgación también contempla el uso de enzimas de ADN para inhibir la expresión del gen c-MAF de la divulgación. Las enzimas de ADN incorporan algunas de las características mecánicas de las tecnologías tanto antisentido como de ribozima. Las enzimas de ADN están diseñadas de modo que reconocen una secuencia particular de ácido nucleico diana similar al oligonucleótido antisentido, no obstante, como la ribozima, son catalíticas y escinden específicamente el ácido nucleico diana.

Ribozimas

También se pueden usar moléculas de ribozima diseñadas para escindir catalíticamente productos de transcripción de un ARNm diana para impedir la traducción del ARNm que codifica c-MAF, cuya actividad se debe inhibir. Las ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar la escisión específica de ARN (para una revisión, véase, Rossi, Current Biology 4: 469-471, 1994). El mecanismo de acción de la ribozima implica una hibridación específica de una secuencia de molécula de ribozima con un ARN diana complementario, seguida de un acontecimiento de escisión endonucleolítica. La composición de las moléculas de ribozima incluye preferentemente una o más secuencias complementarias al ARNm diana y la secuencia bien conocida responsable de la escisión del ARNm o una secuencia funcionalmente equivalente (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5093246).

Las ribozimas usadas en la presente descripción incluyen ribozimas de cabeza de martillo, endorribonucleasa de ARN (a continuación en la presente invención, "ribozimas de tipo Cech") (Zaug et al., Science 224:574-578, 1984.

Las ribozimas pueden formarse mediante oligonucleótidos modificados (por ejemplo, para mejorar la estabilidad, el direccionamiento, etc.) y deben distribuirse a las células que expresan el gen diana in vivo. Un método de distribución preferido implica el uso de una construcción de ADN que "codifica" la ribozima bajo el control de un promotor fuerte pol III o pol II constitutivo, de modo que las células transfectadas produzcan cantidades suficientes de la ribozima para destruir los mensajeros diana endógenos e inhibir la traducción. Dado que las ribozimas son catalíticas, a diferencia de otras moléculas antisentido, se requiere una baja concentración intracelular para su eficiencia.

Anticuerpos inhibidores

En el contexto de la presente divulgación, por "anticuerpo inhibidor" se entiende cualquier anticuerpo capaz de unirse específicamente a la proteína c-MAF e inhibir una o más de las funciones de dicha proteína, preferentemente aquellas relacionadas con la transcripción. Los anticuerpos pueden prepararse usando cualquiera de los métodos que son conocidos por el experto en la materia, algunos de los cuales se han mencionado anteriormente. Por tanto, los anticuerpos policlonales se preparan por medio de la inmunización de un animal con la proteína a inhibir. Los anticuerpos monoclonales se preparan usando el método descrito por Kohler, Milstein et al. (Nature, 1975, 256: 495). En el contexto de la presente divulgación, los anticuerpos adecuados incluyen anticuerpos intactos que comprenden una región de unión a antígeno variable y una región constante, fragmentos "Fab", "F(ab')2" y "Fab", Fv, scFv, diacuerpos y anticuerpos biespecíficos. Una vez que se identifican los anticuerpos con capacidad de unión a la proteína c-MAF, se seleccionarán aquellos capaces de inhibir la actividad de esta proteína usando un ensayo de identificación de agentes inhibidores.

Péptidos inhibidores

Como se usa en el presente documento, la expresión "péptido inhibidor" se refiere a aquellos péptidos capaces de unirse a la proteína c-MAF e inhibir su actividad como se ha explicado anteriormente, es decir, impedir que c-MAF sea capaz de activar la transcripción génica.

Dominantes negativos de c-MAF

Dado que las proteínas de la familia maf son capaces de homodimerizarse y heterodimerizarse con otros miembros de la familia AP-1, tales como Fos y Jun, una forma de inhibir la actividad de c-MAF es por medio del uso de dominantes negativos capaces de dimerizar con c-MAF pero que carecen de capacidad para activar la transcripción. Por tanto, los dominantes negativos de c-MAF pueden ser cualquiera de las pequeñas proteínas maf que existen en la célula y que carecen de dos tercios del extremo amino terminal que contiene el dominio de transactivación (por ejemplo, mafK, mafF, mafg y pi 8) (Fujiwara et al (1993) Oncogene 8, 2371-2380; Igarashi et al. (1995) J. Biol.Chem. 270, 7615-7624; Andrews et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90, 11488-11492; Kataoka et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 2180­ 2190) (Kataoka et al. (1996) Oncogene 12, 53-62).

Como alternativa, los dominantes negativos de c-MAF incluyen variantes de c-MAF que mantienen la capacidad de dimerización con otras proteínas, pero carecen de la capacidad de activar la transcripción. Estas variantes son, por ejemplo, las que carecen del dominio de transactivación de c-MAF ubicado en el extremo N-terminal de la proteína. Por tanto, las variantes dominantes de c-MAF negativas incluyen de una manera ilustrativa las variantes en las que se han eliminado al menos los aminoácidos 1 a 122, al menos los aminoácidos 1-187 o al menos los aminoácidos 1 a 257 (considerando la numeración del c-MAF humano como se describe en el documento US6274338).

La divulgación contempla el uso tanto de las variantes de dominantes negativos de c-MAF como de los polinucleótidos que codifican c-MAF bajo el control operativo de un promotor adecuado para la expresión en células diana. Los promotores que pueden usarse para regular la transcripción polinucleotídica de la divulgación pueden ser promotores constitutivos, es decir, promotores que dirigen la transcripción a nivel basal, o promotores inducibles en los que la actividad transcripcional requiere una señal externa. Los promotores constitutivos adecuados para regular la transcripción son, entre otros, el promotor de CMV, el promotor de SV40, el promotor de DHFR, el promotor del virus de tumor mamario de ratón (MMTV), el promotor del factor de alargamiento 1a (EFIa), el promotor de albúmina, el promotor de ApoA1, el promotor de queratina, el promotor de CD3, el promotor de inmunoglobulina de cadena pesada o ligera, el promotor de neurofilamento, el promotor de enolasa específico de neuronas, el promotor de L7, el promotor de CD2, el promotor de cinasa de cadena ligera de la miosina, el promotor del gen HOX, el promotor de la timidina cinasa, el promotor de la ARN polimerasa II, el promotor del gen MyoD, el promotor del gen de la fosfogliceratocinasa (PGK), el promotor de la lipoproteína de baja densidad (LDL), el promotor del gen de la actina. En un aspecto preferido, el promotor que regula la expresión del transactivador es el promotor del gen PGK. En un aspecto preferido, el promotor que regula la transcripción polinucleotídica de la divulgación es el promotor de la ARN polimerasa del fago T7.

Preferentemente, los promotores inducibles que se pueden usar en el contexto de la presente divulgación son aquellos que responden a un agente inductor que muestra una expresión basal nula o despreciable en ausencia de un agente inductor y son capaces de promover la activación del gen situado en la posición 3'. Dependiendo del tipo de agente inductor, los promotores inducibles se clasifican como promotores de activación/desactivación de Tet (Gossen, M. y H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551; Gossen, M. et al., 1995, Science 268:1766-1769; Rossi, F.M.V. y H.M. Blau, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456); Promotores de activación/desactivación de pip (US 6287813); promotores dependientes de antiprogestina (US 2004132086), promotores dependientes de ecdisona (Christopherson et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6314-6318; No et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351, Suhr et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:7999-8004 y WO9738117), un promotor dependiente de metalotioneína (WO8604920) y promotores dependientes de rapamicina (Rivera et al., 1996, Nat. Med. 2:1028-32).

Los vectores adecuados para expresar el polinucleótido que codifica la variante dominante negativa de c-MAF incluyen vectores derivados de vectores de expresión procariotas tales como pUC18, pUC19, Bluescript y sus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColEl, pCRl, RP4, fagos y vectores lanzadera tales como pSA3 y pAT28, vectores de expresión en levaduras, tales como vectores de tipo plásmido de 2 micrones, plásmidos de integración, vectores de YEP, plásmidos centroméricos y similares, vectores de expresión en células de insecto tales como vectores de la serie pAC y vectores de la serie pVL, vectores de expresión en plantas tales como pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, vectores de la serie pORE y similares y basados en vectores virales (adenovirus, virus asociados con adenovirus, así como retrovirus y particularmente lentivirus) vectores de expresión en células eucariotas superiores o vectores no virales tales como pSilencer 4.1-CMV (Ambion), pcDNA3, pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, pZeoSV2, pCI, pSVL y pKSV-10, pBPV-1, pML2d y pTDTl.

Otros compuestos inhibidores de la actividad de la proteína c-MAF. Otros compuestos inhibidores de c-MAF adecuados para su uso en la presente divulgación incluyen:

T l 1: m l l ñ n i inhi i r -MAF

continuación

continuación

continuación

Otros inhibidores de c-MAF se describen en la solicitud de patente WO2005063252, tal como se muestra en la siguiente tabla Tabla 2.

continuación

Tabla 2: inhibidores de c-MAF

En aspectos preferidos, los agentes inhibidores de c-MAF se usan para el tratamiento y/o prevención de metástasis ósea. En un aspecto aún más preferido, la metástasis ósea es metástasis osteolítica.

Los agentes inhibidores de c-MAF se administran normalmente en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

El término "vehículo" se refiere a un diluyente o un excipiente con el que se administra el principio activo. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceite, incluyendo aquellos de un origen del petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Agua o soluciones salinas acuosas y soluciones de dextrosa y glicerol acuosas, particularmente para soluciones inyectables, se usan preferentemente como vehículos. Vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin, 1995. Preferentemente, los vehículos de la invención están aprobados por la agencia reguladora del gobierno estatal o federal o están enumerados en la Farmacopea Estadounidense u otra farmacopea reconocida en general para su uso en animales, y más particularmente en seres humanos.

Los vehículos y las sustancias auxiliares necesarios para fabricar la forma farmacéutica deseada de la composición farmacéutica de la divulgación dependerán, entre otros factores, de la forma farmacéutica elegida. Dichas formas farmacéuticas de la composición farmacéutica se fabricarán de acuerdo con los métodos convencionales conocidos por el experto en la materia. Una revisión de los distintos métodos de administración de principios activos, excipientes para su uso y de sus procesos de fabricación puede encontrarse en el "Tratado de Farmacia Galénica", C. Faulí i Trillo, Luzán 5, S.A. Edición 1993. Los ejemplos de composiciones farmacéuticas incluyen cualquier composición sólida (comprimidos, píldoras, cápsulas, gránulos, etc.) o composición líquida (soluciones, suspensiones o emulsiones) para la administración oral, tópica o parenteral. Es más, la composición farmacéutica puede contener, según se considere necesario, estabilizantes, suspensiones, conservantes, tensioactivos y similares.

Para su uso en medicina, los agentes inhibidores de c-MAF pueden encontrarse en forma de profármaco, sal, solvato o clatrato, bien de forma aislada o bien en combinación con agentes activos adicionales y pueden ser formuladas conjuntamente con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Excipientes preferidos para su uso en la presente divulgación incluyen azúcares, almidones, celulosas, gomas y proteínas. En un aspecto particular, la composición farmacéutica de la divulgación se formulará en una forma farmacéutica sólida (por ejemplo, comprimidos, cápsulas, píldoras, gránulos, supositorios, sólidos estériles cristalinos o amorfos que pueden reconstituirse para proporcionar formas líquidas etc.), forma farmacéutica líquida (por ejemplo, soluciones, suspensiones, emulsiones, elixires, lociones, pomadas etc.) o forma farmacéutica semisólida (geles, pomadas, cremas y similares). Las composiciones farmacéuticas de la divulgación pueden administrarse por cualquier vía, incluyendo, aunque sin limitación, la vía oral, la vía intravenosa, la vía intramuscular, la vía intraarterial, la vía intramedular, la vía intratecal, la vía intraventricular, la vía transdérmica, la vía subcutánea, la vía intraperitoneal, la vía intranasal, la vía entérica, la vía tópica, la vía sublingual o la vía rectal. Una revisión de las distintas formas de administración de principios activos, de los excipientes que se usan y de sus procesos de fabricación puede encontrarse en el "Tratado de Farmacia Galénica", C. Faulí i Trillo, Luzán 5, S.A., Edición de 1993 y en "Remington's Pharmaceutical Sciences" (A.R. Gennaro, Ed.), 20a edición, Williams & Wilkins PA, EE. UU., (2000). Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables son conocidos en el estado de la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diferentes tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Las composiciones que comprenden dichos vehículos se pueden formular por procedimientos convencionales conocidos en el estado de la técnica.

En el caso de que se administren ácidos nucleicos (ARNip, polinucleótidos que codifican ARNip o ARNhc o polinucleótidos que codifican dominantes negativos de c-MAF), la divulgación contempla composiciones farmacéuticas particularmente preparadas para administrar dichos ácidos nucleicos. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender dichos ácidos nucleicos desnudos, es decir, en ausencia de compuestos que protejan a los ácidos nucleicos de la degradación por las nucleasas del cuerpo, lo que conlleva la ventaja de que se elimina la toxicidad asociada con los reactivos usados para la transfección. Las vías de administración adecuadas para los compuestos desnudos incluyen la vía intravascular, la vía intratumoral, la vía intracraneal, la vía intraperitoneal, la vía intraplénica, la vía intramuscular, la vía subretiniana, la vía subcutánea, la vía mucosa, la vía tópica y la vía oral (Templeton, 2002, DNA Cell Biol., 21:857-867). Como alternativa, los ácidos nucleicos pueden administrarse formando parte de liposomas conjugados con colesterol o conjugados con compuestos capaces de promover la translocación a través de membranas celulares tales como el péptido Tat derivado de la proteína TAT del VIH-1, la tercera hélice del homeodominio de la proteína antennapedia de D. melanogaster, la proteína VP22 del virus del herpes simple, oligómeros y péptidos de arginina como se describe en el documento WO07069090 (Lindgren, A. et al., 2000, Trends Pharmacol. Sci., 21:99-103, Schwarze, S.R. et al., 2000, Trends Pharmacol. Sci., 21:45-48, Lundberg, M. et al., 2003, Mol Therapy 8:143-150 y Snyder, E.L. y Dowdy, S.F., 2004, Pharm. Res. 21:389-393). Como alternativa, el polinucleótido se puede administrar formando parte de un vector plasmídico o vector viral, preferentemente vectores basados en adenovirus, en virus adeno-asociados o en retrovirus tales como virus basados en el virus de la leucemia murina (VLM) o en lentivirus (VIH, VIF, VAIE).

Los agentes inhibidores de c-MAF o las composiciones farmacéuticas que los contienen se pueden administrar en dosis de menos de 10 mg por kilogramo de peso corporal, preferentemente menos de 5, 2, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005 o 0,00001 mg por cada kg de peso corporal. La dosis unitaria se puede administrar por inyección, por inhalación o por administración tópica.

La dosis depende de la gravedad y la respuesta de la afección que hay que tratar y puede variar entre varios días y meses o hasta que la afección desaparezca. La dosis óptima puede determinarse midiendo periódicamente las concentraciones del agente en el cuerpo del paciente. La dosis óptima se puede determinar a partir de los valores de CE50 obtenidos por medio de ensayos previos in vitro o in vivo en modelos animales. La dosis unitaria se puede administrar una vez al día o menos de una vez al día, preferentemente menos de una vez cada 2, 4, 8 o 30 días. Como alternativa, es posible administrar una dosis inicial seguida de una o varias dosis de mantenimiento, generalmente de una cantidad menor que la dosis inicial. El régimen de mantenimiento puede implicar tratar al paciente con una dosis que oscile entre 0,01 |jg y 1,4 mg/kg de peso corporal por día, por ejemplo, 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 o 0,00001 mg por kg de peso corporal por día. Las dosis de mantenimiento se administran preferentemente una vez cada 5, 10 o 30 días. El tratamiento debe continuarse durante un tiempo que variará de acuerdo con el tipo de trastorno que sufra el paciente, la gravedad del mismo y el estado del paciente. Después del tratamiento, se debe supervisar la evolución del paciente para determinar si la dosis debe aumentarse en caso de que la enfermedad no responda al tratamiento o se reduzca la dosis si se observa una mejoría de la enfermedad o si se observan efectos secundarios no deseados.

Tratamiento o prevención de la degradación ósea en pacientes con cáncer de mama con metástasis ósea que tienen niveles elevados de c-MAF

Los autores de la presente invención han demostrado que los niveles de c-MAF son elevados en la metástasis ósea de los tumores de mama. Asimismo, los autores de la presente invención han demostrado claramente que el medio condicionado de líneas celulares derivadas de tumores de mama primarios que tienen elevada capacidad para causar una metástasis ósea y que sobreexpresan c-MAF es capaz de inducir la formación de osteoclastos en un mayor grado que las células que no sobreexpresan c-MAF. Por tanto, los pacientes que padecen cáncer de mama que ha metastatizado en el hueso y en los que hay niveles elevados de c-MAF en dicha metástasis pueden beneficiarse particularmente de terapias dirigidas a prevenir la degradación ósea causada por el aumento de la actividad osteoclástica.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere al uso de un agente para evitar o prevenir la degradación ósea en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la metástasis ósea en un sujeto que padece cáncer de mama en donde se ha identificado que el sujeto que tiene un elevado nivel de expresión de c-MAF, amplificación o número de copias en una muestra de tejido tumoral con respecto a una muestra de control, en donde el agente capaz de evitar o prevenir la degradación ósea es un bifosfonato o un inhibidor de RANKL.

Como alternativa, la invención se refiere a un agente para evitar o prevenir la degradación ósea para su uso en el tratamiento de la metástasis ósea en un sujeto que padece cáncer de mama, en donde se ha identificado que el sujeto tiene un elevado nivel de expresión de c-MAF, amplificación o número de copias en una muestra de tejido tumoral con respecto a una muestra de control, en donde el agente capaz de evitar o prevenir la degradación ósea es un bifosfonato o un inhibidor de RANKL.

En una realización particular, la metástasis ósea es metástasis osteolítica. En otra realización particular, el cáncer de mama es cáncer de mama ER+ o ER-.

Los términos y expresiones "sujeto", "cáncer de mama ER+", "muestra de tejido tumoral", "metástasis", "gen c-MAF", "niveles de expresión aumentados" y "muestra de control" se han descrito en detalle en relación con el primer método de la invención y son igualmente aplicables al agente para evitar o prevenir la degradación ósea.

Los agentes capaces de evitar o prevenir la degradación ósea adecuados para el método terapéutico descrito en la presente invención se han descrito en detalle anteriormente en el contexto del método de terapia personalizada.

La muestra de referencia o de control es una muestra de tejido tumoral de un sujeto con cáncer de mama ER+ o ER­ que no ha experimentado metástasis o que corresponde al valor mediano de los niveles de expresión del gen c-MAF medidos en una colección de tejido tumoral en muestras de biopsia de sujetos con cáncer de mama ER+ que no han experimentado metástasis.

Los métodos para determinar o cuantificar si los niveles de c-MAF son elevados con respecto a una muestra de control se han descrito en detalle en relación con el primer método de la invención y son igualmente aplicables al agente para evitar o prevenir la degradación ósea.

Como alternativa, se puede llevar a cabo un tratamiento combinado, en el que más de un agente para evitar o prevenir la degradación ósea de los mencionados anteriormente se combinan para tratar y/o prevenir la metástasis o dichos agentes se pueden combinar con otros suplementos, tales como calcio o vitamina D o con una hormona.

Los agentes para evitar o prevenir la degradación ósea se administran normalmente en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. El término "vehículo" y los tipos de vehículos se han definido anteriormente para el agente inhibidor de c-MAF, así como la forma y la dosis en que se pueden administrar y son igualmente aplicables al agente para evitar o prevenir la degradación ósea.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no limitan el alcance de la misma.

Ejemplos

I. Materiales y métodos

Modelos de estudio experimental

Se han desarrollado nuevos modelos experimentales para el estudio de la metástasis en cáncer de mama ER+. Para este fin se ha usado una línea celular de cáncer de mama ER+ humano denominada MCF7 que se sometió a transfección de una manera estable con un vector que permite la expresión de GFP/luciferasa. Esta línea celular se inoculó en ratones inmunodeficientes (Balb-c/nude) mediante inyección en vena intraventricular o caudal para permitir la selección de células con capacidad metastásica en diferentes órganos. Los ratones tenían implantes de estrógenos subcutáneos que aseguraban la presencia de esta hormona por todo el experimento.

Selección de poblaciones metastásicas

Se seleccionaron las poblaciones metastásicas en diferentes tejidos por medio de la identificación y aislamiento de las células de las lesiones metastásicas. Para ese fin, se usaron la técnica de imágenes por bioluminiscencia que permite la detección de la siembra y el crecimiento de las células tumorales en órganos de interés en diferentes momentos y cuantificar el número de células tumorales presentes. Para aplicar esta técnica, las células han sido sometidas a traducción para expresar la luciferasa y el gen GFP y, por lo tanto, están permitidos los métodos de seguimiento en tiempo real no invasivos in vivo. La imagen por luminiscencia (actividad de la luciferasa) se captura con el animal bajo anestesia, usando el equipo Xenogen IVIS y el programa informático Livingimage como metodología preferida debido a su sensibilidad y velocidad. Para aislar las células metastásicas, la lesión tumoral se disecciona y, posteriormente, por medio de técnicas de citometría de barrido por láser por fluorescencia (GFP) se aíslan las células metastásicas de las células del organismo hospedador. Una vez que se aíslan estas células se repite el proceso para enriquecer su tropismo para los diferentes tejidos. Por medio de estos métodos, se aislaron diferentes poblaciones metastásicas con especificidad de tejido entre la que se incluye la metástasis ósea.

Una vez que las poblaciones metastásicas se identifican y aíslan, se lleva a cabo un análisis transcripcional de alto rendimiento. Esta estrategia permite colectivamente identificar genes cuya transcripción aumenta y algunos actúan como mediadores del proceso metastásico en células cancerosas con pronóstico malo. La implicación de los genes cuya expresión se altera en la colonización por las células metastásicas en tejidos y órganos específicos se confirmó por medio de un método de selección in vivo imparcial.

Identificar el grupo de genes enriquecidos en metástasis ósea en cáncer de mama ER+

Por medio de la comparación de los perfiles de expresión génica de las subpoblaciones celulares altamente o escasamente metastásicas, se identificó un grupo de genes cuya sobreexpresión o represión está asociada a un fenotipo osteolítico de metástasis ósea. Las lesiones metastásicas osteolíticas óseas (degradación) a diferencia de la osteoblástica (síntesis), están asociadas a las formas de cáncer de mama con metástasis ósea clínicamente más agresiva. Los perfiles de expresión asociados a las líneas celulares con alta capacidad metastásica ósea se obtuvieron usando métodos convencionales. Los diferentes derivados de metástasis ósea procedentes de las células mamíferas ER+ se clasificaron por un análisis imparcial con respecto a su fenotipo de agresividad en hueso y su perfil de expresión. En ambos casos los derivados de la línea celular metastásica, BoM1 y BoM2, demostraron un comportamiento metastásico diferente al de las células de partida (MCF7), tanto a nivel del perfil de expresión génica, así como fenotípicamente (Figura 1A).

El grupo de los genes enriquecidos para la metástasis ósea en cáncer de mama ER+ incluye citoquinas, moléculas de adhesión celular, proteasas de membrana, mediadores de señalización y factores de transcripción.

A continuación, el grupo de genes seleccionados como candidatos para regular la capacidad de metástasis ósea en cáncer de mama ER+ se sometió a validación clínica en seres humanos. Para ese fin, se compararon los cambios de la expresión del gen candidato con los que ocurren en los perfiles de expresión del gen de dos cohortes, una de tumores de mama primarios y la otra de la metástasis que incluyen 560 y 58 tumores de mama y metástasis, respectivamente.

Identificación de aquellos genes enriquecidos en la metástasis ósea en cáncer de mama ER+ que son relevantes en la metástasis ósea en cáncer de mama ER-

A continuación, se evaluó el papel de los genes enriquecidos en la metástasis ósea en cáncer de mama ER+ en el subtipo ER-. El grupo de los genes enriquecidos para la metástasis ósea en cáncer de mama ER+ incluye el factor de transcripción de c-MAF.

Biología bioinformática y computacional

Se usaron los paquetes estadísticos R y Bioconductor para obtener los grupos de genes enriquecidos en metástasis y para verificar su correlación clínica. Se importaron las funciones y las estructuras específicas para el tratamiento de datos y son de acceso público abierto a través de la página www.bioconductor.org.

Ejemplo 1

Selección de genes relevantes

Se llevó a cabo un análisis para la selección de genes que se expresan de una manera diferencial en células derivadas de una línea celular de cáncer de mama ER+ con tendencia a formar metástasis ósea (Figura 1A). El análisis llevado a cabo permitió identificar 91 genes enriquecidos o silenciados en las líneas celulares derivadas de la línea celular MCF7 ER+ con capacidad de metastatizar en hueso (Figura 1B). Los genes y las funciones determinantes sencillas se seleccionaron para un estudio más detallado que seguía los siguientes criterios:

i) Correlación clínicas con cáncer de mama ER+ agresivo y metástasis ósea.

ii) Funciones previamente conocidas por participar en procesos compatibles con un fenotipo agresivo (por ejemplo, reabsorción ósea, inflamación, angiogénesis),

iii) Variaciones en el nivel de expresión entre las poblaciones metastásicas en comparación con las poblaciones progenitoras como se ha descrito anteriormente, y

iv) El papel central en las redes de regulación génica y la ruta de señalización celular

Basándose en estos criterios, se identificó el factor de transcripción de c-MAF y se confirmó cómo sus variaciones en los niveles de expresión predicen la recurrencia de los tumores de cáncer de mama ER+ primarios.

Ejemplo 2

Valor terapéutico y valor pronóstico de los genes enriquecidos para la metástasis ósea independientemente del subtipo de cáncer de mama

Los genes enriquecidos en la metástasis ósea por medio del sistema experimental para la selección de poblaciones celulares metastásicas implementado en el presente documento se evaluaron frente a dos bases de datos diferentes que contenían los perfiles de expresión y las notas clínicas de 560 tumores de cáncer de mama primarios y 58 metástasis de pacientes con cáncer de mama. Estos tumores son representativos de todos los subtipos de cáncer de mama y la localización de la metástasis. Ambas bases de datos y sus notas clínicas están accesibles públicamente (GSE 2603, 2034, 12276 y 14020).

La expresión génica en los tumores primarios ER+ de los genes de metástasis ósea se correlacionó significativamente con la recurrencia, la supervivencia sin metástasis y la supervivencia (Figuras 1C y D).

Además, se evaluaron los niveles de expresión del gen c-MAF en el tejido metastásico en una cohorte de 58 metástasis de pacientes con cáncer de mama (g Se 14020). Estas metástasis se aislaron de pulmón, hígado, hueso y cerebro. Se verificó el enriquecimiento del gen c-MAF específicamente en metástasis ósea independientemente del subtipo del cáncer de mama, ER+ o ER-, al cual pertenece el tumor o la lesión metastásica (Figura 2A).

Ejemplo 3

Validación funcional in vivo del gen de la metástasis ósea c-MAF en cáncer de mama ER-

El gen metastásico c-MAF que era positivo en el análisis se validó funcionalmente en un ensayo de colonización metastásica ósea en un modelo de injerto experimental de metástasis de cáncer de mama en ratones. La selección de células de cáncer de mama ER- con alta capacidad de crecimiento en hueso está acompañada por la selección de altos niveles del gen metastásico c-MAF (Figura 2B).

Las aproximaciones realizadas para validar el gen candidato para dirigir el proceso de metástasis eran ensayos de ganancia de función. Para este fin, el gen c-MAF se expresó en las células MDA-MB-231 progenitoras y posteriormente se evaluó su capacidad para inducir la expresión de los genes que contribuyen a la metástasis (CTGF) (Figura 2C).

Ejemplo 4

Validación funcional in vivo de los genes metastásicos específicos de tejido

El gen metastásico c-MAF que era positivo en el análisis se validó funcionalmente en un ensayo de colonización metastásica ósea en un modelo de injerto experimental de metástasis de cáncer de mama en ratones.

Las aproximaciones realizadas para validar el gen candidato para dirigir el proceso de metástasis eran ensayos de pérdida de función y de ganancia de función. Para este fin, el gen c-MAF se expresó o silenció en las células progenitoras o en los derivados de célula altamente metastásica ósea y posteriormente se evaluó su capacidad metastásica ósea in vivo.

Ensayos de ganancia de función

Para expresar el gen c-MAF se usaron sistemas lentivirales para inducir la expresión heteróloga del gen candidato en las células tumorales progenitoras y aquellas seleccionadas con baja capacidad metastásica. La capacidad inductora de metástasis del gen c-MAF se determinó por medio de técnicas para el seguimiento de la bioluminiscencia de las células metastásicas inoculadas en el ratón por vía intracardiaca (como se describe en la sección "modelos de estudio experimental"). En todos los casos, las correspondientes células control infectadas con vectores lentivirales que no expresaron la proteína c-MAF se inyectaron de una manera paralela en una cohorte paralela de animales como control negativo (Figura 3B).

Ensayos de pérdida de función

Se suprimió la expresión del gen c-MAF en la línea celular BoM2 altamente metastásica ósea que tiene altos niveles de expresión del gen c-MAF endógeno (Figura 3A y 3C). Para este fin se usó un vector lentiviral que permitía la expresión de un ARN de interferencia (ARNip) con capacidad para reducir la expresión del gen c-MAF en un 80 % en relación con los niveles presentes en la línea celular BoM2. Esta población celular con la expresión del gen c-MAF silenciada se inoculó por vía intracardiaca (como se describe en la sección "modelos de estudio experimental") en ratones inmunodeprimidos haciéndose un seguimiento de estos animales para detectar la actividad metastásica por medio de técnica de imágenes por bioluminiscencia. En estos experimentos las células obtenidas de la línea BoM2 mediante infección con vector lentiviral que codifica un ARNip que actúa eficazmente frente a la expresión de otro gen que es irrelevante para el proceso metastásico, se usaron como control negativo.

Ejemplo 5

Ensayo de diferenciación de osteoclastos

Se aislaron células primarias que se originan de la médula ósea de un ratón y se dejaron crecer en cultivo en presencia de M-CSF (factor estimulante de colonia de macrófagos). Después de 3 días las células se sometieron a tripsinización y se sembraron en placas de 24 pocillos (1,5 x 104 células por pocillo) por triplicado para cada condición experimental. Para inducir la diferenciación de osteoclastos, se cultivaron estos precursores con medio de condicionado de células de cáncer de mama ER+ MCF7 con o sin sobreexpresión de la isoforma "corta" y "larga" del gen c-MAF, en presencia del ligando RANK y M-CSF. El medio se cambió cada tres días y, en el séptimo día, se realizó la tinción específica de los osteoclastos que consistía en la detección de la enzima fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP). Se obtuvieron imágenes por microscopio óptico de haz invertido. Se determinó el número de células positivas para TRAP y se dividió entre el número total de células por campo. Por último, todos los valores se normalizaron con aquellos del grupo control, MCF7. Como se puede observar en la figura 4, el número de osteoclastos aumentó cuando los precursores de osteoclastos se pusieron en contacto con el medio de las células de cáncer de mama ER+ MCF7 que sobreexpresan la isoforma corta o la isoforma larga de c-MAF.

Este ensayo permite determinar la interacción de las células metastásicas con los componentes del ambiente o nicho metastásico del hueso. Los osteoclastos son responsables de la degradación del hueso y la degradación se muestra en las lesiones metastásicas osteolíticas.

Ejemplo 6

Identificación de la amplificación cromosómica en la región chr16q22-q24 (incluye el gen c-MAF)

La detección de las alteraciones del número de copias (CNA) por medio del análisis del perfil de expresión es teóricamente posible debido a que hay una fuerte correlación entre las alteraciones genómicas y la expresión génica aberrante en las regiones genómicas afectadas (Pollack et al. 2002; PNAS; 99:12963-12968). Específicamente, la detección exacta de las CNA usando el análisis de expresión génica es posible y su dificultad es el resultado del tipo de datos de expresión de partida (Hu et al. 2009 Cáncer Cell, 15:9-20).

Se evaluó el papel de los genes enriquecidos en la metástasis ósea en cáncer de mama ER+. Para ese fin se analizaron las alteraciones en el número de copias de genoma en las células altamente metastásicas óseas, BoM2, derivadas de la línea celular de cáncer de mama MCF7 que se generan en el propio laboratorio de las investigaciones y que se caracterizan por la expresión de altos niveles del gen c-MAF. El análisis se ha basado en la comparación de los perfiles de expresión génica de las células progenitoras y BoM2 derivadas de MCF7. Se alinean y se localizan las diferencias de la expresión génica observada en las células BoM2 en comparación con las células progenitoras en su posición, en los 23 tipos de cromosomas presentes en las células humanas.

Por tanto, se han identificado regiones genómicas (Figura 5) en donde los genes cuya expresión se sobreexpresa y subexpresa están representados en las células BoM2 en comparación con las células progenitoras, lo cual es un indicador de la amplificación o la deleción del ADN genómico (Hu et al. 2009, Cáncer Cell, 15:9-20). Para ese fin, se ha usado el programa informático "Partek Genomic Suite 6.5". Este programa informático ha permitido identificar aquellos genes cuya expresión se aumenta o reduce en las células BoM2 en comparación con las células progenitoras. Una vez que se identifican estos genes, se representaron las diferencias de expresión observadas para cada gen en la correspondiente localización cromosómica de dicho gen. La representación gráfica de estas observaciones ha permitido identificar las regiones cromosómicas de ganancia de o pérdida de en función de una continua expresión génica aumentada o reducida con una localización cromosómica consecutiva (Figura 5). Los autores de la invención han sido capaces de localizar estas regiones usando citobandas bien conocidas anteriormente descritas.

Entre las regiones diferencialmente amplificadas en las células BoM2, en comparación con las células de cáncer de mama progenitoras MCF7 ER+, se ha observado una ganancia en la región cromosómica 16q22-q24, que incluye el locus que codifica el gen c-MAF.

A continuación, se ha evaluado la razón entre las alteraciones en el número de copias del gen en tumores de mama y metástasis en pacientes con cáncer de mama. Por tanto, se han identificado las regiones cromosómicas con un número significativo de genes asociados a la metástasis en los pacientes usando el modelo de "log del cociente de riesgos instantáneos (CRI) de Cox". Se han seguido los conceptos en ACE (análisis de la alteración en el número de copias en la expresión de datos) (Hu et al. 2009, mencionado anteriormente), que localizan las regiones potenciales con variaciones en el número de copias. Se han usado las funciones del paquete R "PhenoTest". Por tanto, se ha obtenido el "log de CRI" para cada gen a través de la generalización de los modelos aditivos, eligiendo parámetros a través de la validación cruzada y se ha evaluado la significancia estadística permutando (1.000 permutaciones) el "log de CRI" por el genoma completo, y ajustando los valores de p por Benjamini-Hochberg para controlar la tasa de falsos

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un método in vitro para el diagnóstico de la metástasis ósea en un sujeto con cáncer de mama ER+ y/o para el pronóstico de la tendencia a desarrollar metástasis ósea en un sujeto con cáncer de mama ER+, que comprende (i) cuantificar el nivel de expresión del gen c-MAF o el número de copias en una muestra de tejido tumoral de dicho sujeto y

(ii) comparar el nivel de expresión o el número de copias obtenido previamente con el nivel de expresión o el número de copias de dicho gen en una muestra de control, en donde si el nivel de expresión o el número de copias de dicho gen aumenta con respecto a la muestra de control, entonces dicho sujeto tiene un diagnóstico positivo para metástasis ósea o una mayor tendencia a desarrollar metástasis ósea.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la metástasis ósea es metástasis osteolítica.

3. Un método in vitro para diseñar una terapia personalizada para un sujeto con cáncer de mama ER+, que comprende (i) cuantificar el nivel de expresión del gen c-MAF, la amplificación o el número de copias en una muestra de tejido tumoral de dicho sujeto y

(ii) comparar el nivel de expresión, la amplificación o el número de copias obtenido en la etapa (i) con el nivel de expresión, la amplificación o el número de copias de dicho gen en una muestra de control, en donde si el nivel de expresión del gen c-MAF, la amplificación o el número de copias aumenta con respecto a la muestra de control, entonces dicho sujeto es susceptible de recibir una terapia con el objetivo de prevenir la degradación ósea.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la terapia con el objetivo de prevenir la degradación ósea se selecciona del grupo que consiste en un bifosfonato, un inhibidor de RANKL, PTH o un análogo de PRG, ranelato de estroncio, un modulador del receptor de estrógenos, calcitonina y un inhibidor de catepsina K.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el inhibidor de RANKL se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo específico de RANKL y osteoprotegerina.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el anticuerpo específico de RANKL es denosumab.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el bifosfonato es ácido zoledrónico o clodronato.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la cuantificación del nivel de expresión, la amplificación o el número de copias comprende cuantificar el ARN mensajero (ARNm) de dicho gen, o un fragmento de dicho ARNm, el ADN complementario (ADNc) de dicho gen, o un fragmento de dicho ADNc, o cuantificar el nivel de proteína codificado por dicho gen.

9. El método de la reivindicación 8, en donde el nivel de expresión, la amplificación o el número de copias se cuantifica por medio de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa o una matriz de ADN o a Rn .

10. El método de la reivindicación 9, en donde el nivel de proteína se cuantifica por medio de Western blot, ELISA, hibridación in situ, o una matriz de proteína.

11. Uso de un agente capaz de evitar o prevenir la degradación ósea en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la metástasis ósea en un sujeto que padece cáncer de mama en donde se ha identificado que el sujeto tiene un elevado nivel de expresión de c-MAF, amplificación o número de copias en una muestra de tejido tumoral con respecto a una muestra de control, en donde el agente capaz de evitar o prevenir la degradación ósea es un bifosfonato o un inhibidor de RANKL.

12. El uso de la reivindicación 11, en donde el inhibidor de RANKL es el anticuerpo denosumab específico de RANKL.

13. El uso de la reivindicación 11, en donde el bifosfonato es clodronato.

14. El uso de la reivindicación 11, en donde el bifosfonato es ácido zoledrónico.