ES2911526T3

ES2911526T3 - Utilización de campos eléctricos alternos para aumentar la permeabilidad de la barrera de sangre cerebral

Info

Publication number: ES2911526T3
Application number: ES20212126T
Authority: ES
Inventors: Carsten Hagemann; Mario Lohr; Almuth F Kessler; Malgorzata Burek; Carola Forster; Catherine BRAMI; Hadas Sara Hershkovich; Tali VOLOSHIN-SELA
Original assignee: Novocure GmbH
Current assignee: Novocure GmbH
Priority date: 2018-08-23
Filing date: 2019-08-22
Publication date: 2022-05-19
Anticipated expiration: 2039-08-22
Also published as: EP3773291B1; KR20210071964A; KR20250069692A; SG11202012592WA; ES3043508T3; CA3100817A1; CN113908433A; PL3878389T3; DK3892219T3; CN113908432A; EP3895643B1; KR20240042240A; ES2922576T3; PL3773291T3; NZ770867A; IL279466B2; IL279466A; EP3892219A1; CA3100817C; CN113908430B

Abstract

Un aparato para tratar un tumor en el cuerpo de un sujeto y facilitar la administración de una sustancia a través de una barrera hematoencefálica del cuerpo del sujeto, comprendiendo el aparato: un generador de voltaje CA (44) que tiene una entrada de control y está configurado para generar una salida campo eléctrico alterno a una primera frecuencia cuando la entrada de control está en un primer estado y una segunda frecuencia cuando la entrada de control está en un segundo estado; y un controlador (42) programado para colocar la entrada de control en el segundo estado para que el generador de voltaje CA (44) genere el campo eléctrico alterno a la segunda frecuencia, acepte una solicitud para cambiar el generador de voltaje CA (44) para generar el campo eléctrico alterno en la primera frecuencia, al recibir la solicitud, coloque la entrada de control en el primer estado para que el generador de voltaje de CA (44) emita el campo eléctrico alterno en la primera frecuencia durante un intervalo de tiempo y, después de la transcurrido el intervalo de tiempo, coloque la entrada de control en el segundo estado para que el generador de voltaje de CA (44) emita el campo alterno en la segunda frecuencia; caracterizado porque la primera frecuencia está entre 75 kHz y 125 kHz y la segunda frecuencia está entre 150 kHz y 250 kHz.

Description

DESCRIPCIÓN

Utilización de campos eléctricos alternos para aumentar la permeabilidad de la barrera de sangre cerebral

ANTECEDENTES

[0001] Normalmente, los microvasos cerebrales regulan estrictamente la transferencia de sustancias entre la sangre y el tejido cerebral. Esta regulación por parte de los microvasos cerebrales se denomina barrera hematoencefálica (BBB) y se debe a las uniones estrechas intercelulares (TJ) que se forman entre las células endoteliales de los capilares cerebrales. En los capilares cerebrales, las proteínas TJ se expresan entre 50 y 100 veces más que en los microvasos periféricos. Las TJ están formadas por un intrincado complejo de proteínas transmembrana (claudina y ocludina) con proteínas accesorias citoplasmáticas (ZO-1 y -2, cingulina, a F-6 y 7H6). Al unirse al citoesqueleto de actina, estas proteínas forman una fuerte conexión célula-célula. Las células endoteliales del cerebro, que forman el endotelio de los microvasos cerebrales, son responsables de alrededor del 75-80 % de la resistencia de la BHE a las sustancias, y otras células, como los astrocitos y los pericitos, proporcionan el resto de la resistencia.

[0002] La BBB consiste en uniones estrechas alrededor de los capilares, y normalmente restringe la difusión de objetos microscópicos y moléculas grandes o hidrofílicas en el cerebro, al tiempo que permite la difusión de moléculas hidrofóbicas (transporte transcelular en lugar de paracelular).

[0003] En personas sanas, la BBB cumple una función muy importante porque evita que sustancias nocivas (por ejemplo, bacterias, virus y moléculas grandes o hidrofílicas potencialmente dañinas) entren en el cerebro. Hay, sin embargo, situaciones en las que la acción del BBB presenta dificultades. Por ejemplo, podría ser deseable administrar moléculas de fármaco grandes o hidrofílicas para tratar una enfermedad en el cerebro del paciente. Pero cuando la BBB está funcionando normalmente, la BBB bloquea el ingreso de estos medicamentos al cerebro.

[0004] El documento US-A-2017/0281934 describe un aparato para inhibir la propagación de células cancerosas en una región objetivo imponiendo un primer campo eléctrico de CA con una frecuencia de 200 kHz ± 10 % en la región objetivo durante un primer intervalo de tiempo, y un segundo campo eléctrico de CA que tiene una frecuencia de 300 kHz ± 10 % en la región objetivo durante un segundo intervalo de tiempo.

[0005] El documento EP-A-1502623 describe un aparato de electroestimulación transcraneal que incluye un generador de pulsos bipolares de una primera frecuencia y una fuente de modulación de señales de control que produce una salida a una segunda frecuencia, menor que la primera frecuencia, y provoca que los pulsos bipolares varíen en amplitud en un patrón asimétrico predeterminado.

[0006] El documento US-A-2003/0191506 describe un aparato para proporcionar señales eléctricas terapéuticas, que son generadas por un generador de señales que aplica una onda base dentro de una frecuencia de alrededor de 150 kHz a 180 kHz a diferentes frecuencias entre alrededor de 2 a 100 veces en un segundo.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0007] La presente invención proporciona un aparato para tratar un tumor en el cuerpo de un sujeto y facilitar la administración de una sustancia a través de una barrera hematoencefálica del cuerpo del sujeto de acuerdo con la reivindicación 1.

[0008] Se describen formas de realización de la invención en las reivindicaciones dependientes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0009]

La FIG. 1 representa una configuración ejemplar para experimentos in vitro en los que se cultivaron células endoteliales capilares de cerebro murino imortilizadas (cerebEND) en cubreobjetos e insertos transwell para crear una versión artificial in vitro de la BBB.

FIGS. 2A y 2B representan los resultados de las pruebas de integridad y permeabilidad, respectivamente, en la BBB artificial.

FIGS. 3A y 3B representan datos que muestran que la permeabilidad aumentada de la BHE artificial no está provocada por la muerte celular.

FIG. 4 representa las posiciones en las que se cortaron los cerebros de las ratas para un experimento in vivo. FIG. 5 representa la acumulación de EB para este experimento in vivo en diferentes secciones del cerebro de las ratas.

FIG. 6 representa la acumulación promedio de EB en el cerebro de rata para este experimento in vivo, promediada en todas las secciones.

FIG. 7 representa el aumento de la permeabilidad de la BBB en tres secciones diferentes de cerebros de ratas que se induce mediante campos eléctricos alternos in vivo, según se determina utilizando resonancias magnéticas con realce de contraste.

FIG. 8 representa el aumento de la permeabilidad de la BHE en las cortezas de ratas que se induce mediante campos eléctricos alternos in vivo, según se determina utilizando resonancias magnéticas con realce de contraste.

FIG. 9 representa una relación temporal adecuada entre la aplicación del campo eléctrico alterno y la administración de la sustancia al sujeto.

FIG. 10 es un diagrama de bloques de un aparato de doble frecuencia que genera una primera frecuencia para inducir la permeabilidad de BBB y una segunda frecuencia para inducir citotoxicidad.

DESCRIPCIÓN DE LAS FORMAS DE REALIZACIÓN PREFERIDAS

[0010] Esta solicitud describe un enfoque novedoso para aumentar temporalmente la permeabilidad de la BBB utilizando campos eléctricos alternos para que las sustancias que normalmente están bloqueadas por el BBB podrán cruzar el BBB.

[0011] Se llevó a cabo un conjunto de experimentos in vitro en los que se cultivaron células endoteliales capilares de cerebro murino inmortalizadas (cerebEND) en cubreobjetos e insertos transwell para crear una versión artificial in vitro de la BBB, y la FIG. 1 representa la configuración para estos experimentos. A continuación, las células se trataron con campos eléctricos alternos (100-300 kHz) durante 24 h, 48 h y 72 h. La dirección de los campos eléctricos alternos se cambió cada 1 segundo entre dos direcciones perpendiculares (es decir, 1 segundo en una dirección seguido de 1 segundo en la otra dirección, en una secuencia repetitiva). Luego se analizaron los siguientes efectos: (a) Morfología celular (tinción de inmunofluorescencia de las proteínas de unión estrecha Claudin 5 y ZO-1); (b) integridad BBB (usando resistencia eléctrica transendotelial (TEER)); y (c) permeabilidad de BBB (usando isotiocianato de fluoresceína acoplado a dextrano (FITC) para citometría de flujo).

[0012] Un primer conjunto de experimentos implicó la visualización de la morfología y orientación celular, y la visualización de la localización de proteínas teñidas. Este experimento fue diseñado para determinar cómo la frecuencia del campo eléctrico alterno impactó el BBB artificial. Aquí, las células se cultivaron en cubreobjetos y se aplicaron campos eléctricos alternos durante 72 horas a cuatro frecuencias diferentes (100 kHz, 150 kHz, 200 kHz y 300 kHz), con una intensidad de campo de 1,7 V/cm. La dirección de los campos eléctricos alternos se cambió cada 1 segundo entre dos direcciones perpendiculares. También hubo un control en el que no se aplicaron campos eléctricos alternos. A continuación, se obtuvieron imágenes de morfología celular que representaban la presencia de Claudin 5, ZO-1 y 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en (cada una de las cuales se tiñó de un color diferente). Claudin 5 y ZO-1 indican la presencia de una BBB intacta. Este conjunto de imágenes de morfología celular reveló que los campos eléctricos alternos alteran la BBB artificial mediante la deslocalización de las proteínas de unión estrecha desde los límites celulares hasta el citoplasma, con los efectos más dramáticos a 100 kHz.

[0013] Un segundo conjunto de experimentos también implicó la visualización de la morfología celular. Este experimento fue diseñado para determinar cómo la duración del tiempo durante el cual se aplicó el campo eléctrico alterno impactó el BBB artificial. Las células endoteliales se cultivaron en cubreobjetos y se aplicó un campo eléctrico alterno a una frecuencia de 100 kHz durante tres duraciones diferentes (24 h, 48 h, 72 h) más un control. La dirección de los campos eléctricos alternos se cambió cada 1 segundo entre dos direcciones perpendiculares. A continuación, se obtuvieron imágenes de morfología celular que representaban la presencia de Claudin 5 y DAPI (cada una de las cuales se tiñó de un color diferente). Este conjunto de imágenes de morfología celular reveló que los fenómenos discutidos anteriormente en relación con el primer conjunto de experimentos ya eran visibles después de 24 horas y que los efectos eran más pronunciados después de 72 horas.

[0014] Un tercer conjunto de experimentos también implicó la visualización de la morfología celular. Este experimento fue similar al segundo conjunto de experimentos, excepto que las células endoteliales se cultivaron en insertos transwell en lugar de cubreobjetos. Los resultados fueron similares a los resultados del segundo grupo de experimentos. La deslocalización de las proteínas TJ fue visible después de 24 horas y los efectos fueron más pronunciados después de 72 horas. Los tres experimentos descritos anteriormente respaldan la conclusión de que los campos eléctricos alternos provocan cambios estructurales en las células, lo que podría ser responsable de un aumento en la permeabilidad de la BBB.

[0015] Las FIG. 2A y 2B muestran los resultados de las pruebas de integridad y permeabilidad, respectivamente, en el BBB artificial después de someterlo a campos eléctricos alternos a una frecuencia de 100 kHz durante 72 horas (con la dirección de los campos eléctricos alternos cambiada cada 1 segundo entre dos direcciones perpendiculares), y para un control. Más específicamente, la FIG. 2A muestra los resultados de una prueba de resistencia eléctrica transendotelial (TEER), que revela que los campos eléctricos alternos redujeron la integridad de la BHE artificial al 35 % del control. FIG.

2B muestra los resultados de una prueba de permeabilidad de isotiocianato de fluoresceína (FITC), que revela que los campos eléctricos alternos aumentaron la permeabilidad de la BBB artificial a FITC-dextranos con un peso molecular de 4 kDa al 110 % del control. Estos experimentos respaldan aún más la conclusión de que los campos eléctricos alternos aumentan la permeabilidad de la BBB a moléculas que normalmente no pueden atravesar una BBB sin fugas.

[0016] Colectivamente, estos experimentos in vitro revelan que la aplicación de campos eléctricos alternos a ciertas frecuencias durante un tiempo suficiente provoca la deslocalización de las proteínas de unión estrecha (Claudin 5, ZO-1) desde los límites celulares hasta el citoplasma (con la mayor parte efectos dramáticos a 100 kHz), y aumenta la permeabilidad de la BBB. Los efectos de los campos eléctricos alternos aparecen ya después de 24 h y son más prominentes después de 72 h. Más específicamente, después de usar los campos eléctricos alternos para aumentar la permeabilidad de la BBB, las moléculas de 4 kDa pueden pasar a través de la BBB.

[0017] Luego se llevaron a cabo experimentos in vitro adicionales para determinar qué sucede con la BBB después de que se apagan los campos eléctricos alternos. Estos experimentos utilizaron la visualización de la morfología celular para mostrar cómo se recupera la BBB artificial después de interrumpir los campos eléctricos alternos. En estos experimentos, las células endoteliales se cultivaron en cubreobjetos y se trataron con campos eléctricos alternos de 100 kHz a una intensidad de campo de 1,7 V/cm durante 72 horas. La dirección de los campos eléctricos alternos se cambió cada 1 segundo entre dos direcciones perpendiculares. A continuación, se apagaron los campos eléctricos alternos y se siguió a las células durante 96 horas después de detener el campo eléctrico alterno. Se obtuvieron imágenes de morfología celular que representaban la presencia de Claudin 5 (teñidas) a las 24 horas, 48 horas, 72 horas y 96 horas. Esas imágenes revelaron un cambio progresivo en la localización de Claudin entre los límites de la célula y el citoplasma en las imágenes de 24 h, 48 h, 72 h y 96 h. Además, una comparación de esas cuatro imágenes con las imágenes respectivas del control (en las que no se aplicaron campos eléctricos alternos ni durante las primeras 72 h ni durante las últimas 96 h) reveló que la morfología de las células endoteliales se recuperó parcialmente 48 horas después de detener los campos eléctricos alternos, y que la BBB se recuperó por completo (es decir, era comparable al control) 96 horas después de detener los campos eléctricos alternos.

[0018] Las FIG. 3A y 3B representan los resultados de un experimento in vitro diseñado para determinar si los cambios observados en la permeabilidad de la BHE artificial descritos anteriormente podrían atribuirse a la muerte celular. Este experimento probó la división celular comparando los recuentos de células (a) cuando se aplicaron campos eléctricos alternos durante 72 horas seguidos de campos eléctricos alternos durante 96 horas con (b) un control en el que nunca se aplicaron campos eléctricos alternos. Las células endoteliales se cultivaron en cubreobjetos y se trataron con campos eléctricos alternos de 100 kHz a una intensidad de campo de 1,7 V/cm durante 72 horas. La dirección de los campos eléctricos alternos se cambió cada 1 segundo entre dos direcciones perpendiculares. A continuación, se apagaron los campos eléctricos alternos y se siguió a las células durante 96 horas después de detener el campo eléctrico alterno. Se contó el número de células por ml para los campos eléctricos alternos y el control, y los resultados se representan en la FIG. 3A y 3B (para control y para campos eléctricos alternos, respectivamente). Estos resultados revelan que no hubo un aumento estadísticamente significativo en el número de células durante o después de la aplicación de los campos eléctricos alternos, lo que indica que los cambios en la permeabilidad de la BHE señalados anteriormente no pueden atribuirse a la muerte celular.

[0019] Otro experimento in vitro usó un ensayo TUNEL para la apoptosis para determinar si los cambios observados en la permeabilidad de la BHE artificial descritos anteriormente podrían atribuirse a la muerte celular. En este experimento, las células endoteliales se cultivaron en cubreobjetos y se trataron con campos eléctricos alternos de 100 kHz a una intensidad de campo de 1,7 V/cm durante 72 horas. La dirección de los campos eléctricos alternos se cambió cada 1 segundo entre dos direcciones perpendiculares. En el control no se aplicaron campos eléctricos alternos. Se obtuvieron imágenes de morfología celular que representan apoptosis (TUNEL) y núcleos (DAPI) (cada una de las cuales se tiñó de un color diferente) después de 24, 48 y 72 horas. Ninguna de esas imágenes reveló evidencia adicional de apoptosis, lo que indica que los campos eléctricos alternos no causaron la muerte celular. Esto confirma que los cambios en la permeabilidad de la BHE señalados anteriormente no eran atribuibles a la muerte celular.

[0020] También se llevó a cabo un conjunto de experimentos in vivo en ratas para cuantificar el aumento de la permeabilidad de los vasos provocado por la exposición a los campos eléctricos alternos. Estos experimentos utilizaron colorante azul de Evans (EB), que es un colorante azo que tiene una afinidad muy alta por la albúmina sérica (tamaño de molécula ~ 69 kDa). Debido a su gran tamaño de molécula, la albúmina sérica normalmente no podrá atravesar la BBB. Pero si la permeabilidad de la BHE ha aumentado lo suficiente, algunas de las moléculas de albúmina sérica (junto con el colorante EB que se ha unido a ella) atravesarán la BHE y luego podrán detectarse buscando la EB en el cerebro de la rata.

[0021] En este conjunto de experimentos, se aplicaron campos eléctricos alternos de 100 kHz al cerebro de la rata durante 72 horas, y la dirección de los campos eléctricos alternos se cambió cada segundo entre dos direcciones perpendiculares. Esto se logró afeitando la cabeza de cada rata, colocando un primer par de electrodos acoplados capacitivamente en la parte superior e inferior de la cabeza de la rata y colocando un segundo par de electrodos acoplados capacitivamente en los lados izquierdo y derecho de la cabeza de la rata. Luego se aplicó un voltaje de CA de 100 kHz entre los electrodos superior e inferior durante 1 segundo, seguido de un voltaje de CA de 100 kHz entre los electrodos derecho e izquierdo durante 1 segundo, en una secuencia repetitiva.

[0022] En las condiciones indicadas en la Tabla 1 y durante los tiempos indicados en la Tabla 1, se inyectó EB por vía intravenosa en la vena de la cola bajo anestesia (una vez inyectado, EB se une inmediatamente a la albúmina), y se dejó circular el EB durante 2 horas. en todos los casos. Luego se realizaron los siguientes pasos: (a) perfusión intracardíaca con solución salina; (b) los cerebros se cortan en cuatro pedazos con una cortadora de cerebros; (c) los pedazos se fotografiaron para localizar la tinción y se pesaron; (d) extracción de EB después de la homogeneización del tejido con TCA al 50 % (1:3) y centrífuga y (e) cuantificación de EB a 610 nm. Los resultados se dan como mg de EB por g de tejido.

TABLA 1

[0023] Durante el experimento, se excluyeron dos animales del grupo 2 y un animal del grupo 4 (tratamiento interrumpido, fallo en la inyección de EB en la vena de la cola). No hubo diferencias entre los animales tratados con campos eléctricos alternos (grupos 1 y 2) y por lo tanto estos animales fueron agrupados. Del mismo modo, no hubo diferencias entre el celo simulado y los animales de control (grupos 3 y 4) y, por lo tanto, estos animales se agruparon juntos.

[0024] Se cortaron los cerebros de las ratas en cuatro pedazos utilizando un cortador de cerebros en las posiciones que se muestran en la FIG. 4. Después se midió la acumulación de EB en estas cuatro secciones específicas. Además, se realizó una simulación por computadora para determinar la intensidad de campo en cada una de estas cuatro secciones. La Tabla 2 especifica la intensidad de campo obtenida de la simulación en cada una de estas cuatro secciones, con todos los valores dados en V/cm RMS.

TABLA 2

[0025] Los resultados de la acumulación de EB en las secciones 1 a 4 se representan en la FIG. 5. El resumen de estos resultados es el siguiente: (1) se observó un aumento estadísticamente significativo en las secciones 1,2 (cerebro frontal) donde la intensidad de campo era más alta; y se observó un aumento menor (que no fue estadísticamente significativo) en las secciones más posteriores (3, 4) donde la intensidad de campo fue menor.

[0026] La FIG. 6 representa la acumulación promedio de EB en el cerebro de rata, promediada en las cuatro secciones 1-4. Este resultado revela una mayor acumulación de EB en los cerebros de las ratas tratadas con campos eléctricos alternos durante 72 horas, y este resultado fue estadísticamente significativo (p<0,05).

[0027] Los experimentos in vivo descritos anteriormente establecen que: (1) la aplicación de campos eléctricos alternos permite el paso de BBB de moléculas de tamaño molecular medio de ~69 kDa al tejido cerebral; (2) el aumento de la permeabilidad de la BBB se mantiene 2 horas después de terminar la aplicación de campos eléctricos alternos; y (3) el aumento de la permeabilidad de la BBB varía entre las diferentes secciones del cerebro. Este último puede ser el resultado de las diferentes intensidades de campo que se impusieron en las diversas secciones del cerebro. Estos experimentos respaldan aún más nuestra conclusión de que los campos eléctricos alternos aumentan la permeabilidad de la BBB a moléculas que normalmente no pueden atravesar una BBB sin fugas.

[0028] En otro conjunto de experimentos in vivo, se trataron 5 ratas con campos eléctricos alternos a 100 kHz durante 72 h, y 4 ratas de control no se trataron con campos eléctricos alternos durante el mismo período de tiempo. Al final del período de 72 horas, el compuesto fluorescente TRITC-Dextrano de 4 kDa se inyectó por vía intravenosa en la vena de la cola bajo anestesia, y se dejó circular durante 2 minutos en todos los casos. A continuación, los cerebros se extrajeron, congelaron, seccionaron y escanearon con un escáner fluorescente. Todos los portaobjetos se escanearon con las mismas condiciones. Las imágenes resultantes revelaron niveles significativamente más altos de acumulación de TRITC-Dextrano fluorescente de 4 kDA en el tejido cerebral de las ratas que fueron sometidas a campos eléctricos alternos (en comparación con el control), lo que confirma una vez más que los campos eléctricos alternos aumentan la permeabilidad del BBB.

[0029] Se realizó otro conjunto más de experimentos in vivo usando MRI mejorada con contraste dinámico (DCE-MRI) con inyección intravenosa de agente de contraste de gadolinio (Gd-DTPA, Magnetol, PM 547). En estos experimentos, las ratas de prueba se trataron con campos eléctricos alternos de 100 kHz durante 72 horas y las ratas de control no se trataron con campos eléctricos alternos durante el mismo período de tiempo. Después de este período de 72 h, se apagó el campo eléctrico alterno, se anestesiaron las ratas y se adquirió una serie de 60 exploraciones de resonancia magnética T1w (cada una de las exploraciones con una duración de 28 segundos). El agente de contraste de gadolinio se inyectó en la vena de la cola de la rata durante la séptima de estas 60 exploraciones.

[0030] El análisis de imágenes para cada rata incluyó (1) determinar una línea de base para cada vóxel calculando la media de las primeras seis exploraciones de resonancia magnética T1w para cada vóxel (es decir, las exploraciones antes de la inyección del gadolinio); (2) calcular vóxel por vóxel, el cambio porcentual de la señal (es decir, la acumulación de gadolinio) a lo largo del tiempo en relación con la línea de base; (3) segmentar el cerebro en segmentos anterior, medio y posterior; (4) generar para cada uno de los tres segmentos el cambio porcentual medio de la señal con respecto a la línea de base sobre todos los vóxeles en el segmento respectivo y luego (5) promediar 4 puntos de tiempo consecutivos (es decir, 4 exploraciones) juntos. Finalmente, los datos de todas las ratas dentro de cualquier grupo dado se promediaron juntos.

[0031] Los resultados de este experimento DCE-MRI para cada uno de los tres segmentos del cerebro (es decir, anterior, medio y posterior) se representan en la FIG. 7. Estos datos revelan que la acumulación de agente de contraste en el tejido cerebral de las ratas que fueron tratadas con campos eléctricos alternos (campos TTF marcados con trazas; n=6) fue significativamente mayor que en las ratas de control (control marcado con trazas; n=3). Además, la distinción era más pronunciada en el cerebro posterior, que es la parte del cerebro donde los campos eléctricos alternos tenían la mayor intensidad de campo. De esto podemos concluir que los campos eléctricos alternos aumentaron con éxito la permeabilidad de la BHE in vivo.

[0032] Para probar si este aumento en la permeabilidad de la BBB era temporal, se repitieron las mismas condiciones de prueba, pero seguidas de 96 horas adicionales sin campos eléctricos alternos. Después de este período de 96 horas, se adquirió una serie de 60 exploraciones de resonancia magnética T1w (cada una de las exploraciones con una duración de 28 segundos) utilizando el mismo procedimiento descrito anteriormente (incluida la inyección de gadolinio). Los resultados de esta parte del experimento DCE-MRI para cada uno de los tres segmentos del cerebro también se representan en la FIG. 8. Estos datos revelan que la acumulación de agente de contraste en el tejido cerebral de ratas que fueron tratadas con campos eléctricos alternos durante 72 horas seguidas de 96 horas sin campos eléctricos alternos (traza etiquetada TTFields+96h; n=7) no fue significativamente diferente de las ratas de control (control marcado con trazas+96h; n=3). De esto podemos concluir que la permeabilidad de la BBB vuelve a la normalidad después de que se interrumpen los campos eléctricos alternos.

[0033] También se adquirió una serie adicional de 60 exploraciones de MRI T1w (cada una de las exploraciones con una duración de 28 segundos) usando el mismo procedimiento antes de aplicar el campo eléctrico alterno a las ratas (n=2). Los resultados de esta parte del experimento DCE-MRI para cada uno de los tres segmentos del cerebro (es decir, anterior, medio y posterior) también se representan en la FIG. 8 (ver el rastro etiquetado como "antes").

[0034] La FIG. 8 muestra el promedio de los 3 segmentos del cerebro (es decir, anterior, medio y posterior) durante 72 h de TTFields (n=6) y un control sin TTFields durante 72 h (n=3), con barras de desviación estándar. Se utilizó una prueba t pareada para comparar entre los dos grupos, y p<0,0001.

[0035] Observamos que aún no se ha determinado el límite de tamaño superior de las moléculas que pueden pasar a través de la BBB después de aplicar los campos eléctricos alternos. Pero en base a (a) los experimentos in vitro descritos aquí utilizando FITC-dextranos con un peso molecular de 4 kDa y (b) los experimentos in vivo descritos aquí utilizando EB (que se une a la albúmina sérica que tiene un tamaño de molécula de ~ 69 kDa), la parte superior el límite parece ser de al menos aproximadamente 69 kDa, y con toda certeza es de al menos 4 kDa.

[0036] Las implicaciones de poder aumentar reversiblemente la permeabilidad de la BBB a voluntad son de gran alcance, porque ahora es posible administrar muchas sustancias a través de la BBB de un sujeto, a pesar de que esas sustancias tienen al menos una característica que normalmente impide que la sustancia cruce una BBB sin fugas. Muchas de estas implicaciones implican el suministro de una sustancia que incluye, entre otros, agentes de tratamiento y agentes de diagnóstico a través de la barrera hematoencefálica del cerebro de un sujeto.

[0037] Los ejemplos incluyen, entre otros, los siguientes: administrar agentes quimioterapéuticos a través de la BBB para tratar el cáncer (en este contexto, puede ser posible reducir la dosis de fármacos para el tratamiento de tumores cerebrales y metástasis con efectos secundarios graves en otras partes del cuerpo en función de la mayor permeabilidad de las drogas al cerebro); entregar anticuerpos y/o terapias basadas en células a través de la BBB para inmunoterapia; administrar colorantes, indicadores y marcadores de agentes de contraste a través de la BHE con fines de diagnóstico y para investigación (p. ej., seguimiento de la actividad cerebral); entregar agentes antibacterianos a través de la BBB para tratar enfermedades infecciosas; administrar agentes antivirales o anticuerpos neutralizantes de virus a través de la BBB para tratar infecciones virales; administrar agentes antiparasitarios a través de la BBB para tratar parásitos; administrar agentes para tratar enfermedades neurodegenerativas y autoinmunes en la BHE; entrega de medicamentos psiquiátricos; entrega de medicamentos antiepilépticos; administrar medicamentos para la hidrocefalia; administrar medicamentos para la intervención y la recuperación de accidentes cerebrovasculares; administrar compuestos que faltan en el cerebro a través de la BBB para tratar afecciones en las que faltan esos compuestos (p. ej., para tratar la enfermedad de Parkinson, etc.).

[0038] Aunque la prueba descrita anteriormente se realizó in vitro y en ratas vivas, se espera que se obtengan resultados similares con otros animales y humanos.

[0039] Los métodos descritos en el presente documento también se pueden aplicar en el contexto in vivo mediante la aplicación de campos eléctricos alternos al cerebro de un sujeto vivo. La imposición del campo eléctrico en el cerebro del sujeto aumentará la permeabilidad de la BBB, lo que permitirá que las moléculas que normalmente están bloqueadas o impedidas por la BBB pasen. Esto se puede lograr, por ejemplo, colocando electrodos sobre o debajo de la piel del sujeto de modo que la aplicación de un voltaje de CA entre subconjuntos seleccionados de esos electrodos imponga los campos eléctricos alternos en el cerebro del sujeto.

[0040] Por ejemplo, podría colocarse un par de electrodos en la parte delantera y trasera de la cabeza del sujeto, y podría colocarse un segundo par de electrodos en los lados derecho e izquierdo de la cabeza del sujeto. En algunas formas de realización, los electrodos se acoplan capacitivamente al cuerpo del sujeto (p. ej., usando electrodos que incluyen una placa conductora y también tienen una capa dieléctrica dispuesta entre la placa conductora y el cuerpo del sujeto). Pero en formas de realización alternativas, se puede omitir la capa dieléctrica, en cuyo caso las placas conductoras harían contacto directo con el cuerpo del sujeto. En otra forma de realización, los electrodos podrían insertarse por vía subcutánea debajo de la piel de un paciente.

[0041] Un generador de voltaje de CA aplica un voltaje de CA a una frecuencia seleccionada (p. ej., 100 kHz, o entre 50 y 190 kHz) entre los electrodos derecho e izquierdo durante un primer período de tiempo (p. ej., 1 segundo), lo que induce alternancia eléctrica. campos donde los componentes más significativos de las líneas de campo son paralelos al eje transversal de la cabeza del sujeto. A continuación, el generador de voltaje de CA aplica un voltaje de CA a la misma frecuencia (o una frecuencia diferente) entre los electrodos delantero y trasero durante un segundo período de tiempo (por ejemplo, 1 segundo), lo que induce campos eléctricos alternos donde los componentes más significativos de las líneas de campo son paralelas al eje sagital de la cabeza del sujeto. Esta secuencia de dos pasos se repite luego durante la duración del tratamiento. Opcionalmente, se pueden incluir sensores térmicos en los electrodos, y el generador de voltaje de CA se puede configurar para disminuir la amplitud de los voltajes de CA que se aplican a los electrodos si la temperatura detectada en los electrodos es demasiado alta. En algunas formas de realización, se pueden agregar e incluir en la secuencia uno o más pares de electrodos adicionales. En formas de realización alternativas, solo se utiliza un único par de electrodos, en cuyo caso no se cambia la dirección de las líneas de campo. Tenga en cuenta que cualquiera de los parámetros para esta realización in vivo (p. ej., frecuencia, intensidad de campo, duración, tasa de cambio de dirección y colocación de los electrodos) puede variar como se describe anteriormente en relación con las formas de realización in vitro. Pero se debe tener cuidado en el contexto in vivo para garantizar que el campo eléctrico permanezca seguro para el sujeto en todo momento.

[0042] Se puede prever fácilmente una amplia variedad de aplicaciones para aumentar la permeabilidad de la BBB en el contexto in vivo. En un ejemplo, se puede inducir un aumento localizado de la captación del fármaco por parte de las células tumorales (p. ej., células de glioblastoma) en el cerebro aplicando campos eléctricos alternos al cerebro durante un período de tiempo (p. ej., 72 horas o al menos 24 horas) antes de la y durante la administración de quimioterapias u otros agentes antineoplásicos.

[0043] La FIG. 9 representa una relación adecuada en el tiempo entre la aplicación del campo eléctrico alterno y la administración de la sustancia a un paciente vivo. Con base en los datos descritos anteriormente, y suponiendo que la sustancia se introduce o administra en un momento dado t=0, el campo eléctrico alterno puede comenzar antes del tiempo dado (p. ej., 72 horas antes de t=0) y continuar durante un intervalo de tiempo después del tiempo dado (por ejemplo, hasta 12 horas después de t=0). En esta situación, la permeabilidad de la BHE comenzará a aumentar antes de que se administre la sustancia y antes de que la sustancia llegue a la BHE. Esto permitirá que la sustancia cruce la BBB inmediatamente después de su llegada. En el contexto de la quimioterapia, esto correspondería a iniciar la aplicación de los campos eléctricos alternos, administrar el agente quimioterapéutico 72 horas después, seguido de la aplicación de los campos eléctricos alternos por un intervalo de tiempo adicional (por ejemplo, hasta 12 horas después del momento en que se realizó la quimioterapia). que se administró el agente quimioterapéutico).

[0044] Obsérvese que los intervalos de tiempo analizados anteriormente en relación con la FIG. 9 pueden ser ininterrumpidos o pueden incluir descansos que son preferiblemente cortos. Por ejemplo, un intervalo de 12 horas podría satisfacerse con un solo bloque ininterrumpido de 12 horas. Alternativamente, el intervalo de 12 horas podría cumplirse aplicando campos eléctricos alternos durante 6 horas, seguido de un descanso de 1 hora, seguido de la aplicación de campos eléctricos alternos durante 6 horas adicionales. Descansos similares también pueden interrumpir opcionalmente el intervalo de 72 horas que precede a la administración de la sustancia. Obsérvese también que en el contexto de la FIG.

9, cuando la sustancia se administra a un paciente vivo, la administración de la sustancia se puede realizar utilizando cualquiera de una variedad de enfoques que incluyen, entre otros, por vía intravenosa, oral, subcutánea, intratecal, intraventricular e intraperitoneal.

[0045] En algunas formas de realización preferidas, la frecuencia de los campos eléctricos alternos es inferior a 190 kHz (por ejemplo, entre 50 y 190 kHz o entre 25 y 190 kHz). Según los experimentos discutidos anteriormente, el uso de una frecuencia de menos de 190 kHz combinada con un período de tiempo de al menos 24 horas aumentará el cambio en la permeabilidad (en comparación con operar fuera de esos rangos).

[0046] Los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para administrar una sustancia a través de la barrera hematoencefálica del cerebro de un sujeto cuando el cerebro del sujeto incluye un tumor. Un enfoque existente para tratar tumores cerebrales (p. ej., glioblastoma) consiste en aplicar al tumor campos eléctricos alternos a frecuencias entre 50 y 500 kHz, preferiblemente entre 100 y 300 kHz. Para el glioblastoma, 200 kHz es la frecuencia preferida. Los campos eléctricos alternos a estas frecuencias se denominan TTFields y se describen en las patentes estadounidenses 6.868.289 y 7.565.205. Brevemente, esas dos aplicaciones describen la interrupción de células en división durante la mitosis. La eficacia de TTFields mejora cuando la dirección del campo eléctrico se cambia periódicamente, cuando la intensidad del campo en al menos una parte del tumor es de al menos 1 V/cm y cuando los campos se aplican durante largos períodos de tiempo. (por ejemplo, semanas o meses) con la menor cantidad de descansos posible.

[0047] En pacientes con tumores cerebrales, pueden surgir situaciones en las que sea deseable tratar el tumor con TTFields y también administrar una sustancia a través de la barrera hematoencefálica del mismo paciente (p. ej., para ayudar a que una cantidad terapéuticamente eficaz de un fármaco de quimioterapia pase la BBB para proporcionar una línea de ataque adicional contra el tumor). En algunas situaciones, puede ser posible usar una sola frecuencia de un campo eléctrico alterno para tratar el tumor y aumentar la permeabilidad de la BHE. En otras situaciones, puede ser deseable utilizar campos eléctricos alternos con diferentes frecuencias: una primera frecuencia que se selecciona para proporcionar mejores resultados para aumentar la permeabilidad de la BBB, y una segunda frecuencia que se selecciona para proporcionar mejores resultados para la acción anti-tumoral de los TTFields.

[0048] La FIG. 10 es un diagrama de bloques de un aparato que genera una primera frecuencia para inducir la permeabilidad de BBB y una segunda frecuencia para inducir citotoxicidad. El aparato incluye un generador de voltaje CA 44 que es similar a la unidad generadora de campo Optune® convencional, pero tiene la capacidad de operar a dos frecuencias diferentes. La primera frecuencia está entre 50 y 190 kHz y la segunda frecuencia está entre 50 y 500 kHz. En algunas formas de realización, la primera frecuencia está entre 75 kHz y 125 kHz y la segunda frecuencia está entre 150 kHz y 250 kHz.

[0049] La capacidad de operar a dos frecuencias diferentes se puede implementar, por ejemplo, usando relés para cambiar un primer conjunto de componentes o un segundo conjunto de componentes en el circuito convencional que genera el voltaje de CA, y ajustando la frecuencia de operación de un oscilador El generador de tensión CA 44 está configurado para emitir la primera frecuencia o la segunda frecuencia dependiendo del estado de una entrada de control. Cuando la entrada de control está en un primer estado, el generador de tensión CA 44 emite la primera frecuencia, y cuando la entrada de control está en a. segundo estado, el generador de tensión CA 44 emite la segunda frecuencia. Un controlador 42 está programado para colocar la entrada de control en el segundo estado de modo que el generador 44 de tensión CA emita la segunda frecuencia. El controlador 42 también está programado para aceptar una solicitud para cambiar a la primera frecuencia. En la realización representada en la FIG. 10, la solicitud llega a través de una interfaz de usuario 40 que puede implementarse utilizando cualquiera de una variedad de enfoques convencionales que incluyen, entre otros, un botón pulsador, una pantalla táctil, etc. En formas de realización alternativas, la solicitud puede llegar a través de RF (por ejemplo, Bluetooth, WiFi, etc.) desde una tableta, teléfono inteligente, etc.

[0050] Al recibir la solicitud, el controlador 42 colocará la entrada de control en el primer estado para que el generador de voltaje de CA 44 emita la primera frecuencia durante un intervalo de tiempo (por ejemplo, 72 horas). Después de que haya transcurrido el intervalo de tiempo, el controlador 42 colocará la entrada de control en el segundo estado para que el generador de voltaje de CA 44 vuelva a emitir la segunda frecuencia.

[0051] Opcionalmente, el generador de voltaje CA 44 puede configurarse para emitir una o más frecuencias adicionales (por ejemplo, una tercera frecuencia, una cuarta frecuencia, etc.), dependiendo del estado de la entrada de control. Preferiblemente, cada una de estas frecuencias adicionales se selecciona para inducir citotoxicidad. En estas realizaciones, el controlador 42 está programado para hacer circular la entrada de control a través de los estados que hacen que el generador de voltaje CA 44 emita la segunda frecuencia y una o más frecuencias adicionales antes de que llegue la solicitud. El controlador 42 también está programado para aceptar una solicitud para cambiar a la primera frecuencia. Al recibir la solicitud, el controlador 42 colocará la entrada de control en el primer estado para que el generador de voltaje CA 44 emita la primera frecuencia durante un intervalo de tiempo (por ejemplo, 72 horas). Después de que haya transcurrido el intervalo de tiempo, el controlador 42 volverá a alternar la entrada de control a través de los estados que hacen que el generador de voltaje CA 44 emita la segunda frecuencia y una o más frecuencias adicionales.

[0052] El sistema representado en la FIG. 10 es particularmente útil cuando una persona tiene un tumor que está siendo tratado con una terapia combinada que incluye TTFields y quimioterapia. En esta situación, el sistema opera la mayor parte del tiempo en la segunda frecuencia para proporcionar el máximo efecto de citotoxicidad. Pero antes de que una persona visite una clínica de quimioterapia para recibir una dosis de quimioterapia, el personal sanitario (o el usuario) activa la interfaz de usuario 40 para cambiar el sistema a la primera frecuencia que promueve la permeabilidad de BBB. En esta situación, la activación de la interfaz de usuario podría realizarse, por ejemplo, 72 horas antes del comienzo previsto de la quimioterapia.

[0053] Alternativamente, al recibir la solicitud (p. ej., desde la interfaz de usuario 40), el controlador 42 puede controlar la entrada de control para que el generador de voltaje CA 44 emita la primera frecuencia durante un intervalo de tiempo (p. ej., 1 hora), luego alternar entre la segunda frecuencia y la primera frecuencia (por ejemplo, cambiar cada hora). Eventualmente (por ejemplo, cuando la sustancia relevante ha sido agotada del torrente sanguíneo del paciente), el controlador 42 controla la entrada de control para que el generador de voltaje CA 44 vuelva a emitir la segunda frecuencia.

[0054] Un conjunto de electrodos (no mostrados) que son similares a los electrodos convencionales usados con Optune® están conectados a la salida del generador de voltaje de CA 44.

[0055] Tenga en cuenta que en relación con cualquiera de los métodos descritos anteriormente, el BBB debe recuperar su estado original de baja permeabilidad después de que haya transcurrido una cantidad de tiempo suficiente después de la terminación del campo eléctrico alterno. Esto puede ser importante en muchos contextos para la seguridad del sujeto.

[0056] Aunque la presente invención se ha descrito con referencia a determinadas realizaciones, son posibles numerosas modificaciones, alteraciones y cambios en las formas de realización descritas sin apartarse del alcance de la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un aparato para tratar un tumor en el cuerpo de un sujeto y facilitar la administración de una sustancia a través de una barrera hematoencefálica del cuerpo del sujeto, comprendiendo el aparato:

un generador de voltaje CA (44) que tiene una entrada de control y está configurado para generar una salida campo eléctrico alterno a una primera frecuencia cuando la entrada de control está en un primer estado y una segunda frecuencia cuando la entrada de control está en un segundo estado; y

un controlador (42) programado para colocar la entrada de control en el segundo estado para que el generador de voltaje CA (44) genere el campo eléctrico alterno a la segunda frecuencia, acepte una solicitud para cambiar el generador de voltaje CA (44) para generar el campo eléctrico alterno en la primera frecuencia, al recibir la solicitud, coloque la entrada de control en el primer estado para que el generador de voltaje de CA (44) emita el campo eléctrico alterno en la primera frecuencia durante un intervalo de tiempo y, después de la transcurrido el intervalo de tiempo, coloque la entrada de control en el segundo estado para que el generador de voltaje de CA (44) emita el campo alterno en la segunda frecuencia;

caracterizado porque la primera frecuencia está entre 75 kHz y 125 kHz y la segunda frecuencia está entre 150 kHz y 250 kHz.

2. El aparato de la reivindicación 1, que comprende además:

un conjunto de electrodos configurados para fijarse al cuerpo del sujeto; y

cableado que conecta una salida del generador de tensión CA (44) al conjunto de electrodos.

3. El aparato de la reivindicación 1, en el que la segunda frecuencia está entre 190 kHz y 210 kHz.

4. El aparato de la reivindicación 1, en el que el campo eléctrico alterno tiene una intensidad de campo de al menos 1 V/cm en al menos una parte del cerebro del sujeto.

5. El aparato de la reivindicación 1, en el que el intervalo de tiempo es de al menos 24 horas, opcionalmente de al menos 48 horas, opcionalmente de al menos 72 horas.

6. El aparato de la reivindicación 1, en el que el intervalo de tiempo comprende un solo intervalo de tiempo ininterrumpido que tiene una duración de al menos una semana.

7. El aparato de la reivindicación 1, en el que el controlador (42) se programa además, después de recibir la solicitud, para conmutar la entrada de control entre el primer y el segundo estado.

8. El aparato de la reivindicación 1, en el que el generador de voltaje de CA (44) está configurado además para emitir el campo eléctrico alterno en al menos una frecuencia adicional entre 50 kHz y 500 kHz cuando la entrada de control está en al menos un estado adicional, y el controlador (42) está programado para hacer circular la entrada de control a través del segundo estado y al menos un estado adicional antes de recibir la solicitud, y hacer circular la entrada de control a través del segundo estado y al menos un estado adicional después del intervalo de ha transcurrido el tiempo.

9. El aparato de la reivindicación 1, que comprende además:

una interfaz de usuario (40), en el que la solicitud se acepta a través de la interfaz de usuario (40).

10. El aparato de la reivindicación 1, en el que la solicitud se acepta a través de RF.

11. El aparato de la reivindicación 1, en el que la sustancia tiene un peso molecular de al menos 4 kDa, opcionalmente al menos 69 kDa.

12. El aparato de la reivindicación 1, en el que la sustancia comprende un fármaco para tratar una enfermedad, opcionalmente el fármaco comprende un fármaco para el tratamiento del cáncer, un fármaco para el tratamiento de enfermedades infecciosas, un fármaco para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, un fármaco para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, un fármaco anti-epiléptico, un fármaco para la hidrocefalia, un fármaco para la intervención de accidentes cerebrovasculares o un fármaco psiquiátrico.

13. El aparato de la reivindicación 1, en el que la sustancia se usa para monitorear la actividad cerebral, opcionalmente la sustancia es un tinte cerebral, un indicador o un marcador.