ES2913268T3

ES2913268T3 - Método para fabricar una emulsión estable para la administración de péptidos

Info

Publication number: ES2913268T3
Application number: ES18710760T
Authority: ES
Inventors: Jean-Pascal Conduzorgues
Original assignee: OSE Immunotherapeutics SA
Current assignee: OSE Immunotherapeutics SA
Priority date: 2017-01-25
Filing date: 2018-01-24
Publication date: 2022-06-01
Anticipated expiration: 2038-01-24
Also published as: AU2018213890B2; CN114917189A; TW201840331A; US20220259277A1; EP4649954A3; JP2020505464A; CA3047492C; PT4029494T; US11981713B2; MX2019008878A; SMT202200189T1; CY1125239T1; SI3573600T1; AR113209A1; ZA201905487B; ES3056813T3; EP4029494A1; TWI793099B; IL267237B2; CN110191703B

Abstract

Un método para fabricar una emulsión peptídica lista para usar a escala industrial, que comprende la etapa de emulsionar una suspensión de al menos dos péptidos en condiciones de bajo cizallamiento, a una velocidad de rotación de entre 100 y 1000 rpm, durante 2 a 20 minutos, con al menos un adyuvante, en donde el método no comprende ninguna etapa de mezcla a alta velocidad, particularmente por encima de 7000 rpm.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para fabricar una emulsión estable para la administración de péptidos

La presente invención se refiere a un método para fabricar una emulsión peptídica lista para usar a escala industrial y a una emulsión lista para usar que se puede obtener según este método. Esta invención permite la administración de una emulsión peptídica que se puede aumentar de escala, que conserva su integridad y cumple con los requisitos necesarios para un producto farmacéutico estéril.

Antecedentes de la invención

Se están siguiendo nuevos enfoques para el tratamiento del cáncer, que implican el desarrollo de vacunas mejoradas contra el cáncer que comprenden una combinación de péptidos.

Sin embargo, la presencia de péptidos insolubles, el riesgo de agregación peptídica y la posible disminución resultante de la inmunogenicidad, son obstáculos recurrentes en el desarrollo de fármacos proteicos o de fármacos peptídicos. Este riesgo de agregación o desamidación aumenta entre los péptidos cuando se mezclan en la misma formulación.

Aproximadamente el 95% de todos los candidatos a fármacos peptídicos se descartan durante los ensayos preclínicos o clínicos, a menudo debido a problemas relacionados con la baja solubilidad o problemas de agregación. La agregación es también uno de los obstáculos más importantes para el desarrollo de fármacos basados en proteínas ya que no solo puede comprometer su biodisponibilidad y su efecto terapéutico, sino que también aumenta el riesgo de reacciones adversas (Interpretation of the dissolution of insoluble peptide sequences based on the acid-base properties of the solvent. L Malavolta y cois. 2006, Protein Sci. Jun. 2006; 15(6): 1476-1488).

Los péptidos de menos de cinco residuos suelen ser solubles en agua o tampón acuoso, excepto cuando la secuencia completa consiste en aminoácidos hidrofóbicos (p. ej., A, F, I, L, M, P, V, W, Y, ácido alfa-aminobutírico, b-amino alanina, norleucina). Los péptidos que contienen un 50% y más de residuos hidrofóbicos pueden ser insolubles o solo parcialmente solubles en soluciones acuosas. Los péptidos que contienen una alta proporción (> 75%) de D, E, H, K, N, Q, R, S, T, Y son capaces de formar enlaces de hidrógeno intermoleculares (es decir, entrecruzamiento), formando así geles en soluciones acuosas.

Los agregados de péptidos se clasifican como solubles o insolubles, así como covalentes (que implican la formación de un enlace covalente, a menudo un enlace disulfuro) o con enlaces de hidrógeno (interacciones más débiles). La auto asociación de proteínas terapéuticas a través de enlaces covalentes suele ser irreversible, mientras que los agregados formados a través de interacciones más débiles pueden ser reversibles ante cambios en la concentración de proteína, la temperatura y el pH. Como consecuencia, los agregados pueden variar en tamaño desde partículas diminutas, invisibles y no filtrables hasta grandes precipitados que son visibles a simple vista. Además, algunos agregados pueden ser estáticos mientras que otros pueden ser dinámicos.

Ciertas fases de fabricación influyen en el riesgo de degradación química, lo que aumenta el riesgo de degradación física y la formación de agregados. Por ejemplo, concentraciones más altas de una formulación de proteína o péptidos pueden aumentar la probabilidad de agregación, así como cambios en el pH de la solución, temperatura y elección del tampón. Además, la etapa de emulsión realizada en la fabricación de vacunas también puede provocar la degradación y agregación de péptidos. Las formulaciones de vacunas con adyuvantes que permiten la formación de emulsiones de agua en aceite (W/O) inducen una respuesta inmune a través de la formación de un depósito en el sitio de la inyección y, de hecho, son altamente recomendables. Sin embargo, el proceso de homogeneización y emulsión es un problema cuando una combinación de péptidos incluye péptidos solubles e insolubles. La estabilidad de dichos péptidos en la emulsión es fundamental para la seguridad y la inmunogenicidad, ya que la emulsión es un elemento clave para la administración local de péptidos y la presentación inmune. Los péptidos en estados soluble o insoluble son sensibles a la temperatura y a la agitación, son sensibles a la oxidación, la mezcla de péptidos insolubles y solubles puede presentar problemas de reactividad cruzada durante el almacenamiento, y las fuerzas mecánicas usadas para mezclar dicha combinación pueden alterar los péptidos.

En vista de estas deficiencias, las formulaciones de vacunas que comprenden combinaciones de péptidos se preparan más bien de forma extemporánea.

Por ejemplo, se realizó un estudio reciente con los péptidos combinados URLC19-177, CDCA1-56, TTK-567, VEGFR1-770 y VEGFR2-169; se esperaba que los cinco péptidos se unieran a una molécula de HLA-A24. Todos los péptidos combinados se disolvieron en DMSo a la concentración de 20 mg/ml y se almacenaron a -80 °C. Se inyectaron de cabecera después de mezclarlos con un adyuvante (adyuvante incompleto de Freund IFA o Montanide® ISA 51) (Suzuki H. y cols. 2013 "Multiple therapeutic peptide vaccines consisting of combined novel cancer testis antigens and anti-angiogenic peptides for patients with non-small cell lung cancel1'. Journal of Translational Medicine 2013). Se usaron péptidos combinados similares con el mismo proceso (TTK-567, URLC10-177, KOC1-508, VEGFR1-1084, VEGFR2-169 que se unen a la molécula de HLA-A*24 (linuma H. y cols. "Phase 1 clinical study of multiple epitope peptide vaccine combined with chemoradiation therapy in esophageal cancer patients" - Journal of Translational Medicine 2014). También se usaron en combinación cinco péptidos restringidos a1HLA-A*2402 derivados de RNF43, TOMM34, KOC1, VEGFR1 y VEGFR2 [RNF43-721, TOMM34-299, KOC1(IMP-3)-508, VEGFR1-1084 y VEGFR2-169] (Hazama S y cois. "A phase I study of combination vaccine treatment of five therapeutic epitope-peptides for metastatic colorectal cancer; safety, immunological response, and clinical outcome" Journal of Translational Medicine 2014).

Todas las combinaciones de péptidos presentadas anteriormente en la bibliografía reciente se solubilizan primero y luego se mezclan con un adyuvante justo antes de la inyección a los pacientes. Este proceso evitó la preparación de una emulsión en la que se habría requerido una estabilidad a largo plazo de los péptidos en el adyuvante.

Por el contrario, un ejemplo de una vacuna lista para usar que comprende una mezcla de péptidos se describe en el documento WO 2004/094454. En este documento, la combinación de péptidos se administra por vía subcutánea en forma de emulsión inversa. Con el fin de preparar dicha emulsión, los diferentes péptidos solubles e insolubles se solubilizan en diferentes medios, para proporcionar tres soluciones separadas que luego se enfrían, se someten a filtración estéril y se mezclan entre sí para obtener una suspensión, cuyo pH luego se ajusta a 7. Esta suspensión se mezcla con un emulsionante de agua en aceite (W/O) que comprende monooleato de manida obtenido a partir de manitol y ácido oleico purificado de origen sintético o vegetal. Este emulsionante permite obtener una emulsión de agua en aceite que contiene finas gotas de agua en las que se encuentran dispersos los péptidos. Esta estructura de emulsión, a su vez, proporciona una inmunidad intensa y duradera.

La emulsión de péptidos requiere un mezclador potente. La homogeneización usa fuerzas mecánicas para mezclar el aceite procedente del adyuvante y las gotas de agua procedentes de las soluciones peptídicas. Las fuerzas mecánicas y de alto cizallamiento son importantes para crear gotas finamente dispersas. Esta emulsión a menudo resulta problemática, dado que la química de los péptidos imparte resistencia al proceso de mezcla. El alto cizallamiento logrado por un homogeneizador de alta presión es capaz de superar esa resistencia. Los proveedores de adyuvantes recomiendan, por lo tanto, la emulsión de péptidos con alto cizallamiento. Por ejemplo, en el folleto de abril de 2007 que describe el adyuvante vendido como Montanide® ISA 50 V2, SEPPIC sugiere mezclar este adyuvante con un medio acuoso antigénico usando un mezclador de alto cizallamiento como Silverson® L4RT a 4000 rpm para la obtención de una vacuna estable y eficaz.

En línea con lo anterior, en el documento WO 2004/094454, la mezcla de la suspensión peptídica con el adyuvante se realizó usando un homogeneizador Silverson® L4RT girando a 8.000 rpm durante 30 minutos. Este aparato comprende un cabezal de trabajo mezclador que tiene un rotor provisto de paletas que están dispuestas radialmente alrededor de un eje y que dirigen el fluido aspirado por el rotor radialmente a un estator dispuesto concéntricamente desde y a una corta distancia del rotor. El estator comprende orificios provistos en una rejilla. Tal sistema rotor-estator proporciona la emulsión formada en el documento WO 2004/094454 con un alto cizallamiento ya que se muele entre los extremos de las palas del rotor y la pared interna del estator y se expulsa a alta velocidad a través de las perforaciones en el estator, hacia los lados del cabezal de trabajo de mezcla.

Sin embargo, los presentes inventores han demostrado que el aumento de escala de este proceso no dio como resultado una emulsión que proporcionara estabilidad a largo plazo de los péptidos. Concretamente, cuando se aumentó de escala el proceso mencionado, llamó la atención del solicitante que la dosificación de péptidos contenidos en el mismo mediante HPLC de fase inversa daba lugar a diferentes valores dependiendo de los lotes que se probaron. Esto ya se observó en el documento WO 2004/094454 donde se afirma que se observaron errores de hasta un 30% en la concentración del péptido. Esta variabilidad era aceptable para un producto farmacéutico final, ya que se propuso la especificación del 50% de la concentración prevista como criterio de liberación y estabilidad. Aunque esta variabilidad se mantuvo dentro de un intervalo aceptable para los primeros estudios clínicos, sería necesario reducirla tanto como fuera posible para los ensayos clínicos iniciales, con el fin de cumplir con los estrictos requisitos de alguna legislación farmacéutica y, lo que es más importante, para garantizar la administración de péptidos en un estado emulsionado estable y para garantizar la inmunogenicidad de cada péptido. Los inventores han llevado a cabo una extensa investigación para superar este problema.

En este contexto, los presentes inventores han demostrado que la velocidad y la duración de la agitación que se requieren para obtener una emulsión valiosa de péptidos con adyuvante en vacunas contra el cáncer pueden alterar la integridad de los péptidos y reducir su eficacia, en particular cuando la combinación se realiza con péptidos solubles e insolubles.

Se encontró que el método de emulsión con alto cizallamiento y alta velocidad daba lugar a la degradación y/o agregación de péptidos cuando se usaba a gran escala. Además, el mezclador de alto cizallamiento usado en la técnica anterior generaba calor y, por lo tanto, requería un enfriamiento constante del mezclador para evitar una posible degradación de los péptidos sensibles al calor. Al aumentar de escala este proceso, parecía ser un reto el control preciso de esta etapa de enfriamiento con el fin de evitar la oxidación de péptidos, lo que podría afectar negativamente a su eficacia dependiendo de la posición de los aminoácidos oxidados en relación con los dominios funcionales o similares a epítopos del péptido. La oxidación también puede alterar las características fisicoquímicas de los péptidos y dar lugar a agregación. Este fenómeno podría, a su vez, comprometer la seguridad y la administración necesarias para el efecto terapéutico de los fármacos que contienen estos péptidos y también aumentar el riesgo de reacciones inmunogénicas.

Por lo tanto, los inventores buscaron medios para superar los problemas anteriores y así proporcionar un proceso que se pueda realizar fácilmente a escala industrial para preparar una emulsión peptídica inyectable en la que se conserve la integridad química de los péptidos, en particular se prevenga o reduzca la degradación peptídica (como la oxidación y/o desamidación) y la agregación, sin afectar negativamente a la estabilidad física de la emulsión, de manera que cada péptido se administre en condiciones estables. Además, se necesita un proceso reproducible.

Compendio

El alcance de la presente invención está definido por las reivindicaciones y se proporciona únicamente a título informativo cualquier información que no entre dentro de las reivindicaciones.

El solicitante ha descubierto sorprendentemente que los requisitos anteriores se podrían cumplir mediante un proceso en el que se prepare la emulsión peptídica en condiciones más suaves que las condiciones de emulsión usadas hasta ahora. Específicamente, contrariamente a lo que se recomendó en la técnica, se evitan la alta velocidad y el alto cizallamiento y, más sorprendentemente, incluso a baja velocidad no es necesaria una larga duración de mezcla. Así se protegen péptidos de diferentes solubilidades del estrés oxidativo sin necesidad de enfriar la emulsión durante la mezcla y se previene su agregación. La variabilidad de la concentración peptídica se reduce drásticamente en comparación con la técnica anterior, como en el documento WO 2004/094454. Este proceso permite así obtener una emulsión estable para la administración óptima de péptidos que se requiere para una inmunogenicidad estable debido al efecto de depósito necesario para la presentación inmune de péptidos. Este proceso es aún más reproducible que los procesos anteriores para la preparación extemporánea de emulsiones de péptidos, ya que estas últimas son dependientes del operador. Permite la fabricación de un gran volumen de emulsión y, por tanto, es aplicable a escala industrial.

Por lo tanto, esta descripción está dirigida a un método para fabricar una emulsión peptídica lista para usar a escala industrial, que comprende la etapa de emulsionar una suspensión de al menos dos péptidos en condiciones de bajo cizallamiento, a una velocidad de rotación de entre 100 y 1000 rpm, durante de 2 a 15 minutos, con al menos un adyuvante.

Preferiblemente, los péptidos comprenden al menos un péptido soluble y al menos un péptido no soluble. En particular, los péptidos se seleccionan del grupo que consiste en: un péptido KVFGSLAFV (SEQ ID NO: 7), un péptido YLSGADLNL (SEQ ID NO: 8), un péptido KLBPVQLWV con B que indica ácido a-aminoisobutírico (s Eq ID n O: 6), un péptido SMPPPGTRV (SEQ ID NO: 5), un péptido IMIGHLVGV (SEQ ID NO: 9), un péptido LLTFWNPPV (SEQ ID NO: 4), un péptido RLLQETELV (SEQ ID NO: 2), un péptido aKXVAAWTLKAAa con X y a que indican respectivamente ciclohexilalanina y d-alanina (SEQ ID NO: 1), un péptido YLQLVFGIEV (SEQ ID NO: 3) y un péptido KVAEIVHFL (SEQ ID NO: 10). En un aspecto específico, la suspensión comprende una combinación de un péptido KVFGSLAFV (SEQ ID NO: 7), un péptido YLSGADLNL (SEQ ID NO: 8), un péptido KLBPVQLWV (SEQ ID NO: 6), un péptido SMPPPGTRV (SEQ ID NO: 5), un péptido IMIGHLVGV (SEQ ID NO: 9), un péptido LLTFWNPPV (SEQ ID NO: 4), un péptido RLLQETELV (SEQ ID NO: 2), un péptido aKXVAAWTLKAAa con X y a que indican respectivamente ciclohexilalanina y d -alanina (SEQ ID NO: 1), un péptido YLQLVFGIEV (SEQ ID NO: 3) y un péptido KVAEIVHFL (SEQ ID NO: 10).

Preferiblemente, el adyuvante consiste en una mezcla de un aceite de hidrocarburo con un emulsionante de agua en aceite. En particular, el aceite de hidrocarburo se selecciona de aceite de parafina, un aceite vegetal, escualeno, escualano o un aceite mineral, y el emulsionante de agua en aceite se selecciona de monooleato de manida y monooleato de sorbitán. En un aspecto específico, el aceite de hidrocarburo es un aceite mineral y el emulsionante de agua en aceite se selecciona de monooleato de manida.

Preferiblemente, la relación en peso del adyuvante a la suspensión peptídica varía de 10:1 a 1:10, preferiblemente de 5:1 a 1:5 y más preferiblemente de 2:1 a 1:2 y sigue siendo preferible de 1:1.

Preferiblemente, toda o parte de la etapa de mezcla se realiza bajo atmósfera inerte, preferiblemente bajo nitrógeno.

Preferiblemente, el volumen de la emulsión es superior a 5 l, preferiblemente superior o igual a 10 l. En un aspecto particular, la suspensión peptídica se prepara mediante un método que comprende:

a) preparar al menos tres soluciones diferentes A, B y C, en donde:

• la solución A es un medio acuoso ácido y que comprende un péptido aKXVAAWTLKAAa (SEQ ID NO: 1) con X y a que indican respectivamente ciclohexilalanina y d-alanina (SEQ ID NO: 1),

• la solución B es un medio acuoso básico con un pH de entre 12,5 y 12,9 antes de añadirle cualquier péptido y la solución B que comprende un péptido YLSGADLNL (SEQ ID NO: 8),

• la solución C es DMSO y que comprende un péptido KVFGSLAFV (SEQ ID NO: 7), y

• las soluciones A y/o B comprenden además al menos tres péptidos adicionales seleccionados de:

KLBPVQLWV con B que indica ácido a-aminoisobutírico (SEQ ID NO: 6), SMPPPGTRV (SEQ ID NO: 5), IMIGHLVGV (SEQ ID NO: 9), LLTFWNPPV (SEQ ID NO: 4), KVAEIVHFL (SEQ ID NO: 10), RLLQETELV (SEQ ID NO: 2) y YLQLVFGIEV (SEQ ID NO: 3);

b) mezclar dichas soluciones para formar una suspensión, y

c) ajustar el pH de dicha suspensión a aproximadamente 7.

En un aspecto, la solución A comprende aKXVAAWTLKAAa (SEQ ID NO: 1), SMPPPGTRV (SEQ ID NO: 5), IMIGHLVGV (SEQ ID NO: 9) y KVAEIVHFL (SEQ ID NO: 10) y la solución B comprende YLSGADLNL (SEQ ID NO: 8), KLBPVQLWV (SEQ ID NO: 6), LLTFWNPPV (SEQ ID NO: 4), RLLQETELV (SEQ ID NO: 2) y YLQLVFGIEV (SEQ ID NO: 3).

La presente descripción también se refiere a una emulsión lista para usar que se puede obtener u obtenida por el método según la presente descripción, especialmente para uso en el tratamiento de cánceres, preferiblemente de cánceres HLA-2 positivos. En particular, la cantidad de cada péptido en la emulsión oscila entre 0,1 y 10 mg/ml, preferiblemente entre 0,5 y 1 mg/ml y no difiere en más del 10% de la cantidad que se usó en la preparación de la emulsión. En un aspecto, el D50 de la emulsión es de 10 ± 1 pm.

Descripción detallada

Esta descripción se refiere a un método para fabricar, a escala industrial, una emulsión lista para usar a partir de una suspensión peptídica que comprende al menos dos péptidos. Estos péptidos normalmente no tienen la misma solubilidad y se prefiere usar una combinación de al menos un péptido soluble y al menos uno no soluble.

La expresión "péptido no soluble" se refiere a un péptido que es soluble en una cantidad inferior al 60% p/v en agua a un pH de 7,0 ± 1,0, mientras que un "péptido soluble" se refiere a un péptido que es soluble en una cantidad de al menos un 60% p/v en agua a un pH de 7,0 ± 1,0. La solubilidad se puede evaluar pasando una solución acuosa del péptido, a una concentración de 1 mg/ml, a través de un filtro de 0,45 pm y midiendo la cantidad de péptido que queda en el filtro.

Por "escala industrial", se entiende que se prepara un volumen de la emulsión superior a 5 l, preferiblemente superior o igual a 10 l. En un aspecto, el volumen puede ser de 50 l, 100 l, 200 l, 500 l o 1000 l.

Péptidos

Según un aspecto preferido de la presente descripción, los péptidos se pueden seleccionar de epítopos de antígenos asociados a tumores (TAA) y/o análogos de estos, preferiblemente epítopos de TAA que se unen a HLA-A2.

Los epítopos de TAA se pueden derivar de una o varias dianas, en particular seleccionados del grupo que consiste en CEA (antígeno carcinoembrionario), p53, HER-2/neu, MAGE (antígeno de melanoma), en particular MAGE-2 y MAGE-3, LY6K (Complejo del Antígeno Linfocitario 6, Locus K), CDCA1 (asociado al ciclo de división celular 1) (por ejemplo, véase EP2186889), IMP3 (proteína 3 de unión al ARNm del factor de crecimiento similar a la insulina II) (por ejemplo, véase el documento WO11067920), KIF20A (proteína similar a la quinesina) (por ejemplo, véase el documento WO10047062), FOXM1 (proteína de caja de cabeza de horquilla M1) (por ejemplo, véase el documento EP2186889), CDC45L (homólogo de la proteína 45 de control de la división celular), GPC3 (glipicano-3) (por ejemplo, véase el documento WO2015/173112), CDH3 (cadherina 3), SPARC (proteína secretada ácida y rica en cisteína), DEPDC1 (dominio que contiene DEP 1), MPHOSPH1 (FOSFOPROTEÍNA 1 DE FASE M) (por ejemplo, véase el documento WO2013024582), ME-1 (Enzima Málica 1), ENDC3B, PRDX5 (Peroxirredoxina-5), g As 7 (Proteína específica de detención del crecimiento 7), HA-1 (miHAg) (Antígeno menor de histocompatibilidad HA-1), GAPDH (Gliceraldehído 3- fosfato deshidrogenasa), HSP70 (proteínas de choque térmico de 70 kD), ACTININA, HAUS3 (subunidad 3 del complejo similar a augmina HAUS), CSNK1A1 (caseína quinasa I isoforma alfa), CLPP (subunidad proteolítica de proteasa Clp dependiente de ATP) y CDK4 (quinasa 4 dependiente de ciclina). En un aspecto preferido, los péptidos se seleccionan y se dirigen a CEA, p53, HER-2/neu, MAGE-2 y MAGE-3.

Por ejemplo, los péptidos incluyen péptidos seleccionados de los péptidos descritos en los documentos WO 2004/094454, WO2014141683, WO2015173112, WO2015160928, WO2015/155537, WO2014162962, WO2014141652, WO2014136453, WO2014136453, WO2014127276, WO2014047085, WO2014041784, WO2013024582, WO2012073459, WO2013061594, WO2012169200, WO2011111392, WO2012053200, WO2012053206, WO2010137295, WO08047473, WO08102557, WO09109855, EP2186889, EP2186889, WO2010047062, WO2011067920 y similares.

Según un aspecto específico de la presente descripción, los péptidos se seleccionan del grupo que consiste en: un péptido KVFGSLAFV (SEQ ID NO: 7), un péptido YLSGADLNL (SEQ ID NO: 8), un péptido KLBPVQLWV con B que indica ácido a-aminoisobutírico (SEQ ID NO: 6), un péptido SMPPPGTRV (SEQ ID NO: 5), un péptido IMIGHLVGV (SEQ ID NO: 9), un péptido LLTFWNPPV (SEQ ID NO: 4), un péptido RLLQETELV (SEQ ID NO: 2), un péptido aKXVAAWTLKAAa con X y a que indican respectivamente ciclohexilalanina y d-alanina (SEQ ID NO: 1), un péptido YLQLVFGIEV (SEQ ID NO: 3), un péptido KVAEIVHFL (SEQ ID NO: 10). Al menos dos de estos péptidos se pueden usar en este proceso, preferiblemente al menos tres, como aKXVAAWTLKAAa (SEQ ID NO: 1), YLSGADLNL (SEQ ID NO: 8) y KVFGSLAFV (SEQ ID NO: 7), y aun así preferiblemente una combinación de todos los diez péptidos anteriores. En un aspecto particular, los péptidos comprenden además uno o varios péptidos adicionales.

En un aspecto particular, los péptidos pueden comprender un péptido seleccionado del grupo que consiste en FLDEFMEGV (SEQ ID NO: 11), VVMSWAPPV (SEQ ID NO: 12), LLLDDLLVSI (SEQ ID NO: 13), SLADEAEVYL (SEQ ID NO: 14), VLHDDLLEA (SEQ ID NO: 15), GIVEGLITTV (SEQ ID NO: 16), SLFEGIDIYT (SEQ ID NO: 17), FIASNGVKLV (SEQ ID NO: 18), ILNAMIAKI (SEQ ID NO: 19), GLFGDIYLAI (SEQ ID NO: 20), ILDKVLVHL (SEQ ID NO: 21) y ACDPHSGHFV (SEQ ID NO: 22).

La nomenclatura usada para describir los péptidos en esta solicitud sigue la práctica convencional en donde el grupo amino se presenta a la izquierda (el extremo amino o N-terminal) y el grupo carboxilo a la derecha (el extremo carboxilo o C-terminal) de cada residuo de aminoácido. Los grupos amino y carboxilo terminales, aunque no se muestran específicamente, están en la forma que adoptarían a valores de pH fisiológicos, a menos que se especifique lo contrario. En las fórmulas de estructura de aminoácidos, cada residuo se representa generalmente mediante designaciones estándar de tres letras o de una sola letra. La forma L de un residuo de aminoácido se representa con una sola letra mayúscula o la primera letra mayúscula de un símbolo de tres letras, y la forma D para aquellos residuos de aminoácidos que tienen formas D se representa con una sola letra minúscula o un símbolo de tres letras en minúsculas. Por ejemplo, el símbolo "a" se refiere a una D-alanina. Las secuencias de aminoácidos de los péptidos que se exponen en la presente memoria se designan generalmente usando el símbolo estándar de una sola letra. (A, Alanina; C, Cisteína; D, Ácido Aspártico; E, Ácido Glutámico; F, Fenilalanina; G, Glicina; H, Histidina; I, Isoleucina; K, Lisina; L, Leucina; M, Metionina; N, Asparagina; P, Prolina; Q, Glutamina; R, Arginina; S, Serina; T, Treonina; V, Valina; W, T riptófano e Y, Tirosina). Además de estos símbolos, "B" en las abreviaturas de una sola letra usadas en la presente memoria designa ácido a-aminobutírico y "X" indica ciclohexilalanina.

Suspensión

La suspensión de péptidos usada en la presente descripción se puede preparar según un proceso que comprende preparar al menos dos soluciones diferentes que contienen al menos dos péptidos diferentes, respectivamente. Según un aspecto de la presente descripción, se preparan tres soluciones diferentes A, B y C, cada una de las cuales contiene al menos un péptido específico. En particular, la solución A es un medio acuoso ácido, la solución B es un medio acuoso básico y la solución C es un medio orgánico, especialmente DMSO (dimetilsulfóxido). En un aspecto preferido, las soluciones A, B y C comprenden al menos aKXVAAWTLKAAa (SEQ ID NO: 1), YLSGADLNL (SEQ ID NO: 8) y KVFGSLAFV (SEQ ID NO: 7), respectivamente.

Preferiblemente todavía, las soluciones A y/o B comprenden además al menos tres péptidos adicionales, preferiblemente al menos cinco péptidos adicionales, entre la lista anterior de péptidos. Más preferiblemente, las soluciones A y/o B comprenden todos estos siete péptidos adicionales. Cada uno de estos péptidos adicionales estará comprendido dentro de la Solución A o de la Solución B dependiendo de su solubilidad y de su afinidad con aKXVAAWTLKAAa (SEQ ID NO: 1) o YLSGADLNL (SEQ ID NO: 8).

Por consiguiente, en un aspecto, la presente descripción se refiere a un método para fabricar una suspensión peptídica, que comprende:

a) preparar al menos tres soluciones diferentes A, B y C, en donde:

• la solución A comprende un péptido aKXVAAWTLKAAa con X y a que indican respectivamente ciclohexilalanina y d-alanina (SEQ iD NO: 1),

• la solución B comprende un péptido YLSGADLNL (SEQ ID NO: 8),

• la solución C comprende un péptido KVFGSLAFV (SEQ ID NO: 7), y

b) mezclar dichas soluciones para formar una suspensión, y

c) ajustar el pH de dicha suspensión a aproximadamente 7,

y preferiblemente el pH de la solución B se ajusta entre 12,5 y 12,9 antes de añadirle cualquier péptido.

La solución A se prepara preferiblemente solubilizando los péptidos en un medio acuoso ácido, tal como una solución de ácido acético, preferiblemente a temperatura ambiente. La concentración de la solución de ácido acético puede oscilar entre 0,1 M y 0,3 M, por ejemplo. Por consiguiente, el medio acuoso ácido tiene un pH que está preferiblemente comprendido entre 2 y 4, más preferiblemente entre 2,5 y 3. Cada péptido de la solución A puede estar presente a una concentración de 0,3 mg/ml a 4 mg/ml, preferiblemente de 3 a 4 mg/ml. Preferiblemente, todos los péptidos están presentes en la solución A a la misma concentración. Preferiblemente, la solución A comprende aKXVAAWTLKAAa (SEQ ID NO: 1), y uno, dos o tres péptidos seleccionados del grupo que consiste en SMPPPGTRV (SEQ ID NO: 5), IMIGHLVGV (Se Q ID NO: 9) y Kv A e IVHFL (SEQ ID NO: 10). En un aspecto más preferido, la solución A comprende aKXVAAWTLKAAa (SEQ ID NO: 1), SMPPPGTRV (SEQ ID NO: 5), IMIGHLVGV (SEQ ID NO: 9) y KVAEIVHFL (SEQ ID NO: 10). En un aspecto particular, los péptidos de la solución A consisten en aKXVAAWTLKAAa (SEQ ID NO:1), SMPPPGTRV (SEQ ID NO:5), IMIGHLVGV (SEQ ID NO: 9) y KVAEIVHFL (SEQ ID NO: 10).

Además, la solución B se puede preparar solubilizando los péptidos en un medio acuoso básico, por ejemplo, una solución de hidróxido de sodio, normalmente a temperatura ambiente.

Al aumentar de escala el proceso anterior, llamó la atención del solicitante que uno de los péptidos contenidos en la solución básica (más específicamente, YLSGADLNL (SEQ ID NO: 8)) no era químicamente estable durante el tiempo suficiente para permitir la filtración estéril de esta solución a escala industrial.

El Solicitante ha encontrado sorprendentemente que un ligero ajuste en el pH de la solución básica a la que se debía añadir el péptido YLSGADLNL (SEQ ID NO: 8) permitía evitar su degradación. Por lo tanto, el método de la presente descripción es adecuado para preparar una suspensión con una larga estabilidad y una buena reproducibilidad.

De hecho, el pH de la solución B se ajusta entre 12,5 y 12,9 antes de añadirle cualquier péptido, preferiblemente a aproximadamente 12,7. Se puede obtener usando una solución de hidróxido de sodio 0,05 M. Preferiblemente, cada péptido en la solución B está en una cantidad total de 0,4 a 3 mg/ml. Más preferiblemente, cada péptido en la solución B puede estar presente a una concentración de 2 mg/ml a 3 mg/ml. Preferiblemente, todos los péptidos están presentes en la solución B a la misma concentración. Preferiblemente, la solución B comprende YLSGADLNL (SEQ ID NO: 8) y uno, dos, tres o cuatro péptidos seleccionados del grupo que consiste en KLBPVQLWV (SEQ ID NO: 6), LLTFWNPPV (SEQ ID NO: 4), RLLQETELV (SEQ ID NO: 2) y YLQLVFGIEV (SEQ ID NO: 3). En un aspecto más preferido, la solución B comprende YLSGADLNL (SEQ ID NO: 8), KLBPVQLWV (SEQ ID NO: 6), LLTFWNPPV (SEQ ID NO: 4), RLLQETELV (SEQ ID NO: 2) y YLQLVFGIEV (SEQ ID NO: 3). En un aspecto particular, los péptidos de la solución B consisten en YLSGADLNL (SEQ ID NO: 8), KLBPVQLWV (SEQ ID NO: 6), LLTFWNPPV (SEQ ID NO: 4), RLLQETELV (SEQ ID NO: 2) y YLQLVFGIEV (SEQ ID NO: 3).

Finalmente, la solución C se puede preparar solubilizando el péptido KVFGSLAFV (SEQ ID NO: 7) en DMSO, preferiblemente en una cantidad de 1 a 11 mg/ml, más preferiblemente en una cantidad de 10 a 11 mg/ml, a una temperatura que está preferiblemente entre 35 y 40 °C. Preferiblemente, el péptido en la solución C puede estar presente a una concentración de 5 mg/ml a 11 mg/ml. En un aspecto particular, los péptidos en solución C consisten en KVFGSLAFV (SEQ ID NO: 7).

Según un aspecto preferido de la presente descripción, la solución A comprende aKXVAAWTLKAAa (SEQ ID NO: 1), SMPPPGTRV (SEQ ID NO: 5), IMIGHLVGV (SEQ ID NO: 9) y KVAEIVHFL (SEQ ID NO: 10) y la solución B comprende YLSGADLNL (SEQ ID NO: 8), KLBPVQLWV (SEQ ID NO: 6), LLTFWNPPV (SEQ ID NO: 4), RLLQETELV (SEQ ID NO: 2) y YLQLVFGIEV (SEQ ID NO: 3).

Todos los péptidos anteriores son epítopos derivados de CEA, p53, HER-2/neu y MAGE-2/3, excepto PADRE, que es un epítopo universal pan-DR HTL usado como una fuente de células T cooperadoras. Sin embargo, la solución A, B o C puede comprender además péptidos antigénicos asociados a tumores adicionales.

Como se mencionó anteriormente, las soluciones A, B y C se combinan con el fin de obtener una suspensión. En un aspecto preferido, las soluciones A, B y C se combinan en una proporción que permite obtener la misma concentración en la suspensión para cada péptido. Preferiblemente, las soluciones A, B y C se combinan con el fin de obtener una suspensión en una relación de masas A:B:C de 2-4:3-4:1, más preferiblemente en una relación de masas de 2,9:3,6:1. Preferiblemente, la concentración de cada péptido en la suspensión está comprendida entre 0,2 y 2 mg/ml.

Según un aspecto preferido, las soluciones se enfrían a una temperatura entre 2 y 8 °C y se someten a filtración estéril antes de formar la suspensión.

Preferiblemente, la solución B se combina con las soluciones A y C menos de 8 horas después de su preparación, preferiblemente menos de 6 horas y más preferiblemente no más de 4 horas.

El pH de la suspensión así obtenida se puede ajustar a pH fisiológico, por lo tanto a un pH de aproximadamente 7, por cualquier medio adecuado. La concentración de péptido se puede ajustar además añadiendo un diluyente adecuado a la suspensión, como agua, una solución salina, una solución acuosa de dextrosa o una solución de glicerol.

En un aspecto particular, no hay etapa de filtración después de la etapa de mezclar las soluciones A, B y C y/o después de la etapa de ajustar el pH a aproximadamente 7.

En un aspecto preferido, las etapas del método de fabricación de una suspensión peptídica se llevan a cabo en condiciones de saturación de nitrógeno para evitar cualquier riesgo de oxidación que pudiera dañar los péptidos, especialmente el/los péptido(s) soluble(s), de la suspensión.

La presente descripción también se refiere a un recipiente estéril que comprende una suspensión preparada por el método según la presente descripción. Preferiblemente, el recipiente estéril es un vial de vidrio.

Emulsión lista para usar

Este proceso consiste entonces en mezclar la suspensión peptídica con un adyuvante para obtener una emulsión de agua en aceite, que se considera que ayuda a la presentación de los péptidos a las células dendríticas. En este tipo de emulsión, la fase acuosa que contiene los péptidos queda atrapada en forma de gotitas en la fase continua de aceite, lo que permite una liberación más lenta de antígenos desde un depósito y, por lo tanto, una inmunidad más intensa a largo plazo en comparación con las emulsiones de aceite en agua.

Se entiende por "adyuvante" en la presente especificación un compuesto o una mezcla de compuestos que es/son capaz/ces de aumentar la respuesta inmune generada por los péptidos y dirigir esta respuesta inmune, por ejemplo, hacia una respuesta de CTL (Linfocito T citotóxico). Pueden actuar directamente sobre el sistema inmune o indirectamente, al permitir la adecuada administración de los péptidos al sistema inmune. En la presente descripción, el adyuvante es preferiblemente un adyuvante oleoso, que comprende tanto un aceite de hidrocarburo como un emulsionante de agua en aceite. Tales adyuvantes actúan a través del llamado "efecto de depósito". El aceite de hidrocarburo puede ser aceite de parafina, un aceite vegetal, escualeno, escualano o aceite mineral, por ejemplo. Los emulsionantes W/O adecuados se pueden seleccionar de monooleato de manida y monooleato de sorbitán, por ejemplo. Ejemplos de adyuvantes oleosos apropiados son una mezcla de monooleato de manida al 5-20% con aceite mineral al 80-95% (Montanide® ISA 51 vendido por SEPPIC) o escualeno (Montanide® ISA 720 vendido por SEPPIC) y mezclas similares. En un aspecto específico, el adyuvante es una mezcla de aceite mineral y monooleato de manida, especialmente Montanide® ISA 51.

El adyuvante usado en la presente descripción puede alternativamente o, además de los adyuvantes oleosos anteriores, seleccionarse de micro- y nanopartículas, como liposomas y microesferas, de PLG, p La , PLGA u otros polímeros naturales como gelatina, colágeno y quitosano. Otros adyuvantes pueden comprender ligandos TLR, ligandos de receptores tipo Toll (TLR3 y TLR9), agonistas estimuladores de genes de IFN (STING), citoquinas como GM-CSF e IL2, carbohidratos, derivados bacterianos, sales minerales y complejos inmunoestimuladores (ISCOM).

La suspensión y el adyuvante se mezclan según la presente descripción, en condiciones de bajo cizallamiento, por medio de un dispositivo mezclador que gira a una velocidad de rotación de 100 a 1000 rpm. Por ejemplo, la velocidad de rotación puede estar comprendida dentro del intervalo de 100 a 500 rpm, preferiblemente de 150 a 250 rpm, especialmente puede ser de 200 rpm. Por "bajo cizallamiento " se entiende que la mezcla no se realiza por medio de un dispositivo rotor-estator, como (pero no se limita a) los vendidos por SILVERSON con el nombre comercial Silverson® L4RT o Silverson® L5M o por IKA WERKE bajo el nombre comercial Ultra-Turrax®. Luego, la etapa de emulsión se lleva a cabo en condiciones de bajo cizallamiento, en particular a una velocidad de rotación de 100 a 1000 rpm, preferiblemente durante 2 a 20 minutos. En un aspecto, la etapa de emulsión se lleva a cabo en condiciones de bajo cizallamiento a una velocidad de rotación de 100 a 1000 rpm durante 2 a 20 minutos. Preferiblemente, en la presente descripción, la etapa de mezcla o emulsión se lleva a cabo por medio de un mezclador de paletas o una turbina de flujo axial. Por ejemplo, el mezclador puede ser un mezclador de paletas y tener un impulsor de 4 álabes, en particular un impulsor de 4 álabes horizontal. Este tipo de dispositivo comprende un cabezal mezclador que es un impulsor de flujo axial, no un rotor de flujo radial como se puede encontrar en los dispositivos rotor-estator. Por lo tanto, en un aspecto, el mezclador es un impulsor de flujo axial. En otro aspecto, el mezclador es un impulsor de flujo radial. Además, no está encerrado en un estator perforado.

En un aspecto preferido, el método para fabricar la emulsión peptídica lista para usar no comprende ninguna etapa de emulsión con alto cizallamiento. En particular, no comprende ninguna etapa de emulsión a una velocidad superior a 7000, 6000 o 5000 rpm, preferiblemente ninguna etapa de mezcla a una velocidad superior a 2000 rpm. Preferiblemente, el método no comprende ninguna etapa de emulsión llevada a cabo con un mezclador de alto cizallamiento (Silverson® Verso) que tiene una configuración rotor-estator.

En un aspecto preferido, el método para fabricar la emulsión peptídica lista para usar no comprende ning una etapa de mezcla con alto cizallamiento. En particular, no comprende ninguna etapa de mezcla a una velocidad superior a 7000, 6000 o 5000 rpm, preferiblemente ninguna etapa de mezcla a una velocidad superior a 2000 rpm. Preferiblemente, el método no comprende ninguna etapa de mezcla llevada a cabo con un mezclador de alto cizallamiento (Silverson® Verso) que tiene una configuración rotor-estator. Preferiblemente, para obtener la emulsión, el adyuvante se mezcla con la suspensión peptídica, en condiciones asépticas. La relación en peso adyuvante:suspensión puede estar comprendida en el intervalo de 10:1 a 1:10, preferiblemente de 5:1 a 1:5 y más preferiblemente de 2:1 a 1:2 y sigue siendo preferible de 1:1.

Esta etapa de mezcla o emulsión se realiza preferiblemente a una temperatura de 10 a 30 °C, preferiblemente de 20 a 25 °C, durante 2 a 30 min, por ejemplo de 5 a 15 minutos. Cabe señalar que la duración de la mezcla se calcula desde el momento en que se ha añadido todo el adyuvante a la cámara de mezcla, pudiéndose realizar esta adición por etapas. Por ejemplo, el adyuvante se añade a la suspensión durante 30 segundos a 3 minutos, preferiblemente durante 1 a 2 minutos, a una velocidad de rotación en el intervalo de 100 a 1000 rpm y preferiblemente de 100 a 500 rpm, más preferiblemente de 100 a 200 rpm. Luego, el método puede comprender una etapa de adición del adyuvante a la suspensión en la cámara de mezcla, durante un período de 30 segundos a 3 minutos a una temperatura de 10 a 30 °C con una velocidad de agitación en el intervalo de 10 a 1000 rpm, una etapa de mezcla a 10-30 °C durante 2 a 20 minutos a una velocidad de 100 a 1000 rpm y opcionalmente una etapa de recuperación de la emulsión peptídica, en donde el volumen de la emulsión peptídica es mayor a 5 l. La totalidad o parte de la etapa de mezcla anterior se realiza preferiblemente bajo atmósfera inerte, preferiblemente bajo nitrógeno.

De este modo se puede obtener una emulsión peptídica lista para usar que tenga un volumen superior a 5 l, preferiblemente superior o igual a 10 l. Se puede usar para preparar aproximadamente 8000 viales para inyección. La emulsión peptídica obtenida según el presente proceso es físicamente estable. La estabilidad física de la emulsión se puede evaluar midiendo el tamaño de la gota de agua después de 3 meses de almacenamiento a -20,5 y 25 °C, que no debe diferir sustancialmente de su tamaño inmediatamente después de fabricar la emulsión. El tamaño de la gota se puede medir mediante difracción láser.

Según un aspecto preferido, el D50 de la emulsión es de 10 ± 2 pm. Además, la emulsión no se debe separar entre dos capas en las mismas condiciones de almacenamiento.

Además, los péptidos son tanto químicamente estables como también biológicamente estables. Por "químicamente estable", se entiende que, entre otros, los péptidos no se degradan sustancialmente, en particular por oxidación y/o desamidación, y no se agregan sustancialmente entre sí. La estabilidad química de los péptidos se puede medir mediante cromatografía en fase líquida acoplada con espectrometría de masas, después de tres meses de almacenamiento a temperatura ambiente, como se muestra en los Ejemplos a continuación. Preferiblemente, la cantidad de cada péptido en la emulsión oscila entre 0,1 y 10 mg/ml, preferiblemente entre 0,5 y 1 mg/ml y no difiere en más del 10% de la cantidad que se usó en la preparación de la emulsión. Su estabilidad biológica se puede evaluar midiendo la inmunogenicidad de los péptidos, por ejemplo mediante una prueba de potencia transgénica in vivo.

La formulación lista para usar de la presente descripción cumple, por lo tanto, con las regulaciones de la industria para la fabricación y el control de calidad consistentes de un producto de vacuna.

La emulsión se puede almacenar a una temperatura de 2 a 8 °C o incluso congelarse después de la fabricación y llevarse a temperatura ambiente antes de su uso. Esta emulsión se puede acondicionar en un recipiente que tenga un volumen de 1 a 50 ml.

Una de las ventajas de la emulsión lista para usar de la descripción es que esta emulsión se puede congelar y descongelar, en particular sin ningún impacto o con un impacto limitado sobre la estructura de la emulsión. Por lo tanto, la presente descripción se refiere a una emulsión lista para usar según la presente descripción adecuada para congelar y descongelar, es decir, manteniendo o conservando la emulsión.

Se puede administrar por vía parenteral como una vacuna lista para usar para provocar respuestas de linfocitos T frente a todos los epítopos correspondientes a los péptidos usados. Esta vacuna se puede usar en el tratamiento de varios tipos de cáncer. Los cánceres también se pueden seleccionar de cáncer de pulmón como NSCLC (cáncer de pulmón de células no pequeñas) y cáncer de pulmón de células pequeñas, melanoma, mesotelioma, cánceres de mama, cánceres cerebrales primarios, cánceres de metástasis cerebrales, carcinoma de ovario, uterino, especialmente de cuerpo uterino y/o carcinoma de cuello uterino, cánceres de cabeza y cuello, de colon, colorrectal, gastrointestinal, renal, sarcoma, tumores de células germinales, leucemia, linfoma, cáncer testicular, cáncer de páncreas y cáncer de vejiga. Especialmente, el cáncer puede ser cáncer de colon y carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), especialmente en personas que se encuentran en el estadio IIIB o IV y/o que expresan el receptor HLA-A2. Alternativamente, los cánceres también se pueden seleccionar de cánceres de páncreas, cánceres de vejiga o cánceres que expresaron los antígenos tumorales a los que se dirigen los péptidos, especialmente CEA, p53, HER-2/neu, MAGE-2 y MAGE-3. Los pacientes que respondan a un tratamiento con la emulsión preparada según la presente descripción se pueden identificar por el biomarcador HLA-2 medido en muestras de sangre por diferentes métodos tales como RT-PCR.

El producto listo para usar se puede usar para tratar cánceres solo o en combinación con otra terapia, en particular quimioterapias, terapias dirigidas u otras inmunoterapias tales como inhibidores de puntos de control.

Por ejemplo, la quimioterapia se puede seleccionar entre cisplatino, carboplatino, ciclofosfamida, etopósido, tenipósido, mitomicina, irinotecán, vinorelbina, etopósido, ifosfamida, temozolomida, fluorouracilo (5FU), docetaxel, pemetrexed, navelbina, fármacos que atacan el crecimiento de los vasos sanguíneos del tumor (VEGF) como bevacizumab, ramucirumab; prednisona; inhibidores de tirosina quinasa que se dirigen a EGFR tales como gefitinib, erlotinib, afatinib; inhibidores de ALK como crizotinib; ceritinib y cualquier combinación estos.

En un aspecto preferido, la vacuna lista para usar de la presente descripción se usa en combinación con un inhibidor de punto de control, especialmente un inhibidor de CTLA-4 y/o un inhibidor de PD-1 o PD-L1; inhibidores de IDO. El tratamiento con el inhibidor de punto de control se puede realizar antes, simultáneamente o después del tratamiento con la vacuna lista para usar como se describe en la presente memoria.

La presente descripción se refiere a un kit o producto que comprende (a) la cantidad terapéuticamente eficaz de vacuna lista para usar como se describe en la presente memoria; y (b) un inhibidor de punto de control, preferiblemente un inhibidor de CTLA-4 y/o un inhibidor de PD-1 o PD-L1, como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial, en particular en el tratamiento del cáncer.

En un aspecto preferido, el tratamiento con un inhibidor de punto de control se realiza después del tratamiento con la vacuna lista para usar como se describe en la presente memoria.

Varios inhibidores de PD-1/PD-L1 ya están disponibles o en desarrollo clínico. Por ejemplo, los inhibidores de PD-1/PD-L1 se pueden elegir entre una lista no exhaustiva que incluyen pembrolizumab (Merk), nivolumab (Bristol Myers Squibb), pidilizumab (Cure Tech), BMS936559 (Bristol Myers Squibb), MEDI4736 (Astra Zeneca), AMP-224 (Astra Zeneca), AMP-514 (Astra Zeneca), MPDL328OA (Roche), avelumab (también conocido como MSB0010718C de Merck KgA Serono/Pfizer). Por ejemplo, los inhibidores de PD-1/PD-L1 se pueden elegir entre los descritos en el documento WO2013/079174,

Por ejemplo, los inhibidores de CTLA-4 se pueden elegir entre la lista no exhaustiva que incluyen Tremelimumab (Pfizer Medimmune) e ipilimumab (BMS).

Emulsión extemporánea

La presente descripción también se refiere a un proceso para preparar una emulsión para administración parenteral, que comprende la preparación de una suspensión según la presente descripción, seguida de la mezcla de dicha suspensión con un emulsionante de agua en aceite.

La presente descripción se refiere además a un kit que comprende un recipiente estéril que comprende una suspensión preparada por el método según la presente descripción, un recipiente, tal como un vial, que comprende un emulsionante de agua en aceite y opcionalmente un conector. Los ejemplos de emulsionantes adecuados son los descritos anteriormente y se seleccionan preferiblemente de monooleato de manida, monooleato de sorbitán y adyuvantes que consisten en mezclas de monooleato de manida del 5-20% o monooleato de sorbitán con un 80-95% de aceite mineral (adyuvante incompleto de Freund, Montanide® ISA 51 y emulsión NH2) o escualeno (Montanide® ISA 720). En un aspecto preferido, el emulsionante comprende monooleato de manida (como Montanide® ISA 51). El kit puede comprender además un conector.

La suspensión obtenida como se describió anteriormente se puede mezclar luego con un emulsionante de agua en aceite para obtener una emulsión de agua en aceite, que se considera que ayuda en la presentación de los péptidos a las células dendríticas. En este tipo de emulsión, la fase acuosa que contiene los péptidos queda atrapada en forma de gotitas dentro de la fase continua de aceite, lo que permite una liberación más lenta de antígenos desde un depósito y, por lo tanto, una inmunidad más intensa a largo plazo en comparación con las emulsiones de aceite en agua. Ejemplos de tales emulsionantes son monooleato de manida, monooleato de sorbitán y adyuvantes que consisten en mezclas de monooleato de manida del 5-20% o de monooleato de sorbitán con un 80-95% de aceite mineral (adyuvante incompleto de Freund, Montanide® ISA 51 y emulsión NH2) o escualeno (Montanide® ISA 720). Según un aspecto preferido de la presente descripción, el emulsionante es una mezcla de monooleato de manida (8-12%) con aceite mineral (88-92%) que se puede obtener de SEPPIC con el nombre comercial de Montanide® ISA 51. Se supone que el aceite mineral solo se metaboliza parcialmente, lo que le hace más eficaz para inducir una respuesta inmune que los adyuvantes a base de aceite no mineral, especialmente en el caso de inmunógenos débiles. Habitualmente, para obtener la emulsión, se mezcla un volumen de cualquiera de los emulsionantes anteriores con un volumen de la suspensión peptídica, en condiciones asépticas.

La emulsión resultante puede ser una formulación "de cabecera" que se prepara extemporáneamente, justo antes del tratamiento del paciente. Más específicamente, la emulsión se puede preparar de forma extemporánea mediante un conector unido a una jeringa que contiene la emulsión y otra jeringa que contiene el emulsionante, según el proceso comprobado: 20 ciclos lentos (9 s por ciclo - 180 s) seguidos de 40 ciclos rápidos (20 s). El emulsionante y la suspensión se almacenan preferiblemente a una temperatura por debajo de la temperatura ambiente y se llevan a temperatura ambiente inmediatamente antes de mezclar. La emulsión resultante se puede inyectar al paciente dentro de las 8 horas desde la preparación de la emulsión y preferiblemente dentro de las 4 horas. La emulsión se puede administrar por vía parenteral y usarse como vacuna para desencadenar respuestas de linfocitos T frente a todos los epítopos correspondientes a los péptidos usados. Esta vacuna se puede usar en el tratamiento de varios tipos de cáncer, especialmente cáncer de colon y carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), especialmente en personas que se encuentran en el estadio IIIB o IV y/o que expresan el receptor HLA-A2. Los cánceres también se pueden seleccionar de cánceres de páncreas, cánceres de vejiga o cánceres que expresaron los antígenos tumorales a los que se dirigen los péptidos, especialmente CEA, p53, HER-2/neu, MAGE-2 y MAGE-3. El producto listo para usar se puede usar para tratar cánceres solo o en combinación con otra terapia, en particular quimioterapias, terapias dirigidas u otras inmunoterapias tales como inhibidores de punto de control, en particular como se describió anteriormente.

Esta invención se entenderá mejor a la luz de los siguientes ejemplos que se dan únicamente con fines ilustrativos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Preparación de una suspensión según la presente descripción

PolyPeptide (San Diego, CA) sintetizó diez péptidos usando la química de fase sólida Boc o Fmoc estándar:

aKXVAAWTLKAAa (SEQ ID NO: 1) = MPS-7,

SMPPPGTRV (SEQ ID NO: 5) = MPS-103,

IMIGHLVGV (SEQ ID NO: 9) = MPS-214,

KVAEIVHFL (SEQ ID NO: 10) = MPS-215,

YLSGADLNL (SEQ ID NO: 8) = MPS-200,

KLBPVQLWV (SEQ ID NO: 6) = MPS-102,

LLTFWNPPV (SEQ ID NO: 4) = MPS-213,

RLLQETELV (SEQ ID NO: 2) = MPS-112,

YLQLVFGIEV (SEQ ID NO: 3) = MPS-106, y

KVFGSLAFV (SEQ ID NO: 7) = MPS-216.

Estos péptidos se purificaron por HPLC y se verificaron sus identidades por espectrometría de masas.

Se prepararon tres soluciones que se describen en la Tabla 1.

Tabla 1

Las soluciones 1 y 2 se prepararon a temperatura ambiente mediante agitación en vórtex y/o sonicación durante unos minutos, mientras que la solución 3 se preparó calentando a 37 °C mediante agitación en vórtex. Después, estas soluciones se almacenaron a 2-8° C durante un máximo de cuatro horas con el fin de evaluar su degradación durante los posibles tiempos de espera en su proceso de fabricación industrial. Su degradación se evaluó mediante cromatografía líquida acoplada con detección UV y espectrometría de masas. Los resultados del análisis realizado se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2

Por lo tanto, las soluciones anteriores se almacenaron durante menos de 4 horas a 2-8 °C, luego se filtraron en estéril y se mezclaron en una relación de masa A:B:C de 2,9:3,6:1, para obtener una suspensión, cuyo pH se ajustó a 7 añadiendo 0,2 ml de una solución de fosfato de sodio 62,5 mM y una solución de NaOH 0,5 M.

La suspensión se almacenó a -20 °C en un vial estéril.

Ejemplo 2: Experimento comparativo

Se prepararon soluciones peptídicas que eran idénticas a la Solución 2 descrita en el Ejemplo 1, excepto que se varió la cantidad de hidróxido de sodio de 0,10 M (como se describe en el documento WO 2004/094454) a 0,013 M. Se evaluó la capacidad de estos medios para solubilizar los péptidos y prevenir su degradación después de dos horas de almacenamiento a 2-8 °C. Los resultados se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3

A partir de esta tabla, se puede deducir que un pH de 12,4 o inferior no permite la solubilización adecuada de los péptidos, mientras que un pH igual o superior a 13 da como resultado la degradación de uno de los péptidos. Se realizó un análisis de espectroscopia de masas para identificar los productos de degradación que se formaron. Se encontró que las cadenas laterales de Asn o Gln se hidrolizaron a Asp y Glu, respectivamente.

Este experimento demuestra que el pH de la solución 2 se debe ajustar a 12,5-12,9.

Ejemplo 3: Estabilidad de la suspensión.

Se estableció una prueba adicional para evaluar la posible agregación de péptidos como se describe a continuación. Este método es capaz de monitorizar la agregación de péptidos y es sensible, específico y preciso. Era adecuado para monitorizar modificaciones o variantes estructurales y de masa que pueden ocurrir durante la fabricación o durante el almacenamiento. Se llevó a cabo una Cromatografía Líquida-Espectroscopía de Masas (LC-UV/MS) para estar seguros de la identidad de los péptidos y la ausencia de enlaces covalentes entre ellos. El método se desarrolló para comprobar la ausencia de agregación entre péptidos a pesar de la presencia de precipitados de algunos péptidos. El objetivo era determinar si se podían establecer enlaces covalentes entre los péptidos contenidos en la suspensión del Ejemplo 1 durante 9 meses de almacenamiento en diferentes condiciones: -20 °C; 5 °C y 25 °C.

Cada péptido se identificó por su tiempo de retención en el espectro UV y por masa.

Condiciones cromatográficas

Columna: Columna Advance Bio Mapping LC, 2,1*250 mm, 2,7 pm, C18, 120 A, referencia Agilent n°651750-902

Detección: 215 nm y 280 nm

Velocidad de flujo: 0,3 ml/min

Volumen de inyección: 5 pl

Tiempo de ejecución: 100 minutos

Temperatura de la columna: 35 °C ± 2 °C

Temperatura de la muestra: 5 °C

Lavado de aguja: Ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% en dimetilsulfóxido (DMSO)

Fase móvil: Eluyente A: TFA al 0,2% en acetonitrilo al 5%

Eluyente B: TFA al 0,2% en acetonitrilo al 95%

Tabla de gradiente:

Preparación de la solución de muestra

Transferir el contenido de 1 vial (~ 1ml) que contiene la suspensión del Ejemplo 1 a un matraz aforado de 10 ml y completarlo al volumen con TFA al 0,1% en DMSO. El vial se pesa antes y después del muestreo con el fin de determinar el peso exacto de la muestra.

La suspensión del Ejemplo 1 se analizó mediante el método de cromatografía líquida/espectroscopia de masas (LC/MS).

Los resultados obtenidos muestran que en todas las condiciones de almacenamiento se detectan todos los péptidos. No existen diferencias significativas entre los cromatogramas, sean cuales sean las condiciones de almacenamiento. Las áreas de picos UV relativas no cambiaron. La MS de barrido completo de no detectó masas adicionales, incluyendo masas potenciales de alto peso molecular que corresponderían a agregados covalentes. Esto significa que no se establecieron enlaces covalentes entre los péptidos durante estos 3 meses de almacenamiento.

El resultado de este análisis es que no se observaron enlaces covalentes entre péptidos en la suspensión, lo que posteriormente daría lugar a la agregación química.

Después de tres meses en tres condiciones de almacenamiento (-20° C, 5° C y 25° C), los tiempos de retención y el peso molecular (MW) observados corresponden estrictamente a los péptidos del ingrediente activo y se mantienen dentro del nivel de especificación determinado en liberación de los lotes. Los resultados demuestran la ausencia de agregación y que no se producen enlaces covalentes entre péptidos en la suspensión durante la fabricación y el almacenamiento.

Ejemplo 4: preparación de una emulsión W/O extemporánea según la presente descripción

Con el fin de preparar un producto clínico inyectable, se preparó una emulsión de agua en aceite mezclando la suspensión del Ejemplo 1 con una mezcla emulsionante de agua en aceite (Montanide® ISA 51 suministrado por SEPPIC, conservado en la oscuridad a 2-8 °C en un vial) en una relación de masa 1:1, correspondiente a 0,9 ml de suspensión peptídica y 1,1 ml de emulsionante. Específicamente, la suspensión y el emulsionante se llevaron a temperatura ambiente inmediatamente antes de mezclarlos y se transfirieron cada uno a una jeringa. La emulsión se preparó extemporáneamente por medio de un conector de plástico unido a estas jeringas. El émbolo de las jeringas se empujó de modo alternativo lentamente 20 veces cada una, luego 40 veces cada una a alta velocidad. De cualquiera de las jeringas se puede inyectar al paciente 1 ml de esta emulsión por vía subcutánea.

Ejemplo 5: Preparación de una emulsión W/O lista para usar según la presente descripción

Con el fin de preparar un producto de administración clínica inyectable, se formó una emulsión de agua en aceite mezclando la suspensión del Ejemplo 1 con un adyuvante oleoso (Montanide® ISA 51 suministrado por SEPPIC) en una relación de masa de 1:1. Para preparar la emulsión, se infló primero la bolsa de mezcla del dispositivo con nitrógeno para proporcionar una capa de gas inerte durante el funcionamiento. Se filtraron 5200 g del emulsionante, luego se transfirieron en condiciones asépticas a la cámara de mezcla de un mezclador Allegro® que comprende una turbina de flujo axial. La velocidad de rotación del impulsor se ajustó a 200 rpm, luego se añadieron lentamente (en 1 2 min) a la cámara de mezcla 5200 g de la suspensión descrita anteriormente, en condiciones asépticas. Se continuó agitando durante 5 minutos.

Se obtuvo una emulsión blanca libre de partículas visibles, que tenía una viscosidad de 280 mPa.s y se podía fácilmente transferir a través de una aguja de 26 Ga desde una jeringa de 1 ml.

Ejemplo 6: Preparación de emulsiones usando diferentes tiempos de agitación.

Las emulsiones según la presente descripción se prepararon como se describe en el Ejemplo 5, usando diferentes tiempos de agitación. Las concentraciones iniciales de los diversos péptidos están indicadas en las tablas siguientes.

De las tablas anteriores se puede deducir que la concentración de los diversos péptidos permanece dentro del intervalo de 0,49-0,59 mg/ml, cualquiera que sea el tiempo de agitación. Por lo tanto, la emulsión se puede preparar usando un tiempo de agitación corto de solo 5 minutos.

Ejemplo 7: Estabilidad química de la emulsión.

La estabilidad química de los péptidos contenidos en la emulsión preparada según el Ejemplo 5 se evalúa mediante el siguiente método.

Se pesa con precisión una muestra de 0,9 g de la emulsión del Ejemplo 5 y se mezcla con TFA al 0,1% en DMSO para llenar un matraz volumétrico de 5 ml. A continuación, la mezcla se agita durante 2 minutos y se centrifuga durante 7 minutos a 4000 rpm. A continuación, la capa inferior se analiza mediante cromatografía líquida/espectroscopia de masas (LC/MS) usando las siguientes condiciones cromatográficas:

Columna: columna Advance Bio Peptide Mapping LC, 2,1 * 250 mm, 2,7 pm, C18, 120 A, referencia Agilent® n°651750-902 o equivalente

Detección: 215 nm y 280 nm

Velocidad de flujo: 0,3 ml/min

Volumen de inyección: 5 pl

Tiempo de ejecución: 100 minutos

Temperatura de la columna: 35 °C ± 2 °C

Temperatura de la muestra: 5 °C

Lavado de la aguja: Ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% en dimetilsulfóxido (DMSO)

Fase móvil: Eluyente A: TFA al 0,2% en acetonitrilo al 5%

Eluyente B: TFA al 0,2% en acetonitrilo al 95%

Tabla de gradiente:

Se prepara una solución estándar transfiriendo 0,9 ml de la suspensión de partida descrita en el Ejemplo 1 con 1,1 ml de Montanide ISA 51 en un matraz volumétrico de 10,0 ml, luego agitando en vórtex y centrifugando la mezcla como se describió anteriormente. La capa inferior así obtenida se analiza en las mismas condiciones que las anteriores. La concentración de cada péptido se expresa en mg/g mediante la fórmula:

A 0.9X 1

Concentración Concentration (mg/g) = ---------- x --------------x 5 x -------------S 10 W

donde:

A: es el área de pico de cada péptido en la solución de muestra

S : es el área de pico de cada péptido en la solución estándar

W: es el peso de la muestra expresado en g

Los resultados obtenidos en muestras de la emulsión del Ejemplo 5 almacenadas en diferentes condiciones muestran que en todas las condiciones de almacenamiento se detectan todos los péptidos sin diferencias significativas entre los cromatogramas, lo que significa que no se observan enlaces covalentes entre péptidos en la emulsión. Además, las áreas de pico UV relativas no cambian. La MS de barrido completo no detecta masas adicionales, incluidas las masas potenciales de alto peso molecular. Esto significa que no se establecen enlaces covalentes ni agregados entre los péptidos en estas diferentes condiciones de almacenamiento.

En especial, después de un mes en tres condiciones de almacenamiento (-20 °C, 5 °C y 25 °C), los tiempos de retención y el peso molecular (MW) observados corresponden a los péptidos del ingrediente activo y se mantienen dentro del nivel de especificación determinado en la liberación del lote, es decir, ±10%, como se muestra a continuación:

Ejemplo 8: Estabilidad física de la emulsión

Los tamaños de gota de varias muestras de la emulsión preparada como se describe en el Ejemplo 5 se determinaron por difracción láser usando un granulómetro (sistema óptico Malvern mastersizer 3000E). Estas muestras se recogieron de diferentes áreas del mezclador. Los resultados se expresaron como el tamaño máximo de x% de las gotas, es decir, Dx. Se resumen en la siguiente tabla.

Este experimento muestra que los tamaños de las gotas son homogéneos en todo el mezclador, con un D50 de aproximadamente 10 pm.

La variación en el tamaño de las gotas se midió después de un mes de almacenamiento en diferentes condiciones. Como se muestra en la siguiente tabla, el tamaño de las gotas se mantuvo sustancialmente constante:

Ejemplo 9: Inmunogenicidad

Algunos péptidos se identificaron como parcial o totalmente precipitados en la suspensión preparada como se describe en el Ejemplo 1:

MPS-216 KVFGSLAFV (SEQ ID NO: 7) (33% de solubilidad)

MPS-215 KVAEIVHFL (56% de solubilidad)

MPS-106 YLQLVFGIEV (0% de solubilidad)

Se probó in vivo la inmunogenicidad de cada péptido que entra en la combinación, incluso en estado poco soluble o insoluble, en ratones transgénicos HLA A2.1/k.

Se realizó la inducción de CTL (linfocitos T Citotóxicos) y HLT (linfocitos T cooperadores) mediante el ensayo Elispot para medir la producción de IFN gamma, las manchas se contaron mediante análisis de producción asistida por ordenador. Los puntos netos/ 106 células CD8+ (CTL) o células CD4+ (HTL) se calcularon como (número de puntos frente al péptido relevante)-(número de puntos con péptido irrelevante) x 2,5.

Los datos acumulados de 6 experimentos independientes demostraron que la combinación era inmunogénica con inducción de respuestas CTL.

El intervalo observado fue de 50 a 200 Unidades Estándar frente a un péptido muy soluble como MPS 214.

Inesperadamente se observó el mismo intervalo (50 a 200 UE) de respuesta con los 3 péptidos poco solubles [MPS-215 (KVAEIVHFL) con 56% de solubilidad; MPS-216 (KVFGSLAFV (SEQ ID NO: 7)) con 33% de solubilidad; MPS-106 (YLQLVFGIEV) 0% de solubilidad].

Los epítopos solubles, insolubles o poco solubles en la nueva emulsión eran capaces de inducir fuertes respuestas CTL. El estado de solubilidad de los péptidos poco solubles en la emulsión final no afecta a las propiedades inmunogénicas in vivo en el modelo transgénico HLA A2.

Ejemplo 10: Experimento comparativo

La suspensión preparada como se describe en el Ejemplo 1 se mezcló con el mismo adyuvante, en la misma proporción, excepto que la mezcla se realizó por medio de un mezclador de alto cizallamiento (Silverson® Verso) que tenía una configuración rotor-estator. Se usaron velocidades de agitación de 2000 y 8000 rpm durante 15 min y 2 min,

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para fabricar una emulsión peptídica lista para usar a escala industrial, que comprende la etapa de emulsionar una suspensión de al menos dos péptidos en condiciones de bajo cizallamiento, a una velocidad de rotación de entre 100 y 1000 rpm, durante 2 a 20 minutos, con al menos un adyuvante, en donde el método no comprende ninguna etapa de mezcla a alta velocidad, particularmente por encima de 7000 rpm.

2. El método de la reivindicación 1, caracterizado por que los péptidos comprenden al menos un péptido soluble y al menos un péptido no soluble.

3. El método según la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que los péptidos se seleccionan del grupo que consiste en: un péptido KVFGSLAFV (SEQ ID NO: 7), un péptido YLSGADLNL (SEQ ID NO: 8), un péptido KLBPVQLWV con B que indica ácido a-aminoisobutírico (SEQ iD No : 6), un péptido SMPPPGTRV (SEQ ID NO: 5), un péptido IMIGHLVGV (SEQ ID NO: 9), un péptido LLTFWNPPV (SEQ ID NO: 4), un péptido RLLQETELV (SEQ ID NO: 2), un péptido aKXVAAWTLKAAa con X y a que indican respectivamente ciclohexilalanina y d-alanina (SEQ ID NO: 1), un péptido YLQLVFGIEV (SEQ ID NO: 3) y un péptido KVAEIVHFL (SEQ ID NO: 10).

4. El método según la reivindicación 3, caracterizado por que la suspensión comprende una combinación de un péptido KVFGSLAFV (SEQ ID NO: 7), un péptido YLSGADLNL (SEQ ID NO: 8), un péptido KLBPVQLWV (SEQ ID NO: 6), un péptido SMPPPGTRV (SEQ ID NO: 5), un péptido IMIGHLVGV (SEQ ID NO: 9), un péptido LLTFWNPPV (SEQ ID n O: 4), un péptido RLl QeTELV (SEQ ID NO: 2), un péptido aKXVAAWTLKAAa con X y a que indican respectivamente ciclohexilalanina y d-alanina (SEQ ID NO: 1), un péptido YLQLVFGIEV (SEQ ID NO: 3) y un péptido KVAEIVHFL (SEQ ID NO: 10).

5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que el adyuvante consiste en una mezcla de un aceite de hidrocarburo con un emulsionante de agua en aceite.

6. El método según la reivindicación 5, caracterizado por que el aceite de hidrocarburo se selecciona de aceite de parafina, un aceite vegetal, escualeno, escualano o un aceite mineral y el emulsionante de agua en aceite se selecciona de monooleato de manida y monooleato de sorbitán.

7. El método según la reivindicación 5 o 6, caracterizado por que la relación en peso del adyuvante a la suspensión peptídica varía de 10:1 a 1:10, preferiblemente de 5:1 a 1:5 y más preferiblemente de 2:1 a 1:2 y sigue siendo preferiblemente de 1:1.

8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que toda o parte de la etapa de mezcla se realiza bajo atmósfera inerte, preferiblemente bajo nitrógeno.

9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que el volumen de la emulsión es superior a 5 l, preferiblemente superior o igual a 10 l.

10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, caracterizado por que la suspensión peptídica se prepara mediante un método que comprende:

a) preparar al menos tres soluciones diferentes A, B y C, en donde:

• la solución B es un medio acuoso básico con un pH de entre 12,5 y 12,9 antes de añadirle cualquier péptido y la solución B que comprende un péptido YLSg A d LNL (SEQ ID No : 8),

KLBPVQLWV con B que indica ácido a-aminoisobutírico (SEQ ID NO: 6), SMPPPGTRV (SEQ ID NO: 5), IMIGHLVGV (SEQ ID NO: 9) , LLTFWNPPV (SEQ ID NO: 4), KVAEIVHFL (SEQ ID NO: 10), RLLQETELV (SEQ ID NO: 2) y YLQLVFGIEV (SEQ ID NO: 3);

b) mezclar dichas soluciones para formar una suspensión, y

c) ajustar el pH de dicha suspensión a aproximadamente 7.

11. El método según la reivindicación 10, en donde la solución A comprende aKXVAAWTLKAAa (SEQ ID NO: 1), SMPPPGTRV (SEQ ID NO: 5), IMIGHLVGV (SEQ ID NO: 9) y KVAEIVHFL (SEQ ID NO: 10) y la solución B comprende YLSGADLNL (SEQ ID NO: 8), KLBPVQLWV (SEQ ID NO: 6), LLTFWNPPV (SEQ ID NO: 4), RLLQETELV (SEQ ID NO: 2) y YLQLVFGIEV (SEQ ID NO: 3).