RS63259B1 - Postupak za proizvodnju stabilne emulzije za isporuku peptida - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na postupak za proizvodnju emulzije peptida, spremne za upotrebu, u industrijskim razmerama i na emulziju, spremnu za upotrebu, koja se može dobiti prema ovom postupku. Ovaj pronalazak omogućava isporuku skalabilne emulzije peptida koja čuva njihov integritet i ispunjava uslove potrebne za farmaceutski sterilan proizvod.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Praćeni su novi pristupi u lečenju kancera, koji uključuju razvoj poboljšanih vakcina protiv kancera koje obuhvataju kombinaciju peptida.

[0003] Međutim, prisustvo nerastvorljivih peptida, rizik od agregacije peptida i moguće rezultujuće smanjenje imunogenosti, su prepreke u razvoju proteinskih lekova ili lekova na bazi peptida, koje se stalno ponavljaju. Ovaj rizik od agregacije ili deamidacije povećava se između peptida kada su umešani u istoj formulaciji.

[0004] Približno 95% svih kandidata za lekove na bazi peptida se odbacuje tokom prekliničkih ili kliničkih ispitivanja, često zbog problema vezanih za malu rastvorljivost ili probleme agregacije. Agregacija je, takođe, jedna od najznačajnijih prepreka za razvoj lekova na bazi proteina, jer ne samo da može da ugrozi njihovu bioraspoloživost i terapeutski efekat, već i povećava rizik od neželjenih reakcija (Interpretation of the dissolution of insoluble peptide sequences based on the acid-base properties of the solvent L Malavolta et al 2006, Protein Sci.2006 Jun; 15(6): 1476-1488).

[0005] Peptidi kraći od pet ostataka obično su rastvorljivi u vodi ili vodenom puferu, osim u slučaju kada se cela sekvenca sastoji od hidrofobnih aminokiselina (npr. A, F, I, L, M, P, V, W, Y, alfa-amino buterna kiselina, b-amino alanin, norleucin). Peptidi koji sadrže 50% i više hidrofobnih ostataka mogu biti nerastvorljivi ili samo delimično rastvorljivi u vodenim rastvorima. Peptidi koji sadrže visok udeo (> 75%) D, E, H, K, N, Q, R, S, T, Y mogu da grade intermolekulske vodonične veze (tj., umrežavanje), na taj način formirajući gelove u vodenim rastvorima.

[0006] Agregati peptida su klasifikovani kao rastvorljivi ili nerastvorljivi, kao i kovalentno vezani (uključujući obrazovanje kovalentne veze, često disulfidne veze) ili vezani vodoničnim vezama (slabije interakcije). Samopovezivanje terapeutskih proteina kovalentnim vezama je obično nepovratno, dok agregati obrazovani slabijim interakcijama mogu biti povratni usled promena koncentracije proteina, temperature i pH. Kao rezultat, agregati mogu biti u opsegu veličina od sićušnih, nevidljivih, čestica koje se ne mogu isfiltrirati do velikih taloga koji su vidljivi golim okom. Pored toga, neki agregati mogu biti statični dok drugi mogu biti dinamični.

[0007] Određene faze proizvodnje utiču na rizik od hemijske razgradnje, čime se povećava rizik od fizičke razgradnje i obrazovanja agregata. Na primer, više koncentracije formulacije proteina ili peptida mogu da povećaju mogućnost agregacije, kao i promene pH rastvora, temperature, izbora pufera. Štaviše, faza emulgovanja sprovedena u proizvodnji vakcina može takođe da izazove razgradnju i agregaciju peptida. Formulacije vakcina sa adjuvansima koji omogućavaju obrazovanje (V/U) emulzija tipa voda u ulju indukuju imunološki odgovor obrazovanjem depoa na mestu ubrizgavanja i zaista su vrlo poželjne. Međutim, postupak homogenizacije i emulgovanja je problem kada kombinacija peptida uključuje i rastvorljive i nerastvorljive peptide. Stabilnost tih peptida u emulziji je kritična za bezbednost i imunogenost jer je emulgovanje ključni element za lokalnu isporuku peptida i imunološku prezentaciju. Peptidi u rastvorljivim ili nerastvorljivim stanjima su osetljivi i na temperaturu i na mešanje, osetljivi su na oksidaciju, mešavina nerastvorljivih i rastvorljivih peptida može imati probleme unakrsne reaktivnosti tokom skladištenja, a mehaničke sile korišćene za mešanje takve kombinacije mogu izmeniti peptide.

[0008] S obzirom na ove nedostatke, formulacije vakcina koje obuhvataju kombinacije peptida, utoliko pre, pripremaju se magistralno.

[0009] Na primer, sprovedeno je nedavno ispitivanje sa kombinovanim peptidima URLC19-177, CDCA1-56, TTK-567, VEGFR1-770 i VEGFR2-169; očekivano je da se svih pet peptida veže za HLA-A24 molekul. Svi kombinovani peptidi su rastvoreni u DMSO u koncentraciji od 20 mg/ml i čuvani na -80°C . Ubrizgani su neposredno nakon mešanja sa adjuvansom (nepotpuni Freund-ov adjuvans IFA ili Montanide<®>ISA 51) (Suzuki H. et al 2013 (Suzuki H. et al 2013 "Multiple therapeutic peptide vaccines consisting of combined novel cancer testis antigens and anti-angiogenic peptides for patients with non-small cell lung cancer." Journal of Translational Medicine 2013). Slični kombinovani peptidi korišćeni su sa istim postupkom (TTK-567, URLC10-177, KOC1-508, VEGFR1-1084, VEGFR2-169 koji se vezuje za HLA-A<∗>24 molekul (Iinuma H. et al "Phase I clinical study of multiple epitope peptide vaccine combined with chemoradiation therapy in esophageal cancer patients" - Journal of Translational Medicine 2014). Pet HLA-A<∗>2402-restriktivnih peptida dobijenih od RNF43, TOMM34, KOC1, VEGFR1 i VEGFR2 takođe je korišćeno u kombinaciji [RNF43-721, TOMM34-299, KOC1(IMP-3)-508, VEGFR1-1084 i VEGFR2-169] (Hazama S. etal "A phase I study of combination vaccine treatment of five therapeutic epitope-peptides for metastatic colorectal cancer; safety, immunological response, and clinical outcome" Journal of Translational Medicine 2014).

[0010] Sve kombinacije peptida prethodno predstavljene u novijoj literaturi prvo se rastvaraju, a zatim mešaju sa nekim adjuvansom neposredno pre ubrizgavanja pacijentima. Ovim postupkom je izbegnuto pripremanje emulzije u kojem bi dugotrajna stabilnost peptida u adjuvansu bila potrebna.

[0011] Nasuprot tome, primer vakcine spremne za upotrebu koja obuhvata mešavinu peptida opisan je u WO 2004/094454. U ovom dokumentu, kombinacija peptida se daje subkutano u obliku reverzne emulzije. Da bi se pripremila pomenuta emulzija, različiti rastvorljivi i nerastvorljivi peptidi se rastvaraju u različitim sredinama, da bi se obezbedila tri zasebna rastvora koja se zatim hlade, podvrgavaju sterilnoj filtraciji i mešaju zajedno kako bi se dobila suspenzija čija se pH zatim podešava na 7. Ova suspenzija se meša sa (V/U) emulgatorom tipa voda u ulju koji obuhvata manid monooleat dobijen od manitola i prečišćene oleinske kiseline sintetičkog ili biljnog porekla. Ovaj emulgator omogućava dobijanje emulzije tipa voda u ulju koja sadrži fine kapljice vode u kojima su peptidi dispergovani. Ova struktura emulzije, zauzvrat, obezbeđuje jak i dugotrajan imunitet.

[0012] Emulgovanje peptida zahteva snažnu mešalicu. Homogenizacija koristi mehaničke sile za mešanje ulja koje potiče od adjuvansa i kapljica vode koje potiču iz rastvora peptida. Velike smicajne i mehaničke sile su značajne za stvaranje fino dispergovanih kapljica. Ova emulzija često se pokaže problematičnom, s obzirom da hemije peptida pružaju otpor postupku mešanja. Visoko smicanje koje se postiže homogenizatorom visokog pritiska može da prevaziđe taj otpor. Dobavljači adjuvanasa, prema tome, preporučuju emulgovanje peptida sa visokim smicanjem. Na primer, u brošuri iz aprila 2007. godine koja opisuje adjuvans koji se prodaje kao Montanide<®>ISA 50 V2, SEPPIC preporučuje se mešanje ovog adjuvansa sa vodenom antigenom sredinom korišćenjem mešalice sa visokim smicanjem kao što je Silverson<®>L4RT sa 4000 o/min radi dobijanja stabilne i efikasne vakcine.

[0013] U skladu sa navedenim, u WO 2004/094454, mešanje suspenzije peptida sa adjuvansom izvodi se korišćenjem Silverson<®>L4RT homogenizatora koji rotira sa 8000 o/min tokom 30 minuta. Ovaj uređaj obuhvata radnu glavu za mešanje koja ima rotor opremljen lopaticama koje su radijalno izvedene oko ose i koje usmeravaju fluid, kojeg povlači rotor, radijalno na stator smešten koncentrično od rotora i na kratkom rastojanju od njega. Stator obuhvata otvore izvedene u rešetki. Takav rotor-stator sistem obezbeđuje emulziju obrazovanu u WO 2004/094454 sa visokim smicanjem, budući da je mlevena između krajeva lopatica rotora i unutrašnjeg zida statora i potisnuta velikom brzinom kroz perforacije u statoru, prema stranama radne glave za mešanje.

[0014] Međutim, pronalazači su pokazali da povećanje razmera ovog postupka ne daje emulziju kojom se obezbeđuje dugotrajna stabilnost peptida. Određenije, prilikom povećanja razmera gornjeg postupka, prijavilac je primetio da doziranje peptida sadržanih u njemu pomoću HPLC na reverznim fazama dovodi do različitih vrednosti zavisno od šarži koje su testirane. Ovo je već zabeleženo u WO 2004/094454 gde se navodi da su primećene greške do 30% u koncentraciji peptida. Ova varijabilnost je bila prihvatljiva za krajnji farmaceutski proizvod, jer je specifikacija od 50% predviđene koncentracije predložena kao kriterijum oslobađanja i stabilnosti. Iako je ova varijabilnost ostala u prihvatljivom opsegu za rana klinička ispitivanja, za svrhe naprednih kliničkih ispitivanja bilo bi neophodno da se smanji što je moguće više, da bi se ispunili strogi zahtevi nekih farmaceutskih zakona i, što je još važnije, da bi se obezbedila isporuka peptida u stabilnom emulgovanom stanju kao i da bi se garantovala imunogenost svakog peptida. Pronalazači su sproveli opsežno istraživanje da bi se prevazišao ovaj problem.

[0015] U ovom kontekstu, pronalazači su pokazali da brzina i trajanje mešanja, koji su potrebni da bi se postiglo značajno emulgovanje peptida sa adjuvansom u vakcinama protiv kancera, mogu da izmene integritet peptida i smanje njihovu efikasnost, posebno kada se kombinacija izrađuje od rastvorljivih i nerastvorljivih peptida.

[0016] Otkriveno je da postupak emulgovanja sa visokim smicanjem i velikom brzinom dovodi do razgradnje i/ili agregacije peptida kada se koristi u većim razmerama. Štaviše, mešalica sa visokim smicanjem korišćena u stanju tehnike generisala je toplotu i, prema tome, potrebno je bilo konstantno hlađenje mešalice da bi se izbegla moguća razgradnja peptida osetljivih na toplotu. Prilikom povećanja razmera ovog postupka, ispostavilo se da je precizna kontrola ove faze hlađenja izazov kako bi se izbegla oksidacija peptida koja bi mogla štetno da utiče na njihovu efikasnost zavisno od položaja oksidovanih aminokiselina u odnosu na funkcionalne ili epitopu slične domene peptida. Oksidacija može takođe da izmeni fizičko-hemijske karakteristike peptida i da dovede do agregacije. Ovaj fenomen može, zauzvrat, da ugrozi bezbednost i isporuku neophodne za terapeutski efekat lekova koji sadrže ove peptide i, takođe, da poveća rizik od imunogenih reakcija.

[0017] Pronalazači su tako tragali za sredstvima za prevazilaženje gorepomenutih problema i, prema tome, su obezbedili postupak koji se može jednostavno izvesti u industrijskim razmerama da bi se pripremila injektibilna emulzija peptida u kojoj je očuvan hemijski integritet peptida, a posebno sprečeni i smanjeni razgradnja (kao što je oksidacija i/ili deamidacija) i agregacija peptida, bez negativnog uticaja na fizičku stabilnost emulzije, tako da se svaki peptid isporučuje u stabilnim uslovima. Pored toga, potreban je ponovljiv postupak.

SUŠTINA

[0018] Obim ovog pronalaska definisan je patentnim zahtevima i sve informacije koje nisu obuhvaćene patentnim zahtevima date su samo radi informisanja.

[0019] Prijavilac je iznenađujuće otkrio da se gorepomenuti zahtevi mogu ispuniti postupkom u kojem se emulzija peptida priprema pod blažim uslovima od uslova emulgovanja koji su do sad korišćeni.

Posebno, suprotno onome što je preporučeno u tehnici, velika brzina i visoko smicanje su izbegnuti i, što je iznenađujuće, čak i pri maloj brzini nije potrebno dugo trajanje mešanja. Peptidi različitih rastvorljivosti su, na taj način, zaštićeni od oksidativnog stresa bez potrebe za hlađenjem emulzije dok se mešaju, i njihova agregacija je sprečena. Varijabilnost koncentracije peptida se, na taj način, dramatično smanjuje u odnosu na stanje tehnike kao što je WO 2004/094454. Ovaj postupak na taj način omogućava dobijanje stabilne emulzije za optimalnu isporuku peptida što je potrebno za stabilnu imunogenost zbog depo efekta potrebnog za imunološku prezentaciju peptida. Ovaj postupak je dalje ponovljiv u odnosu na ranije postupke za magistralno pripremanje emulzija peptida, budući da su ovi drugi zavisni od rukovaoca. Ovo omogućava proizvodnju velike zapremine emulzije i, prema tome, može da se izvodi u industrijskim razmerama.

[0020] Prema tome, ovo otkrivanje usmereno je na postupak za proizvodnju emulzije peptida, spremne za upotrebu, u industrijskim razmerama, koji obuhvata fazu emulgovanja suspenzije najmanje dva peptida pod uslovima niskog smicanja, pri brzini obrtanja između 100 i 1000 o/min, tokom 2 do 15 minuta, sa najmanje jednim adjuvansom.

[0021] Poželjno, peptidi obuhvataju najmanje jedan rastvorljiv peptid i najmanje jedan nerastvorljiv peptid. Posebno, peptidi su odabrani iz grupe koju čine: peptid KVFGSLAFV (SEQ ID NO:7), peptid YLSGADLNL (SEQ ID NO:8), peptid KLBPVQLWV gde B označava α-aminoizobuternu kiselinu (SEQ ID NO:6), peptid SMPPPGTRV (SEQ ID NO:5), peptid IMIGHLVGV (SEQ ID NO:9), peptid LLTFWNPPV (SEQ ID NO:4), peptid RLLQETELV (SEQ ID NO:2), peptid aKXVAAWTLKAAa gde X i a redom označavaju cikloheksilalanin i d-alanin (SEQ ID NO:1), peptid YLQLVFGIEV (SEQ ID NO:3) i peptid KVAEIVHFL (SEQ ID NO:10). U nekom posebnom aspektu, suspenzija obuhvata kombinaciju peptida KVFGSLAFV (SEQ ID NO:7), peptida YLSGADLNL (SEQ ID NO:8), peptida KLBPVQLWV (SEQ ID NO:6), peptida SMPPPGTRV (SEQ ID NO:5), peptida IMIGHLVGV (SEQ ID NO:9), peptida LLTFWNPPV (SEQ ID NO:4), peptida RLLQETELV (SEQ ID NO:2), peptida aKXVAAWTLKAAa gde X i a redom označavaju cikloheksilalanin i dalanin (SEQ ID NO:1), peptida YLQLVFGIEV (SEQ ID NO:3) i peptida KVAEIVHFL (SEQ ID NO:10).

[0022] Poželjno, adjuvans se sastoji od mešavine naftinog ulja sa nekim emulgatorom tipa voda u ulju. Posebno, naftino ulje je odabrano od parafinskog ulja, nekog biljnog ulja, skvalena, skvalana ili mineralnog ulja, dok je emulgator tipa voda u ulju odabran od manid monooleata i sorbitan monooleata. U nekom posebnom aspektu, naftino ulje je mineralno ulje dok je emulgator tipa voda u ulju odabran od manid monooleata.

[0023] Poželjno, maseni odnos adjuvansa prema suspenziji peptida iznosi 10:1 do 1:10, poželjno od 5:1 do 1:5, i poželjnije od 2:1 do 1:2, a još je poželjnije 1:1.

[0024] Poželjno se cela faza mešanja ili deo nje izvodi u inertnoj atmosferi, poželjno pod azotom.

[0025] Poželjno, zapremina emulzije je veća od 5L, poželjno jednaka 10L ili veća. U određenom aspektu, suspenzija peptida se priprema u postupku koji obuhvata:

a) pripremanje najmanje tri različita rastvora A, B i C, pri čemu:

• rastvor A je kisela vodena sredina i obuhvata peptid aKXVAAWTLKAAa (SEQ ID NO:1) gde X i a redom označavaju cikloheksilalanin i d-alanin (SEQ ID NO:1), • rastvor B je bazna vodena sredina sa pH između 12.5 i 12.9 pre dodavanja bilo kog peptida u nju, i rastvor B obuhvata peptid YLSGADLNL (SEQ ID NO:8),

• rastvor C je DMSO i obuhvata peptid KVFGSLAFV (SEQ ID NO:7), i

• rastvori A i/ili B dalje obuhvataju najmanje tri dodatna peptida odabrana od: KLBPVQLWV gde B označava α-aminoizobuternu kiselinu (SEQ ID NO:6), SMPPPGTRV (SEQ ID NO:5), IMIGHLVGV (SEQ ID NO:9), LLTFWNPPV (SEQ ID NO:4), KVAEIVHFL (SEQ ID NO:10), RLLQETELV (SEQ ID NO:2) i YLQLVFGIEV (SEQ ID NO:3);

b) mešanje pomenutih rastvora da bi se obrazovala suspenzija, i

c) podešavanje pH pomenute suspenzije do oko 7.

[0026] U jednom aspektu, rastvor A obuhvata aKXVAAWTLKAAa (SEQ ID NO:1), SMPPPGTRV (SEQ ID NO:5), IMIGHLVGV (SEQ ID NO:9) i KVAEIVHFL (SEQ ID NO:10) dok rastvor B obuhvata YLSGADLNL (SEQ ID NO:8), KLBPVQLWV (SEQ ID NO:6), LLTFWNPPV (SEQ ID NO:4), RLLQETELV (SEQ ID NO:2) i YLQLVFGIEV (SEQ ID NO:3).

[0027] Ovo otkrivanje se takođe odnosi na emulziju, spremnu za upotrebu, koja se može dobiti ili koja se dobija u postupku prema ovom otkrivanju, posebno za upotrebu u lečenju kancera, poželjno HLA-2 pozitivnih kancera. Određenije, količina svakog peptida u emulziji iznosi od 0.1 do 10 mg/ml, poželjno od 0.5 do 1 mg/ml i ne razlikuje se za više od 10% od količine koja je korišćena u pripremanju te emulzije. U jednom aspektu, D50 emulzije je 10 ± 1 µm.

DETALJAN OPIS

[0028] Ovo otkrivanje odnosi se na postupak za proizvodnju, u industrijskim razmerama, emulzije spremne za upotrebu od suspenzije peptida koja obuhvata najmanje dva peptida. Ovi peptidi obično nemaju istu rastvorljivost i poželjno je da se koristi kombinacija najmanje jednog rastvorljivog i najmanje jednog nerastvorljivog peptida.

[0029] Izraz "nerastvorljiv peptid" odnosi se na peptid koji je rastvorljiv u nekoj količini manjoj od 60mas./zap.% u vodi pri pH od 7.0 ± 1.0, dok se "rastvorljiv peptid" odnosi na peptid koji je rastvorljiv u nekoj količini od najmanje 60mas./zap.% u vodi pri pH od 7.0 ± 1.0. Rastvorljivost se može proceniti propuštanjem vodenog rastvora peptida, u koncentraciji od 1 mg/ml, kroz filter od 0.45 µm i merenjem količine peptida koja je ostala na filteru.

[0030] Pod "industrijska razmera", podrazumeva se pripremanje zapremine emulzije veće od 5L, poželjno jednake 10L ili veće. U jednom aspektu, zapremina može biti 50L, 100L, 200L, 500L ili 1000L.

Peptidi

[0031] Prema poželjnom aspektu ovog otkrivanja, peptidi se mogu odabrati od epitopa antigena povezanih sa tumorom (TAA) i/ili njihovih analoga, poželjno TAA epitopi koji vezuju HLA-A2.

[0032] TAA epitopi mogu se dobiti od jedne ili nekoliko meta, posebno odabranih iz grupe koju čine CEA (karcinoembrionalni antigen), p53, HER-2/neu, MAGE (antigen melanoma), posebno MAGE-2 i MAGE-3, LY6K (limfocitni antigen 6 kompleks, lokus K), CDCA1 (povezan ciklus ćelijske deobe 1) (na primer, pogledaj EP2186889), IMP3 (mRNK-vezujući protein 3 za insulinu sličan faktor rasta-II) (na primer, pogledaj WO11067920), KIF20A (kinezinu sličan protein) (na primer, pogledaj WO10047062), FOXM1 (Forkhead box protein M1) (na primer, pogledaj EP2186889), CDC45L (homolog proteina 45 kontrole ćelijske deobe), GPC3 (glipikan-3) (na primer, pogledaj WO2015/173112), CDH3 (kadherin 3), SPARC (izlučeni protein kiseo i bogati cisteinom), DEPDC1 (DEP domen koji sadrži 1), MPHOSPH1 (M-FAZA FOSFOPROTEIN 1) (na primer, pogledaj WO2013024582), ME-1 (jabučni enzim 1), ENDC3B, PRDX5 (Peroksiredoksin-5), GAS7 (protein 7 specifičan za zaustavljanje rasta), HA-1 (miHAg) (mali antigen histokompatibilnosti HA-1), GAPDH (Gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza), HSP70 (70 kD proteini toplotnog šoka), ACTININ, HAUS3 (subjedinica 3 HAUS augminu sličnog kompleksa), CSNK1A1 (izoforma alfa kazein kinaze I), CLPP (proteolitička subjedinica ATP-zavisne Clp proteaze) i CDK4 (Ciklin-zavisna kinaza 4). U nekom poželjnom aspektu, peptidi su odabrani i ciljaju CEA, p53, HER-2/neu, MAGE-2 i MAGE-3.

[0033] Na primer, peptidi uključuju peptide odabrane od peptida opisanih u WO 2004/094454, WO2014141683, WO2015173112, WO2015160928, WO2015/155537, WO2014162962, WO2014141652, WO2014136453, WO2014136453, WO2014127276, WO2014047085, WO2014041784, WO2013024582, WO2012073459, WO2013061594, WO2012169200, WO2011111392, WO2012053200, WO2012053206, WO2010137295, WO08047473, WO08102557, WO09109855, EP2186889, EP2186889, WO2010047062, WO2011067920 i slično.

[0034] Prema specifičnom aspektu ovog otkrivanja, peptidi su odabrani iz grupe koju čine: peptid KVFGSLAFV (SEQ ID NO:7), peptid YLSGADLNL (SEQ ID NO:8), peptid KLBPVQLWV gde B označava αaminoizobuternu kiselinu (SEQ ID NO:6), peptid SMPPPGTRV (SEQ ID NO:5), peptid IMIGHLVGV (SEQ ID NO:9), peptid LLTFWNPPV (SEQ ID NO:4), peptid RLLQETELV (SEQ ID NO:2), peptid aKXVAAWTLKAAa gde X i a redom označavaju cikloheksilalanin i d-alanin (SEQ ID NO:1), peptid YLQLVFGIEV (SEQ ID NO:3), peptid KVAEIVHFL (SEQ ID NO:10). Najmanje dva od ovih peptida mogu da se koriste u ovom postupku, poželjno najmanje tri, kao što su aKXVAAWTLKAAa (SEQ ID NO:1), YLSGADLNL (SEQ ID NO:8) i KVFGSLAFV (SEQ ID NO:7), a još poželjnije kombinacija svih deset gorepomenutih peptida. U određenom aspektu, peptidi dalje obuhvataju jedan ili više dodatnih peptida.

[0035] U određenom aspektu, peptidi mogu da obuhvataju peptid odabran iz grupe koju čine FLDEFMEGV (SEQ ID NO:11), VVMSWAPPV (SEQ ID NO:12), LLLDDLLVSI(SEQ ID NO:13), SLADEAEVYL (SEQ ID NO:14), VLHDDLLEA (SEQ ID NO:15), GIVEGLITTV (SEQ ID NO:16), SLFEGIDIYT (SEQ ID NO:17), FIASNGVKLV (SEQ ID NO:18), ILNAMIAKI (SEQ ID NO:19), GLFGDIYLAI (SEQ ID NO:20), ILDKVLVHL (SEQ ID NO:21) i ACDPHSGHFV (SEQ ID NO:22).

[0036] Nomenklatura korišćena za opis peptida u ovoj prijavi prati konvencionalnu praksu gde je amino grupa predstavljena levo (amino- ili N-kraj), a karboksilna grupa desno (karboksi- ili C-kraj) od svakog aminokiselinskog ostatka. Amino- i karboksil-terminalne grupe, iako nisu posebno prikazane, u obliku su koji obično imaju pri fiziološkim pH vrednostima, ukoliko nije drugačije naznačeno. U strukturnim formulama aminokiselina, svaki ostatak je uopšteno predstavljen sa standardnim oznakama od tri slova ili jednog slova. L-oblik aminokiselinskog ostatka predstavljen je jednim velikim slovom ili velikim prvim slovom u troslovnom simbolu, dok je D-oblik za ove aminokiselinske ostatke koji imaju D-oblike predstavljen jednim malim slovom ili simbolom od tri mala slova. Na primer, simbol "a" odnosi se na D-alanin. Aminokiselinske sekvence peptida date ovde uopšteno su označene korišćenjem standardnog jednoslovnog simbola. (A, Alanin; C, Cistein; D, Asparaginska kiselina; E, Glutaminska kiselina; F, Fenilalanin; G, Glicin; H, Histidin; I, Izoleucin; K, Lizin; L, Leucin; M, Metionin; N, Asparagin; P, Prolin; Q, Glutamin; R, Arginin; S, Serin; T, Treonin; V, Valin; W, Triptofan; i Y, Tirozin). Pored ovih simbola, "B" u ovde korišćenim jednoslovnim skraćenicama označava a-amino buternu kiselinu dok "X" označava cikloheksilalanin.

Suspenzija

[0037] Suspenzija peptida korišćena u ovom otkrivanju može se pripremiti prema postupku koji obuhvata pripremanje najmanje dva različita rastvora koji sadrže najmanje dva različita peptida, respektivno. Prema nekom aspektu ovog otkrivanja, pripremaju se tri različita rastvora A, B i C, od kojih svaki sadrži najmanje jedan specifičan peptid. Posebno, rastvor A je kisela vodena sredina, rastvor B je bazna vodena sredina i rastvor C je organska sredina, posebno DMSO (dimetilsulfoksid). U nekom poželjnom aspektu, rastvori A, B i C obuhvataju najmanje aKXVAAWTLKAAa (SEQ ID NO:1), YLSGADLNL (SEQ ID NO:8) i KVFGSLAFV (SEQ ID NO:7), tim redom.

[0038] Poželjnije, rastvori A i/ili B dalje obuhvataju najmanje tri dodatna peptida, poželjno najmanje pet dodatnih peptida, iz gornjeg spiska peptida. Poželjnije, rastvori A i/ili B obuhvataju svih sedam ovih dodatnih peptida. Svaki od ovih dodatnih peptida biće obuhvaćen u rastvoru A ili rastvoru B zavisno od njegove rastvorljivosti i od njegovog afiniteta sa aKXVAAWTLKAAa (SEQ ID NO:1) ili YLSGADLNL (SEQ ID NO:8).

[0039] Prema tome, u jednom aspektu, ovo otkrivanje odnosi se na postupak za proizvodnju suspenzije peptida, koji obuhvata:

a) pripremanje najmanje tri različita rastvora A, B i C, pri čemu:

• rastvor A obuhvata peptid aKXVAAWTLKAAa gde X i a redom označavaju cikloheksilalanin i d-alanin (SEQ ID NO:1),

• rastvor B obuhvata peptid YLSGADLNL (SEQ ID NO:8),

• rastvor C obuhvata peptid KVFGSLAFV (SEQ ID NO:7), i

• rastvori A i/ili B dalje obuhvataju najmanje tri dodatna peptida odabrana od: KLBPVQLWV gde B označava α-aminoizobuternu kiselinu (SEQ ID NO:6), SMPPPGTRV (SEQ ID NO:5), IMIGHLVGV (SEQ ID NO:9), LLTFWNPPV (SEQ ID NO:4), KVAEIVHFL (SEQ ID NO:10), RLLQETELV (SEQ ID NO:2) i YLQLVFGIEV (SEQ ID NO:3);

b) mešanje pomenutih rastvora da bi se obrazovala suspenzija, i

c) podešavanje pH pomenute suspenzije do oko 7,

i poželjno se pH rastvora B podešava između 12.5 i 12.9 pre nego što mu se doda bilo koji peptid.

[0040] Rastvor A se poželjno priprema rastvaranjem peptida u kiseloj vodenoj sredini, kao što je rastvor sirćetne kiseline, poželjno na sobnoj temperaturi. Koncentracija rastvora sirćetne kiseline može da iznosi od 0.1 M do 0.3 M, na primer. Prema tome, kisela vodena sredina ima pH koji je poželjno obuhvaćen između 2 i 4, poželjnije između 2.5 i 3. Svaki peptid rastvora A može biti prisutan u koncentraciji od 0.3 mg/ml do 4 mg/ml, poželjno 3 do 4 mg/ml. Poželjno, svi peptidi su prisutni u rastvoru A u istoj koncentraciji. Poželjno, rastvor A obuhvata aKXVAAWTLKAAa (SEQ ID NO:1) i jedan, dva ili tri peptida odabrana iz grupe koju čine SMPPPGTRV (SEQ ID NO:5), IMIGHLVGV (SEQ ID NO:9) i KVAEIVHFL (SEQ ID NO:10). U najpoželjnijem aspektu, rastvor A obuhvata aKXVAAWTLKAAa (SEQ ID NO:1), SMPPPGTRV (SEQ ID NO:5), IMIGHLVGV (SEQ ID NO:9) i KVAEIVHFL (SEQ ID NO:10). U određenom aspektu, peptide rastvora A čine aKXVAAWTLKAAa (SEQ ID NO:1), SMPPPGTRV (SEQ ID NO:5), IMIGHLVGV (SEQ ID NO:9) i KVAEIVHFL (SEQ ID NO:10).

1

[0041] Štaviše, rastvor B može da se pripremi rastvaranjem peptida u baznoj vodenoj sredini, na primer, rastvor natrijumhidroksida, obično na sobnoj temperaturi.

[0042] Prilikom povećanja razmera gore navedenog postupka, prijavilac je primetio da jedan od peptida sadržan u baznom rastvoru (naime YLSGADLNL (SEQ ID NO:8)) nije hemijski stabilan dovoljno dugo da bi se omogućila sterilna filtracija ovog rastvora u industrijskim razmerama.

[0043] Prijavilac je iznenađujuće otkrio da blago podešavanje pH baznog rastvora kojem treba dodati YLSGADLNL (SEQ ID NO:8) peptid, omogućava izbegavanje njegove razgradnje. Prema tome, postupak ovog otkrivanja pogodan je za pripremanje suspenzije sa dugotrajnom stabilnošću i dobrom reproduktivnošću.

[0044] Zaista, pH rastvora B podešava se između 12.5 i 12.9 pre nego što mu se doda bilo koji peptid, poželjno oko 12.7. Može se dobiti korišćenjem 0.05 M rastvora natrijumhidroksida. Poželjno, svaki peptid u rastvoru B je u ukupnoj količini od 0.4 do 3 mg/ml. Poželjnije, svaki peptid u rastvoru B može biti prisutan u koncentraciji od 2 mg/ml do 3 mg/ml. Poželjno, svi peptidi prisutni su u rastvoru B u istoj koncentraciji. Poželjno, rastvor B obuhvata YLSGADLNL (SEQ ID NO:8), i jedan, dva, tri ili četiri peptida odabrana iz grupe koju čine KLBPVQLWV (SEQ ID NO:6), LLTFWNPPV (SEQ ID NO:4), RLLQETELV (SEQ ID NO:2) i YLQLVFGIEV (SEQ ID NO:3). U najpoželjnijem aspektu, rastvor B obuhvata YLSGADLNL (SEQ ID NO:8), KLBPVQLWV (SEQ ID NO:6), LLTFWNPPV (SEQ ID NO:4), RLLQETELV (SEQ ID NO:2) i YLQLVFGIEV (SEQ ID NO:3). U određenom aspektu, peptide rastvora B čine YLSGADLNL (SEQ ID NO:8), KLBPVQLWV (SEQ ID NO:6), LLTFWNPPV (SEQ ID NO:4), RLLQETELV (SEQ ID NO:2) i YLQLVFGIEV (SEQ ID NO:3).

[0045] Konačno, rastvor C može se pripremiti rastvaranjem KVFGSLAFV peptida (SEQ ID NO:7) u DMSO, poželjno u količini od 1 do 11 mg/ml, poželjnije u količini od 10 do 11 mg/ml, na temperaturi koja je poželjno između 35 i 40°C. Poželjno, peptid u rastvoru C može biti prisutan u koncentraciji od 5 mg/ml do 11 mg/ml. U određenom aspektu, peptide u rastvoru C čini KVFGSLAFV (SEQ ID NO:7).

[0046] Prema poželjnom aspektu ovog otkrivanja, rastvor A obuhvata aKXVAAWTLKAAa (SEQ ID NO: 1), SMPPPGTRV (SEQ ID NO:5), IMIGHLVGV (SEQ ID NO:9) i KVAEIVHFL (SEQ ID NO:10), dok rastvor B obuhvata YLSGADLNL (SEQ ID NO:8), KLBPVQLWV (SEQ ID NO:6), LLTFWNPPV (SEQ ID NO:4), RLLQETELV (SEQ ID NO:2) i YLQLVFGIEV (SEQ ID NO:3).

[0047] Svi gornji peptidi su epitopi dobijeni od CEA, p53, HER-2/neu i MAGE-2/3, osim PADRE koji je univerzalni pan-DR HTL epitop korišćen kao izvor pomoćnika T-ćelija. Međutim, rastvor A, B ili C može dalje da obuhvata dodatne peptide antigena povezanih sa tumorom.

[0048] Kao što je prethodno navedeno, rastvori A, B i C su kombinovani da bi se dobila suspenzija. U nekom poželjnom aspektu, rastvori A, B i C se kombinuju u odnosu koji omogućava dobijanje iste koncentracije u suspenziji za svaki peptid. Poželjno, rastvori A, B i C se kombinuju da bi se dobila suspenzija u A:B:C masenom odnosu od 2-4:3-4:1, poželjnije u masenom odnosu od 2.9:3.6:1. Poželjno, koncentracija svakog peptida u suspenziji je obuhvaćena između 0.2 i 2 mg/ml.

[0049] Prema poželjnom aspektu, rastvori se hlade do temperature između 2 i 8°C i podvrgavaju sterilnoj filtraciji pre obrazovanja suspenzije.

[0050] Poželjno, rastvor B se kombinuje sa rastvorima A i C kraće od 8 sati nakon njegove pripreme, poželjno kraće od 6 sati, a poželjnije ne duže od 4 sata.

[0051] pH tako dobijene suspenzije može se podesiti na fiziološki pH, dakle do pH oko 7, bilo kojim pogodnim sredstvom. Koncentracija peptida može dalje da se podesi dodavanjem pogodnog razblaživača suspenziji, kao što je voda, slani rastvor, vodeni rastvor dekstroze ili rastvor glicerola.

[0052] U određenom aspektu, ne postoji faza filtracije nakon faze mešanja rastvora A, B i C i/ili nakon faze podešavanja pH do oko 7.

[0053] U nekom poželjnom aspektu, faze postupka za proizvodnju suspenzije peptida izvode se pod uslovima zasićenosti azotom da bi se izbegao svaki rizik od oksidacije koja može da ošteti peptide suspenzije, posebno rastvorljiv(e) peptid(e).

[0054] Ovo otkrivanje takođe se odnosi na sterilan kontejner koji obuhvata suspenziju pripremljenu u postupku prema ovom otkrivanju. Poželjno, sterilan kontejner je staklena fiolica.

Emulzija spremna za upotrebu

[0055] Ovaj postupak zatim se sastoji od mešanja suspenzije peptida sa nekim adjuvansom da bi se dobila emulzija tipa voda u ulju, za koju se smatra da pomaže u prezentaciji peptida dendritskim ćelijama. Kod ovog tipa emulzije, vodena faza koja sadrži peptide je zarobljena u obliku kapljica u uljnoj kontinuiranoj fazi, što omogućava sporije oslobađanje antigena iz depoa i, prema tome, jači, dugotrajni imunitet u odnosu na emulzije tipa ulje u vodi.

[0056] "Adjuvans" u ovoj specifikaciji znači jedinjenje ili mešavina jedinjenja koje može/mogu da poveća/povećaju imunološki odgovor generisan peptidima i usmeri/usmere imunološki odgovor, na primer, ka CTL (citotoksični T limfocit) odgovoru. Mogu da deluju ili direktno na imunološki sistem, ili indirektno, omogućavajući pogodnu isporuku peptida imunološkom sistemu. U ovom otkrivanju, adjuvans je poželjno neki uljni adjuvans, koji obuhvata i naftino ulje i neki emulgator tipa voda u ulju. Takvi adjuvansi deluju takozvanim "efektom taloženja". Naftino ulje može biti, na primer, parafinsko ulje, neko biljno ulje, skvalen, skvalan ili mineralno ulje. Pogodni V/U emulgatori mogu biti odabrani od manid monooleata i sorbitan monooleata, na primer. Primeri odgovarajućih uljnih adjuvanasa su mešavina 5-20% manid monooleata sa 80-95% mineralnog ulja (Montanide<®>ISA 51 koju prodaje SEPPIC) ili skvalena (Montanide<®>ISA 720 koju prodaje SEPPIC) i slične mešavine. U nekom posebnom aspektu, adjuvans je mešavina mineralnog ulja i manid monooleata, posebno Montanide<®>ISA 51.

[0057] Adjuvans korišćen u ovom otkrivanju može alternativno, ili pored gorepomenutih uljnih adjuvanasa, da bude odabran od mikročestica i nanočestica, kao što su lipozomi i mikrosfere, od PLG, PLA, PLGA ili drugih prirodnih polimera kao što su želatin, kolagen i citozan. Drugi adjuvansi mogu da obuhvataju TLR ligande, ligande Toll-sličnih receptora (TLR3 i TLR9), stimulatore agonista IFN gena (STING), citokine kao što su GM-CSF i IL2, ugljene hidrate, bakterijske derivate, mineralne soli i komplekse za stimulaciju imuniteta (ISCOM).

[0058] Suspenzija i adjuvans se mešaju, prema ovom otkrivanju, pod uslovima niskog smicanja, pomoću uređaja za mešanje koji rotira brzinom obrtanja od 100 do 1000 o/min. Na primer, brzina obrtanja može biti obuhvaćena unutar opsega od 100 do 500 o/min, poželjno od 150 do 250 o/min, posebno može biti 200 o/min. Pod "niskim smicanjem" podrazumeva se da se mešanje ne izvodi pomoću rotor-stator uređaja, kao što su oni (ali bez ograničenja na njih) koje prodaje SILVERSON pod trgovačkim nazivom Silverson<®>L4RT ili Silverson<®>L5M ili koje prodaje IKA WERKE pod trgovačkim nazivom Ultra-Turrax<®>. Zatim, faza emulgovanja izvodi se pod uslovima niskog smicanja, posebno pri brzini obrtanja od 100 do 1000 o/min, poželjno tokom 2 do 20 minuta. U jednom aspektu, faza emulgovanja se izvodi pod uslovima niskog smicanja pri brzini obrtanja od 100 do 1000 o/min tokom 2 do 20 minuta. Poželjno, faza mešanja ili emulgovanja izvodi se, u ovom otkrivanju, pomoću lopataste mešalice ili turbine sa aksijalnim strujanjem. Na primer, mešalica može biti lopatasta mešalica i može da ima propeler sa lopaticama sa 4 koraka, posebno horizontalni propeler sa lopaticama sa 4 koraka. Ova vrsta uređaja obuhvata glavu za mešanje koja je propelerska mešalica sa aksijalnim strujanjem, a ne rotor sa radijalnim strujanjem kao što se može naći u rotor-stator uređajima. Prema tome, u jednom aspektu, mešalica je propelerska mešalica sa aksijalnim strujanjem. U nekom drugom aspektu, mešalica je turbinska mešalica sa radijalnim strujanjem. Štaviše, nije obuhvaćena u perforirani stator.

[0059] U jednom poželjnom aspektu, postupak za proizvodnju emulzije peptida, spremne za upotrebu, ne obuhvata nijednu fazu emulgovanja sa visokim smicanjem. Posebno, ne obuhvata nijednu fazu emulgovanja sa brzinom većom od 7000, 6000 ili 5000 o/min, poželjno nijednu fazu mešanja pri brzini većoj od 2000 o/min. Poželjno, postupak ne obuhvata nijednu fazu emulgovanja koja se izvodi mešalicom sa visokim smicanjem (Silverson<®>Verso) koja ima rotor-stator konfiguraciju.

[0060] U jednom poželjnom aspektu, postupak za proizvodnju emulzije peptida, spremne za upotrebu, ne obuhvata nijednu fazu mešanja sa visokim smicanjem. Posebno, ne obuhvata nijednu fazu mešanja pri brzini većoj od 7000, 6000 ili 5000 o/min, poželjno nijednu fazu mešanja pri brzini većoj od 2000 o/min. Poželjno, postupak ne obuhvata nijednu fazu mešanja koja se izvodi mešalicom sa visokim smicanjem (Silverson<®>Verso) koja ima rotor-stator konfiguraciju. Poželjno, da bi se dobila emulzija,

1

adjuvans se meša sa suspenzijom peptida, pod aseptičkim uslovima. Maseni odnos adjuvans: suspenzija može biti obuhvaćen u opsegu od 10:1 do 1:10, poželjno od 5:1 do 1:5, i poželjnije od 2:1 do 1:2, a još je poželjnije 1:1.

[0061] Ova faza mešanja ili emulgovanja poželjno se izvodi na temperaturi od 10 do 30°C, poželjno od 20 do 25°C, tokom 2 do 30 min, na primer od 5 do 15 minuta. Treba napomenuti da se trajanje mešanja računa od trenutka kada se celokupan adjuvans doda u komoru za mešanje, pri čemu se ovo dodavanje može izvoditi u fazama. Na primer, adjuvans se dodaje suspenziji tokom 30 sekundi do 3 minuta, poželjno tokom 1 do 2 minuta, pri brzini obrtanja u opsegu od 100 do 1000 o/min i poželjno od 100 do 500 o/min, poželjnije od 100 do 200 o/min. Zatim, postupak može da obuhvata fazu dodavanja adjuvansa u suspenziju u komori za mešanje, tokom perioda od 30 sekundi do 3 minuta na temperaturi od 10 do 30°C pri brzini mešanja u opsegu od 10 do 1000 o/min, fazu mešanja na 10-30°C tokom 2 do 20 minuta pri brzini od 100 do 1000 o/min i, opciono, fazu regeneracije emulzije peptida, pri čemu je zapremina emulzije peptida veća od 5L. Cela gorepomenuta faza mešanja ili deo nje se, poželjno, izvodi u inertnoj atmosferi, poželjno pod azotom.

[0062] Na taj način može se dobiti emulzija peptida spremna za upotrebu koja ima zapreminu veću od 5L, poželjno jednaku 10L ili veću. Može da se koristi za pripremu oko 8000 fiolica za injekciju. Emulzija peptida dobijena prema ovom postupku je fizički stabilna. Fizička stabilnost emulzije može se proceniti merenjem veličine kapljice vode nakon 3-mesečnog skladištenja na -20, 5 i 25°C, koja ne bi trebalo da se suštinski razlikuje od njihove veličine neposredno nakon proizvodnje emulzije. Veličina kapljica može da se izmeri laserskom difrakcijom.

[0063] Prema poželjnom aspektu, D50 emulzije je 10 ± 2 µm. Štaviše, emulzija ne treba da se deli na dva sloja pod istim uslovima skladištenja. Štaviše, peptidi su i hemijski stabilni i, takođe, biološki stabilni. Pod "hemijski stabilni" podrazumeva se, inter alia, da se peptidi suštinski ne razgrađuju, posebno oksidacijom i/ili deamidacijom, i da suštinski međusobno ne obrazuju agregate. Hemijska stabilnost peptida može se izmeriti tečnom hromatografijom u kombinaciji sa masenom spektrometrijom, nakon tromesečnog skladištenja na sobnoj temperaturi, kao što je prikazano u Primerima dole. Poželjno, količina svakog peptida u emulziji u opsegu je od 0.1 do 10 mg/ml, poželjno od 0.5 do 1 mg/ml i ne razlikuje se za više od 10% od količine koja je korišćena u pripremanju emulzije. Njihova biološka stabilnost može se proceniti merenjem imunogenosti peptida, na primer, transgeni in vivo test potencije.

[0064] Formulacija, spremna za upotrebu, ovog otkrivanja je, prema tome, u skladu sa industrijskim propisima za doslednu proizvodnju i kontrolu kvaliteta proizvoda vakcine.

[0065] Emulzija može da se čuva na temperaturi od 2 do 8°C ili čak zamrznuta nakon proizvodnje, a dovodi se na sobnu temperaturu pre upotrebe. Ova emulzija može da se kondicionira u sudu zapremine od 1 do 50ml.

[0066] Jedna od prednosti emulzije, spremne za upotrebu, ovog otkrivanja je da se ova emulzija može zamrznuti i odmrznuti, posebno bez bilo kakvog ili sa ograničenim uticajem na strukturu emulzije. Prema tome, ovo otkrivanje se odnosi na emulziju spremnu za upotrebu prema ovom otkrivanju pogodnu za zamrzavanje i odmrzavanje, tj. uz održavanje ili čuvanje emulzije.

[0067] Može se dati parenteralno kao vakcina spremna za upotrebu da bi se izazvali T-limfocitni odgovori na sve epitope koji odgovaraju korišćenim peptidima. Ova vakcina može da se koristi u lečenju različitih kancera. Kanceri mogu takođe da budu odabrani od kancera pluća kao što je NSCLC (kancer nemalih ćelija pluća) i kancer malih ćelija pluća, melanoma, mezotelioma, kancera dojke, primarnih kancera na mozgu, metastaze kancera na mozgu, jajnika, karcinoma materice, posebno karcinoma tela materice i/ili karcinoma grlića materice, glave i vrata, kolona, kolorektalnog, gastrointestinalnog, renalnog kancera, sarkoma, tumora germinativnih ćelija, leukemije, limfoma, kancera testisa, kancera pankreasa i kancera bešike. Posebno, kancer može biti kancer kolona i karcinom nemalih ćelija pluća (NSCLC), posebno kod ljudi koji su u stadijumu IIIB ili IV i/ili koji eksprimiraju HLA-A2 receptor.

Alternativno, kanceri mogu takođe biti odabrani od kancera pankreasa, kancera bešike ili kancera koji eksprimira antigene tumora ciljane peptidima, posebno CEA, p53, HER-2/neu, MAGE-2 i MAGE-3.

Pacijenti koji reaguju na lečenje emulzijom pripremljenoj prema ovom otkrivanju mogu se identifikovati HLA-2 biomarkerom izmerenim u uzorcima krvi različitim postupcima kao što je RT-PCR.

[0068] Proizvod spreman za upotrebu može da se koristi za lečenje kancera sam ili u kombinaciji sa nekom drugom terapijom, posebno hemoterapijama, ciljanim terapijama ili nekim drugim imunoterapijama kao što su inhibitori kontrolnih tačaka.

[0069] Na primer, hemoterapija može da bude odabrana od cisplatina, karboplatina, ciklofosfamida, etopozida, tenipozida, mitomicina, irinotekana, vinorelbina, etopozida, ifosfamida, temozolomida, fluorouracila (5FU), docetaksela, pemetrekseda, navelbina, lekova koji ciljaju rast krvnih sudova tumora (VEGF) kao što su bevacizumab, ramucirumab; prednizon; inhibitora tirozin kinaze koji ciljaju EGFR kao što je gefitinib, erlotinib, afatinib ; ALK inhibitora kao što je crizotinib; ceritiniba i bilo koje njihove kombinacije.

[0070] U nekom poželjnom aspektu, vakcina spremna za upotrebu ovog otkrivanja koristi se u kombinaciji sa inhibitorom kontrolne tačke, posebno CTLA-4 inhibitorom i/ili PD-1 ili PD-L1 inhibitorom; IDO inhibitorima. Lečenje inhibitorom kontrolne tačke može se izvesti pre, istovremeno ili nakon lečenja vakcinom spremnom za upotrebu kao što je ovde opisana.

1

[0071] Ovo otkrivanje odnosi se na komplet ili proizvod koji obuhvata (a) terapeutski efektivnu količinu vakcine spremne za upotrebu kao što je opisana ovde; i (b) inhibitor kontrolne tačke, poželjno CTLA-4 inhibitor i/ili PD-1 ili PD-L1 inhibitor, kao kombinovani preparat za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu, posebno u lečenju kancera.

[0072] U nekom poželjnom aspektu, lečenje inhibitorom kontrolne tačke izvodi se nakon lečenja vakcinom spremnom za upotrebu kao što je ovde opisana.

[0073] Nekoliko PD-1/PD-L1 inhibitora je već dostupno ili je u toku klinički razvoj. Na primer, PD-1/PD-L1 inhibitori mogu biti odabrani sa neiscrpnog spiska koji uključuje pembrolizumab (Merk), nivolumab (Bristol Myers Squibb), pidilizumab (Cure Tech), BMS936559 (Bristol Myers Squibb), MEDI4736 (Astra Zeneca), AMP-224 (Astra Zeneca), AMP-514 (Astra Zeneca), MPDL328OA (Roche), avelumab (takođe poznat kao MSB0010718C od Merck KgA Serono /Pfizer) . Na primer, PD-1/PD-L1 inhibitori mogu biti odabrani od onih opisanih u WO2013/079174,

[0074] Na primer, CTLA-4 inhibitori mogu biti odabrani sa neiscrpnog spiska koji uključuje Tremelimumab (Pfizer Medimmune) i ipilimumab (BMS).

Magistralna emulzija

[0075] Ovo otkrivanje takođe se odnosi na postupak za pripremanje emulzije za parenteralno davanje, koji obuhvata pripremanje suspenzije prema ovom otkrivanju, praćeno mešanjem pomenute suspenzije sa nekim emulgatorom tipa voda u ulju.

[0076] Ovo otkrivanje dalje se odnosi na komplet koji obuhvata sterilan kontejner koji obuhvata suspenziju pripremljenu u postupku prema ovom otkrivanju, kontejner, kao što je fiolica, koji obuhvata emulgator tipa voda u ulju i, opciono, konektor. Primeri pogodnih emulgatora su kao što su prethodno opisani i poželjno su odabrani od manid monooleata, sorbitan monooleata i adjuvanasa koji se sastoje od mešavina 5-20% manid monooleata ili sorbitan monooleata sa 80-95% mineralnog ulja (nepotpun Freund-ov adjuvans, Montanide<®>ISA 51 i NH2 emulzija) ili skvalena (Montanide<®>ISA 720). U nekom poželjnom aspektu, emulgator obuhvata manid monooleat (kao što je Montanide<®>ISA 51). Komplet može dalje da obuhvata konektor.

[0077] Suspenzija dobijena kao što je prethodno opisano može zatim da se meša sa nekim emulgatorom tipa voda u ulju da bi se dobila emulzija tipa voda u ulju, za koju se smatra da pomaže u prezentaciji peptida dendritskim ćelijama. U ovoj vrsti emulzije, vodena faza koja sadrži peptide je zarobljena u obliku kapljica u uljnoj kontinuiranoj fazi, što omogućava sporije oslobađanje antigena iz depoa i, prema tome, jači, dugotrajni imunitet u odnosu na emulzije tipa ulje u vodi. Primeri takvih emulgatora su manid monooleat, sorbitan monooleat i adjuvansi koji se sastoje od mešavina 5-20% manid monooleata ili

1

sorbitan monooleata sa 80-95% mineralnog ulja (nepotpuni Freund-ov adjuvans, Montanide<®>ISA 51 i NH2 emulzija) ili skvalena (Montanide<®>ISA 720). Prema poželjnom aspektu ovog otkrivanja, emulgator je mešavina manid monooleata (8-12%) sa mineralnim uljem (88-92%) koja može da se nabavi od SEPPIC pod trgovačkim nazivom Montanide<®>ISA 51. Pretpostavlja se da se mineralno ulje samo delimično metaboliše, što ga čini efikasnijim u indukovanju imunološkog odgovora u odnosu na adjuvanse na bazi nemineralnog ulja, posebno u slučaju slabih imunogena. Obično, da bi se dobila emulzija, jedna zapremina bilo kojeg od gornjih emulgatora meša se sa jednom zapreminom suspenzije peptida, pod aseptičkim uslovima.

[0078] Dobijena emulzija može biti formulacija "pripremljena pored kreveta" koja se priprema magistralno, neposredno pre lečenja pacijenta. Određenije, emulzija se može pripremiti magistralno korišćenjem konektora povezanog sa špricem koji sadrži emulziju i drugim špricem koji sadrži emulgator, prema proverenom postupku: 20 sporih ciklusa (9s po ciklusu - 180s) praćeno sa 40 brzih ciklusa (20s). Emulgator i suspenzija poželjno se čuvaju na temperaturi ispod sobne temperature i dovode se do sobne temperature neposredno pre mešanja. Dobijena emulzija može se ubrizgati pacijentu u roku od 8 sati od pripreme emulzije, a poželjno u roku od 4 sata. Emulzija se može dati parenteralno i koristiti kao vakcina da bi se izazvali T-limfocitni odgovori na sve epitope koji odgovaraju korišćenim peptidima. Ova vakcina može da se koristi u lečenju različitih kancera, posebno kancera kolona i karcinoma nemalih ćelija pluća (NSCLC), posebno kod ljudi koji su u stadijumu IIIB ili IV i/ili koji eksprimiraju HLA-A2 receptor. Kanceri mogu takođe da budu odabrani od kancera pankreasa, kancera bešike ili kancera koji su eksprimirali tumorske antigene ciljane od strane peptida, posebno CEA, p53, HER-2/neu, MAGE-2 i MAGE-3.

Proizvod spreman za upotrebu može da se koristi za lečenje kancera samog ili u kombinaciji sa nekom drugom terapijom, posebno hemoterapijama, ciljanim terapijama ili drugim imunoterapijama kao što su inhibitori kontrolnih tačaka, posebno kao što je prethodno opisano.

[0079] Ovaj pronalazak bolje će se razumeti u svetlu sledećih primera koji su dati samo u ilustrativne svrhe.

PRIMERI

Primer 1: Pripremanje suspenzije prema ovom otkrivanju

[0080] Deset peptida je sintetisano od strane PolyPeptid (San Diego, CA) pomoću standardne hemije na čvrstoj fazi sa Boc ili Fmoc:

aKXVAAWTLKAAa (SEQ ID NO:1) = MPS-7,

SMPPPGTRV (SEQ ID NO:5) = MPS-103,

IMIGHLVGV (SEQ ID NO:9) = MPS-214,

1

KVAEIVHFL (SEQ ID NO:10) = MPS-215,

YLSGADLNL (SEQ ID NO:8) = MPS-200,

KLBPVQLWV (SEQ ID NO:6) = MPS-102,

LLTFWNPPV (SEQ ID NO:4) = MPS-213,

RLLQETELV (SEQ ID NO:2) = MPS-112,

YLQLVFGIEV (SEQ ID NO:3) = MPS-106, i

KVFGSLAFV (SEQ ID NO:7) = MPS-216.

[0081] Ovi peptidi su prečišćeni pomoću HPLC i njihovi identiteti su potvrđeni masenom spektrometrijom.

[0082] Tri rastvora koja su pripremljena opisana su u Tabeli 1.

Tabela 1

[0083] Rastvori 1 i 2 pripremljeni su na sobnoj temperaturi pomoću vrtložnog mešanja i/ili sonikacije za nekoliko minuta, dok je rastvor 3 pripremljen zagrevanjem na 37°C pomoću vrtložnog mešanja. Ovi rastvori zatim su čuvani na 2-8°C tokom do četiri sata da bi se ocenila njihova razgradnja tokom potencijalnog vremena zadržavanja u postupku njihove industrijske proizvodnje. Njihova razgradnja je ocenjena tečnom hromatografijom zajedno sa UV detekcijom i masenom spektrometrijom. Rezultati izvedene analize rezimirani su u Tabeli 2.

1

Tabela 2

[0084] Gorepomenuti rastvori su, prema tome, čuvani tokom manje od 4 sata na 2-8°C, zatim sterilno filtrirani i umešani zajedno u A:B:C masenom odnosu od 2.9:3.6:1, da bi se dobila suspenzija čiji je pH podešen na 7 dodavanjem u nju 0.2 ml 62.5 mM rastvora natrijumfosfata i 0.5 M NaOH rastvora.

[0085] Suspenzija je čuvana na -20°C u sterilnoj fiolici.

Primer 2: Uporedni eksperiment

[0086] Pripremljeni su rastvori peptida koji su bili identični rastvoru 2 opisanom u Primeru 1, osim što je količina natrijumhidroksida varirana od 0.10 M (kao što je opisano u WO 2004/094454) do 0.013 M.

[0087] Ocenjena je sposobnost ovih sredina da rastvore peptide pri čemu je sprečena njihova razgradnja nakon dvočasovnog čuvanja na 2-8°C. Ovi rezultati su rezimirani u Tabeli 3.

Tabela 3

[0088] Iz ove tabele, može se dobiti da pH od 12.4 ili ispod ne omogućava odgovarajuće rastvaranje peptida, dok pH od 13 ili iznad dovodi do razgradnje jednog od peptida. Izvedena je analiza masenom spektroskopijom da bi se identifikovali proizvodi razgradnje koji su obrazovani. Utvrđeno je da su Asn ili Gln bočni lanci hidrolizovani do Asp i Glu, tim redom.

[0089] Ovaj eksperiment demonstrira da pH rastvora 2 treba da se podesi na 12.5-12.9.

1

Primer 3: Stabilnost suspenzije

[0090] Postavljen je dodatni test da bi se procenila moguća agregacija peptida kao što je opisano u nastavku. Ovaj postupak je mogao da prati agregaciju peptida i osetljiv je, specifičan i precizan. Pogodan je za praćenje strukturnih i masenih modifikacija ili varijanti koje se mogu javiti tokom proizvodnje ili tokom skladištenja. Tečna hromatografija-masena spektroskopija (LC-UV/MS) izvedena je da bi se potvrdio identitet peptida i odsustvo kovalentnih veza između njih. Postupak je razvijen da bi se proverilo odsustvo agregacije između peptida uprkos prisustvu taloga nekih peptida. Cilj je bio da se odredi da li se mogu ustanoviti bilo koje kovalentne veze između peptida sadržanih u suspenziji iz Primera 1 tokom 9 meseci skladištenja u različitim uslovima: -20°C; 5°C i 25°C.

[0091] Svaki peptid je identifikovan svojim vremenom zadržavanja u UV spektru i masom.

Uslovi hromatografije

[0092]

Kolona: Advance Bio Peptide Mapping LC kolona, 2.1<∗>250 mm, 2.7µm, C18, 120Å, Agilent reference n°651750-902

Detekcija: 215 nm i 280 nm

Protok: 0.3 ml/min

Injekciona zapremina: 5µl

Vreme izvođenja: 100 min

Temperatura kolone: 35°C ± 2°C

Temperatura uzorka: 5°C

Ispiranje igle: 0.1% Trifluorosirćetna kiselina (TFA) u dimetilsulfoksidu (DMSO)

Mobilna faza: Eluent A: 0.2% TFA u 5% acetonitrilu

Eluent B: 0.2% TFA u 95% acetonitrilu

Tabela gradijenta:

2

Pripremanje rastvora uzorka

[0093] Prenos sadržaja 1 fiolice (~ 1ml) koja sadrži suspenziju iz Primera 1 u volumetrijsku bocu od 10 ml i dopuna do zapremine sa 0.1% TFA u DMSO. Fiolica je izmerena pre i nakon uzorkovanja da bi se odredila precizna masa uzorka.

[0094] Suspenzija iz Primera 1 je analizirana pomoću postupka tečne hromatografije/masene spektroskopije (LC/MS).

[0095] Dobijeni rezultati pokazuju da su u svim uslovima skladištenja, svi peptidi detektovani. Nije bilo značajnih razlika između hromatograma, bez obzira na uslove skladištenja. Relativna područja UV-pikova nisu se promenila. Potpuno MS skeniranje nije detektovalo dodatne mase, uključujući potencijalne mase pri velikoj molekulskoj masi koje bi odgovarale kovalentnim agregatima. Ovo znači da nisu uspostavljene kovalentne veze između peptida tokom ova 3 meseca skladištenja.

[0096] Rezultat ove analize je da nisu primećene kovalentne veze između peptida u suspenziji, što bi naknadno dovelo do hemijske agregacije.

[0097] Nakon tri meseca pod tri uslova skladištenja (-20°C, 5°C i 25°C), primećena vremena zadržavanja i molekulska masa (MW) strogo odgovaraju peptidima aktivnih sastojaka i ostaju u okviru nivoa specifikacije koji je određen pri puštanju šarže. Rezultati ukazuju na odsustvo agregacije i da nema pojave kovalentnih veza između peptida u suspenziji tokom proizvodnje i skladištenja.

Primer 4: pripremanje magistralne V/U emulzije prema ovom otkrivanju

[0098] Da bi se pripremio injektibilni klinički proizvod, emulzija tipa voda u ulju je obrazovana mešanjem suspenzije iz Primera 1 sa mešavinom za emulgovanje tipa voda u ulju (Montanide<®>ISA 51 nabavljen od SEPPIC, čuvan u mraku na 2-8°C u fiolici) u masenom odnosu od 1:1, što odgovara 0.9 ml suspenzije peptida i 1.1 ml emulgatora. Određenije, suspenzija i emulgator dovedeni su na sobnu temperaturu neposredno pre mešanja i preneti su svaki posebnim špricem. Emulzija je pripremljena magistralno pomoću plastičnog konektora povezanog na ove špriceve. Klipovi špriceva su naizmenično potiskivani lagano 20 puta svaki, zatim 40 puta svaki velikom brzinom. Iz svakog od špriceva, 1 ml ove emulzije mogao je da se ubrizga u pacijenta subkutano.

Primer 5: Pripremanje V/U emulzije spremne za upotrebu prema ovom otkrivanju

[0099] Da bi se pripremio injektibilni proizvod za kliničku isporuku, emulzija tipa voda u ulju je obrazovana mešanjem suspenzije iz Primera 1 sa uljnim adjuvansom (Montanide<®>ISA 51 nabavljen od SEPPIC) u masenom odnosu od 1:1. Da bi se pripremila emulzija, vreća za mešanje uređaja prvo je naduvana azotom da bi se obezbedio sloj inertnog gasa u radu.5200 g emulgatora je filtrirano, zatim preneto pod aseptičkim uslovima u komoru za mešanje Allegro<®>mešalice koja obuhvata turbinu sa aksijalnim strujanjem. Brzina obrtanja propelera podešena je na 200 o/min, zatim je 5200 g prethodno opisane suspenzije lagano dodato (u roku od 1-2 min) u komoru za mešanje, pod aseptičkim uslovima. Mešanje je nastavljeno tokom 5 minuta.

[0100] Dobijena je bela emulzija bez vidljivih čestica, koja je imala viskozitet od 280 mPa.s i mogla je lako da se prenese kroz iglu od 26 Ga iz šprica od 1mL.

Primer 6: Pripremanje emulzije korišćenjem različitih vremena mešanja

[0101] Emulzije prema ovom otkrivanju pripremljene su kao što je opisano u Primeru 5, korišćenjem različitih vremena mešanja. Početne koncentracije različitih peptida navedene su u tabelama u nastavku.

[0102] Iz prethodnih tabela, može se izvesti da koncentracija različitih peptida ostaje u okviru opsega 0.49-0.59 mg/ml, bez obzira na vreme mešanja. Emulzija može, prema tome, da se pripremi kratkim vremenom mešanja samo od 5 minuta.

Primer 7: Hemijska stabilnost emulzije

[0103] Hemijska stabilnost peptida sadržanih u emulziji pripremljenoj prema Primeru 5 ocenjena je pomoću sledećeg postupka.

[0104] Uzorak od 0.9g emulzije iz Primera 5 je precizno izmeren i umešan sa 0.1% TFA u DMSO da bi se napunila volumetrijska boca od 5mL. Mešavina je zatim vorteksovana tokom 2 minuta i centrifugirana

2

tokom 7 minuta pri 4000 o/min. Donji sloj je zatim analiziran tečnom hromatografijom/masenom spektroskopijom (LC/MS) korišćenjem sledećih uslova hromatografije:

Kolona: Advance Bio Peptide Mapping LC kolona, 2.1 × 250 mm, 2.7µm, C18, 120Å, Agilent<®>reference n°651750-902 ili ekvivalentna

Detekcija: 215 nm i 280 nm

Protok: 0.3 ml/min

Injekciona zapremina: 5µl

Vreme izvođenja: 100 min

Temperatura kolone: 35°C ± 2°C

Temperatura uzorka: 5°C

Ispiranje igle: 0.1% Trifluorosirćetna kiselina (TFA) u dimetilsulfoksidu (DMSO)

Mobilna faza: Eluent A: 0.2% TFA u 5% acetonitrilu

Eluent B: 0.2% TFA u 95% acetonitrilu

Tabela gradijenta:

[0105] Standardni rastvor je pripremljen prenošenjem 0.9 mL šaržne suspenzije opisane u Primeru 1 sa 1.1mL Montanide ISA 51 u volumetrijsku bocu od 10.0mL, zatim vorteksovanjem i centrifugiranjem mešavine kao što je prethodno opisano. Tako dobijen donji sloj analiziran je u istim uslovima kao gore.

[0106] Koncentracija svakog peptida izražena je u mg/g korišćenjem formule:

u kojoj:

A : je područje pika svakog peptida u rastvoru uzorka

S : je područje pika svakog peptida u standardnom rastvoru

W: je masa uzorka izražena u g

[0107] Rezultati dobijeni na uzorcima emulzije iz Primera 5 čuvani u različitim uslovima, pokazuju da su u svim uslovima skladištenja svi peptidi detektovani bez značajnih razlika između hromatograma, što znači da nisu primećene kovalentne veze između peptida u emulziji. Štaviše, relativna područja UV-pika nisu promenjena. Potpuno MS skeniranje nije detektovalo dodatne mase, uključujući potencijalne mase pri velikoj molekulskoj masi. Ovo znači da nisu uspostavljene kovalentne veze ili agregati između peptida u ovim različitim uslovima skladištenja.

[0108] Posebno, nakon jednog meseca pod tri uslova skladištenja (-20°C, 5°C i 25°C), uočena vremena zadržavanja i molekulska masa (MW) odgovaraju peptidima aktivnih sastojaka i ostaju u okviru nivoa specifikacije koji je određen pri puštanju šarže, to jest ±10%, kao što je prikazano u nastavku:

Primer 8: Fizička stabilnost emulzije

[0109] Veličine kapljica različitih uzoraka emulzije pripremljene kao što je opisano u Primeru 5 određene su laserskom difrakcijom korišćenjem granulometra (Malvern mastersizer 3000E optički sistem). Ovi

2

uzorci prikupljeni su iz različitih područja mešalice. Rezultati su izraženi kao najveća veličina od x% kapljica, tj. Dx. Rezimirani su u tabeli ispod.

[0110] Ovaj eksperiment pokazuje da su veličine kapljica homogene po čitavom mikseru, sa D50 od oko 10 µm.

[0111] Variranje u veličinama kapljica izmereno je nakon jednomesečnog skladištenja u različitim uslovima. Kao što je prikazano u tabeli ispod, veličina kapljica ostala je suštinski konstantna:

Primer 9: Imunogenost

[0112] Neki peptidi identifikovani su kao delimično ili potpuno istaloženi u suspenziji pripremljenoj kao što je opisano u Primeru 1:

[0113] Imunogenost svakog peptida koji ulazi u kombinaciju čak i u slabo rastvorljivom ili nerastvorljivom stanju je testirana in vivo na HLA A2.1/k transgenim miševima.

[0114] CTL (citotoksični T limfocit) i HLT (pomoćni T limfocit) indukcija Elispot testom izvedena je da bi se izmerila proizvodnja IFN gama, tačke su prebrojane izradom kompjuterski potpomognute analize.

2

[0115] Neto tačke/ 10<6>CD8+ ćelija (CTL) ili CD4+ ćelija (HTL) izračunate su kao (broj tačaka u slučaju relevantnog peptida)- (broj tačaka sa irelevantnim peptidom) × 2.5.

[0116] Podaci prikupljeni iz 6 nezavisnih eksperimenata pokazali su da je kombinacija bila imunogena sa indukcijom CTL odgovora.

[0117] Primećen opseg bio je 50 do 200 standardnih jedinica u slučaju veoma rastvorljivog peptida kao što je MPS 214.

[0118] Neočekivano, isti opseg (50 do 200 SJ) odgovora primećen je sa 3 slabo rastvorljiva peptida [MPS-215 (KVAEIVHFL) sa 56% rastvorljivosti; MPS-216 (KVFGSLAFV (SEQ ID NO:7)) sa 33% rastvorljivosti; MPS-106 (YLQLVFGIEV) 0% rastvorljivosti].

[0119] Rastvorljivi, nerastvorljivi ili slabo rastvorljivi epitopi u novoj emulziji mogli su da indukuju jake CTL odgovore. Stanje rastvorljivosti slabo rastvorljivih peptida u krajnjoj emulziji ne utiče na in vivo imunogena svojstva kod HLA A2 transgenog modela.

Primer 10: Uporedni eksperiment

[0120] Suspenzija pripremljena kao što je opisano u Primeru 1 umešana je sa istim adjuvansom, u istom odnosu, osim što je mešanje izvedeno pomoću mešalice sa visokim smicanjem (Silverson<®>Verso) koja ima rotor-stator konfiguraciju. Korišćene su brzine mešanja od 2000 i 8000 o/min tokom 15 min i 2 min, tim redom: dobijen je veoma gust krem koji nije mogao biti korišćen kao injektibilni proizvod. Druge šarže dobijene istom mešalicom pri 5000 i 8000 o/min dovele su do razgradnje peptida. Određenije, 8.5% oksidacije peptida SMPPPGTRV (SEQ ID NO: 5) primećeno je nakon 6-nedeljnog skladištenja na 4°C i dalje 2% oksidacije na -20°C. Štaviše, 16.5% oksidacije primećeno je za peptid IMIGHLVGV (SEQ ID NO:9) nakon 6-nedeljnog skladištenja na 4°C i dalje 4% oksidacije na -20°C.

[0121] Ovaj eksperiment demonstrira da mešalica sa visokim smicanjem ne omogućava pripremanje injektibilne emulzije za stabilnu isporuku peptida.

2

2

2

1

2

Claims (11)

Patentni zahtevi

1. Postupak za proizvodnju emulzije peptida, spremne za upotrebu, u industrijskim razmerama, koji obuhvata fazu emulgovanja suspenzije najmanje dva peptida pod uslovima niskog smicanja, pri brzini obrtanja između 100 i 1000 o/min, tokom 2 do 20 minuta, sa najmanje jednim adjuvansom, pri čemu taj postupak ne obuhvata nijednu fazu mešanja pri velikoj brzini, posebno iznad 7000 o/min.

2. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što peptidi obuhvataju najmanje jedan rastvorljiv peptid i najmanje jedan nerastvorljiv peptid.

3. Postupak prema zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što su peptidi odabrani iz grupe koju čine: peptid KVFGSLAFV (SEQ ID NO:7), peptid YLSGADLNL (SEQ ID NO:8), peptid KLBPVQLWV gde B označava αaminoizobuternu kiselinu (SEQ ID NO:6), peptid SMPPPGTRV (SEQ ID NO:5), peptid IMIGHLVGV (SEQ ID NO:9), peptid LLTFWNPPV (SEQ ID NO:4), peptid RLLQETELV (SEQ ID NO:2), peptid aKXVAAWTLKAAa gde X i a redom označavaju cikloheksilalanin i d-alanin (SEQ ID NO:1), peptid YLQLVFGIEV (SEQ ID NO:3) i peptid KVAEIVHFL (SEQ ID NO: 10).

4. Postupak prema zahtevu 3, naznačen time, što suspenzija obuhvata kombinaciju peptida KVFGSLAFV (SEQ ID NO:7), peptida YLSGADLNL (SEQ ID NO:8), peptida KLBPVQLWV (SEQ ID NO:6), peptida SMPPPGTRV (SEQ ID NO:5), peptida IMIGHLVGV (SEQ ID NO:9), peptida LLTFWNPPV (SEQ ID NO:4), peptida RLLQETELV (SEQ ID NO:2), peptida aKXVAAWTLKAAa gde X i a redom označavaju cikloheksilalanin i d-alanin (SEQ ID NO:1), peptida YLQLVFGIEV (SEQ ID NO:3) i peptida KVAEIVHFL (SEQ ID NO: 10).

5. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 4, naznačen time, što se adjuvans sastoji od mešavine naftinog ulja sa nekim emulgatorom tipa voda u ulju.

6. Postupak prema zahtevu 5, naznačen time, što je naftino ulje odabrano od parafinskog ulja, nekog biljnog ulja, skvalena, skvalana ili mineralnog ulja, dok je emulgator tipa voda u ulju odabran od manid monooleata i sorbitan monooleata.

4

7. Postupak prema zahtevu 5 ili 6, naznačen time, što maseni odnos adjuvansa prema suspenziji peptida iznosi od 10:1 do 1:10, poželjno od 5:1 do 1:5, a poželjnije od 2:1 do 1:2, i još je poželjnije 1:1.

8. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 7, naznačen time, što se cela faza mešanja ili deo nje izvodi u inertnoj atmosferi, poželjno pod azotom.

9. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 8, naznačen time, što je zapremina emulzije veća od 5L, poželjno jednaka 10L ili veća.

10. Postupak prema bilo kom od zahteva 3 do 8, naznačen time, što se suspenzija peptida priprema u postupku koji obuhvata:

a) pripremanje najmanje tri različita rastvora A, B i C, pri čemu:

• rastvor A je kisela vodena sredina i obuhvata peptid aKXVAAWTLKAAa (SEQ ID NO:1) gde X i a redom označavaju cikloheksilalanin i d-alanin (SEQ ID NO:1),

• rastvor B je bazna vodena sredina sa pH između 12.5 i 12.9 pre dodavanja bilo kog peptida u nju, i rastvor B obuhvata peptid YLSGADLNL (SEQ ID NO:8),

• rastvor C je DMSO i obuhvata peptid KVFGSLAFV (SEQ ID NO:7), i

• rastvori A i/ili B dalje obuhvataju najmanje tri dodatna peptida odabrana od: KLBPVQLWV gde B označava α-aminoizobuternu kiselinu (SEQ ID NO:6), SMPPPGTRV (SEQ ID NO:5), IMIGHLVGV (SEQ ID NO:9), LLTFWNPPV (SEQ ID NO:4), KVAEIVHFL (SEQ ID NO:10), RLLQETELV (SEQ ID NO:2) i YLQLVFGIEV (SEQ ID NO:3);

b) mešanje pomenutih rastvora da bi se obrazovala suspenzija, i

c) podešavanje pH pomenute suspenzije do oko 7.

11. Postupak prema zahtevu 10, pri čemu rastvor A obuhvata aKXVAAWTLKAAa (SEQ ID NO:1), SMPPPGTRV (SEQ ID NO:5), IMIGHLVGV (SEQ ID NO:9) i KVAEIVHFL (SEQ ID NO:10), dok rastvor B obuhvata YLSGADLNL (SEQ ID NO:8), KLBPVQLWV (SEQ ID NO:6), LLTFWNPPV (SEQ ID NO:4), RLLQETELV (SEQ ID NO:2) i YLQLVFGIEV (SEQ ID NO:3).

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5