ES2913324T3

ES2913324T3 - DIVA de Ehrlichia canis (que diferencia animales infectados de vacunados)

Info

Publication number: ES2913324T3
Application number: ES19150904T
Authority: ES
Inventors: Eugene Krah; Melissa Beall; Thomas O'connor; Ramaswany Chandrashekar
Original assignee: Idexx Laboratories Inc
Current assignee: Idexx Laboratories Inc
Priority date: 2007-10-31
Filing date: 2008-10-31
Publication date: 2022-06-01
Anticipated expiration: 2028-10-31
Also published as: BRPI0819349B1; ES2724806T3; US7888054B2; JP2015038476A; EP3527221A1; EP2664344B1; EP3527221B1; EP2215477A2; CA2703989C; JP2011504582A; US20090110691A1; EP2215477B1; MX2010004735A; KR20160003306A; CA2703989A1; KR101621038B1; EP2215477A4; ES2720363T3; JP5759724B2; WO2009059170A9

Abstract

Un método para determinar la presencia de un anticuerpo o sus fragmentos de unión al antígeno que son específicos para E. canis, en una muestra de prueba canina o humana, en donde la muestra de prueba se selecciona del grupo que consiste en plasma, sangre, suero, saliva, orina, heces fecales, exudado de heridas, líquido cefalorraquídeo (CSF), semen, esputo, extractos de tejidos y extractos celulares, que comprende: (a) poner en contacto con la muestra de prueba con uno o más polipéptidos purificados que consisten en las SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32; o uno o más polipéptidos purificados que tienen al menos 95 % de identidad a las SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32; en donde el uno o más polipéptidos purificados se unen específicamente a un anticuerpo que es específico para E. canis, en condiciones adecuadas para la unión específica del uno o más polipéptidos purificados a los anticuerpos o sus fragmentos de unión al antígeno; y (b) detectar la presencia de unión específica del uno o más polipéptidos purificados a los anticuerpos o sus fragmentos de unión al antígeno; en donde la presencia de unión específica del uno o más polipéptidos purificados a los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno indica la presencia de los anticuerpos o sus fragmentos de unión al antígeno específicos para E. canis en la muestra de prueba.

Description

DESCRIPCIÓN

DIVA de Ehrlichia canis (que diferencia animales infectados de vacunados)

La presente invención se refiere a métodos para determinar la presencia de un anticuerpo o sus fragmentos de unión al antígeno que son específicos para Ehrlichia canis, composiciones usadas en dichos métodos, y métodos relacionados para monitorear el tratamiento de una infección por E. canis.

Los Ehrlichia son patógenos intracelulares obligatorios que infectan los glóbulos blancos circulantes en los hospederos mamíferos. Ehrlichia canis puede infectar a caninos y humanos y causar ehrlichiosis monocítica canina (CME) y ehrlichiosis monocítica humana (HME), respectivamente. La enfermedad canina se caracteriza por fiebre, linfadenopatía, pérdida de peso y pancitopenia. En los seres humanos, la enfermedad se caracteriza por fiebre, dolor de cabeza, mialgia y leucopenia. La detección y el tratamiento tempranos son importantes para el tratamiento de la ehrlichiosis canina y humana.

En este contexto, los documentos NO US 2006/0234322 A1 y WO 2008/043000 A2 describen los antígenos de E. canis que pueden usarse para diferenciar a los infectados de, por ejemplo, los animales vacunados.

La presente invención se refiere a las modalidades como se definen en las reivindicaciones adjuntas.

Además, en la presente descripción se describe un método para distinguir entre los animales (a) que se infectaron con Ehrlichia canis; y (b) los animales que no se infectaron con E. canis independientemente de si el animal se vacunó contra E. canis. El método comprende

(a) poner en contacto una muestra biológica de un animal con uno o más primeros polipéptidos purificados que no se unen específicamente a anticuerpos que son un componente de la respuesta inmunitaria del animal a una vacuna de E. canis; en donde el uno o más primeros polipéptidos purificados tienen al menos 95 % de identidad con las SEQ ID NO:22-33 y en donde el uno o más primeros polipéptidos de E. canis purificados se unen específicamente a un anticuerpo que es específico para E. canis; y

(b) detectar si los anticuerpos en la muestra biológica se unen específicamente al uno o más primeros polipéptidos de E. canis purificados.

Si los anticuerpos en la muestra biológica se unen específicamente al uno o más primeros polipéptidos purificados, entonces el animal está infectado con E. canis. El uno o más primeros polipéptidos purificados pueden tener de aproximadamente 15 a aproximadamente 75 aminoácidos de longitud. El uno o más primeros polipéptidos purificados pueden unirse a una secuencia de aminoácidos heteróloga, un reactivo indicador, un separador de aminoácidos, un enlazador de aminoácidos, una secuencia señal, una secuencia de transferencia de parada, un dominio de transmembrana, un ligando para purificación de proteínas, o una de sus combinaciones. El método puede comprender además determinar si los anticuerpos en la muestra biológica se unen específicamente a uno o más segundos polipéptidos de E. canis purificados que son un elemento de una vacuna contra E. canis. Si los anticuerpos en la muestra biológica se unen específicamente al uno o más primeros polipéptidos de E. canis purificados y se unen específicamente al uno o más segundos polipéptidos de E. canis purificados, entonces el animal se infectó con E. canis y se desconoce el estado de vacunación contra E. canis. Si los anticuerpos de la muestra no se unen específicamente al uno o más primeros polipéptidos de E. canis purificados y se unen específicamente al uno o más segundos polipéptidos de E. canis purificados, entonces el animal no se infectó con E. canis y se vacunó contra E. canis. Si los anticuerpos en la muestra no se unen específicamente al uno o más primeros polipéptidos purificados y no se unen específicamente al uno o más segundos polipéptidos purificados, entonces el animal no se vacunó contra E. canis y no se infectó por E. canis.

También se describe en la presente descripción un método para determinar el estado de vacunación e infección de un animal referente a E. canis. El método comprende:

(a) poner contacto una muestra biológica de un animal con uno o más primeros polipéptidos purificados que no se unen específicamente a anticuerpos que son un componente de la respuesta inmunitaria del animal a una vacuna de E. canis, en donde el uno o más primeros polipéptidos purificados tienen al menos 95 % de identidad con las SEQ ID NO:22-33 y en donde el uno o más primeros polipéptidos purificados se unen específicamente a un anticuerpo que es específico para E. canis, y uno o más segundos polipéptidos purificados que se unen específicamente a un anticuerpo que es un componente de la respuesta inmunitaria del animal a una vacuna contra E. canis; y

(b) detectar si los anticuerpos en la muestra biológica se unen específicamente al uno o más primeros polipéptidos purificados y al uno o más segundos polipéptidos purificados.

Si los anticuerpos en la muestra biológica se unen específicamente al uno o más primeros polipéptidos de E. canis purificados y se unen específicamente al uno o más segundos polipéptidos de E. canis purificados, entonces el animal se infectó con E. canis y se desconoce el estado de vacunación contra E. canis. Si los anticuerpos de la muestra no se unen específicamente al uno o más primeros polipéptidos de E. canis purificados y se unen específicamente al uno o más segundos polipéptidos de E. canis purificados, entonces el animal no se infectó con E. canis y se vacunó contra E. canis. Si los anticuerpos en la muestra no se unen específicamente al uno o más primeros polipéptidos purificados y no se unen específicamente al uno o más segundos polipéptidos purificados, entonces el animal no se vacunó contra E. canis y no se infectó por E. canis. El uno o más primeros polipéptidos purificados pueden tener de aproximadamente 15 a aproximadamente 75 aminoácidos de longitud. El uno o más primeros polipéptidos purificados pueden unirse a una secuencia de aminoácidos heteróloga, un reactivo indicador, un separador de aminoácidos, un enlazador de aminoácidos, una secuencia señal, una secuencia de transferencia de parada, un dominio de transmembrana, un ligando para purificación de proteínas, o una de sus combinaciones.

Además, en la presente descripción se describe un método para determinar la presencia de un anticuerpo o sus fragmentos de unión al antígeno que son específicos para E. canis, en una muestra de prueba. El método comprende:

(a) poner en contacto la muestra de prueba con uno o más polipéptidos purificados que tienen al menos un 95 % de identidad con las SEQ ID NO:22-33 en donde el uno o más polipéptidos purificados tienen aproximadamente de 15 a aproximadamente 75 aminoácidos de longitud, y en donde el uno o más primeros polipéptidos purificados se unen específicamente a un anticuerpo que es específico para E. canis, en condiciones adecuadas para la unión específica del uno o más polipéptidos purificados a los anticuerpos o sus fragmentos de unión al antígeno; y (b) detectar la presencia de unión específica del uno o más polipéptidos purificados a los anticuerpos o sus fragmentos de unión al antígeno.

La presencia de unión específica del uno o más polipéptidos purificados a los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno indica la presencia de los anticuerpos o sus fragmentos de unión al antígeno específicos para E. canis en la muestra de prueba. El uno o más polipéptidos purificados pueden unirse a una secuencia de aminoácidos heteróloga, un reactivo indicador, un separador de aminoácidos, un enlazador de aminoácidos, una secuencia señal, una secuencia de transferencia de parada, un dominio de transmembrana, un ligando para purificación de proteínas, o una de sus combinaciones. El método puede comprender además detectar la cantidad de unión específica. El uno o más polipéptidos purificados pueden inmovilizarse en un soporte sólido.

Además, en la presente descripción se describe una composición que comprende:

(a) uno o más polipéptidos purificados que consisten en las SEQ ID NO:22-33; o

(b) uno o más polipéptidos purificados que tienen al menos 95 % de identidad con las SEQ ID NO:22-33 en donde el uno o más polipéptidos purificados tienen de aproximadamente 15 a aproximadamente 75 aminoácidos de longitud, y en donde el uno o más polipéptidos purificados se unen específicamente a un anticuerpo que es específico para E. canis;

(c) La SEQ ID NO:33, en donde la X en la posición 1 está ausente o es C, X en la posición 4 es H o Q, X en la posición 25 es D o G, y X en la posición 36 es E o G;

(d) los aminoácidos 1-27 de la SEQ ID NO:33, en donde la X en la posición 1 es C, X en la posición 4 es H, X en la posición 25 es D o G;

(e) los aminoácidos 13-41 de la SEQ ID NO:33, en donde la X en la posición 25 es D o G, X en la posición 36 es E o G; y una C está opcionalmente presente en el extremo amino;

(f) los aminoácidos 24-49 de la SEQ ID NO:33, en donde la X en la posición 25 es D o G, X en la posición 36 es E o G, y una C está opcionalmente presente en el extremo amino;

(g) los aminoácidos 1-27 de la SEQ ID NO:33, en donde la X en la posición 1 es C o está ausente, y en donde X en la posición 25 es D o G;

(h) los aminoácidos 13-41 de la SEQ ID NO:33, en donde la X en la posición 25 es D o G, X en la posición 36 es E o G, y una C está opcionalmente presente en el extremo amino;

(i) los aminoácidos 24-49 de la SEQ ID NO:33, en donde la X en la posición 25 es D o G, X en la posición 36 es E o G, y una C está opcionalmente presente en el extremo amino;

(j) los aminoácidos 13-27 de la SEQ ID NO:33, en donde la X en la posición 25 es D o G, y una C está opcionalmente presente en el extremo amino;

(k) los aminoácidos 24-41 de la SEQ ID NO:33, en donde la X en la posición 25 es D o G, X en la posición 36 es E o G, y una C está opcionalmente presente en el extremo amino;

(l) los aminoácidos 13-41 de la SEQ ID NO:33, en donde la X en la posición 25 es D o G, X en la posición 36 es E o G, y una C está opcionalmente presente en el extremo amino;

(m) los aminoácidos 24-49 de la SEQ ID NO:33, en donde la X en la posición 25 es D o G, X en la posición 36 es E o G, y una C está opcionalmente presente en el extremo amino;

(n) los aminoácidos 24-41 de la SEQ ID NO:33, en donde la X en la posición 25 es D o G, X en la posición 36 es E o G, y una C está opcionalmente presente en el extremo amino; o

(o) combinaciones de (a)-(n).

El uno o más polipéptidos purificados pueden estar en una forma multimérica. El uno o más polipéptidos purificados pueden unirse a una proteína heteróloga, un reactivo indicador, un separador de aminoácidos, un enlazador de aminoácidos, una secuencia señal, una secuencia de transferencia de parada, un dominio de transmembrana, un ligando para purificación de proteínas, o una de sus combinaciones.

Además, en la presente descripción se describe un método para generar una respuesta inmunitaria en un animal que comprende administrar uno o más polipéptidos purificados que tienen al menos 95 % de identidad con la SEQ ID NO:22-33 o una de sus combinaciones al animal, en donde el uno o más polipéptidos purificados generan una respuesta inmunitaria en el animal. El uno o más polipéptidos purificados pueden tener de aproximadamente 15 a aproximadamente 75 aminoácidos de longitud. El uno o más polipéptidos purificados pueden estar en una forma multimérica. El uno o más polipéptidos purificados pueden unirse a una proteína heteróloga, un reactivo indicador, un separador de aminoácidos, un enlazador de aminoácidos, una secuencia señal, una secuencia de transferencia de parada, un dominio de transmembrana, un ligando para purificación de proteínas, o una de sus combinaciones.

Además, en la presente descripción se describe un método para la profilaxis, tratamiento o mejora de una infección por Ehrlichia canis en un animal que comprende administrar al animal:

(a) uno o más polipéptidos purificados que tienen al menos 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:22-33, o una de sus combinaciones; o

(b) uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos purificados que comprenden la SEQ ID NO:22-33, o una de sus combinaciones; o

(c) uno o más anticuerpos que se unen específicamente a uno o más polipéptidos purificados que comprenden la SEQ ID NO:22-33, o una de sus combinaciones;

de manera que se evita, mejora, o trata la infección por E. canis.

Además, en la presente descripción se describe un método para monitorear el tratamiento de una infección por E. canis en un paciente que comprende: (a) determinar el nivel de anticuerpos anti-E. canis en una primera muestra de un paciente antes o en las primeras etapas de un tratamiento para una infección por E. canis por un método de acuerdo con la reivindicación 10; (b) determinar el nivel de los anticuerpos anti-E. canis en una segunda muestra del paciente después de efectuar el tratamiento mediante un método de acuerdo con la reivindicación 10; y (c) comparar la cantidad de anticuerpos anti-E. canis en la primera muestra con la cantidad de anticuerpos anti-E. canis en la segunda muestra para evaluar un cambio y de esta manera monitorear el tratamiento.

Las figuras muestran:

La Figura 1 muestra la evaluación del ensayo SNAP® 3Dx® de beagles de laboratorio. El dispositivo SNAP® se usó como se describió por el fabricante. La muestra “Pre” es del día 0. La muestra “Pos” es del día 42. El punto positivo de E. canis se convirtió en positivo en los 4 perros para la muestra del día 42. Se observaron resultados similares para la muestra del día 70.

La Figura 2 muestra un gel de proteínas de E. canis separadas mediante el uso de electroforesis en gel 2D. Tinción con Azul Coomassie BIOSAf E™

(Bio-Rad Inc.).

La Figura 3 muestra una inmunotransferencia western de proteínas de E. canis mediante el uso de sueros de perro recolectados en el día 0. La dilución del plasma es 1:100. Estos perros fueron negativos para la reactividad con los antígenos de E. canis.

La Figura 4 muestra una inmunotransferencia Western de proteínas de E. canis mediante el uso de sueros de perros de una mezcla de cuatro animales vacunados. La dilución del suero es 1:100.

La Figura 5 muestra una inmunotransferencia western de proteínas de E. canis mediante el uso de plasma de perros de una mezcla de animales infectados. La dilución del suero es 1:1000.

La Figura 6 muestra una inmunotransferencia western de seis antígenos DIVA diferentes de E. canis expresados en E. coli y probados con sueros de perros de una mezcla de cuatro animales infectados (A) o sueros de perros mezclados de cuatro animales vacunados (B). Las diluciones de suero fueron de 1:100 para los animales vacunados o de 1:500 para los animales infectados. Los antígenos DIVA representados incluyen: (1) antígeno de 200 kDa, (2) proteína ribosomal L1, (3a y 3b) dos segmentos diferentes de “ATPasa”, (4) antígeno de 120k Da, (5) proteínas de choque térmico / antígeno p16.

La Figura 7 demuestra que el antígeno p16 clonado se reconoce por sueros de perros infectados con E. canis pero no de aquellos que se vacunaron (se muestra como “sueros retados”). Los lisados de bacterias no inducidas (U) o inducidas (I) transformadas con un vector que expresa el antígeno p16 o el fragmento genómico original (+C) se separaron por SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa para el análisis por inmunotransferencia western. La Figura 8 demuestra la detección de anticuerpos específicos para E. canis mediante el uso de un polipéptido mostrado en la SEQ ID NO:23 en perros durante un curso de tiempo que incluye infección, tratamiento y recuperación.

Las Figuras 9A-B demuestran la detección de anticuerpos específicos para E. canis mediante el uso de un polipéptido mostrado en la SEQ ID NO:10 en dos perros que no se vacunaron contra E. canis durante un curso de tiempo de infección.

Las Figuras 10A-C demuestran la detección de anticuerpos específicos para E. canis mediante el uso de un polipéptido mostrado en la SEQ ID NO:10 en tres perros que se vacunaron (coadyuvante IRBI) contra E. canis durante un curso de tiempo de infección.

Las Figuras 11A-C demuestran la detección de anticuerpos específicos para E. canis mediante el uso de un polipéptido mostrado en la SEQ ID NO:10 en tres perros que se vacunaron (RIBI coadyuvante de BCG) contra E. canis durante un curso de tiempo de infección.

Se describen antígenos de Ehrlichia canis que pueden usarse para diferenciar a los animales infectados naturalmente con E. canis de los animales que se vacunaron contra E. canis. “Vacunado” significa la administración de una composición vacunal que puede prevenir o mejorar los efectos de la infección por un patógeno al establecer o mejorar la inmunidad al patógeno. Las composiciones de las vacunas pueden comprender patógenos muertos, inactivados o atenuados o productos purificados o porciones del patógeno. La vacuna no es necesariamente 100 % efectiva.

Antes de continuar en detalle, se definirán una serie de términos. Como se usa en la presente descripción, las formas singulares "un", "uno/a" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto lo dicte claramente de cualquier otra manera.

Como se usa en la presente descripción, el término "polipéptido" se refiere a un compuesto de una sola cadena o un complejo de dos o más cadenas de residuos de aminoácidos enlazados por enlaces peptídicos. Las cadenas pueden tener cualquier longitud y pueden comprender una proteína de fusión. Aunque "proteína" se usa frecuentemente en referencia a polipéptidos relativamente grandes, y "péptido" se usa frecuentemente en referencia a polipéptidos pequeños, el uso de estos términos en la técnica se solapa y varía. El término "polipéptido" como se usa en la presente descripción se refiere, por lo tanto, indistintamente a péptidos, polipéptidos, proteínas o proteínas de fusión a menos que se indique de cualquier otra manera. El término "aminoácido" se refiere a una unidad monomérica de un péptido, polipéptido o proteína. El término "polipéptidos" puede referirse a uno o más de un tipo de polipéptido (un conjunto de polipéptidos). “Polipéptidos” también pueden referirse a mezclas de dos o más tipos diferentes de polipéptidos (una mezcla de polipéptidos). Los términos “polipéptidos” o “polipéptido” pueden significar cada uno de ellos, además, “uno o más polipéptidos”.

Los polipéptidos descritos en la presente descripción pueden "aislarse". Un polipéptido aislado es un polipéptido que no es inmediatamente contiguo a una o ambas de las secuencias de aminoácidos flanqueantes amino y carboxilo con las que se asocia naturalmente. En particular, “un polipéptido aislado mostrado en la SEQ ID NO:22-33” significa que el polipéptido no es inmediatamente contiguo a una o ambas de las secuencias de aminoácidos flanqueantes amino y carboxilo con las que se asocia naturalmente (donde el polipéptido es un polipéptido de origen natural) en una molécula de proteína de E. canis.

Como se usa en la presente descripción, “antígeno” como se usa en la presente descripción se refiere a una molécula contra la cual un sujeto puede iniciar una respuesta inmunitaria humoral y/o celular. Los antígenos pueden ser cualquier tipo de molécula biológica que incluye, por ejemplo, metabolitos intermedios simples, azúcares, lípidos y hormonas, así como también macromoléculas tales como carbohidratos complejos, fosfolípidos, ácidos nucleicos y proteínas. En las composiciones y métodos descritos en la presente descripción, un antígeno puede ser un polipéptido, por ejemplo, uno que comprende al menos aproximadamente seis o más aminoácidos.

Como se usa en la presente descripción, un “derivado” de un polipéptido del antígeno de E. canis, o un antígeno o polipéptido que se “deriva de” un antígeno o polipéptido de E. canis, se refiere a un antígeno o polipéptido en el que la forma nativa se purificó, modificó o alteró. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a: sustituciones, modificaciones, adiciones o deleciones de aminoácidos; alteraciones en el patrón de lipidación, glicosilación o fosforilación; reacciones de grupos laterales libres amino, carboxilo, o hidroxilo de los residuos de aminoácidos presentes en el polipéptido con otras moléculas orgánicas y no orgánicas; y otras modificaciones, cualquiera de las cuales puede dar lugar a cambios en la estructura primaria, secundaria o terciaria.

Una “muestra biológica” es cualquier muestra de un animal que se espera que contenga inmunoglobulinas. Por ejemplo, una muestra biológica puede ser plasma, sangre, suero, saliva, orina, heces fecales, exudado de heridas, líquido cefalorraquídeo (CSF), semen, esputo, así como también extractos de tejidos y extractos celulares. Una muestra de prueba puede obtenerse de un animal tal como un caballo, perro, vaca, llama, oveja, cabra, ciervo, alce, roedor o cualquier otro animal. Un ser humano se considera un animal en la presente descripción. Estos ejemplos no deben interpretarse como limitantes de los tipos de muestra o animales que son aplicables en la presente descripción.

Una “infección”, tal como en una infección por E. canis, significa que un animal se expuso a E. canis, independientemente de si el animal presenta síntomas clínicos de E. canis. Una infección natural se refiere a una exposición que se produce como resultado de uno de los métodos de transmisión natural para E. canis, tal como la transmisión por garrapatas. Una infección no incluye una exposición a E. canis mediante la vacunación.

Un “polipéptido o antígeno que no es un elemento de una vacuna de E. canis" es cualquier polipéptido o antígeno de E. canis que no está presente en una vacuna o vacunas de E. canis en particular. Un “polipéptido o antígeno que no es un elemento de una vacuna de E. canis" es también cualquier polipéptido o antígeno de E. canis que no es una porción inmunogénicamente activa de una vacuna de E. canis. Es decir, el polipéptido o antígeno puede estar presente en la vacuna, pero no se genera una respuesta inmunitaria contra el polipéptido o antígeno (por ejemplo, la generación de anticuerpos que se unen específicamente al polipéptido o antígeno) en respuesta a la administración de la vacuna de E. canis. Los elementos de la(s) vacuna(s) pueden ser porciones de una vacuna de subunidades que incluye menos que la bacteria completa; estas porciones pueden sintetizarse químicamente o expresarse recombinantemente antes de convertirse en parte de la vacuna, y estas porciones pueden codificarse por uno o más vectores que expresan una composición inmunogénica in vivo.

Un “anticuerpo que es un componente de la respuesta inmunitaria de un animal a una vacuna de E. canis" se refiere a un anticuerpo que se induce como resultado de una vacunación con una vacuna de E. canis. Estos anticuerpos pueden ser idénticos o similares a los anticuerpos provocados como resultado de una infección natural por E. canis. Estos anticuerpos se mantendrán a un título suficiente y tal que proporcione un efecto protector y neutralizante contra las bacterias. Una vacuna con éxito produce un nivel medible del anticuerpo (o anticuerpos) que se induce por un componente de la vacuna de E. canis. Los ejemplos de antígenos de E. canis que provocan anticuerpos que pueden ser un componente de la respuesta inmunitaria de un animal a una vacuna de E. canis son p28-1, p28-2, p28-3, p28-4, p28-5, p28-6, p28-7, p28-8, p28-9 (ver, patente de EE. UU. NO 6660269; 6,458,942; 6,403,780; 6,392,023), proA, ProB, mmpA, citocromo oxidasa (ver, publicación de patente de EE. UU. NO 20040170972), p43 (ver, patente de EE. UU. NO 6,355,777), que es la porción N-terminal de p153, una glicoproteína (ver, publicación de patente de EE. UU. NO 2004/0121433), p153, y p30-1, p30-2, p30-3, p30-4, p30-5, p30-6, p30-7, p30-8, p30-9, p30-10, p30-11, p30-12, p30-13, p30-14, p30-15, p30-16, p30-17, p30-18, p30-19, p30-20 (Ohashi y otros 2001, Infection and Immunity 69(4): 2083-91).

Una respuesta inmunitaria es el desarrollo en un organismo de una respuesta inmunitaria celular y/o mediada por anticuerpos a un antígeno tal como un polipéptido. Usualmente, tal respuesta incluye, pero no se limita a, uno o más de los siguientes: producción de anticuerpos, linfocitos B, linfocitos T auxiliadores, linfocitos T supresores y/o linfocitos T citotóxicos. Una respuesta inmunitaria puede detectarse mediante el uso de cualquiera de varios ensayos conocidos por los expertos en la técnica.

Polipéptidos

Las muestras biológicas de animales que se vacunaron contra E. canis tienen el potencial de producir un resultado positivo en una prueba para la detección de infección por E. canis debido a la presencia de anticuerpos producidos en respuesta a la vacuna. En un aspecto, en la presente descripción se describe un método para distinguir entre los animales que se infectaron con E. canis y los que no se infectaron con E. canis, independientemente de si el animal se vacunó contra E. canis. Los métodos incluyen poner en contacto una muestra biológica del animal con un antígeno derivado de E. canis que no se une específicamente a un anticuerpo que es un componente de la respuesta de anticuerpos del animal a una vacuna de E. canis particular, pero que se une específicamente a un anticuerpo que se genera en respuesta a la infección por E. canis.

El desarrollo de los anticuerpos contra E. canis en un animal contra una vacuna depende de la vacuna particular usada para vacunar al animal. La diferencia en la respuesta inmunitaria entre los animales que se vacunan contra E. canis y los animales que se infectan natural o experimentalmente con E. canis proporciona un medio para determinar si un animal se infectó natural o experimentalmente con E. canis, independientemente de si el animal se vacunó contra E. canis. Por lo tanto, mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción, los animales que se infectaron con E. canis pueden distinguirse de los animales que no se infectaron con E. canis y/o se vacunaron contra E. canis. Los antígenos descritos en la presente descripción, sus regiones inmunodominantes, y epítopos pueden usarse en los métodos descritos en la presente descripción. Estas composiciones pueden denominarse antígenos DIVA de E. canis (que diferencia animales infectados de animales vacunados). Un antígeno DIVA de E. canis induce una respuesta inmunitaria, por ejemplo, la producción de anticuerpos específicos, en un animal que es diferente de la respuesta inmunitaria inducida en el animal por una vacuna de E. canis particular.

En consecuencia, la detección de la unión específica entre un antígeno DIVA de E. canis y un anticuerpo que no es un componente de la respuesta inmunitaria de un animal a una vacuna particular puede indicar una infección por E. canis natural o experimental. La ausencia de tal unión puede indicar la ausencia de infección por E. canis. En adición, un segundo antígeno separado, tal como un antígeno de E. canis que se une específicamente a un anticuerpo que es un componente de la respuesta inmunitaria de un animal a una vacuna contra E. canis particular, puede usarse para detectar anticuerpos producidos en respuesta a la vacuna (en lo sucesivo denominado “antígeno vacunal de E. canis"). Un antígeno vacunal de E. canis no solo se une específicamente a un anticuerpo que es un componente de la respuesta inmunitaria de un animal a una vacuna contra E. canis particular, sino que también puede unirse específicamente a anticuerpos que son un componente de la respuesta inmunitaria de un animal a la infección por E. canis. Si se detecta un anticuerpo específico para un antígeno de la vacuna contra E. canis, entonces el animal se vacunó y/o infectó. La detección de ninguno de los anticuerpos indica que no hay infección ni vacunación. Como tal, varias combinaciones de reactivos de captura separados pueden conducir a una determinación del estado de vacunación y/o infección del sujeto de prueba.

En un aspecto, un método descrito en la presente descripción incluye poner en contacto una muestra biológica de un animal con un antígeno que es una parte de la bacteria E. canis, pero que no es un elemento de una vacuna contra E. canis particular. En otro aspecto, un método descrito en la presente descripción incluye poner en contacto una muestra biológica de un animal con un antígeno que está presente en o parte de la bacteria E. canis y una vacuna contra E. canis, en donde se genera una respuesta inmunitaria contra el antígeno (por ejemplo, la generación de anticuerpos que se unen específicamente al antígeno) en respuesta a la infección con la bacteria E. canis, pero no en respuesta a la administración de la vacuna contra E. canis. En otro aspecto, se analiza una muestra biológica de un animal para detectar la presencia o ausencia de anticuerpos específicos para un antígeno DIVA de E. canis, y la presencia o ausencia de anticuerpos específicos para un antígeno de la vacuna contra E. canis. Después se determina que el animal no se infectó y no se vacunó al determinar la ausencia de tales anticuerpos.

En un aspecto descrito en la presente descripción, un antígeno DIVA no es un elemento de una vacuna contra E. canis. En otro aspecto descrito en la presente descripción, un antígeno DIVA es parte de una vacuna contra E. canis, pero una respuesta inmunitaria (por ejemplo, la generación de un anticuerpo que se une específicamente al antígeno DIVA) no se genera en respuesta a la administración de la vacuna contra E. canis. La vacunación o el estado de infección de un animal puede determinarse mediante la detección de si los anticuerpos en la muestra se unen específicamente a uno o más antígenos de la vacuna contra E. canis y si los anticuerpos en la muestra se unen específicamente a uno o más antígenos DIVA. Si los anticuerpos de la muestra se unen específicamente a uno o más de los antígenos de la vacuna y se unen específicamente a uno o más de los antígenos DIVA, entonces el animal se infectó con E. canis y se desconoce el estado de vacunación del animal. Si los anticuerpos de la muestra se unen específicamente a uno o más de los antígenos de la vacuna contra E. canis y no se unen específicamente a uno o más de los antígenos DIVA, entonces el animal se vacunó contra E. canis y no se infectó con E. canis. Si los anticuerpos de la muestra no se unen específicamente a uno o más de los antígenos de la vacuna contra E. canis y no se unen específicamente a uno o más de los antígenos DIVA, entonces el animal no se infectó con E. canis y no se vacunó contra E. canis.

Un aspecto descrito en la presente descripción proporciona un método para distinguir entre los animales que (a) se infectaron con Ehrlichia canis; y (b) los animales que no se infectaron con E. canis independientemente de su estado de vacunación contra E. canis. El método comprende poner en contacto una muestra biológica de un animal con un primer polipéptido de E. canis purificado que no se une sustancialmente específicamente a los anticuerpos que son un componente de la respuesta inmunitaria del animal a una vacuna contra E. canis; en donde el primer polipéptido de E. canis purificado comprende las SEQ ID NO:22-33 o sus combinaciones y detectar si los anticuerpos en la muestra se unen específicamente al primer polipéptido purificado. Si los anticuerpos en la muestra se unen específicamente al primer polipéptido de E. canis purificado, entonces el animal se infectó con E. canis; y si los anticuerpos en la muestra no se unen sustancialmente específicamente al primer polipéptido de E. canis purificado, entonces el animal no se infecta con E. canis.

El método puede comprender, además, determinar si los anticuerpos en la muestra se unen específicamente a un segundo polipéptido de E. canis purificado que comprende un antígeno de la vacuna contra E. canis. Si los anticuerpos de la muestra se unen específicamente a uno o más de los antígenos de la vacuna contra E. canis y se unen específicamente a uno o más de los antígenos DIVA, entonces el animal se infectó con E. canis y se desconoce el estado de vacunación del animal. Si los anticuerpos de la muestra se unen específicamente a uno o más de los antígenos de la vacuna contra E. canis y no se unen específicamente a uno o más de los antígenos DIVA, entonces el animal se vacunó contra E. canis y no se infectó con E. canis. Si los anticuerpos de la muestra no se unen específicamente a uno o más de los antígenos de la vacuna contra E. canis y no se unen específicamente a uno o más de los antígenos DIVA, entonces el animal no se infectó con E. canis y no se vacunó contra E. canis. Es posible que los anticuerpos en las muestras de prueba no se unan sustancialmente específicamente a los antígenos DIVA y/o a los antígenos vacunales de E. canis. Sustancialmente ninguna unión específica es una cantidad de unión que se consideraría un resultado negativo por un experto en la técnica.

Un aspecto descrito en la presente descripción proporciona un método para determinar el estado de infección y vacunación de un animal referente a E. canis. El método comprende:

(a) poner en contacto una muestra biológica de un animal con un primer polipéptido purificado que no se une sustancialmente específicamente a anticuerpos que son un componente de la respuesta inmunitaria del animal a una vacuna contra E. canis, en donde el primer polipéptido purificado comprende las SEQ ID NO:22-33 o sus combinaciones, y un segundo polipéptido que se une específicamente a un anticuerpo que es un componente de la respuesta inmunitaria del animal a una vacuna contra E. canis;

(b) detectar si los anticuerpos en la muestra se unen específicamente al primer y segundo polipéptidos purificados;

en donde si los anticuerpos en la muestra biológica se unen específicamente al uno o más primeros polipéptidos de E. canis purificados y se unen específicamente al uno o más segundos polipéptidos de E. canis purificados, entonces el animal se infectó con E. canis y se desconoce el estado de vacunación contra E. canis; en donde si los anticuerpos en la muestra no se unen específicamente al uno o más primeros polipéptidos de E. canis purificados y se unen específicamente al uno o más segundos polipéptidos de E. canis purificados, entonces el animal no se infectó con E. canis y se vacunó contra E. canis; y en donde si los anticuerpos en la muestra no se unen específicamente al uno o más primeros polipéptidos purificados y no se unen específicamente al uno o más segundos polipéptidos purificados, entonces el animal no se vacunó contra E. canis y no se infectó por E. canis.

La Tabla 1 demuestra el estado de infección y/o vacunación de los animales que puede determinarse con los antígenos DIVA de E. canis y los antígenos vacunales de E. canis. “No realizado” en la Tabla 1 significa que no se terminó una prueba particular y, por lo tanto, no hay ningún resultado disponible. Por ejemplo, si una muestra biológica de un animal se analiza con un antígeno DIVA de E. canis y el resultado es positivo y no se termina ninguna prueba con un antígeno vacunal de E. canis, entonces el estado del animal sería infectado, pero se desconoce el estado de la vacunación.

Tabla 1.

Otro aspecto descrito en la presente descripción proporciona un método para determinar la presencia o ausencia de un anticuerpo o sus fragmentos de unión al antígeno, en una muestra de prueba, en donde el anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno se une específicamente a un polipéptido purificado que consiste de las SEQ ID NO:10, 22-33 o sus combinaciones. El método comprende poner en contacto la muestra de prueba con un polipéptido purificado que comprende las SEQ ID NO:10, 22-33 o sus combinaciones en condiciones adecuadas para la unión específica del polipéptido purificado al anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno; y detectar la presencia o ausencia de unión específica. La presencia de unión específica indica la presencia del anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno, y la ausencia de unión específica indica la ausencia del anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno.

Las vacunas pueden no ser completamente efectivas para prevenir o mejorar de la infección. Por lo tanto, es conveniente tener un método para determinar si un animal vacunado se infectó a pesar de la vacunación. Las SEQ ID NO:10, 22-33 no detecta anticuerpos anti-E canis en perros que se vacunaron contra E. canis y que no se infectaron con E. canis. Las SEQ ID NO:10, 22-33 puede usarse para detectar la infección por E. canis en perros que recibieron o no una vacuna contra E. canis. El animal puede infectarse con E. canis después de recibir una vacuna contra E. canis y la detección de E. canis aún es posible.

Otro aspecto descrito en la presente descripción comprende una composición que comprende o que consiste de uno o más polipéptidos purificados que comprenden o que consisten en las SEQ ID NO:10, 22-33 o sus combinaciones. Un polipéptido descrito en la presente descripción puede modificarse postraduccionalmente. Un polipéptido purificado es una preparación de polipéptido que está sustancialmente libre de material celular, otros tipos de polipéptidos, precursores químicos, químicos usados en la síntesis del polipéptido, o sus combinaciones. Una preparación de polipéptido que está sustancialmente libre de material celular, medio de cultivo, precursores químicos, sustancias químicas usadas en la síntesis del polipéptido, etc., tiene menos de aproximadamente 30 %, 20 %, 10 %, 5 %, 1 % o más de otros polipéptidos, medio de cultivo, sustancias químicas precursoras y/u otras sustancias químicas usadas en la síntesis. Por lo tanto, un polipéptido purificado es aproximadamente 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más puro. Un polipéptido purificado no incluye extractos celulares o mezclas de polipéptidos no purificados o semipurificados que son menos del 70 % puros.

En la presente descripción se describe un polipéptido purificado que comprende las SEQ ID NO:22-33, en donde el polipéptido consiste en menos de aproximadamente 50, 45, 40, 35, 30, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 o menos (o cualquier intervalo entre 50 y 6) aminoácidos de Ehrlichia canis contiguos de origen natural (es decir, el polipéptido purificado no abarca el polipéptido de Ehrlichia canis completo de origen natural). Los aminoácidos de Ehrlichia canis de origen natural son cualquier polipéptido producido naturalmente por un organismo Ehrlichia canis. Un polipéptido purificado puede comprender las SEQ ID NO:22-33, en donde el polipéptido comprende más de aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o más aminoácidos de Ehrlichia canis contiguos de origen natural (o cualquier intervalo entre aproximadamente 6 y 100 aminoácidos).

El hecho de que los polipéptidos de SEQ ID NO:22-33 sean más pequeños que un polipéptido de Ehrlichia canis de longitud completa es importante porque los polipéptidos más pequeños pueden tener mayor especificidad y/o sensibilidad que los polipéptidos de longitud completa en ensayos de detección. Adicionalmente, estos polipéptidos más pequeños pueden ser menos costosos de fabricar, y pueden obtenerse a una mayor pureza que el polipéptido de longitud completa.

En la presente descripción se describe un polipéptido purificado que tiene menos de aproximadamente 50, 45, 40, 35, 30, 26, 25, 24, 23, 22, 21,20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 o 6 aminoácidos de Ehrlichia canis de origen natural contiguos y más de aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, o 100 aminoácidos contiguos de las SEQ ID NO:22-23 (o cualquier intervalo entre 6 y 100 aminoácidos). Por lo tanto, un polipéptido descrito en la presente descripción puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30; de aproximadamente 15 a aproximadamente 50; o de aproximadamente 15 a aproximadamente 100 aminoácidos de longitud.

Las variantes de polipéptidos son al menos aproximadamente 79 %, 80 %, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % o más idénticas a las secuencias de polipéptidos mostradas en las SEQ ID NO:22-33. Las variantes de polipéptidos tienen una o más variaciones de aminoácidos conservadoras u otras modificaciones menores y retienen la actividad biológica, es decir, son equivalentes biológicamente funcionales. Un equivalente biológicamente activo tiene una función sustancialmente equivalente en comparación con el polipéptido de tipo salvaje correspondiente. Un polipéptido puede tener aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 o menos sustituciones de aminoácidos conservadoras.

Estos polipéptidos pueden tener residuos de aminoácidos adicionales más allá de los de las SEQ ID NO:22-33. Es decir, los polipéptidos pueden tener residuos de aminoácidos adicionales adicionados al extremo 5' o 3' de los polipéptidos, mientras que la identidad de la secuencia a lo largo de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 o 48 aminoácidos contiguos (en dependencia de la longitud de la SEQ ID NO específica) de las SEQ ID NO:22-33 es de al menos aproximadamente 95 %. Los aminoácidos adicionales adicionados al extremo 5' o 3' de los polipéptidos no se consideran que afectan al porcentaje de identidad de la secuencia. Los aminoácidos adicionales pueden ser aquellos de origen natural o pueden ser aminoácidos de origen no natural. Los polipéptidos pueden ser, por ejemplo, de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 o aproximadamente 75 aminoácidos de longitud.

Las variantes de polipéptidos tienen una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras, adiciones, deleciones u otras modificaciones menores y conservan la actividad biológica, es decir, son equivalentes biológicamente funcionales. Un equivalente biológicamente activo tiene una función sustancialmente equivalente en comparación con el polipéptido de tipo salvaje correspondiente.

La identidad de secuencia porcentual tiene un significado reconocido en la técnica y hay una serie de métodos para medir la identidad entre dos secuencias de polipéptidos o polinucleótidos. Ver, por ejemplo, Lesk, Ed., Computational Molecular Biology, Oxford University Press, Nueva York, (1988); Smith, Ed., Biocomputing: Informatics And Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Griffin & Griffin, Eds., Computer Analysis Of Sequence Data, Parte I, Humana Press, New Jersey, (1994); von Heinje, Sequence Analysis In Molecular Biology, Academic Press, (1987); y Gribskov & Devereux, Eds., Sequence Analysis Primer, M Stockton Press, New York, (1991). Los métodos para alinear polinucleótidos o polipéptidos se codifican en programas de computadora, que incluyen el paquete de programas GCG (Devereux y otros, Nuc. Acids Res. 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul y otros, J. Molec. Biol. 215:403 (1990)), y programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) que usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Adv. App. Math., 2:482-489 (1981)). Por ejemplo, el programa de computadora ALIGN que emplea el algoritmo FASTA puede usarse, con una búsqueda de interrupción afín con una penalización de interrupción abierta de -12 y una penalización de extensión de interrupción de -2.

Cuando se usa cualquiera de los programas de alineación de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, aproximadamente 95 % idéntica a una secuencia de referencia, los parámetros se establecen de manera que el porcentaje de identidad se calcula a lo largo de la longitud completa del polinucleótido o polipéptido de referencia y que se permiten interrupciones en la identidad de hasta el 5 % del número total de nucleótidos o aminoácidos en el polinucleótido de referencia.

Los polipéptidos variantes generalmente pueden identificarse mediante la modificación de una de las secuencias de polipéptidos descritas en la presente descripción, y la evaluación de las propiedades del polipéptido modificado para determinar si es un equivalente biológico. Una variante es un equivalente biológico si reacciona sustancialmente igual que un polipéptido descrito en la presente descripción en un ensayo tal como un ensayo inmunohistoquímico, un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA), un ensayo de inmunoenzima o un ensayo de inmunotransferencia western, por ejemplo, tiene 90-110 % de la actividad del polipéptido original. El ensayo puede ser un ensayo de competencia en donde el polipéptido biológicamente equivalente es capaz de reducir la unión del polipéptido descrito en la presente descripción a un antígeno o anticuerpo reactivo correspondiente por aproximadamente 80, 95, 99, o 100 %. Un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido de tipo salvaje correspondiente también se une específicamente a la variante de polipéptido.

Una sustitución conservadora es una en la que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de manera que un experto en la técnica de la química de péptidos esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido se mantuvieran sustancialmente sin cambios. En general, los siguientes grupos de aminoácidos representan cambios conservadores: (1) ala, pro, gli, glu, sap, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his.

Un polipéptido descrito en la presente descripción puede comprender además una secuencia señal (o líder) que dirige la transferencia de la proteína de manera cotraduccional o postraduccional. El polipéptido puede comprender además un enlazador u otra secuencia para facilitar la síntesis, purificación o identificación del polipéptido (por ejemplo, poli-His), o para mejorar la unión del polipéptido a un soporte sólido. Por ejemplo, un polipéptido puede conjugarse a una región Fc de inmunoglobulina o albúmina sérica bovina.

Un polipéptido puede unirse de manera covalente o no covalente a una secuencia de aminoácidos a la que el polipéptido no se asocia normalmente en la naturaleza, es decir, una secuencia de aminoácidos heterólogos. Una secuencia de aminoácidos heterólogos puede ser de un organismo diferente de E. canis, una secuencia sintética, o una secuencia de E. canis no localizada en el carboxilo o amino terminal de un polipéptido descrito en la presente descripción en la naturaleza. Adicionalmente, un polipéptido puede unirse de manera covalente o no covalente a compuestos o moléculas que no sean aminoácidos tales como reactivos indicadores. Un polipéptido puede unirse de manera covalente o no covalente a un reactivo indicador, un separador de aminoácidos, un enlazador de aminoácidos, una secuencia señal, una secuencia de transferencia de parada, un dominio de transmembrana, un ligando para purificación de proteínas, o una de sus combinaciones. Un polipéptido también puede unirse a un resto (es decir, un grupo funcional que puede ser un polipéptido u otro compuesto) que mejora una respuesta inmunitaria (por ejemplo, citocinas tales como IL-2), un resto que facilita la purificación (por ejemplo, etiquetas de afinidad tales como una etiqueta de seis histidinas, trpE, glutatión, proteína de unión a maltosa), o un resto que facilita la estabilidad del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol; grupos protectores de amino terminal tales como acetilo, propilo, succinilo, bencilo, benciloxicarbonilo o t-butiloxicarbonilo; grupos que protegen el extremo carboxilo tales como amida, metilamida, y etilamida). Un ligando de purificación de proteínas puede ser uno o más residuos de aminoácidos C en, por ejemplo, el extremo amino o extremo carboxilo o ambos extremos de un polipéptido descrito en la presente descripción. Un separador de aminoácidos es una secuencia de aminoácidos que no se asocian con un polipéptido descrito en la presente descripción en la naturaleza. Un separador de aminoácidos puede comprender aproximadamente 1, 5, 10, 20, 100, o 1000 aminoácidos.

Si se desea, un polipéptido descrito en la presente descripción puede ser parte de una proteína de fusión, que también puede contener otras secuencias de aminoácidos, tales como enlazadores de aminoácidos, separadores de aminoácidos, secuencias de señales, secuencias de transferencia de parada de TMR, dominios de transmembrana, así como también ligandos útiles en la purificación de proteínas, tales como glutatión-S-transferasa, etiqueta de histidina, proteína A de estafilococo, o sus combinaciones. Más de un polipéptido descrito en la presente descripción puede estar presente en una proteína de fusión. Los fragmentos de polipéptidos descritos en la presente descripción pueden estar presentes en una proteína de fusión descrita en la presente descripción. Un polipéptido descrito en la presente descripción puede unirse operativamente a proteínas que no son de Ehrlichia canis o proteínas p16 de que no son de Ehrlichia canis para formar proteínas de fusión. Una proteína de fusión descrita en la presente descripción puede comprender uno o más polipéptidos mostrados en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 o sus fragmentos, o sus combinaciones. Una proteína de fusión no se produce en la naturaleza. El término "unido operativamente" significa que el polipéptido descrito en la presente descripción y los otros polipéptidos se fusionan entre sí en marco ya sea al extremo N o al extremo C del polipéptido descrito en la presente descripción.

Los polipéptidos descritos en la presente descripción pueden estar en una forma multimérica. Es decir, un polipéptido puede comprender una o más copias de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 o una de sus combinaciones. Un polipéptido multimérico puede ser un péptido antígeno múltiple (MAP). Ver, por ejemplo, Tam, J. Immunol. Methods, 196:17-32 (1996).

Los polipéptidos descritos en la presente descripción pueden comprender un antígeno que se reconoce por un anticuerpo específico para E. canis. El antígeno puede comprender uno o más epítopos (es decir, determinantes antigénicos). Un epítopo puede ser un epítopo lineal, un epítopo secuencial o un epítopo conformacional. Los epítopos dentro de un polipéptido descrito en la presente descripción pueden identificarse por varios métodos. Ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos NO 4,554,101; Jameson & Wolf, CABIOS 4:181-186 (1988). Por ejemplo, un polipéptido descrito en la presente descripción puede aislarse y cribarse. Una serie de péptidos cortos, que juntos abarcan una secuencia completa de polipéptidos, pueden prepararse mediante escisión proteolítica. Al comenzar con, por ejemplo, fragmentos de polipéptido de 30 mer (o fragmentos más pequeños), cada fragmento puede probarse para detectar la presencia de epítopos reconocidos en un ELISA. Por ejemplo, en un ensayo ELISA un polipéptido de E. canis, tal como un fragmento de polipéptido de 30 mer, se une a un soporte sólido, tal como los pocillos de una placa plástica de pocillos múltiples. Se marca una población de anticuerpos, se adiciona al soporte sólido y se permite que se una al antígeno no marcado, en condiciones en las que se bloquea la absorción no específica, y se elimina cualquier anticuerpo no unido y otras proteínas. La unión de anticuerpos se detecta, por ejemplo, mediante una reacción que convierte un sustrato incoloro en un producto de reacción coloreado. Después, pueden probarse fragmentos progresivamente más pequeños y solapados a partir de 30 mer identificados para mapear el epítopo de interés.

Un antígeno DIVA puede comprender un epítopo o región inmunodominante. Es decir, un epítopo o región que más frecuentemente induce y se une a los anticuerpos en una población de estos en comparación con otros epítopos. Un antígeno puede tener uno o más epítopos inmunodominantes. Los epítopos inmunodominantes pueden mapearse en, por ejemplo, un polipéptido después de que el polipéptido se administra a un animal o antes de tal administración. Ver, por ejemplo, la publicación de patente de Estados Unidos 2004/0209324.

Un polipéptido descrito en la presente descripción puede producirse recombinantemente. Un polinucleótido que codifica un polipéptido descrito en la presente descripción puede introducirse en un vector de expresión recombinante, que puede expresarse en un sistema de células hospederas de expresión adecuado mediante el uso de técnicas bien conocidas en la técnica. Una variedad de sistemas de expresión de bacterias, levaduras, plantas, mamíferos e insectos están disponibles en la técnica y puede usarse cualquiera de tales sistema de expresión. Opcionalmente, un polinucleótido que codifica un polipéptido puede traducirse en un sistema de traducción libre de células. Un polipéptido también puede sintetizarse químicamente u obtenerse a partir de células de E. canis.

Un polipéptido inmunogénico descrito en la presente descripción puede comprender una secuencia de aminoácidos que se muestra en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 o sus fragmentos. Un polipéptido inmunogénico puede provocar anticuerpos u otras respuestas inmunitarias (por ejemplo, las respuestas de los linfocitos T del sistema inmunitario) que reconocen epítopos de un polipéptido que tienen las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33. Un polipéptido inmunogénico descrito en la presente descripción también puede ser un fragmento de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que se muestra en las SEQ ID n O: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33. Un fragmento de polipéptido inmunogénico descrito en la presente descripción puede ser de aproximadamente 50, 45, 40, 35, 30, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 o menos (o cualquier intervalo entre aproximadamente 50 y aproximadamente 6) aminoácidos de longitud. Un fragmento de polipéptido inmunogénico descrito en la presente descripción puede ser de más de aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o más aminoácidos de longitud (o cualquier intervalo entre aproximadamente 6 y aproximadamente 100 aminoácidos).

Los anticuerpos específicos para E. canis pueden detectarse en fluidos biológicos o tejidos mediante cualquier método conocido en la técnica mediante el uso de los polipéptidos descritos en la presente descripción. Los métodos más simples generalmente son los métodos de inmunoensayo. Un método de este tipo es un método basado en la competencia en donde las muestras de suero se incuban previamente con un antígeno de E. canis que no es un elemento de una vacuna contra E. canis (por ejemplo, un antígeno DIVA de E. canis), y después se adicionan a una fase sólida, tal como una placa de microtitulación, que tiene un anticuerpo monoclonal inmovilizado específico para el antígeno DIVA de E. canis. Los anticuerpos específicos para el antígeno DIVA de E. canis en la muestra evitarán que el antígeno DIVA de E. canis se una al anticuerpo inmovilizado. La detección de cualquier unión del antígeno DIVA de E. canis al anticuerpo inmovilizado puede determinarse mediante la adición de un segundo socio de unión para el antígeno de E. canis, ya sea directamente marcado o capaz de marcarse a través de la unión a otro socio de unión que tiene una etiqueta. Una muestra positiva, es decir, una muestra que tiene anticuerpos específicos para un antígeno DIVA de E. canis, se asocia con una disminución de la señal de la etiqueta.

Los anticuerpos contra un antígeno DIVA de E. canis en una muestra biológica pueden detectarse al poner en contacto la muestra con un antígeno DIVA de E. canis y adicionar la muestra a una placa de microtitulación recubierta con un anticuerpo monoclonal anti antígeno DIVA. La unión del antígeno DIVA a la placa de microtitulación puede detectarse mediante la adición de un anticuerpo policlonal de conejo contra el antígeno DIVA y la adición de un anticuerpo policlonal de burro anticonejo conjugado con HRP. Los anticuerpos de la muestra evitarán la unión del antígeno DIVA al anticuerpo inmovilizado, lo que provocará una disminución de la señal.

Otro método para detectar anticuerpos específicos para un antígeno DIVA de E. canis es un ensayo tipo sándwich donde una muestra biológica sospechosa de contener un anticuerpo específico para un antígeno DIVA de E. canis se pone en contacto con un antígeno DIVA de E. canis inmovilizado para formar un complejo inmunológico. La presencia de un anticuerpo específico para un antígeno de DIVA de E. canis se determina mediante la detección de la unión de un socio de unión marcado para el anticuerpo de E. canis, tal como un segundo anticuerpo.

En un aspecto descrito en la presente descripción, los antígenos DIVA de E. canis pueden inmovilizarse sobre un soporte sólido adecuado. Una muestra biológica se pone en contacto con el antígeno DIVA de E. canis, al que se unen los anticuerpos anti-E. canis, si tales anticuerpos están presentes en la muestra. La unión puede detectarse por cualquier medio adecuado, por ejemplo, enzimas, radionúclidos, partículas o etiquetas fluorescentes. El reactivo de detección puede asociarse con una proteína que es la misma o similar a la que se usa para capturar anticuerpos anti-E. canis (si están presentes). Los anticuerpos contra E. canis pueden detectarse mediante la inmovilización de un antígeno de E. canis en un soporte sólido. Las muestras biológicas pueden ponerse en contacto con el soporte sólido y, después de la eliminación de la muestra no unida, la unión de los anticuerpos E. canis al antígeno puede lograrse con, por ejemplo, un anticuerpo IgG marcado.

Los antígenos de DIVA descritos en la presente descripción pueden comprender además mimitopos de antígenos DIVA descritos en la presente descripción. Un mimitopo es un epítopo de péptido aleatorio que imita un epítopo antigénico natural durante la presentación del epítopo. Los epítopos de péptidos aleatorios pueden identificarse mediante la generación o selección de una biblioteca de epítopos de péptidos aleatorios. La biblioteca se pone en contacto con un anticuerpo. Los mimitopos que se identifican son específicamente inmunorreactivos con el anticuerpo. Las bibliotecas de péptidos aleatorias pueden, por ejemplo, mostrarse en fagos o generarse como bibliotecas combinatorias.

Los antígenos DIVA de E. canis, por ejemplo, polipéptidos, pueden ser naturales, es decir, aislados de una fuente natural, o pueden ser sintéticos (es decir, sintetizados químicamente o producidos de forma recombinante mediante el uso de técnicas de ingeniería genética). Las proteínas naturales pueden aislarse de la bacteria completa mediante técnicas convencionales, tales como la cromatografía de afinidad. Los anticuerpos policlonales o monoclonales pueden usarse para preparar una columna de afinidad adecuada mediante técnicas bien conocidas.

Las proteínas que son inmunológicamente reactivas de forma cruzada con una proteína de E. canis natural pueden sintetizarse químicamente. Por ejemplo, los polipéptidos que tienen menos de aproximadamente 100 aminoácidos, más usualmente menos de aproximadamente 80 aminoácidos, y típicamente menos de aproximadamente 50 aminoácidos, pueden sintetizarse mediante el conocido método de síntesis en fase sólida de Merrifield donde los aminoácidos se adicionan secuencialmente a una cadena en crecimiento. Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2156). También pueden usarse proteínas recombinantes. Estas proteínas pueden producirse mediante la expresión en células cultivadas de moléculas de ADN recombinante que codifican una porción deseada del genoma de E. canis. La porción del genoma de E. canis puede ser natural o sintética, con genes naturales que pueden obtenerse de la bacteria aislada mediante técnicas convencionales.

Polinucleótidos de E. canis

Los polinucleótidos descritos en la presente descripción contienen menos de un genoma microbiano completo y pueden ser ácidos nucleicos monocatenarios o bicatenarios. Un polinucleótido puede ser ARN, ADN, ADNc, ADN genómico, ARN o ADN sintetizado químicamente o sus combinaciones. Los polinucleótidos pueden purificarse sin otros componentes, tales como proteínas, lípidos y otros polinucleótidos. Por ejemplo, el polinucleótido puede purificarse al 50 %, 75 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %. Una molécula de ácido nucleico que existe entre cientos y millones de otras moléculas de ácido nucleico dentro, por ejemplo, de bibliotecas genómicas o de ADNc, o cortes de gel que contienen un preparado de ADN genómico hidrolizado enzimáticamente no deben considerarse un polinucleótido aislado. Los polinucleótidos descritos en la presente descripción codifican los polipéptidos descritos en la presente descripción. Los polinucleótidos pueden codificar los polipéptidos mostrados en las SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, sus fragmentos, o sus combinaciones. Los polinucleótidos descritos en la presente descripción pueden consistir en menos de aproximadamente 200, 120, 100, 90, 75, 60, 57, 54, 45 (o cualquier intervalo entre 200 y 45) polinucleótidos de Ehrlichia canis contiguos, de origen natural. Los polinucleótidos descritos en la presente descripción pueden consistir en más de aproximadamente 45, 54, 57, 60, 75, 90, 100, 120, 150, 200, (o cualquier intervalo entre 45 y 200), o más polinucleótidos de Ehrlichia canis contiguos, de origen natural. Los polinucleótidos purificados pueden comprender nucleótidos heterólogos adicionales (es decir, nucleótidos que no son de Ehrlichia canis) e incluso aminoácidos adicionales de Ehrlichia canis siempre que no aparezcan naturalmente de forma contigua con los polinucleótidos p16 de Ehrlichia canis u otros polinucleótidos descritos en la presente descripción. Los polinucleótidos descritos en la presente descripción pueden comprender otras secuencias de nucleótidos, tales como secuencias que codifican para enlazadores, secuencias señal, secuencias de transferencia de parada de TMR, dominios de transmembrana, o ligandos útiles en la purificación de proteínas tales como glutatión-S-transferasa, etiqueta de histidina y proteína A de estafilococo.

Los polinucleótidos descritos en la presente descripción pueden aislarse. Un polinucleótido aislado es un polinucleótido de origen natural que no es inmediatamente contiguo a una o ambas de las secuencias genómicas flanqueantes 5' y 3' con las que se asocia de forma natural. Un polinucleótido aislado puede ser, por ejemplo, una molécula de ADN recombinante de cualquier longitud, siempre y cuando se eliminen o estén ausentes las secuencias de ácido nucleico que naturalmente flanquean de manera inmediata la molécula de ADN recombinante en un genoma de origen natural. Los polinucleótidos aislados también incluyen moléculas de ácido nucleico de origen no natural. Una molécula de ácido nucleico que existe entre cientos y millones de otras moléculas de ácido nucleico dentro, por ejemplo, de bibliotecas genómicas o de ADNc, o cortes de gel que contienen un preparado de ADN genómico hidrolizado enzimáticamente no deben considerarse un polinucleótido aislado. La secuencia de nucleótidos completa para E. canis está disponible en, por ejemplo, GenBank como número de acceso de NCBI: NZ_AAEJ01000001.

Los polinucleótidos descritos en la presente descripción pueden comprender además fragmentos que codifican polipéptidos inmunogénicos. Los polinucleótidos descritos en la presente descripción pueden codificar polipéptidos de longitud completa, fragmentos de polipéptidos y variantes de polipéptidos o polipéptidos de fusión.

Las secuencias de nucleótidos degeneradas que codifican polipéptidos descritos en la presente descripción, así como también las secuencias de nucleótidos homólogas que son al menos aproximadamente 80, o aproximadamente 90, 96, 98, o 99 % idénticas a las secuencias de polinucleótidos descritas en la presente descripción y sus complementos son también polinucleótidos descritos en la presente descripción. La identidad de secuencia en por ciento puede calcularse como se describió en la sección "Polipéptidos". Las secuencias de nucleótidos degeneradas son polinucleótidos que codifican un polipéptido descrito en la presente descripción o sus fragmentos, pero difieren en la secuencia de ácido nucleico de la secuencia de polinucleótidos de tipo salvaje, debido a la degeneración del código genético. Las moléculas de ADN complementario (ADNc), los homólogos de especies, y las variantes de los polinucleótidos de E. canis que codifican polipéptidos de E. canis biológicamente funcionales también son polinucleótidos de E. canis. Los polinucleótidos descritos en la presente descripción pueden aislarse a partir de secuencias de ácidos nucleicos presentes en, por ejemplo, una muestra biológica, tal como sangre, suero, saliva o tejido de un individuo infectado. Los polinucleótidos también pueden sintetizarse en el laboratorio, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador automático. Un método de amplificación tal como PCR puede usarse para amplificar polinucleótidos de ADN genómico o ADNc que codifica los polipéptidos.

Los polinucleótidos descritos en la presente descripción pueden comprender secuencias codificantes para polipéptidos de origen natural o pueden codificar secuencias alteradas que no son de origen natural. Si es conveniente, los polinucleótidos pueden clonarse en un vector de expresión que comprende elementos de control de la expresión, que incluyen, por ejemplo, orígenes de replicación, promotores, potenciadores u otros elementos reguladores que impulsan la expresión de los polinucleótidos descritos en la presente descripción en células hospederas. Un vector de expresión puede ser, por ejemplo, un plásmido, tal como pBR322, pUC, o ColE1, o un vector de adenovirus, tal como un vector de adenovirus de tipo 2 o un vector de tipo 5. Opcionalmente, pueden usarse otros vectores, que incluyen pero no se limitan al virus Sindbis, virus de simios 40, vectores de alfavirus, vectores de poxvirus y vectores de citomegalovirus y retrovíricos, tales como el virus del sarcoma murino, virus del tumor de mama de ratón, virus de la leucemia murina de Moloney y virus del sarcoma de Rous. Los minicromosomas tales como MC y MC1, bacteriófagos, fagamidos, cromosomas artificiales de levadura, cromosomas artificiales bacterianos, partículas de virus, partículas similares a virus, cósmidos (plásmidos en los que se insertaron sitios cos de fagos lambda) y replicones (elementos genéticos que son capaces de replicarse bajo su propio control en una célula) también pueden usarse.

Los métodos para preparar polinucleótidos unidos operativamente a una secuencia de control de expresión y expresarlos en una célula hospedera se conocen bien en la técnica. Ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos NO 4,366,246. Un polinucleótido descrito en la presente descripción se une operativamente cuando se posiciona adyacente a o cerca de uno o más elementos de control de la expresión, que dirigen la transcripción y/o traducción del polinucleótido.

Los polinucleótidos descritos en la presente descripción pueden usarse, por ejemplo, como sondas o cebadores, por ejemplo, cebadores de PCR, para detectar la presencia de polinucleótidos de E. canis en una muestra de prueba, tal como una muestra biológica. Las sondas son moléculas capaces de interactuar con un ácido nucleico diana, típicamente de una manera específica de secuencia, por ejemplo, a través de hibridación. Los cebadores son un subconjunto de sondas que pueden soportar una manipulación enzimática y que pueden hibridarse con un ácido nucleico diana de manera que ocurra la manipulación enzimática. Un cebador puede fabricarse a partir de cualquier combinación de nucleótidos o derivados de nucleótidos o análogos disponibles en la técnica que no interfieren con la manipulación enzimática.

Una sonda o cebador puede ser aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más nucleótidos contiguos que codifican polipéptidos mostrados en, por ejemplo, las SEQ ID NO:22-33.

La hibridación de ácidos nucleicos se entiende bien en la técnica. Típicamente, una sonda puede fabricarse a partir de cualquier combinación de nucleótidos o derivados de nucleótidos o análogos disponibles en la técnica. La capacidad de tales sondas y cebadores para hibridarse específicamente con las secuencias de polinucleótidos de E. canis les permitirá ser de uso en la detección de la presencia de secuencias complementarias en una muestra de prueba dada. Las sondas de polinucleótidos y los cebadores descritos en la presente descripción pueden hibridarse a secuencias complementarias en una muestra de prueba tal como una muestra biológica, que incluye saliva, esputo, sangre, plasma, suero, orina, heces fecales, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, exudado de heridas, o tejido. Los polinucleótidos de la muestra pueden someterse, por ejemplo, a electroforesis en gel u otras técnicas de separación por tamaño o pueden inmovilizarse sin separación por tamaño. Las sondas de polinucleótidos o los cebadores pueden etiquetarse. Las etiquetas adecuadas, y los métodos para etiquetar sondas y cebadores se conocen en la técnica, e incluyen, por ejemplo, etiquetas radiactivas incorporadas por traducción de mella o por cinasa, etiquetas de biotina, etiquetas fluorescentes, etiquetas quimioluminiscentes, etiquetas bioluminiscentes, etiquetas de quelantes de metal y etiquetas enzimáticas. Los polinucleótidos de la muestra se ponen en contacto con las sondas o cebadores en condiciones de hibridación estrictas adecuadas.

En dependencia de la aplicación, pueden usarse condiciones variables de hibridación para lograr diversos grados de selectividad de la sonda o el cebador hacia la secuencia diana. Para aplicaciones que requieren una alta selectividad, pueden usarse condiciones relativamente estrictas, tales como condiciones de baja sal y/o alta temperatura, tales como las proporcionadas por una concentración de sal de aproximadamente 0,02 M a aproximadamente 0,15 M de sal a temperaturas de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 70 °C. Para aplicaciones que requieren menos selectividad, pueden usarse condiciones de hibridación menos estrictas. Por ejemplo, las condiciones de sal de aproximadamente 0,14 M a aproximadamente 0,9 M de sal, a temperaturas en el intervalo de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 55 °C. La presencia de un complejo hibridado que comprende la sonda o el cebador y un polinucleótido complementario a partir de la muestra de prueba indica la presencia de E. canis o un polinucleótido de E. canis en la muestra.

Anticuerpos

Los anticuerpos descritos en la presente descripción son moléculas de anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido de E. canis descrito en la presente descripción, variantes de polipéptidos descritos en la presente descripción, o sus fragmentos. Un anticuerpo descrito en la presente descripción puede ser específico para un polipéptido de Ehrlichia canis, por ejemplo, un anticuerpo específico para una o más de las SEQ ID NO:10, 22-33. Un anticuerpo descrito en la presente descripción puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo de cadena única (scFv), o un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo. Los fragmentos de unión al antígeno de los anticuerpos son la porción de unión al antígeno de un anticuerpo intacto que comprende el sitio de unión al antígeno o la región variable de un anticuerpo intacto, en donde la porción está libre de los dominios constantes de cadena pesada de la región Fc del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de unión al antígeno incluyen los fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 y Fv.

Un anticuerpo descrito en la presente descripción puede ser cualquier clase de anticuerpo, que incluye, por ejemplo, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Un anticuerpo o su fragmento se une a un epítopo de un polipéptido descrito en la presente descripción. Un anticuerpo puede producirse in vivo en animales de laboratorio adecuados o in vitro mediante el uso de técnicas de ADN recombinante. Los medios para preparar y caracterizar anticuerpos se conocen bien en la técnica. Ver, por ejemplo, Dean, Methods Mol. Biol. 80:23-37 (1998); Dean, Methods Mol. Biol. 32:361-79 (1994); Baileg, Methods Mol. Biol. 32:381-88 (1994); Gullick, Methods Mol. Biol. 32:389-99 (1994); Drenckhahn y otros Methods Cell. Biol. 37:7-56 (1993); Morrison, Ann. Rev. Immunol. 10:239-65 (1992); Wright y otros Crit. Rev. Immunol. 12:125-68 (1992). Por ejemplo, los anticuerpos policlonales pueden producirse al administrar un polipéptido descrito en la presente descripción a un animal, tal como un humano u otro primate, ratón, rata, conejo, cobaya, cabra, cerdo, perro, vaca, oveja, burro o caballo. El suero del animal inmunizado se recolecta y los anticuerpos se purifican del plasma por, por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio, seguido de cromatografía, tal como cromatografía de afinidad. Las técnicas para producir y procesar anticuerpos policlonales se conocen en la técnica.

“Se une específicamente” o “es específico para” significa que un primer antígeno, por ejemplo, un polipéptido de E. canis, reconoce y se une a un anticuerpo descrito en la presente descripción con mayor afinidad que a otras moléculas no específicas. “Se une específicamente” o “es específico para” también significa que un primer anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo inducido contra las SEQ ID NO:22-33, reconoce y se une a las SEQ ID NO:22-33, con mayor afinidad que a otras moléculas no específicas. Una molécula no específica es un antígeno que no comparte ningún epítopo común con el primer antígeno. Una molécula no específica puede no derivarse de Ehrlichia sp., y en particular puede no derivarse de Ehrlichia chaffeensis o Ehrlichia canis. “Ehrlichia sp.” se refiere a todas las especies del género Ehrlichia. Por ejemplo, un anticuerpo inducido contra un primer antígeno (por ejemplo, un polipéptido) al que se une más eficientemente que a un antígeno no específico puede describirse como una unión específica al primer antígeno. Un anticuerpo o su porción de unión al antígeno descrita en la presente descripción puede unirse específicamente a un polipéptido de las SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o sus fragmentos cuando se une con una afinidad de unión Ka de 1071/mol o más. La unión específica puede probarse mediante el uso, por ejemplo, de un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo de inmunotransferencia western mediante el uso de una metodología bien conocida en la técnica.

Los anticuerpos descritos en la presente descripción incluyen anticuerpos y sus fragmentos de unión al antígeno que (a) compiten con un anticuerpo de referencia para unirse a las SEQ ID NO:22-33 o sus fragmentos de unión al antígeno; (b) se unen al mismo epítopo de las SEQ ID NO:22-33 o sus fragmentos de unión al antígeno como un anticuerpo de referencia; (c) se unen a las SEQ ID NO:22-33 o sus fragmentos de unión al antígeno con sustancialmente la misma Kd que un anticuerpo de referencia; y/o (d) se unen a las SEQ ID NO:22-33 o sus fragmentos con sustancialmente la misma velocidad de disociación que un anticuerpo de referencia, en donde el anticuerpo de referencia es un anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno que se une específicamente a un polipéptido de las SEQ ID NO:22-33 o sus fragmentos de unión al antígeno con una afinidad de unión Ka de 107 1/mol o más.

Adicionalmente, también pueden producirse fácilmente anticuerpos monoclonales dirigidos contra epítopos presentes en un polipéptido descrito en la presente descripción. Por ejemplo, los linfocitos B normales de un mamífero, tal como un ratón, que se inmunizó con un polipéptido descrito en la presente descripción pueden fusionarse con, por ejemplo, células de mieloma de ratón sensibles a HAT para producir hibridomas. Los hibridomas que producen anticuerpos específicos contra E. canis pueden identificarse mediante el uso de RIA o ELISA y aislarse mediante clonación en agar semisólido o mediante dilución limitante. Los clones que producen los anticuerpos específicos contra E. canis se aíslan mediante otra ronda de cribado. Los anticuerpos monoclonales pueden cribarse para determinar la especificidad mediante el uso de técnicas estándar, por ejemplo, al unir un polipéptido descrito en la presente descripción a una placa de microtitulación y medir la unión del anticuerpo monoclonal mediante un ensayo ELISA. Las técnicas para producir y procesar anticuerpos monoclonales se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975). Los isotipos particulares de un anticuerpo monoclonal pueden prepararse directamente, mediante la selección de la fusión inicial, o preparados secundariamente, a partir de un hibridoma parental que secreta un anticuerpo monoclonal de un isotipo diferente mediante el uso de una técnica de selección sib para aislar variantes de conmutación de clase. Ver Steplewski y otros, P.N.A.S. U.S.A. 82:8653 1985; Spria y otros, J. Immunolog. Meth.

74:307, 1984. Los anticuerpos monoclonales descritos en la presente descripción también pueden ser anticuerpos monoclonales recombinantes. Ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos NO 4,474,893; patente de Estados Unidos NO 4,816,567. Los anticuerpos descritos en la presente descripción también pueden construirse químicamente. Ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos NO 4,676,980.

Los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden ser quiméricos (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos NO 5,482,856), humanizados (ver, por ejemplo, Jones y otros, Nature 321:522 (1986); Reichmann y otros, Nature 332:323 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593 (1992)), o anticuerpos humanos. Los anticuerpos humanos pueden producirse, por ejemplo, mediante inmortilización directa, visualización en fagos, ratones transgénicos o una metodología Trimera, ver, por ejemplo, Reisener y otros, Trends Biotechnol. 16:242-246 (1998).

Los anticuerpos que se unen específicamente a los antígenos de E. canis (por ejemplo, los polipéptidos de E. canis mostrados en las SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33), son particularmente útiles para detectar la presencia de E. canis o antígenos de E. canis en una muestra, tal como una muestra de suero, sangre, plasma, heces fecales, células, tejidos, orina o saliva de un animal infectado con E. canis tal como un ser humano o un perro. Un inmunoensayo para E. canis o un antígeno de E. canis puede utilizar un anticuerpo o varios anticuerpos. Un inmunoensayo para E. canis o un antígeno de E. canis puede usar, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal específico para un epítopo de E. canis, una combinación de anticuerpos monoclonales específicos para epítopos de un polipéptido de E. canis, anticuerpos monoclonales específicos para epítopos de diferentes polipéptidos de E. canis, anticuerpos policlonales específicos para el mismo antígeno de E. canis, anticuerpos policlonales específicos para diferentes antígenos de E. canis o una combinación de anticuerpos monoclonales. Los protocolos de inmunoensayo pueden basarse en, por ejemplo, ensayos de competencia, reacción directa o tipo sándwich que usan, por ejemplo, un anticuerpo etiquetado. Los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden etiquetarse con cualquier tipo de etiqueta conocida en la técnica, que incluye, por ejemplo, etiquetas fluorescentes, quimioluminiscentes, radiactivas, enzimáticas, metálicas coloidales, de radioisótopos y bioluminiscentes.

Los anticuerpos descritos en la presente descripción o sus fragmentos de unión al antígeno pueden unirse a un soporte y usarse para detectar la presencia de E. canis o un antígeno de E. canis, por ejemplo, un antígeno DIVA de E. canis o un antígeno vacunal contra E. canis. Los soportes incluyen, por ejemplo, vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nailon, amilasas, celulosa natural y modificada, poliacrilamidas, agarosa y magletita.

Los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden usarse además para aislar organismos E. canis o antígenos de E. canis por columnas de inmunoafinidad. Los anticuerpos pueden fijarse a un soporte sólido mediante, por ejemplo, adsorción o por enlace covalente de manera que los anticuerpos mantengan su actividad inmunoselectiva. Opcionalmente, los grupos separadores pueden incluirse de manera tal que el sitio de unión al antígeno del anticuerpo aún sea accesible. Los anticuerpos inmovilizados pueden usarse para unirse a los organismos E. canis o a los antígenos de E. canis de una muestra, tal como una muestra biológica que incluye saliva, suero, esputo, sangre, orina, heces fecales, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, exudado de heridas, o tejido. Los organismos E. canis o los antígenos de E. canis unidos se recuperan de la matriz de la columna, por ejemplo, mediante un cambio en el pH.

Los anticuerpos descritos en la presente descripción también pueden usarse en estudios de inmunolocalización para analizar la presencia y distribución de un polipéptido descrito en la presente descripción durante varios eventos celulares o condiciones fisiológicas. Los anticuerpos también pueden usarse para identificar moléculas implicadas en la inmunización pasiva e identificar moléculas implicadas en la biosíntesis de antígenos no proteicos. La identificación de tales moléculas puede ser útil en el desarrollo de vacunas. Los anticuerpos descritos en la presente descripción, que incluyen, por ejemplo, anticuerpos monoclonales y anticuerpos de cadena única, pueden usarse para monitorear el curso de mejora de una enfermedad causada por E. canis. Mediante la medición del aumento o disminución de los anticuerpos contra E. canis específicos para los antígenos de E. canis en una muestra de prueba de un animal, puede determinarse si un régimen terapéutico particular destinado a mejorar el trastorno es efectivo. Los anticuerpos pueden detectarse y/o cuantificarse mediante el uso, por ejemplo, de ensayos de unión directa tales como RIA, ELISA o ensayos de inmunodetección por transferencia western.

Detección

Los métodos descritos en la presente descripción pueden usarse para detectar anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno específicos para antígenos de Ehrlichia canis o polinucleótidos de Ehrlichia canis en una muestra de prueba, tal como una muestra biológica, una muestra ambiental, o una muestra de laboratorio. Una muestra de prueba puede comprender potencialmente polinucleótidos de Ehrlichia sp., polinucleótidos de Ehrlichia canis, polipéptidos de Ehrlichia sp., polipéptidos de Ehrlichia canis, anticuerpos específicos para Ehrlichia sp., y/o anticuerpos específicos para Ehrlichia canis, polinucleótidos no relacionados y polipéptidos, sus combinaciones, o ninguno de los anteriores. Una muestra biológica puede incluir, por ejemplo, sueros, sangre, células, plasma, saliva, orina, heces fecales, o tejido de un mamífero tal como un caballo, gato, perro o ser humano. La muestra de prueba puede ser no tratada, precipitada, fraccionada, separada, diluida, concentrada, o purificada.

Los métodos descritos en la presente descripción pueden comprender poner en contacto uno o más polipéptidos descritos en la presente descripción con una muestra de prueba en condiciones que permiten la formación de complejos polipéptidos/anticuerpos, es decir, inmunocomplejos. Es decir, los polipéptidos descritos en la presente descripción se unen específicamente a los anticuerpos específicos para los antígenos de Ehrlichia canis ubicados en la muestra. Uno o más polipéptidos descritos en la presente descripción pueden unirse específicamente a anticuerpos que son específicos para los antígenos de Ehrlichia canis y pueden no unirse específicamente a antígenos de otros patógenos, tales como, por ejemplo, antígenos de Ehrlichia chaffeensis. Un experto en la técnica está familiarizado con ensayos y condiciones que se usan para detectar la unión del complejo anticuerpo/polipéptido. Se detecta la formación de un complejo entre polipéptidos y anticuerpos en la muestra. La formación de complejos de anticuerpo/polipéptido es una indicación de que los polipéptidos de Ehrlichia canis están presentes en la muestra. La falta de detección de los complejos polipéptidos/anticuerpos es una indicación de que los polipéptidos de Ehrlichia canis no están presentes en la muestra.

Los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden usarse en un método de detección de antígenos de Ehrlichia canis al obtener una muestra de prueba de, por ejemplo, un ser humano o animal sospechoso de tener una infección por Ehrlichia canis. La muestra de prueba se pone en contacto con los anticuerpos descritos en la presente descripción en condiciones que permiten la formación de complejos anticuerpo-antígeno (es decir, inmunocomplejos). Un experto en la técnica es consciente de las condiciones que permiten y son apropiadas para la formación de complejos antígeno/anticuerpo. La cantidad de complejos anticuerpo-antígeno puede determinarse mediante la metodología conocida en la técnica. Un nivel que es mayor que el que se forma en una muestra de control negativo indica la presencia de antígenos de Ehrlichia canis. Una muestra de control negativo es una muestra que no comprende ningún polipéptido de Ehrlichia canis. El control negativo puede contener polipéptidos de Ehrlichia sp. Un anticuerpo puede ser específico para los antígenos de Ehrlichia canis y puede no ser específico para los antígenos de otros patógenos, tales como, por ejemplo, los antígenos de Ehrlichia chaffeensis. Alternativamente, un polipéptido descrito en la presente descripción puede ponerse en contacto con una muestra de prueba. Los anticuerpos específicos para Ehrlichia canis en una muestra de prueba positiva formarán complejos antígeno-anticuerpo en condiciones adecuadas. La cantidad de complejos anticuerpo-antígeno puede determinarse mediante métodos conocidos en la técnica.

La infección por Ehrlichia canis puede detectarse en un sujeto. Se obtiene una muestra biológica del sujeto. Uno o más polipéptidos purificados que comprenden la SEQ ID NO:22-33 u otros polipéptidos descritos en la presente descripción se ponen en contacto con la muestra biológica en condiciones que permiten que se formen complejos polipéptidos/anticuerpos. Se detectan los complejos polipéptidos/anticuerpos. La detección de los complejos polipéptidos/anticuerpos es una indicación de que los anticuerpos específicos para Ehrlichia canis están presentes. La falta de detección de los complejos polipéptido/anticuerpo es una indicación de que el mamífero no tiene anticuerpos específicos para Ehrlichia canis.

Los anticuerpos para Ehrlichia canis detectados por un inmunoensayo descrito en la presente descripción pueden ser IgG, IgM, IgA, IgD o IgE. Los anticuerpos usados para detectar los antígenos de Ehrlichia canis pueden ser IgG, IgM, IgA, IgD o IgE.

La infección por Ehrlichia canis puede detectarse en un sujeto en unos 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 16 días, 17 días, 18 días, 19 días, 20 días, 21 días o más después de que el sujeto adquirió la infección por Ehrlichia canis. La infección por Ehrlichia canis puede detectarse en un sujeto en unos 21 días, 20 días, 19 días, 18 días, 17 días, 16 días, 15 días, 14 días, 13 días, 12 días, 11 días, 10 días, 9 días, 8 días, 7 días, 6 días, 5 días o menos después de que el sujeto adquirió la infección por Ehrlichia canis.

El complejo polipéptido/anticuerpo puede detectarse cuando un reactivo indicador, tal como un conjugado enzimático, que se une al anticuerpo, cataliza una reacción detectable. Opcionalmente, un reactivo indicador que comprende un compuesto generador de señal puede aplicarse al complejo polipéptido/anticuerpo en condiciones que permiten la formación de un complejo polipéptido/anticuerpo/indicador. Se detecta el complejo polipéptido/anticuerpo/indicador. Opcionalmente, el polipéptido o anticuerpo puede marcarse con un reactivo indicador antes de la formación de un complejo polipéptido/anticuerpo. El método puede comprender opcionalmente un control positivo o negativo.

Uno o más anticuerpos descritos en la presente descripción pueden unirse a una fase sólida o sustrato. Se adiciona al sustrato una muestra de prueba que potencialmente comprende una proteína que comprende un polipéptido descrito en la presente descripción. Se adicionan uno o más anticuerpos que se unen específicamente a los polipéptidos descritos en la presente descripción. Los anticuerpos pueden ser los mismos anticuerpos usados en la fase sólida o pueden ser de una fuente o especie diferente y pueden unirse a un reactivo indicador, tal como un conjugado enzimático. Las etapas de lavado pueden realizarse antes de cada adición. Se adiciona un cromóforo o sustrato enzimático y se permite el desarrollo de color. La reacción de color se detiene y el color puede cuantificarse mediante el uso, por ejemplo, de un espectrofotómetro.

Uno o más anticuerpos descritos en la presente descripción pueden unirse a una fase sólida o sustrato. Se adiciona al sustrato una muestra de prueba que potencialmente comprende una proteína que comprende un polipéptido descrito en la presente descripción. Se adicionan segundos anticuerpos antiespecies que se unen específicamente a los polipéptidos descritos en la presente descripción. Estos segundos anticuerpos son de una especie diferente a los anticuerpos de fase sólida. Se adicionan terceros anticuerpos antiespecies que se unen específicamente a los segundos anticuerpos y que no se unen específicamente a los anticuerpos de fase sólida. Los terceros anticuerpos pueden comprender un reactivo indicador tal como un conjugado enzimático. Las etapas de lavado pueden realizarse antes de cada adición. Se adiciona un cromóforo o sustrato enzimático y se permite el desarrollo de color. La reacción de color se detiene y el color puede cuantificarse mediante el uso, por ejemplo, de un espectrofotómetro.

Los ensayos descritos en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, los basados en ensayos de competencia, reacción directa o tipo sándwich, que incluyen, pero no se limitan a, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), inmunotransferencia occidental, IFA, radioinmunoensayo (RIA), hemaglutinación (HA), inmunoensayo de polarización de fluorescencia (FPIA), y ensayos de placa de microtitulación (cualquier ensayo realizado en uno o más pocillos de una placa de microtitulación). Un ensayo descrito en la presente descripción comprende un ensayo de unión cromatográfica de flujo reversible, por ejemplo un ensayo SNAP®. Ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 5,726,010.

Los ensayos pueden usar fases o sustratos sólidos o pueden realizarse mediante inmunoprecipitación o cualquier otro método que no utilice fases sólidas. Cuando se usa una fase sólida o sustrato, uno o más polipéptidos descritos en la presente descripción se unen directa o indirectamente a un soporte sólido o a un sustrato tal como un pocillo de microtitulación, perlas magnéticas, perlas no magnéticas, columna, matriz, membrana, estera fibrosa compuesta de fibras sintéticas o naturales (por ejemplo, materiales de vidrio o a base de celulosa o polímeros termoplásticos, tales como, por ejemplo, polietileno, polipropileno, o poliéster), estructura sinterizada compuesta de materiales en forma de partículas (por ejemplo, vidrio o varios polímeros termoplásticos), o película de membrana moldeada compuesta de nitrocelulosa, nailon, polisulfona o similares (generalmente de naturaleza sintética). Un sustrato puede ser sinterizado, partículas finas de polietileno, comúnmente conocidas como polietileno poroso, por ejemplo, polietileno poroso de 10 15 micras de Chromex Corporation (Albuquerque, NM). Todos estos materiales de sustrato pueden usarse en formas adecuadas, tales como películas, láminas o placas, o pueden recubrirse o unirse o laminarse a portadores inertes apropiados, tales como papel, vidrio, películas de plástico, o telas. Los métodos adecuados para inmovilizar péptidos en fases sólidas incluyen interacciones iónicas, hidrófobas, covalentes y similares. La inmovilización de uno o más reactivos de captura de analitos, por ejemplo, polipéptidos de E. canis, en un dispositivo o soporte sólido se realiza de manera que los procedimientos de muestra, diluyente y/o lavado no eliminen un reactivo de captura de analitos. Uno o más reactivos de captura de analitos pueden unirse a una superficie mediante adsorción física (es decir, sin el uso de enlazadores químicos) o mediante unión química (es decir, con el uso de enlazadores químicos). La unión química puede generar una unión más fuerte de los reactivos de captura en una superficie y proporcionar una orientación y conformación definidas de las moléculas unidas a la superficie.

En un tipo de formato de ensayo, uno o más polipéptidos pueden recubrirse en una fase sólida o sustrato. Una muestra de prueba que se sospecha que contiene anticuerpos anti-Ehrlichia canis o sus fragmentos de unión a antígenos se incuba con un reactivo indicador que comprende un compuesto generador de señal conjugado a un anticuerpo o fragmentos de anticuerpos específicos para Ehrlichia canis durante un tiempo y en condiciones suficientes para formar complejos antígeno/anticuerpo de cualquiera de los anticuerpos de la muestra de prueba a los polipéptidos de la fase sólida o el compuesto de reactivo indicador conjugado a un anticuerpo específico para Ehrlichia canis a los polipéptidos de la fase sólida. La reducción en la unión del reactivo indicador conjugado a los anticuerpos anti-Ehrlichia canis a la fase sólida puede medirse cuantitativamente. Una reducción medible de la señal en comparación con la señal generada a partir, por ejemplo, de una muestra de prueba de Ehrlichia canis negativa confirmada indica la presencia de anticuerpos anti-Ehrlichia canis en la muestra de prueba. Este tipo de ensayo puede cuantificar la cantidad de anticuerpos anti-Ehrlichia canis en una muestra de prueba.

En otro tipo de formato de ensayo, uno o más polipéptidos descritos en la presente descripción se recubren sobre un soporte o sustrato. Un polipéptido descrito en la presente descripción se conjuga a un reactivo indicador y se adiciona a una muestra de prueba. Esta mezcla se aplica al soporte o sustrato. Si los anticuerpos específicos para Ehrlichia canis están presentes en la muestra de prueba, se unirán al uno o más polipéptidos conjugados a un reactivo indicador y al uno o más polipéptidos inmovilizados en el soporte. Después puede detectarse el complejo polipéptido/anticuerpo/indicador. Este tipo de ensayo puede cuantificar la cantidad de anticuerpos anti-Ehrlichia canis en una muestra de prueba.

En otro tipo de formato de ensayo, uno o más polipéptidos descritos en la presente descripción se recubren sobre un soporte o sustrato. La muestra de prueba se aplica al soporte o sustrato y se incuba. Los componentes que no se unieron de la muestra se lavan mediante el lavado del soporte sólido con una solución de lavado. Si los anticuerpos específicos para Ehrlichia canis están presentes en la muestra de prueba, se unirán al polipéptido recubierto en la fase sólida. Este complejo polipéptido/anticuerpo puede detectarse mediante el uso de un segundo anticuerpo específico de la especie que se conjuga a un reactivo indicador. Después puede detectarse el complejo polipéptidos/anticuerpos/indicador de anticuerpos antiespecies. Este tipo de ensayo puede cuantificar la cantidad de anticuerpos anti-Ehrlichia canis en una muestra de prueba.

En la presente descripción se describe un dispositivo que es adecuado para un ensayo de flujo lateral. Por ejemplo, una muestra de prueba se adiciona a una matriz de flujo en una primera región (una zona de aplicación de muestra). La muestra de prueba se transporta en una trayectoria de flujo de fluido por acción capilar a una segunda región de la matriz de flujo donde una etiqueta capaz de unirse y formar un primer complejo con un analito en la muestra de prueba. El primer complejo se transporta a una tercera región de la matriz de flujo donde un polipéptido de E. canis se inmoviliza en una ubicación distinta. Se forma un segundo complejo entre un polipéptido inmovilizado y el primer complejo que incluye el anticuerpo de la muestra. Por ejemplo, un primer complejo que comprende una partícula de sol de oro y un polipéptido de E. canis unido a un anticuerpo para E. canis se unirá específicamente y formará un segundo complejo con un segundo polipéptido de E. canis inmovilizado o con un segundo anticuerpo dirigido a anticuerpos para E. canis. La etiqueta que es parte del segundo complejo puede visualizarse directamente.

En otro aspecto, se describen en la presente descripción uno o más reactivos de unión específicos etiquetados que pueden mezclarse con una muestra de prueba antes de su aplicación a un dispositivo descrito en la presente descripción. En este caso, no es necesario que se etiqueten los reactivos de unión específicos depositados y secarlos en una almohadilla de reactivo de unión específica en el dispositivo. Un reactivo de unión específico etiquetado, ya sea adicionado a una muestra de prueba o predepositado en el dispositivo, puede ser, por ejemplo, un anticuerpo etiquetado que se une específicamente a un anticuerpo para E. canis.

Un antígeno DIVA de E. canis o un antígeno vacunal de E. canis, por ejemplo, un polipéptido, puede ser un reactivo de captura de analito inmovilizado en una zona de reacción (fase sólida). Un segundo reactivo de captura de analito, por ejemplo un anticuerpo anti-IgG o anti-IgM, que se conjugó a una etiqueta, puede adicionarse a la muestra antes de adicionar la muestra al dispositivo, o el segundo reactivo de captura de analito puede incorporarse al dispositivo. Por ejemplo, el reactivo de unión específico etiquetado puede depositarse y secarse en una trayectoria de flujo de fluido que proporciona una comunicación de fluidos entre la zona de aplicación de la muestra y la fase sólida. El contacto del reactivo de unión específico etiquetado con la muestra de fluido da como resultado la disolución del reactivo de unión específico etiquetado.

El dispositivo puede incluir, además, un reactivo líquido que transporta material no unido (por ejemplo, muestra de fluido no reaccionado y reactivos de unión específicos no unidos) fuera de la zona de reacción (fase sólida). Un reactivo líquido puede ser un reactivo de lavado y servir solo para eliminar material no unido de la zona de reacción, o puede incluir un reactivo detector y servir para eliminar material no unido y facilitar la detección de analitos. Por ejemplo, en el caso de un reactivo de unión específico conjugado a una enzima, el reactivo detector incluye un sustrato que produce una señal detectable tras la reacción con el conjugado enzima-anticuerpo en la zona reactiva. En el caso de un reactivo de unión específico etiquetado conjugado a una molécula radiactiva, fluorescente o de absorción de luz, el reactivo detector actúa simplemente como una solución de lavado que facilita la detección de la formación del complejo en la zona reactiva mediante el lavado del reactivo etiquetado no unido.

Dos o más reactivos líquidos pueden estar presentes en un dispositivo, por ejemplo, un dispositivo puede comprender un reactivo líquido que actúa como un reactivo de lavado y un reactivo líquido que actúa como un reactivo detector y facilita la detección de analitos.

Un reactivo líquido puede incluir además una cantidad limitada de un “ inhibidor”, es decir, una sustancia que bloquea el desarrollo del producto final detectable. Una cantidad limitada es una cantidad de inhibidor suficiente para bloquear el desarrollo del producto final hasta que la mayoría o todo el exceso de material no unido se transporte lejos de la segunda región, en cuyo momento se produce el producto final detectable.

La formación de un complejo polipéptido/anticuerpo o un complejo polipéptido/anticuerpo/indicador puede detectarse, por ejemplo, mediante métodos radiométricos, colorimétricos, fluorométricos, de separación por tamaño, o de precipitación. Opcionalmente, la detección de un complejo polipéptido/anticuerpo es mediante la adición de un anticuerpo secundario que se acopla a un reactivo indicador que comprende un compuesto generador de señal. Los reactivos indicadores que comprenden compuestos generadores de señal (etiquetas) asociados con un complejo polipéptido/anticuerpo pueden detectarse mediante el uso de los métodos descritos anteriormente e incluyen agentes cromogénicos, catalizadores tales como enzimas conjugadas con compuestos fluorescentes tales como fluoresceína y rodamina, compuestos quimioluminiscentes tales como dioxetanas, acridinios, fenantridinios, rutenio, y luminol, elementos radiactivos, etiquetas visuales directas, así como también cofactores, inhibidores, partículas magnéticas, y similares. Los ejemplos de conjugados enzimáticos incluyen la fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, betagalactosidasa, y similares. La selección de una etiqueta particular no es crítica, pero será capaz de producir una señal ya sea por sí misma o junto con una o más sustancias adicionales.

La formación del complejo es indicativa de la presencia de anticuerpos anti-Ehrlichia canis en una muestra de prueba. Por lo tanto, los métodos descritos en la presente descripción pueden usarse para diagnosticar la infección por Ehrlichia canis en un animal.

Los métodos descritos en la presente descripción pueden indicar además la cantidad o cantidad de anticuerpos anti-Ehrlichia canis en una muestra de prueba. Con muchos reactivos indicadores, tales como conjugados enzimáticos, la cantidad de anticuerpo presente es proporcional a la señal generada. En dependencia del tipo de muestra de prueba, puede diluirse con un reactivo tampón adecuado, concentrarse, o ponerse en contacto con una fase sólida sin ninguna manipulación. Por ejemplo, por lo general se prefiere probar muestras de suero o plasma que se diluyeron previamente, o especímenes concentrados tales como orina, para determinar la presencia y/o cantidad de anticuerpo presente.

En la presente descripción se describen, además, kits de ensayo (por ejemplo, artículos de fabricación) para detectar anticuerpos anti-Ehrlichia canis o fragmentos de anticuerpos de unión al antígeno, o polipéptidos de Ehrlichia canis en una muestra. Un kit comprende uno o más polipéptidos descritos en la presente descripción y medios para determinar la unión del polipéptido a los anticuerpos anti-Ehrlichia canis o fragmentos de anticuerpos en la muestra. Un kit o artículo de fabricación puede comprender, además, uno o más anticuerpos o fragmentos de anticuerpos descritos en la presente descripción y medios para determinar la unión de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos a los polipéptidos de Ehrlichia canis en la muestra. Un kit puede comprender un dispositivo que contiene uno o más polipéptidos o anticuerpos descritos en la presente descripción e instrucciones de uso de uno o más polipéptidos o anticuerpos para, por ejemplo, la identificación de una infección por Ehrlichia canis en un mamífero. El kit puede comprender, además, material de empaque que comprende una etiqueta que indica que el uno o más polipéptidos o anticuerpos del kit pueden usarse para la identificación de la infección por Ehrlichia canis. Otros componentes tales como tampones, estabilizadores, controles positivos, controles negativos, reactivos de detectores y similares, conocidos por los expertos en la técnica, pueden incluirse en tales kits de prueba. Los polipéptidos, anticuerpos, ensayos, y kits descritos en la presente descripción son útiles, por ejemplo, en el diagnóstico de casos individuales de infección por Ehrlichia canis en un paciente, así como también en estudios epidemiológicos de brotes de Ehrlichia canis. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variarse, para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que optimizan sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos pueden proporcionarse como polvos secos, usualmente liofilizados, que en disolución proporcionarán una solución de reactivo que tenga las concentraciones adecuadas para combinarse con una muestra.

Los polipéptidos y ensayos descritos en la presente descripción pueden combinarse con otros polipéptidos o ensayos para detectar la presencia de Ehrlichia canis junto con otros organismos. Por ejemplo, los polipéptidos y ensayos descritos en la presente descripción pueden combinarse con reactivos que detectan el gusano del corazón y/o Borrelia burgdorferi y/o Ehrlichia chaffeensis y/o Anaplasma platys y/o Anaplasma phagocytophilum.

Los polinucleótidos descritos en la presente descripción pueden usarse para detectar la presencia de polinucleótidos de Ehrlichia canis en una muestra. Los polinucleótidos pueden usarse para detectar polinucleótidos de Ehrlichia canis en una muestra mediante una reacción de hibridación simple y, además, pueden usarse en, por ejemplo, reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) tales como una reacción de PCR en tiempo real. Los métodos y composiciones descritos en la presente descripción también pueden usarse para detectar de manera diferenciada la presencia de Ehrlichia canis de otras Ehrlichia sp., tal como Ehrlichia chaffeensis.

Los ensayos de PCR se describen bien en la técnica, que incluye, por ejemplo, la patente de Estados Unidos NO 4,683,195; patente de Estados Unidos NO 4,683,202; patente de Estados Unidos n O 4,965,188. Generalmente, los cebadores de polinucleótidos se hibridan a hebras desnaturalizadas de un ácido nucleico diana. Los productos de extensión de cebador se forman por polimerización de trifosfatos desoxinucleósidos mediante una polimerasa. A continuación, la PCR implica ciclos repetitivos de desnaturalización del ácido nucleico molde, hibridación de cebadores y extensión de los cebadores hibridados mediante la acción de una polimerasa termoestable. El proceso da como resultado la amplificación exponencial de los ácidos nucleicos de Ehrlichia canis diana en la muestra de prueba, lo que permite la detección de polinucleótidos diana que existen en concentraciones muy bajas en una muestra.

Los ensayos de PCR en tiempo real se basan en la detección de una señal, por ejemplo, una señal de informador fluorescente. Esta señal aumenta en proporción directa a la cantidad de producto de p Cr en una reacción. La PCR en tiempo real es cualquier técnica de amplificación que permite supervisar la evolución de una reacción de amplificación continua. Ver, Quantitation of DNA/RNA Using Real-Time PCR Detection, Perkin Elmer Applied Biosystems (1999); PCR Protocols (Academic Press New York, 1989). Al registrar la cantidad de emisión de fluorescencia en cada ciclo, es posible monitorear la reacción de PCR durante la fase exponencial donde el primer aumento significativo en la cantidad de producto de PCR se correlaciona con la cantidad inicial del molde diana. Cuanto mayor sea el número de copias iniciales de la diana de ácido nucleico, más pronto se observará un aumento significativo de la fluorescencia.

En la presente descripción se describe un método para detectar y/o cuantificar polinucleótidos de Ehrlichia canis en una muestra de prueba. Los cebadores directos y los cebadores inversos pueden adicionarse a una muestra de prueba en condiciones adecuadas para una reacción en cadena de la polimerasa. Los cebadores se hibridan con los polinucleótidos de Ehrlichia canis de manera que se forma un producto de amplificación si los polinucleótidos de Ehrlichia canis están presentes en la muestra de prueba. Se detectan productos de amplificación y se determina la presencia y/o cantidad de polinucleótidos de Ehrlichia canis. Los productos de amplificación pueden detectarse con una sonda de polinucleótidos que hibrida, en condiciones adecuadas para una reacción en cadena de la polimerasa, con una secuencia de polinucleótidos de Ehrlichia canis. El producto de amplificación puede cuantificarse mediante la medición de una señal de detección de la sonda y la comparación de dicha señal de detección con una segunda señal de detección de la sonda de un estándar de cuantificación. El estándar de cuantificación puede extraerse en paralelo con la muestra de prueba.

Métodos de tratamiento, mejora o prevención de una enfermedad causada por E. canis

Un polipéptido, polinucleótido o anticuerpo DIVA descrito en la presente descripción podría usarse para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad causada por E. canis. Sin embargo, si se usa un polipéptido DIVA para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad causada por E. canis, no podría, después de eso, usarse como un polipéptido DIVA para la detección y diferenciación de animales infectados, no vacunados y vacunados porque el sistema inmunitario de un animal vacunado podría reconocer el antígeno DIVA usado para la vacunación. Sin embargo, un polipéptido DIVA que no reacciona de forma cruzada con anticuerpos al polipéptido DIVA usado para el tratamiento, mejora o prevención de una enfermedad causada por E. canis todavía puede usarse como un antígeno DIVA de E. canis.

Por ejemplo, si la SEQ ID NO:2 o un fragmento de esta se usa como vacuna, entonces la SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 o sus combinaciones pueden usarse como un polipéptido DIVA, si no reaccionan de forma cruzada con anticuerpos específicos para la SEQ ID NO:2. Actualmente, ninguna de las SEQ ID NO:10, 22-33 se usa en una vacuna de subunidades comercial contra E. canis y las SEQ ID NO:10, 22-33 no detectan anticuerpos específicos para E. canis en animales vacunados con células de E. canis inactivadas enteras. Por lo tanto, la selección de polipéptidos DIVA no es actualmente un problema. Sin embargo, los expertos en la técnica conocen la composición de las vacunas de E. canis. Si una vacuna comercial de subunidades de E. canis comprendiera las SEQ ID n O:10, 22-33, entonces un experto en la técnica evitaría el uso de las SEQ ID NO:10, 22-33 (si es necesario debido a la generación de anticuerpos de E. canis específicos para las SEQ ID NO:10, 22-33) para diferenciar el estado de vacunación y en su lugar usaría otros antígenos DIVA de E. canis.

Por lo tanto, los polipéptidos, polinucleótidos y anticuerpos DIVA pueden usarse de dos maneras diferentes: (1) como composiciones para la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad o infección causada por E. canis; y (2) como un antígeno DIVA de E. canis para la detección y diferenciación de animales que están vacunados; no vacunados; infectados o no infectados con E. canis.

Los polipéptidos, polinucleótidos y anticuerpos descritos en la presente descripción pueden usarse para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad causada por E. canis. Por ejemplo, un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal descrito en la presente descripción o sus fragmentos, puede administrarse a un animal, tal como un ser humano. Un anticuerpo o sus fragmentos pueden administrarse a un animal en una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o sus fragmentos. Una cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad efectiva para aliviar los síntomas de la infección por E. canis o para reducir la cantidad de organismos de E. canis en un sujeto.

Los polipéptidos o polinucleótidos descritos en la presente descripción pueden estar presentes en una composición inmunogénica y usarse para provocar una respuesta inmunitaria en un huésped. Una composición inmunogénica es capaz de inducir una respuesta inmunitaria en un animal. Una composición inmunogénica de polipéptidos o polinucleótidos descrita en la presente descripción es particularmente útil para sensibilizar un sistema inmunitario de un animal de manera que, como resultado, se produce una respuesta inmunitaria que mejora o evita el efecto de la infección por E. canis. La inducción de una respuesta inmunitaria en un modelo animal puede ser útil para determinar, por ejemplo, dosis óptimas o rutas de administración. La inducción de una respuesta inmunitaria también puede usarse para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o infección causada por E. canis. Una respuesta inmunitaria incluye respuestas inmunitarias humorales o respuestas inmunitarias mediadas por células, o sus combinaciones. Una respuesta inmunitaria puede comprender además la promoción de una respuesta generalizada del huésped, por ejemplo, mediante la promoción de la producción de defensinas.

La generación de un título de anticuerpo por un animal contra E. canis puede ser importante en la protección contra la infección y la eliminación de la infección. La detección y/o cuantificación de los títulos de anticuerpos después del suministro de un polipéptido o polinucleótido puede usarse para identificar epítopos que son particularmente efectivos para obtener títulos de anticuerpos. Los epítopos responsables de una respuesta fuerte de los anticuerpos contra E. canis pueden identificarse al provocar anticuerpos dirigidos contra los polipéptidos de E. canis de diferentes longitudes. Los anticuerpos provocados por un epítopo de polipéptido particular pueden probarse mediante el uso, por ejemplo, de un ensayo ELISA para determinar qué polipéptidos contienen epítopos que son más efectivos para generar una respuesta fuerte. Los polipéptidos o proteínas de fusión que contienen estos epítopos o polinucleótidos que codifican los epítopos pueden construirse y usarse para provocar una respuesta fuerte de anticuerpos.

Un polipéptido, polinucleótido o anticuerpo descrito en la presente descripción puede administrarse a un mamífero, tal como un ratón, conejo, cobaya, macaco, babuino, chimpancé, humano, vaca, oveja, cerdo, caballo, perro, gato o a animales tales como pollos o patos, para obtener anticuerpos in vivo. La inyección de un polinucleótido tiene las ventajas prácticas de la simplicidad de construcción y modificación. Además, la inyección de un polinucleótido da como resultado la síntesis de un polipéptido en el huésped. Por lo tanto, el polipéptido se presenta al sistema inmunitario del huésped con modificaciones, estructura y conformación postraduccionales nativas. Un polinucleótido puede suministrarse a un sujeto como “ADN desnudo”.

La administración de un polinucleótido, polipéptido, o anticuerpo puede ser por cualquier medio conocido en la técnica, que incluye inyección intramuscular, intravenosa, intrapulmonar, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal o subcutánea, aerosol, intranasal, bomba de infusión, supositorio, mucosa, tópica y oral, que incluye la inyección mediante el uso de una pistola balística biológica (“pistola genética”). Un polinucleótido, polipéptido o anticuerpo puede acompañarse de un portador de proteína para la administración oral. Una combinación de métodos de administración también puede usarse para provocar una respuesta inmunitaria. Los anticuerpos pueden administrarse a una dosis diaria de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 200 mg. Los anticuerpos pueden administrarse a una dosis diaria de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 mg.

Los portadores y diluyentes farmacéuticamente aceptables para uso terapéutico se conocen bien en la técnica y se describen en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro ed. (1985)). El portador no debe inducir por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el hospedero. Tales portadores incluyen, pero no se limitan a, macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente, tales como proteínas, polisacáridos tales como SEPHA-ROSE® funcionalizada con látex, agarosa, celulosa, microesferas de celulosa y similares, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos tales como ácido poliglutámico, polilisina, y similares, copolímeros de aminoácidos, peptoides, liptoides, y células bacterianas o partículas de virus avirulentas. Los liposomas, hidrogeles, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradables, y bioadhesivos también pueden usarse como portadores de una composición descrita en la presente descripción.

Las sales farmacéuticamente aceptables también pueden usarse en las composiciones descritas en la presente descripción, por ejemplo, sales minerales tales como clorhidratos, hidrobromuro, fosfatos, o sulfatos, así como también sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, proprionatos, malonatos o benzoatos. Los sustratos proteicos especialmente útiles son las albúminas séricas, hemocianina de lapa de ojo de cerradura, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovoalbúmina, toxoide tetánico, y otras proteínas bien conocidas por los expertos en la técnica. Las composiciones descritas en la presente descripción también pueden contener líquidos o excipientes, tales como agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer, solución de Hank, glucosa, glicerol, dextrosa, malodextrina, etanol, o similares, individualmente o en combinación, así como también sustancias tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes para ajustar la tonicidad, detergentes, o agentes tamponantes de pH. También pueden usarse agentes activos adicionales, tales como agentes bactericidas.

Si se desea, las moléculas coestimuladoras, que mejoran la presentación del inmunógeno a los linfocitos, tales como B7-1 o B7-2, o citocinas tales como MIP1a, g M-CSF, IL-2 e IL-12, pueden incluirse en una composición descrita en la presente descripción. Opcionalmente, los adyuvantes también pueden incluirse en una composición. Los adyuvantes son sustancias que pueden usarse para aumentar de forma no específica una respuesta inmunitaria específica. Generalmente, un adyuvante y un polipéptido descritos en la presente descripción se mezclan antes de su presentación al sistema inmunitario, o se presentan por separado, pero se presentan en el mismo sitio del animal. Los adyuvantes pueden incluir, por ejemplo, coadyuvantes de aceite (por ejemplo, adyuvantes completos e incompletos de Freund) sales minerales (por ejemplo, Alk(SO4)2; AlNa(SO4)2, AlNH4(SO4), sílice, Alúmina, Al(OH)3, y Ca3(PO4)2), polinucleótidos (es decir, ácidos poliícos y poli AU), y ciertas sustancias naturales (es decir, cera D de Mycobacterium tuberculosis, así como también sustancias encontradas en Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis y miembros del género Brucella. Los adyuvantes que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a MF59-0, hidróxido de aluminio, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637), denominado no-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, denominado MTP-PE), y RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, lípido A de monofosforilo, trehalosa dimicolato y esqueleto de la pared celular (MPL+TDM+CWS) en una emulsión de escualeno al 2 %/TWEEN® 80.

Las composiciones descritas en la presente descripción pueden formularse en comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trocas, cápsulas, elixires, suspensiones, siropes, obleas, formulaciones inyectables, enjuagues bucales, dentríficos, y similares. El porcentaje de uno o más polipéptidos, polinucleótidos o anticuerpos descritos en la presente descripción en tales composiciones y preparaciones puede estar en el intervalo del 0,1 % al 60 % del peso de la unidad.

La administración de polipéptidos, polinucleótidos o anticuerpos puede provocar una respuesta inmunitaria en el animal que dura al menos 1 semana, 1 mes, 3 meses, 6 meses, 1 año, o más. Opcionalmente, una respuesta inmunitaria puede mantenerse en un animal al proporcionar una o más inyecciones de refuerzo del polipéptido, polinucleótido, o anticuerpos en 1 mes, 3 meses, 6 meses, 1 año o más después de la inyección primaria. Si se desea, las moléculas coestimuladoras o los adyuvantes también pueden proporcionarse antes, después, o junto con las composiciones.

Una composición descrita en la presente descripción que comprende un polipéptido, polinucleótido, anticuerpo, o una de sus combinaciones se administra de una manera compatible con la composición particular usada y en una cantidad que es efectiva para inducir una respuesta inmunitaria como se detecta por, por ejemplo, un ELISA. Un polinucleótido puede inyectarse intramuscularmente a un mamífero, tal como un babuino, chimpancé, perro o ser humano, a una dosis de 1 ng/kg, 10 ng/kg, 100 ng/kg, 1000 ng/kg, 0,001 mg/kg, 0,1 mg/kg o 0,5 mg/kg. Un polipéptido o anticuerpo puede inyectarse intramuscularmente a un mamífero a una dosis de 0,01, 0,05, 0,5, 0,75, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 5 o 10 mg/kg.

Los polipéptidos, polinudeótidos o anticuerpos, o una de sus combinaciones pueden administrarse a un animal que no está infectado con E. canis o puede administrarse a un animal infectado con E. canis. Las dosis particulares de polinucleótido, polipéptidos o anticuerpos en una composición dependerán de muchos factores que incluyen, pero no se limitan a la especie, edad, sexo, medicación concurrente, condición general del mamífero al que se administra la composición, y el modo de administración de la composición. Una cantidad efectiva de la composición descrita en la presente descripción puede determinarse fácilmente mediante el uso solamente de experimentación rutinaria.

Se proporciona, además, un método para monitorear una infección por E. canis en un paciente. El método incluye determinar el nivel de anticuerpos anti-E. canis en una muestra de un fluido biológico de un paciente que padece o está en riesgo de padecer una infección por E. canis en un primer punto de tiempo mediante el uso de polipéptidos descritos en la presente descripción. El nivel de anticuerpos anti-E. canis se determina en una o más muestras del fluido biológico del paciente en uno o más puntos de tiempo diferentes. Los niveles de anticuerpos anti-E. canis se determinan en diferentes puntos de tiempo de manera que se monitorea la infección por E. canis. El nivel o la cantidad de anticuerpos anti-E. canis proporcionan una indicación del éxito del tratamiento o la terapia, o de la progresión de la infección.

En cada caso en la presente descripción, cualquiera de los términos "que comprende", "que consiste esencialmente de" y "que consiste de" puede reemplazarse con cualquiera de los otros dos términos, mientras que retiene sus significados ordinarios. Los términos y expresiones que se emplearon se usan como términos de descripción y no de limitación, y no existe la intención de que en el uso de tales términos y expresiones se excluya cualquier equivalente de las características mostradas y descritas o sus porciones.

En adición, cuando las características o aspectos de la invención se describen en términos de grupos de Markush u otra agrupación de alternativas, los expertos en la técnica reconocerán que la invención también se describe de esta manera en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo de Markush u otro grupo.

Ejemplos

Ejemplo 1

Preparación de E. canis inactivada con formalina para su inmunización en perros

E. canis se cultiva en cultivo celular canino mediante el uso de los métodos descritos en la literatura. Ver, por ejemplo, Breitschwerdt, Antimicrobial Agents and chemotherapy, 1998, Vol. 42:362-368. Mediante el uso de microscopía óptica, se estimó que las células 030 se infectaron por E. canis por más del 80 %. Se recolectaron dos litros de cultivo celular infectado con E. canis, se centrifugaron y el sedimento se retuvo y produjo 7,31 g de material (peso húmedo). Se supone que el agua representa el 80 % del peso del material, lo que da un peso en seco estimado de 1,462 g (20 % del peso del material). El sedimento celular se resuspendió a 20 mg/ml en PBS (peso en seco) para un volumen total de 73 ml.

A este sedimento celular resuspendido, se adicionaron 0,73 ml de solución de formalina (Catálogo Sigma Solución de formalina HT50-1-2 al 10 %, tamponada a neutral) para una concentración final de formaldehído de 0,04 %. La solución se agitó durante toda la noche a 4 °C. La mezcla inactivada se centrifugó y el sedimento celular se retuvo. El sedimento se lavó mediante resuspensión en 250 ml de PBS. El material se recolectó mediante centrifugación y el lavado se repitió una vez.

El sedimento celular lavado se resuspendió en 73 ml de PBS. La muestra se distribuyó en alícuotas en 73 viales con tapón de rosca y se congeló a -80 °C. Cada vial contiene 20 mg (peso en seco) de cultivo celular de E. canis inactivada con formalina, adecuados para combinarse con el adyuvante adecuado para la inmunización en animales.

Ejemplo 2

Preparación de E. canis inactivada con formalina con dos adyuvantes diferentes, protocolo para la inmunización de beagles con antígeno de E. canis y análisis de sueros a partir de beagles inmunizados mediante el uso de SNAP® 3Dx®.

La preparación del antígeno con el adyuvante de hidróxido de aluminio es una técnica bien conocida para los expertos en la técnica. Por ejemplo, ver "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, 1988, pág. 99.

Para la inmunización en perros (beagles de laboratorio), se prepararon dos conjuntos de dosis con un adyuvante de hidróxido de aluminio preparado como se describió anteriormente y dos conjuntos de dosis se prepararon con un adyuvante Ribi (Corixa Corp., Seattle WA) mediante el uso del protocolo descrito por el fabricante. Cada dosis contenía aproximadamente 20 mg de cultivo celular de E. canis inactivada con formalina (peso en seco).

Los beagles de laboratorio mantenidos en la jaula se seleccionaron para la inmunización con el antígeno de E. canis inactivada con formalina. Dos grupos de dos perros cada uno; donde cada grupo usa un adyuvante diferente se dosificó con la preparación de E. canis inactivada con formalina (óxido de aluminio o Ribi). En el día 0 se observó que los 4 perros eran seronegativos con el uso tanto del diagnóstico SNAP® 3Dx® así como también del análisis de inmunotransferencia western mediante el uso del organismo E. canis.

El comité del IACUC de Covance Research Products Inc. aprobó el protocolo para la inmunización de beagles de laboratorio. Los perros se vacunaron los días 0, 28 y 56 con sangrados semanales de 1 ml monitorizados mediante el uso de SNAP® 3Dx ®. A todos los perros se les administró el artículo de prueba adecuado por vía subcutánea en el área dorsoescapular. Los cuatro animales seroconvirtieron a una prueba positiva en E. canis SNAP®3Dx® para el día 42. Los sangrados de producción se obtuvieron en los días 42 y 70 (aproximadamente 50 ml de sangre que produjo aproximadamente 25 ml de suero).

La Figura 1 muestra la evaluación del ensayo SNAP®3Dx® de los beagles de laboratorio. El dispositivo SNAP® se usó como se describió por el fabricante. La muestra “Pre” es del día 0. La muestra “Pos” es del día 42. El punto positivo a E. canis se vuelve positivo en los 4 perros para la muestra del día 42. Se observaron resultados similares para la muestra del día 70.

Experimentos con una tercera vacuna que comprende un tercer adyuvante, BCG, (Calbiochem of EMD Biosciences, Inc. San Diego, CA) reveló resultados similares. La preparación de la tercera vacuna fue idéntica a las preparaciones descritas para la vacuna complementaria Ribi descrita anteriormente, excepto: 1) la inactivación de formalina fue durante 24 horas a 4 °C, y 2) se adicionó 1 mg de BCG. El calendario de vacunación fue el día 0, día 14, con sangrados semanales analizados para determinar la reactividad con las proteínas de E. canis.

Ejemplo 3

Enriquecimiento de E. canis a partir de cultivo celular mediante el uso de gradientes de PERCOLL®.

Para el aislamiento de ADN y el análisis de inmunotransferencia western, E. canis se enriqueció a partir de un cultivo celular mediante el uso de gradientes de densidad de PERCOLL®. El proceso de aislamiento de patógenos intracelulares a partir del cultivo celular, tal como Ehrlichia, es una técnica bien conocida para los expertos en la técnica. Por ejemplo, ver Akira y otros (1982) Purification of Rickettsia tsutsugamushi by PERCOLL® density gradient centrifugation, Microbiol. Immunol., 26:321-328.

Un enriquecimiento típico de E. canis comenzó con 1,5 litros de cultivo celular infectado (ver más arriba). Las células se centrifugaron 6000 x g, el sedimento celular se retuvo y el sobrenadante se desechó. El sedimento celular se resuspendió en 20 ml de PBS, seguido de una segunda centrifugación. El sobrenadante se desechó y el sobrenadante se conservó. El sedimento se resuspendió en 20 ml de PBS, se sometió a ultrasonido durante 5 segundos a 20 kHz, ajuste de potencia 1,5 mediante el uso de un ultrasonido Branson. Después la muestra se centrifugó a 500 x g durante 5 minutos para sedimentar residuos grandes.

Se adicionó PERCOLL® al sobrenadante a una concentración final de 32 % (4,5 ml de PERCOLL® con 10 ml de muestra). La muestra se cargó en tubos Oak Ridge compatibles con un rotor de ultracentrífuga de 70,1 Ti y se centrifugó durante 30 minutos a 63000 x g. La banda opaca se recolectó mediante el uso de una pipeta Pasteur. La banda opaca está altamente enriquecida para Ehrlichia (confirmada mediante el uso de microscopía óptica de la muestra recolectada). Después de una dilución 1:4 con PBS, la muestra se alicuotó y se centrifugó a 12000 x g. El sobrenadante se desechó y el sedimento de Ehrlichia se conservó a -80 °C.

Ejemplo 4

Pruebas de sueros o plasma de perros vacunados e infectados por inmunotransferencia western.

El uso del análisis de gel de SDS-PAGE en 1 dimensión y el análisis de gel en 2 dimensiones (enfoque isoeléctrico en la1a dimensión, SDS-PAGE en la 2a dimensión) es bien conocido para los expertos en la técnica. Por ejemplo, ver Current Protocols in Molecular Biology, eds. F.M. Ausubel y otros, John Wiley & Sons Inc., 1997, páginas 10.2.2 10.3.11. El uso de inmunotranferencias Western para analizar proteínas separadas mediante el uso de estos métodos se conoce bien par los expertos en la técnica. Por ejemplo, ver Current Protocols in Molecular Biology, eds. F.M. Ausubel y otros, John Wiley & Sons Inc., 1997, páginas 10.8.1-10.8.116.

El trabajo inicial se realizó mediante el uso del análisis por inmunotransferencia western de proteínas separadas con geles 1D (datos no mostrados), seguido del análisis por inmunotransferencia western de proteínas separadas mediante el uso de geles 2D. Las proteínas de E. canis entera cosechadas a partir de cultivo celular se analizaron mediante el uso de electroforesis en gel 2D (materiales y reactivos usados como se describió por el fabricante; Bio-Rad Life Sciences Research, Hercules, CA 94547). La cantidad de muestra a cargar por gel se determinó empíricamente (ver Figura 2). Las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa y se probaron mediante el uso de sueros caninos de beagles de laboratorio en el día 0, perros vacunados con el antígeno de E. canis inactivada con formalina (ver arriba), o sueros de animales infectados con E. canis (ver Figuras 3, 4 y 5).

Se aislaron sueros y plasma caninos positivos de perros infectados con E. canis. La infección por E. canis se verificó mediante el análisis por inmunotransferencia western de linfocitos extraídos de sangre completa de estos perros, y se confirmó mediante el uso del ensayo IDEXX SNAP®3Dx® con suero o plasma canino (comercialmente disponible en IDEXX Laboratories Inc., usado como se describió por el fabricante).

Para el análisis de inmunotransferencia Western, las proteínas se separaron mediante el uso de geles de enfoque isoeléctrico/SDS-PAGE 1D o SDS-PAGE 2D seguidos de electrotransferencia de las proteínas de los geles a nitrocelulosa. Las transferencias en nitrocelulosa se incubaron en una solución de bloqueo de leche seca no grasa al 2,5 % disuelta en solución salina tamponada con Tris (pH 7,5), 0,05 % TWEEN® 20. Los sueros o el plasma caninos se diluyeron hasta el título como se describió en un tampón que contenía un lisado de E. coli para bloquear la unión no específica con suero normal de ternero al 30 % y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C. Después del lavado 3 veces en TBS-TWEEN® (0,05 %), las transferencias se transfirieron a un tampón que contenía suero fetal de ternero al 50 %, TBS-TWEEN®-Kathon al 50 % (0,05 % y 0,5 % respectivamente) para evitar la unión inespecífica de un anticuerpo policlonal anti-Fc canino de conejo conjugado a peroxidasa de rábano (Jackson Immuno Research, West Grove, PA 19390). El conjugado de anticuerpo policlonal anti-Fc canino de conejo se diluyó 1:5000. Los geles se lavaron 3 veces con TBS TWEEN® (0,05 %), una vez con TBS y la presencia de HRP se detectó mediante el uso de reactivos de detección de inmunotransferencia de ECL (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ 08855-1327) usados como se describió por el fabricante. Las imágenes digitales de la película de rayos X expuesta se capturaron mediante el uso de un GelDoc 2000 (Bio-Rad Inc.).

Ejemplo 5

Aislamiento del ADN de E. canis y construcción de una biblioteca de expresión lambda y cribado de la biblioteca de expresión lambda de E. canis para clones que tienen actividad DIVA.

La preparación y el cribado de bibliotecas de expresión lambda es una técnica bien conocida para los expertos en la técnica. Por ejemplo, ver Current Protocols in Molecular Biology, eds. F.M. Ausubel y otros, John Wiley & Sons Inc., 1997, páginas 5.1 a 5.8.6. Para la construcción de la biblioteca de expresión, el ADN genómico se purificó a partir de E. canis aislada a partir de cultivo celular mediante centrifugación por gradiente de PERCOLL® (ver más arriba). El ADN se purificó mediante el uso de un kit de purificación de ADN genómico de Qiagen Sciences (Germantown, MD). Para la construcción de la biblioteca se usó un kit de vectores EcoRI/CIAP prehidrolizado enzimáticamente Lambda ZAP® II (Stratagene Corp., La Jolla, CA 92037) como se especificó por el fabricante. El ADN genómico de E. canis se hidrolizó enzimáticamente parcialmente con TSP509 y los fragmentos que están en el intervalo de 2-6 kb se aislaron mediante el uso de electroforesis en gel de agarosa y se ligaron en el vector lambda. Los fagos se empaquetaron y crecieron como se especificó por el fabricante.

Se cribaron aproximadamente 120 000 placas lambdas individuales para la unión a sueros aislados de perros identificados como positivos para infección por E. canis, pero negativos para reactividad con sueros de animales vacunados con E. canis inactivada con formalina (ver más arriba). A partir del cribado inicial se identificaron 84 placas individuales con esta actividad.

Las placas lambda se sometieron a dos rondas de purificación de la placa y se volvieron a analizar para verificar la reactividad positiva con sueros de animales infectados por E. canis, reactividad negativa cuando se cribaron con sueros de animales vacunados.

Las placas lambda aisladas se sometieron a cribado para determinar la reactividad cruzada con sueros de animales identificados como seropositivos para Anaplasma phagocytophilia, Borrelia burgdorferi (agente causal de la enfermedad de Lyme), Rickettsia rickettsii (agente causal de la fiebre moteada de las Montañas Rocosas,), Leptospira interrogans y Dirofilaria immitis (agente causal del gusano del corazón canino).

Al final del proceso de cribado, se encontraron 43 placas lambda que reaccionaban con sueros de animales infectados con E. canis que no reaccionaban con sueros de perros vacunados o sueros de perros infectados con otros patógenos caninos (ver más arriba).

Mediante el uso de la característica ZAP® del vector de clonación según las instrucciones del fabricante, las inserciones en el vector lambda se convirtieron en plásmidos. Los plásmidos se transformaron en la cepa de E. coli XL-1 azul para la expresión de proteínas y el análisis de proteínas codificadas por inmunotransferencia western. Los extremos de los insertos de a Dn de E. canis se sometieron a análisis de secuencia de ADN mediante el uso de cebadores de secuenciación T7 y T3.

La información de la secuencia de tanto la reacción de T7 como de T3 para los 43 clones se envió para el análisis BLAST al sitio web del NCBI. Los resultados se tabularon en un formato Excel. En base a la identidad de la secuencia entre el clon y la secuencia del genoma de escopeta disponible para E. canis (NCBI: NZ_AAEJ01000001), se identificaron segmentos de ADN genómico para cada clon. Los clones individuales que compartían genes comunes se agruparon para un análisis posterior por inmunotransferencia western mediante el uso de grupos de sueros caninos infectados y vacunados. Basados en patrones de bandas similares, se eliminaron clones duplicados. Se eliminó cualquier clon que mostrara reactividad a ambos conjuntos de sueros. Como resultado de este análisis, se seleccionaron 23 clones para una evaluación adicional. La agrupación de los clones y el antígeno común por grupo se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2.

Ejemplo 6

Análisis de transferencia Western mediante el uso de muestras de suero canino individuales positivas a E. canis

Los 23 clones se analizaron en geles de SDS-PAGE individuales. Cada gel se transfirió a la nitrocelulosa y se sometió a la inmunotransferencia western mediante el uso de muestras individuales de sueros caninos de perros que solo eran positivos para infecciones por E. canis mediante la prueba ELISA/SNAP®. El suero canino se diluyó 1:500 en el mismo diluyente descrito en el Ejemplo 4 que contiene el lisado de E. coli y se detectó reactividad mediante el uso de técnicas colorimétricas estándar de peroxidasa de rábano picante (Opti-4CN, Bio-Rad). Se evaluó un total de trece muestras individuales de suero canino. Se compararon las manchas en las muestras para determinar el número de perros que muestran reactividad a una banda predominante o conjunto de bandas por clon. Los resultados se resumen en la Tabla 3 y la Figura 6 (los clones enumerados en negrita se representan en la figura).

Tabla 3.

Los 23 clones también se analizaron mediante inmunotransferencia western mediante el uso de sueros caninos combinados que habían dado positivo para otras enfermedades infecciosas transmitidas por vectores. Se evaluaron las muestras que dieron positivo por ELISA o SNAP® para las siguientes infecciones únicas: Gusano del corazón, Lyme, Anaplasma phagocytophilum, o E. ewingii. Ninguno de los clones identificados en la tabla anterior mostró reactividad cruzada con sueros caninos positivos para estas otras infecciones transmitidas por vectores.

Ejemplo 7

Identificación de segmentos génicos relevantes que codifican antígenos DIVA de E. canis.

a. Antígeno de 120 kDa

Este antígeno fue descrito previamente por Yu y otros (J Clin Microbiol. 2000 Jan;38(1):369-74; ver también McBride y otros, 2000 Infec. Immun. 68:13) y demostró ser útil en el diagnóstico de infecciones por E. canis en perros. Este antígeno se describió tanto como antígeno "p120" y como "p140" de E. canis. Ver, id. Yu y otros explican que una proteína recombinante expresada por el gen p120 tiene un tamaño molecular de 140 kDa en un gel de dodecilsulfato de sodio, que es mayor que la masa molecular prevista de la proteína. Ver, Yu y otros, página 373. El grupo Walker (Yu y otros, y McBride y otros) se refieren a la proteína como E. canis p120 y p140. Por lo tanto, esta descripción usa tanto p120 como p140 indistintamente para describir esta proteína. El número de acceso para el gen de E. canis p120/140 es AF112369 y la proteína asociada es AAD34330. Ver también, número de acceso YP302666. Los clones 2, 10, 17 y 33 contienen segmentos de longitud completa del gen del antígeno de 120 kDa. El clon 35 puede contener un truncamiento de este gen. (Ver, SEQ ID NO: 1 y 2).

Este gen se amplificó a partir de ADN genómico de E. canis y se subclonó en un sistema de expresión pET con una etiqueta de 6-His de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Los resultados de secuenciación de este plásmido coincidieron exactamente con la secuencia génica que codifica la proteína mostrada en la SEQ NO:ID 2, de los aminoácidos 58 a 589. Los lisados de proteínas de las bacterias BL21 inducidas para expresar esta proteína se analizaron mediante inmunotransferencia western con sueros caninos infectados y en comparación con los inmunotransferencias western sondeadas con sueros de animales vacunados con células de E. canis inactivadas en formalina. De acuerdo con hallazgos previos, solo los sueros de perros infectados reconocieron esta proteína del peso molecular esperado (datos no mostrados).

P120 tiene un resto de 36 aminoácidos que se repite 14 veces. Ver la SEQ ID NO:15. La porción repetida (región subrayada en la SEQ ID NO:15 es un péptido de 60 kD). La SEQ ID NO:16 muestra las 14 repeticiones alineadas. La SEQ ID NO:17 muestra la secuencia consenso de las 14 repeticiones.

En la presente descripción se describe un polipéptido que comprende:

KEEX1TPEVX2AEDLQPAVDX3SX4EHSSSEVGXsKVSX6TS (SEQ ID NO:17).

Donde

X1 = S o N

X2 = K o R

X3 = G, D, o S

X4 = V o I

X5 = E o K

Xa = E o K

En la presente descripción se describe un polipéptido multimérico donde la SEQ ID NO:17 se repite dos o más veces. El polipéptido multimérico puede comprender, además, uno o más polipéptidos heterólogos.

En la presente descripción se describe un polipéptido de la SEQ ID NO:21, XPEVKAEDLQPAVDGSVEHX, en donde cada una de las X = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 aminoácidos.

b. Antígeno de 200 kDa

Este antígeno se describió previamente por McBride y otros (J Clin Microbiol. 2001 Jan;39(1):315-22) y se demostró que es útil en el diagnóstico de ehrlichiosis. El número de acceso para este gen es AF252298 y la proteína asociada AAK01145. Una porción de esta secuencia de proteínas se asocia con una patente publicada (SEQ ID NO:2 de la patente de Estados Unidos NO 6,355,777, número de acceso AAE96254). Identificamos una región diferente de esta proteína que sirve como antígeno diagnóstico para la ehrlichiosis y un reactivo DIVA. La porción del gen se extiende desde el nucleótido 1081 de AF252298 hasta el extremo, el nucleótido 4266. (Ver SEQ ID NO: 3 y 4).

Este gen se amplificó a partir de ADN genómico de E. canis y se subclonó en un sistema de expresión pET con una etiqueta de 6-His de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Los resultados de secuenciación de este plásmido coincidieron exactamente con la secuencia génica que codifica la proteína mostrada en la SEQ ID NO:4, de los aminoácidos 1 a 1061. Los lisados de proteínas de las bacterias BL21 inducidas para expresar esta proteína se analizaron mediante inmunotransferencia western con sueros caninos infectados y se compararon con las inmunotransferencias western sondeadas con sueros de animales vacunados con E. canis inactivada con formalina. De acuerdo con hallazgos previos, solo los sueros de perros infectados reconocieron esta proteína del peso molecular esperado (datos no mostrados).

c. ATPasa

Este gen (etiqueta de locus "Ecan02000699") se predijo mediante el análisis computacional automatizado de la secuencia del genoma de escopeta de E. canis. Este codifica una proteína de más de 4000 aminoácidos (ZP_00210575). El cribado de DIVA de E. canis identificó dos regiones separadas de este gen y su proteína asociada como posibles antígenos inmunodominantes y reactivos DIVA. Los segmentos de la proteína identificados en los clones 84 y 7 son los aminoácidos 1984-2774 y 2980-3740, respectivamente, del número de acceso 46308382. (Ver la SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8).

Ambos fragmentos de este gen se amplificaron a partir de ADN genómico de E. canis y se subclonaron por separado en un sistema de expresión pET con una etiqueta de 6-His de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Los resultados de secuenciación de este plásmido coincidieron exactamente con las secuencias génicas asociadas con las proteínas mostradas en la SEQ ID NO:6 y 8, de los aminoácidos 1 a 782 y 1 a 746 respectivamente. Los lisados de proteínas de las bacterias BL21 inducidas para expresar estas proteínas se analizaron mediante inmunotransferencia western con sueros caninos infectados y se compararon con las inmunotransferencias western sondeadas con sueros de animales vacunados con E. canis inactivada con formalina. De acuerdo con hallazgos previos, solo los sueros de perros infectados reconocieron estas proteínas del peso molecular esperado (datos no mostrados).

d. Proteínas de choque térmico

Aunque este clon contenía un gen para la proteína de choque térmico, GrpE, la secuencia génica que codifica para el antígeno inmunodominante surge de una secuencia de proteína hipotética predicha por el análisis computacional automatizado del genoma. En base al peso molecular y pI de la proteína, el gen de interés en el clon 9 es el número de locus "Ecan02000495" y la proteína asociada 46308954.

Debido a que esta proteína solo se predice a partir de la anotación por computadora del genoma y no se identificó previamente a partir de organismos E. canis como una proteína inmunodominante, esta es la primera evidencia de que este gen se expresa en E. canis y estimula una respuesta inmunitaria en el hospedero canino infectado. La proteína se identificará como el antígeno p16 (ver la SEQ ID NO: 9 y 10).

Este gen se amplificó a partir del vector pBlueScript que contiene el ADN genómico de interés y se subclonó en un sistema de expresión pET con una etiqueta 6-His de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Los resultados de secuenciación de este plásmido coincidieron exactamente con la secuencia génica asociada con el número de locus "Ecan02000495". Los lisados de proteínas de las bacterias BL21 inducidas para expresar esta proteína se analizaron mediante inmunotransferencia western con sueros caninos infectados y se compararon con las inmunotransferencias western sondeadas con sueros de animales vacunados con E. canis inactivada con formalina. En consonancia con los hallazgos anteriores, solo los sueros de perros infectados reconocieron esta proteína del peso molecular esperado (ver Figura 7).

e. Proteína ribosomal L1

Este gen se identifica mediante la etiqueta de locus “Ecan02000476” del genoma de E. canis. La proteína asociada tiene el número de acceso ZP_00211130 (ver las SEQ ID NO:11 y 12). La identificación de esta proteína se predijo en base al análisis computacional automatizado del genoma. Un análisis de BLAST de esta proteína revela que la secuencia es aproximadamente 70 % idéntica a una proteína superficial de E. chaffeensis (número de acceso 4894576). La inmunorreactividad a la proteína E. chaffeensis se notificó previamente por Yu y otros, (J Clin Microbiol. Agosto de 1999;37(8):2568-75). La proteína de E. chaffeensis (número de acceso 4894576) se denomina precursor de la proteína de 106 kDa.

f. Posibles antígenos que no son de 120 kDa

Dentro del fragmento genómico que contiene el gen para el antígeno de 120 kDa, están presentes otros genes que también pueden ser inmunodominantes y reactivos DIVA. Por ejemplo, el clon 10 produce un patrón de bandas diferente en las inmunotransferencias western sondeadas con sueros infectados, en comparación con los clones que contienen el antígeno de 120 kDa solo. El clon 10 contiene información genética para los componentes VirD4 de una vía secretora de tipo IV y esta secuencia génica se identifica mediante la etiqueta del locus “Ecan02000624”. Este gen codifica para una proteína de 723 aminoácidos (ZP_00211244), pero solo una porción de esta proteína parece expresarse por el clon 10, como se determina por el peso molecular de la proteína identificada en el gel (ver las SEQ ID NO:13 y14).

Ejemplo 8

Evaluación de los péptidos P140 de E. canis

Los sueros de beagles inmunizados con E. canis inactivada con formalina (muestras de vacuna) se analizaron mediante el uso de un inmunoensayo basado en placas de microtitulación preparado mediante el uso de péptidos sintéticos derivados de la proteína p140 de E. canis (también conocida como p120, ver el Ejemplo 7).

La preparación de E. canis inactivada con formalina y la inmunización de beagles se describieron en los Ejemplos 1 y 2. Las muestras de beagles inmunizados se analizaron mediante el uso de inmunoensayos basados en placas de microtitulación preparados mediante el uso de péptidos sintéticos (SEQ ID NO:18, SEQ iD NO:19 y SEQ ID NO:20) en formatos de ensayo indirecto y directo.

Formato de ensayo indirecto

Las muestras se analizaron mediante el uso de inmunoensayos basados en placas de microtitulación preparados mediante el uso de los péptidos sintéticos (SEQ ID NO:18, Se Q ID NO:19 y SEQ ID NO:20). Los péptidos individuales se inmovilizaron en pocillos de microtitulación por adsorción directa. Se adicionó una dilución de la muestra de prueba (1:100) al pocillo de microtitulación y se eliminó el anticuerpo no unido mediante lavado. El anticuerpo unido al péptido inmovilizado se detectó por reacción con un conjugado de peroxidasa de rábano picante (HRPO) (dilución 1:2000) antiespecie, en este caso canino, lavado y adición de un sustrato de HRPO. La absorbancia (A650) de los pocillos de microtitulación individuales se determinó mediante el uso de un lector de placas de microtitulación.

Formato de ensayo directo

Los péptidos individuales (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:20) se conjugaron a albúmina sérica bovina e inmovilizaron en pocillos de microtitulación por adsorción directa. Los péptidos sintéticos (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:20) se conjugaron con un reactivo indicador, peroxidasa de rábano picante (HRPO). La muestra de prueba y el péptido/indicador de inmunoensayo se adicionaron a un pocillo de microtitulación bien recubierto con el péptido correspondiente, que se incubó y se lavó. El anticuerpo unido al péptido inmovilizado y al péptido/reactivo indicador se detectó mediante la adición de un reactivo sustrato de HRPO. La absorbancia (A650) de los pocillos de microtitulación individuales se determinó mediante el uso de un lector de placas de microtitulación.

Los resultados del ensayo se muestran en la Tabla 4. El control positivo (PC, ID 1049:16E) y el control negativo (NC, 3818:57B) fueron muestras de suero positivas y negativas conocidas de E. canis, respectivamente. Todas las muestras se analizaron mediante el uso de la prueba s Na P® 4Dx® disponible comercialmente para el anticuerpo de E. canis. Los resultados para las muestras temporales secuenciales de 6 perros (CVYDEH, c W m BDC, CVXc Sm , CWMAXK, CVSCVA y CVXCAP) que reciben el antígeno de E. canis inactivado con formalina formulado con diferentes adyuvantes se muestran del día 0 al día 42 después de la inmunización. Los resultados de la prueba SNAP® 4Dx® demuestran que se indujo una respuesta de anticuerpo en los animales vacunados. Ninguna de las muestras de suero de animales vacunados fue reactiva en el formato de ensayo directo. Varias muestras (por ejemplo, del perro CWMAXK) tuvieron altas reacciones de fondo en el formato de ensayo indirecto.

Los resultados demuestran que el anticuerpo inducido como resultado de la inmunización mediante el uso de la vacuna inactivada con formalina no fue significativamente reactivo a los péptidos sintéticos derivados de una proteína p140 de E. canis. (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:20).

Tabla 4. Reacción de sueros de perros inmunizados con el antígeno de E. canis inactivado con formalina medido mediante el uso de ensayos de microtitulación preparados mediante el uso de péptidos derivados de la proteína p140 de E. canis. (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:20).

Ejemplo 9

Los sueros de los perros positivos y negativos a E. canis conocidos se analizaron mediante el uso de un inmunoensayo basado en placas de microtitulación preparado mediante el uso de los péptidos sintéticos obtenidos de la proteína p140 de E. canis (también conocida como p120, ver Ejemplo 7).

Se obtuvieron muestras de campo positivas y negativas de E. canis y se analizaron mediante el uso de la prueba SNAP® 4Dx® para anticuerpos contra E. canis. Las muestras se analizaron después mediante el uso de ensayos de formato de placa de microtitulación indirecto y directo producidos mediante el uso de péptidos sintéticos derivados de la proteína P140 de E. canis (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:20).

Formato de ensayo indirecto

Las muestras se analizaron mediante el uso de inmunoensayos basados en placas de microtitulación preparados mediante el uso de los péptidos sintéticos (SEQ ID NO:18, Se Q ID NO:19 y SEQ ID NO:20). Los péptidos individuales se inmovilizaron en pocillos de microtitulación por adsorción directa. Se adicionó una dilución de la muestra de prueba (1:100) al pocilio de microtitulación y se eliminó el anticuerpo no unido mediante lavado. El anticuerpo unido al péptido inmovilizado se detectó por reacción con un conjugado de peroxidasa de rábano picante (HRPO) (dilución 1:2000) antiespecie, en este caso canino, lavado y adición de un sustrato de HRPO. La absorbancia (A650) de los pocillos de microtitulación individuales se determinó mediante el uso de un lector de placas de microtitulación.

Formato de ensayo directo

Los péptidos individuales (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:20) se conjugaron a albúmina sérica bovina e inmovilizaron en pocillos de microtitulación por adsorción directa. Los péptidos sintéticos (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:20) se conjugaron con el reactivo indicador, peroxidasa de rábano picante (HRPO). La muestra de prueba y el péptido/indicador de inmunoensayo se adicionaron a un pocillo de microtitulación bien recubierto con el péptido correspondiente, que se incubó y se lavó. El anticuerpo unido al péptido inmovilizado y al péptido/reactivo indicador se detectó mediante la adición de un reactivo sustrato de HRPO. La absorbancia (A650) de los pocillos de microtitulación individuales se determinó mediante el uso de un lector de placas de microtitulación.

La Tabla 4 muestra los resultados de las muestras de campo positivas y negativas de E. canis analizadas con el formato de ensayo indirecto. El control positivo (PC, ID 1049:16e ) y el control negativo (NC, 3818:57B) fueron muestras de suero positivas y negativas conocidas de E. canis, respectivamente. Se determinó que las muestras eran positivas o negativas para el anticuerpo contra E. canis mediante el uso de la prueba SNAP® 4Dx®. Los resultados del ensayo se muestran para los ensayos con formato de placa de microtitulación realizados mediante el uso de reactivos peptídicos (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:20).

La Tabla 5 muestra los resultados de las muestras de campo positivas y negativas de E. canis analizadas con el formato de ensayo directo. El control positivo (PC, ID 1049:16E) y el control negativo (NC, 3818:57B) fueron muestras de suero positivas y negativas conocidas de E. canis, respectivamente. Se determinó que las muestras eran positivas o negativas para el anticuerpo contra E. canis mediante el uso de la prueba SNAP® 4Dx®. Los resultados del ensayo se muestran para los ensayos con formato de placa de microtitulación realizados mediante el uso de reactivos peptídicos (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:20).

Tabla 5. Muestras de campo positivas y negativas a E. canis analizadas mediante el uso del ensayo de formato de placa de microtitulación indirecta construido mediante el uso de péptidos P140 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:20).

Tabla 6. Muestras de campo positivas y negativas a E. canis analizadas mediante el uso del ensayo de formato de placa de microtitulación directa construido mediante el uso de péptidos P140 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:20).

Los resultados demuestran que el anticuerpo inducido como resultado de una infección natural fue reactivo a los péptidos sintéticos derivados de la proteína p140 de E. canis. (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:20).

Ejemplo 10: Pruebas de sueros de perros positivos y negativos a E. canis conocidos mediante el uso de un inmunoensayo basado en placas de microtitulación preparado mediante el uso de los péptidos sintéticos (SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24) obtenidos de la proteína p16 de E. canis. Los ensayos se realizaron mediante el uso del formato de ensayo indirecto al hacer uso del conjugado HRPO anticanino como el indicador.

Se obtuvieron sueros de seis caninos positivos a anticuerpos de E. canis y tres negativos a anticuerpos de E. canis de Sinclair Research (Columbia, MO). Se observó que las muestras de suero eran positivas o negativas mediante el uso del ensayo de unión cromatográfica de flujo reversible con licencia prueba IDEXX SNAP® 4Dx® para el anticuerpo de E. canis. Los resultados del ensayo cromatográfico de flujo reversible SNAP® se muestran en la Tabla 7.

Las muestras se analizaron mediante el uso de inmunoensayos basados en placas de microtitulación preparados mediante el uso de péptidos sintéticos (SEQ ID NO:22, SEQ iD NO:23 y SEQ ID NO:24) derivados de la proteína de superficie pl6 de E. canis. El péptido sintético se inmovilizó en los pocillos de microtitulación Immulon a 0,25 ug/ml (SEQ ID NO: 22 y 23, o a 0,5 ug/ml (SEQ ID NO: 24)). Se adicionó una dilución de la muestra de prueba (1:100) al pocillo de microtitulación y se eliminó el anticuerpo no unido mediante lavado. El anticuerpo unido al péptido inmovilizado se detectó por reacción con un conjugado de peroxidasa de rábano picante (HRPO) (dilución 1:2000) antiespecie, en este caso canino, lavado y adición del sustrato de HRPO. La absorbancia a 650 nm (A650) del fluido en pocillos de microtitulación individuales se determinó mediante el uso de un lector de placas de microtitulación.

Resultados:

Los resultados de las muestras positivas y negativas se muestran en la Tabla 7. Las muestras positivas HP-319, HP-322, HP-326, HP-342, HP-354, Hp -358 fueron reactivas a las secuencias de péptidos mostradas en la SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24. Las muestras negativas HP-302, HP-303 y HP-306 no fueron reactivas a las secuencias de péptidos mostradas en la SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24.

Conclusiones:

Los resultados demuestran que el anticuerpo inducido como resultado de una infección natural fue reactivo a los péptidos sintéticos derivados de la proteína p16 de E. canis (SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24) en el formato de ensayo indirecto descrito anteriormente.

Tabla 7: Resultados del ensayo para muestras caninas positivas y negativas con el uso de pocillos de microtitulación recubiertos con péptidos sintéticos de E. canis (SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24) y conjugado antiespecies como indicador. A650 es la absorbancia a 650 nm. La columna “4Dx SNAP” presenta los resultados del ensayo cromatográfico de flujo reversible SNAP® 4Dx®.

Ejemplo 11: Pruebas de sueros de perros positivos y negativos a E. canis conocidos mediante el uso de un inmunoensayo basado en placas de microtitulación preparado mediante el uso de los péptidos sintéticos (SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24) derivados de la secuencia de la proteína p16 de E. canis. Los ensayos se realizaron mediante el uso del formato de ensayo directo que hacía uso del péptido marcado con HRPO como indicador.

Los sueros de siete caninos positivos a anticuerpos de E. canis y tres negativos a anticuerpos de E. canis se obtuvieron de perros de campo. Se observó que las muestras de suero eran positivas o negativas mediante el uso del cromatográfico de flujo reversible con licencia IDEXX SNAP® 3Dx® para anticuerpos de E. canis. Los resultados del ensayo se muestran en la Tabla 8.

Las muestras se analizaron mediante el uso de un inmunoensayo basado en placas de microtitulación preparado mediante el uso de los péptidos sintéticos (SEQ ID NO:22, SEQ iD NO:23 y SEQ ID NO:24) derivados de la proteína de superficie P16 de E. canis. Los péptidos sintéticos se inmovilizaron en pocilios de placa de microtitulación a 1 ug/ml. Las cantidades separadas de los péptidos sintéticos se conjugaron con la peroxidasa de rábano picante (HRPO) indicadora. La muestra de prueba y el conjugado péptido:HRPO (1 ug/ml) se adicionaron al pocillo de microtitulación recubierto con péptido, que se incubó y se lavó. El anticuerpo de la muestra unido al péptido inmovilizado y al conjugado péptido::HRPO se inmovilizó en el pocillo de microtitulación. Este complejo se detectó mediante la adición de un reactivo de sustrato de HRPO. La densidad óptica de los pocillos de microtitulación individuales se determinó mediante el uso de un lector de placas de microtitulación.

Resultados:

Los resultados de las muestras positivas y negativas se muestran en la Tabla 8. Las muestras positivas 813:911, 1049:16A, 1049:16U, 1061:031, 1177:21G, 1177:21K y 1177:63O fueron reactivas a las secuencias de péptidos mostradas en la SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 y Se Q ID NO:24. Las muestras negativas 3818:57A, 3818:57C y 3818:57D no fueron reactivas a las secuencias de péptidos mostradas en la SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 y SEQ iD NO:24.

Conclusiones:

Los resultados demuestran que el anticuerpo inducido como resultado de una infección natural fue reactivo a los péptidos sintéticos derivados de la proteína p16 de E. canis (SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24) en el formato de ensayo directo descrito anteriormente.

Tabla 8: Resultados del ensayo para muestras de campo caninas positivas y negativas con el uso de pocillos de microtitulación con recubrimiento de péptidos sintéticos de E. canis (Se Q ID n O:22, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24) y conjugados de péptidos sintéticos de E. canis (SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24) como indicadores. A650 es la absorbancia a 650 nm. La columna “3Dx SNAP” presenta los resultados del ensayo cromatográfico de flujo reversible SNAP® 3Dx®.

Ejemplo 12: Resultados del ensayo para sueros de 6 perros infectados experimentalmente con E. canis mediante el uso de placas de microtitulación con revestimiento de péptido sintético (SEQ ID NO:23) y conjugado anticanino como indicador.

Seis perros sin tratamiento previo se infectaron experimentalmente con el aislado de Luisiana de E. canis. Las muestras de suero se obtuvieron los días 3, 7, 10, 13, 17, 21, 24, 28 y 35 después de la infección. Las muestras se analizaron mediante el uso de inmunoensayos basados en placas de microtitulación preparados mediante el uso del péptido sintético p16-2 (SEQ ID NO:23) derivado de la proteína de superficie p16 de E. canis. El péptido sintético se inmovilizó en pocillos de microtitulación, se adicionó una dilución de la muestra de prueba (1:100) al pocillo de microtitulación y se eliminó el anticuerpo no unido mediante lavado. El anticuerpo unido al péptido inmovilizado se detectó por reacción con un conjugado anticanino, peroxidasa de rábano picante (HRPO) (dilución 1:2000), lavado y adición de sustrato de HRPO. La densidad óptica de los pocillos de microtitulación individuales se determinó mediante el uso de un lector de placas de microtitulación.

Resultados:

Los resultados del ensayo se muestran en la Tabla 9. Los 6 perros se convirtieron de un estado negativo a un estado positivo después de una infección experimental medida por el ensayo cromatográfico de flujo reversible SNAP® 4Dx® disponible comercialmente. Los sueros de todos los perros reaccionaron al péptido p16 de E. canis mostrado en la SEQ ID NO:23 en varias ocasiones después de la infección. Los tiempos entre la infección experimental y la reacción inicial al péptido de la SEQ ID NO:23 fueron los siguientes: Perro 108532, 17 días después de la infección; Perro 115853, 13 días después de la infección; Perro 265006, 17 días después de la infección; Perro 268830, 13 días después de la infección; Perro 285307, 13 días después de la infección, y Perro 533573, 13 días después de la infección.

Conclusiones:

Los resultados demuestran que el anticuerpo inducido como resultado de una infección experimental fue reactivo al péptido sintético derivado de la proteína p16 de E. canis (SEQ ID NO:23).

TABLA 9. Resultados del ensayo con el uso para suero de perros infectados experimentalmente con el uso de placas de microtitulación recubiertas con el péptido sintético de E. canis (SEQ ID NO:23) y conjugado antiespecie como indicador. A650 es la absorbancia a 650 nm. La columna “4Dx SNAP” presenta los resultados del ensayo cromatográfico de flujo reversible SNAP® 4Dx®.

Ejemplo 13: Preparación de E. canis inactivada con formalina para su inmunización en perros

E. canis se cultiva en cultivo celular canino mediante el uso de los métodos descritos en la literatura. Ver Breitschwerdt, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1998, Vol 42:362-368. Mediante el uso de microscopía óptica, se estimó que las células 030 se infectaron por E. canis por más del 80 %. Se recolectaron dos litros de cultivo celular infectado con E. canis, se centrifugaron y el sedimento retenido produjo 7,31 g de material (peso húmedo). Se supone que el agua representa el 80 % del peso del material, lo que da un peso en seco estimado de 1,462 g (20 % del peso del material). El sedimento celular se resuspendió a 20 mg/ml en PBS (peso en seco) para un volumen total de 73 ml.

A este sedimento celular resuspendido, se adicionaron 0,73 ml de solución de formalina (Catálogo Sigma Solución de formalina HT50-1-2 al 10 %, tamponada a neutral) para una concentración final de formaldehído de 0,04 %. La solución se agitó de 12 a 24 horas a 4 °C. La mezcla inactivada se centrifugó y el sedimento celular se conservó. El sedimento se lavó mediante resuspensión en 250 ml de PBS. El material se recolectó mediante centrifugación y el lavado se repitió una vez.

La muestra se distribuyó en alícuotas en 73 viales con tapón de rosca y se congeló a -80 °C. Cada vial contiene 20 mg (peso en seco) de cultivo celular de E. canis inactivada con formalina, adecuados para combinarse con el adyuvante adecuado para la inmunización en animales.

Ejemplo 14: Preparación de E. canis inactivado con formalina con dos adyuvantes diferentes y protocolo para la inmunización de beagles con el antígeno de E. canis.

Para la inmunización en perros alojados en jaulas (beagles de laboratorio) se formuló el antígeno de E. canis inactivado en formalina con el uso de tres adyuvantes diferentes. El antígeno de E. canis inactivado con formalina se preparó con el adyuvante Ribi (Corixa Corp., Seattle WA) mediante el uso del protocolo descrito por el fabricante. Cada dosis contenía aproximadamente 20 mg de cultivo celular de E. canis inactivada con formalina (peso en seco). Se preparó una formulación adicional de inmunógeno mediante el uso de una combinación del adyuvante Ribi (descrito anteriormente) y el adyuvante BCG (1 mg por dosis) (Calbiochem de EMD Biosciences, Inc., San Diego, CA). Dos grupos que consistían de tres perros cada uno se dosificaron 4 veces durante un período de 170 días (días 0, 14, 156, 170) mediante el uso de E. canis inactivada que contenía adyuvante Ribi solo o adyuvante Ribi y adyuvante BCG en combinación. En un esfuerzo por producir un estado hiperinmunitario inducido por la vacuna, todos los perros recibieron una dosis única (día 247) de E. canis inactivada con formalina formulada mediante el uso del adyuvante TiterMax® (CytRx Corp., Norcross, GA) o el adyuvante TiterMax® y el adyuvante BCG en combinación mediante el uso de las instrucciones del fabricante. A los perros se les administraron vacunas de acuerdo con el siguiente calendario:

El comité del IACUC de Covance Research Products Inc. aprobó el protocolo para la inmunización de beagles de laboratorio. A todos los perros se les administró el artículo de prueba adecuado por vía subcutánea en el área dorsoescapular. En el día 0 se observó que los 6 perros eran seronegativos mediante el uso tanto del diagnóstico cromatográfico de flujo reversible SNAP® 3Dx ® así como también como por el análisis de inmunotransferencia western mediante el uso del organismo E. canis. Los seis animales seroconvirtieron a una prueba positiva en el ensayo de E. canis cromatográfico de flujo reversible SNAP®3Dx® para el día 42. Los sangrados de producción se obtuvieron en los días 226, 261,268 y 282. (aproximadamente 50 ml de sangre que produjeron aproximadamente 25 ml de suero).

Ejemplo 15: Análisis de sueros de beagles inmunizados con E. canis inactivado con formalina (muestras de vacuna) mediante el uso de un inmunoensayo basado en placas de microtitulación preparado mediante el uso de los péptidos sintéticos (SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ iD NO:24) obtenidos de la proteína P16 de E. canis.

La preparación del E. canis inactivada con formalina y la inmunización de los beagles se describieron en los Ejemplos 13 y 14. Las muestras de beagles inmunizados se analizaron mediante el uso de los inmunoensayos basados en placas de microtitulación directas preparados mediante el uso de los péptidos sintéticos (SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24).

Formato de ensayo directo

Las muestras se analizaron mediante el uso de inmunoensayos basados en placas de microtitulación preparados mediante el uso de los péptidos sintéticos (SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24). Los péptidos sintéticos se inmovilizaron en pocillos de la placa de microtitulación a 1,0 ug/ml. Las cantidades separadas de los péptidos sintéticos se conjugaron con la peroxidasa de rábano picante (HRPO) indicadora. La muestra de prueba y el péptido/indicador de inmunoensayo se adicionaron al pocillo de microtitulación recubierto con péptido, que se incubó y se lavó. El anticuerpo unido al péptido inmovilizado y al reactivo péptido/indicador se inmovilizó en el pocillo de microtitulación. Este complejo se detectó mediante la adición de un reactivo de sustrato de HRPO. La densidad óptica de los pocillos de microtitulación individuales se determinó mediante el uso de un lector de placas de microtitulación.

Resultados

Los resultados del ensayo se muestran en la Tabla 10. El control positivo (PC, ID 1049:16E) y el control negativo (NC, 3818:57B) fueron muestras de suero positivas y negativas conocidas de E. canis, respectivamente. Todas las muestras se analizaron mediante el uso de la prueba reversible cromatográfica de flujo SNAP® 4Dx® disponible comercialmente para el anticuerpo de E. canis. Los resultados para las muestras temporales secuenciales de los 6 perros (CVYDEH, CWMBDC, Cv Xc SM, CWMAXK, CVSCVA y Cv XCAP) que reciben el antígeno de E. canis inactivado en formalina formulado con diferentes adyuvantes se muestran para el día 226, día 261, día 268 y día 282 después de la inmunización. Los resultados de la prueba reversible cromatográfica de flujo SNAP® 4Dx® demuestran que se indujo una respuesta de anticuerpo en los animales vacunados. Ninguna de las muestras de suero de animales vacunados fue reactiva en el ensayo en formato de placa de microtitulación del péptido (SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24).

TABLA 10. Resultados del ensayo con el uso de suero de perros inmunizados con antígeno de E. canis inactivado con formalina medido con el uso de placas de microtitulación recubiertas con el péptido sintético de E. canis (SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24) y péptido sintético-conjugado como indicador. DO es densidad óptica. La columna “4Dx SNAP” presenta los resultados del ensayo cromatográfico de flujo reversible SNAP® 4Dx®.

Conclusiones

Los resultados demuestran que los anticuerpos inducidos como resultado de la inmunización mediante el uso del antígeno de E. canis inactivado con formalina fueron reactivos en la prueba cromatográfica de flujo reversible SNAP® 4Dx®, que indicaría que se inició una respuesta de anticuerpos anti-E. canis. Estas mismas muestras no fueron reactivas a los péptidos sintéticos derivados de la proteína P16 de E. canis (SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24).

Los sueros de los perros inmunizados con el antígeno de E. canis inactivado con formalina fueron no reactivos a los péptidos derivados de la proteína P16 de E. canis (SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24). Los péptidos sintéticos (SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24) no fueron reactivos a los anticuerpos inducidos como resultado de la vacunación.

Ejemplo 15:

Controlar el tratamiento de la infección por E. canis.

Seis perros se infectaron experimentalmente con E. canis. La doxiciclina se administró 28 días después de la infección. Los anticuerpos específicos para E. canis se detectaron mediante el uso de la SEQ ID NO:23 con un protocolo de ensayo indirecto. Los polipéptidos mostrados en la SEQ ID NO:23 se inmovilizaron en pocillos de microtitulación por adsorción directa. Se adicionó una dilución de la muestra de prueba (1:100) al pocillo de microtitulación y se eliminó el anticuerpo no unido mediante lavado. El anticuerpo unido al péptido inmovilizado se detectó por reacción con conjugado de peroxidasa de rábano picante (HRPO) (dilución 1:1000) antiespecie, en este caso anticanino de conejo. La absorbancia (A650) de los pocillos de microtitulación individuales se determinó mediante el uso de un lector de placas de microtitulación. El valor de corte negativo fue 2 veces el valor de O.D. del control negativo.

Los resultados se muestran en la Figura 8. Los perros E-1, E-2, E-3, E-4, E-5 y E-6 se infectaron experimentalmente con E. canis, pero no se trataron para la infección. La Figura 8 demuestra que el nivel de anticuerpos que se unen a la SEQ ID NO:23 aumentó considerablemente después de la infección experimental y no disminuyó durante el curso de tiempo del experimento. Los perros EDTx-1, EDTx-2, EDTx-3, EDTx-4, EDTx-5 y EDTx-6 se infectaron experimentalmente con E. canis y después se trataron con doxiciclina a los 28 días después de la infección. La Figura 8 demuestra que el nivel de anticuerpos que se unen a la SEQ ID NO:23 aumentó considerablemente después de una infección experimental y disminuyó después de la administración de doxiciclina. Por lo tanto, la SEQ ID NO:23 puede usarse para monitorear la progresión, la respuesta al tratamiento, o la eficacia del tratamiento de la infección por E. canis.

Ejemplo 16

Diferenciación de los perros que se vacunaron contra E. canis y los perros que se vacunaron contra E. canis, pero se infectaron con E. canis.

Las vacunas pueden no ser completamente eficaces para prevenir infecciones. Por lo tanto, es conveniente tener un método para determinar si un animal vacunado se infectó a pesar de la vacunación. Los inmunoensayos que usan p16 como agente de detección no detectan anticuerpos anti-E. canis en perros que se vacunaron contra E. canis y que no se infectaron con E. canis. Ahora se descubrió que una proteína p16 de E. canis (SEQ ID NO:10) puede usarse para detectar la infección por E. canis en perros que recibieron una vacuna contra E. canis.

Seis perros que se vacunaron contra E. canis y dos perros no vacunados se retaron con células K9 infectadas con E. canis en DMSO al 10 %. Cada perro se probó con el tiempo para anticuerpos anti-E. canis con un inmunoensayo que comprende la SEQ ID NO:10. Todos los perros vacunados y los dos perros de control se infectaron con E. canis. Las infecciones por E. canis se confirmaron con dos marcadores de infección independientes. Los inmunoensayos fueron capaces de detectar la infección por E. canis en los perros vacunados y no vacunados. Todas las señales de inmunoensayo estaban significativamente por encima de las señales de fondo. Ver las Figuras 9A-B, 10A-C y 11A-C.

Secuencia de nucleótidos del antígeno de la SEQ ID NO:1 120 kDa

ORIGEN

1 ATGGATATTG ATAACAATAA TGTGACTACA TCAAGTACGC AAGATAAAAG TGGGAATTTA

61 ATGGAAGTGA TTATGCGTAT ATTAAATTTT GGTAATAATT CAGATGAGAA AGTAAGCAAT

121 GAAGACACTA AAGTTCTTGT AGAGAGTTTA CAACCTGCTG TGAATGACAA TGTAGGAAAT

181 CCATCAAGTG AAGTTGGTAA AGAAGAAAAT GCTCCTGAAG TTAAAGCGGA AGATTTGCAA

241 CCTGCTGTAG ATGGTAGTGT AGAACATTCA TCAAGTGAAG TTGGGAAAAA AGTATCTGAA

301 ACTAGTAAAG AGGAAAGTAC TCCTGAAGTT AAAGCAGAAG ATTTGCAACC TGCTGTAGAT

361 GGTAGTATAG AACATTCATC AAGTGAAGTT GGAGAAAAAG TATCTAAAAC TAGTAAAGAG

421 GAAAGTACTC CTGAAGTTAA AGCAGAAGAT TTGCAACCTG CTGTAGATGA TAGTGTGGAA

481 CATTCATCAA GTGAAGTTGG AGAAAAAGTA TCTGAAACTA GTAAAGAGGA AAATACTCCT

541 GAAGTTAAAG CAGAAGATTT GCAACCTGCT GTAGATGGTA GTATAGAACA TTCATCAAGT

601 GAAGTTGGAG AAAAAGTATC TAAAACTAGT AAAGAGGAAA GTACTCCTGA AGTTAAAGCA

661 GAAGATTTGC AACCTGCTGT AGATGATAGT GTGGAACATT CATCAAGTGA AGTTGGAGAA

721 AAAGTATCTG AAACTAGTAA AGAGGAAAAT ACTCCTGAAG TTAAAGCAGA AGATTTGCAA

781 CCTGCTGTAG ATGGTAGTGT GGAACATTCA TCAAGTGAAG TTGGAGAAAA AGTATCTAAA

841 ACTAGTAAAG AGGAAAGTAC TCCTGAAGTT AAAGCAGAAG ATTTGCAACC TGCTGTAGAT

901 GATAGTGTGG AACATTCATC AAGTGAAGTT GGAGAAAAAG TATCTGAAAC TAGTAAAGAG

961 GAAAATACTC CTGAAGTTAG AGCAGAAGAT TTGCAACCTG CTGTAGATGG TAGTGTAGAA

1021 CATTCATCAA GTGAAGTTGG AGAAAAAGTA TCTGAAACTA GTAAAGAGGA AAGTACTCCT

1081 GAAGTTAAAG CAGAAGATTT GCAACCTGCT GTAGATAGTA GTATAGAACA TTCATCAAGT

1141 GAAGTTGGGA AAAAAGTATC TGAAACTAGT AAAGAGGAAA GTACTCCTGA AGTTAAAGCA

1201 GAAGATTTGC AACCTGCTGT AGATGGTAGT GTAGAACATT CATCAAGTGA AGTTGGAGAA

1261 AAAGTATCTG AAACTAGTAA AGAGGAAAAT ACTCCTGAAG TTAAAGCAGA AGATTTGCAA

1321 CCTGCTGTAG ATGGTAGTGT AGAACATTCA TCAAGTGAAG TTGGAGAAAA AGTATCTGAA

1381 ACTAGTAAAG AGGAAAATAC TCCTGAAGTT AAAGCGGAAG ATTTGCAACC TGCTGTAGAT

1441 GGTAGTGTAG AACATTCATC AAGTGAAGTT GGAGAAAAAG TATCTGAAAC TAGTAAAGAA

1501 GAAAGTACTC CTGAAGTTAA AGCAGAAGAT TTGCAACCTG CTGTAGATGA TAGTGTAGAA

1561 CATTCATCAA GTGAAGTTGG AGAAAAAGTA TCTGAAACTA GTAAAGAAGA AAGTACTCCT

1621 GAAGTTAAAG CGGAAGATTT GCAACCTGCT GTAGATGGTA GTGTGGAACA TTCATCAAGT

1681 GAAGTTGGAG AAAAAGTATC TGAGACTAGT AAAGAGGAAA GTACTCCTGA AGTTAAAGCG

1741 GAAGTACAGC CTGTTGCAGA TGGTAATCCT GTTCCTTTAA ATCCTATGCC TTCAATTGAT

1801 AATATTGATA CTAATATAAT ATTCCATTAC CATAAAGACT GTAAAAAAGG TTCAGCTGTA

1861 GGAACAGATG AAATGTGTTG TCCTGTATCA GAATTAATGG CTGGGGAACA TGTTCATATG

1921 TATGGAATTT ATGTCTATAG AGTTCAATCA GTAAAGGATT TAAGTGGTGT ATTTAATATA

1981 GATCATTCTA CATGTGATTG TAATTTAGAT GTTTATTTTG TAGGATACAA TTCTTTTACT

2041 AACAAAGAAA CAGTTGATTT AATATAA

ORIGEN

1 MDIDNNNVTT SSTQDKSGNL MEVIMRILNF GNNSDEKVSN EDTKVLVESL QPAVNDNVGN

61 PSSEVGKEEN APEVKAEDLQ PAVDGSVEHS SSEVGKKVSE TSKEESTPEV KAEDLQPAVD

121 GSIEHSSSEV GEKVSKTSKE ESTPEVKAED LQPAVDDSVE HSSSEVGEKV SETSKEENTP

181 EVKAEDLQPA VDGSIEHSSS EVGEKVSKTS KEESTPEVKA EDLQPAVDDS VEHSSSEVGE

241 KVSETSKEEN TPEVKAEDLQ PAVDGSVEHS SSEVGEKVSK TSKEESTPEV KAEDLQPAVD

301 DSVEHSSSEV GEKVSETSKE ENTPEVRAED LQPAVDGSVE HSSSEVGEKV SETSKEESTP

361 EVKAEDLQPA VDSSIEHSSS EVGKKVSETS KEESTPEVKA EDLQPAVDGS VEHSSSEVGE

421 KVSETSKEEN TPEVKAEDLQ PAVDGSVEHS SSEVGEKVSE TSKEENTPEV KAEDLQPAVD

481 GSVEHSSSEV GEKVSETSKE ESTPEVKAED LQPAVDDSVE HSSSEVGEKV SETSKEESTP

541 EVKAEDLQPA VDGSVEHSSS EVGEKVSETS KEESTPEVKA EVQPVADGNP VPLNPMPSID

601 NIDTNIIFHY HKDCKKGSAV GTDEMCCPVS ELMAGEHVHM YGIYVYRVQS VKDLSGVFNI

661 DHSTCDCNLD VYFVGYNSFT NKETVDLI.

SEQ ID NO 3 secuencia de nucleótidos del antígeno de 200 kDa del 1081 al final

ORIGEN

1 AATTTAGAT TTTGGACTTG TAGATGGAGA TGGTAAAAAT CCTTTACATC ATGCTGTTGA

61 ACATTTGCCA CCTGTTATAC TTAAGGGCGT AATGGACCAT GTAAAAAATA GTAGTGAGTT

121 TCAAGATTTA GTAAATGATC CTGATTATTT TGGAAATACT ATAGCTCATT ATGCAGTTAA

181 GAATAAAAAT GCTGATTTAA CATTGTTTAA CATGCTGAAA GCTTCAGGAG CTGATTTAAA

241 TGTTAGGAAT GTAGTTGGTC GAGCTCCAAT ACATGTTGCT TCTTCTAATG GTAAGGCTAA

301 TGCAGTTTCT GGACTTGTAT CATGTGGTAT TGACGTTAAT TCTCAAGATG TGAATGGAGA

361 TACACCACTT CATATTGCTG TTGAAGGCGG TAGTATGGAG ACGGTATTAG CAGTGTTAAA

421 TCAGAGAGGT GCTGATGTTA GTGTCCAGAA TAACGATGGA GTTACACCTA TGCTTAGTGC

481 TGCTAAATAT GGAGATATAG GTGTAATAAA AGCTTTAGGT TCAGCTAAAC CAAATATTAA

SEQ ID NO:4 secuencia parcial de proteína del antígeno de 200 kDa

ORIGEN

1 NLDFGLVDGD GKNPLHHñVE HLPPVILKGV MDHVKNSSEF QDLVNDPDYF GNTIñHYñVK

61 NKNADLTLFN MLKASGADLN VRNVVGRAPI HVASSNGKAN AVSGLVSCGI DVNSQDVNGD

121 TPLHIAVEGG SMETVLAVLN QRGADVSVQN NDGVTPMLSA AKYGDIGVIK ALGSAKPNIK

181 GEDTVAKSLL MEDYKGFTPL HFVAGGGSRD TFRVVRKNYE KCHDLATIRA ALMQDRSGGE

241 LVNLGDFESE NILGSPNAKF LQHIQSANFG FSPAHCAIVS SNHNVMKDIL NFVGDSLHLP

301 SERGYNAMQV AALFGDKEAV KMLAKSAKPS DLNFKTSATP TPLNLACLRG DNEVVRGLVG

361 QHGIDINQRM GSDKNTVLHY AISKGDSFLV QKILAHTGVD VNCENNLGQT PLHLAVEGGD

421 PKIVSSLLKA GAVVNRLDDN GRSVLSSAIV PGRKEKGVLG IVNKLLDRGA DINLDGDHNI

481 LFDQCLRGGY NNVLDKLIQQ GVEVNRNSEI RPMVYAAISG NEHAIKSLAN AGGDVNEVVN

541 NPSSRHSGNP LIMVAVADGN AGLLKTLVSE GCDVGKSGKD GNTALHYAVS HSDKEFGNKA

601 IKILISRNSV GTNRDILTQK NNAGDTPLHE ALKSGNINSV QNILSAVHPR YAKEILTARD

661 KEGYTPMHYT VGVNNVDVGR SILESMLSKG VNNLGEIVGA QDSNFRTPLH AAIKISDYRA

721 ADMIIGSLSK TELSKLSQLT DINGDTPLHL SCQSGNVEMT QFFLGGLDKR ELPKTLKIAN

781 KNGDTPLHDA IRNDDIKSAK MMIRNCNKEE LANVLKCKDS FGNTVLHTIA DQVIANPESK

841 KDLDGLMNLA VKRLKNQDLK DLVNTRNNSD DTVAHCALLS DMKYAQKILK SCNHDTLVRG

901 NSNNQSLSEC IRDDSKYKKG GIFSKSLFSK LKKLEARAAS ASYEELSSIS SGSDVSSVST

961 NSTEVSAVPE VARSSGAVSF KHVQETGVDT SGPSDIESLE RLSDTSLGSN DFDQRMADLD

1021 QEIANIVSGL PEVTQVAVSQ QQAASPSSGQ AAGVQQKEMQ R.

SEQ ID NO:5 ATPasa - Secuencia de nucleótidos del fragmento de clon 84

ORIGEN

1 AATTATGCTG AAACTACTTT ATCATTTGGT GAATCTCGAG CAGAAGGACG TGAATCTCCA

61 TCAAGTGCAT TTGTTCAAAC TGGTCAATCA GAAGTACCTC GGAGTGAGGC TGCAGAGCCA

121 TTAATTCAAT TTCCTCATGA TGAAGAAAGT ACTGCATTAG GTTCTCAAGC AACTATGACA

181 GGAGTGTCTA CTCAGGCTAG TCCGTCAGCA GCATATCAGG ATGATAGTGA AATATCACGT

241 ATGAGGTCTA TGGCAGGAAC ATCTGCTCAA GCTGATCAAT CAGCAGTACA TCGTCGGAGT

301 GGTACAGCAT TAGAGCCATT AATTGAATTG CCTGATGAAG AAGAAAATGC TGCATTAGAT

361 TTTCAAACAG CTATGACAGG AGTGCCTACT CAGGCTAGTC CGTCAGCAGT ACATCGGAGT

421 GGTGTTGCAT CAGATCCTAC GCTACCTGAT GATGAAAGAA TTGATGTTCC ATCAGTTTCA

481 TCTCAAGTTG TAAGACCTTT TAGTGATGGT GAAGATTATT CAGTATATGA TAAATCAGGT

541 GTAGTAAGTG GTCATGAAAG ACCTGTTTCT TCTAGAGATT CAAGACAATT GGATGCATTT

601 GGTGATCCAT CAGATGATTT ATTGCCGGAG AGTGAAATTA TTGTTAGCAG CAGTAAGAAA

661 GCAATATTAG ATAGCCAAAA TGAAATAGAA TCTCTTATTC AGAGTGGAGA TACTTCTAGA

721 TGTATTAGGG CAATTAATAG TGCTCCTAGT GCGTCAGTGT TTCAACTGAA GACTTTATCG

781 AATGATATAT CTATTGCTGG ACGTGCTTTT TTAAATGGTA ATATTGATTT AATAGAAGCT

841 TGTATGAATT CTGGCAAGAA ATTAAATCCA AATATTACTG ATAATGAAAA AAATACTCTA

901 TTACATCAAT TTGTAGGATA TTTTGAACGC GATCCGAGAA TGTTGCTTGA TGCAGGAATG

961 CGTAATCTGT TTTTGAGATT ATGCATGGAT TATGGTTTCG ATATTAATCA TAAAAATAGT

1021 AATGGTAATA CAGTACTTGA TAGATTAAAT GATTTAGTAG AAGGGTTAAG TAGTTCGCAA

1081 GTTGATCTTG AAAGTAGTGG TATTGATGAG TTTATGATCT CATTGTTAGC TCATTCTAGA

1141 ATGAGTGATC AAGCAGTAAA GAATATTGCT ACTGCGCAAA ATGAGTTTTT TGCACGTGAT

1201 TCTGTTTATA ATATTAGTCG TTTAGTTGAT ACTTCTATAG TTTTGCAGAA TAAATTCAGT

1261 GAAGTATTTT ATGAAGTCTG TGGACGTATT TTATCTGAAG AAGCTGGTAA ACATAAGGGT

1321 GTTGCTGAAG CAAATTATTC AAGATTGAAT AAAATATTAA ATGATGAATG TCTTAGAAAG

1381 ACTTTAGCTA ATACAGATGC CGATGGAAAT AATGTTTTAC AGAGATTGTG TCAAGATATT

1441 GCTTCTGGAA AAATCAATGC TCGTGATGAC AGAGTATTAA AACTTTTTGA GACAATTATA

1501 TCTAATTTAA AAGACAAAGA TAAAGCATTA CTAGAGGATT TATTATTTAA TAATAGAAAC

1561 TCAAGATTTG AAAATTGCAT TGAAGCTATA CCACGTATTC CTGGTGCCGA TGCTCTATTT

1621 AAAAAACTAG AAGAGTTATT ATTAAAAAAG AAAATAGCAG AGTCTTGTGA TTTTAATTCT

1681 ATGTTAGTGA ATTGTGCTGA GTCTGCTAAT GATAATTTAT ATAATTACCT GCGCACTAAT

1741 TATGCAGTTA TTGGTATAAA TAACGTAGAT ATAAATGGCA ATTCATCCCT ATGTAAAGCT

1801 GTTGTTACTG GGTCACAAGG TATTGTTAAA GCAGTATTAT CAACTGGAAC TAATATTAAT

1861 AGGAAAGATA AAAATGGTAA TACACCTTTA CATGCATTGT TAATTTTTAT GATGTCTAAC

1921 CCTGAACTTG TCAAGGAGCA ACATATTTCA CTTGTGAAAT TCTTAGCGTC TCGTGGAGCT

1981 TTACTTAATG TAAAAAATAA TATGAATATT TCTCCAATTA TGCTTGCAGA ATCTATTGAT

2041 AAGAAAGAGG AACTTGCTAA GAAATTTACA AATCAAAAAG TTAGTATTTT AGAATCTTTA

2101 ATAGCTGGTA GTGAAGAACA TTTAGGGCTT AAATCCAAAT GTATATCTGA GTTAAAGCCT

2161 TATATAGAAT TAGGAAAAGG CATGAAGTAC GAAGATATAC ATGCTGATGT AATAGGTGGT

2221 GTATTATCTG CTGATATGTG TAATGCTAGA TTGCAGATAG GTAAATTATT AAATGGTGAT

2281 TTTTGTAAAG AAAATGAATT AAAGACAGTA AAATTTAATT TTTCTGATAC AAATAAGGGT

2341 TATGTACAAA ATGTTGGTAA AAAAAGAAAT TAT

SEQ ID NO:6 ATPasa - Secuencia de proteína del fragmento de clon 84

ORIGEN

1 NYAETTLSFG ESRAEGRESP SSAFVQTGQS EVPRSEAAEP LIQFPHDEES TALGSQATMT

61 GVSTQASPSA AYQDDSEISR MRSMAGTSAQ ADQSAVHRRS GTALEPLIEL PDEEENAALD

121 FQTAMTGVPT QASPSAVHRS GVASDPTLPD DERIDVPSVS SQVVRPFSDG EDYSVYDKSG

181 VVSGHERPVS SRDSRQLDAF GDPSDDLLPE SEIIVSSSKK AILDSQNEIE SLIQSGDTSR

241 CIRAINSAPS ASVFQLKTLS NDISIAGRAF LNGNIDLIEA CMNSGKKLNP NITDNEKNTL

301 LHQFVGYFER DPRMLLDAGM RNLFLRLCMD YGFDINHKNS NGNTVLDRLN DLVEGLSSSQ

361 VDLESSGIDE FMISLLAHSR MSDQAVKNIA TAQNEFFARD SVYNISRLVD TSIVLQNKFS

421 EVFYEVCGRI LSEEAGKHKG VAEANYSRLN KILNDECLRK TLANTDADGN NVLQRLCQDI

481 ASGKINARDD RVLKLFETII SNLKDKDKAL LEDLLFNNRN SRFENCIEAI PRIPGADALF

541 KKLEELLLKK KIAESCDFNS MLVNCAESAN DNLYNYLRTN YAVIGINNVD INGNSSLCKA

601 VVTGSQGIVK AVLSTGTNIN RKDKNGNTPL HALLIFMMSN PELVKEQHIS LVKFLASRGA

661 LLNVKNNMNI SPIMLAESID KKEELAKKFT NQKVSILESL IAGSEEHLGL KSKCISELKP

721 YIELGKGMKY EDIHADVIGG VLSADMCNAR LQIGKLLNGD FCKENELKTV KFNFSDTNKG

781 YVQNVGKKRN Y

SEQ ID NO:7 ATPasa - Secuencia de nucleótidos del fragmento de clon 7

ORIGEN

1 GTAAAAAAAT TAAGATTATT ATTAAATTCA ATAAGTGAGT TACCGCAAGA ATTAAAAGAT 61 CAAATTTTAA GTACTAGAAG TACTATAGAT AAATTACGAA ATAGAATTAA TGCCTGCATA 121 AAGTCTGACG ATAGAGAAGG TATTGCACAT GCTGTAGAAT CTATGGCTAG TTCTTATTGT 181 GAATTATTAG GACATTGTAG ATTAATTTTT AAGAAATTAT ATGATGAAAA TGCTGATAAA 241 AGTTTGCTAG AATTATGTAT TAAAGAATAT CAATCTGATT TAAACAAATTATTGGAACAA 301 GGTATTGATA TATGTGCTTC AGAAGTCTCA TCAGAATGTA AGGATTTAGT TTGTAAAGTA 361 TGTGAAGATG AATTTGAGAA ATATGACTCT TTATCTAAAG TACAAAGATT CAGGGAATTA 421 TCTGGTGAAA TTGCTGATTT GGATGATAAA TTAACAAGAA GGGCTTCTTT TGTTGAGACT 481 TTTGGATTAT TTAGCAGTAG ATTAAGACAT TATAGGGAAA TTTTAGGAGA TGGTGATTTA 541 AAATTTCGAG AGAGGATAGT TGAAAAATAT CAAGAGGATT TAAAGGAATTATTAGAATTA 601 TCTGTTGATC TTCATTTGTT AATAAATTTA CCAGCATTAG AAGATTTACG CGATCATAGA 661 AATTTAGTGC ATAGAGCATG TAATGCTGAA ATTGAAAAAT ATCTAACTTT ATTTGATGAT 721 CAACAATTAC GTACATTATC GCAAGAAGTG AATAATGCTC ATGGTGAATT GATACAGATG 781 TTTTCTAAGT TTAGTATATT TGTTGATGGC GTTACTGGTA TTGAACAGAG CACATCTCAA 841 GTAGAGCACC CTCGTTCTGA TATTGCTAAA AGAGATACTA CAACACCAAA GCAACGTGTT 901 GTGCAAGGTA AAGATGATAT ACAATCTAGT GATAGTGATA GTGATAGTGA TAGTAAATAC 961 GGTGATGATG ATAGTAAAAA AGCATCAGTT AGTGCACCTG CTGTTGACCA AGTTGTACCT 1021 GTAGCTGATG TTCAACCTGA ACCTCAGCTA GGTGAAGGAT TGGAAACATTAGAGTCTAGT 1081 ATAGCTGAAG GACCTGAGTT GCCTGGTGAT GCATCTACTG CTAAGCAATC TATACCTTTT 1141 GCGATAACAC CATCAAGTCC TGAGACAGTT GATGAAAAAC TTGAAAGTTC TGGTGTTAGT 1201 CAAGATGGTA TTACAACACC AGGACAACGT GTTGTGCAAG GTAAAGATGA TATACAATCT 1261 AGTGATAGTG ATAGTGATAG TAAATACGGT GATGATGATA GTAAAAAAGC ATCAGCTAGT 1321 GCACCTGCTG TTGACCAAGT TGTACCTGTA GCTGATGTTC AACCTGAACC TCAGCTAGGT 1381 GAAAAATTGG AAACATTAGA GTCTAGTATA ACTAAAGGAC CTGAGTTGCC TGGTGATGCA 1441 TCTACTGCTA AGCAATCTAT ACCTTTTGCG ATAACACCAT CAAGTCCTGA GACAGTTGAT 1501 GAAAAACTTG AAAGTTCTGG TGTTAGTCAA GATGGTATTA CAACACCAGG ACAACGTGTT 1561 GTGCAAGGTA AAGATGATAT ACAATCTAGT GATAGTGATA GTGATAGTAA ATACGGTGAT 1621 GATGATAGTA AAAAAGCATC AGCTAGTGCA CCTGCTGTTG ACCAAGTTGT ACCTTCTGAC 1681 ACTCGTGCAG ATGGAGTATC AGAACCATTA GCATCTCATG TGGATCAAGG ATCTGATGTA 1741 CCTGGTGATG CATCTGTTGA TGGTGTTGAT TTAAGATTAG GACGGTTATC TACTGAGCAA 1801 AGTGGATTGT TGCCACGTCA TGAACAAAAT GTAAGAGCAT TTATTTTAGA ACAGAGTTTG 1861 TTAGATCAAT TATATATGGA CTATATAGAT TTACACCCTG ATCAGAAAAG TTGTGAAGCT 1921 TATAATTCAG CATTGCATGG ATATAATACA AGATTAGAGT TACAGAAGGA ATATAACAGG 1981 ATTTTTGAAT CACATGAATC AGCATCTCCA AATGAAATTA ATAGTTTTTC ACAAAAATAT 2041 AGAGCAGCAT TAAGAGATGT TGCGCAGGAT ATTGTTAATC AGGGTCCAAT GTTTTATTCT 2101 TCTAGAGATG CAATGCTATT AAGGGCTAGA GTAGACACAT TGTGTGATAT GTGTCGTTCA 2161 ATACGTAATC TGTATATGGT TGAATTAGAT GCCATAGATA AAGAAGAAAA ATCGTTACAA 2221 TCTGATATGA AATCTGCAAG TTCTAGTGAT AAAAAGTTGA TACAAGAAAA AATAAAATTA 2281 CTT

1 VKKLRLLLNS ISELPQELKD QILSTRSTID KLRNRINñCI KSDDREGIñH ñVESMASSYC

61 ELLGHCRLIF KKLYDENñDK SLLELCIKEY QSDLNKLLEQ GIDICASEVS SECKDLVCKV

121 CEDEFEKYDSLSKVQRFREL SGEIADLDDK LTRRASFVET FGLFSSRLRH YREILGDGDL

181 KFRERIVEKYQEDLKELLEL SVDLHLLINL PALEDLRDHR NLVHRACNAE IEKYLTLFDD

241 QQLRTLSQEVNNAHGELIQM FSKFSIFVDG VTGIEQSTSQ VEHPRSDIAK RDTTTPKQRV

301 VQGKDDIQSSDSDSDSDSKY GDDDSKKASV SAPAVDQVVP VADVQPEPQL GEGLETLESS

361 IAEGPELPGDASTAKQSIPF AITPSSPETV DEKLESSGVS QDGITTPGQR VVQGKDDIQS

421 SDSDSDSKYGDDDSKKASAS APAVDQVVPV ADVQPEPQLG EKLETLESSI TKGPELPGDA

481 STAKQSIPFAITPSSPETVD EKLESSGVSQ DGITTPGQRV VQGKDDIQSS DSDSDSKYGD

541 DDSKKASASAPAVDQVVPSD TRADGVSEPL ASHVDQGSDV PGDASVDGVD LRLGRLSTEQ

601 SGLLPRHEQNVRAFILEQSL LDQLYMDYID LHPDQKSCEA YNSALHGYNT RLELQKEYNR

661 IFESHESASPNEINSFSQKY RAALRDVAQD IVNQGPMFYS SRDAMLLRAR VDTLCDMCRS

721 IRNLYMVELDAIDKEEKSLQ SDMKSASSSD KKLIQEKIKL L

SEQ ID NO:9: Secuencia de nucleótidos del antígeno p16

ORIGEN

1 ATGTTACACG TTCAAAATCA TGTTGATCAA CATACAAATC ATATAGAACA TGATGATTAC

61 CATTTTACTG GTCCTACTAG TTTTGAAGTT AATCTTTCTG AAGAAGAAAA AATGGAGTTA

121 CAAGAAGTAT CTTCTATTGATAGTGTAGGA TGCGAAGATT GTGATCCAAA TTGTCGTTAT

181 CCTTTAGAAT TAGTAGAATGTCAGCGTATT GAGGAAAGAC CAGTATGCAA TGCAGGTTTA

241 GAGAGCTTGA CTGTTGATGCATATCAATTA GGATTGTTGT TAGGTGGTTT TTTAAGTGCT

301 ATGAATTACA TATCTTATAGCTATCCTTGT TATTATTATG ATTGTTGTGA TAGAAATTAT

361 TACGACTGTT GTCATAAGAATGCGTGTTAT TACAACTGTT GTGATTGTGC GTAA

SEQ ID NO:10 Secuencia de proteína del antígeno p16

ORIGEN

1 MLHVQNHVDQ HTNHIEHDDY HFTGPTSFEV NLSEEEKMEL QEVSSIDSVG CEDCDPNCRY

61 PLELVECQRI EERPVCNAGL ESLTVDAYQL GLLLGGFLSA MNYISYSYPC YYYDCCDRNY

121 YDCCHKNACY YNCCDCA.

SEQ ID NO:11 Secuencia de nucleótidos de la proteína Ribosomal L1

ORIGEN

1 ATGACGATTT TCTTAGAAAG TGATGATGAT AAGAGTAACT TTAAGAAGAC ATTGGAGAAC

61 GGTACTAAAG ACAAGACAAA TCTAGATAAT ACTTATTATG ACTATCATCA TGAAGATGAT

121 ATGGGAAATA CTGAATATCA TTATGTGAGT TTGGATAGAG TGGATCATGT TAAGATGCCT

181 GAAGAGCCTG TAGGTTATGG TGGAGATACT TTACCTATTG TTCCTACTAC AGCTGCTAGT

241 GTATCTGGTA GTGATGCAGG CGTTGCTGTA GGTAATGTTA AAGATTTTGA AGATAATGTT

301 TTTCATCATA CATCTACTAT AAGAAACGAT GAATTGAAGA TAGATTTACG AATACATACT

361 TTAAAGGATT TATCTGATAA AAGATTACGT GAAATTGAAA AGGGATTTAA TGATACGGTA

421 ACAAAATTTA AAAATAATTT TGGGTTAGAA CCAAATGATG GAGAAACTAT TTTTGATTTA

481 TñCCTTTTTG ATGATAAGGA ACAATATAAT TATTATGGAA AGCTTTATAA CTTAGGAATT

541 AGTGGATCTG GAGGTATGAC TTTCTATGGA AATGCTAATG TTCCATATAA AATTTATGTA

601 CATCAATATG GTGAAATATT GAATTTAAAA CATGAATTAA CTCATGCATT AGAAAGTTAT

661 GCATCTGGAC ATAAATTGCA TGGTTCTGAC GTAAATAGCA GAATATTTAC GGAAGGATTA

721 GCTGATTATA TCCAAGAAGA TAATAGTTTT ATTATGAGAG GATTAAAGGA TCGAGAGATC

781 ACTTCAGATG TATTGAAAGA TTCTTCTGGT AATGTAGATC ATTTAAGTGG TGTTGCAGTG

841 AATGAAAATC AGAGGTTAAG TTATAGTATA GGACATGCAT TTGTAAGCTT TTTACAAGAG

901 AAATATCCTA AGTTAATTTC GGAATATTTA AACGCATTAA AAGAGGATAA TATTATTCGT

961 GCTAAAGAAA TAATTAGTAT GGATAAGTAT CCAGATTTTG AGCCGTGGGT GAAGTCTAAA

1021 GACATTAGTT TATATTTAGA AAATATGAAT GTATTAAAGT TAGGATTAGG TGAGAAAATG

1081 TTTTCTGCTG AAAGTGCTAG CTATTTTGAA GATCAAGGTG TCAATAAAGA ATATTACCAT

1141 GAAAATATTT ATGATATGAG TGGTAAACTA GTAGGTGAAA TGTCACCTGT AGTGCATTAT

1201 GCACAAAAAA ATGTGATTCG TATTTGGAAT ATTGCAAGTC CTGATATGAT AGAGGTGCGA

1261 CCAGAATATA ACTTTCTGAA ATTGGTAACT ACTCCATCTG GTAAGTCTGC ATATGTATAT

1321 TGTGATAAGA ATGGGCATGA GTATTTTAAT ACTAAAGATT ACATAGATTC TGCGTTTAAT

1381 ATATTGGCAA GATATGATGT TAAGCTTCGT GAAAGTAGTG ATGCTTTGGA TATTAGAGGT

1441 CGTTACTCAG ATGCTGCTAA AGTGTTTAGT AAGCTGCCTA ATGCGGATTT GCTGTTGGAT

1501 AAGTTTTTAG AAAAAATAGG TTATAGTAGT TATAAGCAGA TAATAATGAG TAATCCAGAA

1561 CAGCTTAATT CTATTAAGGC TTATGTAGTA AAAGAAGTGT TTGAAAATTT TAGGGAATCT

1621 GAGGTCAAAA AGGTGTTGAG TGGTGAGTCT CATCCGGAAG TAAGAAATGT ATTAATGGAT

1681 CTTACCTATG TTGATTTAAA GAGTGTTATA GGAGTAAATG GTGCAGATAT TGACAGTATT

1741 ATTTCTAATC CAGATGTAAT GTTGCGTACT GCTGTGTTAG GTAAAGGAAA TGCAAGTGGG

1801 ATATCTCTAT ATGTAGATGA TCAGAAAGTT GGTGAGCTGT CAACTGAAGC AGGTTATTGT

1861 GTTAAAAATC TTGATACTGG TAAAGTGTAT TTTATGTTCC ATAATGTTGT TGGAATGATA

1921 GCAAGTGGTT ATGAAGACAG AGCATATATG GTTGTATTAG AAAAAGATGG TAAGTTTACT

1981 ACTGCTCTAG TTAATAATAT ACAAAAAGCA GCAGATGGAA ATGTTGTATG GGATAATCAA

2041 TTTAATCATC CGAATATTAA TAACTTGCAC TCAAATTATA AGGAGCTGTT GTTAAATGAT

2101 GCTTCAGTTA AAGATTACTC TCATCTTGCG GATGTGAAAT TTAATAAAGA TGATACAGTA

2161 ATTGTTAAAG GTGAATTATT AGATGATAAA GGTACTGTAA GTGTAGATGA TGATGTACAT

2221 CGTGCAGTTG TTAAGCATGA TGATCAAATA CTACATCAGT TTAAGAGTAT GTCTTTTTAC

2281 ATTACTGAAC CATCAGCTGA TTCAGGTGAC AATTATGGAA GTGATTTTTT CATTTCTGAT

2341 GAAGGAAAAA ATCTTAGATT TCAACTTCCT AAAGCTATTA CGCATTTGAA ATTGGTTAAT

2401 GTTAATGGAA ATAATAAGTT GGTACCATGT ACTAAAGATG GGAATGAACA TCCTGAAGGT

2461 ATGCCATCTG ATTTAACGGA TGAATATAGA TATATAGATC CTATTTTTGC TCATACATTT

2521 GAGAAACAAA GTTATTCTAA AAATAGTATT AGTGTTGGGT TAGTGGACTT CAGTAAATAT

2581 AAAGAAGGAT CTATGTTTAA ATTACAGCAT TATTCTGATG ATTATCATAT TCATAAGGAT

2641 GAACAAGGTA ATGTTATTAG GCCTAATAAC AGATCTTACG TTACAAAAGT GGATTTAGTA

2701 TATGATGATA AAGTTATTGG GATGTTGTCT GATAGTATAA ATCAATTTCA GGGTGATATT

2761 TTCATTTCTG CAAGCCTTAA TTATAGCCAC AATGATTTTC TTTCATCTAA GTACTTTCAG

2821 AAAGTTAATA TTGAGGCGTT AGAAAATGGA ATATATAGTG GAAGATATGA TGTAGGAGAT

2881 GGTGACCAAA TAGCAGGTCT TAATACTGAT ACAGGTTATA GTGATAAAGC TATTTTTTAC

2941 TTTAAAAATG ATAGCGCATC TACTGATATG CCGGCTAGTG ATGTTACTAC TATTTTACCT

3001 TATATAAATG AGCTTTAA

SEQ ID NO:12 Secuencia de proteína de proteína ribosomal L1

ORIGEN

1 MTIFLESDDD KSNFKKTLEN GTKDKTNLDN TYYDYHHEDD MGNTEYHYVS LDRVDHVKMP

61 EEPVGYGGDT LPIVPTTAAS VSGSDAGVAV GNVKDFEDNV FHHTSTIRND ELKIDLRIHT

121 LKDLSDKRLR EIEKGFNDTV TKFKNNFGLE PNDGETIFDL YLFDDKEQYN YYGKLYNLGI

181 SGSGGMTFYG NANVPYKIYV HQYGEILNLK HELTHALESY ASGHKLHGSD VNSRIFTEGL

241 ADYIQEDNSF IMRGLKDREI TSDVLKDSSG NVDHLSGVAV NENQRLSYSI GHAFVSFLQE

301 KYPKLISEYL NALKEDNIIR AKEIISMDKY PDFEPWVKSK DISLYLENMN VLKLGLGEKM

361 FSAESASYFE DQGVNKEYYH ENIYDMSGKL VGEMSPVVHY AQKNVIRIWN IASPDMIEVR

421 PEYNFLKLVT TPSGKSAYVY CDKNGHEYFN TKDYIDSAFN ILARYDVKLR ESSDALDIRG

481 RYSDAAKVFS KLPNADLLLD KFLEKIGYSS YKQIIMSNPE QLNSIKAYVV KEVFENFRES

541 EVKKVLSGES HPEVRNVLMD LTYVDLKSVI GVNGADIDSI ISNPDVMLRT AVLGKGNASG

601 ISLYVDDQKV GELSTEAGYC VKNLDTGKVY FMFHNVVGMI ASGYEDRAYM VVLEKDGKFT

661 TALVNNIQKA ADGNVVWDNQ FNHPNINNLH SNYKELLLND ASVKDYSHLA DVKFNKDDTV

721 IVKGELLDDK GTVSVDDDVH RAVVKHDDQI LHQFKSMSFY ITEPSADSGD NYGSDFFISD

781 EGKNLRFQLP KAITHLKLVN VNGNNKLVPC TKDGNEHPEG MPSDLTDEYR YIDPIFAHTF

841 EKQSYSKNSI SVGLVDFSKY KEGSMFKLQH YSDDYHIHKD EQGNVIRPNN RSYVTKVDLV

901 YDDKVIGMLS DSINQFQGDI FISASLNYSH NDFLSSKYFQ KVNIEALENG IYSGRYDVGD

961 GDQIAGLNTD TGYSDKAIFY FKNDSASTDM PASDVTTILP YINEL.

SEQ ID NO:13 secuencia de nucleótidos VirD4 de la proteína secretora de tipo IV

ORIGEN

1 ATGGATAGTA TAAGTGCAAA TCACATACGC AATATTTTAT TCCTTGTTTT AGGCGCATTT

61 TTTGGACTGG AATTTTGCTT TTATTTATCA GGTGTATTAT TCATCTTAAT GGTCTGGGGA

121 CCAAATTACC TAGATTTTAA TGCTATAAAT CCCAGTTTGA GTGATTTTCC AGACAGAATT

181 TGGCCAACTA TTTTTGACTA TGTACAACAT TGGTGGAAGA ACCCTTCTGC ATACGATGCA

241 GTTTTATTAC TTAAGCTAAT AACGTCATTA TGTACACCAG TAGGTATTCT AAGCATAGTA

301 TTATGGAACC TTAGAAATAT ATTATTCGAT TGGAGGCCAT TTAAGAAGAA AGAATCACTG

361 CATGGAGATT CAAGATGGGC AACAGAAAAA GATATTCGCA AAATAGGATT ACGTAGTAGA

421 AAAGGAATAT TATTAGGGAA AGACAAGAGA GGATATCTCA TTGCAGATGG ATATCAACAT

481 GCATTGTTAT TTGCACCAAC TGGATCCGGA AAAGGTGTAG GTTTTGTAAT ACCAAACTTA

541 TTATTCTGGG AAGATTCTGT AGTAGTACAC GATATAAAAT TAGAGAACTA TGATCTTACA

601 AGTGGGTGGA GAAAAAAAAG GGGACAAGAA GTTTTCGTGT GGAACCCAGC ACAACCTGAC

661 GGTATAAGTC ACTGTTACAA CCCATTAGAT TGGATAAGCT CTAAGCCTGG ACAAATGGTA

721 GATGATGTAC AAAAAATTGC CAATCTAATA ATGCCTGAAC AAGATTTTTG GTATAACGAA

781 GCACGTAGTT TATTTGTAGG AGTAGTATTA TACTTACTAG CAGTACCAGA AAAAGTAAAA

841 TCCTTTGGAG AAGTTGTAAG AACAATGCGC AGCGATGACG TAGTCTACAA CTTAGCAGTA

901 GTACTAGACA CAATAGGGAA AAAGATTCAC CCAGTTGCAT ACATGAATAT AGCTGCATTT

961 TTACAAAAAG CAGACAAAGA ACGCTCAGGT GTTGTATCAA CTATGAACTC ATCTTTAGAA

1021 TTATGGGCAA ACCCATTAAT AGATACAGCA ACAGCATCAA GTGATTTTAA TATTCAAGAA

1081 TTTAAAAGGA AAAAAGTAAC AGTATATGTT GGATTAACAC CAGATAATTT AACTCGTCTT

1141 AGACCTTTAA TGCAGGTATT TTATCAACAA GCTACAGAAT TTTTATGTAG AACTTTACCA

1201 TCAGATGATG AACCATATGG TGTACTGTTC TTAATGGATG AGTTTCCAAC ATTAGGAAAA

1261 ATGGAGCAAT TTCAAACAGG TATCGCATAT TTCCGTGGAT ATAGAGTTAG ACTATTTTTG

1321 ATTATTCAAG ATACTGAACA GCTTAAGGGT ATATATGAAG AAGCAGGAAT GAACTCATTC

1381 TTATCAAACT CTACTTATAG AATAACTTTT GCTGCAAATA ATATAGAAAC TGCAAATTTA

1441 ATATCACAGT TAATAGGAAA TAAAACTGTT AACCAAGAGT CTTTAAACAG ACCTAAATTT

1501 TTAGATTTGA ACCCTGCATC ACGTTCATTA CATATATCAG AAACACAAAG AGCTTTACTA

1561 TTACCTCAAG AAGTAATAAT GTTACCCAGA GATGAGCAAA TACTTTTAAT AGAATCTACT

1621 TATCCTATAA AATCAAAGAA AATAAAATAC TATGAAGACA AAAATTTTAC AAAAAAACTA

1681 TTAAAGAGTA CCTTTGTTCC AACTCAAGAG CCTTATGATC CCAACAAAAC AAAAACAGCA

1741 ACAAAAGAAA ACGAAGAACC TATGCCAAGT ATTGAAAGCG ATCTTCCTAA AAATACATCT

1801 GACAATACTG AAAACAATAT GGAAGATGGT GCAATGTACA GCAGCATAGA AGAAGATTAT

1861 GACGATGATG ATGATGATTT TAATTTTGAA GACTTAGATG AATATATGGA TGAAGAAGAA

1921 GATTATGATG ATGAAGAATA TGATGATATA GATTATGATG ATAATAACAA TAGTAATGAG

1981 GAGTATGAAG AAGATAATCC AGAAGAAGAT GACAATAGCA ATAATCTAGA CGATGAGGAA

2041 GAGGAAGAAG ATAATATTAT AGATTATGAA GATGAAGAAG AATATGATGA TAACATAGAC

2101 TACAAAGATG ATGACAATAA CTACAACAAA GATACCACTG ACGATCAAGA CTCAAAAAAA

2161 CATAATGAAT AG

SEQ ID NO:14 Secuencia de proteínas secretoras VirD4 de tipo IV

ORIGEN

1 MDSISANHIR NILFLVLGAF FGLEFCFYLS GVLFILMVWG PNYLDFNAIN PSLSDFPDRI

61 WPTIFDYVQH WWKNPSAYDA VLLLKLITSL CTPVGILSIV LWNLRNILFD WRPFKKKESL

121 HGDSRWATEK DIRKIGLRSR KGILLGKDKR GYLIADGYQH ALLFAPTGSG KGVGFVIPNL

181 LFWEDSVWH DIKLENYDLT SGWRKKRGQE VFVWNPAQPD GISHCYNPLD WISSKPGQMV

241 DDVQKIANLI MPEQDFWYNE ARSLFVGVVL YLLAVPEKVK SFGEVVRTMR SDDVVYNLAV

301 VLDTIGKKIH PVAYMNIAAF LQKADKERSG VVSTMNSSLE LWANPLIDTA TASSDFNIQE

361 FKRKKVTVYV GLTPDNLTRL RPLMQVFYQQ ATEFLCRTLP SDDEPYGVLF LMDEFPTLGK

421 MEQFQTGIAY FRGYRVRLFL IIQDTEQLKG IYEEAGMNSF LSNSTYRITF AANNIETANL

481 ISQLIGNKTV NQESLNRPKF LDLNPASRSL HISETQRALL LPQEVIMLPR DEQILLIEST

541 YPIKSKKIKY YEDKNFTKKL LKSTFVPTQE PYDPNKTKTA TKENEEPMPS IESDLPKNTS

601 DNTENNMEDG AMYSSIEEDY DDDDDDFNFE DLDEYMDEEE DYDDEEYDDI DYDDNNNSNE

661 EYEEDNPEED DNSNNLDDEE EEEDNIIDYE DEEEYDDNID YKDDDNNYNK DTTDDQDSKK

721 HNE .

SEQ ID NO:15

MDIDNNNVTTSSTQDKS GNLMEVIMRILNFGNN SD

EKVSNEDTKVLVE SLQPAVNDNVGNPSSEVGKEEN

APEVKAEDLQPAVDGSVEHSS SEVGKKVSETSKEE

STPEVKAEDLQPAVDGSIEHSSSEVGEKVSKTSKE

ESTPEVKAEDLQPAVDDSVEHSSSEVGEKVSETSK

EENTPEVKAEDLQPAVDGSIEHSS SEVGEKVSKTS

KEESTPEVKAEDLQPAVDDSVEHS SSEVGEKVSET

SKEENTPEVKAEDLQPAVDGSVEHSSSEVGEKVSK

TSKEESTPEVKAEDLQPAVDDSVEHSSSEVGEKVS

ETSKEENTPEVRAEDLQPAVDGSVEHSSSEVGEKV

SETSKEESTPEVKAEDLQPAVDSSIEHSSSEVGKK

VSETSKEESTPEVKAEDLQPAVDGSVEHSSSEVGE

KVSETSKEENTPEVKAEDLQPAVDGSVEHSSSEVG

EKVSETSKEENTPEVKAEDLQPAVDGSVEHSSSEV

GEKVSETSKEESTPEVKAEDLQPAVDDSVEHSSSE

VGEKVSETSKEESTPEVKAEDLQPAVDGSVEHSSS

EVGEKVSETSKEESTPEVKAEVQPVADGNPVPLNP

MPSIDNIDTNIIFHYHKDCKKGSAVGTDEMCCPVS

ELMAGEHVHMYGIYVYRVQSVKDL SGVFNIDH STC

DCNLDVYFVGYNSFTNKETVDLI

SEQ ID NO:16

KEENAPEVKAEDLQPAVDGSVEHS SSEVGKKVSETS

KEESTPEVKAEDLQPAVDGS^EHSSSEVGEKVSKTS

KEESTPEVKAEDLQPAVDDSVEHS SSEVGEKVSETS

KEENTPEVKAEDLQPAVDGS^EHSSSEVGEKVSKTS

KEESTPEVKAEDLQPAVDDSVEHS SSEVGEKVSETS

KEENTPEVKAEDLQPAVDGSVEHSSSEVGEKVSKTS

KEESTPEVKAEDLQPAVDDSVEHS SSEVGEKVSETS

KEENTPEVRAEDLQPAVDGSVEHS SSEVGEKVSETS

KEESTPEVKAEDLQPAVDSS^EHSSSEVGKKVSETS

KEESTPEVKAEDLQPAVDGSVEHS SSEVGEKVSETS

KEENTPEVKAEDLQPAVDGSVEHS SSEVGEKVSETS

KEESTPEVKAEDLQPAVDDSVEHSSSEVGEKVSETS

KEESTPEVKAEDLQPAVDGSVEHS SSEVGEKVSETS

KEESTPEVKAE SEQ ID NO:18 E. canis P140-1 (72,89)

CPEVKAEDLQPAVDGSVEH SEQ ID NO:19 E. canis P140-3 (64,89)

CEVGKEENAPEVKAEDLQPAVDGSVEH SEQ ID NO:20 E. canis

CKEESTPEVKAEDLQPAVDSVEHSSSEVGKVSETS SEQ ID NO:21

XPEVKAEDLQPAVDGSVEHX, en donde X = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 aminoácidos. SEQ ID NO:22

CMLHVQNHVDQHTNHIEHDDYHFTGPT

SEQ ID NO:23

CTNHIEHDDYHFTGPTSFEVNLSEEEKMEL SEQ ID NO:24

CTGPTSFEVNLSEEEKMELQEVSSIDS SEQ ID NO:25

XMLXVQNHVDQHNHIEHDDYHFTXPT

En donde la X en la posición 1 es C o está ausente, X en la posición 4 es H o Q y X en la posición 25 es D o G.

SEQ ID NO:26

XTNHIEHDDYHFTXPTSFEVNLSEEEKMEL

En donde la X en la posición 1 es C o está ausente y X en la posición 14 es G o D.

SEQ ID NO:27

XTXPTSFEVNLSEEEKMELQEVSSIDS

En donde la X en la posición 1 es C o está ausente, y X en la posición 3 es G o D.

SEQ ID NO:28

XTNHIEHDDYHFTXPT

En donde la X en la posición 1 es C o está ausente, y X en la posición 14 es G o D.

SEQ ID NO:29

XTXPTSFEVNLSEEEKMEL

SEQ ID NO:30

XTNHIEHDDYHFTXPTSFEVNLSEXEKMEL

En donde la X en la posición 1 es C o está ausente, X en la posición 14 es G o D, y X en la posición 25 es E o G.

SEQ ID NO:31

XTXPTSFEVNLSEXEKMELQEVSSIDS

En donde la X en la posición 1 es C o está ausente, X en la posición 3 es G o D, X en la posición 14 es E o G. SEQ ID NO:32

XTXPTSFEVNLSEXEKMEL

En donde la X en la posición 1 es C o está ausente, X en la posición 3 es G o D, y X en la posición 14 es G o E.

SEQ ID NO:33

XMLXVQNHVDQHTNHIEHDDYHFTXPTSFEVNLSEXEKMELQEVSSIDS

En donde la X en la posición 1 está ausente o es c, X en la posición 4 es H o Q, X en la posición 25 es D o G, y X en la posición 36 es E o G.

Los siguientes polipéptidos también se describen en la presente descripción:

(a) La SEQ ID NO:33, en donde la X en la posición 1 está ausente o es C, X en la posición 4 es H o Q, X en la posición 25 es D o G, y X en la posición 36 es E o G;

(b) Los aminoácidos 1-27 de la SEQ ID NO:33, en donde la X en la posición 1 es C, X en la posición 4 es H, X en la posición 25 es D o G;

(c) Los aminoácidos 13-41 de la SEQ ID NO:33, en donde la X en la posición 25 es D o G, X en la posición 36 es E o G; y una C está opcionalmente presente en el extremo amino;

(d) Aminoácidos 24-49 de la SEQ ID NO:33, en donde la X en la posición 25 es D o G, X en la posición 36 es E o G, y una C está opcionalmente presente en el extremo amino;

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar la presencia de un anticuerpo o sus fragmentos de unión al antígeno que son específicos para E. canis, en una muestra de prueba canina o humana, en donde la muestra de prueba se selecciona del grupo que consiste en plasma, sangre, suero, saliva, orina, heces fecales, exudado de heridas, líquido cefalorraquídeo (CSF), semen, esputo, extractos de tejidos y extractos celulares, que comprende:

(a) poner en contacto con la muestra de prueba con uno o más polipéptidos purificados que consisten en las SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32; o uno o más polipéptidos purificados que tienen al menos 95 % de identidad a las SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32;

en donde el uno o más polipéptidos purificados se unen específicamente a un anticuerpo que es específico para E. canis, en condiciones adecuadas para la unión específica del uno o más polipéptidos purificados a los anticuerpos o sus fragmentos de unión al antígeno; y

(b) detectar la presencia de unión específica del uno o más polipéptidos purificados a los anticuerpos o sus fragmentos de unión al antígeno;

en donde la presencia de unión específica del uno o más polipéptidos purificados a los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno indica la presencia de los anticuerpos o sus fragmentos de unión al antígeno específicos para E. canis en la muestra de prueba.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el uno o más polipéptidos purificados se unen a una secuencia de aminoácidos heterólogos, un reactivo indicador, un separador de aminoácidos, un enlazador de aminoácidos, una secuencia señal, una secuencia de transferencia de parada, un dominio de transmembrana, un ligando para purificación de proteínas, o una de sus combinaciones.

3. El método de la reivindicación 1, en donde el método comprende además detectar la cantidad de unión específica.

4. El método de la reivindicación 1, en donde el uno o más polipéptidos purificados se inmovilizan a un soporte sólido.

5. El método de la reivindicación 1, en donde la presencia de la unión específica del uno o más polipéptidos purificados a anticuerpos específicos para E. canis en la muestra de prueba indica que el canino o humano se ha infectado con E. canis.

6. El método de la reivindicación 5, que comprende además determinar si los anticuerpos en la muestra de prueba se unen específicamente a uno o más segundos polipéptidos de E. canis purificados que son antígenos vacunales de E. canis, en donde si los anticuerpos en la muestra de prueba se unen específicamente al uno o más primeros polipéptidos de E. canis purificados y se unen específicamente al uno o más segundos polipéptidos de E. canis purificados, entonces el canino o el humano se ha infectado con E. canis y se desconoce el estado de vacunación contra E. canis;

en donde si los anticuerpos en la muestra de prueba no se unen específicamente al uno o más primeros polipéptidos de E. canis purificados y se unen específicamente al uno o más segundos polipéptidos de E. canis purificados, entonces el canino o el humano no se ha infectado con E. canis y se ha vacunado contra E. canis; y

en donde si los anticuerpos en la muestra de prueba no se unen específicamente al uno o más primeros polipéptidos purificados y no se unen específicamente al uno o más segundos polipéptidos purificados, entonces el canino o el humano no se ha vacunado contra E. canis y no se ha infectado con E. canis.

7. El método de la reivindicación 1, en donde el uno o más polipéptidos purificados están en una forma multimérica.

8. Una composición que comprende uno o más polipéptidos purificados que consisten en las SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32.

9. La composición de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el uno o más polipéptidos purificados están en una forma multimérica.

10. Un método para monitorear el tratamiento de una infección por E. canis en un paciente canino o humano que comprende:

(a) determinar el nivel de anticuerpos anti-E. canis en una primera muestra de prueba del paciente antes o en las primeras etapas de un tratamiento para una infección por E. canis por un método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la muestra de prueba se selecciona del grupo que consiste en plasma, sangre, suero, saliva, orina, heces fecales, exudado de heridas, líquido cefalorraquídeo (CSF), semen, esputo, extractos de tejidos y extractos celulares;

(b) determinar el nivel de anticuerpos anti-E. canis en una segunda muestra de prueba del paciente después de efectuar el tratamiento mediante un método de acuerdo con la reivindicación 5; y

(c) comparar la cantidad de anticuerpos anti-E. canis en la primera muestra de prueba con la cantidad de anticuerpos anti-E. canis en la segunda muestra de prueba para evaluar un cambio y así monitorear el tratamiento.