ES2914126T3 - Membrana artificial de Descemet - Google Patents

Abstract

Constructo artificial de Descemet para la diferenciación mecanotransductora de células biológicas en un tejido endotelial corneal de novo, caracterizada porque el constructo está formado por un cuerpo base esférico (10) con una estructura de panal formada en la cara cóncava (12) del cuerpo base (10).

Description

DESCRIPCIÓN

Membrana artificial de Descemet

La presente invención se refiere a procedimientos y medios para producir tejido endotelial corneal del ojo de mamífero y proporciona un constructo artificial estructurada que permite la nueva formación de un endotelio corneal a partir de células aisladas fuera del cuerpo.

La transparencia de la córnea del ojo es esencial para la visión. Requiere sobre todo un tejido endotelial intacto (endotelio corneal). Este endotelio monocapa de la parte posterior de la córnea está en contacto directo con una membrana basal libre de células, la llamada Lamina limitaos posterior descementi o membrana de Descemet, que la separa de la capa principal de la córnea, el estroma. La membrana de Descemet en la córnea sana está formada principalmente por colágeno tipo VIII y laminina. Tiene una estructura espacial regular que corresponde a la estructura de las células del endotelio. El endotelio drena activamente el estroma a través de la membrana de Descemet y evita la retención de agua y la formación de edema en ella y, por tanto, la opacidad de la córnea.

Las células endoteliales de la córnea humana se detienen en la fase G1 y sólo muestran una capacidad proliferativa limitada in vivo. La incapacidad de dividirse significa que las lesiones de la córnea ya sean causadas por procesos inflamatorios o traumatismos mecánicos, pero también por procesos naturales de envejecimiento, pueden conducir a la destrucción irreversible del endotelio y, en el peor de los casos, a la pérdida completa de la visión debido a la opacidad de la córnea. Es cierto que las células endoteliales muertas son sustituidas por células vecinas que se agrandan y migran a los huecos para garantizar la estanqueidad y, por tanto, la función del endotelio. Sin embargo, este mecanismo de reparación es muy limitado.

La pérdida de células endoteliales en la córnea sólo puede contrarrestarse de forma limitada con medidas médicas. Un método frecuentemente utilizado es la sustitución de toda la córnea enferma por una córnea donante, la llamada queratoplastia perforante. Sin embargo, a menudo se producen complicaciones clínicas que provocan una falta o una reducción de la rehabilitación del ojo, como la sequedad ocular crónica, la vascularización de la córnea y, en el peor de los casos, el rechazo del material extraño del donante.

Además de la sustitución total, en la actualidad se han establecido procedimientos en los que, tras la extirpación local únicamente del endotelio enfermo junto con su membrana de Descemet (Descemetorhexis), se crea posteriormente un injerto laminar a través de un túnel corneo-escleral, consistente en el endotelio corneal y la membrana de Descemet adherida, así como una pequeña cantidad de estroma posterior adherido, se introduce desde una córnea donante en la cámara anterior del receptor. Este trasplante específico reduce los riesgos habituales de un trasplante y los efectos secundarios de la operación en comparación con un trasplante total. Sin embargo, hay otros problemas técnicos que aún no se han superado.

La dificultad de todos estos trasplantes alogénicos de tejido corneal es la pérdida de células endoteliales: la técnica de preparación en el ojo donante, la forma de almacenamiento, así como el medio de cultivo utilizado, el transporte y, por último, la manipulación perioperatoria del tejido donante va siempre acompañados de una pérdida más o menos grave de células endoteliales en el injerto. Además del rechazo inmunorreactivo del tejido extraño, estos factores también pueden provocar un fallo primario del injerto, por el que el tejido endotelial trasplantado deja de ser funcional y no se produce la rehabilitación. Los agregados celulares derivados de células endoteliales aisladas de la córnea humana se conocen por el documento EP 1835023 A1. Se utilizan para hacer un implante endotelial de córnea.

La invención se ha propuesto superar estos inconvenientes en la reparación clínica del tejido endotelial de la córnea. En particular, se deben reducir las desventajas conocidas de los injertos alogénicos, pero también especialmente los problemas de la muerte de las células endoteliales en un tejido donante explantado.

Para resolver esto, la invención proporciona procedimiento y medios para producir un nuevo implante endotelial biológico que supera las desventajas mencionadas de los injertos conocidos: Un tejido endotelial corneal que puede producirse de novo en cultivo de tejidos a partir de células aisladas sobre una novedosa membrana artificial de Descemet.

Los autores de la invención descubrieron sorprendentemente que las células madre omnipotentes o pluripotentes aisladas pueden ser estimuladas por un constructo artificial especial que imita específicamente la membrana de Descemet presente en la córnea sana, formar un tejido endotelial corneal funcional de novo con alta densidad celular, que junto con el constructo artificial de Descemet de acuerdo con la invención puede implantarse en el ojo del paciente para sustituir completamente la función del endotelio corneal perdido.

Para ello, la invención proporciona un constructo artificial de Descemet, que es particularmente adecuada para soportar o permitir la diferenciación mecanotransductora de células biológicas, especialmente células pluripotentes u omnipotentes en un tejido endotelial corneal in vitro.

Sin querer estar limitado por la teoría, después de sembrar células aisladas en el constructo de Descemet de acuerdo con la invención, se produce la diferenciación mecanotransductora de las células, lo que resulta en la formación de un tejido endotelial corneal funcional. Para ello pueden utilizarse células autólogas, especialmente células pluripotentes u omnipotentes del propio receptor. De este modo, se puede crear un implante corneal artificial compuesto por las propias células del receptor y en el que, mediante las medidas de cultivo adecuadas durante el cultivo in vitro del tejido, se puede seleccionar el número y la densidad celular de tal manera que se compense una posible pérdida celular peri o postoperatoria de forma que la función del tejido endotelial trasplantado se conserve de forma permanente incluso después del trasplante y se consiga una rehabilitación permanente completa.

De acuerdo con la invención, el constructo de Descemet comprende un cuerpo base conformado sustancialmente como cúpula, en el que se forma una estructura de panal en el lado cóncavo (cavidad) de este cuerpo base en su superficie. La estructuración espacial en forma de panal de la superficie del cuerpo base puede producirse mediante procesos de microestructuración adecuados.

En el contexto de la presente invención, no se entiende por "cúpula" o "en forma de cúpula" solo una sección esférica en sentido estricto, sino también las formas que corresponden esencialmente a esta forma, incluidas las formas de medio cuenco o media cúpula, como las secciones de elipsoides rotacionales, las formas de paraboloides rotacionales y las formas de transición de estas. De acuerdo con la invención, el constructo artificial de Descemet tiene particularmente una forma que corresponde a la forma de la córnea en la que se va a insertar un implante formado por o con el constructo.

En particular, se pretende que la estructura de panal esté compuesta por elementos geométricos básicos repetitivos o panales, que están dispuestos en forma de panal, preferentemente sin huecos entre ellos, teniendo cada elemento básico previsto una depresión central y nervaduras laterales que delimitan esta depresión hacia los elementos básicos vecinos. Preferiblemente, la altura de la nervadura, y por tanto la profundidad de la depresión central, es de 0,3 a 1 |jm. Preferiblemente, el ancho de la nervadura es de 1 a 8 jm . Preferentemente, el ancho de la depresión delimitada por las nervaduras es de 10 a 20 jm .

Preferiblemente, los elementos básicos tienen cada uno una forma básica hexagonal y forman así una estructura clásica de panal. En realizaciones alternativas, la forma básica de los elementos básicos repetitivos es circular o sustancialmente circular. En una variante alternativa, la forma básica es sustancialmente rectangular o cuadrada. En una variante alternativa, la forma básica es generalmente poligonal. Preferentemente, se alternan polígonos de diferente número de ángulos, preferentemente de cinco a nueve ángulos; de manera particularmente preferente, estas estructuras de panal están compuestas por hexágonos y pentágonos.

En una variante particular, la estructura de panal es estrictamente regular, es decir, está construida a partir de elementos básicos sustancialmente uniformes y, preferentemente, de tamaño sustancialmente uniforme. En una variante alternativa y preferida, la estructura de panal tiene una forma irregular. Es decir, los elementos básicos concebidos tienen cada uno de ellos diferentes tamaños y/o diferentes formas individuales, estando los tamaños de los elementos básicos de la estructura de panal preferentemente distribuidos (cuasi) estocásticamente; el tamaño medio de un grupo de 6 a unos 24 elementos básicos adyacentes se mantiene constante. No se exceden los intervalos de tamaño preferidos antes mencionados.

Preferiblemente, las nervaduras, es decir, las paredes laterales de los elementos básicos están cada una de ellas preferiblemente dispuestas perpendicularmente al plano base de la superficie estructurada del cuerpo básico. En una variante alternativa, las paredes laterales del elemento de base convergen de forma cónica hacia el fondo de su rebaje. Para ello, está previsto especialmente que el grosor de las paredes laterales aumente hacia el fondo del rebaje. Así, la escotadura encierra la forma de una pirámide poligonal truncada o, en el caso de una sección transversal esencialmente circular, la de un cono truncado.

En una realización, se proporciona un borde circunferencial que sobresale del medio cuenco. No es necesario que esté estructurado. Sirve para facilitar la manipulación del constructo de Descemet durante la microestructuración, por un lado, y durante la utilización del constructo de Descemet en el cultivo celular, por otro. Si es necesario, el borde puede separarse tras la finalización de la fase de cultivo celular o antes de la inserción del constructo de Descemet como componente de un implante.

En una realización preferida, el constructo de Descemet de acuerdo con la invención comprende y, preferiblemente, consiste en su totalidad en un polímero biológico o biocompatible. El polímero biológico o biocompatible es preferiblemente mecánicamente elástico y flexible. En una realización alternativa, es sustancialmente no elástica, pero flexible.

Lo relevante para la selección del polímero biológico o biocompatible es que cuando el constructo de Descemet se implanta en el ojo como componente de un implante in vitro, puede sustituir postoperatoriamente la función fisicoquímica de una membrana de Descemet nativa. Esto incluye, en particular, la capacidad de la permeabilidad (difusión pasiva) del agua (humor acuoso) desde el estroma hasta el tejido endotelial que bombea activamente. Se pretende, en particular, permitir esta difusión seleccionando la polaridad de los componentes del material y/o mediante estructuras porosas o perforadas (tamiz molecular).

Además, se prevé que el constructo artificial de Descemet sea parcial o totalmente reabsorbible después de la implantación. Preferentemente, queda una estructura residual que asume la función de la membrana basal nativa, mientras que los materiales presentes en el constructo de Descemet pueden reabsorberse de inmediato después de la implantación, en particular para la estabilización mecánica del implante. También está previsto que se forme una membrana basal a partir del constructo artificial de Descemet postoperatoria.

Se prevé además que las propiedades mecánicas del polímero biológico o biocompatible se seleccionen de manera que se alcancen las propiedades mecánicas de una membrana de Descemet nativa. En particular, se requiere una rigidez mecánica del constructo de Descemet, por un lado, para permitir la formación mecanotransductora de tejido endotelial corneal de novo a partir de células aisladas in vitro en cultivo de tejidos y, por otro lado, para garantizar una estabilidad suficiente durante la implantación en el ojo receptor peri y postoperatoria. En una variante, se prevé que las propiedades mecánicas del constructo cambien durante el cultivo in vitro y/o el postoperatorio. Para ello, se elige una composición de varios componentes, que muestran una reabsorción diferente o interactúan con las células endoteliales.

El (los) polímero(s) biocompatible(s) del constructo puede(n) ser total o parcialmente de origen sintético. Pueden ser funcionalizados de una manera conocida de por sí y, en particular, también pueden ser acoplados con proteínas o péptidos que promueven la adhesión.

El polímero comprende o consiste preferentemente en un colágeno o una mezcla de colágeno. El colágeno preferido es el de tipo I y/o el de tipo II. Se prefiere especialmente el colágeno de tipo VIII y/o el de tipo IV. También se prefieren sus mezclas. Preferiblemente, además está presente la laminina. Preferiblemente, también contiene fibronectina. Desde el punto de vista bioquímico, la membrana de Descemet nativa del ojo está compuesta principalmente por colágeno de tipo IV y VIII, fibronectina y laminina. Se prefiere producir estos componentes de la matriz extracelular preferentemente según procedimientos estandarizados y preferentemente de forma recombinante. La proporción de mezcla de los componentes se ajusta de manera que se alcance el tamaño de los poros en el constructo artificial y, por tanto, el potencial de difusión de la membrana nativa de Descemet. Preferiblemente, se utiliza un colágeno o una mezcla de colágeno con una nanoestructura natural. Esto potencia el efecto mecanotransductor de la microestructura del constructo de Descemet de acuerdo con la invención y acelera y estabiliza la diferenciación de las células aisladas en un tejido endotelial.

De modo adicional o alternativo, el biomaterial comprende o consiste en proteínas producidas de forma recombinante conocidas de la membrana de Descemet nativa infantil o adulta del cuerpo animal o humano. Las proteínas pueden ser de origen xenogénico o alogénico. Se prefiere el colágeno humano producido de manera recombinante o sus mezclas. Alternativa o adicionalmente, el constructo de Descemet contiene o consiste en proteína de seda. En una realización, el constructo contiene o está formado exclusivamente por polímeros biocompatibles de origen no biológico.

En una variante alternativa, el material del constructo de Descemet son polímeros y elastómeros sintéticos como elastómero de silicona o PMMA, polietilenos, poliamidas, PVA así como polímeros funcionalizados, polímeros mezclados y copolímeros. Se prefiere especialmente un polímero termosensible o termo responsable, en particular, una N-isopropilacrilamida, también modificaciones o derivados de la misma, así como N,N-dietilacrilamida (PDEAAm), N-vinilcaprolactama (PVCL) y similares.

Preferiblemente, al menos la superficie de dicho polímero sintético se funcionaliza, por ejemplo, mediante un recubrimiento o un tratamiento químico o físico del polímero, para lograr la compatibilidad con las células biológicas cultivadas en él de una manera en sí conocida. El polímero puede estar unido por hidrógeno a la laminina y/o fibronectina u otra proteína de adhesión celular mediante un proceso de esterilización por plasma. El polímero puede acoplarse de manera covalente a una proteína promotora de la adhesión (véase más arriba) mediante acoplamiento químico (por ejemplo, reacción EDC/NHS).

Por ejemplo, el constructo de Descemet se produce mediante técnicas de microestructuración. Preferentemente, se seleccionan entre los procesos de modelado fotolitográfico, la ablación fotolítica, la ablación micromecánica y la fundición y el estampado de moldes.

La microestructuración se lleva a cabo preferentemente mediante los llamados procesos de ablación, que trabajan la estructura de panal deseada a partir de un material mediante la eliminación de material. Se prefieren los procesos basados en el láser (ablación fotolítica). En la estructuración directa por láser, se dirige un rayo láser enfocado sobre la superficie del componente, por lo que la energía de la radiación láser incidente se convierte en energía térmica por absorción en la superficie cerca de la zona del borde. La eficacia de esta conversión viene determinada por el grado de absorción del material en función de la longitud de onda del láser utilizado, la rugosidad de la superficie, el ángulo de incidencia y la temperatura. A diferencia de esto, la energía de la radiación puede romper directamente los enlaces químicos. De manera alternativa o adicional, la eliminación del material implica un cambio de fase del material de sólido a líquido y posteriormente a gaseoso. En todos los casos, el material se elimina en forma de partículas y/o material fundido en la zona del rayo láser enfocado. En los láseres pulsados, esto produce en particular una única geometría de ablación por pulso láser, generalmente en forma de paraboloide de revolución ("platillo").

La generación de estructuras coherentes se consigue mediante un movimiento adecuado del rayo láser sobre la superficie de la pieza. Esto se realiza preferentemente con la ayuda de los llamados escáneres láser, que contienen uno o más espejos móviles alimentados por motores rápidos. La calidad de la ablación en términos de tamaño de la estructura alcanzable, nitidez de la estructura y precisión puede seleccionarse eligiendo una fuente láser adecuada. La longitud de onda de la luz láser, la potencia de salida (en el caso de los láseres pulsados, la energía de un solo pulso) y la calidad del haz de la fuente son determinantes.

Los procesos de microestructuración alternativos preferidos son los procesos mecánicos de eliminación de virutas, en particular el fresado de microdiamantes con herramientas microcristalinas. Los tamaños de estructura en el intervalo submicrométrico sólo pueden producirse mediante una combinación de tecnología de máquinas especiales y herramientas de gran afilado. Los tamaños de las estructuras de esta gama hacen uso de la llamada tecnología de ultra precisión. Las herramientas de diamante monocristalino son las preferidas en este caso, ya que su dureza y afilado y sus cortes precisos permiten la producción de las estructuras deseadas. La producción de componentes ultraprecisos en el proceso de torneado se limita preferentemente a la producción de superficies rotacionalmente simétricas. Alternativamente, se pueden producir superficies y estructuras que no son simétricas al eje de rotación ampliando el proceso al llamado mecanizado no redondo.

Otros enfoques preferidos para la microestructuración de Descemet son los denominados procesos de generación, en los que la estructura de panal de acuerdo con la invención se forma mediante la acumulación local de material o el curado de material en un cuerpo base mediante la aplicación de material. Los procesos preferidos son la litografía de dos fotones, la litografía de interferencia y la litografía de escala de grises.

La litografía de dos fotones (2PL) se basa en el efecto físico de la absorción de dos fotones (2PA) y permite la fabricación de estructuras tridimensionales con una resolución lateral de 150 nm y una resolución axial de 400 nm. El haz expandido de un láser de fibra de femtosegundo con una longitud de onda de 780 nm se acopla a un objetivo de microscopio invertido y es enfocado por éste en un polímero líquido y fotosensible. Como el láser está enfocado y pulsado, la intensidad en el foco es lo suficientemente alta como para permitir la absorción de dos fotones dentro del foco. En la zona correspondiente, se emite radiación ultravioleta con una longitud de onda de 390 nm en lugar de radiación infrarroja. El fotopolímero líquido como componente del cuerpo base del constructo se reticula sólo cuando se expone a la radiación UV de alta energía, de modo que en el área donde se produce la absorción de dos fotones, el polímero líquido del cuerpo base se cura y forma la estructura de panal.

En la litografía de interferencia, se utiliza la interferencia de dos haces o de varios haces para obtener una imagen y almacenar el patrón de interferencia correspondiente en una superficie sensible a la luz. Para ello, se expande un haz láser (láser de iones de argón) y se divide (por ejemplo, mediante un cubo divisor de haz) en dos haces parciales. Se superponen con espejos (planos o cóncavos) con un ángulo determinado, de modo que se crea un patrón de franjas con una determinada constante de rejilla en función de este ángulo y de la longitud de onda utilizada. Mediante la aplicación repetida, especialmente después de la rotación del cuerpo básico, se puede formar una estructura de panal.

La litografía de tonos grises se basa en la exposición de una máscara, cuyo patrón se almacena en un polímero fotosensible mediante la exposición. En este proceso, las diferentes profundidades de la estructura se realizan mediante diferentes tonos de gris en la máscara. Detrás de la máscara, se forma una distribución de intensidad correspondiente a la distribución de tonos de gris en la máscara. Utilizando una resistencia positiva, la estructura es más profunda donde la intensidad es mayor. Para las resistencias negativas, esta relación se invierte.

Los procesos de gofrado o fundición y sus combinaciones son particularmente preferidos para producir un constructo de Descemet biológico o biocompatible e implantable, en el que se produce primero un molde negativo (troquel) del constructo de Descemet deseada en un material preferentemente polimérico mediante los procesos ablativos o generantes antes mencionados, y posteriormente el propio constructo de Descemet se produce a partir de polímero biológico o biocompatible mediante colada y/o estampación como molde positivo sobre el troquel previamente producido. Este procedimiento preferido de dos pasos permite llevar a cabo la microestructuración en polímeros biológicos o biocompatibles que no serían directamente accesibles a los procesos de microestructuración física. El moldeo está destinado especialmente a todos los biomateriales que se someten a un proceso de endurecimiento o polimerización, es decir, que pasan de un estado líquido, de agregados vertibles, a través del endurecimiento, a un estado gelatinoso o sólido. Para el moldeo, se endurece en el molde negativo (fundición) o se presiona el molde negativo en el material (estampado). Además de los biomateriales puros de origen biológico, los polímeros sintéticos descritos en el presente documento también se proporcionan para la toma de impresiones.

A continuación, se describe un procedimiento para producir un constructo artificial de Descemet que, sin embargo, no forma parte de la invención. El procedimiento comprende al menos los siguientes pasos: 1.

Poner a disposición un cuerpo base polimérico; y 2. formar una estructura espacial de panal en una superficie del cuerpo base mediante un proceso de microestructuración. El proceso se selecciona preferentemente entre:

el estampado fotolitográfico, la ablación fotolítica, la ablación micromecánica, la fundición en molde y el estampado en molde.

Preferentemente, la etapa de formación de la estructura alveolar espacial comprende las subetapas de: 2.1. crear un molde negativo (matriz) de la estructura alveolar mediante un proceso de microestructuración y, a continuación, 2.2. formar la estructura alveolar final en un polímero biocompatible o biológico mediante el vaciado o el estampado por medio del molde negativo creado.

Por ejemplo, el constructo artificial de Descemet descrita en el presente documento se utiliza en un enfoque de ingeniería de tejidos fuera del cuerpo humano o animal para la recreación de un tejido endotelial a partir de células individuales, por ejemplo, el uso del constructo artificial de Descemet para la diferenciación mecanotransductora de, en particular, células mesenquimales, progenitoras o madre en un tejido endotelial corneal in vitro.

Las células a partir de las cuales se va a formar de novo el tejido endotelial corneal en el constructo de Descemet de acuerdo con la invención son preferentemente células progenitoras eucariotas, en particular células madre adultas, células madre embrionarias y células madre pluripotentes inducidas. Se prefieren las células mesenquimales, en particular las células madre mesenquimales. Estos se aíslan preferentemente del tejido del receptor. Preferiblemente, las células madre adultas se toman de forma mínimamente invasiva del tejido adiposo autólogo del paciente.

Para la diferenciación in vitro, las células son sembradas en la superficie estructurada del constructo de Descemet de acuerdo con la invención y cultivadas allí in situ. La densidad celular durante la siembra es preferiblemente de al menos 5 x 105/cm2. Finalmente, para apoyar la diferenciación de las células in vitro, se pueden utilizar factores químicos adicionales de por sí conocidos que apoyen la mecanotransducción de las células sobre el constructo microestructurada de Descemet de acuerdo con la invención. Sin embargo, se pretende especialmente que la diferenciación de las células tenga lugar exclusivamente por mecanotransducción sobre el constructo artificial de Descemet microestructurada de acuerdo con la invención. Los tejidos endoteliales corneales de novo así obtenidos no se ven afectados esencialmente por factores de diferenciación químicos o físicos de otro tipo, lo que, por un lado, estabiliza la diferenciación y, por otro, reduce la mortalidad de estas células o su desdiferenciación incluso en el postoperatorio.

Así, también es un objeto de la invención poner a disposición un procedimiento para producir un implante endotelial corneal de novo a partir de células biológicas aisladas, de acuerdo con la reivindicación 8.

Así, en esta variante, se pretende utilizar el constructo artificial de Descemet junto con las células diferenciadas en ella en un endotelio como implante para reparar los defectos endoteliales en la córnea de los pacientes. En esta realización, se prefieren los biomateriales mencionados como material para el constructo de Descemet.

Como otro objeto de la invención, el constructo artificial de Descemet junto con el tejido endotelial corneal formado en ella se proporciona como un implante de tejido in vitro. Se puede implantar en el ojo de un receptor, ojo vertebrado, especialmente ojo de mamífero, especialmente ojo humano, para sustituir la función de un tejido endotelial corneal destruido allí. Por lo tanto, es también un objeto de la invención proporcionar un implante in vitro que comprenda tejido endotelial corneal construido de novo a partir de células aisladas y el constructo artificial de Descemet. El tejido endotelial corneal diferenciado de novo adherido al constructo de Descemet de acuerdo con la invención puede ser entregado al ojo receptor como un implante fabricado in vitro utilizando técnicas quirúrgicas conocidas per se, en particular DMEk (queratoplastia endotelial de membrana de Descemet) o la DMAEK (queratoplastia endotelial automatizada de membrana de Descemet).

Además, el procedimiento de fabricación de un implante endotelial corneal de novo a partir de biológicos aislados puede incluir el siguiente paso: separación del tejido endotelial corneal del constructo de Descemet y obtención del tejido endotelial corneal aislado como implante endotelial corneal in vitro.

Así, en esta realización alternativa, se pretende separar el tejido endotelial del constructo de Descemet tras la diferenciación de las células sembradas en ella en un tejido endotelial y utilizar el tejido endotelial aislado como implante para reparar los defectos endoteliales en la córnea de los pacientes.

El desprendimiento del tejido endotelial del constructo artificial de Descemet puede realizarse por medio de procedimiento de por sí conocidos del cultivo de tejidos in vitro. Esto incluye el uso de enzimas disolventes, detergentes y similares. Se prevé que las células sean tratadas con una enzima suave como la acutasa. Al hacerlo, hay que evitar que, además de las proteínas de adhesión que median la adhesión de las células endoteliales al sustrato, no se destruyan también las "uniones estrechas" [tight junctions”] entre las propias células endoteliales, lo que perjudicaría la integridad funcional del tejido.

Preferiblemente, de forma alternativa o adicional, la superficie del constructo de Descemet, al menos en el lado de contacto con las células endoteliales, está específicamente recubierta o funcionalizada para reducir la formación de factores de adhesión y facilitar el desprendimiento.

En una realización particularmente preferida, de modo alternativo o adicional, el polímero sintético del constructo de Descemet es un polímero termosensible o termo responsivo descrito en el presente documento, preferentemente una N-isopropilacrilamida. En estos materiales, la adhesión o el desprendimiento de las células endoteliales del sustrato, es decir, el constructo de Descemet, puede controlarse mediante la temperatura. Preferiblemente, para desprender las células endoteliales, el constructo de Descemet con las células endoteliales se lleva a una temperatura baja de unos 20 °C o menos después de completar la fase de cultivo/diferenciación. Esto hace que el sustrato termosensible sufra un cambio de estado, lo que provoca o favorece en gran medida el desprendimiento del tejido endotelial en su conjunto.

En el contexto de la invención, el tejido endotelial corneal formado in vitro como tal se proporciona como el implante de tejido in vitro. Se puede implantar en el ojo de un receptor, un ojo vertebrado, especialmente un ojo de mamífero, especialmente un ojo humano, con el fin de sustituir la función de un tejido endotelial corneal destruido allí. En relación con la invención, por lo tanto, también hay un implante in vitro que consiste en tejido endotelial corneal construido de novo a partir de células aisladas. El tejido endotelial corneal aislado de novo puede entregarse al ojo receptor mediante técnicas quirúrgicas de por sí conocidas, en particular la DMEK (queratoplastia endotelial de membrana de Descemet) o la DMAEK (queratoplastia endotelial automatizada de membrana de Descemet).

La invención se describe con más detalle con referencia a las siguientes figuras y ejemplos de realizaciones específicas.

Las figuras muestran en forma esquemática y a modo de ejemplo la estructura del constructo de Descemet. En las representaciones de la Figura 1 y la Figura 2, los tamaños no están escalados, sino que las estructuras en forma de panal se muestran ampliadas varias veces en comparación con el tamaño total del constructo. La figura 1 muestra una vista superior del lado cóncavo 12 del constructo de Descemet en forma de cúpula de acuerdo con la invención. La figura 2 muestra una vista en sección transversal del constructo de Descemet según la figura 1. Para ilustrar la espacialidad de la estructura, las estructuras de panal de la figura 1 están distorsionadas en perspectiva hacia el borde. El constructo de Descemet tiene un cuerpo base 10 en forma de cúpula o medio cuenco, cuyo radio esférico se adapta al radio de la córnea del ojo del receptor. La estructura del cuerpo de la microestructura se compone de elementos básicos repetitivos imaginarios 20, cada uno de los cuales tiene una depresión central 22 y delimitaciones laterales en forma de nervaduras positivas 24. En la realización mostrada, el constructo de Descemet tiene un borde periférico sobresaliente 14. En la superficie de la depresión cóncava 12 del constructo en forma de cúpula 10, se proporciona una estructura de panal de elementos básicos repetitivos 20, cada uno con depresiones 22 y nervaduras laterales 24. En la realización mostrada, se forma un borde circunferencial sustancialmente liso 14 en el borde superior del cuerpo base 10 en forma de cúpula.

Ejemplo 1: Producción de un constructo artificial de Descemet

1. Producción litográfica de una matriz

1.1 Litografía de dos fotones

La litografía de dos fotones (2PL) se basa en el efecto físico de la absorción de dos fotones (2PA) y permite la fabricación de estructuras tridimensionales con una resolución lateral de 150 nm y una resolución axial de 400 nm. El haz expandido de un láser de fibra de femtosegundo con una longitud de onda de 780 nm se acopla a un objetivo de microscopio invertido y es enfocado por éste en un polímero líquido y fotosensible. Como el láser está enfocado y pulsado, la intensidad en el foco es lo suficientemente alta como para permitir la absorción de dos fotones dentro del foco. En la zona correspondiente, se emite radiación ultravioleta con una longitud de onda de 390 nm en lugar de radiación infrarroja. El fotopolímero líquido sólo se reticula cuando se expone a la radiación UV de alta energía, de modo que en el área donde se produce la absorción de dos fotones, se cura el polímero líquido.

Al mover el polímero fotosensible con respecto al foco, se utiliza cualquier estructura de polímero, IP-Dip, IP-L, IP-G, Ormo-Comp, AR-P3120, SU8. Un último paso de revelado en un disolvente disuelve el material no expuesto del material expuesto para revelar la estructura.

Existen cuatro variaciones de la litografía de dos fotones, cada una de las cuales puede utilizarse para producir estructuras relevantes:

a) En el procedimiento convencional, el rayo láser se enfoca a través de una placa de vidrio en el polímero fotosensible. Además, hay aceite de inmersión entre el objetivo del microscopio y la placa de vidrio para acoplar la mayor cantidad posible de luz láser en el polímero y permitir así la máxima resolución. La distancia de trabajo del objetivo limita la altura máxima de la estructura en esta variación del procedimiento. La estructura se construye hacia arriba desde la parte superior del sustrato.

b) La litografía láser por inmersión (DiLL) también permite utilizar sustratos opacos como el metal o el silicio. Aquí, el rayo láser se enfoca en la parte inferior del sustrato, el polímero fotosensible se encuentra entre el objetivo del microscopio y el sustrato y también sirve como medio de inmersión. La estructura se construye desde el fondo del sustrato hacia abajo. La altura máxima de la estructura gracias al control piezoeléctrico es de 300 |jm, pero utilizando el accionamiento z del objetivo del microscopio se pueden realizar estructuras mucho más altas.

c) La tercera variante es el uso de una lente de aire. El principio corresponde al del procedimiento convencional, pero sin el uso de aceite de inmersión.

d) Al utilizar un complemento basado en galvo escáneres, la velocidad de escritura puede aumentarse hasta 200 veces escribiendo en forma simultánea con varios focos.

Las estructuras que se van a producir con el 2PL primero deben ser programadas. Para ello, se puede utilizar el software Describe (para otros sistemas también Matlab), que trabaja con el lenguaje de programación GWL, o bien programar la estructura correspondiente como archivo stl y transferirla después al programa Nanoslicer. Dado que el polímero fotosensible no es adecuado como material para la diferenciación celular, se produce la estructura invertida de la membrana de Descemet y se moldea en un material adecuado. Se utiliza caucho de silicona o colágeno humano o animal. En consecuencia, se realizan pomos hexagonales, que tienen desviaciones de diámetro y altura y están dispuestos de forma propicia.

La forma de proceder para producir las estructuras es el siguiente:

• Fijación del sustrato con adhesivo (Fixogum) en el portamuestras.

• Goteo del fotopolímero adecuado sobre la cara superior (para el procedimiento convencional y la lente de aire) o la cara inferior (para el procedimiento DiLL) del sustrato.

• Para el procedimiento convencional, además aplicar aceite de inmersión en la parte inferior del sustrato.

• Fijación del portamuestras con la muestra en el dispositivo 2PL

• Inicio del proceso de escritura programando la estructura correspondiente. La muestra se desplaza con respecto al foco del láser según la estructura programada.

1.2. Litografía de interferencia

En la litografía de interferencia, se utiliza la interferencia de dos haces o de múltiples haces para obtener una imagen y almacenar el patrón de interferencia correspondiente en una superficie sensible a la luz. Para ello, se expande un haz láser (láser de iones de argón) y se divide (por ejemplo, mediante un cubo divisor de haz) en dos haces parciales. Se superponen con espejos (planos o cóncavos) con un ángulo determinado, de modo que se crea un patrón de franjas con una determinada constante de rejilla que depende de este ángulo, así como de la longitud de onda utilizada.

La muestra sensible a la luz, que se coloca en el patrón de interferencia, consiste en un sustrato (metal, silicio, vidrio) sobre el que se hace girar una capa lisa de fotopolímero por medio de capas de hilado (espesor de la capa, programa de hilado). En este caso se pueden utilizar revestimientos positivos o negativos, por lo que los revestimientos negativos se reticulan donde están expuestos, en el caso de los revestimientos positivos la parte no expuesta del polímero forma la estructura.

Para almacenar el patrón de interferencia en forma de raya en la capa de polímero, se expone una muestra (sustrato con capa de resistencia) al patrón de interferencia. Un paso posterior de revelado elimina el polímero expuesto de la capa (en el caso de la resistencia positiva). Para producir motas hexagonales con este procedimiento, la misma muestra debe ser expuesta tres veces con el patrón de interferencia, por lo que la muestra es girada 60° después de cada exposición. Tras el paso de desarrollo, se dispone de motas hexagonales de plástico, que también pueden utilizarse para moldear la estructura Descemet en otro material. El procedimiento es el siguiente: recubrimiento de un sustrato con fotopolímero, dependiendo del polímero, posiblemente horneando la muestra en una "placa caliente"; colocación de la muestra en el lugar del patrón de interferencia en el montaje óptico, exposición de la muestra al patrón de interferencia tres veces, rotación de la muestra en 60° en la misma dirección después de cada exposición, y revelado de la muestra en el baño de revelado correspondiente.

1.3 Litografía de tonos grises

La litografía de tonos grises se basa en la exposición de una máscara, cuyo patrón se almacena en un polímero fotosensible mediante la exposición. Las diferentes profundidades de la estructura se realizan mediante diferentes tonos de gris en la máscara. Detrás de la máscara, se forma una distribución de intensidad correspondiente a la distribución de tonos de gris en la máscara. Utilizando una resistencia positiva, la estructura es más profunda donde la intensidad es mayor. Para los materiales de resistencia negativa, esta relación se invierte.

Para producir la estructura de Descemet invertida con litografía de tonos grises, debe diseñarse una máscara que reproduzca la estructura en tonos grises. Si se utiliza un material de resistencia positiva, los contornos de los hexágonos son claros y se oscurecen hacia el centro. Si se utiliza material de resistencia negativa, los hexágonos de la máscara son claros en el centro y se oscurecen hacia el exterior. Para garantizar una iluminación bidimensional de la máscara, ésta se coloca perpendicularmente al eje óptico en un rayo láser expandido y enfocado. Gracias a la focalización, la máscara se visualiza en la muestra en un tamaño reducido, de modo que las dimensiones de la estructura son fieles al original. El procedimiento es el siguiente: recubrir un sustrato con fotopolímero, según el polímero, hornear la muestra en una placa caliente, colocar la muestra en el lugar del patrón de interferencia en el montaje óptico, exponer la muestra a un rayo láser expandido y enfocado que brilla a través de la máscara gris inmediatamente después de la expansión, y revelar la muestra en el baño de revelado correspondiente.

2. Moldeado del constructo biológica final de Descemet

Dado que las propiedades del material son de gran importancia para la diferenciación celular, la estructura producida litográficamente se moldea en un material más blando, caucho de silicona o colágeno animal o humano, para que la estructura de Descemet reproducida esté plasmada en el material. Para producir un constructo de Descemet implantable a partir de material biocompatible, se utiliza una composición de colágeno moldeable, creando primero una matriz estructurada de plástico.

Ejemplo 2: Producción del tejido endotelial corneal in vitro

Las células madre mesenquimales, previamente cosechadas y aisladas del tejido adiposo, son sembradas en el constructo artificial de Descemet preparada según el Ejemplo 1 a una densidad celular de al menos 5 x 105 células por cm2. El constructo se agita orbitalmente para lograr una distribución y adhesión uniformes.

Después de la adhesión completa, la membrana se sujeta en un biorreactor (37 °C, 5 % de CO², 100 % de humedad relativa) y se cultiva hasta que las células madre estén completamente diferenciadas y se haya alcanzado la capacidad funcional de las células endoteliales de la córnea (comprobable mediante marcadores específicos de las células endoteliales o pruebas de función). El tiempo de cultivo depende individualmente de la velocidad de diferenciación de las células madre específicas. Para el cultivo se utiliza un medio de cultivo basal que contiene un 10 % de suero y un 1 % de antibióticos.

Una vez completado el cultivo, se obtiene un tejido endotelial corneal de novo totalmente diferenciado y funcional en el constructo de Descemet. Este tejido se adhiere al constructo de Descemet y, junto con el constructo de Descemet, forma un implante in vitro para la reparación de un defecto endotelial corneal en un ojo receptor.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Constructo artificial de Descemet para la diferenciación mecanotransductora de células biológicas en un tejido endotelial corneal de novo, caracterizada porque el constructo está formado por un cuerpo base esférico (10) con una estructura de panal formada en la cara cóncava (12) del cuerpo base (10).

2. Constructo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la estructura de panal está formada por elementos de base repetitivos (20) con una depresión central (22) y nervaduras laterales (24), y la altura de la nervadura es de 0,3 a 1 |jm, el ancho de la nervadura es de 1 a 8 jm y el ancho de la depresión encerrada por las nervaduras es en cada caso de 10 a 20 jm .

3. Constructo de acuerdo con la reivindicación 2, en la que la estructura de panal está formada por elementos básicos repetitivos (20) de tamaño sustancialmente igual.

4. Constructo de acuerdo con la reivindicación 2, en la que la estructura de panal está formada por elementos básicos repetitivos (20) de diferentes tamaños para una distribución cuasi-estocástica de los tamaños de los elementos básicos (20) en la estructura de panal.

5. Constructo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en la que los elementos básicos (20) presentan cada uno una forma básica hexagonal.

6. Constructo de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, compuesta por un polímero biológico o biocompatible.

7. Implante in vitro que comprende el constructo de Descemet de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores y tejido endotelial corneal formado de novo a partir de células aisladas.

8. Un procedimiento para producir un implante endotelial corneal in vitro a partir de células biológicas aisladas de novo, que comprende los pasos de:

- puesta en contacto de células biológicas aisladas con el constructo artificial de Descemet de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el constructo artificial de Descemet está formado por un cuerpo base en forma de cúpula que tiene una estructura de panal formada en el lado cóncavo del cuerpo base.

- cultivo de las células en la estructura de panal del constructo de Descemet formada en el lado cóncavo del cuerpo base, en el que se produce la diferenciación de las células en células endoteliales de un endotelio corneal, y - obtención del tejido diferenciado en un endotelio corneal de novo en el constructo de Descemet como el implante de endotelio corneal in vitro.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende el paso adicional de:

- desprendimiento del tejido diferenciado en un endotelio corneal de novo del constructo de Descemet y obtención del endotelio corneal aislado como implante endotelial corneal in vitro.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, en el que las células biológicas aisladas son células madre mesenquimales.