ES2914176T3 - Composiciones de una vacuna glucídica para inducir respuestas inmunitarias y usos de las mismas en el tratamiento de cáncer - Google Patents

Composiciones de una vacuna glucídica para inducir respuestas inmunitarias y usos de las mismas en el tratamiento de cáncer Download PDF

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Abstract

Un compuesto que comprende la estructura: **(Ver fórmula)** en donde n es independientemente un número entero de 1 a 1500, m es independientemente un número entero de 1 a . 10, en donde cada una de las fracciones Globo H está covalentemente unida a la fracción KLH en un residuo de aminoácido básico, en donde el compuesto tiene una proporción de epítopo que varía de 750 a 3000, y en donde la fracción KLH es una fracción KLH tiolada que se almacena en gas inerte hasta su conjugación con las fracciones Globo H.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones de una vacuna glucídica para inducir respuestas inmunitarias y usos de las mismas en el tratamiento de cáncer
Campo de la invención
La invención abarca composiciones de inmunoterapia contra el cáncer en general y glucogonjugados inmunogénicos capaces de provocar respuestas inmunitarias anticáncer en particular, como se define en las reivindicaciones.
Antecedentes de la invención
El uso de conjugados glucídicos sintéticos para provocar anticuerpos se demostró primero por Goebel y Avery en 1929. (Goebel, W. F., y Avery, O. T., J. Exp. Med., 1929, 50, 521; Avery, O. T., y Goebel, W. F., J. Exp. Med., 1929, 50, 533). Los hidratos de carbono estaban unidos a proteínas portadoras a través de los glucósidos de bencenodiazonio. La inmunización de conejos con los antígenos sintéticos generó anticuerpos policlonales. Otros trabajadores (Allen, P. Z., y Goldstein, I. J., Biochemistry, 1967, 6, 3029; Rude, E., y Delius, M. M., Carbohydr. Res., 1968, 8, 219; Himmelspach, K., et al., Eur. J. Immunol., 1971, 1, 106; Fielder, R. J., et al., J. Immunol., 1970, 105, 265) desarrollaron técnicas similares para la conjugación de hidratos de carbono a portadores proteicos.
Los glucoconjugados se pueden usar en inmunoterapia activa generada de vacunaciones para dirigirse específicamente a agentes diana conocidos en células tumorales. La respuesta a antígenos glucídicos normalmente no consigue el uso de células T, que ayudaría en el rechazo del cuerpo del tumor. Mientras se piensa que la probabilidad de rechazo del tumor completo como un resultado de vacunación con un conjugado es improbable, tales tratamientos estimularán la vigilancia inmunitaria y se puede reducir la recidiva de nuevas colonias tumorales (Dennis, J., Oxford Glycosystems Glyconews Second, 1992; Lloyd, K. O., en Specific Immunotherapy of Cancer with Vaccines, 1993, New York Academy of Sciences, 50-58). Toyokuni y Singhal han descrito un glucoconjugado sintético (Toyokuni, T., et al., J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 395) que estimuló un título de IgG cuantificable, un resultado que es significativo ya que una respuesta de IgG en general se asocia con reclutamiento de células T auxiliares.
El antígeno glucídico Globo H (Fuca1^-2 Galp1^-3 GalNAcp1^-3 G ala1^4 G alp1^4 Glc) se aisló primero como un glucolípido unido a ceramida y se identificó en 1984 por Hakomori et al. de células de cáncer de mama MCF-7. (Bremer E G, et al. (1984) J Biol Chem 259:14773-14777). Estudios adicionales con anticuerpos monoclonales anti-Globo H mostraron que Globo H estaba presente en muchos otros cánceres, incluyendo cánceres de próstata, gástrico, pancreático, pulmón, ovárico y colon y solo expresión mínima en la superficie luminal de tejido secretor normal que no es fácilmente accesible al sistema inmunitario. (Ragupathi G, et al. (1997) Angew Chem Int Ed 36:125-128). Además, se ha establecido que el suero de paciente de cáncer de mama contiene alto nivel de anticuerpo anti-Globo H. (Gilewski T et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:3270-3275; Huang C-Y, et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103:15-20; Wang C-C, et al. (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105(33):11661-11666). Pacientes con tumores positivos para Globo H mostraron una supervivencia más corta en comparación con pacientes con tumores negativos para Globo H. (Chang, Y-J, et al. (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104(25):10299-10304). Estos hallazgos hacen Globo H, un epítopo hexasacárido, un marcador tumoral atractivo y una diana viable para el desarrollo de vacunas contra el cáncer. El documento US 2004/208884 A1 divulga construcciones multiantigénicas agrupadas y métodos para la síntesis de las mismas, así como métodos para el tratamiento de cáncer, y métodos para inducir anticuerpos en un sujeto.
Se mostró que una vacuna de Globo H sintética basada en un conjugado GloboH-MHCC-KLH en combinación con un adyuvante inmunológico inducía principalmente anticuerpos IgM y a un menor nivel IgG en pacientes tanto de cáncer de próstata como de mama metastásico. En un ensayo clínico en fase I, la vacuna también mostró toxicidad mínima con reacciones en la piel transitorias en el sitio de vacunación. (Gilewski T et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:3270-3275; Ragupathi G, et al. (1997) Angew Chem Int Ed 36:125-128; Slovin S F et al (1997) Proc Natl Acad Sci USA 96:5710-5715). Los síntomas similares a gripe leve que se han observado en algunos de los pacientes estaban probablemente asociados con el efecto secundario de QS-21. Se ha descrito que una vacuna pentavalente que contenía cinco antígenos glucídicos asociados a cáncer de próstata y mama -Globo-H, GM2, STn, TF y Tn- conjugados a la proteína portadora modificada con maleimida KLH produce suero anti-Globo H con títulos mayores de IgG que IgM en ensayos ELISA. (Zhu J. et al. (2009) J. Am. Chem. Soc. 131(26):9298-9303).
Se sabe que KLH contiene subunidades polipeptídicas glucosiladas que se ensamblan para formar partículas decaméricas (10-mero), didecaméricas (20-mero) y mayores. Estas estructuras multiméricas se han caracterizado por técnicas de ultracentrifugación que dan coeficientes de sedimentación de 11-19S para las subunidades disociadas y 92-107S para los multímeros didecaméricos. Se sabe además que una variedad de factores puede afectar la distribución de tamaño de hemocianinas de moluscos, incluyendo KLH. Estos factores incluyen fuerza iónica, pH, temperatura, pO2, y la disponibilidad de ciertos cationes divalentes, notablemente calcio y magnesio. Los presentes inventores han desarrollado una composición con eficacia aumentada que está compuesta principalmente de dímeros y trímeros de KLH unidos a una pluralidad de fracciones Globo H.
Mientras se han desarrollado vacunas para provocar respuestas de anticuerpos contra Globo H, sus eficacias anticáncer son insatisfactorias debido a la baja antigenicidad de Globo H. Hay una necesidad para una nueva vacuna capaz de provocar altos niveles de respuestas inmunitarias que se dirigen a Globo H.
Compendio de la invención
La presente invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
La presente invención se refiere a un compuesto que comprende la estructura:
Figure imgf000003_0001
en donde n es independientemente un número entero de 1 a 1500, m es independientemente un número entero de 1 a 10, en donde cada una de las fracciones Globo H está covalentemente unida a la fracción KLH en un residuo de aminoácido básico, en donde el compuesto tiene una proporción de epítopo que varía desde 750 a 3000, y en donde la fracción KLH es una fracción KLH tiolada que se almacena en gas inerte hasta su conjugación con las fracciones Globo H.
En algunas formas de realización, m es 1 y n es desde 1 a 150, m es 2 y n es desde 1 a 300, m es 3 y n es desde 1 a 450, m es 4 y n es desde 1 a 600, m es 5 y n es desde 1 a 750, m es 6 y n es desde 1 a 900, m es 7 y n es desde 1 a 1050, m es 8 y n es desde 1 a 1200, m es 9 y n es desde 1 a 1350, o m es 10 y n es desde 1 a 1500.
En algunas formas de realización, la proporción del número de fracciones Globo H respecto a fracciones KLH es desde 1:1 a 150:1 expresado como el número de moléculas Globo H respecto a una fracción KLH monomérica, el número de fracciones Globo H es de 1 a 150, expresado como el número de moléculas Globo H respecto a una fracción KLH monomérica, el número de fracciones Globo H es de 1 a 300, expresado como el número de moléculas Globo H respecto a una fracción KLH dimérica, el número de fracciones Globo H es de 1 a 450, expresado como el número de moléculas Globo H respecto a una fracción KLH trimérica, el número de fracciones Globo H es de 1 a 600, expresado como el número de moléculas Globo H respecto a una fracción KLH tetramérica, o el número de fracciones Globo H es de 1 a 750, expresado como el número de moléculas Globo H respecto a una fracción KLH pentamérica.
La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende: un compuesto que comprende la estructura:
Figure imgf000003_0002
en donde n es independientemente un número entero de 1 a 1500, m es independientemente un número entero de 1 a 10, y opcionalmente un soporte farmacéuticamente aceptable, en donde cada una de las fracciones Globo H está covalentemente unida a la fracción KLH en un residuo de aminoácido básico, en donde el compuesto tiene una proporción de epítopo que varía desde 750 a 3000, y en donde la fracción KLH es una fracción k Lh tiolada que se almacena en gas inerte hasta su conjugación con las fracciones Globo H.
En algunas formas de realización, m es 1 y n es desde 1 a 150, m es 2 y n es desde 1 a 300, m es 3 y n es desde 1 a 450, m es 4 y n es desde 1 a 600, m es 5 y n es desde 1 a 750, m es 6 y n es desde 1 a 900, m es 7 y n es desde 1 a 1050, m es 8 y n es desde 1 a 1200, m es 9 y n es desde 1 a 1350, o m es 10 y n es desde 1 a 1500.
En algunas formas de realización, el número de fracciones Globo H respecto a subunidades de fracción KLH es desde 1:1 a 150:1, expresado como el número de molécula Globo H respecto a una fracción KLH monomérica, el número de fracciones Globo H respecto a subunidades de fracciones KLH es desde 1:1 a 300:1, expresado como el número de moléculas Globo H respecto a una fracción KLH dimérica, el número de fracciones Globo H respecto a subunidades de fracciones KLH es desde 1:1 a 450:1, expresado como el número de moléculas Globo H respecto a una fracción KLH trimérica, el número de fracciones Globo H respecto a subunidades de fracciones KLH es desde 1:1 a 600:1, expresado como el número de moléculas Globo H respecto a una fracción KLH tetramérica, o el número de fracciones Globo H respecto a subunidades de fracciones KLH es desde 1:1 a 750:1, expresado como el número de moléculas Globo H respecto a una fracción KLH pentamérica.
En algunas formas de realización, el compuesto comprende monómeros, dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros o combinaciones de los mismos de la fracción KLH. En algunas formas de realización, del 1% al 99% de los conjugados terapéuticos en la composición farmacéutica son monómeros, del 1% al 99% de los conjugados terapéuticos en la composición farmacéutica son dímeros, del 1% al 99% de los conjugados terapéuticos en la composición farmacéutica son trímeros, del 1% al 99% de los conjugados terapéuticos en la composición farmacéutica son tetrámeros, del 1% al 99% de los conjugados terapéuticos en la composición farmacéutica son pentámeros, o del 1% al 99% de las fracciones KLH en la composición farmacéutica son monómeros, dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros o combinaciones de los mismos.
En algunas formas de realización, la composición farmacéutica además comprende
- un adyuvante, en donde el adyuvante es adyuvante de Freund completo e incompleto, moléculas de receptores tipo Toll, LPS, lipoproteínas, lipopéptidos, flagelina, ARN bicatenario, ADN vírico, islas CpG sin metilar, levamisol, bacilo de Calmette-Guerin, isoprinosina, zadaxin, antagonistas de PD-1, anticuerpos contra PD-1, antagonistas de CTLA, anticuerpos contra CTLA, interleuquina, citoquinas, GM-CSF, basado en sal de aluminio, fosfato de aluminio, alumbre, hidróxido de aluminio, liposomas, agonistas de TLR2, nanopartículas, monofosforil lípido A, una saponina OBI-821, nanoemulsiones de aceite en agua, y partículas similares a bacterias,
- una citoquina seleccionada del grupo que consiste en IL-2, lL-12, IL-18, IFN-y, TNF, IL-4, IL-10, IL-13, IL-21, GM-CSF y TGF-p,
- una quimioquina, o
- un agente seleccionado del grupo que consiste en agentes terapéuticos hormonales, terapia de anticuerpos monoclonales, quimioterapia, moduladores de receptor retinoide, agentes citotóxicos/citostáticos, agentes antineoplásicos, agentes antiproliferativos, inhibidores de prenil-proteína transferasa, inhibidores de HMG-CoA reductasa, mostazas de nitrógeno, nitrosoureas, inhibidores de angiogénesis, inhibidores de la ruta de señalización de proliferación y supervivencia celular, agentes inductores de apoptosis, agentes que interfieren con puntos de control del ciclo celular, agentes que interfieren con receptores tirosinas quinasas (RTK), inhibidores de diana de rapamicina de mamífero (mTOR), inhibidores del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2), inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), bloqueantes de integrinas, AINE, agonistas de PPAR, inhibidores de multirresistencia a fármacos (MDR) inherente, agentes antieméticos, agentes útiles en el tratamiento de anemia, agentes útiles en el tratamiento de neutropenia, fármacos de potenciación inmunológica, bifosfonatos, inhibidores de aromatasas, agentes que inducen diferenciación terminal de células neoplásicas, inhibidores de Y-secretasa, vacunas contra el cáncer, inhibidores de PD-1/PD-L1, inmunoterapia de CTLA-4, terapia diana seleccionada de inhibidores de CDK4/6, inhibidores de PI3K, inhibidores de AKT, inhibidores Pan-Her, y cualquier combinación de los mismos.
En algunas formas de realización, la composición farmacéutica además comprende un soporte farmacéuticamente aceptable.
En algunas formas de realización, la composición farmacéutica es una vacuna contra el cáncer.
En algunas formas de realización, la composición farmacéutica se formula para inyección subcutánea, administración intravenosa, o administración intramuscular.
En algunas formas de realización, la composición farmacéutica es para uso en un método de tratar cáncer en un paciente con una dosis eficaz, dicho cáncer se selecciona de cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer bucal, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer nasofaríngeo, cáncer dérmico, cáncer renal, tumor cerebral, cáncer de próstata, cáncer ovárico, cáncer cervical, cáncer endometrial, cáncer intestinal, cáncer pancreático, o cáncer de vejiga. En algunas formas de realización, la dosis eficaz es desde 0,001 pg/kg a 250 g/kg de peso corporal del paciente.
En algunas formas de realización, la composición farmacéutica es para uso en un método de inducir anticuerpos en un animal o un ser humano para el fin de crear anticuerpos monoclonales para usos terapéuticos o diagnósticos.
Breve descripción de las figuras
Se puede obtener un entendimiento más completo de la invención mediante referencia a los dibujos acompañantes, cuando se consideran junto con la posterior descripción detallada.
La figura 1A muestra la estructura química de Globo H y también varios análogos de Globo H ejemplares. Glc representa glucosa, Gal representa galactosa, GalNAc representa N-acetilgalactosamina, y Fuc representa fucosa. La figura 1B muestra una subunidad Globo H-KLH ejemplar conjugada mediante un enlazador MMCCh .
La figura 2A muestra una ruta de síntesis de conjugación Globo H-subunidad KLH ejemplar. La figura 2B muestra dímeros y trímeros de Globo H-KLH de la invención comparados con conjugados de Globo H divulgados en Slovin et al (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96:5710-5 y Gilewski T et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:3270-5.
La figura 3 muestra el resultado de espectrometría de dispersión láser multiángulo (MALS) de KLH nativa (8,3 MDa).
La figura 4 muestra el resultado de cromatografía de exclusión molecular de KLH nativa (8,3 MDa).
La figura 5A-D muestra la expansión cronológica de poblaciones de células B/T CD3+/T CD4+/T CD8+ en ratas Lewis inmunizadas con un glucoconjugado Globo H-KLH según la invención. Los paneles A-D representaban poblaciones de células B, células T CD3, células T CD4 y células T CD8, respectivamente. Los datos se presentaron como porcentaje de números de células en el grupo indicado normalizado al porcentaje de números de células del grupo PBS. Se analizaron múltiples comparaciones usando ANIOVA bidireccional, seguido por pruebas ad hoc de Bonferroni. *, p<0,05, **, p<0,01, y ***, p<0,001 comparado con PBS.
La figura 6A-B muestra los cambios cronológicos en títulos recíprocos de anticuerpos (A) IgM y (B) IgG en la sangre de ratas Lewis inmunizadas con el glucoconjugado (Globo H-KLH) de la invención.
La figura 7 muestra los títulos de anticuerpo IgM en ratones en respuesta al glucoconjugado (Globo H-KLH) de la invención.
La figura 8A-B ilustra la inmunogenicidad de ratones C57BL/6 que se inmunizaron con PBS, adyuvante solo, o Globo H-KLH adyuvante el día 0, 5 y 10. Los sueros se recogieron el día 14 para análisis por ELISA para determinar la producción de IgG e IgM anti-Globo H.
La figura 9 ilustra la citotoxicidad dependiente del complemento en que células TOV21G Globo H(+) o Globo H(-) se sembraron en una placa de 96 pocillos. Se añadieron suero anti-Globo H o suero control a una dilución de 1:50 a 1:100. A la placa se añadió después con/sin complemento. Se determinó la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) por ensayo LDH.
La figura 10A-C ilustra la citotoxicidad de células TOV21G Globo H(+) o Globo H(-) que se sembraron en una placa de 96 pocillos. Se añadieron suero anti-Globo H o suero control a una dilución de 1:50 a 1:100. Se usaron células NK humanas aisladas de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y activadas con anticuerpo anti-CD3 como células efectoras. Las células efectoras se añadieron después o no para reacción de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) a una proporción ET de 4:1, 2:1 o 1:1. La citotoxicidad se normalizó con sin suero control de ratón de cada célula en diferentes proporciones ET.
La figura 11 ilustra ratones NOD-SCID irradiados que se inyectaron por vía intraperitoneal con 1 x 106 células TOV21G positivas para Globo H el día 0. Se recogieron antisueros por separado de ratones C57BL/6 después de 3 vacunaciones de 3 tratamientos diferentes (PBS, adyuvante solo y Globo H-KLH/adyuvante). A los ratones NOD-SCID se dio por vía intraperitoneal 200 pl de los antisueros anteriormente mencionados para cada ratón el día 0, 2, 4, 6, 9, 11, 13 y 16. Las imágenes de tumores se siguieron por sistema de imagenología IVIS el día 3, 7 y 9.
La figura 12 ilustra el crecimiento de tumor LLC1 (una línea celular de cáncer epitelial de cáncer de pulmón) en ratones C57BL/6 inmunizados con Globo H KLH que se vacunaron por vía subcutánea con PBS, adyuvante solo o Globo H-KLH/adyuvante el día 0, 5 y 11. Se inyectaron por vía subcutánea 1x105 células LLC1 en cada ratón el día 16. Los tratamientos se administraron después por vía subcutánea el día 29 y 34. Los tamaños tumorales se verificaron el día 16, 21, 25, 29, 32, 34, 37.
La figura 13 muestra una tabla resumen de identificación de péptidos.
La figura 14 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados a Globo H para la muestra 1 (1a LC-MS/MS) para KLH1 (a) y KLH2 (b). La figura 14 divulga las SEQ ID NOS 3-32, respectivamente, en orden de aparición.
La figura 15 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados a Globo H para la muestra 2 (1a LC-MS/MS) para KLH1 (a) y KLH2 (b). La figura 15 divulga las SEQ ID NOS 33-53, respectivamente, en orden de aparición.
La figura 16 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados a Globo H para la muestra 3 (1a LC-MS/MS) para KLH1 (a) y KLH2 (b). La figura 16 divulga las SEQ ID NOS 54-64, respectivamente, en orden de aparición.
La figura 17 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados a Globo H para la muestra 4 (1a LC-MS/MS) para KLH1 (a) y KLH2 (b). La figura 17 divulga las SEQ ID NOS 65-83, respectivamente, en orden de aparición.
La figura 18 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados a Globo H para la muestra 1 (2a LC-MS/MS) para KLH1 (a) y KLH2 (b). La figura 18 divulga las SEQ ID NOS 84-111, respectivamente, en orden de aparición. La figura 19 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados a Globo H para la muestra 2 (2a LC-MS/MS) para KLH1 (a) y KLH2 (b). La figura 19 divulga las SEQ ID NOS 112-133, respectivamente, en orden de aparición. La figura 20 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados a Globo H para la muestra 3 (2a LC-MS/MS) para KLH1 (a) y KLH2 (b). La figura 20 divulga las SEQ ID NOS 134-144, respectivamente, en orden de aparición. La figura 21 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados a Globo H para la muestra 4 (1a LC-MS/MS) para KLH1 (a) y KLH2 (b). La figura 21 divulga las SEQ ID NOS 145-164, respectivamente, en orden de aparición. La figura 22 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados a MMCCH para la muestra 1 (1a LC-MS/MS) para KLH1 (a) y KLH2 (b). La figura 22 divulga las SEQ ID NOS 165-393, respectivamente, en orden de aparición. La figura 23 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados a MMCCH para la muestra 2 (1a LC-MS/MS) para KLH1 (a) y KLH2 (b). La figura 23 divulga las SEQ ID NOS 394-597, respectivamente, en orden de aparición. La figura 24 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados a MMCCH para la muestra 3 (1a LC-MS/MS) para KLH1 (a) y KLH2 (b). La figura 24 divulga las SEQ ID NOS 598-812, respectivamente, en orden de aparición. La figura 25 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados a MMCCH para la muestra 4 (1a LC-MS/MS) para KLH1 (a) y KLH2 (b). La figura 25 divulga las SEQ ID NOS 813-1008, respectivamente, en orden de aparición. La figura 26 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados a MMCCH para la muestra 1 (2a LC-MS/MS) para KLH1 (a) y KLH2 (b). La figura 26 divulga las Se Q ID NOS 1009-1212, respectivamente, en orden de aparición. La figura 27 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados a MMCCH para la muestra 2 (2a LC-MS/MS) para KLH1 (a) y KLH2 (b). La figura 27 divulga las SEQ ID NOS 1213-1404, respectivamente, en orden de aparición. La figura 28 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados a MMCCH para la muestra 3 (2a LC-MS/MS) para KLH1 (a) y KLH2 (b). La figura 28 divulga las SEQ ID NOS 1405-1616, respectivamente, en orden de aparición. La figura 29 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados a MMCCH para la muestra 4 (1a LC-MS/MS) para KLH1 (a) y KLH2 (b). La figura 29 divulga las SEQ ID NOS 1617-1803, respectivamente, en orden de aparición. La figura 30 ilustra el resumen de identificación de lisinas conjugadas a Globo H para (1a LC-MS/MS) para KLH1 (a) y KLH2 (b) y (2a LC-MS/MS) para KLH1 (c) y KLH2 (d).
La figura 31 ilustra el resumen de identificación de lisinas conjugadas a MMCCH para (1a LC-MS/MS) para KLH1 (a) y KLH2 (b) y (2a LC-MS/MS) para KLH1 (c) y KLH2 (d).
La figura 32 ilustra un resumen de análisis de conjugación a Globo H en la primera (a) y segunda (b) carreras de LC-MS/MS.
La figura 33(a) ilustra la fórmula química: C(56) H(91) N(5) O(33) S(1), adición de MW monoisotópica: 1393,5317 Da. La figura 33(b) ilustra la fórmula química: 1. C(18) H(28) N(4) O(4) S(1), adición de MW monoisotópica: 396,1831 Da; 2. fórmula química: C(24) H(38) N(4) O(9) S(1), adición de MW monoisotópica: 558,2360 Da; 3. fórmula química: C(30) H(48) N(4) O(14) S(1), adición de MW monoisotópica: 720,2888 Da; 4. fórmula química: C(36) H(58) N(4) O(19) S(1), adición de MW monoisotópica: 882,3416 Da; 5. fórmula química: C(44) H(71) N(5) O(24) S(1), adición de MW monoisotópica: 1085,4210 Da.
La figura 34(a) ilustra la estructura química del derivado de MMCCH. Fórmula química: C(16) H(24) N(4) O(3) S(1), adición de MW monoisotópica: 352,1569 Da. La figura 34(b) ilustra un derivado de MMCCH desamidado, Fórmula química: C(16) H(22) N(2) O(4) S(1), adición de MW monoisotópica: 338,1300 Da.
Descripción detallada de la invención
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, e inmunología, que están dentro de la capacidad de la técnica. Tales técnicas se explican por completo en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Ed., ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); DNA Cloning, Volúmenes I y II (D. N. Glover ed., 1985) ; Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986) ; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); el tratado, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller y M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 y 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Antibodies: A Laboratory Manual, por Harlow y Lanes (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); y Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986).
El uso de la palabra “un” o “una” cuando se usa junto con el término “comprender” en las reivindicaciones y/o la especificación puede significar “uno”, pero también es consistente con el significado de “uno o más”, “al menos uno”, y “uno o más de uno”.
A lo largo de esta solicitud, el término “aproximadamente” se usa para indicar que un valor incluye, por ejemplo, la variación inherente de error para un dispositivo de medida, el método que se emplea para determinar el valor, o la variación que existe entre los sujetos de estudio. Típicamente, se entiende que el término abarca aproximadamente o menos del 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% o 20% de variabilidad dependiendo de la situación.
Como se usa en el presente documento, el término “alquilo” se refiere a un hidrocarburo monovalente lineal o ramificado que contiene, a menos que se indique otra cosa, 1-20 átomos de carbono, por ejemplo, C-i-Cs o C1-C4, que pueden estar sustituidos o sin sustituir. Los ejemplos de alquilo incluyen, pero no están limitados a, metilo, etilo, npropilo, i-propilo, n-butilo, i-butilo, y t-butilo.
El uso del término “o” en las reivindicaciones se usa para significar “y/o” a menos que explícitamente se indique que se refiere a alternativas solo o las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgación apoya una definición que se refiere a solo alternativas e “y/o”.
Como se usa en esta especificación y reivindicación(es), las palabras “comprender” (y cualquier forma de comprender, tal como “comprender” y “comprende”), “tener” (y cualquier forma de tener, tal como “tener” y “tiene”), “incluir” (y cualquier forma de incluir, tal como “incluye” e “incluir”) o “contener” (y cualquier forma de contener, tal como “contiene” o “contener”) son inclusivas y abiertas y no excluyen elementos o etapas de método adicionales no enumeradas. Se contempla que cualquier forma de realización discutida en esta especificación se pueda implementar con respecto a cualquier método o composición de la invención, y viceversa. Además, las composiciones de la invención se pueden usar para lograr métodos de la invención.
“Tratar” o “tratamiento” se denomina en el presente documento como administración de una composición terapéutica a un sujeto con el fin de curar, aliviar, mitigar, remediar, prevenir o mejorar un trastorno, síntomas del trastorno, un estado de enfermedad secundario al trastorno, o predisposición hacia el trastorno.
Una “cantidad eficaz” es una cantidad de una composición terapéutica que es capaz de producir un resultado médicamente deseable como se delinea en el presente documento en un sujeto tratado. El resultado médicamente deseable puede ser objetivo (es decir, cuantificable por alguna prueba o marcador) o subjetivo (es decir, el sujeto da una indicación de o siente un efecto).
“Enfermedad susceptible a tratamiento con una composición terapéutica” como se denomina en el presente documento significa cualquier procedimiento, afección, trastorno, dolencia y/o enfermedad que se puede tratar por la administración de las composiciones terapéuticas divulgadas en el presente documento.
Un “trastorno proliferativo” es uno en el que se producen demasiadas de algún tipo de célula produciendo deterioro de la salud. Un trastorno proliferativo puede ser benigno o maligno. Los trastornos proliferativos pueden incluir, por ejemplo, cáncer.
Un “cáncer” que se puede tratar por las composiciones terapéuticas divulgadas en el presente documento, es un crecimiento anómalo de células. Las células cancerosas han perdido mecanismos de control normales y por tanto son capaces de expandirse continuamente, invadir tejidos adyacentes, migrar a partes distantes del cuerpo, y fomentar el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos desde los que las células obtienen nutrientes. Como se usa en el presente documento, un cáncer puede ser maligno o benigno. El cáncer se puede desarrollar desde cualquier tejido en el cuerpo. Según las células crecen y se multiplican, forman una masa de tejido, llamado un tumor. El término tumor se refiere a un crecimiento anómalo o masa. Los tumores pueden ser cancerosos (malignos) o no cancerosos (benignos). Los tumores cancerosos pueden invadir tejidos vecinos y propagarse a lo largo del cuerpo (metastatizar). Los tumores benignos, sin embargo, en general no invaden tejidos vecinos y no se propagan por todo el cuerpo. El cáncer se puede dividir en los de la sangre y tejidos que forman la sangre (leucemias y linfomas) y tumores “sólidos”. Los tumores “sólidos” pueden ser carcinomas o sarcomas.
Los cánceres que se pueden tratar por las composiciones terapéuticas de la invención incluyen los clasificados por sitio incluyen cáncer de la cavidad oral y faringe (labio, lengua, glándula salivar, suelo de la boca, encía y otro de boca, nasofaringe, anginas, orofaringe, hipofaringe, otro oral/faringe); cánceres del sistema digestivo (esófago; estómago; intestino delgado; colon y recto; ano, canal anal, anorrecto; hígado; conducto biliar intrahepático; vesícula biliar; otro biliar; páncreas; retroperitoneo; peritoneo, omento, y mesenterio; otro digestivo); cánceres del sistema respiratorio (cavidad nasal, oído medio, y senos; laringe; pulmón y bronquio; pleura; tráquea, mediastino, y otro respiratorio); cánceres del mesotelioma; huesos y articulaciones; y tejido blando, incluyendo corazón; cánceres de piel, incluyendo melanomas y otros cánceres de piel no epiteliales; sarcoma de Kaposi y cáncer de mama; cáncer del sistema genital femenino (cuello del útero; cuerpo del útero; útero, ovario; vagina; vulva; y otro genital femenino); cánceres del sistema genital masculino (glándula de la próstata; testículo; pene; y otro genital masculino); cánceres del sistema urinario (vejiga urinaria; riñón y pelvis renal; uréter; y otro urinario); cánceres del ojo y órbita; cánceres del cerebro y sistema nervioso (cerebro; y otros del sistema nervioso); cánceres del sistema endocrino (glándula tiroides y otros endocrinos, incluyendo el timo); linfomas (enfermedad de Hodgkin y linfoma no hodgkiniano), mieloma múltiple, y leucemias (leucemia linfocítica; leucemia mieloide; leucemia monocítica; y otras leucemias).
Otros cánceres, clasificados por tipo histológico, que pueden ser dianas adecuadas para las composiciones terapéuticas según la presente invención incluyen, pero no están limitados a, neoplasia, maligna; carcinoma, NOS; carcinoma, sin diferenciar, NOS; carcinoma de células gigantes y huso; carcinoma de células microcíticas, NOS; carcinoma papilar, NOS; carcinoma de células escamosas, NOS; carcinoma linfoepitelial; carcinoma de células basales, NOS; carcinoma pilomatrix; carcinoma de células de transición, NOS; carcinoma de células de transición papilar; adenocarcinoma, NOS; gastrinoma, maligno; colangiocarcinoma; carcinoma hepatocelular, NOS; carcinoma hepatocelular combinado y colangiocarcinoma; adenocarcinoma trabecular; carcinoma quístico adenoide; adenocarcinoma en pólipo adenomatoso; adenocarcinoma, poliposis coli familiar; carcinoma sólido, NOS; tumor carcinoide, maligno; adenocarcinoma bronquioloalveolar; adenocarcinoma papilar, NOS; carcinoma cromófobo; carcinoma acidófilo; adenocarcinoma oxifílico; carcinoma basófilo; adenocarcinoma de células claras, NOS; carcinoma de células granulares; adenocarcinoma folicular, NOS; adenocarcinoma papilar y folicular; carcinoma esclerosante no encapsulante; carcinoma corticosuprarrenal; carcinoma endometroide; carcinoma de apéndice de piel; adenocarcinoma apocrino; adenocarcinoma sebáceo; adenocarcinoma ceruminoso; carcinoma mucoepidermoide; cistoadenocarcinoma, NOS; cistoadenocarcinoma papilar, NOS; cistoadenocarcinoma seroso papilar; cistoadenocarcinoma mucinoso, NOS; adenocarcinoma mucinoso; carcinoma de células en anillo de sello; carcinoma de conducto infiltrante; carcinoma medular, NOS; carcinoma lobular; carcinoma inflamatorio; enfermedad de Paget, mamario; carcinoma de células acinares; carcinoma adenoescamoso; adenocarcinoma con metaplasia escamosa; timoma, maligno; tumor estromal ovárico, maligno; tecoma, maligno; tumor de células granulosas, maligno; androblastoma, maligno; carcinoma de células de Sertoli; tumor de células de Leydig, maligno; tumor de células lipídicas, maligno; paraganglioma, maligno; paraganglioma extramamario, maligno; feocromocitoma; glomangiosarcoma; melanoma maligno, NOS; melanoma amelanótico; melanoma de propagación superficial; melanoma maligno en nevus pigmentado gigante; melanoma de células epitelioides; nevus azul, maligno; sarcoma, NOS; fibrosarcoma, NOS; histiocitoma fibroso, maligno; mixosarcoma; liposarcoma, NOS; leiomiosarcoma, NOS; rabdomiosarcoma, NOS; rabdomiosarcoma embrionario; rabdomiosarcoma alveolar; sarcoma estromal, NOS; tumor mixto, maligno, NOS; tumor mixto mulleriano; nefroblastoma; hepatoblastoma; carcinosarcoma, NOS; mesenquimoma, maligno; tumor de Brenner, maligno; tumor filodes, maligno; sarcoma sinovial, NOS; mesotelioma, maligno; disgerminoma; carcinoma embrionario, NOS; teratoma, maligno, NOS; struma ovarii, maligno; coriocarcinoma; mesonefroma, maligno; hemangiosarcoma; hemangioendotelioma, maligno; sarcoma de Kaposi; hemangiopericitoma, maligno; linfangiosarcoma; osteosarcoma, NOS; osteosarcoma yuxtacortical; condrosarcoma, NOS; condroblastoma, maligno; condrosarcoma mesenquimatoso; tumor de células gigantes del hueso; sarcoma de Ewing; tumor odontogénico, maligno; odontosarcoma ameloblástico; ameloblastoma, maligno; fibrosarcoma ameloblástico; pinealoma, maligno; cordoma; glioma, maligno; ependimoma, NOS; astrocitoma, NOS; astrocitoma protoplásmico; astrocitoma fibrilar; astroblastoma; glioblastoma, NOS; oligodendroglioma, NOS; oligodendroblastoma; neuroectodérmico primitivo; sarcoma cerebelar, NOS; ganglioneuroblastoma; neuroblastoma, NOS; retinoblastoma, NOS; tumor neurogénico olfativo; meningioma, maligno; neurofibrosarcoma; neurilemoma, maligno; tumor de células granulares, maligno; linfoma maligno, NOS; enfermedad de Hodgkin, NOS; Hodgkin; paragranuloma, NOS; linfoma maligno, linfocítico pequeño; linfoma maligno, células grandes, difuso; linfoma maligno, folicular, NOS; micosis fungoides; otros linfomas no hodgkinianos especificados; histiocitosis maligna; mieloma múltiple; sarcoma de células cebadas; enfermedad del intestino delgado inmunoproliferativa; leucemia, NOS; leucemia linfoide, NOS; leucemia de células plasmáticas; eritroleucemia; leucemia de células de linfosarcoma; leucemia mieloide, NOS; leucemia basófila; leucemia eosinofílica; leucemia monocítica, NOS; leucemia de células cebadas; leucemia megacarioblástica; sarcoma mieloide; y leucemia de células pilosas.
“Cánceres epiteliales” como se define en el presente documento se refiere a cáncer(es) que se desarrolla(n) a partir de epitelio o tejidos relacionados en la piel, vísceras huecas, y otros órganos. Los cánceres epiteliales incluyen, pero no están limitados a, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer bucal, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer nasofaríngeo, cáncer dérmico, cáncer renal, tumor cerebral, cáncer de próstata, cáncer ovárico, cáncer cervical, cáncer endometrial, cáncer intestinal, cáncer pancreático, y cáncer de vejiga.
“Paciente” o “sujeto” como se usa en el presente documento se refiere a un sujeto mamífero diagnosticado con o sospechoso de tener o desarrollar una enfermedad proliferativa tal como cáncer. Los pacientes ejemplares pueden ser seres humanos, simios, perros, cerdos, ganado, gatos, caballos, cabras, ovejas, roedores y otros mamíferos que pueden favorecer el desarrollo de enfermedades proliferativas tal como cáncer.
Como se usa en el presente documento, “sustancialmente purificada” o “sustancialmente aislada” se refiere a una molécula (por ejemplo, un compuesto) en un estado que está separada de sustancialmente todas las otras moléculas normalmente asociadas con ella en su estado nativo. Preferiblemente, una molécula sustancialmente purificada es la especie predominante presente en una preparación. En particular, una molécula sustancialmente purificada puede estar más del 60% libre, preferiblemente el 75% libre, más preferiblemente el 90% libre, y lo más preferiblemente el 95% libre de las otras moléculas (excluyendo el solvente) presentes en la mezcla natural. El término “sustancialmente purificada” o “sustancialmente aislada” no se pretende que incluya moléculas o sustancias presentes en su estado nativo. En ciertas formas de realización, el término “sustancialmente purificada” o “sustancialmente aislada” incluye purificar una fracción KLH de otra fracción KLH (por ejemplo, purificar sustancialmente o aislar sustancialmente una fracción dímero de KLH de una fracción trímero de k Lh ). En otra forma de realización, el término “sustancialmente purificada” o “sustancialmente aislada” no incluye purificar una fracción KLH de otra fracción KLH (por ejemplo, dímeros de KLH y trímeros de KLH se incluyen en una composición sustancialmente purificada o sustancialmente aislada), pero las impurezas se eliminan sustancialmente.
En el presente documento, se denomina “administrar” a proporcionar una composición terapéutica de la invención a un paciente. A modo de ejemplo y no limitación, la administración de composición, por ejemplo, inyección, se puede realizar por inyección intravenosa (i.v.), inyección subcutánea (s.c.), inyección intradérmica (i.d.), inyección intraperitoneal (i.p.) o inyección intramuscular (i.m.). Se puede emplear una o más de tales rutas. La administración parenteral puede ser, por ejemplo, por inyección en embolada o por perfusión gradual durante el tiempo. Alternativamente, o al mismo tiempo, la administración puede ser por la ruta oral. Además, la administración también puede ser por deposición quirúrgica de un bolo o colocación de un dispositivo médico.
“Un paciente en necesidad de ello” se denomina en el presente documento a un paciente diagnosticado con o sospechoso de tener un trastorno proliferativo. En una forma de realización, el paciente tiene o es probable que desarrolle cáncer.
Como se usa en el presente documento, el término “antígeno” se define como cualquier sustancia capaz de provocar una respuesta inmunitaria, con o sin la ayuda de una proteína portadora y/o un adyuvante. Preferiblemente, el antígeno de las composiciones inventivas incluye un hidrato de carbono y más preferiblemente antígeno glicano y lo más preferiblemente una fracción Globo H.
Como se usa en el presente documento, el término “inmunogenicidad” se refiere a la capacidad de un inmunógeno, antígeno o vacuna para estimular una respuesta inmunitaria.
Como se usa en el presente documento, el término “ inmunoterapia” se refiere a un conjunto de estrategias de tratamiento basadas en el concepto de modular el sistema inmunitario para alcanzar un fin profiláctico y/o terapéutico.
Como se usa en el presente documento, el término “epítopo” se define como las partes de una molécula de antígeno que entran en contacto con el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo o un receptor de célula T.
Las “composiciones terapéuticas” de la invención incluyen “conjugados terapéuticos” como se definen en las reivindicaciones.
En una forma de realización, el conjugado terapéutico es:
Fuca(1^2)Galp(1^3)GalNAcp(1^3)Gala(1^4)Galp(1^4)Glup(1-O-etilhidraciM-carbonil-ciclohexil-4-(metil-N-maleimido)-3-(tiobutil-imidil)-hemocinina de lapa californiana (KLh ) también denominado OBI-822.
Los “anticuerpos terapéuticos” se definen como que son anticuerpos (como se definen adicionalmente después) que se unen específicamente a los conjugados terapéuticos inventivos y preferiblemente la porción de fracción Globo H de los conjugados terapéuticos.
Como se usa en el presente documento, el término “vacuna” se refiere a una composición terapéutica que contiene un conjugado terapéutico que se usa para conferir inmunidad contra una enfermedad asociada con el antígeno. Las vacunas del cáncer se diseñan para aumentar la capacidad natural del cuerpo para protegerse a sí mismo, mediante el sistema inmunitario, de peligros representados por células dañadas o anómalas tal como células cancerosas. Una respuesta inmunitaria protectora es una que reduce la gravedad de la enfermedad, incluyendo, pero no limitado a prevención de la enfermedad, retraso en el inicio de la enfermedad, gravedad disminuida de síntomas, morbilidad disminuida, y mortalidad retrasada. Preferiblemente, una vacuna es capaz de activar tanto la respuesta inmunitaria humoral (por ejemplo, estimulación de la producción de anticuerpos por linfocitos B) como respuesta inmunitaria celular (por ejemplo, una respuesta inmunitaria que está mediada por linfocitos T y/u otras células, tal como células NK y macrófagos). Se han desarrollado ensayos estándar para determinar la respuesta inmunitaria tal como enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), citometría de flujo, ensayo de proliferación celular, ensayos CTL y ensayos ADCC/CDC.
Como se usa en el presente documento, el término “glicano” se refiere a un polisacárido, u oligosacárido. Glicano también se usa en el presente documento para denominar la porción glucídica de un glucoconjugado, tal como una glucoproteína, glucolípido, glucopéptido, glucoproteoma, peptidoglicano, lipopolisacárido o un proteoglicano. Los glicanos habitualmente consisten solamente de enlaces O-glucosídicos entre monosacáridos. Por ejemplo, la celulosa es un glicano (o más específicamente un glucano) compuesto de D-glucosa con enlaces p-1,4, y quitina es un glicano compuesto de N-acetil-D-glucosamina con enlaces p-1,4. Los glicanos pueden ser homo o heteropolímeros de residuos de monosacárido, y pueden ser lineales o ramificados. Los glicanos se pueden encontrar unidos a proteínas como en glucoproteínas y proteoglicanos. En general se encuentran en la superficie exterior de células. Los glicanos con enlaces O- y N- son muy comunes en eucariotas, pero también se pueden encontrar, aunque de forma menos común, en procariotas. Los N-glicanos se encuentran unidos al nitrógeno (N) del grupo R de asparragina en el sequon. El sequon es una secuencia Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina. El glicano preferido es una fracción Globo H.
Globo H es un hexasacárido, que es un miembro de una familia de carbohidratos antigénicos que están muy expresados en varios tipos de cánceres, especialmente cánceres de mama, próstata, páncreas, estómago, ovario, colon y pulmón. En formas de realización ilustrativas, ciertos pacientes no mostraron niveles de anticuerpos anti-Globo H en el tiempo cero, y después de inmunización con la composición terapéutica de la invención se detectaron títulos altos. En otras formas de realización ilustrativas, ciertos pacientes mostraron niveles de anticuerpos anti-Globo H en el tiempo cero, y después de inmunización con la composición terapéutica de la invención se detectaron títulos altos. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-Globo H se expresa en la superficie de la célula cancerosa como un glucolípido y posiblemente como una glucoproteína. En otras formas de realización, el suero de pacientes de cáncer de mama contenía altos niveles de anticuerpos contra el epítopo Globo H. En ciertas formas de realización, a este epítopo también se dirigen los anticuerpos monoclonales Mbr1, VK9, y anti-SSEA-3 en estudios inmunohistoquímicos. Aunque ciertos tejidos normales también reaccionan con Mbr1, incluyendo tejido normal de mama, páncreas, intestino delgado y próstata, el antígeno en estos tejidos está predominantemente localizado en los bordes secretarios donde el acceso al sistema inmunitario está restringido.
La “fracción Globo H” se define en el presente documento que es un glicano (es decir, una molécula que contiene una fracción azúcar) que es Globo H o una fragmento o análogo del mismo. Globo H es un glicano que contiene el epítopo hexasacárido (Fucal^-2 Galp1^-3 GalNAcp1^-3 G ala1^4 G alp1^4 Glc), y opcionalmente, una fracción no azúcar. Su fragmento es un glicano que contiene un fragmento del epítopo hexasacárido y, si es aplicable, la fracción no azúcar. Estos oligosacáridos se pueden preparar por métodos rutinarios. (Véase, Huang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:15-20 (2006)). Si se desea, se pueden ligar a una fracción no azúcar. La solicitud de patente en EE UU con No. de serie 12/485.546 se refiere a un método de producir anticuerpo específico para Globo H o su fragmento administrando a un mamífero no humano (por ejemplo, ratón, conejo, cabra, oveja o caballo) la composición inmunitaria descrita anteriormente y aislando del mamífero un anticuerpo que se une a Globo H o su fragmento.
Se pueden generar análogos de Globo H usando micromatriz de glicanos e incluyen los divulgados en Wang et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 19 Agosto 2008; 105(33): 11661-11666 y mostrados en la figura 1.
Los análogos de Globo H preferiblemente se unen a los anticuerpos VK-9, Mbr1 y anti-SSEA-3. Preferiblemente, los análogos de Globo H se unen con una constante de disociación particular (Ko,surf). Se puede usar la isoterma de Langmuir para analizar las curvas de unión para generar las constantes de disociación en superficie (Ko,surf). En condiciones de equilibrio durante la incubación, la fluorescencia media de las manchas replicadas (Fobs) se puede describir mediante:
donde Fmax es la intensidad de fluorescencia máxima, una medida de la cantidad de hidrato de carbono activo en la superficie, [P] es la concentración de anticuerpo total, y Ko,surf es la constante de disociación en equilibrio para el hidrato de carbono en superficie y el anticuerpo. Como se describe en Wang et al. En algunas formas de realización, la (Ko surf) preferida de análogos de Globo H es al menos, aproximadamente o exactamente 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 o 1,6 nM con respecto a los anticuerpos VK-9, Mbr1 y anti-SSEA-3 descritos en Wang et al.
La “hemocianina de lapa californiana” (KLH) es un metaloproteína grande, multisubunidad, portadora de oxígeno encontrada en la hemolinfa de la lapa californiana gigante, Megathura crenulata. k Lh es una proteína heterogéneamente glucosilada que consiste en subunidades con un peso molecular desde aproximadamente 350.000 hasta aproximadamente 390.000 en agregados con pesos moleculares de aproximadamente 400 kDa (por ejemplo, un monómero de KLH) hasta aproximadamente 8000 kDa (por ejemplo, un didecámero de KLH). Cada dominio de una subunidad de KLH contiene dos átomos de cobre que juntos unen una única molécula de oxígeno. Cuando el oxígeno está unido a la hemocianina, la molécula toma un color azul distintivo transparente, opalescente. En ciertas formas de realización, la proteína KLH es potentemente inmunógena aun segura en seres humanos. En ciertas formas de realización, KLH se puede purificar de la hemolinfa de Megathura crenulata por una serie de etapas que típicamente incluyen precipitación con sulfato de amonio y diálisis, y puede implicar purificación cromatográfica para obtener la mayor pureza. En ciertas formas de realización, la purificación de KLH también puede incluir eliminación de endotoxina, pero esta etapa puede ser innecesaria porque la endotoxina puede servir como un adyuvante cuando se inyecta para la producción de anticuerpos. Preferiblemente, una preparación de KLH de alta calidad con el color azul transparente opalescente es el mejor indicador de la solubilidad de k Lh . En ciertas formas de realización, las unidades monoméricas de KLH se ensamblan en un multímero grande (decámero o didecámero) con un peso molecular total de aproximadamente 4.000 kDa a 8.000 kDa. “Fracción hemocianina de lapa californiana” o “fracción KLH” se define en el presente documento que es una proteína KLH1 (SEQ ID NO: 1) o KLH2 (SEQ ID NO: 2) o una proteína sustancialmente idéntica a la misma o una mezcla de las mismas. Sustancialmente idéntica en este contexto significa que cada fracción KLH tiene una secuencia de aminoácidos al menos, aproximadamente o exactamente: el 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76 o 75 por ciento idéntica a la de KLH de tipo salvaje nativa. En ciertas formas de realización, la KLH de la invención tiene actividad inmunógena aumentada, en particular actividad antitumoral aumentada. En ciertas formas de realización, la KLH en la composición de la presente invención comprende una subunidad intacta no degradada de aproximadamente 400.000 de peso molecular. En otras formas de realización, la KLH de la invención comprende multímeros de KLH superiores.
En ciertas formas de realización, los multímeros de KLH superiores tienen pesos moleculares de aproximadamente 8­ 10 millones con coeficientes de sedimentación de aproximadamente 92-107S. La cantidad de multímero superior de KLH presente se basa en análisis de ultracentrifugación de sedimentación-equilibrio y/o sedimentación-velocidad. En otras formas de realización, la KLH de la invención demuestra una actividad inmunógena aumentada, en particular actividad antitumoral aumentada. La actividad inmunógena aumentada se ve, por ejemplo, pero sin limitar, (a) con inyección de KLH (sin adyuvante), (b) con KLH usada como un adyuvante, (c) con KLH usada como un inmunógeno portador para haptenos o antígenos débilmente inmunogénicos, y (d) con KLH usada como un agente antitumoral. La composición de KLH de la invención muestra actividad antitumoral aumentada para muchos tumores, incluyendo, pero no limitado a, tumores de vejiga, mama, ováricos, etc. En ciertas formas de realización, dos fracciones de KLH pueden formar un dímero a través de un enlace covalente entre monómeros de KLH. Sin querer estar limitado por teoría, se cree que el enlace covalente entre fracciones KLH es a través de un enlace disulfuro. En ciertas formas de realización, dos o más fracciones KLH pueden formar un dímero, trímero, tetrámero, pentámero, etc., a través de un enlace covalente entre monómeros, dímeros, trímeros etc. de KLH. Sin querer estar limitado por teoría, se cree que el enlace covalente entre fracciones KLH es a través de un enlace disulfuro.
Hay una variedad de métodos para la unión de una fracción KLH a un antígeno, incluyendo conjugación directa y conjugación con un grupo enlazador bifuncional tal como 4-(4-N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxil hidracida (MMCCH). Tales técnicas enlazadoras se divulgan en la patente en EE UU No. 6.544.952. En algunas formas de realización, para preparar los conjugados terapéuticos de la invención, por ejemplo, el glucósido alilo de Globo H se convierte a un aldehído por ozonolisis y el grupo aldehído se une a los grupos NH en el entrecruzador MMCCH, dando Globo H-MMCCH; la proteína portadora, KLH, se somete a tiolación para producir KLH-SH; y los grupos sulfhidrilo en KLH tiolada se unen después al grupo maleimida en MMCCH, produciendo conjugados Globo H-KLH.
En una forma de realización, el glucósido alilo de Globo H se prepara a través de síntesis química. También se usan un reactivo tiolante, 2-iminotiolano y KLH grado cGMP y enlazador 4-(4-N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxil hidracida (MMCCH). En algunas formas de realización se llevan a cabo las siguientes etapas: 1) conversión de glucósido alilo de Globo H a Globo H-aldehído; 2) acoplamiento de Globo H-aldehído con MMCCH a Globo H-MMCCH, por separado; 3) tiolación química de KLH; 4) conjugación de Globo H-MMCCH a la KLH tiolada; y 5) purificación del conjugado Globo H-KLH (OBI-822). Véase, por ejemplo, la figura 2a.
En ciertas formas de realización, durante la conjugación de una proteína con fracción Globo H a una fracción KLH, una proteína fracción KLH en ciertas formas de realización muestra una reducción de peso molecular comprada con la molécula intacta preferiblemente debido a la disociación de subunidades de la fracción Globo H. En otras formas de realización, los métodos de conjugación divulgados en el presente documento producen una disociación de subunidades KLH no descrita previamente. Sin querer estar vinculado por ninguna teoría particular, se prevé que el alto nivel de glucosilación de los conjugados fracción Globo H-subunidad fracción KLH inventivos produzca la formación de enlaces de hidrógeno entre las fracciones Globo H. Como tal, en ciertas formas de realización, las fuerzas de van der Waals e interacciones hidrofóbicas entre las subunidades de la fracción KLH son desplazadas por enlaces de hidrógeno de Globo H y esto lleva a separación de subunidades de la fracción KLH. Después de la conjugación, las subunidades de la fracción KLH de un conjugado fracción Globo H-fracción KLH preferiblemente agregan para formar nuevos monómeros, dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros o hexámeros o cualquier combinación de los mismos. Los conjugados fracción Globo H-fracción KLH terapéuticos resultantes tienen una proporción de epítopo inesperadamente grande que produce atributos inmunógenos inesperadamente superiores. En ciertas formas de realización, las fracciones Globo H se conjugan a lisinas en KLH1 y KLH2. En otras formas de realización, las fracciones Globo H no se conjugan a lisinas en KLH1 y KLH2. En ciertas formas de realización, los sitios de lisina conjugados a Globo H se encuentran conservados en el análisis de mapeo de péptidos lo que sugiere que la composición Globo H-KLH es única en su estructura.
En una forma de realización, las composiciones terapéuticas de la invención incluyen una o más subunidades de fracción KLH en donde al menos una de tales subunidades está conjugada al menos, aproximadamente o exactamente 1, 10, 102 o 103 veces: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 o 160 o más fracciones Globo H.
Los inventores encontraron usando análisis espectrométrico de masas que las fracciones Globo H están conjugadas a residuos de lisina de KLH. En ciertas formas de realización, por tanto, se prefiere que las fracciones Globo H se conjuguen a residuos de lisina.
En una forma de realización, hay un total de exactamente o aproximadamente 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160 residuos de lisina totales por subunidad de fracción KLH. En otra forma de realización hay exactamente o aproximadamente 150 o 156 residuos de lisina por subunidad de fracción KLH. En otra forma de realización hay exactamente o aproximadamente 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 o 110 sitios de conjugación de lisina en cada subunidad de fracción KLH disponibles para unión a o realmente unidas a una fracción Globo H. En otra forma de realización, hay 62, 66, 67, 68, 70, 72, 76, 86, 87, 88, 90, 92, 93, 100 tales sitios de conjugación de lisina en cada subunidad de fracción KLH. Los sitios de conjugación de lisina son esos residuos de lisina en la fracción KLH que están disponibles para unión o realmente se unen a una fracción Globo H y/o un enlazador a una fracción Globo H tal como, por ejemplo, un enlazador MMCCH.
En ciertas formas de realización terapéuticas que contienen una mezcla de subunidades de fracción (por ejemplo, KLH1 y KLH2 o variantes de las mismas), las lisinas disponibles totales (para ambas subunidades) son como contadas juntas a través de los diferentes tipos de subunidades y pueden ser o son exactamente aproximadamente 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309 o 310 en número. En tales formas de realización, hay o puede ser exactamente o aproximadamente 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 o 160 sitios de conjugación de lisina juntos a través de las diferentes subunidades (por ejemplo, KLH1 y KLH2 o variantes de las mismas). En otras tales formas de realización, hay 136, 137, 141, 140, 143, 147 o 155 sitios de conjugación de lisina.
En una forma de realización lo más preferida hay 136, 137, 140, 141, 143, 147 o 155 y sitios de conjugación de lisina entre los 306 residuos de lisina totales en KLH1/KLH2.
En ciertas formas de realización, las composiciones terapéuticas de la invención contienen una mezcla de conjugados subunidad de fracción KLH-fracción Globo H en donde tales conjugados permanecen monómeros o forman dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros o hexámeros o cualquier combinación de los mismos. En otra forma de realización, las composiciones terapéuticas de la invención incluyen monómeros, dímeros, trímeros o tetrámeros de conjugados subunidad de fracción KLH-fracción Globo H o combinaciones de los mismos. En una forma de realización adicional, las composiciones terapéuticas de la invención incluyen solo dímeros y trímeros de conjugados subunidad de fracción KLH-fracción Globo H.
En otra forma de realización, las composiciones terapéuticas de la invención contienen al menos dos subunidades de fracción KLH en donde cada una de las dos subunidades de fracción KLH está unida a glicanos diferentes. Otros antígenos glicanos asociados a tumor unibles a subunidades de fracción KLH pueden incluir, pero no están limitados a GM2, GD2, GD3, fucosilo, GM1, sTn, sialil-Lewisx, Lewisx, sialil-Lewisa, Lewisa, sTn, TF, ácido polisiálico, Lewisy, mucinas, antígeno T, y similares. En algunas formas de realización, solo, al menos o aproximadamente el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 por ciento de las subunidades de la fracción KLH en una composición terapéutica están unidas a una fracción Globo H mientras las subunidades de la fracción KLH restantes en la composición terapéutica están unidas a otros antígenos glicano asociados a tumor.
Como se usa en el presente documento, “proporción de epítopo” en relación a los conjugados terapéuticos divulgados en el presente documento se refiere a, por ejemplo, la relación de epítopos de antígeno respecto a moléculas portadoras en un conjugado terapéutico. Preferiblemente, se refiere a la relación de fracciones Globo H respecto a fracciones KLH. Lo más preferiblemente, la proporción de epítopo de un conjugado terapéutico se calcula usando la siguiente fórmula = (peso de la fracción Globo H real/peso molecular de la fracción Globo H)/(peso de la fracción KLH real/peso molecular de la fracción KLH). Las proporciones de epítopo son fácilmente determinables para los expertos en la materia. Preferiblemente, los pesos de Globo H se determinan, por ejemplo, por cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento con detección amperométrica pulsada (HPAEC-PAD).
Ensayos biológicos
En una forma de realización, cuando se administra a un paciente, las composiciones terapéuticas que contienen los conjugados terapéuticos de la invención son capaces de inducir títulos de anticuerpos anti-Globo H al menos o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 50, 100, 250, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, o 5000 veces mayores que el mismo título de anticuerpo anti-Globo H antes de la administración (es decir, un título basal pretratamiento) en el mismo experimento. En ciertas formas de realización, los anticuerpos anti-Globo H son anticuerpos IgM. En otra forma de realización, los anticuerpos anti-Globo H son anticuerpos IgG.
Las composiciones terapéuticas de la invención son capaces de inducir respuestas tanto humorales como celulares en un sujeto. En ciertas formas de realización, la composición vacuna de la invención induce la producción de anticuerpos IgG e IgM específicos de la fracción Globo H y la expansión de células B y células T (por ejemplo, células T CD3+, células T c D4+ y/o células T CD8+). Típicamente, estas respuestas inmunitarias se producen cronológicamente después de la administración. En un ejemplo particular, después de la administración, la producción de células B aparece aproximadamente el día 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, o 60 días, seguido por la producción de anticuerpos IgG e IgM aproximadamente el día 10, 20, 30, 60, o 90 y posterior producción de células T aproximadamente el día 24, 30, 40, 50, 60, 90, 120, 150, o 180. La composición vacuna de la invención potencialmente proporciona un efecto protector inmunológico a largo plazo que podría prevenir el crecimiento de pequeñas cantidades de células cancerosas, siendo ideal de esta manera para enfermedad residual mínima de modo que se alcance la estabilización de la enfermedad y mejora de supervivencia.
“Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo” y “ADCC” se refiere a una reacción celular en la que células citotóxicas no específicas (por ejemplo, células citolíticas naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen anticuerpo unido en una célula diana y posteriormente producen lisis de la célula diana. En una forma de realización, tales células son células humanas. Mientras no se quiere estar limitado por ningún mecanismo de acción particular, estas células citotóxicas que median ADCC en general expresan receptores de Fc (FcR). Las células principales para mediar ADCC, células NK, expresan FcyRIII, mientras los monocitos expresan FcyRI, FcyRII, FcyRIII y/o FcyRIV. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad ADCC de una molécula, se puede realizar un ensayo ADCC in vitro, tal como el descrito en las patentes en EE UU No. 5.500.362 o 5.821.337. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y células citolíticas naturales (NK). Alternativamente, o además, la actividad ADCC de los conjugados terapéuticos de la invención se puede ensayar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 95:652-656 (1998).
“Citotoxicidad dependiente del complemento” o “CDC” se refiere a la capacidad de un conjugado terapéutico para iniciar la activación del complemento y lisar una diana en presencia del complemento. La ruta de activación del complemento se inicia por la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) a una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) en complejo con un antígeno afín. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santaro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).
En otra forma de realización, cuando se administra a un paciente las composiciones terapéuticas que contienen conjugados terapéuticos de la invención son capaces de inducir la producción en un paciente/sujeto de suero inmunitario anti-Globo H, que específicamente se une a líneas de células cancerosas positivas para Globo H, por ejemplo, células MCF-7.
Combinaciones
Las composiciones terapéuticas pueden incluir otros fármacos anticáncer/antiproliferativos, así como adyuvantes y otras moléculas inmunomoduladoras tal como citoquinas o quimioquinas. Estos agentes se pueden suministrar todos en un kit juntos en envases separados o un único envase. Los agentes se pueden combinar en el momento de la administración o al menos o aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 1,7, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 minutos, horas o días antes de la administración.
Los adyuvantes son agentes farmacológicos o inmunológicos que modifican los efectos de otros agentes. Pueden ser una sustancia química inorgánica u orgánica, macromolécula o células cancerosas enteras o porciones de las mismas que aumentan la respuesta inmunitaria a un antígeno determinado. Los adyuvantes incluyen adyuvante de Freund completo e incompleto, moléculas de receptores tipo Toll y miméticos de las mismas, LPS, lipoproteínas, lipopéptidos, flagelina, ARN bicatenario, islas CpG sin metilar, levamisol, bacilo de Calmette-Guerin, octreótido, isoprinosina, y zadaxin, varias formas de ADN y ARN clásicamente liberadas por bacterias y virus, antagonistas de PD-1 y antagonistas de CTLA. En una forma de realización, el adyuvante es un adyuvante de saponina.
En ciertas formas de realización, el adyuvante de saponina es saponina OBI-821, que está sustancialmente pura. En otras formas de realización, la saponina OBI-821 es un fragmento biológicamente activo de la misma. El adyuvante también puede abarcar formas impuras de saponinas OBI-821. Las saponinas OBI-821 purificadas muestran efecto adyuvante aumentado cuando se administran con una vacuna descrita en el presente documento o mezcladas con otros adyuvantes de saponina o no saponina sustancialmente puros.
Las saponinas OBI-821 son glucósidos naturales, extraídos en alta pureza de la corteza del árbol de Molina Quillaja saponaria, por cromatografía líquida de alta presión (HPLC), cromatografía en sílice líquida de baja presión, y cromatografía interactiva hidrofílica (HILIC) como se describe en, por ejemplo, la patente en EE UU No. 5.057.540 y la patente en EE UU No. 6.524.584. El análisis por cromatografía líquida de alta presión muestra que OBI-821 son una mezcla de compuestos isoméricos estructuralmente relacionados. Se han identificado diferentes compuestos isoméricos purificados de saponinas OBI-821 y se divulgan en el presente documento.
En ciertas formas de realización, la saponina OBI-821 comprende al menos un compuesto aislado de la fórmula I como sigue:
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R1 es p-D-apiosa o p-D-xilosa; y
R2 y R3 son independientemente H, alquilo,
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(fracción acilo graso para el compuesto 1989) o
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(fracción acilo graso para el compuesto 1857).
La saponina OBI-821 también puede comprender un compuesto aislado de fórmula I, en donde
(i) R1 es p-D-apiosa, R2 es la fracción acilo graso para el compuesto 1989 representada anteriormente, y R3 es H (compuesto 1989 V1A);
(ii) R1 es p-D-apiosa, R2 es H y R3 es la fracción acilo graso para el compuesto 1989 representada anteriormente (compuesto 1989 V1B);
(iii) R1 es p-D-xilosa, R2 es la fracción acilo graso para el compuesto 1989 representada anteriormente y R3 es H (compuesto 1989 V2A); o
(iv) R1 es p-D-xilosa, R2 es H y R3 es la fracción acilo graso para el compuesto 1989 representada anteriormente (compuesto 1989 V2B). Colectivamente, el compuesto 1989 V1A, compuesto 1989 V1B, compuesto 1989 V2Ay compuesto 1989 V2A se llaman “mezcla de compuestos 1989”.
La tabla 1 resume los grupos funcionales de los compuestos 1989 y el % molar de cada compuesto 1857 en la mezcla de compuestos 1857.
Tabla 1
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La saponina OBI-821 puede comprender un compuesto aislado de fórmula I, en donde
(i) R1 es p-D-apiosa, R2 es la fracción acilo graso para el compuesto 1857 representada anteriormente y R3 es H (compuesto 1857 V1A);
(ii) R1 es p-D-apiosa, R2 es H y R3 es la fracción acilo graso para el compuesto 1857 representada anteriormente (compuesto 1857 V1B);
(iii) R1 es p-D-xilosa, R2 es la fracción acilo graso para el compuesto 1857 representada anteriormente y R3 es H (compuesto 1857 V2A); o
(iv) R1 es p-D-xilosa, R2 es H y R3 es la fracción acilo graso para el compuesto 1857 representada anteriormente (compuesto 1857 V2B). Colectivamente el compuesto 1857 V1A, compuesto 1857 V1B, compuesto 1857 V2Ay compuesto 1857 V2A se llaman “mezcla de compuestos 1857”.
La tabla 2 resume los grupos funcionales de los compuestos 1857 y el % molar de cada compuesto 1857 en la mezcla de compuestos 1857. HPLC.
Tabla 2
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La saponina OBI-821 comprende uno o más de los siguientes compuestos:
(i) compuesto 1857 V1A; (ii) compuesto 1857 V1B;
(ii) compuesto 1857 V2A;
(iii) compuesto 1857 V2B;
(iv) compuesto 1989 V1A;
(v) compuesto 1989 V1B;
(vi) compuesto 1989 V2A; o
(vii) compuesto 1989 V2B.
Los porcentajes de la mezcla de compuestos 1857 y la mezcla de compuestos 1989 en la saponina OBI-821 pueden variar como sigue:
(i) de aproximadamente el 1% molar a aproximadamente el 15% molar de OBI-821 que comprende una mezcla de compuestos 1857; y
(ii) de aproximadamente el 85% molar a aproximadamente el 99% molar de OBI-821 que comprende una mezcla de compuestos 1989.
Todos los % molares se pueden variar en incremento del 0,1% (por ejemplo, de aproximadamente el 87% a aproximadamente el 90%, de aproximadamente el 90,5% a aproximadamente el 97%, de aproximadamente el 3,5% a aproximadamente el 11%, de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 14%).
La mezcla de compuestos 1989 puede comprender aproximadamente el 60-70% molar de compuesto 1989 V1A; aproximadamente el 1-5% molar de compuesto 1989 V1B; aproximadamente el 30-40% molar de compuesto 1989 V2A; aproximadamente el 0,1-3% molar de compuesto 1989 V2B. Todos los % molares se pueden variar en incremento del 0,1% (por ejemplo, 65%, 2,5%, 35,6%).
La mezcla de compuestos 1857 puede comprender aproximadamente el 60-70% molar de compuesto 1857 V1A; aproximadamente el 1-5% molar de compuesto 1857 V1B; aproximadamente el 30-40% molar de compuesto 1857 V2A; aproximadamente el 0,1-3% molar de compuesto 1857 V2B. Todos los % molares se pueden variar en incremento del 0,1% (por ejemplo, 65%, 2,5%, 35,6%).
En otra forma de realización, la OBI-821 sustancialmente pura se purifica de un extracto de Quillaja saponaria crudo, en donde dicha OBI-821 se caracteriza por un único pico predominante que comprende el 90% o más del área total de todos los picos de un cromatograma, excluyendo el pico de solvente, cuando se analiza en HPLC de fase inversa en una columna Symmetry C18 que tiene tamaño de partícula de 5 um, poro de 100 A, 4,6 mm DI x 25 cm L con una programa de elución que comprende una fase móvil de A:B del 95%:5% al 75%:25% en 11 minutos, fase móvil A que es agua destilada con ácido trifluoroacético al 0,1%, y la fase móvil B es acetonitrilo con ácido trifluoroacético al 0,1% a una velocidad de flujo de 1 ml/min.
En una forma de realización, la composición farmacéutica comprende el compuesto de fórmula (I)
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Formula (I)
en donde,
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y un soporte farmacéuticamente aceptable.
La vacuna puede comprender un antígeno glucídico o su fragmento inmunógeno y una saponina OBI-821. En aún otra forma de realización, la vacuna comprende un antígeno glucídico o su fragmento inmunógeno; una proteína portadora y una saponina OBI-821. En aún otra forma de realización, la vacuna comprende un antígeno glucídico seleccionado de Globo H, KLH, y una saponina OBI-821. Los ejemplos no limitantes de proteína portadora incluyen KLH.
Como se usa en el presente documento, el término “citoquina” se refiere a cualquiera de numerosas proteínas pequeñas, secretadas que regulan la intensidad y duración de la respuesta inmunitaria afectando el proceso de diferenciación de células inmunitarias que habitualmente implica cambios en la expresión génica por lo que una célula precursora se convierte en un tipo celular especializado distinto. Las citoquinas se han nombrado diversamente como linfoquinas, interleuquinas, y quimioquinas, basado en su presunta función, célula de secreción, o diana de acción. Por ejemplo, algunas interleuquinas comunes incluyen, pero no están limitadas a, IL-2, IL-12, IL-18, IFN-y, TNF, IL-4, IL-10, IL-13, IL-21, GM-CSF y TGF-p.
Como se usa en el presente documento, el término “quimioquina” se refiere a cualquiera de varias citoquinas pequeñas quimiotácticas liberadas en el sitio de infección que proporcionan un medio para la movilización y activación de linfocitos. Las quimioquinas atraen leucocitos a los sitios de infección. Las quimioquinas tienen residuos de cisteína conservados que permite asignarlas a cuatro grupos. Los grupos, con quimioquinas representativas, son quimioquinas C-C (RANTES, MCP-1, MIP-1a, y MIP-1p), quimioquinas C-X-C (IL-8), quimioquinas C (linfotactina) y quimioquinas CXXXC (fractalina).
Las composiciones terapéuticas de la invención pueden incluir además inhibidores de PD-1/PD-L1 (inmunoterapia de linfocitos T citotóxicos (CTL)), inmunoterapia de CTLA-4, inhibidores de CDK4/6 (terapia dirigida), inhibidores de PI3K (terapia dirigida), inhibidores de mTOR (terapia dirigida), inhibidores de AKT (terapia dirigida), inhibidores Pan-Her (terapia dirigida). Estos inhibidores se pueden modificar para generar el respectivo anticuerpo monoclonal también. Tales anticuerpos se pueden incluir en composiciones terapéuticas de la invención.
Las composiciones terapéuticas pueden incluir otros agentes anticáncer/antiproliferativos o quimioterapéuticos. En algunas formas de realización, los ejemplos de tales agentes se encuentran en Cancer Principles and Practice of Oncology por V.T. Devita y S. Hellman (editores), 6a edición (15 de febrero, 2001), Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Tales agentes anticáncer incluyen, pero no están limitados a, los siguientes: agentes terapéuticos hormonales (por ejemplo, moduladores del receptor de estrógeno selectivos, moduladores del receptor de andrógeno), terapia de anticuerpos monoclonales, quimioterapia, moduladores de receptor retinoide, agentes citotóxicos/citostáticos, agentes antineoplásicos, agentes antiproliferativos, inhibidores de prenil-proteína transferasa, inhibidores de HMG-CoA reductasa, mostazas de nitrógeno, nitrosoureas, inhibidores de angiogénesis (por ejemplo, bevacizumab), inhibidores de la ruta de señalización de proliferación y supervivencia celular, agentes inductores de apoptosis, agentes que interfieren con puntos de control del ciclo celular, agentes que interfieren con receptores tirosinas quinasas (RTK), inhibidores de diana de rapamicina de mamífero (mTOR), inhibidores del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2), inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), bloqueantes de integrinas, AINE, agonistas de PPAR, inhibidores de multirresistencia a fármacos (MDR) inherente, agentes antieméticos, agentes útiles en el tratamiento de anemia, agentes útiles en el tratamiento de neutropenia, fármacos de potenciación inmunológica, bifosfonatos, inhibidores de aromatasas, agentes que inducen diferenciación terminal de células neoplásicas, inhibidores de Y-secretasa, vacunas contra el cáncer, y cualquier combinación de los mismos.
Formulaciones de la invención
Las composiciones terapéuticas (también denominadas en el presente documento composiciones farmacéuticas) en general incluyen un soporte farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento la frase “soporte farmacéuticamente aceptable” incluye solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. También se pueden incorporar compuestos activos suplementarios en las composiciones. Una composición farmacéutica se formula para que sea compatible con su ruta de administración pretendida. Los ejemplos de rutas de administración incluyen administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraarterial, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica), transmucosa, y rectal. Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, solución salina tamponada en fosfato, solución salina tamponada en tris, aceites no volátiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol, u otros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tal como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tal como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tal como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tal como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tal como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tal como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral se puede encerrar en ampollas, jeringas desechables, o viales multidosis hechos de vidrio o plástico.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para un uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (donde sean solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersión inyectable estéril. Para la administración intravenosa, los soportes adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL® (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada en fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida al nivel de que exista fácil jeringabilidad. Debe ser estable en condiciones de fabricación y almacenamiento y conservarse contra la acción contaminante de microorganismos tal como bacterias y hongos. El soporte puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerida en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede alcanzar por varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tal como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede producir incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido por esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación incluyen secado al vacío y liofilización que da un polvo del principio activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente esterilizada por filtración del mismo.
Las composiciones orales en general incluyen un diluyente inerte o un soporte comestible. Para el fin de administración terapéutica oral, el principio activo se puede incorporar con excipientes y usar en forma de comprimidos, pastillas, o cápsulas, por ejemplo, cápsulas de gelatina. Las composiciones orales también se pueden preparar usando un soporte fluido para uso como un colutorio. Se pueden incluir agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles, o materiales adyuvantes como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, pastillas y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o sterotes; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo o saborizante de naranja.
Para la administración por inhalación, los compuestos se administran en forma de un espray aerosol desde un envase o dispensador presurizado que contiene un propelente adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.
La administración sistémica también puede ser transmucosa o transdérmica. Para la administración transmucosa o transdérmica, se usan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera que se va a permear. Tales penetrantes en general se conocen en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, detergentes, sales biliares, y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa se puede lograr mediante el uso de espráis nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, ungüentos, geles, o cremas como en general se conoce en la técnica. Los compuestos también se pueden preparar en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorio convencionales tal como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para la administración rectal.
Según implementaciones, los compuestos activos se preparan con soportes que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biocompatibles, biodegradables tal como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán aparentes para los expertos en la materia. Los materiales también se pueden obtener comercialmente. También se pueden usar suspensiones liposómicas (incluyendo liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales para antígenos específicos de célula) como soportes farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar según métodos que conocen los expertos en la materia, por ejemplo, como se describe en la patente en EE UU No. 4.522.811.
Es ventajoso formular las composiciones orales o parenterales en forma farmacéutica unitaria para facilidad de administración y uniformidad de dosis. Forma farmacéutica unitaria como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas para el sujeto que se va a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el soporte farmacéutico requerido.
Formas farmacéuticas
Se puede determinar la toxicidad y eficacia terapéutica de tales composiciones terapéuticas por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La proporción de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como el cociente DL50/DE50. Las composiciones terapéuticas que muestran altos índices terapéuticos son preferidas. Mientras los compuestos que muestran efectos secundarios tóxicos se pueden usar, se debe tener cuidado para diseñar un sistema de administración que dirija tales compuestos al sitio de localización afectada para minimizar el daño potencial a células sin infectar y, mediante ello, reducir los efectos secundarios.
Los datos obtenidos de ensayos de cultivo celular y estudios animales se pueden usar en formular un intervalo de dosis para uso en seres humanos. La dosis de tales compuestos está preferiblemente en un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y la ruta de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en el método de la divulgación, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente de ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos animales para alcanzar un intervalo de concentración circulante en plasma que incluya la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que alcanza una inhibición semimáxima de síntomas) determinada en cultivo celular. Tal información se puede usar para determinar de forma más precisa dosis útiles en seres humanos. Se pueden medir niveles en plasma, por ejemplo, por cromatografía líquida de alto rendimiento.
En algunas formas de realización, una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición terapéutica (es decir, una dosis eficaz) puede variar de aproximadamente 0,001 pg/kg hasta aproximadamente 250 g/kg, de 0,01 pg/kg a 10 g/kg, o de 0,1 pg/kg a 1 g/kg o aproximadamente o al menos: 0,001, 0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008, 0,009; 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09;0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 225, o 250 gramos o microgramos por kilogramo de peso corporal del paciente, u otros intervalos que serían aparentes y entenderían los expertos en la materia sin experimentación excesiva. El experto en la materia apreciará que ciertos factores pueden influir la dosis y cadencia requeridas para tratar de forma eficaz un sujeto, incluyendo, pero no limitado a, la gravedad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, la salud general o edad del sujeto, y otras enfermedades presentes.
En otras formas de realización, una cantidad terapéuticamente eficaz de fracción Globo H en la composición terapéutica (es decir, una dosis eficaz) puede variar de aproximadamente 0,001 pg/kg hasta aproximadamente 250 g/kg, de 0,01 pg/kg a 10 g/kg, o de 0,1 pg/kg a 1 g/kg o aproximadamente o al menos: 0,001, 0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008, 0,009; 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09;0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 225, o 250 gramos o microgramos por kilogramo de peso corporal del paciente, u otros intervalos que serían aparentes y entenderían los expertos en la materia sin experimentación excesiva. El experto en la materia apreciará que ciertos factores pueden influir la dosis y cadencia requeridas para tratar de forma eficaz un sujeto, incluyendo, pero no limitado a, la gravedad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, la salud general o edad del sujeto, y otras enfermedades presentes.
En ciertas formas de realización, las composiciones terapéuticas divulgadas en el presente documento contienen o están asociadas con, al menos un conjugado terapéutico por lo cual cada al menos un conjugado terapéutico está presente en una única dosis a una concentración de aproximadamente, al menos o más que: 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 veces cada uno 10-9, 10-8, 10-710-710-610-510410310-210-1 molar por dosis. Preferiblemente, el conjugado terapéutico está presente en una única dosis a una concentración entre aproximadamente: 1-100, 2-60, 3-50, 4-40, 5-30, 6-20, 7-15, 8-10, 2-18, 3-16, 4-14, 5-12, 6-10 o 7-8 pM.
En algunas formas de realización, las composiciones terapéuticas divulgadas en el presente documento contienen o están asociadas con, al menos un conjugado terapéutico por lo cual cada al menos un conjugado terapéutico está presente en un única dosis a una concentración de aproximadamente, al menos o más que: 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 veces cada uno 10-3, 10'2, 10'1 o 10 microgramos. En ciertas formas de realización aproximadamente o al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 o más microgramos de un conjugado terapéuticos se incluye por dosis.
En ciertas formas de realización, las composiciones terapéuticas divulgadas en el presente documento son para administración en una dosis aproximadamente o al menos o más que: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 veces al día, semana o mes durante un periodo de aproximadamente o al menos o más que: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 días, semanas, meses o años.
Kits
Según otro aspecto, el experto en la materia puede prever uno o más kits de partes, los kits de partes para realizar al menos uno de los métodos divulgados en el presente documento, el kit de partes comprende uno o más conjugados terapéuticos, agentes anticáncer/antiproliferativos, adyuvantes, citoquinas y/o quimioquinas. Las composiciones terapéuticas que comprenden solo o en combinación una cantidad eficaz de las composiciones terapéuticas divulgadas en el presente documento según el al menos uno de los métodos anteriormente mencionados. Los agentes anteriormente mencionados pueden venir en un único envase o en diferentes envases en el kit.
Los kits posiblemente incluyen también identificadores de un suceso biológico, u otros compuestos identificables por un experto en la materia tras leer la presente divulgación. El kit también puede comprender al menos una composición que comprende una cantidad eficaz de las composiciones terapéuticas divulgadas en el presente documento. Las composiciones terapéuticas de los kits para realizar el al menos un método divulgado en el presente documento según procedimiento identificable por un experto en la materia.
La divulgación también incluye las composiciones terapéuticas de la invención para uso en métodos de tratar enfermedades proliferativas. En una forma de realización, las composiciones terapéuticas son para uso en métodos que implican el tratamiento de cáncer, por ejemplo, cáncer de mama. Los métodos en general implican proporcionar las composiciones terapéuticas divulgadas en el presente documento a un paciente en necesidad de ello en una cantidad eficaz para tratar el trastorno proliferativo.
En algunas formas de realización, las composiciones terapéuticas de la invención son para administración a un sujeto en necesidad de ello (por ejemplo, uno que tiene un cáncer tal como cáncer de mama) en un método que de media extiende la supervivencia sin evolución o supervivencia global sobre un placebo control, por ejemplo, un placebo de solución salina tamponada con fosfato, en aproximadamente o al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 días, semanas, meses o años.
En algunas formas de realización, las composiciones terapéuticas se van a dar por vía subcutánea en la semana 0-2, 6, 14, y 26 en ausencia de una toxicidad inaceptable o evolución de la enfermedad.
En algunas formas de realización, las composiciones terapéuticas de la invención son para administración a un sujeto en necesidad de ello (por ejemplo, uno que tiene un cáncer tal como cáncer de mama) en un método que de media reduce el volumen de un tumor en el paciente relativo a un placebo control, por ejemplo, un placebo de solución salina tamponada con fosfato, en aproximadamente o al menos , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 52 5354 5556 5758 5960 61 626364 6566 6768 69 7071 72737475 7677 7879 8081 82838485 8687 88 89 9091 929394 9596 979899 o más por ciento sobre el curso de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 días, semanas, meses o años.
En algunas formas de realización, los volúmenes tumorales se pueden medir de forma precisa en al menos una dimensión (el diámetro más largo en el plano de medida se va a registrar) con un tamaño mínimo de 10 mm por TAC (se recomienda que el espesor de las porciones del TAC esté entre 2,5 mm y 5 mm).
Métodos de sintetizar las composiciones de la invención
La porción hexasacárido Globo H de las composiciones terapéuticas de la invención se sintetizó químicamente como el glicósido alilo y después se preparó para conjugación con KLH.
La síntesis química de Globo H puede implicar las siguientes etapas generales:
Figure imgf000024_0001
KLH se trató con 2-iminotiolano en un tampón acuoso. La KLH tiolada se aisló después del 2-iminotiolano sin reaccionar, a través de una columna de exclusión molecular de columna de Sephadex G-15. La KLH tiolada se almacenó en una atmósfera de gas inerte (nitrógeno o argón) y se usó inmediatamente para la conjugación con Globo H MMCCH.
Ejemplos
Ejemplo 1: Preparación de glucoconjugado de la invención (Globo H-KLH)
Se convirtió Globo H glucósido de alilo (comercialmente disponible) a un aldehído por ozonolisis. Se hizo reaccionar Globo H aldehído con M2C2H (enlazador) y NaCNBH3 para dar Globo H-MMCCH. La mezcla se purificó con una columna para capturar Globo H-MMCCH. La fracción con Globo H-MMCCH positivo se confirmó por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y después se juntaron. Se disolvió KLH en tampón de tiolación y se añadió 2-iminotiolano a la reacción en porciones. La reacción se incubó hasta completarse y después se purificó KLH-SH por una columna. Se combinaron Globo H-MMCCH y KLH-SH. La reacción se agitó hasta completarse. Después se purificó Globo H-KLH para proporcionar el producto final.
Ejemplo 2: Análisis de proporción en peso de Globo H respecto a KLH en el glucoconjugado
La proporción en peso de Globo H y KLH en el glucoconjugado preparado se confirmó por cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento con detección amperométrica pulsada (HPAEC-PAD). Los resultados se muestran en la tabla 3.
Tabla 3: La proporción en peso de Globo H y KLH en el glucoconjugado
Figure imgf000025_0001
Ejemplo 3: Análisis de la proporción de epítopo de Globo H respecto a KLH en el glucoconjugado
El peso molecular de un didecámero de KLH (la forma naturalmente agregada) es aproximadamente 7,5 MDa ~ 8,6 MDa, como se describe en la bibliografía, tal como Micron 30 (1999) 597-623. Se confirmó que la KLH nativa por la cromatografía de exclusión molecular y espectrometría de dispersión láser multiángulo (MALS), tenía el peso molecular de aproximadamente 8,6 MDa (véase, Fig. 3 y 4). Los glucoconjugados de la invención (muestra no. 5, la proporción en peso de Globo H a KLH es 0,17:1) se analizaron por cromatografía de exclusión molecular. Los resultados muestran que el glucoconjugado de la invención mostraba una masa reducida en peso molecular en comparación con los didecámeros de KLH agregada. Véase la figura 4. Las proporciones moleculares se calcularon después como en la tabla 4.
T l 4: l l r r i n m l l r l H KLH
Figure imgf000025_0002
* La proporción molecular anterior se calcula basada en la fórmula siguiente:
Peso de Globo H/
proporción molecular ________________________________ ¡M. W. de Globo H
_____________ Peso de KLH_____________
Peso molecular de KLH * *
** El peso molecular de KLH depende de las formas de monómero, dímero o didecámero.
Dado lo anterior, se concluyó que, en el glucoconjugado de la invención, las unidades monoméricas de KLH forman monómeros, dímeros y/o trímeros después de la conjugación a Globo H.
Ejemplo 4: Preparación de composiciones vacuna e inmunización en ratas
Diferentes muestras de los glucoconjugados (Globo H-KLH) preparadas en el ejemplo 1 se almacenaron a 4°C, y se mezclaron con un adyuvante de saponina en una campana de flujo laminar. Las composiciones vacuna resultantes se colocaron en hielo y se transportaron a un animalario para posterior inmunización.
Se inmunizaron tres grupos de ratas Lewis con las varias composiciones vacuna como se muestra en la tabla 5.
Tabla 5: Grupo de ratas inmunizadas
Grupo Composiciones vacuna Número de animales Vía
I GH-KLH* (25 |jg) adyuvante saponina (25 |jg) 8 SC
II GH-KLH* (7,5 jg ) adyuvante saponina (25 jg )
Figure imgf000026_0001
4 SC
II PBS 4 SC
* GH:KLH = 0,17:1 (p/p)
GH: Globo H
SC: subcutánea
PBS: solución salina tamponada en fosfato
Las ratas se inmunizaron el día 0, 7, 14 y 21. Se recogieron células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y plasma el día 0, 3, 10, 17, 24 y 31. Se recogieron bazo, ganglios linfáticos y lavado peritoneal el día 31.
Ejemplo 5: Ensayos para la inducción de respuestas inmunitarias humoral y celular en ratas
Ejemplo 5.1 Análisis de subpoblaciones de células efectoras inmunitarias por citometría de flujo
Las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) se aislaron de los animales y después varias subpoblaciones de células efectoras inmunitarias en las CMSP se identificaron por citometría de flujo usando anticuerpos específicos contra diferentes marcadores celulares. Las CMSP, aisladas de las ratas inmunizadas el día 0, 3, 10, 17, 24 y 31, se tiñeron con diferentes anticuerpos conjugados con fluorescencia (FITC) y se colocaron en hielo durante 30 minutos. Después de la incubación, las células se lavaron con el tampón de lavado (seroalbúmina bovina (Sigma) al 1% y NaN3 (Sigma) al 0,1% en solución salina tamponada con fosfato (UniRegion Biotech) y se centrifugaron a 350 g durante 5 minutos. Las células se resuspendieron en tampón de lavado para la determinación de la fluorescencia por FACS Canto (BD Bioscience). Los datos se analizaron con software BD FACSDiva (BD Bioscience). Los resultados muestran que en las ratas inmunizadas por el glucoconjugado de la presente invención, células T, células B, células T CD4+, y células T CD8+ estaban significativamente expandidas cuando se comparaban al grupo control de PBS. Específicamente, la población de células B apareció primero el día 3 y posteriormente aparecieron células T CD3+, T CD4+ y T CD8+ el día 24. Véase la figura 5 (A)-(D).
Ejemplo 5.2 Prueba de anticuerpo específico para Globo H por ELISA
La producción de anticuerpos específicos de Globo H en el plasma de las ratas inmunizadas se determinó por ensayo ELISA. Los resultados muestran que los títulos de IgG específica de Globo H empezaron a subir a los 10 días y alcanzaron un pico a los 17 días después de la inmunización. Se observaron patrones similares en la producción de anticuerpo IgM específico de Globo H. Véase la figura 5 (A)-(B). No hubo respuesta de anticuerpo IgG e IgM específico de Globo H en ratas tratadas con PBS, o KLH más adyuvante solo (datos no mostrados).
En resumen, en las ratas inmunizadas, la producción de células B aparece el día 3, seguido por la producción de anticuerpo IgM e IgG contra Globo H que aparece el día 10 y posteriormente células T CD3+, T CD4+ y T CD8+ que aparece el día 24. El glucoconjugado (Globo H-KLH) de la invención es eficaz para inducir respuestas tanto humorales como celulares.
Ejemplo 6: Inmunización en ratones y ensayo de anticuerpo por ELISA
Se almacenaron diferentes muestras de los glucoconjugados (Globo H-KLH) a 4°C, y se mezclaron con un adyuvante de saponina en una campana de flujo laminar. Las composiciones vacuna resultantes se colocaron en hielo y se transportaron a un animalario para posterior inmunización.
Se dio a ratones Balb/c de aproximadamente ocho semanas de edad Globo H-KLH con diferentes proporciones de hidrato de carbono a proteína (Globo H:KLH) una vez cada semana durante cuatro semanas (día 0, 7, 14 y 21) mediante inyección subcutánea. Se recogieron muestras de sangre a través de la vena retro-orbital o facial sin anticoagulante preinmunitario o día 0, y tres días después de cada vacunación (día 10, 17 y 24). Las muestras se centrifugaron después para separar suero y glóbulos rojos. Se recogieron los sueros y almacenaron a -20°C, que se analizaron después por ELISA. Se usó la prueba de la t de Mann-Whitney para análisis estadístico.
Como se muestra en la figura 6, se ha demostrado que el glucoconjugado (Globo H-KLH), en combinación con un adyuvante de saponina, según la invención, induce significativamente las respuestas de anticuerpo IgM específico de Globo H en el modelo animal, en comparación con el grupo control de PBS. Específicamente, el glucoconjugado con una proporción de peso 0,17:1 (Globo H:KLH) indujo un mejor título de anticuerpo que el glucoconjugado con una proporción de peso 0,07:1 (Globo H:KLH).
En resumen, se ha demostrado que el glucoconjugado (Globo H-KLH), en combinación con un adyuvante apropiado, según la invención, induce respuesta inmunitaria humoral y celular inesperadamente superior en el modelo animal, particularmente expansión de células B y células T incluyendo CTL y respuestas de IgM e IgG, que son importantes en inmunoterapia contra el cáncer.
Ejemplo 7: Estudio de inmunogenicidad de Globo H-KLH con o sin vacuna adyuvante en ratones
La capacidad de la composición de Globo H de la invención, cuando se empareja con un adyuvante, para provocar una respuesta inmunitaria en ratones se ha llevado a cabo. La cantidad de anticuerpo específico de Globo H inducido por la inmunoterapia se cuantificó por ELISA y FACS.
Se inmunizaron grupos de ratones C57BL/6 hembras de 6 semanas de edad por vía subcutánea con Globo H-KLH y adyuvante. Los niveles de dosis de Globo H-KLH son el equivalente de la cantidad de Globo H (en |jg) en Globo H-KLH. Cada inyección contenía un intervalo de dosis equivalentes a de 0,6 jg a 5,0 jg de Globo H en Globo H-KLH y 20 jg de adyuvante. Las inmunizaciones se produjeron los días 0, 8, y 14, y se recogió suero el día 0 (preinyección) y el día 24 para análisis comparativos por ELISA y FACS. Las respuestas serológicas se midieron por ELISA para determinar su título de anticuerpos contra la ceramida Globo H, y FACS para determinar la reactividad de superficie celular a células MCF-7 positivas para Globo H.
A lo largo de la inmunización, no hubo cambio obvio en el comportamiento, apetito, aspecto general, y aseo después de la vacunación. Diez días después de la tercera inmunización, se recogieron sueros para la determinación de los títulos de anticuerpo IgG e IgM anti-Globo H por ELISA, usando un título > 8 veces del valor pretratamiento como un criterio para respuesta positiva. Como se muestra en la figura 2, no hubo respuesta en ratones tratados con Globo H solo, conjugado Globo H KLH, o adyuvante solo. En contraste, 14/15 ratones tratados con Globo H-KLH adyuvante respondieron con títulos anti-Globo H de IgG significativos que no parecían ser dependientes de la dosis a una dosis de Globo H-KLH de 0,6 a 5 jg . Los títulos de IgG medios para cada dosis aumentaron en 13 a 17,5 veces sobre el valor pretratamiento Respecto a IgM anti-Globo H, uno de los 15 ratones mostró un aumento de 8 veces en el título después de la inmunización con adyuvante Globo H-KLH. Sin embargo, 5/15 tuvieron un título de IgM > 4 veces de los sueros preinmunitarios y un total de 6/15 tuvieron un título > 2 veces. Los títulos de IgM medios para cada dosis aumentaron en 2,5 veces sobre los valores pretratamiento.
La capacidad de unión de los sueros inmunitarios con la línea de células de cáncer de mama que expresa Globo H, MCF-7, se determinó por análisis FACS a una dilución de suero 1:25. El valor postratamiento del 30% por encima del valor pretratamiento (es decir, > 1,3 veces de aumento) se consideró como positivo en este ensayo. Como se muestra en la figura 3, los sueros inmunitarios de todos los grupos tratados con adyuvante Globo H-KLH contenía anticuerpos IgM que reaccionaron con células MCF-7, que variaban de 5~6 veces sobre el basal pretratamiento. Además, los sueros inmunitarios de tres quintos de los ratones tratados con 0,6 jg o 2 jg de Globo H-KLH adyuvante y dos quintos de los tratados con 5 jg de Globo H-KLH adyuvante mostraron anticuerpos IgG que se pudieron unir a células MCF-7. Las capacidades de unión medias aumentaron de 1,3 a 2,0 veces sobre el basal pretratamiento.
Se ha demostrado que la vacunación con Globo H-KLH y un adyuvante provoca respuestas anti-Globo H tanto de IgG como IgM en ratones C57BL/6 hembras. Los sueros inmunitarios tenían la capacidad de unirse a células MCF-7 de cáncer de mama que expresan Globo H.
Ejemplo 8: Análisis por LC-MS/MS de los sitios de conjugación de Globo H en KLH
Se identificaron los sitios de conjugación de Globo H en cuatro muestras de KLH usando digestión con múltiples enzimas y LC-MS/MS. Las cuatro muestras de KLH conjugada con Globo H se digirieron primero con cuatro enzimas diferentes y después se analizaron por LC-MS/MS y búsqueda en base de datos Mascot. Se identificaron dos tipos de derivados: derivado de Globo H (Globo H MMCCH) y el derivado de MMCCH (MMCCH solo). El derivado de Globo H y sus formas de pérdida neutra se consideraron para la identificación de los sitios de conjugación de Globo H. La forma MMCCH y su forma desamidada se consideraron para la identificación del sitio de conjugación de MMCCH. Se consideraron solo esos péptidos con espectros MS/m S de alta calidad y puntuación Mascot. Para el análisis de conjugación de Globo H, se observaron 31 y 28 lisinas conjugadas de los dos análisis de LC-MS/MS replicados de OBI-822-13001-DP (muestra 1); se observaron 19 y 21 lisinas conjugadas de los dos análisis de LC-MS/m S replicados de OBI-822-13002-Dp (muestra 2); se observaron 10 y 11 lisinas conjugadas de los dos análisis de LC-MS/MS replicados de OBI-822-13003-DP (muestra 3); se observaron 18 y 19 lisinas conjugadas de los dos análisis de LC-MS/MS replicados de OBI-822-13004-DS (muestra 4). Para análisis de conjugación de MMCCH, se encontraron 155 y 141 lisinas conjugadas de los dos análisis de Lc-MS/MS replicados de OBI-822-13001-DP (muestra 1); se encontraron 143 y 137 lisinas conjugadas de los dos análisis de LC-MS/MS replicados de OBI-822-13002-DP (muestra 2); se encontraron 147 y 143 lisinas conjugadas de los dos análisis de LC-MS/MS replicados de OBI-822-13003-DP (muestra 3); se encontraron 140 y 136 lisinas conjugadas de los dos análisis de LC-MS/MS replicados de OBI-822-13004-DS (muestra 4).
Ejemplo 8 Materiales y métodos
Las abreviaturas en esta sección son como sigue: K = lisina; LC-MS/MS = cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem; DTT = ditiotreitol; IAM = yodoacetamida; ACN = acetonitrilo; FA = ácido fórmico; Glu-C = endoproteinasa Glu-C; ABC = bicarbonato de amonio; RT = temperatura ambiente; MW = peso molecular.
Las cuatro muestras de KLH, muestra 1-4, se procesaron primero para intercambio de tampón en solución tampón bicarbonato de amonio 50 mM mediante filtros de ultracentrifugación Amicon de límite 100 kDa y se desnaturalizaron con urea 6 M. Las muestras se redujeron después con DTT 10 mM a 37°C durante 1 h, se alquilaron usando IAM 50 mM durante 30 min en la oscuridad a temperatura ambiente y se extinguieron con DTT 50 mM a temperatura ambiente durante 5 min. Las proteínas resultantes se diluyeron hasta que la concentración de urea es 1 M y se sometieron a digestión en solución con diferentes enzimas como se describe en la siguiente sección.
La digestión en solución con diferentes enzimas se realizó con las siguientes condiciones de digestión: (1) digestión con tripsina a 37°C durante 24 h (proteína:enzima = 40:1) (2) digestión con Glu-C a 37°C durante 24 h (proteína:enzima = 25:1); (3) digestión con quimotripsina a temperatura ambiente durante 24 h (proteína:enzima = 25:1); (4) digestión con termolisina a 37°C durante 24 h (proteína:enzima = 25:1).
Las reacciones de digestión se terminaron añadiendo ácido fórmico y las cuatro muestras digeridas se sometieron a análisis de LC-MS/MS.
Las muestras se analizaron con espectrómetro de masas Q Extractive (Thermo Scientific) acoplado con sistema Ultimate 3000 RSLC (Dionex). La separación por LC se realizó usando la columna C18 (Acclaim PepMap RSLC, 75 |jm x 150 mm, 2 jm , 100 A) con el gradiente mostrado a continuación:
Figure imgf000028_0001
Fase móvil A: ACN al 5%/FA al 0,1%
Fase móvil B: ACN al 95%/FA al 0,1%
Se ajustó CID en fuente a 45 eV. Se realizó un barrido MS completo con el intervalo m/z 350-2000, y los diez iones más intensos del barrido MS se sometieron a fragmentación para espectros MS/MS. Los datos crudos se procesaron en listas de picos por Proteome Discoverer 1.4 para búsqueda en bases de datos Mascot.
La búsqueda en bases de datos se realizó con Mascot versión 2.4.1 y Thermo Proteome Discoverer versión 1.4 frente a KLH1 y KLH2 [KLH1, registro en EMBL #CAG28307.1; KLH2, registro en EMBL #CAG28308.1. Los parámetros usados fueron como sigue: Enzima: tripsina, Gluc-C, quimotripsina y termolisina según el método de digestión; modificación fijada: carbamidometilo (C).
Modificaciones variables para derivados de MMCCH (MMCCH solo): desamidado (NQ), oxidación (M), dK_MMCCH-1 (K), dK_MMCCH-2 (K).
Modificaciones variables para derivados de Globo H (Globo H MMCCH): desamidado (NQ), oxidación (M), Globo_H_MMCCH (K), dK_MMCCH_NL997 (K), dK_MMCCH_NL835 (K), dK_MMCCH_NL673 (K), dK_MMCCH_NL511 (K), dK_MMCCH_NL308 (K), desamidado (NQ), Oxidación (M), Tolerancia de masa de péptido: ± 10 ppm; tolerancia a masa de fragmento: ± 0,05 Da; cortes perdidos máx.: 5; tipo de instrumento: ESI-TRAP; puntuación de corte de ion: 13.
“dK_MMCCH-1” en los parámetros de búsqueda indica la lisina conjugada a MMCCH con la adición de MW de 352,1569 Da.
“dK_MMCCH-2” en los parámetros de búsqueda indica la forma desamidada de lisina conjugada a MMCCH con la adición de MW de 338,1300 Da.
“Globo_H_MMCCH (K)” en los parámetros de búsqueda indica la lisina conjugada a Globo H con la adición de MW de 1393,5317 Da.
“dK_MMCCH_NL997 (K)” en los parámetros de búsqueda indica la forma de pérdida neutra de la lisina conjugada a Globo H con la adición de MW de 396,1831 Da.
“dK_MMCCH_NL835 (K)” en los parámetros de búsqueda indica la forma de pérdida neutra de la lisina conjugada a Globo H con la adición de MW de 558,2360 Da.
“dK_MMCCH_NL673 (K)” en los parámetros de búsqueda indica la forma de pérdida neutra de la lisina conjugada a Globo H con la adición de MW de 720,2888 Da.
“dK_MMCCH_NL511 (K)” en los parámetros de búsqueda indica la forma de pérdida neutra de la lisina conjugada a Globo H con la adición de MW de 882,3416 Da.
“dK_MMCCH_NL308 (K)” en los parámetros de búsqueda indica la forma de pérdida neutra de la lisina conjugada a Globo H con la adición de MW de 1085,4210 Da.
La “adición de MW” implica la adición de peso molecular comparada con el residuo de lisina intacto.
Ejemplo 8: Resultados
Las técnicas basadas en LC-MS/MS son herramientas para la identificación de proteína y caracterización de modificación de aminoácidos. Se puede obtener información detallada respecto a secuencias de péptidos y sitios de modificación por la asignación de iones de fragmentos proporcionados por los espectros de MS/MS. Mascot es una máquina de búsqueda y su algoritmo de puntuación basado en probabilidad se ha aceptado bien. La puntuación Mascot se adoptó en este estudio como una referencia de confianza para secuenciación de proteínas e identificación de sitios de conjugación de Globo H o MMCCH. Para analizar extensamente la distribución de sitios de conjugación de Globo H o MMCCH en las muestras 1-4, estas muestras se digirieron con múltiples enzimas seguido por análisis de LC-MS/MS.
La estructura química esperada para el derivado de Globo H (Globo H MMCCH) se muestra en la figura 33A y la correspondiente adición de MW de 1393,53 Da en péptidos que contienen lisina se puede observar entre los resultados. Además, los polisacáridos lábiles tienden a caerse a través de pérdida neutra durante la ionización de electrospray en el análisis de LC-MS. Por tanto, la adición de peso molecular de 396,18 Da, 558,24 Da, 720,29 Da, 882,34 Da y 1085,42 Da resultante de pérdida neutra también se pudo observar para péptidos glucoconjugados, como se muestra en la figura 33B. Todas las formas derivatizadas se consideraron para la identificación de los sitios de conjugación de Globo H.
Además, también se observó el derivado de MMCCH (MMCCH solo) en estas muestras de KLH conjugada a Globo H. La estructura química esperada para el derivado de MMCCH y su forma desamidada se muestran en la figura 34A y 34B y la correspondiente adición de MW de 352,16 Da y 338,13 Da respectivamente en péptidos que contienen lisina se puede observar entre los resultados. Ambas formas derivatizadas se consideraron para la identificación de los sitios de conjugación de MMCCH. La conversión de derivado de Globo H a MMCCH no está clara, pero se supone que sucede durante el tratamiento de la muestra.
La precisión de masa de ± 10 ppm para ion precursor y ± 0,05 Da para ion de fragmento se usaron como los criterios para identificación de proteína e interpretación de espectros. El derivado de Globo H, así como sus formas de pérdida neutra se eligieron como modificación variable para identificación de sitios de conjugación de Globo H, y el derivado de MMCCH, así como su forma desamidada se eligió como modificación variable para identificación de sitios de conjugación de MMCCH. La búsqueda en bases de datos se realizó frente a la secuencia de KLH1 y KLH2

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto que comprende la estructura:
Figure imgf000035_0001
en donde
n es independientemente un número entero de 1 a 1500, m es independientemente un número entero de 1 a 10,
en donde cada una de las fracciones Globo H está covalentemente unida a la fracción KLH en un residuo de aminoácido básico,
en donde el compuesto tiene una proporción de epítopo que varía de 750 a 3000, y
en donde la fracción KLH es una fracción KLH tiolada que se almacena en gas inerte hasta su conjugación con las fracciones Globo H.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde
- m es 1 y n es de 1 a 150,
- m es 2 y n es de 1 a 300,
- m es 3 y n es de 1 a 450,
- m es 4 y n es de 1 a 600,
- m es 5 y n es de 1 a 750,
- m es 6 y n es de 1 a 900,
- m es 7 y n es de 1 a 1050,
- m es 8 y n es de 1 a 1200,
- m es 9 y n es de 1 a 1350, o
- m es 10 y n es de 1 a 1500.
3. El compuesto de la reivindicación 1, en donde
la proporción del número de fracciones Globo H respecto a las fracciones KLH es desde 1:1 a 150:1 expresado como el número de moléculas de Globo H respecto a una fracción KLH monomérica, el número de fracciones Globo H es desde 1 a 150, expresado como el número de moléculas de Globo H respecto a una fracción KLH monomérica,
el número de fracciones Globo H es desde 1 a 300, expresado como el número de moléculas de Globo H respecto a una fracción KLH dimérica,
el número de fracciones Globo H es desde 1 a 450, expresado como el número de moléculas de Globo H respecto a una fracción KLH trimérica,
el número de fracciones Globo H es desde 1 a 600, expresado como el número de moléculas de Globo H respecto a una fracción KLH tetramérica, o
el número de fracciones Globo H es desde 1 a 750, expresado como el número de moléculas de Globo H respecto a una fracción KLH pentamérica.
4. Una composición farmacéutica que comprende: un compuesto que comprende la estructura:
Figure imgf000035_0002
en donde
n es independientemente un número entero de 1 a aproximadamente 1500, m es independientemente un número entero de 1 a 10,
y opcionalmente un soporte farmacéuticamente aceptable,
en donde cada una de las fracciones Globo H está covalentemente unida a la fracción KLH en un residuo de aminoácido básico,
en donde el compuesto tiene una proporción de epítopo que varía de 750 a 3000, y
en donde la fracción KLH es una fracción KLH tiolada que se almacena en gas inerte hasta su conjugación con las fracciones Globo H.
5. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, en donde
- m es 1 y n es de 1 a 150,
- m es 2 y n es de 1 a 300,
- m es 3 y n es de 1 a 450,
- m es 4 y n es de 1 a 600,
- m es 5 y n es de 1 a 750,
- m es 6 y n es de 1 a 900,
- m es 7 y n es de 1 a 1050,
- m es 8 y n es de 1 a 1200,
- m es 9 y n es de 1 a 1350, o
- m es 10 y n es de 1 a 1500.
6. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, en donde
el número de fracciones Globo H respecto a subunidades de fracción KLH es desde 1:1 a 150:1 expresado como el número de moléculas de Globo H respecto a una fracción KLH monomérica,
el número de fracciones Globo H respecto a subunidades de fracción KLH es desde 1:1 a 300:1 expresado como el número de moléculas de Globo H respecto a una fracción KLH dimérica,
el número de fracciones Globo H respecto a subunidades de fracción KLH es desde 1:1 a 450:1 expresado como el número de moléculas de Globo H respecto a una fracción KLH trimérica,
el número de fracciones Globo H respecto a subunidades de fracción KLH es desde 1:1 a 600:1 expresado como el número de moléculas de Globo H respecto a una fracción KLH tetramérica, o
el número de fracciones Globo H respecto a subunidades de fracción KLH es desde 1:1 a 750:1 expresado como el número de moléculas de Globo H respecto a una fracción KLH pentamérica
7. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, en donde el compuesto comprende monómeros, dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros o combinaciones de los mismos de la fracción KLH.
8. La composición farmacéutica de la reivindicación 7, en donde
- del 1% al 99% de los conjugados terapéuticos en la composición farmacéutica son monómeros, - del 1% al 99% de los conjugados terapéuticos en la composición farmacéutica son dímeros,
- del 1% al 99% de los conjugados terapéuticos en la composición farmacéutica son trímeros,
- del 1% al 99% de los conjugados terapéuticos en la composición farmacéutica son tetrámeros,
- del 1% al 99% de los conjugados terapéuticos en la composición farmacéutica son pentámeros, o - del 1% al 99% de las fracciones KLH en la composición son monómeros, dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros o combinaciones de los mismos.
9. La composición farmacéutica de la reivindicación 7, que además comprende
- un adyuvante, en donde el adyuvante es adyuvante de Freund completo e incompleto, moléculas de receptores tipo Toll, LPS, lipoproteínas, lipopéptidos, flagelina, ARN bicatenario, ADN vírico, islas CpG sin metilar, levamisol, bacilo de Calmette-Guerin, isoprinosina, zadaxin, antagonistas de PD-1, anticuerpos contra PD-1, antagonistas de CTLA, anticuerpos contra CTLA, interleuquina, citoquinas, GM-CSF, basado en sal de aluminio, fosfato de aluminio, alumbre, hidróxido de aluminio, liposomas, agonistas de TLR2, nanopartículas, monofosforil lípido A, una saponina OBI-821, nanoemulsiones de aceite en agua, y partículas similares a bacterias,
- una citoquina seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-12, IL-18, IFN-y, TNF, IL-4, IL-10, IL-13, IL-21, GM-CSF y TGF-p,
- una quimioquina, o
- un agente seleccionado del grupo que consiste en agentes terapéuticos hormonales, terapia de anticuerpos monoclonales, quimioterapia, moduladores de receptor retinoide, agentes citotóxicos/citostáticos, agentes antineoplásicos, agentes antiproliferativos, inhibidores de prenil-proteína transferasa, inhibidores de HMG-CoA reductasa, mostazas de nitrógeno, nitrosoureas, inhibidores de angiogénesis, inhibidores de la ruta de señalización de proliferación y supervivencia celular, agentes inductores de apoptosis, agentes que interfieren con puntos de control del ciclo celular, agentes que interfieren con receptores tirosinas quinasas (RTK), inhibidores de diana de rapamicina de mamífero (mTOR), inhibidores del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2), inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), bloqueantes de integrinas, AINE, agonistas de PPAR, inhibidores de multirresistencia a fármacos (MDR) inherente, agentes antieméticos, agentes útiles en el tratamiento de anemia, agentes útiles en el tratamiento de neutropenia, fármacos de potenciación inmunológica, bifosfonatos, inhibidores de aromatasas, agentes que inducen diferenciación terminal de células neoplásicas, inhibidores de ysecretasa, vacunas contra el cáncer, inhibidores de PD-1/PD-L1, inmunoterapia de CTLA-4, terapia diana seleccionada de inhibidores de CDK4/6, inhibidores de PI3K, inhibidores de AKT, inhibidores Pan-Her, y cualquier combinación de los mismos.
10. La composición farmacéutica de la reivindicación 7, que además comprende un soporte farmacéuticamente aceptable.
11. La composición farmacéutica de la reivindicación 10, en donde la composición farmacéutica es una vacuna para el cáncer.
12. La composición farmacéutica de la reivindicación 7, formulada para inyección subcutánea, administración intravenosa o administración intramuscular.
13. La composición farmacéutica de la reivindicación 7 para uso en un método de tratar cáncer en un paciente con una dosis eficaz, dicho cáncer se selecciona de cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer bucal, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer nasofaríngeo, cáncer dérmico, cáncer renal, tumor cerebral, cáncer de próstata, cáncer ovárico, cáncer cervical, cáncer endometrial, cáncer intestinal, cáncer pancreático, o cáncer de vejiga.
14. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 13, en donde la dosis eficaz es desde 0,001 pg/kg a 250 g/kg de peso corporal del paciente.
15. La composición farmacéutica de la reivindicación 7 para uso en un método de inducir anticuerpos en un animal o un ser humano para el fin de crear anticuerpos monoclonales para usos diagnósticos o terapéuticos.
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