ES2915384T3

ES2915384T3 - Materiales de seda con memoria de forma

Info

Publication number: ES2915384T3
Application number: ES16727252T
Authority: ES
Inventors: David Kaplan; Fiorenzo Omenetto; Joseph E Brown; Rodrigo Jose
Original assignee: Tufts University
Current assignee: Tufts University
Priority date: 2015-03-12
Filing date: 2016-03-11
Publication date: 2022-06-22
Anticipated expiration: 2036-03-11
Also published as: EP3268381B1; EP4116318A1; EP3268381A1; JP2018511677A; WO2016145281A1; US10874742B2; CA2979507A1; US20210177977A1; KR20170126470A; KR102625116B1; BR112017019389A2; US20180050109A1

Abstract

Material de seda comprendiendo un plastificante y presentando una estructura caracterizada por una ausencia sustancial de cristales de hielo y: poros interconectados y uniformemente espaciados que presentan una morfología redondeada; una uniformidad sustancial de forma de poro; o sus combinaciones donde los poros dentro del material de seda se forman enfriando una solución de fibroína de seda a una velocidad de enfriamiento de entre -10 °C/min y -0,001 °C/min hasta una temperatura de congelación inferior o igual a - 20 °C, cuyo material de seda: a) es sensible a compresión en un estado comprimido de volumen reducido con respecto al volumen inicial del material antes de la compresión; y b) se caracteriza por una capacidad, en respuesta a un activador ambiental, de expandirse desde el estado comprimido hasta un estado expandido presentando un volumen expandido comparable con el volumen inicial.

Description

DESCRIPCIÓN

Materiales de seda con memoria de forma

REFERENCIA CRUZADA RELACIONADA CON LAS APLICACIONES

[0001] Esta solicitud de patente reivindica los beneficios de prioridad de la solicitud provisional de patente estadounidense con número de serie 62/132, 429 presentada el 12 de marzo de 2015, cuyo título es “Materiales con memoria de forma de seda”.

APOYO DEL GOBIERNO

[0002] Esta invención se ha realizado con el apoyo del gobierno a través de la subvención EB002520 concedida por Institutos Nacionales de la Salud y la subvención W81XWH-14-2-0004 concedida por el ejército de Estados Unidos. El gobierno tiene ciertos derechos sobre esta invención.

ANTECEDENTES

[0003] Los polímeros sensibles a los estímulos son una subclase de materiales inteligentes que pueden recuperarse de una forma deformada y volver a su forma original predefinida en presencia de estímulos externos. Los materiales que exhiben este comportamiento suelen denominarse polímeros con memoria de forma (SMP, por sus siglas en inglés). W o 2010/057142 A2 describe matrices de fibroína de seda con péptidos en la superficie para su uso en aplicaciones biomédicas, como materiales antiadhesivos y antitrombosis. WO 2010/042798 A2 describe láminas de fibroína de seda que comprenden fibroína de seda y glicerol.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0004] Entre otros aspectos, la presente divulgación proporciona materiales a base de fibroína de seda que contienen propiedades de memoria de forma, según la reivindicación 1. La presente divulgación proporciona métodos para hacer y utilizar tales materiales a base de fibroína de seda, según las reivindicaciones 12 y 16.

[0005] Las implementaciones de la presente divulgación son útiles para un gran rango de aplicaciones, incluyendo, pero no limitadas a: biomateriales, dispositivos biomédicos, biosensores, aplicaciones de liberación controlada, administración de fármacos, sistemas electrónicos, materiales para degradación ajustable, óptica, fotónica, prótesis, medicina regenerativa, robótica, aplicaciones de ingeniería de tejidos, regeneración de tejidos, andamios tisulares y coagulación de heridas.

[0006] Los materiales a base de fibroína de seda proporcionados, en algunas formas de realización, ofrecen específicamente posibilidades para una multitud de usos únicos como rellenos, materiales de embalaje, sensores y para gama de diferentes dispositivos. Los materiales a base de fibroína de seda proporcionados son, por ejemplo, útiles como dispositivos biomédicos implantables. Los materiales a base de fibroína de seda proporcionados pueden comprimirse y se pueden introducir en un dispositivo de inserción para su implementación in vivo. Una vez implantados, tales materiales pueden expandirse, por ejemplo, mediante un activador y estímulos externos, En algunas formas de realización, tales materiales, al expandirse recuperan sustancialmente su forma original Los dispositivos biomédicos compuestos por dichos materiales, por ejemplo, pueden implantarse mediante una técnica mínimamente invasiva. Tales técnicas de implantación mínimamente invasiva son a menudo preferibles a las cirugías complejas y altamente invasivas y/o procedimientos médicos.

[0007] Los materiales a base de fibroína de seda proporcionados son susceptibles a la compresión (p. ej. materiales que se caracterizan en que pueden adoptar al menos dos estados diferentes - un estado precomprimido y un estado comprimido - y en algunas formas de realización al menos tres estados diferentes - un estado precomprimido, un estado comprimido y un estado expandido el cual, en algunas formas de realización, será sustancialmente idéntico al estado precomprimido). La compresión reduce el volumen de un material en relación con su volumen inicial previo a la compresión. Además, en algunas formas de realización, la compresión provoca una deformación de la forma. Por consiguiente, los materiales a base de fibroína de seda comprimidos tal y como se describen en el presente documento tienen un volumen menor y opcionalmente una forma deformada en relación con un material idéntico que no ha sido sometido a compresión.

[0008] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda tal y como se describe en el presente documento se caracterizan en que cuando están en su estado comprimido, retienen su volumen reducido y/o forma deformada hasta que se exponen a un activador y/o a estímulos externos.

[0009] Cuando se exponen a un activador y/o a estímulos externos, los materiales a base de fibroína de seda comprimidos se recuperarán hasta alcanzar un volumen sustancialmente idéntico al que tenían antes de la compresión.

[0010] Cuando se exponen a un activador y/o a estímulos externos, los materiales a base de fibroína de seda comprimidos se caracterizan por una expansión volumétrica a partir de su estado comprimido. En algunas formas de realización, cuando se exponen a un activador y/o a estímulos externos, los materiales a base de fibroína de seda comprimidos se hinchan.

[0011] En algunas formas de realización, un activador y/o estímulos externos se compone de o consiste en, por ejemplo: calor, campos eléctricos o magnéticos, pH, luz, presión, agua, iones, enzimas o azúcar, y combinaciones de estas. En algunas formas de realización, un activador y/o estímulos externos se compone de o consiste en, por ejemplo, la exposición de los materiales a base de fibroína de seda a un medio acuoso, como agua, solución salina tamponada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés), o un medio de cultivo celular, como el medio de Eagle modificado por Dubecco (DMEM, por sus siglas en ingles), suero fetal bovino, fluidos corporales; o combinaciones de estos.

[0012] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda están formados por fibroínas de seda producidas a partir de sedas de varios insectos, incluyendo gusanos de seda.

[0013] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados se caracterizan en que incluyen fibroína de seda dentro de un rango de peso molecular determinado, de modo que los materiales tal y como se describen en el presente documento presenten una o más características deseables. En algunas formas de realización, las tecnologías proporcionadas para seleccionar, diseñar y/o producir materiales a base de fibroína de seda tal y como se describen en el presente documento incluyen selección, diseño y/o producción de tales fibroínas de seda dentro de un rango de peso molecular particular, para que se proporciones los materiales que presenten una o más características deseadas (p. ej. deseadas predeterminadas).

[0014] Por ejemplo, en algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda son o compuestos de fibroína de seda y/o fragmentos de fibroína de seda. En algunas formas de realización, se puede utilizar fibroína de seda y/o fragmentos de fibroína de seda de varios pesos moleculares. En algunas formas de realización, la fibroína de seda y/o fragmentos de fibroína de seda de varios pesos moleculares son o constan de polipéptidos de fibroína de seda. En algunas formas de realización, un peso molecular medio de polipéptidos de fibroína de seda es, por ejemplo, entre aproximadamente 3kDa y aproximadamente 400 kDa.

[0015] En algunas formas de realización, las preparaciones de polipéptidos de fibroína de seda dentro de un rango de peso molecular particular pueden preparase mediante un tratamiento térmico (p. ej. por ebullición). En algunas formas de realización, dicho tratamiento térmico se aplica durante un periodo de tiempo determinado, por ejemplo, dentro de un rango de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 120 minutos o más tiempo. Se ha establecido una relación entre el tiempo de ebullición y el peso molecular de la fibroína de seda para soluciones acuosas de fibroína de seda; por lo tanto, los expertos en la técnica son capaces de preparar polipéptidos de fibroína de seda dentro de un rango de peso molecular de interés para preparar los materiales a base de fibroína de seda tal y como se describe en el presente documento.

[0016] En algunas formas de realización, la fibroína de seda se procesa a partir de soluciones acuosas de seda.

[0017] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda procesados a partir de soluciones acuosas de seda han mostrado características favorables, incluyendo, por ejemplo: propiedades mecánicas, eléctricas y ópticas deseables, estabilidad ambiental, biocompatibilidad y degradación ajustable.

[0018] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda se procesan a partir de soluciones de seda (p. ej. soluciones acuosas) que contienen una concentración de solución de seda entre aproximadamente 1% de seda a aproximadamente 50% de seda.

[0019] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda se procesan a partir de soluciones de seda (p. ej. soluciones acuosas) para formar formatos de materiales variados como fibras, espumas, partículas, láminas y/o hidrogeles.

[0020] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda se componen de seda modificada.

[0021] En algunas formas de realización, la seda modificada se diferencia de la seda no modificada por la adición de una o más partes colgantes (p. ej. a un grupo R de un aminoácido), inclusión de uno o más aminoácidos no naturales, asociación con (p. ej. la unión covalente a) una o más partes como péptido, lípido, carbohidrato, ácido nucleico, molécula pequeña, metal, etc.

[0022] En algunas formas de realización, la seda modificada se diferencia de la seda no modificada porque un aditivo, agente y/o porción funcional reacciona con seda en una solución de seda durante la fabricación de materiales a base de fibroína de seda. En algunas formas de realización, la seda modificada se diferencia de la seda no modificada porque un aditivo, agente y/o porción funcional se mezcla con una solución de seda durante la fabricación de materiales a base de fibroína de seda. En algunas formas de realización, la seda modificada se diferencia de la seda no modificada porque un aditivo, agente y/o porción funcional se mezcla con, añade a, aplica a un material a base de fibroína de seda. En algunas formas de realización, la seda modificada se diferencia de la seda no modificada porque un aditivo, agente y/o porción funcional reacciona con seda den un material a base de fibroína de seda.

[0023] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda que constan de dichas sedas modificadas se caracterizan por las propiedades únicas de hinchamiento de los materiales a base de fibroína de seda, p. ej., tal y como se describe en el presente documento. En algunas formas de realización, la seda modificada muestra una mayor hidrofilia en relación con la seda no modificada. En algunas formas de realización, la seda modificada muestra una mayor capacidad para absorber agua en relación con la seda no modificada.

[0024] En algunas formas de realización, por ejemplo, una seda modificada se diferencia de una seda natural debido a la modificación por ácido 4-sulfónico. En algunas formas de realización, una seda modificada se modifica con polilisina (p. ej., es un péptido de fusión que consta de una porción de polilisina y una porción de fibroína de seda). En algunas formas de realización, una seda modificada es pegilada. Se describen otros plastificantes ejemplares a lo largo de la presente solicitud.

0025] En algunas formas de realización, la seda modificada muestra una mayor hidrofobicidad en relación con la seda no modificada. En algunas formas de realización, la seda modificada muestra que puede ser capaz de aumentar la absorción de fluidos no polares (p. ej., aceites o grasas) en materiales de seda.

[0026] En algunas formas de realización, una seda modificada se modifica con 4-(heptiloxi)anilina. En algunas formas de realización, una seda modificada se modifica con 4'-aminoacetofenona. Se describen otros plastificantes ejemplares a lo largo de la presente solicitud.

[0027] En algunas formas de realización, una base de fibroína de seda modificada consta de uno o más residuos de aminoácidos modificados. En algunas formas de realización, un residuo de aminoácido modificado es un residuo de tirosina modificado. En algunas formas de realización, un residuo de tirosina modificado se modifica covalentemente (p. ej., mediante la adición de uno o más grupos colgantes).

[0028] En algunas formas de realización, entre aproximadamente 5% y aproximadamente 75% de la fibroína de seda en un material a base de fibroína de seda es o consta de seda modificada, tal y como se describe en el presente documento.

[0029] Los materiales a base de fibroína de seda proporcionados incluyen un plastificante.

[0030] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda que incluyen un plastificante mejoran ciertas propiedades de dichos materiales en relación con otros materiales idénticos que carecen del plastificante. En algunas formas de realización, los plastificantes aumentan la cristalinidad de los materiales a base de fibroína de seda.

[0031] En algunas formas de realización, los plastificantes pueden ser o constar de, por ejemplo, glicerol, 1,2 Propanodiol, 1,3 Propanodiol, 1,4 Butanodiol, 1,2,2 Butanotriol, Treitol, Eritritol, 1,2 Pentanodiol, 1,5 Pentanodiol, Adonitol, 1,2,6 Hexanotriol, azucares como glucosa, sorbitol o manitol, o combinaciones de estos. Se describen otros plastificantes ejemplares a lo largo de la presente solicitud.

[0032] En algunas formas de realización, los plastificantes no son tóxicos. En algunas formas de realización, los plastificantes no tóxicos preservan la biocompatibilidad de los materiales a base de fibroína de seda.

[0033] En algunas formas de realización, la relación entre el plastificante y la seda está entre, aproximadamente, el 1% y el 75% del plastificante y la seda. En algunas formas de realización, la relación de peso entre el plastificante y la seda está entre, aproximadamente, 0,05 y, aproximadamente, 0,8.

[0034] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda son insolubles en agua. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda que presentan al menos 20% del plastificante son insolubles en agua. En algunas formas de realización, se tratan los materiales a base de fibroína de seda para inducir insolubilidad. En algunas formas de realización, se sumergen en metanol los materiales a base de fibroína de seda proporcionados. En algunas formas de realización, tales materiales a base de fibroína de seda tratados con metanol son insolubles en agua.

[0035] En algunas formas de realización, cuando se incorporan a los materiales a base de fibroína de seda, los plastificantes de distinta composición molecular producen materiales a base de fibra de seda con diversas características de poros y/o diversas propiedades. En algunas formas de realización, las propiedades incluyen, por ejemplo, propiedades mecánicas, ópticas y/o eléctricas.

[0036] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda se caracterizan por sus rasgos únicos que proporcionan ventajas sobre los polímeros con memoria de forma ya existentes. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda que incluyen un plastificante y seda que es o consta de seda modificada muestran propiedades de hinchamiento únicas tal y como se describe en el presente documento.

[0037] En algunas formas de realización, cuando se exponen a un activador y/o estímulos externos, los materiales a base de fibroína de seda comprimidos muestran hinchamiento volumétrico de al menos dos veces el del estado comprimido del material. En algunas formas de realización, cuando se exponen a un activador y/o estímulos externos, los materiales a base de fibroína de seda comprimidos que incluyen un plastificante muestran un hinchamiento volumétrico de hasta aproximadamente 50 veces el del estado comprimido del material.

[0038] En algunas formas de realización, cuando se exponen a un activador y/o estímulos externos (p. ej., un medio acuoso), los materiales a base de fibroína de seda comprimidos muestran presentan un hinchamiento por masa de al menos un 400% con respecto al estado comprimido de los materiales. En algunas formas de realización, cuando se exponen a un activador y/o estímulos externos (p. ej., un medio acuoso), los materiales a base de fibroína de seda comprimidos que incluyen un plastificante muestran un hinchamiento por masa de hasta aproximadamente 900% con respecto al estado comprimido de los materiales.

[0039] Los materiales a base de fibroína de seda proporcionados tienen una estructura que incluye células abiertas que son o se describen como poros.

[0040] Los materiales a base de fibroína de seda proporcionados se caracterizan por una falta sustancial de cristales de hielo.

[0041] En algunas formas de realización, los poros de los materiales a base de fibroína de seda se caracterizan por una forma uniforme sustancialmente redondeada. En algunas formas de realización, los poros de los materiales a base de fibroína de seda están espaciados uniformemente a lo largo de un volumen. En algunas formas de realización, los poros de los materiales a base de fibroína de seda son poros interconectados que atraviesan el material a granel; en algunas formas de realización, tales poros interconectados atraviesan el material a granel.

[0042] En algunas formas de realización, los poros de los materiales a base de fibroína de seda presentan un diámetro medio de entre aproximadamente 5pm y aproximadamente 500|jm.

[0043] En algunas formas de realización, tal y como se describe en el presente documento, los materiales a base de fibroína de seda se caracterizan en que se recuperan sustancialmente después de la compresión. En algunas formas de realización, el tamaño medio de los poros de los materiales a base de fibroína de seda proporcionados no se ve afectado por la compresión o expansión, en que el tamaño medio de los poros es sustancialmente idéntico después de recuperase de la compresión y/o expansión en relación con el tamaño de los poros de su estado precomprimido. En algunas formas de realización, la morfología de los poros de los materiales a base de fibroína de seda proporcionados no se ve comprometida por la compresión o expansión, en que uno o más de los rasgos que caracterizan la morfología de los poros de los materiales es sustancialmente idéntica después de recuperarse de la compresión y/o expansión en relación con su estado precomprimido.

[0044] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados se caracterizan por un valor del módulo elástico en un rango de entre aproximadamente 1 kPa y aproximadamente 2500 kPa.

[0045] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados se caracterizan por un valor del módulo de compresión en un rango de entre aproximadamente 500 Pa y aproximadamente 3000 kPa.

[0046] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados se caracterizan por un valor del módulo de almacenaje en un rango de entre aproximadamente 1kPa y aproximadamente 3000 kPa.

[0047] En algunas formas de realización, tal y como se describe en el presente documento, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados se caracterizan en que, cuando se exponen a una tensión de compresión, recuperan sustancialmente su volumen y/o forma.

[0048] En algunas formas de realización, cuando se exponen a una tensión de compresión de hasta el 90%, los materiales a base de fibroína de seda se comprimen hasta aproximadamente un 10% o menos de su volumen original. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda comprimidos proporcionados se caracterizan, además, en que, cuando se exponen a un activador y/o estímulos externos, recuperan sustancialmente su volumen y/o forma. En algunas formas de realización, los materiales recuperados carecen sustancialmente de cualquier indicación de una deformación plástica.

[0049] En algunas formas de realización, cuando los materiales a base de fibroína de seda proporcionados se exponen a una tensión de compresión de hasta aproximadamente 100 kPa, tales materiales se caracterizan además en que cuando se exponen a un activador y/o a estímulos externos, recuperan sustancialmente su volumen y/o forma. En algunas formas de realización, los materiales recuperados carecen sustancialmente de cualquier indicación de deformación plástica.

[0050] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda son biocompatibles.

[0051] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda incluyen aditivos, agentes y/o porciones funcionales. En algunas formas de realización, los aditivos, agentes y/o porciones funcionales incluyen, por ejemplo, agentes terapéuticos, células, organismo, anticuerpos, ácidos nucleicos, factor de crecimiento, hormonas, polipéptidos y/o agentes activos óptica o eléctricamente. En algunas formas de realización, los aditivos, agentes y/o porciones funcionales incluyen, por ejemplo: antibióticos, moléculas pequeñas, enzimas, inhibidores de enzimas, antiinflamatorios y/o fármacos.

[0052] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda se precargan con aditivos, agentes y/o porciones funcionales durante la fabricación del material. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda absorben aditivos, agentes y/o porciones funcionales cuando el material está en un estado precomprimido. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda absorben aditivos, agentes y/o porciones funcionales cuando el material está en estado expandido. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda absorben aditivos, agentes y/o porciones funcionales cuando el material se recupera de la compresión y/o expansión.

[0053] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda son biodegradables.

[0054] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda se caracterizan en que dichos materiales se descomponen, degradan, delaminan o disuelven. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda se caracterizan en que dichos materiales se descomponen, degradan, delaminan o disuelven para liberar un aditivo, agente y/o porción funcional.

[0055] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda se introducen in vivo.

[0056] En algunas formas de realización, cuando están en un estado comprimido, los materiales a base de fibroína de seda se implantan in vivo, tal y como se describe en el presente documento. En algunas formas de realización, tales materiales a base de fibroína de seda se introducen en un dispositivo de implantación (p. ej., plantados in vivo). En algunas formas de realización, tales materiales a base de fibroína de seda se introducen en un dispositivo de implantación (p. ej., una agua o cánula) cuando dichos materiales están en un estado comprimido. En algunas formas de realización, cuando se exponen a un activador y/o a estímulos externos, los materiales a base de fibroína de seda implantados se caracterizan, además, en que se hinchan para llenar un espacio en el cuerpo. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda con características de memoria de forma permiten comprimirse para encajar en un dispositivo de inserción y, posteriormente, expandirse mediante un activador, como un activador fisiológico, para que vuelvan a tener la forma original; mientras apoyan los requisitos de regeneración del tejido.

[0057] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados permiten infiltración celular. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda se caracterizan en que se infiltran cuando están presentes in vivo.

[0058] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda se descomponen, degradan, delaminan o disuelven cuando están presentes in vivo. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda se descomponen, degradan, delaminan o disuelven sin respuesta inmunológica significativa cuando están presentes in vivo. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda muestran una cinética de degradación predecible. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda se reabsorben in vivo y se sustituyen por tejidos naturales.

[0059] En algunas formas de realización, la presente divulgación proporciona métodos de fabricación de materiales a base de fibroína de seda como se proporciona en el presente documento.

[0060] En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen el suministro de una solución de seda. En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación comprenden la ebullición de seda en Na2CO3 durante entre, aproximadamente, 5 minutos y, aproximadamente, 90 minutos. En algunas formas de realización, las fibras de seda se solubilizaron en bromuro de litio (LiBr) y después se dializaron contra agua para obtener un polímero de peso molecular de entre aproximadamente 3,5 kDa y aproximadamente 400 kDa.

[0061] En algunas formas de realización, los métodos suministro, preparación y/o fabricación de materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen proporcionar una solución de seda con una concentración de seda de entre 0,1% y 50%.

[0062] En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen el suministro de una solución de fibroína de seda comprimida de seda modificada. En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen la modificación de una solución de fibroína de seda o la modificación de un material a base de fibroína de seda.

[0063] En algunas formas de realización, los métodos de modificación de una solución de fibroína de seda o modificación de un material a base de fibroína de seda incluyen añadir, mezclar y/o aplicar un aditivo, agente y/o porción funcional a una solución de seda o a un material a base de fibroína de seda. En algunas formas de realización, los métodos de modificación de una solución de fibroína de seda o modificación de un material a base de fibroína de seda incluyen la reacción de un aditivo, agente y/o porción funcional con una solución de seda o material a base de fibroína de seda.

[0064] En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen el suministro de una solución de fibroína de seda (p. ej., una solución acuosa de fibroína de seda) o un material a base de fibroína de seda y modificación de los residuos de aminoácido mediante una modificación de ácido sulfónico. En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen el suministro de una solución de fibroína de seda o un material a base de fibroína de seda y modificación mediante una modificación de polilisina. En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen el suministro de una solución de fibroína de seda o de un material a base de fibroína de seda y modificación de residuos de tirosina a través de una reacción de acoplamiento diazoico. En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen el suministro de una solución de fibroína de seda o de un material a base de fibroína de seda y modificación con 4-(heptiloxi)-anilina. En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen el suministro de una solución de fibroína de seda o de un material a base de fibroína de seda y modificación con 4'-aminoacetofenona.

[0065] En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen la preparación y/o suministro de una solución de fibroína de seda que consta de entre, aproximadamente, 1% y, aproximadamente, 75% de seda modificada (p. ej., en algunas formas de realización, los residuos de tirosina se modifican covalentemente mediante la adición de uno o más grupos colgantes). En algunas formas de realización, la preparación y/o suministro de tal solución consta de una mezcla de una solución de seda comprimida de seda modificada con una solución de seda no modificada.

[0066] En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen la mezcla de una solución de seda con un plastificante. En algunas formas de realización, la mezcla de una solución de seda y un plastificante produce una solución de seda que presenta una relación de peso entre el plastificante y la seda de entre, aproximadamente, 5% y, aproximadamente, 80%.

[0067] En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen la liofilización de una solución de fibroína de seda que consta de un plastificante, tal y como se describe en el presente documento.

[0068] En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen el suministro de un recipiente para mantener una solución de fibroína de seda durante la liofilización. En algunas formas de realización, tal recipiente posee una geometría optimizada de forma que un volumen de la solución de seda se congele de forma uniforme durante la liofilización. En algunas formas de realización, tal recipiente se caracteriza en que es conductor térmico. En algunas formas de realización, un recipiente conductor térmico se caracteriza por una conductividad térmica que es equivalente a o superior a: 167 W/m-K (métrico) o 1160 BTU-in/hr-ft2-°F (inglés). en algunas formas de realización, por ejemplo, tal recipiente está hecho de: alúmina, aluminio, berilio, latón, cobre, oro, hierro, plata, tungsteno y/o zinc.

[0069] En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen la congelación o liofilización de una solución acuosa de seda a una temperatura objetivo. Una temperatura objetivo es al menos inferior a la temperatura de transición vítrea de la seda. En algunas formas de realización, una temperatura objetivo es de entre, aproximadamente, -20 °C y, aproximadamente, -50 °C.

[0070] En algunas formas de realización, la congelación o liofilización de una solución de seda acuosa incluye la liofilización controlada durante un periodo de tiempo y/o la congelación lenta.

[0071] La liofilización controlada durante un periodo de tiempo y/o la congelación lenta de una solución de seda incluye el enfriamiento de una solución de fibroína de seda a una velocidad (°C/min). En algunas formas de realización, la liofilización controlada durante un periodo de tiempo y/o la congelación lenta de una solución de fibroína de seda se produce a una velocidad de enfriamiento más lenta en relación con una congelación rápida, que se define como colocar directamente un contenedor de muestras en un congelador que ya está a una temperatura objetivo. En algunas formas de realización, los métodos proporcionados constan de liofilización controlada durante un periodo de tiempo y/o congelación a una velocidad de manera que las soluciones de seda alcancen la temperatura en un periodo entre, aproximadamente, 5 horas y, aproximadamente, 25 horas.

[0072] Los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen liofilización controlada durante un periodo de tiempo y/o congelación lenta de una solución de fibroína de seda a una velocidad de entre, aproximadamente, -10 °C/min a, aproximadamente, -0,001 °C/min. En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen liofilización controlada durante un periodo de tiempo y/o congelación lenta de una solución de fibroína de seda a una velocidad de entre, aproximadamente, -0,1 °C/min a, aproximadamente, -0,01 °C/min.

[0073] En algunas formas de realización, cada velocidad diferente produce un material a base de fibroína de seda que presenta una estructura ligeramente distinta con respecto al tamaño de los poros, forma de los poros, estructura secundaria de las proteínas y/o combinaciones de estos. Sin querer limitarse a una teoría, la liofilización controlada durante un periodo de tiempo y/o la congelación lenta afecta a la porosidad y cinética de hinchamiento de un material a base de fibroína de seda.

[0074] En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de materiales a base de fibroma de seda de la presente divulgación incluyen liofilización controlada durante un periodo de tiempo y/o congelación lenta de una solución de fibroína de seda a una velocidad fija, a una velocidad variada o a un perfil de temperatura que incluye combinaciones de estas.

[0075] En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen el tratamiento de materiales a base de fibroína de seda con metanol. En algunas formas de realización, un paso de tratamiento consiste en sumergir en metanol los materiales a base de fibroína de seda proporcionados. En algunas formas de realización, el tratamiento de los materiales a base de fibroína de seda con metanol da lugar a un material a base de fibroína de seda insoluble en agua.

[0076] En algunas formas de realización, los métodos de la presente divulgación comprenden la compresión de materiales a base de fibroína de seda proporcionados hasta un estado comprimido y/o forma deformada. En algunas formas de realización, los métodos de la presente divulgación comprenden el hinchamiento de los materiales a base de fibroína de seda proporcionados hasta un estado expandido.

[0077] En algunas formas de realización, los métodos de la presente divulgación comprenden la activación de la recuperación de un material a base de fibroína de seda de un estado comprimido, de manera que un material a base de fibroína de seda vuelva sustancialmente a su forma original. En algunas formas de realización, los métodos de la presente divulgación incluyen la activación de la recuperación, de manera que un material vuelva sustancialmente a su volumen original.

[0078] En algunas formas de realización, los métodos de la presente divulgación incluyen la activación de la recuperación, de manera que un material vuelva sustancialmente a su volumen original. En algunas formas de realización, los métodos de la presente divulgación incluyen la activación de la recuperación de un material a base de fibroína de seda comprimido de manera que se hinche y expanda rápidamente entre, aproximadamente, dos veces y, aproximadamente, 50 veces el volumen comprimido. En algunas formas de realización, los métodos de la presente divulgación incluyen la activación de la recuperación de un material a base de fibroína de seda comprimido de manera que se hinche y expanda en masa rápidamente hasta, al menos, aproximadamente, 400% con respecto al estado comprimido. En algunas formas de realización, cuando se exponen a un activador y/o a estímulos externos, incluyendo exposición a medio acuoso, los materiales a base de fibroína de seda muestran un hinchamiento de hasta, aproximadamente, 900% con respecto al estado comprimido.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0079] Los objetos anteriores y otros objetos, aspectos, características y ventajas se harán más evidentes y se entenderán mejor al referirse a la siguiente descripción tomada en conjunción con las figuras adjuntas en las que:

La FIG. 1 muestra una espuma de polímero con memoria de forma (SMP) termosensible sometida a una deformación inducida térmicamente. La forma permanente del material puede deformarse calentando por encima de su temperatura de transición térmica (Ttr) y aplicando una tensión de compresión. Al enfriarse por debajo de la temperatura de transición térmica, el material puede bloquear en su forma temporal. Calentar otra vez por encima de la temperatura de transición térmica puede permitir al material recuperar su forma original. Los materiales tienen una geometría inicial establecida (la forma permanente) que puede deformarse mediante una fuerza externa bajo condiciones de activación (p. ej., a o por encima de una temperatura de transición, en la presencia de un solvente, etc.). Tras la deformación, el material existe en una forma temporal. En este ejemplo, el material se ha comprimido. La recuperación activada se inicia una vez que se han recapitulado los estímulos iniciales (temperatura, solvente). El material recupera su forma original o volumen después de que este estímulo dé lugar a la forma recuperada.

La FIG. 2 muestra un almacenamiento del módulo de las espumas que provienen de la seda hervida durante 10 minutos en comparación con 20 minutos. El tiempo de cocción de los capullos tiene un impacto en el peso molecular de la fibroína purificada. Los tiempos de ebullición más cortos dan lugar a un mayor peso molecular. Las espumas que contienen 10 % (p/p) de glicerol o menos, la fibroína de mayor peso molecular incurre en un módulo de almacenamiento significativamente mayor en comparación con la fibroína de menor peso molecular. Esto se puede utilizar para crear espumas con propiedades mecánicas específicas adaptadas a la regeneración de diversos tejidos o aplicaciones terapéuticas.

La FIG. 3 muestra distintos aditivos de poliol que actúan como plastificantes en las espumas de seda, confiriendo memoria de forma y características elastoméricas. La FIG. 3 en el panel (A) muestra una lista abreviada de los aditivos de poliol, separados por número de carbono por moléculas, por espumas de seda. La FIG. 3 en el panel (B) muestra que una adición de cada poliol afecta al resultado de la geometría de los poros después de un proceso de liofilización. Esto puede estar relacionado con la naturaleza higroscópica de estos polioles y su habilidad para aislar las moléculas de agua durante la congelación, lo que da lugar a cristales de hielo más grandes y, por consiguiente, a poros más grandes. La FIG. 3 en el panel (C) muestra una adición de dichos aditivos de polioles. La adición muestra el efecto que da lugar a una alteración del tamaño medio del poro. La FIG. 3 en el panel (D) muestra una adición de dichos aditivos de polioles, cada poliol afecta la rigidez de la espuma, creando espumas que son más suaves que los controles solamente de seda.

La FIG. 4 muestra un módulo de almacenamiento. La FIG. 4 en el panel (A) muestra un módulo de almacenamiento de espumas congeladas lentamente hechas a partir de 20 MB de seda. Las espumas congeladas lentamente se congelaron a un ritmo de -0,05 °C hasta que la temperatura alcanzó -50 °C. La FIG. 4 en el panel (B) muestra un módulo de almacenamiento de espumas congeladas rápidamente hechas a partir de 20 MB de seda. Las espumas congeladas rápidamente se colocaron en un estante preajustado a -50 °C. Las espumas congeladas rápidamente eran más rígidas que las espumas de congelación lenta, y no hubo una diferencia significativa entre el módulo de almacenamiento de las espumas que contienen distintas cantidades de glicerol.

La FIG. 5 muestra un molde de aluminio hecho a medida. En algunas formas de realización, por ejemplo, un pozo mide 12 mm (diámetro) x 20 mm (profundidad), y contiene, aproximadamente, 2 mL de solución. La alta conductividad térmica del aluminio permite un control de calidad sobre la temperatura de la solución durante la congelación, que básicamente afecta la cristalización del agua y, por consiguiente, la porosidad y la geometría de los poros dentro de las espumas.

La FIG. 6 muestra imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM, por sus siglas en inglés) de materiales. La FIG. 6 en el panel (A) muestra una doble capa típica que se obtiene al congelar las espumas en moldes de poliestireno. Esta bicapa genera dos zonas: poros homogéneos y redondos en la parte superior y aleatorios, poros frágiles en la parte inferior que deben cortarse y descartarse. La FIG. 6 en el panel (B) muestra espuma moldeada en moldes de aluminio, lo que no produce una doble capa, sino una morfología de poros consistente y redondeada en toda la espuma. Las imágenes están orientadas con la parte inferior de la espuma hacia la parte inferior de la imagen. La presencia de una bicapa crea una morfología de poros impredecible en la capa superior de la espuma, lo que causa propiedades mecánicas inconsistentes y morfología de poros.

La FIG. 7 muestra espumas de seda con memoria de forma que retienen su forma original después de una compresión extensiva. En el presente documento, una espuma con geometría complicada, aproximadamente 3 cm de largo por 1 cm de ancho se enrolla, se seca y se inserta en el diámetro interior de una tuerca hexagonal de A pulgada. Inmediatamente después de la inmersión en PBS, la espuma recupera su forma y tamaño original.

La FIG. 8 muestra datos de hinchamiento y del módulo elástico para las espumas con memoria de forma. La FIG.

8 en el panel (A) muestra datos de hinchamiento volumétrico para espumas de seda y de glicerol. La expansión volumétrica se determinó comparando el volumen de las espumas al 90 % de compresión con el volumen de después de la recuperación en PBS. La seda (0 % glicerol) mostró que su volumen solamente aumentó el doble inmediatamente después de la compresión, mientras que las espumas de 30% de glicerol mostraron que su volumen aumentó, aproximadamente, 6 veces. La FIG. 8 en el panel (B) muestra el módulo de compresión de las espumas de seda. Las espumas de seda y glicerol muestran una gama de diferentes módulos mecánicos de entre 35-810 kPa dependiendo del contenido de glicerol en las espumas. Sin embargo, otras formulaciones de seda y glicerol sin tratamiento de metanol produjeron espumas con módulos elásticos tan bajos como 7,5 kPa.

La FIG. 9 muestra la histología de espumas recuperadas después de implantación subcutánea de 8 semanas en ratones. La FIG. 9 en el panel (A) muestra espumas solamente de seda. La FIG. 9 en el panel (B) muestra espumas de glicerol y seda. Tanto las espumas solamente de seda como las espumas de glicerol y seda muestran una respuesta inflamatoria mínima. Sin embargo, la infiltración de las células es mucho mayor en las espumas de glicerol que en las espumas solamente de seda. Esto provoca una mayor degradación de las espumas de glicerol y seda.

La FIG. 10 muestra una recuperación después de la compresión al 80 % de la tensión. Las espumas de seda con y sin glicerol se trataron con metanol o se dejaron sin tratar (solo espumas con alto contenido en glicerol), y se midió, mediante analizador dinámico-mecánico (DMA, por sus siglas en ingles), su habilidad para recuperar su tamaño original después de una compresión fuerte. Conforme aumenta el contenido de glicerol, las espumas muestran mayor recuperación. La recuperación después de la compresión es casi del 100% para las espumas que contienen 40 % p/p de glicerol.

La FIG. 11 muestra una expansión volumétrica de espumas a partir de un alto estado comprimido. La adición de glicerol o la modificación de ácido sulfónico de baja intensidad produce leves mejoras en hinchamiento en comparación con los controles solamente de seda. Sin embargo, la modificación de ácido sulfónico de alta intensidad aumenta el hinchamiento hasta 20-25 veces. La modificación de ácido sulfónico de alta intensidad con glicerol provoca un hinchamiento muy alto después de la compresión. Sin embargo, el material se transforma en un estado de semigel, dejando de mantener un material poroso rígido de células abiertas. SAA = modificación del ácido sulfónico azosilk.

La FIG. 12 muestra un análisis de espectroscopía de infrarrojos con transformada de Fourier (FTIR, por sus siglas en inglés) de la estructura secundaria de espumas solo de seda, espumas de glicerol y seda y espumas modificadas con ácido sulfónico de seda. Con el aumento de la modificación de ácido sulfónico, la cristalización producida por el alto contenido en glicerol disminuye, dando lugar a una estructura de lámina beta más baja. SAA = modificación del ácido sulfónico azosilk.

La FIG. 13 muestra un módulo de compresión y una tensión de compresión al 80% de fuerza para espumas de seda modificadas. Las espumas de seda modificadas muestran firmeza mecánica comparable a los controles solamente de seda. La tensión de compresión al 80 % pretende imitar la fuerza necesaria para comprimir una espuma durante la inyección mediante una aguja. Las espumas de glicerol y seda muestran una tensión de compresión significativamente mayor a una alta compresión. Sin embargo, las espumas modificadas con azosilk sulfónico muestran una menor tensión de compresión a mayor modificación. Las espumas modificadas con ácido sulfónico/glicerol y seda necesitan menos fuerza para mayor compresión en comparación con controles, indicando que pueden requerir una menos fuerza para aplicaciones inyectables. SAA = modificación del ácido sulfónico azosilk.

La FIG. 14 muestra un análisis espectrofotométrico de solamente seda y de seda modificada con diazonio (normalizada para el pico de carbonilo) en agua a pH 7. Los equivalentes molares de los residuos de tirosina modificados con diazonio se calcularon en base a la absorción de azobenceno a 325 nm.

La FIG. 15 muestra un análisis de compresión mecánica para esponjas de glicerol y seda. La FIG. 15 en el panel (A) muestra curvas tensión-deformación para esponjas de seda de 10 mE; solamente seda con tratamiento posterior de lavado con metanol, seda con 40 % p/p de glicerol sin tratamiento posterior, y seda con 40 % p/p de glicerol con tratamiento posterior de lavado con metanol. La FIG. 15 en el panel (B) muestra la evaluación de histéresis mediante el cálculo de la relación bajo la curva para el ciclo de carga frente al ciclo de descarga. Los valores más pequeños indican menos histéresis durante los ciclos de compresión. La FIG. 15 en el panel (C) muestra módulos de compresión de esponjas de seda con distintos tiempos de extracción y concentraciones de glicerol. Las esponjas del panel de la izquierda se trataron posteriormente con un lavado de metanol, las esponjas del panel de la derecha no se trataron posteriormente. La FIG. 15 en el panel (D) muestra la recuperación de las esponjas después de una tensión de compresión del 80 %. Las esponjas del panel de la izquierda se trataron posteriormente con un lavado de metanol, las esponjas del panel de la derecha no se trataron posteriormente.

La FIG. 16 muestra ensayos de fatiga de las esponjas de solamente seda y de seda con 40% p/p de glicerol durante 1000 ciclos. Se mantuvo una frecuencia constante a 0,5 Hz, mientras que la amplitud variaba entre 1% y 10% de tensión. Todas las esponjas mostraron baja fatiga y cambios mínimos en los módulos dinámicos durante 1000 ciclos.

La FIG. 17 muestra un análisis de compresión mecánica para esponjas de seda modificadas con diazonio. La FIG. 17 en el panel (A) muestra módulos de compresión de esponjas de seda de 10 mE con una concentración variada de residuos de tirosina modificada y concentraciones de glicerol. La FIG. 17 en el panel (B), tensión máxima de compresión al 80% de deformación axial.

La FIG. 18 muestra una expansión volumétrica de las esponjas de seda en IX PBS después de una compresión axial del 90 %. La combinación de la modificación de tirosina con ácido sulfanílico (% SAA) con aditivos de glicerol mejora el hinchamiento volumétrico de los materiales comprimido en comparación con los controles solamente de seda. A una alta modificación de diazonio, las esponjas hinchadas perdieron su rigidez, asumiendo una forma amorfa y una consistencia similar a la de gel.

La FIG. 19 muestra hidratación y recuperación de las esponjas de seda comprimidas. Las esponjas de seda no modificadas muestran, generalmente, deformación plástica de la compresión mecánica. Además, la hidratación es lenta en las esponjas no modificadas y no produce una recuperación volumétrica rápida. De forma alternativa, las esponjas modificadas con glicerol muestran una absorción rápida de medios acuosos y expansión de volumen, así como una recuperación prácticamente completa de la geometría original.

La FIG. 20 muestra una estructura secundaria de las esponjas de glicerol de seda y glicerina mediante análisis FTIR. La FIG. 20 en el panel (A) muestra esponjas de seda y glicerol analizadas para elementos de estructuras secundarias antes del tratamiento con metanol (Pre-MeOH Wash, por sus siglas en inglés). La FIG. 20 en el panel (B) muestra esponjas de seda y glicerol analizadas para elementos de estructuras secundarias después del tratamiento en metanol (Pre-MeOH Wash). La FIG. 20 en los paneles (A) y (B) muestra esponjas que contienen cantidades variadas de glicerol. La FIG. 20 en los paneles (A) y (B) incluye ratios combinados: (a) solamente seda; (b) 1 p/p % de glicerol; (c) 5 p/p % de glicerol; (d) 10 p/p % de glicerol; (e) 15 p/p % de glicerol; (f) 20 p/p % de glicerol; (g) 30 p/p % de glicerol; (h) 40 p/p % de glicerol. La FIG. 20 en el panel (C) muestra esponjas de seda y glicerol analizadas para elementos de segundas estructuras, en términos de concentración relativa, antes del tratamiento con metanol (Pre-MeOH Wash). La FIG. 20 en el panel (C) muestra esponjas de seda y glicerol analizadas para elementos de segundas estructuras, en términos de concentración relativa, después del tratamiento con metanol (Pre-MeOH Wash). La FIG. 20 en los paneles (C) y (D) muestra como esponjas que contienen diversas cantidades de glicerol. La FIG. 20 en los paneles (C) y (D) muestra además esponjas de seda y glicerol que contienen seda procesada a través de varias cantidades de tiempo de extracción (10 mE, 30 mE y 60 mE). La FIG. 20 en los paneles (C) y (D) muestra una concentración relativa de: (i) lámina beta; (ii) hélice alfa; (iii) bobina aleatoria; y (iv) giros beta.

La FIG. 21 muestra una estructura secundaria de esponjas de seda modificadas con diazonio mediante análisis FTIR. La modificación de residuos de tirosina con químicos hidrofílicos da lugar a una reducción importante de la estructura de lámina beta. La FIG. 21 en el panel (A) muestra esponjas de seda modificadas con diazonio analizadas para elementos de estructura secundaria. La FIG. 21 en el panel (A) muestra esponjas que contienen diversas cantidades de glicerol y de ácido sulfónico azosilk. La FIG. 21 en el panel (A) incluye ratios combinados: (a) solamente seda; (b) 30 p/p % de glicerol; (c) 10 SAA; (d) 10 % SAA, 30 p/p % de glicerol; (e) 30 % SAA; (f) 30 % SAA, 30 p/p % de glicerol; (g) 60 % SAA; (h) 60 % SAA, 30 p/p % de glicerol. La FIG. 21 en el panel (B) muestra esponjas que contienen diversas cantidades de glicerol. La FIG. 21 en el panel muestra, además, esponjas de glicerol y seda que contienen diversas cantidades de glicerol (0 % de glicerol y 30 % de glicerol). La FIG. 21 en el panel (B) muestra una concentración relativa de: (i) láminas beta; (ii) hélice alfa; (iii) bobina aleatoria; y (iv) giros beta.

La FIG. 22 muestra una morfología de poros de esponjas de seda modificadas. La FUG. 22 en el panel (A) muestra una presentación macroscópica de esponjas solamente de seda no modificadas (izquierda) y esponjas modificadas con diazonio (derecha). La FIG. 22 en el panel (B) muestra la microscopía electrónica de barrido que muestra la morfología del material interno de las esponjas que contienen glicerol y tirosina modificada. El glicerol confiere a los materiales de seda una forma de poros redondeada, y el aumento de la modificación del diazonio provoca la formación de estructuras fibrilares. (Las barras de escala son 100 jm para la imagen principal, 200 |jm para las imágenes insertadas). Las FIGs. 22 en los paneles (C) y (D) muestran una distribución del tamaño de los poros mediante porosimetría de intrusión de mercurio. La adición de 30 % p/p de glicerol estrecha y disminuye la distribución del tamaño para las esponjas que provienen de tiempos de extracción más largos. Las FIGs. 22 en los paneles (E y F) muestran una distribución del tamaño de los poros para esponjas modificadas con diazonio. El hinchamiento resultante de la modificación de tirosina provoca un cambio hacia diámetros de poros más grandes.

La FIG. 23 muestra una implantación subcutánea in vivo de esponjas de glicerol y seda en módulos de ratón. La FIG. 23 en el panel (A) muestra examinación histológica que muestra una mejor infiltración de células en esponjas que contienen glicerol en comparación con los controles solamente de seda, donde la infiltración de células se limita al perímetro del material. La evaluación macroscópica del volumen de las esponjas reveló que la adición de glicerol a las esponjas de seda aumenta la tasa de degradación in vivo. La FIG. 23 en el panel (B) muestra círculos de puntos que permiten una comparación visual de solamente seda (blanco) y de grupos de 30 % p/p de glicerol (rojo) en puntos de tiempo de 2 y 12 semanas. La FIG. 23 en el panel (C) muestra una comparación de grupos de diámetros de esponja de solamente seda y de 30 % p/p de glicerol en puntos de tiempo de 2, 4, 8 y 12 semanas.

La FIG. 24 muestra una calorimetría diferencial de barrido de soluciones de seda que contienen diversas cantidades de glicerol, desde 0-10 % p/p. La temperatura de transición vítrea de la solución (indicada con marcas de almohadilla verticales) disminuyó con un aumento en la concentración de glicerol en las mezclas de seda. Esto puede haber alterado la estabilidad de la esponja durante la liofilización, permitiendo el colapso de la estructura y la densificación durante el secado. Los ratios combinados son los siguientes: a) solamente de seda; b) 2 % p/p de glicerol; c) 4 % p/p de glicerol; d) 6 % p/p de glicerol; e) 8 % p/p de glicerol; f) 10 % p/p de glicerol.

DEFINICIONES

[0080] A continuación, se definen algunos términos para que la presente divulgación sea más fácil de entender.

[0081] En esta solicitud, a menos que se deduzca lo contrario del contexto, el término “un, una” puede entenderse como “al menos uno”. Tal y como se utiliza en esta solicitud, el término “o” puede entenderse como “y/o”. En esta solicitud, los términos “que comprende, que consta de” y “que incluye” pueden entenderse como que abarca los componentes o pasos detallados, ya sea que se presenten por sí mismos o en conjunto con uno o más pasos o componentes adicionales. A menos que se indique lo contrario, los términos “aproximadamente” y “alrededor de” pueden entenderse como que permiten variaciones estándar como aquellos expertos en la técnica entenderían. Cuando se proporcionan rangos en este documento, se incluyen los extremos. Tal y como se utiliza en esta solicitud, los términos “comprender, constar de” y variaciones de estos términos, como “que comprende, que consta de” y “comprende, consta de”, no tienen intención de excluir a otros aditivos, componentes, enteros o pasos.

[0082] “Suministro”: tal y como se utiliza en el presente documento, el término “suministro” se refiere al suministro de una composición a un sujeto. Se puede realizar el suministro a través de cualquier ruta apropiada. Por ejemplo, en algunas formas de realización, el suministro puede ser bronquial (incluyendo instilación bronquial), bucal, entérica, interdérmica, intraarterial, intradérmica, intragástrica, intramedular, intramuscular, intranasal, intraperitoneal, intratecal. Intravenosa, intraventricular, por mucosa, nasal, oral, rectal, subcutánea, sublingual, tópica, traqueal (incluyendo instilación intratraqueal), transdérmica, vaginal y vítrea.

[0083] “Afinidad”: como se conoce en la técnica, “afinidad” es una medida de ajuste con un ligando específico que se une a su pareja. Las afinidades se pueden medir de distintas maneras. En algunas formas de realización, la afinidad se mide mediante ensayo cuantitativo. En algunas formas de realización, la concentración de la unión de pareja se puede fijar para que sea superior a la concentración de ligando, con el fin de imitar las condiciones fisiológicas. Además, o de forma alternativa, en algunas formas de realización, la concentración de unión de pareja y/ la concentración de ligando puede variar. En algunas formas de realización, la afinidad puede compararse a una referencia bajo condiciones comparables (p. ej., concentraciones).

[0084] “Agente”: tal y como se utiliza en el presente documento, el término “agente” puede referirse a un compuesto o entidad de cualquier clase química, incluyendo, por ejemplo, polipéptidos, ácidos nucleicos, sacáridos, lípidos, moléculas pequeñas, metales o combinaciones de estos. Como se deduce del contexto, en algunas formas de realización, un agente puede ser o componerse de una célula u organismo, o una fracción, extracto o componente de estos. En algunas formas de realización, un agente es o comprende un producto natural, ya que se encuentra o se obtiene de la naturaleza. En algunas formas de realización, un agente es o comprende una o más entidades que son creadas por el hombre, ya que se diseña, construye y/o produce a través de la acción de la mano del hombre y/o no se encuentra en la naturaleza. En algunas formas de realización, un agente puede utilizarse en forma aislada o pura; en algunas formas de realización, un agente puede utilizarse en forma cruda. En algunas formas de realización, los agentes potenciales se proporcionan como colecciones o librerías, por ejemplo, que pueden examinarse para identificar o caracterizar los agentes activos que contienen. Algunas formas de realización de los agentes que pueden utilizarse según la presente divulgación incluyen moléculas pequeñas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, aptámeros, ARN de interferencia corta, ARN en horquilla corta, híbridos de ARN y ADN, oligonucleótidos antisentido, ribozimas, péptidos, miméticos peptídicos, moléculas pequeñas, etc. En algunas formas de realización, un agente es o comprende un polímero. En algunas formas de realización, un agente no es un polímero y/o no contiene polímeros sustancialmente. En algunas formas de realización, un agente contiene al menos una porción polimérica. En algunas formas de realización, un agente carece o no contiene sustancialmente ninguna porción polimérica.

[0085] “Analogía”: tal y como se utiliza en el presente documento, el término “analogía” se refiere una sustancia que comparte uno o más rasgos, elementos, componentes o fracciones estructurales particulares con una sustancia de referencia. Por lo general, una “analogía” muestra similitud estructural significativa con la sustancia de referencia, por ejemplo, comparten un núcleo o una estructura de consenso, pero también difieren en algunos aspectos discretos. En algunas formas de realización, una analogía es una sustancia que puede generarse a partir de la sustancia de referencia mediante manipulación química de la sustancia de referencia. En algunas formas de realización, una analogía es una sustancia que puede generarse a través de la realización de un proceso sintético sustancialmente similar a (p. ej., compartir un gran número de pasos con) uno que genera la sustancia de referencia. En algunas formas de realización, una analogía es o puede generarse a través de la realización de un proceso sintético diferente al que se utiliza para general la sustancia de referencia.

[0086] “Aminoácidos”: tal y como se utiliza en el presente documento, el término “aminoácidos”, en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que pueda incorporarse a una cadena de polipéptidos, p. ej., a través de la formación de uno o más enlaces péptidos. En algunas formas de realización, un aminoácido tiene la estructura general H2N-C(H)(R)-COOH. En algunas formas de realización, un aminoácido es un aminoácido de origen natural. En algunas formas de realización, un aminoácido es un aminoácido sintético; en algunas formas de realización, un aminoácido es un aminoácido D; en algunas formas de realización, un aminoácido es un aminoácido L; Un “aminoácido estándar” se refiere a cualquiera de los veinte aminoácidos L estándar que se encuentran comúnmente en los péptidos de origen natural. Un “aminoácido no estándar” se refiere a cualquier aminoácido, distinto de los aminoácidos estándar, independientemente de si se ha preparado sintéticamente o de si se ha obtenido de una fuente natural. En algunas formas de realización, un aminoácido, incluyendo un aminoácido de carboxilo y/o un aminoácido amino terminal en un polipéptido, puede contener una modificación estructural en comparación con la estructura general del presente documento. Por ejemplo, en algunas formas de realización, un aminoácido puede modificarse por metilación, amidación, acetilación y/o sustitución con respecto a la estructura general. En algunas formas de realización, dicha modificación puede, por ejemplo, alterar la vida media circulante de un polipéptido que contenga el aminoácido modificado con respecto a otro que contenga un aminoácido idéntico sin modificar. Como se deduce del contexto, en algunas formas de realización, el término “aminoácido” se utiliza para hacer referencia un aminoácido libre; en algunas formas de realización, se utiliza para hacer referencia a un residuo de aminoácido de un polipéptido.

[0087] “Anticuerpo”: tal y como se utiliza en el presente documento, el término “anticuerpo” se refiere a un polipéptido que incluye elementos de secuencia canónica de inmunoglobulina suficientes para conferir una unión específica a un antígeno objetivo concreto. Como se conoce en la técnica, los anticuerpos intactos tal y como se producen en la naturaleza son agentes tetraméricos de unos 150 kD compuestos por dos polipéptidos idénticos de cadena pesada (de aproximadamente 50 kD cada una) y dos polipéptidos idénticos de cadena ligera (de aproximadamente 25 kD cada una) que están asociadas entre sí en lo que comúnmente se denomina una estructura “con forma de Y”. Cada cadena pesada comprende al menos cuatro dominios (cada uno de al menos 110 aminoácidos de largo), un dominio variable aminoterminal (VH) (ubicado en las puntas de la estructura de Y), seguido por tres dominios constantes: CH1, CH2 y la terminal de carboxilo CH3 (ubicadas en la base del eje de Y). Una región corta, conocida como el “interruptor”, conecta la variable de cadena pesada y las regiones constantes. La “bisagra” conecta los dominios CH2 y CH3 con el resto del anticuerpo. Dos enlaces de disulfuro en la región de la bisagra conectan los dos polipéptidos de cadenas pesadas a otra en un anticuerpo intacto. Cada cadena ligera comprende dos dominios: un dominio variable aminoterminal (VL) seguido por un dominio constante de terminal de carboxilo (CL), separados entre sí por otro “interruptor”. Los tetrámeros de anticuerpos intactos comprenden dos dímeros de cadena ligera y de cadena pesada en los que las cadenas ligeras y pesadas están unidad entre sí mediante un único enlace de disulfuro; otros dos enlaces de disulfuro conectan las regiones de bisagra de cadenas pesadas entre sí, de manera que los dímeros estén conectados entre sí y se forme el tetrámero. Los anticuerpos que se han formado naturalmente también son glicosilados, generalmente en el dominio CH2. Cada dominio en un anticuerpo natural tiene una estructura que se caracteriza por un “pliegue de inmunoglobulina” formado a partir de dos láminas beta (p. ej., láminas de 3, 4 o 5 hilos) apisonadas unas contra otras en un barril beta antiparalelo comprimido. Cada dominio variable contiene tres nudos hipervariables conocidos como “regiones determinantes complementarias” (CDR1, CDR2 y CDR3) y cuatro regiones “marco” algo invariables (FR1, FR2, FR3 y FR4). Cuando los anticuerpos naturales se doblan, las regiones FR forman las láminas beta que proporcionan el marco estructural para los dominios, y las regiones de bucle CDR, de las cadenas ligeras y pesadas, se unen en un espacio tridimensional de manera que crean un único sitio de unión de antígeno ubicado en la punta de la estructura Y. Las comparaciones de secuencias de aminoácidos entre las cadenas de polipéptidos de anticuerpos han definido dos clases de cadenas ligeras (k y X), varias clases de cadenas pesadas (p. ej., |i, y, a, s, 8 ) y ciertas subclases de cadenas pesadas (a1, a2, y1, y2, y3 y y4). Las clases de anticuerpos (IgA [incluyendo IgA1, IgA2], IgD, IgE, IgG [incluyendo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4], IgM) se definen en base a la clase de secuencias de cadenas pesadas utilizadas. Para fines de la presente divulgación, en ciertas formas de realización, cualquier polipéptido, o compuesto de polipéptidos que incluya secuencias suficientes de dominios de inmunoglobulina como los que se encuentran en anticuerpos naturales puede referirse a y/o utilizado como “anticuerpo”, ya se produzca de forma natural (p. ej., generado por un organismo reaccionando a un antígeno), o se produzca mediante ingeniería de recombinación, síntesis química o cualquier otro sistema o metodología artificial. En algunas formas de realización, un anticuerpo es monoclonal; en algunas formas de realización es monoclonal. En algunas formas de realización, un anticuerpo tiene secuencias de región constantes que son características de anticuerpos de ratones, conejos, primates o humanos. En algunas formas de realización, los elementos de secuencia de anticuerpos están humanizados, primados, quiméricos, etc. Como se conoce en la técnica. Además, el término “anticuerpo”, tal y como se utiliza en el presente documento, se entenderá que abarca (salvo que se indique lo contrario o se deduzca del contexto) y puede hacer referencia en las realizaciones apropiadas a cualquiera de las construcciones o formatos conocidos o desarrolladas en la técnica para capturar características estructurales y funcionales de anticuerpos en una presentación alternativa. Por ejemplo, en algunas formas de realización, el término puede hacer referencia a anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos (p. ej., zybody, etc.), pequeños inmunofármacos modulares (“SMIPsTM, por sus siglas en inglés), anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos camélidos y/o fragmentos de anticuerpos. En algunas formas de realización, un anticuerpo puede carecer de una modificación covalente (p. ej., fijación de un glicano) que se habría producido de forma natural. En algunas formas de realización, un anticuerpo puede contener una modificación covalente (p. ej., fijación de un glicano, una carga [p. ej., una porción detectable, una porción terapéutica, una porción catalítica, etc.], u otros grupos colgantes (p. ej., glicol de polietileno, etc.]).

[0088] “Asociado” o “asociado con”: tal y como se utiliza en el presente documento, el término “asociado” o “asociado con” se refiere, generalmente, a dos o más entidades en proximidad física entre sí, ya sea de forma directa o indirecta (p. ej., a través de una o más entidades adicionales que sirven como agente de enlace), para formar una estructura que es suficientemente estable de manera que las entidades permanezcan en entidades físicas bajo condiciones relevantes, p. ej., condiciones psicológicas. En algunas formas de realización, las entidades asociadas están unidas covalentemente entre sí. En algunas formas de realización, las entidades asociadas no están unidas de covalentemente. En algunas formas de realización, las entidades asociadas están unidas entre sí mediante interacciones no covalentes específicas (es decir, mediante interacciones entre ligandos de interacción que discriminan entre su pareja de interacción y otras entidades presentes en el contexto de uso, como, por ejemplo, interacciones entre avidina y estreptavidina, interacciones entre anticuerpos y antígenos, etc.). Además, o de forma alternativa, un número suficiente de interacciones débiles no covalentes puede proporcionar estabilidad suficiente para que las partes permanezcan asociadas. Las interacciones no covalentes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, interacciones de afinidad, coordinación de metal, adsorción física, interacciones entre huésped e invitado, interacciones hidrofóbicas, interacciones de apilamiento, interacciones de enlace de hidrógeno, interacciones van der Waals, interacciones magnéticas, interacciones electrostáticas, interacciones dipolodipolo, etc.

[0089] “Enlace”: se entenderá que el término “enlace”, tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere generalmente a una asociación no covalente entre o en dos o más entidades. Un enlace “directo” implica contacto físico entre entidades o partes; un enlace indirecto implica interacción física mediante contacto físico con una o más entidades intermediarias. El enlace entre dos o más entidades puede evaluarse generalmente en cualquier variedad de contextos incluyendo donde las entidades o partes que interactúan se estudian en aislamiento o en el contexto de más sistemas de compuestos (p. ej., mientras está asociado covalentemente o de otro modo con una entidad portadora y/o en un sistema o célula biológica).

[0090] “Agente de enlace”: en general, el término “agente de enlace” se utiliza en el presente documento para se refiere a cualquier entidad que se una a un objetivo de interés tal y como se describe en el presente documento. En muchas formas de realización, un agente de enlace de interés es uno que se une específicamente con su objetivo en el sentido de que discrimina a su objetivo de otras parejas de enlace potenciales en un contexto de interacción específico. En general, un agente de enlace puede ser o comprender una entidad de cualquier clase química (p. ej., polímeros, no polímeros, moléculas pequeñas. Polipéptidos, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos, etc.). En algunas formas de realización, un agente de enlace es una única entidad química. En algunas formas de realización, un agente de enlace es un compuesto de dos o más entidades químicas discretas asociadas entre sí bajo condiciones relevantes por interacciones no covalentes. Por ejemplo, los expertos en la técnica apreciaran que, en algunas formas de realización, un agente de enlace puede comprenden una porción de enlace “genérica” (p. ej., una de biotina, avidina, estreptavidina, y/o un anticuerpo de clase específica), y una porción de enlace “específica” (p. ej., un anticuerpo o aptámeros con un objetivo molecular particular) que está vinculado a la pareja de la porción de enlace genérica. En algunas formas de realización, dicha perspectiva puede permitir un montaje de módulos de múltiples agentes de enlace a través de la unión de distintas fracciones de enlace específicas con la misma pareja de fracción de enlace genérica. En algunas formas de realización, los agentes de enlace son o comprenden polipéptidos (incluyendo, p. ej., anticuerpos o fragmentos de anticuerpos). En algunas formas de realización, los agentes de enlace son o comprenden moléculas pequeñas. En algunas formas de realización, los agentes de enlace son o comprenden ácidos nucleicos. En algunas formas de realización, los agentes de enlace son aptámeros. En algunas formas de realización, los agentes de enlace son polímeros; En algunas formas de realización, los agentes de enlace no son polímeros. En algunas formas de realización, los agentes de enlace no son poliméricos en el sentido de que carecen de fracciones poliméricas. En algunas formas de realización, los agentes de enlace son o comprenden carbohidratos. En algunas formas de realización, los agentes de enlace son o comprenden lectinas. En algunas formas de realización, los agentes de enlace son o comprenden peptidomiméticos. En algunas formas de realización, los agentes de enlace son o comprenden proteínas de andamio. En algunas formas de realización, los agentes de enlace son o comprenden mimeótopos. En algunas formas de realización, los agentes de enlace son o comprenden péptidos engrapados. En algunas formas de realización, los agentes de enlace son o comprenden ácidos nucleicos, como ADN o ARN.

[0091] “Biocompatible”: el término “biocompatible”, tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a materiales que no causan daño significativo a tejidos vivos cuando se ponen en contacto con dicho tejido, p. ej., in vivo. En ciertas formas de realización, los materiales son “biocompatibles” si no son tóxicos para las células. En ciertas formas de realización, los materiales son “biocompatibles” si su adición a las células in vitro provoca una muerte celular inferior o igual al 20%, y/o si su suministro in vivo no induce inflamación significativa u otros efectos adversos.

[0092] “Biodegradable”: tal y como se utiliza en el presente documento, el término “biodegradable” se refiere a materiales que, cuando se introducen en las células, se descomponen (p. ej., mediante maquinaria celular, como degradación enzimática, mediante hidrolisis y/o combinaciones de estas) en componentes que las células pueden reutilizar o disponer sin efectos tóxicos significativos en las células. En ciertas formas de realización, los componentes generados por la descomposición de un material biodegradable son biocompatibles y, por lo tanto, no inducen inflamación significativa y/u otros efectos adversos in vivo. En algunas formas de realización, los materiales de polímeros biodegradables de descomponen en sus componentes de los monómeros. En algunas formas de realización, la descomposición de los materiales biodegradables (incluyendo, por ejemplo, materiales biodegradables de polímeros) implica la hidrolisis de los enlaces de ésteres. Además, o de forma alternativa, en algunas formas de realización, la descomposición de materiales biodegradables (incluyendo, por ejemplo, materiales biodegradables de polímeros) implica la escisión de uniones de uretano. Los polímeros biodegradables ejemplares incluyen, por ejemplo, polímeros de hidroxiácidos como ácido láctico y ácido glicólico, incluyendo pero sin limitarse a poli(hidroxiácidos), poli(ácido lácticos) (PLA, por sus siglas en inglés), poli(ácidos glicólicos) (PGA, por sus siglas en inglés), poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA, por sus siglas en inglés) y copolímeros con PEG, polianhídridos, poli(orto)ésteres, poliésteres, poliuretanos, poli(ácido bórico), poli(ácido valérico), poli(caprolactona), poli(hidroxialcanoatos), poli(lactida-co-caprolactona), mezclas y copolímeros de estos. Muchos polímeros de origen natural también son biodegradables, incluyendo, por ejemplo, proteínas como albúmina, colágeno, gelatina y prolaminas, por ejemplo, zeína, y polisacáridos como alginato, derivados de celulosa y polihidroxialcanoatos, por ejemplo, mezclas de polihidroxibutirato y copolímeros de estos. Los expertos en la técnica apreciarán o serán capaces de determinar cuándo dichos polímeros son biocompatibles y/o derivados biodegradables de estos (p. ej., relacionados con un polímero matrizl mediante estructuras sustancialmente idénticas que difieren solamente en sustitución o adición de grupos químicos particulares como se conoce en la técnica).

[0093] “Activo biológicamente”: tal y como en el presente documento, la frase “activo biológicamente” se refiere una sustancia que tiene actividad en un sistema biológico (p. ej., en una célula (p. ej., aislada, en cultivo, en un tejido, en un organismo), en un cultivo celular, en un tejido, en un organismo, etc.). Por ejemplo, se considera que una sustancia es activa biológicamente cuando se administra dicha sustancia a un organismo y tiene un efecto biológico en ese organismo. Los expertos en la técnica apreciaran que, a menudo, se requiere solamente una parte o fragmento de una sustancia activa biológicamente (p. ej., es necesario y suficiente) para que la actividad esté presente; en tales circunstancias, se considera que esa parte o fragmento es una parte o fragmento biológicamente activo.

[0094] “Parte característica”: tal y como en el presente documento, el término “parte característica” se utiliza, en su sentido más amplio, para referirse a una parte de una sustancia cuya presencia (o ausencia) está correlacionada con la presencia (o ausencia) de una característica, atributo o actividad particulares de la sustancia. En algunas formas de realización, una parte característica de una sustancia es una parte que se encuentra en la sustancia y en sustancias relacionadas que comparten la característica, atributo o actividad particulares, pero no en aquellas con las que no comparten la actividad, característica o rasgo particulares. En algunas formas de realización, una parte característica comparte al menos una característica funcional con la sustancia intacta. Por ejemplo, en algunas formas de realización, una “parte característica” de una proteína o polipéptido es una que contiene un tramo continuo de aminoácidos, o una colección de tramos continuos de aminoácidos, que juntos son característicos de una proteína o polipéptido. En algunas formas de realización, cada tramo continuo contiene, generalmente, al menos, 2, 5, 10, 15, 20, 50 o más aminoácidos. En general, una parte característica de una sustancia (p. ej., de una proteína, anticuerpo, etc.) es una que, además de la secuencia y/o identidad estructural especificada anteriormente, comparte, al menos, una característica funcional con la sustancia intacta relevante. En algunas formas de realización, una parte característica puede ser biológicamente activa.

[0095] “Comparable”: el término comparable, tal y como en el presente documento, se refiere a dos o más agentes, entidades, situaciones, serie de condiciones, etc., que pueden no ser idénticas entre sí, pero que son lo suficientemente similares para permitir comparación entre ellas, de manera que se puedan extraer conclusiones razonables en base a las diferencias o similitudes observadas. Los expertos en la técnica entenderán, en el contexto, que grado de identidad se necesita en cualquier circunstancia para dos o más agentes, entidades, situaciones, series de condiciones, etc. para que se consideren comparables.

[0096] “Conjugado”: tal y como en el presente documento, los términos “conjugado”, “unido”, “conectado” y “asociado con”, cuando se utilizan con respecto a dos o más partes, significa que las partes están asociadas o conectadas físicamente entre sí, ya sea directamente o mediante una o más partes adicionales que sirven como un agente de enlace para formar una estructura que es suficientemente estable para que las partes permanezcan físicamente asociadas bajo las condiciones en las que se utiliza la estructura, p. ej., condiciones fisiológicas. De forma general, las partes están conectadas por uno o más enlaces covalentes o mediante un mecanismo que implica un enlace específico. De forma alternativa, un número suficiente de interacciones débiles puede proporcionar estabilidad suficiente para que las partes permanezcan físicamente asociadas.

[0097] “Correspondiente a”: tal y como en el presente documento, el término “correspondiente a” se utiliza frecuentemente para designar la posición/identidad de un residuo en un polímero, como un residuo de aminoácido en un polipéptido o un residuo de nucleótido en un ácido nucleico. Los expertos en la técnica apreciarán, que por razones de simplicidad, los residuos en tal polímero se designan frecuentemente utilizando un sistema de numeración canónica basado en un polímero relacionado con la referencia, de forma que un residuo en un primer polímero “correspondiente a” un residuo en posición 190 en el polímero de referencia, por ejemplo, realmente no necesita ser el residuo 190 en el primer polímero, sino que corresponde con el residuo encontrado en la posición 190 en el polímero de referencia; los expertos en la técnica apreciarán inmediatamente como identificar los aminoácidos “correspondientes”, incluyendo a través del uso uno o más algoritmos disponibles en el mercado diseñados específicamente para comparaciones de secuencia de polímeros.

[00980] “Entidad de detección”: el término entidad de detección tal y como en el presente documento se refiere a cualquier elemento, molécula, grupo funcional, compuesto, fragmento o porción que es detectable. En algunas formas de realización, una entidad de detección se proporciona o utiliza sola. En algunas formas de realización, una entidad de detección se proporciona y/o utiliza en asociación con (p. ej., unida a) otro agente. Los ejemplos de entidades de detección incluyen, pero no se limitan a: varios ligandos, radionúclidos (p. ej., 3H, 14C, 18F, 32P,35S ,13SI, 125I, 123I, 64Cu, 187Re, 111In, 90Y, 99mTc, 177Lu, 89Zr, etc.), tintes fluorescentes (para tintes fluorescentes ejemplares específicos, veáse más adelante), agentes quimioluminiscentes (como, por ejemplo, esteres de acridinio, dioxetanos estabilizados, y similares), agentes bioluminiscentes, nanocristales fluorescentes inorgánicos resolubles (como puntos cuánticos), nanopartículas de metal (p. ej., oro, plata, cobre, platino, etc.), nanoclústeres, iones de metal paramagnético, enzimas (para ejemplos específicos de enzimas, veáse más adelante), etiquetas colorimétricas (como, por ejemplo, tintes, oro coloidal y similares), biotina, dioxigenina, haptenos, y proteínas para los cuales los antisueros o anticuerpos monoclonales están disponibles.

[0099] “Determinación”: muchas metodologías descritas en el presente documento incluyen un paso de “determinación”. Los expertos en la técnica, leyendo la presente especificación, apreciarán que dicha “determinación” puede utilizarse o conseguirse mediante el uso de cualquier variedad de técnicas disponibles para los expertos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, técnicas específicas a las que se hace referencia explícitamente en el presente documento. En algunas formas de realización, la determinación implica la manipulación de una muestra física. En algunas formas de realización, la determinación implica la consideración y/o manipulación de datos o información, por ejemplo, utilizar un ordenador o cualquier otra unidad de procesamiento adaptada para llevar a cabo análisis relevantes. En algunas formas de realización, la determinación implica recibir información relevante y/o materiales de una fuente. En algunas formas de realización, la determinación implica comparar una o más características de una muestra o entidad a una referencia comparable.

[0100] “Forma de dosificación”: tal y como en el presente documento, el término “forma de dosificación” se refiere a una unidad físicamente discreta de un agente terapéutico para suministro a un sujeto. Cada unidad contiene una cantidad predeterminada de agentes activos. En algunas formas de realización, dicha cantidad es una cantidad de dosificación unitaria (o una fracción es una entera de la misma) apropiada para el suministro según un régimen de dosis que se ha determinado para correlacionar con un con un resultado deseado o beneficioso cuando se administra a una población relevante (es decir, con un régimen de dosificación terapéutica).

[0101] “Encapsulado”: el término “encapsulado” se utiliza en el presente documento para referirse a sustancias que están completamente rodeadas por otro material.

[0102] “Funcional”: tal y como se utiliza en el presente documento, una molécula biológica “funcional” es una molécula biológica en una forma en la que muestra una propiedad y/o actividad por la que se caracteriza. Una molécula biológica puede tener dos funciones (es decir, bifuncional) o muchas funciones (es decir, multifuncional).

[0103] “Rechazo del injerto”: el término “rechazo del injerto” tal y como se utiliza en el presente documento se refiere a un rechazo de tejido trasplantado de un individuo donante a un individuo receptor. En algunas formas de realización, el rechazo del injerto se refiere a un rechazo de aloinjertos, donde el individuo donante y el individuo receptor son de la misma especie. De forma general, se produce un rechazo de aloinjerto cuando el tejido del donante es portador de un aloantígeno contra el que el sistema inmunitario del receptor genera una respuesta de rechazo.

[0104] “Polímero de alto peso molecular”: tal y como en el presente documento, el término “polímero de alto peso molecular” se refiere a polímeros y/o soluciones de polímeros compuestas por polímeros (p. ej., polímeros de proteínas, como seda) que presentan pesos moleculares de al menos, aproximadamente, 200 kDa, y en los que no más del 30 % de la fibroína de seda tiene un peso molecular inferior a 100 kDa. En algunas formas de realización, los polímeros de alto peso molecular y/o las soluciones de polímeros tienen un peso molecular medio de, al menos, aproximadamente, 100 kDa o más, incluyendo, p. ej., de, al menos, aproximadamente, 150 kDa; de, al menos, aproximadamente, 200 kDa; de, al menos, aproximadamente, 250 kDa; de al menos, aproximadamente, 300 kDa; de, al menos, aproximadamente, 350 kDa o más. En algunas formas de realización, los polímeros de alto peso molecular tienen una distribución de peso molecular de no más 50 %, por ejemplo, incluyendo, de no más 40 %, de no más 30 %, de no más 20 %, de no más de 10 % de la fibroína de seda puede tener un peso molecular inferior a 150 kDa, o inferior a 125 kDa o inferior 100 kDa.

[0105] “Degradable hidrolíticamente”: tal y como en el presente documento, el término “degradable hidrolíticamente” se utiliza para hacer referencia a materiales que se degradan mediante escisión hidrolítica. En algunas formas de realización, los materiales degradables hidrolíticamente se degradan en agua. En algunas formas de realización, los materiales degradables hidrolíticamente se degradan en agua en ausencia de cualquier otros agentes o materiales. En algunas formas de realización, los materiales degradables hidrolíticamente se degradan completamente mediante escisión hidrolítica, p. ej., en agua. En cambio, el término “degradable hidrolíticamente” hace referencia generalmente a materiales que no se degradan completamente mediante escisión hidrolítica y/o en la presencia de agua (p. ej., en presencia exclusiva de agua).

[0106] “Hidrofílico”: tal y como en el presente documento, el término “hidrofílico” y/o “polar” se refiere a una tendencia a mezclar con o disolver fácilmente en agua.

[0107] “Hidrofóbico”: tal y como en el presente documento, el término “hidrofóbico” y/o “no polar” se refiere a una tendencia a repeler, no combinar con o a una inhabilidad a disolver fácilmente en agua.

[0108] “Identidad”: tal y como en el presente documento, el término “identidad” se refiere a la relación general entre moléculas poliméricas, p. ej., entre moléculas de ácido nucleico (p. ej., moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas de polipéptidos. En algunas formas de realización, las moléculas poliméricas se consideran ser “sustancialmente idénticas” entre sí si sus secuencias son, al menos, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % idénticas. El cálculo del porcentaje de identidad de dos ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos, por ejemplo, puede realizarse mediante la alineación de las dos secuencias para fines de comparación óptima (p. ej., se pueden introducir huecos en una o ambas secuencias para el alineamiento óptimo y las secuencias no idénticas se pueden descartar a efectos de comparación.). En ciertas formas de realización, la longitud de una secuencia alineada para fines de comparación es de, al menos, 30%; al menos, 40 %; al menos, 50 %; al menos, 60 %; al menos, 70 %; al menos, 80 %; al menos, 90 %; al menos, 95 %; o sustancialmente del 100 % de la longitud de una secuencia de referencia. Después, se comparan los nucleótidos en las posiciones correspondientes. Cuando el mismo residuo que el de la posición correspondiente en la segunda secuencia ocupa una posición en la primera secuencia (p. ej., nucleótido o aminoácido), las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartido por las secuencias, considerando el número de huecos y la longitud de cada hueco, que necesita introducirse para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. Se puede conseguir la comparación de las secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias utilizando un algoritmo matemático. Por ejemplo, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede determinarse utilizando el algoritmo de Meyer y Miller (CABIOS, 1989, 4: 11-17), que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0). En algunas formas de realización ejemplares, las comparaciones de secuencias de ácido nucleico hechas con el programa ALIGN utilizan una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias de nucleótidos puede, de forma alternativa, determinarse utilizando el programa GAP en el paquete de software GCG utilizando una matriz NWSgap-dna.CMP.

[0109] “Polímero de bajo peso molecular”: tal y como en el presente documento, el término “polímero de bajo peso molecular” se refiere a polímeros y/o soluciones de polímeros, como seda, compuestas por polímeros (p. ej., polímeros de proteínas) que presentan pesos moleculares en un rango de entre, aproximadamente, 20 kDa y, aproximadamente, 400 kDa. En algunas formas de realización, los polímeros con bajo peso molecular (p. ej., polímeros de proteínas) tienen pesos moleculares en un rango de entre un límite inferior (p. ej., aproximadamente 20 kDa, aproximadamente 30 kDa, aproximadamente 40 kDa, aproximadamente 50 kDa, aproximadamente 60 kDa, o más) y un límite superior (p. ej., aproximadamente 400 kDa, aproximadamente 375 kDa, aproximadamente 350 kDa, aproximadamente 325 kDa, aproximadamente 300 kDa, o menos). En algunas formas de realización, los polímeros de bajo peso molecular (p. ej., polímeros de proteínas como la seda) no contienen sustancialmente polímeros que presentan un peso molecular superior a, aproximadamente, 400 kDa. En algunas formas de realización, los polímeros de mayor peso molecular en los materiales proporcionados tienen un peso inferior a entre, aproximadamente, 300 kDa y, aproximadamente, 400 kDa (p. ej., inferior a, aproximadamente, 400 kDa; inferior a, aproximadamente, 375 kDa; inferior a, aproximadamente, 350 kDa; inferior a, aproximadamente, 325 kDa; inferior a, aproximadamente, 300 kDa, etc.). En algunas formas de realización, un polímero de bajo peso molecular y/o solución de polímero puede comprender una población de fragmentos de polímeros que presentan un rango de pesos moleculares, caracterizado en que: no más del 15 % de los moles totales de los fragmentos de polímeros de la población tiene un peso molecular superior a 200 kDa, y, al menos, 50 % de los moles totales de los fragmentos de la fibroína de seda de la población tiene un peso molecular dentro de un rango específico, donde el rango específico es entre, aproximadamente, 3,5 kDa y, aproximadamente, 120 kDa; o entre, aproximadamente, 5 kDa y, aproximadamente, 125 kDa.

[0110] “Marcador”: un marcador, tal y como en el presente documento, se refiere a una entidad o porción cuya presencia o nivel es una característica de un estado o evento particular. En algunas formas de realización, la presencia o nivel de un marcador particular puede ser característica de presencia o fase de una enfermedad, trastorno o condición. Por dar un ejemplo, en algunas formas de realización, el término se refiere a un producto de expresión genética que es característico de un tumor particular, subclase de tumor, fase de un tumor, etc. Además, o de forma alternativa, en algunas formas de realización, una presencia o nivel de un marcador particular se correlaciona con actividad (o nivel de actividad) de una vía de señalización particular, por ejemplo, que puede ser característica de una clase particular de tumores. La importancia estadística de la presencia o ausencia de un marcador puede variar en función del marcador particular. En algunas formas de realización, la detección de un marcador es altamente específica en que refleja una probabilidad alta de que el tumor es de una subclase particular. Dicha especificidad puede ser a costa de la sensibilidad (es decir, se puede producir un resultado negativo incluso si el tumor es un tumor que se espera que el marcador exprese). En cambio, los marcadores con un alto grado de sensibilidad pueden ser menos específicos que los marcadores con menos sensibilidad. Según la presente divulgación, un marcador útil no tiene por qué distinguir tumores de una subclase particular con el 100 % de precisión.

[0111] “Modulador”: el término “modulador” se utiliza para hacer referencia a una entidad cuya presencia o nivel en un sistema en el que se observa una actividad de interés se correlaciona con un cambio en el nivel y/o naturaleza de dicha actividad, en comparación con la observada en otras condiciones comparables cuando el modulador está ausente. En algunas formas de realización, un modulador es un activador en el sentido de que la actividad aumenta en su presencia en comparación con la observada en condiciones comparables cuando el modulador está ausente. En algunas formas de realización, un modulador es un antagonista o inhibidor en el sentido de que la actividad disminuye en su presencia en comparación con la observada en condiciones comparables cuando el modulador está ausente. En algunas formas de realización, un modulador interactúa directamente con una entidad objetivo cuya actividad es de interés. En algunas formas de realización, un modulador interactúa indirectamente (es decir, directamente con un agente intermediario que interactúa con la entidad objetivo) con una entidad objetivo cuya actividad es de interés. En algunas formas de realización, un modulador afecta el nivel de una entidad objetivo de interés; Además o de forma alternativa, en algunas formas de realización, un modulador afecta la actividad de una entidad objetivo de interés sin afectar el nivel la entidad objetivo. En algunas formas de realización, un modulador afecta al nivel y a la actividad de una entidad objetivo de interés de manera que una diferencia observada en la actividad no se explica por completo o es proporcional a la diferencia de nivel observada.

[0112] “Nanopartícula”: tal y como en el presente documento, el término “nanopartícula” se refiere a una partícula que tiene un diámetro inferior a 1000 nanómetros (nm). En algunas formas de realización, una nanopartícula tiene un diámetro inferior a 300 nm, como la Fundación Nacional de Ciencia define. En algunas formas de realización, una nanopartícula tiene un diámetro inferior a 100 nm, como el Instituto Nacional de Salud define. En algunas formas de realización, las nanopartículas son micelas en el sentido de que comprenden un compartimento cerrado, separado de la solución de volumen por una membrana micelar, compuesta generalmente por entidades anfifílicas que rodean y encierran un espacio o compartimento (p. ej., para definir un lumen). En algunas formas de realización, una membrana micelar está compuesta por, al menos, un polímero, como por ejemplo un polímero biocompatible y/o biodegradable.

[0113] “Composición de nanopartículas”: tal y como en el presente documento, el término “composición de nanopartículas” se refiere a una composición que contiene, al menos, una nanopartícula y, al menos, un agente o ingrediente adicionales. En algunas formas de realización, una composición de nanopartículas contiene una colección sustancialmente uniforme de nanopartículas tal y tal y como se describe en el presente documento.

[0114] “Ácido nucleico”: tal y como en el presente documento, el término “ácido nucleico” en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que se incorpora o puede incorporarse en una cadena de oligonucleótidos. En algunas formas de realización, un ácido nucleico es un compuesto y/o sustancia que se incorpora o puede incorporarse en una cadena de oligonucleótidos mediante un enlace fosfodiéster. En algunas formas de realización, “ácido nucleico” se refiere a residuos individuales de ácido nucleico (p. ej., nucleótidos y/o nucleósidos). En algunas formas de realización, “ácido nucleico” se refiere a una cadena de oligonucleótidos que comprende residuos individuales de ácido nucleico. Tal y como se utiliza en el presente documento, los términos “oligonucleótido” y “polinucleótido” pueden utilizarse indistintamente. En algunas formas de realización, “ácido nucleico” engloba ARN, así como el ADN de cadena simple y/o bicatenaria y/o el ADNc. Además, los términos “ácido nucleico”, “ADN”, “ARN” y/ términos similares incluyen análogos de ácido nucleico, es decir, análogos que presentan análogos que no tienen una columna vertebral de fosfodiéster. Por ejemplo, dichos “ácidos nucleicos de péptidos”, que son conocidos en la técnica y tienen enlaces de péptidos en vez de enlaces de fosfodiéster en la columna vertebral, se consideran dentro del ámbito de la presente divulgación. El término “secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos” incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas entre sí y /o codifican la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y/o ARN puede incluir intrones. Los ácidos nucleicos pueden purificarse a partir de fuentes naturales, producidas utilizando sistemas de expresión recombinantes y opcionalmente purificados, sintetizados químicamente, etc. Cuando es apropiado, por ejemplo, en el caso de moléculas sintetizadas químicamente, los ácidos nucleicos pueden comprender análogos de nucleósidos como análogos que presentan bases o azúcares modificadas químicamente, modificaciones de la columna vertebral, etc. Una secuencia de ácido nucleico se presenta en la dirección de 5' a 3', a menos que se indique lo contrario. El término “segmento de ácido nucleico” se utiliza en el presente documento para hacer referencia a una secuencia de ácido nucleico que es una parte de una secuencia de ácido nucleico más larga. En muchas formas de realización, un segmento de ácido nucleico comprende, al menos, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más residuos. En algunas formas de realización, un ácido nucleico es o comprende nucleósidos naturales (p. ej., adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, deoxiadenosina, deoxitimidina, deoxiguanosina y deoxicitidina); análogos de nucleósidos (p. ej., 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metil adenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-iodouridina, C5-propiniluridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-deazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-ocoguanosina, O(6)-metilguanina y 2-tiocitidina); bases modificadas químicamente: bases modificadas biológicamente (p. ej., bases metiladas; bases intercaladas; azúcares modificados (p. ej., 2'-fluororibosa, ribosa, 2'-deoxiribosa, arabinosa y hexosa); y/o grupos de fosfatos modificados (p. ej., enlaces de fosforotioatos y 5'-N-fosforamidita). En algunas formas de realización, la presente divulgación se dirige específicamente a “ácidos nucleicos no modificados”, es decir, ácidos nucleicos (p. ej., polinucleótidos y residuos, incluyendo nucleótidos y/o nucleósidos) que no se han modificado químicamente para facilitar o conseguir la entrega.

[0115] “Composición farmacéutica”: tal y como en el presente documento, el término “composición farmacéutica” se refiere a un agente activo formulado junto con uno o más transportadores farmacéuticos aceptables. En algunas formas de realización, un agente activo está presente en una cantidad de dosis de unidad apropiada para suministro en un régimen terapéutico que muestra una probabilidad estadísticamente significativa de conseguir un efecto terapéutico predeterminado cuando se administra a una población relevante. En algunas formas de realización, las composiciones farmacéuticas pueden formulare especialmente para suministro en forma sólida o líquida, incluyendo las que se han adaptado para lo siguiente: administración oral, por ejemplo, empapes (soluciones acuosas o no acuosas o suspensiones), comprimidos, p. ej., los destinados a la absorción bucal, sublingual y sistémica, bolos, polvos, gránulos, pastas para aplicar en la lengua; administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa o epidural como, por ejemplo, una solución o suspensión estéril, o una formulación de liberación sostenida; aplicación tópica, por ejemplo, en forma de crema, pomada o parche de liberación controlada o aerosol aplicado a la piel, los pulmones o la cavidad oral; por vía intravaginal o intrarrectal, por ejemplo, en forma de pesario, crema o espuma; por vía sublingual, ocular, transdérmica o nasal, pulmonar y a otras superficies mucosas.

[0116] “Condiciones fisiológicas”: la frase “condiciones fisiológicas” tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere al rango de condiciones químicas (p. ej., pH, fuerza iónica) y bioquímicas (p. ej., concentraciones de enzimas) que es probable que se encuentren en los fluidos intracelulares y extracelulares de los tejidos. Para la mayoría de los tejidos, el pH fisiológico oscila entre, aproximadamente, 6,8 y, aproximadamente, 8,0 y la temperatura oscila entre alrededor de 20-40 grados Celsius, alrededor de 25-40 °C, alrededor de 30-40 °C, alrededor de 35-40 °C, alrededor de 37 °C, presión atmosférica de alrededor de 1. En algunas formas de realización, las condiciones fisiológicas utilizan o incluyen un entorno acuoso (p. ej., agua, salina, solución de Ringers o cualquier otra solución tamponada); en algunas de dichas formas de realización, el entorno acuoso es o comprende una solución tamponada de fosfato (p. ej., salina tamponada con fosfato).

[0117] “Polipéptido”: generalmente el término polipéptido, tal y como se utiliza en el presente documento, tiene su significado reconocido en la técnica, es decir, de un polímero de al menos tres aminoácidos, unidos entre sí mediante enlaces de péptidos. En algunas formas de realización, el término se utiliza para hacer referencia a clases funcionales específicas de polipéptidos. Para cada clase, la presente especificación proporciona varios ejemplos de secuencias de aminoácidos de polipéptidos ejemplares conocidos dentro de la clase; en algunas formas de realización, dichos polipéptidos conocidos son polipéptidos de referencia para la clase. En dichas formas de realización, el término “polipéptido” se refiere a cualquier miembro de la clase que muestre homología o identidad de secuencia significativas con un polipéptido de referencia relevante. En muchas formas de realización, dicho miembro también comparte actividad significativa con el polipéptido de referencia. Además, o de forma alternativa, en muchas formas de realización, dicho miembro también comparte un elemento de secuencia característica particular con el polipéptido de referencia (y/o con otros polipéptidos dentro de la clase; en algunas formas de realización con todos los polipéptidos dentro de la clase). Por ejemplo, en algunas formas de realización, un polipéptido miembro muestra un grado general de homología o identidad de secuencia con un polipéptido de referencia que es de, al menos y alrededor de, 30-40%, y frecuentemente es superior a, alrededor de, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más y/o incluye al menos una región (p. ej., una región conservada que en algunas formas de realización puede ser o comprender un elemento de secuencia característico) que muestra una identidad de secuencia muy alta, frecuentemente superior a 90 % o incluso superior a 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %. Dicha región conservada normalmente abarca al menos 3-4 y frecuentemente hasta 20 o más aminoácidos; en algunas formas de realización, una región conservada abarca al menos un tramo de, al menos, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más aminoácidos contiguos. En algunas formas de realización, un polipéptido útil puede comprender o consistir en un fragmento de un polipéptido matriz. En algunas formas de realización, un polipéptido útil puede comprender o consistir en una pluralidad de fragmentos, cada uno de los cuales se encuentra en el mismo polipéptido matriz en una disposición espacial distinta entre sí que la que se encuentra en el polipéptido de interés (p. ej., fragmentos que están unidos directamente en la matriz pueden estar separados espacialmente en el polipéptido de interés o viceversa, y/o los fragmentos pueden estar presentes en un orden diferente en el polipéptido de interés al de la matriz), de manera que el polipéptido de interés es un derivado de su polipéptido matriz. En algunas formas de realización, un polipéptido puede comprender solo aminoácidos naturales o solamente aminoácidos no naturales, o ambos. En algunas formas de realización, un polipéptido puede comprender solo aminoácidos naturales o solamente aminoácidos no naturales. En algunas formas de realización, un polipéptido puede comprender aminoácidos D, aminoácidos L o ambos. En algunas formas de realización, un polipéptido puede comprender solamente aminoácidos D. En algunas formas de realización, un polipéptido puede comprender solamente aminoácidos L. En algunas formas de realización, un polipéptido puede incluir uno o más grupos colgantes, p. ej., modificando o uniendo una o más cadenas laterales de aminoácidos, y/o en el extremo N-terminal de un polipéptido, en el extremo C-terminal de un polipéptido. En algunas formas de realización, un polipéptido puede ser cíclico. En algunas formas de realización, un polipéptido no es cíclico. En algunas formas de realización, un polipéptido es lineal.

[0118] “Polisacárido”: el término “polisacárido” se refiere a un polímero de azúcares. De forma general, un polisacárido comprende al menos tres azúcares. En algunas formas de realización, un polipéptido comprende azúcares naturales (p. ej., glucosa, fructosa, galactosa, manosa, arabinosa, ribosa y xilosa); Además o de forma alternativa, en algunas formas de realización, un polipéptido comprende uno o más aminoácidos naturales (p. ej., azúcares modificados como 2'-fluororibosa, 2'-deoxiribosa y hexosa).

[0119] “Porosidad”: el término “porosidad”, tal y como se usa en el presente documento, se refiere a una medida de espacios vacíos en un material y es una fracción de volumen de vacíos sobre el volumen total, como un porcentaje de entre 0 y 100 %. Un experto en la técnica conoce una determinación de una porosidad utilizando técnicas estándar, por ejemplo, porosimetría de mercurio y adsorción de gas (p. ej., adsorción de nitrógeno).

[0120] “Proteína”: tal y como se utiliza en el presente documento, el término proteína se refiere a un polipéptido (es decir, a una cadena de al menos dos aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos). Las proteínas pueden incluir elementos distintos de los aminoácidos (p. ej., pueden ser glicoproteínas, proteoglicanos, etc.) y/o pueden ser procesadas o modificadas de otro modo. Los expertos en la técnica apreciarán que una “proteína” puede ser una cadena de polipéptidos completa como la producida por una célula (con o sin secuencia de señal), o puede ser una parte característica de esta. Los expertos en la técnica apreciarán que una proteína puede incluir algunas veces más de una cadena de polipéptidos, por ejemplo, unidas por uno o más enlaces de disulfuro o asociadas mediante otros medios. Los polipéptidos pueden contener aminoácidos L, aminoácidos D o ambos, y puede contener cualquier variedad de modificaciones de aminoácidos o análogos conocidos en la técnica. Las modificaciones útiles incluyen, p. ej., acetilación terminal, amidación, metilación, etc. En algunas formas de realización, las proteínas pueden comprender aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales, aminoácidos sintéticos, y combinaciones de estos. El término “péptido” se utiliza generalmente para referirse a un polipéptido que tiene una longitud inferior a, aproximadamente, 100 aminoácidos, inferior a, aproximadamente, 50 aminoácidos, inferior a 20 aminoácidos o inferior a 10 aminoácidos. En algunas formas de realización, las proteínas son anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, porciones biológicamente activas de estos y/o porciones características de estos.

[0121] “Referencia”: el término “referencia” se utiliza frecuentemente en el presente documento para describir un estándar o agente de control, individuo, población, muestra, secuencia o valor contra el que se compara un agente, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés. En algunas formas de realización, se prueba un agente de referencia, individuo, población, muestra, secuencia o valor y/o se determina sustancialmente simultáneamente con la prueba o determinación del agente, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés. En algunas formas de realización, un agente de referencia, individuo, población, muestra, secuencia o valor es una referencia histórica, opcionalmente incorporado a un soporte tangible. De forma general, como los expertos en la técnica entenderían, un agente de referencia, individuo, población, muestra, secuencia o valor se determina o caracteriza bajo condiciones comparables a aquellas utilizadas para determinar o caracterizar el agente, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés.

[0122] “Molécula pequeña”: tal y como se utiliza en el presente documento, el término “molécula pequeña” se utiliza para referirse a moléculas, ya sean de origen natural o creadas artificialmente (p. ej., mediante síntesis química), que tienen un peso molecular bajo y que son orgánicas y/o compuestos inorgánicos. De forma general, una “molécula pequeña” es monomérica y tiene un peso molecular inferior a, alrededor de, 1500 g/mol. En general, una “molécula pequeña” es una molécula cuyo tamaño es inferior a, alrededor de, 5 kilodáltones (kD). En algunas formas de realización, una molécula pequeña es inferior a, alrededor, 4 kD; a, alrededor de, 3 kD; a, alrededor de, 2 kD o a, alrededor de, 1 kD. En algunas formas de realización, la molécula pequeña es inferior a, alrededor de, 800 dáltones (D), alrededor de 600 D, alrededor de 500 D, alrededor de 400 D, alrededor de 300 D, alrededor de 200 D o alrededor de 100 D. en algunas formas de realización, una molécula pequeña es inferior a, alrededor de, 2000 g/mol; inferior a, alrededor de, 1500 g/mol; inferior a, alrededor de, 1000 g/mol; inferior a, alrededor de, 800 g/mol o inferior a, alrededor de, 500 g/mol. En algunas formas de realización, una molécula pequeña no es un polímero. En algunas formas de realización, una molécula pequeña no incluye una porción polimérica. En algunas formas de realización, una molécula pequeña no es una proteína o polipéptido (p. ej., no es un oligopéptido o péptido). En algunas formas de realización, una molécula pequeña no es un polinucleótido (p. ej., no es un oligonucleótido). En algunas formas de realización, una molécula pequeña no es un polisacárido. En algunas formas de realización, una molécula pequeña no comprende un polisacárido (p. ej., no es una glicoproteína, proteoglicano, glicolípido, etc.). En algunas formas de realización, una molécula pequeña no es un lípido. En algunas formas de realización, una molécula pequeña es un agente modulador. En algunas formas de realización, una molécula pequeña es activa biológicamente. En algunas formas de realización, una molécula pequeña es detectable (p. ej., comprende al menos una porción detectable. En algunas formas de realización, una molécula pequeña es una terapéutica. Las moléculas pequeñas preferidas son activas biológicamente en el sentido de que producen un efecto sistémico o local en animales, preferiblemente mamíferos, más preferiblemente humanos. En ciertas formas de realización preferidas, la molécula pequeña es un fármaco. Preferiblemente, pero no necesariamente, el fármaco es uno cuyo uso ya ha sido considerado seguro y eficaz por la agencia u organismo gubernamental correspondiente. Por ejemplo, fármacos para uso humano que figuran en la lista de la FDA bajo 21 C.F.R. §§ 330.5, 331 a 361, y 440 a 460; fármacos para uso veterinario que figuran en la lista de la FDA bajo 21 C.F.R §§ 500 a 589, incorporados en el presente documento mediante referencia, todos se consideran aceptables para su uso según la presente solicitud.

[0123] “Solución”: tal y como se utiliza en el presente documento, el término “solución” se refiere a, en términos generales, a una mezcla homogénea compuesta por una fase. De forma general, una solución comprende un soluto o solutos disueltos en un disolvente o disolventes. Se caracteriza en que las propiedades de la mezcla (como concentración, temperatura y densidad) pueden estar distribuidas de forma uniforme a través del volumen. En el contexto de la presente solicitud, por consiguiente, una “solución de fibroína de seda” se refiere a proteína de fibroína de seda en una forma soluble, disuelta en un disolvente, como agua. En algunas formas de realización, las soluciones de fibroína de seda pueden prepararse a partir de un material de fibroína de seda en estado sólido (p. ej., matrices de seda), como películas de seda y otros andamios. De forma general, un material de fibroína de seda en estado sólido se reconstituye con una solución acuosa, como agua y un tampón químico, en una solución de fibroína de seda. Cabe destacar que no se consideran soluciones las mezclas de líquidos que no son homogéneos, p. ej., coloides, suspensiones, emulsiones.

[0124] “Estable”: el término estable, cuando se aplica a composiciones en el presente documento, significa que las composiciones mantienen uno o más aspectos de su estructura física y/o actividad durante un periodo de tiempo bajo un conjunto de condiciones designado. En algunas formas de realización, el periodo de tiempo es de al menos, aproximadamente, una hora; en algunas formas de realización, el periodo de tiempo es de, aproximadamente, 5 horas; aproximadamente, 10 horas; aproximadamente, un (1) día; aproximadamente, una (1) semana; aproximadamente, dos (2) semanas; aproximadamente, un (1) mes; aproximadamente, dos (2) meses; aproximadamente, tres (3) meses; aproximadamente, cuatro (4) meses; aproximadamente, cinco (5) meses; aproximadamente, seis (6) meses; aproximadamente, ocho (8) meses; aproximadamente, diez (10) meses; aproximadamente, doce (12) meses; aproximadamente, veinticuatro (24) meses; aproximadamente, treinta y seis (36) meses o más. En algunas formas de realización, el periodo de tiempo está dentro del rango de alrededor de un (1) día a alrededor de veinticuatro (24) meses; alrededor de dos (2) semanas a alrededor de doce (12) meses; alrededor de dos (2) meses a alrededor de cinco (5) meses, etc. En algunas formas de realización, las condiciones designadas son condiciones de ambiente (p. ej., a temperatura ambiente y presión ambiental). En algunas formas de realización, las condiciones designadas son condiciones fisiológicas (p. ej., in vivo o a alrededor de 37 °C, por ejemplo, en suero o en salina tamponada con fosfato). En algunas formas de realización, las condiciones designadas están bajo refrigeración (p. ej., a o por debajo de aproximadamente 4 °C, -20 °C o - 70 °C). En algunas formas de realización, las condiciones designadas están en la oscuridad.

[0125] “Sustancialmente”: tal y como se utiliza en el presente documento, el término “sustancialmente” y equivalentes gramáticos, se refieren a la condición cualitativa de presentar una extensión o grado total o casi total de una característica o propiedad de interés. Un experto en la técnica entenderá que los fenómenos biológicos y químicos rara vez, o nunca, llegan a completarse y/o proceden a completarse o a alcanzar o evitar un resultado absoluto.

[0126] “Liberación sostenida”: el término “liberación sostenida” se utiliza en el presente documento según su significado de liberación entendido en la técnica que ocurre en un periodo de tiempo prolongado. El periodo de tiempo prolongado puede ser de al menos alrededor de 3 días, alrededor de 5 días, alrededor de 7 días, alrededor de 10 días, alrededor de 15 días, alrededor de 30 días, alrededor de 1 mes, alrededor de 2 meses, alrededor de 3 meses, alrededor de 6 meses, o incluso de alrededor de un año. En algunas formas de realización, la liberación sostenida no tiene explosión sustancialmente. En algunas formas de realización, la liberación sostenida implica liberación estable durante un período prolongado de tiempo, de manera que la velocidad de liberación no varía durante el período prolongado de tiempo más de, aproximadamente, 5 %; aproximadamente, 10 %; aproximadamente, 20 %; aproximadamente 30 %; aproximadamente, 40 % o, aproximadamente 50 %. En algunas formas de realización, la liberación sostenida implica liberación con cinética de primer orden. En algunas formas de realización, la liberación sostenida implica un estallido inicial, seguida de un período de liberación sostenida. En algunas formas de realización, la liberación sostenida no implica un estallido inicial. En algunas formas de realización, la liberación sostenida es sustancialmente una liberación sin estallido.

[0127] “Agente terapéutico”: tal y como se utiliza en el presente documento, la frase “agente terapéutico” se refiere a cualquier agente que provoca un efecto farmacológico deseado cuando se administra a un organismo. En algunas formas de realización, se considera que un agente es un agente terapéutico si demuestra un efecto estadísticamente significativo en una población adecuada. En algunas formas de realización, la población apropiada puede ser una población de organismos modelo. En algunas formas de realización, una población apropiada puede definirse mediante varios criterios, como un cierto grupo de edad, género, antecedentes genéticos, condiciones clínicas preexistentes, etc. En algunas formas de realización, un agente terapéutico es cualquier sustancia que pueda utilizarse para paliar, mejorar, aliviar, inhibir, prevenir, retrasar la aparición de, reducir la gravedad de y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de una enfermedad, trastorno y/o condición.

[0128] “Cantidad terapéuticamente efectiva”: tal y como se utiliza en el presente documento, el término “cantidad terapéuticamente efectiva” significa una cantidad que es suficiente cuando se administra a una población que sufre de o es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o condición según un régimen de dosis terapéuti enfermedad, trastorno y/o condición. En algunas formas de realización, una cantidad terapéuticamente efectiva es una que reduce la incidencia y/o gravedad de, y/o retrasar la aparición de uno o más síntomas de la enfermedad, trastorno y/o condición. Los expertos en la técnica apreciarán que el término “cantidad terapéuticamente efectiva” no requiere que se consiga, de hecho, un tratamiento satisfactorio en un individuo particular. Más bien, una cantidad terapéuticamente efectiva puede ser la cantidad que proporciona una respuesta farmacológica particular deseada en un número significativo de sujetos cuando se administra a pacientes que necesitan dicho tratamiento. Se entiende específicamente que sujetos particulares pueden ser, de hecho, “refractarios” a una “cantidad terapéuticamente efectiva”. Por dar algún ejemplo, un sujeto refractario puede tener una biodisponibilidad baja de manera que la eficacia clínica no sea obtenible. En algunas formas de realización, la referencia a una cantidad terapéuticamente efectiva puede ser una referencia a una cantidad medida en uno o más tejidos específicos (p. ej., un tejido afectado por la enfermedad, trastorno o condición) o fluidos (p. ej., sangre, saliva, suero, sudor, lágrimas, urina, etc.). Los expertos en la técnica apreciarán que, en algunas formas de realización, se puede formular y/o suministrar una cantidad terapéuticamente efectiva en una sola dosis. En algunas formas de realización, una cantidad terapéuticamente efectiva puede formularse y/o suministrarse en una pluralidad de dosis, por ejemplo, como parte de un régimen de dosis.

[0129] “Tratar”: tal y como se utiliza en el presente documento, el término “tratar” se refiere a paliar, mejorar, aliviar, inhibir, prevenir (durante, al menos, un periodo de tiempo), retrasar la aparición de, reducir la gravedad de, reducir la frecuencia de y/o reducir la incidencia parcial o completamente de uno o más síntomas o características de una enfermedad, trastorno y/o condiciones particulares. En algunas formas de realización, el tratamiento puede administrarse a un sujeto que no muestra síntomas, signos o características de una enfermedad y/o muestra los primeros síntomas, signos y/o características de la enfermedad, por ejemplo, con el objetivo de reducir el riesgo de desarrollar patologías asociadas con la enfermedad. En algunas formas de realización, el tratamiento puede suministrarse después del desarrollo de uno o más síntomas, signos y/o características de la enfermedad.

[0130] “Variante”: tal y como se utiliza en el presente documento, el término “variante” se refiere a una entidad que muestra identidad estructural significativa con una entidad de referencia, pero difiere estructuralmente de la entidad de referencia en la presencia o nivel de una o más partes químicas en comparación con la entidad de referencia. En muchas formas de realización, una variante también difiere funcionalmente de su entidad de referencia. En general, el hecho de que una entidad concreta se considere propiamente una "variante" de una entidad de referencia se basa en su grado de identidad estructural con la entidad de referencia. Como apreciarán los expertos en la técnica, cualquier entidad de referencia biológica o química tiene ciertos elementos estructurales característicos. Por definición, una variante es una entidad química distintiva que comparte uno o más de dichos elementos estructurales característicos. Por dar algunos ejemplos. Una molécula pequeña puede tener un elemento estructural de núcleo característico (p. ej., un núcleo macrociclo) y/o una o más partes colgantes características de manera que una variante de la molécula pequeña es una que comparte el elemento estructural del núcleo y las partes colgantes características, pero difiere en otras partes colgantes y/o en los tipos de enlaces presentes (individual vs. Doble, E vs. Z, etc.) dentro del núcleo, un polipéptido puede tener un elemento de secuencia característico compuesto por una pluralidad de aminoácidos que tienen posiciones designadas relacionadas entre sí en un espacio lineal o tridimensional y/o que contribuyen con una función biológica particular, un ácido nucleico puede tener un elemento de secuencia característico compuesto por una pluralidad de residuos de nucleótidos que tienen posiciones designadas relacionadas entre sí en un espacio lineal o tridimensional. Por ejemplo, un polipéptido variante puede diferir de un polipéptido de referencia debido a una o más diferencias en secuencia de aminoácido y/o una o más diferencias en las partes químicas (p. ej., carbohidratos, lípidos, etc.) unidas de forma covalente a la columna vertebral del polipéptido. En algunas formas de realización, un polipéptido variante muestra una identidad de secuencia general con un polipéptido de referencia que es al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % o 99 %. Además, o de forma alternativa, en algunas formas de realización, un polipéptido variante no comparte al menos un elemento de secuencia característico con un polipéptido de referencia. En algunas formas de realización, el polipéptido de referencia tiene una o más actividades biológicas. En algunas formas de realización, un polipéptido variante comparte una o más de las actividades biológicas del polipéptido de referencia. En algunas formas de realización, un polipéptido variante carece de una o más de las actividades biológicas del polipéptido de referencia. En algunas formas de realización, un polipéptido variante muestra un nivel reducido de una o más actividades biológicas en comparación con el polipéptido de referencia. En muchas formas de realización, un polipéptido de interés se considera una “variante” de un polipéptido matriz o de referencia si el polipéptido de interés tiene una secuencia de aminoácido que es idéntica a la de la matriz, pero para un número pequeño de alteraciones de secuencias en posiciones particulares. De forma general, menos del 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % de los residuos de la variante se sustituyen en comparación con la matriz. En algunas formas de realización, una variante tiene 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 residuo sustituido en comparación con una matriz. Frecuentemente, una variante tiene un número pequeño (p. ej., menos de 5, 4, 3, 2 o 1) de residuos funcionales sustituidos (es decir, residuos que participan en una actividad biológica particular). Además, de forma general, una variante no tiene más de 5, 4, 3, 2 o 1 adiciones o eliminaciones, y frecuentemente no tiene adiciones o eliminaciones, en comparación con la matriz. Además, las adiciones o eliminaciones son, de forma general, inferiores a aproximadamente, 25; aproximadamente, 20; aproximadamente, 19; aproximadamente, 18; aproximadamente, 17; aproximadamente, 16; aproximadamente, 15; aproximadamente, 14; aproximadamente, 13; aproximadamente, 10; aproximadamente, 9; aproximadamente 8; aproximadamente 7; aproximadamente 6; y comúnmente inferiores a aproximadamente, 5; aproximadamente, 4; aproximadamente, 3 o aproximadamente 2 residuos. En algunas formas de realización, el polipéptido matriz o de referencia es uno que se encuentra en la naturaleza. Como entenderán los expertos en la técnica, una pluralidad de variantes de un polipéptido particular de interés puede encontrarse comúnmente en la naturaleza, especialmente cuando el polipéptido de interés es un polipéptido de agente infeccioso.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE CIERTAS FORMAS DE REALIZACIÓN

[0131] Entre otros aspectos, la presente divulgación proporciona materiales a base de fibroína de seda y métodos de preparación y utilización de dichos materiales a base de fibroína de seda. Según la presente divulgación, se describen varias formas de realización en detalle en el presente documento, en particular, la presente divulgación describe materiales a base de fibroína de seda y su utilización en varias aplicaciones, incluyendo, por ejemplo: biomateriales, dispositivos biomédicos, biosensores, aplicaciones de liberación controlada, suministro de fármacos, sistemas electrónicos, materiales para degradación sintonizable, óptica, fotónica, medicina regenerativa, sensores, aplicaciones para ingeniería de tejidos, regeneración de tejidos, andamios tisulares y coagulación de heridas.

[0132] Los materiales a base de fibroína de seda proporcionados se caracterizan por características únicas que proporcionan ventajas sobre los materiales con memoria de forma ya existentes. Los materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación muestran susceptibilidad a la compresión de manera que dichos materiales se caracterizan en que pueden adoptar al menos dos estados diferentes, un estado precomprimido y un estado comprimido. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación muestran susceptibilidad al hinchamiento de manera que dichos materiales se caracterizan en que pueden adoptar además un estado expandido.

[0133] Una tensión de compresión reduce el volumen de los materiales a base de fibroína en relación con su volumen del estado precomprimido. En algunas formas de realización, una tensión de compresión deforma la forma de un material a base de fibroína de seda en relación con su forma del estado precomprimido. Además, en algunas formas de realización, el aumento aumenta el volumen de un material a base de fibroína de seda en relación con su volumen del estado precomprimido de manera que su volumen es sustancialmente equivalente a o mayor que su volumen del estado precomprimido.

[0134] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda se caracterizan en que cuando están en un estado comprimido, retienen su volumen reducido y/o forma deformada hasta que se exponen a un activador y/o estímulos externos. Cuando se expone a un activador y/o estímulos externos, dichos materiales a base de fibroína de seda se recuperan a un volumen mayor. Dichos materiales a base de fibroína de seda recuperan sustancialmente su volumen precomprimido. En algunas formas de realización, dichos materiales a base de fibroína de seda recuperan sustancialmente su forma precomprimida.

[0135] Cuando se exponen a un activador y/o estímulos externos, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados se caracterizan por expansión volumétrica. En algunas formas de realización, están comprimidos por una tensión de compresión de, al menos, aproximadamente, 90 %, de manera que están comprimidos a, aproximadamente, 10 % o menos de su volumen original, dichos materiales se caracterizan en que cuando se exponen a un activador y/o estímulos externos recuperan sustancialmente su volumen y/o su forma. En algunas formas de realización, dichos materiales recuperados carecen sustancialmente de una indicación de una deformación plástica. En algunas formas de realización, cuando están comprimidos por una tensión de compresión de hasta 100 kPa, dichos materiales se caracterizan en que cuando se exponen a un activador y/o estímulos externos recuperan su volumen y/o su forma. En algunas formas de realización, dichos materiales recuperados carecen sustancialmente de una indicación de una deformación plástica.

[0136] Los polímeros con memoria de forma generalmente describen una clase de materiales que se pueden recuperar de una forma deformada a su forma original predefinida en presencia de un estímulo. Varios polímeros con memoria de forma sintéticos existen, como poliuretano, silicona, poli(láctido), poli(caprolactona) y poli(glicolido). Ver, por ejemplo, Wong Y, Kong J, Widjaja LK, Venkatraman SS. Biomedical applications of shape-memory polymers: how practically useful are they? Sci China Chem 2014;57(4):476-89; veáse también Safranski DL, Smith KE, Gall K. Mechanical requirements of shape-memory polymers in biomedical devices, Polym Rev 2013;53(1):76-91. Para dispositivos biomédicos, los materiales con memoria de forma implantables deben ser lo suficientemente duros y resistentes a la fatiga para las aplicaciones con carga, mostrar una fuerza de recuperación lo suficientemente fuerte para expandirse en un espacio confinado, poseer una degradabilidad controlada y resorción, y ser biocompatibles con el tejido que los rodea. Ver, por ejemplo, Hager, M. D., Bode, S., Weber, C., & Schubert, U. S., Shape memory polymers: Past present and future developments, 49-50 Progress in Polymer Science, 3-33 (2015).

[0137] Los materiales sintéticos tienen, generalmente, los módulos y la dureza suficientes cuando están secos, pero normalmente experimentan pérdida de integridad mecánica cuando se mojan o se exponen al entorno biológico durante largos períodos de tiempo. También necesitan estar programados para degradarse mediante la adición de enlazadores de agua soluble, y la biocompatibilidad depende de muchos factores, como productos de degradación, ubicación de la implantación, nivel de fatiga y duración en el cuerpo. Estos materiales pueden no causar siempre una respuesta biológica inmune, pero también pueden no integrarse bien con el tejido.

[0138] De forma alternativa, ciertos materiales de origen biológico pueden procesarse para comportarse como los SMPs. Los materiales naturales frecuentemente disfrutan de los beneficios de ser biocompatibles y degradables mediante procesos químicos y enzimáticos en el cuerpo. Correia and Mano hicieron andamios de quitosano reticulados con genipina con memoria de forma que se expanden en presencia de agua. Veáse Correia CO, Mano JF. Chitosan scaffolds with a shape memory effect induced by hydration. J Mater Chem B 2014; 2 (21):3315-23. La reticulación con genipina permitió a la red de quitosano experimentar un mayor hinchamiento en agua en comparación con quitosano no reticulado (hasta 400 % por peso). De forma adicional, el quitosano reticulado mostró una recuperación del 98 % después de una deformación de tensión del 60 %, pero la recuperación fue lenta y tardó 15 minutos. Bencherif et al. Crearon andamios de alginato metacrilado a través de un proceso de criogelación que produjo geles con memoria de forma. Veáse Bencherif SA, Sands RW, Bhatta D, Arany P, Verbeke CS, Edwards dA, et al. Injectable performed scaffolds with shape-memory properties, Proc Natl Acad Sci USA 2012, 109 (48):19590-5. Los geles de alginato podrían recuperar 92 % de su volumen original después de una deformación del 90 %, podrían inyectarse a través de una aguja para implantaciones mínimamente invasivas. Además, los geles podrían impregnarse con células y utilizarse como un dispositivo de entrega de células para aplicaciones terapéuticas. Los geles se implantaron in vivo y se recuperaron 2 días después. Los geles eran biocompatibles en ratones, y solamente se reportó una degradación mínima.

[0139] Al contrario que los ya existentes polímeros con memoria de forma sintéticos o naturales, en algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda que contienen un plastificante muestran una recuperación rápida. En algunas formas de realización, una recuperación rápida se produce en segundos. En algunas formas de realización, una recuperación rápida muestra una expansión de volumen de hasta 50 veces y una expansión de hasta el 900 % por masa sin mostrar evidencias de deformación plástica.

[0140] Previamente a esta divulgación, los métodos de liofilización se centraban en congelar soluciones rápidamente en un entorno de temperatura constante (p. ej., en un congelador de laboratorio o en un congelador tipo baúl) y en dejar que las muestras permanezcan a la temperatura constante durante varios días. Se consigue una congelación rápida o una congelación veloz mediante el ajuste de la temperatura del estante a la temperatura objetivo, lo que hace que la solución se congele a la temperatura establecida en menos de una hora.

[0141] Por el contrario, los métodos de la presente divulgación utilizan liofilización controlada durante un periodo de tiempo y/o congelación lenta. En algunas formas de realización, por ejemplo, las muestras tardan 5 horas, 10 horas o 20 horas en conseguir una temperatura objetivo. Los métodos proporcionados incluyen liofilización controlada durante un periodo de tiempo y/o la congelación lenta, que produce materiales a base de fibroína de seda para formar una estructura que comprende poros. Dichos poros se caracterizan por estar interconectados a través de un material a granel, sustancialmente espaciados de forma uniforme, que presentan una morfología sustancialmente redondeada y/o que presentan una forma de poros sustancialmente uniforme, y por una ausencia sustancial de cristales de hielo tal y como se describe en el presente documento.

[0143] Los métodos anteriores utilizan pozos de plástico para congelación rápida. El plástico no conduce el calor y cuando se utiliza proporciona una solución de seda que está más caliente que el punto de ajuste de la estantería. Las muestras que se mantienen a una temperatura superior a la deseada provocan dan lugar a incoherencias en la congelación de la solución. Por ejemplo, generalmente, los moldes de plástico hacen que se forme una bicapa en la que la mitad de la espuma tiene poros redondeados y la otra mitad contiene una distribución heterogénea de tamaños y geometrías de poros.

[0144] De forma adicional, a diferencia de los métodos de liofilización previos que utilizaban placas de pozos de poliestireno para moldear los polímeros con memoria de forma, los métodos proporcionados, en algunas formas de realización, utilizan materiales altamente termoconductores, como el aluminio para formar los materiales a base de fibroína de seda proporcionados. En algunas formas de realización, los métodos proporcionados incluyen la formación de materiales a base de fibroína de seda que se caracterizan por tener: poros redondeados, una distribución espaciada uniformemente de los poros, una distribución espaciada uniformemente del tamaño de los poros y una morfología de poros consistente a lo largo de un volumen.

[0145] Sin el uso de una molécula de plastificante y procesos de liofilización controlados, las espumas previas se deformaban plásticamente cuando se comprimían. En general, la deformación plástica se considera una calidad desfavorable. Los materiales deformados plásticamente mostrarán propiedades mecánicas distintas a la forma original. Dichos materiales deformados plásticamente, por ejemplo, no son capaces de llenar un vacío en el cuerpo, no permiten la infiltración celular y/o no permiten cinética de degradación predecible in vivo.

[0146] Por el contrario, en algunas formas de realización, los métodos presentes y los materiales a base de fibroína de seda formados a partir de estos no muestran evidencias de deformación plástica tras la compresión.

[0147] Además y a diferencia de previos polímeros con memoria de forma, en algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación se expandirán para llenar un vacío en el cuerpo cuando se implantan in vivo y se exponen a un activador y/o estímulos externos.

[0148] De forma adicional, los métodos presentes y los materiales a base de fibroína de seda formados a partir de estos, en algunas formas de realización, permiten infiltración celular y poseen cinética de degradación predecible, que son propiedades que claramente no están presentes en previos polímeros con memoria de forma.

Materiales a base de fibroína de seda

[0149] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda son o comprenden fibroína de seda y/o fragmentos de fibroína de seda.

Sedas

[0150] En algunas formas de realización, un polímero es seda. La seda es una fibra de proteína natural producida en una glándula especializada de ciertos organismos. La producción de seda en organismos es especialmente común en los himenópteros (abejas, avisas y hormigas), y se utiliza a veces en la construcción de nidos. Otros tipos de artrópodos también producen seda, especialmente varios arácnidos como las arañas (p. ej., arañas de seda). Las fibras de seda generadas por insectos y arañas representan las fibras naturales más fuertes conocidas y son incluso rivales de las fibras sintéticas de alto rendimiento.

[0151] La seda ha sido un producto muy deseado y utilizado desde que apareció por primera vez en la antigua China (veáse Elisseeff, “The Silk Roads: Highways of Culture and Commerce,” Berghan Books/UNESCO, New York (2000); veáse también Vainker, “Chinese Silk: A Cultural History,” Rutgers University Press, Piscataway, New Jersey (2004)). Brillante y suave, la seda no es solamente codiciada por los diseñadores de moda, sino también por ingenieros de tejidos porque es dura mecánicamente, pero se degrada dentro del cuerpo sin causar ningún daño, ofreciendo nuevas oportunidades como sustrato de materiales altamente robusto y biocompatible (veáse Altman et al., Biomaterials, 24:402 (2003); veáse también Sashina et al., Russ. J. Appl. Chem., 79:860 (2006)).

[0152] Varias especies producen seda de forma natural incluyendo, pero sin limitarse a:

Antheraea mylitta; Antheraea pernyi; Antheraea yamamai; Galleria mellonella; Bombyx mori; Bombyx mandarina; Galleria mellonella; Nephila clavipes; Nephila senegalensis; Gasteracantha mammosa; Argiope aurantia; Araneus diadematus; Latrodectus geometricus; Araneus bicentenarius; Tetragnatha versicolor; Araneus ventricosus; Dolomedes tenebrosus; Euagrus chisoseus; Plectreurys tristis; Argiope trifasciata; y Nephila madagascariensis.

[0153] En general, cualquiera de dichos organismos puede producir seda para uso según la presente divulgación a partir de una fuente recombinante, o se puede preparar seda a través de un proceso artificial, por ejemplo, mediante la ingeniería genética de células u organismos para producir una proteína de seda y/o síntesis química. En algunas formas de realización de la presente divulgación, los gusanos de seda, Bombyx mori, producen seda.

[0154] Como se sabe en la técnica, las sedas son modulares en diseño, con grandes repeticiones internas flanqueadas por dominios de extremos terminales (extremos N-terminal y C-terminal) más cortos (~100 aminoácidos). Las sedas de origen natural tienen un alto peso molecular (de 200 a 350 kDa o superior) con transcripciones de 10000 pares de base y superior y > 3000 aminoácidos (revisado en Omenetto y Kaplan (2010) Science 329:528-531). Los dominios modulares más grandes se interrumpen con espaciadores relativamente cortos con grupos de carga hidrofóbica en el caso de la seda del gusano de seda. Los extremos N-terminal y C-terminal están involucrados en el montaje y tratamiento de las sedas, incluyendo control de pH del montaje. Los extremos N-terminal y C-terminal están muy conservados, a pesar de su tamaño relativamente pequeño en comparación con los módulos internos. A continuación, la tabla 1 proporciona una lista ejemplar de especies que producen seda y de proteínas de seda:

A. Gusanos de seda

Adhesión Especie

Glándula productora Proteína

AAN28165 Antheraea mylitta Salival Fibroína

AAC32606 Antheraea ern i Salival Fibroína

AAK83145 Fibroína

AAG10393 Fibroína de cadena pesada (N-

terminal)

AAG10394 Gallería mellonella Salival Fibroína de cadena pesada (C-terminal)

P05790 Bombyx morí Salival Precursor de la cadena pesada

de fibroína, Fib-H, H-fibroin

e

e

B. Arañas

Adhesión Especie

Glándula productora

Proteína

P19837 Nephila clavipes Ampolla mayor Espidroína 1, fibroína de seda dragline 1

i

g

AAK30609 Nephila seneqalensis Ampolla mayor Espidroína 2

AAK30601 Gasteracantha Ampolla mayor Espidroína 2

mammosa

AAK30592 Argiope aurantia Ampolla mayor Espidroína 2

AAC47011 Araneus diadematus Ampolla mayor Fibroína-4, ADF-4

polla mayor Espidroína 2 polla mayor Espidroína 2

polla mayor

Espidroína 1

AAN85280 Araneus ventricosus Ampolla mayor Proteína de seda dragline-1

AAN85281 Araneus ventricosus Am olla ma or Proteína de seda dra line-2

AAF36091 Nephila Flageliforme Fibroína, proteína de seda (N-madagascariensis terminal)

AAF36092 Nephila Flageliforme Proteína de seda (C-terminal) madaqascariensis

AAC38846 Nephila clavipes Flageliforme Fibroína, proteína de seda (N-terminal)

AAC38847

Flageliforme

Proteína de seda (C-terminal)

Tabla 1: una lista ejemplar de especies que producen seda y de proteínas de seda (adaptada de Bini et al. (2003), J. Mol. Bio. 335(1):27-40).

Fibroína de seda

[0155] La fibroína es un tipo de proteína estructural producido por ciertas arañas y especies de insectos que producen seda. La seda de capullo producida por los gusanos de seda, Bombyx mori, es de interés particular porque ofrece producción apropiada a gran escala de bajo coste para un número de aplicaciones comerciales, como el textil.

[0156] La seda de capullos de gusanos de seda contiene dos proteínas estructurales, la cadena pesada de fibroína (~350 kDa) y la cadena ligera de fibroína ((~25 kDa), que están asociadas con una familia de proteínas no estructurales denominadas sericina, que pegan la fibroína para formar el capullo. Las cadenas pesadas y ligeras de fibroína están unidas mediante un enlace de disulfuro en el extremo C-terminal de las dos subunidades (veáse Takei, F., Kikuchi, Y., Kikuchi, A., Mizuno, S. y Shimura, K. (1987) 105 J. Cell Biol., 175-180; veáse también Tanaka, K., Mori, K. y Mizuno, S.

114 J. Biochem. (Tokyo), 1-4 (1993); Tanaka, K., Kajiyama, N., Ishikura, K., Waga, S., Kikuchi, A., Ohtomo, K., Takagi, T. y Mizuno, S., 1432 Biochim. Biophys. Acta., 92-103 (1999); Y Kikuchi, K Mori, S Suzuki, K Yamaguchi y S Mizuno, “Structure of the Bombyx mori fibroin light-chain-encoding gene: upstream sequence elements common to the light and heavy chain,” 110 Gene, 151-158 (1992)). Las sericinas tienen un alto peso molecular, glicoproteínas solubles compuestas de seda que proporciona viscosidad al material. Estas glicoproteínas son hidrofílicas y pueden eliminarse fácilmente de los capullos hirviéndolas en agua.

[0157] Tal y como se usa en el presente documento, el término “fibroína de seda” se refiere a proteínas de fibroína de seda, ya hayan sido producidas por gusanos de seda, arañas u otros insectos que de otra manera (Lucas et al., 13 Adv. Protein Chem., 107-242 (1958)). En algunas formas de realización, se obtiene la fibroína de seda a partir de una solución que contiene una seda de gusano de seda disuelta o de seda de araña disuelta. Por ejemplo, en algunas formas de realización, las fibroínas de seda de gusanos de seda se obtienen a partir del capullo de Bombyx mori. En algunas formas de realización, las fibroínas de seda de araña se obtienen, por ejemplo, de Nephila clavipes. En alternativa, en algunas formas de realización, las fibroínas de seda apropiadas para su uso en la invención se obtienen a partir de una solución que contiene una seda modificada genéticamente a partir de una bacteria, hongo, células de mamíferos, animales o plantas transgénicos. Ver, p. ej., WO 97/08315 y la patente estadounidense número 5.245, 012.

[0158] Por consiguiente, en algunas formas de realización, una solución de seda se utiliza para fabricar composiciones de la presente divulgación que contienen proteínas de fibroína, no tienen esencialmente sericinas. En algunas formas de realización, las soluciones de seda utilizadas para fabricar varias composiciones de la presente divulgación contienen la cadena pesada de fibroína, pero no tienen esencialmente otras proteínas. En otras formas de realización, las soluciones de seda utilizadas para fabricar varias composiciones de la presente divulgación contienen tanto las cadenas pesadas como las cadenas ligeras de fibroína, pero no tienen esencialmente otras proteínas. En ciertas formas de realización, las soluciones de seda utilizadas para fabricar varias composiciones de la presente divulgación comprenden tanto una cadena pesada como ligera de fibroína de seda; en algunas formas de realización, la cadena pesada y la cadena ligera de la fibroína de seda están unidas mediante, al menos, un enlace de disulfuro. En algunas formas de realización donde las cadenas pesadas y ligeras de fibroína están presentes, están unidas mediante uno, dos, tres o más enlaces de disulfuro. Aunque diferentes especies de organismos que producen seda y diferentes tipos de seda tienen distintas composiciones de aminoácidos, varias proteínas de fibroína comparten ciertas características estructurales. Una tendencia general en una estructura de fibroína de seda es una secuencia de aminoácidos que se caracteriza por la alternación usual de glicina y alanina, o solamente de alanina. Dicha configuración permite a las moléculas de fibroína autoensamblarse en una conformación de lámina beta. Estos bloques hidrofóbicos “ricos en alanina” están separados, de forma general, por segmentos de aminoácidos con grupos laterales voluminosos (p. ej., espaciadores hidrofílicos):

[0159] Los materiales de seda explícitamente ejemplificados en el presente documento se prepararon, generalmente, a partir de un material hilado por el gusano de seda, Bombyx mori. De forma general, los capullos se hierven en una solución acuosa de 0,02 M Na2CO3, después se enjuagan minuciosamente con agua para extraer las proteínas de sericina similares al pegamento. Después, la seda extraída se disuelve en un disolvente, por ejemplo, solución de LiBr (como 9,3 M) a temperatura ambiente. Después, una solución de fibroína de seda resultante puede tratarse para una variedad de aplicaciones tal y como se describe en el presente documento.

[0160] En algunas formas de realización, los polímeros se refieren a cadenas de péptidos o polipéptidos que tienen secuencia de aminoácidos correspondiente a los fragmentos derivados de proteínas de fibroína de seda o variantes de estas. En el contexto de materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación, los fragmentos de fibroína de seda, generalmente, se refieren a cadenas de péptidos de fibroína de seda o polipéptidos de fibroína de seda que son más pequeños que los equivalentes de fibroína de seda de longitud completa de origen natural, como uno o más fragmentos de fibroína de seda dentro de una población o composición. En algunas formas de realización, por ejemplo, los materiales a base de fibroína de seda comprenden polipéptidos de fibroína de seda que tienen un peso molecular medio de entre, aproximadamente, 3,5 kDa y, aproximadamente, 400 kDa. En algunas formas de realización, los rangos apropiados de fragmentos de fibroína de seda incluyen, pero no se limitan a: polipéptidos de fibroína de seda que tienen un peso molecular medio de entre, aproximadamente, 3,5 kDa y, aproximadamente, 150 kDa; polipéptidos de fibroína de seda que tienen un peso molecular medio de entre, aproximadamente, 3,5 kDa y, aproximadamente, 120 kDa. En algunas formas de realización, los polipéptidos de fibroína de seda tienen un peso molecular medio de: aproximadamente, 3,5 kDa; aproximadamente , 4 kDa; aproximadamente, 4,5 kDa; aproximadamente, 45kDa; aproximadamente, 6 kDa; aproximadamente, 7 kDa; aproximadamente, 8 kDa; aproximadamente, 9 kDa; aproximadamente, 10 kDa; aproximadamente, 15 kDa; aproximadamente, 20 kDa; aproximadamente, 25 kDa; aproximadamente, 30 kDa; aproximadamente, 35 kDa; aproximadamente, 40 kDa; aproximadamente, 45 kDa; aproximadamente, 50 kDa; aproximadamente, 55 kDa; aproximadamente, 60 kDa; aproximadamente, 65 kDa; aproximadamente, 70 kDa; aproximadamente, 75 kDa; aproximadamente, 80 kDa; aproximadamente, 85 kDa; aproximadamente, 90 kDa; aproximadamente, 95 kDa; aproximadamente, 100 kDa; aproximadamente, 105 kDa; aproximadamente, 110 kDa; aproximadamente, 115 kDa ; aproximadamente, 120 kDa; aproximadamente, 125 kDa; aproximadamente, 150 kDa; aproximadamente, 200 kDa; aproximadamente, 250 kDa; aproximadamente, 300 kDa; aproximadamente, 350 kDa o aproximadamente, 400 kDa. En formas de realización preferidas, los polipéptidos de fibroína de seda tienen un peso molecular medio de, aproximadamente, 100 kDa.

[0161] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda son o comprenden fibroína de seda y/o fragmentos de fibroína de seda. En algunas formas de realización, se pueden utilizar fibroína de seda y/o fragmentos de fibroína de seda de varios pesos moleculares. En algunas formas de realización, la fibroína de seda y/o fragmentos de fibroína de seda de varios pesos moleculares son polipéptidos de fibroína de seda. En algunas formas de realización, los polipéptidos de fibroína de seda son de tamaño “reducido”, por ejemplo, más pequeños que el equivalente original o de tipo salvaje, se puede referir a ellos como “fibroína de seda de bajo peso molecular”. Para más detalles acerca de las fibroínas de seda con bajo peso molecular, veáse la solicitud provisional estadounidense que se adjunta en el presente documento, cuyo título es “FIBROÍNA DE SEDA DE BAJO PESO MOLECULAR Y USOS DE ESTA”. En algunas formas de realización, los polipéptidos de fibroína de seda tienen un peso molecular medio inferior a 350 kDa, inferior a 300 kDa; inferior a 250 kDa; inferior a 200 kDa; inferior a 175 kDa; inferior a 150 kDa; inferior a 120 kDa; inferior a 100 kDa; inferior a 90 kDa; inferior a 80 kDa; inferior a 70 kDa; inferior a 60 kDa; inferior a 50 kDa; inferior a 40 kDa; inferior a 30 kDa; inferior a 25 kDa; inferior a 20 kDa; inferior a 15 kDa; inferior a 12 kDa; inferior a 10 kDa; inferior a 9 kDa; inferior a 8 kDa; inferior a 7 kDa; inferior a 6 kDa; inferior a 5 kDa; inferior a 4 kDa; inferior a 3,5 kDa; inferior a 3 kDa; inferior a 2,5 kDa; inferior a 2 kDa; inferior a 1,5 kDa o inferior a 1 kDam etc.

[0162] En algunas formas de realización, los polímeros de fragmentos de fibroína de seda pueden provenir del desgomado de capullos de seda a o casi a (p. ej., dentro de aproximadamente 5 %) una temperatura de ebullición atmosférica durante, al menos, 1 minutos de ebullición; 2 minutos de ebullición; 3 minutos de ebullición; 4 minutos de ebullición; 5 minutos de ebullición; 6 minutos de ebullición; 7 minutos de ebullición; 8 minutos de ebullición; 9 minutos de ebullición; 10 minutos de ebullición; 11 minutos de ebullición; 12 minutos de ebullición; 13 minutos de ebullición; 14 minutos de ebullición; 15 minutos de ebullición; 16 minutos de ebullición; 17 minutos de ebullición; 18 minutos de ebullición; 19 minutos de ebullición; 20 minutos de ebullición; 25 minutos de ebullición; 30 minutos de ebullición; 35 minutos de ebullición; 40 minutos de ebullición; 45 minutos de ebullición; 50 minutos de ebullición; 55 minutos de ebullición; 60 minutos de ebullición o más incluyendo, por ejemplo, al menos 70 minutos; al menos 80 minutos; al menos 90 minutos; al menos 100 minutos; al menos 110 minutos; al menos 120 minutos o más. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término “temperatura de ebullición atmosférica” se refiere a una temperatura a la que se hierve un líquido bajo temperatura atmosférica.

[0163] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación producidos a partir de fragmentos de fibroína pueden formarse mediante el desgomado de capullos de seda en una solución acuosa a temperaturas de: alrededor de 30 °C; alrededor de 35 °C; alrededor de 40 °C; alrededor de 45 °C; alrededor de 50 °C; alrededor de 55 °C; alrededor de 60 °C; alrededor de 65 °C; alrededor de 70 °C; alrededor de 75 °C; alrededor de 80 °C; alrededor de 85 °C; alrededor de 90 °C; alrededor de 95 °C; alrededor de 100 °C; alrededor de 105 °C; alrededor de 110 °C; alrededor de 115 °C, alrededor de, al menos 120 °C.

[0164] En algunas formas de realización, dicha temperatura elevada puede conseguirse llevando a cabo parte del proceso de calentamiento (p. ej., proceso de ebullición) bajo presión. Por ejemplo, la presión apropiada bajo la cual los fragmentos de fibroína de seda descritos en el presente documento pueden producirse está, generalmente, entre 10-40 psi, p. ej., alrededor de 11 psi; alrededor de 12 psi; alrededor de 13 psi; alrededor de 14 psi; alrededor de 15 psi; alrededor de 16 psi; alrededor de 17 psi; alrededor de 18 psi; alrededor de 19 psi; alrededor de 20 psi; alrededor de 21 psi; alrededor de 22 psi; alrededor de 23 psi; alrededor de 24 psi; alrededor de 25 psi; alrededor de 26 psi; alrededor de 27 psi; alrededor de 28 psi; alrededor de 29 psi; alrededor de 30 psi; alrededor de 31 psi; alrededor de 32 psi; alrededor de 33 psi; alrededor de 34 psi; alrededor de 35 psi; alrededor de 36 psi; alrededor de 37 psi; alrededor de 38 psi; alrededor de 39 psi o alrededor de 40 psi.

[0165] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados se modulan mediante el control de una concentración de seda. En algunas formas de realización, un porcentaje de peso de fibroína de seda puede estar presente en la solución a cualquier concentración adaptada a las necesidades. En algunas formas de realización, una solución de fibroína de seda puede tener fibroína de seda a una concentración de, aproximadamente, 0,1 mg/mL a, aproximadamente, 50 mg/mL. En algunas formas de realización, una solución de fibroína de seda puede constar de fibroína de seda a una concentración de, aproximadamente, inferior a 1 mg/mL; aproximadamente, inferior a 1, 5 mg/mL; aproximadamente, inferior a 2 mg/mL; aproximadamente, inferior a 2,5 mg/mL; aproximadamente, inferior a 3 mg/mL; aproximadamente, inferior a 3,5 mg/mL; aproximadamente, inferior a 4 mg/mL; aproximadamente, inferior a 4,5 mg/mL; aproximadamente, inferior a 5 mg/mL; aproximadamente, inferior a 5,5 mg/mL; aproximadamente, inferior a 6 mg/mL; aproximadamente, inferior a 6,5 mg/mL; aproximadamente, inferior a 7 mg/mL; aproximadamente, inferior a 7,5 mg/mL; aproximadamente, inferior a 8 mg/mL; aproximadamente, inferior a 8,5 mg/mL; aproximadamente, inferior a 9 mg/mL; aproximadamente, inferior a 9,5 mg/mL; aproximadamente, inferior a 10 mg/mL; aproximadamente, inferior a 11 mg/mL; aproximadamente, inferior a 12 mg/mL aproximadamente, inferior a 13 mg/mL aproximadamente, inferior a 14 mg/mL; aproximadamente, inferior a 15 mg/mL aproximadamente, inferior a 16 mg/mL aproximadamente, inferior a 17 mg/mL; aproximadamente, inferior a 18 mg/mL aproximadamente, inferior a 19 mg/mL aproximadamente, inferior a 20 mg/mL; aproximadamente, inferior a 25 mg/mL aproximadamente, inferior a 30 mg/mL aproximadamente, inferior a 35 mg/mL; aproximadamente, inferior a 40 mg/mL; aproximadamente, inferior a 45 mg/mL o aproximadamente, inferior a 50 mg/mL.

Propiedades de degradación de materiales a base de seda

[0166] De forma adicional, como apreciaran los expertos en la técnica, una gran cantidad de trabajo ha establecido que los investigadores tienen la habilidad para controlar el proceso de degradación de la seda. Según la presente divulgación, dicho control puede tener un valor especial en la fabricación de componentes electrónicos y especialmente en componentes electrónicos que son en sí mismos y/o son compatibles con los biomateriales. La degradabilidad (p. ej., biodegradabilidad) es frecuentemente indispensable para los biomateriales utilizados en la ingeniera e implantación de tejido. La presente divulgación abarca el reconocimiento de que dicha degradabilidad también es importante para y útil en la fabricación de componentes electrónicos de seda.

[0167] Según la presente divulgación, una característica especialmente deseable de los materiales a base de seda es el hecho de que se pueden degradar de forma programada. Es decir, como se sabe en la técnica, dependiendo de cómo se prepara un material a base de seda particular, se puede controlar para que se degrade a velocidades determinadas. Se han publicado la degradabilidad y la liberación controlada de una sustancia de los materiales a base de seda (ver, por ejemplo, WO 2004/080346; WO 2005/012606.

[0168] WO 2005/123114, WO 2007/016524, WO 2008/150861, WO 2008/118133.

[0169] El control de los métodos de producción de un material de seda y también de varias formas de materiales a base de seda puede generar composiciones de seda con propiedades de degradación conocidas. Por ejemplo, utilizando diversos materiales a base de fibroína de seda, se pueden cargar de forma activa agentes atrapados, como los terapéuticos, que después se liberan de forma controlada, p. ej., durante el curso de minutos, horas, días, de semanas a meses. Se ha probado que los revestimientos de fibroína de seda en capas se pueden utilizar para revestir sustratos de cualquier material, forma y tamaño, los cuales pueden utilizarse para atrapar moléculas para liberación controlada, p. ej., 2-90 días.

Materiales de seda cristalinos

[0170] Como se sabe en la técnica y se ha descrito en el presente documento, las proteínas de seda pueden amontonarse entre sí en disposiciones cristalinas. Se determinan varias propiedades de dichas disposiciones mediante, por ejemplo, el grado de la estructura de la lámina beta en el material, el grado de reticulación entre dichas láminas beta, la presencia (o ausencia) de ciertos dopantes u otros materiales. En algunas formas de realización, se controlan o diseñan de forma intencionada una o más de estas características para conseguir características particulares de una disposición de seda. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda se caracterizan por estructuras cristalinas, por ejemplo, que comprenden estructuras de lámina beta y/o enlaces de hidrogeno. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados se caracterizan por una estructura de hoja beta porcentual dentro del rango de entre, aproximadamente, 0 % a, aproximadamente 45 %. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda se caracterizan por una estructura cristalina, por ejemplo, que comprende estructuras de láminas beta de, aproximadamente 1 %; aproximadamente 2 %; aproximadamente 3 %; aproximadamente 4 %; aproximadamente 5 %; aproximadamente 6 %; aproximadamente 7 %; aproximadamente 8 %; aproximadamente 9 %; aproximadamente 10 %; aproximadamente 11 %; aproximadamente 12 %; aproximadamente 13 %; aproximadamente 14 %; aproximadamente 15 %; aproximadamente 16 %; aproximadamente 17 %; aproximadamente 18 %; aproximadamente 19 %; aproximadamente 20 %; aproximadamente 21 %; aproximadamente 22 %; aproximadamente 23 %; aproximadamente 24 %; aproximadamente 25 %; aproximadamente 26 %; aproximadamente 27 %; aproximadamente 28 %; aproximadamente 29 %; aproximadamente 30 %; aproximadamente 31 %; aproximadamente 32 %; aproximadamente 33 %; aproximadamente 34 %; aproximadamente 35 %; aproximadamente 36 %; aproximadamente 37 %; aproximadamente 38 %; aproximadamente 39 %; aproximadamente 40 %; aproximadamente 41 %; aproximadamente 42 %; aproximadamente 43 %; aproximadamente 44 % o aproximadamente 45 %.

Materiales a base de fibroína de seda

[0171] Los materiales a base de fibroína de seda proporcionados son susceptibles a la compresión. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados se pueden comprimir en relación con su volumen de precompresión, hasta: aproximadamente, 30 % del original; aproximadamente, 40 % del original; aproximadamente, 50 % del original; aproximadamente, 60 % del original; aproximadamente, 70 % del original; aproximadamente, 80 % del original o aproximadamente, 90 % del original.

[0172] En algunas formas de realización, la compresión pretende imitar el estrés requerido para comprimir una espuma durante inyección mediante aguja. La tensión de compresión de, aproximadamente, 80 % pretende imitar la inserción en una aguja para inyección.

[0173] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados son inyectables. En algunas formas de realización, se modifica una viscosidad de una composición inyectable utilizando un agente espesante farmacéuticamente aceptable. En algunas formas de realización, un agente espesante, por ejemplo, metilcelulosa, goma xantana, carboximetil celulosa, hidroxipropil celulosa, carbómero o combinaciones de estos. Una concentración preferida de espesante depende de un agente seleccionado y de viscosidad para inyección.

[0174] Cuando se expone a un activador y/o estímulos externos, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados se caracterizan por expansión volumétrica.

[0175] En algunas formas de realización, cuando se expone a un activador y/o estímulos externos, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados muestran un rápido rehinchamiento. En algunas formas de realización, el rápido rehinchamiento es de un orden de segundos o decenas de segundos. En algunas formas de realización, un rápido hinchamiento es de es de un orden de minutos, como de, aproximadamente, 2; aproximadamente, 3; aproximadamente, 4; aproximadamente, 5 o aproximadamente, 10. En algunas formas de realización, el hinchamiento puede durar más.

[0176] En algunas formas de realización, cuando se expone a un activador y/o estímulos externos, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados muestran hinchamiento volumétrico. En algunas formas de realización, dichos materiales a base de fibroína de seda aumentan en volumen en relación con el de un estado comprimido alrededor de dos veces (“2X”); alrededor de 3X; alrededor de 4X; alrededor de 5X; alrededor de 6X; alrededor de 7X; alrededor de 8X; alrededor de 9X; alrededor de 10X; alrededor de 15X; alrededor de 20X; alrededor de 25X; alrededor de 30X; alrededor de 35X; alrededor de 40X; alrededor de 45X; alrededor de 50X; alrededor de 55X; alrededor de 60X; alrededor de 65X; alrededor de 70X; alrededor de 75X o más.

[0177] En algunas formas de realización, cuando se exponen a un activador y/o estímulos externos, por ejemplo, exposición a un medio acuoso, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados aumentan en masa en relación con la de un estado comprimido, al menos: alrededor de 400 %; alrededor de 450 %; alrededor de 500 %; alrededor de 550 %; alrededor de 600 %; alrededor de 650 %; alrededor de 700 %; alrededor de 750 %; alrededor de 800 %; alrededor de 850 %; alrededor de 900 %; alrededor de 950 % o alrededor de 1000 % o más.

[0178] En algunas formas de realización, cuando los materiales a base de fibroína de seda se comprimen pueden deformarse en relación con su forma en estado precomprimido. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados se recuperan sustancialmente de la deformación a su forma en estado precomprimido cuando se exponen a un activador y/o estímulos externos.

[0179] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda comprenden seda modificada.

[0180] En algunas formas de realización, la seda modificada difiere de la seda no modificada porque un aditivo, agente y/o porción funcional reacciona con seda en una solución de seda durante la fabricación de materiales a base de fibroína de seda. En algunas formas de realización, la seda modificada difiere de la seda no modificada porque un aditivo, agente y/o porción funcional se mezcla con una solución de seda durante la fabricación de materiales a base de fibroína de seda. En algunas formas de realización, la seda modificada difiere de la seda no modificada porque un aditivo, agente y/o porción funcional se mezcla con, se añade a, se aplica a materiales a base de fibroína de seda. En algunas formas de realización, la seda modificada difiere de la seda no modificada porque un aditivo, agente y/o porción funcional reacciona con seda en un material a base de fibroína de seda.

[0181] En algunas formas de realización, la seda modificada difiere de la seda no modificada debido a la adición de una o más partes colgantes (p. ej., a un grupo R de un aminoácido), inclusión de uno o más aminoácidos no naturales, asociación con (p. ej., unión covalente a) una o más partes como un péptido, lípido, carbohidrato, ácido nucleico, molécula pequeña, metal, etc. En algunas formas de realización, una fibroína a base de seda modificada comprende uno o más residuos de aminoácidos modificados. En algunas formas de realización, un residuo de aminoácido modificado es un residuo de tirosina modificada. En algunas formas de realización, un residuo de tirosina modificada se modifica de forma covalente (p. ej., mediante la adición de uno o más grupos colgantes).

[0182] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda compuestos por dicha seda modificada se caracterizan por ciertas propiedades únicas de hinchamiento de materiales de base de fibroína de seda, p. ej., tal y como se ha descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, los materiales de base de fibroína de seda que comprenden senda modificada han aumentado la hidrofilia, de manera que los materiales a base de fibroína de seda modificada han mejorado su hidrofilia en relación con los materiales de seda no modificada. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda han aumentado su capacidad de absorción de agua, de manera que los materiales a base de fibroína de seda modificada han mejorado su capacidad de absorción de agua en relación con materiales de seda no modificada. En algunas formas de realización, la seda modificada muestra una hidrofobicidad mejorada en relación con la seda no modificada. En algunas formas de realización, la seda modificada muestra que puede ser capaz de aumentar la absorción de fluidos no polares (p. ej., aceites o grasas) en materiales de seda.

[0183] En algunas formas de realización, por ejemplo, una seda modificada difiere de una seda natural debido a la modificación ácido 4-sulfanílico. En algunas formas de realización, una seda modificada se modifica con polilisina (p. ej., es un péptido de fusión que comprende una parte de polilisina y una parte de fibroína de seda). En algunas formas de realización particulares, una seda modificada se pegila. En algunas formas de realización particulares, una seda modificada se modifica con 4-(heptiloxi)anilina. En algunas formas de realización particulares, una seda modificada se modifica con 4'-aminoacetofenona. Se describen a lo largo de la presente divulgación otros plastificantes ejemplares.

[0184] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda que comprenden seda modificada se caracterizan por una concentración de seda modificada de entre, aproximadamente, 5 % y, aproximadamente, 75 %. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda se caracterizan por: una modificación de, al menos, aproximadamente 5 %; una modificación de, al menos, aproximadamente 10 %; una modificación de, al menos, aproximadamente 15 %; una modificación de, al menos, aproximadamente 20 %; una modificación de, al menos aproximadamente 25 %; una modificación de, al menos, aproximadamente 30 %; una modificación de, al menos aproximadamente 35 %; una modificación de, al menos, aproximadamente 40 %; una modificación de, al menos aproximadamente 45 %; una modificación de, al menos, aproximadamente 50 %; una modificación de, al menos aproximadamente 55 %; una modificación de, al menos, aproximadamente 60 %; una modificación de, al menos aproximadamente 65 %; una modificación de, al menos, aproximadamente 70 %; una modificación de, al menos aproximadamente 75 %, o más.

[0185] Los materiales a base de fibroína de seda proporcionados incluyen un plastificante. En algunas formas de realización, dichos materiales a base de fibroína de seda que incluyen un plastificante muestran propiedades mejoradas cuando se comparan con materiales a base de fibroína de seda que no incluyen un plastificante. En algunas formas de realización, dichos materiales a base de fibroína de seda que comprenden plastificantes muestran una cristalinidad aumentada en relación con materiales a base de fibroína de seda sin un plastificante. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados que comprenden plastificantes muestran propiedades de recuperación mejoradas con una concentración creciente de plastificante.

[0186] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda incluyen; al menos 1% de plastificante; al menos 2% de plastificante; al menos 3% de plastificante; al menos 4% de plastificante; al menos 5% de plastificante; al menos 6% de plastificante; al menos 7% de plastificante; al menos 8% de plastificante; al menos 9% de plastificante; al menos 10% de plastificante; al menos 15% de plastificante; al menos 20% de plastificante; al menos 25% de plastificante; al menos 30% de plastificante; al menos 35% de plastificante; al menos 40% de plastificante; al menos 45% de plastificante; al menos 50% de plastificante; al menos 55% de plastificante; al menos 60% de plastificante; al menos 65% de plastificante; al menos 70% de plastificante, o más.

[0187] Los materiales a base de fibroína de seda sin plastificante pueden recuperarse de una compresión tal y como se describe en el presente documento. Los materiales a base de fibroína de seda sin plastificante pueden recuperar: al menos, aproximadamente, 25 % de su volumen original después de la compresión; al menos, aproximadamente, 30 % de su volumen original después de la compresión; al menos, aproximadamente, 35 % de su volumen original después de la compresión; al menos, aproximadamente, 40 % de su volumen original después de la compresión; al menos, aproximadamente, 45 % de su volumen original después de la compresión; al menos, aproximadamente, 50 % de su volumen original después de la compresión; al menos, aproximadamente, 55 % de su volumen original después de la compresión; al menos, aproximadamente, 60 % de su volumen original después de la compresión; al menos, aproximadamente, 65 % de su volumen original después de la compresión; al menos, aproximadamente, 70 % de su volumen original después de la compresión; al menos, aproximadamente, 75 % de su volumen original después de la compresión.

[0188] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda que comprenden un plastificante se recuperan de la compresión tal y como se describe en el presente documento. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda con plastificante recuperan: al menos, aproximadamente, 25 % de su volumen original después de la compresión; al menos, aproximadamente, 30 % de su volumen original después de la compresión; al menos, aproximadamente, 35 % de su volumen original después de la compresión; al menos, aproximadamente, 40 % de su volumen original después de la compresión; al menos, aproximadamente, 45 % de su volumen original después de la compresión; al menos, aproximadamente, 50 % de su volumen original después de la compresión; al menos, aproximadamente, 55 % de su volumen original después de la compresión; al menos, aproximadamente, 60 % de su volumen original después de la compresión; al menos, aproximadamente, 65 % de su volumen original después de la compresión; al menos, aproximadamente, 70 % de su volumen original después de la compresión; al menos, aproximadamente, 75 % de su volumen original después de la compresión; al menos, aproximadamente, 80 % de su volumen original después de la compresión; al menos, aproximadamente, 85 % de su volumen original después de la compresión; al menos, aproximadamente, 90 % de su volumen original después de la compresión; al menos, aproximadamente, 95 % de su volumen original después de la compresión o, aproximadamente, 100 % de su volumen original después de la compresión.

[0189] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados que comprenden, al menos, 20 % p/p de glicerol recuperan el 90-95 % de su volumen original después de la compresión. Sin tratamiento de metanol, los materiales a base de fibroína de seda que contienen glicerol, como se proporcionan en el presente documento, pueden recuperar casi el 100 % de su volumen original después de una compresión severa (alrededor del 80 %).

[0190] Algunos materiales a base de fibroína de seda sin plastificante aumentaron aproximadamente un 400 % de su masa inicial. Algunos materiales a base de fibroína de seda sin plastificante mostraron una recuperación incompleta con respecto a su volumen original. Algunos materiales a base de fibroína de seda sin plastificante mostraron deformación plástica después de la recuperación. Algunos materiales a base de fibroína de seda sin plastificante mostraron una expansión de volumen desde un estado comprimido hasta, aproximadamente, 2 veces el volumen original.

[0191] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados que comprenden un plastificante aumentaron hasta, aproximadamente, 900 % de su masa inicial. En algunas formas de realización, dichos materiales a base de fibroína de seda con plastificante mostraron una recuperación completa con respecto a su volumen original. En algunas formas de realización, dichos materiales a base de fibroína de seda con plastificante no mostraron evidencias de deformación plástica después de la recuperación. En algunas formas de realización, dichos materiales a base de fibroína de seda con plastificante mostraron una expansión de volumen desde un estado comprimido hasta, aproximadamente, 60 veces su volumen original.

[0192] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados se caracterizan en que son insolubles en agua cuando dichos materiales comprenden; al menos, aproximadamente, 20 % de plastificante; al menos, aproximadamente, 25 % de plastificante; al menos, aproximadamente, 30 % de plastificante; al menos, aproximadamente, 35 % de plastificante; al menos, aproximadamente, 40 % de plastificante; al menos, aproximadamente, 45 % de plastificante; al menos, aproximadamente, 50 % de plastificante; al menos, aproximadamente, 55 % de plastificante; al menos, aproximadamente, 60 % de plastificante; al menos, aproximadamente, 65 % de plastificante o al menos, aproximadamente, 70 % de plastificante.

[0193] Los materiales a base de fibroína de seda proporcionados se caracterizan por una estructura que incluye células abiertas: poros. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados comprenden poros que se caracterizan en que son sustancialmente redondos. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados comprenden poros y dichos materiales se caracterizan en que dichos poros están distribuidos de forma uniforme a lo largo de su volumen. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados comprenden poros y dichos materiales se caracterizan en que dichos poros están interconectados a lo largo de su volumen.

[0194] En algunas formas de realización, los poros formados por los métodos proporcionados tienen un diámetro medio de poro, incluyendo, aproximadamente, 5 |im; aproximadamente, 10 |im; aproximadamente, 15 |im; aproximadamente, 20 |im; aproximadamente, 25 |im; aproximadamente, 30 |im; aproximadamente, 35 |im; aproximadamente, 40 |im; aproximadamente, 45 ^m; aproximadamente, 50 ^m; aproximadamente, 55 ^m; aproximadamente, 60 ^m; aproximadamente, 65 ^m; aproximadamente, 70 ^m; aproximadamente, 75 ^m; aproximadamente, 80 ^m; aproximadamente, 85 ^m; aproximadamente, 90 ^m; aproximadamente, 95 ^m; aproximadamente, 100 ^m; aproximadamente, 125 ^m; aproximadamente, 150 ^m; aproximadamente, 175 ^m; aproximadamente, 200 ^m; aproximadamente, 225 ^m; aproximadamente, 250 ^m; aproximadamente, 275 ^m; aproximadamente, 300 ^m; aproximadamente, 325 ^m; aproximadamente, 350 ^m; aproximadamente, 375 ^m; aproximadamente, 400 ^m; aproximadamente, 450 |im; aproximadamente, 475 |im o aproximadamente, 500 |im, o más.

[0195] En algunas formas de realización, un tamaño medio de los poros en los materiales a base de fibroína de seda proporcionados no se ve comprometido por la compresión o la expansión, es decir, el tamaño medio de un poro en un estado precomprimido es sustancialmente idéntico en relación con su tamaño medio de un poro después de la recuperación. En algunas formas de realización, la morfología de los poros en los materiales a base de fibroína de seda proporcionados no se ve comprometida por la compresión o expansión en que uno o más de los rasgos que caracterizan la morfología de los poros de los materiales son sustancialmente idénticos después de la recuperación de la compresión y/o expansión en relación con su estado precomprimido.

[0196] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados se caracterizan por un valor de módulo elástico en un rango entre, aproximadamente, 1 kPa y, aproximadamente, 2500 kPa. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda se caracterizan por un módulo elástico: inferior a, aproximadamente 1 kPa; inferior a, aproximadamente 2 kPa; inferior a, aproximadamente 3 kPa; inferior a aproximadamente 4 kPa; inferior a, aproximadamente 5 kPa; inferior a, aproximadamente 6 kPa; inferior a aproximadamente 7 kPa; inferior a, aproximadamente 8 kPa; inferior a, aproximadamente 9 kPa; inferior a aproximadamente 10 kPa; inferior a, aproximadamente 15 kPa; inferior a, aproximadamente 20 kPa; inferior a aproximadamente 25 kPa; inferior a, aproximadamente 30 kPa; inferior a, aproximadamente 35 kPa; inferior a aproximadamente 40 kPa; inferior a, aproximadamente 45 kPa; inferior a, aproximadamente 50 kPa; inferior a aproximadamente 55 kPa; inferior a, aproximadamente 60 kPa; inferior a, aproximadamente 65 kPa; inferior a aproximadamente 70 kPa; inferior a, aproximadamente 75 kPa; inferior a, aproximadamente 80 kPa; inferior a aproximadamente 85 kPa; inferior a, aproximadamente 90 kPa; inferior a, aproximadamente 95 kPa; inferior a aproximadamente 100 kPa inferior a, aproximadamente 125 kPa inferior a, aproximadamente 150 kPa inferior a, aproximadamente 175 kPa inferior a, aproximadamente 200 kPa inferior a, aproximadamente 225 kPa inferior a, aproximadamente 250 kPa inferior a, aproximadamente 275 kPa inferior a, aproximadamente 300 kPa inferior a, aproximadamente 325 kPa inferior a, aproximadamente 350 kPa inferior a, aproximadamente 375 kPa inferior a, aproximadamente 400 kPa inferior a, aproximadamente 425 kPa inferior a, aproximadamente 450 kPa inferior a, aproximadamente 475 kPa inferior a, aproximadamente 500 kPa inferior a, aproximadamente 600 kPa inferior a, aproximadamente 700 kPa inferior a, aproximadamente 800 kPa inferior a, aproximadamente 900 kPa inferior a, aproximadamente 1000 kPa inferior a, aproximadamente 1100 kPa inferior a, aproximadamente 1200 kPa inferior a, aproximadamente 1300 kPa; inferior a, aproximadamente 1400 kPa inferior a, aproximadamente 1500 kPa inferior a, aproximadamente 1600 kPa; inferior a, aproximadamente 1700 kPa inferior a, aproximadamente 1800 kPa inferior a, aproximadamente 1900 kPa; inferior a, aproximadamente 2000 kPa inferior a, aproximadamente 2100 kPa inferior a, aproximadamente 2200 kPa; inferior a, aproximadamente 2300 kPa; inferior a, aproximadamente 2400 kPa o inferior a aproximadamente 2500 kPa.

[0197] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados se caracterizan por un valor de módulo de compresión en un rango entre, aproximadamente, 500 Pa y, aproximadamente, 3000 kPa. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados se caracterizan por un valor de módulo se caracterizan por un módulo de compresión inferior a, aproximadamente, 500 Pa; inferior a, aproximadamente, 600 Pa; inferior a, aproximadamente, 700 Pa; inferior a, aproximadamente, 800 Pa; inferior a, aproximadamente, 900 Pa; inferior a, aproximadamente, 1 kPa; inferior a, aproximadamente, 2 kPa; inferior a, aproximadamente, 3 kPa; inferior a, aproximadamente, 4 kPa; inferior a, aproximadamente, 5 kPa; inferior a, aproximadamente, 6 kPa; inferior a, aproximadamente, 7 kPa; inferior a, aproximadamente, 8 kPa; inferior a, aproximadamente, 9 kPa; inferior a, aproximadamente, 10 kPa; inferior a, aproximadamente, 15 kPa; inferior a, aproximadamente, 20 kPa; inferior a, aproximadamente, 25 kPa; inferior a, aproximadamente, 30 kPa; inferior a, aproximadamente, 35 kPa; inferior a, aproximadamente, 40 kPa; inferior a, aproximadamente, 45 kPa; inferior a, aproximadamente, 50 kPa; inferior a, aproximadamente, 55 kPa; inferior a, aproximadamente, 60 kPa; inferior a, aproximadamente, 65 kPa; inferior a, aproximadamente, 70 kPa; inferior a, aproximadamente, 75 kPa; inferior a, aproximadamente, 80 kPa; inferior a, aproximadamente, 85 kPa; inferior a, aproximadamente, 90 kPa; inferior a, aproximadamente, 95 kPa; inferior a, aproximadamente, 100 kPa; inferior a, aproximadamente, 125 kPa; inferior a, aproximadamente, 150 kPa; inferior a, aproximadamente, 175 kPa; inferior a, aproximadamente, 200 kPa; inferior a, aproximadamente, 225 kPa; inferior a, aproximadamente, 250 kPa; inferior a, aproximadamente, 275 kPa; inferior a, aproximadamente, 300 kPa; inferior a, aproximadamente, 325 kPa; inferior a, aproximadamente, 350 kPa; inferior a, aproximadamente, 375 kPa; inferior a, aproximadamente, 400 kPa; inferior a, aproximadamente, 425 kPa; inferior a, aproximadamente, 450 kPa; inferior a, aproximadamente, 475 kPa; inferior a, aproximadamente, 500 kPa; inferior a, aproximadamente, 600 kPa; inferior a, aproximadamente, 700 kPa; inferior a, aproximadamente, 800 kPa; inferior a, aproximadamente, 900 kPa; inferior a, aproximadamente, 1000 kPa; inferior a, aproximadamente, 1100 kPa; inferior a, aproximadamente, 1200 kPa; inferior a, aproximadamente, 1300 kPa; inferior a, aproximadamente, 1400 kPa; inferior a, aproximadamente, 1500 kPa; inferior a, aproximadamente, 1600 kPa; inferior a, aproximadamente, 1700 kPa; inferior a, aproximadamente, 1800 kPa; inferior a, aproximadamente, 1900 kPa; inferior a, aproximadamente, 2000 kPa; inferior a, aproximadamente, 2100 kPa; inferior a, aproximadamente, 2200 kPa; inferior a, aproximadamente, 2300 kPa; inferior a, aproximadamente, 2400 kPa; inferior a, aproximadamente, 2500 kPa; inferior a, aproximadamente, 2600 kPa; inferior a, aproximadamente, 2700 kPa; inferior a, aproximadamente, 2800 kPa; inferior a, aproximadamente, 2900 kPa, o inferior a, aproximadamente, 3000 kPa.

[0198] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados se caracterizan por un valor del módulo de almacenamiento en un rango entre, aproximadamente, 1 kPa y, aproximadamente, 3000 kPa. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados se caracterizan por un valor del módulo de compresión inferior a, aproximadamente 1 kPa; 2 kPa; inferior a, aproximadamente, 3 kPa; inferior a, aproximadamente, 4 kPa; inferior a, aproximadamente, 5 kPa; inferior a, aproximadamente, 6 kPa; inferior a, aproximadamente, 7 kPa; inferior a, aproximadamente, 8 kPa; inferior a, aproximadamente, 9 kPa; inferior a, aproximadamente, 10 kPa; inferior a, aproximadamente, 15 kPa; inferior a, aproximadamente, 20 kPa; inferior a, aproximadamente, 25 kPa; inferior a, aproximadamente, 30 kPa; inferior a, aproximadamente, 35 kPa; inferior a, aproximadamente, 40 kPa; inferior a, aproximadamente, 45 kPa; inferior a, aproximadamente, 50 kPa; inferior a, aproximadamente, 55 kPa; inferior a, aproximadamente, 60 kPa; inferior a, aproximadamente, 65 kPa; inferior a aproximadamente, 70 kPa; inferior a, aproximadamente, 75 kPa; inferior a, aproximadamente, 80 kPa; inferior a aproximadamente, 85 kPa; inferior a, aproximadamente, 90 kPa; inferior a, aproximadamente, 95 kPa; inferior a aproximadamente, 100 kPa; inferior a, aproximadamente, 125 kPa; inferior a, aproximadamente, 150 kPa ; inferior a aproximadamente, 175 kPa; inferior a, aproximadamente, 200 kPa; inferior a, aproximadamente, 225 kPa ; inferior a aproximadamente, 250 kPa; inferior a, aproximadamente, 275 kPa; inferior a, aproximadamente, 300 kPa ; inferior a aproximadamente, 325 kPa; inferior a, aproximadamente, 350 kPa; inferior a, aproximadamente, 375 kPa ; inferior a aproximadamente, 400 kPa; inferior a, aproximadamente, 425 kPa; inferior a, aproximadamente, 450 kPa ; inferior a aproximadamente, 475 kPa; inferior a, aproximadamente, 500 kPa; inferior a, aproximadamente, 600 kPa ; inferior a aproximadamente, 700 kPa; inferior a, aproximadamente, 800 kPa; inferior a, aproximadamente, 900 kPa ; inferior a aproximadamente, 1000 kPa; inferior a, aproximadamente, 1100 kPa; inferior a, aproximadamente, 1200 kPa inferior a, aproximadamente, 1300 kPa; inferior a, aproximadamente, 1400 kPa; inferior a, aproximadamente, 1500 kPa inferior a, aproximadamente, 1600 kPa; inferior a, aproximadamente, 1700 kPa; inferior a, aproximadamente, 1800 kPa inferior a, aproximadamente, 1900 kPa; inferior a, aproximadamente, 2000 kPa; inferior a, aproximadamente, 2100 kPa inferior a, aproximadamente, 2200 kPa; inferior a, aproximadamente, 2300 kPa; inferior a, aproximadamente, 2400 kPa inferior a, aproximadamente, 2500 kPa; inferior a, aproximadamente, 2600 kPa; inferior a, aproximadamente, 2700 kPa inferior a, aproximadamente, 2800 kPa; inferior a, aproximadamente 2900 kPa, o inferior a, aproximadamente, 3000 kPa

[0199] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados son biocompatibles. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda incluyen aditivos, agentes y/o partes funcionales.

[0200] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados se precargan con aditivos, agentes y/o partes funcionales durante la fabricación de los materiales. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados absorben aditivos, agentes y/o partes funcionales cuando se encuentran en un estado expandido.

[0201] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados son biodegradables.

[0202] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados se caracterizan en que dichos materiales se descomponen, degradan, delaminan o disuelven. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados se caracterizan en que dichos materiales se descomponen, degradan, delaminan o disuelven para liberal un aditivo, agente y/o porción funcional.

[0203] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados se introducen in vivo. En algunas formas de realización, dichos materiales a base de fibroína de seda se descomponen, degradan, delaminan o disuelven cuando están presentes in vivo. En algunas formas de realización, dichos materiales a base de fibroína de seda se descomponen, degradan, delaminan o disuelven sin respuesta inmunológica significativa cuando están presentes in vivo. En algunas formas de realización, dichos materiales a base de fibroína de seda muestran una cinética de degradación predecible. En algunas formas de realización, dichos materiales a base de fibroína de seda se reabsorben in vivo y se sustituyen con tejidos naturales.

Aditivos, Agentes y/o Partes Funcionales

[0204] En cualquiera de las formas de realización que abarca la presente invención, los materiales a base de fibroína de seda pueden incluir, además, uno o más aditivos, agentes y/o partes funcionales y otros agentes activos o inactivos, dependiendo del uso particular.

[0205] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados pueden comprender uno o más (p. ej., uno, dos, tres, cuatro, cinco o más) aditivos, agentes y/o partes funcionales. Sin querer atarse a una teoría, los aditivos, agentes y/o partes funcionales pueden proporcionar o mejorar una o más propiedades deseadas, p. ej., fuerza, flexibilidad, facilidad de procesamiento y manipulación, biocompatibilidad, biorreabsorción, morfología de la superficie, índices de liberación y/o cinética de uno o más agentes activos presentes en la composición, y similares. En algunas formas de realización, uno o más de dichos aditivos, agentes y/o partes funcionales puede estar unido de forma covalente o no covalente con el material a base de fibroína de seda (p. ej., con un polímero como la fibroína de seda que compone el material) y puede integrarse de forma homogénea o heterogénea dentro de la composición de seda.

[0206] En algunas formas de realización, los aditivos, agentes y/o partes funcionales son o comprenden una parte asociada de forma covalente (p. ej., mediante modificación química o ingeniería genética) con un polímero. En algunas formas de realización, un aditivo está asociado de forma no covalente con un material a base de fibroína de seda o con un componente de un material a base de fibroína de seda.

[0207] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados comprenden aditivos, agentes y/o partes funcionales en una cantidad total desde, aproximadamente, 0,01 p% hasta, aproximadamente, 99 p%; desde, aproximadamente, 0,01 p% hasta, aproximadamente, 70 p%; desde, aproximadamente, 5 p% hasta, aproximadamente, 60 p%; desde, aproximadamente, 10 p% hasta, aproximadamente, 50 p%; desde, aproximadamente, 15 p% hasta, aproximadamente, 45 p% o desde, aproximadamente, 20 p% hasta, aproximadamente, 40 p% de la composición total de seda. En algunas formas de realización, el ratio de la fibroína de seda a un aditivo en la composición puede variar desde, aproximadamente 1000:1 (p/p) hasta, aproximadamente, 1:1000 (p/p); desde, aproximadamente 500:1 (p/p) hasta, aproximadamente, 1:500 (p/p); desde, aproximadamente 250:1 (p/p) hasta, aproximadamente, 1:250 (p/p); desde, aproximadamente 200:1 (p/p) hasta, aproximadamente, 1:200 (p/p); desde, aproximadamente 25:1 (p/p) hasta, aproximadamente, 1:25 (p/p); desde, aproximadamente 20:1 (p/p) hasta, aproximadamente, 1:20 (p/p); desde, aproximadamente 10:1 (p/p) hasta, aproximadamente, 1:10 (p/p), o desde, aproximadamente 5:1 (p/p) hasta, aproximadamente, 1:5 (p/p).

[0208] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados incluyen uno o más aditivos, agentes y/o partes funcionales en una proporción molar relativa a un polímero (p. ej., una relación seda: aditivo) de, p. ej., al menos 1000:1; al menos 900:1; al menos 800:1; al menos 700:1; al menos 600:1; al menos 500:1; al menos 400:1; al menos 300:1; al menos 200:1; al menos 100:1; al menos 90:1; al menos 80:1; al menos 70:1; al menos 60:1; al menos 50:1; al menos 40:1; al menos 30:1; al menos 20:1; al menos 10:1; al menos 7:1; al menos 5:1; al menos 3:1; al menos 1:1; al menos 1:3; al menos 1:5; al menos 1:7; al menos 1:10; al menos 1:20; al menos 1:30; al menos 1:40; al menos 1:50; al menos 1:60; al menos 1:70; al menos 1:80; al menos 1:90; al menos 1:100; al menos 1:200; al menos 1:300; al menos 1:400; al menos 1:500; al menos 1:600; al menos 1:700; al menos 1:800; al menos 1:900 o al menos 1:1000.

[0209] En algunas formas de realización, la relación parte de seda: aditivo es, p. ej., como máximo 1000:1; como máximo 900:1; como máximo 800:1; como máximo 700:1; como máximo 600:1; como máximo 500:1; como máximo 400:1; como máximo 300:1; como máximo 200:1; como máximo 100:1; como máximo 90:1; como máximo 80:1; como máximo 70:1; como máximo 60:1; como máximo 50:1; como máximo 40:1; como máximo 30:1; como máximo 20:1; como máximo 10:1; como máximo 7:1; como máximo 5:1; como máximo 3:1; como máximo 1:1; como máximo 1:3; como máximo 1:5; como máximo 1:7; como máximo 1:10; como máximo 1:20; como máximo 1:30; como máximo 1:40; como máximo 1:50; como máximo 1:60; como máximo 1:70; como máximo 1:80; como máximo 1:90; como máximo 1:100; como máximo 1:200; como máximo 1:300; como máximo 1:400; como máximo 1:500; como máximo 1:600; como máximo 1:700; como máximo 1:800; como máximo 1:900 o como máximo 1:1000.

[0210] En algunas formas de realización, la relación parte de seda: aditivo es, p. ej., de, aproximadamente, 1000:1 a, aproximadamente, 1:1000 ; de, aproximadamente, 900:1 a, aproximadamente, 1:900; de, aproximadamente, 800:1 a aproximadamente, 1:800; de, aproximadamente, 700:1 a, aproximadamente, 1:700; de, aproximadamente, 600:1 a aproximadamente, 1:600; de, aproximadamente, 500:1 a, aproximadamente, 1:500; de, aproximadamente, 400:1 a aproximadamente, 1:400; de, aproximadamente, 300:1 a, aproximadamente, 1:300; de, aproximadamente, 200:1 a aproximadamente, 1:200; de, aproximadamente, 100:1 a, aproximadamente, 1:100 ; de aproximadamente 90:1 a aproximadamente, 1:90; de, aproximadamente, 80:1 a, aproximadamente, 1:80; de, aproximadamente, 70:1 a aproximadamente, 1:70; de, aproximadamente, 60:1 a, aproximadamente, 1:60; de, aproximadamente, 50:1 a aproximadamente, 1:50; de, aproximadamente, 40:1 a, aproximadamente, 1:40; de, aproximadamente, 30:1 a aproximadamente, 1:30; de, aproximadamente, 20:1 a, aproximadamente, 1:20; de, aproximadamente, 10:1 a aproximadamente, 1:10; de, aproximadamente 7:1 a, aproximadamente 1:7; de, aproximadamente, 5:1 a aproximadamente, 1:5; de, aproximadamente, 3:1 a, aproximadamente, 1:3, o de, aproximadamente, 1:1.

[0211] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados comprenden aditivos, agentes y/o partes funcionales, por ejemplo, agentes terapéuticos, preventivos y/o diagnósticos.

[0212] En algunas formas de realización, un aditivo, agente y/o porción funcional es o comprende uno o más agentes terapéuticos. En general, un agente terapéutico es o comprende una molécula pequeña y/o compuesto orgánico con actividad farmacéutica (p. ej., actividad que se ha demostrado con importancia estadística en uno o más modelos preclínicos relevantes o contextos clínicos). En algunas formas de realización, un agente terapéutico es un fármaco de uso clínico. En algunas formas de realización, un agente terapéutico es o comprende una célula, proteína, péptido, análogos de ácido nucleico, nucleótido, oligonucleótido, ácidos nucleicos (ADN, ARN o ARN de interferencia corta), ácidos nucleicos de péptidos, aptámeros, anticuerpos o fragmentos o partes de estos, anestesia, anticoagulante, agente anticáncer, inhibidor de una enzima, agente esteroidal, agente antiinflamatorio, agente antineoplástico, antígeno, vacuna, anticuerpo, descongestionante, antihipertensivos, sedativos, agente anticonceptivo, agente progestacional, anticolinérgico, analgésico, antidepresivo, antipsicótico, agente bloqueador p-andrenérgico, diurético, agente activo cardiovascular, agente vasoactivo, agente antiglaucoma, neuroprotector, inhibidor de angiogénesis, hormonas, antagonista hormonal, factores de crecimiento o factores de crecimiento recombinantes y fragmentos y variantes de ello, citoquinas, enzimas, antibióticos o compuestos antimicrobianos, antifúngicos, antivirales, toxinas, profármacos, agentes quimioterápicos, moléculas pequeñas, fármacos (p. ej., fármacos, colorantes, aminoácidos, vitaminas, antioxidantes), agentes farmacológicos y combinaciones de estos.

[0213] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados comprenden aditivos, agentes y/o partes funcionales, por ejemplo, células. Las células aptas para el uso en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, células progenitoras o células madre, células musculares lisas, células musculares esqueléticas, células musculares cardíacas, células epiteliales, células endoteliales, células uroteliales, fibroblastos, mioblastos, condrocitos, osteoclastos, queratinocitos, hepatocitos, células de las vías biliares, células de los islotes pancreáticos, células tiroideas, paratiroideas, suprarrenales, hipotalámicas, hipofisarias, ováricas, testiculares, células de las glándulas salivales, adipocitos y células precursoras.

[0214] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados comprenden aditivos, agentes y/o partes funcionales, por ejemplo, organismos, como, bacterias, hongos, plantas o animales, o un virus. En algunas formas de realización, un agente activo puede incluir o puede ser seleccionado de neurotransmisores, hormonas, agentes de transducción de señales intracelulares, agentes farmacéuticos, agentes tóxicos, productos químicos agrícolas, toxinas químicas, toxinas biológicas, microbios y células animales como neuronas, células hepáticas y células del sistema inmunitario. Los agentes activos pueden también incluir compuestos terapéuticos, como materiales farmacológicos, vitaminas, sedativos, hipnóticos, prostaglandinas y radiofármacos.

[0215] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados comprenden aditivos, agentes y/o partes funcionales, por ejemplo, antibióticos. Los antibióticos apropiados para incorporación en materiales a base de fibroína de seda incluyen, pero no se limitan a: aminoglucósidos (p. ej., neomicina), ansamicinas, carbacefemas, carbapenems, cefalosporinas (p. ej., cefazolina, cefaclor, cefditoren, ceftobiprole), glucopéptidos (p. ej., vancomicina), macrólidos (por ejemplo, eritromicina, azitromicina), monobactámicos, penicilinas (p. ej., amoxicilina, ampicilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina), polipéptidos (p. ej., bacitracina, polimixina B), quinolonas (p. ej., ciprofloxacina, enoxacina, gatifloxacina, ofloxacina, etc.), sulfonamidas (p. ej., sulfasalazina, trimetoprima, trimetoprima-sulfametoxazol (cotrimoxazol)), tetraciclinas (p. ej, doxicilina, minociclina, tetraciclina, etc. ), cloranfenicol, lincomicina, clindamicina, etambutol, mupirocina, metronidazol, pirazinamida, tiamfenicol, rifampicina, tiamfenicl, dapsona, clofazimina, quinupristina, metronidazol, linezolid isoniazida, fosfomicina, ácido fusídico, antibióticos p-lactámicos, rifamicinas, novobiocina, fusidato sódico, capreomicina, colistimetato, gramicidina, doxiciclina, eritromicina, ácido nalidíxico y vancomicina. Por ejemplo, los antibióticos p-lactámicos pueden ser la aziocilina, el aztreonam, la carbenicilina, la cefoperazona, la ceftriaxona, la cefaloridina, la moxalactama, la piperacilina, la ticarcilina y la combinación de estos.

[0216] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados comprenden aditivos, agentes y/o partes funcionales, por ejemplo, antiinflamatorios. Los agentes antiinflamatorios pueden incluir corticosteroides (p. ej., glucocorticoides), ciclopléjicos, antiinflamatorios no esteroideos (AINE), derivados antiinflamatorios inmunoselectivos (ImSAID) y cualquier combinación de estos. Los AINE ejemplares incluyen, entre otros, celecoxib (Celebrex®) rofecoxib (Vioxx®), etoricoxib (Arcoxia®), meloxicam (Mobic®), valdecoxib, diclofenaco (Voltaren®, Cataflam®), etodolac (Lodine®), sulindac (Clinori®), aspirina, alclofenaco fenclofenaco, diflunisal (Dolobid®), benorilato, fosfosal, ácido salicílico, incluidos el ácido acetilsalicílico, el ácido acetilsalicílico sódico, el ácido acetilsalicílico cálcico y el salicilato sódico; ibuprofeno (Motrin), ketoprofeno, carprofeno, fenbufeno, flurbiprofeno, oxaprozina, suprofeno, ácido triaprofénico, fenoprofeno, indoprofeno, piroprofeno, flufenámico, mefenamic, meclofenamic, niflumic, salsalate, rolmerin, fentiazac, tilomisole, oxyphenbutazone, phenylbutazone, apazone, feprazone, sudoxicam, isoxicam, tenoxicam, piroxicam (Feldene®), indometacina (Indocin®), nabumetona (Relafen®), naproxeno (Naprosyn®), tolmetina, lumiracoxib, parecoxib, licofelona (ML3000), incluidas las sales, isómeros, enantiómeros, derivados, profármacos, polimorfos cristalinos, modificaciones amorfas, cocristales y combinaciones de estos farmacéuticamente aceptables.

[0217] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados comprenden aditivos, agentes y/o partes funcionales, por ejemplo, anticuerpos. Los anticuerpos apropiados para incorporación en los materiales a base de fibroína de seda incluyen, pero no se limitan a, abciximab, adalimumab, alemtuzumab, basiliximab, bevacizumab, cetuximab, certolizumab pegol, daclizumab, eculizumab, efalizumab gemtuzumab, ibritumomab tiuxetan, infliximab, muromonab-CD3, natalizumab, ofatumumab omalizumab, palivizumab, panitumumab, ranibizumab, rituximab, tositumomab, trastuzumab, altumomab pentetato, arcitumomab, atlizumab, bectumomab, belimumab, besilesomab, biciromab, canakinumab, capromab pendetida, catumaxomab, denosumab, edrecolomab, efungumab, ertumaxomab, etaracizumab, fanolesomab, fontolizumab, gemtuzumab ozogamicin, golimumab, igovomab, imciromab, labetuzumab, mepolizumab, motavizumab, nimotuzumab, nofetumomab merpentán, oregovomab, pemtumomab, pertuzumab, rovelizumab, ruplizumab, sulesomab, tacatuzumab tetraxetan, tefibazumab, tocilizumab, ustekinumab, visilizumab, votumumab, zalutumumab y zanolimumab.

[0218] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados comprenden aditivos, agentes y/o partes funcionales, por ejemplo, polipéptidos (p. ej., proteínas), incluyendo, pero sin limitarse a: uno o más antígenos, citocinas, hormonas, quimiocinas, enzimas, y cualquier combinación de estos como agente y/o grupo funcional. Las enzimas ejemplares apropiadas para su uso en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, peroxidasa, lipasa, amilosa, organofosfato deshidrogenasa, ligasas, endonucleasas de restricción, ribonucleasas, ADN polimerasas, glucosa oxidasa, lacasa, y similares.

[0219] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados comprenden aditivos, agentes y/o partes funcionales, por ejemplo, especialmente útiles para la curación de heridas. En algunas formas de realización, los agentes útiles para la curación de heridas incluyen estimuladores, potenciadores o mediadores positivos de la cascada de curación de heridas que 1) fomentan o aceleran el proceso natural de curación de heridas o 2) reducen los efectos asociados con la curación inadecuada o retardada de las heridas, cuyos efectos incluyen, por ejemplo, la inflamación adversa, la epitelización, la angiogénesis y la degradación de matriz, y la cicatrización y la fibrosis.

[0220] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados comprenden aditivos, agentes y/o partes funcionales, por ejemplo, un agente óptica o eléctricamente activo incluyendo, pero sin limitarse a: cromóforos; compuestos orgánicos emisores de luz tales como luciferina, carotenos; compuestos inorgánicos emisores de luz, como los colorantes químicos; compuestos captadores de luz, como la clorofila, la bacteriorrodopsina, la protorrodopsina y las porfirinas; complejos captadores de luz, como las ficobiliproteínas; y compuestos relacionados electrónicamente activos; y combinaciones de estos.

[0221] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados comprenden aditivos, agentes y/o partes funcionales, por ejemplo, especialmente útiles para la modificación química de un material a base de fibroína de seda. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados comprenden aditivos, agentes y/o partes funcionales, por ejemplo, para mejorar especialmente la hidrofilia la capacidad de absorción de agua, la retención de la forma o la hidrofobicidad, incluyendo, pero sin limitarse a: Ácido 4-sulfanílico, polilisina, 4-(heptiloxi)anilina, 4'-aminoacetofenona, polímeros superabsorbentes; los ejemplos incluyen, pero no se limitan, al poliacrilato de sodio, el alcohol polivinílico (PVA) reticulado, el óxido de polietileno (PEO), el ácido poliacrílico, los materiales higroscópicos, la celulosa y el almidón (por ejemplo, modificados o no modificados), el nylon, el policarbonato, el polietilenglicol o combinaciones de estos.

Plastificantes

[0222] Ejemplos de aditivos apropiados incluyen, pero sin limitarse a, uno o más plastificantes. Tal y como se usa en el contexto de la presente divulgación, los términos "plastificante” y “agente plastificante” se usan indistintamente.

[0223] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados comprenden plastificantes que muestran propiedades de recuperación mejoradas con el aumento de la concentración de plastificante. En algunas formas de realización, la preparación de los materiales a base de fibroína de seda incluye un plastificante para favorecer la plasticidad y flexibilidad y para reducir la fragilidad. En algunas formas de realización, dichos materiales a base de fibroína de seda comprenden plastificantes que muestran una mayor cristalinidad en relación con los materiales a base de fibroína de seda sin un plastificante. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados comprenden plastificantes que muestran propiedades de recuperación mejoradas con el aumento de la concentración de plastificante. De forma general, en algunas formas de realización, un plastificante es una sustancia higroscópica que forma enlaces de hidrogeno o electrostáticos con el biopolímero y que aumenta la cantidad de agua libre y de enlace por congelación retenida en los materiales biopolímeros.

[0224] En algunas formas de realización, los plastificantes son o comprenden, pero no se limitan a: Glicerol, 1,2 Propanediol, 1,3 Propanediol, 1,4 Butanediol, 1,2,4 Butanetriol, Treitol, Eritritol, 1,2 Pentanediol, 1,5 Pentanediol, Adonitol, 1,2,6 Hexanetriol, Glicerina; Oleato de glicerilo; Alcohol oleico; PEG-4; PEG-6; PEG-8; PEG-12; PEG-16; PEG-20; PEG-32; PEG-75 (Ref. Handbook of Green Chemistry, Parte IV Funcional/Aplicación, pp. 2759), ácido esteárico, ácido oleico, lactato de sodio, Emerest® 2618; Emerest® 2619; Hydrobrite® 200PO; Hydrobrite® 380PO; Hydrobrite® 550PO estearato de PEG-20; laurato de propilenglicol; Semtol® 40; Semtol® 70; Semtol® 85 Semtol® 100; Semtol® 350 (Ref. Handbook of Green Chemistry, Part IV Functional/Application, pp. 2755), poliacrilato de sodio, alcohol polivinílico reticulado (PVA), óxido de polietileno (PEO), ácido poliacrílico, materiales higroscópicos, celulosa y almidón (p. ej. modificados o no), nylon, policarbonato, polietilenglicol, metanol, etanol, isómeros del propanol: 1-propanol, alcohol isopropílico, isómeros del butanol: n-butanol; sec-butanol; isobutanol; tert-butanol, isómeros del pentanol (alcohol amílico) n-pentanol; carbinol isobutílico; alcohol amílico activo; carbinol butílico terciario; 3-pentanol; metil (n) propil carbinol; metil isopropil carbinol; dimetil etil carbinol, hexanol: n-hexanol e isómeros afines, heptanol e isómeros afines, octanol e isómeros afines, nonanol e isómeros afines, decanol e isómeros afines, dioles, dioles vicinales (grupos hidroxilos unidos a átomos adyacentes); los ejemplos incluyen pero no se limitan a: propano-1,2-diol, etilenglicol, propilenglicol, 1,3 dioles; los ejemplos incluyen pero no se limitan a: propano-1,3-diol, 2,2-dimetil-1,3-propanediol, 1,3-butanediol, 1,4 dioles; los ejemplos incluyen pero no se limitan a: 1,4-butanediol, 1,4-pentanediol, 1,5 dioles y más; trioles;

los ejemplos incluyen pero no se limitan a: Glicerol, Benzenetriol, Pirogalol, 1,2,6 Hexanetriol, 1,3,5-pentanetriol, Fenoles; los ejemplos incluyen pero no se limitan a: Hidroquinona, Resorcinol, Meta-cresol, Eugenol, Timol, Pirogalol, Alcoholes del azúcar o alcoholes polihídricos, Arabitol, Eritritol, Fucitol, Galactitol, Glicerol, Iditol, Inositol, Isomalt, Lactitol, Maltitol, Maltotetraitol, Maltotriitol, Manitol, Ribitol (adonitol), Sorbitol, Treitol, Volemitol, Xilitol, Etilenglicol, Dietilenglicol, Hidrolizados de almidón hidrogenados; poliglicol (mezclas de alcoholes de azúcar utilizadas en la industria alimentaria), propilenglicol (E1520), hexilenglicol y butilenglicol; triacetato de glicerilo (E1518); alcohol vinílico; neoagarobiosa; alcoholes de azúcar/polialcoholes de azúcar: glicerol/glicerina, sorbitol (E420), xilitol, maltitol (E965); polioles poliméricos (e. g., polidextrosa (E1200)); quillaia (E999); urea; gel de aloe vera; MP Diol; alfahidroxiácidos (p. ej, ácido láctico); miel, azúcares y azúcares simples (por ejemplo, monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos, polisacáridos); los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: sacarosa, glucosa, fructosa, ribosa, galactosa, maltosa, lactosa, triosa, tetrosa, pentosa, hexosa, trehalosa, o combinaciones de estas.

Ácidos nucleicos

[0225] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados comprenden aditivos, agentes y/o partes funcionales, por ejemplo, agentes de ácido nucleico. En algunas formas de realización, un material a base de fibroína de seda puede liberar agentes de ácido nucleico. En algunas formas de realización, un agente de ácido nucleico es o comprende un agente terapéutico. En algunas formas de realización, un agente de ácido nucleico es o comprende un agente de diagnóstico. En algunas formas de realización, un agente de ácido nucleico es o comprende un agente profiláctico.

[0226] Los expertos en la técnica apreciarían que un agente de ácido nucleico puede tener una longitud dentro de un rango amplio. En algunas formas de realización, un agente de ácido nucleico tiene una secuencia de nucleótidos de, al menos, aproximadamente 40, por ejemplo, al menos, alrededor de 60; al menos, alrededor de 80; al menos, alrededor de 100; al menos, alrededor de 200; al menos, alrededor de 500; al menos, alrededor de 1000 o al menos, alrededor de 3000 nucleótidos de longitud. En algunas formas de realización, un agente de ácido nucleico tiene una longitud desde, aproximadamente, 6 a, aproximadamente, 40 nucleótidos. Por ejemplo, un agente de ácido nucleico puede tener, aproximadamente, de 12 a, aproximadamente, 35 nucleótidos de longitud; de 12 a, aproximadamente, 20 nucleótidos de longitud o de 18 a, aproximadamente, 35 nucleótidos de longitud.

[0227] En algunas formas de realización, los agentes de ácido nucleico pueden ser o comprenden ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos peptidonucleico (APN), ácidos nucleicos morfolinos, ácidos nucleicos bloqueados (LNA, por sus siglas en inglés), ácidos nucleicos glicólicos (GNA, por sus siglas en inglés), ácidos nucleicos treosados (TNA, por sus siglas en inglés) y/o combinaciones de estos.

[0228] En algunas formas de realización, un ácido nucleico tiene una secuencia de nucleótidos que es o comprende, al menos, un elemento codificador de proteínas. En algunas formas de realización, un ácido nucleico tiene una secuencia de nucleótidos que es o comprende, al menos, un elemento que es un complemento de una secuencia codificadora de proteínas. En algunas formas de realización, un ácido nucleico tiene una secuencia de nucleótidos que incluye una o más elementos reguladores de la expresión génica (p. ej., elementos promotores, elementos potenciadores, sitios donantes de corte y empalme, sitios aceptores de corte y empalme, secuencias de terminación de la transcripción, secuencias de iniciación de la traducción, secuencias de terminación de la traducción, etc.). En algunas formas de realización, un ácido nucleico tiene una secuencia de nucleótidos que incluye un origen de replicación. En algunas formas de realización, un ácido nucleico tiene una secuencia de nucleótidos que incluye una o más secuencias de integración. En algunas formas de realización, un ácido nucleico tiene una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más elementos que participan en una recombinación intra o intermolecular (p. ej., recombinación homologa). En algunas formas de realización, un ácido nucleico tiene actividad enzimática. En algunas formas de realización, un ácido nucleico un ácido nucleico se hibrida con un objetivo en una célula, tejido u organismo. En algunas formas de realización, un ácido nucleico actúa en (p. ej., se une a, se adhiere a) un objetivo dentro de una célula. En algunas formas de realización, un ácido nucleico se expresa en una célula después de una liberación de una composición proporcionada. En algunas formas de realización, un ácido nucleico se integra en un genoma después de una liberación de una composición proporcionada.

[0229] En algunas formas de realización, los agentes de ácido nucleico tienen secuencias de nucleótidos monocatenarios. En algunas formas de realización, los agentes de ácido nucleico tienen secuencias de nucleótidos que se pliegan en estructuras de orden superior (p. ej., estructuras bicatenarias o tricatenarias). En algunas formas de realización, un agente de ácido nucleico es o comprende un oligonucleótido. En algunas formas de realización, un agente de ácido nucleico es o comprende un oligonucleótido antisentido. Los agentes de ácido nucleico pueden incluir una modificación química al nivel del nucleótido individual o al nivel de la columna vertebral del oligonucleótido, o puede no tener modificaciones.

[0230] En algunas formas de realización de la presente divulgación, un agente de ácido nucleico es un agente de interferencia corta. Un agente de interferencia corta ARN comprende un dúplex de ARN de, aproximadamente, 19 pares de bases y, opcionalmente, comprende además uno o dos voladizos monocatenarios. Se puede formar un ARN de interferencia corta a partir de dos moléculas de ARN que se hibridan juntas, o, de forma alternativa, se pueden generar a partir de una sola molécula de ARN que incluye una parte de autohibridación. Generalmente, se prefiere que los extremos 5' libres de moléculas de ARN de interferencia corta tengan grupos de fosfatos, y que los extremos 3' libres tengan grupos de hidroxilo. La parte de dúplex de un ARN de interferencia corta puede, pero generalmente no, contener una o más protuberancias que consisten en uno o más nucleótidos sin pareja. Una cadena de un ARN de interferencia corta incluye una parte que se hibrida con una transcripción objetivo. En ciertas formas de realización preferidas de la invención, una cadena del ARN de interferencia corta es precisamente complementario con una región de la transcripción objetivo. Esto quiere decir que el ARN de interferencia corta se hibrida con la transcripción objetivo sin un solo desajuste. En otras formas de realización de la invención, pueden existir uno o más desajustes entre el ARN de interferencia corta y la parte objetivo de la transcripción objetivo. En muchas formas de realización de la invención, en las que no se ha conseguido una complementariedad perfecta, se prefiere generalmente que cualquiera de los desajustes esté ubicado en o cerca de las terminales de ARN de interferencia corta.

[0231] El ARN de horquilla corta se refiere a una molécula de ARN que comprende al menos dos partes complementarias hibridadas o capaces de hibridarse para formar una estructura bicatenaria (dúplex) lo suficientemente larga como para mediar el ARN de interferencia (de forma general, al menos, 19 pares de base de longitud), y al menos una parte monocatenaria, de forma general, de entre, aproximadamente, 1 y 10 nucleótidos de longitud que forman un bucle. La parte dúplex puede, pero generalmente no, contener una o más protuberancias que consisten en uno o más nucleótidos sin pareja. Tal y como se describe a continuación, los ARN de horquilla corta están pensados para ser procesados en ARN de interferencia corta mediante la maquinaria celular de ARN de interferencia conservada. Por consiguiente, los ARN en horquilla corta son precursores de ARN de interferencia corta y son, en general, capaces de forma similar de inhibir la expresión de una transcripción objetivo.

[0232] A la hora de describir los ARN de interferencia corta, será más practico frecuentemente referirse a las cadenas de sentido y antisentido de los ARN de interferencia corta. En general, la secuencia de la parte dúplex de la cadena de sentido de los ARN de interferencia corta es sustancialmente idéntica a la parte objetivo de la transcripción objetivo, mientras que la cadena de antisentido de los ARN de interferencia corta es sustancialmente complementaria a la transcripción objetivo de esta región tal y como se explica más adelante. Aunque los ARN en horquilla corta contienen una única molécula de ARN que se autohibrida, se apreciará que se puede considerar la estructura dúplex resultante para comprimir las cadenas o partes de sentido y antisentido. Por consiguiente, será conveniente en el presente documento referirse a las cadenas de sentido y de antisentido, o partes de sentido y antisentido, de un ARN en horquilla corta, donde la cadena o parte de antisentido es ese segmento de la molécula que forma o es capaz de formar un dúplex y es sustancialmente complementario a la parte objetivo de la transcripción objetivo; y la cadena o parte de sentido es ese segmento de la molécula que forma o es capaz de formar un dúplex y es sustancialmente idéntico en secuencia a la parte objetivo de la transcripción objetivo.

[0233] A efectos de la descripción, la explicación de a continuación se refiere a los ARN de interferencia corta y no a los ARN de interferencia corta y ARN en horquilla corta. Sin embargo, tal y como será evidente para un experto en la técnica, las enseñanzas relevantes para las cadenas de sentido y de antisentido de un ARN de interferencia corta son generalmente aplicables a las partes de sentido y de antisentido de la parte del tallo de un ARN de horquilla corta correspondiente. Por consiguiente, en general, las consideraciones de a continuación también se aplican a los ARN en horquilla corta.

[0234] Se considera que un agente de ARN de interferencia corta está dirigido a una transcripción objetivo para los fines descritos en el presente documento si 1) la estabilidad de la transcripción objetivo se reduce en presencia del ARN de interferencia corta o ARN de horquilla corta en comparación con su ausencia; y/o 2) el ARN de interferencia corta o el ARN de horquilla corta muestra al menos un 90%, más preferiblemente al menos un 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de complementariedad de secuencia precisa con la transcripción objetivo para un tramo de al menos unos 15, más preferiblemente al menos unos 17, y aún más preferiblemente al menos unos 18 o 19 a unos 21-23 nucleótidos; y/o 3) una cadena del ARN de interferencia corta o una de las porciones autocomplementarias del ARN de horquilla corta se hibrida con la transcripción objetivo en condiciones estrictas de hibridación de moléculas de ARN pequeñas (<50 nucleótidos) in vitro y/o en condiciones típicas del citoplasma o el núcleo de células de mamífero. Dado que el efecto de dirigirse a una transcripción es reducir o inhibir la expresión del gen que dirige la síntesis de la transcripción, se considera que un ARN de interferencia corta, ARN de horquilla corta , dirigido a una transcripción también se dirige al gen que dirige la síntesis de la transcripción, aunque no se piense que el propio gen (es decir, el ADN genómico) interactúe con el ARN de interferencia corta , el ARN de horquilla corta o los componentes de la maquinaria de silenciamiento celular. Así, en algunas realizaciones, se entiende que un ARN de interferencia corta, ARN de horquilla corta, que se dirige a una transcripción se dirige al gen que proporciona una plantilla para la síntesis de la transcripción.

[0235] En algunas formas de realización, un agente de ARN de interferencia corta puede inhibir una expresión de un polipéptido (p. ej., una proteína). Los polipéptidos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, la metalopéptida de matriz 9 (MMP-9), la endopeptidasa neutra (NEP) y la proteína tirosina fosfatasa 1B (PTP1B).

Factor de crecimiento

[0236] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados comprenden aditivos, agentes y/o partes funcionales, por ejemplo, factores de crecimiento. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda pueden liberar factores de crecimiento. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda pueden liberar múltiples factores de crecimiento. En algunas formas de realización, los factores de crecimiento conocidos en la técnica incluyen, por ejemplo, adrenomedulina, angiopoyetina, factor de motilidad autocrino, basófilos, factor neurotrófico derivado del cerebro, proteína morfogenética ósea, factores estimulantes de colonias, factor de crecimiento del tejido conectivo, células endoteliales, factor de crecimiento epidérmico, eritropoyetina, factor de crecimiento de fibroblastos, fibroblastos, factor neurotrófico derivado de la línea celular glial, factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos, factor de diferenciación del crecimiento 9, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento derivado del hepatoma, factor de crecimiento similar a la insulina, interleucinas, factor de crecimiento de queratinocitos, queratinocitos, linfocitos, macrófagos, mastocitos, miostatina, factor de crecimiento nervioso, neurotrofinas, factor de crecimiento derivado de las plaquetas, factor de crecimiento placentario, osteoblastos, plaquetas, células proinflamatorias, células estromales, linfocitos T, trombopoyetina, factor de crecimiento transformante alfa, factor de crecimiento transformante beta, factor de necrosis tumoral alfa, factor de crecimiento endotelial vascular y combinaciones de estos.

[0237] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados comprenden aditivos, agentes, y/o elementos funcionales, por ejemplo, que son particularmente útiles para la curación. Los agentes ejemplares útiles como factor de crecimiento para la reparación y/o curación de defectos pueden incluir, pero no se limitan a, factores de crecimiento para modalidades de tratamiento de defectos ahora conocidos en el arte o desarrollados posteriormente; los factores, agentes o modalidades ejemplares incluyen factores de crecimiento naturales o sintéticos, citoquinas o moduladores de los mismos para promover la curación de defectos óseos y/o tisulares. Los ejemplos adecuados pueden incluir, pero no se limitan a 1) terapias tópicas o de apósitos y agentes desbridantes (como, por ejemplo, la colagenasa Santyl®) y Iodosorb® (yodo cadexómero); 2) agentes antimicrobianos, incluyendo cremas o geles sistémicos o tópicos, incluyendo, por ejemplo, agentes que contienen plata como los SAG (geles antimicrobianos de plata), (CollaGUARD™, Innocoll, Inc) (apósito a base de proteína de colágeno tipo I purificada), CollaGUARD Ag (apósito bioactivo a base de colágeno impregnado de plata para heridas infectadas o con riesgo de infección), DermaSIL™ (apósito compuesto de espuma sintética de colágeno para heridas profundas y muy exudativas); 3) terapia celular o piel de bioingeniería, sustitutos de la piel y equivalentes de la piel, incluidos, por ejemplo, Dermograft (cultivo de matriz tridimensional de fibroblastos humanos que secretan citoquinas y factores de crecimiento), Apligraf® (queratinocitos y fibroblastos humanos) Graftskin® (bicapa de células epidérmicas y fibroblastos que es histológicamente similar a la piel normal y produce factores de crecimiento similares a los producidos por la piel normal), TransCyte (un sustituto temporal de la piel derivado de fibroblastos humanos) y Oasis® (un biomaterial activo que comprende tanto factores de crecimiento como componentes de la matriz extracelular como colágeno, proteoglicanos y glucosaminoglicanos); 4) citoquinas, factores de crecimiento u hormonas (tanto naturales como sintéticos) introducidos en la herida para promover la cicatrización de la misma, incluyendo, por ejemplo, NGF, NT3, BDGF, integrinas, plasmina, semáforo, factor de crecimiento derivado de la sangre, factor de crecimiento de los queratinocitos, factor de crecimiento tisular, TGF-alfa, TGF-beta, PDGF (pueden utilizarse uno o más de los tres subtipos: AA, AB y B), PDGF-BB, TGF-beta 3, factores que modulan los niveles relativos de TGFp3, TGFp1 y TGFp2 (por ejemplo g., manosa-6-fosfato), esteroides sexuales, incluyendo por ejemplo, estrógeno, estradiol, o un agonista del receptor de estrógeno seleccionado del grupo que consiste en etinilestradiol, dienoestrol, mestranol estradiol, estriol, un estrógeno conjugado, sulfato de piperazina de estrona, estilboestrol, fosfesterol tetrasódico, fosfato de poliestradiol, tibolona, un fitoestrógeno, 17-beta-estradiol; hormonas tímicas como timosina-beta-4, EGF, HB-EGF, factores de crecimiento de fibroblastos (por ejemplo g., FGF1, FGF2, FGF7), factor de crecimiento de queratinocitos, TNF, moduladores de la respuesta inflamatoria de la familia de las interleucinas como, por ejemplo, IL-10, IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 e IL-10 y sus moduladores; INF (INF-alfa, -beta y -delta) estimuladores de la activina o la inhibina, e inhibidores del interferón gamma prostaglandina E2 (PGE2) y de los mediadores de la vía de la adenosina 3',5'-monofosfato cíclico (AMPc); agonista de la adenosina A1, agonista de la adenosina A2 o 5) otros agentes útiles para la cicatrización de heridas, incluyendo, por ejemplo, homólogos naturales o sintéticos, agonistas y antagonistas del VEGF, VEGFA, IGF; IGF-1, citoquinas proinflamatorias, GM-CSF y leptinas y 6) ADNc de IGF-1 y KGF, gel de plaquetas autólogo, ácido hipocloroso (ácido lipoico Sterilox®, óxido nítrico sintasa3, metaloproteinasa de matriz 9 (MMP-9), CCT-ETA, integrina alfa-beta6, fibroblastos cebados con factores de crecimiento y decorina, apósitos que contienen plata, Xenaderm™, agentes de desbridamiento de heridas con papaína, lactoferrina, sustancia P, colágeno y plata-ORC, fosfatasa alcalina placentaria o factor de crecimiento placentario, moduladores de la señalización hedgehog, moduladores de la vía de síntesis del colesterol, y APC (proteína C activada), factor de crecimiento de queratinocitos, TNF, tromboxano A2, NGF, BMP (proteína morfogenética ósea), CTGF (factor de crecimiento del tejido conectivo), quimiocinas de curación de heridas, decorina, moduladores de la neovascularización inducida por lactato, aceite de hígado de bacalao, fosfatasa alcalina placentaria o factor de crecimiento placentario, y timosina beta 4. En ciertas realizaciones, uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis agentes útiles para la cicatrización de heridas pueden utilizarse en combinación. Se pueden encontrar más detalles en la patente estadounidense n.° 8.247.384, cuyo contenido se incorpora aquí por referencia.

[0238] Debe entenderse que los agentes útiles para la curación (incluyendo, por ejemplo, los factores de crecimiento y las citoquinas) abarcan todos los polimorfos naturales (por ejemplo, los polimorfos de los factores de crecimiento o las citoquinas). También se incluyen los fragmentos funcionales, las proteínas quiméricas que comprenden uno de dichos agentes útiles para la cicatrización de heridas o un fragmento funcional del mismo, los homólogos obtenidos por sustitución análoga de uno o más aminoácidos del agente de cicatrización de heridas y los homólogos de especies. Se contempla que uno o más agentes útiles para la cicatrización de heridas pueden ser un producto de la tecnología de ADN recombinante, y uno o más agentes útiles para la cicatrización de heridas pueden ser un producto de la tecnología transgénica. Por ejemplo, el factor de crecimiento derivado de las plaquetas puede proporcionarse en forma de un PDGF recombinante o un vector de terapia génica que comprenda una secuencia codificante para el PDGF.

[0239] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados comprenden aditivos, agentes, y/o elementos funcionales, por ejemplo, que son particularmente útiles como agentes de diagnóstico. En algunas formas de realización, los agentes de diagnóstico incluyen gases; los agentes de imagen disponibles en el mercado utilizados en la tomografía por emisión de positrones (PET), la tomografía asistida por ordenador (TAC), la tomografía computarizada por emisión de fotón único, la radiografía, la fluoroscopia y la resonancia magnética (RM); y los agentes de contraste. Ejemplos de materiales apropiados para su uso como agentes de contraste en RM incluyen quelatos de gadolinio, así como hierro, magnesio, manganeso, cobre y cromo. Algunos ejemplos de materiales útiles para la obtención de imágenes por TAC y rayos X son los materiales a base de yodo.

[0240] En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados comprenden aditivos, agentes, y/o elementos funcionales, por ejemplo, radionúclidos que son particularmente útiles como agentes terapéuticos y/o diagnósticos. Entre los radionúclidos utilizados, los emisores gamma, los emisores de positrones y los emisores de rayos X son adecuados para el diagnóstico y/o la terapia, mientras que los emisores beta y los emisores alfa también pueden utilizarse para la terapia. Los radionúclidos adecuados para formar conjugados con respuesta térmica de acuerdo con la invención incluyen, pero no se limitan a, 123I, 125I, 130I, 131I, 133I, 135I, 47Sc, 72As, 72Se, 90Y, 88Y, 97Ru, 100Pd, 101mRh, 119Sb, 128Ba, 197Hg 211At, 212Bi, 212Pb, 109Pd, 111In, 67Ga, 68Ga, 67Cu, 75Br, 77Br, 99mTc, 14C, 13N, 15O 32P, 33P, y 18F. En algunas realizaciones, un agente de diagnóstico puede ser una fracción fluorescente, luminiscente o magnética.

[0241] Las partes fluorescentes y luminiscentes incluyen una variedad de pequeñas moléculas orgánicas o inorgánicas comúnmente denominadas "tintes", "etiquetas" o "indicadores". Algunos ejemplos son la fluoresceína, la rodamina, los colorantes de acridina, los colorantes Alexa, los colorantes de cianina, etc. Las moléculas fluorescentes y luminiscentes pueden incluir una variedad de proteínas de origen natural y derivados de las mismas, por ejemplo, variantes modificadas genéticamente. Por ejemplo, las proteínas fluorescentes incluyen la proteína verde fluorescente (GFP), la GFP mejorada, las proteínas fluorescentes rojas, azules, amarillas, cian y zafiro, la proteína fluorescente de coral de arrecife, etc. Las proteínas luminiscentes incluyen la luciferasa, la aequorina y sus derivados. Numerosos tintes y proteínas fluorescentes y luminiscentes en la técnica son conocidos en la técnica (ver, p. ej., la publicación de solicitud de patente estadounidense número 2004/0067503; Valeur, B., “Molecular Fluorescence: Principles and Applications,” John Wiley and Sons, 2002; Handboos of Fluorescent Probes and Research Products, Molecular Probes, 9a edición, 2002; y The Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies, Invitrogen, 10a edición, disponible en la página web de Invitrogen).

Método de fabricación de materiales a base de fibroína de seda

[0242] En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de los materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen el suministro de una solución de seda tal y como se describe en el presente documento.

[0243] En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de los materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen la preparación y/o el suministro de una solución de fibroína de seda que comprende seda modificada tal y como se describe en el presente documento.

[0244] En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de los materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen el suministro de una solución de fibroína de seda que comprende seda modificada. En algunas formas de realización, la seda modificada comprende residuos de aminoácidos. En algunas formas de realización, un residuo de tirosina modificado es o comprende, de forma covalente, residuos de tirosina modificados (p. ej., mediante la adición de uno o más grupos colgantes). En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda comprenden una concentración de dicha seda modificada de entre, aproximadamente, 1 % y, aproximadamente, 90 %. En algunas formas de realización, los residuos de tirosina modificados de forma covalente. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda proporcionados comprenden una concentración de dicha seda modificada de, al menos, aproximadamente, 5 %; de, al menos, aproximadamente, un 10 %, de, al menos, aproximadamente, un 15 %; de, al menos, aproximadamente, un 20 %; de, al menos, aproximadamente, un 25 %; de, al menos, aproximadamente, un 30 %; de, al menos, aproximadamente, un 35 %; de, al menos, aproximadamente, un 40 %; de, al menos, aproximadamente, un 45 %; de, al menos, aproximadamente, un 50 %; de, al menos, aproximadamente, un 55 %; de, al menos, aproximadamente, un 60 %; de, al menos, aproximadamente, un 65 %; de, al menos, aproximadamente, un 70 %; de, al menos, aproximadamente, un 75 %; de al menos, aproximadamente, un 80 %; de, al menos, aproximadamente, un 85 %, de, al menos, aproximadamente, un 90 %; o más.

[0245] En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de los materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen la modificación de una solución de fibroína de seda o modificación de un material a base de fibroína de seda. En algunas formas de realización, los métodos de modificación de una solución de fibroína de seda o modificación de un material a base de fibroína de seda incluyen la adición, mezcla y/o aplicación de un aditivo, agente y/o porción funcional a una solución de seda o a un material a base de fibroína seda. En algunas formas de realización, los métodos de modificación de una solución de fibroína de seda o modificación de un material a base de fibroína de seda incluyen la reacción de un aditivo, agente y/o porción funcional con una solución de seda o con un material a base de fibroína seda.

[0246] En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de los materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen la preparación de una solución de fibroína de seda que comprende seda modificada. En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen el suministro de una solución de fibroína de seda (p. ej., una solución acuosa de fibroína de seda) y modificación de la solución. En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de los materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen el suministro de un material a base de fibroína de seda y modificación del material.

[0247] En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de los materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen el suministro de una solución acuosa de fibroína de seda y/o suministro de un material a base de fibroína de seda. En algunas formas de realización, dichos métodos comprenden modificación con ácido 4-sulfónico. En algunas formas de realización particulares, dichos métodos comprenden una modificación Dichos métodos comprenden una modificación mediante una reacción de acoplamiento de diazonio. En algunas formas de realización, dichos métodos comprenden la modificación con polilisina. En algunas formas de realización particulares, dichos métodos comprenden la modificación con 4-(heptiloxi)anilina. En algunas formas de realización particulares, tales métodos comprenden modificar con 4'-aminoacetofenona.

[0248] En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de los materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen la preparación y/o suministro de una solución de fibroína de seda que comprende entre, aproximadamente, 1 % y, aproximadamente, 75 % de seda modificada (p. ej., en algunas formas de realización, los residuos de tirosina que se han modificado de forma covalente mediante la adición de uno o más grupos colgantes). En algunas formas de realización, la preparación y/o suministro de dicha solución comprende la mezcla de una solución de seda compuesta por seda modificada con una solución de seda no modificada.

[0249] En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de los materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen la mezcla de soluciones de seda tal y como se describe en el presente documento con un plastificante. En algunas formas de realización, la mezcla de una solución de seda y un plastificante produce una solución con una relación de peso entre plastificante y seda de entre aproximadamente el 5% y aproximadamente el 80%. En algunas formas de realización, la mezcla de una solución de seda y un plastificante produce una solución con una relación de peso entre plastificante y seda de, aproximadamente, el 5 %; aproximadamente, el 10 %; aproximadamente el 15 %; aproximadamente el 20 %; aproximadamente el 25 %; aproximadamente el 30 %; aproximadamente el 35%; aproximadamente el 40 %; aproximadamente el 45 %; aproximadamente el 50%; aproximadamente el 55 %; aproximadamente el 60 %; aproximadamente el 65%; aproximadamente el 70 %; aproximadamente el 75 %; aproximadamente el 80 %; aproximadamente el 85 %; aproximadamente el 90 % o más.

[0250] Los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen la liofilización de una solución de fibroína de seda que comprende un plastificante. En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen la liofilización controlada durante un periodo y/o la congelación lenta. En algunas formas de realización, la liofilización controlada durante un periodo y/o la congelación lenta se utiliza para generar estructuras porosas dentro de las matrices de fibroína de seda. Sin querer ceñirse a una teoría particular, en algunas formas de realización, una tasa dicta cómo se forman los cristales de hielo, lo que en última instancia afecta a la morfología y a las propiedades mecánicas de los materiales a base de la fibroína de seda proporcionados. En algunas formas de realización, la liofilización controlada durante un periodo y/o la congelación lenta forman materiales a base de fibroína de seda que tienen una morfología de poros redondeados, interconectados y uniformemente espaciados.

[0251] Los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen la liofilización controlada durante un periodo y/o congelación lenta a una temperatura objetivo. En algunas formas de realización, una temperatura objetivo está entre -20 °C o -50 °C aproximadamente. Una temperatura objetivo es al menos más fría que la temperatura de transición vítrea de la seda. Una temperatura objetivo es: de, al menos, aproximadamente, -20 °C; al menos, aproximadamente, -25 °C; al menos, aproximadamente, -30 °C; al menos, aproximadamente, -35 °C; al menos, aproximadamente, -40 °C; al menos, aproximadamente, -45 °C, o al menos, aproximadamente, - 50 °C.

[0252] Los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen la liofilización controlada durante un periodo y/o congelación lenta a una tasa fija. En algunas formas de realización, la temperatura del estante se enfría de acuerdo con una tasa fija o variable. El enfriamiento se produce hasta que se alcanza una temperatura objetivo. En algunas formas de realización, el tiempo para alcanzar una temperatura objetivo, por ejemplo, es de entre, aproximadamente, 10 y, aproximadamente, 20 horas.

[0253] En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen la liofilización controlada durante un periodo y/o congelación lenta a una tasa de entre, aproximadamente, -1,0 °C/min y, aproximadamente, 0,001 °C/min. En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen la liofilización controlada durante un periodo y/o congelación lenta a una tasa inferior a, aproximadamente, -1,0 °C/min; inferior a aproximadamente -0,09 °C/min; inferior a aproximadamente -0,08 °C/min; inferior a aproximadamente -0,07 °C/min; inferior a aproximadamente -0,06 °C/min; inferior a aproximadamente -0,05 °C/min; inferior a aproximadamente -0,04 °C/min; inferior a aproximadamente -0,03 °C/min; inferior a aproximadamente -0,02 °C/min; inferior a aproximadamente -001 °C/min; inferior a -0,009 °C/min; inferior a -0,008 °C/min; inferior a -0,007 °C/min; inferior a -0,006 °C/min; inferior a -0,005 °C/min; inferior a -0,004 °C/min; inferior a -0,003 °C/min; inferior a -0,002 °C/min o inferior a -0,001 °C/min.

[0254] En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de materiales a base de fibroína de seda de la presente divulgación incluyen el suministro de un recipiente que posee una geometría optimizada de manera que un volumen de una solución de seda proporcionada se congela uniformemente durante la liofilización. En algunas formas de realización, un contenedor es térmicamente conductor. En algunas formas de realización, un contenedor tiene una conductividad térmica equivalente o superior a: 167 W/m-K (métrico) o 1160 BTU-in/hr-ft2-°F (inglés). En algunas formas de realización, por ejemplo, un contenedor está hecho de: alúmina, aluminio, berilio, latón, cobre, oro, hierro, plata, tungsteno y/o zinc.

[0255] En algunas formas de realización, los métodos de suministro, preparación y/o fabricación de materiales a base de fibroma de seda de la presente divulgación incluyen la inmersión de los materiales a base de fibroína de seda proporcionados en metanol después de la liofilización para formar materiales a base de fibroína de seda que son sustancialmente insolubles en agua. En algunas formas de realización, los materiales a base de fibroína de seda que contenían de 0 a 15% (p/p) de glicerol se sumergieron en metanol al 90% (v/v) durante 1 hora y se secaron en una campana de humos durante 12 horas. En algunas realizaciones, los materiales que contenían al menos un 20% (p/p) de glicerol eran insolubles en agua sin el tratamiento con metanol.

DEMOSTRACIÓN

[0256] Los siguientes ejemplos ilustran algunas formas de realización y aspectos de la invención. Los siguientes ejemplos no limitan en modo alguno la invención.

Ejemplo 1

[0257] El presente ejemplo describe un material de seda que vuelve a hincharse rápidamente después de la deformación provocada por la presencia de medios acuosos como el agua o el PBS de acuerdo con algunas formas de realización de la presente divulgación.

Metodología

[0258] Los capullos de Bombyx mori se hirvieron durante 10 o 20 minutos en una solución acuosa de carbonato de sodio 0,02 M y luego se enjuagaron con agua pura. La fibroína de seda extraída se secó durante 12 horas en una campana química antes de ser disuelta en una solución de LiBr 9,3 M a 60 °C durante 4 horas, obteniendo una solución al 20% (p/v). Esta solución se dializó contra agua destilada utilizando casetes Pierce Slide-a-Lyzer, MWCO 3500 Da (Rockford, IL) durante 3 días para eliminar el LiBr. La solución se centrifugó para eliminar los agregados que se formaron durante la purificación. La concentración final de la fibroína de seda acuosa estaba entre el 6 y el 8% (p/v). Esta concentración se diluyó con agua pura hasta el 3% (p/v) para todos los experimentos.

[0259] El tiempo de ebullición influye en el peso molecular de la fibroína de seda, y el peso molecular ha demostrado tener un impacto en el módulo de almacenamiento de las espumas resultantes (FIG. 2). Hasta ahora, sólo se ha probado la seda hervida durante 10 y 20 minutos, pero se espera que la seda de mayor peso molecular (de 5 minutos de ebullición) o la seda de menor peso molecular (de 30 o 60 minutos de ebullición) produzcan espumas más duras o más blandas, respectivamente. No se ha determinado cómo afectará el peso molecular a la recuperación del hinchamiento y la deformación.

Preparación de mezclas de plastificante/fibroína de seda

[0260] Se han utilizado varios plastificantes de poliol como aditivos, agentes y/o elementos funcionales para hacer espumas con memoria de seda con características físicas únicas. Cada poliol difiere ligeramente en su composición molecular, lo que produce espumas de seda con diferentes morfologías de poros y módulos de almacenamiento (FIG. 3). El trabajo actual se ha centrado predominantemente en el glicerol, sin embargo, se han recogido algunos datos preliminares utilizando otros polioles como el treitol, el 1,5 pentanediol, el 1,3 propanediol y el 1,2,6 hexanetriol. Los trabajos futuros se centrarán en seleccionar únicamente aquellos polioles que se consideren no tóxicos para preservar la naturaleza biocompatible de estas espumas.

[0261] Para hacer espumas de seda y de glicerol, se mezcló una solución acuosa de glicerol con una solución de fibroína de seda purificada a una relación de peso de 0, 1, 5, 10, 15, 20, 30 y 40% (p glicerol/p seda).

Proceso de Liofilización

[0262] Se utilizó un método de liofilización controlado para generar estructuras porosas dentro de las matrices de fibroína de seda. A diferencia de otros métodos de liofilización que se centran en congelar rápidamente las soluciones de seda en un entorno de temperatura constante (congelador de laboratorio o congelador tipo baúl) y dejar que las muestras permanezcan a temperatura durante varios días, este nuevo proceso utiliza un proceso de congelación lenta altamente controlado que afecta a la porosidad de la espuma, la morfología de los poros, la cinética de hinchamiento y la resistencia mecánica.

[0263] Las soluciones de seda y glicerol se congelaron en un liofilizador a -20°C o -50°C. Las soluciones de seda pueden congelarse en cualquier lugar dentro de este rango para hacer espumas con memoria de forma. Las únicas limitaciones de la temperatura de congelación son la temperatura de transición vitrea de la seda acuosa (debe estar por debajo de esta temperatura para conseguir una solidificación adecuada) y la capacidad del congelador (el liofilizador del laboratorio no puede mantener constantemente temperaturas inferiores a -50°C). Por lo tanto, se eligieron estas dos temperaturas como las extremas.

[0264] La temperatura de la plataforma se enfrió a una tasa fija de -0,05 °C/min hasta que se alcanzó la temperatura objetivo, lo que llevó 10 o 20 horas para -20 °C y -50 °C, respectivamente. La tasa de congelación es muy importante, ya que dicta cómo se forman los cristales de hielo, lo que en última instancia afecta a la morfología y las propiedades mecánicas de las espumas (FIG. 4). La congelación lenta controlada dará lugar a una morfología de poros redondeados, interconectados y uniformemente espaciados en las espumas. La congelación rápida se consigue ajustando la temperatura de la plataforma a la temperatura objetivo, lo que hace que la solución se congele en menos de una hora. La congelación rápida hace que los cristales de hielo crezcan con formas y tamaños aleatorios, creando una serie impredecible de diferentes geometrías de poros. Los trabajos futuros se centrarán en determinar cómo afectarán las diferentes velocidades de congelación fijas (p. ej., -0,01 °C o -0,1 °C) a las características mecánicas y morfológicas de las espumas de seda con memoria de forma.

Diseño de Moldes a Medida

[0265] Las mezclas de seda y glicerol se congelaron en un molde de aluminio diseñado a medida (FIG. 5). La placa tiene 380 pozos para hacer grandes lotes de espumas, y cada pozo tiene un diámetro de 12 mm y una profundidad de 20 mm.

[0266] A diferencia de los métodos de liofilización anteriores que utilizaban placas de pozos de poliestireno para moldear las espumas, la alta conductividad térmica del aluminio permite controlar mejor la temperatura de la solución de seda. El plástico, que no conduce el calor, hace que la solución de seda esté más caliente que el punto de ajuste de la estantería. Esto provoca incoherencias en la forma en que se congela la solución. Por ejemplo, los moldes de plástico suelen formar una bicapa en la que la mitad de la espuma tiene poros redondeados y la otra mitad contiene una distribución heterogénea de tamaños y geometrías de poros. El aluminio no crea una bicapa, sino que produce poros redondeados en toda la espuma (FIG. 6).

Tratamiento posterior

[0267] Después de la liofilización, todas las espumas que contenían 0 - 15% (p/p) de glicerol se sumergieron inmediatamente en metanol al 90% (v/v) durante 1 hora y se secaron en una campana de humos durante 12 horas. Las espumas que contenían un 20% (p/p) de glicerol o más se dividieron en dos grupos: 1) tratamiento con metanol durante 1 hora y 12 horas de secado, y 2) sin tratamiento posterior. El tratamiento con metanol se utilizó para hacer que las espumas fueran insolubles en agua, pero se observó que las espumas que contenían un 20% (p/p) de glicerol o más eran insolubles en agua sin el tratamiento con metanol.

Resultados: Hinchamiento, Mecánica y Morfología de los poros

[0268] Se cuantificó el hinchamiento midiendo la masa y el volumen de las espumas antes y después de la compresión. Para simular la inyección, las esponjas se comprimieron hasta un 90% de tensión (o un 10% de su altura original) y se sumergieron en PBS. El hinchamiento se calculó midiendo tanto la masa como las dimensiones de las muestras antes y después de la inmersión en PBS, midiendo así la absorción de PBS. Después de la compresión, las esponjas de seda solamente (controles) se hincharon aproximadamente un 400% de su masa inicial, pero mostraron una deformación plástica y una recuperación incompleta de su volumen original. Las esponjas de seda con glicerol se hincharon más del 800% de su masa inicial y mostraron una recuperación casi completa de su volumen inicial (FIG. 7). La expansión de volumen desde el estado comprimido para las esponjas de solamente de seda fue de aproximadamente 2x, mientras que el de las esponjas con glicerol fue de aproximadamente 6x. (FIG. 8, Izquierda).

[0269] La rigidez de las esponjas de seda con plastificante osciló entre aproximadamente 7,5 kPa y 810 kPa después de la expansión en PBS, un rango que es adecuado para la reconstrucción de una variedad de tejidos blandos. La rigidez mecánica puede ajustarse variando el peso molecular de la seda, el contenido de glicerol y el tiempo de tratamiento con metanol (sin tratamiento frente a 1 hora de tratamiento con metanol). En la FIG. 8, derecha, sólo ajustando el contenido de glicerol, el módulo elástico puede variar en más de un orden de magnitud, desde aproximadamente 35 kPa hasta 810 kPa.

[0270] Las esponjas tenían diámetros de poro de entre 100 y 200 pm, lo que es suficientemente grande como para acomodar la infiltración de células en el material a granel. Además, el tamaño y la forma de los poros no se vieron comprometidos por la compresión en determinadas formulaciones de espuma de seda y glicerol. El tamaño y la geometría de los poros pueden ajustarse mediante el proceso de liofilización controlada, modificando la velocidad de congelación.

Resultados: Degradación In Vivo

[0271] Se realizó la implantación subcutánea de espumas de seda solamente (control) y de seda-glicerol en ratones para observar cualquier respuesta inflamatoria que pudiera producirse como resultado de los materiales o los métodos de procesamiento. Las espumas se esterilizaron mediante gas de óxido de etileno y se implantaron después de haber sido completamente hidratadas. El análisis histológico de los materiales recuperados después de 2, 4, 8 y 12 semanas muestra que hay una respuesta inmunitaria mínima en ambos grupos, pero una amplia infiltración celular y degradación del material sólo en las espumas de seda-glicerol (FIG. 9). Estas son cualidades ideales, ya que la degradación y la infiltración celular son necesarias para la reabsorción de los materiales y la sustitución por tejido natural. Los trabajos futuros determinarán cómo controlar y afinar la degradación alterando la concentración de glicerol, la densidad de la espuma o el peso molecular de la fibroína.

Conclusiones

[0272] La perspectiva que se expone en el presente documento mejora la tecnología actual de las espumas de seda al proporcionar un material que ahora puede sufrir una rápida reexpansión tras la deformación provocada por la presencia de medios acuosos como el agua o el PBS (los materiales permanecen comprimidos cuando están secos y sólo se expanden tras la inmersión en los medios). Sin el uso de una molécula plastificante y un proceso de liofilización controlado, las espumas de seda suelen deformarse plásticamente al comprimirse. Esta es una cualidad desfavorable, ya que un material comprimido mostrará propiedades mecánicas diferentes a las de la forma original, no podrá rellenar un espacio vacío en el cuerpo e impedirá la infiltración celular y una cinética de degradación predecible. Estas espumas de seda con memoria de forma también muestran un hinchamiento volumétrico, una biocompatibilidad y una degradabilidad comparados con los actuales polímeros con memoria derivados de materiales naturales, y pueden ajustarse fácilmente para satisfacer una serie de módulos elásticos. Por ello, las espumas con memoria de seda podrían utilizarse como rellenos de tejidos blandos para defectos de la piel, mejoras estéticas (mamas, muslos, glúteos, etc.) o como injertos reabsorbibles para la desfiguración facial. Además, las propiedades elastoméricas de las espumas con memoria de seda también las convierten en materiales viables para dispositivos de implantación mínimamente invasivos para la administración de fármacos, la regeneración de tejidos o la coagulación de heridas.

Ejemplo 2

[0273] El presente ejemplo describe un material de seda con memoria de forma con modificación de ácido sulfónico según algunas formas de realización de la presente divulgación.

Metodología

[0274] Los capullos de Bombyx mori se hirvieron durante 10 o 20 minutos en una solución acuosa de carbonato de sodio 0,02 M y luego se enjuagaron con agua pura. La fibroína de seda extraída se secó durante 12 horas en una campana química antes de ser disuelta en una solución de LiBr 9,3 M a 60°C durante 4 horas, obteniendo una solución al 20% (p/v). Esta solución se dializó contra agua destilada utilizando casetes Pierce Slide-a-Lyzer, MWCO 3500 Da (Rockford, IL) durante 3 días para eliminar el LiBr. La solución se centrifugó para eliminar los agregados que se formaron durante la purificación. La concentración final de la fibroína de seda acuosa estaba entre el 6 y el 8% (p/v). Esta concentración se diluyó con agua pura hasta el 3% (p/v) para todos los experimentos.

Preparación de las espumas de seda modificada

[0275] Para hacer espumas de seda y glicerol, se mezcló una solución acuosa de glicerol con una solución de fibroína de seda purificada a relaciones de peso de 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60 y 75 % (p glicerol/p seda).

[0276] La modificación con ácido sulfónico de los residuos de tirosina dentro de las proteínas de la fibroína de seda se llevó a cabo mediante una reacción de acoplamiento de diazonio, como se vio en Murphy et al. Véase Murphy, Amanda R.; St. John, Peter; Kaplan, David L. Modification of silk fibroin using diazonium coupling chemistry and the effects on hMSC proliferation and differentiation. Biomaterials 2008; 29:2829-2838. La reacción produjo una solución de seda con aproximadamente el 60% de sus residuos de tirosina modificados con ácido sulfónico. Esta solución se mezcló con la solución de seda no modificada para producir soluciones con menos modificación (p. ej., 10% y 30% de tirosina modificada).

[0277] Después de la liofilización, las espumas se dividieron en 2 grupos: 1) tratado con metanol durante 1 hora y 2) sin tratamiento.

Pruebas mecánicas

[0278] Hinchamiento volumétrico: Los cilindros de espuma humedecidos (4,5 mm de diámetro) se comprimieron unilateralmente hasta el 10% de su altura máxima. El volumen de la espuma se midió en estado comprimido y luego se sumergió en agua durante 15 segundos. El volumen de la espuma resultante Se volvió a medir y se calculó la relación entre los volúmenes hinchados y comprimidos.

[0279] Módulo de compresión y recuperación: Las espumas se cargaron en una máquina de Análisis Mecánico Dinámico (AMD) y se comprimieron hasta el 80% de deformación para simular la compresión experimentada durante la inyección. El módulo de compresión se calculó a través de la pendiente de la curva de tensión-deformación entre el 1 y el 2% de deformación. La tensión máxima de compresión se calculó midiendo la tensión al 80% de la deformación. La velocidad de rampa fue de 1 mm/min.

Resultados: Hinchamiento, recuperación y mecánica

[0280] Se ha observado que la adición de glicerol a las espumas de seda liofilizadas aumenta la elasticidad y la recuperación tras la compresión. Además, el glicerol en altas concentraciones (>20% p/p) hace que los materiales de seda se cristalicen, haciendo que el material sea insoluble en agua. En comparación, las espumas de seda solamente requieren tratamientos posteriores (por ejemplo, metanol, autoclave, recocido en agua) para ser insolubles en agua.

[0281] En la FIG. 10, se muestra que las espumas de seda tienen una mejor recuperación con el aumento de la concentración de glicerol. Para tener una comparación precisa, se trataron con metanol las espumas que contenían de 0% (controles) a 40% p/p de glicerol. Las espumas de control solamente de seda recuperan hasta aproximadamente el 75-80% de su volumen original después de la compresión, mientras que las espumas que contienen >20% p/p de glicerol recuperan hasta el 90-95%. Sin el tratamiento con metanol, las espumas que contienen glicerol pueden recuperar casi el 100% de su volumen original después de una fuerte compresión.

[0282] En cuanto al hinchamiento volumétrico, los controles solamente de seda podrían expandirse 2-3 veces de su volumen comprimido, mientras la adición de 30 % p/p de glicerol permitió un hinchamiento mejorado de hasta 6-7 veces el volumen comprimido. Para mejorar aún más el potencial de hinchamiento de las espumas de seda, se utilizó una reacción de acoplamiento de diazonio para modificar los residuos de tirosina de la seda con ácido sulfónico. Se eligió la modificación con ácido sulfóni

glicerol, se creía que estas modificaciones darían lugar a espumas hidrofílicas capaces de absorber grandes cantidades de agua y un elevado hinchamiento volumétrico en comparación con los controles solamente de seda.

[0283] En la FIG. 11, los andamios de seda modificados con un 10% de ácido sulfónico no mostraron ninguna mejora con respecto a las espumas de seda con glicerol, sin embargo, las modificaciones más altas mostraron un hinchamiento mejorado, superior a 20 veces el volumen comprimido. Con la adición de glicerol, la seda modificada con ácido sulfónico al 30% pudo aumentar más de 40 veces el volumen comprimido, manteniendo cierta estructura. Después de aumentar, los andamios de seda modificados con glicerol/30% de ácido sulfónico se convirtieron en semigeles de forma amorfa con algunas partículas sólidas identificables dentro de su red polimérica.

[0284] Las espumas de seda acopladas con diazonio sin glicerol no tratadas se disolvieron en agua. Tal y como se esperaba, la adición de glicerol evitó una disolución siempre y cuando la modificación con ácido sulfónico no fuera demasiado elevada. Por ejemplo, los andamios modificados con ácido sulfónico al 30% que contenían glicerol no se disolvían, pero los andamios modificados al 60% con glicerol se disolvían rápidamente en el agua. Se predijo que la modificación de los residuos de tirosina con químicas hidrofílicas evitaría la formación de la lámina p en las espumas con tratamiento de glicerol o metanol. Para confirmar esto, se comparó la estructura secundaria de las espumas con distintos niveles de ácido sulfónico con y sin glicerol presente (FIG. 12).

[0285] Tal y como se esperaba, los controles de las espumas demuestran una estructura predominantemente amorfa, mientras que las espumas de glicerol y glicerol tienen un fuerte pico de lámina p. En las espumas modificadas con ácido sulfónico, con una modificación creciente y concentración constante de glicerol, el pico de la lámina p desaparece. Esto explica probablemente la capacidad de las espumas para expandirse mientras absorben agua. La disminución de la cristalinidad probablemente permitiría una mayor expansión, hasta un punto en el que las espumas no poseen suficientes enlaces físicos para mantenerse unidas.

[0286] Finalmente, la FIG. 13 destaca las propiedades mecánicas de las sedad modificadas frente a los controles solamente de seda. Las espumas modificadas con seda solamente, con seda y glicerol, y con ácido sulfónico poseen una rigidez mecánica similar. Las espumas modificadas con seda y glicerol, y ácido sulfónico que se transforman en geles blandos cuando se hinchan por completo, son casi tan blandas como las espumas sólo de seda, a pesar de la elevada retención de agua. Cabe destacar que el pico de tensión de compresión al 80% de deformación pretende imitar la fuerza necesaria para comprimir una espuma al 20% de su tamaño original, simulando así los efectos de la inyección. Mientras que las espumas de seda y de glicerol parecen requerir una mayor fuerza para una alta compresión, las espumas modificadas con ácido sulfónico de seda requieren una fuerza comparable para la compresión. Además, las espumas modificadas con seda y glicerol, y ácido sulfónico requieren una fuerza significativamente menor para la compresión, probablemente debido a la forma amorfa del material. Esto indica que las espumas de seda modificadas pueden ser más fáciles de comprimir durante la inyección.

Conclusiones

[0287] La adición de ácido sulfónico modificó aún más la memoria de forma y la superabsorción de las espumas de seda y de glicerol liofilizadas. Al ajustar tanto el contenido de glicerol como la modificación del ácido sulfónico, se puede conseguir controlar la cristalinidad y, por tanto, el hinchamiento. Hay que lograr un equilibrio entre el alto grado de hinchamiento y la integridad estructural. Lo ideal es que estas espumas sean sólidos altamente porosos. Sin embargo, también pueden utilizarse hidrogeles altamente absorbentes.

[0288] Las espumas resultantes pueden conseguir una mejor recuperación de los controles solamente de seda, un orden de magnitud mayor de hinchamiento, y una resistencia a la compresión comparable o menor a altas tensiones, lo que indica que pueden requerir menos fuerza para inyección mientras siguen manteniendo propiedades de memoria de forma altamente recuperables.

Ejemplo 3

[0289] El ejemplo presente describe un material de seda que vuelve a aumentar rápidamente después de la deformación provocada por la presencia de medios acuosos como agua o PBS según algunas formas de realización de la presente divulgación.

Materiales y Métodos

Preparación de Soluciones de Seda

[0290] La solución de fibroína de seda se preparó tal y como se informó previamente. Veáse, por ejemplo, Rockwood, D. N., Preda, R. C., Yücel, T., Wang, X., Lovett, M. L., & Kaplan, D. L., Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin, 6 Nature Protocols 10, 1612-31 (2011). En resumen, la proteína de fibroína de seda se extrajo de los capullos de Bombyx mori mediante la ebullición en una solución de carbonato de sodio de 0,02 M durante 10, 30 o 60 minutos (de ahora en adelante, 10 mE ("minutos extraídos"), 30 mE y 60 mE, respectivamente) para eliminar la sericina. La fibroína de seda extraída se lavó y secó durante 12 horas en una campana química antes de que se disolviera en una solución de LiBr de 9,3 M a 60 °C durante 4 horas, obteniendo una solución de 20 % p/v. Esta solución se dializó contra agua destilada utilizando casetes Pierce Slide- a-Lyzer, MWCO 3500 Da (Rockford, IL) durante 3 días para eliminar LiBr. La solución se centrifugó para eliminar los agregados que se formaron durante la purificación. La concentración final de la fibroína de seda acuosa (de aquí en adelante, seda) era ~6-8% p/v. Esta concentración se diluyó con agua desionizada al 3% p/v para todos los experimentos y se almacenó a 2-5 °C hasta su uso. Para las modificaciones de acoplamiento de diazonio solamente, la solución de seda se dializó adicionalmente contra el tampón de borato (100 mM de borato, 150 mM de cloruro de sodio, pH 9) (paquetes de tampón de borato Buph; Pierce, Woburn MA) durante 24 horas.

Preparación de mezclas de seda modificada

[0291] Se utilizaron dos métodos para fabricar esponjas de seda con características de hidrofilia mejorada y de memoria de forma. Todas las formulaciones se resumen en. En primer lugar, la proteína de seda acuosa se mezcló con aditivos de poliol específicos, como el glicerol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), como se ha descrito anteriormente. Véase, por ejemplo, Lu, S., Wang, X., Lu, Q., Zhang, X., Kluge, J., Uppal, N., Kaplan, D. L., Insoluble and flexible silk films containing glycerol, 11 Biomacromolecules 1, 143-50 (2010). Brevemente, se añadió una solución de glicerol a 700 mg/mL a soluciones de seda en varias proporciones peso: peso (p/p): 1:99, 5:95, 10:90, 15:85, 20:80, 30:70 y 40:60 peso glicerol: peso seda. Las soluciones se homogeneizaron mediante una inversión suave hasta que la separación de fases dejó de ser visible.

[0292] El segundo método de modificación de la seda fue mediante una reacción de acoplamiento de diazonio para modificar los residuos de tirosina con ácido sulfanílico. Véase, por ejemplo, Murphy, A. R., St John, P., & Kaplan, D. L., Modification of silk fibroin using diazonium coupling chemistry and the effects on hMSC proliferation and differentiation, 29 Biomaterials 19, 2829-38 (2008). Brevemente, las soluciones enfriadas de ácido sulfanílico (30 mL en agua, 0,065 M) y ácido p- toluenosulfónico (7,5 mL, 1,76 M) se agitaron en vórtex y se mantuvieron en un baño de hielo durante 10 minutos. A continuación, se añadió nitrito de sodio (7,5 mL, 0. M) a la solución, se agitó brevemente en vórtex y se mantuvo en hielo durante 30 minutos más. A continuación, se añadió la solución de sal de diazonio a la solución de seda de 10 mE en tampón de borato para conseguir un rendimiento teórico de aproximadamente el 60% de modificación de la tirosina. La modificación de la proteína de la seda se confirmó y cuantificó mediante un análisis espectrofotométrico. Los valores de absorbencia de las soluciones de seda modificadas a 325 nm se utilizaron para calcular la concentración relativa de los residuos de tirosina modificados. La solución de seda modificada con diazonio se diluyó en una solución de seda no modificada de 10 mE para conseguir mezclas con un 10% y un 30% de residuos de tirosina modificados. Las soluciones se diluyeron hasta una concentración de proteína de seda del 3% p/v y se almacenaron a 2-5 °C durante no más de 24 horas antes de su uso. En las figuras, las esponjas modificadas con diazonio se abrevian como SAA por sus siglas en inglés para "ácido sulfónico azosilk".

Liofilización y tratamiento posterior

[0293] Se utilizó un método de liofilización controlada para generar estructuras de poros distribuidas de forma homogénea dentro de las matrices de seda. Las mezclas de seda modificada se congelaron en un molde de aluminio diseñado a medida (FIG. 5). El molde de aluminio contenía 380 pozos (12 mm 0; 20 mm de profundidad) para hacer grandes lotes de esponjas. Se añadieron alícuotas de 1,5 mL de solución de seda en cada pocillo antes de transferirlas a un liofilizador VirTis Genesis 25L Super XL (SP Scientific, Stone Ridge, NY). Las muestras se congelaron utilizando una versión modificada de un protocolo publicado anteriormente. Véase, por ejemplo, Guziewicz, N., Best, A., Pérez-Ramírez, B., y Kaplan, D. L., Lyophilized silk fibroin hydrogels for the sustained local delivery of therapeutic monoclonal antibodies, 32 Biomaterials 10, 2642-2650 (2011). Brevemente, las muestras se enfriaron desde la temperatura ambiente y se mantuvieron a 5 °C durante 1 hora, luego se congelaron a -45 °C (tasa de rampa: -0,05 °C/min) y se mantuvieron durante 12 horas. El secado primario se realizó a - 20 °C a 50 mT de vacío hasta que la presión del manómetro Pirani registró un valor inferior a la presión del manómetro de capacidad. Patel, S. M., Doen, T., & Pikal, M. J., Determination of End Point of Primary Drying in Freeze-Drying Process Control, 11 AAPS PharmSciTech, 1, 73-84 (2010). Se realizó un paso de secado secundario a 4 °C durante 10 horas.

Procesamiento posterior

[0294] Una vez completada la liofilización, las esponjas que contenían entre un 0 y un 15% (p/p) de glicerol se sumergieron inmediatamente en metanol al 90% (v/v) durante 12 horas antes de ser lavadas y almacenadas en agua desionizada hasta su análisis. Las esponjas que contenían un 20% (p/p) de glicerol o más se procesaron posteriormente de las dos maneras siguientes 1) tratamiento con metanol durante 12 horas y almacenamiento en agua desionizada, o 2) almacenamiento directo en agua desionizada sin tratamiento posterior con metanol. Para cada grupo, se extrajo un subconjunto de muestras del agua desionizada y se liofilizó por segunda vez para secar los materiales. Estas muestras se almacenaron en tubos cerrados con paquetes de desecante a temperatura ambiente para el análisis de imágenes y la caracterización de la porosidad.

Técnicas analíticas

Módulo de Compresión, Recuperación, Hinchamiento y Fatiga

[0295] Se evaluaron las propiedades mecánicas de las esponjas de seda mediante ensayos de compresión no confinada en un analizador mecánico dinámico TA Instruments RSA3 (TA Instruments, New Castle, DE). Antes del análisis, las esponjas se cortaron en un tamaño cilíndrico uniforme (8 mm de diámetro y 5 mm de altura) y se rehidrataron en PBS IX al vacío (aproximadamente 60 kPa de vacío) durante 30 minutos para garantizar una hidratación adecuada en todo el material. A continuación, las muestras se mantuvieron en PBS durante 12 horas a temperatura y presión ambiente. Tras la rehidratación, las muestras de esponja se cargaron entre placas paralelas de acero inoxidable dentro de un baño de inmersión que contenía IX PBS. Todas las muestras se analizaron con una precarga inicial de 0,5 gramos para garantizar un contacto adecuado entre la placa superior y la muestra. Cada esponja se sometió a una macro personalizada que midió en secuencia el módulo elástico, la histéresis y la recuperación de la forma antes y después de la aplicación de una tensión axial del 80% (20% de la altura inicial) para simular un esfuerzo físico exigente, como la inyección. Antes de cada prueba, las esponjas se preacondicionaron mediante cuatro ciclos a una tensión axial del 40% a una velocidad de rampa de 1 mm/min y se dejaron recuperar en PBS durante 30 minutos antes de comenzar la prueba primaria. Tras el preacondicionamiento, se registró la altura inicial de la muestra con la precarga de 0,5 gramos aplicada.

[0296] Las muestras de esponja se sometieron a la siguiente secuencia de pruebas 1) carga/descarga al 20% de deformación (para el módulo comprimido previamente; denominado "pre"); 2) carga/descarga al 80% de deformación axial (ciclo de alta compresión); 3) carga/descarga al 20% de deformación axial (para el módulo comprimido posteriormente; denominado "post"). La velocidad de rampa se mantuvo constante en 1 mm/min para todos los ensayos. El módulo de compresión se calculó mediante la pendiente de la región elástica lineal de cada curva de tensión-deformación en el rango de 1-5 % de deformación axial. La recuperación se calculó comparando la altura de la esponja (con una precarga aplicada de 0,5 gramos) antes y después de la deformación axial del 80%. La histéresis se midió como la relación del área bajo la curva entre las regiones de carga y descarga de cada barrido de deformación. Para las mediciones de fatiga, se controló el módulo de almacenamiento de las muestras sometidas a una carga cíclica a una frecuencia de 0,5 Hz con una deformación axial de 1, 5 o 10% durante 1000 ciclos. Los índices de hinchamiento se calcularon midiendo las dimensiones axiales y radiales de las esponjas a una compresión máxima elegida (5% de altura inicial; 95% de tensión axial) y después de la deshidratación mediante la eliminación del agua residual. Las muestras se rehidrataron en IX PBS durante 30 segundos. Se volvió a medir el volumen de la muestra y se comparó con el volumen comprimido.

Porosimetría de intrusión de mercurio

[0297] Se realizaron mediciones de porosimetría por intrusión de mercurio para evaluar la porosidad y la distribución del tamaño de los poros de las esponjas de seda modificadas tras su hidratación y posterior liofilización para secar el material conservando la forma hidratada. Se analizaron muestras de esponjas cilindricas (de tamaño variable según el grado de hinchamiento) mediante un porosímetro de intrusión de mercurio Quantachrome PoreMaster (Quantachrome Instruments, Boynton Beach, FL). Para cada formulación, se masificaron cinco muestras y se agruparon en cubetas de muestra de vidrio con un volumen de vástago de 0,5 cc. Se realizó un ciclo de baja presión (presión máxima: 50 psi, o 344 kPa) para evaluar el tamaño de los poros dentro del rango de los micrómetros. Los resultados se presentan como un histograma del tamaño de los poros (en pm) frente a una función de distribución del tamaño de los poros, FV, donde FV = -[dV/dlog(D)], V es el volumen acumulado de los poros y D es el diámetro de los poros.

Infrarrojos con transformada de Fourier (FTIR)

[0298] Para analizar y cuantificar los elementos estructurales secundarios de las proteínas de las esponjas de seda se utilizaron el FT-IR y la autodeconvolución de Fourier (FSD). Las esponjas se midieron utilizando un espectrómetro JASCO FTIR 6200 (JASCO, Tokio, Japón) combinado con un cristal de germanio MIRacle™ de reflexión total atenuada (ATR). Se midió el fondo y los escaneos espectrales de 4000-600 cm-1 con una resolución de 2 cm-1 para 32 escaneos por muestra. Las muestras de esponja se midieron tal y como se procesaron (inmediatamente después del ciclo de liofilización) o después de la hidratación. Si se hidrataban, las esponjas se secaban en una campana de flujo de aire durante 12 horas y se mantenían bajo desecante hasta el análisis para reducir la interferencia de la adsorción de agua. La estructura secundaria se cuantificó en la región de la amida I (1590-1710 cm-1) mediante FSD y ajuste de picos utilizando el software Opus 5.0 (Bruker, Billerica, MA). Cada espectro IR en bruto se sometió a una línea base, a un suavizado de 9 puntos (método Savitzky-Golay) y a una deconvolución utilizando una forma de línea lorentziana con un ancho de banda medio de 25-26 cm-1 y un factor de reducción de ruido de 0,3. La apodización se realizó mediante una función Blackman Harris. La región de la amida I deconvolucionada se ajustó a la curva con 11 perfiles de forma de línea gaussiana como se ha descrito anteriormente. Véase, por ejemplo, Hu, X., Kaplan, D. y Cebe, P., Determining beta-sheet crystallinity in fibrous proteins by thermal analysis and infrared spectroscopy, 39 Macromolecules 18, 6161-6170 (2006). Los picos se asignaron a elementos estructurales secundarios específicos basándose en trabajos anteriores, véase, por ejemplo, Lawrence, B. D., Omenetto, F., Chui, K., & Kaplan, D. L., Processing methods to control silk fibroin film biomaterial features, 43 J. Materials Science 21, 6967-6985 (2008) y las contribuciones relativas de cada estructura se calcularon a partir de la relación del área bajo el pico en relación con la suma del área de todos los picos ajustados.

Calorimetría diferencial de barrido

[0299] Las soluciones de seda que contenían concentraciones variables de glicerol (0-10 % p/p) se diluyeron hasta el 4 % p/v de proteína de seda y se analizaron en un calorímetro diferencial de barrido TA Instruments G100 (New Castle, DE). Se añadieron 10 pl de muestra a bandejas herméticas de aluminio con tapa y se sellaron utilizando una prensa de muestras para reducir la evaporación durante el calentamiento. Se realizaron mediciones con modulación de temperatura en muestras enfriadas a -45 °C y calentadas a una velocidad de 2,0 °C/min hasta 20 °C, con un período de modulación de 60 s y una amplitud de modulación de temperatura de 1±0,318 °C. La temperatura de transición vítrea de la solución se determinó como el punto de inflexión en los cambios de escalón subtérmico.

Microscopía electrónica de barrido (SEM)

[0300] Se utilizó el MEB para evaluar la morfología de los poros de las esponjas de seda modificadas. Las esponjas de proteína de seda se visualizaron con un microscopio electrónico Zeiss EVO MA10 (Carl Zeiss AG, Alemania). Se analizaron muestras cilíndricas después de la hidratación y subsecuente re-liofilización. Las muestras se cortaron a lo largo del eje horizontal, se montaron en una cinta de cobre y se les aplicó una capa de oro antes de obtener las imágenes.

Implantación Subcutánea In Vivo

[0301] Todos los estudios con animales se llevaron a cabo bajo protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus siglas en inglés) de la Universidad de Tufts y la Oficina de Bienestar de los Animales de Laboratorio (OLAW, por sus siglas en inglés) del Instituto Nacional de Salud. Se compraron ratones hembra Balb-C de 6 a 8 semanas de edad en Charles River Labs (Wilmington, MA) y se les permitió aclimatarse durante 1 semana antes de los estudios de implantación. Los animales fueron anestesiados mediante la inhalación de isoflurano al 3% para la inducción y se mantuvo al 2% durante los procedimientos quirúrgicos. Todos los animales se mantuvieron con almohadillas térmicas durante la anestesia. Las esponjas de seda se esterilizaron en un ciclo de autoclave húmedo durante 25 minutos y se equilibraron en PBS IX estéril durante 24 horas antes de la cirugía. Se asignaron aleatoriamente a los ratones cuatro puntos temporales (2, 4, 8 y 12 semanas) con dos animales por punto temporal. Cada ratón tenía dos tipos de muestras de esponja de seda (5 mm 0; 3 mm de altura): 3% p/v de seda solamente y 3% p/v de seda con 30% p/w de glicerol (N=4 por grupo por punto de tiempo). Las esponjas se implantaron por vía subcutánea en las regiones escapular e inguinal dorsal. En cada momento, se practicó la eutanasia a los animales y se extirparon las esponjas de seda junto con el tejido circundante para su examen histológico. El diámetro de la esponja de cada muestra se midió con calibradores, tras lo cual las muestras se fijaron y almacenaron en formol.

Histoquímica

[0302] Los tejidos extirpados se fijaron en formalina tamponada neutra al 10% y se incrustaron en cera de parafina tras deshidratación por xileno y baño de etanol graduado. Las muestras se seccionaron, se montaron en portaobjetos de vidrio y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) para visualizar la infiltración celular. Las muestras se visualizaron con un microscopio de luz Zeiss Axiovert 40 CFL y un objetivo de 10X (Carl Zeiss, Alemania).

Estadísticas

[0303] Los datos se expresan como media ± desviación estándar. Para los datos mecánicos (N=3 por grupo) y el análisis de la estructura secundaria (N=3 por grupo), se utilizó ANOVA de 1 vía y el análisis post-hoc de Tukey para p<0,05 para determinar la significación de los grupos experimentales en comparación con los controles solamente de seda. La significación entre las propiedades mecánicas de las esponjas comprimidas "pre" y "post" (N=3 por grupo, muestreo dependiente) se determinó mediante una prueba t emparejada con significación estadística aceptada a p<0,05. La significación de la degradación in vivo se midió mediante una prueba t no emparejada entre los controles de sólo seda y las muestras de seda-glicerol (N=4 por grupo y por punto de tiempo) en cada punto de tiempo para p<0. 05.

Resultados

Esponjas de seda modificadas con diazonio

[0304] La modificación mediante el acoplamiento de diazonio se confirmó mediante un análisis espectrofotométrico (FIG.

14). Véase, por ejemplo, Murphy, A. R., St John, P., & Kaplan, D. L., Modification of silk fibroin using diazonium coupling chemistry and the effects on hMSC proliferation and differentiation, 29 Biomaterials 19, 2829-38 (2008). La modificación se detectó observando una disminución del pico de absorción de la tirosina a 280 nm en comparación con el control de sólo seda, así como un aumento de la absorción del azobenceno con picos a 325 y 390 nm en la seda modificada. El rendimiento teórico de los residuos de tirosina modificados se calculó en un 58,6%, basándose en los residuos de tirosina disponibles por proteína de seda y en la concentración de sal de diazonio añadida. La modificación real de tirosina por molécula de proteína de seda se estimó utilizando la Ley de Beer. Véase, por ejemplo, Murphy, A. R., St John, P., & Kaplan, D. L., Modification of silk fibroin using diazonium coupling chemistry and the effects on hMSC proliferation and differentiation, 29 Biomaterials 19, 2829-38 (2008); véase también Pielak, G. J., Urdea, M. S., Igi, K., & Legg, J. I., Azo protein analogues: synthesis and characterization of arsanilazo and sulfanilazo derivatives of tyrosine and histidine, 23 Biochemistry, 589-596 (1984). La concentración de tirosina modificada se calculó a partir de la absorbancia a 325 nm utilizando un coeficiente de extinción de 22.000 M-1 cm-1. El porcentaje se estimó comparando este valor con la molaridad de la proteína de la seda. El rendimiento estimado de la tirosina azo-modificada fue del 57 %. Para simplificar, la nomenclatura de estas esponjas redondea al 60%. El stock de seda modificada con diazonio se diluyó con solución de seda nativa para conseguir soluciones con menor proporción de tirosina modificada.

Mecánicas de Compresión y Recuperación de Esponjas de Seda Modificada

Esponjas Modificadas solo con Glicerol

[0305] En la FIG. 15 se muestran los perfiles representativos de tensión-deformación de las esponjas de seda extraídas durante 10 minutos y modificadas con glicerol (40% en masa), con el tratamiento posterior de metanol o con ambos. En general, la combinación de un alto contenido de glicerol (20% en peso o más) y el tratamiento posterior con metanol aumentó la rigidez de las esponjas de seda en comparación con la seda sola (tratada con metanol) o con la seda-glicerol sin tratar (sin tratamiento con metanol). De manera similar, se observaron cambios en la histéresis (reportada como una relación de las áreas bajo la curva para los ciclos de carga vs. descarga), con las esponjas de seda sola tratadas con metanol exhibiendo mayor histéresis durante la compresión en comparación con las esponjas de seda-glicerol sin tratar y tratadas con metanol (FIG. 15B).

[0306] El módulo de compresión de las esponjas osciló entre aproximadamente 7,5 kPa y 45,9 kPa después de la hidratación en PBS (FIG. 15C), un rango que es adecuado para la reconstrucción de una variedad de tejidos blandos. Véase, por ejemplo, Discher, D. E., Mooney, D. J., & Zandstra, P. W., Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells, 324 Science 5935, 1673-1677 (2010). En las esponjas tratadas posteriormente con metanol, el aumento del contenido de glicerol se correlaciona con un aumento del módulo de compresión. Sin un lavado con metanol, sólo se consideraron para las pruebas las esponjas de seda con alto contenido de glicerol (30% p/p o más), ya que un bajo contenido de glicerol no era suficiente para provocar la reticulación y la insolubilidad del material. Las esponjas de seda con glicerol sin tratamiento posterior con metanol eran significativamente más blandas que sus homólogas tratadas con metanol.

[0307] El tiempo de extracción de la seda por sí solo no influyó en la rigidez de la esponja. Con un contenido bajo de glicerol (0 y 10 % en peso) no hubo diferencias significativas en el módulo de compresión de las esponjas. En general, los cambios en el contenido de glicerol tuvieron el mayor impacto en las esponjas de seda extraídas en 10 y 30 minutos. Las esponjas de seda de 10 mE aumentaron su módulo a medida que aumentaba el contenido de glicerol, con cambios significativos a 30 y 40% p/p en comparación con las esponjas de control. Las esponjas de 30 mE tuvieron una respuesta bifásica, con un módulo de compresión máximo al 20% p/p de contenido de glicerol. No hubo diferencias significativas en el módulo de las esponjas de 60 mE en comparación con los controles de sólo seda por debajo del 30% p/p de glicerol. Sin el tratamiento con metanol, las esponjas de 10 mE y 60 mE no fueron significativamente más rígidas que sus controles de sólo seda.

[0308] La fidelidad de la forma, observada mediante la comparación del módulo de compresión antes ("pre") y después ("post") de la alta compresión, así como la medición del cambio de altura después de la deformación del 80 %, se vio afectada tanto por el peso molecular de la proteína como por el contenido de glicerol (FIGs. 15C y 15D). En las muestras tratadas posteriormente con metanol, la seda extraída en 10 minutos mostró la mayor diferencia en el módulo después de la alta compresión, mientras que no hubo diferencias significativas en el módulo de las esponjas de 60 mE (Tabla 4). Las esponjas de seda con glicerol (30% y 40% p/p) sin tratamiento posterior con metanol no presentaron diferencias significativas en el módulo antes y después de la deformación axial del 80%, independientemente del tiempo de extracción. La recuperación de la forma mejoró en general con el aumento de la concentración de glicerol.

[0309] Las esponjas de 10 mE con 40% p/p de glicerol y sin tratamiento de metanol mostraron la mayor recuperación (98,3% de la altura inicial, frente al 78,6% de recuperación en las esponjas de control de 10 mE). En

las esponjas de 10 mE, tanto las esponjas de control como las que contenían 40% p/p de glicerol mostraron una resistencia a la fatiga similar, con un aumento mínimo de los módulos de compresión a lo largo de 1000 ciclos (FIG. 16).

*= p<0,05; **= p<0,01; ***= p<0,001, en comparación con las esponjas de 0 % de glicerol

dentro de cada grupo.

Tabla 4: Módulo de compresión para la fórmula de esponjas de seda

Esponjas Modificadas con Diazonio

[0310] Las esponjas de seda modificadas con diazonio al 10% (extracción de 10 minutos) con tratamiento posterior de metanol eran más rígidas en comparación con las esponjas de seda sin modificar únicamente (12,9 ± 0,7 kPa diazonio aumentaba al 30% y al 60%, el módulo de compresión se reducía a 11,0 ± 0,8 y 5,8 ± 0,1 kPa, respectivamente. La adición de un 30% p/p de glicerol a las esponjas modificadas con diazonio al 10% y al 30% (sin tratamiento posterior con metanol) redujo el módulo de compresión a 9,0 ± 1,7 y 9,2 ± 0,02 kPa, respectivamente. Las esponjas de glicerina con un 60% de modificación de diazonio no fueron capaces de mantener su forma, dando lugar a una consistencia similar a la de un gel. No fue posible medir el módulo de compresión.

[0311] La alta tensión axial (80% de altura máxima) redujo significativamente el módulo de compresión del material comprimido posteriormente para todas las esponjas modificadas con diazonio, con y sin glicerol, excepto para las esponjas modificadas con SAA al 60% sin glicerol. Las esponjas modificadas con diazonio al 10% y al 30% con glicerol experimentaron el mayor cambio en el módulo de compresión antes y después de la alta compresión, lo que indica una baja resistencia a la deformación plástica. También se registró el pico de tensión de compresión al 80% de deformación axial. Este valor se utilizó como predictor de las fuerzas de inyección. Un mayor pico de tensión a un 80% de compresión probablemente se traduciría en mayores fuerzas de inyección. En general, la adición de un 30% en peso de glicerol aumenta el esfuerzo de compresión medio de todas las esponjas en comparación con sus homólogas con 0% de glicerol. A medida que aumenta el contenido de modificación de diazonio, el esfuerzo máximo disminuye, siguiendo las tendencias observadas en el módulo de compresión.

Relaciones de hinchamiento

[0312] El hinchamiento se cuantificó midiendo el volumen de las esponjas antes y después de la alta compresión axial. Las esponjas derivadas de la fibroína de seda de 10 mE se sometieron a una compresión muy alta (95% de tensión axial, o 5% de su altura original) y se secaron eliminando el agua residual y no ligada. El hinchamiento se calculó midiendo las dimensiones axiales y radiales de las muestras antes y después de sumergirlas en IX PBS, midiendo así la absorción del medio (FIGs. 18, 19). Esta prueba complementa las pruebas de recuperación (que se centraban únicamente en la altura de la muestra) porque tiene en cuenta el volumen total, un parámetro importante para la inyectabilidad. Después de la compresión, las esponjas de seda solamente (control) se hincharon hasta 2,9 veces su volumen comprimido, mostrando una alta deformación plástica y una recuperación incompleta de su volumen original. Las esponjas de seda no tratadas con un 30% en peso de glicerol se hincharon hasta 5,9 veces su volumen comprimido. En general, la modificación con diazonio aumentó la expansión volumétrica de las esponjas de seda tras la compresión. Las esponjas de diazonio modificadas con un 10%, 30% y 60% de tirosina mostraron una expansión volumétrica de 7,7*, 9,5* y 16,9* desde un estado comprimido, respectivamente. Al añadir un 30% p/p de glicerol, la expansión volumétrica de estas esponjas modificadas con diazonio cambió a 5,4*, 14,2* y 71,4*, respectivamente. No hubo diferencias significativas en la expansión volumétrica de las esponjas modificadas con diazonio al 10 % y al 30 % con respecto a las que no tenían glicerol.

Análisis de segundas estructuras

Esponjas modificadas solamente de glicerol

[0313] Se midió la estructura secundaria para correlacionar los cambios en la estructura de las proteínas con las diferencias en las propiedades mecánicas de las esponjas (FIG. 20, Tabla 5). Se registraron espectros FTIR en materiales con y sin glicerol, antes y después del tratamiento posterior con metanol para detectar las diferencias en la cristalinidad como resultado de cada modificador. El tiempo de extracción no desempeñó un papel significativo en la estructura secundaria de las proteínas. En las esponjas de seda-glicerol antes del tratamiento con metanol, comienza a producirse un aumento de la estructura de la hoja p a partir del 15% en peso de glicerol. Con un 20% de glicerol en peso y por debajo, se observó que las esponjas eran parcial o totalmente solubles en medios acuosos y, por lo tanto, no se utilizaron para el análisis mecánico sin un paso de tratamiento posterior con metanol. El aumento de la estructura de la hoja p en los materiales de seda con una alta concentración de glicerol ha sido reportado en varios otros estudios. Véase, por ejemplo, Jose, R. R., Brown, J. E., Polido, K. E., Omenetto, F. G., & Kaplan, D. L., Polyol-Silk Bioink Formulations as Two-Part Room-Temperature Curable Materials for 3D Printing, 1 ACS Biomaterials Science & Engineering 9, 780-788 (2015); véase también Lu, Q., Hu, X., Wang, X., Kluge, J., Lu, S., Cebe, P., & Kaplan, D. L., Water-insoluble silk films with silk I structure, 6 Acta Biomaterialia 4, 1380-7 (2010); Pei, Y., Liu, X., Liu, S., Lu, Q., Liu, J., Kaplan, D. L., & Zhu, H., Mild process to design silk scaffolds with reduced p-sheet structure and various topographies at nanometer scale, 13 Acta Biomaterialia, 168-176 (2015). Alternativamente, el aumento de la concentración de glicerol al 20 % p/p y superior en las esponjas tratadas antes del metanol desencadenó una disminución de las estructuras de p-giro, bobina aleatoria y ahélice. Tras el tratamiento con metanol, todas las esponjas que contenían un 15% p/p de glicerol o menos mostraron un aumento significativo de la estructura de p-hoja y una disminución significativa de las estructuras de bobina aleatoria y ahélice. Las esponjas que contenían un 20% de glicerol en peso tendieron a una ligera disminución de la estructura de hoja p tras el tratamiento con metanol y a un ligero aumento de los otros tres elementos estructurales. Además, los picos de 800-1150 cm-1 se han asociado previamente con las bandas de absorción del glicerol. Véase, por ejemplo, Ramos, O. L., Reinas, I., Silva, S. I., Fernandes, J. C., Cerqueira, M. a., Pereira, R. N., Malcata, F. X., Effect of whey protein purity and glycerol content upon physical properties of edible films manufactured therefrom, 30 Food Hydrocolloids 1, 110-122 (2013). La reducción de la intensidad del pico en esta región sugiere que el glicerol se ha eliminado del material tras el lavado con metanol.

Resultados reportados como el porcentaje relativo /%) de cada estructura secundaria frente a todas las amidas

I (vibraciones C=O del enlace de hidrógeno de la proteína). Las mediciones se presentan antes ("pre") y

después ("post") del tratamiento con metanol.

*= p<0,05; **= p<0,01; ***= p<0,001, en comparación con “pre” y “post” para cada formulación

Tabla 5: Cuantificación de la estructura secundaria en esponjas de seda

Esponjas modificadas con diazonio

[0314] Los elementos de la segunda estructura de esponjas de seda modificadas con diazonio se compararon entre una esponja de glicerol de 10 mE 30 % p/p y grupos de esponjas de glicerol de 10 mE sin tratar 0 % p/p (FIG.21). Como se ha visto previamente, la adición de 30 % p/p de glicerol a una esponja de seda no modificada da lugar a un aumento significativo en el contenido de la lámina p en comparación con las esponjas de los controles de solamente seda (50,5 % ± 0,3 % frente a 35,6 ± 1, 0 %). Sin embargo, con la adición de la modificación de diazonio en los residuos de tirosina, observamos un gran descenso de la estructura de lámina p dentro del rango de concentración de tirosina modificada probada. En general, el contenido de la lámina p disminuía en las esponjas de glicerol y seda conforme el contenido de diazonio aumentaba. Además, hubo aumentos significativos en las estructuras a-helicoidales y de espiral aleatoria y disminuciones significativas en la estructura p-giro en las esponjas de seda-glicerol modificadas con diazonio frente a las esponjas de seda solamente.

Morfología de los Poros y Porosidad

[0315] Para facilitar una integración tisular adecuada, los materiales porosos deben contener estructuras de celular abiertas e interconectadas lo suficientemente largas para admitir la infiltración celular. Para capturar la morfología de los poros en un estado hidratado, las esponjas se hincaron en agua desionizada y se liofilizaron otra vez antes del análisis SEM. La FIG. 22 muestra la apariencia macroscópica de las esponjas de seda no modificada frente a las esponjas de seda modificadas con diazonio, mientras que la FIG. 22B muestra la morfología de poros microscópica de esponjas transversales (de 10 mE de seda, con y sin glicerol) con diferentes concentraciones de modificación de diazonio. Independientemente de la presencia de glicerol, observamos que el aumento de la concentración de la modificación de tirosina produjo poros con diámetros aumentados. Además, la adición de glicerol produjo poros con una morfología más redondeada, mientras que las esponjas de seda sin glicerol mostraron, de forma general, poros irregulares o laminares.

[0316] La porosimetría de intrusión de mercurio también se utilizó para caracterizar la distribución del volumen y del tamaño de los poros de las esponjas de seda modificadas (Tabla 6). El tiempo de extracción impactó la distribución del tamaño de los poros y la morfología, con mayores tiempos de extracción incurriendo en una mayor polidispersidad (FIG.

22C). Los diámetros medios de los poros eran de 11,3 |am; 13,1 |am y 14,2 |am con picos máximos localizados en 11,6 iam; 29,2 |am y 34,5 |am para 10 mE, 30 mE y 60 mE, respectivamente, con la adición del 30 % p/p de glicerol, las funciones de distribución del tamaño de los poros se estrecharon para todos los tiempos de extracción, con los diámetros de los poros predominantemente entre 5-50 |im (FIG. 22D). Los diámetros medios de los poros eran de 13,5 |im; 15, |im, 20,8 |im, con los picos máximos localizados en 33,2 y 11 |im (2 picos); 16,7 |im y 19,3 |im para 10 mE, 30 mE y 60 mE, respectivamente. Modificando la seda con grupos de ácido sulfanílico hidrofílico, observamos un mayor aumento en los diámetros de los poros (FIG. 22E). Para una modificación de diazonio de 10 %, 30 % y 60 %, los diámetros medios de los poros eran de 51,9 |im; 55,3 |im y 76,8 |im, respectivamente, mientras que la adición de 30 % p/p de glicerol cambió los diámetros medios a 64,1 |im; 54,1 |im y 91,2 |im, respectivamente. Todas las muestras eran altamente porosas, siendo las de 30mE, 30% p/p de glicerol las que tenían la menor porosidad, con un 88,5% de espacio vacío (volumen de espacio vacío sobre el volumen total del material).

Tabla 6: Características de porosidad de las esponjas de seda modificadas

Degradación in vivo

[0317] Se implantaron por vía subcutánea en ratones esponjas de seda solamente (control) y de seda-glicerol para controlar la respuesta inflamatoria y la infiltración celular en la estructura de la esponja. Las esponjas se esterilizaron mediante un ciclo de autoclave húmedo y se implantaron después de hidratarse completamente en IX PBS. El análisis histológico de los materiales recuperados después de 2, 4, 8 y 12 semanas muestra que hay una respuesta inmunitaria mínima en ambos grupos, pero una amplia infiltración celular y degradación del material en las esponjas de seda y de glicerol en comparación con los grupos de control (FIG. 23). A las 12 semanas, la tinción de H&E mostró que las células estaban relegadas en su mayoría al perímetro de las esponjas de control de solamente de seda. En cambio, las células pudieron infiltrarse más profundamente en el núcleo de las esponjas de seda-glicerol. Al medir el diámetro de las esponjas extirpadas, observamos un hinchamiento inicial del control de sólo seda durante 8 semanas, mientras que las esponjas de seda-glicerol ya habían empezado a degradarse a las 2 semanas. Al final del estudio, sólo quedaba el 69,9 % del volumen inicial de las esponjas de seda-glicerol, frente al 93,1 % del volumen inicial de los controles de seda.

Discusión

[0318] El objetivo de este estudio era desarrollar esponjas biodegradables que muestren un alto hinchamiento y recuperación de la forma después de la compresión para su uso con dispositivos inyectables y aplicaciones de relleno de tejidos blandos. Como se muestra en trabajos anteriores, véase por ejemplo Bellas, E., Lo, T. J., Fournier, E. P., Brown, J. E., Abbott, R. D., Gil, E. S., Kaplan, D. L., Injectable Silk Foams for Soft Tissue Regeneration, 4 Advanced Healthcare Materials 3, 452-459 (2015); véase también Bellas, E., Panilaitis, B. J. B., Glettig, D. L., Kirker-Head, C. A, Yoo, J. J., Marra, K. G., Kaplan, D. L., Sustained volume retention in vivo with adipocyte and lipoaspirate seeded silk scaffolds, 34 Biomaterials 12, 2960- 8 (2013); Wang, Y., Rudym, D. D., Walsh, A., Abrahamsen, L., Kim, H. J., Kim, H. S., Kaplan, D. L., In vivo degradation of three-dimensional silk fibroin scaffolds, 29 Biomaterials, 3415-3428 (2008) los andamios de seda porosa son mecánicamente robustos, sintonizables y capaces de retener volumen a largo plazo in vivo. Desgraciadamente, estos andamios de seda son también relativamente frágiles y tienden a deformarse plásticamente bajo grandes tensiones. Aunque son ideales para los defectos a gran escala y la reconstrucción de tejidos blandos que requieren técnicas quirúrgicas invasivas, estos andamios de seda tridimensionales requerirían una reformulación sustancial para lograr la elasticidad mecánica necesaria para las estrategias de despliegue mínimamente invasivo y la reparación de defectos de pequeño volumen. Los enfoques anteriores para diseñar materiales de seda porosa con características de memoria de forma se han centrado en la modificación química con poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAAm). Véase, por ejemplo, Gil, E. S., & Hudson, S. M., Effect of Silk Fibroin Interpenetrating Networks on Swelling / Deswelling Kinetics and Rheological Properties of Poly(N-isopropylaclamide) Hydrogels, 8 Biomacromolecules, 258-264 (2007); véase también Gil, E. S., Park, S.-H., Tien, L. W., Trimmer, B., Hudson, S. M., & Kaplan, D. L., Mechanically robust, rapidly actuating, and biologically functionalized macroporous poly(N-isopropyladamide)/silk hybrid hydrogels, 26 Langmuir 19, 15614-24 (2010). Estos materiales pueden hincharse y comprimirse en respuesta a los cambios de temperatura. Esto es ideal para aplicaciones inyectables en las que se desea una compresión del material activable durante la inyección y una expansión después de la implantación; sin embargo, existen preocupaciones respecto a la seguridad de los aditivos sintéticos y potencialmente tóxicos como el PNIPAAm en sistemas biológicos, así como la falta de biodegradabilidad. En el presente estudio, intentamos utilizar aditivos no tóxicos y biológicamente seguros, así como modificaciones químicas, para diseñar materiales que presentaran una expansión desencadenada en respuesta a la hidratación y que, al mismo tiempo, conservaran su plena degradabilidad con el paso del tiempo. En teoría, estos materiales podrían comprimirse e inyectarse en un estado no saturado, y luego expandirse en un medio hidratado hasta alcanzar su volumen original y su estructura de célula abierta para dar cabida al abultamiento del tejido, la infiltración celular y la remodelación de la matriz extracelular circundante.

[0319] Estos nuevos diseños de esponjas se centran principalmente en la fusión de dos estrategias distintas: la mezcla de la proteína de la seda con aditivos higroscópicos de poliol (como el glicerol) y la modificación química de la seda con productos químicos hidrófilos (como el ácido 4-sulfanílico o la polilisina). En estudios recientes se ha informado de varios plastificantes de poliol como aditivos para hacer materiales de seda con propiedades elásticas. Véase, por ejemplo, Jose, R. R., Brown, J. E., Polido, K. E., Omenetto, F. G., y Kaplan, D. L., Polyol-Silk Bioink Formulations as Two-Part Room-Temperature Curable Materials for 3D Printing, 1 ACS Biomaterials Science & Engineering 9, 780-788 (2015); véase también Lu, Q., Hu, X., Wang, X., Kluge, J., Lu, S., Cebe, P., & Kaplan, D. L., Water-insoluble silk films with silk I structure, 6 Acta Biomaterialia 4, 1380-7 (2010); Pei, Y., Liu, X., Liu, S., Lu, Q., Liu, J., Kaplan, D. L., & Zhu, H., Mild process to design silk scaffolds with reduced p-sheet structure and various topographies at nanometer scale, 13 Acta Biomaterialia, 168-176 (2015). Estudios preliminares han demostrado que ciertos polioles, específicamente el glicerol, tienen la capacidad intrínseca de inducir la reticulación física en la seda, produciendo así materiales de seda mezclados con alta cristalinidad e insolubilidad. Aunque los trabajos actuales se han centrado principalmente en el glicerol, se sabe poco sobre las interacciones seda-glicerol que dan lugar a materiales con gran flexibilidad y propiedades de memoria de forma. En las esponjas de seda-glicerol se observan dos tendencias principales: un aumento de la recuperación tras la compresión y un aumento del módulo de compresión de las esponjas correlacionado con los aumentos de la concentración de glicerol. En la FIG. 15, la recuperación a la compresión, especialmente para las esponjas derivadas de tiempos de extracción bajos, aumenta constantemente con el contenido de glicerol en las esponjas tratadas posteriormente con metanol. En las esponjas sin tratamiento posterior con metanol, un alto contenido de glicerol (40% p/p) mostró una reducción de la recuperación en las esponjas de 60 mE, ningún cambio en las de 30 mE y una mejora adicional en las de 10 mE. Está claro que el tiempo de extracción juega un papel en la recuperación de las esponjas de seda-glicerol no tratadas. La estructura secundaria por FTIR muestra un aumento de la cristalinidad (contenido de la lámina p) en las esponjas con alto contenido en glicerol, lo que probablemente contribuye a la robustez mecánica y a la recuperación de la forma. Sin embargo, las diferencias en la estructura secundaria a través de los tiempos de extracción son mínimas dentro de cada grupo. Informes anteriores también describen que las esponjas de seda derivadas de sedas de bajo peso molecular son propensas a colapsar bajo cargas físicas, un fenómeno atribuido a un entrelazamiento molecular insuficiente. Véase, por ejemplo, Rnjak-Kovacina, J., Wray, L. S., Burke, K. A, Torregrosa, T., Golinski, J. M., Huang, W., & Kaplan, D. L., Lyophilized silk sponges: a versatile biomaterial platform for soft tissue engineering, 1 ACS Biomaterials Science & Engineering 4, 260-270 (2015). El bajo enredo de la cadena puede ser la razón por la que las esponjas de seda de mayor tiempo de extracción muestran una recuperación reducida después de la compresión.

[0320] El aumento del módulo de compresión de las esponjas de seda-glicerol puede explicarse por las temperaturas de transición vítrea de la solución (Tgs de la solución) observadas con calorimetría diferencial de barrido (FIG. 24). El glicerol actúa como agente anticongelante, reduciendo la Tg de las soluciones de seda-glicerol. Nuestro protocolo de liofilización seca principalmente a -20 °C, que es más caliente que la temperatura de transición vítrea de una solución de seda-glicerol (10% p/p). Esto puede provocar el colapso de la torta de proteínas, causando potencialmente la densificación. Las esponjas de seda-glicerol que no fueron tratadas con metanol probablemente se hincharon en agua, y el colapso estructural fue irrelevante. Sin embargo, las esponjas tratadas con metanol pueden haberse reticulado aún más en este estado de densificación, fijando así una estructura más densa que la de las esponjas de control sólo de seda. Se esperaba que los materiales de seda-glicerol tuvieran módulos elásticos más bajos en comparación con los controles de sólo seda; véase, por ejemplo, Lu, Q., Hu, X., Wang, X., Kluge, J., Lu, S., Cebe, P., & Kaplan, D. L., Water-insoluble silk films with silk I structure, 6 Acta Biomaterialia 4, 1380-7 (2010); véase también Pei, Y., Liu, X., Liu, S., Lu, Q., Liu, J., Kaplan, D. L., & Zhu, H., Mild process to design silk scaffolds with reduced p-sheet structure and various topographies at nanometer scale, 13 Acta Biomaterialia, 168-176 (2015). Sin embargo, la densificación en las esponjas tratadas con metanol puede explicar la mayor rigidez. Los trabajos futuros deberán estudiar la mecánica de las esponjas formadas a temperaturas inferiores a la Tg de la solución, lo que podría recapitular las tendencias observadas en otros trabajos.

[0321] Previamente, se ha comunicado la modificación química de la proteína de seda con grupos hidrofílicos. Veáse, por ejemplo, Murphy, A. R., St John, P., & Kaplan, D. L., Modification of silk fibroin using diazonium coupling chemistry and the effects on hMSC proliferation and differentiation, 29 Biomaterials 19, 2829-38 (2008). Estos estudios han evaluado la modificación de diazonio de materiales de seda para biocompatibilidad, entrega de fármacos y estructura de proteínas. El trabajo que aquí se presenta se centra en las propiedades materiales aún inexploradas de los formatos de proteína de seda modificados con diazonio. Como se predijo, la adición de sustancias químicas hidrofílicas mejoró la absorción de medios acuosos en el andamiaje de seda, y la inhibición de la formación de cristales de la lámina p permitió una mejor relajación de la matriz interna, permitiendo un hinchamiento volumétrico de hasta 80 veces su estado comprimido en ciertas formulaciones. Sorprendentemente, a pesar de la reducción significativa en el contenido de la lámina p, todas las esponjas de diazonio (tanto las tratadas con metanol como con glicerol) eran mayoritariamente insolubles. Se requiere una caracterización más rigurosa de los materiales para determinar si las esponjas son parcialmente solubles y dónde se produce todavía la reticulación física. Además, todas las pruebas de recuperación/expansión en el trabajo actual se hicieron en condiciones no confinadas. Es poco probable que una esponja de seda con un 60% de SAA/30% en peso de glicerol posea la robustez mecánica necesaria para expandirse en condiciones de confinamiento. Sin embargo, las esponjas con una modificación menor pueden conservar suficiente estructura para ejercer una fuerza de expansión.

[0322] La morfología de los poros, la interconectividad y el volumen total fueron características importantes en el desarrollo de nuestras esponjas. En general, las matrices con poros pequeños (<100 pm de diámetro) pueden no dar cabida a la infiltración celular, ya que los poros están demasiado constreñidos, mientras que los poros de gran diámetro pueden impedir una fijación celular adecuada. Veáse, por ejemplo, Lutolf, M. P., & Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering, 2 3 Nature Biotechnology 1, 47-55 (2005); see also Rnjak-Kovacina, J., Wray, L. S., Burke, K. a, Torregrosa, T., Golinski, J. M., Huang, W., & Kaplan, D. L., Lyophilized silk sponges: a versatile biomaterial platform for soft tissue engineering, 1 ACS Biomaterials Science & Engineering 4, 260-270 (2015). Además, la porosidad total y la interconectividad de los poros desempeñan un papel importante en la absorción del medio y la infiltración celular, lo que podría influir en el hinchamiento volumétrico, la degradación del material y la tasa de remodelación mediada por las células. Por lo tanto, optamos por utilizar un proceso de liofilización controlado, que se sabe que produce andamios con alta porosidad e interconectividad. La forma de los poros puede modificarse durante la liofilización controlando la temperatura de congelación y la velocidad de rampa durante el enfriamiento. Véase, por ejemplo, O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., y Gibson, L., Influence of freezing rate on pore structure in freeze-dried collagen-GAG scaffolds, 25 Biomaterials 6, 1077-1086 (2004). Dado que el objetivo era crear materiales mecánicamente isotrópicos, optamos por utilizar una tasa de congelación lenta en un material de moldeo térmicamente conductor para mejorar la transferencia de calor y limitar la formación de cristales de hielo unidireccionales y poros alargados, como se ha visto en otros estudios. Véase, por ejemplo, Mandal, B. B., Gil, E. S., Panilaitis, B., & Kaplan, D. L., Laminar Silk Scaffolds for Aligned Tissue Fabrication, 13 Macromolecular Bioscience 1,48-58 (2013). Este método produjo poros con una morfología muy redondeada, como se muestra en la FIG. 22.

[0323] Las características de los poros se midieron mediante porosimetria de intrusión de mercurio (PIM). Aunque muchos estudios anteriores se han basado en la microscopía electrónica de barrido o en la tinción histoquímica para analizar la geometría de los poros de las esponjas poliméricas, estos métodos pueden ser subjetivos, ya que el corte transversal del material puede causar daños en la microestructura y puede no dar lugar a poros con límites bien definidos. De forma alternativa, la PIM mide la porosidad de un material intacto en todo su volumen. Desafortunadamente, la principal limitación con varias de estas técnicas es que los materiales deben medirse cuando están secos, mientras que los materiales implantados estarían, normalmente, completamente hidratados. Las esponjas secas tendrían previsiblemente diámetros de poros más pequeños en comparación con su estado hidratado. Estudios futuros que analicen la morfología de los andamios porosos deberían incluir una técnica analítica que pueda medir los andamios hidratados con una alta resolución, como la tomografía microcomputada o el SEM ambiental.

[0324] Sin embargo, observamos que el tiempo de extracción de proteínas influyó en la heterogeneidad del tamaño de los poros, ya que un mayor tiempo de extracción dio lugar a una mayor polidispersidad de las formas de los poros. Este resultado puede tener que ver con la viscosidad de la solución, ya que los tiempos de extracción más cortos producen soluciones de seda más viscosas, y la alta viscosidad limita la formación de cristales de hielo y su propagación. La adición de un 30% p/p de glicerol cambia la distribución de los poros del material estrechándolos entre 5-55 pm de diámetro. Se ha demostrado que la adición de glicerol aumenta la viscosidad de la solución de seda, lo que puede limitar el crecimiento de los cristales de hielo en soluciones de seda de alta extracción; véase, por ejemplo, Jose, R. R., Brown, J. E., Polido, K. E., Omenetto, F. G., & Kaplan, D. L., Polyol-Silk Bioink Formulations as Two-Part Room-Temperature Curable Materials for 3D Printing, 1 ACS Biomaterials Science & Engineering 9, 780-788 (2015) sin embargo, otra explicación puede ser que el glicerol puede secuestrar agua, mejorando la separación proteína-agua y causando regiones de proteína de alta y baja densidad durante la liofilización. Por último, la adición de seda modificada con tirosina aumentó en gran medida el tamaño de los poros en los andamios de seda. Como se esperaba, la química hidrofílica y la reducción del contenido de la hoja p permitieron una mayor captación de medios y la relajación de la matriz proteica para acomodar el alto hinchamiento. Como se muestra en la FIG. 22, la microscopía electrónica de barrido revela que la morfología interna de las esponjas de seda modificadas con tirosina se vuelve más fibrilar con la adición de glicerol. El aumento de la superficie probablemente contribuye a la capacidad de la esponja de 60 % SAA/30 % p/p de glicerol para absorber fluidos. Sin embargo, el material carece por completo de rigidez y sería inadecuado como agente de volumen o relleno de tejidos.

[0325] En todos los casos, la morfología de poros se midió en materiales que no habían experimentado previamente compresión mecánica. Estudios futuros deberían investigar el impacto de una alta compresión en la estructura interna de los materiales porosos. En este trabajo, asumimos que la recuperación de volumen implicaba la preservación de la geometría de la matriz inicial. Sin embargo, este puede no ser el caso. Una alta compresión puede hacer que las paredes celulares se colapsen, se agrieten o se deformen irreversiblemente. La fidelidad de forma, como se ha evaluado mediante la comparación de la compresión mecánica antes y después de una tensión del 80 %, es una métrica útil para estimar el daño de los poros, ya que las propiedades mecánicas de una esponja están en gran parte relacionadas con la integridad de la pared celular. Las esponjas que contienen glicerol sin el tratamiento posterior con metanol no presentaron diferencias significativas entre el módulo de compresión anterior y posterior, independientemente del tiempo de extracción, lo que indica que el glicerol puede mejorar la flexibilidad de la pared, preservar la integridad mecánica y evitar la deformación o fractura permanente. Sin embargo, en futuros trabajos se evaluará un examen más detallado de la superficie de la pared de los poros, quizás a escala nanométrica, para determinar la verdadera resistencia a la fatiga.

[0326] La evaluación in vivo reveló que las esponjas de seda y glicerol experimentan un aumento significativo en una tasa de degradación en comparación con los controles solamente de seda cuando se implantan por vía subcutánea (FIG. 23). Esto es coherente con un estudio de degradación in vitro publicado recientemente que muestra un aumento de la tasa de degradación de las esponjas de seda-glicerol en solución de proteasa en comparación con los controles de sólo seda. Veáse, por ejemplo, Pei, Y., Liu, X., Liu, S., Lu, Q., Liu, J., Kaplan, D. L., & Zhu, H., Mild process to design silk scaffolds with reduced p-sheet structure and various topographies at nanometer scale, 13 Acta Biomaterialia, 168-176 (2015). Para ser claros, se cuantificó la degradación de las esponjas midiendo el diámetro de muestra utilizando calibradores, no midiendo el área del espacio no infiltrado. El diámetro de la esponja y la profundidad de la infiltración celular eran dos atributos distintos, ya que a menudo observamos seda residual entre el infiltrado de tejido fibroso. Sin embargo, el aumento de la infiltración celular en las esponjas de seda-glicerina explica probablemente la rápida degradación, ya que la descomposición del material de seda estaba mediada en gran medida por las células. Además, el diámetro de la esponja no parecía disminuir como resultado de la compresión física. Mediante el examen histológico, el volumen de los poros parece ser aproximadamente comparable en todos los puntos temporales. Si las esponjas se comprimieran in vivo, probablemente observaríamos una densificación del material a granel. Además, observamos la ausencia de células gigantes multinucleadas en todos los puntos temporales, lo que indica una mínima inflamación del tejido. Veáse, por ejemplo, example Meinel, L., Hofmann, S., Karageorgiou, V., Kirker-Head, C., McCool, J., Gronowicz, G., Kaplan, D. L., The inflammatory responses to silk films in vitro and in vivo, 26 Biomaterials 2, 147-155 (2005); see also Thurber, A. E., Omenetto, F. G., & Kaplan, D. L., In vivo bioresponses to silk proteins, 71 Biomaterials, 145-157 (2015).

[0327] No está claro por qué las células pueden infiltrarse mejor en esponjas de seda y de glicerol. Una explicación podría ser que las esponjas de seda y de glicerol tienen una capacidad de hinchamiento mejorada en medios acuosos, haciendo que los diámetros de los poros aumenten y, por consiguiente, permitan un mejor acceso a las células circundante. De forma alternativa, el glicerol es un derivado de las grasas y aceites intrínsecos del organismo. El glicerol residual presente dentro de las esponjas de seda puede ser reconocido por las células, provocando la migración a lo que, por otra parte, es un material extraño. Los futuros ensayos in vivo deben examinar cómo la tasa de degradación y la infiltración celular se ven afectadas por el contenido de glicerol, ya que en este estudio solamente se observaron proporciones de glicerol del 30 % p/p.

[0328] Por último, la mecánica del material, la morfología de los poros y la tasa de degradación in vivo se examinaron con una única concentración de proteína de seda (3% p/v). Las concentraciones de proteína más altas probablemente aumentarían el módulo elástico de todas las esponjas, lo que haría que los materiales fueran adecuados para reparar una gama más amplia de tejidos blandos, así como para ampliar la retención de volumen in vivo, sin embargo, no está claro cómo se compararían las características de recuperación y memoria de forma con las esponjas actuales. La concentración de proteína del 3% p/v se eligió originalmente para imitar el módulo del tejido adiposo, aunque muchos procedimientos de abultamiento de tejidos pueden requerir una retención de volumen más prolongada de la que son capaces las actuales esponjas de seda y glicerol para apoyar una regeneración adecuada del tejido. Para las aplicaciones que requieren un abultamiento a corto plazo (3-6 meses), las esponjas de seda al 3% p/v con un 30% p/p de glicerol son candidatas ideales para una rápida integración del tejido y la recapitulación de la mecánica del tejido blando nativo.

Conclusiones

[0329] El enfoque que aquí se expone mejora la tecnología actual de las esponjas de seda al proporcionar un material que puede experimentar una rápida recuperación de la compresión desencadenada por la presencia de medios acuosos como el agua o el PBS. El uso de modificaciones químicas de diazonio y de aditivos de glicerol confiere a las esponjas de proteína de seda la capacidad de hincharse, lo que hace que los materiales sean útiles para rellenar espacios vacíos o heridas en el cuerpo y mejorar la infiltración celular para la remodelación de tejidos. Estas esponjas de seda modificadas podrían utilizarse como rellenos de tejidos blandos para defectos de la piel, mejoras estéticas (mamas, muslos, glúteos, etc.) o como injertos reabsorbibles para la desfiguración facial. Además, las propiedades elastoméricas de estas esponjas de seda las convertirían en candidatas viables para estrategias de implantación mínimamente invasivas en la administración de fármacos, la regeneración de tejidos o la coagulación de heridas. Los trabajos futuros determinarán cómo afinar aún más la mecánica y la degradación alterando la concentración de glicerol, la hidrofilia, la densidad de reticulación de las moléculas de seda y la concentración de proteínas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Material de seda comprendiendo un plastificante y presentando una estructura caracterizada por una ausencia sustancial de cristales de hielo y:

poros interconectados y uniformemente espaciados que presentan una morfología redondeada;

una uniformidad sustancial de forma de poro; o

sus combinaciones

donde los poros dentro del material de seda se forman enfriando una solución de fibroína de seda a una velocidad de enfriamiento de entre -10 °C/min y -0,001 °C/min hasta una temperatura de congelación inferior o igual a -20 °C,

cuyo material de seda:

a) es sensible a compresión en un estado comprimido de volumen reducido con respecto al volumen inicial del material antes de la compresión; y

b) se caracteriza por una capacidad, en respuesta a un activador ambiental, de expandirse desde el estado comprimido hasta un estado expandido presentando un volumen expandido comparable con el volumen inicial.

2. Material de seda de la reivindicación 1, donde el material se caracteriza por una expansión volumétrica cuando se expone a un activador y/o a estímulos externos tras la compresión, donde la expansión volumétrica es, opcionalmente, al menos dos veces mayor y/o aproximadamente 400 %.

3. Material de seda de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el material de seda comprende fibroína de seda que presenta un peso molecular medio en un rango entre aproximadamente 500 Da y aproximadamente 3000 kDa o en una concentración dentro de un rango de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 50 %.

4. Material de seda de la reivindicación 1, donde el material presenta un diámetro medio de poro en un rango entre aproximadamente 5 pm y aproximadamente 500 pm o donde el material se caracteriza por poros que son homogéneos a través de un volumen.

5. Material de seda de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el material se caracteriza por un valor de módulo elástico en un rango entre aproximadamente 5 kPa y aproximadamente 2500 kPa, un valor de módulo compresivo en un rango entre aproximadamente 500 Pa y aproximadamente 1500 kPa, y/o un valor de módulo de almacenamiento en un rango entre aproximadamente 500 Pa y aproximadamente 1500 kPa.

6. Material de seda de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el material se caracteriza por que, cuando se expone a una presión de compresión de hasta 90 %, el material se recupera cuando se expone al desencadenante sin mostrar una indicación de una deformación plástica.

7. Material de seda de la reivindicación 6, donde el material se recupera de una tensión de compresión de hasta 100 kPa cuando se expone al activador sin mostrar una indicación de una deformación plástica o donde el material se recupera cuando se expone a un disolvente.

8. Material de seda de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el material se caracteriza por un hinchamiento de hasta aproximadamente 900 % a partir de una masa inicial cuando se expone a un disolvente o donde el material se caracteriza por un hinchamiento volumétrico de hasta aproximadamente 50 veces a partir de un volumen inicial cuando se expone al disolvente.

9. Material de seda de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el material comprende además un aditivo, un agente, y/o una porción funcional.

10. Material de seda de la reivindicación 1, comprendiendo además un anestésico.

11. Material de seda según la reivindicación 1, comprendiendo además un medio acuoso o medios de cultivo celular.

12. Método de preparación de un material de seda que presenta propiedades de memoria de forma, el método comprendiendo las etapas de:

enfriamiento de una solución de fibroína de seda que comprende un plastificante a una temperatura de congelación inferior a la temperatura de transición vítrea de la seda, dicho enfriamiento realizándose a una velocidad que se ha determinado como lo suficientemente lenta para que la solución de seda forme un material de seda caracterizado por:

una ausencia sustancial de cristales de hielo;

una uniformidad sustancial de forma de poro; o

sus combinaciones,

donde los poros dentro del material de seda se forman enfriando una solución de fibroína de seda a una velocidad de enfriamiento entre -10 °C/min y -0,001 °C/min a una temperatura de congelación inferior o igual a -20 °C.

13. Método de la reivindicación 12, donde la velocidad de enfriamiento es inferior a aproximadamente -1,0 °C/min, está en un rango entre aproximadamente -0,01 °C/min y aproximadamente -0,1 °C/min, es inferior a aproximadamente -0,1 °C/min, o es aproximadamente -0,05 °C/min.

14. Método de la reivindicación 12, donde la etapa de enfriamiento comprende el mantenimiento de la solución de fibroína de seda en un recipiente, donde el recipiente es opcionalmente de aluminio, donde el recipiente es opcionalmente conductor térmico.

15. Método de la reivindicación 12, comprendiendo además la configuración de un valor de módulo de almacenamiento del material en un rango entre aproximadamente 5kPa y aproximadamente 2000 kPa, entre aproximadamente 5kPa y aproximadamente 1500 kPa, o entre aproximadamente 500 Pa y aproximadamente 1500 kPa.

16. Método de utilización de un material de seda con memoria de forma, el método comprendiendo las etapas de:

sometimiento de un material de espuma con memoria de forma de seda que comprende un plastificante a una tensión de compresión para que se comprima; y

exposición del material comprimido a un activador ambiental de manera que se expanda para formar una esponja de seda,

donde la esponja de seda presenta un volumen comparable al de la espuma con memoria de seda antes de la compresión y una estructura caracterizada por:

una ausencia sustancial de cristales de hielo;

una uniformidad sustancial de forma de poro; o

sus combinaciones,

donde los poros dentro del material de fibroína de seda se forman enfriando una solución de fibroína de seda a una velocidad de enfriamiento entre -10 °C/min y -0,001 °C/min a una temperatura de congelación inferior a -20 °C.