ES2916709T3 - Secuencias de HCBI, MSBI, MSSI y CMI como marcador temprano para el futuro desarrollo del cáncer y enfermedades del SNC y como diana para el tratamiento y la prevención de estas enfermedades - Google Patents

Abstract

Un ácido polinucleico de aislado de leche de vaca (CMI) que comprende: (a) una secuencia de nucleótidos representada en la Figura 1 (e) [SEQ ID NO: 46], Figura 1(f) [SEQ ID NO: 57], Figura 1(g) [SEQ ID NO: 70] o Figura 1(h) [SEQ ID NO: 90]; (b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 99 % de identidad con una secuencia de nucleótidos de (a); (c) una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de (a) o (b); o (d) una secuencia de nucleótidos que es redundante como resultado de la degeneración del código genético en comparación con cualquiera de las secuencias de nucleótidos proporcionadas anteriormente.

Description

DESCRIPCIÓN

Secuencias de HCBI, MSBI, MSSI y CMI como marcador temprano para el futuro desarrollo del cáncer y enfermedades del SNC y como diana para el tratamiento y la prevención de estas enfermedades

La presente invención se refiere a secuencias de nucleótidos de CMI (forma siglada de Cow Milk Isolate, aislado de leche de vaca), así como sondas y cebadores que comprenden parte de dichas secuencias de nucleótidos y anticuerpos contra polipéptidos codificados por dichas secuencias de nucleótidos. Finalmente, la presente invención se refiere al uso de dichos compuestos como un marcador temprano para el futuro desarrollo de enfermedades tales como cáncer y enfermedades del SNC y como diana para el tratamiento y la prevención de estas enfermedades.

Antecedentes

Varios análisis epidemiológicos realizados en las últimas décadas indican que el consumo a largo plazo de carne "roja" procesada de diferentes maneras (incluyendo carne ahumada o secada al aire y carne como componente de embutido consumido infrecuentemente, poco cocinada o asada) puede considerarse un factor de riesgo para cáncer de colon (World Cancer Report 2007, zur Hausen 2012). La carne "roja" se considera que comprende vacuno, cerdo, cordero, cordero lechal y cabra, en contraste con la carne "blanca" (carne de ave de corral/pescado).

Hasta ahora, las sustancias químicas carcinógenas que se producen durante el horneado, asado, a la barbacoa, ahumado y secado al aire se atribuyeron como factores de riesgo para cáncer. Sin embargo, a menudo el hecho se desechó ya que las mismas sustancias también se producen en concentraciones comparables durante maneras análogas de preparación de carne de ave de corral/pescado. Por consiguiente, esto no apoya la suposición de que estas sustancias químicas desempeñen una función exclusiva con respecto al desarrollo del cáncer de colon. Como, además, los análisis epidemiológicos actuales sugieren que el vacuno es el factor de riesgo principal, se ha postulado que un factor específico de especie adicional, supuestamente infeccioso, contribuye a activar este tipo de cáncer (zur Hausen, 2012). Los resultados de la correlación de los análisis de la propagación global de especies bovinas domesticadas con la incidencia global de cáncer de colon parecen sugerir que el consumo de carne de especies bovinas procedentes de ganado bovino de Europa/Asia (Bos taurus), pero no de las razas cebú, búfalo de agua o yak podrían ser de importancia como factor de riesgo principal (zur Hausen, 2015)

Por tanto, el problema técnico subyacente de la presente invención es identificar secuencias de nucleótidos específicas que pudieran asociarse con enfermedades tales como cáncer y enfermedades del SNC y, por tanto, proporcionar un medio para diagnóstico y tratamiento.

Breve descripción de la presente invención

La solución a dicho problema técnico se consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las realizaciones.

Durante los experimentos que produjeron la presente invención, se cribaron sueros de ganado bovino en busca de agentes infecciosos, partiendo de la suposición de que la presencia en suero también es indicativa de la presencia de estos agentes en carne "roja". Se cribaron sueros de vacas sanas y pudieron aislarse nuevos componentes de ácido nucleico víricos. Las secuencias de ADN y los marcos abiertos de lectura de varios de estos componentes mostraron una relación reconocible con dos secuencias que ya se describieron para la encefalopatía espongiforme transmisible (TSE) para enfermedades de TSE de ovejas, ganado bovino y seres humanos.

También se ha sospechado que los aislados de TSE desempeñan una función en la inducción del cáncer (Manuelidis, 2011), por tanto, es razonable asumir que las secuencias víricas descritas podrían estar asociadas con el desarrollo de enfermedades como cáncer, específicamente cáncer de colon y de mama, pero también en enfermedad de Hodgkin y otras, y enfermedades del SNC (esclerosis múltiple (EM), esclerosis lateral amiotrófica, encefalopatías espongiformes transmisibles/enfermedades ligadas a priones, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer).

Breve descripción de los dibujos

Abreviaturas para las figuras 1-4: Rep = proteína de replicación; PC =proteína de la cápside

CMI: aislado de leche de ganado bovino

HCBI: aislado de sangre de ganado bovino sano

MSCI: aislado cerebral con EM

MSSI: aislado de suero con EM

Sphinx: infección oculta progresiva lenta de latencia variable (X)

Figura 1:

Grupo 1 - Aislados de suero bovino, leche bovina y muestras cerebrales de esclerosis múltiple (EM) (después de la muerte), todos relacionados con Sphinx1.76

(a) HCBI6.252 (2522 pb) (Aislado de sangre de ganado bovino sano; idéntico a CMI1.252 (Aislado de leche de vaca)).

(b) HCBI6.159 (1591 pb): Una eliminación en HCBI6.252 aparentemente producía HCBI6.159, ambos se rescataban independientemente del suero bovino usando cebador consecutivo, es decir, moléculas de ADN circulares y no un artefacto. Esto podría indicar que estos organismos infecciosos tienen 2 formas, una molécula grande y una pequeña relacionadas o que se complementan entre sí

(c) MSBI1.176 (Aislado cerebral de esclerosis múltiple) (1766 pb), un 98 % idéntico a Sphinx1.76

(d) MSBI2.176 (1766 pb), aislado de la misma muestra cerebral de EM que MSB1.176

(e) CMI1.252 (2523 pb) (Aislado de leche de vaca; idéntico a HCBI6.252)

(f) CMI2.214 (2148 pb)

(g) CMI3.168 (1687 pb)

(h) CMI4.158 (1583 pb)

Los aislados se generaron todos usando cebadores consecutivos diseñados sobre el gen de replicación de Sphinx1.76.

Cebadores (varios aislados se aislaron dos veces aplicando ambos pares de cebadores independientemente). Nn (directo GGATTAATGCCAATGATCC), Xn (inverso CTTT G CCTGTTT CTCT CG) y/o No (directo GAGGACGAATTAATATTACAAGTC), Xo (inverso GTTCTCGTTTTCTTGGTAA)

Figura 2:

Grupo 2: Aislado HCBI7.228 (2280 pb) (Aislado de sangre de ganado bovino sano) relacionado con Sphinx2.36 Esta muestra se generó por PCR a partir de suero bovino usando cebadores consecutivos

Cebadores: Nd (directo CAGATTGCAAAGCCTGTAATTCAT), Xd (inverso CTAAGGCAGATCAACACAGGGATA) Figura 3:

Grupo 3: Aislados de suero bovino y suero de esclerosis múltiple y muestras cerebrales de EM (después de la muerte), relacionados de forma distante con virus de ADNmc conocidos

Secuencias de nucleótido de (a) HCBI8.215 (2152 pb) y (b) HCBI9.212 (2121 pb) (Aislado de sangre de ganado bovino sano) así como (c) MSSI2.225 (2259 pb) (Aislado de suero de esclerosis múltiple). También se aisló una secuencia idéntica (MSBI3.224) a MSSI2.225 de una muestra cerebral de EM.

Estos aislados HCBI se generaron de la siguiente manera:

Las muestras de suero se sometieron a ultracentrifugación en centrifugación con gradiente de Optiprep. El gradiente se fraccionó, se extrajo el ADN de las fracciones y se sometió a amplificación por círculo rodante. Los productos se digirieron con las enzimas BamHI o EcoRI. Los productos se clonaron y se secuenciaron. Se obtuvieron genomas completos por amplificación de muestras de ADN originales con cebadores consecutivos diseñados sobre los clones de gradiente respectivos. Los genomas completos se secuenciaron por completo.

El aislado MSSI (así como el clon MSBI3.224 del cerebro de EM) se obtuvo después de amplificación por círculo rodante del ADN extraído de suero de EM y cerebro de EM, digestión con enzimas de restricción, clonación del producto y posterior secuenciación. El genoma completo se obtuvo por amplificación con cebadores consecutivos diseñados sobre el clon original. El genoma completo se secuenció por completo.

Figura 4:

Grupo 4: relacionado de forma distante con el plásmido de Psychrobacter spp.: Secuencia de nucleótidos de MSSI1.162 y supuestos marcos abiertos de lectura

El asilado de suero de EM MSSI1.162 (grupo 4) se generó por amplificación por círculo rodante de una muestra de suero de EM múltiple. El producto se digirió con la enzima de restricción HindIII, se clonó y se secuenció.

Figura 5:

Organización genómica de 4 grupos de aislados

Los aislados se agrupan de acuerdo con su similitud de secuencia respecto al genoma Sphinx1.76 (grupo 1), Sphinx2.36 (grupo 2), gemicircularvirus de tipo micovirus (grupo 3) y plásmido de Psychrobacter spp. (grupo 4). (A) grupo 1

(^b ) grupos 2, 3 y 4

Figura 6:

Alineamiento de un gen de replicación/región de repetición de tipo iterón entre 8 aislados y Sphinx1.76

Figura 7:

Resumen esquemático de infección latente de diferentes tipos de células cerebrales con genomas de tipo herpes y factor BMF

Figura 8:

Reactivación espontánea del ADN de herpes en una célula infectada simultáneamente por ADN de herpes y BMF Amplificación de BMF e inhibición de la replicación del ADN de herpes.

Figura 9:

Resumen esquemático del reconocimiento de antígenos exógenos por el sistema inmunitario, respuesta de linfocitos T Figura 10:

Células inflamatorias mononucleares que rodean una pequeña vena en una lesión inicial

Linfocitos, monocitos, células plasmáticas y macrófagos ocasionales.

Figura 11:

El avance de la edad de la lesión (placa) a la izquierda con materia blanca normal a la derecha

Hay macrófagos presentes en la lesión (flechas) y en la interfase.

Figura 12:

Resumen esquemático del concepto de patogenia para esclerosis múltiple

Se usa EBV como ejemplo para la función de virus de tipo herpes.

Figura 13:

Esquema provisional de la patogenia de EM

Descripción detallada de la presente invención

En la presente solicitud, se presenta un nuevo concepto para la patogenia de esclerosis múltiple y cáncer: interacción de un virus de amplificación y el ADN amplificado de un factor de leche (o suero) bovino (BMF)

Introducción

La incidencia de esclerosis múltiple (EM) aumentó en varias partes del mundo (revisado en Kurtzke, 2000, Alcalde-Cabero et al., 2013). Este aumento se ha atribuido principalmente a factores ambientales. Los migrantes de zonas de alto riesgo a zonas de menor riesgo retienen el riesgo de EM de su propio lugar de nacimiento únicamente si tienen al menos 15 años en el momento de migrar, que frecuentemente se interpreta debido a una infección adquirida durante la primera infancia (revisado en Kurtzke, 2000). La agrupación de casos y la epidemiología geográfica también se ha analizado ampliamente: Se apreció una incidencia creciente de EM en mujeres ligada a la urbanización (Kotzamani et al., 2012).

La desmielinización es un rasgo característico de las lesiones de EM. Se encontraron cuatro patrones fundamentalmente diferentes de desmielinización, definidos basándose en la proteína mielina perdida, la ubicación y la extensión de placas, los patrones de destrucción de oligodendrocitos y la evidencia inmunopatológica de la activación del complemento (Lucchinetti et al., 2000, Metz et al., 2014). En un punto temporal dado de la enfermedad, los patrones de desmielinización eran heterogéneos entre los pacientes; pero eran homogéneos dentro de múltiples lesiones activas del mismo paciente, lo que apunta potencialmente a diferentes factores contribuyentes.

Dos de los factores de riesgo parece que merecen especial atención: los resultados relativamente coherentes que apuntan a una posible función de diferentes virus predominantemente del grupo de herpes y el consumo de leche de vaca fresca, potencialmente incluyendo otros productos lácteos (véase a continuación). Además, la deficiencia de vitamina D desempeña una función como factor de riesgo.

- Factores de riesgo víricos

Aparentemente todos los tipos de virus del herpes comparten dos propiedades que parecen ser relevantes para el posterior análisis: Durante su persistencia en una fase latente, puede producirse reactivación espontánea, en parte regulada por funciones génicas específicas, parcialmente también por mecanismos epigenéticos (revisado en Nicoll et al., 2012, Grinde, 2013). La reactivación también puede activarse por interacción con citocinas extracelulares, tales como el factor de crecimiento transformante p.

Se ha observado inducción espontánea de un ciclo lítico para casi todos los tipos de virus de herpes patógenos humanos. Los altos títulos de anticuerpo contra proteínas estructurales del virus de Epstein-Barr en linfoma de Burkitt positivo a EBV y cánceres nasofaríngeos (revisado en Henle, W. y Henle, G., 1977) puede servir aquí como un ejemplo. Las reactivaciones de virus de herpes humano de tipo 6, virus de la varicela-zóster, virus del herpes simple y otros no son eventos infrecuentes y pueden afectar a varios tipos celulares diferentes (Hu Knox et al., 2000).

Una segunda propiedad notable de infección por virus del herpes representa la amplificación de diversos genomas víricos de ADN pequeño bicatenario o monocatenario tras la infección de células que contienen dichos ADN en un estado latente. Esto se ha apreciado para virus de polioma humano y de mono, JC y SV40, para virus de papiloma humano y bovino, así como para virus adenoasociados monocatenarios (AAV) y anelovirus/virus TT (Schlehofer y zur Hausen, 1990, Heilbronn et al., 1993, Borkosky et al., 2012). Los virus del grupo de los herpes usados en estos estudios eran virus del herpes simple, citomegalovirus humano y virus de Epstein-Barr. El potencial de inducir amplificación de genomas de ADN víricos pequeños latentes también está compartido por los adenovirus y los virus de variolovacuna (Schlehofer y zur Hausen, 1990). El efecto auxiliar de la amplificación inducida por virus del herpes y adenovirus de los parvovirus se ha estudiado intensivamente para los virus adenoasociados. La replicación de los últimos parece depender de este efecto auxiliar, pero a su vez da lugar a una reducción de la replicación del virus del herpes o adenovirus debido a la amplificación preferente del ADN vírico pequeño (Schlehofer et al., 1983, Matz et al., 1984 , Bantel-Schaal y zur Hausen, 1988, Schmitt et al., 1989, Schlehofer y zur Hausen, 1990, Heilbronn et al., 1990a, Heilbronn et al., 1990b).

La inducción espontánea de virus del grupo del herpes y la amplificación del ADN vírico pequeño latente forma la base de la posterior postulación del mecanismo subyacente al desarrollo de EM.

- Factor de leche bovina

Varios informes indicaron una correlación entre el consumo de leche de vaca no pasteurizada y el desarrollo de EM (Murray TJ. 1976, Sepcic et al., 1993, Malosse y Perron, 1993), mientras que otros resaltaron el consumo a largo plazo de leche de vaca como factor de riesgo, en particular cuando la consumían en una fase inicial de la vida (Agranoff y Goldberg, 1974, Christensen, 1975, Warren, 1984, Butcher, 1976, 1986, Winer et al., 2001, Munger et al., 2011a).

Si existe un factor específico en la leche de vaca que aumente el riesgo de desarrollo de EM, se puede anticipar una función protectora de la lactancia a largo plazo. La lactancia a largo plazo (durante seis meses y más) de hecho se ha presentado repetidamente con un efecto protector para el desarrollo de EM (Christensen, 1975, Warren, 1984, Tarrats et al., 2002, Conradi et al., 2013). La existencia de un factor de leche de vaca tampoco excluiría una predisposición genética específica para el desarrollo de EM. Una predisposición monogenética para EM se ha presentado en una ubicación cromosómica cerca de BRCA1 (Holzmann et al., 2013).

- Deficiencia de vitamina D

Se ha implicado repetidamente una función de la de vitamina D para el inicio de EM (revisado en Ascherio et al. 2012, 2013).

Una relación convincente entre la deficiencia de vitamina D y la reactivación del virus de Epstein Barr se origina en estudios iniciales sobre la reactivación de EBV mediante el factor de crecimiento transformante beta (TGF-p). Un factor sérico, purificado y marcado como factor inductor del virus de Epstein-Barr (EIF) (Bauer et al., 1982) demostró ser idéntico a la molécula TGF-p descrita posteriormente (Frolik et al., 1983, Bauer et al., 1991). TGF-p, a su vez, está regulada negativamente por receptores de vitamina D activados (Isik et al., 2012, Itoet al., 2013, Zerr et al., 2014). Esto podría explicar muy bien la aparición preferente relacionada con la estación de EM y de las exacerbaciones.

La relación entre la baja concentración de vitamina D y la reactivación de EBV se respalda adicionalmente por estudios que describen una correlación entre las bajas concentraciones de vitamina D y la inmunorreactividad elevada contra el virus de Epstein-Barr antes de la manifestación clínica de esclerosis múltiple (Munger et al., 2011b, Decard et al., 2012) y una tasa mayor de excreción de EBV en pacientes con EM positivos a EBV-en comparación con controles sanos positivos a EBV(Yea et al., 2013).

Por tanto, se han implicado al menos dos factores como contribuyentes etiológicos potenciales para ambas enfermedades del SNC (por ejemplo, EM) y cáncer (por ejemplo, cáncer de colon y de mama): la deficiencia de vitamina D y la reactivación de diversos virus del grupo del herpes, principalmente virus de Epstein-Barr (EBV), virus del herpes humano de tipo 6 y virus de la varicela-zóster. De acuerdo con la presente invención, la identificación de varios tipos novedosos de ADN monocatenarios circulares pequeños, supuestamente de origen vírico, de sueros de ganado bovino de la presente invención y productos lácteos disponibles en el mercado, muestra un concepto unificador. Los autores de la invención han demostrado en la presente invención que la coinfección de células con virus del grupo del herpes y virus de ADN monocatenario o bicatenario provoca una amplificación sustancial del ADN vírico pequeño con inhibición parcial del virus del herpes. Algunas de las moléculas identificadas en suero y leche de ganado bovino lechero están relacionadas de forma distante con el ADN presentado en lesiones cerebrales ligadas a priones y se han encontrado en dos lesiones de autopsia de pacientes con esclerosis múltiple. La amplificación de estas moléculas de ADN bicatenario por reactivación de un genoma de virus de herpes colatentemente persistente podría provocar la amplificación y la producción de una respuesta inmunitaria local que produce destrucción de las células cerebrales afectadas. Este modelo en parte podría explicar el gradiente de incidencia de norte a sur de la esclerosis múltiple, que se cree que está ligado a la deficiencia de vitamina D y la reactivación del virus del herpes (véase la fig. 12 y 13).

Además, los genomas de longitud completa de los aislados de cerebros y sueros con EM se aislaron y recircularizaron antes de la transfección en la línea celular humana 293TT. Se recogieron células transfectadas en el día 3 y el ARN total se extrajo usando el kit miRNA Easy (Qiagen). Las muestras se purificaron adicionalmente (digestión con DNasa, eliminación del ribosoma) y se sometieron a secuenciación de ARN de alto rendimiento. Se han obtenido transcritos de ARN para MSBI1.176, MSBI2.176 (Grupo 1), MSSI2.225 (Grupo 3) y MSSI1.162 (Grupo 4). Los transcritos de ARN muestran claramente que los aislados se replican en células humanas.

Los autores de la invención consideran la deficiencia de vitamina D y la reactivación del virus del herpes como factores de riesgo también para cáncer de mama y de colon. La reactivación de infecciones latentes dobles dentro de la misma célula, resumido anteriormente para la patogenia de esclerosis múltiple, por lo tanto, también podría desempeñar una función importante particular en la etiología de estos cánceres.

Por tanto, los autores de la invención consideran que la esclerosis múltiple (EM) y también las otras enfermedades mencionadas a continuación son el resultado de

• Infecciones latentes de la misma célula con dos agentes infecciosos diferentes, uno de ellos muy probablemente un virus de tipo herpes (en particular, EBV, HHV-6, VZV, pero también HSV, HHV-7), el otro uno adquirido por consumo de leche bovina (factor de leche bovina, BMF) como el primer evento. Cada uno de ellos infecta de forma latente células individuales, pero ocasionalmente genomas de ambos agentes existen dentro de la misma célula.

• Reactivación del virus de tipo herpes muy frecuentemente, pero no únicamente, virus de Epstein Barr (EBV) a un ciclo lítico como segunda condición previa. Para EBV esto está probablemente ligado a niveles aumentados de factor de crecimiento transformante p (TGF p) que está regulado negativamente por receptores de vitamina D activados;

• Como tercer evento, amplificación de BMF, que provoca supresión parcial de síntesis de ADN de tipo herpes y formación de partículas de BMF o propagación de su ácido nucleico a las células adyacentes mediante interconexiones neuronales;

• Esto está seguido por una infección de las células adyacentes con expresión de la proteína BMF;

• Finalmente, la respuesta de linfocitos T contra BMF da lugar a la destrucción de las células afectadas y en el caso de EM a formación de placas. Esto apoya la observación clínica de la aparición focal de lesiones, habitualmente partiendo de una vena central y la respuesta inmunitaria localizada intensiva en lesiones iniciales.

Las transmisiones de agentes presentes en la leche o en productos lácteos puede dar lugar a infecciones latentes en células de cerebro humano seguidas de amplificación de estos agentes en caso de colatencia e inducción espontánea de un ADN de virus del herpes o ADN de tipo virus del herpes. Se describen agentes candidatos de BMF potenciales en los ejemplos 2-5 y las figuras adjuntas.

La presencia de ADN supuestamente monocatenario circular relacionado con secuencias Sphinx, familias de anelovirus, circovirus y gemicircularvirus, así como especies de Psychrobacter en sueros de ganado bovino (véanse los ejemplos 2-5), en muestras de leche disponibles en el mercado, así como en lesiones de EM floridas y suero de EM permite el desarrollo de un concepto para la patogenia de EM. Integra las observaciones de la implicación de los virus de tipo herpes, muy prominentemente de EBV, de su propiedad de amplificar virus de ADN bicatenario y monocatenario pequeño, de factores de leche de vaca víricos, de deficiencia de vitamina D, la propiedad inductora de EBV de TGFp y la dependencia parcial de la estación de la aparición de EM y de la exacerbación en la evolución de la enfermedad. Este concepto se resume esquemáticamente en las figuras 7-13.

Una infección latente doble inicial de las mismas células o células flanqueantes cercanas por un genoma de virus del herpes y el BMF postulado, seguida de una activación para la reactivación del virus del herpes y la posterior amplificación preferente de ADN monocatenario se definen como el evento principal. En el caso de infección latente por EBV, la deficiencia de vitamina D con la posterior regulación por aumento de TNF-p como factor inductor de EBV podría ser el activador importante para la regulación por aumento. Probablemente la infección fallida de células adyacentes con expresión de antígenos víricos provoca una respuesta de linfocitos T activa y la destrucción de las células afectadas. La estacionalidad frecuentemente descrita de la aparición de EM y de nuevas rondas de exacerbaciones de EM, el gradiente de norte a sur repetidamente presentado de la incidencia de EM podría reflejar el grado de exposición a luz solar, que correlaciona negativamente con los niveles de vitamina D con la concentración de TGFp y la reactivación de EBV.

Por tanto, los autores de la invención prevén la presencia de diferentes secuencias de BMF también en células cerebrales humanas normales susceptibles en una forma latente. La heterogeneidad notable de los aislados de BMF también encuentra su reflejo en variaciones de características patológicas de EM en seres humanos (Lucchinetti et al., 2000, Metz et al., 2014). No sería demasiado sorprendente si finalmente se identificaran tipos de "alto" y "bajo" riesgo, en una determinada analogía a la patogenia del virus del papiloma humano (zur Hausen, 1985). La mayoría de esos portadores no desarrollará EM, ya que lo último debe requerir coinfección latente de una célula positiva a BMF con un virus de tipo herpes y la inducción espontánea del último. Esto debe ser un evento infrecuente, que aumenta, sin embargo, en condiciones que provocan frecuentes reactivaciones de virus del herpes.

Como punto final, debe ser de interés aplicar también este concepto a otras enfermedades supuestamente autoinmunitarias y determinados cánceres que se producen a una frecuencia aumentada en condiciones de deficiencia de vitamina D. En cuanto a lo que se refiere a los cánceres, esto representa específicamente cáncer de colon y de mama, y posiblemente cáncer de ovario, de próstata, pancreático y pulmonar.

El riesgo de diabetes mellitus insulinodependiente se ha ligado repetidamente al consumo de leche de vaca y la deficiencia de vitamina D (revisado en Scott, 1990, en Grant, 2006, en Hypponen et al, 2010). El último sistema parece particularmente cercano a la situación de EM.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a ácido nucleico de CMI, que comprende:

(a) una secuencia de nucleótidos representada en la Figura 1(e) [SEQ ID NO: 46], Figura 1(f) [SEQ ID NO: 57], Figura 1(g) [SEQ ID NO: 70] o Figura 1(h) [SEQ ID NO: 90]; (b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 99 % de identidad con una secuencia de nucleótidos de (a); (c) una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de (a) o (b); o (d) una secuencia de nucleótidos que es redundante como resultado de la degeneración del código genético en comparación con cualquiera de las secuencias de nucleótidos proporcionadas anteriormente.

La expresión "ácido polinucleico" se refiere a una secuencia de ácido nucleico monocatenaria o bicatenaria. Un ácido polinucleico puede consistir en desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, análogos nucleotídicos o nucleótidos modificados o puede haberse adaptado con fines de diagnóstico o terapéuticos. Un ácido polinucleico también puede comprender un clon de ADNc bicatenario que puede usarse, por ejemplo, con fines de clonación.

Los ácidos polinucleicos de CMI de la invención pueden prepararse de acuerdo con métodos rutinarios bien conocidos, por ejemplo, por (a) aislamiento del ADN o ARN completo de una muestra, (b) detección de la secuencia de CMI por hibridación o PCR y (c) clonación de la secuencia de CMI en un vector.

Las secuencias de ácido polinucleico de acuerdo con la presente invención pueden caracterizarse y aislarse de acuerdo con cualquiera de las técnicas conocidas en la técnica, tales como amplificación mediante cebadores específicos de secuencia, hibridación con sondas específicas de secuencia en condiciones más o menos rigurosas, determinación de la secuencia de la información genética de HCBI, MSBI, MSSI o CMI, etc.

La presente invención también proporciona secuencias de ácido polinucleico que son redundantes como resultado de la degeneración del código genético en comparación con cualquiera de las secuencias de nucleótidos proporcionadas anteriormente. Estas secuencias de ácido polinucleico variantes, por tanto, codificarán la misma secuencia de aminoácidos que los ácidos polinucleicos de los que derivan.

Los ácidos polinucleicos de CMI de la invención podrían estar presentes como episoma extracromosómico, podrían integrarse en el genoma del hospedador y/o podrían ligarse a un ADN de la célula hospedadora.

La presente invención también se refiere a un cebador oligonucleotídico que comprende o consiste en parte de un ácido polinucleico como se define anteriormente, pudiendo dicho cebador actuar como cebador para secuenciar específicamente o amplificar específicamente el ácido polinucleico de CMI de la invención.

El término "cebador" se refiere a una secuencia oligonucleotídica de ADN monocatenario que puede actuar como punto de inicio para la síntesis de un producto de prolongación de cebador que es complementario a la hebra de ácido nucleico a copiar. La longitud y la secuencia del cebador deben ser tales que permitan cebar la síntesis de los productos de prolongación. Preferiblemente, el cebador es de aproximadamente 5-50 nucleótidos. La longitud y secuencia específicas dependerán de la complejidad de las dianas de ADN y ARN requeridas, así como de las condiciones del uso del cebador tales como la temperatura y fuerza iónica.

El hecho de que los cebadores de amplificación no tengan que coincidir exactamente con una secuencia de molde correspondiente para garantizar la amplificación apropiada está ampliamente documentado en la bibliografía. El método de amplificación usado puede ser, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA), sistema de amplificación basado en transcripción (TAS), amplificación por desplazamiento de hebra (SDA) o amplificación mediante replicasa Qb o cualquier otro método adecuado para amplificar moléculas de ácido nucleico usando prolongación de cebador. Durante la amplificación, los productos amplificados pueden marcarse usando cebadores marcados o incorporando nucleótidos marcados.

Los marcadores pueden ser isotópicos (32P, 35S, etc.) o no isotópicos (biotina, digoxigenina, etc.). La reacción de amplificación se repite ente 20 y 70 veces, ventajosamente entre 25 y 45 veces. Cualquiera de una diversidad de reacciones de secuenciación conocidas en la técnica puede usarse para secuenciar directamente la información genética vírica y determinar el ORF traduciendo la secuencia de la muestra en la secuencia de aminoácidos correspondiente. Las reacciones de secuenciación ejemplares incluyen las basadas en técnicas desarrolladas por Sanger o Maxam y Gilbert. También se contempla que puede utilizarse una diversidad de procedimientos de secuenciación automatizados cuando se realizan los presente ensayos, incluyendo secuenciación por espectrometría de masas (véase, por ejemplo: publicación PCT ^w O 94/16101). Será evidente para un experto en la materia, por ejemplo, que la aparición de únicamente dos o tres bases nucleotídicas tiene que determinarse en la reacción de secuenciación.

Preferiblemente, estos cebadores son de aproximadamente 5 a 50 nucleótidos de longitud, más preferiblemente de aproximadamente 10 a 25 nucleotídicos. Muy preferiblemente son cebadores que tienen una longitud de al menos 13 bases.

La presente invención también se refiere a una sonda oligonucleotídica que comprende o consiste en parte de un ácido polinucleico de CMI como se define anteriormente, pudiendo dicha sonda actuar como sonda de hibridación para la detección específica de un ácido polinucleico de HCBI, MSBI o CMI de acuerdo con la invención.

La sonda puede marcarse o adherirse a un soporte sólido. El término "sonda" se refiere a oligonucleótidos específicos de secuencia monocatenarios que tienen una secuencia que es complementaria a la secuencia diana de un ácido polinucleico de HCBI, MSBI, MSSI o CMI a detectar.

Preferiblemente, estas sondas son de aproximadamente 5 a 50 nucleótidos de longitud, más preferiblemente de aproximadamente 10 a 25 nucleotídicos. Muy preferiblemente son sondas que tienen una longitud de al menos 13 bases.

La expresión "soporte sólido" puede referirse a cualquier sustrato al que pueda acoplarse una sonda oligonucleotídica, con la condición de que retenga sus características de hibridación y con la condición de que el nivel de fondo de hibridación permanezca bajo. Habitualmente, el sustrato sólido será una placa de microvaloración, una membrana (por ejemplo, nailon o nitrocelulosa) o una microesfera (perla). Antes de su aplicación a la membrana o su fijación puede ser conveniente modificar la sonda de ácido nucleico para facilitar la fijación o mejorar la eficacia de hibridación. Dichas modificaciones pueden englobar la adición de colas homopoliméricas, acoplamiento con diferentes grupos reactivos tales como grupos alifáticos, grupos NH² , grupos SH, grupos carboxílicos o acoplamiento con biotina o haptenos. Los oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención, usados como cebadores o sondas también pueden contener o consistir en análogos nucleotídicos tales fosforotioatos, alquilfosforiatos o ácidos peptidonucleicos o pueden contener agentes intercalantes. Estas modificaciones necesitarán adaptaciones con respecto a las condiciones en las que debe usarse el oligonucleótido para obtener la especificidad y sensibilidad requeridas. Sin embargo, los resultados finales serán esencialmente los mismos que los obtenidos con los oligonucleótidos no modificados.

La introducción de estas modificaciones puede ser ventajosa para influir positivamente en las características tales como cinética de hibridación, capacidad reversible de la formación de híbridos, estabilidad biológica de las moléculas oligonucleotídicas, etc.

La presente invención también se refiere a un vector de expresión recombinante que comprende un ácido polinucleico de CMI de la invención como se define anteriormente unido operativamente a elementos de control de la transcripción y la traducción procariotas, eucariotas o víricos, así como células hospedadoras que contienen dicho vector.

El término "vector" puede comprender un plásmido, un cósmido, un cromosoma artificial, un fago o un virus o un animal no humano transgénico. Puede ser particularmente útil para el desarrollo de vacunas

moléculas recombinantes de CMI, vectores BCG o adenovíricos, así como virus recombinantes de viruela aviar.

La expresión "expresión recombinante" usada dentro del contexto de la presente invención se refiere al hecho de que los polipéptidos de la presente invención se producen mediante métodos de expresión recombinante que es en procariotas, o eucariotas inferiores o superiores como se analiza en detalle a continuación.

La expresión "célula hospedadora" se refiere a células que pueden usarse o se han usado como destinatarios de un vector recombinante u otro polinucleótido de transferencia, e incluyen la descendencia de la célula original que se ha transfectado.

Se entiende que la descendencia de una única célula precursora puede no ser completamente idéntica necesariamente en la morfología o en el complemento genómico o de ADN total que el precursor original, debido a mutación o recombinación natural, accidental o deliberada. La expresión "eucariota inferior" se refiere a células hospedadoras tales como levaduras, hongos y similares. Los eucariotas inferiores en general son (pero no necesariamente) unicelulares. Los eucariotas inferiores preferidos son levaduras, particularmente especies de Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluiveromyces, Pichia (por ejemplo, Pichia pastoris), Hansenula (por ejemplo, Hansenula polymorph), Schwaniomyces, Schizosaccharomyces, Yarowia, Zygosaccharomyces y similares. Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbergensis y K. lactis son los hospedadores de levadura más habitualmente usados, y son hospedadores fúngicos convenientes.

La expresión "eucariota superior" se refiere a células hospedadoras derivadas de animales superiores, tales como mamíferos, reptiles, insectos y similares. Las células hospedadoras eucariotas superiores actualmente preferidas se obtienen de hámster chino (por ejemplo, CHO), mono (por ejemplo, células COS y Vero), riñón de cría de hámster (BHK), riñón de cerdo (PK15), células 13 de riñón de conejo (RK13), la línea celular de osteosarcoma humano 143 B, la línea celular humana HeLa y las líneas celulares de hepatoma humano como Hep G2, la línea celular 293TT (Buck et al., 2004) y líneas celulares de insecto (por ejemplo, Spodoptera frugiperda). Las células hospedadoras pueden proporcionarse en cultivos en suspensión o en matraz, cultivos tisulares, cultivos orgánicos y similares. Como alternativa las células hospedadoras también pueden ser animales no humanos transgénicos.

El término "procariotas" se refiere a hospedadores tales como E. coli, Lactobacillus, Lactococcus, Salmonella, Streptococcus, Bacillus subtilis o Streptomyces. También estos hospedadores se contemplan dentro de la presente invención.

El segmento del ADN de CMI que codifica la secuencia deseada insertada en la secuencia del vector puede adherirse a una secuencia señal. Dicha secuencia señal puede ser la de una fuente de CMI, pero las construcciones particularmente preferidas de acuerdo con la presente invención contienen secuencias señal que aparecen en el genoma de CMI antes de sus respectivos puntos de inicio de las proteínas.

Los eucariotas superiores pueden transformarse con vectores, o pueden infectarse con un virus recombinante, por ejemplo, un virus de la variolovacuna recombinante. Las técnicas y vectores para la inserción de ADN exógeno en virus de la variolovacuna son bien conocidos en la técnica, y utilizan, por ejemplo, recombinación homóloga. Una amplia diversidad de secuencias promotoras víricas, posiblemente secuencias terminadoras y secuencias de adición de poli(A), posiblemente secuencias potenciadoras y posiblemente secuencias de amplificación, todas necesarias para la expresión en mamífero están disponibles en la técnica. El virus de la variolovacuna es particularmente preferido ya que el virus de la variolovacuna detiene la expresión de las proteínas de la célula hospedadora. Para la vacunación de seres humanos, el virus de la viruela aviar y el virus modificado de Ankara (AMV) son vectores particularmente útiles.

También se conocen vectores de transferencia de expresión de insectos derivados del baculovirus, virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV), que es un vector de expresión vírico independiente de auxiliar. Los vectores de expresión derivados de este sistema habitualmente usan el promotor del gen de la polihedrina vírica fuerte para dirigir la expresión de genes heterólogos. Diferentes vectores, así como métodos para la introducción de ADN heterólogo en el sitio deseado del baculovirus están disponible para los expertos en la materia para la expresión de baculovirus. También se conocen en la técnica diferentes señales para la modificación postraduccional reconocida por células de insecto.

La presente invención también se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido polinucleico de CMI como se define anteriormente, o una parte o un análogo del mismo que es sustancialmente similar y biológicamente equivalente. El término "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto. Por tanto, péptidos, oligopéptidos y proteínas se incluyen dentro de la definición de polipéptido. Este término tampoco se refiere a o excluye las modificaciones tras la expresión del polipéptido, por ejemplo, glucosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, ácido peptidonucleico (APN), etc.), polipéptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto de origen natural como de origen no natural.

Los polipéptidos de la invención pueden prepararse por síntesis química clásica. La síntesis puede realizarse en solución homogénea o en fase sólida. Los polipéptidos de acuerdo con esta invención también pueden prepararse mediante técnicas de ADN recombinante. La presente invención también se refiere a un método para la producción de un polipéptido recombinante como se define anteriormente, que comprende: (a) transformación de un hospedador celular apropiado con un vector recombinante, en que un ácido polinucleico o una parte del mismo como se define anteriormente se ha insertado bajo el control de los elementos reguladores apropiados, (b) cultivo de dicho hospedador celular transformado en condiciones que posibilitan la expresión de dicho inserto y (c) recolección de dicho polipéptido.

La presente invención también se refiere a un anticuerpo generado tras la inmunización con al menos un polipéptido como se define anteriormente, siendo dicho polipéptido específicamente reactivo con cualquiera de dichos polipéptidos, y siendo dicho anticuerpo preferiblemente un anticuerpo monoclonal. El término "anticuerpo", preferiblemente, se refiere a anticuerpos que consisten esencialmente en anticuerpo monoclonales combinados con diferentes especificidades epitópicas, así como distintas preparaciones de anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de un antígeno que contiene, por ejemplo, un polipéptido codificado por un ácido polinucleico de CMI de la invención o un fragmento del mismo por métodos bien conocidos por los expertos en la materia. Como se usa en este documento, se entiende que el término "anticuerpo" (Ab) o "anticuerpo monoclonal" (Mab) incluye moléculas intactas, así como fragmentos de anticuerpo (tales como, por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab')2) que pueden unirse específicamente a la proteína. Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se eliminan más rápidamente de la circulación y pueden tener menos unión a tejido no específico que un anticuerpo intacto. Por tanto, estos fragmentos son preferidos, así como los productos de un FAB u otra colección de expresión de inmunoglobulina. Además, los anticuerpos útiles para los fines de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos, monocatenarios y humanizados.

Preferiblemente, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo porta un marcador detectable. El anticuerpo/fragmento puede marcarse de forma detectable directa o indirectamente, por ejemplo, con un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante de metales o una enzima. Los expertos en la materia conocerán otros marcadores adecuados para la unión al anticuerpo, o podrán averiguarlos, usando experimentación rutinaria.

La presente invención también se refiere a un método para la detección de ácidos polinucleicos de CMI de acuerdo con la invención, presente en una muestra biológica, que comprende: (a) extraer opcionalmente ácido polinucleico de muestra, (b) amplificar el ácido polinucleico como se describe anteriormente con al menos un cebador como se divulga anteriormente, opcionalmente un cebador marcado y (c) detectar los ácidos polinucleicos amplificados.

La expresión "ácido polinucleico" también puede mencionarse como hebra de analito y corresponde a una molécula de ácido polinucleico monocatenaria o bicatenaria.

El término "marcado" se refiere al uso de ácidos nucleicos marcados. Esto puede incluir el uso de nucleótidos marcados incorporados durante la etapa de la polimerasa de la amplificación o cebadores marcados, o mediante cualquier otro método conocido por los expertos en la materia.

La presente invención también se refiere a un método para la detección de ácidos polinucleicos de CMI de acuerdo con la invención, presente en una muestra biológica, que comprende: (a) extraer opcionalmente ácido polinucleico de muestra, (b) hibridar el ácido polinucleico como se describe anteriormente con al menos una sonda como se define anteriormente y (c) detectar los ácidos polinucleicos hibridados.

Las condiciones de hibridación y lavado tienen que entenderse como rigurosas y en general son conocidas en la técnica. Sin embargo, de acuerdo con la solución de hibridación (SSC, SSPE, etc.), estas sondas deben hibridar a su temperatura apropiada para obtener suficiente especificidad.

De acuerdo con la solución de hibridación (SSC, SSPE, etc.), estas sondas deben hibridar de forma rigurosa a su temperatura apropiada para obtener suficiente especificidad. Sin embargo, modificando ligeramente las sondas de ADN, añadiendo a eliminando uno o unos pocos nucleótidos en sus extremos (3' o 5') o sustituyendo algunos nucleótidos no esenciales (es decir, nucleótidos no esenciales para discriminar entre tipos) por otros (incluyendo nucleótidos modificados o inosina) puede causarse que estas sondas o variantes de las mismas hibriden específicamente a las mismas condiciones de hibridación (es decir, la misma temperatura y la misma solución de hibridación). También cambiar la cantidad (concentración) de la sonda usada puede ser beneficioso para obtener resultados de hibridación más específicos. Debe apreciarse en este contexto, que sondas de la misma longitud, independientemente de su contenido de GC, hibridarán específicamente a aproximadamente la misma temperatura en soluciones de TMACI.

Los métodos de ensayo adecuados para los fines de la presente invención para detectar híbridos formados entre las sondas oligonucleotídicas y las secuencias de ácido polinucleico de HCBI, MSBI, MSSI o CMI en una muestra pueden comprender cualquiera de los formatos de ensayo conocidos en la técnica, tal como el formato de transferencia puntual convencional, hibridación en emparedado o hibridación inversa. Por ejemplo, la detección puede conseguirse usando un formato de transferencia puntual, uniéndose la muestra amplificada no marcada a una membrana, incorporándose a la membrana al menos una sonda marcada en condiciones adecuadas de hibridación y lavado y controlándose la presencia de sonda unida.

Un método alternativo y preferido es un formato de transferencia puntual "inverso", en que la secuencia amplificada contiene un marcador. En este formato, las sondas oligonucleotídicas no marcadas se unen a un soporte sólido y se exponen a la muestra marcada en condiciones apropiadas rigurosas de hibridación y posterior lavado. Debe entenderse que también puede usarse cualquier otro método de ensayo que dependa de la formación de un híbrido entre los ácidos polinucleicos de la muestra y las sondas oligonucleotídicas de acuerdo con la presente invención.

La presente invención también se refiere a un método para detectar un polipéptido codificado por un ácido polinucleico de CMI de la presente invención o un anticuerpo contra dicho polipéptido presente en una muestra biológica, que comprende: (a) poner en contacto la muestra biológica para la presencia de dicho polipéptido o anticuerpo como se define anteriormente y (b) detectar el complejo inmunológico formado entre dicho anticuerpo y dicho polipéptido.

Los métodos de inmunoensayo de acuerdo con la presente de invención pueden utilizar antígenos de diferentes dominios de las secuencias polipeptídicas nuevas y únicas de la presente invención. Pertenece al alcance de la invención el uso, por ejemplo, de antígenos oligoméricos individuales o específicos, antígenos diméricos, así como combinaciones de antígenos oligoméricos individuales o específicos. Los antígenos HCBI, MSBI, MSSI o CMI de la presente invención pueden emplearse en casi cualquier formato de ensayo que emplee un antígeno conocido para detectar anticuerpos o respuestas inmunitarias mediadas por células. Por tanto, la presente invención también engloba la detección de respuestas inmunitarias mediadas por células contra antígenos HCBI, MSBI, MSSI oCMI y la aplicación de interferencias terapéuticas en respuestas inmunitarias mediadas por células contra antígenos HCBI, MSBI, MSSI o CMI.

Por supuesto, un formato de ensayo que desnaturalice el epítopo conformacional de CMI debe evitarse o adaptarse. Una característica común de todos estos ensayos es que el antígeno se pone en contacto con el componente corporal sospechoso de contener anticuerpos para CMI en condiciones que permitan que el antígeno se una a cualquiera de dichos anticuerpos presente en el componente. Dichas condiciones típicamente serán temperatura, pH y fuerza iónica fisiológicas usando un exceso de antígeno. La incubación del antígeno con la muestra va seguida de la detección de complejos inmunitarios compuestos del antígeno.

El diseño de los inmunoensayos está sometido a una gran variación y se conocen muchos formatos en la técnica. Los protocolos pueden, por ejemplo, usar soportes sólidos o inmunoprecipitación. La mayoría de los ensayos implican el uso de anticuerpo o polipéptido marcado; los marcadores pueden ser, por ejemplo, enzimáticos, fluorescentes, quimioluminiscentes, radioactivos o moléculas de tinte. También se conocen ensayos que amplifican las señales del complejo inmunitario; cuyos ejemplos son ensayos que utilizan biotina y avidina o estreptavidina, e inmunoensayos marcados y mediados por enzima, tales como ensayos ELISA.

El inmunoensayo puede estar en un formato heterogéneo o en uno homogéneo, y ser de un tipo convencional o competitivo. En un formato heterogéneo, el polipéptido típicamente se une a una matriz o soporte sólido para facilitar la separación de la muestra del polipéptido después de la incubación. Ejemplos de soportes sólidos que pueden usarse son microcelulosa (por ejemplo, en forma de membrana o pocillo de microvaloración), poli(cloruro de vinilo) (por ejemplo, en láminas o pocillos de microvaloración), látex de poliestireno (por ejemplo, en microesferas o placas de microvaloración, poli(fluoruro de vinilideno) (conocido como Immunolon), papel diazotizado, membranas de nailon, microesferas activadas y microesferas de proteína A. El soporte sólido que contiene los polipéptidos antigénicos típicamente se lava después de separarlo de la muestra de ensayo y antes de la detección de los anticuerpos unidos. Se conocen en la técnica tanto formatos convencionales como competitivos.

En un formato homogéneo, la muestra de ensayo se incuba con la combinación de antígenos en solución. Por ejemplo, puede ser en condiciones que precipitarán cualquier complejo de antígeno-anticuerpo que se forme. Se conocen en la técnica tanto formatos convencionales como competitivos para estos ensayos.

En un formato convencional, la cantidad de anticuerpos para HCBI, MSBI, MSSI o CMI en los complejos de anticuerpoantígeno se controla directamente. Esto puede conseguirse determinando si anticuerpos (marcados) antixenogénicos (por ejemplo, antihumanos) que reconocen un epítopo en anticuerpos para CMI se unirán debido a la formación de complejos. En un formato competitivo, la cantidad de anticuerpos para CMI en la muestra se deduce controlando el efecto competitivo sobre la unión de una cantidad conocida de anticuerpo marcado (u otro ligando competidor) en el complejo.

Los complejos formados que comprenden anticuerpo para CMI (o en el caso de ensayos competitivos, la cantidad de anticuerpo competidor), se detectan por cualquiera de varias técnicas conocidas, dependiendo del formato. Por ejemplo, pueden detectarse anticuerpos para HCBI, MSBI, MSSI o CMI no marcados en el complejo usando un conjugado de Ig antixenogénica en complejo con un marcador (por ejemplo, un marcador enzimático).

En un formato de ensayo de inmunoprecipitación o aglutinación, la reacción entre los antígenos CMI y el anticuerpo forma una red que precipita en la solución o suspensión y forma una capa visible o película de precipitado. Si no hay anticuerpo anti-CMI presente en la muestra de ensayo, no se forma precipitado visible.

Actualmente existen tres tipos específicos de ensayos de aglutinación de partículas (PA). Estos ensayos se usan para la detección de anticuerpos contra diversos antígenos cuando se recubren en un soporte. Un tipo de este ensayo es el ensayo de hemaglutinación que usa glóbulos rojos (RBC) que se sensibilizan por adsorción pasiva de antígeno (o anticuerpo) en los RBC. La adición de antígeno específico/anticuerpos presentes en el componente corporal, si lo hay, causa que los RBC recubiertos con el antígeno purificado se aglutinen.

Para eliminar las potenciales reacciones no específicas en el ensayo de hemaglutinación, pueden usarse dos vehículos artificiales en lugar de RBC en la PA. Los más comunes de estos con las partículas de látex.

La fase sólida seleccionada puede incluir microesferas poliméricas o de vidrio, nitrocelulosa, micropartículas, micropocillos de una placa de reacción, tubos de ensayo y microesferas magnéticas. El compuesto que genera señal puede incluir una enzima, un compuesto luminiscente, un cromógeno, un elemento radioactivo y un compuesto quimioluminiscente. Ejemplos de enzimas incluyen fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano rusticano y betagalactosidasa. Ejemplos de compuestos potenciadores incluyen biotina, antibiotina y avidina. Ejemplos de miembros que se unen a compuestos potenciadores incluyen biotina, antibiotina y avidina.

Los métodos anteriores son útiles para evaluar el riesgo de desarrollar enfermedades como cáncer o una enfermedad autoinmunitaria debida a los efectos perjudiciales de la presencia de una secuencia polinucleotídica HCBI, MSBI, MSSI o CMI subgenómica por sí misma o ligada a un gen o fragmento génico del hospedador particular dentro de las células del paciente y permite tomar contramedidas apropiadas.

Por tanto, la presente invención también se refiere a un oligonucleótido antisentido o ARNi específico para el ácido polinucleico de virus de CMI de la invención.

La generación de oligonucleótidos de antisentido adecuados o ARNi incluye la determinación de un sitio o sitios dentro del ácido polinucleico de CMI para que se produzca la interacción de antisentido de modo que se produzca el efecto deseado, por ejemplo, inhibición de la expresión del polipéptido. Un sitio intragénico preferido es (a) la región que engloba el codón de inicio o terminación de la traducción del marco abierto de lectura (ORF) del gen o (b) una región del ARNm que es un "bucle" o "protuberancia", es decir, no es parte de una estructura secundaria. Una vez se ha identificado uno o más sitios diana, se eligen los oligonucleótidos que son suficientemente complementarios a la diana, es decir, hibridan suficientemente bien y con suficiente especificidad, para proporcionar el efecto deseado. En el contexto de la presente invención, "hibridación" significa enlaces de hidrógeno, que pueden ser enlaces de hidrógeno de Watson-Crick, de Hoogsteen o de Hoogsteen inversos, entre las bases nucleosídicas o nucleotídicas complementarias. "Complementario" como se usa en este documento, se refiere a la capacidad de emparejamiento preciso entre dos nucleótidos. Por ejemplo, si un nucleótido en una determinada posición de un oligonucleótido puede formar enlaces de hidrógeno con un nucleótido en la misma posición de una molécula de ADN o ARN, entonces el oligonucleótido y el ADN o ARN se consideran complementarios entre sí en esa posición. El oligonucleótido y el ADN o ARN son complementarios entre sí cuando un número suficiente de posiciones correspondientes en cada molécula están ocupadas por nucleótidos que pueden formar enlaces de hidrógeno entre sí. Por tanto, "específicamente hibridable" y "complementario" son términos que se usan para indicar un grado suficiente de complementariedad o emparejamiento preciso de modo que se produzca unión estable y específica entre el oligonucleótido y la diana de ADN o ARN. Se entiende en la técnica que la secuencia de un compuesto de antisentido no tiene que ser un 100 % complementario a la de su ácido nucleico diana para que sea específicamente hibridable. Un compuesto de antisentido es específicamente hibridable cuando la unión del compuesto a la molécula de ADN o ARN diana impide la función normal del ADN o ARN diana causando una pérdida de utilidad, y hay un suficiente grado de complementariedad para evitar la unión no específica del compuesto de antisentido a una secuencia inespecífica en condiciones en que se desea unión específica, es decir, en el caso de tratamiento terapéutico.

"Oligonucleótido" (en particular en el contexto de compuestos de antisentido) se refiere a un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN) o miméticos de los mismos. Este término incluye oligonucleótidos compuestos de nucleobases de origen natural, glúcidos y enlaces internucleosídicos covalentes (cadena principal), así como oligonucleótidos que tienen partes que no son de origen natural que funcionan de forma similar. Dichos oligonucleótidos modificados o sustituidos a menudo se prefieren sobre las formas nativas a causa de propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular potenciada, afinidad potenciada por la diana de ácido nucleico y estabilidad aumentada en presencia de nucleasas. Aunque los oligonucleótidos de antisentido son una forma preferida del compuesto de antisentido, la presente invención comprende otros compuestos de antisentido oligoméricos, incluyendo, aunque sin limitación, miméticos oligonucleotídicos tales como los descritos a continuación. Los compuestos de antisentido de acuerdo con esta invención comprenden de aproximadamente 8 a aproximadamente 50 nucleobases (es decir, de aproximadamente 8 a aproximadamente 50 nucleósidos unidos). Compuestos de antisentido particularmente preferidos son oligonucleótidos de antisentido, incluso más preferiblemente aquellos que comprenden de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 nucleobases. Los compuestos de antisentido incluyen ribozimas, secuencias de guía externas (EGS), oligonucleótidos (oligozimas) y otros ARN catalíticos cortos u oligonucleótidos catalíticos que hibridan con el ácido nucleico diana e inhiben su expresión. Los compuestos de antisentido también incluyen un ARNi que comprende una secuencia con sentido y una secuencia de antisentido, en donde las secuencias con sentido y de antisentido forman una doble hélice de ARN y en donde la secuencia de antisentido comprende una secuencia de nucleótidos suficientemente complementaria a la secuencia de nucleótidos de un ácido polinucleico de HCBI, MSBI, MSSI o CMI de la presente invención.

Como alternativa, la invención proporciona un vector que permite transcribir un oligonucleótido antisentido de la invención, por ejemplo, en un hospedador de mamífero. Preferiblemente, dicho vector es un vector útil para genoterapia. Los vectores preferidos útiles para genoterapia son vectores víricos, por ejemplo, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes simple, virus de la variolovacuna o un virus de ARN tal como un retrovirus. Preferiblemente, el vector retrovírico es un derivado de un retrovirus murino o aviar. Ejemplos de dichos vectores retrovíricos que pueden usarse en la presente invención son: virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV), virus del sarcoma murina de Harvey (HaMuSV), virus del tumor mamario murino (MuMTV) y virus del sarcoma de Rous (RSV). Mucho más preferiblemente, se emplea un vector retrovírico de primates no humanos, tal como el virus de la leucemia del mono gibón (GaLV), que proporciona un rango de hospedador más amplio en comparación con los vectores murinos. Como los retrovirus recombinantes son defectuosos, se requiere asistencia para producir partículas infecciosas. Dicha asistencia puede proporcionarse, por ejemplo, usando líneas celulares auxiliares que contienen plásmidos que codifican todos los genes estructurales del retrovirus bajo el control de secuencias reguladoras dentro de la LTR. Las líneas celulares auxiliares adecuadas son bien conocidas por los expertos en la materia. Dichos vectores pueden contener adicionalmente un gen que codifica un marcador de selección de modo que puedan identificarse las células transducidas. Además, los vectores retrovíricos pueden modificarse de tal manera que lleguen a ser específicos de diana. Esto puede conseguirse, por ejemplo, insertando un polinucleótido que codifica un glúcido, un glucolípido o una proteína, preferiblemente un anticuerpo. Los expertos en la materia conocen métodos adicionales para generar vectores específicos de diana. Vectores y métodos adecuados adicionales para genoterapia in vitro o in vivo se describen en la bibliografía y son conocidos por los expertos en la materia; véase, por ejemplo, el documento WO 94/29469 o el documento WO 97/00957. Las secuencias polinucleotídicas de CMI de la invención también pueden servir como un vector adecuado en sí mismo, compuesto únicamente de secuencias de CMI reordenadas o de

secuencias de ADN de célula hospedadora de CMI quiméricas. Además, las secuencias de nucleótidos de la invención pueden usarse para la construcción de cromosomas artificiales.

Para conseguir la expresión únicamente en el órgano diana, las secuencias de ADN para la transcripción de los oligonucleótidos de antisentido pueden unirse a un promotor específico de tejido y usarse para genoterapia. Dichos promotores son bien conocidos por los expertos en la materia.

Dentro de una estructura oligonucleotídica, los grupos fosfato a menudo se denominan formando la cadena principal internucleosídica del oligonucleótido. El enlace normal o cadena principal de ARN y ADN es un enlace fosfodiéster 3' a 5'. Ejemplos específicos de compuestos de antisentido preferidos útiles en la presente invención incluyen oligonucleótidos que contienen cadenas principales modificadas o enlaces internucleosídicos no naturales. Los oligonucleótidos que tienen cadenas principales modificadas incluyen los que retienen un átomo de fósforo en la cadena principal y los que no tienen un átomo de fósforo en la cadena principal. Las cadenas principales oligonucleotídicas modificadas que pueden producir estabilidad aumentada son conocidas por los expertos en la materia, preferiblemente dicha modificación es un enlace fosforotioato.

Un mimético oligonucleotídico preferido es un mimético oligonucleotídico que ha demostrado tener excelentes propiedades de hibridación, y se denomina ácido peptidonucleico (APN). En compuestos de APN, la cadena principal glucídica de un oligonucleótido se remplaza con una cadena principal que contiene amida, en particular una cadena principal de aminoetilglicina. Las nucleobases se retienen y se unen directa o indirectamente a los átomos de nitrógeno aza de la parte amida de la cadena principal.

Los oligonucleótidos modificados también pueden contener uno o más restos glucídicos sustituidos o modificados. Los oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': OH; F; 0-, S-, o N-alquilo; 0-, S-, o N-alquenilo; 0-, S- o N-alquinilo; u 0-alquil-O-alquilo, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C1 a C10 o alquenilo C2 a C10 y alquinilo sustituido o no sustituido. Un resto glucídico modificado particularmente preferido es un resto glucídico con 2'-O-metoxietilo.

Los oligonucleótidos de antisentido de la invención también pueden incluir modificaciones o sustituciones de las nucleobases. Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil-citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, derivados de 6-metilo y otros de derivados de alquilo de adenina y guanina, derivados de 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, etc., prefiriéndose las sustituciones de 5-metilcitosina ya que estas modificaciones han demostrado aumentar la estabilidad de la doble hélice del ácido nucleico.

Otra modificación de los oligonucleótidos de la invención implica unión química al oligonucleótido de uno o más restos o conjugados que potencian la actividad, la distribución celular o la captación celular del oligonucleótido. Dichos restos incluyen restos lipídicos tales como un resto de colesterol, ácido cólico, un tioéter, un tiocolesterol, una cadena alifática, por ejemplo, restos de dodecandiol o undecilo, un fosfolípido, una poliamina o una cadena de polietilenglicol o ácido adamantanoacético, un resto de palmitilo o un resto de octadecilamina o de hexilamino-carbonil-oxicolesterol.

La presente invención también incluye compuesto de antisentido que son compuestos quiméricos. Los compuestos de antisentido "quiméricos" o "quimeras", en el contexto de esta invención, son compuestos de antisentido, particularmente oligonucleótidos, que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una compuesta de al menos una unidad monomérica, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto oligonucleotídico. Estos oligonucleótidos típicamente contienen al menos una región donde el oligonucleótido está modificado para conferir al oligonucleótido resistencia aumentada a degradación por nucleasas, captación celular aumentada y/o afinidad de unión aumentada por el ácido nucleico diana. Una región adición del oligonucleótido puede servir como sustrato para enzimas que pueden escindir híbridos de ARN:ADN o ARN:ARN. A modo de ejemplo, la RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la hebra de ARN de una doble hélice de ARN:ADN. La activación de la RNasa H, por lo tanto, provoca la escisión de la diana de ARN, potenciando enormemente de ese modo la eficacia de la inhibición por el oligonucleótido de la expresión génica. Por consiguiente, a menudo pueden obtenerse resultados comparables con oligonucleótidos más cortos cuando se usan oligonucleótidos quiméricos, en comparación con desoxioligonucleótidos de fosforotioato que hibridan con la misma región diana. Los compuestos de antisentido quiméricos de la invención pueden formarse como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos y/o miméticos oligonucleotídicos como se describe anteriormente. Dichos compuestos también se han denominado en la técnica híbridos o gápmeros.

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo u oligonucleótido antisentido de la invención y un excipiente, diluyente o vehículo adecuado. Preferiblemente, en una composición farmacéutica, dicho compuesto como se describe anteriormente se combina con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se entiende que "farmacéuticamente aceptable" engloba cualquier vehículo, que no interfiera con la eficacia de la actividad biológica del ingrediente activo y que no sea tóxico para el hospedador al que se administra. Ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Dichos vehículos pueden formularse por métodos convencionales y el compuesto activo puede administrarse al sujeto a una dosis eficaz.

Una "dosis eficaz" se refiere a una cantidad del ingrediente activo que es suficiente para prevenir la enfermedad o para afectar a la evolución y la gravedad de la enfermedad, dando lugar a la reducción o remisión de dicha patología. Una "dosis eficaz" útil para tratar y/o prevenir estas enfermedades o trastornos puede determinarse usando métodos conocidos por los expertos en la materia.

La administración de las composiciones adecuadas puede lograrse por diferentes vías, por ejemplo, por administración intravenosa, intraperitoneal, oral, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica. La vía de administración, por supuesto, depende del tipo de tratamiento y el tipo de compuesto contenido en la composición farmacéutica. La pauta posológica la determinará el médico a cargo y mediante otros factores clínicos. Como es bien sabido en las técnicas médicas, las dosificaciones para un paciente cualquiera dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área superficial corporal, la edad, el sexo, el compuesto particular a administrar, el tiempo y vía de administración, el tipo de tratamiento, la salud general y otros fármacos que se estén administrando simultáneamente.

La presente invención también se refiere a una vacuna para inmunizar a un mamífero contra una infección por CMI, que comprende al menos un polipéptido o ácido polinucleico de CMI como se define anteriormente o VLP (partícula de tipo virus) correspondiente o complejos de péptido/proteína/ADN, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. También implica ensayos moleculares e inmunológicos en animales (en particular ganado bovino) y en sus productos (por ejemplo, leche y productos lácteos).

También puede incluir productos químicos pequeños para tratamiento dirigido derivados del análisis de los componentes estructurales de estos agentes.

Una "vacuna" es una composición inmunógena que puede provocar protección contra CMI, ya sea parcial o completa. Una vacuna también puede ser útil para el tratamiento de un individuo ya infectado, en cuyo caso se llama vacuna terapéutica.

El término "terapéutico" se refiere a una composición que puede tratar la infección por CMI o enfermedades ligadas a esta infección. La expresión "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de polipéptido que alberga epítopo suficiente para inducir una respuesta inmunogénica en el individuo al que se administra, o para que inmunorreaccione de forma detectable de otro modo en su sistema pretendido (por ejemplo, inmunoensayo). Preferiblemente, la cantidad eficaz es suficiente para lograr el tratamiento, como se define anteriormente. La cantidad exacta necesaria variará de acuerdo con la aplicación. Para aplicaciones de vacuna o para la generación de antisuero/anticuerpos policlonales, por ejemplo, la cantidad eficaz puede variar dependiendo de la especie, edad y estado general del individuo, de la gravedad de la afección que se está tratando, el polipéptido particular seleccionado y su modo de administración, etc. Se encontrarán cantidades eficaces dentro de un intervalo no crítico relativamente grande. Una cantidad eficaz apropiada puede determinarse fácilmente usando experimentación rutinaria. Los intervalos preferidos de proteínas para la profilaxis de enfermedades causadas por HCBI, MSBI, MSSI o CMI son de 0,01 a 100 pg/dosis, preferiblemente de 0,1 a 50 pg/dosis. Pueden necesitarse varias dosis por individuo para conseguir una respuesta inmunitaria suficiente y la posterior protección contra una infección por HCBI, MSBI, MSSI o CMI y una enfermedad ligada a HCBI, MSBI o CMI, respectivamente.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen cualquier vehículo que por sí mismo no induzca la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la vacuna. Los vehículos adecuados son normalmente macromoléculas grandes, que se metabolizan lentamente, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos y copolímeros de aminoácidos. Dichos vehículos son bien conocidos por los expertos en la materia.

Los adyuvantes preferidos para potenciar la eficacia de la composición incluyen, aunque sin limitación: hidróxido de aluminio (alumbre), N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) como se encuentra en la patente de Estados Unidos n.° 4606918, N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D. isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil sn-glicero-3-hidroxi-fosforiloxi)-etilamina (MTP-PE) y RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, monofosforil lípido A, dimicolato de trehalosa y esqueleto de pared celular (MPL TDM CWS) en una emulsión al 2 % de escualeno/Tween 80. Cualquiera de los 3 componentes MPL, TDM o CWS también puede usarse en solitario o combinados de 2 en 2. Adicionalmente, pueden usarse adyuvantes tales como Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) o SAF-1 (Syntex). Además, puede usarse adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA) para aplicaciones que no son en seres humanos y con propósitos de investigación.

Las composiciones inmunógenas típicamente contendrán vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como agua, solución salina, glicerol, etanol, etc. Adicionalmente, sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes del pH, conservantes y similares, pueden incluirse en dichos vehículos.

Típicamente, las composiciones inmunógenas se preparan como inyectables, como soluciones o suspensiones líquidas. También pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse o encapsularse en liposomas para un efecto adyuvante potenciado. Las proteínas también pueden incorporarse en complejos inmunoestimuladores junto con saponinas, por ejemplo, Quil A (ISCOMS).

Las composiciones inmunógenas usadas como vacunas comprenden una "cantidad suficiente" o "una cantidad inmunológicamente eficaz" de las proteínas de la presente invención, así como cualquier otro de los componentes mencionados anteriormente, según lo necesario. "Cantidad inmunológicamente eficaz" significa que la administración de esa cantidad a un individuo, en una sola dosis o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento, como se define anteriormente. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y estado físico del individuo a tratar, la capacidad del sistema inmunitario del individuo de sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación del médico a cargo de la situación médica y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad esté en un intervalo relativamente amplio que puede determinarse mediante ensayos rutinarios. Habitualmente, la cantidad variará de 0,01 a 1000 pg/dosis, más particularmente de 0,1-100 pg/dosis.

Ejemplo 1

Material y métodos

(A) Fraccionamiento de suero bovino en gradientes de sedimentación por densidad con posterior clonación

Inicialmente, se sometieron combinaciones de 5 sueros de un total de 120 sueros bovinos a ultracentrifugación en gradiente de densidad de Optiprep-(iodixanol) después de tratamiento previo con benzonasa para eliminar todo el ADN y ARN libre (Buck et al., 2005). El ADN asociado a proteína se extrajo de las fracciones (kit de purificación de PCR Qiagen) y 1 pl de la fracción de ADN se sometió a RCA (amplificación por círculo rodante) en una solución de cebadores aleatorios Exo resistentes 50 pM (Thermo Scientific), 3,2 pmol de cada dNTP (Takara) y 10 U de polimerasa phi 29 (Biolabs). Los productos digeridos de restricción (EcoR1 o BamH1) se separaron por la electroforesis en gel de agarosa, se eluyeron y se clonaron en el vector pUC19 antes de la secuenciación.

(B) Amplificación por círculo rodante del ADN extraído de sueros, leche de vaca o tejido cerebral: El ADN se extrajo mediante fenolcloroformo de leche y tejido cerebral después de la muerte y sueros de pacientes con EM. El ADN de todas las muestras de suero se extrajo usando el kit de ácido nucleico vírico High Pure (Roche). Se realizó RCA (amplificación por círculo rodante) con cebadores aleatorios en el ADN de fracciones asociadas a proteínas, digestión de restricción, clonaron y se secuenciación de los fragmentos resultantes (remítase a anteriormente). Se diseñaron cebadores colindantes usados en las secuencias de ADN aisladas individuales, así como en los genes de replicación de Sphinx1.76 o Sphinx2.36 y se usaron en PCR invertida sobre el ADN amplificado por RCA de sueros bovinos individuales y leche de vaca, así como sueros de pacientes con esclerosis múltiple y muestras cerebrales de esclerosis múltiple después de la muerte.

Ejemplo 2

Concepto para la patogenia de esclerosis múltiple: Aislamiento de moléculas de ADN circular (agentes bovinos) de suero bovino, leche de vaca y cerebro con esclerosis múltiple (grupo 1)

La epidemiología del cáncer de colon sugirió la implicación de un factor infeccioso presente en carne roja derivado de ganado bovino de descendencia europea/asiática (zur Hausen, 2012; zur Hausen, 2015) y consumo de leche de vaca que se ha sospechado que desempeña una función en esclerosis múltiple. En intentos por aislar estos supuestos factores, se obtuvieron sueros de 120 vacas sanas de 5 años de edad de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Leipzig y se analizaron para la presencia de ADN episómico circular. Desde el principio los aislados HCBI6.252 (Healthy Cattle Blood Isolate - aislado de sangre de ganado bovino sano) (2522 pb) y HCBI6.159 (1591 pb) revelaron una relación distante con el ADN relacionado con secuencias encontradas en lesiones cerebrales de animales ligadas a afecciones asociadas a priones (Manuelidis, 2011). Los autores de la invención analizaron simultáneamente 8 sueros (de pacientes en recidiva), 2 CSF y 1 PBMC de pacientes con EM, así como 12 biopsias de tejido cerebral después de la muerte de secuencias relacionadas con Sphinx. Se aislaron dos moléculas de ADN circular relacionadas con Sphinx1.76 (1758 pb n.° de acceso HQ444404) de una muestra cerebral con EM - MSBI1.176 (Multiple Sclerosis Brain Isolate - aislado de cerebro de esclerosis múltiple) (1766 pb) y MS2.176 (1766 pb). Como hay un riesgo elevado de EM después de consumo de leche de vaca, los autores de la invención investigaron la leche pasteurizada disponible en el mercado para la presencia de ADN relacionado. De hecho, aislaron moléculas de ADN monocatenario episómicas de las 4 muestras de leche (CMI1.252 (Cow Milk Isolate - aislado de leche de vaca), CMI2.214, CMI3.168 y CMI4.158) (HCBI6.252 y CMI1.252 son casi idénticas). Esto se aceptó como una indicación de que la excreción en leche de estos agentes de hecho se está produciendo.

Los autores de la invención usaron 2 pares de cebadores diseñados sobre Sphinx1.76 para PCR invertida en todas las muestra humanas y bovinas. Estos pares de cebadores eran: directo 5'-GGATTAATGCCAATGATCC-3' (nt 721­ 739), inverso 5'-CGAGAGAAACAG GCAAAG-3' (nt703-720) y directo 5'-GAGGACGAATTAATATTACAAGTC-3' (nt868-891), inverso 5'-TTACCAAGAAAAGCGAGAAC-3' (nt848-867). Las secuencias resultantes son todas similares de forma distante (que varían de un 79 %-98 %) al aislado Sphinx1.76. HCBI6.159 aparentemente evolucionó a partir de una eliminación en HCBI6.252 (eliminación de nt 1129-2060 en HCBI6.252) ya que sus secuencias solapantes son idénticas. HCBI6.159 se aisló independientemente de HCBI6.252 y, por lo tanto, es muy poco probable que sea un artefacto. MSBI1.176 es un 98 % idéntico a Sphinx1.76, pero la naturaleza (patrones) de las diferencias de secuencia individuales son tales que estas pueden considerarse como dos agentes diferentes. Como la construcción Sphinx1.76 no estaba disponible en el laboratorio del autor de la invención, no puede haber sido producto de contaminación de laboratorio. Los autores de la invención aislaron una segunda molécula de ADN circular relacionada con Sphinx1.76 de forma muy distante (pero de tamaño idéntico) MSBI2.176 de la misma muestra cerebral.

Los ORF grandes del aislado del grupo 1 codifican la proteína de replicación (ProtSweep, del Val et al., 2007) que comparten alta similitud entre ellos. Otra característica común es la presencia de repeticiones en tándem de tipo iterón (3x22nt más 17/18nt de la repetición en cada aislado). La alineación de esta región de repetición indica una variación de únicamente un nucleótido en el núcleo (figura 6). Estas repeticiones de tipo iterón pueden constituir sitios de unión para proteína Rep (Chattoraj, 2000, Dziewit et al., 2013).

Número de acceso a secuencia de nucleótidos: Las secuencias completas de 8 aislados se han depositado en el EMBL Databank con el número de acceso:

CMI1.2522 n.° de acceso LK931487

CMI2.214 n.° de acceso LK931488

CMI3.168 n.° de acceso LK931489

CMI4.158 n.° de acceso LK931490

MSBI1.17 n.° de acceso LK931491

MSBI2.176 n.° de acceso LK931492

HCBI6.252 n.° de acceso LK931493

HCBI6.159 n.° de acceso LK931494

En este contexto, las enfermedades del SNC (por ejemplo, esclerosis múltiple EM, esclerosis lateral amiotrófica, encefalopatías espongiformes transmisibles/enfermedades ligadas a priones, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer) son también muy interesantes ya que las secuencias similares descritas por Manuelidis se encuentran principalmente en el SNC.

Ejemplo 3

Aislamiento de un factor bovino de suero bovino (grupo 2)

Se extrajo el ADN de suero bovino seguido de amplificación por círculo rodante del ADN. La amplificación por PCR usando cebadores colindantes (directo (nt2313-2336) 5'CTAATGCAGATCAACACAGGGATA -3' e inverso (nt2312-2291) 5'-GAATTACAGGCTTTGCAAT^c T^g -3') diseñados sobre el gen de replicación de Sphinx2.36 (2364 pb, n.° de acceso HQ444405) (Manuelidis 2011) produjo un aislado de ADN circular HCBI7.228 (2280 pb, n.° de acceso LK931498) (grupo 2).

Ejemplo 4

Aislamiento de secuencias de sueros bovinos y suero de esclerosis múltiple relacionados de forma distante con un grupo novedoso de virus de ADN monocatenario, los gemicircularvirus de tipo micovirus (grupo 3) Recientemente se ha identificado un gran número de virus de ADNmc circular por análisis metagenómicos (Rosario et al., 2012a). El grupo de gemicircularvirus se ha aislado de hongos, heces de diversos animales y hojas de plantas (Rosario et al., 2012b; Sikorski et al. 2013). Los autores de la invención informan del aislamiento de los genomas de 3 virus novedosos relacionados de forma distante con este grupo de virus.

Dos secuencias HCBI8.215 (2152 pb) y HCBI9.2112 (2121 pb) se aislaron después de fraccionamiento en gradiente de densidad de combinaciones de suero bovino. Los fragmentos obtenidos después de la digestión de restricción (BamH1 y EcoR1) se clonaron en pUC19. Sus genomas de longitud completa se verificaron por PCR invertida usando cebadores colindantes. Un aislado de suero de esclerosis múltiple MSSI2.225 rescatado usando cebadores colindantes y PCR invertida se relacionó con los gemicircularvirus de tipo micovirus aislados de sueros de ganado bovino (HCBI8.215 y HCBI9.212). Los autores de la invención posteriormente aislaron una secuencia MSBI3.224 de un tejido cerebral afectado por EM después de la muerte que demostró ser idéntico a MSSI2.225.

La organización genómica de los 3 aislados reveló una supuesta proteína de replicación con ayuste codificada en la hebra negativa y la proteína de cubierta (CP) en la hebra positiva. La CP era rica arginina y se indicó una similitud con la proteína TTV ORF1 en un análisis de DomainSweep (del Val et al., 2007). Los supuestos motivos de círculo rodante I, II y III y un motivo Walker B de cada uno se identificaron de la siguiente manera: HCBI8.215 (LLTYA, HLHAFVD, YAIKD; VFDDI), para HCBI9.212 (LLKMP, HYHIYLG, YVGKD; VFDDI) y para MSSI2.225 (LLTYP, HLHAFVD, YAIKD; IFDDF). Los motivos GRS fueron AVFDVGGFHPNISITK, TAFDYFGAHGNIKSIRy RAFDVEGCHPNVSPSR, respectivamente. El motivo nonanucleotídico tanto para HCBI8.215 como para MSSI2.225 es (TAATGTTAT) y para HCBI9.212 (TAATATTAT).

Estos 3 aislados probablemente constituyen un grupo novedoso de virus ya que sus proteínas de la cápside comparten similitudes con el ORF1 de virus TT de la familia Anelloviridae, y no con las de la familia de virus de plantas Geminiviridae como en los gemicircularvirus. El aislamiento de estos 3 genomas relacionados con gemicircularvirus directamente de tejido animal y humano enfermo los vincula a tener alguna relevancia etiológica para enfermedades tales como esclerosis múltiple.

HCBI8.215 n.° de acceso LK931483

HCBI9.212 n.° de acceso LK931484

MSSI2.225 n.° de acceso LK931485

Ejemplo 5

ADN circular relacionado con plásmido bacteriano de suero humano (grupo 4)

Las especies de Psychrobacter están frecuentemente presentes como contaminantes de alimentos y se han aislado de tejidos humanos incluyendo cerebro, líquido cefalorraquídeo y sangre. Se considera como un patógeno humano oportunista (Caspar et al., 2013; Lloyd-Puryear et al., 1991). Los autores de la invención informan del aislamiento de una molécula de ADN circular, MSSI1.162, de suero recogido de un paciente con esclerosis múltiple durante recidiva. Se realizó amplificación por círculo rodante y digestión de restricción en ADN extraído de sueros de pacientes con esclerosis múltiple. El fragmento resultante se clonó en el vector pUC19. El genoma de longitud completo se verificó por amplificación por PCR invertida usando cebadores diseñados sobre la secuencia identificada inicialmente: cebador directo 5-GACTTCTGATTGATTGATGCCTG-3' -3' e inverso 5'-CCTGTTGAATACCGCTTAAATACT-3'. Todos los productos se secuenciaron por paseo de cebador. MSSI1.162 (aislado de suero de esclerosis múltiple) (1627 pb) (n.° de acceso LK931486) comparte un 66 % de similitud de nucleótidos por análisis BlastN con el plásmido pRWF102 de la especie de Psychrobacter PRwf-1. La supuesta proteína (321 aminoácidos) codificada por el ORF grande muestra similitud débil con la familia de proteína de replicación de E. coli analizada por ProtSweep (del Val et al., 2007).

Este nuevo aislado está relacionado únicamente de forma distante con las especies conocidas de Psychrobacter y sus plásmidos. Por lo tanto, puede representar un patógeno humano aún desconocido.

Sumario:

La presencia de agentes supuestamente infecciosos y sus ácidos nucleicos en el suero de vacas sanas debe implicar que las mismas partículas también están presentes en carne roja.

Los autores de la invención aislaron 13 moléculas de ADN monocatenario novedosas de suero de ganado bovino y leche y tejido cerebral y suero de EM. Estos aislados se agruparon en 4 grupos de acuerdo con su similitud de secuencia respecto al genoma de SphinxI.76 (grupo 1), genoma de Sphinx2.36 (grupo 2), gemicircularvirus de tipo micovirus (grupo 3) y plásmido de Psychrobacter spp. (grupo 4). Sus organizaciones genómicas se presentan en la figura 5 A, B. La característica principal de todas las secuencias es la presencia de un ORF que codifica proteína asociada a replicación.

Todos los aislados son supuestamente ADN monocatenario a causa de la desviación de RCA hacia la amplificación de ADN monocatenario (del Solar et al., 1998). Una clasificación taxonómica de los aislados en esta fase no es posible. Únicamente el grupo 3 puede definirse como claramente relacionado con los gemicircularvirus de tipo micovirus. Este grupo relativamente novedoso de virus se ha identificado por metagenómica y se ha aislado principalmente de heces de una diversidad muy grande de animales e insectos, así como plantas y hongos. Comparten algunas características con los geminivirus de plantas (Sikorski et al., 2013). Su aislamiento en tejidos de animales o de seres humanos aún no se ha descrito. La supuesta proteína asociada a replicación de los 3 aislados descritos en esta solicitud tiene una región rica en arginina con una similitud con virus TT monocatenarios humanos.

La infección de células humanas por dichos agentes debe provocar una fuerte reacción inmunitaria, bastante distinta de los virus TT humanos, donde se han obtenido evidencias razonables de transmisión vertical (revisado en zur Hausen y de Villiers, 2014). Esto podría explicar la alta susceptibilidad a factores ambientales para el desarrollo de EM durante los primeros 15 años de vida: la infección primaria puede dar lugar inicialmente a rondas de replicación y de propagación de BMF probablemente mediante células sanguíneas, provocando finalmente infección de células cerebrales latente. Esta infección inicial debe inducir una respuesta inmunitaria, que probablemente neutraliza el agente en posteriores rondas de infección antes de la entrada al cerebro. Los aislados presentados aquí parecen representar excelentes candidatos para el factor de leche bovina (BMF) postulado.

Se apreció una alta variabilidad en el tamaño en el grupo 1. El aislado circular HCBI6.159 parece haber evolucionado de HCBI6.252 a través de eliminación de 931 nucleótidos del último. Los aislados tienen todos un gen de replicación y tienen una región de repetición de tipo iterón en común (Dziewit et al., 2013). La alineación de esta región entre 8 aislados y Sphinx1.76 revela un núcleo idéntico central (figura 6). Los aislados del grupo 2 y 4 no tienen regiones de repetición.

Las secuencias "Sphinx" (Manuelidis, 2011) muestran altas homologías con secuencias plasmídicas de la bacteria Acinetobacter (Vallenet et al., 2008; Longkumer et al., 2013). Las secuencias obtenidas en la presente invención también muestran homologías llamativas con las secuencias plasmídicas correspondientes. Aunque se ha aislado un gran número de plásmidos y se ha secuenciado a partir de Acinetobacter, hasta ahora ninguno de ellos correspondía exactamente a las secuencias bovinas y humanas presentadas en esta invención. De forma interesante, un grupo de científicos en R. U. publicó datos serológicos sobre un periodo de años que apunta a una formación selectiva aumentada de anticuerpos contra proteínas de Acinetobacter, pero no contra otros antígenos bacterianos obtenidos de pacientes que padecen esclerosis múltiple (véase el artículo de revisión: Ebringer et al., 2012). Estos resultados no pudieron confirmarse por el grupo de Chapman (Chapman et al., 2005). Sin embargo, tiene que resaltarse que el grupo de Chapman usó una cepa diferente de Acinetobacter (Acinetobacter calcoaceticus). Se obtuvieron resultados inequívocos por el grupo de Ebringer para tres cepas de Acinetobacter (Acinetobacter 1woffii, A. radioesistens y un aislado específico, A. 11171). Sin embargo, los resultados obtenidos para A. junii 17908 fueron menos impresionantes y apenas fue detectable reactividad significativa (Hughes et al., 2001). Estos resultados sugieren que estamos tratando con reactividades específicas de cepa en donde esta serorreactividad se debe a plásmidos específicos de cepa que muestran homologías con las secuencias de ADN obtenidas en la presente invención.

El aislado MSSI1.162 (grupo 4) tiene similitud con un plásmido de Psychrobacter spp. Las especies de Pyschrobacter se han considerado patógenos humanos oportunistas (Caspar et al., 2013) y se han aislado de un caso de meningitis (Lloyd-Puryear et al., 1991). Estas bacterias se han presentado repetidamente como contaminantes durante y después del almacenamiento en frío de carne (de Filippis et al., 2013) y se aislaron frecuentemente de leche y de una diversidad de quesos (Coton et al., 2012).

Es de interés observar que Manuelidis informó de dos "estructuras de Sphinx", marcadas como Sphinx "grande" (2,36) y "pequeño" (1,76). Aunque la mayoría de las presentes secuencias diferían sustancialmente de sus aislados, los autores de la invención también obtuvieron secuencias de tipo Sphinx grandes y pequeñas de las mismas sondas. HCBI6.159 circular parece haber evolucionado de HCBI6.252 a través de una eliminación de 931 nucleótidos del último. No puede excluirse que los otros aislados grandes puedan tener equivalentes más pequeños que no se aislaron. Sigue teniendo que determinarse, sin embargo, si las dos estructuras encontradas aquí persisten dentro de la misma cubierta proteínica o se complementan entre sí.

El aislamiento de ADN de ácidos nucleicos circulares monocatenarios similares, en parte incluso idénticos de sueros de ganado bovino, leche de vaca disponible en el mercado y tejidos de EM floridos argumenta a favor del concepto resumido anteriormente.

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Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un ácido polinucleico de aislado de leche de vaca (CMI) que comprende:

(a) una secuencia de nucleótidos representada en la Figura 1 (e) [SEQ ID NO: 46], Figura 1(f) [SEQ ID NO: 57], Figura 1(g) [SEQ ID NO: 70] o Figura 1(h) [SEQ ID NO: 90];

(b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 99 % de identidad con una secuencia de nucleótidos de (a);

(c) una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de (a) o (b); o (d) una secuencia de nucleótidos que es redundante como resultado de la degeneración del código genético en comparación con cualquiera de las secuencias de nucleótidos proporcionadas anteriormente.

2. Un vector de expresión que comprende un ácido polinucleico de CMI de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. unido operativamente a elementos de control de la transcripción y de la traducción procariotas, eucariotas o víricos.

3. Una célula hospedadora transformada o modificada con un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 2.

4. Un polipéptido que está codificado por un ácido polinucleico de CMI de la reivindicación 1.

5. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un polipéptido de la reivindicación 4.

6. Un método para la detección de un ácido polinucleico de CMI de acuerdo con la reivindicación 1 en una muestra biológica, que comprende: (a) extraer opcionalmente ácido polinucleico de muestra, (b) amplificar el ácido polinucleico como se describe anteriormente con al menos un cebador oligonucleotídico que comprende parte de un ácido polinucleico de CMI de la reivindicación 1, siendo dicho cebador capaz de actuar como cebador para secuenciar específicamente o amplificar específicamente el ácido nucleico de un determinado aislado de CMI que contenga una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1, opcionalmente un cebador marcado, y (c) detectar el ácido polinucleico amplificado.

7. Un método para la detección de un ácido polinucleico de CMI de acuerdo con la reivindicación 1 en una muestra biológica, que comprende: (a) extraer opcionalmente ácido polinucleico de muestra, (b) hibridar el ácido polinucleico como se describe anteriormente con al menos una sonda oligonucleotídica que comprenda parte de un ácido polinucleico de CMI de la reivindicación 1, siendo dicha sonda capaz de actuar como una sonda de hibridación para la detección específica del ácido nucleico de un determinado aislado de CMI que contenga una secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1, opcionalmente una sonda marcada, y (c) detectar el ácido polinucleico hibridado.

8. Un método para detectar un polipéptido de la reivindicación 4 o un anticuerpo de la reivindicación 5 presente en una muestra biológica, que comprende: (a) poner en contacto la muestra biológica en cuanto a la presencia y/o la concentración de dicho polipéptido o anticuerpo como se define anteriormente, y (b) detectar el complejo inmunológico formado entre dicho anticuerpo y/o dicho polipéptido.

9. Un oligonucleótido antisentido que reduce o inhibe la expresión de un ácido polinucleico de la reivindicación 1 o un vector que contiene dicho oligonucleótido antisentido.

10. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 5 o el oligonucleótido antisentido de la reivindicación 9 y un vehículo farmacéutico adecuado.

11. Una vacuna que comprende un ácido polinucleico de CMI de la reivindicación 1 o un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4, preferentemente en donde la vacuna comprende una VLP o un complejo de proteína/ADN o polipéptido/ADN o proteínas específicas o agentes infecciosos atenuados.

12. Uso de un ácido polinucleico de CMI de la reivindicación 1 como componente principal para el desarrollo de un medicamento para la prevención o el tratamiento del cáncer, una enfermedad del SNC o la diabetes, preferentemente en donde el cáncer es cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer colorrectal o cáncer de colon y la enfermedad del SNC es esclerosis múltiple ^e M, esclerosis lateral amiotrófica, encefalopatías espongiformes transmisibles/enfermedades ligadas a priones, enfermedad de Parkinson o enfermedad de Alzheimer.