ES2920150T3

ES2920150T3 - Una combinación de péptidos antimicrobianos y fármacos antibióticos para el tratamiento de enfermedades

Info

Publication number: ES2920150T3
Application number: ES17838921T
Authority: ES
Inventors: Niv Bachnoff; Moshe Cohen-Kutner
Original assignee: Omnix Medical Ltd
Current assignee: Omnix Medical Ltd
Priority date: 2016-08-09
Filing date: 2017-08-07
Publication date: 2022-08-01
Anticipated expiration: 2037-08-07
Also published as: WO2018029676A1; EP3496740A1; US20190177379A1; EP3496740B1; US10745452B2; EP3496740A4

Abstract

La invención proporciona un péptido que comprende: una secuencia de aminoácidos central, que es idéntica o similar a la secuencia de aminoácidos de un miembro de la familia de cecropina en una combinación con un fármaco antibiótico. La invención proporciona métodos para tratar una infección, superar la resistencia inherente o adquirida de un microorganismo a un agente antibiótico o desinfectar una herida, los métodos comprenden la administración del péptido en combinación con el fármaco antibiótico a un sujeto que se necesita, en el que el péptido y el péptido y El fármaco antibiótico se administra simultáneamente o consecutivamente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Una combinación de péptidos antimicrobianos y fármacos antibióticos para el tratamiento de enfermedades Campo de la invención

La invención abarca la combinación de péptidos antimicrobianos y compuestos antibióticos para usos terapéuticos. Los péptidos se basan en la familia de cecropinas que sirven como potentes agentes antibacterianos. Los compuestos antibióticos son fármacos antibióticos estándar que se encuentran actualmente en uso clínico. El tratamiento conjunto de los péptidos y los compuestos antibióticos sirve para reducir la concentración eficaz y las dosis eficaces de los fármacos antibióticos necesarios cuando se tratan infecciones bacterianas.

Antecedentes de la invención

Los antibióticos son sustancias químicas que tienen la capacidad, en una solución diluida, de matar o inhibir el crecimiento de microorganismos. Los antibióticos que son lo suficientemente no tóxicos para el hospedero se usan como agentes quimioterapéuticos para tratar enfermedades infecciosas de seres humanos, animales y plantas. El término se restringió originalmente a las sustancias producidas por microorganismos, pero se ha ampliado para incluir compuestos sintéticos y semisintéticos de actividad química similar.

Los fármacos antibióticos se clasifican comúnmente en base a su estructura química, mecanismo de acción o espectro de actividad. La mayoría de los antibióticos se dirigen a funciones bacterianas o procesos de crecimiento (Calderon C.B. y otros, Antimicrobial Susceptibility Testing Protocols. 2007, CRC Press. Grupo Taylor & Frances) que no son comunes con los organismos eucariotas. Las principales familias de fármacos antibióticos pueden clasificarse de la siguiente manera: las penicilinas y las cefalosporinas son fármacos antibióticos que se dirigen a la pared celular bacteriana. Las polimixinas se dirigen a la membrana celular bacteriana. Las rifamicinas, las lipiarmicinas, las quinolonas y las sulfonamidas interfieren con enzimas bacterianas esenciales. Los macrólidos, las lincosamidas y las tetraciclinas se dirigen a la síntesis de proteínas (Finberg R.W. y otros, Clin. Infect. Dis. 2004, 39 (9): 1314-20). La clasificación adicional se basa en la especificidad por su objetivo y, por lo tanto, los antibióticos antibacterianos de espectro reducido se dirigen a tipos específicos de bacterias, mientras que los antibióticos de amplio espectro afectan a una amplia gama de bacterias.

El uso extensivo y generalizado de fármacos antimicrobianos condujo a la aparición de cepas resistentes de microorganismos. Estos microorganismos ya no son susceptibles a los fármacos antimicrobianos actualmente disponibles. Para reducir o prevenir enfermedades infecciosas letales y mantener la salud pública, se requieren nuevos agentes antimicrobianos. Esto obliga a los investigadores a buscar nuevos antibióticos, que aún no son resistentes a las bacterias.

Los péptidos antimicrobianos (AMP) son parte del armamento que los insectos han desarrollado para combatir los patógenos. Aunque normalmente son catiónicos, las estructuras primarias de los AMP de insectos varían notablemente. Los miembros de las familias de AMP más frecuentes adoptan una conformación a-helicoidal en entornos similares a membranas (Bulet P. y otros, Protein and Peptide Letters, 2005, 12, 3-11).

Los insectos producen péptidos antibacterianos, que se secretan a su hemolinfa, como una defensa innata contra infecciones por patógenos (Boman, H.G. y otros, Annu. Rev. Microbial., 1987, 41, 103-126). Algunas especies de insectos pueden producir 10-15 péptidos antibióticos diferentes (Hoffman, J.A., y otros, FEBS Let., 1993, 325, 663 664). Cada péptido tiene una gama de acción antibacteriana completamente diferente (Bulet, P. Medicine Sciences 1999.15,23-29).

Las cecropinas se aislaron por primera vez de la hemolinfa de Hyalophora cecropia. Las cecropinas son pequeños péptidos catiónicos que consisten en 29-42 residuos de aminoácidos, que se encuentran en el orden Diptera (género Drosophila, Sarcophaga) y el orden Lepidoptera (género Hyalophora, Manduca, Bombyx, Antheraea). Cabe mencionar que una cecropina se aisló de intestino porcino (Boman, H.G. y otros, Eur. J. Biochem. 1991. 201, 23-31; Morishima, I. y otros Biochem. Physiol. 1990. 95B, 551-554; Steiner, H. y otros, Nature 1981.292, 246-248; Sun, D. y otros, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. 249(2), 410-415; Bulet, P. y otros Immunological Reviews. 2004.

198, 169-184). Las secuencias conocidas de las principales cecropinas muestran que las partes N-terminales son fuertemente básicas, mientras que las regiones C-terminales son neutras y contienen largos tramos hidrofóbicos. En todos los casos, las cecropinas tienen un residuo C-terminal amidado (Boman, H.G. y otros, Annu. Rev. Microbial., 1987, 41, 103-126). La estructura secundaria de las cecropinas forma dos a-hélices anfipáticas que pueden penetrar la membrana bacteriana. Esta capacidad va seguida de la pérdida del equilibrio del gradiente iónico de la membrana que conduce a la muerte de las bacterias (Christensen, B.C. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 198883:1670-1674; Lockey, T.D. y otros, Eur. J. Biochem.1996. 236, 263-271; Marassi, F.M. y otros, Biophys. J. 1999. 77, 3152-3155; Wang, W. y otros, J. Biol. Chem. 1998. 273, (42) 27438-27448).

Las cecropinas son moléculas muy similares ya que la mitad de las sustituciones de aminoácidos son estrictamente conservativas. Las predicciones teóricas y los espectros de dicroísmo circular indican que estos péptidos pueden formar a-hélices anfipáticas casi perfectas con grupos cargados en un lado longitudinal y residuos laterales hidrofóbicos en el lado opuesto. Las proteínas con hélices anfipáticas a menudo se asocian con membranas, y esta estructura secundaria puede ser importante para la actividad de ruptura de membranas de las cecropinas (Boman, H.G. y otros, Annu. Rev. Microbial., 1987, 41, 103-126).

La estructura de diferentes secuencias de péptidos de la familia de cecropinas muestra que representan tipos similares de moléculas. Además de la región N-terminal fuertemente básica y un largo tramo hidrofóbico en la mitad C-terminal, hay otras características típicas conservadas tales como: triptófano en la posición 2, las lisinas simples y dobles en las posiciones 5, 8 y 9 y arginina en posición 12. Se puede concluir que deben haber existido fuertes presiones de selección que han conservado ciertas secuencias de cecropina en diferentes tipos de insectos a lo largo de la evolución (Boman, H.G. y otros, Eur. J. Biochem. 1991. 201,23-31).

Mataraci y otros, ha informado previamente un efecto sinérgico de varios antibióticos en combinación con péptidos catiónicos antimicrobianos, que incluyen el péptido híbrido Cecropina A - Melitina A (CAMA), en el tratamiento del Staphylococcus aureus grampositivo resistente a la meticilina (MRSA).

El documento WO 2016/132359 A2 describe péptidos de cecropina cíclicos con mayor actividad antimicrobiana que pueden usarse solos o en combinación con un antibiótico, tal como penicilinas, cefalosporinas y tetraciclinas, para tratar a un paciente con una infección bacteriana.

Resumen de la invención

Un primer aspecto de la invención se refiere a una combinación de: a) Un péptido de acuerdo con una secuencia como se expone en las SEQ ID No. 1-11 o una secuencia que tiene al menos 90 %, 95 %, 99 % de identidad de secuencia con la secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No. 1-11, que comprende una secuencia de aminoácidos central que es idéntica o similar a la secuencia de aminoácidos de un miembro de la familia de cecropinas, en donde la secuencia de aminoácidos central se extiende en el extremo N-terminal mediante un grupo N-terminal y se extiende en el extremo C-terminal mediante un grupo C-terminal; y en donde el grupo N-terminal y el grupo C-terminal forman un enlace covalente para formar un péptido cíclico o ensamblaje de homomultímero mediante enlace covalente intermolecular, en donde el enlace covalente es un enlace disulfuro; y b) un fármaco antibiótico seleccionado del grupo que consiste en polimixinas, rifamicinas, lipiarmicinas, quinolonas, sulfonamidas, macrólidos, lincosamidas, aminoglucósidos, ansamicina, glicopéptido, monobactámico, nitrofurano, oxazolidinona, fluoroquinolona, cefamicinas, carbapenémicos; en donde el péptido forma poros en las membranas de las bacterias, en donde los poros aumentan el flujo de entrada del fármaco antibiótico y en donde la combinación es para el uso en el tratamiento de una infección o la desinfección de una herida mediante el contacto de la herida con la combinación para superar la resistencia inherente o adquirida de un microorganismo a un agente antibiótico.

En el presente documento se describe, pero no se reivindica, un método para tratar una infección, el método comprende administrar a un sujeto que lo necesita una combinación de un péptido que comprende: a) una secuencia de aminoácidos central, que es idéntica o similar a la secuencia de aminoácidos de un miembro de la familia de cecropinas, en donde la secuencia de aminoácidos central se extiende en el extremo N-terminal mediante un grupo N-terminal y/o se extiende en el extremo C-terminal mediante un grupo C-terminal; y en donde el grupo N-terminal y/o el grupo C-terminal son idénticos o diferentes o nulos y pueden formar un enlace covalente para formar un péptido cíclico o un ensamblaje de homomultímero mediante enlace covalente intermolecular; y b) Un fármaco antibiótico; en donde el péptido y el fármaco antibiótico se añaden simultánea o consecutivamente.

En el presente documento se describe, pero no se reivindica, un método para desinfectar una herida que comprende poner en contacto la herida con una combinación de: a) un péptido que comprende: una secuencia de aminoácidos central, que es idéntica o similar a la secuencia de aminoácidos de un miembro de la familia de cecropinas, en donde la secuencia de aminoácidos central se extiende en el extremo N-terminal mediante un grupo N-terminal y/o se extiende en el extremo C-terminal mediante un grupo C-terminal; y en donde el grupo N-terminal y/o el grupo C-terminal son idénticos o diferentes o nulos y pueden formar un enlace covalente para formar un péptido cíclico o un ensamblaje de homomultímero mediante enlace covalente intermolecular; y b) Un fármaco antibiótico; en donde la combinación del péptido y el fármaco antibiótico se añade simultánea o consecutivamente.

En un segundo aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una combinación de un péptido de acuerdo con la secuencia expuesta en las SEQ ID No. 1-11 o secuencia que tiene al menos 90 %, 95 %, 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No. 1-11 que comprende: una secuencia de aminoácidos central, que es idéntica o similar a la secuencia de aminoácidos de un miembro de la familia de cecropinas, en donde la secuencia de aminoácidos central se extiende en el extremo N-terminal mediante un grupo N-terminal y se extiende en el extremo C-terminal mediante un grupo C-terminal para formar un péptido cíclico o un ensamblaje de homomultímero mediante enlace covalente intermolecular en donde el enlace covalente es un enlace disulfuro; y un fármaco antibiótico seleccionado del grupo que consiste en polimixinas, rifamicinas, lipiarmicinas, quinolonas, sulfonamidas, macrólidos, lincosamidas, aminoglucósidos, ansamicina, glicopéptido, monobactámico, nitrofurano, oxazolidinona, fluoroquinolona, cefamicinas, carbapenémicos; en donde el péptido forma poros en las membranas de las bacterias, en donde los poros aumentan el flujo de entrada del fármaco antibiótico.

El péptido de la invención puede ser péptidos resistentes a la degradación modificados genéticamente o sintetizados para su adición simultánea o consecutiva, antes o después, de un fármaco antibiótico según se reivindica. El péptido y el fármaco antibiótico pueden añadirse en una composición farmacéutica combinada o en dos o más composiciones farmacéuticas separadas. En algunas modalidades, los péptidos comprenden al menos un resto de cisteína en sus extremos carboxi y amino. En algunas modalidades de la invención, en un entorno oxidativo, por ejemplo, como en varias infecciones, las cisteínas en los extremos carboxi y amino de los péptidos de la invención se unen covalentemente, para crear así en una modalidad de la invención una forma cíclica de los péptidos, en donde dichos péptidos cíclicos representan una mayor estabilidad mientras mantienen su actividad biológica original. En algunas modalidades de la invención, el miembro de la familia de cecropinas pertenece al grupo de AMP CMiv, cecropina A, cecropina B, cecropina B2, cecropina D, cecropina IA y cecropina P1.

En algunas modalidades de la invención, el péptido cíclico tiene una topología, en donde la topología es de cabeza a cola, de cadena lateral a cadena lateral, de cabeza a cadena lateral o de cadena lateral a cola o de cadena principal a cadena principal o de cadena lateral a cadena principal o de cabeza a cadena principal o de cola a cadena principal.

En algunas modalidades de la invención, el enlace covalente se forma en condiciones fisiológicas oxidativas y/o ácidas.

En algunas modalidades de la invención, la secuencia de aminoácidos del miembro de la familia de cecropinas comprende 17-144 aminoácidos.

En el presente documento se describe, pero no se reivindica, la secuencia de aminoácidos central de un miembro de la familia de cecropinas como se expone en las SEQ ID No. 12-22.

En el presente documento se describe, pero no se reivindica, la secuencia de aminoácidos central que tiene al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No. 12-22.

En algunas modalidades de la invención, la secuencia de aminoácidos central comprende sustitución, sustituciones de aminoácidos conservativas, variantes de secuencia modificadas de forma conservativa, deleción y/o inserción en una o más posiciones.

En algunas modalidades de la invención, el grupo C-terminal y/o el grupo N-terminal comprende uno o más de cisteína, un derivado de cisteína, una secuencia de aminoácidos que contiene cisteína o un grupo que comprende un resto tiol o cualquier combinación de los mismos.

En algunas modalidades de la invención, el grupo C-terminal y/o el grupo N-terminal se seleccionan cada uno del grupo que consiste en cisteína, derivado de cisteína, una secuencia de aminoácidos que contiene cisteína o cualquier otro grupo que comprende un resto tiol.

En algunas modalidades de la invención, el grupo N-terminal comprende la secuencia de aminoácidos metioninacisteína, metionina-derivado de cisteína, derivado de metionina-cisteína o derivado de metionina-derivado de cisteína y el grupo C-terminal es cisteína o un derivado de cisteína.

En algunas modalidades de la invención, el grupo C-terminal comprende la secuencia de aminoácidos metioninacisteína, metionina-derivado de cisteína, derivado de metionina-cisteína o derivado de metionina-derivado de cisteína y el grupo N-terminal es cisteína o un derivado de cisteína.

De acuerdo con la presente invención, el enlace covalente es un enlace disulfuro.

En el presente documento se describen, pero no se reivindican, alternativas en las que el enlace covalente es un enlace amida, lactama o peptídico.

En algunas modalidades de la invención, el grupo N-terminal y el grupo C-terminal se unen covalentemente para formar un péptido cíclico.

En algunas modalidades de la invención, el péptido se autoensambla dentro de una membrana fisiológica de modo que el enlace covalente intermolecular se forma entre el grupo N-terminal del péptido y el extremo N-terminal o un grupo C-terminal de un péptido idéntico adicional o en donde el enlace covalente intermolecular se forma entre el grupo C-terminal del péptido y el extremo N-terminal o un grupo C-terminal de un péptido idéntico adicional.

En algunas modalidades de la invención, el péptido es como se expone en cualquiera de las SEQ ID No. 1-11. En algunas modalidades de la invención, el péptido tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No. 1-11. En algunas modalidades de la invención, el péptido es como se expone en la SEQ ID NO: 6.

En algunas modalidades de la invención, el péptido tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6.

En algunas modalidades de la invención, la combinación es para el uso en el tratamiento de una infección donde la infección es una infección bacteriana, viral y/o fúngica.

En algunas modalidades de la invención, la composición farmacéutica se encuentra en forma de un líquido, crema, gel, pasta, polvo, emulsión, una pomada, un linimento, una loción, un sistema transdérmico, un fluido inyectable, una suspensión, parche, parche de película o pulverización.

En algunas modalidades de la invención, la composición farmacéutica está en forma de cápsula o comprimido. En el presente documento se describe, pero no se reivindica, un método para superar la resistencia inherente o adquirida de un microorganismo a un agente antibiótico, que comprende: poner en contacto el microorganismo con los péptidos mencionados anteriormente o la composición farmacéutica mencionada anteriormente junto con un fármaco antibiótico.

En algunas modalidades de la invención, el microorganismo es Escherichia coli, Klebsiella Pneumoniaea, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella serotipo Typhi, Acinetobacter baumannii, un miembro de Enterobacteriaceae spp., Pseudomonas spp. Salmonella spp. o Acinetobacter spp., o cualquier combinación de los mismos.

En el presente documento se describe, pero no se reivindica, un método para desinfectar una herida que comprende poner en contacto la herida con cualquiera de los péptidos mencionados anteriormente o la composición farmacéutica mencionada anteriormente junto con un fármaco antibiótico.

En algunas modalidades de la invención, la herida es una ampolla, una herida de tejido blando, un absceso cutáneo, una herida quirúrgica, una laceración suturada, una laceración contaminada, una herida por quemadura, una úlcera por decúbito, una úlcera por estasis, una úlcera en la pierna, una úlcera del pie, una úlcera venosa, una úlcera diabética, una úlcera isquémica, una úlcera por presión, una infección oral, una enfermedad periodontal, una quemadura de grosor parcial o una quemadura de grosor total.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: el crecimiento bacteriano de Salmonella serotipo Typhimurium (ATCC 700408) se monitoreó durante 17.5 horas mediante la absorbancia a 600 nm. El crecimiento bacteriano o la inhibición del crecimiento se presenta como valores de absorbancia a 600 nm en el tiempo (DO600 nm). A medida que crecen las bacterias, aumentan los valores de DO. La combinación de OMN6 y el fármaco antibiótico Kanamicina (KAN) ejerció un poderoso efecto antimicrobiano que se demuestra por los valores bajos y constantes de DO que representan la muerte de las bacterias.

Figura 2: el crecimiento bacteriano de Salmonella serotipo Typhimurium (ATCC 700408) se monitoreó durante 17.5 horas mediante la absorbancia a 600 nm. El crecimiento bacteriano o la inhibición del crecimiento se presenta como valores de absorbancia a 600 nm en el tiempo (DO600 nm). A medida que crecen las bacterias, aumentan los valores de DO. La combinación de OMN11 y el fármaco antibiótico Imipenem (IPM) ejerció un poderoso efecto antimicrobiano que se demuestra por los valores bajos y constantes de DO que representan la muerte de las bacterias.

Figura 3A: Crecimiento bacteriano de Salmonella serotipo Typhimurium (ATCC 700408) monitoreado durante 17.5 horas mediante la absorbancia a 600 nm. El crecimiento bacteriano o la inhibición del crecimiento se presenta como valores de absorbancia a 600 nm en el tiempo (DO600 nm). A medida que crecen las bacterias, aumentan los valores de DO. La combinación de OMN6 y el fármaco antibiótico ampicilina (AMP) ejerció un poderoso efecto antimicrobiano que se demuestra por los valores bajos y constantes de DO que representan la muerte de las bacterias.

Figura 3B: el crecimiento bacteriano de Pseudomonas aeruginosa (ATCC BAA-2110) se monitoreó durante 17,5 horas mediante la absorbancia a 600 nm. El crecimiento bacteriano o la inhibición del crecimiento se presenta como valores de absorbancia a 600 nm en el tiempo (DO600 nm). A medida que crecen las bacterias, aumentan los valores de DO. La combinación de OMN6 y el fármaco antibiótico ampicilina (AMP) ejerció un poderoso efecto antimicrobiano que se demuestra por los valores bajos y constantes de DO que representan la muerte de las bacterias.

Figura 4: el crecimiento bacteriano de Salmonella serotipo Typhimurium (ATCC 700408) se monitoreó durante 17,5 horas mediante la absorbancia a 600 nm. El crecimiento bacteriano o la inhibición del crecimiento se presenta como valores de absorbancia a 600 nm en el tiempo (DO600 nm). A medida que crecen las bacterias, aumentan los valores de DO. La combinación de OMN6 y el fármaco antibiótico tetraciclina (TET) ejerció un poderoso efecto antimicrobiano que se demuestra por los valores bajos y constantes de DO que representan la muerte de las bacterias.

Descripción detallada de las modalidades de la invención

La invención se basa en péptidos de la familia de cecropinas, que se expresan principalmente en insectos de los órdenes Lepidoptera y Diptera, los cuales se modifican como se describe en el presente documento y se administran en combinación con fármacos antibióticos para el tratamiento de enfermedades o infecciones.

Algunas bacterias desarrollan resistencia a los antibióticos a través de la expresión de bombas especializadas que, al activarse, conducen a un flujo de salida de fármacos fuera de las células bacterianas. La concentración del fármaco antibiótico no puede alcanzar niveles eficaces intracelularmente y las bacterias resistentes se mantienen vivas. Esta forma de resistencia puede superarse si el flujo de entrada del fármaco antibiótico supera el flujo de salida creado por las bombas, lo que conduce a una concentración eficaz del fármaco antibiótico dentro de las células bacterianas. Los péptidos antimicrobianos OMN en algunas modalidades forman poros en las membranas de las bacterias, estos poros pueden aumentar el flujo de entrada de cualquier fármaco antibiótico basado en molécula pequeña que se encuentre en los medios circundantes de las bacterias. Este aumento del flujo de entrada del fármaco antibiótico puede restablecer la concentración eficaz del fármaco intracelularmente y conducir a la muerte de las bacterias.

Los experimentos descritos en la Sección de Ejemplos demuestran que cuando las bacterias desarrollan resistencia a un fármaco específico, este fármaco ya no es eficaz incluso a altas concentraciones. Este medicamento ya no puede usarse con fines terapéuticos ya que ha perdido su capacidad para matar las bacterias resistentes. En los casos en que un fármaco antibiótico ya no sea eficaz contra una cepa de bacteria resistente, una combinación de este fármaco con uno de los péptidos mostrados en las Seq ID Nos. 1-11 puede restablecer la capacidad del fármaco para combatir las bacterias resistentes. La presente invención proporciona una combinación de: a) Un péptido de acuerdo con una secuencia como se expone en las SEQ ID No. 1-11 o una secuencia que tiene al menos 90 %, 95 %, 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No. 1-11, que comprende una secuencia de aminoácidos central que es idéntica o similar a la secuencia de aminoácidos de un miembro de la familia de cecropinas, en donde la secuencia de aminoácidos central se extiende en el extremo N-terminal mediante un grupo N-terminal y se extiende en el extremo C-terminal mediante un grupo C-terminal; y en donde el grupo N-terminal y el grupo C-terminal forman un enlace covalente para formar un péptido cíclico o ensamblaje de homomultímero mediante enlace covalente intermolecular, en donde el enlace covalente es un enlace disulfuro; y b) un fármaco antibiótico seleccionado del grupo que consiste en polimixinas, rifamicinas, lipiarmicinas, quinolonas, sulfonamidas, macrólidos, lincosamidas, aminoglucósidos, ansamicina, glicopéptido, monobactámico, nitrofurano, oxazolidinona, fluoroquinolona, cefamicinas, carbapenémicos; en donde el péptido forma poros en las membranas de las bacterias, en donde los poros aumentan el flujo de entrada del fármaco antibiótico y en donde la combinación es para el uso en el tratamiento de una infección o la desinfección de una herida mediante el contacto de la herida con la combinación para superar la resistencia inherente o adquirida de un microorganismo a un agente antibiótico.

En algunas modalidades, la combinación para el uso de acuerdo con la reivindicación 1 da como resultado un efecto antimicrobiano sinérgico que es más fuerte que un tratamiento independiente con el compuesto antibiótico o el péptido descrito en el presente documento.

En algunas modalidades de la invención, el péptido y/o el fármaco antibiótico se aplican en concentraciones que, cuando se aplican como tratamiento independiente, ni el péptido ni el compuesto antibiótico han demostrado eficacia.

El fármaco antibiótico es cualquier fármaco antibiótico seleccionado del grupo que consiste en polimixinas, rifamicinas, lipiarmicinas, quinolonas, sulfonamidas, macrólidos, lincosamidas, aminoglucósidos, ansamicina, glicopéptido, monobactámico, nitrofurano, oxazolidinona, fluoroquinolona, cefamicinas, carbapenémicos. En algunas modalidades, el fármaco antibiótico es kanamicina, imipenem, ampicilina o cualquier combinación de los mismos. En algunas modalidades de la invención, el fármaco antibiótico es oxitetraciclina, clorotetraciclina, demeclociclina, meclociclina, rolitetraciclina, 6-tiatetraciclina, 4-epi-anhidroclortetraciclina, aminometilciclina, azatetraciclina, fluorociclina, pentaciclina, minociclina, doxiciclina o tigeciclina o cualquier combinación de los mismos.

En algunas modalidades de la invención, el fármaco antibiótico es un antibiótico betalactámico seleccionado del grupo que consiste en cefamicinas, carbapenémicos, ceftazidima, cefotaxima, ceftriaxona, cefpodoxima y aztreonam. En algunas modalidades de la invención, el fármaco antibiótico puede seleccionarse de uno o más de los siguientes grupos: aminoglucósido, ansamicina, glicopéptido, lincosamida, macrólido, monobactámico, nitrofurano, oxazolidinona, quinolona/fluoroquinolona y sulfonamida.

En algunas modalidades, la composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la invención se usa en un sujeto que tiene infecciones bacterianas resistentes a antibióticos causadas por patógenos bacterianos grampositivos y/o gramnegativos. En algunas modalidades, los péptidos comprenden al menos un resto de cisteína en sus extremos carboxi y amino. En algunas modalidades de la invención, en un entorno oxidativo, por ejemplo, como en varias infecciones, las cisteínas en los extremos carboxi y amino de los péptidos de la invención se unen covalentemente, para crear así una forma cíclica de los péptidos, en donde dichos péptidos cíclicos representan una mayor estabilidad mientras mantienen su actividad biológica original.

En todas las modalidades, hay un péptido de acuerdo con una secuencia como se expone en las SEQ ID No. 1-11 o una secuencia que tiene al menos 90 %, 95 %, 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID. Nos. 1-11 que comprende: una secuencia de aminoácidos central, que es idéntica o similar a la secuencia de aminoácidos de un miembro de la familia de cecropinas, en donde la secuencia de aminoácidos central se extiende en el extremo N-terminal mediante un grupo N-terminal y se extiende en el extremo C-terminal mediante un grupo C-terminal; y en donde el grupo N-terminal y el grupo C-terminal forman un enlace covalente para formar un péptido cíclico o un ensamblaje de homomultímero mediante enlace covalente intermolecular, en donde el enlace covalente es un enlace disulfuro.

Como se usa en el presente documento, en una modalidad, la frase "ensamblaje de homomultímero" se refiere a la organización estructural molecular que comprende más de una réplica de la misma molécula. La conectividad y organización estructural de las diferentes réplicas de una misma molécula podría mantenerse mediante enlaces covalentes y/o interacciones no covalentes.

Como se usa en el presente documento, en una modalidad, la frase "enlace covalente intermolecular" se refiere al enlace covalente que se forma entre dos moléculas idénticas o diferentes.

En algunas modalidades ilustrativas de la invención, el miembro de la familia de cecropinas pertenece al grupo de AMP CMIV, cecropina A, cecropina B, cecropina B2, cecropina D, cecropina IA y cecropina P1.

Se hace referencia a las Tablas 1, 2 y 3 que muestran una biblioteca de 11 péptidos antimicrobianos ilustrativos de la invención (secuencias 1-11, Tabla 1), las secuencias originales de la familia de cecropinas (secuencias 12-22, Tabla 2), y secuencias de ácidos nucleicos que codifican los péptidos como se expone en las SEQ ID No. 1-11, Tabla 3).

La Tabla 1 presenta la secuencia de aminoácidos de los péptidos modificados. Los residuos de cisteína y metionina insertados aparecen en negrita.

Tabla 1: Péptidos modificados de Omnix Medical

La Tabla 2 presenta las secuencias de aminoácidos de péptidos ilustrativos de la familia de cecropinas y su origen.

Tabla 2: Familia de péptidos de cecropina

La Tabla 3 presenta las secuencias de ácidos nucleicos que codifican respectivamente los péptidos de las secuencias 1-11.

Tabla 3: Secuencia de nucleótidos que codifica los péptidos modificados de la invención.

En algunas modalidades de la invención, el péptido cíclico tiene una topología, en donde la topología es de cabeza a cola, de cadena lateral a cadena lateral, de cabeza a cadena lateral o de cadena lateral a cola o de cadena principal a cadena principal o de cadena lateral a cadena principal o de cabeza a cadena principal o de cola a cadena principal. El péptido cíclico de acuerdo con algunas modalidades de la invención es un péptido cíclico homodésico, un isopéptido cíclico, un depsipéptido cíclico o un péptido bicíclico. En algunas modalidades, el enlace covalente se forma en condiciones fisiológicas oxidativas y/o ácidas. En algunas modalidades, el péptido de la invención es un péptido grapado.

Como se usa en el presente documento, en una modalidad relacionada con la topología del péptido cíclico, la frase "de cabeza a cola" se refiere a la ciclación del péptido mediante la formación de enlaces amida entre el extremo amino y el extremo carboxilo del péptido.

Como se usa en el presente documento, en una modalidad relacionada con la topología del péptido cíclico, la frase "de cadena lateral a cadena lateral" se refiere a la ciclación del péptido mediante la formación de un enlace covalente entre dos cadenas laterales.

Como se usa en el presente documento, en una modalidad relacionada con la topología del péptido cíclico, la frase "de cabeza a cadena lateral" se refiere a la ciclación del péptido mediante la formación de un enlace covalente entre el extremo amino y una cadena lateral del péptido.

Como se usa en el presente documento, en una modalidad relacionada con la topología del péptido cíclico, la frase "de cadena lateral a cola" se refiere a la ciclación del péptido mediante la formación de un enlace covalente entre el extremo carboxilo y una cadena lateral del péptido.

Como se usa en el presente documento, en una modalidad relacionada con la topología del péptido cíclico, la frase "de cadena principal a cadena principal" se refiere a la ciclación del péptido mediante la formación de un enlace covalente entre dos átomos diferentes de la cadena principal del péptido.

Como se usa en el presente documento, en una modalidad relacionada con la topología del péptido cíclico, la frase "de cadena lateral a cadena principal" se refiere a la ciclación del péptido mediante la formación de un enlace covalente entre una cadena lateral y un átomo de la cadena principal del péptido.

Como se usa en el presente documento, en una modalidad relacionada con la topología del péptido cíclico, la frase "de cabeza a cadena principal" se refiere a la ciclación del péptido mediante la formación de un enlace covalente entre el extremo amino y un átomo de la cadena principal del péptido.

Como se usa en el presente documento, en una modalidad relacionada con la topología del péptido cíclico, la frase "de cola a cadena principal" se refiere a la ciclación del péptido mediante la formación de un enlace covalente entre el extremo carboxilo y un átomo de la cadena principal del péptido.

En el presente documento se describe, pero no se reivindica, la secuencia de aminoácidos central de un miembro de la familia de cecropinas como se expone en las SEQ ID No: 12-22 como se detalla en la Tabla 2. La secuencia de aminoácidos central puede comprender estereoisómeros L o D o una combinación de los mismos. En algunas modalidades de la invención, la secuencia de aminoácidos central tiene al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No: 12-22. La secuencia de aminoácidos central puede comprender sustitución, sustituciones de aminoácidos conservativas, variantes de secuencia modificadas de forma conservativa, deleción y/o inserción en una o más posiciones o en orden inverso.

Como se usa en el presente documento, en una modalidad, la frase "sustituciones de aminoácidos conservativas" o la frase "variante de secuencia modificada de forma conservativa" se refieren a cambios triviales en la secuencia de aminoácidos donde un experto reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales a una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína que altera, añade o elimina un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante de secuencia modificada de manera conservativa", incluso cuando la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar (sustituciones conservativas de aminoácidos). Las tablas de sustitución conservativa que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares se conocen bien en la técnica. También se puede encontrar orientación sobre qué cambios de aminoácidos probablemente sean fenotípicamente silentes en Bowie y otros, 1990, Science 247:1306 1310. Dichas variantes modificadas de forma conservativa se suman a y no excluyen las variantes polimórficas, los homólogos entre especies y los alelos. Las sustituciones conservativas típicas incluyen pero no se limitan a: 1) alanina (A), glicina (G); 2) ácido aspártico (D), ácido glutámico (E); 3) asparagina (N), glutamina (Q); 4) arginina (R), lisina (K); 5) isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), valina (V); 6) fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W); 7) serina (S), treonina (T); y 8) cisteína (C), metionina (M) (ver, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)). Los aminoácidos pueden sustituirse en base a las propiedades asociadas con las cadenas laterales, por ejemplo, pueden sustituirse los aminoácidos con cadenas laterales polares, por ejemplo, serina (S) y treonina (T); aminoácidos basados en la carga eléctrica de cadenas laterales, por ejemplo, arginina (R) e histidina (H); y aminoácidos que tienen cadenas laterales hidrofóbicas, por ejemplo, valina (V) y leucina (L). Como se indica, típicamente los cambios son de naturaleza menor, tales como las sustituciones de aminoácidos conservativas que no afectan significativamente el plegamiento o la actividad de la proteína.

En algunas modalidades de la invención, la secuencia de aminoácidos del miembro de la familia de cecropinas que forma el aminoácido central del péptido de la invención comprende 17-144 aminoácidos. En algunas modalidades de la invención, la secuencia de aminoácidos del miembro de la familia de cecropinas comprende 20-140 aminoácidos. En algunas modalidades de la invención, la secuencia de aminoácidos del miembro de la familia de cecropinas comprende 25-130 aminoácidos. En algunas modalidades de la invención, la secuencia de aminoácidos del miembro de la familia de cecropinas comprende 20-40 aminoácidos. En algunas modalidades de la invención, la secuencia de aminoácidos del miembro de la familia de cecropinas comprende 25-30 aminoácidos. En algunas modalidades de la invención, la secuencia de aminoácidos del miembro de la familia de cecropinas comprende 20-50 aminoácidos. En algunas modalidades de la invención, la secuencia de aminoácidos del miembro de la familia de cecropinas comprende 15-50 aminoácidos. En algunas modalidades de la invención, la secuencia de aminoácidos del miembro de la familia de cecropinas comprende 20-70 aminoácidos. En algunas modalidades de la invención, la secuencia de aminoácidos del miembro de la familia de cecropinas comprende 20-100 aminoácidos. En algunas modalidades de la invención, el péptido comprende un grupo C-terminal y/o un grupo N-terminal en donde el grupo C-terminal y/o el grupo N-terminal comprende uno o más de cisteína, derivado de cisteína, una secuencia de aminoácidos que contiene cisteína o un grupo que comprende un resto tiol o cualquier combinación de los mismos.

En algunas modalidades de la invención, el grupo C-terminal y/o el grupo N-terminal se seleccionan cada uno del grupo que consiste en cisteína, derivado de cisteína, una secuencia de aminoácidos que contiene cisteína o cualquier otro grupo que comprende un resto tiol. En algunas modalidades de la invención, el grupo N-terminal comprende la secuencia de aminoácidos metionina-cisteína, metionina-derivado de cisteína, derivado de metioninacisteína o derivado de metionina-derivado de cisteína y el grupo C-terminal es cisteína o un derivado de cisteína. En algunas modalidades de la invención, el grupo C-terminal comprende la secuencia de aminoácidos metioninacisteína, metionina-derivado de cisteína, derivado de metionina-cisteína o derivado de metionina-derivado de cisteína y el grupo N-terminal es cisteína o un derivado de cisteína.

En algunas modalidades de la invención, el grupo N-terminal y el grupo C-terminal se unen covalentemente para formar un péptido cíclico. El enlace covalente es un enlace disulfuro.

En algunas modalidades de la invención, el grupo C-terminal y el grupo N-terminal se seleccionan cada uno del grupo de L-aminoácidos, D-aminoácidos, aminoácido no natural o derivado de aminoácido.

En algunas modalidades de la invención, en donde el péptido es como se expone en las SEQ ID No. 1-11. En algunas modalidades, el péptido es como se expone en la SEQ ID. No. 6, que también se designa aquí como OMN 6.

En algunas modalidades, los péptidos de la invención se estabilizan mediante la adición de un grupo amida al grupo C-terminal y/o mediante un grupo acetilo al grupo N-terminal. En algunas modalidades, los péptidos de la invención se estabilizan mediante cualquier técnica conocida en la técnica, tal como la adición de un resto proteico o no proteico.

En una modalidad de la invención, el no proteico es polietilenglicol (PEG) o un derivado del mismo, polivinilpirrolidona (PVP), albúmina, éter divinílico, copolímero de anhídrido maleico (DIVEMA; y poli(estireno anhídrido comaleico) (SMA), ácido hialurónico (HA), ácido algínico (AA), metacrilato de polihidroxietilo (Poli-HEMA), glima o poliisopropilacrilamida o cualquier combinación de los mismos.

Como se usa en el presente documento, en una modalidad, el término "derivado de aminoácido" se refiere a un grupo derivable de un aminoácido natural o no natural, como se describe y ejemplifica en el presente documento. Los derivados de aminoácidos son evidentes para los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, derivados de éster, amino alcohol, amino aldehído, amino lactona y N-metilo de aminoácidos naturales y no naturales. En una modalidad, se proporciona un derivado de aminoácido como sustituyente de un compuesto descrito en el presente documento, en donde el sustituyente es -NH-G(Sc)-C(0)-Q o -OC(0)G(Sc)-Q, en donde Q es -SR, -NRR o alcoxilo, R es hidrógeno o alquilo, Sc es una cadena lateral de un aminoácido natural o no natural y G es alquilo C1-C2. En ciertas modalidades, G es alquilo Ci y Sc se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, heteroalquilo, arilalquilo y heteroarilalquilo.

Como se usa en el presente documento, en una modalidad, el término "péptido" puede derivarse de una fuente biológica natural, sintetizarse o producirse mediante tecnología recombinante. Puede generarse de cualquier manera, que incluye mediante síntesis química.

"Fragmentos de péptidos", como se usa ese término o frase en el presente documento, incluyen fragmentos proteolíticos, así como fragmentos de deleción. Las "variantes de péptidos" incluyen fragmentos y péptidos con secuencias de aminoácidos alteradas debido a sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos.

En una modalidad, como se usa en el presente documento, los términos "péptido" y "proteína" pueden usarse indistintamente, todos con los mismos significados y cualidades.

En una modalidad, péptidos de acuerdo con una secuencia como se expone en las SEQ ID No. 1-11 o una secuencia que tiene al menos 90 %, 95 %, 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No. 1-11 se purifican mediante el uso de una variedad de técnicas estándar de purificación de proteínas, tales como, pero sin limitarse a, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, filtración, electroforesis, cromatografía de interacciones hidrofóbicas, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de fase inversa, cromatografía con concanavalina A, cromatoenfoque y solubilización diferencial. En una modalidad, para facilitar la recuperación, la secuencia codificante expresada puede diseñarse para codificar el péptido de acuerdo con una secuencia como se expone en las SEQ ID No. 1-11 o una secuencia que tiene al menos 90 %, 95 %, 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No. 1-11 y resto escindible fusionado. En una modalidad, puede diseñarse una proteína de fusión de manera que el péptido pueda aislarse fácilmente mediante cromatografía de afinidad; por ejemplo, por inmovilización en una columna específica para el resto escindible. En una modalidad, se manipula un sitio de escisión entre el péptido y el resto escindible y el péptido puede liberarse de la columna cromatográfica mediante tratamiento con una enzima o agente apropiado que escinde específicamente la proteína de fusión en este sitio [por ejemplo, ver Booth y otros, Immunol. Lett. 19:65-70 (1988); y Gardella y otros, J. Biol. Chem. 265:15854-15859 (1990)].

En una modalidad, el péptido de acuerdo con una secuencia como se expone en las SEQ ID No. 1-11 o una secuencia que tiene al menos 90 %, 95 %, 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No. 1-11 se recupera en una forma sustancialmente pura.

En una modalidad, la frase "sustancialmente pura" se refiere a una pureza que permite el uso eficaz de la proteína en las aplicaciones descritas en el presente documento.

En una modalidad, el péptido de acuerdo con una secuencia como se expone en las SEQ ID No. 1-11 o una secuencia que tiene al menos 90 %, 95 %, 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No. 1-11 también puede sintetizarse mediante el uso de sistemas de expresión in vitro. En una modalidad, los métodos de síntesis in vitro se conocen bien en la técnica y los componentes del sistema están disponibles comercialmente.

En una modalidad, un péptido de acuerdo con una secuencia como se expone en las SEQ ID No. 1-11 o una secuencia que tiene al menos 90 %, 95 %, 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No. 1-11 se produce mediante un proceso de síntesis. En algunas modalidades, el péptido se produce mediante el uso de tecnología de ADN recombinante. Un péptido o proteína "recombinante" se refiere a un péptido o proteína producido mediante técnicas de ADN recombinante; es decir, producido a partir de células transformadas con una construcción de ADN exógeno que codifica el péptido o la proteína deseados.

En algunas modalidades, los péptidos recombinantes, fragmentos de los mismos o péptidos se sintetizan y purifican; su eficacia terapéutica puede ensayarse in vivo o in vitro. Las actividades de los péptidos de acuerdo con una secuencia como se expone en las SEQ ID No. 1-11 o una secuencia que tiene al menos 90 %, 95 %, 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No. 1-11 puede determinarse mediante el uso de varios ensayos que incluyen, entre otros, la viabilidad celular, la supervivencia de ratones y la recuperación de heridas.

En una modalidad, un péptido de acuerdo con una secuencia como se expone en las SEQ ID No. 1-11 o una secuencia que tiene al menos 90 %, 95 %, 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No. 1-11 comprende al menos 20 aminoácidos. En otra modalidad, un péptido comprende al menos 25 aminoácidos. En otras modalidades, un péptido comprende al menos 30 aminoácidos o al menos 50 aminoácidos o 75 aminoácidos o 100 aminoácidos o 125 aminoácidos o 150 aminoácidos o 200 aminoácidos o 250 aminoácidos o 300 aminoácidos ácidos o 350 aminoácidos o 400 aminoácidos.

Como se usa en el presente documento, en una modalidad, el término "aminoácido" se refiere a aminoácidos a, p y o 8 naturales y sintéticos, e incluye, pero no se limita a, aminoácidos que se encuentran en proteínas, es decir, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptófano, prolina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina, aspartato, glutamato, lisina, arginina e histidina. En ciertas modalidades, el aminoácido está en la configuración L.

En cuanto a las secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales a una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína que altera, añade o elimina un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada de forma conservativa", que incluye cuando la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservativa que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares se conocen bien en la técnica. También se puede encontrar orientación sobre qué cambios de aminoácidos probablemente sean fenotípicamente silentes en Bowie y otros, 1990, Science 247:1306 1310. Dichas variantes modificadas de forma conservativa se suman a y no excluyen las variantes polimórficas, los homólogos entre especies y los alelos. Las sustituciones conservativas típicas incluyen pero no se limitan a: 1) alanina (A), glicina (G); 2) ácido aspártico (D), ácido glutámico (E); 3) asparagina (N), glutamina (Q); 4) arginina (R), lisina (K); 5) isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), valina (V); 6) fenilalanina (f ), tirosina (Y), triptófano (W); 7) serina (S), treonina (T); y 8) cisteína (C), metionina (M) (ver, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)). Los aminoácidos pueden sustituirse en base a las propiedades asociadas con las cadenas laterales, por ejemplo, pueden sustituirse los aminoácidos con cadenas laterales polares, por ejemplo, serina (S) y treonina (T); aminoácidos basados en la carga eléctrica de cadenas laterales, por ejemplo, arginina (R) e histidina (H); y aminoácidos que tienen cadenas laterales hidrofóbicas, por ejemplo, valina (V) y leucina (L). Como se indica, típicamente los cambios son de naturaleza menor, tales como las sustituciones de aminoácidos conservativas que no afectan significativamente el plegamiento o la actividad de la proteína.

En algunas modalidades, el péptido de acuerdo con una secuencia como se expone en las SEQ ID No. 1-11 o una secuencia que tiene al menos 90 %, 95 %, 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No. 1-11 es un péptido aislado. Como se usa en el presente documento, en una modalidad el término "aislado" significa alterado "por la mano del hombre" respecto a su estado natural; es decir, que, si aparece en la naturaleza, se ha cambiado o retirado de su ambiente original, o ambos.

Los péptidos de acuerdo con una secuencia como se expone en las SEQ ID No. 1-11 o una secuencia que tiene al menos 90 %, 95 %, 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No. 1-11 pueden analizarse, por ejemplo, mediante un ensayo MIC de dilución en agarosa, una dilución en caldo, un ensayo de muerte por tiempo o métodos equivalentes. La actividad antibiótica se mide como inhibición del crecimiento de un microorganismo (por ejemplo, bacterias, hongos) o su muerte.

De acuerdo con otra modalidad de la invención, en un entorno oxidativo, por ejemplo, como en infecciones, las cisteínas en los extremos carboxi y amino del péptido de acuerdo con una secuencia como se expone en las SEQ ID No. 1-11 o una secuencia que tiene al menos 90 %, 95 %, 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No. 1-11 están unidas covalentemente entre sí, para crear así en algunas modalidades, una forma cíclica del péptido, que representa mayor estabilidad mientras mantiene la actividad biológica original del péptido o incluso una actividad mejorada en comparación con la forma original.

En el presente documento también se describe, pero no se reivindica, un método para expresar los nuevos péptidos que albergan cisteína de la familia de cecropinas en sistemas de expresión heterólogos de células individuales. El método permite una expresión a gran escala mientras evita la rápida degradación por actividad de proteólisis.

Una producción masiva de OMN en un sistema de expresión heterólogo, tal como las cepas de levadura Saccharomyces cerevisiae / Pichia pastoris o cepas de bacterias compatibles, sirve en algunas modalidades de la invención para generar una clase de agentes eficaces contra una amplia gama de bacterias grampositivas y gramnegativas que superan el problema de la resistencia a los antibióticos.

En el presente documento se describe, pero no se reivindica, un método en el que los genes deseados, tales como, pero sin limitarse a, cualquiera de los péptidos enumerados en la Tabla 1, por ejemplo, el gen de OMN6 (SEQ ID NO:25), se identifican, aíslan y clonan en un vector adecuado después de la adición de codones de cisteína a cada uno de los extremos carboxi y amino de los genes. El vector es adecuado para la expresión en grandes cantidades de los péptidos objetivo, por ejemplo, los plásmidos pPIC9K y pET28, y se transforman en un sistema de expresión objetivo aceptable, por ejemplo, células de BL21, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, etc.

Los genes deseados que codifican proteínas de la familia de cecropinas se manipulan genéticamente de modo que posean un número par de cisteínas ubicadas en sus extremos carboxi y amino terminales. La Tabla 1 proporciona una lista detallada de varios péptidos de la familia de cecropinas, que incluyen su secuencia de aminoácidos natural y los residuos de cisteína y metionina añadidos.

Un método que se describe, pero no se reivindica, es la inserción de un codón ATG (que codifica el aminoácido metionina) en el extremo 5' de los genes maduros de cecropina. Cuando se manipulan péptidos no modificados y se insertan residuos de cisteína aguas abajo del codón ATG nativo.

En el presente documento se describe, pero no se reivindica, la inserción del gen de AMCP deseado aguas abajo de una región que codifica 6 residuos de histidina (etiqueta de His). Los expertos en la técnica conocen un gran número de vectores compatibles adecuados para este fin. Un ejemplo de la invención es el uso del vector pET28a, para la expresión de los péptidos en un sistema de expresión bacteriano compatible. El uso de la etiqueta de His de 6 residuos de histidina es una técnica bien conocida para el aislamiento y purificación de proteínas a partir de células del sistema de expresión.

El uso de sistemas de expresión eucariotas se usa comúnmente para la producción de proteínas extrañas. Un ejemplo de dicho sistema es la cepa de levadura metanoltrófica Pichia pastoris. P. pastoris se ha convertido en un excelente sistema hospedero para la producción masiva de las proteínas deseadas. Una de las ventajas del uso de P. pastoris respecto a las células bacterianas de E. coli es que las proteínas de interés normalmente se pliegan correctamente y se secretan al medio de cultivo. Además, P. pastoris no tiene el problema de las endotoxinas asociado con las bacterias, especialmente cuando se trata de péptidos antimicrobianos como se requiere en esta invención. Por lo tanto, una modalidad de la invención es la inserción de genes de OMN en pPIC9K, un vector de Pichia para la integración de múltiples copias y la expresión secretada (Invitrogen). El gen OMN de elección se clona en dicha expresión, lo que da como resultado pPIC9K-OMN (9,5 Kb). La clonación de los genes de OMN aguas abajo del promotor de AOX1 verifica que su expresión está bajo su regulación. Por ejemplo, el gen de OMN que contiene codones ATG-TGC, que codifican metionina y cisteína respectivamente, en el extremo 5' de su origen natural; y codón TGC-, que codifica cisteína, en su 3'; da como resultado la expresión de los péptidos cíclicos deseados de la invención.

De acuerdo con alguna modalidad de la invención, se proporciona una combinación de a) Un péptido de acuerdo con una secuencia como se expone en las SEQ ID No. 1-11 o una secuencia que tiene al menos 90 %, 95 %, 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No. 1-11, que comprende una secuencia de aminoácidos central que es idéntica o similar a la secuencia de aminoácidos de un miembro de la familia de cecropinas, en donde la secuencia de aminoácidos central se extiende en el extremo N-terminal mediante un grupo N-terminal y se extiende en el extremo C-terminal mediante un grupo C-terminal; y en donde el grupo N-terminal y el grupo C-terminal forman un enlace covalente para formar un péptido cíclico o ensamblaje de homomultímero mediante enlace covalente intermolecular, en donde el enlace covalente es un enlace disulfuro; y b) un fármaco antibiótico seleccionado del grupo que consiste en polimixinas, rifamicinas, lipiarmicinas, quinolonas, sulfonamidas, macrólidos, lincosamidas, aminoglucósidos, ansamicina, glicopéptido, monobactámico, nitrofurano, oxazolidinona, fluoroquinolona, cefamicinas, carbapenémicos; en donde el péptido forma poros en las membranas de las bacterias, en donde los poros aumentan el flujo de entrada del fármaco antibiótico y en donde la combinación es para el uso en el tratamiento de una infección o la desinfección de una herida mediante el contacto de la herida con la combinación para superar la resistencia inherente o adquirida de un microorganismo a un agente antibiótico. El microorganismo es, en algunas modalidades, Escherichia coli, Klebsiella Pneumoniaea, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella serotipo Typhi, Acinetobacter baumannii, un miembro de Enterobacteriaceae spp., Pseudomonas spp. Salmonella spp., Acinetobacter spp. o cualquier combinación de los mismos.

Como se usa en el presente documento, "resistencia inherente" de un microorganismo a un agente antibiótico se refiere a una resistencia natural a la acción del agente incluso en ausencia de exposición previa al agente. (R. C. Moellering Jr., Principles of Anti-infective Therapy; En: Principles and Practice of Infectious Diseases, 4.sup.ta Edición, Eds.; G. L. Mandell, J. E. Bennett, R. Dolin. Churchill Livingstone, Nueva York, EE. UU., 1995, página 200). Como se usa en el presente documento, "resistencia adquirida" de un microorganismo a un agente antibiótico se refiere a una resistencia que no se inhibe por las concentraciones séricas alcanzables normales de un agente antibiótico recomendado en base a la dosis recomendada. (Directrices NCCLS).

Como se usa en el presente documento, "tolerancia" de un microorganismo a un agente antibiótico se refiere a cuando hay un efecto microstático, en lugar de un efecto microcida del agente. La tolerancia se mide por una relación m BC: MIC mayor o igual a 32. (Textbook of Diagnostic Microbiology, Eds., C. R. Mahon y G. Manuselis, W.B. Saunders Co., Toronto Canadá, 1995, página 92).

La herida a la que se hace referencia en las reivindicaciones puede ser, en algunas modalidades, una ampolla, una herida de tejido blando, un absceso cutáneo, una herida quirúrgica, una laceración suturada, una laceración contaminada, una herida por quemadura, una úlcera por decúbito, una úlcera por estasis, una úlcera en la pierna, una úlcera del pie, una úlcera venosa, una úlcera diabética, una úlcera isquémica, una úlcera por presión, una infección oral, una enfermedad periodontal, una quemadura de grosor parcial o una quemadura de grosor total. Como se usa en el presente documento en la descripción y en la sección de reivindicaciones a continuación, el término "tratar" o "que trata" y sus derivados incluye inhibir o ralentizar sustancialmente el crecimiento de un patógeno, o matarlo. El patógeno puede seleccionarse de bacterias, virus, parásitos y hongos patógenos.

Como se usa en el presente documento, "cantidad eficaz" significa una cantidad necesaria para lograr el resultado deseado. Por ejemplo, una cantidad eficaz de los péptidos para eliminar una infección bacteriana de un mamífero en 3 días, 4 días, 5 días, 7 días o 10 días. La "cantidad eficaz" para los fines en el presente documento es la determinada por las consideraciones conocidas en la técnica. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba in vitro o en modelos animales. Debe entenderse que la "cantidad eficaz" depende de las bacterias tratadas, el estado físico del sujeto, etc. La determinación de los intervalos óptimos de cantidades eficaces del ingrediente activo está dentro de los conocimientos de la técnica. En algunas modalidades de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una combinación de un péptido de acuerdo con la secuencia expuesta en las SEQ ID No. 1-11 o una secuencia que tiene al menos 90 %, 95 %, 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No. 1 -11 que comprende una secuencia de aminoácidos central que es idéntica o similar a la secuencia de aminoácidos de un miembro de la familia de cecropinas, en donde la secuencia de aminoácidos central se extiende en el extremo N-terminal mediante un grupo N-terminal y se extiende en el extremo C-terminal mediante un grupo C-terminal; y en donde el grupo N-terminal y el grupo C-terminal forman un enlace covalente para formar un péptido cíclico o ensamblaje de homomultímero mediante enlace covalente intermolecular, en donde el enlace covalente es un enlace disulfuro; y un fármaco antibiótico seleccionado del grupo que consiste en polimixinas, rifamicinas, lipiarmicinas, quinolonas, sulfonamidas, macrólidos, lincosamidas, aminoglucósidos, ansamicina, glicopéptido, monobactámico, nitrofurano, oxazolidinona, fluoroquinolona, cefamicinas, carbapenémicos; en donde el péptido forma poros en las membranas de las bacterias, en donde los poros aumentan el flujo de entrada del fármaco antibiótico. La composición farmacéutica puede estar en forma de un líquido, crema, gel, pasta, polvo, emulsión, una pomada, un linimento, una loción, un sistema transdérmico, un fluido de inyección, una suspensión, un parche, parche de película o pulverización. En algunas modalidades, la formulación está en forma de cápsula o comprimido o está diseñada para inyección.

De acuerdo con una modalidad, las composiciones de la presente invención (reivindicaciones 7 y 8) pueden formularse para administración tópica, oral, ocular o pulmonar (por ejemplo, para inhalación). Otras formulaciones se describen a continuación y están dentro del alcance de la invención.

Como se usa en el presente documento, una "composición farmacéutica" se refiere a una preparación de los ingredientes activos descritos en el presente documento con otros componentes químicos tales como portadores y excipientes fisiológicamente adecuados. El fin de la composición es facilitar la administración al sujeto de los ingredientes activos (por ejemplo, los péptidos de acuerdo con una secuencia como se expone en las SEQ ID No. 1 11 o una secuencia que tiene al menos 90 %, 95 %, 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No. 1-11).

De aquí en adelante, las frases "portador fisiológicamente aceptable" y "portador farmacéuticamente aceptable" que pueden usarse indistintamente para referirse a un portador o un diluyente que no causa irritación significativa al sujeto y no anula la actividad biológica y las propiedades de los ingredientes activos administrados. Bajo estas frases se incluye un adyuvante.

En el presente documento, el término "excipiente" se refiere a una sustancia inerte añadida a la composición (composición farmacéutica o composición cosmética) para facilitar aún más la administración de un ingrediente activo de la presente invención.

Las técnicas para la formulación y administración de fármacos pueden encontrarse en "Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.

Las técnicas de formulación y administración pueden encontrarse en "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", vigésima edición, Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, Pa. (1995). Para la administración a seres humanos o animales, las preparaciones deben cumplir con los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza comparables a los requeridos por la FDA. La administración de la formulación farmacéutica puede realizarse de diversas formas, como se describe en el presente documento.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que incluye un fármaco antibiótico seleccionado del grupo que consiste en polimixinas, rifamicinas, lipiarmicinas, quinolonas, sulfonamidas, macrólidos, lincosamidas, aminoglucósidos, ansamicina, glicopéptido, monobactámico, nitrofurano, oxazolidinona, fluoroquinolona, cefamicinas, carbapenémicos y un ingrediente activo que es el péptido de acuerdo con una secuencia como se expone en las SEQ ID No. 1-11 o una secuencia que tiene al menos 90 %, 95 %, 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No. 1-11. La frase "ingrediente activo" se refiere a cualquiera de los péptidos. La composición farmacéutica puede contener uno o más de los ingredientes activos identificados anteriormente. Típicamente, la composición farmacéutica de la presente invención incluirá un ingrediente activo así como un portador farmacéuticamente aceptable. El término "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquier adyuvante, portador, excipiente o estabilizador adecuado, y puede estar en forma sólida o líquida, tal como comprimidos, cápsulas, polvos, soluciones, suspensiones o emulsiones.

Típicamente, la composición contendrá de 0,01 a 99 por ciento del ingrediente activo. En algunas modalidades, la composición contendrá de 20 a 75 por ciento de un ingrediente activo y además contendrá adyuvantes, portadores y/o excipientes. La determinación de los intervalos óptimos de cantidades eficaces del ingrediente activo está dentro del conocimiento de la técnica. En algunas modalidades, la composición farmacéutica puede comprender de 0,01 a 100 mg/kg de peso corporal del péptido. En algunas modalidades, la composición farmacéutica puede comprender de 0,5 a 100 mg/kg de peso corporal del péptido. En algunas modalidades, la composición farmacéutica puede comprender de 100 a 500 mg/kg de peso corporal del péptido. En algunas modalidades, la composición farmacéutica puede comprender de 100 a 300 mg/kg de peso corporal del péptido. El régimen de tratamiento para la administración del péptido también puede determinarse fácilmente por los expertos en la técnica. Es decir, la frecuencia de administración y el tamaño de la dosis pueden establecerse mediante optimización de rutina.

En algunas modalidades, la composición farmacéutica está en forma de una forma de dosificación unitaria sólida, tal como una cápsula, comprimido y similares, tales como un tipo de gelatina común que contiene el ingrediente activo de la misma de la presente invención, y un portador, por ejemplo, lubricantes y rellenos inertes tales como lactosa, sacarosa o almidón de maíz. En otra modalidad, el ingrediente activo se tabula con bases de comprimidos convencionales tales como lactosa, sacarosa o almidón de maíz en combinación con aglutinantes como goma arábiga, almidón de maíz o gelatina, agentes desintegrantes tales como almidón de maíz, almidón de patata o ácido algínico y un lubricante, como el ácido esteárico o el estearato de magnesio. Los comprimidos, cápsulas y similares también pueden contener un aglutinante tal como goma de tragacanto, acacia, almidón de maíz o gelatina; excipientes tales como fosfato dicálcico; un agente desintegrante tal como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico; un lubricante tal como estearato de magnesio; y un agente edulcorante tal como sacarosa, lactosa o sacarina. Cuando la forma de unidad de dosificación es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un portador líquido tal como un aceite graso.

Pueden estar presentes varios otros materiales como recubrimientos o para modificar la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los comprimidos pueden recubrirse con goma laca, azúcar o ambos. Un jarabe puede contener, además del ingrediente activo, sacarosa como agente edulcorante, metil y propilparabenos como conservantes, un colorante y saborizantes tales como cereza o naranja.

Para la administración terapéutica oral, el ingrediente activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes y similares.

El ingrediente activo de la presente invención puede administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o con un portador comestible asimilable, o puede encerrarse en cápsulas de cubierta dura o blanda, o se puede comprimir como comprimidos, o puede incorporarse directamente con los alimentos de la dieta.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil jeringabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales.

Para el uso como aerosoles, el ingrediente activo de los mismos de la presente invención en solución o suspensión puede envasarse en un recipiente de aerosol presurizado junto con propulsores adecuados, por ejemplo, propulsores de hidrocarburo como propano, butano o isobutano con adyuvantes convencionales. Los materiales de la presente invención también pueden administrarse en forma no presurizada, tal como en un nebulizador o atomizador.

Cuando se administra el ingrediente activo de la presente invención y las composiciones farmacéuticas del mismo, pueden administrarse por vía sistémica o, alternativamente, pueden administrarse directamente en un sitio específico. Por lo tanto, la administración puede realizarse de cualquier manera eficaz para suministrar los ingredientes activos de los mismos o las composiciones farmacéuticas a las células objetivo específicas. Los modos de administración ilustrativos incluyen, sin limitación, administrar los ingredientes activos de los mismos o las composiciones por vía oral, tópica, transdérmica, parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, por instilación intranasal, por instilación intracavitaria o intravesical, intraocular, intraarterial, intralesional o por aplicación a las membranas mucosas, tales como la de la nariz, la garganta y los bronquios.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de los péptidos descritos en el presente documento pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, mediante la determinación de la IC50 (la concentración que proporciona una inhibición del 50 %) y la LD50 (dosis letal que provoca la muerte en el 50 % de los animales analizados) para un compuesto en cuestión. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivos celulares y estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificación para uso en seres humanos. La dosificación puede variar en dependencia de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. El médico individual puede elegir la formulación exacta, la vía de administración y la dosificación en vista del estado del paciente. (Ver, por ejemplo, Fingl y otros, 1975, en The Pharmacological Basis of Therapeutics, cap. 1 p.1).

En dependencia de la gravedad y la capacidad de respuesta de la afección a tratar, la dosificación también puede ser una sola administración de una composición de liberación lenta, con un curso de tratamiento que dura desde varios días hasta varias semanas o hasta que se efectúe la curación o se logre la disminución del estado patológico. La cantidad de una composición a administrar dependerá, por supuesto, del sujeto que se trata, la gravedad de la afección, la forma de administración, el criterio del médico que prescribe y todos los demás factores relevantes. La determinación de la dosis exacta a administrar se realiza mediante métodos conocidos por un experto en la técnica. Se entiende además que el ingrediente activo puede formularse o administrarse junto con ingredientes activos adicionales según se requiera para tratar la afección del paciente.

Alternativamente, puede administrarse la composición de manera local en lugar de sistémica, por ejemplo, mediante inyección de la composición que incluye el ingrediente activo (y un portador fisiológicamente aceptable) directamente en una región de tejido de un paciente (por ejemplo, en la piel infectada o en un piel sana que rodea la piel infectada).

Las vías adecuadas de administración de las composiciones pueden incluir, por ejemplo, administraciones por vía ocular (por ejemplo, en el ojo), tópica (por ejemplo, en un tejido queratinoso, tal como la piel, cabello, uñas, cuero cabelludo), transdérmica, subdérmica, pulmonar y oral (por ejemplo, por la boca).

La composición de la presente invención puede administrarse por vía tópica, pulmonar (por ejemplo, mediante inhalación), oral u ocular.

Como se usa en el presente documento, la frase "administración dérmica" se refiere a aplicar o esparcir la composición de la presente invención sobre la superficie del cuerpo, es decir, piel, cuero cabelludo, cabello, uñas y similares, preferentemente sobre la superficie afectada por la infección.

Como se usa en el presente documento, la frase "administración transdérmica" se refiere a la administración de las composiciones de la presente invención a través de la piel para administración sistémica (por ejemplo, a través de parches transdérmicos o mediante implantes transdérmicos). La administración transdérmica se efectúa típicamente en las proximidades del sitio de infección, sin embargo, la administración transdérmica puede llevarse a cabo en cualquier ubicación anatómica según lo considere adecuado un experto en la técnica.

Como se usa en el presente documento, la frase "administración subdérmica" se refiere a la administración de las composiciones de la presente invención debajo de la piel (es decir, completamente enterrada en la piel, por ejemplo, mediante implantes subdérmicos). La administración subdérmica se efectúa típicamente en las proximidades del sitio de infección, sin embargo, la administración subdérmica puede llevarse a cabo en cualquier ubicación anatómica según lo considere adecuado un experto en la técnica.

Las composiciones de la presente invención pueden fabricarse mediante procesos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, fabricación de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización.

Las composiciones para el uso en el tratamiento de una infección o la desinfección de una herida de acuerdo con algunas modalidades de la invención pueden formularse así de manera convencional mediante el uso de uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares, que facilitan el procesamiento de los ingredientes activos en preparaciones que, pueden usarse cosmética o farmacéuticamente. La formulación adecuada depende de la vía de administración elegida.

Además, puede formularse una dosis en sistemas de cultivo de tejidos (por ejemplo, sistemas ex vivo) o en modelos animales para lograr la concentración o el título deseados. Dicha información puede usarse para determinar con mayor exactitud las dosis útiles en seres humanos. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz puede evaluarse in vivo mediante la determinación del nivel de inflamación antes y después de la administración de la composición en un sujeto afectado por un estado inflamatorio [por ejemplo, mediante el uso de un análisis de sangre tal como un hemograma completo (CBC), por observación de heridas en la piel, etc.].

La toxicidad y la eficacia terapéutica de los ingredientes activos descritos en el presente documento pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar in vitro, en cultivos celulares o animales de experimentación. Los datos obtenidos de estos ensayos in vitro y de cultivos celulares y estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificación para uso en seres humanos. La dosificación puede variar en dependencia de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. El médico individual puede elegir la formulación exacta, la vía de administración y la dosificación en vista del estado del paciente. (Ver, por ejemplo, Fingl, E. y otros (1975), "The Pharmacological Basis of Therapeutics", cap. 1, p.1.)

En dependencia de la gravedad de la afección (por ejemplo, el área, la profundidad y el grado de la infección) y la capacidad de respuesta del sujeto al tratamiento, la dosificación puede ser de una sola o una pluralidad de administraciones, con un ciclo de tratamiento que dura desde varios días hasta varias semanas, varios meses o varios años, o hasta que se efectúe la curación o se logre la disminución de la infección. Alternativamente, las composiciones se administran para prevenir la aparición de una infección en un sujeto con riesgo de desarrollar una infección (por ejemplo, un sujeto que padece una enfermedad inflamatoria crónica). Las composiciones pueden administrarse durante períodos de tiempo prolongados (por ejemplo, varios días, varias semanas, varios meses o varios años) para prevenir la aparición de una infección.

Las composiciones de la presente invención pueden administrarse al menos una vez al día. Las composiciones pueden administrarse dos veces al día, tres veces al día o más.

La administración puede efectuarse de forma crónica.

La administración puede efectuarse durante al menos 10 días, 12 días, 14 días, 16 días, 18 días, 21 días, 24 días, 27 días, 30 días, 60 días, 90 días o más.

La cantidad de una composición a administrar dependerá, por supuesto, del sujeto que se trata, la gravedad de la afección, la forma de administración, el criterio del médico que prescribe, etc.

Las composiciones de la presente invención pueden formularse como una forma de dosificación unitaria. En tal forma, la preparación se subdivide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas de los ingredientes activos, tales como para una sola administración. La forma de dosificación unitaria puede ser una preparación empaquetada, el paquete contiene cantidades discretas de preparación, por ejemplo, una ampolla, un dosificador, un vendaje adhesivo, un vendaje no adhesivo, una toallita, una toallita húmeda para bebés, una gasa, una almohadilla y una toalla higiénica.

En el presente documento se describen factores adicionales que pueden incorporarse en las composiciones de la presente invención. Estos incluyen, pero no se limitan a, componentes de la matriz extracelular (por ejemplo, vitronectina, laminina, colágeno, elastina), factores de crecimiento (por ejemplo, FGF 1, FGF 2, IGF 1, iGf 2, PDGF, EGF, KGF, HGF, VEGF, SDF-1, GM-CSF, CSF, G-CSF, TGF alfa, TGF beta, NGF y ECGF), factores de crecimiento [por ejemplo, eritropoyetina, factor de crecimiento de fibroblastos, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF)], hormonas (por ejemplo, insulina, hormona del crecimiento (GH), CRH, leptina, prolactina y TSH), factores angiogénicos (por ejemplo, angiogenina y angiopoyetina), factores de coagulación y anticoagulación [por ejemplo, Factor I, Factor XIII, factor tisular, calcio, vWF, proteína C, proteína S, proteína Z, fibronectina, antitrombina, heparina, plasminógeno, heparina de bajo peso molecular (Clixan), cininógeno de alto peso molecular (HMWK), precalicreína, inhibidor del activador del plasminógeno-1 (PAI1), inhibidor del activador del plasminógeno-2 (PAI2), urocinasa, trombomodulina, activador del plasminógeno tisular (tPA), alfa 2-antiplasmina e inhibidor de la proteasa relacionada con la proteína Z (ZPI)], inhibidores de citocinas (por ejemplo, ciclosporina A; alfa-2-macroglobulina, pentamidina, pentoxifilina, dexametasona), inhibidores de quimiocinas (por ejemplo, péptido 3, NR58.3-14-3), enzimas (por ejemplo, endoglucosidasas, exoglucosidasas, endonucleasas, exonucleasas, peptidasas, lipasas, oxidasas, descarboxilasas, hidrasas, condroitinasa, condroitinasa ABC, condroitinasa AC, hialuronidasa, queratanasa, heparanasas, variación de empalme de heparanasa, colagenasa, tripsina, catalasas), neurotransmisores, neuropéptidos (por ejemplo, sustancia P), vitaminas (por ejemplo, D-biotina, cloruro de colina, ácido fólico, mioinositol, niacinamida, ácido D-pantoténico, sales de calcio, piridoxal.HCl, pirodixina.HCl, riboflavina, tiamina.HCl, vitamina B12, vitamina E, vitamina C, vitamina D, vitamina B1-6, vitamina K, vitamina A y vitamina PP), carbohidratos (por ejemplo, mono/di/polisacáridos que incluyen glucosa, manosa, maltosa y fructosa), iones, quelantes (por ejemplo, quelantes de Fe, quelantes de Ca), antioxidantes (por ejemplo, vitamina E, cuarcetina, captadores de superóxido, superóxido dismutasa, captadores de H2O2, captadores de radicales libres, captadores de Fe), ácidos grasos (por ejemplo, triglicéridos, fosfolípidos, colesteroles, ácidos grasos libres y ácidos grasos no libres, alcohol graso, ácido linoleico, ácido oleico y ácido lipoico), aminoácidos (por ejemplo, esenciales y no esenciales (de A-Z) especialmente glutamina y arginina), sales (por ejemplo, sales de prurivat y sales de sulfato), sulfatos (por ejemplo, sulfato de calcio), esteroides (por ejemplo, andrógenos, estrógenos, progestágenos, glucocorticoides y mineralocorticoides), analgésicos, anestésicos, agentes antibacterianos, agentes antilevaduras, agentes antifúngicos, agentes antivirales, agentes probióticos, agentes antiprotozoarios, agentes antipruriginosos, agentes antidermatitis, antieméticos, agentes antiinflamatorios, agentes antihiperqueratolíticos, antitranspirantes, agentes antiseborreicos, agentes antihistamínicos, factores inducibles por hipoxia (por ejemplo, HIF-1 alfa y beta y HIF-2), catecolaminas (por ejemplo, epinefrina y norepinefrina), nucleósidos y nucleótidos (por ejemplo, purinas y pirimidinas), prostaglandinas (por ejemplo, prostaglandina E2), leucotrienos, eritropoyetinas (por ejemplo, trombopoyetina), proteoglicanos (por ejemplo, sulfato de heparán, sulfato de queratán), hidroxiapatitas [por ejemplo, hidroxiapatita (Ca10(PO4)6(OH)2)], haptoglobinas (Hp1-1, Hp2-2 y Hp1-2), superóxido dismutasas (por ejemplo, SOD 1/2/3), óxidos nítricos, donantes de óxido nítrico (por ejemplo, nitroprusiato, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU., glutatión peroxidasas, compuestos hidratantes (por ejemplo, vasopresina), células (por ejemplo, plaquetas), medio celular (por ejemplo, M199, DMEM/F12, RPMI, Iscovs), suero (por ejemplo, suero humano, suero fetal de ternero, suero fetal bovino), tampones (por ejemplo, HEPES, bicarbonato de sodio), detergentes (por ejemplo, Tween), desinfectantes, hierbas, extractos de frutas, extractos vegetales (por ejemplo, col, pepino), extractos florales, extractos de plantas adicionales, flavinoides (por ejemplo, jugo de granada), especias, hojas (por ejemplo, té verde, manzanilla), polifenoles (por ejemplo, vino tinto), miel, lectinas, micropartículas, nanopartículas (liposomas), micelas, carbonato de calcio (CaCO3, por ejemplo, carbonato de calcio precipitado, carbonato de calcio molido/pulverizado, albacar, PCC, GCC), calcita, piedra caliza, mármol triturado, piedra caliza molida, cal y tiza (por ejemplo, tiza blanca, tiza champaña, tiza francesa).

La presente formulación también puede contener ingredientes, sustancias, elementos y materiales que contienen hidrógeno, grupos alquilo, grupos arilo, grupos halo, grupos hidroxi, grupos alcoxi, grupos alquilamino, grupos dialquilamino, grupos acilo, grupos carboxilo, grupos carboamido, grupos sulfonamida, grupos aminoacilo, grupos amida, grupos amina, grupos nitro, compuestos orgánicos de selenio, hidrocarburos e hidrocarburos cíclicos.

La presente formulación puede combinarse con sustancias tales como peróxido de benzol, vasoconstrictores, vasodilatadores, ácido salicílico, ácido retinoico, ácido azelaico, ácido láctico, ácido glicólico, ácido pireúrico, taninos, bencilideno alcanfor y derivados de los mismos, alfa hidroxi, tensioactivos.

Las composiciones de algunas modalidades de la presente invención pueden bioconjugarse con polietilenglicol (por ejemplo, PEG, SE-PEG) lo que conserva la estabilidad (por ejemplo, contra actividades de proteasa) y/o la solubilidad (por ejemplo, dentro de un fluido biológico como sangre, fluido digestivo) de los ingredientes activos mientras conserva su actividad biológica y prolonga su vida media.

El portador utilizado en las composiciones de la invención puede estar en una amplia variedad de formas. Estos incluyen portadores de emulsión, que incluyen, pero sin limitarse a, emulsiones de aceite en agua, agua en aceite, agua en aceite en agua y aceite en agua en silicona, una crema, una pomada, una solución acuosa, una loción, un jabón, una pasta, una emulsión, un gel, una pulverización o un aerosol.

Los métodos para preparar composiciones que tienen tales propiedades se conocen bien por los expertos en la técnica y se describen en detalle en Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990 (supra); y Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6a ed., Williams & Wilkins (1995).

Ejemplos

Algunas bacterias desarrollan resistencia a los antibióticos a través de la expresión de bombas especializadas que, al activarse, conducen a un flujo de salida de fármacos de las células bacterianas. La concentración del fármaco antibiótico no puede alcanzar niveles eficaces intracelularmente y las bacterias resistentes permanecen vivas. Esta forma de resistencia puede superarse si el flujo de entrada del fármaco antibiótico supera el flujo de salida creado por las bombas, lo que conduce a una concentración eficaz del fármaco antibiótico dentro de las células bacterianas. Los péptidos antimicrobianos OMN en algunas modalidades forman poros en las membranas de las bacterias, en donde dichos poros pueden aumentar el flujo de entrada de cualquier fármaco antibiótico basado en molécula pequeña que se encuentre en los medios circundantes de las bacterias. Este aumento del flujo de entrada del fármaco antibiótico puede restablecer la concentración eficaz del fármaco intracelularmente y conducir a la muerte de las bacterias.

Ejemplo 1

La combinación de OMN6 y kanamicina ejerce un potente efecto antimicrobiano

Para evaluar y determinar la eficacia de la combinación del péptido antimicrobiano OMN6 con el fármaco antibiótico kanamicina (KAN) sobre el crecimiento de bacterias resistentes, se realizó el siguiente experimento. Se monitoreó el crecimiento y la inhibición de bacterias resistentes a KAN después del tratamiento conjunto con KAN y OMN6. La Figura 1 presenta: Se cultivó Salmonella serotipo Typhimurium (ATCC 700408), una cepa de bacteria resistente a múltiples fármacos (MDR) en presencia de OMN6 o kanamicina KAN. Las bacterias se introdujeron en soluciones de OMN6 (217 |jg/ml) y KAN (3,75 jg/ml) que, en esas concentraciones, demostraron previamente que no eran eficaces cuando se añadían solas. Estas concentraciones de OMN6 solo o KAN sola no inhibieron el crecimiento bacteriano y no condujeron a la muerte de las bacterias. Después, las bacterias se cultivaron en presencia de una combinación de OMN6 y KAN y, después, se administraron simultáneamente en las mismas concentraciones no eficaces. Las bacterias se incubaron durante 17-20 horas y el crecimiento de las bacterias se monitoreó continuamente mediante espectrofotometría a 600 nm (DO600). A medida que avanza el crecimiento bacteriano, los valores de DO600 aumentan y, cuando se inhibe el crecimiento, los valores de DO600 permanecen constantes. Los resultados muestran claramente que el tratamiento independiente con 3,75 jg/ml de KAN o 217 jg/ml de OMN6 no inhibió el crecimiento bacteriano de forma eficaz. Al final del experimento se observó un crecimiento bacteriano significativo. Por el contrario, cuando se usó una combinación de o MN6 a 217 jg/ml junto con KAN a 3,75 jg/ml, se logró un efecto antimicrobiano completo y duradero y se inhibió significativamente el crecimiento bacteriano.

Para este tratamiento conjunto se determinó una concentración inhibitoria mínima (MIC) de OMN6217 jg/ml KAN 3,75 jg/ml (Figura 1).

Este tratamiento combinado puede servir para reducir las dosis eficaces de fármacos antibióticos así como para reducir la concentración de los péptidos descritos en el presente documento que son necesarios para inhibir el crecimiento de bacterias. Además, las cepas de bacterias que son resistentes a los fármacos pueden volver a sensibilizarse a los mismos fármacos a los que ya no son susceptibles mediante el uso de la combinación del péptido con el fármaco antibiótico. Por lo tanto, este tratamiento conjunto puede facilitar el tratamiento de infecciones que involucran bacterias resistentes a antibióticos.

Ejemplo 2

Una combinación de OMN11 e imipenem ejerce un poderoso efecto antimicrobiano

Para evaluar y determinar la eficacia de la combinación del péptido antimicrobiano OMN11 con el fármaco antibiótico imipenem (IPM) sobre el crecimiento de bacterias resistentes, se realizó el siguiente experimento. Se monitoreó el crecimiento y la inhibición de bacterias resistentes a IPM después del tratamiento conjunto con IPM y OMN11.

La Figura 2 presenta: se cultivó Salmonella serotipo Typhimurium (ATCC 700408), una cepa de bacteria resistente a múltiples fármacos (MDR), en presencia de OMN11 o ⁱP^m.

Las bacterias se introdujeron en soluciones de OMN11 (304 pg/ml) e IPM (32 pg/ml) en concentraciones que previamente se había demostrado que no eran eficaces cuando se añadían solas. Estas concentraciones de OMN11 solo o IPM solo no inhibieron el crecimiento bacteriano y no condujeron a la muerte de las bacterias. Después, las bacterias se cultivaron en presencia de una combinación de OMN11 e IPM, y se administraron simultáneamente en las mismas concentraciones no eficaces mostradas anteriormente.

Las bacterias se incubaron durante 17-20 horas y el crecimiento de las bacterias se monitoreó continuamente mediante espectrofotometría a 600 nm (DO600). A medida que avanza el crecimiento bacteriano, los valores de DO600 aumentan y, cuando se inhibe el crecimiento, los valores de DO600 permanecen constantes.

Los resultados muestran claramente que el tratamiento independiente con 32 pg/ml de IPM o 304 pg/ml de OMN11 no inhibió el crecimiento bacteriano de forma eficaz. Al final del experimento se observó un crecimiento bacteriano significativo.

Por el contrario, cuando se usó una combinación de OMN11 a 304 pg/ml junto con IPM a 32 pg/ml, se logró un efecto antimicrobiano completo y duradero y se inhibió significativamente el crecimiento bacteriano.

Para este tratamiento conjunto se determinó una concentración inhibitoria mínima (MIC) de OMN11 304 pg/ml IPM 32 pg/ml (Figura 2).

Ejemplo 3

Una combinación de OMN6 y ampicilina ejerce un poderoso

Efecto antimicrobiano en dos cepas de bacterias resistentes separadas

Para evaluar y determinar la eficacia de la combinación del péptido antimicrobiano OMN6 con el fármaco antibiótico ampicilina (a Mp ) sobre el crecimiento de bacterias resistentes, se realizó el siguiente experimento. Se monitoreó el crecimiento y la inhibición de bacterias resistentes a AMP después del tratamiento conjunto con AMP y OMN6. La Figura 3A presenta: se cultivó Salmonella serotipo Typhimurium (ATCC 700408), una cepa de bacteria resistente a múltiples fármacos (MDR) en presencia de OMN6 o AMP

Las bacterias se introdujeron en soluciones de OMN6 (32 pg/ml) y AMP (128 pg/ml) en concentraciones que previamente se había demostrado que no eran eficaces. Estas concentraciones de OMN6 solo o AMP sola no inhibieron el crecimiento bacteriano y no condujeron a la muerte de las bacterias. Después, las bacterias se cultivaron en presencia de una combinación de OMN6 y AMP y se administraron simultáneamente en las mismas concentraciones no eficaces descritas anteriormente.

Los resultados muestran claramente que el tratamiento independiente con 128 pg/ml de AMP o 32 pg/ml de OMN6 no inhibió el crecimiento bacteriano de manera eficaz. Al final del experimento, se observó un crecimiento bacteriano significativo. Por el contrario, cuando se usó una combinación de OMN6 a 32 pg/ml junto con AMP a 128 pg/ml, se logró un efecto antimicrobiano completo y duradero y se inhibió significativamente el crecimiento bacteriano.

Para este tratamiento conjunto se determinó una concentración inhibitoria mínima (MIC) de OMN632 pg/ml AMP 128 pg/ml (Figura 3A).

La Figura 3B presenta: se cultivó Pseudomonas aeruginosa (ATCC BAA-2110), una cepa de bacteria resistente a múltiples fármacos (MDR) en presencia de OMN6 o AMP. Las bacterias se introdujeron en soluciones de OMN6 (32 pg/ml) y AMP (64 pg/ml) en concentraciones que previamente se había demostrado que no eran eficaces cuando se añadían solas. Estas concentraciones de OMN6 solo o AMP sola no inhibieron el crecimiento bacteriano y no condujeron a la muerte de las bacterias. Después, las bacterias se cultivaron en presencia de un tratamiento conjunto con una combinación de OMN6 y AMP, y se administraron simultáneamente, en las mismas concentraciones no eficaces descritas anteriormente.

Los resultados muestran claramente que el tratamiento independiente con 128 pg/ml de AMP o 32 pg/ml de OMN6 no inhibió el crecimiento bacteriano de manera eficaz. Al final del experimento, se observó un crecimiento bacteriano significativo. Por el contrario, cuando se usó una combinación de OMN6 a 32 pg/ml junto con AMP a 64 pg/ml, se logró un efecto antimicrobiano completo y duradero y se inhibió significativamente el crecimiento bacteriano.

Para este tratamiento conjunto se determinó una concentración inhibitoria mínima (MIC) de OMN632 pg/ml AMP 64 pg/ml (Figura 3B).

Este tratamiento combinado puede servir para reducir las dosis eficaces de fármacos antibióticos así como para reducir la concentración de los péptidos de acuerdo con una secuencia como se expone en las SEQ ID No. 1-11 o una secuencia que tiene al menos 90 %, 95 %, 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No. 1-11 que son necesarias para inhibir el crecimiento de bacterias. Además, las cepas de bacterias que son resistentes a los fármacos pueden volver a sensibilizarse a los mismos fármacos a los que ya no son susceptibles mediante el uso de la combinación del péptido con el fármaco antibiótico. Por lo tanto, este tratamiento conjunto puede facilitar el tratamiento de infecciones que involucran bacterias resistentes a antibióticos. Ejemplo 4

Una combinación de OMN6 y tetraciclina ejerce un poderoso efecto antimicrobiano

Para evaluar y determinar la eficacia de la combinación del péptido antimicrobiano OMN11 con el fármaco antibiótico tetraciclina (TET) sobre el crecimiento de bacterias resistentes, se realizó el siguiente experimento. Se monitoreó el crecimiento y la inhibición de bacterias resistentes a IPM después del tratamiento conjunto con IPM y OMN11. La Figura 4 presenta: se cultivó Salmonella serotipo Typhimurium (ATCC 700408), una cepa de bacteria resistente a múltiples fármacos (MDR) en presencia de OMN6 o TET.

Las bacterias se introdujeron en soluciones de OMN6 (32 pg/ml) y TET (16 pg/ml) en concentraciones que previamente se había demostrado que no eran eficaces cuando se administraban solas. Estas concentraciones de OMN6 solo o TET sola no inhibieron el crecimiento bacteriano y no condujeron a la muerte de las bacterias. Después, las bacterias se cultivaron en presencia de un tratamiento conjunto con una combinación de OMN6 y AMP, y se administraron simultáneamente, en las mismas concentraciones no eficaces descritas anteriormente.

Los resultados muestran claramente que el tratamiento independiente con 16 pg/ml de TET o 32 pg/ml de OMN6 no inhibió el crecimiento bacteriano de forma eficaz. Al final del experimento se observó un crecimiento bacteriano significativo.

Por el contrario, cuando se usó una combinación de OMN6 a 32 pg/ml junto con TET a 16 pg/ml, se logró un efecto antimicrobiano completo y duradero y se inhibió significativamente el crecimiento bacteriano.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una combinación de:

a) Un péptido de acuerdo con una secuencia como se expone en las SEQ ID No. 1-11 o una secuencia que tiene al menos 90 %, 95 %, 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No. 1-11, que comprende una secuencia de aminoácidos central que es idéntica o similar a la secuencia de aminoácidos de un miembro de la familia de cecropinas, en donde la secuencia de aminoácidos central se extiende en el extremo N-terminal mediante un grupo N-terminal y se extiende en el extremo C-terminal mediante un grupo C-terminal; y en donde el grupo N-terminal y el grupo C-terminal forman un enlace covalente para formar un péptido cíclico o ensamblaje de homomultímero mediante enlace covalente intermolecular, en donde el enlace covalente es un enlace disulfuro; y

b) un fármaco antibiótico seleccionado del grupo que consiste en polimixinas, rifamicinas, lipiarmicinas, quinolonas, sulfonamidas, macrólidos, lincosamidas, aminoglucósidos, ansamicina, glicopéptido, monobactámico, nitrofurano, oxazolidinona, fluoroquinolona, cefamicinas, carbapenémicos;

en donde el péptido forma poros en las membranas de las bacterias, en donde los poros aumentan el flujo de entrada del fármaco antibiótico y en donde la combinación es para el uso en el tratamiento de una infección o la desinfección de una herida mediante el contacto de la herida con la combinación para superar la resistencia inherente o adquirida de un microorganismo a un agente antibiótico.

2. La combinación para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el péptido y el fármaco antibiótico se administran simultánea o consecutivamente.

3. La combinación para el uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el péptido es la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6.

4. La combinación para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el fármaco antibiótico es kanamicina, imipenem, ampicilina, oxitetraciclina, clorotetraciclina, demeclociclina, meclociclina, rolitetraciclina, 6-tiatetraciclina, 4-epi-anhidroclortetraciclina, aminometilciclina, azatetraciclina, fluorociclina, pentaciclina, minociclina, doxiciclina o tigeciclina, o cualquier combinación de los mismos, y ceftazidima, cefotaxima, ceftriaxona, cefpodoxima y aztreonam.

5. La combinación para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el microorganismo es Escherichia coli, Klebsiella Pneumoniaea, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella serotipo Typhi, Acinetobacter baumannii, un miembro de Enterobacteriaceae spp., Pseudomonas spp. Salmonella spp. o Acinetobacter spp., o cualquier combinación de los mismos.

6. La combinación para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la herida es una ampolla, una herida de tejido blando, un absceso cutáneo, una herida quirúrgica, una laceración suturada, una laceración contaminada, una herida por quemadura, una úlcera por decúbito, una úlcera por estasis, una úlcera en la pierna, una úlcera del pie, una úlcera venosa, una úlcera diabética, una úlcera isquémica, una úlcera por presión, una infección oral, una enfermedad periodontal, una quemadura de grosor parcial o una quemadura de grosor total.

7. Una composición farmacéutica que comprende una combinación de un péptido de acuerdo con la secuencia expuesta en las SEQ ID No. 1-11 o una secuencia que tiene al menos 90 %, 95 %, 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No. 1 - 11 que comprende una secuencia de aminoácidos central que es idéntica o similar a la secuencia de aminoácidos de un miembro de la familia de cecropinas, en donde la secuencia de aminoácidos central se extiende en el extremo N-terminal mediante un grupo N-terminal y se extiende en el extremo C-terminal mediante un grupo C-terminal; y en donde el grupo N-terminal y el grupo C-terminal forman un enlace covalente para formar un péptido cíclico o ensamblaje de homomultímero mediante enlace covalente intermolecular, en donde el enlace covalente es un enlace disulfuro; y un fármaco antibiótico seleccionado del grupo que consiste en polimixinas, rifamicinas, lipiarmicinas, quinolonas, sulfonamidas, macrólidos, lincosamidas, aminoglucósidos, ansamicina, glicopéptido, monobactámico, nitrofurano, oxazolidinona, fluoroquinolona, cefamicinas, carbapenémicos; en donde el péptido forma poros en las membranas de las bacterias, en donde los poros aumentan el flujo de entrada del fármaco antibiótico.

8. La composición farmacéutica de la reivindicación 7, en donde el fármaco antibiótico es kanamicina, imipenem, ampicilina, oxitetraciclina, clorotetraciclina, demeclociclina, meclociclina, rolitetraciclina, 6-tiatetraciclina, 4-epi-anhidroclortetraciclina, aminometilciclina, azatetraciclina, fluorociclina, pentaciclina, minociclina, doxiciclina o tigeciclina o cualquier combinación de los mismos, y ceftazidima, cefotaxima, ceftriaxona, cefpodoxima y aztreonam.