ES2920376T3 - Procedimiento de cribado de pacientes de cáncer basado en AXL - Google Patents

Procedimiento de cribado de pacientes de cáncer basado en AXL Download PDF

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Abstract

Según una realización de la presente invención, se proporciona un método de detección de un paciente con cáncer de pulmón que ha adquirido resistencia a un inhibidor de EGFR mediante el análisis de imágenes ópticas de células tumorales circulantes y AXL. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento de cribado de pacientes de cáncer basado en AXL
[Campo técnico]
La presente invención se refiere a un procedimiento de cribado de un paciente con cáncer y, más particularmente, a un procedimiento de cribado de un paciente con cáncer utilizando células tumorales circulantes mediante el análisis de imágenes ópticas de AXL y células tumorales circulantes.
[Técnica anterior]
El cáncer de pulmón ocupa el primer lugar en cuanto a mortalidad por cáncer, no sólo en Corea sino en todo el mundo, y alrededor de 1,2 millones de pacientes mueren de cáncer de pulmón cada año (Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P. Global Cancer Statistics, 2002. CA Cancer J Clin 55:74-108, 2005). El cáncer de pulmón de células no pequeñas representa aproximadamente el 80% de todos los cánceres de pulmón, y sólo puede curarse completamente en algunos pacientes mediante cirugía. La mayoría de los pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas se diagnostican en un estadio localmente avanzado o en un estadio metastásico. La tasa de supervivencia a un año de los pacientes con derrame pleural maligno, derrame pericárdico o lesiones metastásicas aumentó a cerca del 30-40% mediante la quimioterapia basada en el platino, pero la mediana de supervivencia de estos pacientes sigue siendo de sólo 10 meses (Schiller JH, Harrington D, Belani CP, Langer C, Sandler A, Krook J, Zhu J, Johnson DH. “Comparación de cuatro regímenes de quimioterapia para el cáncer de pulmón no microcítico avanzado”. N Engl J Med 346:92-98, 2002). En los últimos años, los fármacos terapéuticos moleculares dirigidos se han utilizado con frecuencia para el cáncer de pulmón de células no pequeñas. Entre las diversas vías de señalización, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) son las más importantes, y el gefitinib y el erlotinib, que son inhibidores de la tirosina quinasa del EGFR, ya se han utilizado ampliamente en aplicaciones clínicas. Se sabe que estos fármacos son muy eficaces en pacientes con mutaciones del EGFR o con algunos rasgos clínicos característicos. Sin embargo, desgraciadamente, en la actualidad, no mucho después de la introducción del EGFR-TKI en la práctica clínica, se sabe que la recaída acaba por producirse en la mayoría de los pacientes, incluso en los que han mostrado una respuesta espectacular al EGFR-TKI. Recientemente, se ha encontrado que se produce una mutación secundaria (T790M) en el exón 20, por lo que el cáncer de pulmón de células no pequeñas adquiere resistencia a gefitinib o erlotinib. Se cree que esta mutación interfiere críticamente con el enlace de hidrógeno del fármaco en el bolsillo de unión al ATP. En relación con esta resistencia adquirida al fármaco terapéutico dirigido EGFR-TKI, se ha informado continuamente de que el AXL desempeña un papel muy importante en la resistencia adquirida al EGFR-TKI y también está profundamente implicada en el mal pronóstico después del tratamiento. AXL está sobreexpresado/sobreactivado en varios cánceres sólidos, especialmente en el cáncer de pulmón de células no pequeñas, por lo que la importancia de AXL en la resistencia adquirida es cada vez mayor. Por lo tanto, la inhibición eficaz de AXL se ha convertido en un tema importante.
En términos de tratamiento y prevención del cáncer, la identificación de los pacientes que responden, o es probable que respondan, a los tratamientos contra el cáncer puede ser un objetivo para el tratamiento eficaz del cáncer, en particular del cáncer de pulmón. El cáncer de pulmón puede diagnosticarse mediante procedimientos como la prueba del antígeno específico del cáncer de pulmón en suero, la ultrasonografía, la biopsia de tejido y otros similares, y el patrón de expresión del AXL puede examinarse mediante una biopsia de tejido. Sin embargo, en el caso de la biopsia de tejidos, la toma repetida de muestras de un paciente es difícil y puede suponer una carga física para el paciente.
El perfil de las composiciones de células tumorales circulantes en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas es descrito por Nel et al. (Transl Lung Cancer Res (2014) 3:100-106).
Por lo tanto, existe la necesidad de una tecnología que pueda detectar el AXL al tiempo que reduce la carga para el paciente.
[Divulgación]
[Problema técnicol
Un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento de cribado de un paciente con cáncer, en el que el cáncer tiene una resistencia adquirida a un inhibidor del EGFR, mediante la detección de AXL, que se expresa en las células tumorales circulantes, por análisis de imágenes ópticas.
[Solución técnical
Para lograr el objeto anterior, un procedimiento de cribado de un paciente con cáncer según un aspecto de la presente invención comprende las etapas de:
aislar las células tumorales circulantes de una muestra de sangre obtenida previamente del paciente con cáncer mediante un biochip;
hacer reaccionar las células tumorales circulantes aisladas con un marcador fluorescente que se une específicamente a las células tumorales circulantes y un marcador fluorescente que se une específicamente a AXL;
recibir imágenes ópticas de las células tumorales circulantes reaccionadas con el marcador fluorescente específico de las células tumorales circulantes y del AXL reaccionado con el marcador fluorescente específico del AXL bajo una pluralidad de intervalos de longitudes de onda, respectivamente;
realizar un primer filtrado midiendo las intensidades de fluorescencia de las células tumorales circulantes y del AXL en las imágenes ópticas bajo la totalidad o parte de la pluralidad de intervalos de longitudes de onda;
realizar un segundo filtrado midiendo la morfología de las células tumorales circulantes en las imágenes ópticas bajo todo o parte de la pluralidad de intervalos de longitudes de onda; y
realizar un tercer filtrado midiendo la morfología de las células tumorales circulantes en una imagen combinada obtenida mediante la fusión de todas o parte de las imágenes ópticas bajo la pluralidad de intervalos de longitud de onda respectivos, en la que el cáncer tiene una resistencia adquirida a un inhibidor del EGFR.
En una realización de la presente invención, el marcador fluorescente que se une específicamente a las células tumorales circulantes puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo específico para vimentina, un anticuerpo específico para EpCAM y un anticuerpo específico para CK.
En una realización de la presente invención, las imágenes ópticas bajo la pluralidad de intervalos de longitud de onda en la etapa de recepción de las imágenes ópticas pueden incluir una imagen de intervalo de longitud de onda azul, una imagen de intervalo de longitud de onda verde y una imagen de intervalo de longitud de onda roja.
En una realización de la presente invención, el núcleo de las células tumorales circulantes puede identificarse realizando, en la imagen de intervalo de longitud de onda azul, la etapa de realizar el primer filtrado y la etapa de realizar el segundo filtrado.
En una realización de la presente invención, la membrana de las células tumorales circulantes puede identificarse realizando, en una o más de las imágenes de intervalo de longitud de onda verde y de intervalo de longitud de onda roja, la etapa de realizar el primer filtrado.
En una realización de la presente invención, la morfología de las células tumorales circulantes puede incluir una o más de las áreas celulares, el tamaño celular y la capacidad de circular.
En una realización de la presente invención, la etapa de realizar el primer filtrado puede comprender las etapas de:
medir el tamaño de las células tumorales circulantes en las imágenes ópticas para todo o parte de la pluralidad de intervalos de longitud de onda; y
establecer un área poligonal o circular, que sea mayor que el tamaño medido de las células tumorales circulantes en una proporción o cantidad predeterminada, y realizar el primer filtrado midiendo la intensidad de fluorescencia de las células tumorales circulantes dentro del área.
En una realización de la presente invención, el cáncer puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón, cáncer de mama, leucemia mieloide, leucemia linfocítica crónica, cáncer colorrectal adenocarcinoma esofágico, cáncer gástrico, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de tiroides, glioma, cáncer de riñón, melanoma, mesotelioma pleural maligno, carcinoma de células escamosas y cáncer de endometrio.
En una realización de la presente invención, el cáncer puede ser de pulmón.
En una realización de la presente invención, el cáncer puede ser un cáncer de pulmón de células no pequeñas. Según la presente invención, el cáncer tiene una resistencia adquirida a un inhibidor del EGFR.
En una realización de la presente invención, la etapa de aislar las células tumorales circulantes puede realizarse bajo una presión de la presión atmosférica 1000 hPa a 1020 hPa.
En una realización de la presente invención, el biochip puede ser un chip microporoso de alta densidad recubierto con una solución de BSA.
En una realización de la presente invención, el chip microporoso de alta densidad puede tener especificidad de tamaño.
En una realización de la presente invención, el recubrimiento con la solución de BSA puede realizarse a una concentración de BSA de 0,05 a 0,15%.
[Efectos ventajosos!
Según una realización de la presente invención, un paciente con cáncer de pulmón que tiene resistencia al EGFR-TKI puede ser examinado por análisis de imagen de AXL que se expresa en las células tumorales circulantes.
Debe entenderse que los efectos de la presente invención no se limitan a los efectos descritos anteriormente e incluyen todos los efectos que pueden deducirse de la configuración de la presente invención descrita en las reivindicaciones.
[Descripción de los dibujos]
La FIG. 1 muestra un proceso de aislamiento de células tumorales circulantes.
La FIG. 2 es una fotografía que muestra células tumorales circulantes aisladas por un chip microporoso de alta densidad.
La FIG. 3 representa gráficos que muestran el crecimiento y la división de las células tumorales circulantes cultivadas en un medio según la presente invención y el crecimiento y la división de las células tumorales circulantes cultivadas en un medio de cultivo normal.
La FIG. 4 representa gráficos que muestran el crecimiento y la división de las células tumorales circulantes cultivadas utilizando un medio según la presente invención en una placa de cultivo recubierta de hidrogel utilizada en la presente invención y el crecimiento y la división de las células tumorales circulantes cultivadas en una placa de cultivo normal.
La FIG. 5 representa fotografías de muestra de imágenes ópticas de células tumorales circulantes para los intervalos de longitud de onda azul, verde y roja.
La FIG. 6 es una fotografía que muestra una imagen combinada obtenida al fusionar las imágenes ópticas de las células tumorales circulantes mostradas en la FIG. 5.
La FIG. 7 muestra los resultados de la medición de las formas e intensidades de fluorescencia de las células tumorales circulantes unidas con varios colorantes o marcadores fluorescentes.
La FIG. 8 muestra un ejemplo de conducción de un programa que implementa un procedimiento óptico para identificar células tumorales circulantes.
La FIG. 9 muestra imágenes de inmunofluorescencia DAPI, EpCAM, PSMA y CD45 de células tumorales circulantes en portaobjetos con células de líneas celulares cancerosas y glóbulos blancos.
La FIG. 10 muestra imágenes de inmunofluorescencia DAPI, EpCAM, pan-CK, AXL y CD45 de células tumorales circulantes en muestras de pacientes con cáncer.
La FIG. 11 muestra un ejemplo de análisis en el que se comparó el porcentaje de detección de células tumorales circulantes AXL-positivas entre los pacientes resistentes a los fármacos contra el cáncer y los pacientes de control cuando la intensidad de fluorescencia de AXL se analizó en base a tres veces o más la de las células AXL-negativas.
[Mejor modo]
A continuación, se describirán en detalle ejemplos de la presente invención para que los expertos en el campo técnico al que pertenece la presente invención puedan llevarla a cabo fácilmente.
Ejemplo 1 : Fabricación de un chip microporoso de alta densidad
Un chip microporoso de alta densidad utilizado en un experimento tenía un tamaño de poro de 5,5 a 8,5 pm y estaba configurado de tal manera que los glóbulos blancos (WBC) y los glóbulos rojos (RBC) con un tamaño inferior a 5,5 pm se eliminarían al pasar por el chip, mientras que las células objetivo con un tamaño superior a 5,5 pm permanecerían en el chip. Así, se trataba de un chip microporoso diseñado de forma que pudiera recuperar selectivamente células de un tamaño específico.
Como referencia, se realizó un experimento para examinar la tasa de recuperación celular del chip microporoso de alta densidad. En el experimento, se introdujeron 10, 100 y 1.000 células cancerosas de pacientes con cáncer y se hicieron pasar por el chip, y se examinó el número de células cancerosas en el chip (tasa de recuperación celular). Los resultados se muestran en la Tabla 1.
[Tabla 1!
Figure imgf000004_0001
Los resultados del cálculo de la tasa de recuperación celular del chip mostraron que la tasa de recuperación celular era de aproximadamente el 80% o superior.
Para confirmar de nuevo que las células recuperadas serían células cancerosas, las células se tiñeron con el anticuerpo CK que se ha utilizado previamente en un ensayo de cáncer. Como resultado, se confirmó que todas las células eran CK-positivas, lo que indicaba que las células eran cancerosas.
Ejemplo 2: Proceso de aislamiento de las células tumorales circulantes (CTC)
1. Se añadieron 250 pl de un polímero de anticuerpos a 5 ml de sangre, y luego se mezclaron durante unos 3 segundos, seguido de una reacción a temperatura ambiente durante 20 minutos.
2. Se añadieron 5 ml de PBS que contenía 1% de FBS.
3. Se colocaron cuidadosamente 10 ml de la solución de reacción en un tubo de 50 ml que contenía 15 ml de solución de Ficoll.
4. Se centrifugó la solución a 1200g durante 20 minutos para eliminar principalmente las células sanguíneas. 5. Para evitar la adsorción de células innecesarias, se revistió un filtro de chip microporoso de alta densidad (HD) con una solución de BSA al 0,1% durante 10 minutos, seguido de un enjuague con PBS.
6. Se colocó el sobrenadante del Ficoll en el filtro y se filtró una cantidad mínima de glóbulos rojos restantes por gravedad para aislar secundariamente las células tumorales circulantes de alta pureza. En este caso, no se realizó la centrifugación o un tratamiento como el de las inmunoalmohadillas, con lo que se evita que las células tumorales circulantes resulten dañadas.
7. Se identificaron las células tumorales circulantes aisladas mediante tinción.
Ejemplo 3: Cultivo a corto plazo de células tumorales circulantes aisladas
Las células tumorales circulantes aisladas por el chip microporoso de alta densidad según la presente invención se sembraron en una placa de cultivo de ultra baja fijación recubierta con un hidrogel hidrófilo de carga neutra. La placa de cultivo contenía un medio con 11 ng/ml de insulina, 22 ng/ml de transferrina, 2 ng/ml de EGF y 8 pM de un inhibidor de ROCK, y el cultivo a corto plazo de las células se realizó en una incubadora de cultivos celulares a 37°C bajo 5 a 10% de CO2 durante 14 días desde el inicio del cultivo.
Ejemplo 4: Confirmación de las células tumorales circulantes
Para confirmar, mediante un procedimiento de tinción, que las células tumorales circulantes sometidas a un cultivo a corto plazo según el Ejemplo 3 son células cancerosas, se realizó un proceso de tinción celular utilizando el siguiente procedimiento.
1. Se realizó un proceso de citospin, que es una técnica de citocentrifugación, y se fijaron las células recogidas en un portaobjetos para su tinción.
2. Se realizó un proceso de permeabilización para permitir que el anticuerpo entre en las células.
3. Se realizó un proceso de lavado con PBS.
4. Se produjo BSA al 1% (albúmina de suero bovino) utilizando PBS y se realizó un proceso de bloqueo para reducir la unión no específica y la actividad de la peroxidasa endógena.
5. Se realizó la reacción con EpCAM (molécula de adhesión de células epiteliales; EpCAM-488 (Ratón) (cat# 5198S, Cell Signaling Technology)), CK (citoqueratina; Pan CK-488 (Mouse) (cat# 4523S, Cell Signaling Technology)), vimentina (Vimentin-488 (Conejo) (cat# 9854S, Cell Signaling Technology) y CD (racimo de diferenciación) 45 (Ratón, cat# M0701, Dako) como anticuerpos primarios a temperatura ambiente durante 60 minutos.
6. Se realizó la reacción con anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia, que se unen a los anticuerpos primarios, a temperatura ambiente durante 60 minutos.
7. Se realizó un proceso de lavado con PBS.
8. Para teñir finalmente el núcleo celular, se añadió una solución de DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) y se cubrió la muestra con un cubreobjetos, tras lo cual se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
9. Se calculó la proporción de las células teñidas y la tasa de recuperación celular según un manual mientras se observó las células teñidas.
Ejemplo 5: Análisis de imágenes de fluorescencia de células tumorales circulantes y AXL
1. Se prepararon células tumorales circulantes que fueron marcadas fluorescentemente en el Ejemplo 4 anterior.
2. Se hizo reaccionar las células tumorales circulantes, que fueron marcadas fluorescentemente en el Ejemplo 4, con un anticuerpo primario (Conejo, cat# 8661S, Cell Signaling Technology) específico para AXL, seguido de la reacción con un anticuerpo secundario (Alexa546(Conejo, cat# A11010, Invitrogen)) marcando así fluorescentemente el AXL.
3. Después de la reacción, cárguese cargaron las células tumorales circulantes en un portaobjetos y, a continuación, colóquese colocó el portaobjetos en la plataforma de un analizador de imágenes celulares SmartBiopsy (CIA 020).
4. Se tomaron imágenes de las células en una pluralidad de intervalos de longitud de onda establecidos, seguido de la medición de la intensidad de fluorescencia de las células.
5. Se realizó un primer filtrado midiendo las longitudes de onda de fluorescencia de las células tumorales circulantes y el AXL en la medición de la intensidad de fluorescencia realizada en la pluralidad de intervalos de longitud de onda.
6. Se midieron las longitudes de onda de fluorescencia (azul, verde y rojo) de los marcadores fluorescentes (DAPI, EpCAM, CK y CD45) para el núcleo celular y la membrana de las células tumorales circulantes mediante el primer filtrado.
7. Se realizó un segundo filtrado midiendo el área celular, el tamaño celular y la capacidad de circulación de las células tumorales circulantes para las longitudes de onda de las sustancias fluorescentes unidas a las células tumorales circulantes en las longitudes de onda de fluorescencia medidas.
8. El segundo filtrado incluyó un proceso de exclusión de las células teñidas con CD45 (rojo) mientras se midió y analizó adicionalmente el núcleo de las células tumorales circulantes en la primera imagen filtrada.
9. Se fusionaron la primera imagen filtrada y la segunda imagen filtrada, y luego se realizó un tercer filtrado midiendo y analizando el área, el tamaño de las células y la capacidad de circulación de las células tumorales circulantes.
10. se midió y digitalizó la intensidad de cada longitud de onda de fluorescencia.
Ejemplo comparativo 1: Cambio dependiente del medio en el recuento celular de las células tumorales circulantes cultivadas
Se probó comparativamente la división y el crecimiento de las células tumorales circulantes en un medio de cultivo celular, que se utiliza generalmente en el cultivo celular, y en el medio de cultivo según la presente invención. El medio de cultivo que se utilizó generalmente en el cultivo celular contenía 25 nM de selenito de sodio, 50 nM de hidrocortisona, 0,01 mM de etanolamina, 0,01 mM de fosforiletanolamina, 100 pM de triyodotironina, 05% (p/v) de albúmina de suero bovino, 10 mM de HEPES, 0,5 mM de piruvato sódico, 4,5 mM de L-glutamina y 1X de antibiótico-antimicótico, y el medio de cultivo según la presente invención era el mismo que el del Ejemplo 3. Además, las condiciones de cultivo fueron las mismas que las del ejemplo 3, salvo que se utilizó una placa de cultivo normal.
Con referencia a la FIG. 3, CD45(-) es un biomarcador de las células tumorales circulantes cultivadas, medio de crecimiento normal significa un medio de cultivo celular normal, y medio de crecimiento CG significa el medio de cultivo según la presente invención. La FIG. 3 muestra que el recuento celular de las células tumorales circulantes cultivadas en el medio de cultivo según la presente invención fue mayor. Esto sugiere que el medio de cultivo según la presente invención es más eficaz en la división y el cultivo de células tumorales circulantes que el medio de cultivo normal.
La descripción anterior de la presente invención es ejemplar, y las personas con conocimientos ordinarios en la técnica al que pertenece la presente invención apreciarán que la presente invención puede ser fácilmente modificada en otras formas específicas sin apartarse del espíritu técnico o las características esenciales de la presente invención. Por lo tanto, debe entenderse que las realizaciones ejemplares descritas anteriormente son ejemplares en todos los aspectos y no son restrictivas. Por ejemplo, cada componente descrito para ser de un solo tipo puede ser implementado de manera distribuida. Asimismo, los componentes descritos para ser distribuidos pueden ser implementados de manera combinada.
El alcance de la presente invención está definido por las reivindicaciones descritas a continuación.
[Modo de invención]
En lo que sigue, la presente invención se describirá con referencia a los dibujos adjuntos. En los dibujos, las partes irrelevantes para la descripción se omiten para simplificar la explicación, y los números de referencia similares designan partes similares en toda la memoria.
A lo largo de la memoria, cuando se hace referencia a cualquier porción como "conectada, contactada o acoplada" a otra porción, esto incluye no sólo un caso en el que cualquier porción está "conectada directamente" a otra porción, sino también un caso en el que cualquier porción está "conectada indirectamente" a otra porción con uno o más elementos interpuestos entre las mismas. Además, se deberá entender que cuando se hace referencia a cualquier porción como comprendiendo cualquier componente, puede comprender además uno o más componentes en lugar de excluir otros componentes, a menos que se especifique lo contrario.
Los términos utilizados en la presente memoria son sólo para describir realizaciones específicas y no pretenden limitar el ámbito de la presente invención. Las expresiones singulares incluyen las expresiones plurales, a menos que se especifique lo contrario en su contexto. En la presente memoria, debe entenderse que los términos "comprender", "tener", etc., pretenden denotar la existencia de las mencionadas características, números, etapas, operaciones, componentes, partes o combinaciones de los mismos, pero no excluyen la probabilidad de existencia o adición de una o más características, números, etapas, operaciones, componentes, partes o combinaciones de los mismos.
En lo que sigue, las realizaciones de la presente invención se describirán en detalle con referencia a los dibujos adjuntos.
Un procedimiento para examinar a un paciente con cáncer según un aspecto de la presente invención puede comprender las etapas de: (a) aislar las células tumorales circulantes de una muestra de sangre obtenida previamente de un paciente con cáncer utilizando un biochip; (b) hacer reaccionar las células tumorales circulantes aisladas con un marcador fluorescente, que se une específicamente a las células tumorales circulantes, y un marcador fluorescente que se une específicamente al AXL; (c) recibir imágenes ópticas para una pluralidad de intervalos de longitudes de onda, respectivamente, sobre las células tumorales circulantes, que reaccionaron con los marcadores fluorescentes, y el AXL; (d) realizar un primer filtrado midiendo las intensidades de fluorescencia de las células tumorales circulantes y de los AXL en las imágenes ópticas para la totalidad o parte de la pluralidad de intervalos de longitudes de onda; e) realizar un segundo filtrado midiendo la morfología de las células tumorales circulantes en las imágenes ópticas para la totalidad o parte de la pluralidad de intervalos de longitudes de onda y (f) realizar un tercer filtrado midiendo la morfología de las células tumorales circulantes en una imagen combinada obtenida mediante la fusión de todas o parte de las imágenes ópticas bajo la pluralidad de intervalos de longitud de onda respectivos cuando el cáncer tiene una resistencia adquirida a un inhibidor del EGFR.
Las células tumorales circulantes (CTC) son células tumorales que se encuentran en la sangre periférica de pacientes con tumores malignos. Las células tumorales circulantes son muy raras y la cantidad de muestras disponibles es muy limitada. Las técnicas para la detección y caracterización de las células cancerosas circulantes en la sangre incluyen, entre otras, los procedimientos de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcriptasa inversa múltiple, los enfoques basados en imágenes, las técnicas de microfiltración y los dispositivos de microchips. Las células tumorales circulantes son muestras de biopsia líquida y pueden actuar como biomarcadores tumorales que inevitablemente pueden proporcionar un tratamiento individualizado y un seguimiento posterior al tratamiento. Además, las células tumorales circulantes pueden utilizarse como objetivos para comprender las características biológicas de los tumores y la siembra de células tumorales, pero no se limitan a ello. Según una realización de la presente invención, el cáncer puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón, cáncer de mama, leucemia mieloide, leucemia linfocítica crónica, cáncer colorrectal, adenocarcinoma de esófago, cáncer gástrico, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de tiroides, glioma, cáncer de riñón, melanoma, mesotelioma pleural maligno, carcinoma de células escamosas y cáncer de endometrio. Según una realización de la presente invención, las células tumorales circulantes pueden ser células derivadas del cáncer de pulmón. Según una realización preferente de la presente invención pueden ser células derivadas de cáncer de pulmón de células no pequeñas.
El biochip es un dispositivo híbrido fabricado en forma de chip semiconductor existente mediante la integración y combinación de sustancias, como ADN derivado de organismos, proteínas, enzimas, anticuerpos, microorganismos, células y órganos animales y vegetales, y neuronas, en un sustrato sólido realizado de un material inorgánico como un semiconductor. El biochip se refiere a una herramienta o dispositivo que utiliza las funciones inherentes a las biomoléculas para obtener información biológica, como patrones de expresión de genes, unión de genes o distribuciones de proteínas, o que acelera los procesos y reacciones bioquímicas o el procesamiento de la información.
El chip microporoso de alta densidad se refiere a un biochip capaz de aislar una sustancia que tiene un tamaño específico basado en el principio de funcionamiento del biochip.
El chip microporoso de alta densidad se basa en la diferencia de tamaño de las células sanguíneas y puede capturar las células tumorales circulantes con una tasa de recuperación de aproximadamente el 90% en 10 minutos.
El tamaño de los poros del chip microporoso de alta densidad puede ser preferentemente de 5,5 a 8,5 pm, más preferentemente de 6,5 a 7,5 pm. Si el tamaño del poro es inferior a 5,5 pm, los glóbulos rojos y los glóbulos blancos no pueden extraerse, porque estas células permanecen en el chip sin atravesarlo, y si el tamaño del poro es superior a 8,5 pm, las células tumorales circulantes no pueden recuperarse de forma selectiva, porque el tamaño del poro es superior al de las células tumorales circulantes y, por tanto, las células tumorales circulantes atraviesan el chip. La forma de los poros del chip microporoso de alta densidad puede ser circular, rectangular o elíptica, preferentemente rectangular.
Los poros del chip microporoso de alta densidad pueden estar dispuestos en un patrón regular. El chip microporoso de alta densidad puede ser específicamente de acero inoxidable, níquel, aluminio o cobre. Los poros pueden formarse mediante el grabado con tecnología MEMS (sistemas microelectromecánicos).
El espacio entre dos poros adyacentes de los poros es más estrecho que el diámetro de las células tumorales circulantes. El espacio entre los dos poros puede ser del 45 al 65% en relación con el diámetro de las células tumorales circulantes. El chip microporoso de alta densidad no se deforma por la presión de la sangre o la solución que fluye por el canal.
Después de pasar por los poros, la sangre es descargada al exterior y las células tumorales circulantes en la sangre permanecen en la superficie del chip sin pasar por los poros. Según una realización de la presente invención, puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón, cáncer de mama, leucemia mieloide, leucemia linfocítica crónica, cáncer colorrectal, adenocarcinoma de esófago, cáncer gástrico, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de tiroides, glioma, cáncer de riñón, melanoma, mesotelioma pleural maligno, carcinoma de células escamosas y cáncer de endometrio. Según una realización de la presente invención, las células tumorales circulantes pueden ser células derivadas del cáncer de pulmón. Según una realización preferente de la presente invención pueden ser células derivadas de cáncer de pulmón de células no pequeñas.
Las células no objetivo, es decir, los glóbulos rojos que tienen una mayor tasa de deformación que las células tumorales circulantes, pasan fácilmente a través de los poros.
Después de la filtración de las células tumorales circulantes, las células tumorales circulantes pueden ser descargadas al exterior mediante el suministro de una solución en dirección inversa o hacia adelante.
La solución puede suministrarse en sentido inverso para minimizar el daño a las células cancerosas tumorales circulantes. La solución puede ser suministrada por una jeringa, una bomba de jeringa, una bomba de émbolo, o similares. La solución puede estar compuesta por un diluyente, agua y ácido diluyente, que diluyen la sangre. Las células tumorales circulantes descargadas al exterior mediante el suministro de la solución pueden recogerse fácilmente en un recipiente, por ejemplo, un tubo de ensayo o una placa de cultivo.
Mientras tanto, las células tumorales circulantes que tienen un diámetro de 7,5 a 15 pm pasan a través de un tubo que tiene un diámetro de 8 pm cuando se aplica a éste una presión de aproximadamente 100 mmHg. Las células tumorales circulantes con un diámetro de 15 pm, que pasan a través del tubo de 8 pm de diámetro, tienen una tasa de deformación de aproximadamente el 53%. El espacio entre dos poros es preferiblemente de 4 pm o menos en consideración a la tasa de deformación de las células tumorales circulantes cuando las células tumorales circulantes que tienen un diámetro de 7,5 pm son descargadas al exterior por medio de un lavado a contracorriente, es decir, permitiendo que la solución fluya en una dirección opuesta al flujo de la sangre. Se sabe que las células del cáncer de pulmón de células no pequeñas y del cáncer de mama, por ejemplo, tienen un diámetro que alcanza unos 40 pm. Teniendo en cuenta la tasa de deformación de las células cancerosas circulantes que tienen un diámetro de 40 pm durante el lavado a contracorriente, la separación entre dos poros se establece preferentemente en 21 pm o menor. Cuando las células cancerosas circulantes que tienen un diámetro de 7,5 pm están presentes entre dos poros que tienen una separación mayor de 4 pm, las células tumorales circulantes pueden no desprenderse de la superficie al ser deformadas por el flujo de la solución. Además, las células tumorales que tienen un diámetro de 40 pm tampoco pueden desprenderse de la superficie entre dos poros que tienen una separación mayor de 21 pm. En el chip microporoso de alta densidad según la presente invención, el espacio entre dos poros es del 45 al 65% del diámetro de las células tumorales circulantes en consideración a la presión de la solución. Si el espaciado es mayor del 65%, es decir, mayor de aproximadamente 4,9 pm, las células cancerosas circulantes que tienen un diámetro de 7,5 pm no pueden desprenderse de la superficie entre dos poros mediante el lavado posterior. Si la separación es superior al 65%, es decir, superior a 26 pm, es posible que las células tumorales circulantes con un diámetro de 40 pm no se desprendan de la superficie entre dos poros mediante el lavado posterior. Si se aumenta la presión de la solución para desprender por la fuerza las células tumorales circulantes adheridas a la superficie entre dos poros, se pueden producir daños en las células tumorales circulantes, lo que reduce la tasa de recogida de células tumorales circulantes vivas. Si el espacio para las células cancerosas circulantes que tienen un diámetro de 7,5 pm es inferior al 45%, es decir, más pequeño que unos 3,375 pm, es muy probable que el chip microporoso de alta densidad se dañe por el flujo de la sangre y la solución.
La muestra puede pasar repetidamente por el chip microporoso de alta densidad. Específicamente, después de que las células tumorales circulantes se aíslen una vez del chip microporoso de alta densidad, las células tumorales circulantes aisladas pueden cargarse de nuevo en el chip microporoso de alta densidad y aislarse, y el proceso de aislamiento puede repetirse.
El aislamiento de las células tumorales circulantes a través del chip microporoso de alta densidad no se realiza aplicando una presión artificial específica después de cargar la solución que contiene las células tumorales circulantes en el chip microporoso de alta densidad, sino que puede realizarse utilizando la gravedad. El aislamiento de las células tumorales circulantes a través del chip microporoso de alta densidad según la presente invención puede minimizar el daño causado a las células tumorales circulantes por la presión artificial, manteniendo así las células tumorales circulantes en el mismo estado que cuando estas células están presentes en el cuerpo del paciente.
En una realización de la presente invención, el chip microporoso de alta densidad puede estar recubierto con un material específico para minimizar el daño causado a las células tumorales circulantes por el chip microporoso de alta densidad durante el aislamiento de las células cancerosas tumorales circulantes, o para hacer más eficiente el uso repetido del chip microporoso de alta densidad, o para hacer más eficiente la recuperación de las células tumorales circulantes. Específicamente, el material específico puede ser un anticuerpo que pueda unirse específicamente a las células tumorales circulantes, y también puede ser cualquier biomaterial que no dañe física o químicamente las células. Según una realización de la presente invención, el material específico puede ser BSA (albúmina de suero bovino). También se describe aquí un anticuerpo. El anticuerpo puede estar compuesto, por ejemplo, por un anticuerpo contra la molécula de adhesión de células epiteliales (anticuerpo anti-EpCAM), un anticuerpo contra la citoqueratina (anticuerpo anti-CK), o similares. Según una realización preferente de la presente invención, el material específico puede ser BSA (albúmina de suero bovino).
La solución de BSA (albúmina de suero bovino) se refiere a la albúmina de suero bovino. Es una proteína con un peso molecular de aproximadamente 66,4 kDa, que se encuentra abundantemente en la mayoría de los animales. La BSA puede añadirse como nutriente a las células durante el cultivo celular en bioquímica/biología, y también se utiliza frecuentemente como estándar para obtener una curva de calibración en la cuantificación de proteínas. Además, dado que cuando se utiliza una enzima de restricción es necesario utilizar una pequeña cantidad de enzima (proteína), la BSA también puede añadirse para complementar la concentración de la proteína en una solución. Además, en diversos experimentos bioquímicos (Western blot, inmunocitoquímica, ELISA, etc.), la BSA también puede utilizarse para evitar la unión inespecífica, es decir, para evitar que un anticuerpo específico se una a una proteína no deseada o a una posición no deseada, antes de que el anticuerpo específico se una a una proteína que debe detectarse.
Se puede utilizar la centrifugación para permitir que la sangre periférica reaccione con el chip microporoso de alta densidad recubierto con la solución de BSA, eliminando así los biopolímeros distintos de las células tumorales circulantes. El aislamiento de las células tumorales circulantes mediante el chip microporoso de alta densidad puede realizarse utilizando la gravedad. Específicamente, el aislamiento puede realizarse bajo una presión atmosférica 1000 hPa a 1020 hPa. Preferiblemente, se puede realizar bajo una presión atmosférica 1000 hPa a 1015 hPa. Más preferentemente, puede realizarse bajo una presión atmosférica 1000 hPa a 1013 hPa.
La solución de BSA puede recubrirse en la superficie superior o inferior del chip microporoso de alta densidad o en la superficie interior de los poros. Preferiblemente, la solución de BSA puede recubrirse no sólo en la superficie superior e inferior del chip microporoso de alta densidad, sino también en la superficie interior de los poros.
El recubrimiento con la solución de BSA puede realizarse a una concentración de BSA de 0,05 a 0,15%. El recubrimiento con la solución de BSA puede realizarse con una concentración de BSA del 0,08 al 0,012%.
El recubrimiento con la solución de BSA puede realizarse durante 5 a 15 minutos. El recubrimiento con la solución de BSA puede realizarse durante 8 a 12 minutos.
Con referencia a la FIG. 1, para eliminar primero las células sanguíneas de la sangre del paciente, se añade un polímero de anticuerpos a la sangre recogida del paciente y luego se mezcla bien, seguido de una reacción a temperatura ambiente. A continuación, se añade una solución de PBS que contiene un 1% de FBS, se coloca la solución de Ficoll sobre la solución de reacción y, a continuación, se eliminan principalmente las células sanguíneas por centrifugación. Después de que las células sanguíneas que son innecesarias en la presente invención se eliminan principalmente como se ha descrito anteriormente, los glóbulos rojos se filtran utilizando el chip microporoso de alta densidad especialmente recubierto con la solución de BSA, aislando así las células tumorales circulantes altamente puras. Las células tumorales circulantes aisladas se identifican mediante tinción. Cuando se utiliza el chip microporoso de alta densidad recubierto con BSA, las células tumorales circulantes que se van a aislar en la presente invención pueden ser aisladas con un daño mínimo a las células tumorales circulantes.
Según una realización de la presente invención, después de la etapa de aislar las células tumorales circulantes de la sangre mediante el uso del biochip, se puede realizar además una etapa de cultivo a corto plazo de las células tumorales circulantes aisladas.
En una realización de la presente invención, un medio de cultivo que se utiliza en el cultivo a corto plazo puede estar compuesto por al menos tres seleccionados del grupo que consiste en insulina, transferrina, EGF (factor de crecimiento epidérmico) y un inhibidor de ROCK (Rho quinasa).
La insulina es una de las hormonas metabólicas humanas, es secretada por las células beta de la Isla de Langerhans del páncreas (órgano) y sirve para mantener el nivel de glucosa en sangre en un nivel constante. Cuando el nivel de azúcar en la sangre se eleva por encima de un determinado nivel, la insulina se segrega y promueve la acción de introducir la glucosa de la sangre en las células y almacenarla de nuevo en forma de polisacárido (glucógeno). Como el medio de cultivo que se utiliza en la etapa de cultivo a corto plazo según la presente invención contiene insulina, puede promover aún más el crecimiento y la división celular durante el cultivo de células tumorales circulantes en comparación con un medio de cultivo convencional para cultivar células tumorales circulantes.
El contenido de la insulina puede ser de 3 a 50 ng/ml, de 3 a 45 ng/ml, de 3 a 40 ng/ml, de 3 a 30 ng/ml, de 4 a 50 ng/ml, de 4 a 45 ng/ml, de 4 a 30 ng/ml, de 5 a 50 ng/ml, de 5 a 45 ng/ml, o de 5 a 30 ng/ml.
La transferrina, un tipo de p-globulina, es una proteína transportadora de hierro que se une a los iones de hierro trivalente de dos moléculas absorbidas en el suero y suministra el hierro necesario para la proliferación celular o la producción de hemoglobina a las células a través del receptor de transferrina. Más del 99% del hierro del suero se une a la transferrina, y normalmente alrededor de un tercio de la transferrina puede unirse al hierro. Como el medio de cultivo que se utiliza en la etapa de cultivo a corto plazo según la presente invención contiene la transferrina, puede promover aún más el crecimiento y la división celular durante el cultivo de células tumorales circulantes en comparación con un medio de cultivo convencional para cultivar células tumorales circulantes.
El contenido de la transferrina puede ser de 3 a 50 ng/ml, de 3 a 45 ng/ml, de 3 a 40 ng/ml, de 3 a 30 ng/ml, de 4 a 50 ng/ml, de 4 a 45 ng/ml, de 4 a 30 ng/ml, de 5 a 50 ng/ml, de 5 a 45 ng/ml, o de 5 a 30 ng/ml.
El factor de crecimiento epidérmico (EGF) es un factor de crecimiento polipeptídico que se une al receptor del factor de crecimiento epidérmico y promueve el crecimiento y la división celular. Además, el factor de crecimiento epidérmico puede inducir la ornitina descarboxilasa además de promover la síntesis de proteínas o de ARN. Como el medio de cultivo que se utiliza en la etapa de cultivo a corto plazo según la presente invención contiene el factor de crecimiento epidérmico, puede promover aún más el crecimiento y la división celular durante el cultivo de células tumorales circulantes en comparación con un medio de cultivo convencional para cultivar células tumorales circulantes. El contenido del factor de crecimiento epidérmico puede ser de 0,5 a 10 ng/ml, de 0,5 a 9 ng/ml, de 0,5 a 8 ng/ml, de 0,5 a 7 ng/ml, de 0,5 a 6 ng/ml, de 0,5 a 5 ng/ml, de 0,7 a 10 ng/ml, de 0,7 a 9 ng/ml, 0,7 a 8 ng/ml, 0,7 a 7 ng/ml, 0,7 a 6 ng/ml, 0,7 a 5 ng/ml, 1 a 10 ng/ml, 1 a 9 ng/ml, 1 a 8 ng/ml, 1 a 7 ng/ml, 1 a 6 ng/ml, o 1 a 5 ng/ml. El inhibidor de la proteína quinasa asociada a Rho (ROCK) se refiere a un compuesto capaz de dirigirse a la Rho quinasa (ROCK) e inhibir o disminuir la función de la Rho quinasa. La Rho quinasa es una quinasa perteneciente a la familia AGC de serina-treonina quinasas (PKA/PKG/PKC). La Rho quinasa participa en el proceso de control del movimiento y la morfología de las células actuando sobre el citoesqueleto. En concreto, la quinasa Rho puede actuar como regulador de la migración celular y de la organización de la actina. La Rho quinasa está relacionada con enfermedades neurodegenerativas como la diabetes, la enfermedad cerebrovascular hemorrágica y la enfermedad de Parkinson, y el inhibidor de la Rho quinasa puede utilizarse para el tratamiento y la supresión de las enfermedades relacionadas con la Rho quinasa.
El inhibidor de ROCK puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en Fasudil, Ripasudil, RKI-1447 e Y27632. El Fasudil es uno de los inhibidores de ROCK, y puede utilizarse para el tratamiento del espasmo cerebrovascular y también puede ser eficaz en el tratamiento de la hipertensión pulmonar. El Ripasudil, un derivado del Fasudil, puede actuar como un inhibidor de ROCK y también puede utilizarse para el tratamiento del glaucoma o la hipertensión ocular. El RKI-1447 puede suprimir ROCK1 y ROCK2. El Y27632 puede atravesar las células y suprimir ROCK1 y ROCK2 al competir con el ATP por la unión al sitio catalítico de la enzima.
El inhibidor de ROCK puede ser de 3 a 30 pM, de 3 a 27 pM, de 3 a 24 pM, de 3 a 21 pM, de 4 a 20 pM, de 4 a 30 |jM, de 4 a 27 pM, de 4 a 24 pM, de 4 a 21 pM, de 4 a 20 pM, de 5 a 30 pM, de 5 a 27 pM, de 5 a 24 pM, de 5 a 21 pM, o de 5 a 20 pM.
La placa de cultivo que se utiliza en el cultivo a corto plazo según la presente invención puede tener una superficie que impida la adhesión celular. Las células tumorales circulantes pueden cultivarse en estado de suspensión, por lo que la superficie de la placa de cultivo puede estar recubierta para evitar la adhesión celular. La superficie de la placa de cultivo puede estar recubierta de un hidrogel. El hidrogel se refiere a un gel que contiene agua como medio de dispersión, y se forma cuando el hidrosol pierde su fluidez debido al enfriamiento o cuando un polímero hidrófilo que tiene una estructura de red tridimensional y una estructura microcristalina se hincha por el agua que contiene. Específicamente, el hidrogel es un polímero hidrófilo reticulado por interacciones tales como enlaces covalentes, enlaces de hidrógeno, enlaces de Van der Waals o enlaces físicos, y es un material que tiene una estructura de red polimérica tridimensional capaz de hincharse en una solución acuosa por una gran cantidad de agua contenida en ella. En un estado en el que el hidrogel absorbe agua como se ha descrito anteriormente, el hidrogel muestra un comportamiento similar al de un tejido corporal vivo. El hidrogel puede sufrir una transición de fase con un cambio de temperatura, pH o similar, y por lo tanto la tasa de hinchamiento del mismo puede cambiar de forma discontinua. El hidrogel puede utilizarse para lentes de contacto, electrodos médicos y cultivos celulares. El hidrogel puede estar recubierto covalentemente en la placa de cultivo y puede impedir que las células tumorales circulantes se adhieran a la superficie de la placa de cultivo. El hidrogel puede tener hidrofilia mientras tiene una carga neutra. La expresión "tener la carga neutra" significa que la carga no es ni positiva ni negativa, y el término "hidrofilia" se refiere a una fuerte afinidad por el agua, y significa que el hidrogel puede disolverse fácilmente en agua.
En una realización de la presente invención, la etapa de cultivo a corto plazo puede realizarse durante 1 a 15 días desde el inicio del cultivo. En otra realización de la presente invención, puede realizarse durante 5 a 15 días, preferiblemente de 10 a 15 días. Incluso es preferible que se realice durante 12 a 15 días.
El marcador fluorescente que se une específicamente a las células tumorales circulantes se refiere a una sustancia fluorescente que puede unirse específicamente a las propias células tumorales circulantes o a sustancias presentes dentro o fuera de las células tumorales circulantes. Según una realización de la presente invención, el marcador fluorescente capaz de identificar las células tumorales circulantes puede unirse específicamente al núcleo celular o unirse específicamente a la proteína, el ADN, el ARN o similares presentes dentro o fuera de las células. Específicamente, para la unión al núcleo celular, se puede utilizar DAPI como marcador fluorescente. Además, se puede utilizar un marcador fluorescente que se une específicamente a la vimentina, una proteína de filamento intermedio. Además, se puede utilizar un marcador fluorescente que se une específicamente a la molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM) y a la citoqueratina (CK), y también se puede utilizar un marcador fluorescente que se une específicamente a la CD45, que se utiliza como medio para eliminar las células no objetivo. El marcador fluorescente que se une específicamente a las células tumorales circulantes puede estar compuesto por un nucleótido, un oligonucleótido, un péptido, un polipéptido, un ácido nucleico o una proteína, y puede ser preferentemente un anticuerpo compuesto por proteínas. El marcador fluorescente que se une específicamente a las células tumorales circulantes puede ser cualquier sustancia que permita identificar las células tumorales circulantes mediante su unión específica a las mismas.
El AXL se refiere al receptor tirosina quinasa (RTK) AXL, y es un miembro de la familia TAM (TYRO3-AXL-MER) de receptores tirosina quinasas (RTK). Se sabe que el RTK está implicado en la carcinogénesis y es también un objetivo de la terapia anticancerosa. El AXL puede expresarse significativamente en el cáncer en comparación con los tejidos normales y se sabe que está implicado en la metástasis del cáncer. Además, el AXL puede estar significativamente implicado en la resistencia adquirida a la terapia EGFR-TKI. La mayoría de las vías de señalización mediadas por AXL se producen a través de un proceso dependiente de ligando mediado por GAS6. Según la presente invención, el cáncer tiene una resistencia adquirida al EGFR-TKI que es un inhibidor del EGFR. El EGFR-TKI puede ser, por ejemplo, gefitinib o erlotinib. Además, el inhibidor del EGFR puede ser un anticuerpo monoclonal, concretamente cetuximab, panitumumab o matuzumab.
El marcador fluorescente que se une específicamente al AXL puede ser una sustancia fluorescente que puede unirse específicamente al a Xl . Específicamente, puede ser un anticuerpo que pueda unirse específicamente al AXL. De acuerdo con la presente invención, los pacientes con cáncer (por ejemplo, pacientes con cáncer de pulmón) que tienen resistencia al fármaco anticanceroso EGFR-TKI se examinan mediante el análisis de imagen del AXL y las células tumorales circulantes. Según un aspecto, el análisis de imagen del AXL y de las células tumorales circulantes permite predecir el pronóstico de los pacientes con cáncer (por ejemplo, pacientes con cáncer de pulmón) o realizar el diagnóstico y el análisis de la evolución de, por ejemplo, el cáncer de pulmón.
Las imágenes ópticas pueden ser generadas por un sistema de formación de imágenes. El sistema de formación de imagenes puede ser un sistema de formación de imágenes de células. El sistema de formación de imágenes de células es un sistema configurado para colocar células teñidas en una plataforma, como un portaobjetos de vidrio, y observar y obtener imágenes de las células en varias longitudes de onda. El sistema de formación de imagenes de células puede incluir un módulo de recuento celular automatizado, un módulo de análisis de la intensidad de la fluorescencia y un módulo de clasificación/conocimiento celular basado en la citología. Además, como funciones de comodidad para el usuario, se pueden incluir como interfaces de usuario una función de medición, una función de generación automática de informes y una función de gestión de BD. Este sistema de formación de imágenes de células incluye un equipo de análisis de imágenes digitales para distinguir las células, los medios de cultivo, los desechos y similares, y para identificar y contar las células deseadas por un usuario. El sistema de formación de imagenes de células puede identificar y contar con precisión las células objetivo marcadas con fluorescencia o unidas a marcadores a partir de imágenes ópticas.
Las imágenes ópticas pueden ser imágenes ópticas obtenidas por la luz reflejada de un objeto. Las imágenes ópticas de las células pueden ser emitidas por el sistema de formación de imágenes de células y pueden incluir imágenes de células, restos y similares en el fondo. Dichas imágenes ópticas pueden proporcionarse como un único archivo de imagen realizado mediante la unión de una pluralidad de imágenes divididas para las respectivas gamas de longitudes de onda específicas. Aquí, las imágenes ópticas bajo la pluralidad de intervalos de longitud de onda pueden incluir una imagen de intervalo de longitud de onda azul, una imagen de intervalo de longitud de onda verde y una imagen de intervalo de longitud de onda roja. La imagen óptica para el intervalo de longitud de onda azul es particularmente útil para la identificación del núcleo de las células tumorales circulantes, y las imágenes ópticas para los intervalos de longitud de onda verde y roja son particularmente útiles para la identificación de la membrana de las células tumorales circulantes. Además, es posible identificar sondas o marcadores fluorescentes específicos utilizando los intervalos de longitud de onda de varios colores.
En el primer filtrado o en el segundo filtrado, si la identificación de las células tumorales circulantes o de los AXL no se logra a un nivel deseado, es posible realizar el filtrado de los datos de la imagen óptica y realizar el primer filtrado o el segundo filtrado una vez más, y también es posible realizar el filtrado de datos una pluralidad de veces. Además, después de realizar el primer filtrado o el segundo filtrado, los datos de la imagen pueden ser almacenados y emitidos.
Además, después de realizar la primera etapa de filtrado y la segunda etapa de filtrado en la imagen óptica para el primer intervalo de longitudes de onda, se puede realizar además una o más de las etapas de filtrado primera y segunda en la imagen óptica para el segundo intervalo de longitudes de onda diferente del primer intervalo de longitudes de onda.
Por ejemplo, el primer intervalo de longitud de onda puede ser un intervalo de longitud de onda azul, y el segundo intervalo de longitud de onda puede ser un intervalo de longitud de onda verde o roja. En este caso, el núcleo de las células tumorales circulantes puede identificarse realizando el primer proceso de filtrado y el segundo proceso de filtrado en la imagen del intervalo de longitud de onda azul. Además, la membrana celular de las células tumorales circulantes puede identificarse realizando un primer proceso de filtrado en una o más de las imágenes de la gama de longitudes de onda verdes y de la gama de longitudes de onda rojas. Estos primeros y segundos procesos de filtrado permiten identificar con precisión las células a partir de la imagen óptica. Por ejemplo, las imágenes de la gama de longitudes de onda verde y roja aumentan la identificación de las células objetivo, por ejemplo, los glóbulos blancos y las células tumorales. La FIG. 5 muestra fotografías de muestra de una imagen de intervalo de longitud de onda azul (a), una imagen de intervalo de longitud de onda verde (b) y una imagen de intervalo de longitud de onda roja (c) para células tumorales circulantes reales.
Mientras tanto, en el segundo proceso de filtrado, se mide la morfología de las células tumorales circulantes. Aquí, la morfología de las células tumorales circulantes puede incluir una o más de las áreas celulares, el tamaño de las células (diámetro) y la capacidad de circulación de las células.
En una realización de la invención, la medición de la intensidad de fluorescencia del AXL se realiza midiendo la intensidad de fluorescencia en la imagen óptica de toda o parte de una pluralidad de intervalos de longitudes de onda resultantes del marcador de fluorescencia que se une específicamente al AXL, y se puede realizar un primer filtrado del mismo.
El proceso de realizar el primer filtrado midiendo la intensidad de fluorescencia de las células tumorales circulantes distintas del AXL se describirá ahora con más detalle. El primer filtrado puede realizarse midiendo el tamaño de las células en una imagen óptica de todo o parte de una pluralidad de intervalos de longitudes de onda y, a continuación, estableciendo un área poligonal o circular, que es mayor que el tamaño de las células medido en una proporción o cantidad predeterminada, y midiendo la intensidad de fluorescencia de las células dentro de esta área. La FIG. 7 muestra los resultados de la medición de la morfología y la intensidad de la fluorescencia de las células tumorales circulantes unidas con varios tintes o marcadores fluorescentes. En concreto, la FIG. 7 muestra un caso en el que el núcleo de las células se tiñó con DAPI (a), un caso en el que se utilizó vimentina como marcador (b), un caso en el que se utilizó una molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM) y citoqueratina (CK) como marcadores (c), y un caso en el que se utilizó CD45 como marcador o medio para eliminar las células no objetivo (d). En cada uno de los casos, el primer filtrado puede realizarse midiendo el tamaño de las células en la imagen óptica para la gama de longitudes de onda azules, por ejemplo, y luego fijando un rectángulo que tenga un tamaño que sea al menos un 10% mayor que el tamaño medido, y midiendo la intensidad de fluorescencia de las células dentro de este rectángulo. Posteriormente, en las imágenes ópticas para las gamas de longitudes de onda de otros colores, por ejemplo, el verde, el rojo y el amarillo, se puede realizar la medición de la intensidad de la fluorescencia dentro de las áreas que tienen las mismas coordenadas y tamaños. 7(a) a 7(d) muestran imágenes para los intervalos de longitud de onda azul, verde, amarillo y rojo, respectivamente, y la FIG. 7(e) muestra los resultados de la medición de la intensidad de la fluorescencia en cada imagen de intervalo de longitud de onda.
En la tercera etapa de filtrado, el tercer filtrado se realiza midiendo la morfología de las células tumorales circulantes en una imagen combinada obtenida al fusionar todas o parte de las imágenes ópticas bajo la pluralidad de intervalos de longitud de onda. En este caso, la morfología de las células tumorales circulantes puede incluir una o más de las áreas celulares, el tamaño de las células y la capacidad de circulación de las mismas.
Por ejemplo, como se muestra en la FIG. 6, el tercer filtrado puede realizarse generando una imagen combinada mediante la fusión de la imagen de la gama de longitudes de onda azules, la imagen de la gama de longitudes de onda verdes y la imagen de la gama de longitudes de onda rojas, y midiendo la morfología de las células tumorales circulantes a partir de la imagen combinada.
El tercer filtrado puede realizarse sobre la totalidad de las células cancerosas tumorales circulantes, y también puede realizarse adicionalmente sobre las células que han sido difíciles de identificar en el primer y segundo proceso de filtrado. Si se requiere una identificación adicional, se puede realizar un filtrado de datos por separado o también se puede realizar el tercer filtrado varias veces.
El análisis de la imagen puede ser ejecutado por un programa informático. Este programa informático puede implementarse utilizando uno o más ordenadores de propósito general o especial, como un procesador, un controlador, una unidad aritmética lógica (ALU), un procesador de señales digitales, un microordenador, una matriz de puertas programables en campo (FPGA), una unidad lógica programable (PLU), un microprocesador o cualquier otro dispositivo capaz de ejecutar y responder a instrucciones.
La FIG. 8 muestra un ejemplo de conducción de un programa que implementa el análisis de imágenes, que es un ejemplo de interfaz de usuario de un software de análisis que implementa el análisis de imágenes ópticas mediante un algoritmo. Con este software, la identificación y el recuento de células pueden realizarse automáticamente en poco tiempo.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para examinar a un paciente con cáncer, el procedimiento comprende las etapas de:
aislar las células tumorales circulantes de una muestra de sangre obtenida previamente del paciente con cáncer mediante un biochip;
hacer reaccionar las células tumorales circulantes aisladas con un marcador fluorescente que se une específicamente a las células tumorales circulantes y un marcador fluorescente que se une específicamente al AXL;
recibir imágenes ópticas de las células tumorales circulantes reaccionadas con el marcador fluorescente específico de las células tumorales circulantes y del AXL reaccionado con el marcador fluorescente específico del AXL bajo una pluralidad de intervalos de longitudes de onda, respectivamente;
realizar un primer filtrado midiendo las intensidades de fluorescencia de las células tumorales circulantes y del AXL en las imágenes ópticas bajo la totalidad o parte de la pluralidad de intervalos de longitudes de onda;
realizar un segundo filtrado midiendo la morfología de las células tumorales circulantes en las imágenes ópticas bajo todo o parte de la pluralidad de intervalos de longitudes de onda; y
realizar un tercer filtrado midiendo la morfología de las células tumorales circulantes en una imagen combinada obtenida al fusionar todas o parte de las imágenes ópticas bajo la pluralidad de intervalos de longitud de onda respectivos,
en el que el cáncer tiene una resistencia adquirida a un inhibidor del EGFR.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el marcador fluorescente que se une específicamente a las células tumorales circulantes es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo específico para vimentina, un anticuerpo específico para EpCAM y un anticuerpo específico para CK.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las imágenes ópticas bajo la pluralidad de intervalos de longitud de onda en la etapa de recibir las imágenes ópticas incluyen una imagen de intervalo de longitud de onda azul, una imagen de intervalo de longitud de onda verde y una imagen de intervalo de longitud de onda roja.
4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que un núcleo de las células tumorales circulantes se identifica realizando, en la imagen de intervalo de longitud de onda azul, la etapa de realizar el primer filtrado y la etapa de realizar el segundo filtrado.
5. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que una membrana de las células tumorales circulantes se identifica realizando, en una o más de la imagen de intervalo de longitud de onda verde y la imagen de intervalo de longitud de onda roja, la etapa de realizar el primer filtrado.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la morfología de las células tumorales circulantes incluye una o más de las áreas celulares, el tamaño celular y la capacidad de circular.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de realizar el primer filtrado comprende las etapas de:
medir el tamaño de las células tumorales circulantes en las imágenes ópticas bajo todo o parte de la pluralidad de intervalos de longitudes de onda; y
establecer un área poligonal o circular, que sea mayor que el tamaño medido de las células tumorales circulantes en una proporción o cantidad predeterminada, y realizar el primer filtrado midiendo la intensidad de fluorescencia de las células tumorales circulantes dentro del área.
8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el cáncer es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón, cáncer de mama, leucemia mieloide, leucemia linfocítica crónica, cáncer colorrectal, adenocarcinoma de esófago, cáncer gástrico, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de tiroides, glioma, cáncer de riñón, melanoma, mesotelioma pleural maligno, carcinoma de células escamosas y cáncer de endometrio.
9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el cáncer es un cancer de pulmón.
10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el cáncer es un cáncer de pulmón de células no pequeñas.
11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de aislar las células tumorales circulantes se realiza bajo una presión atmosférica de 1000 hPa a 1020 hPa.
12. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el biochip es un chip microporoso de alta densidad recubierto con una solución de BSA.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el chip microporoso de alta densidad es un chip basado en el tamaño.
14. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el recubrimiento con una solución de BSA se realiza a una concentración de BSA de 0,05 a 0,15%.
15. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que se realiza una etapa de cultivo a corto plazo de las células tumorales circulantes aisladas durante 1 a 15 días desde el inicio del cultivo antes de hacer reaccionar las células tumorales circulantes aisladas con los marcadores fluorescentes.
16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que un medio de cultivo utilizado en el cultivo a corto plazo está compuesto por al menos tres seleccionados del grupo que consiste en insulina, transferrina, EGF (factor de crecimiento epidérmico) y un inhibidor de ROCK (Rho quinasa).
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