ES2923148T3

ES2923148T3 - Formulación y método de preparación

Info

Publication number: ES2923148T3
Application number: ES19713467T
Authority: ES
Inventors: Marit Swärd Nordmo Kiserud
Original assignee: GE Healthcare AS
Current assignee: GE Healthcare AS
Priority date: 2018-03-26
Filing date: 2019-03-26
Publication date: 2022-09-23
Anticipated expiration: 2039-03-26
Also published as: JP2021519300A; PL3773750T3; AU2019246196A1; BR112020019367A2; CA3094571A1; SG11202009315WA; EP3773750A1; PT3773750T; AU2019246196B2; SI3773750T1; MX2020010130A; SMT202200278T1; LT3773750T; KR20200136007A; JP2024045106A; EP3773750B1; GB201804835D0; HRP20220850T1; HUE059216T2; RU2020134801A

Abstract

Se describen formulaciones para administración humana o animal y un método de preparación de las mismas. En particular, se describen formulaciones farmacéuticas más estables, como las de administración intravenosa, y un método de preparación de las mismas. También se describen formulaciones liofilizadas que tienen un ingrediente farmacéutico activo (API), un agente tampón y un lioprotector, en las que el API es un agente de formación de imágenes que comprende al menos un péptido de unión a cMet, adecuado para obtener imágenes ópticas del cuerpo de un mamífero in vivo. También se describen un método para preparar una formulación liofilizada, una composición farmacéutica y un kit para la preparación de la composición farmacéutica. Se describen además métodos de obtención de imágenes que utilizan la formulación o composición farmacéutica, como en la detección, diagnóstico, cirugía, estadificación, tratamiento, monitorización del tratamiento, monitorización de la progresión de la enfermedad o monitorización de la terapia de afecciones como el cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Formulación y método de preparación

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una formulación para administración a seres humanos o animales y a un método de preparación de la misma. En particular, la presente invención se refiere a formulaciones farmacéuticas más estables, tales como aquellas para la administración intravenosa, y a un método de preparación de la misma.

Antecedentes

El documento WO2008/139207 describe péptidos de unión a cMet marcados adecuados para la obtención de imágenes ópticas in vivo. Los péptidos están marcados con un grupo indicador óptico adecuado para la obtención de imágenes en la región del rojo al infrarrojo cercano. También se describen péptidos de unión a cMet para la obtención de imágenes moleculares ópticas administrados por vía intravenosa, tales como los que pueden usarse para el diagnóstico precoz del cáncer colorrectal (CRC).

Con más detalle, el documento WO2008/139207 describe un péptido cíclico de 26 aminoácidos soluble en agua con una alta afinidad hacia la cMet humana, que comprende un resto de obtención de imágenes indicador óptico fluorescente adecuado para la obtención de imágenes del cuerpo de un mamífero in vivo. Muestra fuertes señales de fluorescencia con un pico de excitación a 653 nm y un pico de emisión a 675 nm, que se considera la región de longitud de onda óptima para obtener imágenes de lesiones superficiales.

Sin embargo, los presentes inventores han observado que los agentes de obtención de imágenes descritos tienen una vida útil escasa en disolución y, por tanto, el almacenamiento y la degradación de los agentes de obtención de imágenes antes de la inyección intravenosa pueden ser un problema. Además, para uso intravenoso, los agentes de obtención de imágenes son beneficiosos a un pH y una tonicidad apropiados para la administración intravenosa.

Por tanto, un objeto de la invención es proporcionar una formulación más estable para agentes de obtención de imágenes, en particular agentes de obtención de imágenes ópticas, más particularmente agentes de obtención de imágenes ópticas que comprenden péptidos tales como los descritos en el documento WO2008/139207. Un objeto adicional de la invención es proporcionar una formulación para agentes de obtención de imágenes, en particular agentes de obtención de imágenes ópticas, más particularmente agentes de obtención de imágenes ópticas que comprenden péptidos tales como los descritos en el documento WO2008/139207, y que ilustran una mejor reconstitución, en particular a un pH y/o una tonicidad apropiados para uso intravenoso.

El documento WO 2004/078778 da a conocer un polipéptido de unión a c-Met liofilizado.

Divulgación de la invención

Según un primer aspecto de la invención, se proporciona una formulación liofilizada que comprende:

(i) un principio activo farmacéutico (API);

(ii) un agente de tamponamiento; y

(iii) un lioprotector;

en la que el API es un agente de obtención de imágenes que comprende al menos un péptido de unión a cMet, adecuado para obtener, de manera óptica, imágenes del cuerpo de un mamífero, comprendiendo el agente de obtención de imágenes un compuesto de fórmula I:

en la que:

Z1 está unido al extremo N-terminal de cMBP, y es H o MIG;

Z2 está unido al extremo C-terminal de cMBP, y es OH, NH2, OBc o MIG;

en el que Bc es un catión biocompatible;

cMBP es un péptido cíclico de unión a cMet de 17 a 30 aminoácidos, que comprende la secuencia de aminoácidos (SEQ-1):

Cysa-Xaa1-Cysc-Xaa2-Gly-Pro-Pro-Xaa3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Xaa4-Xaa5-Xaa6;

en la que: Xaa¹es Asn, His o Tyr;

Xaa²es Gly, Ser, Thr o Asn;

Xaa³es Thr o Arg;

Xaa⁴es Ala, Asp, Glu, Gly o Ser;

Xaa⁵es Ser o Thr;

Xaa⁶es Asp o Glu;

y Cys^a-dson cada uno residuos de cisteína de manera que los residuos a y b, así como c y d, se ciclan para formar dos enlaces disulfuro independientes;

M^IGes un grupo de inhibición del metabolismo, que es un grupo biocompatible que inhibe o suprime el metabolismo in vivo del péptido;

L es un grupo ligador sintético de fórmula -(A)m- en la que cada A es independientemente -CR²-, -CR=CR-, -C=C-, -CR²CO²-, -CO²CR²-,-NRCO-, -CONR-, -NR(C=O)NR-, -NR(C=S)NR-, -SO²NR-, -NRSO²-, CR²OCR²-, -CR²SCR²-, CR²NRCR²-, un grupo cicloheteroalquileno C^4-8, un grupo cicloalquileno C^4-8, un grupo arileno C^{5 -12}, un grupo heteroarileno C^{3 -12}, un aminoácido, un azúcar o un elemento estructural de polietilenglicol (PEG) monodisperso;

cada R se elige independientemente de H, alquilo C^1-4, alquenilo C^2-4, alquinilo C^2-4, alcoxialquilo C^1-4o hidroxialquilo C^1-4;

m es un número entero de valor de 1 a 20;

n es un número entero de valor 0 ó 1;

IM es un resto de obtención de imágenes indicador óptico adecuado para obtener imágenes del cuerpo de un mamífero usando luz de longitud de onda de violeta a infrarrojo cercano (de 400 a 1.200 nm);

en la que la formulación comprende desde aproximadamente el 4 hasta aproximadamente el 12% en peso de API, desde aproximadamente el 3 hasta aproximadamente el 35% en peso de agente de tamponamiento, y desde aproximadamente el 56 hasta aproximadamente el 91% en peso de lioprotector; y en la que la formulación, cuando se reconstituye, tiene un pH de entre aproximadamente pH 6,8 y aproximadamente pH 9. La obtención de imágenes ópticas del cuerpo de un mamífero puede ser in vivo.

Por el término “agente de tamponamiento” se entiende un agente de ajuste del pH. El agente de tamponamiento puede ser un compuesto o una composición (por ejemplo, una sal) que forma un tampón al disolverse. El agente de tamponamiento puede ser una sal tampón deshidratada. El agente de tamponamiento puede ser al menos uno de: un ácido (normalmente un ácido débil) y una de sus sales, y una base (normalmente una base débil) y una de sus sales.

Cualquier referencia a un “lioprotector” incluye un “crioprotector” y viceversa, dado que los términos se usan a menudo indistintamente en el campo de la invención.

Por el término “agente de obtención de imágenes” se entiende un compuesto adecuado para obtener imágenes del cuerpo de un mamífero in vivo o ex vivo. La obtención de imágenes ex-vivo todavía requiere la administración al cuerpo de un mamífero, pero también puede implicar la extracción de una muestra de tejido o similar y la obtención de imágenes de esa muestra fuera del cuerpo. En un ejemplo de este tipo, la formulación se usa in vivo en la medida en que se administra al cuerpo de un mamífero, y se usa ex-vivo en la medida en que la obtención de imágenes tiene lugar fuera del cuerpo de un mamífero. El mamífero puede ser un sujeto humano. La obtención de imágenes puede ser invasiva (por ejemplo, intraoperatoria o endoscópica) o no invasiva. El método de obtención de imágenes puede ser la endoscopia. Mientras que el compuesto de fórmula I es adecuado para la obtención de imágenes in vivo, también puede tener aplicaciones in vitro (por ejemplo, ensayos que cuantifican cMet en muestras biológicas o visualización de cMet en muestras de tejido). El agente de obtención de imágenes puede usarse para la obtención de imágenes in vivo.

El grupo Z¹sustituye al grupo amina del último residuo de aminoácido. Por tanto, cuando Z¹es H, el extremo amino terminal del cMBP termina en un grupo NH²libre del último residuo de aminoácido. El grupo Z²sustituye al grupo carbonilo del último residuo de aminoácido. Por tanto, cuando Z²es OH, el extremo carboxilo terminal del cMBP termina en el grupo CO²H libre del último residuo de aminoácido, y cuando Z²es OB^cse ioniza este grupo carboxilo terminal como grupo CO²B^L

Por el término “grupo de inhibición del metabolismo” (M^IG) se entiende un grupo biocompatible que inhibe o suprime el metabolismo in vivo del péptido cMBP en el extremo amino terminal (Z¹) o carboxilo terminal (Z²). Tales grupos son bien conocidos por los expertos en la técnica y se eligen adecuadamente de, para el extremo amino terminal del péptido: grupos N-acilados -NH(C=O)R^Gen el que el grupo acilo -(C=O)R^Gtiene R^Gelegido de: grupos alquilo C^1-6, arilo C^3-10o comprende un elemento estructural de polietilenglicol (PEG). Los grupos PEG adecuados se describen a continuación para el grupo ligador (L). Tales grupos PEG pueden ser los biomodificadores de fórmula IA o IB. Tales grupos M^IGamino terminales pueden ser acetilo, benciloxicarbonilo o trifluoroacetilo, normalmente acetilo.

Los grupos de inhibición del metabolismo adecuados para el extremo carboxilo terminal de péptido incluyen: carboxamida, éster terc-butílico, éster bencílico, éster ciclohexílico, aminoalcohol o un elemento estructural de polietilenglicol (PEG). Un grupo M adecuado para el residuo de aminoácido en el extremo carboxilo terminal del péptido cMBP es en el que la amina terminal del residuo de aminoácido está N-alquilada con un grupo alquilo C^1-4, opcionalmente un grupo metilo. Tales grupos M^IGpueden ser carboxamida o PEG, y pueden ser carboxamida.

La fórmula I indica que el resto -(L)ⁿ[IM] puede unirse en cualquier posición adecuada de Z¹, Z²o cMBP. Para Z¹o Z², el resto -(L)ⁿ[IM] puede unirse al grupo M^IGcuando cualquiera de Z¹/Z²es un M^IG. Cuando Z¹es H o Z²es OH, la unión del resto -(L)ⁿ[IM] en la posición Z¹o Z²proporciona compuestos de fórmulas [IM]-(L)ⁿ-[cMBP]-Z²o Z¹-[cMBP]-(L)ⁿ-[IM], respectivamente. La inhibición del metabolismo del cMBP en cualquier extremo terminal de péptido puede lograrse mediante la unión del resto -(L)ⁿ[IM] de esta manera, pero -(L)ⁿ[IM] no se encuentra dentro de la definición de M^IGen el presente documento.

El resto -(L)ⁿ- de fórmula I puede unirse en cualquier posición adecuada del IM. El resto -(L)ⁿ- toma el lugar de un sustituyente existente del IM, o se une covalentemente al sustituyente existente del IM. El resto -(L)ⁿ- se une opcionalmente a través de un sustituyente carboxialquilo del IM.

Por el término “péptido cíclico de unión a cMet” (cMBP) se entiende un péptido que se une al receptor de alta afinidad del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), también conocido como cMet (c-Met o receptor del factor de crecimiento de hepatocitos). Los péptidos cMBP adecuados tienen una Kd aparente para cMet del complejo cMet/HGF de menos de aproximadamente 2 |iM. Los péptidos cMBP comprenden residuos de prolina, y se sabe que tales residuos pueden presentar isomerización cis/trans del enlace amida de la estructura principal. Los péptidos cMBP descritos en el presente documento incluyen cualquiera de tales isómeros.

Por el término “catión biocompatible” (B^C) se entiende un contraión cargado positivamente que forma una sal con un grupo ionizado cargado negativamente, donde dicho contraión cargado positivamente tampoco es tóxico y, por tanto, es adecuado para la administración al cuerpo de un mamífero, especialmente al cuerpo humano. Los ejemplos de cationes biocompatibles adecuados incluyen: los metales alcalinos sodio o potasio; los metales alcalinotérreos calcio y magnesio; y el ion amonio. Los cationes biocompatibles típicos son sodio y potasio, normalmente sodio.

Por el término “aminoácido” se entiende un aminoácido L o D, un análogo de aminoácido (por ejemplo, naftilalanina) o un mimético de aminoácido que puede producirse de manera natural o ser de origen puramente sintético y puede ser ópticamente puro, es decir, un solo enantiómero y, por tanto, quiral, o una mezcla de enantiómeros. En el presente documento se usan abreviaturas convencionales de 3 letras o de una sola letra para los aminoácidos. Los aminoácidos usados pueden ser ópticamente puros. Por el término “mimético de aminoácidos” se entiende análogos sintéticos de aminoácidos que se producen de manera natural que son isósteros, es decir, han sido diseñados para imitar la estructura estérica y electrónica del compuesto natural. Tales isósteros son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, depsipéptidos, péptidos retro-inversos, tioamidas, cicloalcanos o tetrazoles 1,5-disustituidos [véase M. Goodman, Biopolymers, 24, 137, (1985)].

Por el término “péptido” se entiende un compuesto que comprende dos o más aminoácidos, tal como se definió anteriormente, unidos por un enlace peptídico (es decir, un enlace amida que une la amina de un aminoácido con el carboxilo de otro). El término “mimético de péptidos” o “mimético” se refiere a compuestos biológicamente activos que imitan la actividad biológica de un péptido o una proteína, pero ya no son de naturaleza química peptídica, es decir, ya no contienen ningún enlace peptídico (es decir, enlaces amida entre aminoácidos). En este caso, el término mimético de péptidos se usa en un sentido más amplio para incluir moléculas que ya no son completamente de naturaleza peptídica, tales como pseudopéptidos, semipéptidos y peptoides.

Por el término “resto de obtención de imágenes indicador óptico” (IM) se entiende un cromóforo o tinte fluorescente que puede detectarse directa o indirectamente en un procedimiento de obtención de imágenes ópticas usando luz de longitud de onda de verde a infrarroja cercana (400-1.200 nm, opcionalmente 600-1.000 nm). El IM puede tener propiedades fluorescentes.

Uno de los papeles del grupo ligador -(A)^m,- de fórmula I puede ser distanciar el IM del sitio activo del péptido cMBP. Esto es particularmente importante cuando el resto de obtención de imágenes es relativamente voluminoso, de modo que la interacción con la enzima no se vea afectada. Esto puede lograrse mediante una combinación de flexibilidad (por ejemplo, cadenas de alquilo simples), de modo que el grupo voluminoso tenga la libertad de posicionarse lejos del sitio activo y/o rigidez, tal como un espaciador de cicloalquilo o de arilo que oriente el IM lejos del sitio activo. La naturaleza del grupo ligador también puede usarse para modificar la biodistribución del agente de obtención de imágenes. Por tanto, por ejemplo, la introducción de grupos éter en el ligador ayudará a modificar la unión a proteínas plasmáticas. Cuando -(A)^m- comprende un elemento estructural de polietilenglicol (PEG) o una cadena peptídica de 1 a 10 residuos de aminoácido, el grupo ligador puede funcionar para modificar la farmacocinética y las tasas de aclaramiento en sangre del agente de obtención de imágenes in vivo. Tales grupos ligadores “biomodificadores” pueden acelerar el aclaramiento del agente de obtención de imágenes del tejido de fondo, tal como músculo o hígado, y/o de la sangre, dando así una mejor imagen de diagnóstico debido a una menor interferencia de fondo. También puede usarse un grupo ligador biomodificador para favorecer una vía particular de excreción, por ejemplo, a través de los riñones en lugar de a través del hígado.

Por el término “azúcar” se entiende un mono-, di- o trisacárido. Los azúcares adecuados incluyen: glucosa, galactosa, maltosa, manosa y lactosa. Opcionalmente, el azúcar puede funcionalizarse para permitir un fácil acoplamiento a los aminoácidos. Por tanto, por ejemplo, un derivado de glucosamina de un aminoácido puede conjugarse con otros aminoácidos a través de enlaces peptídicos. El derivado de glucosamina de la asparagina (disponible comercialmente de NovaBiochem) es un ejemplo de esto:

Convenientemente, el peso molecular del agente de obtención de imágenes es de hasta 8.000 Dalton. Opcionalmente, el peso molecular está en el intervalo de 2.800 a 6.000 Dalton, normalmente de 3.000 a 4.500 Dalton, siendo el más típico de 3.200 a 4.000 Dalton.

Los agentes de obtención de imágenes de la presente invención pueden tener ambos extremos terminales del péptido protegidos por grupos M^IG, es decir, opcionalmente tanto Z¹como Z²son M^IG, que serán habitualmente diferentes. Tal como se ha indicado anteriormente, cualquiera de Z¹/Z²puede equivaler opcionalmente a -(L)ⁿ[IM]. Tener ambos extremos terminales del péptido protegidos de esta manera es importante para las aplicaciones de obtención de imágenes in vivo, ya que de lo contrario se esperaría un metabolismo rápido con la consiguiente pérdida de afinidad de unión selectiva por cMet. Cuando tanto Z¹como Z²son M^IG, opcionalmente Z¹es acetilo y Z²es una amida primaria. Z¹puede ser acetilo y Z²puede ser una amida primaria y el resto -(L)ⁿ[IM] puede unirse a la cadena lateral de amina épsilon de un residuo de lisina de cMBP.

Los péptidos cMBP de la presente invención pueden tener una K^dpara la unión de cMet al complejo cMet/HGF de menos de aproximadamente 10 nM (basándose en las mediciones del ensayo de polarización de fluorescencia), lo más típico en el intervalo de 1 a 5 nM, siendo el ideal menos de 3 nM.

La secuencia peptídica (SEQ-1):

Cysa-Xaa1-Cysc-Xaa2-Gly-Pro-Pro-Xaa3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Xaa4-Xaa5-Xaa6

(SEQ-1)

del cMBP de fórmula I es una secuencia peptídica de 17 meros, que es principalmente responsable de la unión selectiva a cMet. Cuando el péptido cMBP de la presente invención comprende más de 17 residuos de aminoácido, los restantes aminoácidos pueden ser cualquier aminoácido aparte de cisteína. Además, los residuos de cisteína no protegidos podrían provocar una reorganización al azar no deseada de los puentes disulfuro definidos Cys^a-Cys^by Cys^c-Cys^d. Los péptidos adicionales comprenden preferiblemente al menos un residuo de aminoácido con una cadena lateral adecuada para la fácil conjugación del resto -(L)ⁿ[IM]. Tales residuos adecuados incluyen residuos de Asp o Glu para la conjugación con grupos -(L)ⁿ[IM] funcionalizados con amina, o un residuo de Lys para la conjugación con un grupo -(L)ⁿ[IM] funcionalizado con carboxilo o éster activo. Los residuos de aminoácido para la conjugación de -(L)ⁿ[IM] están ubicados adecuadamente lejos de la región de unión de 17 meros del péptido cMBP (SEQ-1), y están ubicados opcionalmente en el extremo C- o N-terminal. Opcionalmente, el residuo de aminoácido para la conjugación es un residuo de Lys.

Se evaluó la sustitución del residuo de triptófano de SEQ-1 con los sustitutos de aminoácido conocidos fenilalanina y naftilalanina. Sin embargo, se halló pérdida de afinidad por cMet, lo que sugiere que el residuo de triptófano es importante para la actividad. Opcionalmente, el péptido cMBP comprende además un residuo de serina N-terminal, que da los 18 meros (SEQ-2):

(SEQ-2)

Además de SEQ-1 o SEQ-2, el cMBP puede comprender además:

(i) o bien un residuo de Asp o Glu, o un análogo de los mismos, dentro de los 4 residuos de aminoácidos del extremo de péptido C- o N-terminal del péptido cMBP, y -(L)ⁿ[IM] se funcionaliza con un grupo amina que se conjuga con la cadena lateral de carboxilo de dicho residuo de Asp o Glu, o análogo de los mismos, para dar un enlace amida;

(ii) o bien un residuo de Lys, o un análogo del mismo, dentro de los 4 residuos de aminoácidos del extremo de péptido C- o N-terminal del péptido cMBP, y -(L)ⁿ[IM] se funcionaliza con un grupo carboxilo que se conjuga con la cadena lateral de amina épsilon de dicho residuo de Lys, o análogo del mismo, para dar un enlace amida. Los análogos de Asp y/o Glu pueden incluir uno o más de ácido 2-aminobutanodioico, ácido 2-aminohexanodioico, ácido 2-aminoheptanodioico, ácido 2-aminooctanodioico, ácido 2-aminononanodioico, ácido 2-aminodecanodioico, ácido 2-aminoundecanodioico, y ácido 2-aminododecanodioico.

Los análogos de Lys pueden incluir uno o más de ácido 2,3-diaminopropanoico, ácido 2,4-diaminobutanoico, ácido 2,5-diaminopentanoico, ácido 2,7-diaminoheptanoico, ácido 2,8-diaminooctanoico, ácido 2,9-diaminononanoico, ácido 2,10-diaminodecanoico, ácido 2,11-diaminoundecanoico, ácido 2,12-diaminododecanoico.

Los péptidos cMBP pueden comprender la secuencia de aminoácidos de 22 meros (SEQ-3):

Ala-Gly-Ser-Cysa-Xaa1-Cysc-Xaa2-Gly-Pro-Pro-Xaa3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-T y r-Xaa4-Xaa5-Xaa6-G ly-Th r.

(SEQ-3)

Los péptidos cMBP pueden tener Xaa³igual a Arg.

El péptido cMBP puede comprender además de SEQ-1, SEQ-2 o SEQ-3, en el extremo N- o C-terminal un péptido ligador que se elige de: -Gly-Gly-Gly-Lys-(SEQ-4), -Gly-Ser-Gly-Lys-(SEQ-5) o -Gly-Ser-Gly-Ser-Lys-(SEQ-6).

El residuo de Lys del péptido ligador es una ubicación típica para la conjugación del resto -(L)ⁿ[IM]. Algunos péptidos cMBP comprenden SEQ-3 junto con el péptido ligador de SEQ-4, que tiene la secuencia de aminoácidos de 26 meros (SEQ-7):

Ala-Gly-Ser-Cysa-Tyr-Cysc-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-

Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys.

(SEQ-7)

Los péptidos cMBP de SEQ-1, SEQ-2, SEQ-3 y SEQ-7 pueden tener Z¹= Z²= M^IG, y pueden tener Z¹= acetilo y Z²= amida primaria.

El resto -(L)ⁿ[IM] se une de manera adecuada a cualquiera de los grupos Z¹o Z²o un residuo de aminoácido del péptido cMBP que es diferente a la secuencia de unión a cMet de SEQ-1. Los posibles residuos de aminoácido y sitios de conjugación son tal como se describieron anteriormente. Cuando el resto -(L)ⁿ[IM] se une a Z¹o Z², puede tomar el lugar de Z¹o Z²mediante la conjugación al extremo N- o C-terminal, y bloquear de esa manera el metabolismo in vivo.

Los grupos IM típicos tienen un extenso sistema de electrones deslocalizados, por ejemplo, cianinas, merocianinas, indocianinas, ftalocianinas, naftalocianinas, trifenilmetinas, porfirinas, tintes de pirilio, tintes de tiapirilio, tintes de escuarilio, tintes de croconio, tintes de azulenio, indoanilinas, tintes de benzofenoxazinio, tintes de benzotiafenotiazinio, antraquinonas, naftoquinonas, indatrenos, ftaloilacridonas, trisfenoquinonas, tintes azoicos, tintes de transferencia de carga intramoleculares e intermoleculares y complejos de tintes, troponas, tetrazinas, complejos de bis(ditioleno), complejos de bis(benceno-ditiolato), tintes de yodoanilina, complejos de bis(S,O-ditioleno). También son útiles las proteínas fluorescentes, tales como la proteína verde fluorescente (^gF^p) y las modificaciones de GFP que tienen diferentes propiedades de absorción/emisión. Los complejos de determinados metales de tierras raras (por ejemplo, europio, samario, terbio o disprosio) se usan en determinados contextos, al igual que los nanocristales fluorescentes (puntos cuánticos).

Los ejemplos de cromóforos que pueden usarse incluyen: Atto 647, CF640R, Atto 647N, SiR650, CF633, Sulfo Cy5, T700-H, T700-F, CF647 Se , Quasar 670, Chromeo 642, Oyster 645, Oyster 647, Oyster 650, Iris 5, CyAL 5, IRDye 650, NIR4, AOI987, BODIPY^®650/665, Dylight 633, Dylight 650, DDAO (7-hidroxi-9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona), Chromis 645 C, Chromis 645 Z, Chromis 645 A, HiLyte 647, PromoFluor 647p , Dy-630, Dy-631, Dy-632, Dy-633, Dy-636, Dy-650, Dy-651, Dy-652, Dy-654, Tracy 645, Tracy 652, NIR 782 rojo fluorescente, Atto 655, Atto 680, CF660 C, CF660 R, Quasar 705, CF680, IRDye680RD, NIR2, IRDye680LT, HiLyte 680, IRDye700DX, Oyster 680, Iris 5,5, HROMIS LSS 670Z, CHROMIS LSS 690Z, Dylight 680 (Pierce), ftalocianina de magnesio, oxazina 750, SeTa-665, SeTa-667, SeTa-670, PromoFluor 670 (Promo Kine), Dy-682, PromoFluor 680, PromoFluor 700 P, azul de metileno, reactivo NIR 730 rojo fluorescente, reactivo NIR 781 rojo fluorescente, BM104, BM105 (éster de NHS de BM104), SiR720, Atto 740, CF750, Sulfo Cy7, IRDye750, NIR3, Dylight 755, DY-732, DY-734, DY-752, PromoFluor 750 P, HiLyte 750, DY-776, NIR1, IRDye800RS, PromoFluor 770 P, DY-778, CHROMIS 770 C, ZW800-1, ZW800-3, IRIS 7G-WS, IR 780, ESNF31, CF770, Vivotag 800, IRDye800CW, Alexa Fluor 790, CF790, Oyster 800, CHROMIS 770 A, CHROMIS 800 C, CHROMIS 800 A, CHROMIS 830 C, CHROMIS 830 A, Dylight 800, DY-777, DY-782, DY-800, PromoFluor 780 P, NIR-797, PromoFluor 840 P, fluoresceína, sulforrodamina 101 (rojo Texas), rodamina B, rodamina 6G, rodamina 19, verde de indocianina, Cy2, Cy3B, Cy3,5, Cy5, Cy5,5, Cy7, Cy7,5, Marina Blue, Pacific Blue, Oregon Green 488, Oregon Green 514, tAm rA (tetrametilrrodamina), Tm R, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700 y Alexa Fluor 750. Normalmente pueden usarse los tintes de cianina y derivados y análogos de los mismos.

Los ejemplos particulares de cromóforos que pueden usarse incluyen: Cy5, Cy5,5, Cy7, Cy7,5, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700 y Alexa Fluor 750, Atto 647, CF640R, Atto 647N, SiR650, CF633, Sulfo Cy5, T700-H, T700-F, CF647 SE, Quasar 670, Chromeo 642, Oyster 645, Oyster 647, Oyster 650, Iris 5, CyAL 5, IRDye 650, NIR4, AOI987, BODIPY^®650/665, Dylight 633, Dylight 650, DDAO (7-hidroxi-9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona), Chromis 645 C, Chromis 645 Z, Chromis 645 A, HiLyte 647, PromoFluor 647P, Dy-630, Dy-631, Dy-632, Dy-633, Dy-636, Dy-650, Dy-651, Dy-652, Dy-654, Tracy 645, Tracy 652, NIR 782 rojo fluorescente, Atto 655, Atto 680, CF660 C, c F660 R, Quasar 705, CF680, IRDye680RD, NIR2, IRDye680LT, HiLyte 680, IRDye700DX, Oyster 680, Iris 5,5, HROMIS LSS 670Z, CHROMIS LSS 690Z, Dylight 680 (Pierce), ftalocianina de magnesio, oxazina 750, SeTa-665, SeTa-667, SeTa-670, PromoFluor 670 (Promo Kine), Dy-682, PromoFluor 680, PromoFluor 700 P, azul de metileno, reactivo NIR 730 rojo fluorescente, reactivo NIR 781 rojo fluorescente, BM104, BM105 (éster de NHS de BM104), SiR720, Atto 740, CF750, Sulfo Cy7, IRDye750, NIR3, Dylight 755, DY-732, DY-734, DY-752, PromoFluor 750 P, HiLyte 750, DY-776, NIR1, IRDye800RS, PromoFluor 770 P, DY-778, CHROMIS 770 C, ZW800-1, ZW800-3, IRIS 7G-WS, IR 780, ESNF31, CF770, Vivotag 800, IRDye800CW, Alexa Fluor 790, CF790, Oyster 800, CHROMIS 770 A, CHROMIS 800 C, CHROMIS 800 A, CHROMIS 830 C, CHROMIS 830 A, Dylight 800, DY-777, DY-782, DY-800, PromoFluor 780 P, NIR-797, PromoFluor 840 P y verde de indocianina. Licha et al han revisado tintes y conjugados de tintes para la obtención de imágenes ópticas in vivo [Topics Curr.Chem., 222, 1-29 (2002); Adv.Drug Deliv.Rev., 57, 1087-1108 (2005)].

Los ejemplos más particulares de cromóforos que pueden usarse incluyen: Cy5, Cy5**, Alexa Fluor 647, BODIPY® 630, Atto 647, Oyster 647, IRDye650, BODIPY® 650, DY631, DY632, Cy5,5, IRDye 680RD, Alexa Fluor 660 y Alexa Fluor 680.

Los tintes de cianina pueden ser fluoróforos de fórmula II:

en la que:

cada X’ se selecciona independientemente de: -C(CH³)²-, -S-, -O- o -C[(CH²)^aCH³][(CH²)^bM]-, en el que a es un número entero de valor de 0 a 5, b es un número entero de valor de 1 a 5, y M es el grupo G o se selecciona de SO³M¹o H;

cada Y’ representa independientemente de 1 a 4 grupos seleccionados del grupo que consiste en: H, -CH²NH², -SO³M¹, -CH²COOM¹, -NCS y F, y

en la que los grupos Y’ están colocados en cualquiera de las posiciones del anillo aromático;

Q’ se selecciona independientemente del grupo que consiste en: H, SO³M¹, NH², COOM¹, amonio, grupos éster, bencilo y un grupo G;

M¹es H o B^c;

I es un número entero desde 1 hasta 3;

y m es un número entero desde 1 hasta 5;

en la que al menos uno de X’, Y’ y Q’ comprende un grupo G;

G es un grupo reactivo o funcional adecuado para unirse al péptido cMBP.

El grupo G reacciona con un grupo complementario del péptido cMBP formando un enlace covalente entre el fluoróforo de tinte de cianina y el péptido cMBP. G puede ser un grupo reactivo que puede reaccionar con un grupo funcional complementario del péptido o, alternativamente, puede incluir un grupo funcional que puede reaccionar con un grupo reactivo del péptido cMBP. Los ejemplos de grupos reactivos y funcionales incluyen: ésteres activos; isotiocianato; maleimida; haloacetamida; haluro de ácido; hidrazida; vinilsulfona; diclorotriazina; fosforamidita; hidroxilo; amino; sulfhidrilo; carbonilo; ácido carboxílico y tiofosfato. G puede ser un éster activo. Por el término “éster activado” o “éster activo” se entiende un derivado de éster del ácido carboxílico asociado que está diseñado para incluir un mejor grupo saliente y, por tanto, permitir una reacción más fácil con nucleófilos, tales como aminas. Ejemplos de ésteres activos adecuados son: N-hidroxisuccinimida (NHS), éster sulfosuccinimidílico, pentafluorofenol, pentafluorotiofenol, paranitrofenol, hidroxibenzotriazol y PyBOP (es decir, hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxitripirrolidinofosfonio). Los ésteres activos pueden ser ésteres de N-hidroxisuccinimida o pentafluorofenol, especialmente ésteres de N-hidroxisuccinimida.

En una realización de fórmula II:

cada X’ se selecciona del grupo de -C(CH³)²- y -C(CH³)[(CH²)⁴M]-,

en el que M es un grupo G o -SO³M¹;

cada Y’ representa SO³M¹, H o de 1 a 4 átomos de F;

cada Q’ se selecciona de un grupo G y SO³M¹;

I es preferiblemente 2 y m es preferiblemente 3, 4 ó 5;

en la que cuando o bien X’ o bien Q’ es un grupo G, puede ser un éster succinimidílico.

El tinte de cianina puede ser de fórmula III:

en la que:

R¹y R²son independientemente H o SO³M¹, y al menos uno de R¹y R²es SO³M¹, donde M¹es H o B^c;

R³y R⁴son independientemente alquilo C^1-4o carboxialquilo C^1-6;

R⁵, R⁶, R⁷y R⁸son independientemente grupos R^a;

en los que R^aes alquilo C^1-4, carboxialquilo C^1-6o -(CH²)^kSO³M¹, donde k es un número entero de valor 3 ó 4; con la condición de que el tinte de cianina tenga un total de 1 a 4 sustituyentes SO³M¹en los grupos R¹, R²y R^a. Los tintes de fórmula III pueden elegirse de manera que al menos un grupo carboxialquilo C^1-6esté presente, para facilitar la conjugación con el cMBP.

Los posibles tintes individuales de fórmula III se resumen en la tabla 1:

Tabla 1: Estructuras químicas de tintes de cianina individuales

Los tintes de fórmula II que se usan normalmente son Cy5** y Alexa647, siendo el más típico Cy5** Cuando un grupo ligador sintético (L) está presente, puede comprender grupos funcionales terminales que facilitan la conjugación con [IM] y Z1-[cMBP]-Z2. Cuando L comprende una cadena peptídica de 1 a 10 residuos de aminoácido, los residuos de aminoácido pueden elegirse de glicina, lisina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico o serina. Cuando L comprende un resto de PEG, puede comprender unidades derivadas de la oligomerización de las estructuras similares a PEG monodisperso de fórmulas IA (ácido 17-amino-5-oxo-6-aza-3, 9, 12, 15-tetraoxaheptadecanoico) o IB:

(Fórmula IA)

en la que p es un número entero desde 1 hasta 10. Alternativamente, puede usarse una estructura similar a PEG basada en un derivado de ácido propiónico de fórmula IB:

(Fórmula IB)

donde p es tal como se define para la fórmula IA y q es un número entero desde 3 hasta 15. En la fórmula IB, p puede ser 1 ó 2, y q puede ser de 5 a 12.

Cuando el grupo ligador no comprende PEG o una cadena peptídica, los grupos L pueden tener una cadena de estructura principal de átomos unidos que conforman el resto -(A)^m- de 2 a 10 átomos, lo más preferiblemente de 2 a 5 átomos, siendo 2 ó 3 átomos especialmente preferido. Una cadena de estructura principal de grupo ligador mínima de 2 átomos confiere la ventaja de que el resto de obtención de imágenes está bien separado de manera que se minimiza cualquiera interacción indeseable.

En la fórmula I, n puede ser 0 ó 1, normalmente 0, es decir no está presente ningún grupo ligador.

Los agentes de obtención de imágenes tal como se describen en el presente documento pueden ser de fórmula IV (que comprende SEQ-7):

MIG-Ala-Gly-Ser-Cysa-Tyr-Cysc-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Ty r-G I u-Thr-G I u-G ly-Th r-G ly-G ly-G ly-Lys-M1(3

(L)n[IM]

(Fórmula IV)

en la que el grupo (L)ⁿ[IM] se une al grupo amino épsilon del residuo de Lys. Los agentes de obtención de imágenes de fórmula IV pueden tener M (Ala N-terminal) igual a acetilo y M^IG(Lys C-terminal) igual a amida primaria. En la fórmula IV, n puede ser cero e IM puede ser un tinte de cianina, normalmente un tinte de cianina de fórmula II. Pueden usarse agentes de obtención de imágenes de fórmula IV que tienen IM = Cy5** o Alexa647, lo más típico Cy5**

Pueden obtenerse péptidos de fórmula Z¹-[cMBP]-Z²mediante un método de preparación que comprende:

(i) síntesis peptídica en fase sólida de un péptido lineal que tiene la misma secuencia peptídica que el péptido cMBP deseado y en el que los Cys^ay Cys^bestán desprotegidos, y los residuos Cys^Cy Cys^dtienen grupos protectores de tiol;

(ii) escisión a partir del soporte sólido y tratamiento del péptido de la etapa (i) con base acuosa en disolución para dar un péptido monocíclico con un primer enlace disulfuro que une Cys^ay Cys^b;

(iii) eliminación de los grupos protectores de tiol de Cys^Cy Cys^dy ciclación para dar un segundo enlace disulfuro que une Cys^Cy Cys^d, que es el producto peptídico bicíclico deseado Z¹-[cMBP]-Z².

Por el término “grupo protector” se entiende un grupo que inhibe o suprime reacciones químicas indeseables, pero que está diseñado para ser lo suficientemente reactivo como para poder escindirse del grupo funcional en cuestión en condiciones lo suficientemente suaves como para no modificar el resto de la molécula. Después de la desprotección, se obtiene el producto deseado. Los grupos protectores de amina son bien conocidos por los expertos en la técnica y se eligen adecuadamente de: Boc (donde Boc es terc-butiloxicarbonilo), Fmoc (donde Fmoc es fluorenilmetoxicarbonilo), trifluoroacetilo, aliloxicarbonilo, Dde [es decir, 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)etilo] o Npys (es decir, 3-nitro-2-piridinasulfenilo). Los grupos protectores de tiol adecuados son Trt (tritilo), Acm (acetamidometilo), t-Bu (terc-butilo), t-butiltio, metoxibencilo, metilbencilo o Npys (3-nitro-2-piridinasulfenilo). El uso de grupos protectores adicionales se describe en ’Protective Groups in Organic Synthesis', Theorodora W. Greene y Peter G. M. Wuts, (John Wiley & Sons, 1991). Los grupos protectores de amina típicos son Boc y Fmoc, lo más típico Boc. Otros grupos protectores de tiol típicos son Trt y Acm.

Los ejemplos 1 y 2 proporcionan detalles específicos adicionales. Los detalles adicionales de la síntesis de péptidos en fase sólida se describen en P. Lloyd-Williams, F. Albericio y E. Girald; Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, CRC Press, 1997. Los péptidos cMBP se almacenan mejor en atmósfera inerte y se mantienen en un congelador. Cuando se usan en disolución, es mejor evitar un pH por encima de 7, ya que se corre el riesgo de que los puentes disulfuro se reorganicen al azar, y es mejor evitar un pH bajo, ya que esto desencadena la agregación del péptido.

Un método general de preparación del agente de obtención de imágenes del primer aspecto comprende una de las etapas (i) a (iv):

(i) reacción de un péptido cMBP de fórmula Z¹-[cMBP]-Z²en la que Z¹es H y Z²es un M^IGcon un compuesto de fórmula Y¹-(L)ⁿ-[IM], para dar el agente de obtención de imágenes de fórmula I en la que [IM] se conjuga en la posición Z1;

(ii) reacción de un péptido cMBP de fórmula Z¹-[cMBP]-Z²en la que Z¹= Z²= M^IGy cMBP comprende un residuo de Asp o Glu dentro de 4 residuos de aminoácido del extremo C- o N-terminal del péptido cMBP, y los otros residuos de Asp/Glu del péptido cMBP están protegidos, con un compuesto de fórmula Y²-(L)ⁿ-[IM], para dar el agente de obtención de imágenes de fórmula I en la que [IM] se conjuga en dicho residuo Asp o Glu del péptido cMBP;

(iii) reacción de un péptido cMBP de fórmula Z¹-[cMBP]-Z³en la que Z¹es M^IGy Z³es un grupo Z²o un éster activado y los otros residuos de Asp/Glu del péptido cMBP están protegidos, con un compuesto de fórmula Y²-(L)ⁿ-[IM], para dar el agente de obtención de imágenes de fórmula I en la que [IM] se conjuga en la posición Z²;

(iv) reacción de un péptido cMBP de fórmula Z¹-[cMBP]-Z²en la que Z¹= Z²= M^IGy cMBP comprende una Lys dentro de 4 residuos de aminoácido del extremo C- o N-terminal del péptido cMBP, con un compuesto de fórmula ^y1-(L)ⁿ-[IM], para dar el agente de obtención de imágenes de fórmula I en la que [IM] se conjuga en un residuo de Lys del péptido cMBP;

en el que Z, cMBP, Z, M, L, n e IM son tal como se definieron anteriormente, y Z³es un grupo Z²o un éster activado;

Y¹es un ácido carboxílico, éster activado, grupo isotiocianato o tiocianato;

Y²es un grupo amina.

Los términos “éster activado” o “éster activo” y las realizaciones de los mismos son tal como se describieron anteriormente. Y²es opcionalmente un grupo amina primaria o secundaria, normalmente un grupo amina primaria.

En el compuesto Z¹-[cMBP]-Z²pueden tener tanto Z¹como Z²iguales a M^IGLos péptidos cMBP y los grupos Z¹/Z²típicos son tal como se describieron anteriormente. En particular, es típico que el péptido cMBP comprenda un residuo de Asp, Glu o Lys para facilitar la conjugación tal como se describe para los péptidos cMBP típicos descritos anteriormente. Lo más típico es que el péptido cMBP comprenda un residuo de Lys, tal como se describe en la etapa (iv).

La preparación del Z¹-[cMBP]-Z²se describió anteriormente. El péptido Z¹-[cMBP]-Z³en el que Z³es un éster activo puede prepararse a partir de Z¹-[cMBP]-Z², en el que Z²es OH o un catión biocompatible (B^c), mediante métodos convencionales.

Tintes indicadores ópticos (IM) funcionalizados adecuados para la conjugación con péptidos están disponibles comercialmente de G^eHealthcare Limited, Atto-Tec, Dyomics, Molecular Probes y otros. La mayoría de tales tintes están disponibles como ésteres de NHS.

Los métodos de conjugación de indicadores ópticos (IM) adecuados, en particular tintes, con aminoácidos y péptidos se describen por Licha (véase anteriormente), así como por Flanagan et al [Bioconj. Chem., 8, 751-756 (1997)]; Lin et al, [ibid, 13, 605-610 (2002)] y Zaheer [Mol. Imaging, 1(4), 354-364 (2002)]. Los métodos de conjugación del grupo ligador (L) con el péptido cMBP usan química análoga a la de los tintes solos (véase anteriormente), y se conocen en la técnica.

Además de SEQ-1, el cMBP puede comprender además un residuo de Asp o Glu dentro de 4 residuos de aminoácido del extremo C- o N-terminal del péptido cMBP, y -(L)ⁿIM puede funcionalizarse con un grupo amina, que se conjuga con la cadena lateral de carboxilo de dicho residuo de Asp o Glu para dar un enlace amida. Además de SEQ-1, el cMBP puede comprender un residuo de Lys dentro de 4 residuos de aminoácido del extremo C- o N-terminal del péptido cmBp , y -(L)ⁿIM puede funcionalizarse con un grupo carboxilo, que se conjuga con la cadena lateral de amina épsilon de dicho residuo de Lys para dar un enlace amida.

El cMBP pueden comprender la secuencia de aminoácidos de o bien SEQ-2 o bien SEQ-3:

Ser-Cysa-Xaa1-Cysc-Xaa2-Gly-Pro-Pro-Xaa3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Xaa4-Xaa5-Xaa6 (SEQ-2);

Ala-Gly-Ser-Cysa-Xaa1-Cysc-Xaa2-Gly-Pro-Pro-Xaa3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-T y r-Xaa4-Xaa5-Xaa6-G ly-Thr (SEQ-3).

Xaa3 puede ser Arg.

Además de SEQ-1, SEQ-2 o SEQ-3, el cMBP puede comprender además en el extremo N- o C-terminal un péptido ligador que se elige de -Gly-Gly-Gly-Lys (SEQ-4), -Gly-Ser-Gly-Lys-(SEQ-5) y -Gly-Ser-Gly-Ser-Lys (SEQ-6).

El cMBP puede tener la secuencia de aminoácidos (SEQ-7):

Ala-Gly-Ser-Cysa-Tyr-Cysc-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys.

Tanto Z1 como Z2 pueden ser independientemente M^IG.

Z1 puede ser acetilo y Z2 puede ser una amida primaria.

n puede ser 0.

IM puede ser un tinte que tiene un máximo de absorbancia en el intervalo de 600 a 1.000 nm.

IM puede ser un tinte de cianina.

El tinte de cianina puede tener la fórmula III:

en la que:

R³y R⁴son independientemente alquilo C^1-4o carboxialquilo C^1-6;

R⁵, R⁶, R⁷y R⁸son independientemente grupos R^a;

en los que R^aes alquilo C^1-4, carboxialquilo C^1-6o -(CH²)^kSO³M¹, donde k es un número entero de valor 3 ó 4; con la condición de que el tinte de cianina tenga un total de 1 a 4 sustituyentes SO³M¹en los grupos R¹, R²y R^a.

El cMBP puede tener la secuencia de aminoácidos (SEQ-7):

Ala-Gly-Ser-Cysa-Tyr-Cysc-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys;

Z1 puede ser acetilo y Z2 puede ser una amida primaria; y

IM puede ser un tinte que tiene un máximo de absorbancia en el intervalo de 600 a 1.000 nm, opcionalmente un tinte de cianina, opcionalmente un tinte de cianina que tiene la fórmula III:

en la que:

R³y R⁴son independientemente alquilo C^1-4o carboxialquilo C^1-6;

R⁵, R⁶, R⁷y R⁸son independientemente grupos R^a;

en los que R^aes alquilo C^1-4, carboxialquilo C^1-6o -(CH²)^kSO³M¹, donde k es un número entero de valor 3 ó 4; con la condición de que el tinte de cianina tenga un total de 1 a 4 sustituyentes SO³M¹en los grupos R¹, R²y R^a. La formulación, cuando se reconstituye, puede tener un pH de entre aproximadamente pH 6,8 y aproximadamente pH 8,2, opcionalmente entre aproximadamente pH 6,8 y aproximadamente pH 8, opcionalmente entre aproximadamente pH 7 y aproximadamente pH 8.

El agente de tamponamiento puede estar presente en una cantidad para proporcionar, cuando se reconstituye, una disolución que tiene un pH de entre aproximadamente pH 6,8 y aproximadamente pH 9, opcionalmente entre aproximadamente pH 6,8 y aproximadamente pH 8,2, opcionalmente entre aproximadamente pH 6,8 y aproximadamente pH 8, opcionalmente entre aproximadamente pH 7 y aproximadamente pH 8.

La razón molar del API : tampón puede ser de aproximadamente 1 mol de API : de aproximadamente 17 a aproximadamente 47 moles de agente de tamponamiento. La razón molar del API : agente de tamponamiento puede ser de aproximadamente 1 mol de API : de aproximadamente 27 a aproximadamente 47 moles de agente de tamponamiento. La razón molar del API : agente de tamponamiento puede ser de aproximadamente 1 mol de API : de aproximadamente 30 a aproximadamente 47 moles de agente de tamponamiento. La razón molar del API : agente de tamponamiento puede ser de aproximadamente 1 mol de API : de aproximadamente 34 a aproximadamente 47 moles de agente de tamponamiento.

La razón molar del API : agente de tamponamiento puede ser de aproximadamente 1 mol de API : de aproximadamente 27 a aproximadamente 38 moles de agente de tamponamiento. La razón molar del API : agente de tamponamiento puede ser de aproximadamente 1 mol de API : de aproximadamente 30 a aproximadamente 38 moles de agente de tamponamiento. La razón molar del API : tampón puede ser de aproximadamente 1 mol de API : de aproximadamente 34 a aproximadamente 38 moles de agente de tamponamiento.

La razón molar del API : agente de tamponamiento puede ser de aproximadamente 1 mol de API : aproximadamente 38 moles de agente de tamponamiento.

La razón molar de API : lioprotector puede ser de aproximadamente 1 mol de API : de aproximadamente 105 a aproximadamente 216 moles de lioprotector. La razón molar de API : lioprotector puede ser de aproximadamente 1 mol de API : de aproximadamente 105 a aproximadamente 163 moles de lioprotector. La razón molar de API : lioprotector puede ser de aproximadamente 1 mol de API : de aproximadamente 105 a aproximadamente 154 moles de lioprotector. La razón molar de API : lioprotector puede ser de aproximadamente 1 mol de API : de aproximadamente 105 a aproximadamente 145 moles de lioprotector. La razón molar de API : lioprotector puede ser de aproximadamente 1 mol de API : de aproximadamente 105 a aproximadamente 141 moles de lioprotector. La razón molar de API : lioprotector puede ser de aproximadamente 1 mol de API : de aproximadamente 105 a aproximadamente 132 moles de lioprotector. La razón molar de API : lioprotector puede ser de aproximadamente 1 mol de API : de aproximadamente 105 a aproximadamente 129 moles de lioprotector.

La razón molar de API : lioprotector puede ser de aproximadamente 1 mol de API : de aproximadamente 129 a aproximadamente 216 moles de lioprotector. La razón molar de API : lioprotector puede ser de aproximadamente 1 mol de API : de aproximadamente 129 a aproximadamente 163 moles de lioprotector. La razón molar de API : lioprotector puede ser de aproximadamente 1 mol de API : de aproximadamente 129 a aproximadamente 154 moles de lioprotector. La razón molar de API : lioprotector puede ser de aproximadamente 1 mol de API : de aproximadamente 129 a aproximadamente 145 moles de lioprotector. La razón molar de API : lioprotector puede ser de aproximadamente 1 mol de API : de aproximadamente 129 a aproximadamente 141 moles de lioprotector. La razón molar de API : lioprotector puede ser de aproximadamente 1 mol de API : de aproximadamente 129 a aproximadamente 132 moles de lioprotector.

La razón molar de API : lioprotector puede ser de aproximadamente 1 mol de API : aproximadamente 129 moles de lioprotector.

La formulación puede comprender desde aproximadamente el 8 hasta aproximadamente el 10% en peso de API, de manera opcional aproximadamente el 9% en peso de API.

La formulación puede comprender desde aproximadamente el 7 hasta aproximadamente el 35% en peso de agente de tamponamiento, opcionalmente desde aproximadamente el 12 hasta aproximadamente el 35% en peso de agente de tamponamiento, opcionalmente desde aproximadamente el 15 hasta aproximadamente el 35% en peso de agente de tamponamiento, opcionalmente desde aproximadamente el 18 hasta aproximadamente el 35% en peso de agente de tamponamiento, opcionalmente desde aproximadamente el 25 hasta aproximadamente el 35% en peso de agente de tamponamiento, opcionalmente desde aproximadamente el 32 hasta aproximadamente el 35% en peso de agente de tamponamiento, de manera opcional aproximadamente el 32% en peso de agente de tamponamiento.

La formulación puede comprender desde aproximadamente el 56 hasta aproximadamente el 82% en peso de lioprotector, opcionalmente desde aproximadamente el 56 hasta aproximadamente el 77% en peso de lioprotector, opcionalmente desde aproximadamente el 56 hasta aproximadamente el 75% en peso de lioprotector, opcionalmente desde aproximadamente el 56 hasta aproximadamente el 72% en peso de lioprotector, opcionalmente desde aproximadamente el 56 hasta aproximadamente el 66% en peso de lioprotector, opcionalmente desde aproximadamente el 56 hasta aproximadamente el 58% en peso de lioprotector, de manera opcional aproximadamente el 58% en peso de lioprotector.

Se entenderá que los componentes de la formulación se eligen de tal manera que la cantidad total es del 100% en peso.

La formulación puede comprender al menos 40 mM de agente de tamponamiento.

El agente de tamponamiento puede ser al menos uno de un tampón fosfato y un tampón alcanolamina. El tampón fosfato puede comprender hidrogenofosfato y dihidrogenofosfato. El tampón fosfato puede estar hidratado.

El tampón alcanolamina puede comprender tris(hidroximetil)aminometano. El tampón alcanolamina puede comprender 2-amino-2-(hidroximetil)propano-1,3-diol.

El lioprotector puede ser al menos uno de un azúcar, un alcohol y un alcohol de azúcar, y derivados de los mismos. Opcionalmente, el lioprotector es al menos uno de un azúcar y un alcohol de azúcar, y derivados de los mismos. Opcionalmente, el lioprotector es al menos uno de un monosacárido, un disacárido, un oligosacárido, un polisacárido, y derivados de los mismos. El lioprotector puede ser al menos uno de sacarosa y manitol, y derivados de los mismos. El lioprotector puede ser manitol, o un derivado del mismo.

La formulación puede comprender además un regulador de la tonicidad.

El lioprotector también puede actuar como regulador de la tonicidad, en cuyo caso case es un lioprotector y regulador de la tonicidad combinados.

Según un segundo aspecto de la invención, se proporciona un método de preparación de una formulación liofilizada, comprendiendo el método las etapas de:

a) proporcionar un principio activo farmacéutico (API), un agente de tamponamiento y un lioprotector a un recipiente de liofilización;

b) realizar una primera etapa de eliminación de agua; y

c) realizar una segunda etapa de eliminación de agua;

en el que el lioprotector y el agente de tamponamiento se añaden antes de que se lleve a cabo la liofilización, y el API es un agente de obtención de imágenes que comprende al menos un péptido de unión a cMet, adecuado para obtener, de manera óptica, imágenes del cuerpo de un mamífero, comprendiendo el agente de obtención de imágenes un compuesto de fórmula I:

en la que:

Z¹está unido al extremo N-terminal de cMBP, y es H o M^IG;

Z²está unido al extremo C-terminal de cMBP, y es OH, NH², OB^co M^IG;

en el que B^ces un catión biocompatible;

cMBP es un péptido cíclico de unión a cMet de 17 a 30 aminoácidos, que comprende la secuencia de aminoácidos ^{( S e Q -1}): Cys^a-Xaa¹-Cys^c-Xaa²-Gly-Pro-Pro-Xaa³-Phe-Glu-Cys^d-T rp-Cys^b-Tyr-Xaa⁴-Xaa⁵-Xaa⁶; en la que: Xaa¹es Asn, His o Tyr;

Xaa²es Gly, Ser, Thr o Asn;

Xaa³es Thr o Arg;

Xaa⁴es Ala, Asp, Glu, Gly o Ser;

Xaa⁵es Ser o Thr;

Xaa⁶es Asp o Glu;

L es un grupo ligador sintético de fórmula -(A)m- en la que cada A es independientemente -CR²-, -CR=CR-, -C=C-, -CR²CO²-,-CO²CR²-, -NRCO-, -CONR-, -NR(C=O)NR-, -NR(C=S)NR-,-SO²NR-, -NRSO²-, CR²OCR²-, -CR²SCR²-, CR²NRCR²-, un grupo cicloheteroalquileno C^4-8, un grupo cicloalquileno C^4-8, un grupo arileno C^{5 -12}, un grupo heteroarileno C^{3 -12}, un aminoácido, un azúcar o un elemento estructural de polietilenglicol (PEG) monodisperso;

m es un número entero de valor de 1 a 20;

n es un número entero de valor 0 ó 1;

IM es un resto de obtención de imágenes indicador óptico adecuado para la obtención de imágenes del cuerpo de un mamífero usando luz de longitud de onda de violeta a infrarrojo cercano (de 400 a 1.200 nm);

en el que la formulación comprende desde aproximadamente el 4 hasta aproximadamente el 12% en peso de API, desde aproximadamente el 3 hasta aproximadamente el 35% en peso de agente de tamponamiento, y desde aproximadamente el 56 hasta aproximadamente el 91% en peso de lioprotector; y en el que la formulación, cuando se reconstituye, tiene un pH de entre aproximadamente pH 6,8 y aproximadamente pH 9. La primera etapa de eliminación de agua puede llevarse a cabo a una temperatura de aproximadamente -30°C o menor, de manera opcional aproximadamente -35°C o menor, de manera opcional aproximadamente -38°C o menor.

La segunda etapa de eliminación de agua puede llevarse a cabo a una temperatura de aproximadamente 10°C o mayor, de manera opcional aproximadamente 15°C o mayor, de manera opcional aproximadamente 20°C o mayor.

Al menos una de las etapas de eliminación de agua primera y segunda puede llevarse a cabo a una presión de 50 |ibar o menos. Opcionalmente, ambas etapas de eliminación de agua primera y segunda pueden llevarse a cabo a una presión de 50 |ibar o menos.

La formulación liofilizada puede ser la formulación liofilizada del primer aspecto de la invención.

Según un tercer aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende la formulación del primer aspecto de la invención y un portador biocompatible, en una forma adecuada para la administración a mamíferos.

El portador biocompatible puede ser un disolvente, normalmente un disolvente acuoso, normalmente agua. El disolvente puede ser un fluido.

El “portador biocompatible” puede ser un fluido, especialmente un líquido, en el que el agente de obtención de imágenes puede suspenderse o disolverse, de modo que la composición sea fisiológicamente tolerable, es decir, pueda administrarse al cuerpo de un mamífero sin toxicidad ni incomodidad indebida. Convenientemente, el portador biocompatible es un portador líquido inyectable tal como agua para inyección estéril y libre de pirógenos; una disolución acuosa tal como solución salina (que ventajosamente puede equilibrarse para que el producto final para inyección sea isotónico); una disolución acuosa de una o más sustancias que ajustan la tonicidad (por ejemplo, sales de cationes de plasma con contraiones biocompatibles), azúcares (por ejemplo, glucosa o sacarosa), alcoholes de azúcar (por ejemplo, sorbitol o manitol), glicoles (por ejemplo, glicerol) u otros materiales de polioles no iónicos (por ejemplo, polietilenglicoles, propilenglicoles y similares). El portador biocompatible puede ser agua para inyección libre de pirógenos o solución salina isotónica. Los agentes de obtención de imágenes y el portador biocompatible se suministran, cada uno, en viales o recipientes adecuados que comprenden un envase sellado que permite el mantenimiento de la integridad estéril y/o la seguridad radioactiva, más opcionalmente un gas inerte de espacio de cabeza (por ejemplo, nitrógeno o argón), al tiempo que permite la adición y extracción de disoluciones por jeringa o cánula. Un envase de este tipo preferido es un vial sellado con una membrana de goma, en el que el cierre hermético al gas se engarza con un sobresellado (normalmente de aluminio). El cierre es adecuado para una única o múltiples perforaciones con una aguja hipodérmica (por ejemplo, un cierre de sello con membrana de goma engarzado) mientras mantiene la integridad estéril. Tales envases tienen la ventaja adicional de que el cierre puede resistir el vacío si se desea (por ejemplo, para cambiar el gas de espacio de cabeza o desgasificar disoluciones) y soportar cambios de presión, tales como reducciones de presión, sin permitir la entrada de gases atmosféricos externos, tales como oxígeno o vapor de agua.

La composición farmacéutica puede tener una dosificación adecuada para un único paciente y puede proporcionarse en una jeringa o recipiente adecuado.

Los envases de dosis múltiples comprenden un solo vial a granel (por ejemplo, de 10 a 30 cm3 de volumen) que contiene dosis para múltiples pacientes, por lo que la dosis para un único paciente puede extraerse así en jeringas de grado clínico en varios intervalos de tiempo durante la vida útil viable de la preparación para adaptarse a la situación clínica. Las jeringas precargadas están diseñadas para contener una sola dosis humana, o “dosis unitaria” y, por tanto, son preferiblemente jeringas desechables u otras adecuadas para uso clínico. Las composiciones farmacéuticas pueden tener una dosificación adecuada para un único paciente y pueden proporcionarse en una jeringa o envase adecuado, tal como se describió anteriormente.

La composición farmacéutica puede tener un pH de entre aproximadamente pH 6,8 y aproximadamente pH 9, opcionalmente entre aproximadamente pH 6,8 y aproximadamente pH 8,2, opcionalmente entre aproximadamente pH 7 y aproximadamente pH 8.

Según un cuarto aspecto de la invención, se proporciona un kit para la preparación de la composición farmacéutica del tercer aspecto de la invención, comprendiendo el kit la formulación del primer aspecto de la invención en forma sólida y estéril de manera que tras la reconstitución con un suministro estéril del portador biocompatible del tercer aspecto de la invención, se produce la disolución para dar la composición farmacéutica deseada.

La forma sólida y estéril puede ser un sólido liofilizado.

Dado a conocer en el presente documento, y que no forma parte de la invención reivindicada, se proporciona un método de obtención de imágenes del cuerpo de un mamífero que comprende el uso de al menos una de la formulación del primer aspecto de la invención y la composición farmacéutica del tercer aspecto de la invención. Se apreciará que para el uso in vivo, la formulación se elabora para dar una forma adecuada para la administración a mamíferos mediante, por ejemplo, reconstitución con un portador biocompatible.

La obtención de imágenes puede ser in vivo.

La obtención de imágenes puede obtención de imágenes ópticas.

Por el término “obtención de imágenes ópticas” se entiende cualquier método que forme una imagen para la detección, estadificación o diagnóstico de una enfermedad, seguimiento del desarrollo de la enfermedad o seguimiento del tratamiento de la enfermedad basado en la interacción con la luz en la región del rojo al infrarrojo cercano (longitud de onda 400-1.200 nm). La obtención de imágenes ópticas incluye además todos los métodos desde la visualización directa sin el uso de ningún dispositivo y con el uso de dispositivos tales como diversos endoscopios, catéteres y equipos de obtención de imágenes ópticas, por ejemplo, hardware asistido por ordenador para presentaciones tomográficas. Las modalidades y técnicas de medición incluyen, pero no se limitan a: obtención de imágenes por fluorescencia, obtención de imágenes por luminiscencia; endoscopia; endoscopia por fluorescencia; tomografía de coherencia óptica; obtención de imágenes por transmitancia; obtención de imágenes por transmitancia resuelta en el tiempo; obtención de imágenes confocales; microscopía no lineal; obtención de imágenes fotoacústicas; obtención de imágenes acústico-ópticas; espectroscopia; espectroscopia de reflectancia; interferometría; interferometría de coherencia; tomografía óptica difusa y tomografía óptica difusa mediada por fluorescencia (sistemas de onda continua, dominio del tiempo y dominio de la frecuencia), y medición de la dispersión de la luz, la absorción, la polarización, la luminiscencia, la vida útil de la fluorescencia, el rendimiento cuántico y la extinción. Más detalles de estas técnicas se proporcionan en: (Tuan Vo-Dinh (editor): “Biomedical Photonics Handbook” (2003), CRC Press LCC; Mycek & Pogue (editores): “Handbook of Biomedical Fluorescence” (2003), Marcel Dekker, Inc.; Splinter & Hopper: “An Introducción to Biomedical Optics” (2007), CRC Press LCC.

La obtención de imágenes puede ser para obtener imágenes de sitios de localización o sobreexpresión de cMet. La formulación del primer aspecto de la invención o la composición farmacéutica del tercer aspecto de la invención puede haberse administrado previamente al cuerpo de un mamífero.

El método de obtención de imágenes ópticas puede usar obtención de imágenes por reflectancia de fluorescencia (FRI). En FRI, el agente de obtención de imágenes de la presente invención se administra a un sujeto que va a ser diagnosticado y, posteriormente, la superficie del tejido del sujeto se ilumina con una luz de excitación, habitualmente excitación de onda continua (CW). La luz excita la molécula indicadora (IM). La fluorescencia del agente de obtención de imágenes, que se genera mediante la luz de excitación, se detecta mediante un detector de fluorescencia. La luz que regresa puede filtrarse para separar el componente de fluorescencia (única o parcialmente). Se forma una imagen a partir de la luz fluorescente. Habitualmente, se realiza un procesamiento mínimo (sin procesador para calcular parámetros ópticos tales como la vida útil, el rendimiento cuántico, etc.) y la imagen mapea la intensidad de fluorescencia. El agente de obtención de imágenes está diseñado para concentrarse en el área de la enfermedad, produciendo una mayor intensidad de fluorescencia. Por tanto, el área de la enfermedad produce un contraste positivo en una imagen de intensidad de fluorescencia. La imagen puede obtenerse usando una cámara CCD o un chip, de manera que es posible obtener imágenes en tiempo real.

La longitud de onda para la excitación varía dependiendo del tipo de tinte usado. El aparato para generar la luz de excitación puede ser una fuente de luz de excitación convencional tal como: un láser (por ejemplo, láser iónico, láser de tinte o láser semiconductor); fuente de luz halógena o fuente de luz de xenón. Pueden usarse opcionalmente diversos filtros ópticos para obtener la longitud de onda de excitación óptima.

El método puede comprender las etapas de:

a) iluminar la superficie del tejido de interés con una luz de excitación;

b) detectar la fluorescencia del agente de obtención de imágenes, que se genera por excitación del agente de obtención de imágenes;

c) opcionalmente filtrar la luz detectada mediante el detector de fluorescencia para separar el componente fluorescente; y

d) formar una imagen de la superficie del tejido de interés a partir de la luz fluorescente de las etapas (b) o (c). La luz de excitación de la etapa (a) puede ser de naturaleza de onda continua (CW).

La etapa (a) puede llevarse a cabo dentro del cuerpo de un mamífero.

Un método de obtención de imágenes alternativo utiliza FDPM (migración de fotones en el dominio de la frecuencia). Esto tiene ventajas con respecto a los métodos de onda continua (CW) donde es importante una mayor profundidad de detección del IM dentro del tejido [Sevick-Muraca et al, Curr.Opin.Chem.Biol., 6, 642-650 (2002)]. Para tal obtención de imágenes en el dominio de la frecuencia/tiempo, es ventajoso que el IM tenga propiedades fluorescentes que puedan modularse dependiendo de la profundidad del tejido de la lesión de la que se va a obtener la imagen y del tipo de instrumentación empleada.

El método puede comprender las etapas de:

a) exponer el tejido biológico que dispersa la luz de dicho cuerpo de un mamífero que tiene una composición heterogénea a la luz de una fuente de luz con una intensidad variable en el tiempo predeterminada para excitar el agente de obtención de imágenes, dispersando de manera múltiple el tejido la luz de excitación;

b) detectar una emisión de luz dispersada de manera múltiple desde el tejido en respuesta a dicha exposición; c) cuantificar una característica de fluorescencia en todo el tejido a partir de la emisión estableciendo varios valores con un procesador, correspondiendo cada uno de los valores a un nivel de la característica de fluorescencia en una posición diferente dentro del tejido, variando el nivel de la característica de fluorescencia con la composición heterogénea del tejido; y

d) generar una imagen del tejido mapeando la composición heterogénea del tejido según los valores de la etapa (c).

El método de obtención de imágenes ópticas puede comprender obtención de imágenes por fluorescencia, opcionalmente endoscopia por fluorescencia.

El método puede usarse para ayudar en la detección, el diagnóstico, la cirugía, la estadificación, el tratamiento, la monitorización del tratamiento, la monitorización de la evolución de la enfermedad o la monitorización de la terapia.

El método puede usarse para ayudar en la detección, el diagnóstico, la cirugía, la estadificación, el tratamiento, la monitorización del tratamiento, la monitorización de la evolución de la enfermedad o la monitorización de la terapia de cáncer, opcionalmente cáncer colorrectal.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona al menos una de la formulación del primer aspecto de la invención y la composición farmacéutica del tercer aspecto de la invención para su uso como agente de obtención de imágenes en la obtención de imágenes del cuerpo de un mamífero.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona al menos una de la formulación del primer aspecto de la invención y la composición farmacéutica del tercer aspecto de la invención para su uso como medicamento. Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona al menos una de la formulación del primer aspecto de la invención y la composición farmacéutica del tercer aspecto de la invención para su uso en la detección, el diagnóstico, la cirugía, la estadificación, el tratamiento, la monitorización del tratamiento, la monitorización de la evolución de la enfermedad o la monitorización de la terapia.

Según un aspecto adicional de la invención se proporciona al menos una de la formulación del primer aspecto de la invención y la composición farmacéutica del tercer aspecto de la invención para su uso en la detección, el diagnóstico, la cirugía, la estadificación, el tratamiento, la monitorización del tratamiento, la monitorización de la evolución de la enfermedad o la monitorización de la terapia de uno o más de un estado precanceroso y cáncer, opcionalmente uno o más de cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de cabeza, cáncer de cuello, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de páncreas, cáncer de tiroides, cáncer de estómago y sarcoma.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona al menos una de la formulación del primer aspecto de la invención y la composición farmacéutica del tercer aspecto de la invención para su uso en la detección, el diagnóstico, la cirugía, la estadificación, el tratamiento, la monitorización del tratamiento, la monitorización de la evolución de la enfermedad o la monitorización de la terapia de sitios de localización o sobreexpresión de cMet. Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona al menos una de la formulación del primer aspecto de la invención y la composición farmacéutica del tercer aspecto de la invención para su uso en la obtención de una imagen de sitios de localización o sobreexpresión de cMet, opcionalmente in vivo.

Dado a conocer en el presente documento, y que no forma parte de la invención reivindicada, se proporciona un método para la detección, el diagnóstico, la cirugía, la estadificación, el tratamiento, la monitorización del tratamiento, la monitorización de la evolución de la enfermedad o la monitorización de la terapia usando al menos una de la formulación del primer aspecto de la invención y la composición farmacéutica del tercer aspecto de la invención.

Dado a conocer en el presente documento, y que no forma parte de la invención reivindicada, se proporciona un método de obtención de imágenes del cuerpo de un mamífero usando al menos una de la formulación del primer aspecto de la invención y la composición farmacéutica del tercer aspecto de la invención.

Dado a conocer en el presente documento, y que no forma parte de la invención reivindicada, se proporciona un método para la detección, el diagnóstico, la cirugía, la estadificación, el tratamiento, la monitorización del tratamiento, la monitorización de la evolución de la enfermedad o la monitorización de la terapia de uno o más de un estado precanceroso y cáncer, opcionalmente uno o más de cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de cabeza, cáncer de cuello, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de páncreas, cáncer de tiroides, cáncer de estómago y sarcoma, usando al menos una de la formulación del primer aspecto de la invención y la composición farmacéutica del tercer aspecto de la invención.

Dado a conocer en el presente documento, y que no forma parte de la invención reivindicada, se proporciona un método para la detección, el diagnóstico, la cirugía, la estadificación, el tratamiento, la monitorización del tratamiento, la monitorización de la evolución de la enfermedad o la monitorización de la terapia de sitios de localización o sobreexpresión de cMet usando al menos una de la formulación del primer aspecto de la invención y la composición farmacéutica del tercer aspecto de la invención.

Dado a conocer en el presente documento, y que no forma parte de la invención reivindicada, se proporciona un método de obtención de una imagen de sitios de localización o sobreexpresión de cMet, opcionalmente in vivo, usando al menos una de la formulación del primer aspecto de la invención y la composición farmacéutica del tercer aspecto de la invención.

Dado a conocer en el presente documento, y que no forma parte de la invención reivindicada, se proporciona el uso de al menos una de la formulación del primer aspecto de la invención y la composición farmacéutica del tercer aspecto de la invención.

Dado a conocer en el presente documento, y que no forma parte de la invención reivindicada, se proporciona el uso de al menos una de la formulación del primer aspecto de la invención y la composición farmacéutica del tercer aspecto de la invención en la detección, el diagnóstico, la cirugía, la estadificación, el tratamiento, la monitorización del tratamiento, la monitorización de la evolución de la enfermedad o la monitorización de la terapia.

Dado a conocer en el presente documento, y que no forma parte de la invención reivindicada, se proporciona el uso de al menos una de la formulación del primer aspecto de la invención y la composición farmacéutica del tercer aspecto de la invención como agente de obtención de imágenes.

Dado a conocer en el presente documento, y que no forma parte de la invención reivindicada, se proporciona el uso de al menos una de la formulación del primer aspecto de la invención y la composición farmacéutica del tercer aspecto de la invención en la detección, el diagnóstico, la cirugía, la estadificación, el tratamiento, la monitorización del tratamiento, la monitorización de la evolución de la enfermedad o la monitorización de la terapia de uno o más de un estado precanceroso y cáncer, opcionalmente uno o más de cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de cabeza, cáncer de cuello, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de páncreas, cáncer de tiroides, cáncer de estómago y sarcoma.

Dado a conocer en el presente documento, y que no forma parte de la invención reivindicada, se proporciona el uso de al menos una de la formulación del primer aspecto de la invención y la composición farmacéutica del tercer aspecto de la invención en la detección, el diagnóstico, la cirugía, la estadificación, el tratamiento, la monitorización del tratamiento, la monitorización de la evolución de la enfermedad o la monitorización de la terapia de sitios de localización o sobreexpresión de cMet.

Dado a conocer en el presente documento, y que no forma parte de la invención reivindicada, se proporciona el uso de al menos una de la formulación del primer aspecto de la invención y la composición farmacéutica del tercer aspecto de la invención en la obtención de una imagen de sitios de localización o sobreexpresión de cMet, opcionalmente in vivo.

Las características alternativas y diferentes realizaciones tal como se describen se aplican a todos y cada uno de los aspectos y a todas y cada una de las realizaciones de los mismos mutatis mutandis.

Breve descripción de los dibujos

Ahora se describirán realizaciones de la invención, a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos, en los que: la figura 1 representa un API (EMI-137).

Descripción detallada

Un agente de obtención de imágenes ópticas tal como se describe en el documento WO2008/139207 se usó para realizar una serie de experimentos para hallar una formulación más estable que ilustrara una mejor reconstitución, en particular a un pH y/o tonicidad apropiados para uso intravenoso. El compuesto usado fue EMI-137 tal como se muestra en la figura 1.

Los experimentos discutidos a continuación usaron la sal de acetato de EMI-137, pero todos los pesos y cálculos se realizaron usando el ion libre.

Después de la reconstitución, un producto farmacológico intravenoso debe ser una solución isotónica y tener un pH fisiológico para que sea adecuado para la administración intravenosa. También debe ser homogéneo y debe solubilizarse sin formación de aglomerados. Sin embargo, cuando se disuelve en agua, EMI-137 tiene un pH de 4,6 y muestra un grado significativo de formación de estructuras o aglomerados más grandes. Esta aglomeración es sólo parcialmente reversible al aumentar el pH de la disolución, haciéndola no apta para la administración intravenosa. Por tanto, se requiere una formulación que en la reconstitución tenga un pH adecuado para la administración intravenosa, y que sea sustancialmente homogénea y sustancialmente libre de aglomerados o partículas. Además, EMI-137 tiene una vida útil razonablemente corta y, por tanto, para fines prácticos y de seguridad, no es muy útil en su forma aislada. Por tanto, se requiere una formulación que prolongará la estabilidad y la vida útil de EMI-137.

Preparación de y obtención de imágenes usando EMI-137

El ejemplo 1 proporciona la síntesis de un péptido cMBP (compuesto 1 (que comprende SEQ-7)). El ejemplo 2 proporciona la síntesis de un péptido relacionado como control negativo, en el que la secuencia peptídica del compuesto 1 se reorganiza al azar, para proporcionar el compuesto 2, que tiene la secuencia peptídica:

Thr-Gly-Glu-Cys-Thr-Cys-Pro-Tyr-Trp-Glu-Phe-Arg-Pro-Cys-Glu-Cys-Gly-Ser-Tyr-Ser-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys

(SEQ-8).

El ejemplo 3 proporciona la síntesis de tinte de cianina Cy5** El ejemplo 4 proporciona la síntesis de un éster activo de Cy5**. El ejemplo 5 proporciona la conjugación de tintes de cianina con péptidos (péptido cMBP y control). Los compuestos 3 (que comprende SEQ-7), 4 (que comprende SEQ-8), 5 (que comprende SEQ-7), 6 (que comprende SEQ-7) y 7 (que comprende SEQ-8) se compararon de esta manera. El ejemplo 6 proporciona un método de determinación de la afinidad de los péptidos por cMet in vitro. Estos resultados muestran que la unión es selectiva, incluso cuando se une un resto de obtención de imágenes indicador óptico (un tinte de cianina). El ejemplo 7 proporciona los datos en las pruebas in vivo de los compuestos 5 y 7 en un modelo animal de cáncer. Tumor superior: se observaron razones de fondo con el compuesto 5, mientras que el compuesto 7 (control negativo) no discriminó entre el tumor y el fondo.

Las estructuras de los compuestos se proporcionan en la tabla 2 a continuación.

Tabla 2: estructuras de los compuestos

Ejemplo 1: Síntesis del compuesto 1 Etapa (a): síntesis de péptido lineal precursor protegido.

El péptido lineal precursor tiene la estructura:

Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys(Acm)-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys(Acm)-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2 (que comprende SEQ-7).

Se ensambló la resina de peptidilo H-Ala-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Gly-Pro-Pro-Arg(Pbf)-Phe-Glu(OtBu)-Cys(Acm)-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(^^MeMepro)-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Gly-Gly-Gly-Lys(Boc)-polímero (que comprende SEQ-7) en un sintetizador de péptidos 433A de Applied Biosystems usando química de Fmoc a partir de 0,1 mmol de resina de amida de Rink de Novagel. Se aplicó un exceso de 1 mmol de aminoácidos preactivados (usando HBTU) en las etapas de acoplamiento. Se incorporó pseudoprolina Glu-Thr (Novabiochem 05-20-1122) en la secuencia. Se transfirió la resina a un aparato burbujeador de nitrógeno y se trató con una disolución de anhídrido acético (1 mmol) y NMM (1 mmol) disueltos en ^dC^m(5 ml) durante 60 min. Se eliminó por filtración la disolución de anhídrido y se lavó la resina con DCM y se secó bajo una corriente de nitrógeno.

Se llevó a cabo la eliminación simultánea de los grupos protectores de la cadena lateral y la escisión del péptido de la resina en TFA (10 ml) que contenía el 2,5% de TIS, el 2,5% de 4-tiocresol y el 2,5% de agua durante 2 horas y 30 min. Se eliminó por filtración la resina, se eliminó el TFA a vacío y se añadió dietil éter al residuo. Se lavó el precipitado formado con dietil éter y se secó al aire proporcionando 264 mg de péptido en bruto.

La purificación mediante HPLC preparativa (gradiente: el 20-30% de B durante 40 min donde A = H²O/TFA al 0,1% y B = ACN/TFA al 0,1%, velocidad de flujo: 10 ml/min, columna: Phenomenex Luna 5 ^ C18 (2) 50 x 21,20 mm, detección: UV 214 nm, tiempo de retención del producto: 30 min) del péptido en bruto proporcionó 100 mg del precursor lineal del compuesto 1 puro. Se analizó el producto puro mediante HPLC analítica (gradiente: el 10-40% de B durante 10 min donde A = H²O/TFA al 0,1% y B = a Cn/TFA al 0,1%, velocidad de flujo: 0,3 ml/min, columna: Phenomenex Luna 3 ^ C18 (2) 50 x 2 mm, detección: UV 214 nm, tiempo de retención del producto: 6,54 min). La caracterización adicional del producto se llevó a cabo usando espectrometría de masas por electropulverización (MH²²⁺calculado: 1464,6, MH²²⁺encontrado: 1465,1).

Etapa (b): Formación del puente de disulfuro monocíclico Cys4-16

Cys4-16; Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys(Acm)-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys(Acm)-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2 (que comprende SEQ-7).

Se disolvió el precursor lineal de la etapa (a) (100 mg) en DMSO al 5%/agua (200 ml) y se ajustó la disolución a un pH de 6 usando amoníaco. Se agitó la mezcla de reacción durante 5 días. Luego, se ajustó la disolución a un pH de 2 usando TFA y se eliminó la mayor parte del disolvente por evaporación a vacío. Se inyectó el residuo (40 ml) en porciones en una columna de HPLC preparativa para la purificación del producto.

La purificación mediante HPLC preparativa (gradiente: el 0% de B durante 10 min, luego el 0-40% de B durante 40 min donde A = H²O/TFA al 0,1% y B = ACN/TFA al 0,1%, velocidad de flujo: 10 ml/min, columna: Phenomenex Luna 5 ^ C18 (2) 250 x 21,20 mm, detección: UV 214 nm, tiempo de retención del producto: 44 min) del residuo proporcionó 72 mg del precursor monocíclico del compuesto 1 puro. Se analizó el producto puro (como una mezcla de isómeros P1 a P3) mediante HPLC analítica (gradiente: el 10-40% de B durante 10 min donde A = H²O/TFA al 0,1% y B = ACN/TFA al 0,1%, velocidad de flujo: 0,3 ml/min, columna: Phenomenex Luna 3 ^ C18 (2) 50 x 2 mm, detección: UV 214 nm, tiempo de retención del producto: 5,37 min (P1); 5,61 minutos (P2); 6,05 minutos (P3)). Se llevó a cabo la caracterización adicional del producto usando espectrometría de masas por electropulverización (MH²²⁺calculado: 1463,6, MH²²⁺encontrado: 1464,1 (P1); 1464,4 (P2); 1464,3 (P3)).

Etapa (c): Formación del segundo puente de disulfuro Cys6-14 (compuesto 1)

Se disolvió el precursor monocíclico de la etapa (b) (72 mg) en AcOH al 75%/agua (72 ml) bajo una cobertura de nitrógeno. Se añadieron HCl 1 M (7,2 ml) y I²0,05 M en AcOH (4,8 ml) en ese orden y se agitó la mezcla durante 45 min. Se añadió ácido ascórbico 1 M (1 ml) proporcionando una mezcla incolora. Se evaporó la mayor parte de los disolventes a vacío y se diluyó el residuo (18 ml) con agua/TFA al 0,1% (4 ml) y se purificó el producto usando HPLC preparativa.

La purificación mediante HPLC preparativa (gradiente: el 0% de B durante 10 min, luego el 20-30% de B a lo largo de 40 min donde A = H²O/TFA al 0,1% y B = ACN/TFA al 0,1%, velocidad de flujo: 10 ml/min, columna: Phenomenex Luna 5 ^ C18 (2) 250 x 21,20 mm, detección: UV 214 nm, tiempo de retención del producto: 43 53 min) del residuo proporcionó 52 mg de compuesto 1 puro. Se analizó el producto puro mediante HPLC analítica (gradiente: el 10-40% de B a lo largo de 10 min donde A = H²O/TFA al 0,1% y B = ACN/TFA al 0,1%, velocidad de flujo: 0,3 ml/min, columna: Phenomenex Luna 3 ^ C18 (2) 50 x 2 mm, detección: UV 214 nm, tiempo de retención del producto: 6,54 min). Se llevó a cabo caracterización adicional del producto usando espectrometría de masas por electropulverización (MH²²⁺calculado: 1391,5, MH²²⁺encontrado: 1392,5).

Ejemplo 2: Síntesis del compuesto 2

Ac-Thr-Gly-Glu-Cys-Thr-Cys(Acm)-Pro-Tyr-Trp-Glu-Phe-Arg-Pro-

Cys(Acm)-Glu- Cys-Gly-Ser-Tyr-Ser-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys-Nhh

El compuesto 2 (que comprende SEQ-8) es un control negativo, en el que se ha reorganizado al azar la secuencia peptídica del compuesto 1.

Etapa (a): Síntesis del péptido lineal precursor protegido

Se ensambló la resina de peptidilo -Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Pro-Tyr(tBu)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Arg(Pbf}-Pro-Cys(Acm)-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Gly-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(^^MeMepro)-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys(Boc)-polímero (que comprende s Eq -8) en un sintetizador de péptidos 433A de Applied Biosystems usando química de Fmoc a partir de 0,1 mmol de resina de amida de Rink de Novagel. Se aplicó un exceso de 1 mmol de aminoácidos preactivados (usando HBTU) en las etapas de acoplamiento. Se incorporó pseudoprolina Tyr-Ser (Novabiochem 05-20-1014) en la secuencia. Se transfirió la resina a un aparato burbujeador de nitrógeno y se trató con una disolución de anhídrido acético (1 mmol) y NMM (1 mmol) disueltos en DCM (5 ml) durante 60 min. Se eliminó por filtración la disolución de anhídrido y se lavó la resina con DCM y se secó bajo una corriente de nitrógeno.

Se llevó a cabo la eliminación simultánea de los grupos protectores de la cadena lateral y la escisión del péptido de la resina en TFA (10 ml) que contenía el 2,5% de TIS, el 2,5% de 4-tiocresol y el 2,5% de agua durante 2 horas y 10 min. Se eliminó por filtración la resina, se eliminó el TFA a vacío y se añadió dietil éter al residuo. Se lavó el precipitado formado con dietil éter y se secó al aire proporcionando 216 mg de péptido en bruto.

La purificación mediante HPLC preparativa (gradiente: el 20-30% de B a lo largo 40 min donde A = H²O/TFA al 0,1% y B = ACN/TFA al 0,1%, velocidad de flujo: 50 ml/min, columna: Phenomenex Luna 5 ^ C18 (2) 250 x 50 mm, detección: UV 214 nm, tiempo de retención del producto: 34,1 min) del péptido en bruto proporcionó precursor lineal de control negativo DX-1662 puro disuelto en 200 ml de ACN/agua. Se analizó el producto puro mediante HPLC analítica (gradiente: el 10-40% de B a lo largo de 5 min donde A = H²O/TFA al 0,1% y B = ACN/TFA al 0,1%, velocidad de flujo: 0,6 ml/min, columna: Phenomenex Luna 3 ^ C18 (2) 20 x 2 mm, detección: UV 214 nm, tiempo de retención del producto: 3,52 min). Se llevó a cabo caracterización adicional del producto usando espectrometría de masas por electropulverización (MH²²⁺calculado: 1464,6, MH²²⁺encontrado: 1464,9).

Etapa (b): Formación de puente de disulfuro monocíclico Cvs4-16.

Cys4-16; Ac-Thr-Gly-Glu-Cys-Thr-Cys(Acm)-Pro-Tyr-Trp-Glu-Phe-Arg-

Pro-Cys(Acm)-Glu-Cys-Gly-Ser-Tyr-Ser-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys-

NH2 (que comprende SEQ-8).

Se añadió DMSO (10 ml) a la disolución de precursor lineal de control negativo de la etapa (a) (200 ml, véase 4.3.1) y se ajustó la disolución a un pH de 7 usando amoniaco. Se calentó la mezcla de reacción a 40°C durante 18 horas, luego a 60°C durante 60 min. Se ajustó la disolución a un pH de 2 usando TFA y se eliminó por evaporación el ACN a vacío. Se sometió el residuo a purificación mediante HPLC preparativa.

La purificación mediante HPLC preparativa (gradiente: el 0% de B durante 5 min, luego el 20-30% de B a lo largo de 60 min donde A = H²O/TFA al 0,1% y B = ACN/TFA al 0,1%, velocidad de flujo: 50 ml/min, columna: Phenomenex Luna 5 ^ C18 (2) 250 x 50 mm, detección: UV 214 nm, tiempo de retención del producto: 29,6 min) del residuo proporcionó precursor monocíclico de control negativo puro en 100 ml de ACN/agua. Se analizó el producto puro mediante HPLC analítica (gradiente: el 10-40% de B a lo largo de 5 min donde A = H²O/TFA al 0,1% y B = ACN/TFA al 0,1%, velocidad de flujo: 0,6 ml/min, columna: Phenomenex Luna 3 ^ C18 (2) 20 x 2 mm, detección: UV 214 nm, tiempo de retención del producto: 3,46 min). Se llevó a cabo caracterización adicional del producto usando espectrometría de masas por electropulverización (MH²²⁺calculado: 1463,6, MH²²⁺encontrado: 1463,7).

Etapa (c): Formación del puente de disulfuro Cvs6-14 (compuesto 2)

Cys4-16, 6-14; Ac-Thr-Gly-Glu-Cys-Thr-Cys-Pro-Tyr-Trp-Glu-Phe-Arg-

Pro-Cys-Glu-Cys-Gly-Ser-Tyr-Ser-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys-Nhte

{que comprende SEG-8).

Se diluyó la disolución de precursor monocíclico de control negativo de la etapa (b) (100 ml) con AcOH (100 ml). Se añadieron HCI 1 M (5 ml) y I²0,05 M en AcOH (7 ml) en ese orden bajo una cobertura de argón y se agitó la mezcla durante 20 min. Se añadió ácido ascórbico 1 M (1 ml) proporcionando una mezcla incolora. Se evaporó la mayor parte de los disolventes a vacío y se diluyó el residuo (30 ml) con agua/TFA al 0,1% (100 ml) y se purificó el producto usando HPLC preparativa. La purificación mediante H^pL^cpreparativa (gradiente: el 0% de B durante 10 min, luego el 20-30% de B a lo largo de 60 min donde A = H²O/TFA al 0,1% y B = ACN/TFA al 0,1%, velocidad de flujo: 50 ml/min, columna: Phenomenex Luna 5 ^ C18 (2) 250 x 50 mm, detección: UV 214 nm, tiempo de retención del producto: 32,8 min) del residuo proporcionó 30 mg de compuesto 2 puro. Se analizó el producto puro mediante HPLC analítica (gradiente: el 10-40% de B a lo largo de 10 min donde A = H²O/TFA al 0,1% y B = ACN/TFA al 0,1%, velocidad de flujo: 0,3 ml/min, columna: Phenomenex Luna 3 ^ C18 (2) 50 x 2 mm, detección: UV 214 nm, tiempo de retención del producto: 6,54 min). Se llevó a cabo caracterización adicional del producto usando espectrometría de masas por electropulverización (MH²²⁺calculado: 1391,5, MH²²⁺encontrado: 1392,5).

Ejemplo 3: Síntesis del tinte de cianina 2-{(1E,3E,I5E)-5-[1-(5-carboxipentil)-3,3-dimetil-5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-vilideno]penta-1,3-dienil-3-metil-1,3-6/s(4-sulfobut¡l)-3H-¡ndol¡o-5-sulfonato (Cy5**)

(3a) Acido 5-metil-6-oxoheptano-1-sulfónico

Se añadió 2-metilacetoacetato de etilo (50 g) en DMF (25 ml) a una suspensión de hidruro de sodio (12,0 g de NaH al 60% en aceite mineral) en DMF (100 ml), gota a gota con enfriamiento en baño de hielo a lo largo de 1 hora, (temperatura interna 0-4°C). Se dejó calentar esta mezcla hasta temperatura ambiental durante 45 min con agitación antes de volver a enfriar. Luego se añadió gota a gota una disolución de 1,4-butanosultona (45 g) en DMF (25 ml) a lo largo de 15 minutos. Se calentó la mezcla final a 60°C durante 18 horas. Se eliminó el disolvente mediante evaporación rotatoria y se repartió el residuo entre agua y dietil éter. Se recogió la fase acuosa, se lavó con dietil éter recién preparado y se sometió a evaporación rotatoria para proporcionar una espuma pegajosa. Se disolvió este producto intermedio en agua (100 ml) y se añadió hidróxido de sodio (17,8 g) a lo largo de 15 minutos con agitación. Se calentó la mezcla a 90°C durante 18 horas. Se ajustó la mezcla de reacción enfriada a ~pH 2 mediante la adición de ácido clorhídrico concentrado (~40 ml). Se sometió a evaporación rotatoria la disolución y se secó a vacío. Se lavó el sólido amarillo con etanol que contenía ácido clorhídrico al 2% (3x150 ml). Se filtró la disolución etanólica, se sometió a evaporación rotatoria y se secó a vacío para proporcionar un sólido amarillo. Rendimiento 70 g.

(3b) Acido 2,3-dimetil-3-(4-sulfobutil)-3H-indol-5-sulfónico, sal de dipotasio

Se mezclaron ácido 4-hidrazinobencenosulfónico (40 g), ácido 5-metil-6-oxoheptano-1-sulfónico (de 3a; 60 g) y ácido acético (500 ml) y se calentaron a reflujo durante 6 horas. Se filtró el disolvente, se sometió a evaporación rotatoria y se secó a vacío. Se disolvió el sólido en metanol (1 l). A esto se le añadió hidróxido de potasio metanólico 2 M (300 ml). Se agitó la mezcla durante 3 horas y luego se redujo el volumen de disolvente al 50% usando evaporación rotatoria. Se filtró el precipitado resultante, se lavó con metanol y se secó a vacío. Rendimiento 60 g. EM (CLEM): MH+ 362. Masa de ac.: encontrada, 362,0729. MH+ = C14H2ONO6S2 requiere m/z 362,0732 (-0,8ppm).

(3c) 2,3-dimetil-13-bis(4-sulfobutil)-3H-indolio-5-sulfonato, sal de dipotasio

Se calentó ácido 2,3-dimetil-3-(4-sulfobutil)-3H-indol-5-sulfónico (de 3b; 60 g) con 1,4-butanosultona (180 g) y tetrametilensulfona (146 ml) a 140°C durante 16 horas. Se lavó el sólido rojo resultante con dietil éter, se trituró para dar un polvo y se secó a vacío. Rendimiento 60 g.

(3d) Cv5**, como sal de TFA

Se calentaron ácido 1-(5’-carboxipentil)-2,3,3-trimetil-indolio-bromuro-5-sulfónico, sal de K+ (2,7 g), monoclorhidrato de malonaldehído-bis(fenilimina) (960 mg), anhídrido acético (36 ml) y ácido acético (18 ml) a 120°C durante 1 hora para proporcionar una disolución de color marrón oscuro-rojo. Se enfrió la mezcla de reacción hasta temperatura ambiental. Se añadieron 2,3-dimetil-1,3-bis(4-sulfobutil)-3H-indolio-5-sulfonato (de 3c; 8,1 g) y acetato de potasio (4,5 g) a la mezcla, que se agitó durante 18 horas a temperatura ambiental. Se precipitó la disolución azul resultante usando acetato de etilo y se secó a vacío. Se purificó el tinte en bruto mediante cromatografía de líquidos (RPC18. Gradiente de agua TFA al 0,1%/MeCN TFA al 0,1%). Se recogieron las fracciones que contenían el pico principal de tinte, se combinaron y se evaporaron a vacío para proporcionar el tinte del título, 2 g. UV/Vis (agua TFA al 0,1%): 650 nm. MS (MALDI-TOF): MH+ 887,1. MH+ = C38H50N2O14S4 requiere m/z 887,1.

Ejemplo 4: Síntesis del 2-[(1£,3£,5£)-5-(1-{6-[2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]-6-oxohexil}-3,3-dimetil-5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-ilideno]penta-1,3-dienil-3-metil-1,3-bis(4-sulfobutil)-3H-indolio-5-sulfonato, sal de diisopropiletilamina (éster de NHS de Cy5**)

Se disolvió Cy5** (ejemplo 3; 10 mg) en DMSO anhidro (3 ml); a esto se le añadieron HSPyU (20 mg) y N,N’-diisopropiletilamina (80 |al). Se mezcló la disolución resultante durante 3 horas, tras lo cual la CCF (RPC18. agua/MeCN) reveló una reacción completa. Se aisló el tinte mediante precipitación en acetato de etilo/dietil éter, se filtró, se lavó con acetato de etilo y se secó a vacío. UV/Vis (Agua) 650nm. MS (MALDI-TOF) MH+ 983,5. MH+ = C42H53N3O16S4 requiere m/z 984,16.

Ejemplo 5: Conjugación de tintes, síntesis de los compuestos 3 a 7

Cys4-16, 6-14; Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr Gly-Gly-Gly-Lys(Cy5)-NH2 (Compuesto 3) (que comprende SEQ-7).

Se disolvieron compuesto 1 (10 mg), NMM (4 |il) y éster de NHS de Cy5 (5,7 mg; GE Healthcare PAI 5104) en NMP (1 ml) y se agitó la mezcla de reacción durante 7 horas. Luego se diluyó la mezcla de reacción con ACN al 5%/agua (8 ml) y se purificó el producto usando HPLC preparativa.

La purificación mediante HPLC preparativa (gradiente: el 5-50% de B a lo largo de 40 min donde A = H2O/HCOOH al 0,1% y B = ACN/HCOOH al 0,1%, velocidad de flujo: 10 ml/min, columna: Phenomenex Luna 5 |i C18 (2) 250 x 21,20 mm, detección: UV 214 nm, tiempo de retención del producto: 35,5 min) del péptido en bruto proporcionó 8,1 mg de compuesto 3 puro. Se analizó el producto puro mediante HPLC analítica (gradiente: el 5-50% de B a lo largo de 10 min donde A = H2O/HCOOH al 0,1% y B = ACN/HCOOH al 0,1%, velocidad de flujo: 0,3 ml/min, columna: Phenomenex Luna 3 |i C18 (2) 50 * 2 mm, detección: UV 214 nm, tiempo de retención del producto: 8,15 min). Se llevó a cabo caracterización adicional del producto usando espectrometría de masas por electropulverización (MH22+ calculado: 1710,6, MH22+ encontrado: 1711,0).

Se preparó el compuesto 4 de una manera similar - espectrometría de masas por electropulverización (MH22+ calculado: 1710,6, Mh2²⁺encontrado: 1710,9).

Se prepararon otros conjugados de tinte-péptido (compuestos 5 a 7) mediante métodos análogos. Se adquirió Alexa647 de Molecular Probes (A20106):

Compuesto 5 (MH22+ calculado: 1825,7, MH22+ encontrado: 1825,9),

Compuesto 6 (MH22+ calculado: 1811,7, MH22+ encontrado: 1812,0),

Compuesto 7 (MH22+ calculado: 1825,7, MH22+ encontrado: 1826,2).

Ejemplo 6: Ensayo de polarización de fluorescencia in vitro

El principio del método de polarización de fluorescencia puede describirse brevemente de la siguiente manera: La luz monocromática pasa a través de un filtro polarizador horizontal y excita las moléculas fluorescentes de la muestra. Sólo aquellas moléculas que se orientan correctamente en el plano polarizado verticalmente adsorben la luz, se excitan y posteriormente emiten luz. La luz emitida se mide en planos tanto horizontales como verticales. El valor de anisotropía (A) es la razón entre las intensidades de luz siguiendo la ecuación:

A = (Intensidad con polarizador horizontal - intensidad con polarizador vertical)/(intensidad con polarizador horizontal 2* intensidad con polarizador vertical).

Las mediciones de anisotropía de fluorescencia se realizaron en microplacas de 384 pocillos en un volumen de 10 |il en tampón de unión (PBS, Tween-20 al 0,01%, pH 7,5) usando un lector de placas de polarización de fluorescencia Tecan Safire (Tecan, EE. UU.) a ex646/em678 nm. La concentración de péptido marcado con tinte se mantuvo constante (20 nM) y las concentraciones de la quimera cMet/Fc humana o de ratón (R&D Systems) o semaforina 6A (R&D Systems) se variaron de 0-150 nM. Las mezclas de unión se equilibraron en la microplaca durante 10 min a 30°C. El cambio observado en la anisotropía se ajustó a la ecuación:

(Kd + cMet + P) - J(K0 + cMet P) 2 - 4 ■ cMet ■ P

r obs ~ r libre 0 "unido ~ ?libre ) 2 ■ p

donde robs es la anisotropía observada, rlibre es la anisotropía del péptido libre, runido es la anisotropía del péptido unido, K^des la constante de disociación, cMet es la concentración total de cMet y P es la concentración total de péptido marcado con tinte. La ecuación supone que el péptido sintético y el receptor forman un complejo reversible en disolución con estequiometría 1:1. Se realizó el ajuste de datos a través de regresión no lineal usando el software GraphPad Prism para obtener el valor de K^d(unión de un sitio).

Se sometieron a prueba los compuestos 3 y 4 para determinar la unión con cMet humana y de ratón (quimera Fc). Los resultados mostraron una K^dde 3 /- 1 nM para la unión del compuesto 3 a c-Met humana. No hubo unión del compuesto 4 a la cMet humana. Además, los compuestos 3 y 4 no mostraron unión a cMet de ratón en el intervalo sometido a prueba.

Usando el mismo método, se halló que el compuesto 5 tenía una K^dpara cMet humana de 1,1 nM.

Ejemplo 7: Pruebas in vivo de los compuestos 5 y 7

(a) Modelo animal

Se usaron en el estudio 54 ratones hembra BALB c/A desnudos (Bom). El comité de ética local aprobó el uso de los animales. BALB c/A desnudo es una raza de ratón inmunodeprimida endocriada con una alta tasa de aceptación de tumores humanos en comparación con otras razas de ratones desnudos. Los ratones tenían 4 semanas de edad cuando llegaron y un peso corporal de aproximadamente 20 gramos al inicio del estudio. Se alojaron los animales en jaulas ventiladas individualmente (IVC, Scanbur BK) con aire filtrado por HEPA. Los animales tenían acceso a demanda a la dieta “Rat and Mouse n.° 3 Breeding” (Scanbur BK) y agua del grifo acidificada mediante adición de HCl a una concentración molar de 1 mM (pH 3,0).

La célula de cáncer de colon HCT-15 se deriva de carcinomas de colon humanos y se informa que expresa cMet según Zeng et al [Clin. Exp. Metastasis, 21, 409-417. (2004)]. Se demostró que la línea celular era oncógena cuando se inoculó por vía subcutánea en ratones desnudos [Flatmark et al, Eur. J. Cancer 40,1593-1598 (2004)]. Se cultivaron células HCT-15 y se prepararon para inoculación subcutánea en RPMI (n.° de cat. de Sigma R0883) con suero al 10% y penicilina/estreptomicina. Se hicieron reservas en el pase número cuatro (P4) y se congelaron para su almacenamiento en nitrógeno líquido a 3*107 células/vial en los medios de cultivo que contienen DMSO al 5%. El día del trasplante, se descongelaron las células rápidamente en un baño de agua a 37°C (aproximadamente 2 min), se lavaron y se resuspendieron en PBS/suero al 2% (centrifugación a 1200 rpm durante 10 min). Se aseguró una mezcla rigurosa de las células en los viales cada vez que se aspiraron las células en la jeringa dosificadora. Se inyectaron volúmenes de 0,1 ml de suspensión celular s.c. en el hombro y en la espalda usando una aguja de calibre fino (25 G) mientras los animales estaban bajo anestesia con gas ligero. A continuación, los animales se devolvieron a sus jaulas y se permitió que los tumores crecieran durante 13-17 días. Luego se permitió a los animales un periodo de aclimatación de al menos 5 días antes del procedimiento de inoculación.

(b) Procedimiento

Se reconstituyeron todas las sustancias de prueba con PBS a partir de polvo secado por congelación. Se obtuvieron imágenes de una pequeña pila de papel de impresora blanco para obtener una imagen de campo plano que se usó para corregir las faltas de homogeneidad de la iluminación. Se inyectaron por vía intravenosa las sustancias de prueba en la vena lateral de la cola durante la fijación física. El volumen de inyección fue de 0,1 ml, lo que corresponde a una dosis de 1 nmol de sustancia de prueba por animal. Después de la inyección, se devolvieron los animales a sus jaulas. Se sacrificaron los animales inmediatamente antes de la obtención de imágenes por luxación cervical. Se estimó el punto de tiempo de obtención de imágenes óptimo para cada sustancia de prueba basándose en la comparación de las tasas de periodo de reposo farmacológico en la piel y en el tejido muscular en un número limitado de animales (n=1-6). El punto de tiempo de obtención de imágenes para los compuestos 3 y 4 fue 120 minutos después de la inyección. Para cada animal, se extirparon los tumores desarrollados subcutáneamente después de la muerte. Se cortó un corte fino, de aproximadamente 1,6 mm de grosor y 3-4 mm de diámetro, del borde de uno de los tumores. A continuación, se obtuvieron imágenes del corte tumoral contra un área de colon normal del mismo animal.

(c) Obtención de imágenes

Se realizó la obtención de imágenes a través de un laparoscopio clínico adaptado para usar una fuente de luz para excitar al indicador y un sistema de filtrado para extraer el componente de fluorescencia. Se usó un láser de 635 nm para la excitación de la molécula indicadora. Como detector se usó una cámara Hamamatsu ORCA ERG CCD. Se hizo funcionar la cámara en modo de agrupaciones pequeñas 2x2 con ganancia 0. El tiempo de exposición convencional para la obtención de imágenes de colon fue de 10 s. Las mediciones de calibración del sistema indican que el tiempo de exposición de 10 s con el sistema de obtención de imágenes de animales corresponde a una exposición de 40 ms con una fuente de luz, un campo de visión y una distancia a la superficie del tejido clínicamente relevantes. La distribución de intensidad en la imagen se corrigió por falta de homogeneidad de iluminación a través de datos de calibración del sistema. Se calculó una razón diana con respecto a fondo a partir de las regiones de interés colocadas sobre el tumor y el fondo de colon normal. Las imágenes se puntuaron visualmente usando el sistema de puntuación convencional empleado para el análisis de características operativas del receptor.

(d) Resultados

El compuesto 5 tenía una razón tumor con respecto a normal de 1,46:1 y el correspondiente péptido de control reorganizado al azar con el mismo tinte (compuesto 7) tenía una razón de 1,04:1. El compuesto 5 tenía un tumor fácilmente identificable, mientras que no se pudo distinguir nada contra el fondo con el compuesto 7.

Preparación de formulación de EMI-137 liofilizada

Es necesario secar por congelación de manera eficaz la formulación (por ejemplo, sin golpes ni o colapso) para proporcionar un sólido homogéneo que sea estable. Tal como se indicó previamente, el pH de EMI-137 en agua es de aproximadamente 4,6, que no es adecuado para la administración intravenosa. Por tanto, los requisitos adicionales de la formulación son que en la reconstitución tenga un pH que sea adecuado para la administración intravenosa. Además, la tonicidad de la formulación en la reconstitución debe ser adecuada para la administración intravenosa. Un beneficio adicional sería que la formulación pudiera almacenarse a temperatura ambiente, aunque también sería aceptable el almacenamiento refrigerado.

Los estudios de formulación iniciales mostraron que las formulaciones que tenían un pH de menos de aproximadamente pH 6,8 tendían a aglomerarse. Por tanto, cualquier formulación que proporcionara un pH por debajo de 6,8 se consideró inaceptable. Además, se sabe que a un pH de más de aproximadamente pH 8 (en algunos casos hasta aproximadamente pH 9) existe el riesgo de degradación de los puentes disulfuro (de los cuales hay dos en EMI-137). Por tanto, sería beneficioso llegar a una formulación que en la reconstitución proporcione un pH lo suficientemente alto para evitar la aglomeración, pero lo suficientemente bajo para mitigar el riesgo de degradación de los puentes disulfuro.

Por tanto, para mantener el pH de la disolución de EMI-137 dentro de un intervalo aceptable en la reconstitución, es necesario incluir un tampón antes del secado por congelación. Los estudios han demostrado que la viscosidad de la disolución de EMI-137 aumenta en presencia de solución salina tamponada con fosfato enriquecida con cloruro de potasio (PBS), y que se desarrolla una formación sustancial de gel. Este efecto de gelificación no se observó cuando se disolvió EMI-137 en tampón fosfato de sodio a pH 7,4. Por tanto, se descartó el uso de NaCl y KCI (debido a problemas de gelificación).

El proceso de liofilización se llevó a cabo tal como se destaca en la tabla 3.

Tabla 3: Parámetros de liofilización

La liofilización se llevó a cabo de la siguiente manera.

Los constituyentes de las formulaciones, tal como se destaca en las tablas 4A a 4F a continuación, se añadieron a un recipiente de liofilización adecuado. Obsérvese que todos los componentes enumerados (incluyendo el tampón) se añadieron antes de la liofilización.

La fase de carga se lleva a cabo aproximadamente a -40°C. Luego se reduce la temperatura hasta aproximadamente -55°C. La velocidad de enfriamiento puede ser de aproximadamente 1,5°C por minuto. Luego se mantiene la mezcla en condiciones de congelación en estado estacionario durante al menos dos horas. Luego se reduce la presión hasta 50 |ibar, lo que tarda aproximadamente 45 minutos. Luego se aumenta la temperatura hasta aproximadamente -38°C para la fase de secado primario. La velocidad de calentamiento puede ser de aproximadamente 1°C por minuto. Luego se mantiene la mezcla en condiciones de congelación en estado estacionario durante aproximadamente nueve días. Luego se calienta la mezcla hasta aproximadamente 30°C a una velocidad de aproximadamente 6,8°C por hora durante al menos un periodo de diez horas (fase de transición de secado primario a secundario, o “fase en rampa”). Luego se mantiene la mezcla en condiciones de secado secundario en estado estacionario durante aproximadamente seis horas. Luego se enfría la mezcla hasta aproximadamente 20°C a una velocidad de aproximadamente 1°C por minuto, antes de añadir el gas de espacio de cabeza (es decir, gas inerte tales como argón o nitrógeno), liberando así el vacío en el recipiente de liofilización. Luego se descarga/almacena el producto a 5°C.

La etapa de secado primario, la fase en rampa y la etapa de secado secundario se llevan a cabo todas colocando la mezcla en un vacío de aproximadamente 50 |ibar. Esta presión puede introducirse en la fase de secado primario y luego mantenerse hasta la fase de almacenamiento/descarga.

Se sabe que el uso de un tampón tal como el fosfato de sodio provoca un cambio de pH hacia un pH bajo durante la congelación y, por tanto, se esperaba que la formulación fuera difícil de secar por congelación sin colapsar, ya que las temperaturas de transición vítrea de los concentrados congelados serían bajas. Como tal, la presente invención incluye un regulador de la tonicidad y un lioprotector combinados. El manitol es uno de los agentes de carga más ampliamente usados y documentados en el secado por congelación, pero se han informado varios problemas térmicos y complicaciones de cristalización que podrían afectar potencialmente la producción y la estabilidad del producto. Como tal, normalmente no se piensa que el uso de manitol sólo sea ventajoso en la liofilización y se sabe que da lugar a varios problemas.

Como la combinación de tampón y lioprotectores en la presente invención era difícil de secar por congelación sin experimentar el colapso de la torta secada por congelación, se requería un ciclo de secado por congelación a la medida. El ciclo de secado por congelación se seleccionó para tener un vacío y una temperatura de estantes suficientemente bajos para lograr una temperatura de hielo baja para evitar esta refusión/colapso de la torta secada por congelación. Debe evitarse el colapso de la torta secada por congelación para evitar que EMI-137 forme estructuras/aglomerados más grandes durante la etapa de secado del procedimiento de secado por congelación (se ha hallado que esto sucede a un pH de menos de 6,8 y no es completamente reversible).

Después de algunos estudios iniciales de formulación, y en vista de lo anterior, se eligieron las siguientes variables para pruebas adicionales:

• Tampón: fosfato de sodio o Tris HCl (25, 40 y 55 mM);

• Lioprotector: sacarosa o manitol.

Ejemplos de formulaciones liofilizadas

Se investigaron las formulaciones candidatas usando un diseño factorial con cuatro variables combinadas con un diseño de nivel mixto tal como se muestra en las tablas 4A a 4F. El diseño se componía de un diseño fraccional de dos niveles con cuatro variables (muestras 1 a 8), cuatro puntos centrales (muestras 10 a 13), y un diseño de niveles mixtos con tres niveles para el principio activo farmacéutico (API) y dos niveles para las variables categóricas de tipo de tampón y tipo de lioprotector (muestras 14 a 21). Además, se incluyeron diversas muestras de referencia (muestras 22 a 24). También se estudiaron dos muestras adicionales (muestras 25 y 26). La muestra 25 se refiere a la composición de la disolución antes del secado por congelación en 1 ml de agua, y la muestra 26 se refiere a una formulación típica adicional que se preparó basándose en los resultados de las muestras previas.

Tabla 4A: Diseño de clasificación de formulación (mg/ml)

Tabla 4B: Diseño de clasificación de formulación (mg)

Tabla 4C: Diseño de clasificación de formulación (mmol)

Tabla 4D: Diseño de clasificación de formulación (razón molar)

Tabla 4E: Diseño de clasificación de formulación (% p/p antes del secado por congelación)

Tabla 4F: Diseño de clasificación de formulación (% p/p después del secado por congelación)

Las referencias a (1), (2), (3) y (4) en las tablas 4A a 4F anteriores son las siguientes:

(1) 0,25 mg/ml de NaH2PO4 anh. 3,25 mg/ml de NaH2PO4 anh.

(2) 0,56 mg/ml de NaH2PO4 anh. 7,14 mg/ml de NaH2PO4 anh.

(3) 0,41 mg/ml de NaH2PO4 anh. 5,19 mg/ml de NaH2PO4 anh.

(4) 0,50877 mg/ml de NaH2PO4 anh. 6,49467 mg/ml de NaH2PO4 anh.

Las cantidades de fosfato de sodio anhidro e hidratado usadas se ilustran a continuación en la tabla 5.

Tabla 5: Cantidad equivalente de fosfato de sodio hidratado

Las masas molares usadas en las formulaciones fueron las siguientes:

• Dihidrogenofosfato de sodio (anhidr.) = 119,98 g/mol

• Hidrogenofosfato de disodio (anhidr.) = 141,96 g/mol

• Tris HCl = 121,14 g/mol

• Manitol = 182,17 g/mol

• Sacarosa = 342,29 g/mol

• EMI-137 = 3,650,3 g/mol

A partir de lo anterior, puede observarse que intervalo del tampón fosfato de sodio = 4,26 - 18,26% p/p antes del secado por congelación y 9,78 - 35,22% p/p después del secado por congelación, mientras que el intervalo del tampón Tris HCl = 3,27 - 12,63% p/p antes del secado por congelación y 3,27 - 12,63% p/p después del secado por congelación.

Los materiales usados en las formulaciones se enumeran en la tabla 6 a continuación.

Tabla 6: Materiales usados en las formulaciones para la clasificación

Al estudio de clasificación le siguió un estudio de estabilidad previa de 4 semanas a 25°C y 40°C. El conjunto de experimentos se diseñó para lograr la clasificación de tampones y lioprotectores seleccionados y para someter a prueba la robustez en torno a las concentraciones de API relevantes para la producción (objetivo de 4,8 mg/ml). Se estudió un intervalo de 10% alrededor de la concentración objetivo. El diseño también descubriría interacciones potenciales entre EMI-137, tampón y lioprotectores. Como todas las muestras se hicieron isotónicas, la concentración de tampón y la concentración de lioprotector fueron covariables. Los parámetros de prueba se muestran en la tabla 7. Además de las pruebas en proceso de la disolución a granel antes del secado por congelación, las pruebas también incluyeron muestras de la etapa de congelación para descubrir si una posible inestabilidad podría atribuirse al procedimiento de congelación o secado.

Tabla 7: Parámetros de prueba

Resultados de la formulación liofilizada

Los datos de estabilidad de hasta 102 meses de 2 a 8°C, 61 meses a 30°C y 6 meses a 40°C se ilustran en las tablas 8A a 8C, 9A a 9C y 10, respectivamente (se usan las siguientes claves/abreviaturas: Amb = humedad ambiental, no regulada; NMT = no más de; ND = no detectado; ---: no realizado; *punto de muestreo a 24 meses pospuesto debido a las vacaciones de verano; **punto de muestreo adicional).

Tabla 8A: Estabilidad de la formulación de EMI-137 almacenada a 5°C durante 102 meses

Tabla 8B: Estabilidad de la formulación de EMI-137 almacenada a 5°C durante 102 Meses

Tabla 8C: Estabilidad de la formulación de EMI-137 almacenada a 5°C durante 102 meses

Tabla 9A: Estabilidad de la formulación de EMI-137 almacenada a 30°C durante 61 meses

Tabla 9B: Estabilidad de la formulación de EMI-137 almacenada a 30°C durante 61 Meses

Tabla 9C: Estabilidad de la formulación de EMI-137 almacenada a 30°C durante 61 Meses

Tabla 10: Estabilidad de la formulación de EMI-137 almacenada a 40°C durante 6 meses

Los parámetros de prueba se muestran anteriormente (tabla 7). Se sometió a prueba la pureza mediante HPLC con detección UV/visual a 650 nm y se expresó como unidades de % de área.

La aglomeración se expresó como intensidad de dispersión medida mediante espectroscopía de correlación de fotones (PCS). La evaluación de la reconstitución y el aspecto visual después del secado por congelación siguió un sistema de calificación desarrollado para describir diversas características de las tortas secadas por congelación.

Aspecto visual después del secado por congelación

En general, las buenas propiedades de carga del manitol dieron una muy buena estructura a todas las formulaciones que contenían manitol. Las tortas que contenían fosfato de manitol parecían tener un color azul/blanquecino no homogéneo en la pared del vial a diferencia de las formulaciones de manitol-Tris-HCl. Dado que el principio activo es de un azul intenso, estos gradientes de color se volvieron muy pronunciados. Se esperaba que el aspecto no homogéneo se originara en parte de la naturaleza inherentemente aleatoria de la congelación y en parte de las propiedades de la formulación. Cuando se reconstituyó con agua, el producto era una disolución homogénea. Los otros resultados analíticos, tanto inicialmente como durante el periodo de estabilidad previa, indicaron que el aspecto no homogéneo podría considerarse como un problema puramente cosmético. La sacarosa en combinación con Tris-HCl tendía a colapsarse/fundirse en un grado variable durante el secado por congelación. Se observó una variación considerable de vial a vial, ya que el 50% del lote tenía tortas secadas por congelación sin colapso aparente. Tras el almacenamiento a 40°C, los tapones parcialmente colapsados se convirtieron gradualmente en material completamente colapsado, ya observado después de siete días. Esto puede deberse a una elevada concentración de agua en el material colapsado. El colapso masivo observado durante el almacenamiento tuvo un efecto negativo sobre la pureza, la reconstitución y la tendencia a formar aglomerados.

Reconstitución después del secado por congelación

Todas las formulaciones tamponadas que contenían lioprotector se reconstituyeron fácilmente usando agitación muy suave durante unos segundos. Los resultados no se vieron alterados para las muestras con tapones no colapsados y moderadamente colapsados después de cuatro semanas de almacenamiento (25°C y 40°C). Los tapones secados por congelación colapsados masivamente fueron muy difíciles de reconstituir. Estos productos también tenían una pureza inferior y contenían aglomerados. Las formulaciones sin lioprotectores (muestras 22 a 24) necesitaron más mezclado para la reconstitución, pero todavía se consideraron aceptables.

pH

Para las formulaciones tamponadas con fosfato de sodio, el pH se mantuvo estable durante el secado por congelación, pero disminuyó durante las cuatro semanas de almacenamiento a 40°C. Las formulaciones tamponadas con Tris-HCl tuvieron una disminución del pH durante el secado por congelación, pero generalmente fueron más estables durante el almacenamiento a 40°C. Los resultados del pH fueron difíciles de interpretar y el análisis quimiométrico no dio una imagen clara. No pudieron atribuirse tendencias al manitol ni a la sacarosa. Sin embargo, estaba claro que un aumento en la concentración de tampón fosfato reduciría la caída del pH durante el almacenamiento. A una baja concentración de tampón, la caída del pH aumentaría con una mayor concentración de EMI-137. Las formulaciones de Tris-HCl fueron aún más sensibles al aumento de la concentración del principio activo EMI-137. Esto indicó que debe seleccionarse una concentración de tampón en el intervalo de prueba superior.

Aglomerados (PCS)

Se sometió a prueba cada formulación mediante PCS para detectar la presencia de grandes estructuras/aglomerados antes y después del secado por congelación, y al final del periodo de estabilidad previa de cuatro semanas. Las formulaciones de punto central (muestras 10 a 13) también se sometieron a prueba después de una semana y dos semanas. Los valores por debajo de aproximadamente 20 ks/s se consideraron como fondo y no se consideraron como aglomerados. No se detectaron aglomerados en ninguna de las disoluciones a granel antes del secado por congelación. Todas las formulaciones que contenían lioprotectores se consideraron libres de estructuras/aglomerados más grandes después del secado por congelación. Después de cuatro semanas de almacenamiento a 40°C, todas las muestras aún estaban libres de aglomerados 4, excepto una muestra colapsada masivamente (muestra 17) y la muestra no tamponada 24 que contenía EMI-137 en agua. Esta última formulación tenía un pH de 4,2. La aglomeración a pH bajo fue consistente con los hallazgos iniciales previos. Sin embargo, la formulación tamponada con fosfato sin lioprotector (sacarosa o manitol) contenía aglomerados después del secado por congelación (muestra 23). El análisis de las muestras reconstituidas mostró la presencia de estructuras grandes de aproximadamente 100 nm. Los aglomerados se formaron durante el procedimiento de secado, no durante la etapa de congelación, ya que no se encontraron aglomerados en las muestras extraídas después de la congelación. Se sabe que el tampón fosfato de sodio forma gradientes de pH y cambia el pH hacia valores bajos durante la congelación debido a la diferencia en la solubilidad y cristalización de las sales de fosfato. Se ha informado un pH tan bajo como 3,5. A este pH se formarían aglomerados en la disolución de EMI-137. Aunque congelado, el periodo prolongado a este pH durante el secado por congelación podría conducir potencialmente a la formación de aglomerados. Se cree que el manitol y la sacarosa evitaron que esto sucediera (no se necesitó lioprotector en las formulaciones de Tris-HCl. El Tris-HCl cambiaría el pH hacia un pH alto (>9) durante la congelación). Se concluyó que la refusión/colapso significativos afectará al nivel de aglomerados del producto farmacológico y debe evitarse. Se confirmó que se formarían aglomerados a pH bajo. Cuando se usó tampón fosfato como constituyente durante el secado por congelación, se necesitó un lioprotector para evitar que EMI-137 formara estructuras/aglomerados más grandes durante la etapa de secado del procedimiento de secado por congelación.

Calorimetría diferencial de barrido (DSC)

Las formulaciones que representan los puntos centrales en el diseño de la formulación se analizaron mediante DSC como muestras concentradas por congelación. Aproximadamente 20 |il de muestra estaban contenidos en un crisol de aluminio sellado y se analizaron usando un instrumento de DSC Diamond de Perkin Elmer. Se enfriaron las muestras a -80°C a 5°C/min y se mantuvieron a -80°C durante 10 minutos, luego se calentaron hasta 24°C a 5°C/min en atmósfera de nitrógeno. Todos los cálculos se realizaron sobre los datos recogidos tras el calentamiento.

Formulaciones de manitol

La formulación de Tris-HCl-manitol tenía termogramas complejos, que mostraban tres transiciones vítreas diferentes y dos picos de cristalización. No se observó colapso visual de la torta secada por congelación a pesar de una transición vítrea por debajo de -60°C. Esto probablemente se debió a las propiedades de carga del manitol cristalizado. El termograma de la formulación de fosfato-manitol mostró dos transiciones vítreas y un pico de cristalización. Una de las transiciones vítreas se produjo entre -50°C y -60°C, que es significativamente menor que la temperatura operativa práctica de un liofilizador normal. La otra transición vítrea tuvo lugar alrededor de -41°C, que está cerca del límite operativo cuando se diseña un ciclo de secado por congelación. Aparte de una ligera contracción de la torta secada por congelación, no hubo refusión/colapso macroscópico de las formulaciones de fosfato-manitol. Se anticipó que el manitol había cristalizado parcialmente y que la porción cristalizada del manitol era suficiente para dar estabilidad mecánica al producto secado por congelación. El pico de cristalización exotérmica observado a -27,6°C (inicio de Tcrist) correspondió a la temperatura potencial de desvitrificación del manitol, ya que puede producirse una recristalización ligeramente por encima de la Tg' del manitol (de -33°C a -27°C) al calentar la formulación.

Formulaciones de sacarosa

Los termogramas de las formulaciones que contenían sacarosa mostraron dos eventos térmicos de acuerdo con transiciones vítreas muy por debajo de -50°C y a aproximadamente de -35°C a -37°C, respectivamente. No se observaron picos de cristalización o fusión eutéctica para ninguna de las formulaciones que contenían sacarosa, de acuerdo con el contenido de sacarosa. Sin embargo, el flujo de calor de reacciones de cristalización muy pequeñas no sería perceptible si se superpusiera con el flujo de calor mucho mayor del lado de baja temperatura de la fusión endotérmica del agua. Se observó un colapso visual significativo en algunos de los viales que contenían TrisHCl-sacarosa, pero no en la formulación que contenía fosfato-sacarosa. Aunque los datos de DSC podrían interpretarse a favor de la formulación que contiene fosfato-sacarosa (muestra 13), se concluyó que el tamaño del lote de sólo doce viales era demasiado pequeño para determinar si podía esperarse que se produjera un problema similar con una formulación de fosfato-sacarosa.

Análisis de infrarrojo cercano (NIR)

Es bien sabido que el manitol tiene una fuerte tendencia a cristalizar a partir de disoluciones acuosas congeladas, tanto durante el enfriamiento como durante el recalentamiento, y también se ha observado que continúa cristalizando después del secado por congelación, ya que el procedimiento de secado por congelación puede producir material parcialmente amorfo y parcialmente cristalino. La cristalización durante el secado por congelación puede conducir a diferentes polimorfos anhidros (a, p, 8) y sus mezclas, lo que da lugar a transformaciones polimórficas durante el almacenamiento.

Los estudios en el NIR preliminares combinados con el análisis de componentes principales (PCA) indicaron la presencia de diferencias estructurales entre los viales, que se atribuyeron a diversos grados de cristalización. Pureza mediante HPLC

Los perfiles de pureza mediante HPLC mostraron que las formulaciones de fosfato y Tris-HCl tenían perfiles de pureza muy similares y también patrones de degradación similares en comparación con el EMI-137 puro. Además, las formulaciones que contenían sacarosa y manitol tenían perfiles de pureza similares. Se encontraron algunas pequeñas diferencias de razón entre algunos de los picos. No se observaron nuevos picos en ninguna de las formulaciones en comparación con el principio activo EMI-137. La concentración de tampón no pareció afectar. Sin embargo, durante el análisis del aspecto visual se observó que la sacarosa en combinación con Tris-HCl dio lugar a una variabilidad de vial a vial con respecto a los viales colapsados, ya que algunos viales tenían un aspecto perfecto mientras que otros tenían tortas secada por congelación colapsadas significativamente. Como tanto el Tris HCl como el fosfato de sodio son sustancias con baja Tg', se consideró que el tamaño del lote de doce viales era demasiado pequeño para descubrir posibles problemas similares con formulaciones que contienen fosfato-sacarosa.

Resumen del análisis quimiométrico

El modelado quimiométrico se centró en los cambios en la pureza mediante HPLC en función de las diversas formulaciones secadas por congelación a lo largo de un periodo de hasta cuatro semanas a 40°C, cambios químicos en los espectros de NIR para identificar cambios significativos en los viales secados por congelación degradados frente a los no degradados, y cambios en los aglomerados medidos mediante PCS. El modelado quimiométrico indicó que todas las formulaciones que contenían Tris-HCl tendrían más degradación en comparación con las formulaciones tamponadas con fosfato, aunque esto no podía detectarse fácilmente a partir de la comparación visual de los datos de pureza mediante HPLC. Las superficies de respuesta del análisis quimiométrico indicaron que el aumento de la concentración de Tris-HCl condujo a una mayor degradación e interacciones químicas. Generalmente, se concluyó que las formulaciones que contenían Tris HCI eran menos predecibles que el fosfato con respecto a la degradación química. Esto fue respaldado por el análisis de componentes principales (PCA) de los espectros de NIR obtenidos de las muestras 10 a 12 (que representan puntos centrales en el estudio de clasificación) y la correlación entre la pureza en el NIR y mediante HPLC.

Los modelos quimiométricos realizados con formulaciones que contenían fosfato de sodio fueron precisos y fiables. En combinación con sacarosa, las formulaciones tamponadas con fosfato eran químicamente muy estables dentro del espacio de formulación sometido a prueba, ya que se producía muy poca degradación. Sin embargo, se necesitaban más pruebas para confirmar que el colapso durante el secado por congelación no sería un problema potencial. Se concluyó que el fosfato de sodio en combinación con manitol proporcionaba una formulación adecuada a juzgar por todos los parámetros analizados.

Robustez/espacio de diseño

Aunque las trazas de HPLC mostraron que la concentración de tampón no parecía ser crucial para el perfil de degradación, el análisis quimiométrico indicó que podía esperarse que una mayor concentración de fosfato proporcionara un producto químicamente más estable cuando la formulación contenía manitol. La superficie de respuesta mostró un área particularmente estable por encima de la concentración de tampón de 40 mM, donde la concentración de EMI-137 no influyó significativamente en la degradación. Se sometió a prueba un espacio de diseño de 10% alrededor de la concentración objetivo de EMI-137. Esto cubre un intervalo de especificación normal para el contenido de principio activo. Se halló que una variación en la concentración de EMI-137 dentro de este intervalo apenas afectó a la pureza a concentraciones de tampón mayores, lo que le dio suficiente robustez a la formulación durante la fabricación. La superficie de respuesta de los cambios de pH demostró que el aumento en la concentración de tampón fosfato de sodio redujo los cambios de pH durante el almacenamiento. También se confirmó que la formulación no sería robusta a los cambios en la concentración de EMI-137 si la concentración del tampón era demasiado baja. A concentraciones de tampón por encima de 40 mM, los cambios de pH fueron de menos de 0,2 unidades de pH, cuando la concentración de EMI-137 varió 10% de la concentración objetivo (4,8 mg/ml). Por encima de 50 mM, los cambios de pH previstos durante el almacenamiento fueron pequeños y estables frente a las variaciones tanto de la concentración de EMI-137 como de la concentración de tampón, lo que otorga una buena robustez a la formulación durante la fabricación. El análisis multivariable mostró que la concentración de tampón puede variar entre 40 y 55 mM con una concentración de principio activo que varía entre 4,3 y 5,3 mg/ml sin afectar la calidad del producto farmacológico.

Prueba de afinidad del receptor de cMet in vitro

Se sometió a prueba la muestra 11 en cuanto a su afinidad por el receptor de c-Met y mostró datos de unión equivalentes a los del principio activo EMI-137 puro. Se concluyó que la formulación de manitol-fosfato 40 mM no afectó negativamente a la unión del péptido al receptor diana.

Análisis de los resultados de la formulación liofilizada

Tal como se ilustra en las tablas anteriores, la formulación de EMI-137 permanece estable durante un largo periodo de tiempo (102 meses), incluso a temperatura elevada, por tanto, tiene una vida útil prolongada. También es notable que no hay tendencia en la degradación del producto a lo largo de la escala de tiempo de medición, lo que es evidencia de una estabilidad excepcional. Además, es sorprendente que prácticamente no se formen sustancias relacionadas (es decir, impurezas) a lo largo del periodo de tiempo de medición, que no haya una tendencia en la formación de las mismas. Además, en la reconstitución, la formulación tiene un pH adecuado para la administración intravenosa (pH 7,5 aproximadamente) y se solubiliza sin aglomeración. Además, el sólido liofilizado seco conserva un aspecto azul heterogéneo. También vale la pena señalar que la formulación reconstituida permanece estable y sustancialmente libre de sustancias relacionadas hasta 24 horas después de la reconstitución. Por tanto, se ha demostrado que la formulación de EMI-137 es muy estable tanto en forma seca (liofilizada) como reconstituida.

Basándose en los resultados analíticos y el análisis quimiométrico, se extrajeron las siguientes conclusiones.

Es necesario tener tampón en la formulación durante la preparación y el secado por congelación para mantener un pH neutro y evitar la aglomeración. Se consideró que las formulaciones tamponadas con fosfato de sodio eran más robustas que las formulaciones de TrisHCl basándose en el análisis quimiométrico de todos los resultados. La concentración mínima de tampón fosfato debe ser de 40 mM. Se necesitaba lioprotector para secar por congelación la formulación tamponada con fosfato para evitar la formación de aglomerados durante el procedimiento de secado. Se demostró que el manitol tiene una buena actividad lioprotectora. Las tortas secadas por congelación colapsadas masivamente eran difíciles de reconstituir, tenían una pureza inferior y una tendencia a formar aglomerados. Esto no se observó en viales con refusión/colapso moderado, pero todavía claramente visible. Las formulaciones que contenían fosfato de sodio-sacarosa se consideraron las formulaciones químicamente más robustas, pero potencialmente no eran tan robustas desde el punto de vista del secado por congelación. Las formulaciones de fosfato de sodio-manitol secadas por congelación tenían un aspecto no homogéneo y eran menos “farmacéuticamente elegantes” que las formulaciones de Tris HCl-manitol ya que aparecen gradientes de color en las tortas secadas por congelación. Se anticipó que esto se originaría en la fase de congelación y se concluyó que era aceptable, ya que el producto formó una disolución homogénea tras la reconstitución. Las formulaciones que contenían Tris HCI tenían generalmente menos datos predictivos y, basándose en el análisis quimiométrico, estas formulaciones se consideraron potencialmente una opción más arriesgada (aunque todavía válida). La conclusión general del estudio fue que se consideró que la formulación que contenía fosfato de sodio-manitol proporcionaba un equilibrio satisfactorio de riesgo, previsibilidad y aceptabilidad basándose en los limitados datos de estabilidad previa disponibles, el análisis quimiométrico de los datos analíticos y las consideraciones de robustez, aunque Tris HCl y sacarosa también pueden usarse de manera independiente como alternativas.

Sumario

La presente invención enseña que para obtener una estabilidad adecuada del API, se requiere una formulación del producto farmacológico secado por congelación. Después de la reconstitución, el producto farmacológico debe ser una disolución isotónica y tener un pH fisiológico para que sea adecuado para la administración intravenosa. EMI-137 en agua tiene un pH de 4,6 y muestra un grado significativo de formación de estructuras o aglomerados más grandes. Esta aglomeración es sólo parcialmente reversible al aumentar el pH de la disolución, haciéndola así no apta para la administración intravenosa. Por tanto, un pH de más de 6,8 y menos de 9 (o potencialmente menor) es ventajoso, ya que no se observa la formación de aglomerados en este intervalo de pH. Este intervalo de pH debe mantenerse en todo momento y también debe aplicarse durante la fabricación de la disolución de producto farmacológico a granel. Por tanto, para mantener el pH de la disolución de EMI-137 dentro de un intervalo aceptable, es beneficioso incluir un tampón en la disolución antes del secado por congelación. También es beneficioso incluir un lioprotector para garantizar que el EMI-137 no se degrade durante el secado por congelación y un regulador de la tonicidad (que puede ser del mismo material que el lioprotector) para garantizar que el producto reconstituido sea isotónico y/o adecuado para administración intravenosa.

El uso del tampón y del lioprotector/regulador de la tonicidad tal como se describió anteriormente proporciona un sólido homogéneo que es estable y que, en la reconstitución, tiene un pH y una tonicidad adecuados para la administración intravenosa. Además, la formulación descrita conserva un pH suficiente durante la liofilización que evita que se produzca aglomeración, y que no da lugar a la ruptura de los puentes disulfuro en EMI-137. Además, la formulación puede almacenarse a temperatura ambiente durante largos periodos de tiempo sin una degradación notable y permanece estable en y después de la reconstitución.

Tal como se indicó anteriormente, para mantener el pH de la disolución de EMI-137 dentro de un intervalo aceptable en la reconstitución, es necesario incluir un tampón antes del secado por congelación.

Abreviaturas

Se usan abreviaturas convencionales de aminoácidos de una sola letra o de 3 letras.

Acm: Acetamidometilo

ACN (o MeCN): Acetonitrilo

Boc: ferc-Butiloxicarbonilo

DCM: Diclorometano

DMF: Dimetilformamida

DMSO: Dimetilsulfóxido

Fmoc: 9-Fluorenilmetoxicarbonilo

HBTU: Hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio

HPLC: Cromatografía de líquidos de alta resolución

HSPyU: Hexafluorofosfato de O-(N-succinimidil)-N,N,N',N'-tetrametilenuronio

NHS: N-hidroxi-succinimida

NMM: N-Metilmorfolina

NMP : 1 -Metil-2-pi rrolidinona

Pbf: 2,2,4,6,7-Pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo

PBS: Solución salina tamponada con fosfato

tBu: /-butilo

TFA: Ácido trifluoroacético

TIS: Triisopropilsilano

Trt: Tritilo

Tris HCl: Clorhidrato de 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol

Texto libre de la lista de secuencias

SEQ-1

Cysa-Xaa1-Cysc-Xaa2-Gly-Pro-Pro-Xaa3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Xaa4 Xaa5-Xaa6

Xaa1 es Asn, His o Tyr;

Xaa2 es Gly, Ser, Thr o Asn;

Xaa3 es Thr o Arg;

Xaa4 es Ala, Asp, Glu, Gly o Ser;

Xaa5 es Ser o Thr; y

Xaa6 es Asp o Glu.

Péptido de unión a cMet de 17 meros.

SEQ-2

Ser-Cysa-Xaa1-Cysc-Xaa2-Gly-Pro-Pro-Xaa3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Xaa4-Xaa5-Xaa6

Xaa1 es Asn, His o Tyr;

Xaa2 is Gly, Ser, Thr o Asn;

Xaa3 es Thr o Arg;

Xaa4 es Ala, Asp, Glu, Gly o Ser;

Xaa5 es Ser o Thr; y

Xaa6 es Asp o Glu.

Péptido de unión a cMet de 18 meros.

SEQ-3

Ala-Gly-Ser-Cysa-Xaa1-Cysc-Xaa2-Gly-Pro-Pro-Xaa3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Gly-Thr

Xaa1 es Asn, His o Tyr;

Xaa2 es Gly, Ser, Thr o Asn;

Xaa3 es Thr o Arg;

Xaa4 es Ala, Asp, Glu, Gly o Ser;

Xaa5 es Ser o Thr; y

Xaa6 es Asp o Glu.

Péptido de unión a cMet de 22 meros.

SEQ-4

Gly-Gly-Gly-Lys

Secuencia tetrapeptídica que es un parte del péptido de unión a cMet.

SEQ-5

Gly-Ser-Gly-Lys

Secuencia tetrapeptídica que es un parte del péptido de unión a cMet.

SEQ-6

Gly-Ser-Gly-Ser-Lys

Secuencia pentapeptídica que es un parte del péptido de unión a cMet.

SEQ-7

Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys

Péptido de unión a cMet de 26 meros.

SEQ-8

Péptido de unión a cMet reorganizado al azar de 26 meros (control negativo).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Formulación liofilizada que comprende:

(i) un principio activo farmacéutico (API);

(ii) un agente de tamponamiento; y

(iii) un lioprotector;

en la que:

Z1 está unido al extremo N-terminal de cMBP, y es H o MIG;

Z2 está unido al extremo C-terminal de cMBP, y es OH, NH2, OBc o MIG;

en el que Bc es un catión biocompatible;

cMBP es un péptido cíclico de unión a cMet de 17 a 30 aminoácidos, que comprende la secuencia de aminoácidos (S^eQ-1):

Cysa-Xaa1-Cysc-Xaa2-Gly-Pro-Pro-Xaa3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Xaa4-Xaa5-Xaa6;

en la que: Xaa1 es Asn, His o Tyr;

Xaa2 es Gly, Ser, Thr o Asn;

Xaa3 es Thr o Arg;

Xaa4 es Ala, Asp, Glu, Gly o Ser;

Xaa5 es Ser o Thr;

Xaa6 es Asp o Glu;

y Cysa-d son cada uno residuos de cisteína de manera que los residuos a y b, así como c y d, se ciclan para formar dos enlaces disulfuro independientes;

MIG es un grupo de inhibición del metabolismo, que es un grupo biocompatible que inhibe o suprime el metabolismo in vivo del péptido;

L es un grupo ligador sintético de fórmula -(A)m- en la que cada A es independientemente -CR2-, -CR=CR-, -CeC-, -CR2CO2-, - CO2CR2-, -NRCO-, -CONR-, -NR(C=O)NR-, -NR(C=S)NR-, - SO2NR-, -NRSO2-, CR2OCR2-, -CR2SCR2-, CR2NRCR2-, un grupo cicloheteroalquileno C4-8, un grupo cicloalquileno C4-8, un grupo arileno C5-12, un grupo heteroarileno C3-12, un aminoácido, un azúcar o un elemento estructural de polietilenglicol (PEG) monodisperso;

cada R se elige independientemente de H, alquilo C1-4, alquenilo C2-4, alquinilo C2-4, alcoxialquilo C1-4 o hidroxialquilo C1-4;

m es un número entero de valor de 1 a 20;

n es un número entero de valor 0 ó 1;

en la que la formulación comprende desde aproximadamente el 4 hasta aproximadamente el 12% en peso de API, desde aproximadamente el 3 hasta aproximadamente el 35% en peso de agente de tamponamiento, y desde aproximadamente el 56 hasta aproximadamente el 91% en peso de lioprotector; y en la que la formulación, cuando se reconstituye, tiene un pH de entre aproximadamente pH 6,8 y aproximadamente pH 9.

2. Formulación liofilizada según la reivindicación 1, en la que además de SEQ-1, el cMBP comprende además un residuo de Asp o Glu, o un análogo de los mismos, dentro de 4 residuos de aminoácido del extremo C- o N-terminal del péptido cMBP, y -(L)nIM se funcionaliza con un grupo amina, que se conjuga con la cadena lateral de carboxilo de dicho residuo de Asp o Glu, o un análogo de los mismos, para dar un enlace amida; y/o en la que además de SEQ-1, el cMBP comprende un residuo de Lys, o un análogo del mismo, dentro de 4 residuos de aminoácido del extremo C- o N-terminal del péptido cMBP, y -(L)nIM se funcionaliza con un grupo carboxilo, que se conjuga con la cadena lateral de amina épsilon de dicho residuo de Lys, o un análogo del mismo, para dar un enlace amida.

3. Formulación liofilizada según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que cMBP comprende la secuencia de aminoácidos de o bien SEQ-2 o bien SEQ-3:

Ala-Gly-Ser-Cysa-Xaa1-Cysc-Xaa2-Gly-Pro-Pro-Xaa3-Phe-Glu-Cysd-T rp-Cysb-Tyr-Xaa4-Xaa5-Xaa6-G ly-Thr (SEQ-3).

4. Formulación liofilizada según cualquier reivindicación anterior, en la que Xaa3 es Arg.

5. Formulación liofilizada según cualquier reivindicación anterior, en la que además de SEQ-1, SEQ-2 o SEQ-3, cMBP comprende además en el extremo N- o C- terminal un péptido ligador que se elige de - Gly-Gly-Gly-Lys (SEQ-4), -Gly-Ser-Gly-Lys-(SEQ-5) y -Gly-Ser-Gly-Ser-Lys (SEQ-6).

6. Formulación liofilizada según cualquier reivindicación anterior, en la que cMBP comprende la secuencia de aminoácidos (SEQ-7):

7. Formulación liofilizada según cualquier reivindicación anterior, en la que tanto Z1 como Z2 son independientemente MIG, en la que opcionalmente Z1 es acetilo y Z2 es una amida primaria.

8. Formulación liofilizada según cualquier reivindicación anterior, en la que IM es un tinte que tiene un máximo de absorbancia en el intervalo de 600 a 1.000 nm, en la que opcionalmente IM es un tinte de cianina, en la que opcionalmente el tinte de cianina tiene la fórmula III:

en la que:

R1 y R2 son independientemente H o SO3M1, y al menos uno de R1 y R2 es SO3M1, en el que M1 es H o Bc; R3 y R4 son independientemente alquilo C1-4 o carboxialquilo C1-6;

R5, R6, R7 y R8 son independientemente grupos Ra;

en los que Ra es alquilo C1-4, carboxialquilo C1-6 o -(CH2)kSO3M1, en el que k es un número entero de valor 3 ó 4; con la condición de que el tinte de cianina tenga un total de 1 a 4 sustituyentes SO3M1 en los grupos R1, R2 y Ra.

9. Formulación liofilizada según cualquier reivindicación anterior, en la que la formulación, cuando se reconstituye, tiene un pH de entre aproximadamente pH 6,8 y aproximadamente pH 8,2, opcionalmente entre aproximadamente pH 6,8 y aproximadamente pH 8, opcionalmente entre aproximadamente pH 7 y aproximadamente pH 8.

10. Formulación liofilizada según cualquier reivindicación anterior, en la que el agente de tamponamiento está presente en una cantidad para proporcionar, cuando se reconstituye, una disolución que tiene un pH de entre aproximadamente pH 6,8 y aproximadamente pH 9, opcionalmente entre aproximadamente pH 6,8 y aproximadamente pH 8,2, opcionalmente entre aproximadamente pH 6,8 y aproximadamente pH 8, opcionalmente entre aproximadamente pH 7 y aproximadamente pH 8.

11. Formulación liofilizada según cualquier reivindicación anterior, en la que la formulación comprende desde aproximadamente el 8 hasta aproximadamente el 10% en peso de API, de manera opcional aproximadamente el 9% en peso de API.

12. Formulación liofilizada según cualquier reivindicación anterior, en la que la formulación comprende desde aproximadamente el 7 hasta aproximadamente el 35% en peso de agente de tamponamiento, opcionalmente desde aproximadamente el 12 hasta aproximadamente el 35% en peso de agente de tamponamiento, opcionalmente desde aproximadamente el 15 hasta aproximadamente el 35% en peso de agente de tamponamiento, opcionalmente desde aproximadamente el 18 hasta aproximadamente el 35% en peso de agente de tamponamiento, opcionalmente desde aproximadamente el 25 hasta aproximadamente el 35% en peso de agente de tamponamiento, opcionalmente desde aproximadamente el 32 hasta aproximadamente el 35% en peso de agente de tamponamiento, de manera opcional aproximadamente el 32% en peso de agente de tamponamiento.

13. Formulación liofilizada según cualquier reivindicación anterior, en la que la formulación comprende desde aproximadamente el 56 hasta aproximadamente el 82% en peso de lioprotector, opcionalmente desde aproximadamente el 56 hasta aproximadamente el 77% en peso de lioprotector, opcionalmente desde aproximadamente el 56 hasta aproximadamente el 75% en peso de lioprotector, opcionalmente desde aproximadamente el 56 hasta aproximadamente el 72% en peso de lioprotector, opcionalmente desde aproximadamente el 56 hasta aproximadamente el 66% en peso de lioprotector, opcionalmente desde aproximadamente el 56 hasta aproximadamente el 58% en peso de lioprotector, de manera opcional aproximadamente el 58% en peso de lioprotector.

14. Formulación liofilizada según cualquier reivindicación anterior, en la que el agente de tamponamiento es al menos uno de un tampón fosfato y un tampón alcanolamina, opcionalmente en la que el tampón fosfato comprende hidrogenofosfato y dihidrogenofosfato, en la que opcionalmente el tampón fosfato está hidratado, en la que opcionalmente el tampón alcanolamina es tris(hidroximetil)aminometano.

15. Formulación liofilizada según cualquier reivindicación anterior, en la que el lioprotector es al menos uno de sacarosa y manitol, y derivados de los mismos, en la que opcionalmente el lioprotector es manitol, o un derivado del mismo.

16. Formulación liofilizada según cualquier reivindicación anterior, en la que la formulación comprende además un regulador de la tonicidad, en la que opcionalmente el lioprotector también actúa como regulador de la tonicidad.

17. Método de preparación de una formulación liofilizada, comprendiendo el método las etapas de:

b) realizar una primera etapa de eliminación de agua; y

c) realizar una segunda etapa de eliminación de agua;

en el que el lioprotector y el agente de tamponamiento se añaden antes de llevarse a cabo la liofilización, y el API es un agente de obtención de imágenes que comprende al menos un péptido de unión a cMet, adecuado para obtener, de manera óptica, imágenes del cuerpo de un mamífero, comprendiendo el agente de obtención de imágenes un compuesto de fórmula I:

en la que:

Z1 está unido al extremo N-terminal de cMBP, y es H o MIG;

Z2 está unido al extremo C-terminal de cMBP, y es OH, NH2, OBc o MIG;

en el que Bc es un catión biocompatible;

Cysa-Xaa1-Cysc-Xaa2-Gly-Pro-Pro-Xaa3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Xaa4-Xaa5-Xaa6;

en la que: Xaa1 es Asn, His o Tyr;

Xaa2 es Gly, Ser, Thr o Asn;

Xaa3 es Thr o Arg;

Xaa4 es Ala, Asp, Glu, Gly o Ser;

Xaa5 es Ser o Thr;

Xaa6 es Asp o Glu;

L es un grupo ligador sintético de fórmula -(A)m- en la que cada A es independientemente -CR2-, -CR=CR-, -C^eC-, -CR2CO2-, - CO2CR2-, -NRCO-, -CONR-, -NR(C=O)NR-, -NR(C=S)NR-, - SO2NR-, -NRSO2-, CR2OCR2-, -CR2SCR2-, CR2NRCR2-, un grupo cicloheteroalquileno C4-8, un grupo cicloalquileno C4-8, un grupo arileno C5-12, un grupo heteroarileno C3-12, un aminoácido, un azúcar o un elemento estructural de polietilenglicol (PEG) monodisperso;

m es un número entero de valor de 1 a 20;

n es un número entero de valor 0 ó 1;

en el que la formulación comprende desde aproximadamente el 4 hasta aproximadamente el 12% en peso de API, desde aproximadamente el 3 hasta aproximadamente el 35% en peso de agente de tamponamiento, y desde aproximadamente el 56 hasta aproximadamente el 91% en peso de lioprotector; y en el que la formulación, cuando se reconstituye, tiene un pH de entre aproximadamente pH 6,8 y aproximadamente pH 9.

18. Método según la reivindicación 17, en el que la primera etapa de eliminación de agua se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente -30°C o menor, de manera opcional aproximadamente -35°C o menor, de manera opcional aproximadamente -38°C o menor.

19. Método según la reivindicación 17 o la reivindicación 18, en el que la segunda etapa de eliminación de agua se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 10°C o mayor, de manera opcional aproximadamente 15°C o mayor, de manera opcional aproximadamente 20°C o mayor.

20. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que al menos una de las etapas de eliminación de agua primera y segunda se lleva a cabo a una presión de 50 |ibar o menos, en el que opcionalmente ambas etapas de eliminación de agua primera y segunda se llevan a cabo a una presión de 50 |ibar o menos.

21. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, en el que la formulación liofilizada es la formulación liofilizada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.

22. Composición farmacéutica que comprende la formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y un portador biocompatible, en una forma adecuada para la administración a mamíferos.

23. Kit para la preparación de la composición farmacéutica según la reivindicación 22, comprendiendo el kit la formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en forma sólida y estéril de manera que tras la reconstitución con un suministro estéril del portador biocompatible según la reivindicación 22, se produce la disolución para dar la composición farmacéutica deseada.

24. Formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o composición farmacéutica según la reivindicación 22, para su uso agente de obtención de imágenes en la obtención de imágenes del cuerpo de un mamífero.

25. Formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o composición farmacéutica según la reivindicación 22, para su uso como medicamento.

26. Formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o composición farmacéutica según la reivindicación 22, para su uso en la detección, el diagnóstico, la cirugía, la estadificación, el tratamiento, la monitorización del tratamiento, la monitorización de la evolución de la enfermedad o la monitorización de la terapia.

27. Formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o composición farmacéutica según la reivindicación 22, para su uso en la detección, el diagnóstico, la cirugía, la estadificación, el tratamiento, la monitorización del tratamiento, la monitorización de la evolución de la enfermedad o la monitorización de la terapia de uno o más de un estado precanceroso y cáncer, opcionalmente uno o más de cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de cabeza, cáncer de cuello, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de páncreas, cáncer de tiroides, cáncer de estómago y sarcoma.

28. Formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o composición farmacéutica según la reivindicación 22, para su uso en la detección, el diagnóstico, la cirugía, la estadificación, el tratamiento, la monitorización del tratamiento, la monitorización de la evolución de la enfermedad o la monitorización de la terapia de sitios de localización o sobreexpresión de cMet.

29. Formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o composición farmacéutica según la reivindicación 22, para su uso en la obtención de una imagen de sitios de localización o sobreexpresión de cMet, opcionalmente in vivo.