ES2923641T3 - Inmunoglobulina con Fabs en tándem y usos de la misma - Google Patents

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Abstract

La presente invención proporciona proteínas de unión multivalentes y multiespecíficas que son capaces de unir dos o más antígenos, o dos o más epítopos. La presente invención también proporciona métodos de fabricación y uso de tales proteínas de unión multivalentes y multiespecíficas, incluidos los métodos para usar tales proteínas de unión para la prevención o el tratamiento de diversas enfermedades, o para detectar antígenos específicos in vitro o in vivo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Inmunoglobulina con Fabs en tándem y usos de la misma
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a proteínas de unión multivalentes y multiespecíficas. En la presente invención se describen, además, métodos de preparación y utilización de proteínas de unión multivalentes y multiespecíficas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Se han generado anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos en un intento de preparar moléculas que resulten útiles para el tratamiento de diversas enfermedades inflamatorias, cánceres y otros trastornos.
Se han producido anticuerpos biespecíficos mediante la utilización de la tecnología del cuadroma (ver Milstein C. y A.C. Cuello, Nature, 1983. 305(5934): p. 537-40), basada en la fusión somática de dos líneas celulares de hibridoma diferentes que expresan anticuerpos monoclonales murinos con las especificidades deseadas del anticuerpo biespecífico. También pueden producirse anticuerpos biespecíficos mediante conjugación química de dos mAb diferentes (ver Staerz, U.D. et al., Nature, 1985, 314(6012): p. 628-31). Otros enfoques han utilizado la conjugación química de dos anticuerpos monoclonales diferentes o fragmentos de anticuerpo más pequeños (ver Brennan, M. et al., Science, 1985, 229(4708): p. 81-3).
Otro método es el acoplamiento de dos anticuerpos parentales con un entrecruzante heterobifuncional. En particular, se han entrecruzado químicamente dos fragmentos Fab diferentes en cuanto a sus residuos de cisteína de bisagra, de una manera dirigida a sitio (ver Glennie, M.J., et al., J. Immunol., 1987. 139(7): p. 2367-75).
Últimamente se han desarrollado otros formatos de anticuerpo biespecífico recombinante (ver Kriangkum, J., et al., Biomol. Eng., 2001. 18(2): p. 31-40). Entre ellos, se han utilizado moléculas de Fv de cadena sencilla en tándem y diacuerpos, y diversos derivados de los mismos, para la construcción de anticuerpos biespecíficos recombinantes. Normalmente, la construcción de dichas moléculas se inicia a partir de dos fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv) que reconocen diferentes antígenos (ver Economides, A.N., et al., Nat. Med., 2003. 9(1): p. 47-52). Las moléculas scFv en tándem (taFv) representan un formato sencillo que conecta de manera sencilla las dos moléculas de scFv con un conector peptídico adicional. Los dos fragmentos scFv presentes en dichas moléculas de scFv en tándem forman entidades de plegado separadas. Pueden utilizarse diversos conectores para conector los dos fragmentos scFv y conectores con una longitud de hasta 63 residuos (ver Nakanishi, K. et al., Annu. Rev. Immunol., 2001. 19: p. 423-74).
En un estudio reciente, se ha informado de la expresión in vivo por conejos y vacas transgénicas de un scFv en tándem dirigido contra CD28 y un proteoglicano asociado a melanoma (ver Gracie, J.A., et al., J. Clin. Invest., 1999. 104(10): p. 1393-401). En dicho constructo, se conectan las dos moléculas de scFv mediante un conector CH1 y se han observado concentraciones en suero de hasta 100 mg/l del anticuerpo biespecífico. Algunos estudios actuales han informado de la expresión de moléculas de scFv en tándem solubles en bacterias (ver Leung, B.P. et al., J. Immunol., 2000, 164(12): p. 6495-502; Ito, A., et al., J. Immunol., 2003. 170(9): p. 4802-9; Kami, A., et al., J. Neuroimmunol., 2002. 125(1-2): p. 134-40) utilizando un conector Ala3 muy corto o conectores ricos en glicina/serina largos.
En un estudio reciente, la expresión fágica de un repertorio de scFv en tándem que contenía conectores intermedios aleatorizados con una longitud de 3 o 6 residuos enriqueció dichas moléculas en forma soluble y activa en bacterias. Este enfoque ha resultado en el aislamiento de una molécula de scFv en tándem preferente con un conector de 6 residuos aminoácidos (ver Arndt, M. and J. Krauss, Methods Mol. Biol., 2003. 207: p. 305-21).
Los diacuerpos biespecíficos (Db) utilizan el formato de diacuerpo para la expresión. Los diacuerpos se producen a partir de fragmentos scFv mediante la reducción de la longitud del conector que conecta los dominios VH y Vl hasta que presenta aproximadamente 5 residuos (ver Peipp, M. y T. Valerius, Biochem. Soc. Trans, 2002. 30(4): p. 507-11). Dicha reducción del tamaño del conector facilita la dimerización de dos cadenas polipeptídicas mediante emparejamiento cruzado de los dominios VH y VL. Se producen diacuerpos biespecíficos mediante la expresión de dos cadenas polipeptídicas con la estructura VHA-VLB y VHB-VLA (configuración VH-VL) o VLA-VHB y VLB-VHA (configuración VL-VH) dentro de la misma célula. Un estudio comparativo reciente demuestra que la orientación de los dominios variables puede influir sobre la expresión y formación de sitios de unión activos (ver Mack, M., G. Riethmuller, y P. Kufer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995. 92(15): p. 7021-5).
Un enfoque para forzar la generación de diacuerpos biespecíficos es la producción de diacuerpos de botón-en-ojal (knob-into-hole) (ver Holliger, P., T. Prospero y G. Winter, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1993. 90(14): p. 6444-8,18). Lo anterior ha sido demostrado para un diacuerpo biespecífico dirigido contra HER2 y CD3. Se introdujo un botón grande en el dominio VH mediante intercambio de Val37 por Phe y de Leu45 por Trp, y se produjo un ojal complementario en el dominio VL mediante mutación de Phe98 en Met y de Tyr87 en Ala, en el dominio variable anti-HER2 o anti-CD3. Mediante la utilización de este enfoque pudo incrementarse la producción de diacuerpos biespecíficos de 72 % por el diacuerpo parental a más de 90 % por el diacuerpo de botón-en-ojal.
Los diacuerpos de cadena sencilla (scDb, por sus siglas en inglés) representan una estrategia alternativa para mejorar la formación de moléculas biespecíficas similares a diacuerpos (ver Holliger, P. y G. Winter, Cancer Immunol. Immunother., 1997. 45(3-4): p. 128-30; Wu, A.M., et al., Immunotechnology, 1996. 2(1): p. 21-36). Los diacuerpos de cadena sencilla biespecíficos se producen mediante la conexión de las dos cadenas polipeptídicas formadoras de diacuerpo con un conector intermedio adicional con una longitud de aproximadamente 15 residuos aminoácidos. En consecuencia, todas las moléculas con un peso molecular correspondiente a los diacuerpos de cadena sencilla monoméricos (50 a 60 kDa) son biespecíficas. Varios estudios han demostrado que los diacuerpos de cadena sencilla biespecíficos se expresan en bacterias en forma soluble y activa, con la mayoría de las moléculas purificadas presentes en forma de monómeros (ver Holliger, P. y G. Winter, Cancer Immunol. Immunother., 1997. 45(3-4): p. 128­ 30; Wu, A.M., et al., Immunotechnology, 1996. 2(1): p. 21-36; Pluckthun, A. y P. Pack, Immunotechnology, 1997. 3(2): p. 83-105; Ridgway, J.B., et al., Protein Eng., 1996. 9(7): p. 617-21).
Se ha fusionado un diacuerpo con Fc para generar más moléculas de tipo Ig, denominadas di-diacuerpos (ver Lu, D., et al., J. Biol. Chem., 2004. 279(4): p. 2856-65). Además, se ha descrito un constructo de anticuerpos multivalente que comprende dos repeticiones de Fab en la cadena pesada de una IgG y capaz de unirse a cuatro moléculas de antígeno (ver la patente n° US 8.722.859 B2 y Miller, K., et al., J. Immunol., 2003. 170(9): p. 4854-61).
Los ejemplos más recientes son fusiones de fragmento variable tetravalente de IgG-cadena sencilla (scFv) (Dong J. et al., 2011 MAbs 3:273-288; Coloma MJ, Morrison SL 1997 Nat. Biotechnol. 15:159-163; Lu D, et al. 2002 J. Immunol. Methods 267:213-226), catumaxomab, un anticuerpo trifuncional híbrido de rata/ratón biespecífico de molécula de adhesión a célula epitelial-CD3 (Lindhofer H, et al. 1995 J. Immunol. 155:219-225), el anticuerpo scFv biespecífico de CD19-CD3 llamado blinatumomab (Bargou R, et al. 2008 Science 321:974-977), anticuerpos "Fab de acción dual" (DAF, por sus siglas en inglés) (BostromJ, et al. 2009 Science 323:1610-1614), péptidos farmacóforos unidos covalentemente a anticuerpos catalíticos (Doppalapudi VR, et al. 2010 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:22611-22616), utilización del intercambio dinámico entre medias moléculas IgG4 para generar anticuerpos biespecíficos (van der Neut Kolfschoten M, et al. 2007 Science 317:1554-1557; Stubenrauch K, et al. 2010 Drug Metab. Dispos. 38:84-91), o mediante intercambio de dominios de cadena pesada y de cadena ligera dentro del fragmento de unión a antígeno (Fab) de una mitad del anticuerpo biespecífico (formato CrossMab) (Schaefer Wet al. 2011 Proc. Natl. Acad. Sci.
108:11187-92). El documento n° WO20107145792 pretende describir proteínas de unión a antígeno biespecíficos, métodos para su producción, composiciones farmacéuticas que contienen dichos anticuerpos, y usos de los mismos. El documento n° WO2013/026831 pretende describe moléculas biespecíficas de unión a antígeno y polinucleótidos codificantes de dichas moléculas biespecíficas de unión a antígeno, y vectores y células huésped que comprenden dichos polinucleótidos. El documento n° WO2013/026831 también pretende describir métodos para producir las moléculas biespecíficas de unión a antígeno y a métodos de utilización de dichas moléculas biespecíficas de unión a antígeno en el tratamiento de enfermedades. El documento n° WO2012/025525 pretende describir anticuerpos biespecíficos en los que la afinidad de unión a uno de los dos antígenos está reducida y que pueden activarse con proteasas específicas tumorales o de inflamación, y la preparación y utilización de dichos anticuerpos biespecíficos. El documento n° WO2010/115589 pretende describir anticuerpos biespecíficos trivalentes, a métodos para su producción, a composiciones farmacéuticas que contienen dichos anticuerpos y usos de los mismos. Los anticuerpos biespecíficos trivalentes del documento n° WO2010/115589 supuestamente comprenden un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno y que consiste en dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo y un dominio VH fusionado con el extremo C-terminal de una de dichas cadenas pesadas, y un dominio VL fusionado con el extremo C-terminal de la otra de dichas cadenas pesadas, en el que dicho dominio Vh y dicho dominio VL juntos forman un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a un segundo antígeno. El documento n° WO2014/161845 se ha citado bajo el artículo 54(3) EPC y pretende describir anticuerpos biespecíficos que comprenden por lo menos un sitio de unión a antígeno específico para DR5 y por lo menos un sitio de unión a antígeno específico para anticuerpos FAP específicos para DR5, métodos para su producción, composiciones farmacéuticas que contienen dichos anticuerpos, y usos de los mismos. El documento n° WO2014/144357 se ha citado bajo el artículo 54(3) EPC y pretende describir anticuerpos biespecíficos tetravalentes (TetBiAb), métodos de preparación y métodos de utilización de los mismos para el diagnóstico y para el tratamiento del cáncer o de trastornos inmunitarios. Los TetBiAb presentan una segunda pareja de fragmentos Fab con una segunda especificidad de antígeno unida al extremo C-terminal de un anticuerpo, proporcionando de esta manera una molécula que es bivalente para cada una de las dos especificidades de antígeno. El anticuerpo tetravalente se produce mediante métodos de ingeniería genética, mediante la unión de una cadena pesada de anticuerpo covalentemente a un Fab de cadena ligera, que se asocia a su Fab de cadena pesada coexpresado afín.
Existe una necesidad en la técnica de entidades moleculares individuales con doble función de unión a antígeno y de métodos de generación de dichas proteínas de unión multivalentes y multiespecíficas. La presente invención satisface dichas necesidades y otras.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona una proteína de unión según la reivindicación 1.
La presente invención proporciona además una composición farmacéutica según la reivindicación 10.
La presente invención proporciona además una proteína de unión según las reivindicaciones 1 a 10 para la utilización según la reivindicación 11.
La presente invención proporciona además una proteína de unión según la reivindicación 5 para la utilización según la reivindicación 12.
La presente invención proporciona además una proteína de unión según la reivindicación 1 para la utilización según la reivindicación 14.
La invención se define mediante el conjunto de reivindicaciones adjunto. Las realizaciones y/o ejemplos de la descripción siguiente que no están cubiertas por las reivindicaciones adjuntas, si se interpretan de acuerdo con el artículo 69 EPC y el Protocolo de interpretación del artículo 69 EPC, no se consideran parte de la presente invención.
Cualesquiera referencias en la descripción a métodos de tratamiento se refieren a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para la utilización en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para el diagnóstico).
La presente invención proporciona proteínas de unión multivalentes y multiespecíficas. En la presente invención se describen, además, métodos de preparación y utilización de dichas proteínas de unión. Las proteínas de unión multivalentes y multiespecíficas proporcionadas en la presente memoria son inmunoglobulinas con Fab en tándem (Ig-FET) y son capaces de unirse a dos o más antígenos, o a dos o más epítopos del mismo antígeno, o a dos o más copias del mismo epítopo. Las proteínas de unión multivalentes y multiespecíficas proporcionadas en la presente memoria resultan útiles para el tratamiento y/o prevención de enfermedades y trastornos inflamatorios agudos y crónicos, enfermedades autoinmunitarias, lesiones de la médula espinal, sepsis y otras enfermedades, trastornos y condiciones. En la presente memoria se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas de unión multivalentes y multiespecíficas. Además, en la presente memoria se describen ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante y células huésped para producir dichos Ig-FET. Los métodos de utilización de los Ig-FET de la invención para detectar antígenos específicos, in vivo o in vitro, también se encuentran descritos en la presente memoria.
La presente invención proporciona una familia de proteínas de unión que son capaces de unirse a dos o más antígenos, p. ej., con afinidad elevada. En la presente memoria se da a conocer además un enfoque para construir una proteína de unión biespecífica utilizando dos anticuerpos monoclonales parentales: mAb A, que se une al antígeno A, y mAb B, que se une al antígeno B. Las proteínas de unión dadas a conocer en la presente memoria, en una realización, son capaces de unirse a antígenos, citoquinas, quimioquinas, receptores de citoquina, receptores de quimioquina, moléculas relacionadas con citoquinas o quimioquinas, o proteínas de superficie celular.
De esta manera, en un aspecto, se proporcionan proteínas de unión capaces de unirse a dos o más antígenos. En la presente memoria se da a conocer, además, una proteína de unión que comprende por lo menos dos cadenas polipeptídicas, en la que las cadenas polipeptídicas se emparejan formando moléculas de tipo IgG capaces de unirse a dos o más antígenos. En una realización, la proteína de unión comprende tres, cuatro, cinco o más cadenas polipeptídicas. En la presente memoria se da a conocer, además, una proteína de unión que comprende por lo menos un VLa, por lo menos un VLb, por lo menos un VHa, por lo menos un VHb, por lo menos un CL y por lo menos un CH1, en el que VL es un dominio variable de cadena ligera, VH es un dominio variable de cadena pesada, CL es un dominio constante de cadena ligera, CH1 es el primer dominio constante de la cadena pesada, A es un primer antígeno y B es un segundo antígeno. En una realización adicional, la primera cadena polipeptídica comprende un VLa, un CL, un VHb, un CH1 y un Fc. En otra realización, la región Fc es una región Fc variante. En una realización adicional, la región Fc variante muestra una función efectora modificada, tal como ADCC o CDC. En otra realización, la región Fc variante muestra una afinidad o avidez modificada para uno o más FcyR.
En una realización, la proteína de unión comprende tres cadenas polipeptídicas, en la que la primera cadena polipeptídica comprende un VLa, un CL, un VHb, un CH1 y un Fc, la segunda cadena polipeptídica comprende VHa y CH1, y la tercera cadena polipeptídica comprende VLb y CL. En la presente memoria se da a conocer, además, una proteína de unión que comprende dos cadenas polipeptídicas, en la que la primera cadena polipeptídica comprende un VLa, un CL, un VHb y un CH1, la segunda cadena polipeptídica comprende VHa, CH1, VLb y CL. En un aspecto adicional, la primera cadena polipeptídica comprende, además, un Fc.
En una realización, la proteína de unión comprende tres cadenas polipeptídicas, y sus ADNc correspondientes durante la cotransfección se encuentran presentes en una proporción molar de primera:segunda:tercera de 1:1:1, 1:1.5:1, 1:3:1, 1:1:1.5, 1:1:3, 1:15:1.5, 1:3:15, 1:15:3, o 1:3:3. Tal como se indica en la presente memoria, una proteína de unión puede comprender dos cadenas polipeptídicas y sus ADNc correspondientes durante la cotransfección pueden estar presentes en una proporción molar de primer:segundo de 1:1, 1:1,5 o 1:3, o en cualesquiera otras proporciones, mediante optimización, en un esfuerzo por maximizar la fracción de Ig-FET monomérico en cualquier transfección dada.
La proteína de unión de la presente invención no comprende un conector peptídico.
En una realización, la proteína de unión comprende un primer polipéptido que comprende, de extremo aminoterminal a extremo carboxilo-terminal, VLa-CL-VHb-CH1-Fc, una segunda cadena polipeptídica que comprende, de extremo aminoterminal a extremo carboxiloterminal, VHa-CH1, y una tercera cadena polipeptídica que comprende, de extremo aminoterminal a extremo carboxiloterminal, VLb-CL; en la que VL es un dominio variable de cadena ligera, CL es un dominio constante de cadena ligera, VH es un dominio variable de cadena pesada, CH1 es el primer dominio constante, A es un primer epítopo o antígeno y B es un segundo epítopo o antígeno. En una realización, la región Fc es IgG1 humana. En otra realización, la región Fc es una región Fc variante. En una realización adicional, la secuencia de aminoácidos de la región Fc es idéntica por lo menos al 65 %, por lo menos al 70 %, por lo menos al 75 %, por lo menos al 80 %, por lo menos al 85 %, por lo menos al 90 %, por lo menos al 95 %, por lo menos al 99 % o al 100 % a SEC ID n° 20. La CL de la primera cadena polipeptídica se fusiona directamente con VHb.
En otra realización, la proteína de unión comprende un primer polipéptido que comprende, de extremo aminoterminal a extremo carboxiloterminal, VHb-CH1-VLa-CL-Fc, una segunda cadena polipeptídica que comprende, de extremo aminoterminal a extremo carboxiloterminal, VHa-CH1, y una tercera cadena polipeptídica que comprende, de extremo aminoterminal a extremo carboxiloterminal, VLb-CL; en la que VL es un dominio variable de cadena ligera, CL es un dominio constante de cadena ligera, VH es un dominio variable de cadena pesada, CH1 es el primer dominio constante, A es un primer epítopo o antígeno y B es un segundo epítopo o antígeno. En una realización, la región Fc es IgG1 humana. En otra realización, la región Fc es una región Fc variante. En una realización adicional, la secuencia de aminoácidos de la región Fc es idéntica por lo menos al 65 %, por lo menos al 70 %, por lo menos al 75 %, por lo menos al 80 %, por lo menos al 85 %, por lo menos al 90 %, por lo menos al 95 %, por lo menos al 99 % o al 100 % a SEC ID n° 20. La CH1 de la primera cadena polipeptídica se fusiona directamente con VLa.
En otra realización, la proteína de unión comprende un primer polipéptido que comprende, de extremo aminoterminal a extremo carboxilo-terminal, VLa-CL-VHb-CH1-Fc, una segunda cadena polipeptídica que comprende, de extremo aminoterminal a extremo carboxiloterminal, VHa-CH1-VLb-CL, en la que VL es un dominio variable de cadena ligera, CL es un dominio constante de cadena ligera, VH es un dominio variable de cadena pesada, CH1 es el primer dominio constante, A es un primer epítopo o antígeno y B es un segundo epítopo o antígeno. En una realización, la región Fc es IgG1 humana. En otra realización, la región Fc es una región Fc variante. En una realización adicional, la secuencia de aminoácidos de la región Fc es idéntica por lo menos al 65 %, por lo menos al 70 %, por lo menos al 75 %, por lo menos al 80 %, por lo menos al 85 %, por lo menos al 90 %, por lo menos al 95 %, por lo menos al 99 % o al 100 % a SEC ID n° 20. La CL de la primera cadena polipeptídica se fusiona directamente con VHb.
En otra realización, la proteína de unión comprende un primer polipéptido que comprende, de extremo aminoterminal a extremo carboxiloterminal, VHb-CH1-VLa-CL-Fc, una segunda cadena polipeptídica que comprende, de extremo aminoterminal a extremo carboxiloterminal, VLb-CL-VHa-CH1, en la que VL es un dominio variable de cadena ligera, CL es un dominio constante de cadena ligera, VH es un dominio variable de cadena pesada, CH1 es el primer dominio constante, A es un primer epítopo o antígeno y B es un segundo epítopo o antígeno. En una realización, la región Fc es IgG1 humana. En otra realización, la región Fc es una región Fc variante. En una realización adicional, la secuencia de aminoácidos de la región Fc es idéntica por lo menos al 65 %, por lo menos al 70 %, por lo menos al 75 %, por lo menos al 80 %, por lo menos al 85 %, por lo menos al 90 %, por lo menos al 95 %, por lo menos al 99 % o al 100 % a SEC ID n° 20. En una realización, la CH1 de la primera cadena polipeptídica se fusiona directamente con VLa.
Las proteínas de unión de la presente invención son capaces de unirse a parejas de citoquinas. Por ejemplo, las proteínas de unión de la presente invención son capaces de unirse a parejas de citoquinas seleccionadas del grupo que consiste en IL-1a e IL-1P; IL-12 e IL-18, TNFa e IL-23, TNFa e IL-13; TNF e IL-18; TNF e IL-12; TNF e IL-1beta; TNF y MIF; TNF e IL-6, TNF y receptor de IL-6, TNF e IL-17; IL-17 e IL-20; IL-17 e IL-23; TNF e IL-15; TNF y VEGF; VEGFR y EGFR; PDGFR y VEGF, IL-13 e IL-9; IL-13 e IL-4; IL-13 e IL-5; IL-13 e IL-25; IL-13 y TARC; IL-13 y MDC; IL-13 y MIF; IL-13 y TGF-p; IL-13 y agonista de LHR; IL-13 y CL25; IL-13 y SPRR2a; IL-13 y SPRR2b; IL-13 y ADAM8; y TNFa y PGE4, iL-13 y PED2, TNF y PEG2. En una realización, las proteínas de unión de la presente invención son capaces de unirse a IL-17 e IL-20. Las proteínas de unión de la presente invención, en una realización, son capaces de unirse a IL-17 e IL-20 y comprenden cadenas pesadas y ligeras variables derivadas del anticuerpo LY anti-lL-17 y del anticuerpo 15D2 anti-IL-20. En una realización, las proteínas de unión de la presente invención son capaces de unirse a IL-17 y TNF. Las proteínas de unión de la presente invención, en una realización, son capaces de unirse a IL-17 y TNF, y comprenden cadenas pesadas y ligeras variables derivadas del anticuerpo LY anti-IL-17 y del anticuerpo de TNF golimumab.
En una realización, las proteínas de unión de la presente invención se unen a IL-17 e IL-20 y comprenden un primer polipéptido que comprende, consiste esencialmente o consiste en una secuencia de aminoácidos según SEC ID n° 15; una segunda cadena polipeptídica que comprende, consiste esencialmente o consiste en una secuencia de aminoácidos según SEC ID n° 21; y una tercera cadena polipeptídica que comprende, consiste esencialmente o consiste en una secuencia según SEC ID n° 23. En otra realización, las proteínas de unión de la presente invención se unen a IL-27 e IL-20 y comprenden una primera cadena polipeptídica que comprende, consiste esencialmente o consiste en una secuencia de aminoácidos según SEC ID n° 15; una segunda cadena polipeptídica que comprende, consiste esencialmente o consiste en una secuencia de aminoácidos según SEC ID n° 29.
En una realización, las proteínas de unión de la presente invención se unen a TNF e IL-17 y comprenden un primer polipéptido que comprende, consiste esencialmente o consiste en una secuencia de aminoácidos según SEC ID n° 87; una segunda cadena polipeptídica que comprende, consiste esencialmente o consiste en una secuencia de aminoácidos según SEC ID n° 89; y una tercera cadena polipeptídica que comprende, consiste esencialmente o consiste en una secuencia según SEC ID n° 91.
En otra realización, la proteína de unión es capaz de unirse a parejas de dianas seleccionadas del grupo que consiste en CD137 y CD20, CD137 y EGFR, CD137 y Her-2, CD137 y PD-1, CD137 y PDL-1, VEGF y PD-L1, Lag-3 y TIM-3, OX40 y PD-1, TIM-3 y PD-1, TIM-3 y PDL-1, EGFR y DLL-4, CD138 y CD20; CD138 y CD40; CD19 y CD20; CD20 y CD3; CD3 y CD33; CD3 y CD133; CD47 y CD20, CD38 y CD138; CD38 y CD20; CD20 y CD22; CD38 y CD40; CD40 y CD20; CD-8 y IL-6; CSPGs y RGM A; CTLA-4 y BTNO2; IGF1 e IGF2; IGF1/2 y Erb2B; IGF-1R y EGFR; EGFR y CD13; IGF-1R y ErbB3; EGFR-2 e IGFR; VEGFR-2 y Met; VEGF-A y angiopoyetina-2 (Ang-2); IL-12 y TWEAK; IL-13 e IL-1beta; PDGFR y VEGF" EpCAM y CD3, Her2 y CD3, CD19 y CD3, EGFR y Her3, CD16a y CD30, CD30 y PSMA, EGFR y CD3, CEA y CD3, TROP-2 y HSG, TROP-2 y CD3, MAG y RGM A; NgR y RGM A; NogoA y RGM A; OMGp y RGM A; PDL-1 y CTLA-4; CTLA-4 y PD-1; PD-1 y TIM-3; RGM A y RGM B; Te38 y TNFa; TNFa y Blys; TNFa y CD-22; TNFa y dominio CTLA-4; TNFa y GP130; TNFa e IL-12p40; y TNFa y ligando de RANK, Factor IXa, Factor X. En una realización, las proteínas de unión de la presente invención son capaces de unirse a CD3 y CD20. Las proteínas de unión de la presente invención, en una realización, son capaces de unirse a CD3 y CD20 y comprenden cadenas pesadas y ligeras variables derivadas del anticuerpo OKT3 anti-CD3 y del anticuerpo anti-CD2o ofatumumab. En una realización, las proteínas de unión de la presente invención son capaces de unirse a CTLA-4 y PD-1. Las proteínas de unión de la presente invención, en una realización, son capaces de unirse a CTLA-4 y PD-1, y comprenden cadenas pesadas y ligeras variables derivadas del anticuerpo anti-CTLA-4 ipilimumab y del anticuerpo de PD-1 nivolumab.
En una realización, las proteínas de unión de la presente invención se unen a CD3 y CD20, y comprenden una primera cadena polipeptídica que comprende, consiste esencialmente o consiste en una secuencia de aminoácidos según SEC ID n° 41; una segunda cadena polipeptídica que comprende, consiste esencialmente o consiste en una secuencia de aminoácidos según SEC ID n° 44; y una tercera cadena polipeptídica que comprende, consiste esencialmente o consiste en una secuencia de aminoácidos según SEC ID n° 46.
En una realización, las proteínas de unión de la presente invención se unen a CTLA-4 y PD-1 y comprenden una primera cadena polipeptídica que comprende, consiste esencialmente o consiste en una secuencia de aminoácidos según SEC ID n° 92; una segunda cadena polipeptídica que comprende, consiste esencialmente o consiste en una secuencia de aminoácidos según SEC ID n° 95; y una tercera cadena polipeptídica que comprende, consiste esencialmente o consiste en una secuencia de aminoácidos según SEC ID n° 97.
En una realización, la proteína de unión proporcionada en la presente memoria es capaz de unirse a uno o más epítopos sobre CTLA-4. En una realización, la proteína de unión proporcionada en la presente memoria es capaz de unirse a uno o más epítopos sobre PD-1.
En una realización, la proteína de unión es capaz de unirse a uno o más epítopos en una o más proteínas de punto de control inmunitario sobre células T, tales como, por ejemplo, TIM-3, Lag3, ICOS, BTLA, CD160, 2B4, KIR, CD137, CD27, OX40, CD40L y A2aR. En otra realización, la proteína de unión es capaz de unirse a uno o más epítopos sobre una o más proteínas de superficie de las células tumorales que participan en rutas de punto de control inmunitario, tales como, por ejemplo, PD-L1, PD-L2, galectina-9, HVEM, CD48, B7-1, B7-2, ICOSL, B7-H3, B7-H4, CD137L, OX40L, CD70 y CD40.
En un aspecto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden la proteína de unión definida en las reivindicaciones. En una realización, en la presente memoria se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden la proteína de unión definida en las reivindicaciones y uno o más portadores farmacéuticamente aceptables.
En otro aspecto, la presente invención proporciona las proteínas de unión definidas en las reivindicaciones, para la utilización en el tratamiento o prevención de una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad neurodegenerativa, cáncer, sepsis o lesión de médula espinal. En la presente memoria se describe, además, un método que comprende administrar en el sujeto una cantidad eficaz de una o más de las proteínas de unión proporcionadas en la presente memoria, o una o más composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas de unión proporcionadas en la presente memoria y un portador farmacéuticamente aceptable. En la presente memoria se proporcionan, además, usos de las proteínas de unión indicados en la presente memoria en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento o prevención de una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad neurodegenerativa o una lesión de la médula espinal. En una realización, la enfermedad inflamatoria, la enfermedad autoinmunitaria o la enfermedad neurodegenerativa se selecciona del grupo que consiste en asma, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer o enfermedad de Parkinson.
En una realización, la presente exposición proporciona las proteínas de unión tal como se definen en las reivindicaciones, para la utilización en el tratamiento o prevención de artritis reumatoide, soriasis, osteoporosis, ictus, enfermedad hepática o cáncer oral, en un sujeto que lo necesita, en el que el método comprende administrar en el sujeto una proteína de unión Ig-FET indicada en la presente memoria, en la que la proteína de unión es capaz de unirse a IL-17 e IL-20. Una proteína de unión Ig-FET ejemplar comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID n° 15, y la secuencia de aminoácidos según SEC ID n° 21, y una secuencia de aminoácidos según SEC ID n° 23. Una proteína de unión Ig-FET ejemplar adicional comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID n° 15, y una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID n° 29.
En una realización, la presente invención proporciona las proteínas de unión tal como se definen en las reivindicaciones, para la utilización en el tratamiento o prevención de cáncer de células B en un sujeto que lo necesita, en el que el método comprende administrar en el sujeto una proteína de unión Ig-FET indicada en la presente memoria, en la que la proteína de unión es capaz de unirse a uno o más antígenos de células B. Una proteína de unión Ig-FET ejemplar es capaz de unirse a CD20. Una proteína de unión Ig-FET ejemplar adicional es capaz de unirse a CD20 y a otro antígeno. Una proteína de unión ejemplar es capaz de unirse a c D3 y CD20. En una realización adicional, el cáncer es un cáncer de células B. En una realización todavía adicional, el cáncer de células B se selecciona del grupo que consiste en linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin [LNH], leucemia/linfoma linfoblástico de células B precursoras, neoplasmas de células B maduras, leucemia linfocítica crónica de células B/linfoma linfocítico pequeño, leucemia prolinfocítico de células B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de células del manto, linfoma folicular, linfoma de centro folicular cutáneo, linfoma de células B de la zona marginal, leucemia de células pilosas, linfoma de células B grandes difusas, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de células plasmáticas, trastorno linfoproliferativo postransplante, macroglobulinemia de Waldenstrom y linfoma de células grandes anaplásicas. En una realización, la presente exposición proporciona las proteínas de unión tal como se definen en las reivindicaciones, para la utilización en el tratamiento o prevención de cáncer de células B, en el que el método comprende administrar en el sujeto una proteína de unión Ig-FET, en la que la proteína de unión Ig-FET comprende una secuencia de aminoácidos según SEC ID n° 41, y la secuencia de aminoácidos según SEC ID n° 44, y una secuencia de aminoácidos según SEC ID n° 46.
En una realización, la presente exposición proporciona las proteínas de unión tal como se definen en las reivindicaciones, para la utilización en el tratamiento o prevención de una enfermedad autoinmunitaria, enfermedad inflamatoria o infección en un sujeto que lo necesita, en el que el método comprende administrar en el sujeto una proteína de unión Ig-FET indicada en la presente memoria, en la que la proteína de unión es capaz de unirse a TNF e IL-17. Una proteína de unión Ig-FET ejemplar comprende secuencias según SEC ID n° 87, n° 89 y n° 91. En otra realización, la presente invención proporciona las proteínas de unión tal como se definen en las reivindicaciones para la utilización en el tratamiento o prevención de una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria, en el que el método comprende administrar en el sujeto una proteína de unión Ig-FET, en la que la proteína de unión es capaz de unirse a TNF e IL-17, y en la que la enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Crohn, soriasis (incluyendo la soriasis en placas), artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis soriática, osteoartritis o artritis idiopática juvenil), esclerosis múltiple, espondilitis anquilosante, artropatía espondilosante, lupus eritematoso sistémico, uveítis, sepsis, enfermedades neurodegenerativas, regeneración neuronal, lesión de la médula espinal, cánceres primarios y metastásicos, un trastorno respiratorio; asma, asma alérgica y no alérgico, asma debido a infección, asma debido a infección por el virus sincitial respiratorio (VSR), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), una condición que implica la inflamación de las vías respiratorias, eosinofilia, fibrosis y producción excesiva de moco, fibrosis quística, fibrosis pulmonar, un trastorno atópico, dermatitis atópica, urticaria, eccema, rinitis alérgica, enterogastritis alérgica, una condición inflamatoria y/o autoinmunitaria de la piel, una condición inflamatoria y/o autoinmunitaria de órganos gastrointestinales, enfermedad intestinal inflamatoria (EII), colitis ulcerosa, una condición inflamatoria y/o autoinmunitaria del hígado, cirrosis hepática, fibrosis hepática y fibrosis hepática causada por el virus de la hepatitis B y/o C, escleroderma. En otra realización, la presente invención proporciona las proteínas de unión tal como se definen en las reivindicaciones, para la utilización en métodos para el tratamiento o prevención del cáncer, en el que el método comprende administrar en el sujeto una proteína de unión Ig-FET reivindicada en la presente memoria, en la que la proteína de unión es capaz de unirse a TNF e IL-17. En una realización adicional, el cáncer es carcinoma hepatocelular, glioblastoma, linfoma o linfoma de Hodgkin. En otra realización, la presente invención proporciona las proteínas de unión tal como se definen en las reivindicaciones, para la utilización en métodos para el tratamiento o prevención de una infección en un sujeto, en el que el método comprende administrar en el sujeto una proteína de unión Ig-FET reivindicada en la presente memoria, en la que la infección es una infección vírica, una infección bacteriana, una infección parasitaria o infección por HTLV-1. En una realización, la presente invención proporciona las proteínas de unión definidas en las reivindicaciones para la utilización en métodos para la supresión de la expresión de respuestas inmunitarias de tipo 1 protectoras, y la supresión de la expresión de una respuesta inmunitaria de tipo 1 protectora durante la vacunación.
En una realización, la presente exposición proporciona las proteínas de unión tal como se definen en las reivindicaciones, para la utilización en métodos para el tratamiento de la artritis reumatoide, en el que el método comprende administrar en el sujeto una proteína de unión Ig-FET, en la que la proteína de unión comprende secuencias según SEC ID n° 87, n° 89 y n° 91.
En una realización, la presente exposición proporciona las proteínas de unión tal como se definen en las reivindicaciones, para la utilización en métodos para el tratamiento o prevención del cáncer en un sujeto que lo necesita, en el que el método comprende administrar en el sujeto una proteína de unión Ig-FET reivindicada en la presente memoria, en la que la proteína de unión es capaz de unirse a CTLA-4 y PD-1. En una realización adicional, la proteína de unión Ig-FET comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEC ID n° 92, n° 95 y n° 97. En otra realización, la presente invención proporciona las proteínas de unión definidas en las reivindicaciones para la utilización en métodos para el tratamiento o la prevención de cáncer, en los que la proteína de unión es capaz de unirse a CTLA-4 y PD-1, y en los que el cáncer es un cáncer típicamente sensible a la inmunoterapia. En otra realización, el cáncer es un cáncer que no se ha asociado a la inmunoterapia. En otra realización, el cáncer es un cáncer que es una neoplasia maligna refractaria o recurrente. En otra realización, la proteína de unión inhibe el crecimiento o la supervivencia de las células tumorales. En otra realización, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en melanoma (p. ej., melanoma maligno metastásico), cáncer renal (p. ej., carcinoma de células claras), cáncer de próstata (p. ej., adenocarcinoma prostático refractario a hormonas), adenocarcinoma pancreático, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer pulmonar (p. ej., cáncer pulmonar no microcítico), cáncer esofágico, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer hepático, cáncer ovárico, cáncer cervical, cáncer tiroideo, glioblastoma, glioma, leucemia, linfoma y otras neoplasias malignas neoplásicas.
En una realización, la presente exposición proporciona las proteínas de unión tal como se definen en las reivindicaciones, para la utilización en métodos para el tratamiento o prevención del melanoma en un sujeto que lo necesita, en el que el método comprende administrar en el sujeto una proteína de unión Ig-FET reivindicada en la presente memoria, en la que la proteína de unión es capaz de unirse a CTLA-4 y PD-1. En una realización adicional, la presente exposición proporciona las proteínas de unión tal como se definen en las reivindicaciones, para la utilización en métodos para el tratamiento o prevención del melanoma, en el que el método comprende administrar en el sujeto una proteína de unión Ig-FET, que comprende una secuencia de aminoácidos según SEC ID n° 92, n° 95 y n° 97.
En otra realización, la presente exposición proporciona las proteínas de unión tal como se definen en las reivindicaciones, para la utilización en métodos para el tratamiento o prevención de infecciones o enfermedades infecciosas, en el que el método comprende administrar en el sujeto una proteína de unión Ig-FET reivindicada en la presente memoria, en la que la proteína de unión es capaz de unirse a CTLA-4 y PD-1. En una realización, la proteína de unión Ig-FET se administra sola, o en combinación con vacunas, para estimular la respuesta inmunitaria frente a patógenos, toxinas y autoantígenos. Por lo tanto, en una realización, las proteínas de unión proporcionadas en la presente memoria pueden utilizarse para estimular la respuesta inmunitaria a virus infecciosos para el ser humano, tales como, aunque sin limitarse a ellos, virus de la inmunodeficiencia humana, virus de la hepatitis clases A, B y C, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus humano, virus del papiloma humano, virus herpes, bacterias, parásitos fúngicos u otros patógenos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1A muestra la estructura de las Ig-FET que están constituidos por tres constructos, tales como Ig-FET1, Ig-FET2 y Ig-FET3. La figura 1B muestra los tres constructos utilizados para preparar dichos Ig-FET1.
La figura 2A muestra la estructura básica de los Ig-FET que están constituidos por dos constructos. La figura 2B muestra los dos constructos utilizados para preparar dichos Ig-FET.
La figura 3 proporciona la unión a antígeno de doble especificidad de Ig-FET1 según medición Biacore. El panel superior de la figura 3 muestra los resultados del ensayo de unión Biacore en el que Ig-FET2 en primer lugar se saturó con IL-17, seguido de IL-20. El panel inferior de la figura 3 muestra los resultados del ensayo de Biacore en el que Ig-FET1 en primer lugar se saturó con IL-20, seguido de IL-17.
Figura 4. Muestra la solubilidad en el rango de pH de Ig-FET anti-IL-17/IL-20 o el anticuerpo monoclonal rituximab, según medición mediante precipitación inducida con PEG.
La figura 5 muestra la estabilidad de la línea celular CHO estable tanto en sistemas de DG44 (5A y 5B) como CHO-2 (5C y 5D).
La figura 6 muestra la unión a CTLA-4 (6A) o PD-1 (figura 6B) a Ig-FET10 o los anticuerpos parentales Ipilimumab y nivolumab, según evaluación mediante ELISA.
La figura 7 muestra un estudio de unión múltiple de Ig-FET10 frente a tanto CTLA-4 como PD-1. Se muestra la unión a CTLA-4 seguido de PD-1, y la unión a PD-1 seguido de CTLA-4, tal como se indica en la figura 7.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La presente invención se refiere a proteínas de unión multivalentes y multiespecíficas. En la presente memoria se describen además métodos de preparación de proteínas de unión, y la utilización de proteínas de unión en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades y trastornos inflamatorios agudos y crónicos, cánceres y otras enfermedades. La presente invención se refiere a proteínas de unión multivalentes o multiespecíficas capaces de unirse a dos o más antígenos. Específicamente, la invención se refiere a inmunoglobulinas con Fab en tándem (Ig-FET) y composiciones farmacéuticas de las mismas. En la presente memoria se describen además ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante y células huésped para preparar dichas Ig-FET. Los métodos de utilización de las Ig-FET de la invención para detectar antígenos específicos, in vivo o in vitro, también se dan a conocer en la presente memoria.
La nueva familia de proteínas de unión proporcionada en la presente memoria es capaz de unirse a dos o más antígenos, p. ej., con afinidad elevada. En la presente memoria se da a conocer además un enfoque para construir una proteína de unión biespecífica utilizando 2 anticuerpos monoclonales parentales: mAb A, que se une al antígeno a, y mAb B, que se une al antígeno b.
En un aspecto, la presente invención proporciona una proteína de unión que comprende una cadena ligera variable específica para un primer antígeno o epítopo, un primer dominio constante de cadena ligera, una cadena pesada variable específica de un segundo antígeno o epítopo, un primer CH1 de cadena pesada, una cadena pesada variable específica para el primer antígeno o epítopo, un segundo CH1 de cadena pesada, una cadena pesada variable específica del segundo antígeno o epítopo, y un segundo dominio constante de cadena ligera. La proteína de unión comprende, además, una región Fc. En la presente memoria se describen, además, proteínas de unión que comprenden uno o más aminoácidos o conectores polipeptídicos que unen dos o más de los componentes de la proteína de unión. Por ejemplo, la proteína de unión puede comprender un conector polipeptídico que une la región variable de cadena ligera a la región constante de cadena ligera.
En la presente memoria se describen además proteínas de unión que comprenden una cadena polipeptídica que comprende VLA-CL-(X1)n-VHB-CH1-(X2)n, en la que VLa es el dominio variable de cadena ligera de mAb A, CL es un dominio constante de cadena ligera, X1 representa un aminoácido o un conector oligopeptídico, VHb es el dominio variable de cadena pesada de mAb B, CH1 es el primer dominio constante de la cadena pesada, X2 representa una región Fc o un dominio de dimerización diferente, y n es 0 o 1.
En la presente memoria se describen además proteínas de unión que comprenden tres cadenas polipeptídicas diferentes (figura 1), en las que la primera cadena polipeptídica (constructo n° 1) comprende VLA-CL-(X1)n-VHB-CH1-(X2)n, en la que VLa es el dominio variable de cadena ligera de mAb A, CL es un dominio constante de cadena ligera, X1 representa un aminoácido o un conector oligopeptídico, VHb es el dominio variable de cadena pesada de mAb B, CH1 es el primer dominio constante de la cadena pesada, X2 representa una región Fc o un dominio de dimerización diferente, y n es 0 o 1. La segunda cadena polipeptídica (constructo n° 2) comprende VHa-CH1, en la que VHa es el dominio variable de cadena pesada de mAb A, y CH1 es el primer dominio constante de la cadena pesada. La tercera cadena polipeptídica (constructo n° 3) comprende VLb-CL, en la que VLb es el dominio variable de cadena ligera de mAb B, y CL es el dominio constante de la cadena ligera.
En la presente memoria se describe además una primera cadena polipeptídica que comprende VHB-CH1-(X1)n-VLA-CL-(X2)n, en la que VLa es el dominio variable de cadena ligera de mAb A, CL es un dominio constante de cadena ligera, X1 representa un aminoácido o un conector oligopeptídico, VHb es el dominio variable de cadena pesada de mAb B, CH1 es el primer dominio constante de la cadena pesada, X2 representa una región Fc o un dominio de dimerización diferente, y n es 0 o 1. La segunda cadena polipeptídica comprende VHa-CH1, en la que VHa es el dominio variable de cadena pesada de mAb A, y CH1 es el primer dominio constante de la cadena pesada. La tercera cadena polipeptídica comprende VLb-CL, en la que VLb es el dominio variable de cadena ligera de mAb B, y CL es el dominio constante de la cadena ligera.
En la presente memoria se describen además proteínas de unión que comprenden dos cadenas polipeptídicas diferentes (figura 2), en las que la primera cadena polipeptídica (constructo n° 1) comprende VLa-CL-(X1^-VHb-CH1-(X2)n, en la que VLA es el dominio variable de cadena ligera de mAb A, CL es un dominio constante de cadena ligera, X1 representa un aminoácido o un conector oligopeptídico, VHb es el dominio variable de cadena pesada de mAb B, CH1 es el primer dominio constante de la cadena pesada, X2 representa una región Fc o un dominio de dimerización diferente, y n es 0 o 1. La segunda cadena polipeptídica (constructo n° 4) comprende VHA-CH1-(X3)n-VLB-CL, en la que VHa es el dominio variable de cadena pesada de mAb A, CH1 es el primer dominio constante de la cadena pesada, X3 representa un aminoácido o polipéptido que no es un dominio constante, n es 0 o 1, VLb es el dominio variable de cadena ligera de mAb B y CL es el dominio constante de la cadena ligera.
En la presente memoria se describe, además, una proteína de unión que comprende dos cadenas polipeptídicas con un diseño molecular global similar a la realización anterior, excepto en que el orden de los dominios variables está invertido. En la presente realización, la primera cadena polipeptídica comprende VHB-CH1-(X1)n-VLA-CL-(X2)n, en la que VLa es un dominio variable de cadena ligera de mAb A, CL es un dominio constante de cadena ligera, X1 representa un aminoácido o un conector oligopeptídico, VHb es el dominio variable de cadena pesada de mAb B, CH1 es el primer dominio constante de la cadena pesada, X2 representa una región Fc o un dominio de dimerización diferente, y n es 0 o 1. La segunda cadena polipeptídica comprende VLB-CL-(X3)n-VHA-CH1, en la que VHa es el dominio variable de cadena pesada de mAb A, CH1 es el primer dominio constante de la cadena pesada, X3 representa un aminoácido o un conector oligopéptido, n es 0 o 1, VLb es el dominio variable de cadena ligera de mAb B, y CL es el dominio constante de la cadena ligera.
En una realización, los dominios VH y VL en la proteína de unión se seleccionan del grupo que consiste en dominios variables de cadena pesada/ligera murina, dominios variables de cadena pesada/ligera totalmente humanos, dominios variables de cadena pesada/ligera injertados con CDR, dominios variables de cadena pesada/ligera humanizados, y mezclas de los mismos. En una realización preferente, VHa/VLa y VHb/VLb son capaces de unirse al mismo antígeno. En otra realización, VHa/VLa y VHb/VLb son capaces de unirse a antígenos diferentes.
En una realización, la primera cadena polipeptídica comprende VLa-CL-VHb-CH1-Fc, y CL y VHb de la primera cadena polipeptídica se fusionan directamente entre sí. En otra realización, la primera cadena polipeptídica comprende VHb-CH1-VLa-CL-Fc, y CH1 y VLa se fusionan directamente entre sí. En una realización, la proteína de unión comprende una región Fc. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "región Fc" se refiere a la región C-terminal de una cadena pesada de IgG. Un ejemplo de la secuencia de aminoácidos que contiene la región Fc de IgGI humana es SEC ID n° 20. La región Fc de una IgG comprende dos dominios constantes: CH2 y CH3.
En una realización, la región Fc es una región Fc variante. En una realización, la región Fc variante presenta una o más modificaciones de aminoácido, tales como sustituciones, deleciones o inserciones, respecto a la región Fc parental. En una realización adicional, las modificaciones de aminoácidos de la región Fc alteran la actividad de función efectora respecto a la actividad de la región Fc parental. Por ejemplo, en una realización, la región c variante puede presentar una citotoxicidad dependiente de anticuerpos alterada (es decir, incrementada o reducida), citotoxicidad mediada por el complemento (CDC), fagocitosis, opsonización o unión celular. En otra realización, las modificaciones de aminoácidos de la región Fc pueden alterar (es decir, incrementar o reducir) la afinidad de la región Fc variante para un FcyR respecto a la región Fc parental. Por ejemplo, la región Fc variante puede alterar la afinidad para FcyRI, FcyRIl y FcyRIII.
En una realización preferente, las proteínas de unión proporcionadas en la presente memoria son capaces de unirse a una o más dianas. En una realización, la diana se selecciona del grupo que consiste en citoquinas, proteínas de superficie celular, enzimas y receptores. Preferentemente, la proteína de unión es capaz de modular una función biológica de una o más dianas. Más preferentemente, la proteína de unión es capaz de neutralizar una o más dianas.
En una realización, la proteína de unión de la invención es capaz de unirse a citoquinas seleccionadas del grupo que consiste en linfoquinas, monoquinas y hormonas polipeptídicas. En una realización adicional, la proteína de unión es capaz de unirse a parejas de citoquinas seleccionadas del grupo que consiste en IL-1a e IL-1p; IL-12 e IL-18, TNFa y IL-23, TNFa e IL-13; TNF e IL-18; TNF e IL-12; TNF e IL-1beta; TNF y MIF; TNF e IL-6, TNF y receptor de IL-6, TNF e IL-17; IL-17 e IL-20; IL-17 e IL-23; TNF e IL-15; TNF y VEGF; VEGFR y EGFR; IL-13 e IL-9; IL-13 e IL-4; IL-13 e IL-5; IL-13 e IL-25; IL-13 y TARC; IL-13 y MDC; IL-13 y MIF; IL-13 y TGF-p; IL-13 y agonista de LHR; IL-13 y CL25; IL-13 y SPRR2a; IL-13 y SPRR2b; IL-13 y ADAM8; y TNFa y PGE4, IL-13 y PED2, TNF y PEG2.
En otra realización, la proteína de unión de la invención es capaz de unirse a parejas de dianas seleccionadas del grupo que consiste en CD137 y CD20, CD137 y EGFR, CD137 y Her-2, CD137 y PD-1, CD137 y PDL-1, VEGF y PD-L1, Lag-3 y TIM-3, OX40 y PD-1, TIM-3 y PD-1, TIM-3 y PDL-1, EGFR y DLL-4, VEGF y EGFR, HGF y VEGF, VEGF y VEGF (mismo epítopo o uno diferente), VEGF y Ang2, EGFR y cMet, PDGF y VEGF, VEGF y DLL-4, OX40 y PD-L1, ICOS y PD-1, ICOS y PD-L1, Lag-3 y PD-1, Lag-3 y PD-L1, Lag-3 y CTLA-4, ICOS y CTLA-4, CD138 y CD20; CD138 y CD40; CD19 y CD20; CD20 y CD3; CD3 y CD33; CD3 y CD133; CD38 & CD138; CD38 y CD20; CD20 y CD22; CD38 y CD40; CD40 y CD20; CD47 y CD20, CD-8 eIL-6; CSPGs y RGM A; CTLA-4 y BTNO2; CTLA-4 y PD-1; IGF1 e IGF2; IGF1/2 y Erb2B; IGF-1R y EGFR; EGFR y CD13; IGF-1R y ErbB3; EGFR-2 y IGFR; Her2 y Her2 (mismo epítopo o uno diferente); Factor IXa, Factor X ,VEGFR-2 y Met; VEGF-A y angiopoyetina-2 (Ang-2); IL-12 y TWEAK; IL-13 e IL-1beta ; MAG y RGM A; NgR y RGM A; NogoA y RGM A; OMGp y RGM A; PDL-1 y CTLA-4; PD-1 y TIM-3; RGM A y RGM B; Te38 y TNFa; TNFa y Blys; TNFa y CD-22; TNFa y dominio CTLA-4; TNFa y GP130; TNFa y IL-12p40; y TNFa y ligando RANK.
En una realización, la proteína de unión es capaz de unirse a IL-17 humana y a IL-20 humana. En una realización adicional, la proteína de unión es capaz de unirse a IL-17 humana y a IL-20 humana, y comprende una secuencia de cadena polipeptídica n° 1 de Ig-FET que es aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 99 %, o aproximadamente 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID n° 15; una secuencia polipeptídica n° 2 que es aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 99 %, o 100 % idéntica a SEC ID n° 21; y una secuencia polipeptídica n° 3 que es aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 99 %, o 100 % idéntica a SEC ID n° 23. En otra realización, la proteína de unión es capaz de unirse a IL-17 humana y a IL-20 humana, y comprende una secuencia de cadena polipeptídica n° 1 de Ig-FET que es aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 99 %, o aproximadamente 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID n° 15; y una secuencia polipeptídica n° 4 que es aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 99 %, o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID n° 29.
En una realización, la proteína de unión es capaz de unirse a CD3 humana y a CD20 humana. En una realización adicional, la proteína de unión comprende una secuencia de cadena polipeptídica n° 1 de Ig-FET que es aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 99 %, o aproximadamente 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID n° 41 y 48; una secuencia de cadena polipeptídica n° 2 que es aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 99 %, o 100 % idéntica a SEC ID n° 44; y una cadena polipeptídica n° 3 que es aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 99 % o 100 % idéntica a Se C ID n° 46.
En una realización, la proteína de unión es capaz de unirse a IL-17 humana y a TNF humana. En una realización adicional, la proteína de unión es capaz de unirse a IL-17 humana y a TNF humana, y comprende una secuencia de cadena polipeptídica n° 1 de Ig-FET que es aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 99 %, o aproximadamente 100 % idéntica a SEC ID n° 87; una secuencia polipeptídica n° 2 que es aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 99 %, o 100 % idéntica a SEC ID n° 89; y una secuencia polipeptídica n° 3 que es aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 99 %, o 100 % idéntica a SEC ID n° 91.
En una realización, la proteína de unión es capaz de unirse a CTLA-4 humana y a PD-1 humana. En una realización adicional, la proteína de unión es capaz de unirse a CTLA-4 humana y a PD-1 humana, y comprende una secuencia de cadena polipeptídica n° 1 de Ig-FET que es aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 99 %, o aproximadamente 100 % idéntica a s Ec ID n° 92; una secuencia polipeptídica n° 2 que es aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 99 %, o 100 % idéntica a SEC ID n° 95; y una secuencia polipeptídica n° 3 que es aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 99 %, o 100 % idéntica a SEC ID n° 97.
En otra realización, la proteína de unión de la invención es capaz de unirse a una o dos citoquinas, proteínas relacionadas con citoquinas y receptores de citoquinas seleccionados del grupo que consiste en BMP1, BMP2, BMP3B (GDF10), BMP4, BMP6, BMP8, CSF1 (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (G-CSF), EPO, FGF1 (aFGF), FGF2 (bFGF), FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF14, FGF16, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF23, IGF1, IGF2, IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNB1, IFNG, IFNW1, FIL1, FIL1 (EPSILON), FIL1 (ZETA), ILIA, IL1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL17B, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL30, PDGFA, FGER1, FGFR2, FGFR3, EGFR, ROR1,2B4, KIR, CD137, CD27, OX40, CD40L, A2aR, CD48, B7-1, B7-2, ICOSL, B7-H3, B7-H4, CD137L, OX40L, CD70, CD40, PDGFB, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, LTA (TNF-b), LTB, TNF (TNF-a ), TNFSF4 (ligando de OX40), TNFSF5 (ligando de CD40), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (ligando de CD27), TNFSF8 (ligando de CD30), TNFSF9 (ligando de 4-1BB), TNFSF10 (TRAIL), TNFSF11 (TRANCE), TNFSF12 (APO3L), TNFSF13 (April), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, FIGF (VEGFD), VEGF, VEGFB, VEGFC, IL1R1, IL1R2, IL1RL1, IL1RL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL7R, IL8RA, IL8RB, IL9R, IL10RA, IL10RB, IL11RA, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL17R, IL18R1, IL20RA, IL21R, IL22R, IL1HY1, IL1RAP, IL1RAPL1, IL1RAPL2, IL1RN, IL6ST, IL18BP, IL18RAP, IL22RA2, AIF1, HGF, LEP (leptina), PTN y THPO.
La proteína de unión de la invención es capaz de unirse a una o más quimioquinas, receptores de quimioquina y proteínas relacionadas con quimioquinas seleccionadas del grupo que consiste en CCL1 (1-309), CCL2 (m Cp -1 / MCAF), CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP-1b), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CCL11 (eotaxina), CCL13 (MCP-4), CCL15 (MIP-1d), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19 (MIP-3b), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (SLC / exodus-2), CCL22 (MDC / STC-1), CCL23 (MPIF-1), CCL24 (MPIF-2 / eotaxina-2), CCL25 (TECK), CCL26 (eotaxina-3), CCL27 (CTACK / ILC), CCL28, CXCL1 (GRO1), CXCL2 (GRO2), CXCL3 (GRO3), CXCL5 (ENA-78), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP 10), CXCL11 (I-TAC), CXCL12 (SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL16, PF4 (CXCL4), PPBP (CXCL7), CX3CL1 (SCYD1), SCYE1, XCL1 (linfotactina), XCL2 (SCM-1b), BLR1 (MDR15), CCBP2 (D6 / JAB61), CCR1 (CKR1 / HM145), CCR2 (mcp-1RB / RA), CCR3 (CKR3 / CMKBR3), CCR4, CCR5 (CMKBR5 / ChemR13), CCR6 (CMKBR6 / CKR-L3 / STRL22 / DRY6), CCR7 (CKR7 / EBI1), CCR8 (CMKBR8 / TER1 / CKR-L1), CCR9 (GPR-9-6), CCRL1 (VSHK1), CCRL2 (L-CCR), XCR1 (GPR5 / CCXCR1), CMKLR1, CMKOR1 (RDC1), CX3CR1 (V28), CXCR4, GPR2 (CCR10), GPR31, GPR81 (FKSG80), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR6 (TYMSTR /STRL33 / Bonzo), HM74, IL8RA (IL8Ra), IL8RB (IL8Rb), LTB4R (GPR16), TCP10, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, BDNF, C5R1, CSF3, GRCC10 (C10), EPO, FY (DARC), GDF5, HIF1A, IL8, PRL, RGS3, RGS13, SDF2, SLIT2, TLR2, TLR4, TREM1, TREM2 y VHL.
En otra realización, la proteína de unión de la invención es capaz de unirse a una proteína de superficie celular, tal como, por ejemplo, integrinas. En otra realización, la proteína de unión de la invención es capaz de unirse a enzimas seleccionados del grupo que consiste en quinasas y proteasas. En todavía otra realización, la proteína de unión de la invención es capaz de unirse a receptores de unión seleccionados del grupo que consiste en receptores de linfoquinas, receptores de monoquinas y receptores de hormonas polipeptídicas.
En una realización, la proteína de unión es multivalente. En otra realización, la proteína de unión es multiespecífica. Las proteínas de unión multivalentes o multiespecíficas indicadas anteriormente presentan propiedades deseas particularmente desde un punto de vista terapéutico. Por ejemplo, la proteína de unión multivalente o multiespecífica puede: (1) internalizarse (y/o catabolizarse) más rápido que un anticuerpo bivalente por parte de una célula que expresa un antígeno al que se unen los anticuerpos, (2) ser un anticuerpo agonista, o (3) inducir la muerte y/o apoptosis celular de una célula que expresa un antígeno al que el anticuerpo multivalente es capaz de unirse. El "anticuerpo parental" que proporciona por lo menos una especificidad de unión a antígeno de las proteínas de unión multivalentes o multiespecíficas puede ser uno que sea internalizado (o catabolizado) por una célula que expresa un antígeno al que se une el anticuerpo, o puede ser un agonista, un anticuerpo inductor de muerte celular o inductor de apoptosis, y la proteína de unión multivalente o multiespecífica tal como se indica en la presente memoria puede mostrar una o más mejoras de una o más de dichas propiedades. Además, el anticuerpo parental puede no presentar una o más cualesquiera de dichas propiedades, aunque puede dotarse de ellas al construirse en forma de una proteína de unión multivalente tal como se indica en la presente memoria.
En otra realización, la proteína de unión de la invención presenta una constante de la tasa de asociación (Kon) a una o más dianas seleccionadas del grupo que consiste en por lo menos aproximadamente 102 M-1s-1; por lo menos aproximadamente 103 M-1s-1; por lo menos aproximadamente 104 M-1s-1; por lo menos aproximadamente 105 M-1s-1; y por lo menos aproximadamente 106 M-1s-1, según medición mediante resonancia del plasmón superficial. Preferentemente, la proteína de unión de la invención presenta una constante de la tasa de asociación (Kon) a una o más dianas de entre 102 M-1s-1 y 103 M-1s-1; de entre 103 M-1s-1 y 104 M-1s-1 ; de entre 104 M-1s-1 y 105 M-1s-1; o de entre 105 M-1s-1 y 106 M-1s-1, según medición mediante resonancia del plasmón superficial.
En otra realización, la proteína de unión presenta una constante de tasa de disociación ( K f para una o más dianas seleccionadas del grupo que consiste en como máximo aproximadamente 10-3s-1; como máximo aproximadamente 10-4 s-1; como máximo aproximadamente 10-5 s-1; y como máximo aproximadamente 10-6 s-1, según medición mediante resonancia del plasmón superficial. Preferentemente, la proteína de unión de la invención presenta una constante de tasa de disociación ( K f a una o más dianas de entre 10-3s-1 y 10-4s-1; de entre 10-4s-1 y 10-5s-1; o de entre 10-5s-1 y 10-6s-1, según medición mediante resonancia del plasmón superficial.
En otra realización, la proteína de unión presenta una constante de disociación (Kd) respecto a una o más dianas seleccionada del grupo que consiste en como máximo aproximadamente 10-7 M; como máximo aproximadamente 10­ 8 M; como máximo aproximadamente 10-9M; como máximo aproximadamente 10-10M; como máximo aproximadamente 10-11 M; como máximo aproximadamente 10-12M; y como máximo 10-13M. Preferentemente, la proteína de unión de la invención presenta una constante de disociación (Kd) respecto a IL-12 o IL-23 de entre 10-7 M y 10-8 M; de entre 10-8 M y 10-9 M; de entre 10-9 M y 10-10 M; de entre 10-10 y 10-11 M; de entre 10-11 M y 10-12 M; o de entre 10-12M y 10-13M.
En otra realización, la proteína de unión indicada anteriormente es un conjugado que comprende además un agente seleccionado del grupo que consiste en una molécula de inmunoadhesión, un agente trazador, un agente terapéutico y un agente citotóxico. En una realización, el agente trazador se selecciona del grupo que consiste en un marcador radiactivo, un enzima, un marcador fluorescente, un marcador luminiscente, un marcador bioluminiscente, un marcador magnético y biotina. En una realización adicional, el agente trazador es un marcador radiactivo seleccionado del grupo que consiste en: 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho y 153Sm. En una realización, el agente terapéutico o citotóxico se selecciona del grupo que consiste en un agente inmunosupresor, un agente inmunoestimulante, un antimetabolito, un agente alquilante, un antibiótico, un factor de crecimiento, una citoquina, un agente antiangiogénico, un agente antimitótico, una antraciclina, una toxina y una gente apoptótico. En una realización, la proteína de unión se conjuga directamente con el agente. En otra realización, la proteína de unión se conjuga con el agente mediante un conector. Entre los conectores adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, conectores de aminoácidos y polipeptídicos dados a conocer en la presente memoria. Los conectores pueden ser escindibles o no escindibles.
En otra realización, la proteína de unión indicada anteriormente es una proteína de unión cristalizada y existe en forma de un cristal. Preferentemente, el cristal es un cristal de liberación controlada farmacéuticamente libre de portadores. Más preferentemente, la proteína de unión cristalizada posee una semivida in vivo más grande que la contrapartida soluble de dicha proteína de unión. Lo más preferentemente, la proteína de unión cristalizada conserva actividad biológica.
En otra realización, la proteína de unión indicada anteriormente está glucosilada. Preferentemente, la glucosilación es un patrón de glucosilación humano.
En la presente memoria se describe además un ácido nucleico aislado codificante de cualquiera de las proteínas de unión dadas a conocer anteriormente. En la presente memoria se describe además un vector que comprende el ácido nucleico aislado que se ha dado a conocer anteriormente, en el que dicho vector se selecciona del grupo que consiste en pcDNA; pTT (Durocher et al., Nucleic Acids Research 2002, vol 30, n° 2); pTT3 (pTT con múltiples sitios de clonación adicionales; pEFBOS (Mizushima, S. y Nagata, S., (1990) Nucleic acids Research vol 18, n° 17); pBV; pJV; pcDNA3.1 TOPO, pEF6 TOPO y pBJ. Las proteínas de unión multiespecíficas y los métodos de preparación de las mismas también se describen en la presente memoria. La proteína de unión puede generarse utilizando diversas técnicas. En la presente exposición se proporcionan vectores de expresión, células huésped y métodos de generación de las proteínas de unión.
Los dominios variables de unión a antígeno de las proteínas de unión de la presente exposición pueden obtenerse a partir de proteínas de unión parentales, incluyendo anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales o receptores capaces de unirse a antígenos de interés. Dichas proteínas de unión parentales pueden ser naturales o pueden generarse mediante tecnología recombinante. Al experto ordinario en la materia le son muy familiares la multitud de métodos para producir anticuerpos y/o receptores aislados, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, las técnicas del hibridoma, el método de anticuerpo de linfocitos seleccionados (SLAM, por sus siglas en inglés), la utilización de un fago, levadura o expresión de fusión de ARN-proteína u otra biblioteca, la inmunización de un animal no humano que comprende por lo menos algunos de los loci de inmunoglobulinas humanas, y la preparación de anticuerpos quiméricos, injertados con CDR, y anticuerpos humanizados. Ver, por ejemplo, la publicación de patente US n° 20090311253 A1. También pueden prepararse dominios variables utilizando técnicas de maduración por afinidad. Los dominios variables de unión de las proteínas de unión también pueden obtenerse a partir de moléculas de receptor aisladas que se han obtenido mediante procedimientos de extracción conocidos de la técnica (p. ej., la utilización de solventes, detergentes y/o purificaciones por afinidad) o determinarse mediante métodos biofísicos conocidos de la técnica (p. ej., cristalografía de rayos X, RMN, interferometría y/o modelado por ordenador).
En la presente memoria se describe además la selección de proteínas de unión parentales con por lo menos una o más propiedades deseadas en la molécula de la proteína de unión. Tal como se indica en la presente memoria, la propiedad deseada es una o más de las utilizadas para caracterizar parámetros de los anticuerpos, tales como, por ejemplo, la especificidad de antígeno, la afinidad para antígenos, la potencia, la función biológica, el reconocimiento de epítopos, la estabilidad, la solubilidad, la eficiencia de producción, la inmunogenicidad, la farmacocinética, la biodisponibilidad, la reactividad cruzada de tejidos o la unión de antígenos ortólogos. Ver, por ejemplo, la publicación de patente US n° 20090311253.
Los anticuerpos multiespecíficos también pueden diseñarse de manera que uno o más dominios de unión a antígeno se vuelven no funcionales. Los dominios variables pueden obtenerse utilizando técnicas de ADN recombinante a partir de proteínas de unión parentales generadas mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria. En una realización, un dominio variable es un dominio variable de cadena pesada o ligera murina. En otra realización, un dominio variable es un dominio de cadena pesada o ligera variable humanizada o injertado con CDR. En una realización, un dominio variable es un dominio variable de cadena pesada o ligera humana.
En una realización, se une uno o más dominios constantes a los dominios variables utilizando técnicas de ADN recombinante. En una realización, una secuencia que comprende uno o más dominios variables de cadena pesada se une a un dominio constante de cadena pesada y una secuencia que comprende uno o más dominios variables de cadena ligera se une a un dominio constante de cadena ligera. En una realización, los dominios constantes son dominios constantes de cadena pesada humana y dominios constantes de cadena ligera humana, respectivamente. En una realización, la cadena pesada se une adicionalmente a una región Fc. La región Fc puede ser una región Fc de secuencia nativa o una región Fc variante. En otra realización, la región Fc es una región Fc humana. En otra realización, la región Fc incluye una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE o IgD.
Además, las proteínas de unión proporcionadas en la presente memoria pueden utilizarse para el transporte específico de tejido (reconocimiento de un marcador de tejido y un mediador de enfermedad para una FC local mejorada, proporcionando de esta manera una eficacia más alta y/o una toxicidad más baja), incluyendo la administración intracelular (con diana en un receptor internalizante y una molécula intracelular), con transporte al interior del cerebro (con diana en un receptor de transferrina y un mediador de enfermedad del SNC para cruzar la barrera hematoencefálica). La proteína de unión también puede servir de proteína portadora para transportar un antígeno a una localización específica mediante la unión a un epítopo no neutralizante de ese antígeno y también para incrementar la semivida del antígeno. Además, las proteínas de unión pueden diseñarse para unirse físicamente a dispositivos médicos implantados en los pacientes o para transportar de manera dirigida dichos dispositivos médicos (ver Burket et al. (2006) Advanced Drug Deliv. Rev. 58(3): 437-446; Hildebrand et al. (2006) Surface and Coatings Technol. 200(22-23): 6318-6324; Drug/device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis, Wu (2006) Biomaterials 27(11):2450-2467; Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices, Marques (2005) Biodegradable Systems in Tissue Engineer. Regen. Med. 377-397). La dirección de tipos apropiados de células al sitio del implante médico puede fomentar la cicatrización y restauración del funcionamiento normal del tejido. Alternativamente, también se proporciona la inhibición de mediadores (incluyendo, aunque sin limitación, las citoquinas), liberados al implantarse el dispositivo por una proteína de fusión de receptor-anticuerpo acoplado con o dirigido a un dispositivo.
Tal como se indica en la presente memoria, puede transformarse una célula huésped con el vector dado a conocer anteriormente. Tal como se indica en la presente memoria, la célula huésped puede ser una célula procariótica. Tal como se indica en la presente memoria, la célula huésped puede ser de Escherichia coli. Tal como se indica en la presente memoria, la célula huésped puede ser una célula eucariótica. Tal como se indica en la presente memoria, la célula eucariótica puede seleccionarse del grupo que consiste en células protistas, células animales, células vegetales y células fúngicas. Tal como se indica en la presente memoria, la célula huésped puede ser una célula de mamífero, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, células 293, COS, NS0 y CHO, o una célula fúngica, tal como Saccharomyces cerevisiae, o una célula de insecto, tal como Sf9.
En la presente memoria se indica además un método para producir una proteína de unión dada a conocer anteriormente que comprende cultivar cualquiera de las células huésped dadas a conocer anteriormente en un medio de cultivo bajo condiciones suficientes para producir la proteína de unión. Preferentemente 50 % a 75 % de la proteína de unión producida mediante dicho método es una proteína de unión tetravalente de doble especificidad. Más preferentemente, 75 % a 90 % de la proteína de unión producida mediante dicho método es una proteína de unión tetravalente de doble especificidad. Lo más preferentemente, 90 % a 95 % de la proteína de unión producida es una proteína de unión tetravalente de doble especificidad.
En la presente memoria se describe además una proteína de unión producida según el método dado a conocer anteriormente.
En la presente memoria se describe además una composición para la liberación de una proteína de unión en la que la composición comprende una formulación que, a su vez, comprende una proteína de unión cristalizada, tal como se ha dado a conocer anteriormente, y un ingrediente, y por lo menos un portador polimérico. Preferentemente, el portador polimérico es un polímero seleccionado de uno o más del grupo que consiste en poli(ácido acrílico), poli(cianoacrilatos), poli(aminoácidos), poli(anhídridos), poli(depsipéptido), poli(ésteres), poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-co-glicólico) o PLGA, poli(b-hidroxibutirato), poli(caprolactona), poli(dioxanona), poli(etilenglicol), poli(hidroxipropil)metacrilamida, poli[(organo)fosfaceno], poli(orto-ésteres), poli(alcohol vinílico), poli(vinilpirrolidona), copolímeros de anhídrido maleico-éter alquilvinílico, polioles plurónicos, albúmina, alginato, celulosa y derivados de celulosa, colágeno, fibrina, gelatina, ácido hialurónico, oligosacáridos, glucaminoglicanos, polisacáridos sulfatados, mezclas y copolímeros de los mismos. Preferentemente, el ingrediente se selecciona del grupo que consiste en albúmina, sucrosa, trehalosa, lactitol, gelatina, hidroxipropil-p-ciclodextrina, metoxipolietilenglicol y polietilenglicol. En la presente memoria se describe además un método para el tratamiento de un mamífero, que comprende la etapa de administrar en el mamífero una cantidad eficaz de la composición dada a conocer anteriormente.
La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión, tal como se reivindica en la presente memoria y un portador farmacéuticamente aceptable. Entre los portadores farmacéuticamente aceptables se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, tampón de fosfato o solución salina. Entre otros vehículos parenterales comunes se incluyen soluciones de fosfato sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, solución de Ringer lactato o aceites fijos. Entre los vehículos intravenosos se incluyen los reabastecedores de fluidos y nutrientes, los reabastecedores de electrolitos, tales como los basados en dextrosa de Ringer, y similares. También pueden encontrarse presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes, y similares. Más particularmente, entre las composiciones farmacéuticas adecuadas para el uso inyectable se incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles (en el caso de ser solubles en agua), y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (p. ej., glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. En algunos casos, resulta preferente incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse mediante la inclusión en la composición de un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
En una realización adicional, la composición farmacéutica comprende por lo menos un agente terapéutico adicional para el tratamiento de un trastorno. En una realización, el agente adicional se selecciona del grupo que consiste en agentes terapéuticos, agentes de captación de imágenes, agentes citotóxicos, inhibidores de angiogénesis (incluyendo, aunque sin limitación, anticuerpos anti-VEGF o trampas de VEGF), inhibidores de quinasa (incluyendo, aunque sin limitación, inhibidores de KDR y TIE-2), bloqueantes de molécula de coestimulación (incluyendo, aunque sin limitación, anti-B7.1, anti-B7.2, CTLA4-Ig, anti-PD-1 y anti-CD20), bloqueantes de molécula de adhesión (incluyendo, aunque sin limitación, anticuerpos anti-LFA-1, anticuerpos antiselectina E/L e inhibidores de molécula pequeña), anticuerpo anticitoquina o fragmento funcional del mismo (incluyendo, aunque sin limitación, anticuerpos anti-IL-18, anti-TNF y anti-IL-6/receptor de citoquina), metotrexato, ciclosporina, rapamicina, FK506, marcaje o informador detectable, un antagonista de TNF, un antirreumático, un relajante muscular, un narcótico, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueante neuromuscular, un antimicrobiano, un antisoriático, un corticoesteroide, un esteroide anabólico, una eritropoyetina, una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona de crecimiento, un fármaco de reemplazo hormonal, un radiofarmacéutico, un antidepresivo, un antipsicótico, un estimulante, una medicación del asma, un betaagonista, un esteroide inhalado, una epinefrina o análogo, una citoquina y un antagonista de citoquina.
En otro aspecto, la invención proporciona las proteínas de unión definidas en las reivindicaciones para la utilización en un método para el tratamiento de un sujeto humano que sufre de un trastorno en el que la diana, o dianas, capaces de ser ligadas por la proteína de unión reivindicada en la presente memoria, son perjudiciales, que comprende administrar en el sujeto humano una proteína de unión reivindicada en la presente memoria, de manera que la actividad de la diana o dianas en el sujeto humano resulta inhibida y se consigue el tratamiento o la prevención del trastorno. En una realización, la enfermedad o trastorno es una condición inflamatoria, enfermedad autoinmunitaria o cáncer. En una realización, la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que comprende artritis, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis séptica, artritis de Lyme, artritis soriática, artritis reactiva, espondiloartropatía, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad intestinal inflamatoria, diabetes mellitus dependiente de insulina, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, soriasis, colitis ulcerosa, enfermedad intestinal inflamatoria, diabetes mellitus dependiente de insulina, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, psoriasis, dermatitis, esclerodermia, enfermedad del injerto contra el huésped, rechazo del trasplante de órgano, enfermedad inmunitaria aguda o crónica asociada a trasplante de órgano, sarcoidosis, ateroesclerosis, coagulación intravascular diseminada, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Grave, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, púrpura de Henoch-Schoenlein, vasculitis microscópica de los riñones, hepatitis activa crónica, uveítis, choque séptico, síndrome de choque tóxico, síndrome de sepsis, caquexia, enfermedades infecciosas, enfermedades parasitarias, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, mielitis transversal aguda, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, ictus, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, neoplasias malignas, insuficiencia cardiaca, infarto de miocardio, enfermedad de Addison, deficiencia poliglandular esporádica de tipo I y deficiencia poliglandular de tipo II, síndrome de Schmidt, síndrome del distrés respiratorio en el adulto (agudo), alopecia, alopecia areata, artropatía seronegativa, artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía soriática, artropatía colítica ulcerativa, sinovitis enteropática, artropatía asociada a Clamidia, Yersinia y Salmonella, espondiloartropatía, enfermedad ateromatosa/arterioesclerosis, alergia atópica, enfermedad bullosa autoinmune, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, penfigoide,, enfermedad de IgA lineal, anemia hemolítica autoinmune, anemia hemolítica positiva para Coombs, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis miálgica/enfermedad de Royal, candidiasis crónica mucocutánea, arteritis de células gigantes, hepatitis esclerosante primaria, hepatitis esclerosante primaria hepatitis autoinmune criptogénica, síndrome de enfermedad de inmunodeficiencia adquirida, enfermedades relacionadas con la inmunodeficiencia adquirida, hepatitis B, hepatitis C, inmunodeficiencia variada común (hipogammaglobulinemia variable común), cardiomiopatía dilatada, infertilidad femenina, fallo ovárico, fallo ovárico prematuro, enfermedad pulmonar fibrótica, alveolitis fibrosante criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial postinflamatoria, neumonitis intersticial, enfermedad del tejido conectivo asociada a enfermedad del tejido conectivo, enfermedad pulmonar asociada a enfermedad del tejido conectivo mixta, enfermedad pulmonar intersticial asociada a esclerosis sistémica, enfermedad pulmonar intersticial asociada a artritis reumatoide, enfermedad pulmonar asociada a lupus eritematoso sistémico, enfermedad pulmonar asociada a dermatomiositis/polimiositis, enfermedad pulmonar asociada a enfermedad de Sjogren, enfermedad pulmonar asociada a espondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar difusa vasculítica, enfermedad pulmonar asociada a hemosiderosis, enfermedad pulmonar intersticial inducida farmacológicamente, fibrosis, fibrosis por radiación, bronquiolitis obliterante, neumonía eosinofílica crónica, enfermedad pulmonar infiltrante linfocítica, enfermedad pulmonar intersticial postinfecciosa, artritis gotosa, hepatitis autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria de tipo 1 (hepatitis autoinmune clásica o lupoide), hepatitis autoinmune de tipo 2 (hepatitis de anticuerpos anti-LKM), hipoglucemia de tipo autoinmunitario, resistencia a la insulina de tipo B con acantosis nigricans, hipoparatiroidismo, enfermedad inmunitaria aguda asociada al trasplante de órgano, enfermedad inmunitaria crónica asociada al trasplante de órgano, osteoartrosis, colangitis esclerosante primaria, soriasis de tipo 1, soriasis de tipo 2, leucopenia idiopática, neutropenia autoinmune, enfermedad renal NOS, glomerulonefritis, vasculitis microscópica de los riñones, enfermedad de Lyme, lupus eritematoso discoide, infertilidad masculina idiopática o NOS, autoinmunidad del esperma, esclerosis múltiple (todos los subtipos), oftalmia simpática, hipertensión pulmonar secundaria a enfermedad del tejido conectivo, síndrome de Goodpasture, manifestación pulmonar de la poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, enfermedad de Still, esclerosis sistémica, síndrome de Sjorgren, enfermedad de Takayasu/arteritis, trombocitopenia autoinmune, enfermedad tiroidea autoinmune, hipertiroidismo, hipotiroidismo autoinmune gotoso (enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo autoinmune atrófico, mixoedema primario, uveítis facogénica, vasculitis primaria, vitíligo, enfermedad hepática aguda del vitíligo, enfermedades hepáticas crónicas, cirrosis alcohólica, lesión hepática inducida por alcohol, coleostasis, enfermedad hepática idiosincrática, hepatitis inducida farmacológicamente, esteatohepatitis no alcohólica, alergia y asma, infección por estreptococos del grupo B (GBS, por sus siglas en inglés), trastornos mentales (p. ej., depresión y esquizofrenia), enfermedades mediadas por tipo Th2 y tipo Th1, dolor agudo y crónico (diferentes formas de dolor), y cánceres, tales como cáncer de pulmón, mama, estómago, vejiga, colon, páncreas, ovario, próstata y recto, y neoplasias malignas hematopoyéticas (leucemia y linfoma), abetalipoprotemia, acrocianosis, procesos parasitarios o infecciosos agudos y crónicos, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), infección bacteriana aguda o crónica, pancreatitis aguda, insuficiencia renal aguda, adenocarcinomas, latidos ectópicos aéreos, complejo de la demencia del SIDA, hepatitis inducida por alcohol, conjuntivitis alérgica, dermatitis por contacto alérgica, rinitis alérgica, rechazo del aloinjerto, deficiencia en antitripsina alfa-1, esclerosis lateral amiotrófica, anemia, angina de pecho, degeneración de las células del cuerno anterior, terapia anti-CD3, síndrome antifosfolípido, reacciones de hipersensibilidad antirreceptor, aneurismas aórticos y periféricos, disección aórtica, hipertensión arterial, arteriesclerosis, fístula arteriovenosa, ataxia, fibrilación auricular (sostenida o paroxística), fibrilación auricular, bloqueo auriculoventricular, linfoma de células B, rechazo del injerto óseo, rechazo del trasplante de médula ósea (TMO), bloqueo de rama del haz, linfoma de Burkitt, ardores, arritmias cardiacas, síndrome del aturdimiento cardíaco, tumores cardiacos, cardiomiopatía, respuesta de inflamación de la derivación cardiopulmonar, rechazo del trasplante de cartílago, degeneración cortical cerebelar, trastornos cerebelares, taquicardia auricular caótica o multifocal, trastornos asociados a quimioterapia, leucemia mielocítica crónica (LMC), alcoholismo crónico, patologías inflamatorias crónicas, leucemia linfocítica crónica (LLC), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), intoxicación por salicilato crónica, carcinoma colorrectal, insuficiencia cardiaca congestiva, conjuntivitis, dermatitis por contacto, cor pulmonale, enfermedad arterial coronaria, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, sepsis negativa en cultivo, fibrosis quística, trastornos asociados a la terapia de citoquinas, demencia del púgil, enfermedades desmielinizantes, fiebre hemorrágica del Dengue, dermatitis, condiciones dérmicas, diabetes, diabetes mellitus, enfermedad ateroesclerótica diabética, enfermedad de cueros de Lewy difusos, cardiomiopatía congestiva dilatada, trastornos de los ganglios basales, síndrome de Down en la mediana edad, trastornos del movimiento inducidos farmacológicamente inducidos por fármacos que bloquean los receptores de la dopamina en el SNC, sensibilidad farmacológica, eccema, encefalomielitis, endocarditis, endocrinopatía, epiglotitis, infección por virus de Epstein-Barr, eritromelalgia, trastornos extrapiramidales y cerebelares, linfohistiocitosis hematofagocítica familiar, rechazo del implante de timo fetal, ataxia de Friedreich, trastornos arteriales periféricos funcionales, sepsis fúngica, gangrena gaseosa, úlcera gástrica, nefritis glomerular, rechazo del injerto de cualquier órgano o tejido, sepsis Gram-negativa, sepsis Gram-positiva, granulomas debidos a organismos intracelulares, leucemia de células pilosas, enfermedad de Hallerrorden-Spatz, tiroiditis de Hashimoto, fiebre del heno, rechazo del trasplante cardíaco, hemacromatosis, hemodiálisis, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombocitopénica trombolítica, hemorragia, hepatitis (A), arritmias de haz de His, infección por VIH/neuropatía del VIH, enfermedad de Hodgkin, trastornos del movimiento hipercinético, reacciones de hipersensibilidad, neumonitis por hipersensibilidad, hipertensión, trastornos del movimiento hipocinético, evaluación del eje hipotalámico-pituitario-adrenal, enfermedad de Addison idiopática, fibrosis pulmonar idiopática, citotoxicidad mediada por anticuerpos, astenia, atrofia muscular espinal infantil, inflamación de la aorta, influenza a, exposición a radiación ionizante, iridociclitis/uveítis/neuritis óptica, daño por isquemia/reperfusión, ictus isquémico, artritis reumatoide juvenil, atrofia muscular espinal juvenil, sarcoma de Kaposi, rechazo del trasplante renal, Legionella, leishmaniasis, lepra, lesiones del sistema corticoespinal, lipedema, rechazo del trasplante hepático, linfoedema, malaria, linfoma maligno, histiocitosis maligna, melanoma maligno, meningitis, meningococcemia, metabólico/idiopático, migraña, trastorno multisistema mitocondrial, enfermedad del tejido conectivo mixto, gammapatía monoclonal, mieloma múltiple, degeneraciones de múltiples sistemas (Mencel Dejerine- Thomas Shi-Drager y Machado-Joseph), miastenia grave, Mycobacterium avium intracelular, Mycobacterium tuberculosis, síndrome mielodisplásico, infarto de miocardio, trastornos isquémicos miocárdicos, carcinoma nasofaríngeo, enfermedad pulmonar crónica neonatal, nefritis, nefrosis, enfermedades neurodegenerativas, atrofias musculares neurogénicas I, fiebre neutropénica, linfoma no de Hodgkin, oclusión de la aorta abdominal y sus ramas, trastornos arteriales oclusivos, terapia de okt3, orquitis/epididimitis, orquitis/procedimientos de reversión de vasectomía, organomegalia, osteoporosis, rechazo del trasplante de páncreas, carcinoma pancreático, síndrome paraneoplásico/hipercalcemia de neoplasia maligna, rechazo del trasplante paratiroideo, enfermedad inflamatoria pélvica, rinitis perenne, enfermedad pericárdica, enfermedad ateroesclerótica periférica, trastornos vasculares periféricos, peritonitis, anemia perniciosa, neumonía por Pneumocystis carinii, neumonía, síndrome POEMS (polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gammapatía monoclonal y síndrome de cambios cutáneos), síndrome postperfusión, síndrome postbomba, síndrome postcardiotomía MI, preeclampsia, parálisis supranuclear progresiva, hipertensión pulmonar primaria, terapia de radiación, fenómeno y enfermedad de Raynaud, enfermedad de Raynoud, enfermedad de Refsum, taquicardia QRS estrecha regular, hipertensión renovascular, daño por reperfusión, cardiomiopatía restrictiva, sarcomas, esclerodermia, corea senil, demencia senil de tipo cuerpos de Lewis, artropatías seronegativas, choque, anemia de células falciformes, rechazo del aloinjerto cutáneo, síndrome de cambios cutáneos, rechazo del trasplante de intestino delgado, tumores sólidos, arritmias específicas, ataxia espinal, degeneraciones espinocerebelares, miositis estreptocócica, lesiones estructurales del cerebelo, panencefalitis esclerosante subaguda, síncope, sífilis del sistema cardiovascular, anafilaxis sistémica, síndrome de la respuesta inflamatoria sistémica, artritis reumatoide juvenil de aparición sistémica, LLA de células T o FAB, telangiectasia, tromboangitis obliterante, trombocitopenia, toxicidad, trasplantes, traumatismo/hemorragia, reacciones de hipersensibilidad de tipo III, hipersensibilidad de tipo IV, angina inestable, uremia, urosepsis, urticaria, enfermedades cardíacas valvulares, venas varicosas, vasculitis, enfermedades venosas, trombosis venosa, fibrilación ventricular, infecciones víricas y fúngicas, encefalitis vital/meningitis aséptica, síndrome hemafagocítico asociado a vital, síndrome de Wernicke-Korsakoff, enfermedad de Wilson, rechazo del xenoinjerto de cualquier órgano o tejido.
En otro aspecto, la invención proporciona las proteínas de unión según se definen en las reivindicaciones, para la utilización en un método de tratamiento de un paciente que sufre de un trastorno, que comprende la etapa de administrar cualquiera de las proteínas de unión reivindicadas anteriormente en la presente memoria, concurrentemente o después de la administración de un segundo agente, tal como se ha comentado anteriormente. En una realización preferente, el segundo agente se selecciona del grupo que consiste en budenósido, factor de crecimiento epidérmico, corticoesteroides, ciclosporina, sulfasalazina, aminosalicilatos, 6-mercaptopurina, azatioprina, metronidazol, inhibidores de lipooxigenasa, mesalamina, olsalazina, balsalazida, antioxidantes, inhibidores de tromboxano, antaognistas de receptor de IL-1, anticuerpos monoclonales anti-IL-1p, anticuerpos monoclonales anti-IL-6, factores de crecimiento, inhibidores de elastasa, compuestos de piridinil-imidazol, anticuerpos o agonistas de TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-18, IL-23, EMAP-II, GM-CSF, FGF y PDGF, anticuerpos de CD2, CD3, CD4, CD8, CD-19, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o sus ligandos, metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato mofetilo, leflunomida, AINE, ibuprofeno, corticoesteroides, prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, IRAK, NIK, IKK, p38, inhibidores de MAP quinasa, inhibidores del enzima conversor de IL-1p, inhibidores del enzima conversor de TNFa, inhibidores de señalización de células T, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores del enzima conversor de la angiotensina, receptores de citoquina solubles, receptor p55 de TNF soluble, receptor p75 de TNF soluble, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, citoquinas antiinflamatorias, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 y TGFp.
En una realización, las composiciones farmacéuticas dadas a conocer anteriormente se administran en el sujeto mediante por lo menos un modo seleccionado de entre parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitario, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocárdico, intraosteal, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniano, intraespinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal y transdérmico.
En la presente memoria se describe además por lo menos un anticuerpo antiidiotipo de por lo menos una proteína de unión de la presente invención. El anticuerpo antiidiotipo incluye cualquier molécula que contenga proteína o péptido que comprende por lo menos una parte de una molécula de inmunoglobulina, tal como, aunque sin limitación, por lo menos una región determinante de complementariedad (CDR) de una cadena pesada o ligera o una parte de unión a ligando de la misma, una región variable de cadena pesada o de cadena ligera, una región constante de cadena pesada o de cadena ligera, una región marco, o cualquier porción de las mismas, que puede incorporarse en una proteína de unión de la presente invención.
En otra realización, las proteínas de unión de la invención son capaces de unirse a una o más dianas seleccionada del grupo que consiste en ABCF1; ACVR1; ACVR1B; ACVR2; ACVR2B; ACVRL1; ADORA2A; agrecano; AGR2; AICDA; AIF1; AIG1; AKAP1; AKAP2; AMH; AMHR2; ANGPT1; ANGPT2; ANGPTL3; ANGPTL4; ANPEP; APC; APOC1; AR; AZGP1 (zinc-a-glucoproteína); B7.1; B7.2; BAD; BAFF; BAG1; BAI1; BCL2; BCL6; BDNF; BLNK; BLR1 (MDR15); BlyS; BMP1; BMP2; BMP3B (GDF10); BMP4; BMP6; BMP8; BMPR1A; BMPR1B; BMPR2; BPAG1 (plectin); BRCA1; C19orf10 (IL27w); C3; C4A; C5; C5R1; CANT1; CASP1; CASP4; CAVI; CCBP2 (D6 / JAB61); CCL1 (1-309); CCL11 (eotaxina); CCL13 (MCP-4); CCL15 (MIP-1d); CCL16 (HCC-4); CCL17 (TARC); CCL18 (PARC); CCL19 (MIP-3b); CCL2 (MCP -1); MCAF; CCL20 (MIP-3a); CCL21 (MIP-2); SLC; exodus-2; CCL22 (MDC / STC-1); CCL23 (MPIF-1); CCL24 (MPIF-2 / eotaxina-2); CCL25 (TECK); CCL26 (eotaxina-3); CCL27 (CTACK / ILC); CCL28; CCL3 (MIP-1a); CCL4 (MIP-1b); CCL5 (RANTES); CCL7 (MCP-3); CCL8 (mcp-2); CCNA1; CCNA2; CCND1; CCNE1; CCNE2; CCR1 (CKR1 / HM145); CCR2 (mcp-1RB / RA);CCR3 (CKR3 / CMKBR3); CCR4; CCR5 (CMKBR5 / ChemR13); CCR6 (CMKBR6 / CKR-L3 / STRL22 / DRY6); CCR7 (CKR7 / EBI1); CCR8 (CMKBR8 / TER1 / CKR-L1); CCR9 (GPR-9-6); CCRL1 (VSHK1); CCRL2 (L-CCR); CD164; CD19; CD1C; CD20; CD200; CD-22; CD24; CD28; CD3; CD37; CD38; CD3E; CD3G; CD3Z; CD4; CD40; CD40L; CD44; CD45RB; CD47, CD48, CD52; CD69; CD70, CD72; CD74; CD79A; CD79B; CD8; CD80; CD81; CD83; CD86; CD137, CD138, B7-1, B7-2, ICOSL, B7-H3, B7-H4, CD137L, OX40L, CDH1 (E-cadherina); CDH10; CDH12; CDH13; CDH18; CDH19; CDH20; CDH5; CDH7; CDH8; CDH9; CDK2; CDK3; CDK4; CDK5; CDK6; CDK7; CDK9; CDKN1A (p21Wap1/Cip1); CDKN1B (p27Kip1); CDKN1C; CDKN2A (p16INK4a); CDKN2B; CDKN2C; CDKN3; CEBPB; CER1; CHGA; CHGB; quitinasa; CHST10; CKLFSF2; CKLFSF3; CKLFSF4; CKLFSF5; CKLFSF6; CKLFSF7; CKLFSF8; CLDN3; CLDN7 (claudina-7); CLN3; CLU (clusterina); CMKLR1; CMKOR1 (RDC1); CNR1; COL18A1; COL1A1; COL4A3; COL6A1; CR2; CRP; CSF1 (M-CSF); CSF2 (GM-CSF); CSF3 (GCSF); CTLA-4; CTNNB1 (b-catenina); CTSB (catepsina B); CX3CL1 (SCYD1); CX3CR1 (V28); CXCL1 (GRO1); CXCL10 (IP-10); CXCL11 (I-TAC / IP-9); CXCL12 (SDF1); CXCL13; CXCL14; CXCL16; CXCL2 (GRO2); CXCL3 (GRO3); CXCL5 (ENA-78 / LIX); CXCL6 (GCP-2); CXCL9 (MIG); CXCR3 (GPR9/CKR-L2); CXCR4; CXCR6 (TYMSTR /STRL33 / Bonzo); CYB5; CYC1; CYSLTR1; DAB2IP; DES; DKFZp451J0118; DNCL1; DPP4; E2F1; ECGF1; EDG1; EFNA1; EFNA3; EFNB2; EGF; EGFR; ELAC2; ENG; ENO1; ENO2; ENO3; EPHB4; EPO; ERBB2 (Her-2); EREG; ERK8; ESR1; ESR2; F3 (TF); FADD; FasL; FASN; FCER1A; FCER2; FCGR3A; FGF; FGF1 (aFGF); FGF10; FGF11; FGF12; FGF12B; FGF13; FGF14; FGF16; FGF17; FGF18; FGF19; FGF2 (bFGF); FGF20; FGF21; FGF22; FGF23; FGF3 (int-2); FGF4 (HST); FGF5; FGF6 (HST-2); FGF7 (KGF); FGF8; FGF9; FGFR3; FIGF (VEGFD); FIL1 (EPSILON); FIL1 (ZETA); FLJ12584; FLJ25530; FLRT1 (fibronectina); FLT1; FOS; FOSL1 (FRA-1); FY (DARC); GABRP (GABAa); GAGEB1; GAGEC1; GALNAC4S-6ST; GATA3; GDF5; GFI1; GGT1; GM-CSF; GNAS1; GNRH1; GPR2 (CCR10); GPR31; GPR44; GPR81 (FKSG80); GRCC10 (C10); GRP; GSN (Gelsolina); GSTP1; HAVCR2; HDAC4; HDAC5; HDAC7A; HDAC9; HGF; HIF1A; HIP1; histamina y receptores de histamina; HLA-A; HLA-DRA; HM74; HMOX1; HUMCYT2A; ICEBERG; ICOSL; ID2; IFN-a; IFNA1; IFNA2; IFNA4; IFNA5; IFNA6; IFNA7; IFNB1; IFN-gamma; IFNW1; IGBP1; IGF1; IGF1R; IGF2; IGFBP2; IGFBP3; IGFBP6; IL-1; IL10; IL10RA; IL10RB; IL11; IL11RA; IL-12; IL12A; IL12B; IL12RB1; IL12RB2; IL13; IL13RA1; IL13RA2; IL14; IL15; IL15RA; IL16; IL17; IL17B; IL17C; IL17R; IL18; IL18BP; IL18R1; IL18RAP; IL19; ILIA; IL1B; IL1F10; IL1F5; IL1F6; IL1F7; IL1F8; IL1F9; IL1HY1; IL1R1; IL1R2; IL1RAP; IL1RAPL1; IL1RAPL2;IL1RL1;IL1RL2 IL1RN; IL2; IL20; IL20RA; IL21R; IL22; IL22R; IL22RA2; IL23; IL24; IL25; IL26; IL27; IL28A; IL28B; IL29; IL2RA; IL2RB; IL2RG; IL3; IL30; IL3RA; IL4; IL4R; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL6ST (glucoproteína 130); IL7; IL7R; IL8; IL8RA; IL8RB; IL8RB; IL9; IL9R; ILK; INHA; INHBA; INSL3; INSL4; IRAK1; IRAK2; ITGA1; ITGA2; ITGA3; ITGA6 (a6 integrina); ITGAV; ITGB3; ITGB4 (b 4 integrina); JAG1; JAK1; JAK3; JUN; K6HF; KAI1; KDR; KITLG; KLF5 (GC Box BP); KLF6; KLK10; KLK12; KLK13; KLK14; KLK15; KLK3; KLK4; KLK5; KLK6; KLK9; KRT1; KRT19 (queratina 19); KRT2A; KRTHB6 (queratina tipo II específica de pelo); LAMA5; LEP (leptina); Lingo-p75; Lingo-Troy; LPS; LTA (TNF-b); LTB; LTB4R (GPR16); LTB4R2; LTBR; MACMARCKS; MAG o Omgp ; MAP2K7 (c-Jun); MDK; MIB1; midkina; MIF; MIP-2; MKI67 (Ki-67); MMP2; MMP9; MS4A1; MSMB; MT3 (metalotionectina-III); MTSS1; MUC1 (mucina); MYC; MYD88; NCK2; neurocán; NFKB1; NFKB2; NGFB (NGF); NGFR; NgR-Lingo; NgR-Nogo66 (Nogo); NgR-p75; NgR-Troy; NME1 (NM23A); NOX5; NPPB; NR0B1; NR0B2; NR1D1; NR1D2; NR1H2; NR1H3; NR1H4; NR1I2; NR1I3; NR2C1; NR2C2; NR2E1; NR2E3; NR2F1; NR2F2; NR2F6; NR3C1; NR3C2; NR4A1; NR4A2; NR4A3; NR5A1; NR5A2; NR6A1; NRP1; NRP2; NT5E; NTN4; ODZ1; OPRD1; PCSK9; P2RX7; PAP; PART1; PATE; PAWR; PCA3; PCNA; PD-1; PD-L1; alpha4beta7, OX40, GITR, TIM-3, Lag-3, B7-H3, B7-H4, GDF8, CGRP, Lingo-1, Factor IXa, Factor X, ICOS, GARP, BTLA, CD160, ROR1, 2B4, KIR, CD27, OX40, CD40L, A2aR, PDGFA; PDGFB; PECAM1; PF4 (CXCL4); PGF; PGR; fosfacán; PIAS2; PIK3CG; PLAU (uPA); PLG; PLXDC1; PPBP (CXCL7); PPID; PR1; PRKCQ; PRKD1; PRL; PROC; PROK2; PSAP; PSCA; PTAFR; PTEN; PTGS2 (COX-2); PTN; RAC2 (p21Rac2); RARB; RGS1; RGS13; RGS3; RNF110 (ZNF144); ROBO2; S100A2; SCGB1D2 (lipofilina B); SCGB2A1 (mammaglobina 2); SCGB2A2 (mammaglobina 1); SCYE1 (citoquina activadora de monocito endotelial); SDF2; SERPINA1; SERPINA3; SERPINB5 (maspina); SERPINE1 (PAI-1); SERPINF1; SHBG; SLA2; SLC2A2; SLC33A1; SLC43A1; SLIT2; SPP1; SPRR1B (Spr1); ST6GAL1; STAB1; STAT6; STEAP; STEAP2; TB4R2; TBX21; TCP10; TDGF1; TEK; TGFA; TGFB1; TGFB1I1; TGFB2; TGFB3; TGFBI; TGFBR1; TGFBR2; TGFBR3; TH1L; THBS1 (trombospondina-1); THBS2; THBS4; THPO; TIE (Tie-1); TIMP3; factor tisular; TLR10; TLR2; TLR3; TLR4; TLR5; TLR6; TLR7; TLR8; TLR9; TNF; TNF-a; TNFAIP2 (B94); TNFAIP3; TNFRSF11A; TNFRSF1A; TNFRSF1B; TNFRSF21; TNFRSF5; TNFRSF6 (Fas); TNFRSF7; TNFRSF8; TNFRSF9; TNFSF10 (TRAIL); TNFSF11 (TRANCE); TNFSF12 (APO3L); TNFSF13 (April); TNFSF13B; TNFSF14 (HVEM-L); TNFSF15 (VEGI); TNFSF18; TNFSF4 (ligando de OX40); TNFSF5 (ligando de CD40); TNFSF6 (FasL); TNFSF7 (ligando de CD27); TNFSF8 (ligando de CD30); TNFSF9 (ligando de 4-1BB); TOLLIP; receptores de tipo Toll; TOP2A (topoisomerasa IIa); TP53; TPM1; TPM2; TRADD; TRAF1; TRAF2; TRAF3; TRAF4; TRAF5; TRAF6; TREM1; TREM2; TRPC6; TSLP; TWEAK; VEGF; VEGFB; VEGFC; versicán; VHL C5; VLA-4; XCL1 (linfotactina); XCL2 (SCM-1b); XCR1 (GPR5 / CCXCR1); YY1; and ZFPM2.
Dada su capacidad de unirse a dos o más antígenos, las proteínas de unión de la presente invención pueden utilizarse para detectar los antígenos (p. ej., en una muestra biológica, tal como suero o plasma), utilizando un inmunoensayo convencional, tal como un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) o inmunohistoquímica de tejidos. La Ig-FET se marca directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Entre las sustancias detectables adecuadas se incluyen diversos enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radioactivos. Entre los ejemplos de enzimas adecuados se incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, galactosidasa o acetilcolinesterasa; entre los ejemplos de complejos de grupo prostético adecuado se incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; entre los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados se incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; y entre los ejemplos de material radioactivo adecuado se incluyen 3h , 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, o 153Sm.
Las proteínas de unión de la invención, en una realización, son capaces de neutralizar la actividad de los antígenos tanto in vitro como in vivo. De acuerdo con lo anterior, dichas Ig-FET pueden utilizarse para inhibir la actividad de los antígenos, p. ej., en un cultivo celular que contiene los antígenos, en sujetos humanos o en otros sujetos mamíferos que presentan los antígenos con los que reacciona de manera cruzada una proteína de unión de la invención. En la presente memoria se describe, además, un método para reducir la actividad de antígeno en un sujeto que sufre de una enfermedad o trastorno en el que la actividad del antígeno es perjudicial. Una proteína de unión de la invención puede administrarse en un sujeto humano con fines terapéuticos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "un trastorno en el que la actividad de antígeno resulta perjudicial" pretende incluir enfermedades y otros trastornos en los que la presencia del antígeno en un sujeto que sufre del trastorno se ha mostrado o se sospecha que es responsable de la fisiopatología del trastorno, o un factor que contribuye al agravamiento del trastorno. De acuerdo con lo anterior, un trastorno en el que la actividad de antígeno resulta perjudicial es un trastorno en el que la reducción de la actividad de antígeno se espera que alivie los síntomas y/o la progresión del trastorno. Dichos trastornos pueden ponerse en evidencia, por ejemplo, por un incremento de la concentración del antígeno en un líquido biológico de un sujeto que sufre del trastorno (p. ej., un incremento de la concentración del antígeno en el suero, plasma, líquido sinovial, etc. del sujeto). Entre los ejemplos no limitativos de trastornos que pueden tratarse con las proteínas de unión de la invención se incluyen aquellos trastornos comentados posteriormente y en la sección referente a composiciones farmacéuticas de los anticuerpos de la invención.
Las Ig-FET de la invención pueden unirse a un antígeno o a múltiples antígenos. Entre dichos antígenos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, las dianas indicadas en las bases de datos siguientes. Entre dichas bases de datos de dianas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, las listas siguientes:
• Dianas terapéuticas (http://xin.cz3.nus.edu.sg/group/cjttd/ttd.asp);
• Citoquinas y receptores de citoquinas (http://www.cytokinewebfacts.com/, http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi, y
• http://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/cgf/CGF_Database/cytokine.medic.kumamotou. ac.jp/CFC/indexR.html); Quimioquinas (http: //cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/CK/Chemokine.html);
Receptores de quimioquinas y GPCR (http://csp.medic.kumamotou.ac.jp/CSP/Receptor.html, http://www.gpcr.org/7tm/);
Receptores olfactivos (http://senselab.med.yale.edu/senselab/ORDB/default.asp);
Receptores (http://www.iuphar-db.org/iuphar-rd/list/index.htm);
Dianas de cáncer (http://cged.hgc.jp/cgi-bin/input.cgi);
Proteínas secretadas como potenciales dianas de anticuerpos (http://spd.cbi.pku.edu.cn/);
Proteína quinasas (http://spd.cbi.pku.edu.cn/), y
marcadores CD humanos (http://content.labvelocity.com/tools/6/1226/CD_table_final_locked.pdf) and (Zola H, 2005 CD molecules 2005: human cell differentiation molecules Blood, 106:3123-6).
Las Ig-FET resultan útiles como agentes terapéuticos para bloquear simultáneamente dos dianas diferentes a fin de potenciar la eficacia/seguridad y/o incrementar la cobertura del paciente. Entre dichas dianas pueden incluirse dianas solubles (IL-13 y TNF) y dianas receptoras de superficie celular (VEGFR y EGFR). También puede utilizarse para inducir citotoxicidad redirigida entre células tumorales y células T (Her2 y CD3) para la terapia del cáncer, o entre células autorreactivas y células efectoras para autoinmunidad/trasplante, o entre cualquier célula diana y célula efectora para eliminar las células causantes de enfermedad en cualquier enfermedad dada.
Además, las Ig-FET pueden utilizarse para inducir agregación y activación de receptores en el caso de que se diseñe que haya dos dianas de epítopos diferentes en el mismo receptor. Lo anterior puede resultar beneficioso para producir terapéuticos anti-GPCR agonistas y antagonistas. En este caso, las Ig-FET pueden utilizarse para reconocer dos epítopos diferentes en una célula para la agregación/señalización (dos moléculas de superficie celular) o la señalización (en una molécula). De manera similar, una molécula de Ig-FET puede diseñarse para inducir la ligación de CTLA-4 y una señal negativa mediante el reconocimiento de dos epítopos diferentes (o 2 copias del mismo epítopo) del dominio extracelular de CTLA-4, conduciendo a la regulación negativa de la respuesta inmunitaria. CTLA-4 es una diana clínicamente validada para el tratamiento terapéutico de varios trastornos inmunitarios. Las interacciones CTLA-4/B7 regulan negativamente la activación de las células T mediante atenuación de la progresión del ciclo celular, la producción de IL-2 y la proliferación de células T tras la activación, y el acoplamiento de CTLA-4 (CD152) puede regular negativamente la activación de las células T y fomentar la inducción de tolerancia inmunitaria. Sin embargo, la estrategia de atenuar la activación de las células T mediante acoplamiento de anticuerpos agonistas de CTLA-4 no ha tenido éxito, ya que la activación de CTLA-4 requiere la ligación. La interacción molecular de CTLA-4/B7 se produce en matrices de "cremallera asimétrica", tal como muestra el análisis estructural de cristales (Stamper 2001 Nature410:608). Sin embargo, ninguno de los reactivos de unión a CTLA-4 actualmente disponibles presenta propiedades de ligación, incluyendo los anticuerpos monoclonales anti-CTLA-4. Se han realizado varios intentos para abordar este problema. En un caso, se ha generado un anticuerpo de cadena sencilla unido a un miembro celular, y ha inhibido significativamente el rechazo alogénico en ratones (Hwang 2002 JI 169:633). En otro caso diferente, se ha generado un anticuerpo de cadena sencilla unido a la superficie de APC artificial y ha demostrado que atenúa las respuestas de células T (Griffin 2000 JI 164:4433). En ambos casos, se ha conseguido la ligación de CTLA-4 con anticuerpo unidos a un miembro estrechamente localizados en sistemas artificiales. Aunque dichos experimentos proporcionan la prueba de concepto de la regulación inmunitaria negativa mediante la inducción de señalización negativa de CTLA-4, los reactivos utilizados en estas publicaciones no resultan adecuados para el uso terapéutico. Con este fin, puede conseguirse la ligación de CTLA-4 mediante la utilización de una molécula de Ig-FET, con diana en dos epítopos diferentes (o 2 copias del mismo epítopo) de dominio extracelular de CTLA-4. La justificación es que la distancia entre dos sitios de unión de una IgG, aproximadamente 150-170 A, es excesivamente grande para la activación activa de CTLA-4 (30 a 50 A entre 2 homodímeros de CTLA-4). Sin embargo, la distancia entre dos sitios de unión sobre Ig-FET (un brazo) es mucho menor, también en el intervalo de 30-50 A, permitiendo una ligación correcta de CTLA-4.
De manera similar, Ig-FET puede presentar como diana dos miembros diferentes de un complejo de receptores de superficie celular (p. ej., IL-12R alfa y beta). Además, Ig-FET puede presentar como diana CR1 y una proteína soluble/patógeno para impulsar una eliminación rápida de la proteína soluble/patógeno-diana.
Además, las Ig-FET de la invención pueden utilizarse para el transporte específico de tejido (reconocimiento de un marcador de tejido y un mediador de enfermedad para una FC local mejorada, proporcionando de esta manera una eficacia más alta y/o una toxicidad más baja), incluyendo la administración intracelular (con diana en un receptor internalizante y una molécula intracelular), con transporte al interior del cerebro (con diana en un receptor de transferrina y un mediador de enfermedad del SNC para cruzar la barrera hematoencefálica). Ig-FET también puede servir de proteína portadora para transportar un antígeno a una localización específica mediante la unión a un epítopo no neutralizante de ese antígeno y también para incrementar la semivida del antígeno. Además, puede diseñarse la Ig-FET para unirla físicamente a dispositivos médicos implantados en pacientes o para que reconozca estos dispositivos médicos (Burke, Sandra E.; Kuntz, Richard E.; Schwartz, Lewis B. Zotarolimus (ABT-578) eluting stents. Advanced Drug Delivery Reviews (2006), 58(3), 437-446; Surface coatings for biological activation and functionalization of medical devices. Hildebrand, H. F.; Blanchemain, N.; Mayer, G.; Chai, F.; Lefebvre, M.; Boschin, F. Surface and Coatings Technology (2006), 200(22-23), 6318-6324. ; Drug/ device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis. Wu, Peng; Grainger, David W. Biomaterials (2006), 27(11), 2450-2467. ; Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices. Marques, A. P.; Hunt, J. A.; Reis, Rui L. Biodegradable Systems in Tissue Engineering and Regenerative Medicine (2005), 377-397; página 52; Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices. Marques, A. P.; Hunt, J. A.; Reis, Rui L. Biodegradable Systems in Tissue Engineering and Regenerative Medicine (2005), 377-397). En resumen, la dirección de tipos apropiados de células al sitio del implante médico puede fomentar la cicatrización y restauración del funcionamiento normal del tejido. Alternativamente, también se proporciona la inhibición de mediadores (incluyendo, aunque sin limitación, las citoquinas), liberados al implantarse el dispositivo por una Ig-FET acoplada con un dispositivo o con diana en un dispositivo. Por ejemplo, se han utilizado endoprótesis durante años en cardiología de intervención para desbloquear arterias y para mejorar el flujo de la sangre del músculo cardíaco. Sin embargo, es conocido que las endoprótesis de metal no recubierto tradicionales causan restenosis (reestrechamiento de la arteria en una zona tratada) en algunos pacientes y que pueden contribuir a la formación de coágulos sanguíneos. Recientemente, se ha descrito una endoprótesis recubierta con anticuerpo anti-CD34 que reduce la restenosis y evita la formación de coágulos sanguíneos mediante la captura de células progenitoras endoteliales (CPE) circulantes en la sangre. Las células endoteliales son células que revisten los vasos sanguíneos, permitiendo que la sangre fluya sin obstáculos. Las CPE se adhieren a la superficie dura de la endoprótesis formando una capa lisa que no sólo estimula la cicatrización, sino que evita la restenosis y la formación de coágulos sanguíneos; complicaciones anteriormente asociadas a la utilización de endoprótesis (Aoji et al. 2005 J. Am. Coll. Cardiol. 45(10):1574-9). Además de mejorar los resultados clínicos para los pacientes que requieren endoprótesis, también hay consecuencias para los pacientes que requieren cirugía de derivación cardiovascular. Por ejemplo, un conducto vascular prostético (arteria artificial) recubierta con anticuerpos anti-CPE eliminaría la necesidad de utilizar arterias procedentes de las piernas o brazos del paciente para realizar injertos quirúrgicos de derivación. Ello reduciría los tiempos quirúrgicos y de anestesia, lo que a su vez reduciría las muertes durante la cirugía coronaria. Las Ig-FET están diseñadas de manera que se unen a un marcador de superficie celular (tal como CD34), así como a una proteína (o a un epítopo de cualquier tipo, incluyendo, aunque sin limitación, lípidos y polisacáridos) que se utilizan para recubrir el dispositivo implantado a fin de facilitar el reclutamiento celular. Dichos enfoques también pueden aplicarse a otros implantes médicos en general. Alternativamente, las Ig-FET pueden utilizarse para recubrir dispositivos médicos, y tras liberar todos los FET a partir del dispositivo (o cualquier otra necesidad que pueda requerir Ig-FET nuevos adicionales, incluyendo el envejecimiento y la desnaturalización de las Ig-FET ya cargadas), el dispositivo podría recargarse mediante la administración sistémica de Ig-FET nuevas en el paciente, en el que la Ig-FET está diseñada para unirse a una diana de interés (una citoquina, un marcador de superficie celular (tal como CD34), etc.) con un grupo de sitios de unión y a una diana de recubrimiento del dispositivo (incluyendo una proteína, un epítopo de cualquier tipo, incluyendo, aunque sin limitación, lípidos, polisacáridos y polímeros) con el otro grupo. Esta tecnología posee la ventaja de ampliar la utilidad de los implantes recubiertos.
Las moléculas de Ig-FET de la invención resultan útiles además como moléculas terapéuticas para tratar diversas enfermedades. Dichas moléculas de Ig-FET pueden unirse a una o más dianas implicadas en una enfermedad específica. Se indican a continuación ejemplos de dichas dianas en diversas enfermedades.
Se han implicado muchas proteínas en las respuestas generales autoinmunitarias e inflamatorias, incluyendo C5, CCL1 (1-309), CCL11 (eotaxina), CCL13 (mcp-4), CCL15 (MIP-1d), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19, CCL2 (mcp-1), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (MIP-2), CCL23 (MPIF-1), CCL24 (MPIF-2 / eotaxina-2), CCL25 (TECK), CCL26, CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP-1b), CCL5 (RANTES), CCL7 (mcp-3), CCL8 (mcp-2), CXCL1, CXCL10 (IP-10), CXCL11 (I-TAC / IP-9), CXCL12 (SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL2, CXCL3, CXCL5 (ENA-78 / LIX), CXCL6 (GCP-2), CXCL9, IL13, IL8, CCL13 (mcp-4), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CR1, IL8RA, XCR1 (CCXCR1), IFNA2, IL10, IL13, IL17C, ILIA, IL1B, IL1F10, IL1F5, IL1F6, IL1F7, IL1F8, IL1F9, IL22, IL5, IL8, IL9, LTA, LTB, MIF, SCYE1 (citoquina activadora de monocitos endoteliales), SPP1, TNF, TNFSF5, IFNA2, IL10RA, IL10RB, IL13, IL13RA1, IL5RA, IL9, IL9R, ABCF1, BCL6, C3, C4A, CEBPB, CRP, ICEBERG, IL1R1, IL1RN, IL8RB, LTB4R, TOLLIP, FADD, IRAK1, IRAK2, MYD88, NCK2, TNFAIP3, TRADD, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5, TRAF6, ACVR1, ACVR1B, ACVR2, ACVR2B, ACVRL1, CD28, CD3E, CD3G, CD3Z, CD69, CD80, CD86, CNR1, CTLA-4, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, FCGR3A, GPR44, HAVCR2, OPRD1, P2RX7, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, BLR1, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CL1, CX3CR1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCR4, GPR2, SCYE1, SDF2, XCL1, XCL2, XCR1, AMH, AMHR2, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, C19orf10 (IL27w), CER1, CSF1, CSF2, CSF3, DKFZp451J0118, FGF2, GFI1, IFNA1, IFNB1, IFNG, IGF1, ILIA, IL1B, IL1R1, IL1R2, IL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL4, IL4R, IL5, IL5RA, IL6, IL6R, IL6ST, IL7, IL8, IL8RA, IL8RB, IL9, IL9R, IL10, IL10RA, IL10RB, IL11, IL11RA, IL12A, IL12B, IL12RB1, IL12RB2, IL13, IL13RA1, IL13RA2, IL15, IL15RA, IL16, IL17, IL17R, IL18, IL18R1, IL19, IL20, KITLG, LEP, LTA, LTB, LTB4R, LTB4R2, LTBR, MIF, NPPB, PDGFB, TBX21, TDGF1, TGFA, TGFB1, TGFB1I1, TGFB2, TGFB3, TGFBI, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TH1L, TNF, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF11A, TNFRSF21, TNFSF4, TNFSF5, TNFSF6, TNFSF11, VEGF, ZFPM2 y RNF110 (ZNF144). También se encuentran contempladas las Ig-FET capaces de unirse a una o más de las dianas indicadas anteriormente.
El asma alérgico se caracteriza por la presencia de eosinofilia, metaplasia de células caliciformes, alteraciones de las células epiteliales, hiperreactividad de las vías respiratorias (HVA), y expresión de citoquinas Th1 y Th2, así como niveles séricos elevados de IgE. Actualmente está ampliamente aceptado que la inflamación de las vías respiratorias es el factor clave subyacente a la patogénesis del asma, que implica una compleja interacción de células inflamatorias, tales como células T, células B, eosinófilos, mastocitos y macrófagos, y de sus mediadores secretados, incluyendo citoquinas y quimioquinas. Los corticoesteroides son el tratamiento antiinflamatorio más importante para el asma actualmente; sin embargo, su mecanismo de acción es no específico y existen consideraciones de seguridad, especialmente para la población de pacientes jóvenes. Por lo tanto, está justificado el desarrollo de terapias más específicas y dirigidas. Hay evidencia creciente de que IL-13 en ratones imita muchas de las características del asma, incluyendo la HVA, la hipersecreción de moco y la fibrosis de las vías respiratorias, con independencia de la inflamación eosinofílica (Finotto et al., International Immunology (2005), 17(8), 993-1007; Padilla et al., Journal of Immunology (2005), 174(12), 8097-8105).
Se ha implicado IL-13 como factor clave en la producción de respuestas patológicas asociadas al asma. El desarrollo de terapia de anticuerpos monoclonales anti-IL-13 para reducir los efectos de IL-13 en los pulmones es un nuevo y excitante enfoque que ofrece una promesa considerable de convertirse en un nuevo tratamiento para el asma. Sin embargo, también participan otros mediadores de diferentes rutas inmunitarias en la patogénesis del asma, y el bloqueo de estos mediadores, además de IL-13, podría ofrecer un beneficio terapéutico adicional. Entre dichas parejas de dianas se incluyen, aunque sin limitación, IL-13 y una citoquina proinflamatoria, tal como el factor a de necrosis tumoral (TNF-a). TNF-a podría amplificar la respuesta inflamatoria en el asma y podría estar relacionado con la gravedad de la enfermedad (McDonnell, et al., Progress in Respiratory Research (2001), 31(New Drugs for Asthma, Allergy and COPD), 247-250). Lo anterior sugiere que el bloqueo de tanto IL-13 como TNF-a podría presentar efectos beneficiosos, particularmente en la enfermedad de las vías respiratorias grave. En una realización preferente, la Ig-FET de la invención se une a las dianas IL-13 y TNFa y se utiliza para el tratamiento del asma.
Se conocen de la técnica modelos animales, tales como el modelo de ratón de asma inducida por OVA, en el que puede evaluarse tanto la inflamación como la HVA, y pueden utilizarse para determinar la capacidad de diversas moléculas de Ig-FET para el tratamiento del asma. Se dan a conocer modelos animales de estudio del asma en Coffman, et al., Journal of Experimental Medicine (2005), 201(12), 1875-1879; Lloyd, et al., Advances in Immunology (2001), 77, 263-295; Boyce et al., Journal of Experimental Medicine (2005), 201(12), 1869-1873 y Snibson, et al., Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology (2005), 35(2), 146-52. Además de evaluaciones rutinarias de seguridad de estas parejas de dianas, podrían estar justificados pruebas específicas para el grado de inmunosupresión y podrían resultar útiles para seleccionar las mejoras parejas de dianas (ver Luster et al., Toxicology (1994), 92(1-3), 229-43; Descotes, et al., Developments in biological standardization (1992), 77 99­ 102; Hart et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology (2001), 108(2), 250-257).
Basándose en la justificación explicada anteriormente, y utilizando el mismo modelo de evaluación para eficacia y seguridad, pueden identificarse otras parejas de dianas a las que pueden unirse las moléculas de Ig-FET y resultar útiles en el tratamiento del asma. Preferentemente, entre dichas dianas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, IL-13 e IL-1beta, ya que IL-1beta también participa en la respuesta inflamatoria en el asma; IL-13 y citoquinas y quimioquinas que participan en la inflamación, tales como IL-13 e IL-9; IL-13 e IL-4; IL-13 e IL-5; IL-13 e IL-25; IL-13 y TARC; IL-13 y MDC; IL-13 y MIF; IL-13 y TGF-p; IL-13 y agonista de LHR; IL-13 y CL25; IL-13 y SPRR2a; IL-13 y SPRR2b; e IL-13 y ADAM8. La presente invención contempla además Ig-FET capaces de unirse a una o más dianas implicadas en el asma, seleccionadas del grupo que consiste en CSF1 (MCSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), FGF2, IFNA1, IFNB1, IFNG, histaminas y receptores de histamina, ILIA, IL1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL19, KITLG, PDGFB, IL2RA, IL4R, IL5RA, IL8RA, IL8RB, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL18R1, TSLP, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL13, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL22, CCL24,CX3CL1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, XCL1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CX3CR1, GPR2, XCR1, FOS, GATA3, JAK1, JAK3, STAT6, TBX21, TGFB1, TNFSF6, YY1, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, LTB4R, TB4R2, LTBR, y quitinasa.
La artritis reumatoide (AR), una enfermedad sistémica, se caracteriza por una reacción inflamatoria crónica en el sinovio de la articulación y se asocia a la degeneración del cartílago y la erosión del hueso yuxtaarticular. Muchas citoquinas proinflamatorias, incluyendo TNF, quimioquinas y factores de crecimiento, se expresan en las articulaciones enfermas. Se ha demostrado que la administración sistémica de anticuerpo anti-TNF o una proteína de fusión de sTNFR en modelos de ratón de AR resulta antiinflamatoria y protectora de la articulación. En investigaciones clínicas en las que se ha bloqueado la actividad de TNF en pacientes de ARN con infliximab administrado por vía intravenosa (Harriman G, Harper LK, Schaible TF. 1999 Summary of clinical trials in rheumatoid arthritis using infliximab, an anti-TNFalpha treatment. Ann. Rheum. Dis. 58 supl. 1:I61-4), un anticuerpo monoclonal (mAb) anti-TNF quimérico ha proporcionado pruebas de que TNF regula la producción de IL-6, IL-8, MCP-1 y VEGF, el reclutamiento de células inmunitarias e inflamatorias en las articulaciones, la angiogénesis y la reducción de los niveles sanguíneos de las metaloproteinasas de matriz 1 y 3. Una mejor comprensión de la ruta inflamatoria en la artritis reumatoide ha conducido a la identificación de otras dianas terapéuticas implicadas en la misma. Ya se han sometido a ensayo tratamientos prometedores, tales como los antagonistas de interleuquina-6 (MRA), CTLA4Ig (abatacept, Genovese Mc et al. 2005 Abatacept for rheumatoid arthritis refractory to tumor necrosis factor alpha inhibition. N. Engl. J. Med. 353:1114-23) y la terapia anticélulas B (rituximab, Okamoto H, Kamatani N. 2004 Rituximab for rheumatoid arthritis. N. Engl. J. Med.
351:1909) en ensayos controlados y aleatorizados durante el último año. Se han identificado otras citoquinas y se ha demostrado que resultan beneficiosas en modelos animales, incluyendo la interleuquina-15, la interleuquina-17 y la interleuquina-18, y actualmente se están realizando ensayos clínicos de dichos agentes. La terapia de anticuerpos de doble especificidad, que combina anti-TNF y otro mediador, tiene un gran potencial de mejorar la eficacia clínica y/o la cobertura del paciente. Por ejemplo, el bloqueo de tanto TNF como VEGF potencialmente puede erradicar la inflamación y la angiogénesis, ambas implicadas en la fisiopatología de la AR. El bloqueo de otras parejas de dianas implicadas en la AR, incluyendo, aunque sin limitación, TNF e IL-18; TNF e IL-12; TNF e IL-23; TNF e IL-1beta; TNF y MIF; TNF e IL-17; y TNF e IL-15 con Ig-FET específicas también se encuentra contemplado. Además de evaluaciones rutinarias de seguridad de estas parejas de dianas, podrían estar justificados pruebas específicas para el grado de inmunosupresión y podrían resultar útiles para seleccionar las mejoras parejas de dianas (ver Luster et al., Toxicology (1994), 92(1-3), 229-43; Descotes, et al., Developments in biological standardizaron (1992), 77 99-102; Hart et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology (2001), 108(2), 250-257). Puede evaluarse si una molécula de Ig-FET resultará útil para el tratamiento de la artritis reumatoide mediante la utilización de modelos de AR animales preclínicos, tales como el modelo de ratón de artritis inducida con colágeno. También son bien conocidos de la técnica otros modelos útiles (ver Brand DD., Comp. Med. (2005) 55(2):114-22).
La característica diagnóstica inmunopatogénica del lupus eritematoso sistémico (LES) es la activación de las células B policlonales, que conduce a hiperglobulinemia, producción de autoanticuerpos y formación de complejos inmunitarios. La anormalidad fundamental aparentemente es el fracaso de las células T en la supresión de los clones de células B prohibidos debido a una desregulación generalizada de las células T. Además, la interacción de las células B y T se ve facilitada por varias citoquinas, tales como IL-10, así como moléculas coestimuladoras, tales como CD40 y CD40L, B7 y CD28 y CTLA-4, que inician la segunda señal. Dichas interacciones junto con una eliminación fagocítica alterada de los complejos inmunitarios y el material apoptótico, perpetúan la respuesta inmunitaria, con el consiguiente daño a tejidos. Las dianas siguientes podrían participar en el LES y utilizarse potencialmente para el enfoque de Ig-FET de intervención terapéutica. Terapias dirigidas a células B: CD-20, CD-22, CD-19, CD28, CD4, CD80, HLA-DRA, IL10, IL2, IL4, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFSF5, TNFSF6, BLR1, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, ICOSL, IGBP1, MS4A1, RGS1, SLA2, CD81, IFNB1, IL10, TNFRSF5, TNFRSF7, TNFSF5, AICDA, BLNK, GALNAC4S-6ST, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, IL10, IL11, IL4, INHA, INHBA, KLF6, TNFRSF7, CD28, CD38, CD69, CD80, CD83, CD86, DPP4, FCER2, IL2RA, TNFRSF8, TNFSF7, CD24, CD37, CD40, CD72, CD74, CD79A, CD79B, CR2, IL1R2, ITGA2, ITGA3, MS4A1, ST6GAL1, CD1C, CHST10, HLA-A, HLA-DRA y NT5E.; señales coestimuladoras: CTLA-4 o B7.1/B7.2; inhibición de la supervivencia de células B: BlyS y BAFF; Inactivación del complemento: C5; Modulación de citoquinas: el principio clave es que la respuesta biológica neta en cualquier tejido es el resultado de un equilibrio entre los niveles locales de citoquinas proinflamatorias o antiinflamatorias (ver Sfikakis PP et al. 2005 Curr. Opin. Rheumatol. 17:550-7). Se considera que el LES es una enfermedad controlada por Th-2, con elevaciones documentadas en IL-4, IL-6 e IL-10 en suero. También se encuentran contempladas las Ig-FET son capaces de unirse a una o más dianas seleccionadas del grupo que consiste en IL-4, IL-6, IL-10, IFN-a y TNF-a. La combinación de dianas comentadas anteriormente potenciará la eficacia terapéutica para el LES, que puede someterse a ensayo en varios modelos preclínicos de lupus (ver Peng SL (2004) Methods Mol. Med.;102:227-72).
La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad de tipo autoinmunitario humana compleja con una etiología mayoritariamente desconocida. La destrucción inmunitaria de la proteína básica de la mielina (p Bm ) en todo el sistema nervioso es la patología principal de la esclerosis múltiple. La Em es una enfermedad de patologías complejas, que implica la infiltración de células T CD4+ y CD8+ y de respuesta dentro del sistema nervioso central. La expresión en el SNC de citoquinas, especies de nitrógeno reactivas y moléculas coestimuladoras ha sido descrita en la EM. Son importantes los mecanismos inmunitarios que contribuyen al desarrollo de la autoinmunidad. En particular, la expresión de antígenos, las interacciones de citoquinas y leucocitos, y las células T reguladoras, que ayudan a equilibrar/modular otras células T, tales como las células Th1 y Th2, son áreas importantes para la identificación de dianas terapéuticas.
IL-12 es una citoquina proinflamatoria que es producida por las células presentadoras de antígenos (APC) y estimula la diferenciación de las células efectoras Th1. Se produce IL-12 en las lesiones en desarrollo de los pacientes con EM, además de en animales afectados de EAE. Se ha mostrado anteriormente que la interferencia en las rutas de IL-12 evita eficazmente EAE en roedores, y que la neutralización in vivo de IL-12p40 utilizando un mAb anti-IL-12 presenta efectos beneficiosos en el modelo de EAE inducido por mielina en el tití común.
TWEAK es un miembro de la familia de TNF que se expresa constitutivamente en el sistema nervioso central (SNC), con efectos proinflamatorios, proliferativos o apoptóticos según los tipos celulares. Su receptor, Fn14, se expresa en el SNC en células endoteliales, astrocitos reactivos y neuronas. La expresión de ARNm de TWEAK y Fn14 se incrementó en la médula espinal durante encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). El tratamiento con anticuerpos anti-TWEAK en EAE inducida con glucoproteína de la mielina de oligodendrocitos (GMO) en ratones C57BL/6 resultó en una reducción de la gravedad de la enfermedad y de la infiltración de leucocitos al tratar los ratones después de la etapa de exposición.
Un aspecto de la invención se refiere a moléculas de Ig-FET capaces de unirse a una o más, preferentemente dos, dianas seleccionadas del grupo que consiste en IL-12, TWEAK, IL-23, CXCL13, CD40, CD40L, IL-18, VEGF, VLA-4, TNF, CD45RB, CD200, IFN-gamma, GM-CSF, FGF, C5, CD52 y CCR2. Una realización preferente incluye una Ig Ig-FET de doble especificidad anti-IL-12/TWEAK como agente terapéutico beneficioso para el tratamiento de la EM. Se conocen de la técnica varios modelos animales para evaluar la utilidad de las moléculas de Ig-FET en el tratamiento de la EM (ver Steinman L, et al., (2005) Trends Immunol. 26(11):565-71; Lublin FD., et al., (1985) Springer Semin Immunopathol.8(3):197-208; Genain CP, et al., (1997) J. Mol. Med. 75(3):187-97; Tuohy VK, et al., (1999) J. Exp. Med.
189(7):1033-42; Owens T, et al., (1995) Neurol Clin. 13(1):51-73; and 't Hart BA, et al., (2005) J. Immunol. 175(7):47618. Además de las evaluaciones de seguridad rutinarias de dichas parejas de dianas, podrían estar justificadas pruebas específicas para el grado de inmunosupresión y podrían resultar útiles para seleccionar los mejores pares de dianas (ver Luster et al., Toxicology (1994), 92(1-3), 229-43; Descotes, et al., Developments in biological standardization (1992), 7799-102; Jones R. 2000 Rovelizumab (ICOS Corp). IDrugs.3(4):442-6).
La fisiopatología de la sepsis es iniciada por los componentes de la membrana externa de organismos tanto Gramnegativos (lipopolisacárido [LPS], lípido A y endotoxina) como organismos Gram-positivos (ácido lipoteicoico y peptidoglicano). Dichos componentes de la membrana externa son capaces de unirse al receptor de c D14 sobre la superficie de los monocitos. En virtud de los receptores de tipo Toll anteriormente descritos, a continuación, se transmite una señal a la célula, conduciendo a la producción final de las citoquinas proinflamatorias factor alfa de necrosis tumoral (TNF-alfa) e interleuquina-1 (IL-1). Las respuestas inflamatorias e inmunitarias insuperables son características esenciales del choque séptico y desempeñan un papel clave en la patogénesis del daño en los tejidos, el fallo orgánico múltiple y la muerte inducida por sepsis. Las citoquinas, especialmente el factor de necrosis tumoral (TNF) y la interleuquina (IL)-1, se ha demostrado que son mediadores cruciales del choque séptico. Dichas citoquinas presentan un efecto tóxico directo sobre los tejidos; también activan la fosfolipasa A2. Dichos efectos y otros conducen a concentraciones incrementadas de factor activador de las plaquetas, la estimulación de la actividad de la óxidonítrico sintasa, la estimulación de la infiltración en los tejidos de neutrófilos y la estimulación de la actividad de los neutrófilos.
El tratamiento de la sepsis y el choque séptico sigue siendo un problema clínico sin resolver, y algunos ensayos prospectivos recientes con modificadores de la respuesta biológica (es decir, anti-TNF o anti-MFI) dirigidos a la respuesta inflamatoria solo han mostrado un beneficio clínico pequeño. Recientemente el interés se ha desplazado hacia terapias destinadas a revertir los periodos acompañantes de supresión inmunitaria. Estudios en animales experimentales y pacientes críticamente enfermos han demostrado que la apoptosis incrementada de los órganos linfoides y de algunos tejidos parenquimáticos contribuye a dicha supresión inmunitaria, anergia y disfunción de sistemas de órganos. Durante los síndromes sépticos, puede desencadenarse la apoptosis de linfocitos por la ausencia de IL-2 o por la liberación de glucocorticoides, granzimas o las denominadas citoquinas 'de muerte': factor alfa de necrosis tumoral o ligando Fas. La apoptosis transcurre mediante autoactivación de caspasasa citosólicas y/o mitocondriales, que pueden verse influidas por miembros proapoptóticos y antiapoptóticos de la familia de Bcl-2. En animales experimentales, el tratamiento con inhibidores de la apoptosis no solo puede evitar la apoptosis de células linfoides, sino que también puede mejorar el resultado clínico. Aunque siguen estando lejos los ensayos clínicos con agentes antiapoptóticos, debido en gran parte a las dificultades técnicas asociadas a su administración y dirección a los tejidos, la inhibición de la apoptosis de los linfocitos representa una diana terapéutica atractiva para el paciente séptico. De manera similar, un agente de especificidad doble, tanto mediador inflamatoria como mediador apoptótico, podría poseer un beneficio añadido. Un aspecto de la invención se refiere a las Ig Ig-FET capaces de unirse a una o más dianas implicadas en la sepsis, preferentemente dos dianas, seleccionadas del grupo que consiste en TNF, IL-1, MIF, IL-6, IL-8, IL-18, IL-12, IL-23, FasL, LPS, receptores de tipo Toll, TLR-4, factor tisular, MIP-2, ADORA2A, CASP1, CASP4, IL10, IL1B, NFKB1, PROC, TNFRSF1A, CSF3, IL10, IL1B, IL6, ADORA2A, CCR3, IL10, IL1B, IL1RN, MIF, NFKB1, PTAFR, TLR2, TLR4, GPR44, HMOX1, midkina, IRAK1, NFKB2, SERPINA1, SERPINE1 y TREM1. La eficacia de dichas Ig Ig-FET para la sepsis puede evaluarse en modelos animales preclínicos conocidos de la técnica (ver Buras JA, et al. (2005) Nat. Rev. Drug Discov. 4(10):854-65 y Calandra T, et al., (2000) Nat Med. 6(2):164-70).
Las enfermedades neurodegenerativas crónicas habitualmente son enfermedades dependientes de la edad caracterizadas por la pérdida progresiva de funciones neuronales (muerte de las células neuronales y desmielinización), pérdida de movilidad y pérdida de memoria. El conocimiento emergente del mecanismo subyacente a las enfermedades neurodegenerativas crónicas (p. ej., la enfermedad de Alzheimer) muestra una etiología compleja y una diversidad de factores que se ha reconocido contribuyen a su desarrollo y progresión, p. ej., la edad, el estado glucémico, la producción y multimerización de amiloide, la acumulación de productos finales de glicación avanzada (AGE) que se unen a su receptor RAGE (receptor de AGE), el estrés oxidativo cerebral incrementado, el flujo sanguíneo cerebral reducido, la neuroinflamación, incluyendo la liberación de citoquinas y quimioquinas inflamatorias, la disfunción neuronal y la activación microglial. De esta manera, dichas enfermedades neurodegenerativas crónicas representan una interacción compleja entre múltiples tipos celulares y mediadores. Las estrategias de tratamiento para dichas enfermedades son limitadas y la mayoría constituyen procesos inflamatorios de bloqueo con agentes antiinflamatorios no específicos (p. ej., corticoesteroides e inhibidores de COX) o agentes que evitan la pérdida neuronal y/o las funciones sinápticas. Dichos tratamientos no consiguen detener la progresión de la enfermedad. Algunos estudios recientes sugieren que terapias más dirigidas, tales como los anticuerpos del péptido A-p soluble (incluyendo las formas oligoméricas A-b) no solo pueden ayudar a detener la progresión de la enfermedad, sino que también pueden ayudar a mantener la memoria. Dichas observaciones preliminares sugieren que las terapias específicas con diana en más de un mediador de enfermedad (p. ej., A-p y una citoquina proinflamatoria, tal como TNF) pueden proporcionar una eficacia terapéutica todavía mejor para las enfermedades neurodegenerativas crónicas que la observada al utilizar como diana un solo mecanismo de enfermedad (p. ej., A-p soluble solo) (ver C.E. Shepherd, et al., Neurobiol. Aging. 24 de oct., 2005; Nelson RB., Curr Pharm Des. 2005;11:3335; William L. Klein.; Neurochem Int. 2002 ;41:345; Michelle C Janelsins, et al., J Neuroinflammation. 2005;2:23; Soloman B., Curr Alzheimer Res.
2004;1:149; Igor Klyubin, et al., Nat Med. 2005;11:556-61; Arancio O, et al., EMBO Journal (2004) 1-10; Bornemann KD, et al., Am J Pathol. 2001;158:63; Deane R, et al., Nat Med. 2003;9:907-13 y Eliezer Masliah, et al., Neuron.
2005;46:857).
Las moléculas de Ig-FET de la invención pueden unirse a una o más dianas implicadas en enfermedades neurodegenerativas crónicas tales como la enfermedad de Alzheimer. Entre dichas dianas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, cualquier mediador, soluble o de superficie celular, implicado en la patogénesis de la EA, p. ej., AGE (S100 A y anfoterina), citoquinas proinflamatorias (p. ej., IL-1), quimioquinas (p. ej., MCP-1), moléculas que inhiben la regeneración nerviosa (p. ej., Novo y RGM A), o moléculas que potencian el crecimiento de las neuritas (neurotrofinas). La eficacia de las moléculas de Ig-FET puede validarse en modelos animales preclínicos, tales como los ratones transgénicos que sobreexpresan la proteína precursora del amiloide o RAGE y desarrollan síntomas similares a los de la enfermedad de Alzheimer. Además, las moléculas de Ig-FET pueden construirse y someterse a ensayo para la eficacia en los modelos animales y puede seleccionarse la Ig-FET terapéutica mejor para el ensayo en pacientes humanos. Las moléculas de Ig-FET también pueden utilizarse para el tratamiento de otras enfermedades neurodegenerativas, tales como la enfermedad de Parkinson. La alfa-sinucleína está implicada en la patología del Parkinson. Una Ig-FET capaz de reconocer la alfa-sinucleína y mediadores inflamatorios tales como TNF, IL-1 y MCP-1 puede demostrar ser una terapia eficaz para la enfermedad de Parkinson y se encuentran contemplados en la invención.
A pesar de que ha crecido el conocimiento sobre los mecanismos patológicos, la lesión de la médula espinal (LME) sigue siendo una condición devastadora y representa una indicación médica caracterizada por una elevada necesidad médica. La mayoría de lesiones de la médula espinal son lesiones por contusión o compresión y a la lesión primaria habitualmente siguen mecanismos de lesión secundarios (mediadores inflamatorios, p. ej., citoquinas y quimioquinas) que agravan la lesión inicial y resultan en un agrandamiento significativo de la zona de lesión, en ocasiones en más de 10 veces. Dichos mecanismos primarios y secundarios en la LME son muy similares a los que actúan en la lesión cerebral causada por otros medios, p. ej., el ictus. No existe ningún tratamiento satisfactorio y la inyección de un bolo de dosis elevada de metilprednisolona (MP) es la única terapia utilizada dentro de la ventana temporal estrecha de 8 h después de la lesión. Sin embargo, dicho tratamiento solo está destinado a evitar daños secundarios, sin causar ninguna recuperación funcional significativa. Se ha criticado fuertemente la falta de una eficacia inequívoca y la presencia de efectos secundarios graves, tales como la inmunosupresión con infecciones secundarias y graves alteraciones musculares histopatológicas. No existen otros fármacos, productos biológicos o moléculas pequeñas, estimulantes del potencial regenerativo endógeno, que hayan sido aprobados, aunque algunos principios de tratamiento y candidatos a fármaco prometedores han mostrado eficacia en modelos animales de LME en los últimos años. En gran medida, la falta de recuperación funcional en la LME humana está causada por factores que inhiben el crecimiento de las neuritas, en los sitios de la lesión, en el tejido cicatricial, en la mielina, así como en células asociadas a la lesión. Dichos factores son las proteínas asociadas a la mielina NogoA, OMgp y MAG, RGM A, la proteína asociada a cicatriz CSPG (proteoglicano condroitín-sulfato) y factores inhibidores que actúan sobre astrocitos reactivos (algunas semaforinas y efrinas). Sin embargo, en el sitio de la lesión no solo se observan moléculas inhibidoras del crecimiento, sino también factores estimulantes del crecimiento de las neuritas, tales como las neurotrofinas, la laminina, L1 y otros. Dicho conjunto de moléculas inhibidores del crecimiento de neuritas y estimulantes del crecimiento podría explicar que el bloqueo de factores individuales, tales como NogoA o RGM A, ha resultado en una recuperación funcional significativa en modelos de LME de roedor, debido a que una reducción de las influencias inhibidoras podía desplazar el equilibrio de inhibición del crecimiento a estimulación del crecimiento. Sin embargo, las recuperaciones observadas con el bloqueo de una sola molécula inhibidora del crecimiento expansivo de las neuritas no eran completas. Para conseguir recuperación más rápidas y más pronunciadas, podría resultar deseable bloquear dos moléculas inhibidoras del crecimiento expansivo de las neuritas, p. ej., Nogo y RGM A, o el bloqueo de una molécula inhibidora del crecimiento expansivo de las neuritas y que potencie las funciones de una molécula potenciadora del crecimiento expansivo de las neuritas, p. ej., Nogo y neurotrofinas, o el bloqueo de una molécula inhibidora del crecimiento expansivo de las neuritas, p. ej., Nogo y una molécula proinflamatorias, p. ej., TNF (ver McGee AW et al., Trends Neurosci. 2003;26:193; Marco Domeniconi, et al., J Neurol Sci. 2005;233:43; Milan Makwana1, et al., FEBS J.
2005;272:2628; Barry J. Dickson, Science. 2002;298:1959; Felicia Yu Hsuan Teng, et al., J Neurosci Res.
2005;79:273; Tara Karnezis, et al., Nature Neuroscience 2004; 7, 736; Gang Xu, et al., J. Neurochem.2004; 91; 1018).
Otras Ig-FET contempladas son aquellas capaces de unirse a parejas de dianas, tales como NgR y RGM A; NogoA y RGM A; MAG y RGM A; OMGp y Rg M A; RGM A y RGM B; CSPG y RGM A; agrecano, midkina, neurocán, versicán, fosfacán, Te38 y TNF-a; anticuerpos específicos de globulómero Ap combinados con anticuerpos estimulantes del brote de dendritas y axones. La patología de las dendritas es un signo muy temprano de EA y es conocido que NOGO A restringe el crecimiento de las dendritas. Podría combinarse dicho tipo de anticuerpo con cualquiera de los anticuerpos de los candidatos de LME (proteínas de mielina). Entre otras dianas de Ig-FET puede incluirse cualquier combinación de NgR-p75, NgR-Troy, NgR-Nogo66 (Nogo), NgR-Lingo, Lingo-Troy, Lingo-p75, MAG o Omgp. Además, entre las dianas puede incluirse además cualquier mediador, soluble o de superficie celular, implicado en la inhibición de las neuritas, p. ej., Nogo, Ompg, MAG, RGM A, semaforinas, efrinas, A-b soluble, citoquinas proinflamatorias (p. ej., IL-1), quimioquinas (p. ej., MIP 1a) y moléculas que inhiben la regeneración nerviosa. La eficacia de moléculas Ig-FET anti-nogo/anti-RGM A o similares puede validarse en modelos animales preclínicos de lesión de la médula espinal. Además, dichas moléculas de Ig-FET pueden construirse y someterse a ensayo para la eficacia en los modelos animales y puede seleccionarse la Ig-FET terapéutica óptima para el ensayo en pacientes humanos. Además, pueden construirse moléculas de Ig-FET con diana en dos sitios de unión a ligando diferentes en un único receptor, p. ej., el receptor de Nogo que se une a los tres ligandos Nogo, Ompg y MAG, y RAGE, que se une a A-b y S100A. Además, los inhibidores del crecimiento expansivo de las neuritas, p. ej., Nogo y el receptor de Nogo, también desempeñan una función en la prevención de la regeneración nerviosa en enfermedades inmunitarias como la esclerosis múltiple. La inhibición de la interacción de Nogo-receptor de Nogo se ha demostrado que potencia la recuperación en modelos animales de esclerosis múltiple. Por lo tanto, las moléculas de Ig-FET que pueden bloquear la función de un mediador inmunitario, p. ej., una citoquina como IL-12 y una molécula inhibidora del crecimiento expansivo de las neuritas, p. ej., Nogo o Rg M, podría ofrecer una eficacia más rápida y más elevada que el bloqueo de una molécula inhibidora inmune o una molécula inhibidora del crecimiento expansivo de las neuritas.
La terapia de anticuerpos monoclonales ha emergido como una importante modalidad terapéutica para el cáncer (von Mehren M, et al. 2003 Monoclonal antibody therapy for cancer (Annu Rev Med.;54:343-69). Los anticuerpos pueden ejercer efectos antitumorales mediante la inducción de apoptosis, citotoxicidad redirigida, interfiriendo con las interacciones de ligando-receptor, o evitando la expresión de proteínas que son cruciales para el fenotipo neoplásico. Además, los anticuerpos pueden presentar como diana componentes del microambiente tumoral, perturbando estructuras vitales, tales como la formación de vasculatura asociada al tumor. Los anticuerpos también pueden utilizar como diana receptores cuyos ligandos son factores de crecimiento, tales como el receptor del factor de crecimiento epidérmico. El anticuerpo de esta manera inhibe que los ligandos naturales que estimulan el crecimiento celular se unan a las células tumorales diana. Alternativamente, los anticuerpos pueden inducir una red antiidiotípica, citotoxicidad mediada por el complemento o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés). La utilización de un anticuerpo de especificidad doble con diana en dos mediadores tumorales independientes probablemente proporcionará un beneficio adicional respecto a una terapia monoespecífica. Las Ig-FET capaces de unirse a las parejas siguientes de dianas para tratar las enfermedades oncológicas también se encuentran contempladas: IGF1 e IGF2; IGF1/2 y Erb2B; VEGFR y EGFR; CD20 y CD3, CD138 y CD20, CD38 y CD20, CD38 y CD138, CD40 y CD20, CD138 y CD40, y CD38 y CD40. Entre otras combinaciones de dianas se incluyen uno o más miembros de la familia de EGF/erb-2/erb-3. Entre otras dianas (una o más) que participan en las enfermedades oncológicas a las que pueden unirse las Ig Ig-FET se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, las seleccionadas del grupo que consiste en: CD52, CD20, CD19, CD3, CD4, CD8, BMP6, IL12A, ILIA, IL1B, IL2, IL24, INHA, TNF, TNFSF10, BMP6, EGF, FGF1, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GRP, IGF1, IGF2, IL12A, ILIA, IL1B, IL2, INHA, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, VEGF, CDK2, EGF, FGF10, FGF18, FGF2, FGF4, FGF7, IGF1, IGF1R, IL2, VEGF, BCL2, CD164, CDKN1A, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, GNRH1, IGFBP6, ILIA, IL1B, ODZ1, PAWR, PLG, TGFB1I1, AR, BRCA1, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7, CDK9, E2F1, EGFR, ENO1, ERBB2, ESR1, ESR2, IGFBP3, IGFBP6, IL2, INSL4, MYC, NOX5, NR6A1, PAP, PCNA, PRKCQ, PRKD1, PRL, TP53, FGF22, FGF23, FGF9, IGFBP3, IL2, INHA, KLK6, TP53, CHGB, GNRH1, IGF1, IGF2, INHA, INSL3, INSL4, PRL, KLK6, SHBG, NR1D1, NR1H3, NR1I3, NR2F6, NR4A3, ESR1, ESR2, NR0B1, NR0B2, NR1D2, NR1H2, NR1H4, NR1I2, NR2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR5A1, NR5A2, NR6A1, PGR, RARB, FGF1, FGF2, FGF6, KLK3, KRT1, APOC1, BRCA1, CHGA, CHGB, CLU, COL1A1, COL6A1, EGF, ERBB2, ERK8, FGF1, FGF10, FGF11, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GNRH1, IGF1, IGF2, IGFBP3, IGFBP6, IL12A, ILIA, IL1B, IL2, IL24, INHA, INSL3, INSL4, KLK10, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK9, MMP2, MMP9, MSMB, NTN4, ODZ1, PAP, PLAU, PRL, PSAP, SERPINA3, SHBG, TGFA, TIMP3, CD44, CDH1, CDH10, CDH19, CDH20, CDH7, CDH9, CDH1, CDH10, CDH13, CDH18, CDH19, CDH20, CDH7, CDH8, CDH9, ROBO2, CD44, ILK, ITGA1, APC, CD164, COL6A1, MTSS1, PAP, TGFB1I1, AGR2, AIG1, AKAP1, AKAP2, CANT1, CAV1, CDH12, CLDN3, CLN3, CYB5, CYC1, DAB2IP, DES, DNCL1, ELAC2, ENO2, ENO3, FASN, FLJ12584, FLJ25530, GAGEB1, GAGEC1, GGT1, GSTP1, HIP1, HUMCYT2A, IL29, K6HF, KAI1, KRT2A, MIB1, PART1, PATE, PCA3, PIAS2, PIK3CG, PPID, PR1, PSCA, SLC2A2, SLC33A1, SLC43A1, STEAP, STEAP2, TPM1, TPM2, TRPC6, ANGPT1, ANGPT2, ANPEP, ECGF1, EREG, FGF1, FGF2, FIGF, FLT1, JAG1, KDR, LAMA5, NRP1, NRP2, PGF, PLXDC1, STAB1, VEGF, VEGFC, ANGPTL3, BAI1, COL4A3, IL8, LAMA5, NRP1, NRP2, STAB1, ANGPTL4, PECAM1, PF4, PROK2, SERPINF1, TNFAIP2, CCL11, CCL2, CXCL1, CXCL10, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL9, IFNA1, IFNB1, IFNG, IL1B, IL6, MDK, EDG1, EFNA1, EFNA3, EFNB2, EGF, EPHB4, FGFR3, HGF, IGF1, ITGB3, PDGFA, TEK, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFBR1, CCL2, CDH5, COL18A1, EDG1, ENG, ITGAV, ITGB3, THBS1, THBS2, BAD, BAG1, BCL2, CCNA1, CCNA2, CCND1, CCNE1, CCNE2, CDH1 (E-cadherina), CDKN1B (p27Kip1), CDKN2A (p16INK4a), COL6A1, CTNNB1 (b-catenina), CTSB (catepsina B), ERBB2 (Her-2), ESR1, ESR2, F3 (TF), FOSL1 (FRA-1), GATA3, GSN (gelsolina), IGFBP2, IL2RA, IL6, IL6R, IL6ST (glucoproteína 130), ITGA6 (integrina a6, JUN, KLK5, KRT19, MAP2K7 (c-Jun), MKI67 (Ki-67), NGFB (NGF), NGFR, NME1 (NM23A), PGR, PLAU (uPA), PTEN, CTLA-4, OX40, GITR, TIM-3, Lag-3, B7-H3, B7-H4, GDF8, CGRP, Lingo-1, ICOS, GARP, BTLA, CD160, ROR1, SERPINB5 (maspina), SERPINE1 (PAI-1), TGFA, THBS1 (trombospondina-1), TIE (Tie-1), TNFRSF6 (Fas), TNFSF6 (FasL), TOP2A (topoisomerasa IIa), TP53, AZGP1 (zinc-a-glucoproteína), BPAG1 (plectina), CDKN1A (p21Wap1/Cip1), CLDN7 (claudina-7), CLU (clusterina), ERBB2 (Her-2), FGF1, FLRT1 (fibronectina), GABRP (GABAa), GNAS1, ID2, ITGA6 (integrina a 6), ITGB4 (b 4 integrina), KLF5 (GC Box BP), KRT19 (queratina 19), KRTHB6 (queratina de tipo II específica del pelo), MACMARCKS, MT3 (metalotionectina-III), MUC1 (mucina), PTGS2 (COX-2), RAC2 (p21Rac2), S100A2, SCGB1D2 (lipofilina B), SCGB2A1 (mamaglobina 2), SCGB2A2 (mamaglobina 1), SPRR1B (Spr1), THBS1, THBS2, THBS4, y TNFAIP2 (B94).
En una realización, entre las enfermedades que pueden tratarse o diagnosticarse con las composiciones reivindicadas en la presente memoria se incluyen, aunque sin limitación, cánceres primarios y metastásicos, incluyendo carcinomas de mama, colon, recto, pulmón, orofaringe, hipofaringe, esófago, estómago, páncreas, hígado, vesícula biliar y conductos biliares, intestino delgado, tracto urinario (incluyendo riñón, vejiga y urotelio), tracto genital femenino (incluyendo cuello uterino, útero y ovarios, así como coriocarcinoma y enfermedad trofoblástica gestacional), tracto genital masculino (incluyendo próstata, vesículas seminales, testículos y tumores de las células germinales), glándulas endocrinas (incluyendo las glándulas del tiroides, adrenal y pituitaria), y la piel, así como hemangiomas, melanomas, sarcomas (incluyendo los que aparece en tejidos óseos y blandos, así como el sarcoma de Kaposi), tumores cerebrales, nervios, ojos y meninges (incluyendo astrocitomas, gliomas, glioblastomas, retinoblastomas, neuromas, neuroblastomas, Schwanomas y meningiomas), tumores sólidos que aparecen a partir de neoplasias malignas hematopoyéticas, tales como leucemias y linfomas (linfomas tanto de Hodgkin como no de Hodgkin).
En una realización, los anticuerpos proporcionados en la presente memoria encuentran utilidad en el tratamiento del cáncer o en la prevención de metástasis a partir de tumores indicados en la presente memoria, o bien en el caso de que se utilicen solos o bien en combinación con radioterapia u otros agentes quimioterapéuticos.
Tal como se indica en la presente memoria, las células efectoras inmunitarias humanas son un miembro del linaje de células linfoides humanas. Tal como se indica en la presente memoria, las células efectoras ventajosamente pueden ser una célula T humana, una célula B humana o una célula asesina natural (NK) humana. Ventajosamente, dichas células pueden presentar un efecto citotóxico o apoptótico sobre la célula diana. Especialmente ventajosamente, la célula linfoide humana es una célula T citotóxica que, al activarse, ejerce un efecto citotóxico sobre la célula diana. Según dicha realización, entonces, la actividad reclutada de la célula efectora humana es la actividad citotóxica de dicha célula.
Según una realización preferente, la activación de la célula T citotóxica puede producirse mediante la unión del antígeno CD3 como antígeno efecto a la superficie de la célula T citotóxica mediante un anticuerpo biespecífico de la presente realización de la invención. El antígeno CD3 humano se encuentra presente tanto sobre células T ayudantes como sobre células T citotóxicas. CD3 humano denota un antígeno que se expresa sobre las células T como parte del complejo multimolecular de las células T y que comprende tres cadenas diferentes: CD3-epsilón, CD3-delta y CD3-gamma.
La activación del potencial citotóxico de las células T es un fenómeno complejo que requiere la interacción de múltiples proteínas. La proteína receptora de células T ("RCT") es un heterodímero unido mediante disulfuro a la membrana, que consiste en dos subunidades glucoproteicas diferentes. La RCT reconoce y se une a un antígeno peptídico foráneo que a su vez se ha unido a un miembro de la clase altamente diversa de proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad ("CMH") y ha sido presentado, unido al CMH, desde la superficie de las células presentadoras de antígenos ("CPA").
Aunque la RCT variable se une a antígenos foráneos tal como se ha señalado anteriormente, la señalización a las células T de que ha tenido lugar esta unión depende de la presencia de otras proteínas de señalización, invariantes, asociadas a la RCT. Dichas proteínas de señalización en forma asociada se denominan colectivamente complejo de CD3, en la presente memoria se denominan colectivamente antígeno CD3.
La activación de la citotoxicidad de las células T, entonces, normalmente depende en primer lugar de la unión de la RCT a una proteína del CMH, a su vez unida al antígeno foráneo, localizados en una célula diferente. Solo una vez ha tenido lugar dicha unión inicial de RCT-CMH, puede producirse la cascada de señalización dependiente de CD3 que es responsable de la expansión clonal de las células T y, en última instancia, la citotoxicidad de las mismas.
Sin embargo, la unión del antígeno CD3 humano por la primera o segunda porción de un anticuerpo biespecífico de la invención activa las células T para ejercer un efecto citotóxico sobre otras células en ausencia de una unión independiente de RCT-CMH. Ello significa que las células T pueden activarse citotóxicamente de una manera clonalmente independiente, es decir, de una manera que es independiente del clon de RCT específico que porta la célula T. Lo anterior permite una activación de todo el compartimiento de las células T en lugar de solo células T específicas de una determinada identidad clonal.
A la luz del comentario anteriormente proporcionado, entonces, una realización especialmente preferente de la invención proporciona un anticuerpo biespecífico en el que el antígeno efecto es el antígeno CD3 humano.
Según realizaciones adicionales de la invención, otros antígenos efectores asociados a células linfoides unidos mediante un anticuerpo biespecífico de la invención pueden ser el antígeno CD16 humano, el antígeno NKG2D humano, el antígeno NKp46 humano, el antígeno c D2 humano, el antígeno CD28 humano o el antígeno CD25 humano.
Según otra realización de la invención, la célula efectora humana es un miembro del linaje mieloide humano. Ventajosamente, la célula efectora puede ser un monocito humano, un granulocito neutrófilo humano o una célula dendrítica humana. Ventajosamente, dichas células pueden presentar un efecto citotóxico o apoptótico sobre la célula diana. Los antígenos ventajosos dentro de esta realización que pueden unirse a un anticuerpo biespecífico de la invención pueden ser el antígeno CD64 humano o el antígeno CD89 humano.
Según otra realización de la invención, el antígeno diana es un antígeno que se expresa de forma única sobre una célula diana o célula efectora en una condición de enfermedad, aunque se mantiene no expresada o se expresa a un nivel bajo o no accesible en una condición de salud. Los ejemplos de dichos antígenos diana que podrían unirse específicamente a un anticuerpo biespecífico de la invención se pueden seleccionar ventajosamente de entre EpCAM, CCR5, CD19, HER-2 neu, HER-3, HER-4, EGFR, PSMA, CEA, MUC-1 (mucina), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, phCG, Lewis-Y, CD20, CD33, CD30, gangliósido GD3, 9-O-acetil-GD3, GM2, Globo H, fucosil-GMI, poli-SA, GD2, carboanhidrasa IX (MN/CA IX), CD44v6, Sonic Hedgehog (Shh), Wue-1, antígeno de célula plasmática, IgE (unido a membrana), proteoglicano condroitín-sulfato del melanoma (MCSP), CCR8, precursor de TNF-alfa, STEAP, mesotelina, antígeno A33, antígeno de célula madre prostática (PSCA), Ly-6; desmogleína-4, neoepítopo E-cadherina, receptor de acetilcolina fetal, CD25, marcador CA19-9, marcador CA-125 y receptor de tipo II de la sustancia inhibidora muelleriana (MIS), sTn (antígeno Tn sialilado; TAG-72), FAP (antígeno de activación fibroblástica), endosialina, EGFRvIII, LG, SAS y CD63.
Según una realización específica, el antígeno diana que se une específicamente a un anticuerpo biespecífico puede ser un antígeno relacionado con cáncer, es decir, un antígeno relacionado con una condición neoplásica maligna. Dicho antígeno se expresa o es accesible sobre una célula maligna, mientras que el antígeno o bien no se encuentra presente, no se encuentra significativamente presente o no es accesible sobre una célula no maligna. De esta manera, un anticuerpo biespecífico según la presente realización de la invención es un anticuerpo biespecífico que recluta la actividad de una célula efectora inmunitaria humana contra la célula diana maligna que porta el antígeno diana, o consigue que el antígeno diana sea accesible.
Terapia génica: Tal como se indica en la presente memoria, las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de una proteína de unión proporcionada en la presente memoria u otro agente profiláctico o terapéutico pueden administrarse para tratar, prevenir, controlar o mejorar un trastorno o uno o más síntomas del mismo mediante terapia génica. La terapia génica se refiere a la terapia llevada a cabo mediante la administración en el sujeto de un ácido nucleico expresado o expresable. Tal como se indica en la presente memoria, los ácidos nucleicos producen el anticuerpo o el agente profiláctico o terapéutico proporcionado en la presente memoria que codifican y que actúa de mediador en un efecto profiláctico o terapéutico.
Puede utilizarse cualquiera de los métodos de terapia génica disponibles de la técnica en los métodos proporcionados en la presente memoria. Para revisiones generales de los métodos de terapia génica, ver Goldspiel et al. (1993) Clin. Pharmacy 12:488-505; Wu y Wu (1991) Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev (l993) Ann Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) Science 260:926-932; Morgan y Anderson (1993) Ann Rev. Biochem. 62:191-217; y May (1993) TIBTECH 11(5):155-215. Los métodos comúnmente conocidos de la tecnología de DNA recombinante que pueden utilizarse se describen en Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993) y en Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990). Se da a conocer una descripción detallada de diversos métodos de terapia génica en la publicación de patente US n° US2005/0042664.
Diagnósticos: La exposición en la presente memoria proporciona, además, aplicaciones diagnósticas, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, métodos de ensayo diagnóstico, kits diagnósticos que contienen una o más proteínas de unión, y adaptaciones de los métodos y kits para la utilización en sistemas automatizados o semiautomatizados. Los métodos, kits y adaptaciones proporcionados pueden utilizarse en la detección, monitorización y/o tratamiento de una enfermedad o trastorno en un individuo. Lo anterior se aclara adicionalmente después.
A. Método de ensayo: La presente exposición proporciona además un método para determinar la presencia, cantidad o concentración de un analito, o fragmento del mismo, en una muestra de ensayo utilizando por lo menos una proteína de unión tal como se indica en la presente memoria. En el método puede utilizarse cualquier ensayo adecuado tal como se conoce de la técnica. Entre los ejemplos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, inmunoensayos y/o métodos que utilizan la espectrometría de masas. Los inmunoensayos proporcionados mediante la presente exposición pueden incluir inmunoensayos de tipo sándwich, radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos enzimáticos (EIA), ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), inmunoensayos de inhibición competitiva, inmunoensayo de fluorescencia polarizada (FPIA), técnica de inmunoensayo por multiplicación enzimática (EMIT), transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) y ensayos quimioluminiscentes homogéneos, entre otros. Un inmunoensayo de micropartículas quimioluminiscente, en particular uno que utiliza el analizador automatizado ARCHITECT® (Abbott Laboratories, Abbott Park, III.) es un ejemplo de un inmunoensayo. Los métodos que utilizan espectrometría de masas se proporcionan mediante la presente exposición y entre ellos se incluyen, aunque sin limitación, MALDI (desorción/ionización láser asistida por matriz) o SELDI (desorción/ionización láser potenciada en superficie).
Los métodos para recoger, manipular, procesar y analizar muestras de ensayo biológico utilizando inmunoensayos y espectrometría de masas son bien conocidos por el experto en la materia, y se proporcionan para la práctica en la presente exposición (documento n° US 2009-0311253 A1).
B. Kit: se proporciona, además, un kit para el ensayo de una muestra de ensayo para la presencia, cantidad o concentración de un analito, o fragmento del mismo, en una muestra de ensayo. El kit comprende por lo menos un componente para el ensayo de la muestra de ensayo para el analito, o fragmento del mismo, e instrucciones para someter a ensayo la muestra de ensayo para el analito, o fragmento del mismo. El componente o componentes para someter a ensayo la muestra de ensayo para el analito, o fragmento del mismo, pueden incluir una composición que comprende una proteína de unión, tal como se da a conocer en la presente memoria, o una proteína de unión antianalito (o un fragmento, una variante o un fragmento de una variante del mismo), que se inmoviliza opcionalmente sobre una fase sólida. Opcionalmente, el kit puede comprender un calibrador o control, que puede comprender un analito aislado o purificado. El kit puede comprender por lo menos un componente para el ensayo de la muestra de ensayo para un analito mediante inmunoensayo y/o espectrometría de masas. Los componentes del kit, incluyendo el analito, proteína de unión o proteína de unión antianalito, o fragmentos de la misma, pueden marcarse opcionalmente mediante la utilización de cualquier marcaje detectable conocido de la técnica. Los materiales y métodos para la creación proporcionados para la práctica de la presente exposición serían conocidos por el experto en la materia (documento n° US 2009-0311253 A1).
C. Adaptación del kit y método: el kit (o componentes del mismo), así como el método para determinar la presencia, cantidad o concentración de un analito en una muestra de ensayo mediante un ensayo, tal como un inmunoensayo tal como se indica en la presente memoria, pueden adaptarse para la utilización en una diversidad de sistemas automatizados y semiautomatizados (incluyendo aquellos en los que la fase sólida comprende una micropartícula), tal como se indica en, por ejemplo, las patentes US n° 5.089.424 y n° 5.006.309, y tal como comercializa, por ejemplo, Abbott Laboratories (Abbott Park, Ill.) como ARCHITECT®. Entre otras plataformas disponibles de Abbott Laboratories se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, AxSYM®, IMx® (ver, por ejemplo, la patente US n° 5.294.404, PRISM®, EIA (perlas) y Quantum™ II, así como otras plataformas. Además, los ensayos, kits y componentes de kits pueden utilizarse en otros formatos, por ejemplo, en sistemas de ensayo electroquímicos u otros sistemas de ensayo manuales o de punto-de-atención. La presente exposición es aplicable, por ejemplo, al sistema de inmunoensayo electroquímico de punto-de-atención comercial de Abbott (i-STAT®, Abbott Laboratories) que realiza inmunoensayos de tipo sándwich. Los inmunosensores y sus métodos de fabricación y funcionamiento en dispositivos de ensayo de un solo uso se describen en, por ejemplo, las patentes US n° 5.063.081, n° 7.419.821 y n° 7.682.833; y en las publicaciones de patente US n° 20040018577, n° 20060160164 y n° US 20090311253.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Construcción, expresión, purificación y análisis de inmunoglobulinas con Fab en tándem (Ig-FET) anti-IL17/IL-20
Con el fin de demostrar la tecnología de Ig-FET, los presentes inventores generaron un grupo de moléculas de Ig-FET anti-IL-17/IL-20: Ig-FET1, Ig-FET2 e Ig-FET3, la totalidad de los cuales contiene 3 polipéptidos diferentes, tal como se muestra en la figura 1, en la que el antígeno A es IL-17 y el antígeno B es IL-20. El constructo de ADN utilizado para generar Ig-FET capaz de unirse a IL-17 e IL-20 se ilustra en la figura 1B. Brevemente, los mAb parentales incluían dos anticuerpos de elevada afinidad: anti-IL-17 (clon LY) (patente US n° 7.838.638) y anti-hIL-20 (clon 15D2) (solicitud publicada de patente US n° US2014/0194599). Para generar el constructo de Ig-FET n° 1, el VL-CL de LY se fusionó directamente (Ig-FET1) o mediante un conector de 3 aminoácidos (Ig-FET2) o 7 aminoácidos (Ig-FET3) fusionado con el extremo N-terminal de la cadena pesada de 15D2 (tal como se muestra en la Tabla 1). El constructo n° 2 era VH-CH1 de LY y el 3° constructo era v L-CL de 15D2. Los 3 constructos para cada Ig-FET se cotransfectaron en células 293, resultando en la expresión y secreción de proteína Ig-FET.
Los presentes inventores generaron además un grupo de moléculas de Ig-FET anti-IL-17/IL-20: Ig-FET4, Ig-FET5 e Ig-FET6, cada una de las cuales contenía 2 polipéptidos diferentes, tal como se muestra en la figura 2. Los constructos de ADN utilizados para generar Ig-FET capaz de unirse a IL-17 e IL-20 se ilustran en la figura 2B, en la que el antígeno A es IL-17 y el antígeno B es IL-20. Brevemente, los mAb parentales incluían dos anticuerpos de alta afinidad: anti-IL-17 (clon LY) y anti-hIL-20 (clon 15D2). Para generar el constructo de Ig-FET n° 1, el VL-CL de LY se fusionó directamente (Ig-FET4) o mediante un conector de 3 aminoácidos (Ig-FET5) o 7 aminoácidos (Ig-FET6) con el extremo N-terminal de la cadena pesada de 15D2 (tal como se muestra en la Tabla 1). Para generar el constructo de Ig-FET n° 4, el VH-CH1 de LY se fusionó directamente (Ig-FET4) o mediante un conector de 3 aminoácidos (Ig-FET5) o 7 aminoácidos (Ig-FET6) con el extremo N-terminal de la cadena ligera de 15D2. Los 2 constructos de ADN (constructos n° 1 y n° 4) para cada Ig-FET se cotransfectaron en células 293, resultando en la expresión y secreción de proteína Ig-FET. Los procedimientos detallados de la clonación por PCR se describen posteriormente.
Ejemplo 1.1: clonación molecular de moléculas de Ig-FET anti-IL-17/IL-20:
Para la clonación del constructo n° 1, se amplificó por PCR la cadena ligera de LY utilizando cebadores directos que se hibridaban en la secuencia de señal de cadena ligera y cebadores inversos que se hibridaban en la cadena C-terminal de la cadena ligera. Se amplificó por PCR la cadena pesada de 15D2 utilizando cebadores directos que se hibridaban en el extremo N-terminal de VH de 15D2 y cebadores inversos que se hibridaban en el extremo C-terminal de CH. Dichos 2 fragmentos de PCR se purificaron en gel y se combinaron mediante PCR solapante mediante la utilización de péptido de señal y una pareja de cebadores CH. El producto de PCR combinado se clonó en un vector de expresión 293, que ya contenía la secuencia Fc humana.
Tabla 1. Moléculas de Ig-FET anti-IL-17/IL-20 y constructos de ADN.
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Para la clonación del constructo n° 2, se amplificó por PCR la VH-CH1 de LY mediante la utilización de cebadores directos que se hibridaban en la secuencia de señal de cadena pesada y cebador inverso que se hibridaba en la cadena C-terminal de CH1. El producto de PCR se purificó en gel antes de la clonación en un vector de expresión 293.
Para el constructo n° 3, se amplificó por PCR la cadena ligera de 15D2 mediante la utilización de cebador directo que se hibridaba en el extremo N-terminal del péptido de señal de la cadena ligera y cebador inverso que se hibridaba en el extremo de CL. El producto de PCR se purificó en gel antes de la clonación en un vector de expresión 293.
Para la clonación del constructo n° 4, se amplificó por PCR la VH-CH1 de LY mediante la utilización de cebador directo que se hibridaba en el extremo N-terminal del péptido de señal de la cadena pesada y cebador inverso que se hibridaba en el extremo de CH1. VL de 15D2 se amplificó utilizando cebadores que se hibridaban en el extremo de VL de 15D2. Ambos productos de PCR se purificaron en gel y se combinaron mediante PCR de solapamiento. El producto de PCR combinado se purificó en gel antes de la clonación en un vector de expresión 293. La Tabla 2 muestras las secuencias de los cebadores de PCR para la clonación molecular anteriormente indicada.
Tabla 2. Cebadores de PCR utilizados para la construcción molecular de las Ig-FET anti-IL-17/anti-CD20
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(continuación)
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Las secuencias finales de Ig-FET1 de hIL-17/hIL-20, Ig-FET2, Ig-FET3, Ig-FET4, Ig-FET5 y Ig-FET6 se indican en la Tabla 3.
Tabla 3. Secuencias de aminoácidos de moléculas Ig-FET anti-IL-17/IL-20
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Ejemplo 1.2: Expresión, purificación y análisis de proteínas Ig-FET anti-IL-17/IL-20:
Todos los constructos de ADN de cada Ig-FET se subclonaron en vectores a base de pBOS y se secuenciaron para garantizar la precisión. Los constructos n° 1, n° 2 y n° 3 de cada Ig-FET (1,2 y 3) o los constructos n° 1 y n° 4 de cada Ig-FET (4, 5 y 6 ) se coexpresaron transitoriamente utilizando polietilenimina (PEI) en células 293E. Brevemente, ADN en medio de expresión FreeStyle™ 293 se mezcló con la PEI a la concentración final de proporción de ADN a PEI de 1:2, se incubó durante 15 min (no más de 20 min) a temperatura ambiente y después se añadió a las células 293E (1,0-1,2x106/ml, viabilidad celular >95 %) a razón de 60 |jg de ADN/120 ml de cultivo. Tras 6 a 24 horas de cultivo en un agitador, se añadió peptona a las células transfectadas a una concentración final de 5 % bajo agitación a 125 rpm/min a 37°C con 8 % de CO2. El 6°-7° día, se recolectó el sobrenadante mediante centrifugación y filtración y la proteína Ig-FET se purificó mediante cromatografía de proteína A (Pierce, Rockford, IL) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las proteínas se analizaron mediante SDS-PAGE y se determinó su concentración mediante A280 y BCA (Pierce, Rockford, IL).
Para la expresión de Ig-FET1, Ig-FET2 e Ig-FET3, se utilizaron diferentes proporciones molares de ADN de los 3 constructos, incluyendo constructo n° 1:n° 2:n° 3=1:1:1, constructo n° 1:n° 2:n° 3=1:1,5:1,5 y constructo n° 1:n° 2:n° 3=1:3:3 (Tabla 4 ). Las proteínas Ig-FET se purificaron mediante cromatografía de proteína A. El rendimiento de purificación (7 a 16 mg/l) era consistente con la cuantificación de hIgG del medio de expresión para cada proteína. La composición y pureza de cada Ig-FET purificada se analizó mediante SDS-PAGE tanto bajo condiciones reducidas como no reducidas. Bajo condiciones no reducidas, la Ig-FET migró como una sola banda de aproximadamente 250 kDa. Bajo condiciones reducidas, cada una de las proteínas Ig-FET rindió dos bandas: una banda de PM más alto era el constructo n° 1 de aproximadamente 75 kDa y una banda de PM más bajo que correspondía a los constructos n° 2 y n° 3 solapados en aproximadamente 25 kDa. La SDS-PAGE mostraba que cada Ig-FET se expresaba como una única especie, y las 3 cadenas polipeptídicas se emparejaban eficientemente para formar una molécula de tipo IgG. Los tamaños de las cadenas, así como la proteína de longitud completa de las moléculas de Ig-FET son consistentes con su masa molecular calculada basándose en las secuencias de aminoácidos.
Tabla 4. Expresión y análisis mediante cromatografía de exclusión por tamaño (CET) de proteínas Ig-FET anti-IL-17/IL-20
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Con el fin de estudiar adicionalmente las propiedades físicas de Ig-FET en solución, se utilizó la cromatografía de exclusión por tamaños (CET) para analizar cada proteína. Para el análisis de CET de la Ig-FET, se aplicó Ig-FET purificado en PBS en una columna de 300 x 4,6 mm de TSKgel SuperSW3000 (TOSOH). Para la CET se utilizó un instrumento de HPLC modelo U3000 (DIONEX). Todas las proteínas se determinaron mediante detección de UV a 280 nm y 214 nm. La elución fue isocrática a un caudal de 0,25 ml/min. La totalidad de las 3 proteínas Ig-FET mostró un único pico principal, demostrando la homogeneidad física como proteínas monoméricas (Tabla 4). La proporción de constructo n° 1:n° 2:n° 3=1:3:3 mostró un mejor perfil monomérico según CET para la totalidad de las 3 proteínas Ig-FET (Tabla 4).
La Tabla 4 también muestra que los niveles de expresión de todas las proteínas Ig-FET son comparables a los de los mAb regulares, indicando que las Ig-FET pueden expresarse eficientemente en las células de mamífero. Para la expresión de Ig-FET4, Ig-FET5 e Ig-FET6 , la proporción de ADN de constructo n° 1:n° 4=1:1, y el nivel de expresión se encontraba comprendido en el intervalo de 1 a 1 0 mg/l, y el % máximo de fracción monomérica determinado mediante CET se encontraba comprendido en el intervalo de 58 % a 76 %. Basándose en dicha combinación particular de mAb (LY y 15D2), los 3 constructos de polipéptido Ig-FET (Ig-FET1, Ig-FET2 e Ig-FET3) mostraron un mejor perfil de expresión que el de los constructos de 2 polipéptidos Ig-FET (Ig-FET4, Ig-FET5 e Ig-FET6 ), por lo tanto, se analizaron adicionalmente Ig-FET1, Ig-FET2 e Ig-FET3 para sus propiedades funcionales.
Ejemplo 1.3 Determinación de la afinidad de unión a antígeno de las Ig-FET anti-IL-17/IL-20
Se determinó la cinética de la unión de Ig-FET a rhIL-17 y rhIL-20 mediante resonancia del plasmón superficial (Tabla 5) con un instrumento Biacore X100 (Biacore AB, Uppsala, Suecia) utilizando HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y surfactante P20 al 0,005 %) a 25°C. Brevemente, se inmovilizó directamente anticuerpo policlonal fragmento Fcy de cabra anti-IgG humana (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL) en un chip biosensor de grado de investigación CM5 utilizando un kit estándar de acoplamiento de aminas siguiendo las instrucciones del fabricante. Se diluyeron muestras purificadas de Ig-FET en solución salina tamponada con HEPES para la captura en superficies de reacción específicas de Fc de cabra anti-IgG humana y se inyectaron en matrices de reacción a un caudal de 5 jl/min. Se determinaron las constantes de tasa de asociación y de disociación, kon (M 'V ) y koff (s_1) bajo un caudal continuo de 30 pl/min. Se obtuvieron las constantes de tasa mediante la realización de mediciones de unión cinéticas a diez concentraciones de antígeno diferentes comprendidas entre 1,25 y 1000 nM. La constante de disociación en el equilibrio (M) de la reacción entre Ig-FET y las proteínas diana a continuación se calculó a partir de las constantes de tasa cinética mediante la fórmula a continuación: KD=koff/kon. También se inyectaron simultáneamente alícuotas de muestras de antígeno sobre una referencia de blanco y superficie de CM de reacción para registrar y substraer cualquier unión no específica de fondo a fin de eliminar la mayor parte de los cambios de índice de refracción y de ruido de inyección. Las superficies se regeneraron con dos inyecciones posteriores de 25 ml de glicina 1 0 mM (pH 1,5) a un caudal de 1 0 pl/min. Las superficies con anticuerpo anti-Fc inmovilizado se regeneraron por completo y retuvieron su capacidad de captura completa durante doce ciclos.
Tabla 5. Caracterizaciones funcionales de moléculas de Ig-FET anti-IL-17/IL-20
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El análisis de Biacore indica que los parámetros de unión globales de las tres Ig-FET a hIL-17 y hIL-20 eran similares, con afinidades de las Ig-FET muy próximas a las de los mAb parentales LY y 15D2, y no se produjo ninguna pérdida de afinidad de unión para ninguno de los dominios de unión a antígeno (Tabla 5).
Además, también se analizó mediante Biacore la unión de antígeno de doble especificidad tetravalente de Ig-FET. En primer lugar, se capturó Ig-FET mediante un anticuerpo de cabra anti-Fc humano en el chip sensor Biacore, y se inyectó el primer antígeno y se observó la señal de unión. A medida que la Ig-FET1 se saturaba con el primer antígeno, seguidamente se inyectaba el segundo antígeno y se observaba la segunda señal. Lo anterior se llevó a cabo en primer lugar inyectando IL-17, seguido de IL-20 o en primer lugar inyectando IL-20 seguido de Il-17 para Ig-FET2 (figura 3). En cualquiera de las secuencias, se detectó una actividad de doble unión, y se saturó la unión de ambos antígenos a 25-30 Ru . Se obtuvieron resultados similares para Ig-FET2 e Ig-FET3. De esta manera, cada Ig-FET era capaz de unirse a ambos antígenos simultáneamente como molécula tetravalente de doble especificidad.
El perfil de expresión y propiedades de doble unión de la Ig-fET claramente demuestra que, dentro de la molécula de Ig-FET, ambos VL-CL se emparejaron correctamente con la VH-CH1 correspondiente para formar 2 dominios de unión funcionales, y se expresaron como una única proteína Ig-FET de longitud completa monomérica, tetravalente y biespecífica. Lo anterior contrasta con el tipo multivalente de molécula de anticuerpo (Miller y Presta, patente US n° 8722859), que mostraba actividades de unión tetravalente, aunque monoespecíficas con un antígeno diana.
Ejemplo 1.4 Determinación de la actividad biológica de Ig-FET anti-IL-17/IL-20
La actividad biológica de Ig-FET para neutralizar la función de IL-17 se midió mediante bioensayo de GROa. Brevemente, se sembraron células Hs27 a razón de 10000 células/50 pl/pocillo en placas de 96 pocillos. Se añadió Ig-FET o anticuerpo de control anti-IL-17 (25 pl) en pocillos por duplicado, con una concentración inicial de 2,5 nM, seguido de diluciones en serie de 1:2 hasta llegar a 5 pM. A continuación, se añadió IL-17A (25 pl) a cada pocillo. La concentración final de IL-17A era de 0,3 nM. Las células se incubaron a 37°C durante 17 h antes de recoger el sobrenadante de cultivo celular. Se midieron las concentraciones de GRO-a en los sobrenadantes de cultivo celular mediante el kit Quantikine de CACL1/GRO-alfa humano siguiendo el protocolo del fabricante (R&D systems).
Se midió la actividad biológica de Ig-FET para neutralizar la función de IL-20 utilizando el ensayo de proliferación celular de BAF3 IL-20R+. Brevemente, se añadieron 25 pl de IL-20 humana recombinante a 0,8 nM a cada pocillo de placas de 96 pocillos (concentración final de IL-20: 0,2 nM). Se diluyó anticuerpo anti-IL20 o Ig-FET u otro anticuerpo de control a 400 nM (concentración de trabajo: 100 nM) seguido de diluciones en serie de 5 veces y se añadieron a placas de ensayo de 96 pocillos (25 pl en cada pocillo). A continuación, se añadieron células BaF3 establemente transfectadas con receptor de IL-20 a cada pocillo a una concentración de 10000 células/pocillo en un volumen de 50 pl de RPMI más FBS al 10 %, higromicina B a una concentración de 800 pg/ml, G418 a una concentración de 800 pg/ml. Tras 48 h de incubación, se añadieron a cada pocillo 100 pl de tampón luminiscente CellTiter-Glo. Se mezcló el contenido durante 2 minutos en un agitador orbital para inducir la lisis celular y se incubaron las placas a temperatura ambiente durante 10 minutos para estabilizar la señal luminiscente. Se registró la luminiscencia mediante SpectraMax M5.
Tal como se muestra en la Tabla 5, todas las Ig-FET pudieron neutralizar tanto hIL-20 como hIL-17 con afinidades similares a la de los anticuerpos parentales. Basándose en el análisis funcional mediante Biacore y ensayos celulares de neutralización, aparentemente la totalidad de las 3 Ig-FET conservó completamente las actividades de los mAb parentales. No se observaron diferencias funcionales significativas en las tres Ig-FET, indicando que el conector era opcional y que el constructo de Ig-FET proporcionaba suficiente flexibilidad y dimensiones especiales que permitían la unión dual en ausencia de un péptido espaciador entre las 2 regiones de unión de Fab. Lo anterior contraste con el tipo DVD-Ig de moléculas, en el que resulta necesario un conector entre los 2 dominios variables en cada una de las 2 cadenas polipeptídicas para conservar las actividades del dominio variable inferior (2 °).
Ejemplo 1.5 Estudio de estabilidad de la Ig-FET anti-IL-17/IL-20
Se incubaron individualmente muestras de proteína Ig-FET en tampón de citrato (pH=6,0) a 4°C, 25°C y 40°C constantes durante 1 día, 3 días o 7 días. De manera similar, se congelaron-descongelaron una vez, dos veces o tres veces muestras de proteína Ig-FET1. Las fracciones de proteína monomérica completa intacta de todas las muestras se detectaron mediante CET-HPLC con 10 |jg de cada muestra de proteína inyectada en un instrumento de HPLC Ultimate 3000 dotado de Superdex20005/150 GL a un caudal de 0,3 ml/min durante 15 min, y los datos se registraron y analizaron utilizando el software Chromeleon suministrado por el fabricante. La Tabla 6 muestra que la Ig-FET1 y la Ig-FET3 se conservaron como moléculas monoméricas intactas completas bajo dichas condiciones de reto térmico.
Tabla 6. Análisis de estabilidad de Ig-FET mediante la medición del % de fracciones monoméricas completas mediante CET
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Ejemplo 1.6 Estudio de solubilidad de la Ig-FET anti-IL-17/IL-20
Se analizó la solubilidad de la Ig-FET1 mediante la medición de los indicios de precipitación en presencia de concentraciones crecientes de PEG6000 (el PEG6000 se adquirió de Shanghai lingfeng chemical reagent co. Ltd). Brevemente, se obtuvo la solubilidad de la proteína en presencia de PEG6000 como función de la concentración de PEG6000 (0, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 % y 30 %). Los estudios de solubilidad se llevaron a cabo a una temperatura de 25°C a un pH de la solución de 6 ,0. Brevemente, se precipitó la proteína mediante la mezcla de cantidades apropiadas de soluciones patrón tamponadas de la proteína, PEG y el tampón a fin de obtener la concentración deseada de los componentes. Se enrasó el volumen final a 200 j l y se fijó la concentración de la proteína en 1,0 mg/ml. Las soluciones finales se mezclaron bien y se equilibraron durante 16 h. Tras el equilibrado, las soluciones se centrifugaron a 13000 rpm durante 10 min para separar el precipitado de proteína. Se midió la solubilidad de la proteína a 280 nm utilizando Spectra Max Plus384 (Molecular Device) y se obtuvo a partir de la absorbancia del sobrenadante, y se calculó la concentración basándose en la curva patrón de concentración de proteína (figura 4A). Los presentes inventores analizaron además el anticuerpo comercial rituxan utilizando el mismo método experimental bajo 3 condiciones de pH diferentes (figura 4B). Aparentemente la solubilidad de la proteína es dependiente de las condiciones de pH y la solubilidad predicha de Ig-FET será del orden de la de los anticuerpos monoclonales.
Ejemplo 1.7 Estudio farmacocinético de la Ig-FET anti-IL-17/IL-20
Se evaluaron las propiedades farmacocinéticas de Ig-FET1 en ratas Sprague-Dawley (SD) macho. Se administraron proteínas Ig-FET en ratas SD macho a una única dosis intravenosa de 5 mg/kg por una cánula yugular o por vía subcutánea bajo la piel dorsal. Se recogieron muestras de suero en diferentes puntos temporales a lo largo de un periodo de 28 días con muestro en 0, 5, 15 y 30 min, 1,2, 4, 8 y 24 h, y 2, 4, 7, 0, 14, 21 y 28 días mediante sangrado en serie por la vena de la cola, y se analizaron mediante ELISA de captura de IL-17 humana o de IL-20 humana. Brevemente, las placas de ELISA se recubrieron con anticuerpo de cabra antibiotina (5 jg/ml, 4°C, durante la noche), se bloquearon con Superblock (Pierce) y se incubaron con IL-17 humana biotinilada (ELISA de captura de IL-17) o IL 20 (ELISA de captura de IL-20) a razón de 50 ng/ml en TTBS Superblock al 10 % a temperatura ambiente durante 2 h. Las muestras de suero se diluyeron en serie (suero al 0,5 %, Superblock al 10 % en TTBS) y se incubaron en la placa durante 30 min a temperatura ambiente. La detección se llevó a cabo con un anticuerpo de cabra antihumano marcado con HRP y se determinaron las concentraciones con ayuda de curvas patrón utilizando el ajuste logístico de cuatro parámetros. Varios animales, especialmente en el grupo de vía subcutánea, mostraron una caída súbita de las concentraciones de Ig-FET tras el día 10, probablemente debido a que desarrollaron una respuesta antihumana. Estos animales fueron eliminados de los cálculos finales. Los valores de los parámetros farmacocinéticos se determinaron con un modelo no compartimental utilizando el software WinNonlin (Pharsight Corporation, Mountain View, Calif.).
En el estudio FC en ratas, las concentraciones en suero de Ig-FET1 eran muy similares al determinarlas mediante los dos diferentes métodos de ELISA, indicando que la molécula estaba intacta y era capaz de unirse a ambos antígenos in vivo. Tras la administración IV, Ig-FET1 mostró un perfil farmacocinético bifásico, que consistía en una etapa de distribución seguida de una etapa de eliminación, similar al perfil FC de las moléculas de IgG convencionales. Los parámetros farmacocinéticos calculados basándose en los dos métodos analíticos diferentes eran muy similares y se muestran en la Tabla 7. La eliminación de Ig-FET (12 ml/día/kg) era baja, con bajos volúmenes de distribución (Vss~130 ml/kg) que resultaron en una semivida prolongada (T1/2>10 días). Tras la administración subcutánea, la Ig-FET se absorbió lentamente, con concentraciones en suero máximas de aproximadamente 26,9 pg/ml que se alcanzaron 4 días después de la administración de la dosis. La semivida terminal era de aproximadamente 11 días y la biodisponibilidad subcutánea era próxima al 100 %. Tal como demuestran estos resultados, las propiedades de Ig-FET1 eran muy similares a las de una molécula de igG convencional in vivo, indicando un potencial para aplicaciones terapéuticas con regímenes de administración comparables.
El estudio farmacocinético de la Ig-FET demostró un avance radical inesperado en el campo del desarrollo de productos biológicos similares a Ig multiespecíficos. El sistema farmacocinético de la rata se utiliza habitualmente en la industria farmacéutica para la evaluación preclínica de mAb terapéuticos, y predice bien el perfil farmacocinético de los mAb en el ser humano. La prolongada semivida y baja eliminación de la Ig-FET lo dotan de utilidad terapéutica para indicaciones crónicas con administración menos frecuente, de manera similar a un mAb terapéutico. Además, la Ig-FET, al ser 100 kDa más grande que una IgG, aparentemente penetraba eficientemente en los tejidos según el volumen similar a IgG del parámetro de distribución en el estudio FC.
Tabla 7. Análisis farmacocinético de Ig-FET1 en ratas SD
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Ejemplo 1.8 Estudios de desarrollo de línea celular CHO estable de Ig-FET
Se ha observado que la Ig-FET se expresa eficientemente en células 293E transfectadas transitoriamente. Con el fin de determinar adicionalmente la viabilidad de producir Ig-FET, se llevaron a cabo transfecciones estables en las líneas celulares CHO-DG44 y CHO-S y se llevaron a cabo selecciones clonales posteriores, así como un análisis de productividad. Brevemente, se transfectaron células CHO mediante electroporación con 8x106 células en 400 pl de solución de transfección más 20 pg de ADN (para células CHO DG44) o 25 pg de ADN (para células CHO-S) subclonadas en vector pCHO Freedom (Life Technologies). La selección de una línea celular estable se llevó a cabo mediante procedimientos rutinarios. Brevemente, para la selección de CHO-DG44, tras la transfección, se seleccionó un pool estable (-HT/2P/400G, en donde P es pg/ml de puromicina, G es pg/ml de G418) y se analizó la producción de la proteína mediante ELISA de IgG. Se seleccionaron los mejores pools y se continuó con la amplificación en varias rondas de concentración creciente de MTX (50, 100, 200 y 500 nM), seguido del análisis de la producción de proteína mediante ELISA de IgG. A continuación, se seleccionaron los mejores pools para la subclonación. Para la selección de las células CHO-S, se llevó a cabo la selección de la primera fase en medio que contenía 10P/400G/100M (M es nM de MTX), seguido del análisis de la producción de proteína. A continuación, se seleccionaron los mejores pools y se continuó con la segunda fase de selección en 30P/400G/500M o 50P/400G/1000M, seguido de la medición de la producción de proteína mediante ELISA. A continuación, se seleccionaron los mejores pools para la subclonación. Para el análisis de la productividad de proteína, se sembraron los pools celulares totalmente recuperados (viabilidad >90 %) a razón de 5*105 células viables/ml (CHO DG44) o 3*105 células viables/ml (CHO-S) utilizando 30 ml de medio fresco (medio CD FortiCHO™ complementado con L-glutamina 6 mM) en matraces de agitación de 125 ml. Las células se incubaron en una plataforma de agitación a 37°C, con 80 % de humedad relativa, 8 % de CO2 y 130 rpm. Se muestrearon los cultivos diariamente o a intervalos regulares (p. ej., los días 0, 3, 5, 7, 10, 12 y 14) para determinar la densidad celular, la viabilidad y la productividad hasta que la viabilidad del cultivo cayese a menos de 50 % o se alcanzase el día 14 de cultivo. Tras el muestreo, se alimentaron los cultivos con glucosa según se requiriese.
El procedimiento global de desarrollo de la línea celular estable de CHO Ig-FET1 mostró características similares a las del desarrollo de anticuerpos monoclonales en células CHO. Por ejemplo, durante el análisis del pool de DG44 bajo 2P/400G, el VCD continuó incrementándose hasta el día 10-12, hasta aproximadamente 1,3E7, mientras que la viabilidad celular se mantuvo a niveles superiores a 80 % hasta el día 13-14 y la productividad alcanzó prácticamente 40 mg/ml el día 14 (figura 5A). Tras la amplificación a 5P/400G/50M, la productividad alcanzó un valor superior a 50 mg/ml el día 14 (figura 5B). Para la selección de células CHO-S, el título alcanzó un nivel superior a 200 mg/ml durante la selección de la etapa 1 (figura 5C) y superior a 370 mg/ml en la selección de la etapa 2 (figura 5D). Dichos niveles de productividad son similares a los observados anteriormente para el desarrollo de mAb humanos regulares en el laboratorio de los presentes inventores, sugiriendo que las Ig-FET muestran una viabilidad de producción similar a los mAb para las aplicaciones comerciales.
Ejemplo 2: Construcción, expresión y purificación de inmunoglobulinas con Fab en tándem (Ig-FET) anti-CD3/CD20
Con el fin de demostrar que Ig-FET puede unirse a los antígenos de superficie celular, los presentes inventores generaron una molécula de Ig-FET anti-CD3/CD20, Ig-FET7 e Ig-FET8 , que es el constructo de 3 polipéptidos mostrado en la figura 1. El constructo utilizado para generar Ig-FET capaces de unirse a CD3 y CD20 de superficie celular se ilustra en la figura 1B. Brevemente, entre los mAb parentales se incluyen dos anticuerpos de alta afinidad: anti-CD3 (OKT3) y anti-CD20 (ofatumumab). Con el fin de generar el constructo n° 1 de Ig-FET7, se fusionó la VL-CL de OKT3 (Ig-FET7) directamente o mediante un conector de 7 aminoácidos (Ig-FET8 ) con el extremo N-terminal de la cadena pesada de ofatumumab (tal como se muestra en la Tabla 8). El constructo n° 2 era VH-CH1 de OKT3 y el 3° constructo era VL-CL de ofatumumab. Los 3 constructos para Ig-FET se cotransfectaron en células 293, resultando en la expresión y secreción de proteína Ig-FET. Los procedimientos detallados de la clonación por PCR se describen posteriormente.
Tabla 8. Moléculas y constructos de Ig-FET anti-CD3/CD20.
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La Tabla 9 muestras las secuencias de los cebadores de PCR utilizados para la construcción molecular, anteriormente.
Ċ
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Las secuencias finales de la Ig-FET anti-CD3/CD20 se indican en la Tabla 10.
Tabla 10. Secuencias de aminoácidos de Ig-FET anti-CD3/CD20
Figure imgf000047_0001
(continuación)
Figure imgf000048_0001
(continuación)
Figure imgf000049_0001
(continuación)
Figure imgf000050_0001
Ejemplo 2.2 Expresión y purificación de Ig-FET anti-CD3/CD20:
Todos los constructos de ADN de cada Ig-FET se subclonaron en vectores a base de pBOS y se secuenciaron para garantizar la precisión. Los constructos n° 1, n° 2 y n° 3 de cada Ig-FET se coexpresaron transitoriamente utilizando polietilenimina (PEI) en células 293E. Brevemente, ADN en medio de expresión FreeStyle™ 293 se mezcló con la PEI a la concentración final de proporción de ADN a PEI de 1:2, se incubó durante 15 min (no más de 20 min) a temperatura ambiente y después se añadió a las células 293E (1,0-1,2x106/ml, viabilidad celular >95 %) a razón de 60 ^g de ADN/120 ml de cultivo. Tras 6 a 24 horas de cultivo en un agitador, se añadió peptona a las células transfectadas a una concentración final de 5 % bajo agitación a 125 rpm/min a 37°C con 8 % de CO2. El 6°-7° día, se recolectó el sobrenadante mediante centrifugación y filtración y la proteína Ig-FET se purificó mediante cromatografía de proteína A (Pierce, Rockford, IL) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las proteínas se analizaron mediante SDS-PAGE y se determinó su concentración mediante A280 y BCA (Pierce, Rockford, IL) (Tabla 11).
Tabla 11. Expresión y análisis de CET de proteínas Ig-FET anti-CD3/CD20
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Ejemplo 2.3 Actividades de unión de moléculas de Ig-FET anti-CD3/CD20:
La unión de Ig-FET anti-CD3/CD20 a ambas dianas se analizó mediante FACS utilizando células Jurkat que expresan CD3 sobre la superficie celular, así como células Raji, que expresan CD20 sobre la superficie celular. Brevemente, se lavaron 5*105 células en PBS helado y se bloquearon con FBS al 2 % sobre hielo durante 1 h. Las células se incubaron con anticuerpo, Ig-FET (100 nM) o control de isotipo sobre hielo durante 1 h y se lavaron 3 veces con PBS. Se añadió anticuerpo secundario (IgG de cabra antihumano
marcado con Alexa Fluor 488, Invitrogen) y se incubó con células sobre hielo durante 1 h en la oscuridad, seguido del lavado tres veces con PBS. Las muestras se analizaron en FACscalibur. La unión en la superficie celular mostró que tanto Ig-FET7 como Ig-FET8 eran capaces de unirse a ambos antígenos de superficie celular, CD3 y CD20, de una manera dependiente de la concentración. En comparación con las actividades de unión de los mAb parentales, las Ig-FET mostraron una intensidad de unión reducida a CD3 sobre las células Jurkat, aunque una intensidad de unión incrementada a CD20 sobre las células Raji. En todos los estudios de unión, Ig-FET7 e Ig-FET8 mostraron actividades de unión similares a ambos antígenos, indicando que el conector no presentaba ningún impacto significativo sobre su capacidad de unión para Ig-FET8 (Tabla 12).
Tabla 12. Estudios de unión a antígeno en superficie celular de proteínas Ig-FET anti-CD3/CD20
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Ejemplo 3: Construcción, expresión y purificación de inmunoglobulinas con Fab en tándem (Ig-FET) anti-TNF/IL-17
También se generó otra Ig-FET que puede unirse a la IL-17 humana y a TNFa humana (Ig-FET9), utilizando el clon de mAb anti-IL-17 LY y el mAb anti-TNF golimumab, en el constructo de 3 polipéptidos, tal como se muestra en la figura 1. Para generar el constructo n° 1 de Ig-FET9, se fusionó directamente la VL-CL del golimumab con el extremo N-terminal de la cadena pesada de LY (tal como se muestra en la Tabla 13). El constructo n° 2 era VH-CH1 de golimumab y el 3° constructo era VL-CL de LY. Los 3 constructos para Ig-FET9 se cotransfectaron en células 293, resultando en la expresión y secreción de proteínas Ig-FET9. Las secuencias finales de la Ig-FET anti-TNF/IL-17 se indican en la Tabla 14.
Ejemplo 3.1 Clonación molecular de la Ig-FET anti-TNF/IL-17:
El método de clonación molecular es similar al de la Ig-FET anti-hIL-17/hIL-20.
Tabla 13. Moléculas y constructos de Ig-FET anti-TNF/IL-17.
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Tabla 14: secuencias de aminoácidos de moléculas Ig-FET anti-TNF/IL-17
Figure imgf000052_0001
(continuación)
Figure imgf000053_0001
(continuación)
Figure imgf000054_0001
(continuación)
Figure imgf000055_0001
Ejemplo 3.2 Expresión, purificación y análisis de proteínas Ig-FET anti-TNF/IL-17:
Todos los constructos de ADN de cada Ig-FET se subclonaron en vectores a base de pBOS y se secuenciaron para garantizar la precisión. Los constructos n° 1, n° 2 y n° 3 de Ig-FET9 se coexpresaron transitoriamente utilizando polietilenimina (PEI) en células 293E tal como se ha indicado anteriormente y las proteínas Ig-FET9 se purificaron mediante cromatografía de proteína A. El nivel de expresión era de 10 a 23 mg/l. La proteína purificada se sometió a análisis funcional utilizando ensayos celulares para lL-17 (producción de GROa por células Hs27) y TNF (producción de IL- 8 por células L929). La potencia de neutralización de Ig-FET9 contra TNF humana era de l1,6 pM (en comparación con 15,9 pM por golimumab en el mismo experimento), contra IL-17 humana era de 1 2 2 pM (en comparación con 51,5 pM por LY en el mismo experimento). Globalmente, la Ig-FET9 conservó las actividades biológicas de los mAb parentales.
Ejemplo 4: Construcción, expresión y purificación de inmunoglobulinas con Fab en tándem (Ig-FET) anti-CTLA/PD-1
Se generó otro Ig-FET que puede unirse a la CTLA-17 humana y a PD-1 humana (Ig-FET10), utilizando el mAb anti-CTLA-4 ipilimumab y el mAb anti-PD-1 nivolumab, en el constructo de 3 polipéptidos, tal como se muestra en la figura 1. Para generar el constructo n° 1 de Ig-FET10, se fusionó directamente la VL-CL del ipilimumab con el extremo N-terminal de la cadena pesada de nivolumab (tal como se muestra en la Tabla 15). El constructo n° 2 era VH-CH1 de ipilimumab y el 3° constructo era VL-CL de nivolumab. Los 3 constructos para Ig-FET10 se cotransfectaron en células 293, resultando en la expresión y secreción de proteínas Ig-FET10.
Ejemplo 4.1 Clonación molecular de la Ig-FET anti-CTLA-4/PD-1:
El método de clonación molecular es similar al de la Ig-FET anti-hIL-17/hIL-20. Las secuencias finales de la Ig-FET anti-CTLA-4/PD-1 se indican en la Tabla 16.
Tabla 15. Moléculas y constructos de Ig-FET anti-CTLA-4/PD-1.
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Tabla 16. Secuencias de aminoácidos de moléculas Ig-FET anti-CTLA-4/PD-1
Figure imgf000056_0001
(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína de unión que comprende al menos tres cadenas polipeptídicas, en la que la primera cadena polipeptídica comprende, desde el extremo aminoterminal al extremo carboxiloterminal, ya sea (i) v La-CL-VHb-CH1-Fc, en el que CL se fusiona directamente con VHb, o (ii) VHb-CH1-VLa-CL-Fc, en el que CH1 se fusiona directamente con VLa; en el que la segunda cadena polipeptídica comprende, desde el extremo aminoterminal al extremo carboxiloterminal, VHa-CH1, y la tercera cadena polipeptídica comprende, desde el extremo aminoterminal a extremo carboxiloterminal, VLb-CL, en el que VL es un dominio variable de cadena ligera, CL es un dominio constante de cadena ligera, VH es un dominio variable de cadena pesada, CH1 es un primer dominio constante de la cadena pesada, A es un primer epítopo o antígeno, y B es un segundo epítopo o antígeno, en el que A y B son epítopos diferentes del mismo antígeno o antígenos diferentes, y en el que la proteína de unión es capaz de unirse a A y B.
2. La proteína de unión según la reivindicación 1, en la que el Fc es un Fc variante.
3. La proteína de unión según la reivindicación 1, en la que el Fc es el Fc de la IgG1 humana.
4. La proteína de unión según la reivindicación 3, en la que el Fc de la IgG1 humana presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID n° 20.
5. La proteína de unión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la proteína de unión es capaz de unirse a parejas de dianas seleccionadas del grupo que consiste en CD138 y CD20; CD138 y CD40; CD19 y CD20; CD20 y CD3; CD3 y CD33; CD16 y CD33, CD3 y CD133; CD38 & CD138; CD38 y CD20; CD20 y CD22; CD38 y CD40; CD40 y CD20; CD-8 y IL-6; CSPG y RGM A; CTLA-4 y BTN02; IGF1 y IGF2; IGF1/2 y Erb2B; IGF-1R y EGFR; EGFR y CD13; IGF-1R y ErbB3; EGFR-2 y IGFR; VEGFR-2 y Met; VEGF-A y angiopoyetina-2 (Ang-2); IL-12 y TWEAK; IL-13 y IL-lbeta ; MAG y RGM A; NgR y RGM A; NogoA y RGM A; OMGp y RGM A; PDL-1 y CTLA-4; PD-1 y CTLA-4; PD-1 y TIM-3; CD137 y CD20, CD137 y EGFR, CD137 y Her-2, CD137 y PD-1, CD137 y PDL-1, VEGF y PD-L1, Lag-3 y TIM-3, OX40 y PD-1, TIM-3 y PDL-1, EGFR y DLL-4, PDGFR y VEGF, EpCAM y CD3, Her2 y CD3, CD19 y CD3, EGFR y Her3, CD16a y CD30, CD30 y PSMA, EGFR y CD3, CEA y CD3, TROP-2 y HSG, TROP-2 y CD3, VEGF y EGFR, HGF y VEGF, VEGF y VEGF (epítopo igual o diferente), EGFR y cMet, PDGF y VEGF, VEGF y DLL-4, OX40 y PD-L1, ICOS y PD-1, ICOS y PD-L1, Lag-3 y PD-1, Lag-3 y PD-L1, Lag-3 y CTLA-4, ICOS y CTLA-4, CD47 y CD20, RGM A y RGM B; Te38 y TNFa; TNFa y Blys; TNFa y CD-22; TNFa y dominio CTLA-4; TNFa y GP130; TNFa y IL-12p40; TNFa y RANK ligy, IL-1a y IL-1P; IL-12 y IL-18, TNFa y IL-23, TNFa y IL-13; TNF y IL-18; TNF y IL-12; TNF y IL-1P; TNF y MIF; TNF y IL-6, TNF y receptor de IL-6, TNF y IL-17; IL-17 y IL-20; IL-17 y IL-23; TNF y IL-15; TNF y VEGF; VEGFR y EGFR; IL-13 y IL-9; IL-13 y IL-4; IL-13 y IL-5; IL-13 y IL-25; IL-13 y TARC; IL-13 y MDC; IL-13 y MIF; IL-13 y TGF-P; IL-13 y agonista de LHR; IL-13 y CL25; IL-13 y SPRR2a; IL-13 y SPRR2b; IL-13 y ADAM8; y TNFa y PGE4, IL-13 y PED2, TNF y PEG2.
6. La proteína de unión según la reivindicación 1, en la que la proteína de unión es capaz de unirse a uno o más epítopos en CTLA-4 o uno o más epítopos en PD-1.
7. La proteína de unión según la reivindicación 1, en la que la proteína de unión es capaz de unirse a uno o más epítopos en una proteína que participa en actividades de punto de control inmunitario.
8. La proteína de unión según la reivindicación 7, en la que la proteína se selecciona del grupo que consiste en PD-1, CTLA-4, TIM-3, lag3, ICOS, BTLA, CD160, 2B4, KIR, CD137, CD27, OX40, CD40L, A2aR, PD-L1, PD-L2, galectina-9. HVEM, CD48, B7-1, B7-2, ICOSL, B7-H3, B7-H4, CD137L, OX40L, CD70 y CD40.
9. La proteína de unión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la proteína de unión se conjuga con un agente seleccionado del grupo que consiste en una molécula de inmunoadhesión, un agente trazador, un agente terapéutico y un agente citotóxico.
10. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores y uno o más portadores farmacéuticamente aceptables.
11. La proteína de unión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 10 para la utilización en el tratamiento o la prevención de una enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad neurodegenerativa, cáncer o lesión de la médula espinal.
12. La proteína de unión según la reivindicación 5 para su uso en el tratamiento del cáncer, en particular un cáncer de células B, en un sujeto que necesite del mismo, en el que la proteína de unión es capaz de unirse a CD3 y a CD20.
13. La proteína de unión para su uso según la reivindicación 12, en la que el cáncer de células B se selecciona del grupo que consiste en linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin (LNH), leucemia/linfoma linfoblástico de células B precursoras, neoplasmas de células B maduras, leucemia linfocítica crónica de células B/linfoma linfocítico pequeño, leucemia prolinfocítico de células B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de células del manto, linfoma folicular, linfoma de centro folicular cutáneo, linfoma de células B de la zona marginal, leucemia de células pilosas, linfoma de células B grandes difusas, linterna de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de células plasmáticas, trastorno linfoproliferativo postrasplante, macroglobulinemia de Waldenstrom y linfoma de células grandes anaplásicas.
14. La proteína de unión según la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto que necesite del mismo, en el que la proteína de unión es capaz de unirse a CTLA-4 y a PD-1.
15. La proteína de unión para su uso según la reivindicación 14, en la que el cáncer es melanoma, cáncer renal, cáncer de próstata, adenocarcinoma pancreático, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer pulmonar, cáncer esofágico, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer hepático, cáncer ovárico, cáncer de cuello uterino, cáncer de tiroides, glioblastoma, glioma, leucemia, linfoma y otras neoplasias malignas.
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