ES2924362T3 - Oligonucleótidos que comprenden un enlace internucleosídico fosforotritioato - Google Patents

Oligonucleótidos que comprenden un enlace internucleosídico fosforotritioato Download PDF

Info

Publication number
ES2924362T3
ES2924362T3 ES19755294T ES19755294T ES2924362T3 ES 2924362 T3 ES2924362 T3 ES 2924362T3 ES 19755294 T ES19755294 T ES 19755294T ES 19755294 T ES19755294 T ES 19755294T ES 2924362 T3 ES2924362 T3 ES 2924362T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
oligonucleotide
nucleoside
nucleosides
region
anb
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES19755294T
Other languages
English (en)
Inventor
Konrad Bleicher
Troels Koch
Adrian Schaeublin
Joerg Duschmale
Martina Brigitte Duschmale
Meiling Li
Erich Koller
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Innovation Center Copenhagen AS
Original Assignee
Roche Innovation Center Copenhagen AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roche Innovation Center Copenhagen AS filed Critical Roche Innovation Center Copenhagen AS
Application granted granted Critical
Publication of ES2924362T3 publication Critical patent/ES2924362T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

La presente invención se refiere a un oligonucleótido que comprende al menos un enlace internucleósido fosforotritioato de fórmula (I), en la que (A1), (A2) y R son como se definen en la descripción y en la reivindicación. El oligonucleótido de la invención se puede utilizar como medicamento. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Oligonucleótidos que comprenden un enlace intemucleosídico fosforotritioato
La invención se refiere a un oligonucleótido que comprende al menos un enlace intemucleosídico fosforotritioato de fórmula (I)
Figure imgf000002_0001
en la que (A1) es un nucleósido 3', (A2) es un nucleósido 5' y R es hidrógeno.
Los ácidos nucleicos sintéticos cortos muestran un alto potencial como agentes terapéuticos. Desde los primeros estudios de prueba de concepto a finales de la década de 1970, donde se demostró que los desoxinucleótidos no modificados inhibían la producción de virus in vitro (P. C. Zamecnik, M. L. Stephenson, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1978, 75, 280-284), se ha logrado un notable avance por su modificación química. Debido a su sensibilidad hacia la degradación nucleolítica, la estabilización de la cadena principal de fosfodiéster de los ácidos nucleicos fue un obvio punto de partida para la optimización química de los oligonucleótidos terapéuticos. Como consecuencia, se ha examinado una amplia variedad de modificaciones de fosfato, incluyendo fosforotioatos (PS) (documento WO2004/083430 A2 o F. Eckstein, Antisense and Nucleic Acid Drug Development 2009, 10, 117-121), fosforoditioatos (por ejemplo, W. T. Weisler, M. H. Caruthers, J. Org. Chem 1996, 61, 4272-4281), boranofosfatos (por ejemplo, J. S. Summers, B. R. Shaw, Curr. Med. Chem. 2001, 8, 1147-1155), (tio)fosforamidatos (por ejemplo, S. Gryaznov, T. Skorski, C. Cucco, M. Nieborowska-Skorska, C. Y. Chiu, D. Lloyd, J. Chen, M. Koziolkiewicz B. Calabretta, Nucleic Acids Res. 1996, 24, 1508-1514) y metilfosfonatos (por ejemplo, P. S. Sarin, S. Agrawal, M. P. Civeira, J. Goodchild, T. Ikeuchi, P. C. Zamecnik, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1988, 20, 7448-7451). Entre estos análogos de fosfato, de forma cuestionable, la modificación más satisfactoria es el fosforotioato, donde uno de los átomos de oxígeno del fosfato no puente se reemplaza por azufre. Debido a su alta estabilidad hacia las nucleasas y sus beneficios farmacocinéticos, los oligonucleótidos con fosforotioato se han convertido en la primera generación de opciones terapéuticas con oligonucleótidos y han allanado el camino para modificaciones en generaciones posteriores, tales como ácidos nucleicos bloqueados (ANB) o 2'-O-(2-metoxietil)-oligorribonucleótidos (2'-MOE).
Sin embargo, el reemplazo de un enlace fosfodiéster por un fosforotioato crea un centro quiral en el átomo de fósforo. Como consecuencia, todas las opciones terapéuticas con oligonucleótidos aprobadas hasta ahora son mezclas de una gran cantidad de compuestos diastereoisómeros, con propiedades fisicoquímicas potencialmente diferentes (y posiblemente opuestas). Aunque ahora sea posible la síntesis estereoespecífica de únicos oligonucleótidos con fosforotioato estereoquímicamente definido (N. Oka, M. Yamamoto, T. Sato, T. Wada, J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 16031-16037), sigue siendo un problema identificar el estereoisómero con propiedades óptimas dentro del gran número de posibles diastereoisómeros. En este contexto, la reducción de la complejidad diastereoisómera por el uso de enlaces tiofosfato no quirales es de gran interés. Cada enlace (tio)fosfato no quiral introducido en un oligonucleótido da lugar a una reducción de la complejidad en un 50 %. Se han examinado las propiedades de diversos mono-, di- y tritioatos. Entre estos están los novedosos tritioatos simétricos, donde, dentro de un enlace fosfato, tanto los átomos de oxígeno terminales, así como el que está en la posición 5' en el resto de glúcido ribosa del nucleótido precedente, se reemplazan por azufre (enlaces -O-P(S)2-S-).
De forma muy sorprendente, al introducirse en oligonucleótidos, dichos tritioatos simétricos no solo reducen la complejidad diastereoisómera de la mezcla global, sino que también se ha descubierto que dan lugar a moléculas con propiedades terapéuticas mejoradas.
La figura 1 muestra los valores de CI50 para la reducción de Malat-1 en células LTK
En la presente descripción, el término "alquilo", solo o en combinación, significa un grupo alquilo de cadena lineal o de cadena ramificada con de 1 a 8 átomos de carbono, en particular, un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada con de 1 a 6 átomos de carbono y, más en particular, un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada con de 1 a 4 átomos de carbono. Los ejemplos de grupos alquilo C1-C8 de cadena lineal y de cadena ramificada son metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, terc-butilo, los pentilos isómeros, los hexilos isómeros, los heptilos isómeros y los octilos isómeros, en particular, metilo, etilo, propilo, butilo y pentilo. Los ejemplos particulares de alquilo son metilo, etilo y propilo.
El término "cicloalquilo", solo o en combinación, significa un anillo cicloalquilo con de 3 a 8 átomos de carbono y, en particular, un anillo cicloalquilo con de 3 a 6 átomos de carbono. Los ejemplos de cicloalquilo son ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y ciclooctilo, más en particular, ciclopropilo y ciclobutilo. Un ejemplo particular de "cicloalquilo" es ciclopropilo.
El término "alcoxi", solo o en combinación, significa un grupo de fórmula alquil-O-, en la que el término "alquil" tiene el significado dado previamente, tal como metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi, isobutoxi, sec-butoxi y ferc-butoxi. Los "alcoxi" particulares son metoxi y etoxi. Metoxietoxi es un ejemplo particular de "alcoxialcoxi". El término "oxi", solo o en combinación, significa el grupo -O-.
El término "alquenilo", solo o en combinación, significa un residuo de hidrocarburo de cadena lineal o ramificado que comprende un enlace olefínico y hasta 8, preferentemente hasta 6, en particular, preferentemente hasta 4 átomos de carbono. Los ejemplos de grupos alquenilo son etenilo, 1-propenilo, 2-propenilo, isopropenilo, 1- butenilo, 2-butenilo, 3-butenilo e isobutenilo.
El término "alquinilo", solo o en combinación, significa un residuo de hidrocarburo de cadena lineal o ramificado que comprende un triple enlace y hasta 8, en particular, 2 átomos de carbono.
Los términos "halógeno" o "halo", solos o en combinación, significan flúor, cloro, bromo o yodo y, en particular, flúor, cloro o bromo, más en particular, flúor. El término "halo", en combinación con otro grupo, indica la sustitución de dicho grupo con al menos un halógeno, en particular, sustituido con de uno a cinco halógenos, en particular, de uno a cuatro halógenos, es decir, uno, dos, tres o cuatro halógenos.
El término "haloalquilo", solo o en combinación, indica un grupo alquilo sustituido con al menos un halógeno, en particular, sustituido con de uno a cinco halógenos, en particular, de uno a tres halógenos. Los ejemplos de haloalquilo incluyen monofluoro-, difluoro- o trifluoro-metilo, -etilo o -propilo, por ejemplo, 3,3,3-trifluoropropilo, 2- fluoroetilo, 2,2,2-trifluoroetilo, fluorometilo o trifluorometilo. Fluorometilo, difluorometilo y trifluorometilo son "haloalquilos" particulares.
El término "halocicloalquilo", solo o en combinación, indica un grupo cicloalquilo, como se define anteriormente, sustituido con al menos un halógeno, en particular, sustituido con de uno a cinco halógenos, en particular, de uno a tres halógenos. Los ejemplos particulares de "halocicloalquilo" son halociclopropilo, en particular, fluorociclopropilo, difluorociclopropilo y trifluorociclopropilo.
Los términos "hidroxilo" e "hidroxi", solos o en combinación, significan el grupo -OH.
Los términos "tiohidroxilo" y "tiohidroxi", solos o en combinación, significan el grupo -SH.
El término "carbonilo", solo o en combinación, significa el grupo -C(O)-.
El término "carboxi" o "carboxilo", solo o en combinación, significa el grupo -COOH.
El término "amino", solo o en combinación, significa el grupo amino primario (-NH2), el grupo amino secundario (-NH-) o el grupo amino terciario (-N-).
El término "alquilamino", solo o en combinación, significa un grupo amino, como se define anteriormente, sustituido con uno o dos grupos alquilo, como se define anteriormente.
El término "sulfonilo", solo o en combinación, significa el grupo -SO2.
El término "sulfinilo", solo o en combinación, significa el grupo -SO-.
El término "sulfanilo", solo o en combinación, significa el grupo -S -.
El término "ciano", solo o en combinación, significa el grupo -CN.
El término "azido", solo o en combinación, significa el grupo -N3.
El término "nitro", solo o en combinación, significa el grupo NO2.
El término "formilo", solo o en combinación, significa el grupo -C(O)H.
El término "carbamoilo", solo o en combinación, significa el grupo C(O)NH2.
El término "carbamido", solo en combinación, significa el grupo -NH-C(O)-NH2.
El término "arilo", solo o en combinación, indica un sistema de anillo mono- o bicíclico carbocíclico aromático monovalente que comprende de 6 a 10 átomos de anillo de carbono, opcionalmente sustituido con de 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, hidroxilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, alcoxialquilo, alqueniloxi, carboxilo, alcoxicarbonilo, alquilcarbonilo y formilo. Los ejemplos de arilo incluyen fenilo y naftilo, en particular, fenilo.
El término "heteroarilo", solo o en combinación, indica un sistema de anillo mono- o bicíclico heterocíclico aromático monovalente de 5 a 12 átomos de anillo, que comprende 1,2, 3 o 4 heteroátomos seleccionados de N, O y S, siendo los átomos de anillo restantes carbono, opcionalmente sustituido con de 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, hidroxilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, alcoxialquilo, alqueniloxi, carboxilo, alcoxicarbonilo, alquilcarbonilo y formilo. Los ejemplos de heteroarilo incluyen pirrolilo, furanilo, tienilo, imidazolilo, oxazolilo, tiazolilo, triazolilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo, tetrazolilo, piridinilo, piracinilo, pirazolilo, piridacinilo, pirimidinilo, triacinilo, acepinilo, diacepinilo, isoxazolilo, benzofuranilo, isotiazolilo, benzotienilo, indolilo, isoindolilo, isobenzofuranilo, bencimidazolilo, benzoxazolilo, benzoisoxazolilo, benzotiazolilo, benzoisotiazolilo, benzooxadiazolilo, benzotiadiazolilo, benzotriazolilo, purinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, carbazolilo o acridinilo.
El término "heterociclilo", solo o en combinación, significa un sistema de anillo mono- o bicíclico saturado o parcialmente insaturado monovalente de 4 a 12, en particular, de 4 a 9 átomos de anillo, que comprende 1,2, 3 o 4 heteroátomos de anillo seleccionados de N, O y S, siendo los átomos de anillo restantes carbono, opcionalmente sustituido con de 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, hidroxilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, alcoxialquilo, alqueniloxi, carboxilo, alcoxicarbonilo, alquilcarbonilo y formilo. Los ejemplos para heterociclilo saturado monocíclico son acetidinilo, pirrolidinilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidro-tienilo, pirazolidinilo, imidazolidinilo, oxazolidinilo, isoxazolidinilo, tiazolidinilo, piperidinilo, tetrahidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, piperacinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, 1,1-dioxo-tiomorfolin-4-ilo, acepanilo, diacepanilo, homopiperacinilo u oxacepanilo. Los ejemplos para heterocicloalquilo saturado bicíclico son 8-aza-biciclo[3.2.1]octilo, quinuclidinilo, 8-oxa-3-aza-biciclo[3.2.1]octilo, 9-aza-biciclo[3.3.1]nonilo, 3-oxa-9-aza-biciclo[3.3.1]nonilo o 3-tia-9-aza-biciclo[3.3.1]nonilo. Los ejemplos para heterocicloalquilo parcialmente insaturado son dihidrofurilo, imidazolinilo, dihidro-oxazolilo, tetrahidro-piridinilo o dihidropiranilo.
El término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a las sales que retienen la eficacia biológica y propiedades de las bases libres o ácidos libres, que no sean indeseables biológicamente o de otro modo. Las sales se forman con ácidos inorgánicos, tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, en particular, ácido clorhídrico, y ácidos orgánicos, tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido salicílico, N-acetilcisteína. Además, estas sales se pueden preparar a partir de la adición de una base inorgánica o de una base orgánica al ácido libre. Las sales derivadas de una base inorgánica incluyen, pero no se limitan a, las sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio. Las sales derivadas de bases orgánicas incluyen, pero no se limitan a, sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas, incluyendo aminas sustituidas naturales, aminas cíclicas y resinas básicas de intercambio iónico, tales como resinas de isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, etanolamina, lisina, arginina, N-etilpiperidina, piperidina, poliamina. El oligonucleótido de la invención también puede estar presente en forma de iones dipolares. Las sales farmacéuticamente aceptables, en particular, preferentes de la invención son las sales de sodio, litio, potasio y trialquilamonio.
El término "grupo protector", solo o en combinación, significa un grupo que bloquea selectivamente un sitio reactivo en un compuesto multifuncional de modo que se pueda llevar a cabo selectivamente una reacción química en otro sitio reactivo no protegido. Los grupos protectores se pueden retirar. Los grupos protectores ejemplares son grupos protectores de amino, grupos protectores de carboxi o grupos protectores de hidroxi.
"Grupo protector de fosfato" es un grupo protector del grupo fosfato. Los ejemplos de grupos protectores de fosfato son 2-cianoetilo y metilo. Un ejemplo particular de grupo protector de fosfato es 2-cianoetilo.
"Grupo protector de hidroxilo" es un grupo protector del grupo hidroxilo y también se usa para proteger grupos tiol. Los ejemplos de grupos protectores de hidroxilo son acetilo (Ac), benzoílo (Bz), bencilo (Bn), éter p-metoxietoximetílico (MEM), dimetoxitritilo (o bis-(4-metoxifenil)fenilmetilo) (DMT), trimetoxitritilo (o tris-(4-metoxifenil)fenilmetilo) (TMT), éter metoximetílico (MOM), metoxitritilo [(4-metoxifenil)difenilmetilo] (MMT), éter p-metoxibencílico (PMB), éter metiltiometílico, pivaloílo (Piv), tetrahidropiranilo (THP), tetrahidrofurano (THF), tritilo o trifenilmetilo (Tr), éter silílico (por ejemplo, éteres trimetilsilílico (TMS), ferc-butildimetilsilílico (TBDMS), tri-iso-propilsililoximetílico (TOM) y triisopropilsilílico (TIPS)), éteres metílicos y éteres etoxietílicos (EE). Los ejemplos particulares de grupo protector de hidroxilo son DMT y TMT, en particular, DMT.
"Grupo protector de tiohidroxilo" es un grupo protector del grupo tiohidroxilo. Los ejemplos de grupos protectores de tiohidroxilo son los del "grupo protector de hidroxilo".
Si uno de los materiales de partida o compuestos de la invención contiene uno o más grupos funcionales que no sean estables o sean reactivos en las condiciones de reacción de una o más etapas de reacción, se pueden introducir grupos protectores apropiados (como se describe, por ejemplo, en "Protective Groups in Organic Chemistry" por T. W. Greene y P. G. M. Wuts, 3.a ed., 1999, Wiley, New York) antes de la etapa crítica aplicando procedimientos bien conocidos en la técnica. Dichos grupos protectores se pueden retirar en una fase posterior de la síntesis usando procedimientos estándar descritos en la literatura. Los ejemplos de grupos protectores son ferc-butoxicarbonilo (Boc), carbamato de 9-fluorenilmetilo (Fmoc), carbamato de 2-trimetilsililetilo (Teoc), carbobenciloxi (Cbz) y p-metoxibenciloxicarbonilo (Moz).
Los compuestos descritos en el presente documento pueden contener varios centros asimétricos y pueden estar presentes en forma de enantiómeros ópticamente puros, mezclas de enantiómeros, tales como, por ejemplo, racematos, mezclas de diastereoisómeros, racematos diastereoisómeros o mezclas de racematos diastereoisómeros.
Oligonucleótido
El término "oligonucleótido" como se usa en el presente documento se define como se entiende, en general, por el experto en la técnica como una molécula que comprende dos o más nucleósidos enlazados de forma covalente. Dichos nucleósidos unidos de forma covalente también se pueden denominar moléculas de ácido nucleico u oligómeros. Los oligonucleótidos se preparan comúnmente en el laboratorio por síntesis química en fase sólida seguido de purificación. Al hacer referencia a una secuencia del oligonucleótido, se hace referencia a la secuencia u orden de los restos de nucleobase, o modificaciones de los mismos, de los nucleótidos o nucleósidos enlazados de forma covalente. El oligonucleótido de la invención es artificial, y está sintetizado químicamente y típicamente está purificado o aislado. El oligonucleótido de la invención puede comprender uno o más nucleósidos o nucleótidos modificados.
Oligonucleótidos antisentido
El término "oligonucleótido antisentido" como se usa en el presente documento se define como oligonucleótidos que pueden modular la expresión de un gen diana hibridándose a un ácido nucleico diana, en particular, a una secuencia contigua en un ácido nucleico diana. Los oligonucleótidos antisentido no son esencialmente bicatenarios y, por lo tanto, no son ARNip o ARNhc. Preferentemente, los oligonucleótidos antisentido de la presente invención son monocatenarios. Se entiende que los oligonucleótidos monocatenarios de la presente invención pueden formar horquillas o estructuras dúplex intermoleculares (dúplex entre dos moléculas del mismo oligonucleótido), siempre que el grado de intra- o interautocomplementariedad sea menor de un 50 % por toda la longitud completa del oligonucleótido
Secuencia de nucleótidos contiguos
El término "secuencia de nucleótidos contigua" se refiere a la región del oligonucleótido que es complementaria al ácido nucleico diana. El término se usa de manera intercambiable en el presente documento con el término "secuencia de nucleobases contigua" y el término "secuencia de motivos de oligonucleótido". En algunos modos de realización, todos los nucleótidos del oligonucleótido constituyen la secuencia de nucleótidos contigua. En algunos modos de realización, el oligonucleótido comprende la secuencia de nucleótidos contigua, tal como una región de gápmero F-G-F', y puede comprender opcionalmente otro(s) nucleótido(s), por ejemplo, una región conectora de nucleótidos que se puede usar para fijar un grupo funcional a la secuencia de nucleótidos contigua. La región conectora de nucleótidos puede ser complementaria o no al ácido nucleico diana.
Nucleótidos
Los nucleótidos son los bloques de construcción de oligonucleótidos y polinucleótidos, y, para los propósitos de la presente invención, incluyen nucleótidos tanto naturales como no naturales. En la naturaleza, los nucleótidos, tales como los nucleótidos de ADN y ARN, comprenden un resto de glúcido ribosa, un resto de nucleobase y uno o más grupos fosfato (que están ausentes en los nucleósidos). Los nucleósidos y nucleótidos también se pueden denominar de manera intercambiable "unidades" o "monómeros".
Nucleósido modificado
El término "nucleósido modificado" o "modificación de nucleósido" como se usa en el presente documento se refiere a nucleósidos modificados en comparación con el nucleósido de ADN o ARN equivalente por la introducción de una o más modificaciones del resto de glúcido o del resto de (nucleo)base. En un modo de realización preferente, el nucleósido modificado comprende un resto de glúcido modificado. El término nucleósido modificado también se puede usar en el presente documento de manera intercambiable con el término "análogo de nucleósido" o "unidades" modificadas o "monómeros" modificados. Los nucleósidos con un resto de glúcido de ADN o ARN no modificado se denominan en el presente documento nucleósidos de ADN o ARN. Los nucleósidos con modificaciones en la región de base del nucleósido de ADN o ARN todavía se denominan, en general, ADN o ARN si permiten el emparejamiento de bases de Watson-Crick.
Enlace intemucleosídico modificado
El término "enlace internucleosídico modificado" se define como se entiende, en general, por el experto en la técnica como enlaces distintos de enlaces fosfodiéster (PO), que acopla de forma covalente dos nucleósidos entre sí. Por lo tanto, los oligonucleótidos de la invención pueden comprender enlaces internucleosídicos modificados. En algunos modos de realización, el enlace internucleosídico modificado incrementa la resistencia a nucleasa del oligonucleótido en comparación con un enlace fosfodiéster. Para los oligonucleótidos naturales, el enlace internucleosídico incluye grupos fosfato que crean un enlace fosfodiéster entre nucleósidos adyacentes. Los enlaces internucleosídicos modificados, en particular, son útiles para estabilizar oligonucleótidos para su uso in vivo y pueden servir para proteger frente a la escisión por nucleasa en regiones de nucleósidos de ADN o ARN en el oligonucleótido de la invención, por ejemplo, dentro de la región de hueco de un oligonucleótido gápmero, así como en regiones de nucleósidos modificados, tales como la región F y F'.
En un modo de realización, el oligonucleótido comprende uno o más enlaces internucleosídicos modificados a partir del fosfodiéster natural, tales como uno o más enlaces internucleosídicos modificados que sean, por ejemplo, más resistentes al ataque de nucleasa. La resistencia a nucleasa se puede determinar incubando el oligonucleótido en suero sanguíneo o usando un ensayo de resistencia a nucleasa (por ejemplo, fosfodiesterasa de veneno de serpiente (SVPD)), ambos son bien conocidos en la técnica. Los enlaces internucleosídicos que pueden potenciar la resistencia a nucleasa de un oligonucleótido se denominan enlaces internucleosídicos resistentes a nucleasa. En algunos modos de realización, al menos un 50 % de los enlaces internucleosídicos en el oligonucleótido, o secuencia de nucleótidos contigua del mismo, están modificados, tal como al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, tal como al menos un 80 o tal como al menos un 90 % de los enlaces internucleosídicos en el oligonucleótido, o secuencia de nucleótidos contigua del mismo, son enlaces internucleosídicos resistentes a nucleasa. En algunos modos de realización, todos los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido, o secuencia de nucleótidos contigua del mismo, son enlaces internucleosídicos resistentes a nucleasa. Se reconocerá que, en algunos modos de realización, los nucleósidos que enlazan el oligonucleótido de la invención a un grupo funcional no nucleotídico, tal como un conjugado, pueden ser fosfodiéster.
Un enlace internucleosídico modificado preferente para su uso en el oligonucleótido de la invención es fosforotioato.
Los enlaces internucleosídicos fosforotioato, en particular, son útiles debido a la resistencia a nucleasa, la farmacocinética beneficiosa y la facilidad de preparación. En algunos modos de realización, al menos un 50 % de los enlaces internucleosídicos en el oligonucleótido, o secuencia de nucleótidos contigua del mismo, son fosforotioato, tal como al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, tal como al menos un 80 % o tal como al menos un 90 % de los enlaces internucleosídicos en el oligonucleótido, o secuencia de nucleótidos contigua del mismo, son fosforotioato. En algunos modos de realización, además de los enlaces internucleosídicos fosforotritioato, todos los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido, o secuencia de nucleótidos contigua del mismo, son fosforotioato. En algunos modos de realización, el oligonucleótido de la invención comprende tanto enlaces internucleosídicos fosforotioato como al menos un enlace fosfodiéster, tal como 2, 3 o 4 enlaces fosfodiéster, además del/de los enlace(s) fosforotritioato. En un oligonucleótido gápmero, los enlaces fosfodiéster, cuando están presentes, no se localizan adecuadamente entre nucleósidos de ADN contiguos en la región de hueco G.
Los enlaces resistentes a nucleasa, tales como enlaces fosforotioato, en particular, son útiles en las regiones de oligonucleótido que pueden reclutar nucleasa al formar un dúplex con el ácido nucleico diana, tal como la región G para los gápmeros. Sin embargo, los enlaces fosforotioato también pueden ser útiles en regiones no reclutadoras de nucleasa y/o regiones potenciadoras de la afinidad, tales como las regiones F y F' para los gápmeros. Los oligonucleótidos gápmero, en algunos modos de realización, pueden comprender uno o más enlaces fosfodiéster en la región F o F', o ambas regiones F y F', pudiendo ser el enlace internucleosídico en la región G completamente fosforotioato.
De forma ventajosa, todos los enlaces internucleosídicos en la secuencia de nucleótidos contigua del oligonucleótido, o todos los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido, son enlaces fosforotioato.
Se reconoce, como se divulga en el documento EP 2 742 135, que los oligonucleótidos antisentido pueden comprender otros enlaces internucleosídicos (distintos de fosfodiéster y fosforotioato), por ejemplo, internucleósidos de alquilfosfonato/metilfosfonato, que, de acuerdo con el documento EP 2742 135, por ejemplo, de otro modo se pueden tolerar en una región de hueco de fosforotioato en ADN.
Enlaces fosforotioato estereoaleatorios
Los enlaces fosforotioato son enlaces fosfato internucleosídicos donde uno de los oxígenos no puente se ha sustituido con un azufre. La sustitución de uno de los oxígenos no puente con un azufre introduce un centro quiral y, como tal, dentro de un único oligonucleótido con fosforotioato, cada enlace intemucleosídico fosforotioato estará en las estereoisoformas S (Sp) o bien R (Rp). Dichos enlaces intemucleosídicos se denominan "enlaces intemucleosídicos quirales". En comparación, los enlaces internucleosídicos fosfodiéster son no quirales, ya que tienen dos átomos de oxígeno no terminales.
La designación de la quiralidad de un estereocentro está determinada por las reglas de Cahn-Ingold-Prelog estándar (reglas de prioridad CIP) publicadas por primera vez en Cahn, R.S.; Ingold, C.K.; Prelog, V. (1966) "Specification of Molecular Chirality" Angewandte Chemie International Edition 5 (4): 385-415. doi: 10.1002/anie.196603851.
Durante la síntesis de oligonucleótidos estándar, la estereoselectividad del acoplamiento y la siguiente sulfuración no se controlan. Por este motivo, la estereoquímica de cada enlace internucleosídico fosforotioato es aleatoriamente Sp o Rp y, como tal, un oligonucleótido con fosforotioato producido por síntesis de oligonucleótidos tradicional, en realidad, puede existir en hasta 2X diastereoisómeros de fosforotioato diferentes, donde X es el número de enlaces internucleosídicos fosforotioato. Dichos oligonucleótidos se denominan oligonucleótidos con fosforotioato estereoaleatorio en el presente documento, y no contienen ningún enlace internucleosídico estereodefinido. Por lo tanto, los oligonucleótidos con fosforotioato estereoaleatorio son mezclas de diastereoisómeros individuales que se originan a partir de la síntesis no estereodefinida. En este contexto, la mezcla se define como hasta 2X diastereoisómeros de fosforotioato diferentes.
Enlaces internucleosídicos estereodefinidos
Un enlace internucleosídico estereodefinido es un enlace internucleosídico quiral que tiene un exceso diastereoisómero para una de sus dos formas diaestereómeras, Rp o Sp.
Se debe reconocer que los procedimientos de síntesis de oligonucleótidos estereoselectivos usados en la técnica típicamente proporcionan al menos aproximadamente un 90 % o al menos aproximadamente un 95 % de diastereoselectividad en cada enlace internucleosídico quiral y, como tal, hasta aproximadamente un 10 %, tal como aproximadamente un 5 % de moléculas de oligonucleótido pueden tener la forma diastereoisómera alternativa.
En algunos modos de realización, la proporción diastereoisómera de cada enlace internucleosídico quiral estereodefinido es al menos aproximadamente 90:10. En algunos modos de realización, la proporción diastereoisómera de cada enlace internucleosídico quiral es al menos aproximadamente 95:5.
El enlace fosforotioato estereodefinido es un ejemplo particular de enlace internucleosídico estereodefinido.
Enlace fosforotioato estereodefinido
Un enlace fosforotioato estereodefinido es un enlace fosforotioato que tiene un exceso diaestereómero para una de sus dos formas diastereoisómeras, Rp o Sp.
Las configuraciones Rp y Sp de los enlaces internucleosídicos fosforotioato se presentan a continuación.
Figure imgf000007_0001
Donde el grupo R 3' representa la posición 3' del nucleósido adyacente (un nucleósido 5'), y el grupo R 5' representa la posición 5' del nucleósido adyacente (un nucleósido 3').
Los enlaces internucleosídicos Rp también se pueden representar como srP, y los enlaces internucleosídicos Sp se pueden representar como ssP en el presente documento.
En un modo de realización particular, la proporción diaestereómera de cada enlace fosforotioato estereodefinido es al menos aproximadamente 90:10 o al menos 95:5.
En algunos modos de realización, la proporción diaestereómera de cada enlace fosforotioato estereodefinido es al menos aproximadamente 97:3. En algunos modos de realización, la proporción diaestereómera de cada enlace fosforotioato estereodefinido es al menos aproximadamente 98:2. En algunos modos de realización, la proporción diaestereómera de cada enlace fosforotioato estereodefinido es al menos aproximadamente 99:1.
En algunos modos de realización, un enlace internucleosídico estereodefinido está en la misma forma diaestereómera (Rp o Sp) en al menos un 97 %, tal como al menos un 98 %, tal como al menos un 99 %, o (esencialmente) todas las moléculas de oligonucleótido presentes en una población de la molécula de oligonucleótido.
La pureza diaestereómera se puede medir en un sistema modelo que solo tenga una cadena principal aquiral (es decir, fosfodiésteres). Es posible medir la pureza diastereómera de cada monómero, por ejemplo, acoplando un monómero que tenga un enlace internucleosídico estereodefinido al siguiente sistema modelo "5' t-po-t-po-t-po 3"'. A continuación, el resultado de esto dará: 5' DMTr-t-srp-t-po-t-po-t-po 3' o 5' DMTr-t-ssp-t-po-t-po-t-po 3', que se pueden separar usando HPLC. La pureza diaestereómera se determina integrando la señal UV de los dos posibles diastereoisómeros y dando una proporción de estos, por ejemplo, 98:2, 99:1 o >99:1.
Se entenderá que la pureza diaestereómera de un único diastereoisómero específico (una única molécula de oligonucleótido estereodefinido) será una función de la selectividad de acoplamiento para el estereocentro definido en cada posición internucleosídica, y el número de enlaces internucleosídicos estereodefinidos que se van a introducir. A modo de ejemplo, si la selectividad de acoplamiento en cada posición es de un 97 %, la pureza resultante del oligonucleótido estereodefinido con 15 enlaces internucleosídicos estereodefinidos será de 0,9715, es decir un 63 % del diastereoisómero deseado en comparación con un 37 % de los demás diastereoisómeros. La pureza del diastereoisómero definido se puede mejorar después de la síntesis por purificación, por ejemplo, por HPLC, tal como cromatografía de intercambio iónico o cromatografía de fase inversa.
En algunos modos de realización, un oligonucleótido estereodefinido se refiere a una población de un oligonucleótido en la que al menos aproximadamente un 40 %, tal como al menos aproximadamente un 50 % de la población, es del diastereoisómero deseado.
Dicho de forma alternativa, en algunos modos de realización, un oligonucleótido estereodefinido se refiere a una población de oligonucleótidos en la que al menos aproximadamente un 40 %, tal como al menos aproximadamente un 50 %, de la población consiste en los motivos de enlace internucleosídico estereodefinido (específico) deseados (también denominados motivos estereodefinidos).
Para los oligonucleótidos estereodefinidos que comprendan centros quirales internucleosídicos tanto estereoaleatorios como estereodefinidos, la pureza del oligonucleótido estereodefinido se determina con referencia al % de la población del oligonucleótido que retiene el/los motivo(s) de enlace internucleosídico estereodefinido deseados, descartándose los enlaces estereoaleatorios en el cálculo.
Nucleobase
El término nucleobase incluye los restos purina (por ejemplo, adenina y guanina) y pirimidina (por ejemplo, uracilo, timina y citosina) presentes en nucleósidos y nucleótidos que forman enlaces de hidrógeno en la hibridación de ácidos nucleicos. En el contexto de la presente invención, el término nucleobase también engloba nucleobases modificadas que pueden diferir de las nucleobases naturales, pero que son funcionales durante la hibridación de ácidos nucleicos. En este contexto, "nucleobase" se refiere tanto a las nucleobases naturales, tales como adenina, guanina, citosina, timidina, uracilo, xantina e hipoxantina, así como a las variantes no naturales. Dichas variantes se describen, por ejemplo, en Hirao et al. (2012) Accounts of Chemical Research vol. 45, página 2055, y Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 371.4.1.
En algunos modos de realización, el resto de nucleobase se modifica cambiando la purina o pirimidina por una purina o pirimidina modificada, tal como purina sustituida o pirimidina sustituida, tal como una nucleobase seleccionada de isocitosina, pseudoisocitosina, 5-metil-citosina, 5-tiozolo-citosina, 5-propinil-citosina, 5- propinil-uracilo, 5-bromouracilo, 5-tiazolo-uracilo, 2-tio-uracilo, 2'tio-timina, inosina, diaminopurina, 6- aminopurina, 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina y 2-cloro-6-aminopurina.
Los restos de nucleobase se pueden indicar por el código de letras para cada nucleobase correspondiente, por ejemplo, A, T, G, C o U, en el que cada letra puede incluir opcionalmente nucleobases modificadas de función equivalente. Por ejemplo, en los oligonucleótidos ejemplificados, los restos de nucleobase se seleccionan de A, T, G, C y 5-metil-citosina. Opcionalmente, para los gápmeros de ANB, se pueden usar nucleósidos de ANB de 5-metil-citosina.
Oligonucleótido modificado
El término oligonucleótido modificado describe un oligonucleótido que comprende uno o más nucleósidos modificados en glúcido y/o enlaces internucleosídicos modificados. El término oligonucleótido "quimérico" es un término que se ha usado en la literatura para describir oligonucleótidos con nucleósidos modificados.
Oligonucleótido estereodefinido
Un oligonucleótido estereodefinido es un oligonucleótido en el que al menos uno de los enlaces intemudeosídico es un enlace internucleosídico estereodefinido.
Un oligonucleótido con fosforotioato estereodefinido es un oligonucleótido en el que al menos uno de los enlaces internucleosídicos es un enlace internucleosídico fosforotioato estereodefinido.
Complementariedad
El término "complementariedad" describe la capacidad de someterse a emparejamiento de bases de Watson-Crick de los nucleósidos/nucleótidos. Los pares de bases de Watson-Crick son guanina (G)-citosina (C) y adenina (A)-timina (T)/uracilo (U). Se entenderá que los oligonucleótidos pueden comprender nucleósidos con nucleobases modificadas, por ejemplo, a menudo se usa 5-metil-citosina en lugar de citosina y, como tal, el término complementariedad engloba el emparejamiento de bases de Watson-Crick entre nucleobases modificadas y no modificadas (véanse, por ejemplo, Hirao et al. (2012) Accounts of Chemical Research vol. 45, página 2055, y Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 371.4.1).
El término "% complementario" como se usa en el presente documento se refiere a la proporción de nucleótidos en una secuencia de nucleótidos contigua en una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un oligonucleótido) que, en una posición dada, son complementarios a (es decir, forman pares de bases de Watson-Crick con) una secuencia de nucleótidos contigua, en una posición dada de una molécula de ácido nucleico separada (por ejemplo, el ácido nucleico diana). El porcentaje se calcula contando el número de bases alineadas que forman pares entre las dos secuencias (al alinearse con la secuencia diana 5'-3' y la secuencia de oligonucleótidos 3'-5'), dividiendo por el número total de nucleótidos en el oligonucleótido y multiplicando por 100. En una comparación de este tipo, una nucleobase/nucleótido que no se alinea (forma un par de bases) se denomina emparejamiento erróneo. Preferentemente, no se permiten inserciones ni deleciones en el cálculo del % de complementariedad de una secuencia de nucleótidos contigua.
El término "completamente complementario" se refiere a un 100 % de complementariedad.
Identidad
El término "identidad" como se usa en el presente documento se refiere al número de nucleótidos en porcentaje de una secuencia de nucleótidos contigua en una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, oligonucleótido) que, en una posición dada, son idénticos a (es decir en su capacidad para formar pares de bases de Watson-Crick con el nucleósido complementario) una secuencia de nucleótidos contigua, en una posición dada de una molécula de ácido nucleico separada (por ejemplo, el ácido nucleico diana). El porcentaje se calcula contando el número de bases alineadas que sean idénticas entre las dos secuencias dividiendo por el número total de nucleótidos del oligonucleótido y multiplicándolo por 100. Identidad en porcentaje = (emparejamientos x 100)/longitud de la región alineada. Preferentemente, no se permiten inserciones ni deleciones en el cálculo del % de complementariedad de una secuencia de nucleótidos contigua.
Hibridación
El término "que se hibrida" o "se hibrida" como se usa en el presente documento se ha de entender como dos hebras de ácido nucleico (por ejemplo, un oligonucleótido y un ácido nucleico diana) que forman enlaces de hidrógeno entre pares de bases en hebras opuestas formando, de este modo, un dúplex. La afinidad de la unión entre dos hebras de ácido nucleico es la fuerza de la hibridación. A menudo se describe en términos de la temperatura de fusión (Tf) definida como la temperatura a la que la mitad de los oligonucleótidos se duplican con el ácido nucleico diana. En condiciones fisiológicas, Tf no es estrictamente proporcional a la afinidad (Mergny y Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13:515-537). La energía libre de Gibbs AG° en estado estándar es una representación más exacta de la afinidad de unión y está relacionada con la constante de disociación (Kd) de la reacción por AG°=-RTln(Kd), donde R es la constante de los gases y T es la temperatura absoluta. Por lo tanto, una AG° muy baja de la reacción entre un oligonucleótido y el ácido nucleico diana refleja una fuerte hibridación entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana. AG° es la energía asociada con una reacción donde las concentraciones acuosas son 1 M, el pH es 7 y la temperatura es de 37 °C. La hibridación de oligonucleótidos a un ácido nucleico diana es una reacción espontánea y para las reacciones espontáneas AG° es menor de cero. AG° se puede medir experimentalmente, por ejemplo, por el uso del procedimiento de calorimetría de valoración isotérmica (ITC) como se describe en Hansen et al., 1965, Chem. Comm. 36-38 y Holdgate et al., 2005, Drug Discov Today. El experto en la técnica sabrá que están disponibles equipos comerciales para las mediciones de AG°. AG° también se puede estimar numéricamente usando el modelo de vecino más cercano como se describe por SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465 usando parámetros termodinámicos derivados apropiadamente descritos por Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216 y McTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405. Para tener la posibilidad de modular su ácido nucleico diana pretendido por hibridación, los oligonucleótidos de la presente invención se hibridan a un ácido nucleico diana con valores de AG° estimados por debajo de -10 kcal para los oligonucleótidos que tengan una longitud de 10-30 nucleótidos. En algunos modos de realización, el grado o fuerza de hibridación se mide por la energía libre de Gibbs AG° en estado estándar. Los oligonucleótidos se pueden hibridar a un ácido nucleico diana con valores de AG° estimados por debajo del intervalo de -10 kcal, tal como por debajo de -15 kcal, tal como por debajo de -20 kcal y tal como por debajo de -25 kcal para oligonucleótidos que tengan una longitud de 8-30 nucleótidos. En algunos modos de realización, los oligonucleótidos se hibridan a un ácido nucleico diana con un valor de AG° estimado de -10 a -60 kcal, tal como de -12 a -40, tal como de -15 a -30 kcal o de -16 a -27 kcal, tal como de -18 a -25 kcal.
Modificaciones de glúcido
El oligómero de la invención puede comprender uno o más nucleósidos que tengan un resto de glúcido modificado, es decir, una modificación del resto de glúcido en comparación con el resto de glúcido ribosa encontrado en el ADN y ARN.
Se han preparado numerosos nucleósidos con modificación del resto de glúcido ribosa, principalmente con el objetivo de mejorar determinadas propiedades de los oligonucleótidos, tales como la afinidad y/o la resistencia a nucleasa.
Dichas modificaciones incluyen aquellas donde se modifica la estructura de anillo de ribosa, por ejemplo, por reemplazo por un anillo de hexosa (ANH), o un anillo bicíclico, que típicamente tenga un puente birradical entre los carbonos C2 y C4 en el anillo de ribosa (ANB), o un anillo de ribosa no enlazado que típicamente carezca de un enlace entre los carbonos C2 y C3 (por ejemplo, ANNB). Otros nucleósidos modificados en glúcido incluyen, por ejemplo, ácidos nucleicos de biciclohexosa (documento WO 2011/017521) o ácidos nucleicos tricíclicos (documento WO 2013/154798). Los nucleósidos modificados también incluyen nucleósidos donde el resto de glúcido se reemplaza por un resto distinto de glúcido, por ejemplo, en el caso de los ácidos peptidonucleicos (APN) o los ácidos morfolinonucleicos.
Las modificaciones de glúcido también incluyen modificaciones realizadas por medio de alteración de los grupos sustituyentes en el anillo de ribosa con respecto a grupos distintos de hidrógeno, o el grupo 2'-OH encontrado naturalmente en los nucleósidos de ADN y ARN. Los sustituyentes, por ejemplo, se pueden introducir en las posiciones 2', 3', 4' o 5'.
Nucleósidos modificados en glúcido en 2'
Un nucleósido modificado en glúcido en 2' es un nucleósido que tiene un sustituyente distinto de H u -OH en la posición 2' (nucleósido sustituido en 2') o comprende un birradical enlazado en 2' que puede formar un puente entre el carbono 2' y un segundo carbono en el anillo de ribosa, tal como nucleósidos (con puente birradical entre 2'-4') de ANB.
De hecho, se ha prestado mucha atención al desarrollo de nucleósidos sustituidos en 2', y se ha descubierto que numerosos nucleósidos sustituidos en 2' tienen propiedades beneficiosas al incorporarse en los oligonucleótidos. Por ejemplo, el glúcido modificado en 2' puede proporcionar una afinidad de unión potenciada y/o resistencia a nucleasa incrementada al oligonucleótido. Los ejemplos de nucleósidos modificados sustituidos en 2' son los nucleósidos 2'-O-alquil-ARN, 2'-O-metil-ARN, 2'-alcoxi-ARN, 2'-O-metoxietil-ARN (MOE), 2'-amino-ADN, 2'-fluoro-ARN y 2 '-F-Aa N. Se pueden encontrar otros ejemplos, por ejemplo, en Freier y Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 y Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213 y Deleavey y Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937. A continuación, hay ilustraciones de algunos nucleósidos modificados sustituidos en 2'.
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000011_0001
En relación con la presente invención, sustituido en 2' no incluye moléculas con puente en 2' como ANB.
Nucleósidos de ácido nucleico bloqueado (nucleósidos de ANB)
Un "nucleósido de ANB" es un nucleósido modificado en 2' que comprende un birradical que enlaza los C2' y C4' del anillo de glúcido ribosa de dicho nucleósido (también denominado "puente entre 2'-NH2 restringe o bloquea la conformación del anillo de ribosa. Estos nucleósidos también se denominan ácido nucleico con puente o ácido nucleico bicíclico (BNA) en la literatura. El bloqueo de la conformación de la ribosa se asocia con una afinidad de hibridación potenciada (estabilización de dúplex) cuando el ANB se incorpora en un oligonucleótido para una molécula de ARN o ADN complementaria. Esto se puede determinar de forma rutinaria midiendo la temperatura de fusión del dúplex oligonucleótido/complemento.
Se divulgan nucleósidos de ANB ejemplares no limitantes en los documentos WO 99/014226, WO 00/66604, WO 98/039352, WO 2004/046160, WO 00/047599, WO 2007/134181, WO 2010/077578, WO 2010/036698, WO 2007/090071, WO 2009/006478, WO 2011/156202, WO 2008/154401, WO 2009/067647, WO 2008/150729, Morita et al., Bioorganic & Med. Chem. Lett. 12, 73-76, Seth et al. J. Org. Chem. 2010, vol. 75(5) pp. 1569-81 y Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238.
El puente entre 2'-4' comprende de 2 a 4 átomos puente y, en particular, es de fórmula -X-Y-, estando X enlazado a C4' e Y enlazado a C2',
en la que
X es oxígeno, azufre, -CRaRb-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(=CRa Rb)-, -C(Ra)=N-, -Si(Ra)2-, -SO2-, -NRa-; -O-NRa-, -NRa-O-, -C(=J)-, Se, -O-NRa-, -NRa-CRaRb-, -N(Ra)-O- u -O-CRaRb-;
Y es oxígeno, azufre, -(CRaRb)n-, -CRaRb-O-CRaRb-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -Si(Ra)2-, -SO2-, -NRa-, -C(=J)-, Se, -O-NRa-, -NRa-CRaRb-, -N(Ra)-O- u -O-CRaRb-;
con la condición de que -X-Y- no sea -O-O-, Si(Ra)2-Si(Ra)2-, -SO2-SO2-, -C(Ra)=C(Rb)-C(Ra)=C(Rb), -C(Ra)=N-C(Ra)=N-, -C(Ra)=N-C(Ra)=C(Rb), -C(Ra)=C(Rb)-C(Ra)=N- o -Se-Se-;
J es oxígeno, azufre, =CH2 o =N(Ra);
Ra y Rb se seleccionan independientemente de hidrógeno, halógeno, hidroxilo, ciano, tiohidroxilo, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, alcoxialquilo, alqueniloxi, carboxilo, alcoxicarbonilo, alquilcarbonilo, formilo, arilo, heterociclilo, amino, alquilamino, carbamoilo, alquilaminocarbonilo, aminoalquilaminocarbonilo, alquilaminoalquilaminocarbonilo, alquilcarbonilamino, carbamido, alcanoiloxi, sulfonilo, alquilsulfoniloxi, nitro, azido, tiohidroxilsulfuro, alquilsulfanilo, ariloxicarbonilo, ariloxi, arilcarbonilo, heteroarilo, heteroariloxicarbonilo, heteroariloxi, heteroarilcarbonilo, -OC(=Xa)Rc, -OC(=Xa)NRcRd y -NReC(=Xa)NRcRd ;
o dos Ra y Rb geminales forman conjuntamente metileno opcionalmente sustituido;
o dos Ra y Rb geminales, conjuntamente con el átomo de carbono al que están fijados, forman cicloalquilo o halocicloalquilo, con solo un átomo de carbono de -X-Y-;
en los que alquilo sustituido, alquenilo sustituido, alquinilo sustituido, alcoxi sustituido y metileno sustituido son alquilo, alquenilo, alquinilo y metileno sustituidos con de 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, hidroxilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, alcoxialquilo, alqueniloxi, carboxilo, alcoxicarbonilo, alquilcarbonilo, formilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo;
Xa es oxígeno, azufre o -NRc;
Rc , Rd y Re se seleccionan independientemente de hidrógeno y alquilo; y
n es 1, 2 o 3.
En otro modo de realización particular de la invención, X es oxígeno, azufre, -NRa-, -CRaRb- o -C(=CRaRb)-, en particular, oxígeno, azufre, -NH-, -CH2- o -C(=CH2)-, más en particular, oxígeno.
En otro modo de realización particular de la invención, Y es -CRaRb-, -CRaRb-CRaRb- o -CRaRb' CRaRb' CRaRb-, en particular, -CH2-CHCH3-, -CHCH3-CH2-, -CH2-CH2- o -CH2-CH2-CH2-.
En un modo de realización particular de la invención, -X-Y- es -O-(CRaRb)n-, -S-CRaRb-, -N(Ra)CRaRb-, -CRaRb-CRaRb-, -O-CRaRb-O-CRaRb-, -CRaRb-O-CRaRb-, -C(=CRaRb)-CRaRb-, -N(Ra)CRa Rb-, -O-N(Ra)-CRa Rb- o -N(Ra)-O-CRaRb-.
En un modo de realización particular de la invención, Ra y Rb se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, hidroxilo, alquilo y alcoxialquilo, en particular, hidrógeno, halógeno, alquilo y alcoxialquilo.
En otro modo de realización de la invención, Ra y Rb se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, fluoro, hidroxilo, metilo y -CH2-O-CH3 , en particular, hidrógeno, fluoro, metilo y -CH2-O-CH3.
De forma ventajosa, uno de Ra y Rb de -X-Y- es como se define anteriormente y los demás son todos hidrógeno al mismo tiempo.
En otro modo de realización particular de la invención, Ra es hidrógeno o alquilo, en particular, hidrógeno o metilo. En otro modo de realización particular de la invención, Rb es hidrógeno o alquilo, en particular, hidrógeno o metilo. En un modo de realización particular de la invención, uno o ambos de Ra y Rb son hidrógeno.
En un modo de realización particular de la invención, solo uno de Ra y Rb es hidrógeno.
En un modo de realización particular de la invención, uno de Ra y Rb es metilo y el otro es hidrógeno.
En un modo de realización particular de la invención, tanto Ra como Rb son metilo al mismo tiempo.
En un modo de realización particular de la invención, -X-Y- es -O-CH2-, -S-CH2-, -S-CH(CH3)-, -NH-CH2-, -O-CH2CH2-, -O-CH(CH2-O-CH3)-, -O-CH(CH2CH3)-, -O-CH(CH3)-, -O-CH2-O-CH2-, -O-CH2-O-CH2-, -CH2-O-CH2-, -C(=CH2)CH2-, -C(=CH2)CH(CH3)-, -N(OCH3)CH2- o -N(CH3)CH2-;
En un modo de realización particular de la invención, -X-Y- es -O-CRaRb-, en la que Ra y Rb se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo y alcoxialquilo, en particular, hidrógeno, metilo y -CH2-O-CH3.
En un modo de realización particular, -X-Y- es -O-CH2- u -O-CH(CH3)-, en particular, -O-CH2-.
El puente entre 2'-4' se puede situar por debajo del plano del anillo de ribosa (configuración beta-D) o bien por encima del plano del anillo (configuración alfa-L), como se ilustra en la fórmula (A) y fórmula (B) respectivamente. El nucleósido de ANB de acuerdo con la invención es, en particular, de fórmula (B1) o (B2)
Figure imgf000012_0001
en las que
W es oxígeno, azufre, -N(Ra)- o -CRaRb-, en particular, oxígeno;
B es una nucleobase o una nucleobase modificada;
Z es un enlace internucleosídico con respecto a un nucleósido adyacente o un grupo 5' terminal;
Z* es un enlace internucleosídico con respecto a un nucleósido adyacente o un grupo 3' terminal;
R1, R2 , R3 , R5 y R5* se seleccionan independientemente de hidrógeno, halógeno, alquilo, haloalquilo, alquenilo, alquinilo, hidroxi, alcoxi, alcoxialquilo, azido, alqueniloxi, carboxilo, alcoxicarbonilo, alquilcarbonilo, formilo y arilo; y
X, Y, Ra y Rb son como se definen anteriormente.
En un modo de realización particular, en la definición de -X-Y-, Ra es hidrógeno o alquilo, en particular, hidrógeno o metilo. En otro modo de realización particular, en la definición de -X-Y-, Rb es hidrógeno o alquilo, en particular, hidrógeno o metilo. En otro modo de realización particular, en la definición de -X-Y-, uno o ambos de Ra y Rb son hidrógeno. En un modo de realización particular, en la definición de -X-Y-, solo uno de Ra y Rb es hidrógeno. En un modo de realización particular, en la definición de -X-Y-, uno de Ra y Rb es metilo y el otro es hidrógeno. En un modo de realización particular, en la definición de -X-Y-, tanto Ra como Rb son metilo al mismo tiempo.
En otro modo de realización particular, en la definición de X, Ra es hidrógeno o alquilo, en particular, hidrógeno o metilo. En otro modo de realización particular, en la definición de X, Rb es hidrógeno o alquilo, en particular, hidrógeno o metilo. En un modo de realización particular, en la definición de X, uno o ambos de Ra y Rb son hidrógeno. En un modo de realización particular, en la definición de X, solo uno de Ra y Rb es hidrógeno. En un modo de realización particular, en la definición de X, uno de Ra y Rb es metilo y el otro es hidrógeno. En un modo de realización particular, en la definición de X, tanto Ra como Rb son metilo al mismo tiempo.
En otro modo de realización particular, en la definición de Y, Ra es hidrógeno o alquilo, en particular, hidrógeno o metilo. En otro modo de realización particular, en la definición de Y, Rb es hidrógeno o alquilo, en particular, hidrógeno o metilo. En un modo de realización particular, en la definición de Y, uno o ambos de Ra y Rb son hidrógeno. En un modo de realización particular, en la definición de Y, solo uno de Ra y Rb es hidrógeno. En un modo de realización particular, en la definición de Y, uno de Ra y Rb es metilo y el otro es hidrógeno. En un modo de realización particular, en la definición de Y, tanto Ra como Rb son metilo al mismo tiempo.
En un modo de realización particular de la invención R1, R2 , R3 , R5 y R5* se seleccionan independientemente de hidrógeno y alquilo, en particular, hidrógeno y metilo.
En otro modo de realización ventajoso particular de la invención, R1, R2 , R3 , R5 y R5* son todos hidrógeno al mismo tiempo.
En otro modo de realización particular de la invención, R1, R2 , R3 , son todos hidrógeno al mismo tiempo, uno de R5 y R5* es hidrógeno y el otro es como se define anteriormente, en particular, alquilo, más en particular, metilo.
En un modo de realización particular de la invención, R5 y R5* se seleccionan independientemente de hidrógeno, halógeno, alquilo, alcoxialquilo y azido, en particular, de hidrógeno, fluoro, metilo, metoxietilo y azido. En modos de realización ventajosos particulares de la invención, uno de R5 y R5* es hidrógeno y el otro es alquilo, en particular, metilo, halógeno, en particular, fluoro, alcoxialquilo, en particular, metoxietilo o azido; o tanto R5 como R5* son hidrógeno o halógeno al mismo tiempo, en particular, ambos hidrógeno o fluoro al mismo tiempo. En dichos modos de realización particulares, W puede ser de forma ventajosa oxígeno, y -X-Y- de forma ventajosa -O-CH2-.
En un modo de realización particular de la invención, -X-Y- es -O-CH2-, W es oxígeno y R1, R2 , R3, R5 y R5* son todos hidrógeno al mismo tiempo. Dichos nucleósidos de ANB se divulgan en los documentos WO 99/014226, WO 00/66604, WO 98/039352 y Wo 2004/046160, e incluyen lo que se conoce comúnmente en la técnica como nucleósidos de beta-D-oxi-ANB y alfa-L-oxi-ANB.
En otro modo de realización particular de la invención, -X-Y- es -S-CH2-, W es oxígeno y R1, R2 , R3 , R5 y R5* son todos hidrógeno al mismo tiempo. Dichos nucleósidos de tio-ANB se divulgan en los documentos WO 99/014226 y WO 2004/046160.
En otro modo de realización particular de la invención, -X-Y- es -NH-CH2-, W es oxígeno y R1, R2 , R3 , R5 y R5* son todos hidrógeno al mismo tiempo. Dichos nucleósidos de amino-ANB se divulgan en los documentos WO 99/014226 y WO 2004/046160.
En otro modo de realización particular de la invención, -X-Y- es -O-CH2CH2- u -OCH2CH2CH2-, W es oxígeno, y R1, R2 , R3 , R5 y R5* son todos hidrógeno al mismo tiempo. Dichos nucleósidos de ANB se divulgan en el documento WO 00/047599 y Morita et al., Bioorganic & Med. Chem. Lett. 12, 73-76, e incluyen lo que se conoce comúnmente en la técnica como ácidos nucleicos con puente de 2'-O-4'C-etileno (ENA).
En otro modo de realización particular de la invención, -X-Y- es -O-CH2-, W es oxígeno, R1, R2 , R3 son todos hidrógeno al mismo tiempo, uno de R5 y R5* es hidrógeno y el otro no es hidrógeno, tal como alquilo, por ejemplo, metilo. Dichos nucleósidos de ANB sustituidos en 5' se divulgan en el documento WO 2007/134181.
En otro modo de realización particular de la invención, -X-Y- es -O-CRaRb-, en la que uno o ambos de Ra y Rb no son hidrógeno, en particular, alquilo, tal como metilo, W es oxígeno, R1, R2, R3 son todos hidrógeno al mismo tiempo, uno de R5 y R5* es hidrógeno y el otro no es hidrógeno, en particular, alquilo, por ejemplo, metilo. Dichos nucleósidos de ANB bis-modificados se divulgan en el documento WO 2010/077578.
En otro modo de realización particular de la invención, -X-Y- es -O-CHRa-, W es oxígeno y R1, R2 , R3 , R5 y R5* son todos hidrógeno al mismo tiempo. Dichos nucleósidos de ANB sustituidos en 6' se divulgan en los documentos WO 2010/036698 y WO 2007/090071. En dichos nucleósidos de ANB sustituidos en 6', Ra es, en particular, alquilo C1-C6 , tal como metilo.
En otro modo de realización particular de la invención, -X-Y- es -O-CH(CH2-O-CH3)- ("2'-O-metoxietil-ácido nucleico bicíclico", Seth et al. J. Org. Chem. 2010, vol. 75(5) pp. 1569-81).
En otro modo de realización particular de la invención, -X-Y- es -O-CH(CH2CH3)-;
En otro modo de realización particular de la invención, -X-Y- es -O-CH(CH2-O-CH3)-, W es oxígeno y R1, R2 , R3 , R5 y R5* son todos hidrógeno al mismo tiempo. Dichos nucleósidos de ANB también son conocidos en la técnica como MOE cíclicos (cMOE) y se divulgan en el documento WO 2007/090071.
En otro modo de realización particular de la invención, -X-Y- es -O-CH(CH3)-("2'-O-etil-ácido nucleico bicíclico", Seth et al., J. Org. Chem. 2010, vol. 75(5) pp. 1569-81).
En otro modo de realización particular de la invención, -X-Y- es -O-CH2-O-CH2-(Seth et al., J. Org. Chem 2010 ob. cit.)
En otro modo de realización particular de la invención, -X-Y- es -O-CH(CH3)-, W es oxígeno y R1, R2 , R3 , R5 y R5* son todos hidrógeno al mismo tiempo. Dichos nucleósidos de 6'-metil-ANB también son conocidos en la técnica como nucleósidos cET, y pueden ser los diastereoisómeros (S)-cET o bien (R)-cET, como se divulga en los documentos WO 2007/090071 (beta-D) y WO 2010/036698 (alfa-L).
En otro modo de realización particular de la invención, -X-Y- es -O-CRaRb-, en la que ni Ra ni Rb es hidrógeno, W es oxígeno y R1, R2 , R3 , R5 y R5* son todos hidrógeno al mismo tiempo. En un modo de realización particular, tanto Ra como Rb son alquilo al mismo tiempo, en particular, ambos metilo al mismo tiempo. Dichos nucleósidos de ANB disustituidos en 6' se divulgan en el documento WO 2009/006478.
En otro modo de realización particular de la invención, -X-Y- es -S-CHRa-, W es oxígeno y R1, R2 , R3 , R5 y R5* son todos hidrógeno al mismo tiempo. Dichos nucleósidos de tio-ANB sustituido en 6' se divulgan en el documento WO 2011/156202.
En un modo de realización particular de dicho tio-ANB sustituido en 6', Ra es alquilo, en particular, metilo.
En un modo de realización particular de la invención, -X-Y- es -C(=CH2)C(RaRb)-, -C(=CHF)C(RaRb)- o -C(=CF2)C(RaRb)-, W es oxígeno y R1, R2 , R3, R5 y R5* son todos hidrógeno al mismo tiempo. Ra y Rb, de forma ventajosa, se seleccionan independientemente de hidrógeno, halógeno, alquilo y alcoxialquilo, en particular, hidrógeno, metilo, fluoro y metoximetilo. Tanto Ra como Rb son, en particular, hidrógeno o metilo al mismo tiempo o uno de Ra y Rb es hidrógeno y el otro es metilo. Dichos nucleósidos de vinil-carbo-ANB se divulgan en los documentos WO 2008/154401 y WO 2009/067647.
En un modo de realización particular de la invención, -X-Y- es -N(ORa)-CH2-, W es oxígeno y R1, R2, R3 , R5 y R5* son todos hidrógeno al mismo tiempo. En un modo de realización particular, Ra es alquilo, tal como metilo. Dichos nucleósidos de ANB también son conocidos como ANB N sustituidos y se divulgan en el documento WO 2008/150729.
En un modo de realización particular de la invención, -X-Y- es -O-N(Ra)-, -N(Ra)-O-, -NRa-CRaRb-CRaRb- o -NRa-CRaRb-, W es oxígeno y R1, R2, R3 , R5 y R5* son todos hidrógeno al mismo tiempo. Ra y Rb, de forma ventajosa, se seleccionan independientemente de hidrógeno, halógeno, alquilo y alcoxialquilo, en particular, hidrógeno, metilo, fluoro y metoximetilo. En un modo de realización particular, Ra es alquilo, tal como metilo, Rb es hidrógeno o metilo, en particular, hidrógeno. (Seth et al., J. Org. Chem 2010 ob. cit.).
En un modo de realización particular de la invención, -X-Y- es -O-N(CH3)-(Seth et al., J. Org. Chem 2010 ob. cit.).
En un modo de realización particular de la invención, tanto R5 como R5* son hidrógeno al mismo tiempo. En otro modo de realización particular de la invención, uno de R5 y R5* es hidrógeno y el otro es alquilo, tal como metilo. En dichos modos de realización, R1, R2 y R3 pueden ser, en particular, hidrógeno, y -X-Y- puede ser, en particular, O-CH2- u -O-CHC(Ra)3-, tal como -O-CH(CH3)-.
En un modo de realización particular de la invención, -X-Y- es -CRaRb-O-CRaRb-, tal como -CH2-O-CH2-, W es oxígeno y R1, R2 , R3 , R5 y R5* son todos hidrógeno al mismo tiempo. En dichos modos de realización particulares, Ra puede ser, en particular, alquilo, tal como metilo, Rb hidrógeno o metilo, en particular, hidrógeno. Dichos nucleósidos de ANB también son conocidos como nucleótidos restringidos conformacionalmente (CRN) y se divulgan en el documento WO 2013/036868.
En un modo de realización particular de la invención, -X-Y- es -O-CRaRb-O-CRaRb-, tal como -O-CH2-O-CH2-, W es oxígeno y R1, R2 , R3 , R5 y R5* son todos hidrógeno al mismo tiempo. Ra y Rb, de forma ventajosa, se seleccionan independientemente de hidrógeno, halógeno, alquilo y alcoxialquilo, en particular, hidrógeno, metilo, fluoro y metoximetilo. En un modo de realización particular de este tipo, Ra puede ser, en particular, alquilo, tal como metilo, Rb hidrógeno o metilo, en particular, hidrógeno. Dichos nucleósidos de ANB también son conocidos como nucleótidos COC y se divulgan en Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238.
Se reconocerá que, a menos que se especifique, los nucleósidos de ANB pueden estar en la estereoisoforma beta-D o alfa-L.
Los ejemplos particulares de nucleósidos de ANB de la invención se presentan en el esquema 1 (en el que B es como se define anteriormente).
Esquema 1
Figure imgf000015_0001
(S)-5'-metil-6'-dimet¡l-p-D (R)-5'-metil-6'-dimetil-p-D
-oxi-ANB -oxi-ANB (S)-5'-metil-p-D-oxi-ANB (R)-5'-metil-p-D-oxi-ANB
Figure imgf000016_0001
(S)-cET (R)-cET cprop-p-D-oxi-ANB trifluorometil-p-D-oxi-ANB
Figure imgf000016_0002
Figure imgf000016_0003
B p-D-metoxiamino-ANB
Figure imgf000016_0005
-sulfóxido-ANB -sulfoxido-ANB -sufonil-ANB -sufonil-ANB
Figure imgf000016_0004
metil-sulfoxamida metil-sulfonamida
-P-D-ANB -P-D-ANB
Figure imgf000017_0001
carbocíclico(vinil) carbocíclico-p-D-ANB -P-D-Z-ANB
Figure imgf000017_0002
Los nucleósidos de ANB particulares son beta-D-oxi-ANB, 6-metil-beta-D-oxi-ANB, tal como (S)-6'-metil-beta-D-oxi-ANB ((S)-cET) y ENA.
Actividad y reclutamiento de RNasa H
La actividad RNasa H de un oligonudeótido antisentido se refiere a su capacidad para reclutar RNasa H cuando está en un dúplex con una molécula de ARN complementaria. El documento WO01/23613 proporciona procedimientos in vitro para determinar la actividad RNasa H, que se pueden usar para determinar la capacidad de reclutar RNasa H. Típicamente, se considera que un oligonucleótido puede reclutar RNasa H si, cuando se le proporciona una secuencia de ácido nucleico diana complementaria, tiene una tasa inicial, como se mide en pmol/l/min, de al menos un 5 %, tal como de al menos un 10 % o más de un 20 % de la tasa inicial determinada al usarse un oligonucleótido que tiene la misma secuencia de bases que el oligonucleótido modificado que se está sometiendo a prueba, pero que contiene solo monómeros de ADN, con enlaces fosforotioato entre todos los monómeros en el oligonucleótido, y usando la metodología proporcionada por el ejemplo 91-95 del documento WO01/23613. Para su uso en la determinación de la actividad RNasa H, la RNasa H1 humana recombinante está disponible de Lubio Science GmbH, Lucerna, Suiza.
Gápmero
El oligonucleótido antisentido de la invención, o secuencia de nucleótidos contigua del mismo, puede ser un gápmero. Los gápmeros antisentido se usan comúnmente para inhibir un ácido nucleico diana por medio de degradación mediada por RNasa H. Un oligonucleótido gápmero comprende al menos tres regiones estructurales distintas, un flanco 5', un hueco y un flanco 3', F-G-F' en la orientación de '5 -> 3'. La región de "hueco" (G) comprende un tramo de nucleótidos de ADN contiguos que posibilitan que el oligonucleótido reclute RNasa H. La región de hueco está flanqueada por una región flanqueante (F) 5' que comprende uno o más nucleósidos modificados en glúcido, de forma ventajosa, nucleósidos modificados en glúcido de alta afinidad, y por una región flanqueante (F') 3' que comprende uno o más nucleósidos modificados en glúcido, de forma ventajosa, nucleósidos modificados en glúcido de alta afinidad. El uno o más nucleósidos modificados en glúcido en la región F y F' potencian la afinidad del oligonucleótido por el ácido nucleico diana (es decir, son nucleósidos modificados en glúcido potenciadores de la afinidad). En algunos modos de realización, el uno o más nucleósidos modificados en glúcido en la región F y F' son nucleósidos modificados en glúcido en 2', tales como las modificaciones de glúcido en 2' de alta afinidad, tal como se selecciona independientemente de ANB y 2'-MOE.
En un diseño de gápmero, los nucleósidos más hacia 5' y 3' de la región de hueco son nucleósidos de ADN y se sitúan adyacentes a un nucleósido modificado en glúcido de la región 5' (F) o 3' (F') respectivamente. Los flancos se pueden definir además al tener al menos un nucleósido modificado en glúcido en el extremo más distante desde la región de hueco, es decir, en el extremo 5' del flanco 5' y en el extremo 3' del flanco 3'.
Las regiones F-G-F' forman una secuencia de nucleótidos contigua. Los oligonucleótidos antisentido de la invención, o la secuencia de nucleótidos contigua de los mismos, pueden comprender una región de gápmero de fórmula F-G-F'.
La longitud global del diseño de gápmero F-G-F' puede ser, por ejemplo, de 12 a 32 nucleósidos, tal como de 13 a 24, tal como de 14 a 22 nucleósidos, tal como de 14 a 17, tal como de 16 a 18 nucleósidos.
A modo de ejemplo, el oligonucleótido gápmero de la presente invención se puede representar por las siguientes fórmulas:
F1-8-G5-16-F'1-8, tal como
F1-8-G7-16-F 2-8
con la condición de que la longitud global de las regiones de gápmero F-G-F' sea de al menos 12, tal como de al menos 14 nucleótidos de longitud.
Las regiones F, G y F' se definen adicionalmente a continuación y se pueden incorporar en la fórmula F-G-F'.
Gápmero: región G
La región G (región de hueco) del gápmero es una región de nucleósidos que posibilita que el oligonucleótido reclute RNasa H, tal como RNasa H1 humana, típicamente nucleósidos de a Dn . RNasa H es una enzima celular que reconoce el dúplex entre el ADN y ARN y escinde enzimáticamente la molécula de ARN. Los gápmeros adecuados pueden tener una región de hueco (G) de al menos 5 o 6 nucleósidos de ADN contiguos, tal como una longitud de 5 - 16 nucleósidos de ADN contiguos, tal como de 6 - 15 nucleósidos de ADN contiguos, tal como de 7-14 nucleósidos de ADN contiguos, tal como de 8 - 12 nucleótidos de ADN contiguos, tal como de 8 - 12 nucleótidos de ADN contiguos. La región de hueco G puede, en algunos modos de realización, consistir en 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 nucleósidos de ADN contiguos. En algunos casos, el ADN con citosina (C) en la región de hueco puede estar metilado, dichos residuos se anotan como 5-metil-citosina (meC o bien con una e en lugar de una c). La metilación del ADN con citosina en el hueco es ventajosa si los dinucleótidos cg están presentes en el hueco para reducir la potencial toxicidad, la modificación no tiene un impacto significativo sobre la eficacia de los oligonudeótidos.
En algunos modos de realización, la región de hueco G puede consistir en 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 nucleósidos de ADN enlazados por fosforotioato contiguos. En algunos modos de realización, todos los enlaces internucleosídicos en el hueco son enlaces fosforotioato.
Mientras que los gápmeros tradicionales tienen una región de hueco de ADN, existen numerosos ejemplos de nucleósidos modificados que permiten el reclutamiento de RNasa H cuando se usan dentro de la región de hueco. Los nucleósidos modificados que se ha informado que pueden reclutar RNasa H al incluirse dentro de una región de hueco incluyen, por ejemplo, alfa-L-ANB, ADN alquilado en C4' (como se describe en el documento PCT/EP2009/050349 y Vester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296-2300), nucleósidos derivados de arabinosa como AAN y 2'F-AAN (Mangos et al. 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661), ANNB (ácido nucleico no bloqueado) (como se describe en Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039, que se incorpora en el presente documento por referencia). ANNB es un ácido nucleico no bloqueado, típicamente donde se ha retirado el enlace entre C2 y C3 de la ribosa, formando un residuo de "glúcido" no bloqueado. Los nucleósidos modificados usados en dichos gápmeros pueden ser nucleósidos que adopten una estructura 2'-endo (similar al ADN) al introducirse en la región de hueco, es decir, modificaciones que permitan el reclutamiento de RNasa H). En algunos modos de realización, la región de hueco (G) de ADN descrita en el presente documento puede contener opcionalmente de 1 a 3 nucleósidos modificados en glúcido que adopten una estructura 2'-endo (similar al ADN) al introducirse en la región de hueco.
Región G: "disruptor de hueco"
De forma alternativa, existen numerosos informes de la inserción de un nucleósido modificado que confiere una conformación 3'-endo en la región de hueco de los gápmeros, mientras que se retiene algo de actividad RNasa H. Dichos gápmeros con una región de hueco que comprenda uno o más nucleósidos modificados 3'-endo se denominan gápmeros con "disruptor de hueco" o "alterados en hueco", véase, por ejemplo, el documento WO2013/022984. Los oligonucleótidos con disruptor de hueco retienen suficiente región de nucleósidos de ADN dentro de la región de hueco para permitir el reclutamiento de RNasa H. La capacidad del diseño de oligonucleótidos con disruptor de hueco para reclutar RNasa H típicamente es específica de secuencia o incluso de compuesto —véase Rukov et al. 2015 Nucl. Acids Res. vol. 43 pp. 8476-8487, que divulga oligonucleótidos con "disruptor de hueco" que reclutan RNasa H que, en algunos casos, proporcionan una escisión más específica del ARN diana—. Los nucleósidos modificados usados dentro de la región de hueco de los oligonucleótidos con disruptor de hueco pueden ser, por ejemplo, nucleósidos modificados que confieran una conformación 3'-endo, tales como los nucleósidos 2'-O-metil (OMe) o 2'-O-MOE (MOE), o los nucleósidos de beta-D-ANB (el puente entre C2' y C4' del anillo de glúcido ribosa de un nucleósido está en la conformación beta), tal como los nucleósidos de beta-D-oxi-ANB o ScET.
Al igual que los gápmeros que contienen la región G descrita anteriormente, la región de hueco de los gápmeros con disruptor de hueco o alterados en hueco, tienen un nucleósido de ADN en el extremo 5' del hueco (adyacente al nucleósido 3' de la región F), y un nucleósido de ADN en el extremo 3' del hueco (adyacente al nucleósido 5' de la región F'). Los gápmeros que comprenden un hueco alterado típicamente retienen una región de al menos 3 o 4 nucleósidos de ADN contiguos en el extremo 5' o bien en el extremo 3' de la región de hueco.
Los diseños ejemplares para oligonucleótidos con disruptor de hueco incluyen
F1-8-[D3-4-E1- D 3-4]-F'1-8
F1-8-[D 1-4-E1- D 3-4]-F'1-8
F1-8-[D 3-4-E1- D 1-4]-F'1-8
en los que la región G está entre corchetes [Dn-Er-Dm], D es una secuencia contigua de nucleósidos de ADN, E es un nucleósido modificado (el nucleósido con disruptor de hueco o de alteración de hueco), y F y F' son las regiones flanqueantes como se define en el presente documento, y con la condición de que la longitud global de las regiones de gápmero F-G-F' sea de al menos 12, tal como de al menos 14 nucleótidos de longitud.
En algunos modos de realización, la región G de un gápmero alterado en hueco comprende al menos 6 nucleósidos de ADN, tales como 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 nucleósidos de ADN. Como se describe anteriormente, los nucleósidos de ADN pueden ser contiguos u opcionalmente pueden estar intercalados con uno o más nucleósidos modificados, con la condición de que la región de hueco G pueda mediar en el reclutamiento de RNasa H.
Gápmero: regiones flanqueantes, F y F'
La región F se sitúa inmediatamente adyacente al nucleósido de ADN 5' de la región G. El nucleósido más hacia 3' de la región F es un nucleósido modificado en glúcido, tal como un nucleósido modificado en glúcido de alta afinidad, por ejemplo, un nucleósido sustituido en 2', tal como un nucleósido MOE o un nucleósido de ANB.
La región F' se sitúa inmediatamente adyacente al nucleósido de ADN 3' de la región G. El nucleósido más hacia 5' de la región F' es un nucleósido modificado en glúcido, tal como un nucleósido modificado en glúcido de alta afinidad, por ejemplo, un nucleósido sustituido en 2', tal como como un nucleósido MOE o un nucleósido de ANB.
La región F tiene una longitud de 1-8 nucleótidos contiguos, tal como de 2-6, tal como una longitud de 3-4 nucleótidos contiguos. De forma ventajosa, el nucleósido más hacia 5' de la región F es un nucleósido modificado en glúcido. En algunos modos de realización, los dos nucleósidos más hacia 5' de la región F son nucleósidos modificados en glúcido. En algunos modos de realización, el nucleósido más hacia 5' de la región F es un nucleósido de ANB. En algunos modos de realización, los dos nucleósidos más hacia 5' de la región F son nucleósidos de ANB. En algunos modos de realización, los dos nucleósidos más hacia 5' de la región F son nucleósidos de nucleósidos sustituidos en 2', tales como dos nucleósidos MOE 3'. En algunos modos de realización, el nucleósido más hacia 5' de la región F es un nucleósido sustituido en 2', tal como un nucleósido MOE.
La región F' tiene una longitud de 2-8 nucleótidos contiguos, tal como de 3-6, tal como una longitud de 4-5 nucleótidos contiguos. De forma ventajosa, en modos de realización, el nucleósido más hacia 3' de la región F' es un nucleósido modificado en glúcido. En algunos modos de realización, los dos nucleósidos más hacia 3' de la región F' son nucleósidos modificados en glúcido. En algunos modos de realización, los dos nucleósidos más hacia 3' de la región F' son nucleósidos de ANB. En algunos modos de realización, el nucleósido más hacia 3' de la región F' es un nucleósido de ANB. En algunos modos de realización, los dos nucleósidos más hacia 3' de la región F' son nucleósidos de nucleósidos sustituidos en 2', tales como dos nucleósidos MOE 3'. En algunos modos de realización, el nucleósido más hacia 3' de la región F' es un nucleósido sustituido en 2', tal como un nucleósido MOE.
Cabe destacar que, cuando la longitud de la región F o F' es de uno, de forma ventajosa es un nucleósido de ANB.
En algunos modos de realización, la región F y F' independientemente consiste en o comprende una secuencia contigua de nucleósidos modificados en glúcido. En algunos modos de realización, los nucleósidos modificados en glúcido de la región F se pueden seleccionar independientemente de unidades de 2'-O-alquil-ARN, 2'-O-metil-ARN, unidades de 2'-amino-ADN, unidades de 2'-fluoro-ADN, 2'-alcoxi-ARN, unidades de MOE, unidades de ANB, unidades de ácido arabinonucleico (AAN) y unidades de 2'-fluoro-AAN.
En algunos modos de realización, la región F y F' comprende independientemente tanto ANB como nucleósidos modificados sustituidos en 2' (diseño de ala mixta).
En algunos modos de realización, la región F y F' consiste en solo un tipo de nucleósidos modificados en glúcido, tal como solo MOE o solo beta-D-oxi-ANB o solo ScET. Dichos diseños también se denominan flancos uniformes o diseño de gápmero uniforme.
En algunos modos de realización, todos los nucleósidos de la región F o F' o F y F' son nucleósidos de ANB, tal como se selecciona independientemente de los nucleósidos de beta-D-oxi-ANB, ENA o ScET. En algunos modos de realización, la región F consiste en 1-5, tal como en 2-4, tal como en 3-4, tal como en 1,2, 3, 4 o 5 nucleósidos de ANB contiguos. En algunos modos de realización, todos los nucleósidos de la región F y F' son nucleósidos de beta-D-oxi-ANB.
En algunos modos de realización, todos los nucleósidos de la región F o F' o F y F' son nucleósidos sustituidos en 2', tales como los nucleósidos OMe o MOE. En algunos modos de realización, la región F consiste en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 nucleósidos OMe o MOE contiguos. En algunos modos de realización, solo una de las regiones flanqueantes puede consistir en nucleósidos sustituidos en 2', tales como los nucleósidos OMe o MOE. En algunos modos de realización, es la región flanqueante (F) 5' la que consiste en nucleósidos sustituidos en 2', tales como los nucleósidos OMe o MOE, mientras que la región flanqueante (F') 3' comprende al menos un nucleósido de ANB, tal como nucleósidos de beta-D-oxi-ANB o nucleósidos cET. En algunos modos de realización, es la región flanqueante (F') 3' la que consiste en nucleósidos sustituidos en 2', tales como los nucleósidos OMe o MOE, mientras que la región flanqueante (F) 5' comprende al menos un nucleósido de ANB, tal como nucleósidos de beta-D-oxi-ANB o nucleósidos cET.
En algunos modos de realización, todos los nucleósidos modificados de la región F y F' son nucleósidos de ANB, tal como se selecciona independientemente de los nucleósidos de beta-D-oxi-ANB, ENA o ScET, en los que la región F o F' o F y F' puede comprender opcionalmente nucleósidos de ADN (un flanco alterno, véase la definición de estos para obtener más detalles). En algunos modos de realización, todos los nucleósidos modificados de la región F y F' son nucleósidos de beta-D-oxi-ANB, en los que la región F o F' o F y F' puede comprender opcionalmente nucleósidos de ADN (un flanco alterno, véase la definición de estos para obtener más detalles).
En algunos modos de realización, los nucleósidos más hacia 5' y más hacia 3' de la región F y F' son nucleósidos de ANB, tales como nucleósidos de beta-D-oxi-ANB o nucleósidos ScET.
En algunos modos de realización, el enlace internucleosídico entre la región F y la región G es un enlace internucleosídico fosforotioato. En algunos modos de realización, el enlace internucleosídico entre la región F' y la región G es un enlace internucleosídico fosforotioato. En algunos modos de realización, los enlaces internucleosídicos entre los nucleósidos de la región F o F', F y F' son enlaces internucleosídicos fosforotioato.
En los documentos WO 2004/046160, WO 2007/146511 y WO 2008/113832 se divulgan otros diseños de gápmero.
Gápmero de ANB
Un gápmero de ANB es un gápmero en el que una o bien ambas de la región F y F' comprende o consiste en nucleósidos de ANB. Un gápmero de beta-D-oxi es un gápmero en el que una o bien ambas de la región F y F' comprende o consiste en nucleósidos de beta-D-oxi-ANB.
En algunos modos de realización, el gápmero de ANB es de fórmula: [ANB]1-5-[región G]-[ANB]1-5, en la que la región G es como se define en la definición de la región G de gápmero.
Gápmeros de MOE
Un gápmero de MOE es un gápmero en el que las regiones F y F' consisten en nucleósidos MOE. En algunos modos de realización, el gápmero de MOE es de un diseño [MOE]1-8-[región G]-[MOE]1-8, tal como [MOE]2-7-[región G]5-16-[MOE] 2-7, tal como [MOE]3-6-[región G]-[MOE]3-6, en el que la región G es como se define en la definición de gápmero. Los gápmeros de MOE con un diseño 5-10-5 (MOE-ADN-MOE) se han usado ampliamente en la técnica.
Gápmero de ala mixta
Un gápmero de ala mixta es un gápmero de ANB en el que una o ambas de la región F y F' comprenden un nucleósido sustituido en 2', tal como un nucleósido sustituido en 2' seleccionado independientemente del grupo que consiste en unidades de 2'-O-alquil-ARN, 2'-O-metil-ARN, unidades de 2'-amino-ADN, unidades 2'-fluoro-ADN, 2'-alcoxi-ARN, unidades de MOE, unidades de ácido arabinonucleico (AAN) y unidades de 2'-fluoro-AAN, tal como un nucleósido MOE. En algunos modos de realización en los que al menos una de la región F y F', o ambas regiones F y F' comprenden al menos un nucleósido de ANB, los nucleósidos restantes de la región F y F' se seleccionan independientemente del grupo que consiste en MOE y ANB. En algunos modos de realización en los que al menos una de la región F y F', o ambas regiones F y F' comprenden al menos dos nucleósidos de ANB, los nucleósidos restantes de la región F y F' se seleccionan independientemente del grupo que consiste en MOE y ANB. En algunos modos de realización de ala mixta, una o ambas de la región F y F' puede comprender además uno o más nucleósidos de ADN.
En los documentos WO 2008/049085 y WO 2012/109395 se divulgan diseños de gápmero de ala mixta, incorporándose ambos por la presente por referencia.
Gápmeros con flancos alternos
Las regiones flanqueantes pueden comprender nucleósidos tanto de ANB como de ADN y se denominan "flancos alternos", ya que comprenden un motivo alterno de nucleósidos de ANB-ADN-ANB. Los gápmeros que comprenden dichos flancos alternos se denominan "gápmeros con flancos alternos". Por tanto, los "gápmeros con flancos alternativos" son oligonucleótidos gápmero de ANB donde al menos uno de los flancos (F o F') comprende ADN además del/de los nucleósido(s) de ANB. En algunos modos de realización, al menos una de la región F o F', o ambas regiones F y F', comprenden tanto nucleósidos de ANB como nucleósidos de ADN. En dichos modos de realización, la región flanqueante F o F', o tanto F como F', comprenden al menos tres nucleósidos, en las que los nucleósidos más hacia 5' y 3' de la región F y/o F' son nucleósidos de ANB.
Los gápmeros de ANB con flancos alternos se divulgan en el documento WO 2016/127002.
Una región de flancos alternos puede comprender hasta 3 nucleósidos de ADN contiguos, tal como de 1 a 2 o 1 o 2 o 3 nucleósidos de ADN contiguos.
El flanco alterno se puede anotar como una serie de números enteros, que representan un número de nucleósidos de ANB (L) seguido de un número de nucleósidos de ADN (D), por ejemplo
[L]1-3-[D]1-4-[L]1-3
[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2
En los diseños de oligonucleótidos, a menudo se representarán como números, de modo que 2-2-1 represente 5' [L]2-[D]2-[L] 3', y 1-1-1-1-1 represente 5' [L]-[D]-[L]-[D]-[L] 3'. La longitud del flanco (región F y F') en oligonucleótidos con flancos alternos puede ser independientemente de 3 a 10 nucleósidos, tal como de 4 a 8, tal como de 5 a 6 nucleósidos, tal como de 4, 5, 6 o 7 nucleósidos modificados. En algunos modos de realización, solo uno de los flancos en el oligonucleótido gápmero es alterno, mientras que el otro está constituido por nucleótidos de ANB. Puede ser ventajoso tener al menos dos nucleósidos de ANB en el extremo 3' del flanco 3' (F') para conferir resistencia a exonucleasa adicional. Algunos ejemplos de oligonucleótidos con flancos alternos son:
[L]1-5-[D]1-4-[L]1-3-[G]5-16-[L]2-6
[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[G]5-16-[L]1-2-[D]1-3-[L]2-4
[L]1-5-[G]5-16-[L]-[D]-[L]-[D]-[L]2
con la condición de que la longitud global del gápmero sea de al menos 12, tal como de al menos 14 nucleótidos de longitud.
Región D' o D" en un oligonucleótido
En algunos modos de realización, el oligonucleótido de la invención puede comprender o consistir en la secuencia de nucleótidos contigua del oligonucleótido que es complementaria al ácido nucleico diana, tal como el gápmero F-G-F', y otros nucleósidos 5' y/o 3'. Los otros nucleósidos 5' y/o 3' pueden ser completamente complementarios o no al ácido nucleico diana. Dichos otros nucleósidos 5' y/o 3' se pueden denominar región D' y D" en el presente documento.
La adición de la región D' o D" se puede usar con el propósito de unir la secuencia de nucleótidos contigua, tal como el gápmero, a un resto de conjugado u otro grupo funcional. Al usarse para unir la secuencia de nucleótidos contigua con un resto de conjugado, puede servir como conector bioescindible. De forma alternativa, se puede usar para proporcionar protección frente a exonucleasa o para facilitar la síntesis o preparación.
La región D' y D'' se puede fijar al extremo 5' de la región F o al extremo 3' de la región F', respectivamente, para generar diseños de las siguientes fórmulas D'-F-G-F', F-G-F'-D'' o
D'-F-G-F'-D''. En este caso, la F-G-F' es la porción de gápmero del oligonucleótido y la región D' o D'' constituyen una parte separada del oligonucleótido.
La región D' o D" independientemente puede comprender o consistir en 1, 2, 3, 4 o 5 nucleótidos adicionales, que pueden ser complementarios o no complementarios al ácido nucleico diana. El nucleótido adyacente a la región F o F' no es un nucleótido modificado en glúcido, tal como un ADN o ARN o versiones modificadas en base de estos. La región D' o D' puede servir como conector bioescindible susceptible a nucleasa (véase la definición de conectores). En algunos modos de realización, los nucleótidos de extremo 5' y/o 3' adicionales están enlazados con enlaces fosfodiéster y son ADN o ARN. En el documento WO 2014/076195 se divulgan conectores bioescindibles basados en nucleótido adecuados para su uso como región D' o D", que incluyen, a modo de ejemplo, un dinucleótido de ADN enlazado con fosfodiéster. El uso de conectores bioescindibles en construcciones de polioligonucleótidos se divulga en el documento WO 2015/113922, donde se usan para enlazar múltiples construcciones antisentido (por ejemplo, regiones de gápmero) dentro de un único oligonucleótido.
En un modo de realización, el oligonucleótido de la invención comprende una región D' y/o D" además de la secuencia de nucleótidos contigua que constituye el gápmero.
En algunos modos de realización, el oligonucleótido de la presente invención se puede representar por las siguientes fórmulas:
F-G-F', en particular, F1-8-G5-16-F 2-8
D'-F-G-F', en particular, D'1-3-F1-8-G5-16-F'2-8
F-G-F'-D'', en particular, F1-8-G5-16-F'2-8-D''1-3
D'-F-G-F'-D'', en particular, D'1-3-F1-8-G5-16-F'2-8-D''1-3
En algunos modos de realización, el enlace internucleosídico situado entre la región D' y región F es un enlace fosfodiéster. En algunos modos de realización, el enlace internucleosídico situado entre la región F' y región D" es un enlace fosfodiéster.
Totálmeros
En algunos modos de realización, todos los nucleósidos del oligonucleótido, o secuencia de nucleótidos contigua del mismo, son nucleósidos modificados en glúcido. Dichos oligonucleótidos se denominan totálmeros en el presente documento.
En algunos modos de realización, todos los nucleósidos modificados en glúcido de un totálmero comprenden la misma modificación de glúcido, por ejemplo, todos pueden ser nucleósidos de ANB o todos pueden ser nucleósidos 2'O-MOE. En algunos modos de realización, los nucleósidos modificados en glúcido de un totálmero se pueden seleccionar independientemente de nucleósidos de ANB y nucleósidos sustituidos en 2', tal como nucleósido sustituido en 2' seleccionado del grupo que consiste en los nucleósidos 2'-O-alquil-ARN, 2'-O-metil-ARN, 2'-alcoxi-ARN, 2'-O-metoxietil-ARN (MOE), 2'-amino-ADN, 2'-fluoro-ARN y 2'-F-AAN. En algunos modos de realización, el oligonucleótido comprende tanto nucleósidos de ANB como nucleósidos sustituidos en 2', tal como nucleósido sustituido en 2' seleccionado del grupo que consiste en los nucleósidos 2'-O-alquil-ARN, 2'-O-metil-ARN, 2'-alcoxi-ARN, 2'-O-metoxietil-ARN (MOE), 2'-amino-ADN, 2'-fluoro-ARN y 2'-F-AAN. En algunos modos de realización, el oligonucleótido comprende nucleósidos de ANB y nucleósidos 2'-O-MOE. En algunos modos de realización, el oligonucleótido comprende nucleósidos de ANB (S)cET y nucleósidos 2'-O-MOE. En algunos modos de realización, cada unidad de nucleósido del oligonucleótido es un nucleósido sustituido en 2'. En algunos modos de realización, cada unidad de nucleósido del oligonucleótido es un nucleósido 2'-O-MOE.
En algunos modos de realización, todos los nucleósidos del oligonucleótido, o secuencia de nucleótidos contigua del mismo, son nucleósidos de ANB, tales como los nucleósidos de beta-D-oxi-ANB y/o nucleósidos (S)cET. En algunos modos de realización, dichos oligonucleótidos totálmeros de ANB tienen una longitud de entre 7 - 12 nucleósidos (véase, por ejemplo, el documento WO 2009/043353). Dichos oligonucleótidos completamente de ANB cortos son, en particular, eficaces en la inhibición de microARN.
Diversos compuestos totálmeros son altamente eficaces como oligómeros terapéuticos, en particular, al dirigirse a microARN (antimiR) o como oligómeros de cambio de empalme (SSO).
En algunos modos de realización, el totálmero comprende o consiste en al menos un motivo de secuencia XYX o YXY, tal como una secuencia repetida XYX o YXY, en la que X es ANB e Y es un análogo de nucleótido alternativo (es decir, distinto de ANB), tal como una unidad de 2'-OMe-ARN y unidad de 2'-fluoro-ADN. El motivo de secuencia anterior, en algunos modos de realización, puede ser XXY, XYX, YXY o YYX, por ejemplo.
En algunos modos de realización, el totálmero puede comprender o consistir en una secuencia de nucleótidos contigua de entre 7 y 24 nucleótidos, tal como de 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 nucleótidos.
En algunos modos de realización, la secuencia de nucleótidos contigua del totálmero comprende al menos un 30 %, tal como al menos un 40 %, tal como al menos un 50 %, tal como al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 90 %, tal como un 95 %, tal como un 100 % de unidades de ANB. Para los compuestos de ANB completos, es ventajoso que tengan una longitud menor de 12 nucleótidos, tal como de 7 - 10.
Las unidades restantes se pueden seleccionar de los análogos de nucleótido distintos de ANB a los que se hace referencia en el presente documento, tales como los seleccionados del grupo que consiste en la unidad de 2'-O-alquil-ARN, unidad de 2'-OMe-ARN, unidad de 2'-amino-ADN, unidad de 2'-fluoro-ADN, unidad de ANB, unidad de APN, unidad de ANH, unidad de INA y una unidad de 2'MOE-ARN, o unidad de 2'-OMe-ARN del grupo y unidad de 2'-fluoro-ADN.
Míxmeros
El término "míxmero" se refiere a oligómeros que comprenden tanto nucleósidos de ADN como nucleósidos modificados en glúcido, en los que existe una longitud insuficiente de nucleósidos de ADN contiguos para reclutar RNasa H. Los míxmeros adecuados pueden comprender hasta 3 o hasta 4 nucleósidos de ADN contiguos. En algunos modos de realización, los míxmeros comprenden regiones alternas de nucleósidos modificados en glúcido y nucleósidos de ADN. Al alternar regiones de nucleósidos modificados en glúcido que formen una conformación similar a ARN (3'-endo) al incorporarse en el oligonucleótido, con regiones cortas de nucleósidos de ADN, se pueden preparar oligonucleótidos no reclutadores de RNasa H. De forma ventajosa, los nucleósidos modificados en glúcido son nucleósidos modificados en glúcido potenciadores de la afinidad.
A menudo se usan míxmeros de oligonucleótido para proporcionar una modulación basada en ocupación de genes diana, tal como moduladores de empalme o inhibidores de microARN.
En algunos modos de realización, los nucleósidos modificados en glúcido en el míxmero, o secuencia de nucleótidos contigua del mismo, comprenden o son todos nucleósidos de ANB, tales como nucleósidos (S)cET o de beta-D-oxi-ANB.
En algunos modos de realización, todos los nucleósidos modificados en glúcido de un míxmero comprenden la misma modificación de glúcido, por ejemplo, todos pueden ser nucleósidos de ANB o todos pueden ser nucleósidos 2'O-MOE. En algunos modos de realización, los nucleósidos modificados en glúcido de un míxmero se pueden seleccionar independientemente de nucleósidos de ANB y nucleósidos sustituidos en 2', tal como nucleósido sustituido en 2' seleccionado del grupo que consiste en los nucleósidos 2'-O-alquil-ARN, 2'-O-metil-ARN, 2'-alcoxi-ARN, 2'-O-metoxietil-ARN (MOE), 2'-amino-ADN, 2'-fluoro-ARN y 2'-F-AAN. En algunos modos de realización, el oligonucleótido comprende tanto nucleósidos de ANB como nucleósidos sustituidos en 2', tal como nucleósido sustituido en 2' seleccionado del grupo que consiste en los nucleósidos 2'-O-alquil-ARN, 2'-O-metil-ARN, 2'-alcoxi-ARN, 2'-O-metoxietil-ARN (MOE), 2'-amino-ADN, 2'-fluoro-ARN y 2'-F-AAN. En algunos modos de realización, el oligonucleótido comprende nucleósidos de ANB y nucleósidos 2'-O-MOE. En algunos modos de realización, el oligonucleótido comprende nucleósidos de ANB (S)cET y nucleósidos 2'-O-MOE.
En algunos modos de realización, el míxmero, o la secuencia de nucleótidos contigua del mismo, solo comprende nucleósidos de ANB y ADN, pudiendo tener una longitud dichos oligonucleótidos míxmero de ANB, por ejemplo, de entre 8-24 nucleósidos (véase, por ejemplo, el documento WO2007112754, que divulga inhibidores antmiR de ANB de microARN).
Diversos compuestos míxmeros son altamente eficaces como oligómeros terapéuticos, en particular, al dirigirse a microARN (antimiR) o como oligómeros de cambio de empalme (SSO).
En algunos modos de realización, el míxmero comprende un motivo
,..[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m ... o
...[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m . o
,..[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m ... o
,..[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m ...
en el que L representa un nucleósido modificado en glúcido, tal como un nucleósido de ANB o sustituido en 2' (por ejemplo, 2'-O-MOE), D representa un nucleósido de ADN, y en el que cada m se selecciona independientemente de 1 - 6, y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4, tal como de 1-3. En algunos modos de realización, cada L es un nucleósido de ANB. En algunos modos de realización, al menos un L es un nucleósido de ANB y al menos un L es un nucleósido 2'-O-MOE. En algunos modos de realización, cada L se selecciona independientemente de nucleósido de ANB y 2'-O-MOE.
En algunos modos de realización, el míxmero puede comprender o consistir en una secuencia de nucleótidos contigua de entre 10 y 24 nucleótidos, tal como de 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 nucleótidos.
En algunos modos de realización, la secuencia de nucleótidos contigua del míxmero comprende al menos un 30 %, tal como al menos un 40 %, tal como al menos un 50 % de unidades de ANB.
En algunos modos de realización, el míxmero comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos contigua de patrón repetitivo de análogos de nucleótido y nucleótidos naturales, o un tipo de análogo de nucleótido y un segundo tipo de análogo de nucleótido. El patrón repetitivo puede ser, por ejemplo: cada segundo o cada tercer nucleótido es un análogo de nucleótido, tal como ANB, y los nucleótidos restantes son nucleótidos naturales, tales como ADN, o son un análogo de nucleótido sustituido en 2', tal como análogos de 2'MOE o 2'fluoro como se hace referencia en el presente documento, o, en algunos modos de realización, seleccionados de los grupos de análogos de nucleótido a los que se hace referencia en el presente documento. Se reconoce que el patrón repetitivo de los análogos de nucleótido, tales como las unidades de ANB, se puede combinar con análogos de nucleótido en posiciones fijas, por ejemplo, en los extremos 5' o 3'.
En algunos modos de realización, el primer nucleótido del oligómero, contando desde el extremo 3', es un análogo de nucleótido, tal como un nucleótido de ANB o un nucleósido 2'-O-MOE.
En algunos modos de realización, que pueden ser los mismos o diferentes, el segundo nucleótido del oligómero, contando desde el extremo 3', es un análogo de nucleótido, tal como un nucleótido de ANB o un nucleósido 2'-O-MOE.
En algunos modos de realización, que pueden ser los mismos o diferentes, el extremo 5' del oligómero es un análogo de nucleótido, tal como un nucleótido de ANB o un nucleósido 2'-O-MOE.
En algunos modos de realización, el míxmero comprende al menos una región que comprende al menos dos unidades de análogos de nucleótido consecutivas, tal como al menos dos unidades de ANB consecutivas.
En algunos modos de realización, el míxmero comprende al menos una región que comprende al menos tres unidades de análogos de nucleótido consecutivas, tal como al menos tres unidades de ANB consecutivas.
Conjugado
El término conjugado como se usa en el presente documento se refiere a un oligonucleótido que está enlazado de forma covalente a un resto no nucleotídico (resto de conjugado o región C o tercera región).
La conjugación del oligonucleótido de la invención a uno o más restos no nucleotídicos puede mejorar la farmacología del oligonucleótido, por ejemplo, afectando la actividad, distribución celular, absorción celular o estabilidad del oligonucleótido. En algunos modos de realización, el resto de conjugado modifica o potencia las propiedades farmacocinéticas del oligonucleótido mejorando la distribución celular, biodisponibilidad, metabolismo, excreción, permeabilidad y/o absorción celular del oligonucleótido. En particular, el conjugado puede dirigir el oligonucleótido a un órgano, tejido o tipo de células específico y, de este modo, potenciar la eficacia del oligonucleótido en ese órgano, tejido o tipo de células. Al mismo tiempo, el conjugado puede servir para reducir la actividad del oligonucleótido en tipos de células, tejidos u órganos distintos de diana, por ejemplo, actividad fuera de diana o actividad en tipos de células, tejidos u órganos distintos de diana.
Los documentos WO 93/07883 y WO 2013/033230 proporcionan restos de conjugado adecuados, que se incorporan por la presente por referencia. Otros restos de conjugado adecuados son aquellos que se pueden unir al receptor de asialoglucoproteína (ASGPR). En particular, los restos de conjugado de N-acetilgalactosamina trivalente son adecuados para unirse al ASGPR, véanse, por ejemplo, los documentos WO 2014/076196, WO 2014/207232 y WO 2014/179620. Dichos conjugados sirven para potenciar la absorción del oligonucleótido en el hígado mientras reducen su presencia en el riñón, incrementando, de este modo, la proporción hígado/riñón de un oligonucleótido conjugado en comparación con la versión no conjugada del mismo oligonucleótido.
También se ha informado de los conjugados de oligonucleótido y su síntesis en revisiones exhaustivas por Manoharan en Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., cap. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001 y Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103.
En un modo de realización, el resto no nucleotídico (resto de conjugado) se selecciona del grupo que consiste en carbohidratos, ligandos de receptor de superficie celular, fármacos, hormonas, sustancias lipófilas, polímeros, proteínas, péptidos, toxinas (por ejemplo, toxinas bacterianas), vitaminas, proteínas víricas (por ejemplo, cápsides) o combinaciones de los mismos.
Conectores
Un enlace o conector es una conexión entre dos átomos que enlaza un grupo químico o segmento de interés a otro grupo químico o segmento de interés por medio de uno o más enlaces covalentes. Los restos de conjugado se pueden fijar al oligonucleótido directamente o a través de un resto de enlace (por ejemplo, conector o engarce). Los conectores sirven para conectar de forma covalente una tercera región, por ejemplo, un resto de conjugado (región C), a una primera región, por ejemplo, un oligonucleótido o una secuencia de nucleótidos contigua complementaria al ácido nucleico diana (región A).
En algunos modos de realización de la invención, el conjugado o conjugado de oligonucleótido de la invención puede comprender opcionalmente una región conectora (segunda región o región B y/o región Y) que se sitúa entre el oligonucleótido o secuencia de nucleótidos contigua complementaria al ácido nucleico diana (región A o primera región) y el resto de conjugado (región C o tercera región).
La región B se refiere a conectores bioescindibles que comprenden o consisten en un enlace fisiológicamente lábil que sea escindible en condiciones normalmente encontradas o análogas a las encontradas dentro del cuerpo de un mamífero. Las condiciones en las que los conectores fisiológicamente lábiles se someten a transformación química (por ejemplo, escisión) incluyen condiciones químicas, tales como pH, temperatura, agentes o condiciones oxidantes o reductoras y concentración de sal encontrada en o análoga a la encontrada en células de mamífero. Las condiciones intracelulares de mamíferos también incluyen la presencia de actividad enzimática normalmente presente en una célula de mamífero, tal como de enzimas proteolíticas o enzimas hidrolíticas o nucleasas. En un modo de realización, el conector bioescindible es susceptible de escisión por nucleasa S1. En un modo de realización preferente, el conector susceptible a nucleasa comprende entre 1 y 10 nucleósidos, tal como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleósidos, más preferentemente entre 2 y 6 nucleósidos y lo más preferentemente entre 2 y 4 nucleósidos enlazados que comprenden al menos dos enlaces fosfodiéster consecutivos, tal como al menos 3 o 4 o 5 enlaces fosfodiéster consecutivos. Preferentemente, los nucleósidos son ADN o ARN. Los conectores bioescindibles que contienen fosfodiéster se describen con más detalle en el documento WO 2014/076195.
La región Y se refiere a conectores que no sean necesariamente bioescindibles, pero que sirvan principalmente para conectar de forma covalente un resto de conjugado (región C o tercera región) a un oligonucleótido (región A o primera región). Los conectores de la región Y pueden comprender una estructura de cadena o un oligómero de unidades repetitivas, tales como etilenglicol, unidades de aminoácido o grupos aminoalquilo. Los conjugados de oligonucleótido de la presente invención se pueden construir a partir de los siguientes elementos regionales A-C, A-B-C, A-B-Y-C, A-Y-B-C o A-Y-C. En algunos modos de realización, el conector (región Y) es un aminoalquilo, tal como un grupo aminoalquilo C2 - C36, que incluye, por ejemplo, grupos aminoalquilo de C6 a C12. En un modo de realización preferente, el conector (región Y) es un grupo aminoalquilo C6.
Por tanto, la invención se refiere, en particular, a:
un oligonucleótido de acuerdo con la invención, en el que el nucleósido (A1) es un nucleósido de ADN, un nucleósido de ARN o un nucleósido modificado en glúcido;
un oligonucleótido de acuerdo con la invención, en el que el nucleósido (A1) es un nucleósido de ADN o un nucleósido modificado en glúcido;
un oligonucleótido de acuerdo con la invención, en el que el nucleósido (A2) es un nucleósido de ADN, un nucleósido de ARN o un nucleósido modificado en glúcido;
un oligonucleótido de acuerdo con la invención, en el que el nucleósido (A2) es un nucleósido de ADN o un nucleósido modificado en glúcido;
un oligonucleótido de acuerdo con la invención, en el que el nucleósido modificado en glúcido es un nucleósido modificado en glúcido en 2';
un oligonucleótido de acuerdo con la invención, en el que el nucleósido (A2) es 2'-alcoxi-ARN, en particular, 2'-metoxi-ARN, 2'-alcoxialcoxi-ARN, en particular, 2'-metoxietoxi-ARN, 2'-amino-ADN, 2'-fluoro-ARN o 2'-fluoro-AAN;
un oligonucleótido de acuerdo con la invención, en el que el nucleósido (A2) es un nucleósido de ANB;
un oligonucleótido de acuerdo con la invención, en el que el nucleósido de ANB se selecciona independientemente de beta-D-oxi-ANB, 6'-metil-beta-D-oxi-ANB y ENA, en particular, beta-D-oxi-ANB;
un oligonucleótido de acuerdo con la invención, en el que al menos uno de los nucleósidos (A1) y (A2) es un 2'-alcoxialcoxi-ARN;
un oligonucleótido de acuerdo con la invención, en el que el 2'-alcoxialcoxi-ARN es 2'-metoxietoxi-ARN;
un oligonucleótido de acuerdo con la invención, en el que los nucleósidos (A1) y (A2) son ambos nucleósidos de ADN o ambos nucleósidos de nucleósidos modificados en glúcido en 2', en particular, nucleósidos de ANB; un oligonucleótido de acuerdo con la invención, que comprende otros enlaces internucleosídicos seleccionados de enlace internucleosídico fosfodiéster, enlace internucleosídico fosforotioato y enlace internucleosídico fosforotritioato de fórmula (I) como se define anteriormente;
un oligonucleótido de acuerdo con la invención, que comprende otros enlaces internucleosídicos seleccionados de enlace internucleosídico fosforotioato y enlace internucleosídico fosforotritioato de fórmula (I) como se define anteriormente;
un oligonucleótido de acuerdo con la invención, que comprende entre 1 y 15, en particular, entre 1 y 5, más en particular, 1, 2, 3, 4 o 5 enlaces internucleosídicos fosforotritioato de fórmula (I) como se define anteriormente; un oligonucleótido de acuerdo con la invención, en el que los otros enlaces internucleosídicos son todos enlaces internucleosídicos fosforotioato de fórmula -P(=S)(OR)O2-, en la que R es como se define anteriormente; un oligonucleótido de acuerdo con la invención, que comprende otros nucleósidos seleccionados de nucleósidos de ADN, nucleósidos de ARN y nucleósidos modificados en glúcido;
un oligonucleótido de acuerdo con la invención, en el que uno o más nucleósidos es un nucleósido modificado en nucleobase;
un oligonucleótido de acuerdo con la invención, en el que el oligonucleótido es un oligonucleótido antisentido, un ARNip, un mimético de microARN o una ribozima;
un oligonucleótido de acuerdo con la invención, en el que el oligonucleótido es un oligonucleótido gápmero antisentido;
un oligonucleótido de acuerdo con la invención, en el que el enlace intemucleosídico fosforotritioato de fórmula (I) está en la región de hueco del oligonucleótido gápmero;
un oligonucleótido de acuerdo con la invención, en el que el enlace internucleosídico fosforotritioato de fórmula (I) está en la región de hueco del oligonucleótido gápmero;
un oligonucleótido de acuerdo con la invención, en el que el oligonucleótido gápmero es un gápmero de ANB, un gápmero de ala mixta o un gápmero sustituido en 2', en particular, un gápmero de 2'-O-metoxietilo;
un oligonucleótido gápmero de acuerdo con la invención, en el que el oligonucleótido gápmero comprende una secuencia de nucleótidos contigua de fórmula 5'-F-G-F'-3', en la que G es una región de 5 a 18 nucleósidos que puede reclutar RNasa H, y dicha región G está flanqueada en 5' y en 3' por las regiones flanqueantes F y F' respectivamente, en la que las regiones F y F' comprenden o consisten independientemente en de 1 a 7 nucleótidos modificados en glúcido en 2', en la que el nucleósido de la región F que sea adyacente a la región G es un nucleósido modificado en glúcido en 2' y en la que el nucleósido de la región F' que sea adyacente a la región G es un nucleósido modificado en glúcido en 2';
un oligonucleótido gápmero de acuerdo con la invención, en el que dicho al menos un enlace internucleosídico fosforotritioato de fórmula (I) como se define anteriormente se sitúa entre nucleósidos adyacentes en la región G o entre la región G y la región F';
un oligonucleótido de acuerdo con la invención, en el que el oligonucleótido es un totálmero o míxmero de oligonucleótido antisentido, en particular, un oligonucleótido de cambio de empalme o un oligonucleótido inhibidor de microARN;
una sal farmacéuticamente aceptable de un oligonucleótido de acuerdo con la invención, en particular, una sal de sodio o una de potasio;
un conjugado que comprende un oligonucleótido o una sal farmacéuticamente aceptable de acuerdo con la invención y al menos un resto de conjugado fijado de forma covalente a dicho oligonucleótido o a dicha sal farmacéuticamente aceptable, opcionalmente por medio de un resto conector;
una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido, una sal farmacéuticamente aceptable o un conjugado de acuerdo con la invención y un vehículo terapéuticamente inerte;
un oligonucleótido, sal farmacéuticamente aceptable o conjugado de acuerdo con la invención para su uso como sustancia terapéuticamente activa;
un oligonucleótido, sal farmacéuticamente aceptable o conjugado de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento o profilaxis de una cardiopatía o hemopatía;
el uso de un oligonucleótido, sal farmacéuticamente aceptable o conjugado de acuerdo con la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una cardiopatía o hemopatía;
el uso de un oligonucleótido, sal farmacéuticamente aceptable o conjugado de acuerdo con la invención en el tratamiento o profilaxis de una cardiopatía o hemopatía;
un procedimiento para el tratamiento o profilaxis de una cardiopatía o hemopatía que comprende la administración de una cantidad eficaz de un oligonucleótido, sal farmacéuticamente aceptable o conjugado de acuerdo con la invención a un paciente que lo necesite;
un procedimiento de inhibición de un ARN diana, en particular, un ARNm humano o un ARN vírico, en una célula que comprende administrar un oligonucleótido de acuerdo con la invención a una célula que expresa dicho ARN diana;
un procedimiento in vitro de modulación o inhibición de un ARN diana, en particular, un ARNm humano o un ARN vírico, en una célula que comprende administrar un oligonucleótido u oligonucleótido gápmero de acuerdo con la invención a una célula que expresa dicho ARN diana;
un procedimiento para la preparación de un oligonucleótido de acuerdo con la invención, que comprende las siguientes etapas:
(a) acoplar una tiofosforamidita al átomo de azufre 5' terminal de un oligonucleótido o nucleósido modificado en glúcido en 5' para producir un intermedio de triéster de ditiofosfito;
(b) tiooxidar el intermedio de triéster de ditiofosfito obtenido en la etapa a); y
(c) opcionalmente alargar adicionalmente el oligonucleótido;
un procedimiento de acuerdo con la invención, en el que el oligonucleótido o nucleósido modificado en glúcido en 5' de la etapa (a) está fijado a un soporte sólido;
un procedimiento de acuerdo con la invención, que comprende además la escisión del oligonucleótido del soporte sólido; y
un oligonucleótido preparado de acuerdo con un procedimiento de la invención.
En algunos modos de realización, el oligonucleótido de la invención tiene una mayor actividad en la modulación de su ácido nucleico diana, en comparación con el oligonucleótido completamente enlazado a fosforotioato correspondiente. En algunos modos de realización, la invención proporciona oligonucleótidos con actividad potenciada, potencia potenciada, actividad específica potenciada o absorción celular potenciada. En algunos modos de realización, la invención proporciona oligonucleótidos que tienen una duración alterada de acción in vitro o in vivo, tal como una duración prolongada de la acción in vitro o in vivo. En algunos modos de realización, la mayor actividad en la modulación del ácido nucleico diana se determina in vitro o in vivo en una célula que expresa el ácido nucleico diana.
En algunos modos de realización, el oligonucleótido de la invención tiene propiedades farmacológicas alteradas, tales como toxicidad reducida, por ejemplo, nefrotoxicidad reducida, hepatotoxicidad reducida o estimulación inmunitaria reducida. La hepatotoxicidad se puede determinar, por ejemplo, in vivo o usando los ensayos in vitro divulgados en el documento WO 2017/067970. La nefrotoxicidad se puede determinar, por ejemplo, in vitro o usando los ensayos divulgados en el documento PCT/EP2017/064770. En algunos modos de realización, el oligonucleótido de la invención comprende un dinucleótido 5' CG 3', tal como un dinucleótido 5' CG 3' de ADN, en el que el enlace internucleosídico entre C y G es un enlace internucleosídico fosforotritioato de fórmula (I) como se define anteriormente.
En algunos modos de realización, el oligonucleótido de la invención tiene resistencia a nucleasa mejorada, tal como bioestabilidad mejorada en el suero sanguíneo. En algunos modos de realización, el nucleósido 3' terminal del oligonucleótido de la invención tiene una base A o G, tal como un nucleósido de ANB-A o de ANB-G 3' terminal. Adecuadamente, el enlace internucleosídico entre los dos nucleósidos más hacia 3' del oligonucleótido puede ser un enlace internucleosídico fosforotritioato de acuerdo con la fórmula (I) como se define anteriormente.
En algunos modos de realización, el oligonucleótido de la invención tiene biodisponibilidad potenciada. En algunos modos de realización, el oligonucleótido de la invención tiene una mayor exposición a la sangre, tal como un mayor tiempo de retención en la sangre.
El oligonucleótido de acuerdo con la invención se puede preparar, por ejemplo, de acuerdo con los siguientes esquemas.
Los enlaces tritiofosfato que tienen átomos de azufre en la posición no puente, así como en las posiciones 3' y 5' de los anillos de furanosa adyacentes, se pueden introducir en oligonucleótidos por síntesis en fase sólida con el procedimiento de fosforamidita. Las síntesis se realizan usando vidrio de poro controlado (CPG) equipado con un conector universal como soporte. En un soporte sólido de este tipo, típicamente se construye un oligonucleótido en un sentido de 3' a 5' por medio de ciclos secuenciales que consisten en el acoplamiento de bloques de construcción de nucleósido fosforamidita protegido con 5'O-DMT seguido de (tio)oxidación, agregación de caperuza y desprotección del grupo DMT. Para la introducción de un fosforotritioato como se describe en la presente solicitud, se acopla un bloque de construcción de 5'-desoxi-5'-mercapto-fosforamidita protegida con DMT al grupo 5'-hidroxi libre de una cadena de oligonucleótido unida a un soporte sólido. Después de la (tio)oxidación y agregación de caperuza, el intermedio resultante, a continuación, se desprotege para liberar un grupo 5'-tiol.
Esquema 2
Figure imgf000029_0001
R
5-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-tetrazol en CH 3 CN (3 acoplamientos cor
I ” 100 ul defosforamiditay 110 ul de activador) 23456
Figure imgf000029_0002
2. ) Lavado con CH 3CN q _ \ p _O-R 3. ) Tiooxidación (3-amino-1,2,4-ditiazoL5-tiona en CLbCN/piridina 1:1, 3x200 ul) 1
4. ) Lavado con CH 3 CN O 5. ) Agregación de caperuza (THF/lutid¡na/Ac20 8:1:1, THF/N-metilimidazol 8:2, 75 ul en cada caso)
6. ) Lavado con CFbCN
Esta desprotección es problemática y se realiza mejor por la aplicación repetida (más de 15 veces) de condiciones de desprotección estándar (típicamente de ácido dicloroacético o ácido tricloroacético al 3-5 % en diclorometano) o bien usando mayores concentraciones de ácido (por ejemplo, ácido tricloroacético hasta al 10 % en diclorometano) o ácidos más fuertes (por ejemplo, ácido trifluoroacético al 5 % en diclorometano) usando preferentemente secuestrantes de cationes apropiados (típicamente trietilsilano al 20 %, 4-metoxitiofenol al 5 % o una combinación de ambos).
Esquema 3
Figure imgf000029_0003
El grupo 5' tiol libre así obtenido se acopla, a continuación, a un bloque de construcción de tiofosforamidita protegida con 5'O-DMT apropiado. Dichos bloques de construcción de tiofosforamidita típicamente se acoplan como soluciones de mayores concentraciones (por ejemplo, 0,15 M) y con tiempos de acoplamiento prolongados en comparación con las fosforamiditas para ADN no modificadas estándar. A continuación, el intermedio de ditiofosfito resultante se puede someter a tiooxidación usando un reactivo apropiado (por ejemplo, 3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona) para proporcionar el enlace forforotritioato simétrico deseado.
Esquema 4
Figure imgf000030_0001
En los esquemas anteriores:
R2a y R4a forman conjuntamente -X-Y- como se define anteriormente; o
R4a es hidrógeno y R2a se selecciona de alcoxi, en particular, metoxi, halógeno, en particular, fluoro, alcoxialcoxi, en particular, metoxietoxi, alqueniloxi, en particular, aliloxi y aminoalcoxi, en particular, aminoetiloxi;
R2b y R4b forman conjuntamente -X-Y- como se define anteriormente; o
tanto R2b como R4b son hidrógeno al mismo tiempo; o
R4b es hidrógeno y R2b se selecciona de alcoxi, en particular, metoxi, halógeno, en particular, fluoro, alcoxialcoxi, en particular, metoxietoxi, alqueniloxi, en particular, aliloxi y aminoalcoxi, en particular, aminoetiloxi;
Rx es fenilo, nitrofenilo, fenilalquilo, halofenilalquilo, cianoalquilo, fenilcarbonilsulfanilalquilo, halofenilcarbonilsulfanilalquilo, alquilcarbonilsulfanilalquilo o alquilcarbonilcarbonilsulfanilalquilo;
R3 es dialquilamino o pirrolidinilo;
R5 es un grupo protector de tiohidroxilo; y
R es como se define anteriormente.
La invención se ilustrará ahora por los siguientes ejemplos que no tienen carácter limitante.
Ejemplos
Ejemplo 1
Síntesis de oligonucleótidos
Los oligonucleótidos se sintetizaron usando un sintetizador de ADN automatizado MerMade 12 de Bioautomation. Las síntesis se realizaron en una escala de 1 |jmol usando un soporte de vidrio de poro controlado (500 A) que tenía un conector universal.
En los procedimientos de ciclo estándar para el acoplamiento de fosforamiditas para ADN y ANB, la desprotección de DMT se realizó con ácido tricloroacético al 3 % (p/v) en CH2O 2 en tres aplicaciones de 200 j l durante 30 s. Las fosforamiditas respectivas se acoplaron tres veces con 100 j l de soluciones 0,1 M en acetonitrilo (o acetonitrilo/CH2Cl2 1:1 para el bloque de construcción de MeC de ANB) y 110 j l de una solución 0,1 M de 5-(3,5-bis(trifluorometilfenil))-1 H-tetrazol en acetonitrilo como activador y un tiempo de acoplamiento de 180 s. Para la tiooxidación, se usó una solución 0,1 M de 3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona en acetonitrilo/piridina 1:1 (3x190 |jl, 55 s). La agregación de caperuza se realizó usando THF/lutidina/Ac2O 8:1:1 (CapA, 75 |jmol) y THF/N-metilimidazol 8:2 (CapB, 75 jmol) durante 55 s.
Los ciclos de síntesis para la incorporación de 2',5'-didesoxi-5'-mercapto-fosforamiditas incluyeron el acoplamiento de los bloques de construcción de fosforamidita usando 100 j l de soluciones 0,1 M en acetonitrilo y 110 j l de una solución 0,1 M de 5-(3,5-bis(trifluorometilfenil))-1 H-tetrazol en acetonitrilo con un tiempo de acoplamiento de 180 s. Se realizaron acoplamientos triples. La tiooxidación se realizó usando una solución 0,1 M de 3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona en acetonitrilo/piridina 1:1 (3x190 jl, 55 s). Para la agregación de caperuza, se aplicaron soluciones de THF/lutidina/Ac2O 8:1:1 (CapA, 75 jm ol) y THF/N-metilimidazol 8:2 (CapB, 75 jmol) durante 55 s. La desprotección de DMT y liberación del tiol se realizaron con ácido tricloroacético al 3 % (p/v) en CH2 O 2 en 15 aplicaciones de 200 j l durante 30 s. La desprotección de DMT y liberación del tiol también se realizaron de forma ventajosa con 3-6 aplicaciones de 200 j l durante 45 s de ácido trifluoroacético al 1-10 % (v/v) o ácido tricloroacético al 5-10 % (p/v), en presencia de trietilsilano al 5-30 % (v/v) en CH2 O 2 y/o p-metoxitiofenol al 2-10 % en CH2Cl2.
Las tiofosforamiditas se acoplaron tres veces con 100 j l de soluciones 0,15 M en CH2O 2 al 10 % (v/v) en acetonitrilo y 110 j l de una solución 0,1 M de 5-(3,5-bis(trifluorometilfenil))-1 H-tetrazol en acetonitrilo como activador y un tiempo de acoplamiento de 600 s en cada caso. Se aplicaron procedimientos de tiooxidación estándar usando una solución 0,1 M de 3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona en acetonitrilo/piridina 1:1 (3x190 jl, 55 s) y de agregación de caperuza usando THF/lutidina/Ac2O 8:1:1 (CapA, 75 jmol) y THF/N-metilimidazol 8:2 (CapB, 75 jmol) (55 s).
La retirada de los grupos protectores de nucleobase y escisión del soporte sólido se logró usando una mezcla de amoníaco (32 %):etanol (3:1, v:v) que contenía DTT 20 mM a 55 °C durante 15-16 h. Los oligonucleótidos brutos con DMT se purificaron usando un cartucho de extracción en fase sólida y repurificación con cromatografía de intercambio iónico o bien por purificación por RP-HPLC usando una columna C18 seguido de retirada de DMT con ácido acético acuoso al 80 % y precipitación con etanol.
De acuerdo con los procedimientos generales anteriores, se prepararon las siguientes moléculas.
Figure imgf000031_0001
Modificaciones de tritioato entre nucleótidos en negrita y subrayados
A, G, mC, T representan nucleótidos de ANB
a, g, c, t representan nucleótidos de ADN
todos los demás enlaces se prepararon como fosforotioatos
Los compuestos n.° 1-13 se basan en la SEQ ID NO: 1. Difieren en la posición del enlace internucleosídico fosforotritioato de fórmula (I) como se indica en la tabla anterior.
Ejemplo 1
Datos de actividad in vitro
Se cultivaron células LTK en medios de cultivo celular (DMEM [Sigma, n.° de cat. D0819] complementados con suero fetal bovino al 10 % [Sigma, n.° de cat. F7524 y 0,025 mg/ml de gentamicina [Sigma, n.° de cat. G1397]). Las células se tripsinizaron cada 5 días lavando con solución salina tamponada con fosfato (PBS), [Sigma n.° de cat.
14190-094] seguido de adición de una solución de tripsina-EDTA al 0,25 % (Sigma, T3924), 2-3 minutos de incubación a 37 °C y trituración antes de la siembra celular. Las células se mantuvieron en cultivo durante hasta 15 pases.
Para su uso experimental, se sembraron 2000 células por pocillo en placas de 96 pocillos (Nunc, n.° de cat.
167008) en 100 |jl de medios de cultivo. Los oligonucleótidos se prepararon a partir de una solución madre 750 |jM. Se añadieron oligonucleótidos disueltos en PBS aproximadamente 24 horas después de que las células se sembraran hasta el intervalo de concentración final de 16-50.000 nM. Las células se cultivaron en presencia de oligonucleótido durante 3 días.
Se obtuvieron células por retirada de los medios seguido de adición de 125 j l de tampón de lisis PureLink©Pro 96 (Invitrogen 12173.001A) y 125 j l de etanol al 70 %. El ARN se purificó de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se eluyó en un volumen final de 50 j l de agua, lo que dio como resultado una concentración de ARN de 10-20 ng/jl. El ARN se diluyó 10 veces en agua antes de la reacción de qPCR de una etapa. Para la reacción de qPCR de una etapa, se mezcló mezcla de qPCR (qScriptTMXLE 1-step RT-qPCR ToughMix®Low ROX de QauntaBio, n.° de cat. 95134-500) con dos sondas Taqman en una proporción 10:1:1 (mezcla de qPCR: sonda1 :sonda2) para generar la mezcla maestra. Las sondas Taqman se adquirieron de LifeTechnologies: MALAT1: Mm01227912; BCL2: Mm00477631; GAPDH 4352339E. A continuación, se mezclaron la mezcla maestra (6 j l) y ARN (4 jl, 1-2 ng/jl) en una placa de qPCR (MicroAmp®optical, 384 pocillos, 4309849). Después del sellado, la placa se centrifugó a 1000 g durante 1 minuto a TA y se transfirió a un sistema ViiaTM7 (Applied Biosystems, Thermo) y se usaron las siguientes condiciones de p CR: 50 °C durante 15 minutos; 95 °C durante 3 minutos; 40 ciclos de: 95 °C durante 5 s seguido de una disminución de temperatura de 1,6 °C/s seguido de 60 °C durante 45 s. Los datos se analizaron usando el programa informático QuantStudioTM Real_time PCR.
Los resultados se muestran en la figura 1.
Los datos demuestran claramente que esta modificación se tolera bien. Además, existe un gran potencial de esta modificación para la optimización de oligonucleótidos con fosforotioato de otro modo regulares. En muchos casos, se obtienen valores de CI50 significativamente menores por la introducción de tan solo una única modificación. La introducción de esta modificación en los flancos de ANB de los gápmeros da como resultado un beneficio particular. Esto muestra claramente el valor de la modificación para la optimización de la potencia y más allá de la retirada de los centros quirales de los oligonucleótidos con fosforotioato.
Ejemplo 2
Medición de los niveles de ARNm diana (Malat1) en el corazón con una dosis de 15 mg/kg
A los ratones (C57/BL6) se les administró una dosis de 15 mg/kg del oligonucleótido por vía subcutánea en tres dosis los días 1,2 y 3 (n=5). Los ratones se sacrificaron el día 8 y se midió la reducción del ARN de MALAT-1 en el corazón. El compuesto original se administró en dos dosis, 3*15 mg/kg y 3*30 mg/kg.
Los resultados se muestran en la figura 2.
Ejemplo 3
Afinidad de unión hacia ARN de ApoB
Las siguientes secuencias de ApoB se generaron de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1.
Figure imgf000033_0001
Modificaciones de tritioato entre nucleótidos en negrita y subrayados
A, G, C, T representan nucleótidos de ANB
a, g, c, t representan nucleótidos de ADN
todos los demás enlaces se prepararon como fosforotioatos
Los compuestos n.° 14-21 de se basan en la SEQ ID NO: 2. Difieren en la posición del enlace internucleosídico fosforotritioato de fórmula (I) como se indica en la tabla anterior.
La temperatura de fusión de los dúplex de ANB se midió en un Cary 300 (Agilent) equipado con un controlador térmico. Los ANB y el ARN de la contrahebra se hibridaron para proporcionar una concentración equimolar de 1,5 |jM en solución salina tamponada con fosfato (Na2HPO420 mM, NaCl 200 mM, EDTA 0,2 mM, pH = 7). Se midieron las absorciones a 260 nm. El gradiente de temperatura se mantuvo a 1 °C/min para el intervalo de 25 °C a 95 °C y el tiempo de hueco se fijó en 3 min a 25 °C y 95 °C, respectivamente. Se tomaron lecturas de absorbancia cada 30 segundos. Los perfiles de fusión se ajustaron a una forma sigmoidea y la Tf se determinó por la derivada de los mismos.

Claims (32)

REIVINDICACIONES
1. Un oligonucleótido que comprende al menos un enlace intemucleosídico fosforotritioato de fórmula (I)
Figure imgf000035_0001
en la que (A1) es un nucleósido 3', (A2) es un nucleósido 5' y R es hidrógeno.
2. Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el nucleósido (A1) es un nucleósido de ADN, un nucleósido de ARN o un nucleósido modificado en glúcido, que es un nucleósido modificado en glúcido en 2'.
3. Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el nucleósido (A1) es un nucleósido de ADN o un nucleósido modificado en glúcido, que es un nucleósido modificado en glúcido en 2'.
4. Un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el nucleósido (A2) es un nucleósido de ADN, un nucleósido de ARN o un nucleósido modificado en glúcido, que es un nucleósido modificado en glúcido en 2'.
5. Un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el nucleósido (A2) es un nucleósido de ADN o un nucleósido modificado en glúcido, que es un nucleósido modificado en glúcido en 2'.
6. Un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el nucleósido (A2) es 2'-alcoxi-ARN, en particular, 2'-metoxi-ARN, 2'-alcoxialcoxi-ARN, en particular, 2'-metoxietoxi-ARN, 2'-amino-ADN, 2'-fluoro-ARN o 2'-fluoro-AAN.
7. Un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el nucleósido (A2) es un nucleósido de ANB.
8. Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el nucleósido de ANB se selecciona independientemente de beta-D-oxi-ANB, 6'-metil-beta-D-oxi-ANB y ENA, en particular, beta-D-oxi-ANB.
9. Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que al menos uno de los nucleósidos (A1) y (A2) es un 2'-alcoxialcoxi-ARN.
10. Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el 2'-alcoxialcoxi-ARN es 2'-metoxietoxi-ARN.
11. Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los nucleósidos (A1) y (A2) son ambos nucleósidos de ADN o ambos nucleósidos de nucleósidos modificados en glúcido en 2', en particular, nucleósidos de ANB.
12. Un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende otros enlaces internucleosídicos seleccionados de enlace internucleosídico fosfodiéster, enlace internucleosídico fosforotioato y enlace internucleosídico fosforotritioato de fórmula (I), como se define en la reivindicación 1.
13. Un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende otros enlaces internucleosídicos seleccionados de enlace internucleosídico fosforotioato y enlace internucleosídico fosforotritioato de fórmula (I), como se define en la reivindicación 1.
14. Un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende entre 1 y 15, en particular, entre 1 y 5, más en particular, 1, 2, 3, 4 o 5 enlaces internucleosídicos fosforotritioato de fórmula (I), como se define en la reivindicación 1.
15. Un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que los demás enlaces internucleosídicos son todos enlaces internucleosídicos fosforotioato de fórmula -P(=S)(oR)O2-, en la que R es como se define en la reivindicación 1.
16. Un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que comprende otros nucleósidos seleccionados de nucleósido de ADN, nucleósido de ARN y nucleósidos modificados en glúcido.
17. Un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que uno o más nucleósidos es un nucleósido modificado en nucleobase.
18. Un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que el oligonucleótido es un oligonucleótido antisentido, un ARNip, un mimético de microARN o una ribozima.
19. Un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que el oligonucleótido es un oligonucleótido gápmero antisentido.
20. Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el enlace internucleosídico fosforotritioato de fórmula (I) está en la región de hueco del oligonucleótido gápmero.
21. Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el enlace internucleosídico fosforotritioato de fórmula (I) está en la región de flanco del oligonucleótido gápmero.
22. Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 19 a 21, en el que el oligonucleótido gápmero es un gápmero de ANB, un gápmero de ala mixta o un gápmero sustituido en 2', en particular, un gápmero de 2'-O-metoxietilo.
23. Un oligonucleótido gápmero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, en el que el oligonucleótido gápmero comprende una secuencia de nucleótidos contigua de fórmula 5'-F-G-F'-3', en la que G es una región de 5 a 18 nucleósidos que puede reclutar RNasa H, y dicha región G está flanqueada en 5' y en 3' por las regiones flanqueantes F y F' respectivamente, en la que las regiones F y F' comprenden o consisten independientemente en de 1 a 7 nucleótidos modificados en glúcido en 2', en la que el nucleósido de la región F que sea adyacente a la región G es un nucleósido modificado en glúcido en 2' y en la que el nucleósido de la región F' que sea adyacente a la región G es un nucleósido modificado en glúcido en 2'.
24. Un oligonucleótido gápmero de acuerdo con la reivindicación 23, en el que dicho al menos un enlace internucleosídico fosforotritioato de fórmula (I) como se define en la reivindicación 1 se sitúa entre nucleósidos adyacentes en la región G o entre la región G y la región F'.
25. Un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en el que el oligonucleótido es un totálmero o míxmero de oligonucleótido antisentido, en particular, un oligonucleótido de cambio de empalme o un oligonucleótido inhibidor de microARN.
26. Una sal farmacéuticamente aceptable de un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en particular, una sal de sodio o una de potasio.
27. Un conjugado que comprende un oligonucleótido o una sal farmacéuticamente aceptable de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26 y al menos un resto de conjugado fijado de forma covalente a dicho oligonucleótido o a dicha sal farmacéuticamente aceptable, opcionalmente por medio de un resto conector.
28. Una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido, una sal farmacéuticamente aceptable o un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27 y un vehículo terapéuticamente inerte.
29. Un oligonucleótido, sal farmacéuticamente aceptable o conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27 para su uso como sustancia terapéuticamente activa.
30. Un oligonucleótido, sal farmacéuticamente aceptable o conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27 para su uso en el tratamiento o profilaxis de una cardiopatía o hemopatía.
31. Un procedimiento para la preparación de un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, que comprende las siguientes etapas:
(a) acoplar un nucleósido tiofosforamidita al átomo de azufre 5' terminal de un oligonucleótido o nucleósido modificado en glúcido en 5' para producir un intermedio de triéster de ditiofosfito;
(b) tiooxidar el intermedio de triéster de ditiofosfito obtenido en la etapa a); y
(c) opcionalmente alargar adicionalmente el oligonucleótido.
32. Un oligonucleótido preparado de acuerdo con un procedimiento de la reivindicación 31.
ES19755294T 2018-07-31 2019-07-30 Oligonucleótidos que comprenden un enlace internucleosídico fosforotritioato Active ES2924362T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18186679 2018-07-31
PCT/EP2019/070406 WO2020025563A1 (en) 2018-07-31 2019-07-30 Oligonucleotides comprising a phosphorotrithioate internucleoside linkage

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2924362T3 true ES2924362T3 (es) 2022-10-06

Family

ID=63259379

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES19755294T Active ES2924362T3 (es) 2018-07-31 2019-07-30 Oligonucleótidos que comprenden un enlace internucleosídico fosforotritioato

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20210292358A1 (es)
EP (2) EP4122943B1 (es)
JP (1) JP7470097B2 (es)
KR (1) KR20210040060A (es)
CN (1) CN112513060B (es)
AU (1) AU2019313527A1 (es)
BR (1) BR112021001756A2 (es)
CA (1) CA3105705A1 (es)
ES (1) ES2924362T3 (es)
IL (1) IL280255A (es)
MX (1) MX2021001019A (es)
PL (1) PL3830102T3 (es)
TW (1) TW202020155A (es)
WO (1) WO2020025563A1 (es)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4110924A4 (en) * 2020-02-28 2024-03-13 Ionis Pharmaceuticals, Inc. COMPOUNDS AND METHODS FOR MODULATING PRE-MRNA SPLICEING
TWI866002B (zh) * 2021-12-29 2024-12-11 財團法人生物技術開發中心 反義寡核苷酸及其用途
CN115407655B (zh) * 2022-08-25 2025-11-21 大连大学 一种基于DNA链置换的延迟酶促反应超灵敏Brink控制的实现方法
IL324922A (en) * 2023-06-02 2026-01-01 Avidity Biosciences Inc Conjugate compositions comprising phosphoryl guanidine linkages and uses thereof

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993007883A1 (en) 1991-10-24 1993-04-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
US5864031A (en) * 1994-07-29 1999-01-26 Amgen Inc. Process for preparing 5-dithio-modified oligonucleotides
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
AU9063398A (en) 1997-09-12 1999-04-05 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
CZ296576B6 (cs) 1999-02-12 2006-04-12 Sankyo Company Limited Nukleosidový analog a oligonukleotidový analog a farmaceutický prostredek, sonda a primer s jeho obsahem
EP1178999B1 (en) 1999-05-04 2007-03-14 Santaris Pharma A/S L-ribo-lna analogues
US6617442B1 (en) 1999-09-30 2003-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof
US9045518B2 (en) 2002-11-18 2015-06-02 Santaris Pharma A/S Amino-LNA, thio-LNA and alpha-L-oxy-LN
CA2519860C (en) * 2003-03-21 2018-01-16 Santaris Pharma A/S Short interfering rna (sirna) analogues
JP5342881B2 (ja) 2006-01-27 2013-11-13 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド ６−修飾された二環式核酸類似体
DK1984382T3 (da) * 2006-01-27 2012-09-03 Santaris Pharma As LNA modificerede fosforthiolerede oligonukleotider
CA2648132C (en) 2006-04-03 2019-05-28 Santaris Pharma A/S Pharmaceutical composition comprising anti-mirna antisense oligonucleotides
EP2023940B1 (en) 2006-05-05 2011-06-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating expression of sglt2
US7666854B2 (en) 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
AU2007249349B2 (en) 2006-05-11 2012-03-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-Modified bicyclic nucleic acid analogs
WO2008049085A1 (en) 2006-10-18 2008-04-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense compounds
US20090264353A1 (en) * 2007-10-19 2009-10-22 Santaris Pharma A/S Splice Switching Oligomers for TNF Superfamily Receptors and their Use in Treatment of Disease
WO2008113832A2 (en) 2007-03-22 2008-09-25 Santaris Pharma A/S SHORT RNA ANTAGONIST COMPOUNDS FOR THE MODULATION OF TARGET mRNA
EP2170917B1 (en) 2007-05-30 2012-06-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
EP2173760B2 (en) 2007-06-08 2015-11-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs
CA2692579C (en) 2007-07-05 2016-05-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-disubstituted bicyclic nucleic acid analogs
EP2623599B1 (en) 2007-10-04 2019-01-02 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Micromirs
US8546556B2 (en) 2007-11-21 2013-10-01 Isis Pharmaceuticals, Inc Carbocyclic alpha-L-bicyclic nucleic acid analogs
WO2010036698A1 (en) 2008-09-24 2010-04-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted alpha-l-bicyclic nucleosides
EP2462153B1 (en) 2009-08-06 2015-07-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
EP2580228B1 (en) 2010-06-08 2016-03-23 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Substituted 2'-amino and 2'-thio-bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
US10017764B2 (en) 2011-02-08 2018-07-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof
ES2651514T3 (es) 2011-08-11 2018-01-26 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compuestos oligoméricos gapados que comprenden deoxirribonucleósidos modificados en 5 ' -en la brecha y usos de ellos
EP3453761A1 (en) 2011-08-29 2019-03-13 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use
CN104136451A (zh) 2011-09-07 2014-11-05 玛瑞纳生物技术有限公司 具有构象限制的单体的核酸化合物的合成和用途
EP2850092B1 (en) 2012-04-09 2017-03-01 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Tricyclic nucleic acid analogs
US10077443B2 (en) 2012-11-15 2018-09-18 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide conjugates
DK2991656T3 (da) 2013-05-01 2020-03-23 Ionis Pharmaceuticals Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til modulering af apolipoprotein c-iii-ekspression
ES2770667T3 (es) 2013-06-27 2020-07-02 Roche Innovation Ct Copenhagen As Oligómeros antisentido y conjugados que se dirigen a PCSK9
WO2015113922A1 (en) 2014-01-30 2015-08-06 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Poly oligomer compound with biocleavable conjugates
EP3020813A1 (en) * 2014-11-16 2016-05-18 Neurovision Pharma GmbH Antisense-oligonucleotides as inhibitors of TGF-R signaling
WO2016127002A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Lna oligonucleotides with alternating flanks
EP3394258B1 (en) 2015-10-22 2021-09-22 Roche Innovation Center Copenhagen A/S In vitro toxicity screening assay

Also Published As

Publication number Publication date
CN112513060B (zh) 2024-08-06
CN112513060A (zh) 2021-03-16
EP3830102B1 (en) 2022-06-08
TW202020155A (zh) 2020-06-01
PL3830102T3 (pl) 2022-10-03
EP3830102A1 (en) 2021-06-09
KR20210040060A (ko) 2021-04-12
JP2021533118A (ja) 2021-12-02
CA3105705A1 (en) 2020-02-06
MX2021001019A (es) 2021-04-19
AU2019313527A8 (en) 2021-03-11
IL280255A (en) 2021-03-01
JP7470097B2 (ja) 2024-04-17
EP4122943A1 (en) 2023-01-25
AU2019313527A1 (en) 2021-02-11
BR112021001756A2 (pt) 2021-05-11
EP4122943B1 (en) 2024-05-29
EP4122943C0 (en) 2024-05-29
US20210292358A1 (en) 2021-09-23
WO2020025563A1 (en) 2020-02-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2924362T3 (es) Oligonucleótidos que comprenden un enlace internucleosídico fosforotritioato
US20220112493A1 (en) Phosphonoacetate gapmer oligonucleotides
EP3830101B1 (en) Oligonucleotides comprising a phosphorotrithioate internucleoside linkage
HK40119680A (zh) 包含三硫代磷酸酯核苷间键的寡核苷酸
HK40046699B (zh) 包含三硫代磷酸酯核苷间键的寡核苷酸
US20220073916A1 (en) Novel phosphoramidites
HK40046699A (en) Oligonucleotides comprising a phosphorotrithioate internucleoside linkage
HK40044075A (en) Oligonucleotides comprising a phosphorotrithioate internucleoside linkage
HK40060208A (en) Phosphonoacetate gapmer oligonucleotides