ES2925105T3 - Procedimiento de preparación de una muestra a analizar obtenida a partir de una matriz alimentaria - Google Patents
Procedimiento de preparación de una muestra a analizar obtenida a partir de una matriz alimentaria Download PDFInfo
- Publication number
- ES2925105T3 ES2925105T3 ES19207805T ES19207805T ES2925105T3 ES 2925105 T3 ES2925105 T3 ES 2925105T3 ES 19207805 T ES19207805 T ES 19207805T ES 19207805 T ES19207805 T ES 19207805T ES 2925105 T3 ES2925105 T3 ES 2925105T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- sample
- filter
- biological species
- channel
- analyzed
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 235000013305 food Nutrition 0.000 title claims abstract description 35
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 title claims abstract description 25
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 24
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 19
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000011045 prefiltration Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 11
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract 5
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims abstract 2
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 22
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 17
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 claims description 16
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 13
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 11
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 11
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 claims description 11
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 6
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 claims description 6
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 2
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 claims description 2
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 claims description 2
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 claims description 2
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 claims description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 2
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 claims description 2
- 229940066758 endopeptidases Drugs 0.000 claims description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 2
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 claims description 2
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 claims description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 claims description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 claims description 2
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 claims description 2
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 claims description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 32
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 21
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 7
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 3
- 235000013350 formula milk Nutrition 0.000 description 3
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 241000219315 Spinacia Species 0.000 description 2
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000014670 detection of bacterium Effects 0.000 description 2
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000012780 transparent material Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000007769 metal material Substances 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000007650 screen-printing Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000003746 surface roughness Effects 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/38—Diluting, dispersing or mixing samples
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/40—Concentrating samples
- G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/40—Concentrating samples
- G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
- G01N2001/4088—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids filtration
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/02—Food
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
La invención se refiere a un método para preparar una muestra a partir de una muestra de matriz alimentaria, conteniendo dicha muestra especies biológicas a analizar, comprendiendo el método:- Una etapa (E3) de diluir una primera muestra de dicha muestra con una proteasa durante un tiempo suficiente para degradar dicha primera muestra y obtener una segunda muestra líquida, - Una etapa (E4) de prefiltración de dicha segunda muestra líquida a través de un primer filtro (F1) para separar primeras moléculas (M1) que son de tamaño mayor que el de los poros de dicho primer filtro (F1), con vistas a la obtención de una tercera muestra que comprenda la especie biológica a analizar y unas segundas moléculas (M2) de tamaños inferiores a los de los poros de dicho primer filtro, - Una etapa (E5) de filtrado de dicho tercer muestra a través de un segundo filtro (F2) para separar dichas especies biológicas de dichas segundas moléculas (M2). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimiento de preparación de una muestra a analizar obtenida a partir de una matriz alimentaria
Campo técnico de la invención
La invención se refiere a un procedimiento para preparar una muestra con vistas a realizar un análisis de especies biológicas dianas, tales como, por ejemplo, bacterias, en una matriz alimentaria o en la línea de producción de una matriz alimentaria. Por matriz alimentaria, se entiende de manera no limitativa una muestra de productos tales como salmón, leche (en particular infantil en polvo), carne picada, jamón, etc.
Estado de la técnica
La detección de bacterias en una muestra alimentaria en la línea de producción se ha vuelto necesaria en la actualidad por cuestiones de higiene y de respecto de las normas y de reglamentación.
Los métodos utilizados actualmente son frecuentemente largos de lleva a cabo y, por lo tanto, son muy a menudo poco eficaces y de rendimiento insuficiente ya que requieren un volumen de matriz alimentaria particularmente consecuente para obtener una muestra final que comprende suficientemente bacterias.
El bajo nivel de contaminación de las células dianas, asociado a la complejidad y diversidad de las matrices alimentarias, supone un auténtico reto para el desarrollo de una técnica de detección. En efecto, los alimentos son muestras complejas que comprenden no solo una multitud de microorganismos, sino también proteínas, grasas o restos que pueden interferir con el método de detección. Las técnicas de detección son en su mayor parte rápidas y sensibles, pero requieren un tiempo de enriquecimiento importante (entre 7 h y 26 h) para alcanzar un número suficiente de células dianas. Las técnicas de detección están también limitadas por el volumen de muestra de ensayo, a menudo demasiado bajo, lo que conduce a una mala representatividad del conjunto de la muestra cuando está poco contaminada.
Destaca de ello que existe la necesidad de establecer un procedimiento de preparación adaptado para el análisis cualitativo y cuantitativo de las bacterias presentes en una muestra alimentaria o en una muestra tomada en la línea de producción de un producto alimentario, permitiendo este procedimiento de preparación obtener al final una muestra a analizar de manera rápida y con un rendimiento muy satisfactorio, es decir con una alta concentración de bacterias a analizar a partir de una muestra inicial en cantidad limitada.
La solicitud de patente US2018/180611A1 describe un método para detectar patógenos en muestras alimentarias. Este método utiliza en particular membranas fibrosas para llevar a cabo la separación de las especies biológicas. Exposición de la invención
Este objeto se alcanza mediante un procedimiento para preparar una muestra a partir de una extracción de matriz alimentaria o de una extracción tomada en una línea de fabricación de productos alimentarios, según la reivindicación 1. Otras realizaciones se describen en las reivindicaciones dependientes.
La invención se refiere también al uso del procedimiento según la reivindicación 1, para preparar una muestra que contiene especies biológicas a analizar según una técnica de análisis escogida de q-PCR, LAMP, secuenciación, detección inmunológica.
Por las razones de complejidad mencionadas anteriormente, cabe señalar que la filtración es una técnica interesante para tratar un gran volumen de muestra, así como para concentrar y purificar los patógenos diana.
Breve descripción de las figuras.
Otras características y ventajas aparecerán en la descripción detallada que se da a continuación con respecto a los dibujos anexos en los que:
- La Figura 1 representa un diagrama que muestra las diferentes etapas del procedimiento de preparación de la invención.
- La Figura 2 ilustra, de manera esquemática, las diferentes etapas de filtrado llevadas a cabo en el procedimiento de preparación de la invención.
- La Figura 3A representa un dispositivo de preparación que se puede utilizar para llevar a cabo el procedimiento. - La Figura 3B representa la conexión en serie de dos dispositivos tales como el de la Figura 3A.
- La Figura 3C ilustra el principio de intercambiabilidad de filtros en el dispositivo de la Figura 3A.
- La Figura 4 ilustra, mediante dos diagramas, el interés de añadir una antiproteasa en el procedimiento de la invención.
Descripción detallada de al menos una realización
La invención se refiere a un procedimiento para preparar una muestra con el fin de detectar especies biológicas presentes en una extracción de matriz alimentaria o en una extracción tomada en una línea de fabricación de productos alimentarios. En este último caso, no se tratará por lo tanto necesariamente de una extracción de matriz alimentaria, sino de una extracción de una película o equivalente en la línea de producción. De manera no limitativa, se considerará que el procedimiento está esencialmente adaptado para una extracción directa de la matriz alimentaria.
La matriz alimentaria que sirve de base para la extracción a analizar puede extraerse directamente de la línea de producción o del producto terminado.
De manera no limitativa, la matriz alimentaria puede consistir en leche (en particular infantil), jamón, carne picada, salmón, espinacas o incluso croquetas para animales.
Las especies biológicas dianas son esencialmente bacterias, pero también podría tratarse de cualquier tipo de microorganismos o moléculas de ADN. En el resto de la descripción, el procedimiento se describirá con mayor precisión para especies biológicas de tipo bacterias.
De manera no limitativa, el análisis posterior de las especies biológicas se podrá llevar a cabo según diferentes técnicas conocidas tales como Q-PCR (Polymerase Chain Reaction), LAMP, secuenciación, etc.
Con referencia a las Figuras 1 y 2, según la invención, el procedimiento de preparación de una muestra para la detección de bacterias comprende las siguientes etapas descritas a continuación.
Etapa E1
Se trata de una etapa de extracción de la matriz alimentaria a analizar. Como se mencionó anteriormente, ésta podrá ser de cualquier tipo.
Etapa E2
Como norma general, se realiza una primera dilución de la matriz alimentaria extraída en un líquido de enriquecimiento con el fin de obtener una proliferación de bacterias (por ejemplo 25 g del producto alimentario csp 250 ml de líquido del medio de enriquecimiento)
Etapa E3
Se trata de una etapa clave del procedimiento de preparación de la invención que consiste en realizar una segunda dilución de la muestra ya diluida en la etapa anterior con un líquido que contiene una proteasa.
Las matrices alimentarias son, en efecto, muestras complejas, que comprenden no solo una multitud de microorganismos naturalmente presentes, sino también restos, grasas o también proteínas que limitan la filtración de un gran volumen de la muestra, ya que los filtros se obstruyen rápidamente. El principio es por lo tanto utilizar la proteasa para degradar los pequeños elementos presentes en la matriz o en la superficie de las bacterias para disociarlos (bacterias-partículas, partículas-partículas) y permitir una mejor filtración de la muestra. De manera ventajosa, se lleva así a la proteasa a degradar las proteínas y los pequeños elementos proteicos sin afectar a la viabilidad de las bacterias.
De manera no limitativa, la proteasa se puede escoger de endopeptidasas o exopeptidasas, tales como tripsina, quimotripsina, trombina y papaína, endolisis C, etc.
A continuación en la descripción, de manera no limitativa, la proteasa que se utiliza es la tripsina.
Etapa E4
Se trata de una etapa de prefiltración de la muestra obtenida después de la dilución con la proteasa.
Esta etapa de prefiltración se lleva a cabo utilizando un primer filtro F1 que tiene poros que tienen un tamaño suficiente para separar las moléculas M1 de la matriz alimentaria que son de gran tamaño con respecto al resto de la muestra.
Etapa E5
Se trata de la etapa principal de filtración de la muestra que se obtiene después de la etapa anterior de prefiltración. Esta etapa de filtración se lleva a cabo usando un segundo filtro F2 que tiene poros de un tamaño menor que el de los poros del primer filtro F1 usado durante la prefiltración.
Así, durante la filtración, las moléculas M2 de la matriz alimentaria más pequeñas pasan a través del filtro, y las especies biológicas dianas, es decir, las bacterias B, se quedan por encima de este filtro.
Etapa E6 (opcional)
Las bacterias B presentes por encima del filtro se eluyen a fin de ser recogidas para el análisis.
La proteasa añadida inicialmente permite también mejorar la elución de las especies biológicas tales como las bacterias concentradas en el filtro F1. La adición de la proteasa permite limitar en efecto la adsorción no específica de bacterias en las superficies, en particular las del filtro, y por lo tanto asegurar la máxima recuperación de bacterias.
La muestra final obtenida está por lo tanto lista para el análisis.
Etapa E7
Se trata de la etapa de análisis de la muestra obtenida anteriormente. El análisis se puede llevar a cabo según diferentes técnicas mencionadas anteriormente.
De manera no limitativa, el procedimiento de preparación se puede llevar a cabo respetando uno o más de los siguientes principios:
- El primer filtro F1 puede estar provisto de poros de un tamaño comprendido entre 1 pm y 8 pm, ventajosamente comprendido entre 3 pm y 6 pm, ventajosamente 5 pm.
- El segundo filtro F2 puede estar provisto de poros de un tamaño comprendido entre 0,2 pm y 1 pm, ventajosamente comprendido entre 0,4 pm y 0,8 pm, ventajosamente 0,6 pm o 0,8 pm según la técnica de análisis empleada posteriormente.
- El procedimiento se puede llevar a cabo, al menos a partir de la etapa de filtración, utilizando un dispositivo de preparación tal como se describe en la solicitud de patente EP3222989A1.
Con respecto a la Figura 3A, este dispositivo de preparación 1 comprende una carcasa que comprende una pared inferior 10, una pared lateral 11 y una pared superior 12. Todas las paredes de la carcasa serán preferentemente realizadas del mismo material. Este material será apto en particular para poder someterse a un calentamiento un rango de temperatura comprendido entre 20°C y 100°C. Preferiblemente, algunas paredes de la carcasa, al menos su pared lateral, estarán realizadas de un material transparente. Preferentemente, el material utilizado será un plástico, por ejemplo del tipo PMMA (Poli(Metacrilato de Metilo)).
El dispositivo 1 comprende una cámara 13 dispuesta en la carcasa. Esta cámara representa el lugar en el que se pueden llevar a cabo tanto la purificación/concentración, la lisis mecánica, la separación y eventualmente la detección en las especies biológicas. La cámara 13 está cerrada hacia abajo por la pared inferior de la carcasa.
El dispositivo comprende un primer canal 14 para inyectar fluidos en la cámara o para evacuar fluidos fuera de la cámara. El primer canal 14 comprende un primer extremo que comprende una abertura dispuesta por ejemplo a través de la pared superior 12 de la carcasa, y un segundo extremo que desemboca en dicha cámara 13. El primer extremo del primer canal 14 está dispuesto por ejemplo verticalmente, y su segundo extremo desemboca por ejemplo horizontalmente en la cámara 13. El primer extremo del primer canal está por ejemplo ensanchado para aplicarle el cono de una pipeta o estará adaptado al tipo de dispositivo utilizado para inyectar el fluido en el dispositivo. A título de ejemplo, puede tratarse de una abertura que tiene una boquilla de tipo Luer para conectarle una jeringa, o adaptada para conectar un circuito fluídico tal como el que se describirá a continuación.
El dispositivo comprende un segundo canal 15. Este segundo canal 15 comprende también un primer extremo que comunica con el exterior, formando una abertura practicada por ejemplo a través de la pared superior de la carcasa, y un segundo extremo que comunica con el espacio formado por la cámara 13. A través de este segundo canal 15, también se puede inyectar fluidos en dicha cámara o evacuar fluidos fuera de dicha cámara. Su primer extremo está dispuesto, por ejemplo, verticalmente y su segundo extremo horizontalmente. La cámara 13 se coloca entre el primer canal 14 y el segundo canal 15. De manera idéntica, el primer extremo de este segundo canal está por ejemplo ensanchado para aplicarle el cono de una pipeta, o estará adaptado al tipo de dispositivo utilizado para inyectar el fluido en el dispositivo. A título de ejemplo, puede tratarse de una abertura que tiene una boquilla del tipo Luer para conectarle una jeringa, o adaptada para conectarle un circuito fluídico.
Hacia arriba, la cámara 13 puede estar cerrada por una membrana 18 flexible y estirable, preferiblemente transparente. La pared superior 12 de la carcasa del dispositivo comprende así una abertura que está recubierta herméticamente por dicha membrana 18. Dicha membrana queda así anclada en la carcasa mediante cualquier solución de fijación adaptada, por ejemplo mediante pegamento. Esta membrana 18 estará por ejemplo compuesta por una película, por ejemplo del tipo MicroAmp, 3M (marcas registradas), de grosor, dimensiones y constitución adaptados para deformarse elásticamente con respecto a sus puntos de anclaje, en particular hasta el fondo de la cámara 13.
Por el término “transparente”, se entiende que el material utilizado es al menos parcialmente transparente a la luz visible, de manera que permita dejar pasar al menos 80% de esta luz. Debe entenderse así que será suficientemente transparente para ver el interior de la cámara 13, al menos el segundo espacio situado por encima del filtro.
El dispositivo comprende un filtro 16 dispuesto en dicha cámara 13 y que separa dicha cámara 13 en dos espacios. Los dos espacios están, por ejemplo, superpuestos y se denominan por lo tanto espacio inferior 130 situado debajo del filtro y espacio superior 131 situado por encima del filtro. Este filtro 16 está preferentemente realizado en todo o en parte en forma de una película flexible y delgada, estirada en el espacio formado por la cámara de manera a permitir el paso de un espacio a otro únicamente por los poros del filtro 16. La película tiene una deformabilidad elástica que le permite estirarse cuando se ejerce una fuerza de apoyo en una dirección sustancialmente vertical, teniendo esta deformabilidad elástica un nivel suficiente para alcanzar la superficie inferior de la cámara 13. El filtro 16 tiene un diámetro medio de poros tal como se define anteriormente. El diámetro de los poros está por supuesto adaptado para asegurar una separación entre las diferentes especies biológicas presentes en la muestra. El filtro 16 estará por ejemplo compuesto por una película de grosor, dimensiones y constitución adaptada para deformarse hasta el fondo de la cámara 13 con respecto a sus puntos de anclaje. Según una realización particular, el filtro también puede ser realizado de un material transparente, por ejemplo con las mismas características de transparencia que la membrana.
El dispositivo puede comprender ventajosamente una superficie de apoyo rugosa 17 dispuesta en el fondo de la cámara 13. Esta superficie de apoyo rugosa 17 se extiende sobre una mayor parte del fondo de la cámara. Tiene un parámetro de rugosidad superficial medio comprendido entre 0,1 pm y 10 pm, preferentemente comprendido entre 0,2 pm y 3 pm. Esta superficie de apoyo rugosa 17 está destinada a permitir una lisis mecánica de las especies biológicas presentes en una muestra biológica colocada en el dispositivo. Preferiblemente, la lisis mecánica se realiza triturando dichas especies biológicas, por abrasión sobre dicha superficie de apoyo rugosa. La operación de trituración se lleva a cabo mediante un movimiento de fricción de las especies biológicas contra la superficie de apoyo rugosa, utilizando un elemento de trituración adaptado. Este elemento será, por ejemplo, una espátula o una varilla, por ejemplo de material plástico o metálico. Este elemento se aplica desde el exterior de la cámara 13 y su extremo se aplica contra la superficie exterior de la membrana 18 de manera a estirar la membrana 18 y el filtro hacia el fondo de la cámara y así friccionar las especies biológicas presentes en una muestra contra la superficie de apoyo rugosa.
Preferiblemente, la carcasa puede integrar ventajosamente medios de calentamiento del espacio interior de la cámara, compuestos por ejemplo por al menos una resistencia 19 calefactora o por un elemento Peltier, como se muestra en las figuras anexas. La resistencia se fija, por ejemplo, debajo de la pared inferior de la carcasa. Se preverá una fuente de alimentación 20, por ejemplo, para alimentar la resistencia 19. La fuente de alimentación comprenderá, por ejemplo, una o más pilas eléctricas, que suministran suficiente energía para calentar la cámara a una temperatura comprendida en el rango definido anteriormente, es decir, de 20°C a 100°C. Por supuesto, se podrían emplear otros medios de calentamiento, que comprenden, por ejemplo, una tinta conductora depositada por impresión o serigrafía debajo de la pared inferior de la carcasa.
Así, a modo de resumen, el dispositivo puede ventajosamente comprender la siguiente estructura “multicapa”:
- Una superficie inferior de apoyo rugosa 17,
- Un espacio inferior 130 de una cámara 13 situada por encima de la superficie de apoyo rugosa 17,
- Un filtro 16 flexible y estirable situado por encima del espacio inferior 130,
- Un espacio superior 131 de la cámara 13 situado por encima del filtro 16,
- Una membrana 18 flexible y estirable situada por encima del espacio superior 131, que cierra herméticamente la cámara y accesible desde el exterior del dispositivo.
Durante la filtración realizada en la etapa E5 descrita anteriormente, la muestra se inyecta en forma líquida a través del canal 15 del dispositivo a fin de atravesar el filtro 16 en un sentido. Una vez finalizada la filtración, las bacterias B son retenidas por el filtro 16 y permanecen en el espacio superior 131 de la cámara 13, mientras que las moléculas M2 pasan a través del filtro 16 (que corresponde entonces al filtro F2 descrito anteriormente) y migran hacia el espacio inferior 130 de la cámara 13. La etapa E6 de elución de las bacterias B se lleva a cabo entonces inyectando un líquido de elución por el canal 15 del dispositivo de manera a atravesar el filtro en el sentido opuesto y llevar las bacterias B únicamente hacia el exterior por el canal 14 del dispositivo. Cabe señalar que, si el objetivo es eluir las moléculas de
ADN obtenidas después de una lisis de las especies biológicas contenidas en la muestra, entonces el líquido de elución se introduciría en sentido contrario, es decir del canal 14 hacia el canal 15.
Sin embargo, la etapa de elución E6 es opcional ya que el dispositivo permite, gracias a su arquitectura transparente, lleva a cabo un análisis de tipo q-PCR in situ, es decir, directamente en el dispositivo.
Como se muestra en la Figura 3B, la etapa de prefiltración también se puede llevar a cabo utilizando un dispositivo 1 a de preparación del mismo tipo conectado en serie y aguas arriba, equipado con el filtro F1 y de un dispositivo 1 b similar equipado con el filtro F2 utilizado para la filtración y la elución. Los dos dispositivos podrán ser fabricados en la misma tarjeta y comunicarse entre sí a través de un circuito fluídico. En una variante representada en la Figura 3C, también sería posible utilizar un único dispositivo 1c tal como el descrito anteriormente, cuyo filtro es amovible. Esta solución permitiría mantener la muestra en el mismo dispositivo. El primer filtro F1 se instalaría primero en el dispositivo 1c para la etapa de prefiltración y después se retiraría y se reemplazaría por el segundo filtro F2 para llevar a cabo la etapa de filtración.
Gracias a las partes transparentes, el dispositivo de preparación se puede utilizar directamente para un análisis tipo q-PCR, un ensayo inmunológico, o una secuenciación.
En el caso de un análisis ulterior de tipo q-PCR, puede ser necesario detener la acción de la proteasa. Según la invención, es necesario inhibir la acción de la proteasa antes de la etapa de prefiltración.
La acción de la proteasa se puede detener mediante procedimientos de tipo térmico, acidez o inhibidores de proteasa químicos o bioquímicos, tales como, por ejemplo:
- Pepstatina, leupeptina, suero bovino fetal (que puede contener alfa-antitripsina, o cócteles de enzimas tales como “complete” de Roche (marca registrada));
- Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF);
De manera no limitativa, el experimento puede desarrollarse de la siguiente manera:
- Dilución de la matriz alimentaria después del enriquecimiento al / en tripsina al 0,05%-0,125%.
- En previsión de un análisis q-PCR, es posible detener la reacción con un inhibidor de proteasa (SVF) que se añade al 1/10 del volumen de tripsina en la muestra.
- Prefiltración: Un gran volumen de muestra (1-10 ml) se prefiltra después sobre un filtro comercial (5 gm, 1,2 gm o 2 gm) que deja pasar las moléculas más pequeñas (M2+B) y retiene las moléculas más grandes (M1).
- Se realiza entonces una filtración más fina que permite retener y concentrar las bacterias B en un dispositivo de preparación tal como el descrito anteriormente y que lleva un filtro que tiene tamaños de poros de 0,6 gm o 0,8 gm.
Se han llevado a cabo varios ensayos del procedimiento de la invención, sobre diferentes matrices alimentarias, permitiendo validar en particular el principio de adición de la proteasa con vistas a una mejor filtración.
1. Matriz alimentaria de tipo SALMÓN
La prefiltración del salmón tal cual o diluido en un tampón salino (PBS) en la misma proporción que la tripsina no permite que pase un gran volumen a través del filtro, 2 ml en un filtro de tamaño de poros de 5 gm durante la etapa de prefiltración, después 50 gl en un filtro de tamaño de poros de 0,6 gm durante la etapa de filtración principal. Cuando se añade tripsina, la filtración de un gran volumen se hace entonces posible, ya que un volumen de 10 ml de la muestra pasó sobre el primer filtro (5 gm) durante la etapa de prefiltración y de 2 ml sobre el segundo filtro (0,6 gm) durante la etapa de filtración principal. Cabe señalar así que cuando la matriz se diluye en una disolución de tripsina, la filtración es más eficiente. Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente tabla:
La observación en microscopio de las disoluciones revela que después de la acción de la tripsina, el número de partículas pequeñas disminuye bruscamente. Después de pasar por el primer filtro durante la prefiltración, las partículas grandes se quedan retenidas. Solo quedan partículas muy pequeñas que se encuentran después de pasar por el segundo filtro (0,6 pm), lo que indica bien que estas pequeñas partículas no obstruirán el filtro (o en todo caso claramente menos).
Matriz alimentaria de tipo buey después del enriquecimiento
Para esta matriz alimentaria, se obtiene la siguiente tabla:
Se realizaron ensayos similares en leche infantil (en polvo) y espinacas, para resultados y conclusiones similares. Por otro lado, además de facilitar la filtración de la matriz alimentaria, se ha constatado que la adición de tripsina también permite aumentar el número de bacterias obtenidas después de la etapa de elución E6 y por tanto mejorar el rendimiento. La siguiente tabla pone en evidencia esta ventaja:
La Figura 4 pone en evidencia el interés de añadir una antiproteasa de tipo químico cuando se debe llevar a cabo un análisis de tipo Q-PCR posteriormente.
En esta figura, se puede observar que, cuando se realiza un análisis Q-PCR después de la filtración-concentraciónpurificación y lisis de las bacterias, la señal de fluorescencia se aplana (diagrama D1 y curva C1). Para paliar el efecto de la tripsina y restablecer la señal, se añade la antiproteasa antes del análisis. En el diagrama D2, se restablece la señal formada por la curva C2.
La solución de la invención tiene así numerosas ventajas, entre las cuales:
- Permite evitar una obstrucción demasiado rápida del filtro y por lo tanto mejorar la filtración y hacer pasar un mayor volumen de líquido a través del filtro;
- Es compatible con todas las técnicas de análisis conocidas;
- No afecta a las bacterias ni las degrada;
- No presenta dificultades particulares de realización;
- Permite ahorrar tiempo, en particular gracias a una filtración mejorada;
Claims (10)
1. Procedimiento para preparar una muestra a partir de una extracción de matriz alimentaria o de una extracción tomada en una línea de producción de productos alimentarios, conteniendo dicha muestra especies biológicas a analizar, que comprende:
- una primera etapa (E3) de dilución de una primera muestra resultante de dicha extracción con una proteasa durante un tiempo suficiente para degradar dicha primera muestra y obtener una segunda muestra líquida, - una segunda etapa (E4) de prefiltración de dicha segunda muestra líquida a través de un primer filtro (F1) para separar las primeras moléculas (M1) que tienen tamaños superiores a los de los poros de dicho primer filtro (F1), con vistas a obtener una tercera muestra que comprende las especies biológicas a analizar y las segundas moléculas (M2) que tienen tamaños inferiores a los de los poros de dicho primer filtro,
- una tercera etapa (E5) de filtrado de dicha tercera muestra a través de un segundo filtro (F2) para separar dichas especies biológicas de dichas segundas moléculas (M2),
caracterizado por que comprende una etapa de inhibición de la proteasa, llevada a cabo entre la primera etapa (E3) de dilución y la segunda etapa (E4) de prefiltración.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que comprende una etapa (E2) previa de dilución de dicha extracción en un medio de enriquecimiento.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que comprende una etapa (E6) de elución de las especies biológicas obtenidas después de dicha tercera etapa de filtración.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que la proteasa se puede escoger de endopeptidasas o exopeptidasas, tales como tripsina, quimotripsina, trombina y papaína, y endolisis C.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que la etapa de inhibición de la proteasa se lleva a cabo mediante adición de un compuesto químico de tipo antiproteasa.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado por que la antiproteasa se puede escoger de pepstatina, leupeptina, suero bovino fetal, fluoruro de fenilmetilsulfonilo.
7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que el primer filtro (F1) está dotado de poros que tienen un tamaño comprendido entre 1 pm y 6 pm.
8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que el segundo filtro (F2) está dotado de poros que tienen un tamaño comprendido entre 0,4 pm y 0,8 pm.
9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que la tercera etapa se lleva a cabo utilizando un dispositivo de preparación que comprende al menos:
- una carcasa que comprende al menos una abertura,
- un primer canal (14) dispuesto en dicha carcasa,
- un segundo canal (15) dispuesto en dicha carcasa,
- una cámara (13) en la que desembocan el primer canal y el segundo canal,
- un filtro (16) que separa dicha cámara en dos espacios distintos de manera a definir un primer espacio (130) en el que desemboca dicho primer canal de inyección y un segundo espacio (131) en el que desemboca dicho segundo canal, teniendo dicho filtro una porosidad adaptada para retener dichas especies biológicas a analizar.
10. Uso del procedimiento tal como se define en una de las reivindicaciones 1 a 9, para preparar una muestra que contiene especies biológicas a analizar según una técnica de análisis escogida de q-PCR, LAMP, secuenciación y detección inmunológica.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1860598A FR3088719B1 (fr) | 2018-11-16 | 2018-11-16 | Procede de preparation d'un echantillon a analyser obtenu a partir de matrice alimentaire |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2925105T3 true ES2925105T3 (es) | 2022-10-13 |
Family
ID=66041548
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES19207805T Active ES2925105T3 (es) | 2018-11-16 | 2019-11-07 | Procedimiento de preparación de una muestra a analizar obtenida a partir de una matriz alimentaria |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP3654011B1 (es) |
| ES (1) | ES2925105T3 (es) |
| FR (1) | FR3088719B1 (es) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005031362A2 (en) * | 2003-10-02 | 2005-04-07 | Ramot At Tel Aviv University Ltd. | Novel antibacterial agents and methods of identifying and utilizing same |
| WO2011103172A1 (en) * | 2010-02-17 | 2011-08-25 | One Lambda, Inc. | Compositions and methods for the detection of antibodies to native human leukocyte antigen |
| WO2017015574A1 (en) * | 2015-07-23 | 2017-01-26 | Purdue Research Foundation | Rapid concentration, recovery and detection of pathogens in food samples |
| FR3049061B1 (fr) | 2016-03-21 | 2018-04-20 | Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives | Dispositif d'analyse d'un echantillon biologique |
-
2018
- 2018-11-16 FR FR1860598A patent/FR3088719B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2019
- 2019-11-07 ES ES19207805T patent/ES2925105T3/es active Active
- 2019-11-07 EP EP19207805.3A patent/EP3654011B1/fr active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3654011A1 (fr) | 2020-05-20 |
| EP3654011B1 (fr) | 2022-06-29 |
| FR3088719B1 (fr) | 2023-03-31 |
| FR3088719A1 (fr) | 2020-05-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cho et al. | Isolation of extracellular vesicle from blood plasma using electrophoretic migration through porous membrane | |
| ES2873362T3 (es) | Dispositivo microfluídico y método para la purificación de ácidos nucleicos | |
| JP6573832B2 (ja) | 使い捨て流体経路を有する液−液生物学的粒子濃縮器 | |
| AU2012347741B2 (en) | Method and device for sample processing | |
| JP6325115B2 (ja) | 流体中の細胞を分離する装置 | |
| US9574977B2 (en) | Liquid to liquid biological particle concentrator with disposable fluid path | |
| JP2012510272A5 (es) | ||
| ES2692805T3 (es) | Dispositivo de análisis de una muestra biológica | |
| CA2782176C (en) | Methods and apparatus for segregation of particles, including segregation and proliferation of fetal and stem cells | |
| CA3084860A1 (en) | Liquid to liquid biological particle concentrator with disposable fluid path | |
| TWI678522B (zh) | 檢體萃取及製備裝置 | |
| EP3629000B1 (fr) | Procédé de préparation d'un échantillon biologique | |
| ES2664831T3 (es) | Disposición y procedimiento para el análisis óptico y el aislamiento específico de muestras biológicas | |
| JP6771161B2 (ja) | 核酸抽出装置 | |
| US11173498B2 (en) | Apparatus and method for the analysis; isolation and/or enrichment of target structures in a fluid sample | |
| Chernyshev et al. | Filtration-based technologies for isolation, purification and analysis of extracellular vesicles | |
| JP7619773B2 (ja) | 増幅反応チャンバーを含むマイクロ流体デバイス | |
| JP7558699B2 (ja) | 生物学的試料を調製および分析するためのマイクロ流体装置 | |
| ES2925105T3 (es) | Procedimiento de preparación de una muestra a analizar obtenida a partir de una matriz alimentaria | |
| US20140272997A1 (en) | Sample Preparation Device and Methods of Use | |
| WO2016051793A1 (en) | Container assembly and container assembly kit | |
| US12383894B2 (en) | Extraction apparatus, extraction method, and fluidic chip for extracting target material | |
| PT2813565T (pt) | Aparelho de extração de ácidos nucleicos a ultra alta velocidade e método de extração de ácidos nucleicos que o utiliza | |
| CN115702238A (zh) | 核酸提取容器和核酸提取方法 | |
| Bansal et al. | Laboratory dialysis-past, present and future |