ES2925724T3 - Sistema de obtención de imágenes de cámara para un ensayo de muestra de fluido y método para usar el mismo - Google Patents

Sistema de obtención de imágenes de cámara para un ensayo de muestra de fluido y método para usar el mismo Download PDF

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Abstract

Los aparatos y para provocar una reacción en cadena de la polimerasa en el punto de atención y analizar la reacción en cadena de la polimerasa en el punto de atención, particularmente cuando hay burbujas no deseadas presentes durante la reacción en cadena de la polimerasa, se describen aquí. En una realización general, un dispositivo para analizar una reacción en cadena de la polimerasa en una muestra de fluido incluye una fuente de corriente configurada para provocar la reacción en cadena de la polimerasa calentando la muestra de fluido dentro de una zona objetivo, un dispositivo de imágenes de cámara configurado para registrar una pluralidad de imágenes de la muestra de fluido en la zona objetivo mientras que la fuente de corriente provoca la reacción en cadena de la polimerasa, y un controlador configurado para (i) distinguir los objetos deseados en la pluralidad de imágenes de un objeto no deseado en la pluralidad de imágenes, y (ii) determinar si el la muestra de líquido da positivo o negativo para una bacteria o virus según los objetos buscados. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Sistema de obtención de imágenes de cámara para un ensayo de muestra de fluido y método para usar el mismo
Campo de la invención
La presente invención se refiere generalmente a aparatos y métodos para realizar un ensayo, y más específicamente a aparatos y métodos para provocar una reacción en cadena de la polimerasa en el lugar de atención y analizar la reacción en cadena de la polimerasa en el lugar de atención.
Antecedentes de la invención
Las pruebas de diagnóstico in vitro (IVDT) en el lugar de atención (POC) han tenido tradicionalmente dos categorías principales, las pruebas de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT) o las pruebas basadas en inmunoensayos. Las primeras detectan directamente el ADN o el ARN del patógeno, mientras que las segundas detectan anticuerpos o antígenos generados por la respuesta del sistema inmunitario al patógeno.
Los actuales inmunoensayos de diagnóstico en POC carecen de la alta sensibilidad y especificidad de los métodos de amplificación de ácidos nucleicos. Esto se hace más acusado durante las etapas iniciales de la infección, a menudo en las primeras 168 horas. Tomando el caso del virus del dengue en sangre entera, la inmunoglobulina M (IgM) y la inmunoglobulina G (IgG) permanecen indetectables en la mayoría de los pacientes hasta 5 y 10 días después de la infección, respectivamente, mientras que el ácido nucleico se puede encontrar tan pronto como entre 0 y 7 días. Además, muchas pruebas de inmunoensayo no pueden detectar agentes infecciosos hasta 3 meses después del inicio de la infección. Este retraso se debe al tiempo que tarda el sistema inmunológico del cuerpo en responder a una infección.
Los ensayos de diagnóstico de POC desarrollados utilizando NAAT tienen sensibilidades y especificidades muy altas, que coinciden con las de las pruebas de laboratorio actualmente aceptadas. El mecanismo primario de los sistemas basados en NAAT es detectar directamente el ácido nucleico de un agente infeccioso, lo que confiere a la prueba la capacidad para detectar enfermedades dentro de los primeros días del inicio de la infección. Además, mediante un cuidadoso diseño de cebadores, las NAAT también tienen la capacidad de tener una especificidad y sensibilidad muy altas en comparación con las pruebas basadas en inmunoensayos. El mayor inconveniente de las NAAT en comparación con las pruebas basadas en inmunoensayos es el equipo y/o los procesos complicados que se requieren para preparar una muestra para la prueba.
El documento WO/2007/035172, de Attogenix Biosystems Pte Ltd, describe un método y un aparato para analizar una muestra de fluido. El aparato puede incluir un dispositivo microfluídico que tiene al menos una cámara de reacción que tiene una cubierta transparente a la luz. Cada una de las al menos una cámara de reacción está destinada a recibir en su interior la muestra de fluido para su análisis, de manera que la muestra de fluido llene al menos sustancialmente la cámara de reacción, evitando así que se forme rocío o condensación en la superficie interior de la cubierta cuando se calienta el fluido. Alternativamente, el aparato puede estar equipado con capacidades de calentamiento y/u obtención de imágenes, incluido un sistema de tratamiento de imágenes para observar señales espurias, identificar áreas de reacción con respecto a áreas sin reacción, reconocer los contornos de la cámara de reacción y/o detectar regiones que no contienen señales espurias ni burbujas. Esto se lleva a cabo mediante un análisis de variación de intensidad en los datos de imagen recopilados y su comparación con una biblioteca establecida de datos de cámara de reacción.
El documento WO/2015/032835, de Maersk Olie OG Gas A/S, describe un método y un sistema para la detección automática de inclusiones fluidas en materiales cristalinos, tales como rocas. El método comprende recibir al menos una imagen digital de un material cristalino, determinar las propiedades de intensidad de imagen global de cada píxel de la imagen digital recibida y aplicar uno o más filtros de imagen global sobre las propiedades de intensidad de imagen global determinadas, a fin de proporcionar una primera imagen filtrada. Se aplica sucesivamente un conjunto de filtros segmentando la primera imagen filtrada o una imagen filtrada adicional hasta formar una pluralidad de secciones, de manera que se aplica un filtro del conjunto de filtros a una o más propiedades de intensidad determinadas para cada una de la pluralidad de secciones, a fin de proporcionar una imagen filtrada adicional. Se proporciona una imagen filtrada resultante y, basándose en la imagen filtrada resultante, se identifican las inclusiones fluidas en la al menos una imagen recibida.
El documento WO 2014055963, del California Institute of Technology, describe un dispositivo para analizar una reacción en cadena de la polimerasa en una muestra de fluido.
Resumen de la invención
Un primer aspecto de la invención proporciona un dispositivo para analizar una reacción en cadena de la polimerasa en una muestra de fluido, de manera que el dispositivo comprende: una fuente de corriente (30), configurada para provocar la reacción en cadena de la polimerasa calentando la muestra de fluido dentro de una zona objetivo (166); un dispositivo de obtención de imágenes de cámara (20), configurado para registrar una pluralidad de imágenes de la muestra de fluido en la zona objetivo mientras la fuente de corriente provoca la reacción en cadena de la polimerasa; y un controlador (28), configurado para, para al menos una de la pluralidad de imágenes, (i) dividir virtualmente la zona de objetivo de la imagen respectiva en una pluralidad de contenedores (200) sin que los contenedores estén separados por barreras físicas, (ii) distinguir objetos deseados de la pluralidad de contenedores de un objeto no deseado de la pluralidad de contenedores comparando el tamaño o la forma de los objetos de la imagen respectiva con el tamaño promedio o la forma promedio de las células sanguíneas, y (iii) determinar si la muestra de fluido da positivo o negativo para una bacteria o virus sobre la base de los objetos deseados, seleccionando al menos dos de la pluralidad de contenedores que se solapan a un grupo de objetos deseados, y calculando un valor medio de fluorescencia de los al menos dos de la pluralidad de contenedores, de manera que los objetos deseados incluyen células y el objeto no deseado incluye un objeto que no tiene al menos uno del tamaño promedio o la forma promedio de las células, y de forma que el controlador (28) está configurado para al menos una acción de entre (a) excluir al menos uno de la pluralidad de contenedores del cálculo del valor medio de fluorescencia si el al menos uno de la pluralidad de contenedores se solapa al objeto no deseado, o (b) asignar un peso a al menos uno de la pluralidad de contenedores utilizados en el cálculo del valor medio de fluorescencia basándose en la proximidad del al menos uno de la pluralidad de contenedores al objeto no deseado.
En una realización, el objeto no deseado es una burbuja de aire.
En una realización, el controlador (28) está configurado para asignar pesos a al menos dos de la pluralidad de contenedores basándose en la proximidad del objeto no deseado, siendo los pesos mayores que cero, y usar los pesos de los al menos dos de la pluralidad de contenedores en un cálculo de valor medio de fluorescencia.
En una realización, la pluralidad de contenedores (200) están dispuestos en una retícula con una pluralidad de filas y columnas.
En una realización, el controlador (28) está configurado para seleccionar, adicionalmente, los al menos dos de la pluralidad de contenedores basándose en un valor de umbral para el brillo.
En una realización, el controlador (28) está configurado para excluir, adicionalmente, al menos uno de la pluralidad de contenedores si el al menos uno de la pluralidad de contenedores no alcanza un valor de umbral mínimo para el brillo.
En una realización, el controlador (28) está configurado para informar de una prueba no concluyente si el controlador identifica una imagen no deseada en la pluralidad de imágenes.
En una realización, el dispositivo incluye una interfaz de usuario (60), el controlador (28) incluye una pluralidad de análisis preprogramados que se pueden realizar en la muestra de fluido, y la interfaz de usuario está configurada para permitir a un usuario seleccionar al menos un análisis de entre la pluralidad de análisis preprogramados.
En una realización, la pluralidad de imágenes incluye al menos una de entre: (i) una pluralidad de imágenes fijas de la reacción en cadena de la polimerasa registradas por el dispositivo de obtención de imágenes de cámara (20) durante un período de tiempo; o (ii) una imagen de vídeo de la reacción en cadena de la polimerasa registrada por el dispositivo de obtención de imágenes de cámara durante ese período de tiempo.
En una realización, el dispositivo (10) comprende, además, una fuente de luz (22) que proporciona una luz de excitación fluorescente sobre la muestra de fluido.
En una realización, el dispositivo (10) está configurado para recibir una tarjeta de prueba (100) que incluye la muestra de fluido, y en él la zona de objetivo está situada dentro de la tarjeta de prueba.
Un segundo aspecto de la invención proporciona un método de uso del dispositivo de acuerdo con la invención, que incluye: calentar la muestra de fluido en la zona de objetivo (166) para provocar la reacción en cadena de la polimerasa; registrar la pluralidad de imágenes de la muestra de fluido en la zona de objetivo durante la reacción en cadena de la polimerasa mientras una fuente de luz (22) proporciona una luz de excitación fluorescente sobre la muestra de fluido; dividir la zona de objetivo en una pluralidad de contenedores en al menos una de la pluralidad de imágenes; calcular un valor de fluorescencia utilizando al menos dos de la pluralidad de contenedores para la imagen respectiva; y determinar si la muestra de fluido da positivo o negativo para una bacteria o virus basándose en el valor de fluorescencia calculado, seleccionando al menos dos de la pluralidad de contenedores que se solapan a un grupo de objetos deseados y calculando un valor medio de fluorescencia de los al menos dos de la pluralidad de contenedores, donde los objetos deseados incluyen células y el objeto no deseado incluye un objeto que no tiene al menos uno del tamaño promedio o la forma promedio de las células sanguíneas, y donde el cálculo del valor de fluorescencia incluye al menos una acción de entre (i) ponderar los al menos dos de la pluralidad de contenedores basándose en la proximidad a un objeto no deseado, o (ii) excluir al menos uno de la pluralidad de contenedores del cálculo del valor de fluorescencia si el al menos uno de la pluralidad de contenedores se solapa a un objeto no deseado.
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Materia adicional no reivindicada se divulga a modo de referencia.
Breve descripción de los dibujos
La presente invención se explicará a continuación con más detalle a modo de ejemplo únicamente, con referencia a las figuras adjuntas, en las que:
La Figura 1 es una vista en perspectiva desde arriba de un ejemplo de realización de un dispositivo de ensayo según la presente invención;
la Figura 2 es una vista en perspectiva desde arriba de un ejemplo de realización de una tarjeta de prueba según la presente invención;
la Figura 3 es una vista en sección transversal de la tarjeta de prueba de la Figura 2;
la Figura 4 es una vista en perspectiva desde arriba del dispositivo de ensayo de la Figura 1, con la tarjeta de prueba de la Figura 2 insertada en el mismo;
la Figura 5 es una vista en sección transversal del dispositivo de ensayo y la tarjeta de prueba que se muestran en la Figura 4;
las Figuras 6A a 6C ilustran un ejemplo de realización de imágenes amplificadas que muestran una PCR;
las Figuras 7A a 7E ilustran un ejemplo de realización que muestra cómo un controlador puede detectar burbujas y analizar una reacción incluso cuando se detectan burbujas;
la Figura 8 ilustra un ejemplo de realización de un método de control que puede usarse para realizar y analizar una reacción de acuerdo con la presente invención;
la Figura 9 ilustra un ejemplo de realización de un controlador que puede llevar a cabo el método de la Figura 8.
Descripción detallada
Antes de describir en detalle el sistema y el método ilustrativos de la presente invención, debe entenderse y apreciarse aquí que la presente invención se refiere a un sistema de diagnóstico 1 rápido, de alta sensibilidad y alta especificidad, de baja complejidad, que usa amplificación de ácido nucleico y es capaz de operar en entornos de bajos recursos con un adiestramiento mínimo del usuario. El sistema descrito en la presente memoria está configurado, por ejemplo, para provocar y analizar reacciones en cadena de la polimerasa (PCR), particularmente en las primeras etapas de la infección, utilizando una plataforma microfluídica de bajo coste que emplea PCR con una polimerasa de ADN modificado.
La Figura 1 ilustra un ejemplo de realización de un sistema de diagnóstico 1 en el lugar de atención, de acuerdo con la presente invención. Como se ilustra, el sistema de diagnóstico 1 incluye un dispositivo de ensayo 10 con un alojamiento 12 que tiene una ranura 14 para recibir una tarjeta de prueba 100 (Figura 2), que es una tarjeta de prueba desechable y económica que puede usarse con el dispositivo 10 y después desecharse. Como se explica con mayor detalle más adelante, puede inyectarse una muestra de fluido en la tarjeta de prueba 100 y, a continuación, puede insertarse la tarjeta de prueba 100 en la ranura 14 para que el dispositivo 10 pueda alimentar energéticamente la tarjeta de prueba 100 a fin de que lleve a cabo un ensayo dentro de la tarjeta de prueba 100 sin más acción por parte del usuario. El análisis resultante se puede entonces presentar visualmente al usuario mediante la interfaz de usuario 60. La tarjeta de prueba 100 puede ser entonces desechada y puede insertarse una nueva tarjeta de prueba 100 en la ranura 14 y usarse de la misma manera para realizar un nuevo ensayo. La tarjeta de prueba puede configurarse para recibir alrededor de 10 gl de sangre entera, el equivalente a una gota de sangre obtenida de una punción en el dedo. Alternativamente, la muestra de fluido puede ser suero, orina, saliva, lágrimas y/o sustancias similares.
El dispositivo 10 se describe con más detalle en la Solicitud de los EE.UU. N.° 15/185.640 (publicada como US 2016/0369322 A1), titulada "Dispositivo para analizar una muestra de fluido y uso de tarjeta de prueba con el mismo".
La tarjeta de prueba 100 se describe con más detalle en la Solicitud de los EE.UU. N.° 15/185.661 (publicada como US 2016/0369323 A1), titulada "Tarjeta de prueba para ensayo y método de fabricación de la misma".
Como se ilustra en las Figuras 2 y 3, la tarjeta de prueba 100 incluye un puerto de entrada 124, una cámara de mezcla 126, un puerto de captación 128, un puerto de salida 130 y un microcanal de fluido 134. Se puede inyectar una muestra líquida en el puerto de entrada 124 y mezclarse con uno o más reactivos en la cámara de mezcla 126, y seguidamente la tarjeta de prueba 100 puede colocarse en la ranura 14 del dispositivo de ensayo 10. Una vez que la tarjeta de prueba 100 ha sido colocada dentro del dispositivo 10, la muestra de fluido puede succionarse a través del microcanal de fluido 134, de modo que la muestra de fluido pueda analizarse a través de un puerto de análisis 132 de la tarjeta de prueba 100. La tarjeta de prueba 100 también incluye contactos eléctricos 122 en una superficie inferior 102 de la misma, lo que permite controlar los electrodos adyacentes al microcanal de fluido 134 para alimentar energéticamente la tarjeta de prueba 100, por ejemplo, con el fin de calentar el fluido del interior del microcanal de fluido 134, efectuar un seguimiento del flujo de fluido a través del microcanal de fluido 134 y/o medir la concentración de una especie química en la muestra de fluido.
La Figura 4 ilustra una vista en perspectiva del dispositivo 10 después de haber colocado la tarjeta de prueba 100 en la ranura 14, y la Figura 5 ilustra una vista en sección transversal del mismo. Como se ilustra, la colocación de la tarjeta de prueba 100 en la ranura 14 alinea varios de los elementos del dispositivo 10 con varios de los elementos de la tarjeta de prueba 100. Por ejemplo, la colocación de la tarjeta de prueba 100 en la ranura 14 alinea el dispositivo de obtención de imágenes de cámara 20 y la fuente de luz 22 del dispositivo 10 con el puerto de análisis 132 en una superficie superior 104 de la tarjeta de prueba 100, el tubo neumático 40 de la fuente de accionamiento 24 de fluido con el puerto de salida 130 en la superficie superior 104 de la tarjeta de prueba 100, y los contactos eléctricos 42 del dispositivo de contacto eléctrico 26 con los contactos eléctricos 122 en la superficie inferior 102 de la tarjeta de prueba 100.
Como se explica con más detalle en la Solicitud de los EE.UU. N.° 15/185.640 (publicada como US 2016/0369322 A1), una vez que el tubo neumático 40 se ha dispuesto formando un cierre hermético con el puerto de salida 130, se puede aplicar una fuerza neumática negativa al puerto de salida 130 desde la fuente de accionamiento 24 de fluido. Cuando se aplica la fuerza neumática negativa, la muestra de fluido inyectada en el puerto de entrada 124 es succionada a través del microcanal de fluido 134 hacia el puerto de salida 130. Sin embargo, la muestra de fluido no es succionada al interior del tubo neumático 40 debido a la presencia del puerto de captación 128 entre el puerto de entrada 124 y el puerto de salida 130. El puerto de captación 128 permite que se acumule fluido antes de que este pueda llegar al puerto de salida 130 y/o al tubo neumático 40, lo que mantiene el dispositivo 10 estéril y protege la integridad del sistema de diagnóstico 1.
La tarjeta de prueba 100 está dimensionada de manera que los contactos eléctricos 122 de la tarjeta de prueba 100 se colocan en contacto eléctrico con los contactos eléctricos 42 del dispositivo de contacto eléctrico 26 cuando la tarjeta de prueba 100 es completamente insertada en la ranura 14. Con los contactos eléctricos 42 y 122 alineados, el controlador 28 puede realizar varias funciones. Antes de comenzar un ensayo, el controlador 28 puede garantizar que la muestra de fluido se haya succionado correctamente a través del microcanal 134 y al interior de una zona de objetivo del microcanal 134 midiendo la capacidad de la muestra de fluido aguas arriba y/o aguas abajo de la zona de objetivo. Una vez que se determina que el fluido está situado dentro de la zona de objetivo del microcanal 134, el controlador 28 puede controlar la fuente de alimentación energética 30 para que aplique una corriente a los contactos eléctricos alineados con la zona de objetivo con el fin de calentar la muestra de fluido situada dentro de la zona de objetivo y provocar que se produzca una reacción, tal como una PCR.
La alineación del dispositivo de obtención de imágenes de cámara 20 sobre el puerto de análisis 132 en la superficie superior 104 de la tarjeta de prueba 100 permite que el controlador 28 analice una o más reacciones dentro del microcanal de fluido 134 mientras controla la reacción. El dispositivo de obtención de imágenes de cámara 20 está configurado para registrar una pluralidad de imágenes de la muestra de fluido dentro de la zona de objetivo, a fin de que las imágenes puedan analizarse en tiempo real. La pluralidad de imágenes puede incluir, por ejemplo, una pluralidad de imágenes fijas y/o una imagen de vídeo. Por lo tanto, el dispositivo de obtención de imágenes de cámara 20 está configurado para registrar la reacción de la muestra de fluido tomando una serie de imágenes fijas de la muestra de fluido dentro de la zona objetivo durante una reacción o tomando un vídeo de la muestra de fluido dentro de la zona de objetivo durante una reacción. Como se explica con más detalle más adelante, la pluralidad de imágenes puede usarse, por ejemplo, para analizar las características físicas y/o químicas de las células contenidas en la muestra de fluido.
La zona de objetivo puede estar en cualquier lugar a lo largo del microcanal de fluido 134 o puede obtenerse como derivación del microcanal de fluido 134. Ejemplos de zonas de objetivo se describen con más detalle en la Solicitud de los EE.UU. N.° 15/185.661 (publicada como US 2016/0369323 A1), titulada "Tarjeta de prueba para ensayo y método de fabricación de la misma". En un aspecto de la invención, la zona de objetivo puede estar situada en una parte central del microcanal de fluido 134 y el microcanal de fluido 134 puede incluir, por ejemplo, un sensor de capacidad aguas arriba y/o aguas abajo de la zona de objetivo para determinar si se ha succionado fluido a través del microcanal de fluido 134 y al interior de la zona de objetivo. El microcanal 134 puede incluir una pluralidad de zonas de objetivo para realizar una pluralidad de ensayos al mismo tiempo o en momentos diferentes, por ejemplo, a fin de mejorar la fiabilidad de los ensayos. El controlador 28 puede programarse para analizar una sección específica del microcanal 134 como la zona objetivo, o bien el controlador 28 puede determinar la zona de objetivo basándose en la pluralidad de imágenes tomadas por el dispositivo de obtención de imágenes de cámara 20.
Las Figuras 6A a 6C ilustran un ejemplo de realización de imágenes amplificadas que muestran una PCR. La Figura 6A ilustra una muestra de fluido que se ha cargado inicialmente en la zona objetivo 166, con unas pocas moléculas de ácido nucleico 50 separadas por grandes distancias. La Figura 6B muestra la muestra de fluido durante la PCR, cuando se pueden ver claras colonias 52 de moléculas de ácido nucleico 50 porque la velocidad de difusión de las moléculas es más lenta que la velocidad requerida para que las moléculas viajen la distancia entre colonias. La Figura 6C muestra el final de la PCR, cuando las colonias 52 ya no son claramente visibles.
A partir del número de colonias que se muestra en la Figura 6B, el controlador 28 puede determinar si la muestra de fluido da positivo o negativo para un virus o bacteria específico basándose en un valor de título conocido para el virus o bacteria específico. El valor del título corresponde al factor de dilución más alto para el virus o bacteria específico que arroja un resultado positivo en la prueba. Al contar las colonias en la Figura 6B, y comparando el recuento con el valor de título conocido, el controlador 28 puede determinar un resultado de prueba positivo o negativo para la muestra de fluido. El valor del título conocido se puede comparar a través de una variedad de métodos. Se puede utilizar un análisis estadístico para afirmar con cierta probabilidad que el resultado caerá por debajo de un cierto valor de título. Esto se puede lograr manejando una cantidad estadísticamente significativa de muestras controladas en diluciones controladas y generando una curva normalizada basándose en el valor de umbral de cruce de cada una (punto en el que la curva comienza a ascender).
El dispositivo de obtención de imágenes de cámara 20 puede incluir un sensor de cámara de semiconductor de óxido metálico complementario (CMOS) de alta sensibilidad y rango dinámico que hace posible una imagen general de una reacción dentro de la zona de objetivo 166 del microcanal fluido 134 de la tarjeta de prueba 100. El sensor de cámara de CMOS puede habilitar el dispositivo de obtención de imágenes de cámara 20 para que genere imágenes de todo el puerto de análisis 132 de la tarjeta de prueba 100. Aunque en la realización ilustrada solo se muestra una única zona de objetivo 166 dentro de un solo microcanal 134, el dispositivo de obtención de imágenes de cámara 20 está configurado para obtener imágenes de una pluralidad de zonas de objetivo y/o de una pluralidad de microcanales en caso de que el usuario inserte dicha tarjeta de prueba 100 en el dispositivo 10. Ejemplos de tarjetas de prueba 100 alternativas se divulgan en la Solicitud de los e E.UU. N.° 15/185.661 (publicada como US 2016/0369323 A1), titulada "Tarjeta de prueba para ensayo y método de fabricación de la misma".
En la realización ilustrada, la fuente de luz 22 está configurada para proyectar una luz de excitación fluorescente en la zona de objetivo 166 del microcanal de fluido 134 durante una PCR, mientras el dispositivo de obtención de imágenes de cámara 20 está grabando imágenes fijas y/o de vídeo de la PCR. La muestra de fluido puede haberse mezclado con un reactivo de fluorescencia en el puerto de mezcla 126, antes de que la muestra de fluido sea aspirada al interior de la zona de objetivo 166. Iluminando la zona de objetivo 166 con una luz de excitación de fluorescencia, el controlador 28 puede registrar mediciones de fluorescencia a partir de las imágenes tomadas por el dispositivo de obtención de imágenes de cámara 20. Las imágenes de fluorescencia pueden analizarse para determinar los incrementos graduales en la fluorescencia durante cada ciclo de PCR. Esto permite la determinación de la curva de amplificación por PCR. Además, las imágenes se pueden utilizar durante el análisis de fusión para determinar la disminución gradual de la fluorescencia a medida que se aumenta la temperatura. El cambio gradual en la fluorescencia se puede determinar tomando la diferencia en la intensidad de píxeles entre imágenes sucesivas.
Para mediciones generales de fluorescencia, por ejemplo, se puede lograr una formulación estadística de la PCR subdividiendo la zona de objetivo 166 y midiendo la fluorescencia en varias posiciones de la zona de objetivo 166. Esto arroja valores de umbral de cruce altamente precisos y coherentes para la PCR en tiempo real basada en valores de títulos. Una vez que se completa la PCR, un análisis de la curva de fusión permite la comprobación de errores, lo que asegura que se ha amplificado el amplicón correcto durante la PCR, a fin de reducir la probabilidad de una falsa prueba positiva.
El dispositivo de obtención de imágenes de cámara 20 también permite al controlador 28 registrar una variedad de otras medidas además de las medidas de fluorescencia. Por ejemplo, el controlador 28 puede determinar la turbidez y la detección de objetos usando las imágenes tomadas por el dispositivo de obtención imágenes de cámara 20. La turbidez se puede determinar usando los LEDs del dispositivo para aplicar luz incidente a un microcanal de tarjeta de prueba y/o zona de objetivo. La cantidad de luz dispersada puede ser medida por la cámara, lo que permite medir un valor numérico de turbidez relativa. La turbidez se puede utilizar para determinar el resultado de varias reacciones diferentes, tales como la medición de la reactividad de las proteínas durante un ensayo ELISA (medición de colorimetría) o la medición de la calidad del agua. Puede utilizarse la detección de objetos, por ejemplo, para determinar si se han formado burbujas de aire en la zona de objetivo 166 durante la PCR y estas posiblemente han destruido la integridad del análisis de la PCR. Al generar imágenes de todo el puerto de análisis 132 de la tarjeta de prueba 100, el dispositivo de obtención imágenes de cámara 20 es capaz de mejorar en gran medida la precisión, al permitir la aplicación de diversos algoritmos avanzados de tratamiento de imágenes.
Con respecto a la detección de objetos, el dispositivo de obtención de imágenes de cámara 20 se puede usar para detectar objetos deseados y no deseados dentro del microcanal 134. Los objetos deseados pueden ser células como glóbulos rojos y blancos en la muestra de fluido que se analizará durante la reacción. El controlador 28 puede contar los objetos deseados haciendo coincidir el tamaño de célula y la forma de célula de los objetos presentes en las imágenes del dispositivo de obtención de imágenes de la cámara 20 con el tamaño y la forma promedio de células sanguíneas específicas, lo que permite al controlador 28 contar, por ejemplo, el número de glóbulos rojos y blancos de la muestra de fluido en la zona de objetivo 166. El controlador 28 también puede distinguir los glóbulos rojos y blancos de otros objetos no deseados que no coinciden con el tamaño y la forma promedio de células sanguíneas específicas.
Si el controlador 28 detecta un objeto no deseado, el controlador 28 puede determinar que la PCR ha fallado o que es indeterminada, y puede indicar a un usuario que se debe realizar una PCR adicional en la misma tarjeta de prueba o en una diferente. Si la PCR se realiza en la misma tarjeta de prueba, la zona de objetivo 166 debe ser despejada de líquido y, a continuación, debe succionarse nuevo fluido de la cámara de mezcla 126 al interior de la zona objetivo 166.
En una realización, la imagen no deseada es una burbuja de aire. En un aspecto de la invención, el controlador 28 puede detectar burbujas de aire porque las burbujas de aire se expandirán en la zona objetivo 166 mientras se produce la reacción PCR. Los glóbulos rojos y blancos, por otro lado, se multiplican, pero no aumentan de tamaño. Por lo tanto, el controlador 28 puede determinar la presencia de una burbuja de aire en la zona de objetivo 166 observando un cambio en el tamaño de un objeto a lo largo de una pluralidad de imágenes subsiguientes de entre la pluralidad de imágenes. En otro aspecto de la invención, el controlador 28 puede determinar la presencia de una burbuja de aire observando que un objeto no deseado no coincide con el tamaño y la forma promedio de las células sanguíneas. En otro aspecto de la invención, el controlador 28 puede determinar la presencia de una burbuja de aire debido a que no hay fluorescencia dentro de la burbuja al buscar un cambio en el gradiente de fluorescencia.
En algunos casos, una burbuja formada dentro del microcanal 134 permanecerá pequeña y no afectará a ningún flujo de fluido o reacción que se produzca dentro del microcanal 134. Sin embargo, cuando se aplica calor a la zona de objetivo 166, el calor puede hacer que la burbuja se expanda debido al gran coeficiente de dilatación térmica de la burbuja.
Las Figuras 7A a 7E ilustran un ejemplo de realización que muestra cómo el controlador 28 puede detectar objetos no deseados tales como burbujas y analizar una reacción incluso cuando hay burbujas presentes. En algunos casos, los objetos no deseados pueden hacer que la reacción falle por completo y sea necesario volver a realizarla. Puede ocurrir un fallo si hay demasiadas burbujas que compensar. En las Figuras 7A a 7E, sin embargo, el controlador 28 puede continuar con la reacción y el análisis incluso en presencia de una burbuja de aire.
La Figura 7A ilustra un ejemplo de realización de la zona de objetivo 166 antes de que cualquier fluido haya entrado en la zona de objetivo. Como se ilustra, el controlador 28 ha dividido la zona de objetivo 166 en una pluralidad de contenedores 200. En la realización ilustrada, el controlador 28 ha dividido la zona de objetivo 166 en seis filas (designadas de la A a la F por facilidad de referencia) y doce columnas (designadas de la 1 a la 12 por facilidad de referencia) para crear setenta y dos contenedores 200, pero los expertos en la materia constatarán que se puede crear cualquier número de contenedores 200 dentro de una zona de objetivo 166. Debe entenderse que los contenedores 200 se crean virtualmente por el controlador 28, y no hay barreras físicas que separen los contenedores 200 dentro de la zona de objetivo 166.
La Figura 7B ilustra la zona de objetivo 166 después de recibir una muestra de fluido pero antes de que se produzca una reacción. Como se ilustra, hay un número mínimo de moléculas de ácido nucleico 202 en la muestra de fluido antes de la reacción. En la realización ilustrada, los contenedores B7, C3, C10, D8 y E2 contienen moléculas de ácido nucleico 202.
La Figura 7C ilustra la zona de objetivo 166 durante una PCR. Como se ilustra, las moléculas que se muestran en los contenedores B7, C3, C10, D8 y E2 en la Figura 7B se han multiplicado por difusión. Pueden verse claras colonias 204 de moléculas de ácido nucleico 202 porque la velocidad de difusión de las moléculas es más lenta que la velocidad requerida para que las moléculas se desplacen la distancia entre colonias. Los contenedores A6, A7, B3, B6, B7, C3, C4, C9, C10, D2, D3, D7, D8, E1, E2, E3, E8 y E9 contienen, cada uno de ellos, moléculas de ácido nucleico 202 en la Figura 7C.
La Figura 7D ilustra contenedores 200 que han sido seleccionados por el controlador 28 para ser utilizados en los cálculos para curvas de amplificación y de fusión y para el análisis correspondiente. En la realización ilustrada, las colonias 204 de moléculas de ácido nucleico 202 son visualizadas por el controlador 28 basándose en aumentos localizados de brillo en cada contenedor. Si un contenedor 200 alcanza un valor de umbral de brillo, entonces el valor de fluorescencia de ese contenedor se usa en los cálculos para las curvas de amplificación y de fusión y para el análisis correspondiente. Si un contenedor 200 no alcanza el valor de umbral de brillo, entonces ese contenedor 200 se excluye de los cálculos para las curvas de amplificación y de fusión y para el análisis correspondiente. Para obtener un valor final de fluorescencia de toda la zona de objetivo 166, se toma la media aritmética entre todos los contenedores 200 seleccionados. En la realización ilustrada, los contenedores A6, A7, B6, B7, C3, C9, C10, D2, D3, D7, D8 y E2 se han seleccionado para ser utilizados en los cálculos de curvas de amplificación y de fusión y para el análisis correspondiente, mientras que los contenedores B3, C4, E1, E3, E8 y E9 se han excluido a pesar de que contienen moléculas de ácido nucleico, porque no alcanzan el umbral de brillo.
La Figura 7E ilustra cómo un objeto no deseado, como una burbuja, afecta al análisis llevado a cabo por el controlador 28. En la realización ilustrada, el controlador 28 ha detectado una burbuja 206 en los contenedores C3, C4, C5, C6, D3, D4, D5, D6, E3, E4, E5, E6, F3, F4 y F5. Aunque los contenedores C3 y D3 han alcanzado el valor de umbral de brillo, el controlador 28 ha determinado que los contenedores C3 y D3 deben excluirse de las curvas de amplificación y fusión y del análisis correspondiente debido a la presencia de la burbuja 206. El controlador 28 también ha determinado que debe darse a los contenedores D2 y E2 un peso más bajo durante los cálculos debido a su proximidad a la burbuja 206.
Basándose en el análisis anterior, el controlador 28 puede promediar los valores de fluorescencia de los contenedores 200 seleccionados. Si el controlador 28 no detecta ninguna burbuja en las imágenes tomadas por el dispositivo de obtención de imágenes de cámara 20, entonces el controlador 28 calcula la fluorescencia usando la siguiente ecuación:
Figure imgf000007_0001
donde n es el número de contenedores 200 utilizados en el cálculo, y xí son los contenedores individuales de la retícula utilizados por el algoritmo.
Si se detectan una o más burbujas en la zona de objetivo 166, entonces el controlador 28 calcula la fluorescencia usando la siguiente ecuación:
p __ ^ i = i a ix i
n i
donde ai es el peso del contenedor, que está determinado por la proximidad del contenedor a la burbuja. En un aspecto de la invención, ai debe ser mayor que cero y menor o igual que uno (0 < ai < 1).
En un aspecto de la invención, todos los ai pueden tener el mismo peso de 1 cuando no hay burbujas presentes. En un aspecto de la invención, el valor de ai puede disminuir proporcionalmente a medida que la burbuja se acerca al contenedor.
La curva de amplificación y la curva de fusión se pueden crear midiendo el valor absoluto de la fluorescencia de cada píxel de imágenes sucesivas tomadas ya sea durante cada ciclo (para la curva de amplificación), ya sea a medida que la temperatura es aumentada lentamente con el tiempo (para la curva de fusión). En el caso de una curva de amplificación, que muestra el cambio gradual en la fluorescencia durante la etapa de amplificación de una PCR, es posible determinar un valor de umbral de cruce de PCR, y el controlador 28 puede buscar cuándo el valor de fluorescencia ha aumentado más allá de un cierto valor de umbral y cuándo la primera derivada de la fluorescencia con respecto al número de ciclos se encuentra en un máximo. En el caso de una curva de fusión, el cambio gradual en la fluorescencia puede proporcionar al controlador 28 la temperatura de fusión del ADN amplificado. Matemáticamente, el controlador 28 busca cuándo la primera derivada de la fluorescencia con respecto a la temperatura está en un mínimo y la segunda derivada de la fluorescencia con respecto a la temperatura es igual a cero.
La detección y el análisis anteriores son útiles para un análisis de PCR o citométrico basado en fluorescencia, pero los expertos en la materia constatarán que el controlador 28 se puede utilizar para otros fines. En un aspecto de la invención, el controlador 28 puede usar el dispositivo de obtención de imágenes de cámara 20 para realizar un análisis colorimétrico, que analiza la concentración de un elemento químico o compuesto químico en una solución con la ayuda de un reactivo de color. El controlador 28 puede cuantificar la cantidad de proteína presente en la muestra de fluido midiendo el espectro de absorción y comparándolo con soluciones de proteína de concentración conocida. En un aspecto de la invención, el controlador 28 puede analizar e interpretar los resultados de los ensayos colorimétricos de proteína, por ejemplo, mediante un ensayo de proteína de Bradford, un ensayo de ácido bicinconínico (ensayo BCA) y/o un ensayo de colorante de Ponceau S.
La Figura 8 ilustra un ejemplo de realización de un método de control que puede ser utilizado por el controlador 28 para producir y analizar una reacción según se describe en este documento, y la Figura 9 ilustra un ejemplo de realización de un controlador 28 que puede realizar el método de la Figura 8. Como se ilustra, el controlador 28 puede incluir un procesador 250 y una memoria 252, la cual puede incluir un medio legible por computadora no transitorio. La memoria 252 puede incluir, por ejemplo, un módulo de entrada 254, un módulo de control 256, un módulo de análisis 258 y un módulo de salida 260. El procesador 250 puede hacer correr los módulos 252, 254, 256, 258 de acuerdo con instrucciones almacenadas en la memoria 252. Las líneas discontinuas de la Figura 8 ilustran las conexiones eléctricas entre los módulos 252, 254, 256, 258 del controlador 28 y diversos elementos del dispositivo 10. Los expertos en la materia deben entender que los módulos ilustrados y/o módulos adicionales pueden ser conectados a los elementos mostrados y/o a elementos adicionales.
El procedimiento comienza cargando una tarjeta de prueba 100 y/o una muestra de fluido en el dispositivo 10. La muestra de fluido se puede mezclar con un reactivo antes de su inyección en la tarjeta de prueba 100 y/o en el dispositivo 10, o bien se puede mezclar con un reactivo dentro de la cámara de mezcla 126 de la tarjeta de prueba 100. El reactivo puede incluir una polimerasa resistente a inhibidores de PCR junto con una mezcla específica de transcriptasa inversa (en el caso de objetivos de ARN) y tensioactivos / dispersantes para permitir una rápida dispersión y lisis de la muestra. La mezcla reactiva puede incluir, por ejemplo, cebadores de oligonucleótidos, ADN polimerasa de dNTP y otras sustancias químicas para ayudar a la PCR. Es importante tener una relación correcta entre la muestra de fluido y el volumen final de la PCR, porque si no se mantiene la relación correcta, la PCR tardará demasiado o no se producirá.
Usando la interfaz de usuario 60, un usuario puede entonces elegir una prueba positiva / negativa para realizarla en la muestra de fluido. El usuario puede desplazarse por una pluralidad de pruebas en la pantalla 62 usando los botones 64 y elegir una o más pruebas para realizar. La pluralidad de pruebas puede incluir, por ejemplo, un análisis de PCR, un análisis de citometría y/o un análisis de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). En una alternativa, se puede insertar una pluralidad de diferentes tipos de tarjetas de prueba 100 en el dispositivo 10, de manera que cada tarjeta de prueba 100 corresponde a una o más pruebas específicas que se realizarán en una muestra de fluido, y el controlador 28 puede determinar qué prueba(s) se ha(n) de realizar detectando el tipo de tarjeta de prueba 100 insertada en el dispositivo 10, sin más instrucciones por parte del usuario. En otra alternativa, el microcanal de fluido 134 se puede incorporar en el dispositivo 10 en lugar de la tarjeta de prueba 100, y un usuario puede elegir una prueba para realizar en la muestra de fluido después de inyectar la muestra de fluido directamente en el dispositivo 10.
El módulo de entrada 254 está configurado para recibir las entradas del usuario introducidas en la interfaz de usuario 60, y comunicar las entradas del usuario al módulo de control 256. El módulo de entrada 254 también puede recibir información adicional a través de la interfaz de usuario 60 y/o mediante la programación previa del controlador 28, por ejemplo, (i) información sobre el valor de umbral de cruce de PCR en tiempo real; (ii) información de fluorescencia máxima; y (iii) información sobre la temperatura de inflexión de la curva de fusión. También se pueden proporcionar otros parámetros de control para la reacción de PCR. Esto incluye las temperaturas de desnaturalización, elongación y recocido de la PCR y los tiempos de permanencia.
Una vez que se han cargado una tarjeta de prueba 100 y/o una muestra de fluido en el dispositivo 10, el módulo de control 256 del controlador 28 inicia el método de control en la etapa 200 haciendo que la fuente de accionamiento 26 de fluido succione fluido a través del microcanal 134. En la realización ilustrada, la fuente de accionamiento de fluido aplica una fuerza neumática negativa al puerto de salida 130 a través del tubo neumático 40 para succionar fluido a través del microcanal 134. En una alternativa, la fuente de accionamiento de fluido puede incluir uno o más tipos de bombas en comunicación de fluido con el microcanal 134.
Una vez que se ha activado la fuente de accionamiento 26 de fluido, pero antes de que comience la reacción, el módulo de control 256, en la etapa 202, puede comprobar que el fluido esté situado dentro de la zona de objetivo 166 observando la capacidad del microcanal 134 en una o más posiciones aguas arriba y/o aguas abajo de la zona de objetivo 166. Si se detecta fluido en el microcanal 134 aguas arriba y/o aguas abajo de la zona de objetivo 166, el módulo de control 256 puede verificar que el fluido esté situado dentro de la zona de objetivo 166, activar la fuente de luz 22 en la etapa 204 e iniciar la reacción en la etapa 206. El controlador 28 puede elegir una porción del microcanal 134 para designarla como zona de objetivo 166, o bien la zona de objetivo 166 puede ser predeterminada.
En la realización ilustrada, el módulo de control 256 inicia la reacción en la etapa 206 dando instrucciones a la fuente de alimentación energética 30 para que envíe una corriente a los electrodos situados adyacentes a la zona de objetivo 166 a través del dispositivo de contacto eléctrico 26, a fin de hacer que el fluido situado dentro de la zona de objetivo 166 se caliente. A medida que se calienta la muestra de fluido, las moléculas de ácido nucleico se multiplican por difusión como se explicó anteriormente.
Al mismo tiempo que la muestra de fluido es calentada dentro de la zona de objetivo 166 para que las moléculas de ácido nucleico se multipliquen por difusión, el módulo de control 256, en la etapa 208, puede hacer que el dispositivo de obtención de imágenes de cámara 20 registre una pluralidad de imágenes de la reacción dentro de la zona de objetivo 166. A continuación, la pluralidad de imágenes puede enviarse al módulo de análisis 208 para su análisis en la etapa 210. La tarjeta de prueba 100 puede incluir un material transparente que permite tomar imágenes de la zona de objetivo 166 del microcanal de fluido 134 aunque se encuentre una capa de material polimérico entre el dispositivo de obtención de imágenes de cámara 20 y el microcanal de fluido 134.
En la etapa 210, el módulo de análisis 258 analiza las imágenes tomadas por el dispositivo de obtención de imágenes de cámara 20 para determinar si la muestra de fluido da en la prueba positivo o negativo para una bacteria o un virus. El tipo de análisis realizado por el módulo de análisis en la etapa 210 dependerá del tipo de prueba que se realice en la muestra de fluido.
Si el ensayo que se lleva a cabo en la muestra de fluido es un análisis de PCR, entonces el módulo de análisis 258 puede analizar las imágenes como se ha explicado anteriormente, midiendo la fluorescencia basándose en los objetos deseados y no deseados detectados.
Si el ensayo que se está llevando a cabo en la muestra de fluido es un análisis de citometría, entonces el módulo de análisis 258 también puede analizar las imágenes como se ha explicado anteriormente, midiendo la fluorescencia basándose en los objetos deseados y no deseados detectados. El análisis de citometría puede diferir del análisis de PCR, por ejemplo, en que el fluido de la zona de objetivo 166 no necesite calentarse para multiplicar las moléculas por difusión, por lo que se puede omitir la etapa 206. Con un análisis de citometría, el módulo de análisis 258 puede analizar la muestra de fluido situada dentro de la zona de objetivo 166, por ejemplo, analizando el tamaño celular, el recuento celular, la morfología celular (forma y estructura), la fase del ciclo celular, el contenido de ADN y la existencia o ausencia de proteínas específicas en las superficies celulares. El controlador 28 puede usar diversos fluoróforos diferentes para la citometría de flujo. Para detectar proteínas específicas en las superficies celulares, fluoróforos específicamente diseñados que se unen a esas proteínas se pueden mezclar en la muestra para hacer que las proteínas de interés emitan fluorescencia.
Si el ensayo que se está llevando a cabo en la muestra de fluido es un análisis ELISA, de nuevo no es necesario calentar el fluido de la zona de objetivo 166 para multiplicar las moléculas por difusión, por lo que se puede omitir la etapa 206. Con un análisis ELISA, el módulo de análisis 258 puede analizar la muestra de fluido contenida en la zona de objetivo 166, por ejemplo, midiendo la concentración de un analito en la muestra de fluido mediante el uso de un análisis colorimétrico. En un aspecto de la invención, el controlador 28 puede medir la cantidad de luz incidente dispersada en la zona objetivo de ELISA para determinar la concentración de un analito. El método de medición es el mismo que el de la medición de la turbidez.
En un aspecto de la invención, el controlador 28 puede realizar pruebas de genotipificación como una extensión de una PCR.
En la etapa 212, el módulo de análisis 258 determina, basándose en el análisis, si la muestra de fluido ha dado positivo o negativo para bacterias o virus. Seguidamente, los resultados del análisis se muestran en la interfaz de usuario 60 mediante el módulo de salida 260. En un aspecto de la invención, se puede mostrar una simple indicación de "POSITIVO" o "NEGATIVO" en la interfaz de usuario 60 para informar sobre si la muestra de fluido ha dado positivo o negativo para una bacteria o virus. En otro aspecto de la invención, la interfaz de usuario 60 puede presentar visualmente los resultados de más de una bacteria o virus, o puede presentar visualmente datos específicos como el tamaño celular, el recuento celular, la morfología celular (forma y estructura), la fase del ciclo celular, el contenido de ADN y la existencia o ausencia de proteínas específicas en las superficies celulares. En un aspecto de la invención, el controlador 28 puede presentar visualmente el título viral en el caso de una reacción de PCR, o bien puede presentar visualmente la concentración de proteínas y la concentración de ADN.
En un aspecto de la invención, el resultado del análisis se puede guardar en un módulo de memoria de la memoria 252, para que los resultados se puedan revisar en un momento posterior. Si se guarda el resultado, el resultado debe codificarse para proteger el anonimato del paciente. En otro aspecto de la invención, uno o más resultados codificados pueden transmitirse de forma inalámbrica para su revisión en una ubicación distante del sistema de diagnóstico 1.
En un aspecto de la invención, el dispositivo 10 puede incluir un sensor de sistema de localización global (GPS) y puede registrar el resultado de la prueba junto con una lectura del sensor de GPS en el momento de la prueba. El controlador 28 puede entonces agregar una pluralidad de pruebas para determinar los virus o bacterias que prevalecen más en un área en contraposición con otra. En este aspecto de la invención, el controlador 28 no necesita guardar ninguna información del paciente, y solo necesita la ubicación del GPS y el número de resultados de prueba positivos y negativos en la ubicación para determinar la prevalencia del virus o bacteria en la ubicación. Los resultados pueden ser utilizados por una organización de salud para tratar una zona con la medicación adecuada para un virus o bacteria prevalente.
En otro aspecto de la invención, el usuario puede programar la ubicación en el dispositivo 10 antes, durante o después de realizar una pluralidad de pruebas, y el controlador 28 puede agregar la pluralidad de pruebas para determinar los virus o bacterias que prevalecen más o menos en la zona programada.
En un aspecto de la invención, el controlador 28 puede determinar si uno o más de entre la Yersina pestis, la Brucella, el alfavirus, el virus del dengue y/o el virus de la viruela están presentes en la muestra de fluido.
El sistema de diagnóstico 1 descrito en esta memoria puede detectar, por ejemplo, lentivirus (ssRNA) y adenovirus (dsDNA) en sangre entera, así como otros agentes infecciosos. Ejemplos de agentes infecciosos que pueden ser detectados por el sistema 1 descrito en la presente memoria incluyen patógenos bacterianos, patógenos víricos, patógenos fúngicos y/o patógenos parasitarios, si bien no se limitan a estos.
Ejemplos no limitativos de patógenos bacterianos incluyen el bacilo (por ejemplo, el Bacillus anthracis, el Bacillus cereus), la Bartonella (por ejemplo, la Bartonella henselae, la Bartonella quintana), la Bordatella (por ejemplo, la Bordatella pertussis), la Borrelia (por ejemplo, la Borrelia burgdorferi, la Borrelia garinii, la Borrelia afzelii, la Borrelia recurrentis), la Brucella (por ejemplo, la Brucella abortus, la Brucella canis, la Brucella melitensis, la Brucella suis), la Campylobacter (por ejemplo, la Campylobacter jejuni), la clamidia (por ejemplo, la Chlamydia pneumoniae, la Chlamydia trachomatis), la Chlamydophila (por ejemplo, la Chlamydophila psittaci), el Clostridium (por ejemplo, el Clostridium botulinum, el Clostridium difficile, el Clostridium perfringens, el Clostridium tetani), el Corynebacterium (por ejemplo, el Corynebacterium diphtheriae), el Enterococcus (por ejemplo, el Enterococcus faecalis, el Enterococcus faecium), la Escherichia (por ejemplo, la Escherichia coli), la Francisella (por ejemplo, la Francisella tularensis), el Haemophilus (por ejemplo, el Haemophilus influenzae), la Helicobacter (por ejemplo, la Helicobacter pylori), la Legionella (por ejemplo, la Legionella pneumophila), la Leptospira (por ejemplo, la Leptospira interrogans, la Leptospira santarosai, la Leptospira weilii, la Leptospira noguchii), la Listeria (por ejemplo, la Listeria monocytogenes), el Mycobacterium (por ejemplo, el Mycobacterium leprae, el Mycobacterium tuberculosis, el Mycobacterium ulcerans), el Mycoplasma (por ejemplo, el Mycoplasma pneumoniae), la Neisseria (por ejemplo, la Neisseria gonorrhoeae, la Neisseria meningitidis), la Pseudomonas (por ejemplo, la Pseudomonas aeruginosa), la Rickettsia (por ejemplo, la Rickettsia rickettsii), la Salmonella (por ejemplo, la Salmonella typhi, la Salmonella typhimurium), la Shigella (por ejemplo, la Shigella sonnei), el estafilococo (por ejemplo, el Staphylococcus aureus, el Staphylococcus epidermidis, el Staphylococcus saprophyticus), el estreptococo (por ejemplo, el Streptococcus agalactiae, el Streptococcus pneumoniae, el Streptococcus pyogenes), el Treponema (por ejemplo, el Treponema pallidum), el Ureaplasma (por ejemplo, el Ureaplasma urealyticum), el Vibrio (por ejemplo, el Vibrio cholerae), y la Yersinia (por ejemplo, la Yersinia pestis, la Yersinia enterocolitica, la Yersinia pseudotuberculosis).
Ejemplos no limitativos de patógenos virales incluyen los Adenoviridae (por ejemplo, el adenovirus), los Herpesviridae (por ejemplo, el virus del herpes simple de tipo 1 y tipo 2, el virus de varicela-zoster, el citomegalovirus, el virus de Epstein-Barr, el herpesvirus humano de tipo 8), los Papillomaviridae (por ejemplo, el papilomavirus humano), los Polyomaviridae (por ejemplo, el virus BK, el virus JC), los Poxviridae (por ejemplo, la viruela), los Hepadnaviridae (por ejemplo, el virus de la hepatitis B), los Parvoviridae (por ejemplo, el bocavirus humano, el parvovirus B19), los Astroviridae (por ejemplo, el astrovirus humano), los Caliciviridae, (por ejemplo, el virus Norwalk), los Picornaviridae (por ejemplo, el virus Coxsackie, el virus de la hepatitis A, el poliovirus, el rinovirus); los Coronaviridae (por ejemplo, el virus del síndrome respiratorio agudo grave, el virus del síndrome respiratorio de Oriente Medio), los Flaviviridae (por ejemplo, el virus de la hepatitis C, el virus de la fiebre amarilla, el virus del dengue, el virus del Nilo Occidental), los Togaviridae (por ejemplo, el virus de la rubéola), los Hepeviridae (por ejemplo, el virus de la hepatitis E), los Retroviridae (por ejemplo, los lentivirus, el virus de la inmunodeficiencia humana); los Orthomyxoviridae (por ejemplo, el virus de la gripe), los Arenaviridae (por ejemplo, el virus Guanarito, el virus Junin, el virus Lassa, el virus Machupo, el virus Sabiá), los Bunyaviridae (por ejemplo, el virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo), los Filoviridae (por ejemplo, el virus Ébola, virus de Marburgo), los Paramyxoviridae (por ejemplo, el virus del sarampión, el virus de las paperas, el virus de la parainfluenza, el virus respiratorio sincitial, el virus de la metaneumonía humana, el virus Hendra, el virus Nipah), los Phabdoviridae (por ejemplo, el virus de la rabia), los Reoviridae (por ejemplo, el rotavirus, el orbivirus, el coltivirus, el virus Banna) y virus no asignados (por ejemplo, el virus de la hepatitis D).
Ejemplos no limitativos de patógenos fúngicos incluyen la cándida (por ejemplo, la Candida albicans), el Aspergillus (por ejemplo, el Aspergillus fumigatus, el Aspergillus flavus), el Cryptococcus (por ejemplo, el Cryptococcus neoformans, el Cryptococcus laurentii, el Cryptococcus gattii), el Histoplasma (por ejemplo, el Histoplasma capsulatum), el Pneumocystis (por ejemplo, el Pneumocystis jirovecii, el Pneumocystis carinii), el Stachybotrys (por ejemplo, el Stachybotrys chartarum).
Ejemplos no limitativos de patógenos parasitarios incluyen la Acanthamoeba, el anisakis, la lombriz intestinal, el moscardón, el Balantidium coli, las chinches, la Cestoda (la tenia), las niguas, la Cochliomyia hominivorax, la Entamoeba histolytica, la Fasciola hepatica, la Giardia lamblia, los anquilostomas, la Leishmania, la Linguatula serrata, las duelas del hígado, la Loa serreta, el Paragonimus -duela pulmonar-, los oxiuros, el Plasmodium falciparum, el esquistosoma, el Strongyloides stercoralis, los ácaros, las tenias, el Toxoplasma gondii, el tripanosoma, los tricocéfalos, y la Wuchereria bancrofti.
A menos que se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, propiedades tales como peso molecular, condiciones de reacción, etc. utilizados en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones deben entenderse como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". En consecuencia, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos establecidos en la anterior memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se pretende obtener mediante la presente invención. Como mínimo, y no como un intento de limitar la aplicación de la doctrina de los equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico debe interpretarse al menos a la luz del número de dígitos significativos que se aportan y aplicando técnicas de redondeo ordinarias. Independientemente del hecho de que los intervalos numéricos y los parámetros que establecen el alcance amplio de la invención son aproximaciones, los valores numéricos establecidos en los ejemplos específicos se han aportado con la mayor precisión posible. Sin embargo, cualquier valor numérico contiene inherentemente ciertos errores que resultan necesariamente de la desviación típica encontrada en sus respectivas mediciones de prueba.
Los términos "un" y "una", y "el" y “la”, así como referencias similares utilizadas en el contexto de la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) deben interpretarse de manera que cubran tanto el singular como el plural, a menos que se indique de otro modo en esta memoria o se contradiga claramente por el contexto. La enumeración de intervalos de valores en esta memoria tiene la intención de servir simplemente como un método abreviado para referirse por separado a cada valor individual que se encuentre dentro del intervalo. A menos que se indique de otro modo en la presente memoria, cada valor individual se incorpora a la memoria como si se mencionara de forma individual en esta memoria. Todos los métodos descritos en esta memoria se pueden llevar a cabo en cualquier orden adecuado, a menos que se indique de otro modo en esta memoria o el contexto lo contradiga claramente. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o lenguaje ilustrativo (por ejemplo, "tal como"), que se proporciona en el presente documento tiene la mera intención de ilustrar mejor la invención y no impone ninguna limitación en el alcance de la invención de otro modo reivindicada. Nada de lo dicho en la memoria debe interpretarse como una indicación de algún elemento esencial que no se haya reivindicado para la práctica de la invención.
El uso del término "o" en las reivindicaciones se hace para significar "y/o", a menos que se indique explícitamente que se refiere solo a alternativas o las alternativas se excluyan mutuamente, aunque la invención apoye una definición que se refiera solo a alternativas e "y/o".
Las agrupaciones de elementos o realizaciones alternativos de la descripción divulgada en esta memoria no deben interpretarse como limitaciones. Se puede hacer referencia a cada miembro del grupo y reivindicarlo individualmente o en cualquier combinación con otros miembros del grupo u otros elementos que se encuentren en esta memoria. Se anticipa que uno o más miembros de un grupo pueden ser incluidos o eliminados de un grupo por razones de conveniencia y/o patentabilidad. Cuando se produce dicha inclusión o supresión, se considera aquí que la memoria contiene el grupo tal y como se ha modificado, cumpliendo así la descripción escrita de todos los grupos de Markush que se utilizan en las reivindicaciones adjuntas.
En la presente memoria se describen realizaciones preferidas de la invención, incluido el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la invención. Por supuesto, variaciones de esas realizaciones preferidas resultarán evidentes para los expertos en la materia al leer la descripción anterior. Los presentes inventores esperan que las personas con conocimientos ordinarios de la técnica empleen tales variaciones según sea apropiado, y los inventores pretenden que la descripción se lleve a la práctica de forma diferente a la específicamente descrita en esta memoria. Además, cualquier combinación de los elementos descritos anteriormente, en todas las variaciones posibles de los mismos, está abarcada por la descripción, a menos que se indique lo contrario en la presente memoria o que el contexto lo contradiga claramente.
Las realizaciones específicas descritas en la presente memoria pueden estar limitadas de manera adicional en las reivindicaciones mediante el uso de la frase “que consiste en” o “que consiste esencialmente en”. Cuando se usa en las reivindicaciones, ya sea tal y como se presentaron estas o según se añadió en unas modificaciones, la expresión de transición "que consiste en" excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en las reivindicaciones. La expresión de transición "que consiste esencialmente en" limita el alcance de una reivindicación a los materiales o etapas especificados y a aquellos que no afectan materialmente a la(s) característica(s) básica(s) y novedosa(s). Las realizaciones de la invención así reivindicada se describen y habilitan inherente o expresamente en esta memoria.
Debe entenderse que las realizaciones de la invención divulgada en esta memoria son ilustrativas de los principios de la presente invención. Otras modificaciones que pueden emplearse están dentro del alcance de la invención. Así, a modo de ejemplo, pero no de limitación, pueden utilizarse configuraciones alternativas de la presente invención de acuerdo con las enseñanzas de la presente memoria. En consecuencia, la presente invención no se limita a lo que se muestra y describe de forma precisa.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un dispositivo (10) para analizar una reacción en cadena de la polimerasa en una muestra de fluido, de manera que el dispositivo comprende:
una fuente de corriente (30), configurada para provocar la reacción en cadena de la polimerasa calentando la muestra de fluido dentro de una zona de objetivo (166);
un dispositivo de obtención de imágenes de cámara (20), configurado para registrar una pluralidad de imágenes de la muestra de fluido de la zona objetivo mientras la fuente de corriente provoca la reacción en cadena de la polimerasa; y
un controlador (28), configurado para, para al menos una de la pluralidad de imágenes, (i) dividir virtualmente la zona de objetivo de la imagen respectiva en una pluralidad de contenedores (200) sin que los contenedores estén separados por barreras físicas, (ii) distinguir objetos deseados de la pluralidad de contenedores de un objeto no deseado de la pluralidad de contenedores comparando el tamaño o la forma de los objetos de la imagen respectiva con el tamaño promedio o la forma promedio de las células sanguíneas, y (iii) determinar si la muestra de fluido da positivo o negativo para una bacteria o virus basándose en los objetos deseados, seleccionando al menos dos de la pluralidad de contenedores que se solapan a un grupo de objetos deseados y calculando un valor medio de fluorescencia de los al menos dos de la pluralidad de contenedores,
en el que los objetos deseados incluyen células, y el objeto no deseado incluye un objeto que no tiene al menos uno de entre el tamaño promedio o la forma promedio de las células, y
en el cual el controlador (28) está configurado para al menos una acción de entre (a) excluir al menos uno de la pluralidad de contenedores del cálculo del valor medio de fluorescencia si el al menos uno de la pluralidad de contenedores se solapa al objeto no deseado, o (b) asignar un peso a al menos uno de la pluralidad de contenedores utilizados en el cálculo del valor medio de fluorescencia basándose en la proximidad del al menos uno de la pluralidad de contenedores al objeto no deseado.
2. El dispositivo (10) de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el objeto no deseado es una burbuja de aire.
3. El dispositivo (10) de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el controlador (28) está configurado para asignar pesos a al menos dos de la pluralidad de contenedores basándose en la proximidad del objeto no deseado, siendo los pesos mayores que cero, y utilizar los pesos de los al menos dos de la pluralidad de contenedores en un cálculo del valor medio de fluorescencia.
4. El dispositivo (10) de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en el que la pluralidad de contenedores (200) están dispuestos en una retícula con una pluralidad de filas y columnas.
5. El dispositivo (10) de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el controlador (28) está configurado para seleccionar adicionalmente los al menos dos de la pluralidad de contenedores basándose en un valor umbral para el brillo.
6. El dispositivo (10) de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el controlador (28) está configurado para excluir adicionalmente al menos uno de la pluralidad de contenedores si el al menos uno de la pluralidad de contenedores no alcanza un valor de umbral mínimo de brillo.
7. El dispositivo (10) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el controlador (28) está configurado para informar de una prueba no concluyente si el controlador identifica al menos un objeto no deseado en la pluralidad de imágenes.
8. El dispositivo (10) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que incluye una interfaz de usuario (60), en el que el controlador (28) incluye una pluralidad de análisis preprogramados que se pueden realizar en la muestra de fluido, y en el cual la interfaz de usuario está configurada permitir a un usuario seleccionar al menos un análisis de la pluralidad de análisis preprogramados.
9. El dispositivo (10) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la pluralidad de imágenes incluye al menos una de entre: (i) una pluralidad de imágenes fijas de la reacción en cadena de la polimerasa registradas por el dispositivo de obtención de imágenes de cámara (20) durante un cierto período de tiempo; o (ii) una imagen de vídeo de la reacción en cadena de la polimerasa registrada por el dispositivo de obtención de imágenes de cámara durante ese período de tiempo.
10. El dispositivo (10) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además una fuente de luz (22) que proporciona una luz de excitación de fluorescencia sobre la muestra de fluido.
11. El dispositivo (10) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, de manera que el dispositivo está configurado para recibir una tarjeta de prueba (100) que incluye la muestra de fluido, y de modo que la zona de objetivo está situada dentro de la tarjeta de prueba.
12. Un método para utilizar el dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que incluye: calentar la muestra de fluido de la zona objetivo (166) para provocar la reacción en cadena de la polimerasa; registrar la pluralidad de imágenes de la muestra de fluido de la zona objetivo durante la reacción en cadena de la polimerasa, mientras una fuente de luz (22) proporciona una luz de excitación de fluorescencia sobre la muestra de fluido;
dividir la zona de objetivo en una pluralidad de contenedores en al menos una de la pluralidad de imágenes; calcular un valor de fluorescencia utilizando al menos dos de la pluralidad de contenedores para la imagen respectiva; y
determinar si la muestra de fluido da positivo o negativo para una bacteria o virus basándose en el valor de fluorescencia calculado, seleccionando al menos dos de la pluralidad de contenedores que se solapan a un grupo de objetos deseados y calculando un valor medio de fluorescencia de los al menos dos de la pluralidad de contenedores,
en el que los objetos deseados incluyen células, y el objeto no deseado incluye un objeto que no tiene al menos uno del tamaño promedio o la forma promedio de las células sanguíneas, y
en el cual calcular el valor de fluorescencia incluye al menos una acción de entre (i) ponderar los al menos dos de la pluralidad de contenedores basándose en la proximidad a un objeto no deseado, o (ii) excluir al menos uno de la pluralidad de contenedores del cálculo del valor de fluorescencia si el al menos uno de la pluralidad de contenedores se solapa a un objeto no deseado.
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