ES2926227T3 - Receptor de antígeno quimérico con dominio de activación o bloqueo del receptor de citoquinas - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR), que comprende una parte extracelular, al menos un dominio de señalización intracelular y al menos un dominio transmembrana, en el que la parte extracelular de dicho CAR comprende a) al menos un dominio de unión a antígeno, y b) al menos un dominio activador o bloqueador del receptor de citoquinas. La invención también proporciona molécula(s) de ácido nucleico aislado(s) que codifica(n) dicha(s) CAR, una célula que comprende dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico, una célula que expresa dicha(s) CAR y usos terapéuticos de dicha CAR. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Receptor de antígeno quimérico con dominio de activación o bloqueo del receptor de citoquinas

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de los receptores de antígenos quiméricos, en particular a los receptores de antígenos quiméricos que comprenden al menos un dominio de unión a antígeno, al menos un dominio de activación o bloqueo del receptor de citoquinas, un dominio espaciador extracelular facultativo unido a un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, a las células que expresan los mismos, y a los usos terapéuticos de los mismos.

Antecedentes de la invención

El tratamiento de enfermedades malignas mediante terapia celular adoptiva está cobrando un gran interés, basado en la suposición general de que el sistema inmunitario puede controlar el cáncer a largo plazo. Los linfocitos infiltrantes de tumores (TILs) aislados de lesiones tumorales, expandidos ex vivo y re-infundidos al paciente han producido resultados alentadores en la terapia del melanoma metastásico. Como la especificidad de esas células T con frecuencia no se conoce y los TILs a menudo no se pueden aislar en cantidades suficientes de otras entidades tumorales, se elaboraron estrategias para injertar las células T de los pacientes ex vivo con una especificidad predefinida para las células cancerosas, mediante la modificación con ingeniería genética con un receptor de células T (TCR) o un receptor de antígeno quimérico recombinante (CAR) ("cuerpo T"). En contraste con el TCR, el CAR se compone de una cadena polipeptídica con un dominio de unión a antígeno extracelular derivado de un anticuerpo, principalmente un fragmento de cadena única de anticuerpo de región variable (scFv), y una cadena de señalización intracelular, con frecuencia la cadena CD3zeta derivada de TCR. El dominio del anticuerpo media en el reconocimiento del objetivo independientemente del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) y permite el direccionamiento de una gran cantidad de antígenos, incluyendo proteínas, carbohidratos y gangliósidos, siempre que el antígeno esté presente en la superficie de la célula objetivo. La participación del antígeno en el CAR induce la formación de sinapsis y la posterior señalización a través de la cascada de quinasas asociadas a TCR, lo que finalmente produce una mayor secreción de citoquinas, amplificación de células T y citotoxicidad. La modificación de la estructura del CAR y, en particular, de los dominios CAR individuales para optimizar la función de las células T redirigidas ha sido durante mucho tiempo un aspecto de la investigación preclínica. Los CARs de segunda generación se modificaron genéticamente añadiendo un dominio co-estimulador a la cadena de señalización básica de CD3zeta para impulsar la respuesta y prolongar la persistencia de las células T; los CARs de tercera generación albergan dos dominios co­ estimuladores para ajustar la respuesta de las células T redirigidas.

En la Patente de EE.UU. US7,514,537B2 se describen inmunorreceptores de transmembrana quiméricos, denominados ''zetaquinas''. Están compuestos por un dominio extracelular que comprende un ligando de receptor soluble, por ejemplo, una citoquina, unida a una región de soporte capaz de unir el dominio extracelular a una superficie celular, una región de transmembrana y un dominio de señalización intracelular. Las zetaquinas, cuando se expresan en la superficie de los linfocitos T, dirigen la actividad de las células T a aquellas células específicas que expresan un receptor para el cual el ligando del receptor soluble es específico, ya que el ligando del receptor soluble es idéntico al dominio de unión al antígeno del inmunorreceptor de transmembrana quimérico. Una zetaquina no afecta el medio homeostático de las citoquinas en un paciente al que se le podría aplicar.

A pesar del notable éxito en el tratamiento de neoplasias malignas hematológicas, la estrategia de los cuerpos-T se enfrenta a una serie de limitaciones cuando se dirige a lesiones tumorales sólidas; algunas de ellas representan una limitación más general de las estrategias de redirección de antígenos. A medida que avanza la enfermedad, las células cancerosas adquieren una variabilidad considerable en el fenotipo y la función, lo que da como resultado variantes de células tumorales con pérdida de antígeno que son invisibles para las células T modificadas con CAR o TCR. Además, varios mecanismos más se suman a la reducción de la eficacia antitumoral de células T específicas, por ejemplo, aumentando la resistencia a un ataque de células T citolíticas debido a defectos en la vía de apoptosis, un estroma, que es menos penetrable para células T y un medio, que reprime activamente la activación de las células inmunitarias por diversos medios, incluyendo las células T reguladoras (Treg), las células supresoras derivadas de mieloides (MDSCs) y los macrófagos. Estos y otros factores facilitan la reincidencia del tumor, a pesar de la gran cantidad de células T circulantes específicas del tumor. Actualmente se están realizando varios esfuerzos para superar estas limitaciones, por ejemplo, mediante la optimización de la unión al objetivo, mejorando la supervivencia de las células T y proporcionando un medio homeostático favorable. Una estrategia descrita recientemente aborda la eliminación de variantes de células cancerosas con pérdida de antígeno además de los inconvenientes mencionados mediante el uso de células T modificadas genéticamente con CAR como instalaciones de producción, que liberan una citoquina transgénica en el tejido tumoral objetivo para reclutar células inmunitarias adicionales para la lucha contra esas células cancerosas que son invisibles para las células T CAR (Chmielewski et al, Immunological Reviews 2014, vol. 257: 83­ 90).

Las TRUCKs (células T redirigidas para la eliminación universal de citoquinas) son células T redirigidas por CAR que se utilizan como vehículos para producir y liberar un producto transgénico que se acumula en el tejido objetivo. El producto, en su mayoría una citoquina proinflamatoria, se puede producir o inducir de manera constitutiva una vez que la CAR activa la célula T en el tejido objetivo. La acumulación de una citoquina proinflamatoria transgénica tiene como objetivo reclutar una segunda ola de células inmunitarias de manera local restringida para iniciar un ataque hacia aquellas células cancerosas que son invisibles para las células T CAR. Otras células productoras además de las células T, como las células NK, también se pueden usar como vehículos redirigidos por CAR produciendo una carga útil tras la activación de CAR en el tejido objetivo. La viabilidad de la estrategia de TRUCK se demostró recientemente por la acumulación local de IL-12, que no puede administrarse sistémicamente en dosis terapéuticas debido a la extraordinaria toxicidad de IL-12. Las células T redirigidas por un CAR dirigido al tumor y además modificadas genéticamente con un casete de IL-12 inducible por CAR (iIL-12) secretan IL-12 tras la participación de CAR del antígeno afín (Chmielewski Cancer Res 2011 ;71:5697-5706); sin señalización de CAR, no se produjo liberación de IL-12.

La liberación de IL-12 mediada por TRUCK está restringida localmente, sin embargo, corre el riesgo de acumular IL-12 en un entorno "fuera del tumor".

La interleucina 12 (IL-12) es una interleucina producida de manera natural por las células dendríticas, los macrófagos, los neutrófilos y las células linfoblastoides B humanas (NC-37) en respuesta a la estimulación antigénica.

Es una citoquina heterodimérica codificada por dos genes separados, IL-12A (p35) e IL-12B (p40). El heterodímero activo (denominado 'p70') y un homodímero de p40 se forman después de la síntesis de proteínas. IL-12 está implicado en la diferenciación de células T nativas en células Th1. Es conocido como un factor estimulante de células T, que puede estimular el crecimiento y la función de las células T. Estimula la producción de interferón gamma (IFN-y ) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) a partir de células T y células asesinas naturales (NK), y reduce la supresión de IFN-y mediada por IL-4. IL-12 juega un papel importante en las actividades de las células asesinas naturales y los linfocitos T. IL-12 media la mejora de la actividad citotóxica de las células NK y los linfocitos T citotóxicos CD8+.

La IL-12 se une al receptor de IL-12, que es un receptor heterodimérico formado por IL-12R-p 1 e IL-12R-p2. Se considera que IL-12R-p2 juega un papel clave en la función de IL-12, ya que se encuentra en las células T activadas.

Existe la necesidad en la técnica de un CAR mejorado, especialmente de un CAR que pueda interactuar de manera controlable con el receptor de citoquinas - sistema de citoquinas en un sujeto, cuando el CAR se expresa en las células inmunitarias.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona un CAR que alberga al menos un dominio de activación del receptor de citoquinas, por ejemplo, al menos una citoquina de interés, como un módulo adicional en la parte extracelular del CAR, en el que dicho al menos un dominio de activación del receptor de citoquinas se selecciona del grupo que consiste en IL-1, IL-2, IL-4, IL-6 , IL-7, GM-CSF, variante p35-p40 de ⁱL-12, IL 18 e IL-32. El CAR como se describe en la presente memoria es un CAR de transactivación. El CAR de transactivación, cuando se expresa en la superficie de los glóbulos blancos (células inmunitarias) dirige la trans-actividad de esas células contra las células objetivo que expresan el antígeno que es reconocido por dicho al menos un dominio de unión al antígeno del CAR de transactivación.

Transactividad significa las características del CAR de la invención, que el CAR de la invención comprende al menos un dominio, es decir, el dominio de activación del receptor de citoquinas, que, cuando se expresa en la superficie de los glóbulos blancos, desencadena una actividad en la célula objetivo, en el glóbulo blanco que expresa dicho CAR o en otra célula, en donde dicha actividad desencadenada es independiente de la unión del antígeno de la célula objetivo por el dominio de unión al antígeno de dicho CAR. Dicha actividad desencadenada puede ser la activación de un receptor de citoquinas que dé como resultado, por ejemplo, una liberación de la citoquina dada (cuando dicho dominio es un dominio de activación del receptor de citoquinas). Sorprendentemente, se descubrió que un dominio de activación del receptor de citoquinas, tal como la p34-p40 de IL-12 de cadena sencilla (una variante recombinante de la IL-12) que está integrada en la parte extracelular de un CAR, puede interactuar y activar el receptor de citoquinas coincidente. Por ejemplo, la IL-12 o un fragmento funcional de la misma integrado en la parte extracelular de un CAR activa el receptor de IL-12 de la célula efectora inmunitaria, por ejemplo, las células T que expresan dicho CAR, lo que da como resultado una activación de células T sinérgica tras el compromiso de CAR con el objetivo, por ejemplo, indicado por el aumento en la liberación de IFN-y . El ataque de células que contienen CAR (en lo sucesivo, "células CAR") se beneficia de la señalización mediada por citoquinas con respecto a una respuesta inmune mejorada y prolongada y la persistencia en el tejido tumoral objetivo. IL-12 inicia y promueve una serie de funciones que incluyen la activación de células T, células NK, células derivadas de mieloides, la promoción de la polarización de células T auxiliares-1 y la reversión de la polarización de células T auxiliares-2, la mejora de la presentación de MHC de clase I, el aumento de secreción de quimioquinas como IP-10 y MIG, alterando la matriz extracelular y la disminución de la angiogénesis.

La invención también proporciona molécula(s) de ácido nucleico aislado(s) que codifica(n) dicho(s) CAR, una célula que comprende dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico, una célula que expresa dicho(s) CAR y usos terapéuticos de dicho CAR.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1: Composición modular del IL12-CAR.

(A) Casete de expresión de anti-CEA CAR convencional de 2nd generación.

(B) Casete de expresión del híbrido de CAR con el dominio de unión al antígeno CEA y el dominio de activación del receptor de IL-12 (anti-CEA-IL12-CAR).

La Figura 2: Expresión de CARs por células T de sangre periférica.

Las células T de sangre periférica se transdujeron para expresar un anti-CEA CAR convencional de segunda generación o el anti-CEA-IL12-CAR híbrido, respectivamente. Los CARs se detectaron en la superficie celular mediante citometría de flujo de dos colores utilizando un anticuerpo IgG anti-humano y anti-CD3, respectivamente.

La Figura 3: Anti-CEA-IL12-CAR se expresa en diferentes subconjuntos de células T.

Se transdujeron células T de sangre periférica para expresar un anti-CEA-CAR convencional de segunda generación o el anti-CEA-IL12-CAR híbrido, respectivamente. La expresión de CAR en células T CD4+ y CD8+ se registró mediante citometría de flujo de tres colores utilizando anticuerpos IgG anti-humana y anti-CD4 y anti-CD8, respectivamente. Se controlaron las células T CD4+ y CD8+ y se determinó el número de células CAR+ en los subconjuntos de células T.

La Figura 4: Anti-CEA-IL12-CAR induce células T CD56+CD62L+.

Células T anti-CEA-CAR, células T anti-CEA-IL12-CAR y células T no transducidas, respectivamente, se cultivaron durante 9 días después de la transducción en presencia de IL2 (500U/ml) y se analizó la expresión de CD56 y CD62L mediante citometría de flujo multicolor. Los datos representan transferencias de puntos de un experimento típico.

La Figura 5: Secreción mejorada de IFN-gamma mediante la señalización combinada cis y trans del anti-CEA-IL12-CAR híbrido.

Las células T CAR (0,313-2,5 x 10(4)/pocillo) se co-cultivaron durante 48 h con células tumorales CEA+ LS174T, CEA-Colo320 (cada una 2,5 x 10(4)/pocillo) y sin células objetivo, respectivamente. Después de 48 h, se separaron los sobrenadantes y se analizó la secreción de IFN-gamma mediante ELISA. Los datos representan la media de triplicados - desviación estándar (SD).

La Figura 6: Lisis de células objetivo mediada por CAR.

Se co-cultivaron células T CAR (0,313-2,5 x 10(4)/pocillo) durante 48 h con células tumorales CEA+ LS174T o Skov3 y para el control con células tumorales CEA-Colo320 (cada una 2,5 x 10(4)/pocillo), respectivamente. Después de 48 h, se determinó la viabilidad de las células diana mediante un ensayo XTT colorimétrico basado en sal de tetrazolio. La citotoxicidad se calculó por 100-viabilidad [%]. Los datos representan la media de triplicados - desviación estándar (SD).

La Figura 7: El anti-CEA-IL12-CAR híbrido es superior al anti-CEA-CAR convencional con estimulación combinada por CAR e IL12 exógena.

Las células T CAR convencionales se cultivaron en presencia de IL2 (500 U/ml) o se acondicionaron durante 72 h en presencia del anticuerpo antiidiotípico específico para CAR BW2064 (4 pg/ml) y mIL12 exógeno (5 ng/nml) e IL2 ( 500U/ml). Células T CAR condicionadas y no condicionadas (2,5 x 10(4)/pocillo) y células T anti-CEA-IL12-CAR se co-cultivaron durante 48 h con células tumorales CEA+ LS174T o Skov3 y para el control con células tumorales CEA-Colo320 células (cada una 2,5 x 10(4)/pozo), respectivamente). Después de 48 h, se determinó la viabilidad de las células objetivo mediante un ensayo XTT colorimétrico basado en la sal de tetrazolio. La citotoxicidad se calculó por 100-viabilidad [%]. Los datos representan la media de triplicados - desviación estándar (SD).

La Figura 8: La estimulación combinada por IL2 e IL12 exógena no tiene impacto en la lisis de células objetivo de anti-CEA-IL12-CAR híbrido y anti-CEA-CAR convencional, respectivamente.

Se co-cultivaron células T CAR y no transducidas (2,5 x 10(4)/pocillo) durante 48 h con células tumorales CEA+ Skov3 (2,5 x 10(4)/pocillo) en presencia de mIL12 (5 ng/ml) o IL2 (10-1000 U/ml) o una combinación de ambos, respectivamente). Después de 48 h, se determinó la viabilidad de las células objetivo mediante un ensayo XTT colorimétrico basado en la sal de tetrazolio. La citotoxicidad se calculó por 100-viabilidad [%]. Los datos representan la media de triplicados - desviación estándar (SD).

La Figura 9: Las células T anti-CEA-CAR inhiben el crecimiento de tumores Skov3 en ratones immunodeficientes Rag -/- gamma común -/-.

Los ratones Rag -/- gamma común -/- fueron injertados subcutáneamente con células tumorales Skov3 (5 x 10 (6)/ratón; 6 animales/grupo). Después del establecimiento de los tumores, los ratones recibieron una única dosis intravenosa de células T CAR o no transducidas (1 x 10(7)/ratón). El número de células T CAR fue del 14 % (anti CEA-CAR) y del 9 % (anti-CEA-IL12-CAR), respectivamente. Los datos representan valores medios. La flecha indica el momento de la inyección de células T.

La Figura 10: Casetes de expresión del anti-Muc1-CAR y del anti-Muc1-IL12-CAR.

(A) Casete de expresión de anti-Muc1-CAR.

(B) Casete de expresión del anti-Muc1 scFv-IL12-CAR.

La Figura 11: Expresión de los scFv-IL12-CARs con diferentes especificidades antigénicas en células T de sangre periférica.

Las células T de la sangre periférica se transdujeron para expresar el anti-CEA-IL12-CAR o el anti-Mucl-IL12-CAR, respectivamente. Los CARs se detectaron en la superficie de las células T mediante citometría de flujo de dos colores utilizando un anticuerpo IgG antihumano, que detecta el espaciador Fc extracelular, y un anticuerpo anti-CD3, respectivamente. Los diagramas de puntos FACS demuestran la expresión de los respectivos scFv-IL12-CAR en la superficie de las células T.

La Figura 12: El anti-Muc1-IL12-CAR mejoró la secreción de IFN-y tras la unión con el antígeno.

(A, B) Las células T CAR (0,313-2,5 x 10(4) células/pocillo) se co-cultivaron durante 48 h con células tumorales Muc1 LS174T y Mucl-Colo320 (cada una 2,5 x 10(4) células/pocillo), respectivamente. Después de 48 h, se analizó IFN-y en los sobrenadantes mediante ELISA. Los datos representan medias de triplicados /- desviación estándar (SD).

(C) Células T anti-Mucl-CAR, células T anti-Muc1-IL12-CAR y células T no transducidas para el control (cada una 0,313-2,5 x 10(4) células/pocillo) se co-cultivaron con células tumorales Muc1+ MCF7 (2,5 x 10(4) células/pocillo). Después de 48 h, se determinó la viabilidad de las células objetivo mediante un ensayo XTT colorimétrico basado en la sal de tetrazolio. La citotoxicidad se calculó por 100-viabilidad [%]. Los datos representan la media de triplicados /-desviación estándar (SD).

La Figura 13: Las células T CAR anti-CEA-IL12 y anti-Muc1-IL12 lisan las células tumorales específicamente con alta eficiencia.

Se co-cultivaron células T anti-Muc1-IL12-CAR, anti-CEA-IL12 CAR y células T no transducidas para el control, respectivamente, con células tumorales CEA+Muc1+ LS174T, CEA+Muc1+ MCF7 o CEA-Muc1-Colo 320 (cada una 2,5 x 10(4) células/pocillo). Después de 48 h, se determinó la viabilidad de las células objetivo mediante un ensayo XTT colorimétrico basado en la sal de tetrazolio. La citotoxicidad se calculó por 100-viabilidad [%]. Los datos representan la media de triplicados /- desviación estándar (SD). Los datos demuestran una lisis eficiente y específica de las células objetivo por células T scFv-IL12-CAR híbridas.

La Figura 14: Las células T anti-CEA-IL12 CAR no lisan los fibroblastos normales de CEA.

(A) Células T anti-CEA-CAR, anti-CEA-IL12-CAR híbrido y no transducidas (cada una 0,313-2,5 x 10(4) células/pocillo) se co-cultivaron con CEA+ LS 174T, fibroblastos normales de CEA y células tumorales CEA-Colo320 (cada una 2,5 x 10(4) células/pocillo). Después de 48 h, se determinó la viabilidad de las células objetivo mediante un ensayo XTT colorimétrico basado en la sal de tetrazolio. La citotoxicidad se calculó por 100-viabilidad [%]. Los datos representan la media de triplicados /- desviación estándar (SD).

La Figura 15: Casete de expresión de IL7-anti-CEA-CAR.

El IL7-CAR alberga IL7 en lugar de IL12 como citoquina activa y tiene el dominio de citoquina en la posición terminal mientras que el IL12 CAR en la posición entre el scFv y el espaciador IgG1-Fc. li, enlazador; hi, bisagra; CD28d, dominio intracelular de CD28 con sitio de unión a lck mutado; BW431/26 scFv, anti-CEA scFv.

La Figura 16: Expresión de IL7-anti-CEA-CAR híbrido en células T de sangre periférica.

Se transdujeron células T de sangre periférica para expresar el anti-CEA-CAR o el IL7-anti-CEA-CAR híbrido. Los CARs se detectaron en la superficie celular mediante citometría de flujo de dos colores utilizando un anticuerpo IgG anti-humano y anti-CD3, respectivamente. Los datos demuestran la expresión eficiente del IL7-anti-CEA-CAR híbrido. w/o, sin CAR.

La Figura 17: Expansión preferencial de células T CD8+ con IL7-anti-CEA-CAR.

(A) Las células T de sangre periférica se modificaron genéticamente mediante transducción retroviral con IL7-anti-CEA CAR y, para su comparación con anti-CEA CAR sin citoquina, respectivamente. Las células T se cultivaron en presencia de IL2 (500 U/ml). La expresión de CAR se controló 72 h y 144 h después de la transducción mediante citometría de flujo de dos colores.

(B) Las células T se tiñeron 144 horas después de la transducción con anticuerpos anti-CD4 y anti-CD8 para la clasificación de células T y con un anticuerpo IgG Fc antihumano para registrar el CAR. Las células se analizaron por citometría de flujo y se determinó el número de células T CAR+.

La Figura 18: Células T IL7-anti-CEA-CAR lisan células tumorales CEA+ con alta eficiencia.

Células T anti-CEA-CAR, IL7-anti-CEA-CAR y no transducidas (cada una 0,625-5 x 10(4) células/pocillo) se co­ cultivaron con células tumorales CEA+ LS174T o CEA-Colo320 (cada una 2,5 x 10(4) células/pozo). Después de 48 h, se determinó la viabilidad de las células objetivo mediante un ensayo XTT colorimétrico basado en la sal de tetrazolio. La citotoxicidad se calculó por 100-viabilidad [%]. Los datos representan la media de triplicados /-desviación estándar (SD). w/o, sin CAR.

Descripción detallada de la invención

En un primer aspecto, la invención proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR), que comprende desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal una parte extracelular, al menos un dominio de señalización intracelular y al menos un dominio transmembrana, en donde la parte extracelular de dicho CAR comprende

a) al menos un dominio de unión a antígeno, y

b) al menos un dominio de activación del receptor de citoquinas,

en el que dicho al menos un dominio de activación del receptor de citoquinas se selecciona del grupo que consiste en IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, GM-CSF, variante p35-p40 de IL-12, IL 18 e IL-32.

El al menos un dominio de señalización intracelular puede comprender al menos un dominio co-estimulador y/o al menos un dominio de señalización primario.

En una divulgación, el CAR también puede comprender dos o más miembros de polipéptidos que juntos funcionan como un CAR activo funcional (por ejemplo, CAR de encendido, CAR de apagado, CAR condicionalmente activo, CAR regulable, CAR controlable, CAR multicadena), por ejemplo, un primer polipéptido que comprende al menos un dominio de unión a antígeno, al menos un dominio de activación o bloqueo del receptor de citoquinas, un primer miembro de un par de dimerización y un dominio transmembrana; y un segundo polipéptido que comprende un segundo miembro de un par de dimerización y al menos un dominio de señalización intracelular (para la señalización clave del CAR activo), y opcionalmente un dominio transmembrana, en el que el CAR se activa tras la dimerización mediante un dimerizador que reconoce los miembros del par de dimerización. Dichos constructos del CAR con módulos de señalización y reconocimiento de la clave dividida se describen, por ejemplo, en las Patentes Internacionales WO2014/127261A1, WO2015017214A1, WO2015090229A1, WO2015142661A1,

y WO2015150771A1.

En una realización de la divulgación, dicho al menos un dominio de activación del receptor de citoquinas de dicho CAR puede seleccionarse del grupo que consiste en IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IFN-gamma, IL-6, IL-7, GM-CSF, variante p35-p40 de IL-12, IL-17, IL-18, IL-23, IL-32, TNF-alfa o fragmentos funcionales de los mismos. Dichos dominios de activación del receptor de citoquinas pueden tener una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % en comparación con la secuencia de tipo nativo de dichos dominios de activación del receptor de citoquinas, respectivamente.

En una realización de la divulgación, el CAR puede comprender al menos un dominio de bloqueo del receptor de citoquinas y dicho al menos un dominio de bloqueo del receptor de citoquinas puede seleccionarse del grupo que consiste en TGF-beta, IL-10, variante p40-p40 de IL12, IL-13, IL-32 o fragmentos funcionales de los mismos. Dichos dominios de bloqueo de receptores de citoquinas pueden tener una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % en comparación con la secuencia de tipo nativo de dichos dominios de bloqueo de receptores de citoquinas, respectivamente.

En una realización de la invención, dicho al menos un dominio de activación del receptor de citoquinas de dicho CAR activa el receptor de interleucina 12.

Dicho al menos un dominio de activación del receptor de citoquinas del receptor de interleucina 12 es la variante p35-p40 de la citoquina IL-12 o un fragmento funcional de la misma.

En una realización de la invención, dicho al menos un dominio de activación del receptor de citoquinas comprende la secuencia codificada por SEQ ID NO: 1.

En una realización de la invención, dicho al menos un dominio de activación del receptor de citoquinas de dicho CAR activa el receptor de interleucina 7.

Dicho al menos un dominio de activación del receptor de citoquinas del receptor de interleucina 7 es la citoquina IL-7 o un fragmento funcional de la misma.

En una realización de la invención, dicho al menos un dominio de activación del receptor de citoquinas comprende la secuencia codificada por SEQ ID NO: 14.

En una realización de la invención, dicho al menos un dominio de activación del receptor de citoquinas está entre el al menos un dominio de unión a antígeno y el al menos un dominio transmembrana de dicho CAR. En otra realización, dicho al menos un dominio de activación del receptor de citoquinas está flanqueado por dominios enlazadores, por ejemplo, la bisagra de IgG1.

En una realización adicional de la invención, dicho al menos un dominio de activación o bloqueo del receptor de citoquinas está en la posición N-terminal de la secuencia de aminoácidos de dicho CAR, es decir, el al menos un dominio de unión a antígeno está entre el al menos un dominio de activación o bloqueo del receptor de citoquinas y el al menos un dominio transmembrana de dicho CAR.

La activación de los receptores que corresponden al respectivo dominio de activación o bloqueo del receptor de citoquinas, por ejemplo, la activación del receptor de IL-12 o del receptor de IL-7 como se describe en la presente memoria da como resultado una mayor liberación de IFN-y y otras funciones efectoras mejoradas bien conocidas por los expertos mediante la célula que alberga dicho receptor. El efecto de activación o inhibición de dicho receptor es independiente de la posición extracelular de dicho al menos un dominio de activación o bloqueo del receptor de citoquinas del CAR como se describe en la presente memoria.

En una realización de la invención, dicho al menos un dominio de unión a antígeno comprende al menos un fragmento variable de cadena única de un anticuerpo que se une al antígeno, o al menos una región variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo que se une al antígeno.

En una realización de la invención, el al menos un antígeno de dicho al menos dominio de unión a antígeno es un antígeno específico del tumor o un antígeno asociado al tumor.

En una realización de la invención, el al menos un antígeno de dicho al menos un dominio de unión a antígeno es un antígeno carcinoembrionario (CEA).

En una realización de la invención, dicho dominio de unión a antígeno comprende un dominio de unión a antígeno anti-CEA scFV, o una secuencia de aminoácidos con una identidad del mismo de 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %.

En una realización de la invención, dicho dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización de CD3 zeta.

En una realización de la invención, dicho al menos un dominio co-estimulador comprende un dominio de señalización funcional de OX40, CD70, CD27, CD28, CD5, ICAM-1, LFA-1 (CD11 a/CD18), ICOS (CD278), DAP10, DAP12 y 4-1BB (CD137), o una combinación de los mismos. En una realización de la invención, dicho CAR comprende la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 2, o una secuencia de aminoácidos con una identidad del mismo del 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %.

En una realización de la invención, el CAR es un anti-CEA-IL12-CAR que comprende la secuencia de SEQ ID NO:3 o la secuencia codificada por SEQ ID NO:4.

En una realización de la invención, el CAR es un IL7-anti-CEA-CAR que comprende la secuencia de SEQ ID NO:13 o la secuencia codificada por SEQ ID NO:12.

En una realización de la invención, el al menos un antígeno de dicho al menos un dominio de unión a antígeno es Mucin-1 (Muc1, CD227).

En una realización de la invención, dicho dominio de unión a antígeno comprende un dominio de unión a antígeno anti-Muc1 scFV, o una secuencia de aminoácidos con una identidad del mismo del 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %.

En una realización de la invención, el CAR es un anti-Muc1-IL12-CAR que comprende la secuencia de SEQ ID NO:6 o la secuencia codificada por SEQ ID NO:5.

En una realización de la invención, dicho CAR es para su uso en inmunoterapia, es decir, para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un sujeto.

En una realización de la invención, dicho CAR es para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto.

El cáncer incluye, Ínter alia, neoplasias malignas hematológicas tales como leucemia (por ejemplo, leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia linfocítica aguda (ALL) o leucemia mielógena crónica (CML), linfoma (por ejemplo, linfoma de células del manto, linfoma de no-Hodgkin o linfoma de Hodgkin) o mieloma múltiple, o cáncer sólido como carcinoma del tracto gastrointestinal, glándula mamaria, ovario, próstata, hígado, pulmón, riñón o una combinación de los mismos. En una realización de la invención, dicho CAR es para su uso en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, inflamación crónica y/o infección.

En un aspecto, la invención proporciona una o más molécula(s) de ácido nucleico aisladas en las que dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico codifica(n) para un CAR, que comprende desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal una parte extracelular, al menos un dominio de señalización intracelular, y al menos un dominio transmembrana, en el que la parte extracelular de dicho CAR comprende

a) al menos un dominio de unión a antígeno, y

b) al menos un dominio de activación del receptor de citoquinas,

en el que dicho al menos un dominio de activación del receptor de citoquinas se selecciona del grupo que consiste en IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, GM-CSF, variante p35-p40 de IL-12, IL 18 e IL-32.

La(s) molécula(s) de ácidos nucleicos puede(n) construirse de modo que codifiquen al menos todas las realizaciones de los CARs descritas en la presente memoria. Hay una molécula de ácido nucleico contigua cuando todos los dominios del CAR codificados por dicha molécula están dentro de un polipéptido. En una divulgación alternativa, puede haber dos o más moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, cuando algunos dominios del CAR codificado por dichas moléculas están en polipéptidos separados.

En una realización de la invención, la(s) molécula(s) de ácido nucleico que codifica(n) los CARs descritos pueden estar contenidas en un vector, tal como un vector viral. Los vectores pueden ser vectores de DNA, vectores de RNA, vectores de plásmidos, vectores de cósmidos, vectores de virus del herpes, vectores de virus del sarampión, vectores de lentivirus, vectores adenovirales, o vectores de retrovirus, o combinaciones de los mismos.

En ciertas realizaciones de la invención, los vectores comprenden además un promotor en los que el promotor es un promotor inducible, un promotor específico de tejido, un promotor constitutivo, un promotor suicida o cualquier combinación de los mismos.

En una realización adicional, los vectores que expresan CAR pueden modificarse adicionalmente para incluir elementos operativos para controlar la expresión de células del CAR, o para eliminar células del CAR a través de un interruptor suicida (por ejemplo, una cascada de señalización que induce apoptosis o un fármaco que induce muerte celular).

En otro aspecto, la invención proporciona una célula que comprende una o más moléculas de ácido nucleico aisladas en la que dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico codifica(n) para un CAR, que comprende desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal una parte extracelular, al menos un dominio de señalización intracelular y al menos un dominio transmembrana, en el que la parte extracelular de dicho CAR comprende

a) al menos un dominio de unión a antígeno, y

b) al menos un dominio de activación del receptor de citoquinas,

en el que dicho al menos un dominio de activación del receptor de citoquinas se selecciona del grupo que consiste en IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, GM-CSF, variante p35-p40 de IL-12, IL 18 e IL-32. Dicha célula puede ser una célula inmunitaria.

Preferiblemente, dicha célula es una célula NK o una célula T, en particular una célula T CD4+ o CD8+.

En otro aspecto, la invención proporciona una célula que expresa un CAR, que comprende desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal una parte extracelular, al menos un dominio de señalización intracelular y al menos un dominio transmembrana, en el que la parte extracelular de dicho CAR comprende

a) al menos un dominio de unión a antígeno, y

b) al menos un dominio de activación del receptor de citoquinas,

en el que dicho al menos un dominio de activación del receptor de citoquinas se selecciona del grupo que consiste en IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, GM-CSF, variante p35-p40 de IL-12, IL 18 e IL-32.

Dicha célula puede ser una célula inmunitaria.

Preferiblemente, dicha célula es una célula NK o una célula T, en particular una célula T CD4+ o CD8+.

En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una población de células (una composición celular) que expresa un CAR que comprende desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal una parte extracelular, al menos un dominio de señalización intracelular y al menos un dominio transmembrana, en el que la parte extracelular de dicho CAR comprende

a) al menos un dominio de unión a antígeno, y

b) al menos un dominio de activación del receptor de citoquinas,

en el que dicho al menos un dominio de activación del receptor de citoquinas se selecciona del grupo que consiste en IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, GM-CSF, variante p35-p40 de IL-12, IL 18 e IL-32.

Dicha población de células puede ser células efectoras inmunitarias.

Preferiblemente, dicha población de células es una población de células NK y células T, en particular, células T CD4+ o CD8+.

Dicha composición farmacéutica puede comprender una cantidad eficaz antitumoral de una población de dichas células.

Dicha composición farmacéutica también puede comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En un aspecto, la divulgación proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad en un sujeto, por ejemplo, cáncer, enfermedades autoinmunes, inflamación crónica o infección mediante la administración al sujeto de la(s) molécula(s) de ácido nucleico que codifica(n) el CAR o células que expresan el CAR de la invención.

La terapia celular adoptiva utiliza respuestas citotóxicas basadas en células inmunitarias, preferentemente basadas en células T, para atacar a las células enfermas, por ejemplo, células cancerosas. Las células inmunitarias, preferentemente las células T, con una reactividad natural o modificada genéticamente al cáncer de un paciente se modifican genéticamente in vitro con el CAR de la invención y se transfieren al paciente con cáncer. El CAR proporciona la especificidad del objetivo para el cáncer. El CAR de la invención puede modificarse genéticamente para comprender una parte extracelular que comprende un dominio de unión a antígeno y un dominio de activación del receptor de citoquinas, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, frecuentemente, por ejemplo, CD3 zeta, en el que dicho al menos un dominio de activación del receptor de citoquinas se selecciona del grupo que consiste en IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, GM-CSF, variante p35-p40 de IL- 12, IL 18 e IL-32. En otra divulgación, los módulos clave de señalización y reconocimiento de antígenos pueden estar en dos (o incluso más) polipéptidos. La división de los módulos de señalización y reconocimiento de antígenos permite un control reversible, titulable y dependiente de moléculas pequeñas sobre la expresión de células del CAR (Wu et al, 2015, Science 350: 293-303) debido a dominios heterodimerizantes dependientes de moléculas pequeñas en cada polipéptido del CAR. Las células inmunitarias modificadas genéticamente, preferentemente las células T de la invención, expresan un CAR de la invención que es capaz de reconocer y activar posteriormente un receptor de citoquinas en la misma célula o en otras células inmunitarias adyacentes o en las células objetivo debido a la integración de un dominio de activación del receptor de citoquinas en el CAR. El constructo del CAR de la invención tiene el efecto de unirse localmente y activar los receptores de citoquinas además de unirse al dominio de unión al antígeno del CAR al antígeno de la célula objetivo, en donde principalmente el antígeno es un antígeno asociado a un tumor. La activación del receptor de citoquinas por el dominio de activación del receptor de citoquinas da como resultado, por ejemplo, una liberación alterada de sustancias inmunomoduladoras desde la célula hacia el entorno restringido localmente. A modo de ejemplo, la unión a un receptor de IL-12 por parte de una célula del CAR que alberga un dominio de activación del receptor de IL-12 da como resultado un aumento de la liberación de IFN-y a dicho entorno restringido localmente. Después el ataque de las células del CAR se beneficia de la liberación creciente de IFN-y con una mejor eliminación de células cancerosas y eliminación de tumores. De manera simultánea se evitan los efectos secundarios graves debidos a la toxicidad mediada por IL-12, ya que no se libera IL-12 soluble en el medio ambiente. A modo de ejemplo, el concepto de la invención se muestra con un CEA-CAR, es decir, un CAR que tiene un dominio de unión a antígeno frente el antígeno carcinoembrionario (CEA, CD66e) y una secuencia de IL-12 como dominio de activación de citoquinas (véase la Figura 1B) o una secuencia de IL7 como dominio de activación de citoquinas (véase la Figura 15), por lo que las posiciones de ambos dominios de citoquinas son diferentes con respecto a su localización extracelular en el CAR. Otro CAR con una especificidad diferente para la célula objetivo (anti-Mucl en lugar de anti-CEA) se utilizó a modo de ejemplo para demostrar la independencia del concepto de la invención del antígeno de la célula objetivo que es reconocida por el CAR. Por lo tanto, no se pretende limitar los CAR utilizados específicamente en la presente memoria que albergan dichos dominios de unión a antígenos específicos y dichos dominios de activación de receptores de citoquinas específicos, ya que el concepto puede transferirse a otros CARs que albergan otros dominios de unión a antígenos y otros dominios de activación o bloqueo de receptores de citoquinas.

El CAR con el dominio de unión al antígeno CEA y el dominio de activación del receptor de IL-12 (en adelante, "CEA-CAR con el módulo IL-12" o "anti-CEA-IL12-CAR") redirige las células T de una manera específica, según lo indicado por la muerte específica (Figura 6) y la liberación de IFN-gamma (Figura 5) tras la incubación con células cancerosas CEA+ pero no con células cancerosas CEA-.

Algunas células cancerosas suprimen la activación de las células T por varios medios con el resultado de que la respuesta antitumoral de las células T no tiene éxito. Este también es el caso de las células T redirigidas por TCR o CAR. Usando un CEA-CAR con un módulo IL-12 para la orientación, las células T modificadas genéticamente se activan con éxito y median una respuesta productiva de células anticancerosas que no se obtiene con las células T con el módulo CAR específico de CEA sin IL-12. Las células SKOV-3 son células de adenocarcinoma de ovario que se utilizan con frecuencia como un modelo para la inhibición inducida por el cáncer de las vías de señalización dependientes de IL-2 en las células T. Las células SKOV-3 suprimen la inducción de las cadenas p y y del receptor de IL-1, la señalización a través de la vía JAK-STAT5, reducen el IFN-^y y aumentan los niveles de IL-10 e inhiben el ciclo celular mediante la detención de G0/G1. En consecuencia, en un ensayo a largo plazo, la eliminación por las células T CAR es pobre en comparación con la eliminación de otras líneas de células cancerosas por las mismas células T CAR. Sin embargo, la eliminación específica de las células SKOV-3 mejora sustancialmente tras agregar el módulo IL-12 en el CAR en comparación con la eliminación por las células T CAR que carecen del módulo IL-12 (Figura 6).

Varios modelos de ratón indican que el reconocimiento del antígeno objetivo de CEA y la activación de células T específicas está mediado por el CAR específico de CEA in vivo. Por lo tanto, se espera que se produzca la misma unión y activación a través del CEA-CAR con el módulo IL-12. Además, es probable que cualquier otro dominio de activación o bloqueo del receptor de citoquinas actúe de forma predictiva in vivo.

En una realización de la invención, se genera un constructo de DNA (vector, plásmido) que codifica un CAR como se describe en la presente memoria, por ejemplo, para un CEA-CAR con módulo IL-12. La construcción de dichos vectores de expresión se puede realizar mediante métodos recombinantes bien conocidos en la técnica. Alternativamente, las secuencias de ácido nucleico se pueden producir sintéticamente.

Los constructos de DNA y RNA (molécula(s) de ácido nucleico) que codifican el CAR de la invención pueden transfectarse o transducirse en una célula huésped mediante métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, sistemas basados en virus, métodos físicos, métodos biológicos, métodos químicos). Independientemente de los métodos usados para integrar, preferiblemente integrar establemente, el DNA que codifica el CAR de la invención, en la célula huésped, como resultado, la célula huésped expresa un CAR que alberga un dominio de activación del receptor de citoquinas en su parte extracelular.

En una realización de la invención, el CAR que alberga un dominio de activación del receptor de citoquinas en su parte extracelular se expresa en células inmunitarias o subconjuntos de células inmunitarias.

En una realización de la invención, el CAR que alberga un dominio de activación del receptor de citoquinas en su parte extracelular se expresa en células T o subconjuntos de células T.

En una realización de la invención, el CAR que alberga un dominio de activación del receptor de citoquinas en su parte extracelular se expresa en células NK o subconjuntos de células NK.

En una realización de la divulgación, una célula modificada por ingeniería genética que expresa un CAR que alberga un dominio de activación o bloqueo del receptor de citoquinas en su parte extracelular se aísla (enriquece o separa) después del proceso de transfección/transducción para generar dicha célula de CAR modificada por ingeniería genética a partir de células no transfectadas/transducidas mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo tecnologías de separación basadas en fluorescencia tal como FACS® o métodos de separación de células magnéticas tales como MACS®.

Generalmente, las células inmunitarias, preferentemente las células T para generar células modificadas por ingeniería genética que expresan el CAR de la invención, pueden obtenerse de un sujeto. Las células inmunes, preferentemente las células T, se pueden obtener de una variedad de fuentes tales como células mononucleares de sangre periférica (PMBCs), médula ósea, tejido de nódulo linfático, sangre de cordón umbilical o tejido del timo. Para el enriquecimiento de estas células se pueden utilizar métodos bien conocidos en la técnica como la centrifugación a través de un gradiente Ficoll™ o PERCOLL™ o técnicas de selección positiva/negativa, tales como la clasificación fluorescente (por ejemplo, FCASsort) o la clasificación magnética (por ejemplo, MACS®).

A modo de ejemplo, las células T de una muestra de sangre de un sujeto se marcan magnéticamente, por ejemplo, con una perla magnética acoplada a anticuerpos específicos para CD4 y CD8, respectivamente, se lavan, se enriquecen magnéticamente y se recogen. Después, estas células T pueden modificarse por ingeniería genética para expresar el CAR que alberga un dominio de activación o bloqueo del receptor de citoquinas en su parte extracelular en su superficie celular.

En una realización de la divulgación, las células T modificadas por ingeniería genética aisladas/enriquecidas que expresan el CAR que alberga un dominio de activación o bloqueo del receptor de citoquinas en su parte extracelular antes o después de la modificación genética pueden activarse y expandirse para aumentar el número de células T modificadas por ingeniería genética usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, la estimulación policlonal con perlas anti-CD3/anti-CD28 o reactivos de células T TransAct (Miltenyi Biotec; EP2711418A1). Preferentemente, dicho número de células T modificadas por ingeniería genética aumenta hasta una cantidad terapéuticamente eficaz.

En una realización de la invención, una célula que expresa el CAR de la invención se modifica por ingeniería genética mediante un RNA que codifica el CAR de la invención. El RNA se puede transfectar o transducir en una célula huésped mediante métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, sistemas basados en virus, métodos físicos, métodos biológicos, métodos químicos). En general, dicha "célula modificada por ingeniería genética" se describe en detalle en la Patente Internacional WO2013/040557. Independientemente de los métodos utilizados para transferir el RNA que codifica el CAR de la invención en la célula huésped, como resultado, la célula huésped expresa un CAR que alberga un dominio de activación del receptor de citoquinas en su parte extracelular. Las "células modificadas por ingeniería genética con RNA" expresan el CAR durante un tiempo limitado (expresión transitoria).

En una realización de la divulgación, las células genéticamente modificadas que expresan el CAR que alberga un dominio de activación o bloqueo del receptor de citoquinas en su parte extracelular, preferentemente células T, se generan en un proceso automatizado en un sistema cerrado. Un proceso para la generación de células modificadas genéticamente, preferentemente células T, comprende, por ejemplo, las etapas:

a) proporcionar una muestra de células

b) preparar la muestra celular por centrifugación

c) realizar la separación magnética de las células, preferentemente células T,

d) activar las células enriquecidas, preferentemente células T, utilizando agentes moduladores

e) modificar genéticamente las células, preferentemente las células T, para expresar el CAR de la invención

f) expandir las células modificadas genéticamente, preferentemente células T, en una cámara de cultivo

g) lavar las células cultivadas, preferentemente células T.

Todas estas etapas se pueden realizar en un sistema cerrado, preferentemente en un sistema cerrado y estéril.

El proceso es especialmente adecuado para preparar células modificadas genéticamente, preferentemente células T, en las que las células enriquecidas, preferentemente células T, se modifican genéticamente mediante el uso de vectores virales y/o no virales. Cualquiera de estas etapas puede multiplicarse, omitirse o puede producirse en un orden diferente.

Los agentes moduladores pueden seleccionarse entre anticuerpos agonistas y/o citoquinas.

Las células genéticamente modificadas, preferentemente células T, pueden enriquecerse mediante marcaje magnético de células y separación magnética antes o después del cultivo para obtener una mayor frecuencia de células genéticamente modificadas, preferentemente células T, en el producto celular final.

Como sistema cerrado y estéril para la modificación celular, se puede utilizar el dispositivo de procesamiento celular totalmente automatizado CliniMACS Prodigy® y conjuntos de tubos asociados (Miltenyi Biotec GmbH, Alemania) (Patente Internacional WO2009/072003). Este sistema cerrado cumple con los requisitos de procesamiento de grado GMP de casi cualquier tipo de productos celulares y puede permitir reducir los requisitos de sala limpia, mejorar la transferencia de tecnología y armonizar los procesos de fabricación de células.

En una realización de la invención, el CAR que alberga un dominio de activación del receptor de citoquinas en su parte extracelular se usa para el tratamiento en un sujeto que tiene una enfermedad, trastorno o afección asociada con un antígeno que puede unirse específicamente al dominio de unión al antígeno del CAR de la invención.

En una realización de la invención, el CAR de la invención se usa en el tratamiento del cáncer en un sujeto que padece cáncer. Células inmunitarias, por ejemplo, las células T de un sujeto se aíslan o se utilizan líneas de células inmunitarias establecidas. El sujeto puede padecer dicho cáncer o puede ser un sujeto sano. Estas células se modifican genéticamente in vitro para expresar el CAR de la invención. Estas células modificadas genéticamente pueden activarse y expandirse in vitro. En la terapia celular, estas células modificadas genéticamente se infunden a un receptor que las necesita. Estas células pueden ser una composición farmacéutica. Las células infundidas en el receptor pueden ser capaces de eliminar (o al menos detener el crecimiento de) células cancerosas que expresan el antígeno que es reconocido por el dominio de unión al antígeno del CAR de la invención. El receptor puede ser el mismo sujeto del que se obtuvieron las células (terapia celular autóloga) o puede ser de otro sujeto de la misma especie (terapia celular alogénica).

En una realización de la invención, el sujeto que padece cáncer puede tratarse con la composición farmacéutica de la invención junto con un agente inmunomodulador, tal como, pero no limitado a, rapamicina o fármacos dirigidos a puntos de control de activación celular.

En una realización de la invención, el sujeto puede tratarse adicionalmente (simultáneamente o con posterioridad) con quimioterapia clásica. Los agentes quimioterapéuticos clásicos adecuados para tratar cánceres son bien conocidos en la técnica.

Las células inmunitarias, preferentemente células T modificadas genéticamente para expresar un CAR que alberga un dominio de activación del receptor de citoquinas en su parte extracelular, pueden administrarse solas o como una composición farmacéutica en combinación con diluyentes y/o con otros componentes o poblaciones celulares. Brevemente, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender una población celular de células modificadas genéticamente como se describe en la presente memoria, en combinación con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables. Dichas composiciones pueden comprender tampones tales como solución salina tamponada neutra, solución salina tamponada con fosfato y similares; carbohidratos tales como glucosa, manosa, sacarosa o dextranos, manitol; proteínas; polipéptidos o aminoácidos tales como glicina; antioxidantes; agentes quelantes como EDTA o glutatión; adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio); y conservantes.

Preferiblemente, las composiciones de la presente invención se formulan para administración intravenosa. La administración de composiciones celulares (población de células) al sujeto puede realizarse de cualquier manera conveniente conocida en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse de manera apropiada para la enfermedad a tratar. Las dosis apropiadas pueden determinarse mediante ensayos clínicos. Pero la cantidad y frecuencia de administración también estarán determinadas e influenciadas por factores tales como la condición del paciente y el tipo y gravedad de la enfermedad del paciente.

Una composición farmacéutica que comprende las células inmunitarias, preferentemente las células T descritas en la presente memoria, puede administrarse en una dosis de 104 a 109 células/kg de peso corporal, preferiblemente 105 a 106 células/kg de peso corporal. Las composiciones celulares también se pueden administrar varias veces a estas dosis. Las composiciones de células pueden inyectarse directamente en un tumor, ganglio linfático o sitio de infección.

Las células pueden activarse y expandirse a cantidades terapéuticas eficaces utilizando métodos conocidos en la técnica.

Las células de la divulgación se pueden usar en combinación con, por ejemplo, quimioterapia, radiación, agentes inmunomoduladores, anticuerpos o terapias con anticuerpos.

Definiciones

A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención.

En general, un CAR puede comprender un dominio extracelular (parte extracelular) que comprende el dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular. El dominio extracelular puede unirse al dominio transmembrana mediante un enlazador. El dominio extracelular también puede comprender un péptido señal. La parte extracelular del CAR de la presente divulgación también comprende un dominio de activación o bloqueo del receptor de citoquinas como se describe en la presente memoria. Un "péptido señal" se refiere a una secuencia peptídica que dirige el transporte y la localización de la proteína dentro de una célula, por ejemplo, a un determinado orgánulo celular (tal como el retículo endoplásmico) y/o la superficie celular.

Un "dominio de unión a antígeno" se refiere a la región de CAR que se une específicamente a un antígeno (y, por lo tanto, puede dirigirse a una célula que contiene el antígeno). Los CARs de la invención pueden comprender uno o más dominios de unión a antígeno. En general, las regiones objetivos en el CAR son extracelulares. El dominio de unión a antígeno puede comprender un anticuerpo o un fragmento del mismo. El dominio de unión a antígeno puede comprender, por ejemplo, cadena pesada de longitud completa, fragmentos Fab, fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv), anticuerpos divalentes de cadena sencilla o diacuerpos. Cualquier molécula que se una específicamente a un antígeno dado tal como aficuerpos o dominios de unión a ligandos de receptores que se producen de manera natural puede usarse como un dominio de unión a antígeno. A menudo, el dominio de unión al antígeno es un scFv. Normalmente, en un scFv, las regiones variables de una cadena pesada y una cadena ligera de inmunoglobulina se fusionan mediante un enlazador flexible para formar un scFv. Dicho enlazador puede ser, por ejemplo, el "(G4/S1)3-enlazador".

En algunos casos, es beneficioso que el dominio de unión al antígeno se derive de la misma especie en la que se usará el CAR. Por ejemplo, cuando se planea utilizarlo con fines terapéuticos en humanos, puede ser beneficioso para el dominio de unión al antígeno del CAR comprender un anticuerpo humano o humanizado o un fragmento del mismo. Los anticuerpos humanos o humanizados o fragmentos de los mismos pueden prepararse mediante una variedad de métodos bien conocidos en la técnica.

"Espaciador" o "bisagra" como se usa en la presente memoria se refiere a la región hidrófila que está entre el dominio de unión al antígeno y el dominio transmembrana. Los CARs de la invención pueden comprender un dominio espaciador extracelular pero también es posible pasar dicho espaciador. El espaciador puede incluir fragmentos Fc de anticuerpos o fragmentos de los mismos, regiones bisagra de anticuerpos o fragmentos de los mismos, regiones CH2 o CH3 de anticuerpos, proteínas accesorias, secuencias espaciadoras artificiales o combinaciones de las mismas. Un ejemplo destacado de un espaciador es la bisagra CD8alfa.

El dominio transmembrana del CAR se puede derivar de cualquier fuente natural o sintética deseada para dicho dominio. Cuando la fuente es natural, el dominio puede derivar de cualquier proteína unida a la membrana o transmembrana. El dominio transmembrana puede derivar, por ejemplo, de CD8alfa o CD28. Cuando los módulos clave de señalización y reconocimiento de antígenos están en dos (o incluso más) polipéptidos como se describe anteriormente, entonces el CAR puede tener dos (o más) dominios transmembrana. Los módulos clave de reconocimiento de antígenos y señalización de división permiten un control reversible, titulable y dependiente de moléculas pequeñas sobre la expresión de células del CAR (Wu et al, 2015, Science 350: 293-303) debido a dominios heterodimerizantes dependientes de moléculas pequeñas en cada polipéptido del CAR.

El dominio citoplasmático o el dominio de señalización intracelular del CAR es responsable de la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmunitaria en la que se expresa el CAR. "Función efectora" significa una función especializada de una célula, por ejemplo, en una célula T, una función efectora puede ser actividad citolítica o actividad auxiliar, incluyendo la secreción de citoquinas. El dominio de señalización intracelular se refiere a la parte de una proteína que transduce la señal de la función efectora y dirige a la célula que expresa el CAR para realizar una función especializada. El dominio de señalización intracelular puede incluir cualquier parte completa, mutada o truncada del dominio de señalización intracelular de una proteína dada suficiente para transducir una señal que inicia o bloquea las funciones efectoras de las células inmunitarias.

Los ejemplos destacados de dominios de señalización intracelular para su uso en los CARs incluyen las secuencias de señalización citoplásmica del receptor de células T (TCR) y los correceptores que inician la transducción de señales después de la participación del receptor de antígeno.

En general, la activación de las células T puede estar mediada por dos clases distintas de secuencias de señalización citoplasmática, en primer lugar, aquellas que inician la activación primaria dependiente de antígeno a través de TCR (secuencias de señalización citoplasmática primaria) y, en segundo lugar, aquellas que actúan de manera independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora (secuencias de señalización citoplasmáticas secundarias, dominio de señalización coestimuladora). Por lo tanto, un dominio de señalización intracelular de un CAR puede comprender un dominio de señalización citoplasmático primario y/o un dominio de señalización citoplasmático secundario.

Las secuencias de señalización citoplasmáticas primarias que actúan de forma estimuladora pueden contener ITAMs (motivos de señalización de motivos de activación basados en tirosina de inmunorreceptores).

Los ejemplos de ITAM que contienen secuencias de señalización citoplasmáticas primarias que se usan a menudo en CARs son los derivados de TCR zeta (CD3 zeta), FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. La más destacada es la secuencia derivada de CD3 zeta.

El dominio citoplasmático del CAR puede diseñarse para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta por sí mismo o combinado con cualquier otro dominio(s) citoplasmático(s) deseado. El dominio citoplasmático del CAR puede comprender una parte de la cadena de CD3 zeta y una región de señalización co-estimuladora. La región de señalización co-estimuladora se refiere a una parte del CAR que comprende el dominio intracelular de una molécula co-estimuladora. Una molécula co-estimuladora es una molécula de superficie celular distinta de un receptor de antígeno o sus ligandos que se requiere para una respuesta eficaz de los linfocitos a un antígeno. Ejemplos de moléculas co-estimuladoras son CD27, C^d 28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3.

Las secuencias de señalización citoplasmática dentro de la parte de señalización citoplasmática del CAR pueden estar unidas entre sí con o sin un enlazador en un orden aleatorio o específico. Un enlazador oligo o polipeptídico corto, que preferiblemente tiene entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, puede formar el enlace. Un enlazador destacado es el doblete de glicina-serina.

Como ejemplo, el dominio citoplasmático puede comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD28. En otro ejemplo, el dominio citoplasmático puede comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD27. En otro ejemplo, el dominio citoplasmático puede comprender el dominio de señalización de CD3-zeta, el dominio de señalización de CD28 y el dominio de señalización de CD27.

Como se mencionó anteriormente, la parte extracelular o el dominio transmembrana o el dominio citoplásmico de un CAR también pueden comprender un dominio de heterodimerización con el fin de dividir los módulos clave de señalización y reconocimiento de antígenos del CAR.

El CAR de la divulgación (el CAR que comprende un dominio de activación o bloqueo del receptor de citoquinas) puede diseñarse para comprender cualquier porción o parte de los dominios mencionados anteriormente como se describe en la presente memoria en cualquier combinación que dé como resultado un CAR funcional. A modo de ejemplo, el CAR de la invención puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No:3.

El CAR de la divulgación puede ser un CAR con al menos doble especificidad, que comprende una parte extracelular, al menos un dominio de señalización intracelular y al menos un dominio transmembrana, en donde la parte extracelular de dicho CAR comprende a) al menos un dominio de unión a antígeno, y b) al menos un dominio de activación o bloqueo del receptor de citoquinas, en el que dicho al menos un dominio de unión a antígeno es específico para un antígeno de una célula objetivo (primera especificidad), y en el que dicho al menos un dominio de activación o bloqueo del receptor de citoquinas es específico para un receptor de citoquinas (segunda especificidad) que no es dicho antígeno.

El CAR de la divulgación que alberga al menos un dominio de activación o bloqueo del receptor de citoquinas, por ejemplo, al menos una citoquina de interés, ya que un módulo en la parte extracelular del CAR es un CAR trans­ activante. El CAR trans-activante, cuando se expresa en la superficie de los glóbulos blancos, por ejemplo, las células T dirigen la transactividad de esas células frente las células objetivo que expresan el antígeno que es reconocido por dicho al menos un dominio de unión a antígeno del CAR trans-activante. Trans-actividad significa las características del CAR de la divulgación, que el CAR de la divulgación comprende al menos un dominio, es decir, el dominio de activación o bloqueo del receptor de citoquinas, que, cuando se expresa en la superficie de los glóbulos blancos, desencadena una actividad en la célula objetivo, en el glóbulo blanco que expresa dicho CAR o en otra célula, en donde dicha actividad desencadenada es independiente de la unión del antígeno de la célula objetivo por el receptor de unión al antígeno de dicho CAR. Dicha actividad desencadenada puede ser la activación de un receptor de citoquinas que da como resultado, por ejemplo, la liberación de la citoquina dada (cuando dicho dominio es un dominio de activación del receptor de citoquinas) o puede ser el bloqueo de un receptor de citoquinas que da como resultado, por ejemplo, una disminución o inhibición de la liberación de una citoquina dada (cuando dicho dominio es un dominio de bloqueo de receptores de citoquinas). Los efectos de la trans-actividad pueden verse influenciados adicionalmente cuando se usan dos o más dominios de activación o bloqueo del receptor de citoquinas en el CAR de la divulgación. Un CAR con, por ejemplo, dos dominios de activación o bloqueo de receptores de citoquinas idénticos puede mejorar los efectos de la trans-actividad. Un CAR con, por ejemplo, dos dominios de activación o bloqueo de receptores de citoquinas diferentes puede diversificar los efectos de la trans-actividad, ya que cada dominio de activación o bloqueo de receptores de citoquinas de dicho CAR puede desencadenar actividades diferentes en la célula objetivo, en el glóbulo blanco que expresa dicho CAR o en otra célula.

Las citoquinas son una categoría amplia y libre de proteínas pequeñas (-5-20 kDa) que son importantes en la señalización celular. Son liberadas por las células y afectan el comportamiento de otras células. Las citoquinas incluyen quimiocinas, interferones, interleucinas, linfocinas y factor de necrosis tumoral. Las citoquinas son producidas por una amplia gama de células, incluyendo células inmunitarias como macrófagos, linfocitos B, linfocitos T y mastocitos, así como células endoteliales, fibroblastos y varias células del estroma; una citoquina dada puede ser producida por más de un tipo de célula.

Actúan a través de receptores, y son especialmente importantes en el sistema inmunitario; las citoquinas modulan el equilibrio entre las respuestas inmunitarias humorales y basadas en células, y regulan la maduración, el crecimiento y la capacidad de respuesta de poblaciones celulares particulares. Algunas citoquinas potencian o inhiben la acción de otras citoquinas de formas complejas. Son importantes en la salud y la enfermedad, específicamente en las respuestas del huésped a la infección, la respuesta inmunitaria, la inflamación, el trauma, la sepsis, el cáncer y la reproducción.

Cada citoquina tiene un receptor de superficie celular correspondiente. Las cascadas posteriores de señalización intracelular alteran las funciones celulares. Esto puede incluir la regulación anterior y/o la regulación posterior de varios genes y sus factores de transcripción, lo que da como resultado la producción de otras citoquinas, un aumento en la cantidad de receptores de superficie para otras moléculas o la supresión de su propio efecto por inhibición por retroalimentación.

El efecto de una citoquina particular en una célula dada depende de la citoquina, su concentración, la presencia del receptor complementario en la superficie celular y las señales posteriores activadas por la unión del receptor; estos dos últimos factores pueden variar según el tipo de célula.

La interleucina 12 (IL-12) es una citoquina producida de forma natural por las células dendríticas, los macrófagos, los neutrófilos y las células linfoblastoides B humanas (NC-37) en respuesta a la estimulación antigénica.

Es una citoquina heterodimérica codificada por dos genes separados, IL-12A (p35) e IL-12B (p40). El heterodímero activo (denominado como 'p70') y un homodímero de p40 se forman después de la síntesis de proteínas. IL-12 está implicada en la diferenciación de células T nativas en células Th1. Es conocido como un factor estimulante de células T, que puede estimular el crecimiento y la función de las células T. Estimula la producción de interferón gamma (IFN-Y) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) a partir de células T y células asesinas naturales (NK), y reduce la supresión de IFN-y mediada por IL-4. Las células T que producen IL-12 tienen un co-receptor, CD30, que está asociado con la actividad de IL-12. IL-12 juega un papel importante en las actividades de las células asesinas naturales y los linfocitos T. IL-12 media la mejora de la actividad citotóxica de las células NK y los linfocitos T citotóxicos CD8+.

La IL-12 se une al receptor de IL-12, que es un receptor heterodimérico formado por IL-12R-p1 e IL-12R-p2. Se considera que IL-12R-p2 juega un papel clave en la función de IL-12, ya que se encuentra en las células T activadas.

El término "dominio de activación o bloqueo del receptor de citoquinas" como se usa en la presente memoria se refiere a una secuencia de aminoácidos que es parte del CAR como se describe en la presente memoria que es capaz de unirse y activar o bloquear un receptor de citoquinas. El dominio de activación del receptor de citoquinas puede ser un agonista de citoquinas. La activación de un receptor de citoquina particular mediante un dominio de activación del receptor de citoquina coincidente de un CAR conduce a la activación de las señales posteriores dadas inherentes a dicho receptor de citoquina.

Pero la secuencia de aminoácidos de un dominio de activación del receptor de citoquinas también puede ser una variante de una citoquina que tiene algunos aminoácidos suprimidos, añadidos, reemplazados o dispuestos en un orden diferente al de la citoquina natural, pero conservando la función de la citoquina natural de longitud completa. La secuencia de aminoácidos de un dominio de activación del receptor de citoquinas también puede ser un fragmento funcional de una citoquina de longitud completa. En este contexto, "funcional" significa que el fragmento es capaz de unirse y activar el receptor de citoquinas de una manera suficiente para conducir a la activación de las señales posteriores dadas inherentes a dicho receptor de citoquinas. Preferiblemente, el dominio de activación del receptor de citoquinas puede ser una secuencia de aminoácidos de una citoquina o fragmento de la misma que puede unirse y activar un receptor de citoquinas.

El dominio de bloqueo del receptor de citoquinas puede ser un antagonista de citoquinas. El bloqueo o inhibición de un receptor de citoquina particular por un dominio de bloqueo del receptor de citoquina coincidente de un CAR conduce al bloqueo y/o inhibición de las señales posteriores dadas inherentes a dicho receptor de citoquina. La secuencia de aminoácidos de un dominio de bloqueo del receptor de citoquinas puede ser una variante de una citoquina que tiene algunos aminoácidos eliminados, añadidos, reemplazados o dispuestos en un orden diferente al de la citoquina natural, perdiendo así la función de dicha citoquina natural para activar el receptor de citoquina correspondiente, pero conservando la función de dicha citoquina natural para unirse al receptor de citoquina correspondiente. La secuencia de aminoácidos de un dominio de bloqueo del receptor de citoquinas también puede ser un fragmento no funcional de una citoquina de longitud completa o un fragmento de una citoquina de longitud completa que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70 %, o al menos el 75 %, 80 %, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% a nivel de secuencia de aminoácidos para dicha citoquina. En este contexto, "no funcional" significa que el fragmento es capaz de unirse, pero no activar al receptor de citoquinas de manera suficiente para conducir a la activación de las señales posteriores dadas inherentes a dicho receptor de citoquinas.

El término "antígeno" se refiere a una entidad molecular que puede ser soluble o estar unida a la membrana celular en particular, pero no restringido a, entidades moleculares que pueden reconocerse por medio del sistema inmunitario adaptativo, incluyendo, pero no restringido a, anticuerpos o TCRs, o moléculas modificadas genéticamente que incluyen pero no están restringidas a TCRs transgénicos, CARs, scFvs o multímeros de los mismos, fragmentos Fab o multímeros de los mismos, anticuerpos o multímeros de los mismos, anticuerpos de cadena sencilla o multímeros de los mismos, o cualquier otra molécula que pueda ejecutar la unión a una estructura con alta afinidad. Los antígenos tumorales se pueden clasificar en dos categorías basadas según su patrón de expresión: antígenos específicos de tumores (TSA), que están presentes solo en las células tumorales y no en ninguna otra célula, y antígenos asociados a tumores (TAA), que están presentes en algunas células tumorales y también algunas células normales.

El término "células objetivo", como se usa en la presente memoria, se refiere a células que expresan el antígeno en su superficie celular que debería ser reconocido (unido) por un dominio de unión al antígeno de CAR.

El antígeno carcinoembrionario (CEA; CD66e) describe un conjunto de glicoproteínas altamente relacionadas implicadas en la adhesión celular. El CEA se produce en el tejido gastrointestinal durante el desarrollo fetal y está presente en el sitio luminal del epitelio gastrointestinal y pulmonar de los adultos. El CEA soluble se encuentra en el suero de individuos sanos y aumenta durante la inflamación y enfermedades malignas, en particular en pacientes con adenocarcinoma del tracto gastrointestinal, mama, ovario y otros.

Los CARs (polipéptido(s)), la(s) molécula(s) de ácido nucleico que codifican los CARs, los vectores de expresión recombinantes, las células que expresan los CARs y las poblaciones de células que expresan los CARs, pueden aislarse y/o purificarse. Por ejemplo, una preparación celular purificada (o aislada) es aquella en la que la población celular es más pura que la población celular en su entorno natural dentro del cuerpo. Dichas células se pueden producir, por ejemplo, mediante técnicas de purificación estándar, por ejemplo, métodos de separación magnética celular tales como MACS® (Miltenyi Biotec GmbH, Alemania) o métodos de separación por citometría de flujo tales como FACS® (Beckton Dickinson).

En algunas realizaciones, una preparación de una célula se purifica de manera que la célula represente al menos aproximadamente el 50 %, por ejemplo, al menos aproximadamente el 70 %, del contenido celular total de la preparación. Por ejemplo, la pureza puede ser de al menos aproximadamente el 50 %, puede ser mayor que aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 % o aproximadamente el 80 %, o puede ser aproximadamente el 100 %.

El término "tumor" se conoce médicamente como una neoplasia. No todos los tumores son cancerosos; los tumores benignos no invaden los tejidos vecinos y no se extienden por todo el cuerpo.

El término "cáncer" se conoce médicamente como una neoplasia maligna. El cáncer es un amplio grupo de enfermedades que implican un crecimiento celular no regulado e incluye todo tipo de leucemia. En el cáncer, las células (células cancerosas) se dividen y crecen sin control, formando tumores malignos e invadiendo partes cercanas del cuerpo. El cáncer también puede extenderse a partes más distantes del cuerpo a través del sistema linfático o del torrente sanguíneo. Hay más de 200 cánceres diferentes conocidos que afectan a los humanos.

Los términos "quimioterapia" o "tratamiento quimioterapéutico" se refieren al tratamiento del cáncer (células cancerosas) con uno o más fármacos antineoplásicos citotóxicos ("agentes quimioterapéuticas" o "fármacos quimioterapéuticos") como parte de un régimen estandarizado. La quimioterapia se puede administrar con una intención curativa o puede tener como objetivo prolongar la vida o paliar los síntomas. A menudo se usa junto con otros tratamientos contra el cáncer, tales como radioterapia, cirugía y/o terapia de hipertermia. Los agentes quimioterapéuticos tradicionales actúan eliminando las células que se dividen rápidamente, una de las principales propiedades de la mayoría de las células cancerosas. Esto significa que la quimioterapia también daña las células que se dividen rápidamente en circunstancias normales: las células de la médula ósea, el tracto digestivo y los folículos pilosos. Esto da como resultado los efectos secundarios más comunes de la quimioterapia: mielosupresión (disminución de la producción de células sanguíneas, por lo tanto, también inmunosupresión), mucositis (inflamación del revestimiento del tracto digestivo) y alopecia (pérdida de cabello).

Algunos fármacos anticancerosos más nuevos (por ejemplo, varios anticuerpos monoclonales o células modificadas genéticamente como las de la presente invención) no son indiscriminadamente citotóxicos, sino que se dirigen a proteínas que se expresan de forma anormal en las células cancerosas y que son esenciales para su crecimiento. Dichos tratamientos a menudo se denominan "terapia dirigida" (a diferencia de la quimioterapia clásica) y, a menudo, se usan junto con agentes quimioterapéuticos tradicionales en regímenes de tratamiento antineoplásico. La inmunoterapia es un término médico definido como el "tratamiento de una enfermedad mediante la inducción, mejora o supresión de una respuesta inmunitaria". Las inmunoterapias diseñadas para provocar o amplificar una respuesta inmunitaria se clasifican como inmunoterapias de activación, mientras que las inmunoterapias que reducen o suprimen se clasifican como inmunoterapias de supresión. La inmunoterapia contra el cáncer como inmunoterapia de activación intenta estimular el sistema inmunitario para que rechace y destruya los tumores. La transferencia celular adoptiva utiliza respuestas citotóxicas basadas en células, preferentemente basadas en células T, para atacar las células cancerosas (terapia celular). Se generan in vitro células T que tienen una reactividad natural o modificada genéticamente al cáncer de un paciente y después se transfiere de nuevo al paciente con cáncer.

El término "tratamiento", como se usa en la presente memoria, significa reducir la frecuencia o la gravedad de al menos una señal o síntoma de una enfermedad.

El término "biomarcador" o "marcador" está muy extendido en la técnica y puede indicar ampliamente una molécula biológica y/o una porción detectable de la misma (por ejemplo, un ácido nucleico, un péptido o un lípido tal como un glicolípido) cuya evaluación cualitativa y/o cuantitativa en un sujeto es predictiva o informativa (por ejemplo, predictiva, diagnóstica y/o pronóstica) con respecto a uno o más aspectos del fenotipo y/o genotipo del individuo, tal como, por ejemplo, con respecto al estado del individuo.

Como se usa en la presente memoria, el término "sujeto" se refiere a un animal. Preferentemente, el sujeto es un mamífero tal como ratón, rata, vaca, cerdo, cabra, gallina, perro, mono o ser humano. Más preferentemente, el sujeto es un ser humano. El sujeto puede ser un sujeto que padezca una enfermedad tal como cáncer (un paciente), pero el sujeto también puede ser un sujeto sano.

El término "autólogo", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier material derivado del mismo sujeto al que se vuelve a introducir posteriormente.

El término "alogénico", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier material derivado de un sujeto diferente de la misma especie que el sujeto al que se le vuelve a introducir el material.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico en un sujeto.

Los términos "se une específicamente" o "específico para" con respecto a un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo, de un fragmento del mismo o de un CAR se refieren a un dominio de unión a antígeno que reconoce y se une a un antígeno específico, pero no reconoce o se une sustancialmente a otras moléculas en una muestra. Un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno de una especie también puede unirse a ese antígeno de otra especie. Esta reactividad entre especies no es contraria a la definición de ese dominio de unión a antígeno como específico. Un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno también puede unirse a diferentes formas alélicas del antígeno (variantes alélicas, variantes de empalme, isoformas, etc.). Esta reactividad cruzada no es contraria a la definición de ese dominio de unión a antígeno como específico.

Los términos "célula modificada por ingeniería genética" y "célula modificada genéticamente" como se usan en la presente memoria, pueden usarse indistintamente. Los términos significan que contienen y/o expresan un gen extraño o una secuencia de ácido nucleico que a su vez modifica el genotipo o fenotipo de la célula o su progenie. Especialmente, los términos se refieren al hecho de que las células, preferentemente las células T, pueden manipularse mediante métodos recombinantes bien conocidos en la técnica para expresar de forma estable o transitoria péptidos o proteínas que no se expresan en estas células en el estado natural. Por ejemplo, las células T se modifican por ingeniería genética para expresar un constructo artificial, tal como un receptor de antígeno quimérico en su superficie celular. Por ejemplo, las secuencias de CAR pueden administrarse en células utilizando un vector retroviral o lentiviral.

El término "célula inmunitaria" o "célula efectora inmunitaria" se refiere a una célula que puede ser parte del sistema inmunitario y ejecuta una función efectora particular, tal como las células T alfa-beta, las células NK, las células NKT, las células B, las células linfoides innatas (ILC), células asesinas inducidas por citoquinas (CIK), células asesinas activadas por linfocinas (LAK), células T gamma-delta, células madre mesenquimales o células estromales mesenquimales (MSC), monocitos o macrófagos. Las células inmunitarias preferidas son células con función efectora citotóxica tales como células T alfa-beta, células NK, células NKT, ILC, células CIK, células LAK o células T gammadelta. La "función efectora" significa una función especializada de una célula, por ejemplo, en una célula T, una función efectora puede ser actividad citolítica o actividad auxiliar, incluyendo la secreción de citoquinas.

El término "sistema cerrado", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier sistema cerrado que reduce el riesgo de contaminación del cultivo celular mientras realiza procesos de cultivo tales como la introducción de nuevo material y la realización de etapas de cultivo celular tales como proliferación, diferenciación, activación, modificación genética y/o o separación de células. Tal sistema permite operar bajo GMP o condiciones similares a GMP ("estériles") dando como resultado composiciones celulares que son clínicamente aplicables.

Un ejemplo de un sistema cerrado es el CliniMACS Prodigy® (Miltenyi Biotec GmbH, Alemania, WO2009/072003).

Los términos "método automatizado" o "proceso automatizado", tal como se utilizan en la presente memoria, se refieren a cualquier proceso que se automatice mediante el uso de dispositivos y/o computadoras y software informático que, de lo contrario, un operador podría o podría realizar manualmente. Los métodos (procesos) que han sido automatizados requieren menos intervención humana y menos tiempo humano para administrar. En algunos casos, un método se automatiza si al menos una etapa del método se realiza sin ningún apoyo o intervención humana. Preferiblemente, el método está automatizado si todas las etapas del método se realizan sin ayuda o intervención humana.

Esta invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse de ninguna manera como que imponen limitaciones sobre el alcance de la misma.

Ejemplos

Ejemplo 1: Expresión del CAR con el dominio de activación del receptor de IL-12 (en adelante: IL12-CAR) en subconjuntos de células T.

Injerto de células T de sangre periférica con IL12-CAR.

Las células T se aislaron con Ficoll de sangre periférica, se activaron en presencia de anticuerpos agonistas anti-CD3 y anti-CD28 (100 ng/ml cada uno) y 500 U/ml de IL2, respectivamente. Las células T activadas se transdujeron retroviralmente con un vector que codifica el IL12-CAR o un CAR sin el dominio de activación del receptor de IL12 (Figura 1). El dominio de unión al antígeno derivado del anticuerpo de ambos CARs está dirigido contra el antígeno tumoral CEA. Las células T transducidas se tiñeron con mAb anti-CD3 y un anticuerpo IgG antihumano para controlar la expresión de CAR (Figura 2). La IL12-CAR se expresó en células T periféricas con una eficacia similar a la del CAR sin el dominio de activación del receptor de IL12.

IL12-CAR se expresa en diferentes subconjuntos de células T.

Las células T periféricas se transdujeron con el IL12-CAR como se describe anteriormente. La expresión de CAR en células T CD4 y CD8 se controló utilizando anticuerpos anti-CD4 y anti-CD8, respectivamente, y un anticuerpo IgG Fc antihumano para controlar la expresión de CAR (Figura 3). Detectamos un alto número de células T CD4 y CD8 con expresión de IL12-CAR. En contraste con el CAR sin el dominio de activación del receptor IL12, que se expresó de manera más eficiente en las células T CD8+, el IL12-CAR se expresó en los subconjuntos de células T CD4+ y CD8+ con una eficiencia similar.

Conclusión:

El IL12-CAR se expresa eficientemente en células T periféricas primarias. Por lo tanto, IL12-CAR se expresa en células T CD4 y CD8 con una eficiencia similar, lo que hace que ambos subconjuntos de células T sean redirigidos por IL12-CAR.

Ejemplo 2: IL12-CAR induce un fenotipo CD56+CD62L+ de células T modificadas genéticamente.

Las células T se aislaron de sangre periférica, se activaron en presencia de mAbs agonistas anti-CD3 y anti-CD28 (100 ng/ml cada uno) y 500 U/ml de IL, respectivamente. Las células T activadas se transdujeron retroviralmente con un vector que codifica el IL12-CAR o CAR sin el dominio de activación del receptor de citoquinas para el control según el protocolo de operación estándar. Las células T transducidas se cultivaron durante 9 días y se tiñeron con anticuerpos anti-CD3, anti-CD56 y anti-CD62L (Figura 4). El IL12-CAR indujo preferentemente un fenotipo CD56+CD62L+ de células T IL12-CAR.

Conclusión:

El fenotipo de las células T transducidas con IL12-CAR se parece al fenotipo de las células NK/NKT maduradas con IL12 que, según se informó, adquirieron un potencial terapéutico mejorado (Lehman D et al., PLoS One 9, e87131, 2014)

Ejemplo 3: la señalización de IL12-CAR da como resultado una secreción mejorada de IFN-gamma.

La secreción de IFN-gamma es sustancial para una respuesta antitumoral eficiente de las células T CAR transferidas adoptivamente. En consecuencia, un CAR con alta capacidad de inducción de IFN-gamma será valioso para la aplicación clínica. Para probar las propiedades de secreción de IFN-gamma de IL12-CAR, se aislaron células T de sangre periférica y se transdujeron para expresar IL12-CAR y para comparar un CAR sin el dominio de unión al receptor de citoquinas como se describió anteriormente. Las células T CAR se co-cultivaron con células tumorales CEA+ LS174T y CEA-Colo320, respectivamente, durante 48 h y se registró la secreción de IFN-gamma mediante ELISA. Las células T que expresan IL12-CAR secretaron sustancialmente más IFN-gamma tras el encuentro con el antígeno que las células T con CAR sin el dominio de activación del receptor de IL12 (Figura 5). Además, incluso en ausencia del antígeno IL12-CAR, las células T secretan IFN-gamma que modulará el entorno del tumor para que sea más susceptible a un ataque inmunitario celular.

Conclusión:

El IL12-CAR ha mejorado las propiedades de secreción de citoquinas debido a la señalización sinérgica a través del dominio de señalización de CAR y el dominio de activación del receptor de IL12. La secreción mejorada de citoquinas proinflamatorias será adecuada para reprogramar el microambiente tumoral para reclutar una reactividad antitumoral innata y adoptiva adicional.

Ejemplo 4: IL12-CAR mejora la eliminación de células tumorales.

Las células T de la sangre periférica se modificaron genéticamente para expresar IL12-CAR o para compararlas con CAR de tipo nativo sin el dominio de activación del receptor de citoquinas. Las células T CAR se co-cultivaron (0,625x10(4)-5x10(4)/pocillo) con CEA+ LS174T y células tumorales Skov3 difíciles de eliminar, respectivamente, o células tumorales CEA-Colo320 (cada una 2,5 x 10(4)/pocillo ) durante 48 horas. La viabilidad de las células tumorales se registró mediante un ensayo XTT basado en la sal de tetrazolio y el porcentaje de citotoxicidad se calculó de la siguiente manera: citotoxicidad [%] = 100-viabilidad [%]. Mientras que las células T con CAR de tipo nativo e IL12-CAR, respectivamente, lisaron las células tumorales c Ea LS174T con una eficacia similar, las células T IL12-CAR eliminaron las células tumorales Skov3 con una eficacia mucho mayor que las células T CAR sin el dominio de activación del receptor de IL12 (Figura 6). Por el contrario, las células tumorales de CEA no fueron eliminadas por las células T CAR, lo que indica la especificidad de antígeno de CAR. La eliminación mejorada de las células tumorales Skov3 se debió en parte a la señalización simultánea a través de CAR y el dominio de activación del receptor de IL12 porque la estimulación del CAR de tipo nativo con un anticuerpo anti-idiotípico contra el dominio de unión a CAR y la IL12 exógena mejoró la eliminación de células Skov3 por células T CAR sin dominio de activación del receptor de IL12. Sorprendentemente, IL12-CAR fue aún más eficaz y la estimulación adicional a través de IL12 exógena y el anticuerpo anti-idiotípico no mejoró más la eliminación de células Skov3 (Figura 7).

Conclusión:

El IL12-CAR mejoró la eliminación de células objetivo, especialmente de células tumorales que eran menos susceptibles a un ataque de células T como las células tumorales de ovario Skov3. Por otro lado, las propiedades de eliminación mejoradas de las células T IL12-CAR no dieron como resultado una eliminación no específica general de las células objetivo, como se demostró mediante el co-cultivo con células tumorales CEA-Colo320. Dado que la aplicación simultánea de un ligando agonista para el dominio de unión al antígeno del receptor CAR y el receptor IL12 no indujo una actividad antitumoral citolítica mejorada, respectivamente, concluimos que la orientación mejorada de las células tumorales de Skov se debe a las propiedades intrínsecas de la célula T IL12 modificada en sí misma y no únicamente a la combinación de diferentes agentes activadores de células T.

Ejemplo 5: La activación de células T mediada por IL12 CAR es superior a la activación de células T CAR y la estimulación simultánea de IL2 e IL12.

IL2 e IL12 mejoran sinérgicamente la función de las células T frente a las células tumorales. Probamos la aplicación simultánea de IL2 e IL12 exógenas en la lisis de células objetivo de células T IL12-CAR y CAR, respectivamente, contra células tumorales Skov3. No encontramos ningún impacto de IL2 e IL12 exógenas en la lisis mediada por CAR de células Skov3. Además, las células T IL12-CAR demostraron una lisis superior de las células Skov3 en comparación con las células T CAR, independientemente de la presencia o ausencia de IL2 o IL12 exógena o tanto IL2 como IL12, respectivamente (Figura 8).

Conclusión:

IL12-CAR induce una citólisis superior de las células tumorales Skov3 que no está modulada por citoquinas proinflamatorias exógenas como IL2 e IL12 o la combinación de ambas. Además, la lisis mejorada de las células objetivo parece deberse a las propiedades intrínsecas de IL12-CAR.

Ejemplo 6: Las células T CAR IL12 inhiben el crecimiento in vivo de tumores Skov3 establecidos en ratones Rag-/- gama común

Las células T se modificaron genéticamente para expresar IL12-CAR y CAR sin el dominio de activación del receptor de IL12 según SOP y la expresión de CAR se controló mediante FACS. Se injertaron ratones Rag-/- gamma común -/- con 5 x 10(6) células tumorales Skov3/ratón. Después de 7 días, se inyectó una dosis de 1 x 10(7) células T totales por ratón en las venas de la cola de ratones con tumores establecidos. El número de células T CAR fue del 14 % (anti-CEA-CAR) y del 9 % (anti-CEA-IL12-CAR), respectivamente. Se registró el crecimiento tumoral cada 2o-3er día y se determinó el volumen del tumor (Figura 9). Mientras que las células T modificadas con CAR y las células T sin CAR no fueron efectivas para suprimir el crecimiento tumoral, las células T IL12-CAR inhibieron sustancialmente el crecimiento de los tumores Skov3.

Conclusión:

Las células T IL12-CAR suprimieron el crecimiento tumoral de las células Skov3, lo que indica una reactividad antitumoral sostenida in vivo.

Ejemplo 7: Un IL-12 CAR con especificidad para Muc1.

Se modificó genéticamente un IL-12 CAR que alberga el scFv anti-Muc1 como un dominio de dirección de CAR en lugar del dominio de dirección de anti-CEA (Figura 10). El CAR tiene la misma composición modular que el anti-CEA CAR, sin embargo, con una especificidad de orientación diferente (cf. Figura 1). A modo de comparación, se modificó genéticamente un anti-Muc1 CAR sin IL-12 integrado.

Las células T de la sangre periférica se transdujeron retroviralmente para expresar anti-CEA-IL12-CAR o anti-Muc1-IL12-CAR, respectivamente. Los CARs se detectaron en la superficie de las células T mediante citometría de flujo utilizando un anticuerpo IgG antihumano, que detecta el dominio espaciador extracelular común y el anticuerpo anti-CD3, respectivamente, para verificar las células T (Figura 11).

Conclusión:

Las células T expresan el anti-CEA-IL12 CAR y el anti-Muc1-IL12 CAR, respectivamente, en la superficie celular después de la transducción retroviral.

Ejemplo 8: El anti-Muc1 IL12-CAR mejoró la activación de las células T tras la interacción con el antígeno.

Las células T anti-Muc1-IL12-CAR se co-cultivaron durante 48 h con células tumorales Muc1+ LS174T y Muc1-Colo320, respectivamente. Después de 48 h, se registró más IFN-y mediante ELISA en los sobrenadantes de las células T IL12-CAR que en las células T CAR sin IL12 tras la interacción de las células tumorales Muc1+ (Figura 12). Hay cierta liberación de IFN-y de las células T IL12-CAR en presencia de células tumorales Muc1, lo que indica la inducción de la secreción de IFN-y independiente del antígeno por las células T IL12-CAR, lo que no es el caso de las células T CAR.

Para ensayar la actividad citolítica, se co-incubaron células T anti-Muc1-IL12-CAR y células T anti-Mucl-CAR, respectivamente, en cantidades crecientes de células con células de carcinoma mamario Muc1+ MCF7 in vitro y se registró la supervivencia de las células tumorales. Como se resume en la Figura 13, las células MCF7 fueron lisadas más eficientemente por células T anti-Muc1 -IL12-CAR a números bajos de células T que por células T anti-Mucl-CAR. El CAR medió específicamente en la eliminación de las células MCF7 ya que las células T sin CAR no produjeron citólisis dependiente de la dosis.

Conclusión:

El IL12-CAR mostró una activación de células T dependiente de antígeno mejorada indicada por una mayor liberación de IFN-y y actividad citolítica en comparación con las células T CAR de la misma especificidad, pero sin IL12. En ausencia de antígeno, las células T IL12-CAR liberaron IFN-y que, sin embargo, fue menor que en presencia del antígeno de CAR afín.

Ejemplo 9: Lisis de células tumorales específicas por células TIL12-CAR

Se co-cultivaron células T anti-Muc1-IL12-CAR, células T anti-CEA-IL12 CAR y células T no modificadas para el control, respectivamente, con células tumorales CEA+Muc1+ LS174T y MCF7 o CEA-Muc1-Colo 320. La actividad citolítica se determinó después de 48 horas (Figura 13). Las células T con anti-CEA-IL12 CAR eliminaron las células CEA+ LS174T y MCF-7 pero no las células CEA-Colo320. En consecuencia, las células T con anti-Muc1-IL12 CAR eliminaron las células Muc1+ LS174T y MCF-7 pero no las células Mucl-Colo320. A modo de comparación, las células T no modificadas no mostraron una actividad citolítica sustancial hacia las células objetivo.

Conclusión:

El anti-CEA y anti-Muc CAR con el dominio integrado IL12 mediaron la eliminación de células objetivo específicas de

Claims (10)

r e iv in d ic a c io n e s

1. Un receptor de antígeno quimérico (CAR), que comprende desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal una parte extracelular, un dominio transmembrana y al menos un dominio de señalización intracelular, en el que la parte extracelular de dicho CAR comprende

a) al menos un dominio de unión a antígeno, y

b) al menos un dominio de activación del receptor de citoquinas,

en el que dicho al menos un dominio de activación del receptor de citoquinas se selecciona del grupo que consiste en IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, GM-CSF, variante p35-p40 de IL-12, IL 18 e IL-32.

2. El CAR según la reivindicación 1, en el que dicho al menos un dominio de activación del receptor de citoquinas es la proteína p35-p40 de cadena sencilla de IL-12.

3. El CAR según la reivindicación 1 o 2, en el que el antígeno reconocido por dicho al menos un dominio de unión a antígeno es un antígeno asociado a un tumor.

4. El CAR según la reivindicación 3, en el que dicho antígeno es antígeno carcinoembrionario (CEA).

5. El CAR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho al menos un dominio de unión a antígeno comprende al menos un fragmento variable de cadena sencilla de un anticuerpo que se une al antígeno.

6. El CAR según la reivindicación 5, en el que dicho CAR comprende la secuencia codificada por SEQ ID NO:4.

7. Molécula(s) de ácido nucleico aislado(s) que codifica(n) el CAR según las reivindicaciones 1 a 6.

8. Una célula que comprende la(s) molécula(s) de ácido nucleico de la reivindicación 7.

9. Una célula que expresa el CAR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

10. Una composición farmacéutica que comprende células según la reivindicación 8 o 9.