ES2927461T3

ES2927461T3 - Células madre mesenquimatosas derivadas de tejido perinatal: método de preparación y utilizaciones de las mismas

Info

Publication number: ES2927461T3
Application number: ES17832923T
Authority: ES
Inventors: Zhongchao Han; Zhibo Han; Tao Wang
Original assignee: Health And Biotech France H&b France
Current assignee: Health And Biotech France H&b France
Priority date: 2016-12-12
Filing date: 2017-12-12
Publication date: 2022-11-07
Anticipated expiration: 2037-12-12
Also published as: US12053492B2; WO2018108859A1; RU2019118712A; JP7275441B2; KR20190128622A; KR102590455B1; JP2020503375A; US20200009193A1; EP3551748B1; EP3551748A1; RU2019118712A3; CN110352240A; CA3046576A1; PT3551748T

Abstract

La presente invención describe la preparación de células madre mesenquimales (MSC) CD106 high CD151 + Nestin+ derivadas de tejido de placenta. En un primer aspecto, la invención se refiere a un método particular para preparar estas células a escala industrial ya la población celular generada por el mismo. En un segundo aspecto, la invención se refiere a un cultivo celular obtenido por dicho método particular, que contiene MSCs placentarias CD106high CD151+ Nestin+ que expresan el marcador de la molécula de adhesión celular vascular 1 (VCAM-1). La presente solicitud muestra que dichas MSC Nestin+ CD106high CD151+ placentarias son capaces de inducir angiogénesis in vitro e in vivo. Los resultados presentados en el presente documento también muestran que la administración de dichas MSC CD106high CD151 + Nestin+ placentarias a individuos que padecen una enfermedad isquémica o un trastorno del sistema circulatorio da como resultado una mejora detectable de uno o más síntomas de dicha enfermedad o trastorno. Por lo tanto, en un tercer aspecto, la invención se refiere a MSC CD 106 high CD151 + Nestin+ placentarias para su uso como medicamento para tratar sujetos que padecen una enfermedad isquémica, un trastorno del sistema circulatorio, una enfermedad inmunitaria, una lesión de un órgano o una función de un órgano. falla. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Células madre mesenquimatosas derivadas de tejido perinatal: método de preparación y utilizaciones de las mismas

Antecedentes de la invención

Las células madre mesenquimatosas (MSC) es conocido que resultan útiles en medicina regenerativa y en ingeniería de tejidos. En adultos, la médula ósea, el tejido adiposo, la pulpa dentaria y la sangre menstrual son las fuentes principales de MSC. Pueden obtenerse, además, mediante el cultivo de células placentarias o células del cordón umbilical durante 3 a 4 semanas en DMEM complementado con FCS ([12], [13] y [14]).

Las MSC presentan un potencial de diferenciación mesodérmico, ectodérmico y endodérmico. Además, las MSC presentan propiedades inmunosupresoras. Las MSC inhiben o detienen la maduración de las células dendríticas y la proliferación de las células T, las células B y las células NK. Su acción inmunomoduladora está mediada por las citocinas y quimiocinas que secretan. Varios grupos han demostrado que las MSC en el tejido placentario muestran plasticidad de desarrollo multilinaje in vitro e in vivo. Las MSC derivadas de tejido placentario (incluyendo el cordón umbilical, la sangre de cordón umbilical, placenta, corion, amnios y líquido amniótico) muestran expresión positiva de CD29, CD44, CD73, CD90 y CD105; expresión negativa de los marcadores de superficie hematopoyéticos CD11b, CD19, CD34 y CD45, y expresión negativa del marcador de superficie endotelial CD31. Además, las MSC derivadas de tejido placentario son capaces de transdiferenciarse en células de la totalidad de las tres capas germinales bajo las condiciones apropiadas (por ejemplo, un medio completo).

Se ha mostrado que las MSC derivadas de tejido perinatal asimismo poseen amplias capacidades inmunorreguladoras y que son capaces de influir sobre respuestas inmunitarias tanto adaptativas como innatas. Dichas MSC inhiben la proliferación y maduración de las células inmunitarias y suprimen las reacciones inmunitarias tanto in vitro como in vivo de una manera no restringida por MHC Por lo tanto, dichas MSC se consideran hipoinmunogénicas, al mostrar niveles de expresión bajos de HLA de clase I, y expresión nula de HLA de clase II y de moléculas coestimuladoras, incluyendo CD40, CD80 y CD86. Básicamente, dichas MSC podrían ejercer efectos inmunomoduladores de células del sistema inmunitario tanto innato como adaptativo. Las MSC placentarias expandidas ex vivo asimismo se ha mostrado que suprimen la actividad de un amplio abanico de células inmunitarias, incluyendo las células T, las células T asesinas naturales (NKT), las células dendríticas (DC), las células B, los neutrófilos, los monocitos, los macrófagos, etc.

Las MSC derivadas de tejido perinatal humanas asimismo son seguras según numerosos informes de ensayo clínico. Se evaluó la seguridad y eficacia inicial de las MSC derivadas de transfusiones de cordón umbilical (MSC-CU) para pacientes con insuficiencia hepática aguda sobre crónica (ACLF) asociada a infección por virus de la hepatitis B. Estos resultados sugieren que las transfusiones de MSC son seguras en la clínica y que podrían servir como un nuevo enfoque terapéutico para los pacientes de ACLF asociada al VHB [1]. Asimismo se evaluó la seguridad y eficacia de las MSC-CU humanas en el tratamiento de la artritis reumatoide (AR). Estos resultados muestran que no se observaron efectos adversos graves durante o después de la infusión. Además, el tratamiento de las MSC indujo una remisión significativa de la enfermedad según la puntuación de la actividad de la enfermedad en 28 articulaciones [2] Los científicos han evaluado la seguridad y viabilidad de la inyección intramiocárdica de MSC en nueve pacientes, poco después de un infarto agudo de miocardio (IAM) durante el seguimiento a corto plazo y a 5 años [3]. Estos resultados sugieren que la inyección intramiocárdica de MSC en pacientes poco después de un IAM es viable y segura hasta el seguimiento a 5 años. Un estudio multicéntrico prospectivo aleatorizado y controlado con placebo, con doble enmascaramiento, para determinar la seguridad de las MSC en pacientes con isquemia de extremidad crítica mostró que las MSC asimismo son seguras al inyectarlas intramuscularmente a una dosis de 2 millones de células/kg de peso corporal [4]. No se detectaron complicaciones neoplásicas en ninguno de los sitios de implantación de MSC. Hongye Fan et al. [15] han mostrado que el trasplante de MSC expuestas a IL1p presenta una eficiencia terapéutica aumentada en la colitis murina inducida con DSS, que depende de sus capacidades inmunosupresoras incrementadas y capacidad aumentada de migración. El documento WO 2014/093948 asimismo ha dado a conocer el valor terapéutico de las MSC purificadas.

Sin embargo, la definición de MSC siempre ha sido controvertida debido a que no existe ningún marcador de superficie celular específico o único que las identifique inequívocamente. Hasta la fecha, las MSC han sido definidas mediante la utilización de una combinación de marcadores de proteína fenotípica de superficie celular, crecimiento de tipo fibroblástico adherente plástico y propiedades funcionales. Sin embargo, existen varias subpoblaciones diferentes según dichos marcadores de superficie celular y estas diferentes subpoblaciones muestran diferentes características y funciones biológicas, y no todas resultan eficientes en los protocolos de tratamiento. Por ejemplo, algunas poblaciones de MSC resultan estimuladas por ILp [12], mientras que otras poblaciones, no (las MSC positivas para CD106 en [15]). Además, la proliferación de algunas poblaciones de MSC resulta inhibida por IL4 [12], mientras que en otras resulta inducida la proliferación en presencia de dicha citocina [13]. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de identificación de una población de MSC funcionales que presenten eficiencia clínica y de estandarización de su procedimiento de preparación. Asimismo resulta importante diseñar un protocolo que pueda utilizarse en todo tejido placentario y extraembrionario de manera intercambiable.

Más exactamente, resulta importante identificar un procedimiento de preparación que rinda poblaciones de MSC terapéuticamente eficientes a partir de tejido placentario o a partir de fragmentos del cordón umbilical.

Por otra parte, actualmente existe una demanda elevada de MSC humanas para numerosas aplicaciones terapéuticas, aunque una disponibilidad insuficiente en el mercado. Por lo tanto, existe una necesidad de un procedimiento a escala industrial que proporcione un rendimiento elevado de MSC funcionales. Asimismo existe una necesidad de un sistema de cultivo eficiente que proporcione un rendimiento óptimo a un coste asequible, reduciendo de esta manera la brecha entre oferta y demanda, para las MSC obtenidas de todos los tejidos placentarios y extraembrionarios.

La presente solicitud satisface la totalidad de dichas necesidades y otras, mediante la propuesta de un método óptimo para la generación y purificación de subpoblaciones de MSC de diferentes orígenes (de tejido placentario o de cordón umbilical) y finalmente la expansión de dichas subpoblaciones con el mínimo número de pases y el número mínimo de duplicaciones de la población. Dicho método conduce a la recuperación, a partir de tejidos placentarios y del cordón umbilical, de MSC altamente potentes que presentan una capacidad de diferenciación multilinaje. Dicho método proporciona reproduciblemente un número considerable de células MSC que resultan adecuadas para la aplicación clínica.

Descripción detallada de la invención

El ejemplo 1 (ver a continuación) divulga un método de preparación para generar células mesenquimatosas (MSC) tejido placentario humano CD106elevado CD151+Nestina+ derivadas de tejido placentario humano a escala industrial, permitiendo obtener un rendimiento de por lo menos 1*105 células/cm2 de MSC que se preparan en unas instalaciones conformes a GMP y que resultan adecuadas para el uso alogénico. Dichas células madre mesenquimatosas (MSC) CD106elevado CD151+Nestina+ derivadas de tejido placentario comprenden más de 95% de células que expresan los marcadores positivos CD73, CD90, CD105 y CD166, y menos de 2% de las células que expresan los marcadores negativos CD45, CD34 y HLA-DR.

Dicho método resulta útil para generar células que pueden utilizarse en ensayos de trasplante en un sujeto humano o en un animal.

Comprende las dos etapas generales siguientes:

(i) cultivo de células madre mesenquimatosas obtenidas de un tejido o líquido biológico en un primer medio de cultivo privado de factores de crecimiento, de manera que se genera una población de células madre mesenquimatosas no diferenciadas en cultivo,

y

(ii) puesta en contacto de dicha población de células madre mesenquimatosas no diferenciadas en cultivo con un segundo medio de cultivo que contiene factores de crecimiento proinflamatorios o mediadores inflamatorios, generando de esta manera células madre mesenquimatosas CD106elevado CD151+ Nestina+ útiles para el trasplante en un sujeto que necesitas de las mismas.

En un primer aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para preparar células madre mesenquimatosas (MSC) CD106elevado CD151+ Nestina+ a escala industrial, en el que dicho método comprende cultivar una población de MSC no diferenciadas en un medio de cultivo que comprende entre 1 y 100 ng/ml de interleucina-1p añadida y entre 1 y 100 ng/ml de interleucina-4 añadida durante por lo menos un día, preferentemente durante dos días.

Dicha "población de MSC no diferenciadas" puede obtenerse mediante recolección de las células mononucleares presentes en un tejido o líquido biológico y cultivo de las mismas en un primer medio de cultivo. Dichas células mononucleares pueden obtenerse mediante cualesquiera medios convencionales, por ejemplo, mediante digestión enzimática o cultivo de un explante de trozos de tejido perinatal [10] o el aislamiento a partir de líquidos biológicos [11].

El cultivo de explantes es un procedimiento particularmente preferido para obtener MSC a partir de cordones umbilicales, tal como se expone en el ejemplo 3, a continuación.

Típicamente, dicho procedimiento requiere extraer la muestra de la solución de transporte, cortarla en secciones (de aproximadamente 2-3 cm de longitud), desinfectarlas con antibióticos y agentes antifúngicos que se enjuagan posteriormente, recuperar la membrana epitelial e introducir trozos de dicha membrana en matraces para que se adhieran (preferentemente sin medio, a temperatura ambiente), antes de añadir cuidadosamente medio completo sobre los explantes adheridos y mantener bajo incubación a 37°C durante varios días. Las células migradas se recogen finalmente con herramientas apropiadas y se mantienen en cultivo en el primer medio apropiado (ver a continuación) hasta que alcanzan la confluencia objetivo.

Dicho "primer medio de cultivo" puede ser cualquier medio clásico utilizado habitualmente para favorecer el crecimiento de las células primarias vivas. Preferentemente, no contiene ningún factor de crecimiento ni ningún factor de diferenciación.

El experto en la materia conoce bien qué tipo de medios de cultivo puede utilizarse como "primer medio de cultivo". Son, por ejemplo, DMEM, DMEM/F12, m Em , alfa-MEM (a-MEM), IMDM o RPMI. Preferentemente, dicho primer medio de cultivo es DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) o DMEM/F12 (medio de Eagle modificado por Dulbecco: mezcla de nutrientes F-12).

Más preferentemente, dicho primer medio de cultivo contiene 2% a 20% o 2% a 10% de suero de feto bovino. Alternativamente, dicho primer medio de cultivo puede contener 1% a 5% de lisado de plaquetas. Un medio más preferido contiene 2% a 20% o 2% a 10% de suero de feto bovino y 1% a 5% de lisado de plaquetas.

Asimismo resulta posible utilizar como primer medio de cultivo un medio que no contenga suero o listado de plaquetas, con la condición de que contenga otros agentes apropiados que favorecen el crecimiento de células vivas primarias.

En una forma de realización preferida, dicho "tejido biológico" es cualquier parte de un tejido placentario, o de cordón umbilical. En particular, puede incluir o consistir en cotiledones placentarios, la membrana amniótica o la membrana coriónica de la placenta. Además, puede ser la gelatina de Wharton que se encuentra en el cordón umbilical. Puede incluir las venas y/o las arterias, o estar privado de las mismas.

En otra forma de realización, dicho "líquido biológico" es una muestra de sangre del cordón umbilical, de sangre placentaria o de líquido amniótico, que han sido recogidos sin daños de una mujer o de un mamífero en general. Por ejemplo, dichos tejidos y líquidos pueden obtenerse después del parto de un bebé o una cría, sin ningún procedimiento invasivo.

Dicha población de MSC no diferenciadas es preferentemente una población de células madre mesenquimatosas sembrada sobre una superficie plástica, que ha sido cultivada en dicho primer medio de cultivo sin ningún factor de crecimiento hasta que las células alcanzan una confluencia de 85% a 90%.

Periódicamente, se caracteriza el fenotipo de las células mediante FACS o cualquier medio convencional, con el fin de detectar el nivel de los marcadores de superficie CD73, CD90, CD105, CD166, CD45, CD34 y HLA-DR.

En el caso de que el 95% de las células exprese los marcadores de superficie positivos CD73, CD90, CD105 y CD166, y menos de 2% exprese los marcadores de superficie negativos CD45, CD34 y HLA-DR, se tripsinizan las células y se siembran nuevamente a una densidad inferior, por ejemplo, a una densidad de entre 1000 y 5000 MSC por cm2 en un segundo medio de cultivo.

Preferentemente, dicho "segundo medio de cultivo" es cualquier medio clásico utilizado habitualmente para favorecer el crecimiento de las células primarias vivas. Puede ser el mismo medio que el "primer medio de cultivo", o puede ser otro, seleccionado, por ejemplo, de entre DMEM, DMEM/F12, MEM, alfa-MEM (a-MEM), IMDM o RPMI. Más preferentemente, dicho segundo medio de cultivo es DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) o DMEM/F12 (medio de Eagle modificado por Dulbecco: mezcla de nutrientes F-12).

Todavía más preferentemente, dicho segundo medio de cultivo contiene suero o lisado de plaquetas, por ejemplo, entre 2% y 20% de suero de feto bovino y/o 1% a% de listado de plaquetas. Un segundo medio más preferido es DMEM que contiene 2% a 20% de suero de feto bovino y 1% a 5% de lisado de plaquetas. Asimismo resulta posible utilizar como segundo medio de cultivo un medio que no contenga suero o listado de plaquetas, con la condición de que contenga otros agentes apropiados que favorecen el crecimiento de células vivas primarias.

Una vez las células alcanzan una confluencia de 40% a 50%, se añaden factores de crecimiento proinflamatorios o mediadores inflamatorios al segundo medio de cultivo y las células se cultivan en dicho medio hasta que alcanzan una confluencia de 90% a 95%.

Dichos "factores de crecimiento proinflamatorios" típicamente son interleucinas o quimiocinas que es conocido que presentan un efecto proinflamatorio. Entre los ejemplos de interleucinas que pueden añadirse al segundo medio de cultivo se incluyen TNFa, IL1, IL4, IL12, IL18 e ⁱFN^y. Entre los ejemplos de quimiocinas que pueden añadirse al segundo medio de cultivo se incluyen CXCL8, CXCL10, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CCL2 y CCL5. Pueden utilizarse otros mediadores inflamatorios (tales como agentes antiinflamatoríos).

Se añaden por lo menos dos factores de crecimiento proinflamatorios al segundo medio de cultivo definido anteriormente. Estos dos o más factores de crecimiento proinflamatorios pueden seleccionarse del grupo que consiste en: TNFa, IL1, IL4, IL12, IL18 e IFN^y. Dichos factores de crecimiento proinflamatorios pueden seleccionarse de entre IL1, IL4, IL12 e IL18.

Una concentración típica de factor o factores de crecimiento que pueden añadirse a las MSC está comprendida entre 1 y 100 ng/ml, más preferentemente entre 10 y 80 ng/ml. La etapa de cultivo de las MSC con el factor o factores de crecimiento dura por lo menos un día, más preferentemente dos días.

El término "IL1" en la presente memoria designa cualquier isoforma de interleucina-1, en particular, IL1a e IL1p. Las isoformas de IL1 pueden ser de diversos orígenes, según la aplicación deseada. Por ejemplo, puede utilizarse IL1 animal para aplicaciones veterinarias. Se añade IL1p al segundo medio de cultivo de la invención. La concentración de interleucina-1p añadida puede estar comprendida entre 1 y 100 ng/ml, preferentemente entre 1 y 50 ng/ml, más preferentemente entre 10 y 40 ng/ml.

Se hace referencia a ILIbeta (IL1p) humana como número de acceso NP_000567.1 (SEC ID n° 6, 269 aminoácidos). La proteína recombinante se encuentra disponible comercialmente bajo condiciones de GMP (RnD Systems, Thermofisher, Cellgenix y Preprotech).

El término "IL4" en la presente memoria designa cualquier isoforma de la interleucina-4. IL4 puede ser de diversos orígenes, según la aplicación deseada. Por ejemplo, puede utilizarse IL4 animal para aplicaciones veterinarias.

Se hace referencia a IL4 humana como número de acceso AAA59149 (SEC ID n° 7, 153 aminoácidos). La proteína recombinante se encuentra disponible comercialmente bajo condiciones de GMP (RnD Systems, Thermofisher, Cellgenix y Preprotech).

El segundo medio de la invención contiene una mezcla de IL1p e IL4, tal como se da a conocer en la parte experimental, a continuación.

En dicho segundo medio, la interleucina-1p añadida presenta una concentración comprendida entre 1 y 100 ng/ml, preferentemente entre 1 y 50 ng/ml, más preferentemente entre 10 y 40 ng/ml y la IL4 añadida presenta una concentración comprendida entre 1 y 100 ng/ml, preferentemente entre 1 y 50 ng/ml, más preferentemente entre 10 y 40 ng/ml. La etapa de cultivo con interleucina-1p e IL4 dura por lo menos un día, más preferentemente dos días.

En una etapa final, las células se caracterizan fenotípicamente mediante cualquier medio convencional, con el fin de detectar el nivel de los marcadores de superficie Cd 73, CD90, CD105, CD166, CD45, CD34 y HLA-DR. Dichos marcadores son bien conocidos en la técnica. Todos los anticuerpos útiles para detectar el nivel de expresión de dichos marcadores se encuentran disponibles comercialmente.

La expresión de dichos marcadores de superficie celular puede evaluarse notablemente mediante la utilización de tecnologías bien conocidas, tales como la tinción de membrana celular utilizando la biotinilación u otras técnicas equivalentes seguido de la inmunoprecipitación con anticuerpos específicos, la citometría de flujo, la transferencia western, ELISA o ELISPOT, las micromatrices de anticuerpos, o las micromatrices de tejidos acopladas con inmunohistoquímica. Entre otras técnicas adecuadas se incluyen FRET o BRET, métodos microscópicos o histoquímicos de células individuales que utilizan una o múltiples longitudes de onda de excitación y que aplican cualquiera de los métodos ópticos adaptados, tales como métodos electroquímicos (técnicas de voltametría y amperometría), microscopía de fuerza atómica y métodos de radiofrecuencia, por ejemplo, espectroscopía de resonancia multipolar, detección confocal y no confocal de fluorescencia, luminiscencia, quimioluminiscencia, absorbancia, reflectancia, transmitancia y birrefringencia o índice de refracción (por ejemplo, resonancia del plasmón superficial, elipsometría, un método de espejo resonante, un método de rejilla acopladora de guía de ondas o interferometría), ELISA celular, citometría de flujo, obtención de imágenes de resonancia magnética radioisotópica, análisis mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), HPLC-espectroscopía de masas, cromatografía líquida/espectrometría de masas/espectrometría de masas (LC-MS/MS).

Preferentemente, los niveles de marcadores de superficie se evalúan mediante FACS. Es decir, el método de la invención típicamente requiere:

a) recoger las células mononucleares contenidas en un tejido o líquido biológico perinatal,

b) permitir que dichas células mononucleares crezcan en un primer medio de cultivo hasta que alcanzan una confluencia de 85% a 90%, preferentemente sobre una superficie de plástico,

c) una vez 95% de las células expresa los marcadores positivos CD73, Cd90, CD105 y CD166, y menos de 2% expresan los marcadores negativos CD45, CD34 y HLA-DR, sembrar las células a una densidad de 1000 a 5000 MSC por cm2 en un segundo medio de cultivo,

d) añadir entre 1 y 100 ng/ml de mediadores inflamatorios o factores de crecimiento proinflamatorios una vez las células alcanzan una confluencia de 40% a 50%,

e) recoger las células una vez han alcanzado una confluencia de 90% a 95%.

A continuación, puede caracterizarse mediante FACS o cualquier medio convencional el fenotipo de las células recogidas, con el fin de detectar el nivel de los marcadores de superficie CD73, CD90, CD105, CD166, CD45, CD34 y HLA-DR. Dicho primer y segundo medios de cultivo se han descrito anteriormente.

En la etapa d) de dicho método, la concentración típica de factor o factores de crecimiento añadidos se encuentra comprendida entre 1 y 100 ng/ml, más preferentemente entre 10 y 80 ng/ml. La etapa de cultivo con uno o más factores de crecimiento dura como mínimo un día, más preferentemente, dos días.

La concentración de interleucina-1p o IL4 añadida se encuentra comprendida entre 1 y 100 ng/ml, preferentemente entre 1 y 50 ng/ml, más preferentemente entre 10 y 40 ng/ml. La etapa de cultivo con interleucina 1p e IL4 dura por lo menos un día, más preferentemente dos días.

Las células recogidas finales serán el "cultivo celular de la invención" o "MSC CD106elevado CD151+Nestina+ de la invención' o "MSC de la invención'. Dicho cultivo celular típicamente comprende más de 60%, preferentemente entre 60% y 70%, preferentemente más de 70%, preferentemente más de 80%, más preferentemente más de 90% y todavía más preferentemente más de 95% de las células que expresan CD106. Además, comprende más de 98%, preferentemente más de 99% de las células que expresan CD151. Además, comprende más de 98%, preferentemente más de 99% de las células que expresan nestina. Finalmente, comprende más de 95%, preferentemente más de 96%, preferentemente más de 97%, preferentemente más de 98% de las células que expresan los marcadores positivos CD73, CD90, CD105 y CD166, y comprende menos de 2% de células que expresan los marcadores negativos CD45, CD34 y HLA-DR.

El CD106 (asimismo conocido como VCAM-1 por "proteína 1 de adhesión a células vasculares") es conocido que presenta tres isoformas. NP_001069.1 (en la presente memoria denominado SEC iD n° 1, 739 aminoácidos), NP_542413.1 (en la presente memoria denominado SEC iD n° 2, 647 aminoácidos) y NP_001186763.1 (en la presente memoria denominado SEC ID n° 3, 677 aminoácidos) son las secuencias de las isoformas a, b y c, respectivamente. Los anticuerpos para detectar el nivel de expresión de dicho biomarcador particular se encuentran disponibles comercialmente (por ejemplo, de Thermofisher, Abcam, OriGen, etc.). La expresión de dicho marcador en la superficie de las células de la invención resulta muy importante, ya que induce actividades proangiogénicas que resultan esenciales para su utilización terapéutica.

El biomarcador nestina (al que en la presente memoria se hace referencia como SEC ID n° 4, 1621 aminoácidos) presenta la referencia número NP_006608.1 en el ser humano. Los anticuerpos para detectar el nivel de expresión de dicho biomarcador particular se encuentran disponibles comercialmente (por ejemplo, de Thermofisher, Abcam, etc.).

El biomarcador CD151 (al que en la presente memoria se hace referencia como SEC ID n° 5, 253 aminoácidos) presenta la referencia número NP_620599 en el ser humano. Los anticuerpos para detectar el nivel de expresión de dicho biomarcador particular se encuentran disponibles comercialmente (por ejemplo, de Invitrogen, Sigma-Aldrich, Abcam, etc.).

En una forma de realización preferida, las etapas de cultivo (o etapas de crecimiento) se llevan a cabo sobre una superficie de plástico.

Más específicamente, el método de la invención puede comprender las etapas de:

a) recoger opcionalmente por separado tejidos placentarios procedentes de múltiples donantes,

b) lavar opcionalmente el tejido placentario tres veces utilizando 1X PBS diseccionado en cubos de 1 mm3 y lavar el tejido de los cubos nuevamente para eliminar la mayor parte de la sangre en el tejido.

c) Digerir opcionalmente el tejido placentario de cada donante por separado utilizando colagenasa; centrifugar el tejido digerido y recoger las células mononucleares.

d) Sembrar las células mononucleares recogidas en un medio de cultivo.

e) Tripsinizar y subcultivar las células una vez alcanzan una confluencia de entre 85% y 90%.

f) Caracterizar las células basándose en el porcentaje de células que expresan los marcadores positivos CD73, CD90, CD105 y CD166 y los marcadores negativos CD45, Cd 34 y HLA-DR.

g) Sembrar las células en un medio de cultivo que contiene 90% de medio de Eagle modificado por Dulbecco/F12-Knockout (DMEM/F12-KO) y 10% de FBS, y factores de crecimiento a una densidad de siembra de entre 1000 y 5000 MSC por cm2, en el que comprenden por lo menos 95% de los marcadores positivos y, como máximo, 2% de los marcadores negativos.

h Añadir entre 1 a 100 ng/ml de interleucina-1p y, opcionalmente, entre 1 y 100 ng/ml de IL4, una vez han alcanzado una confluencia de 40% a 50%.

i) Tripsinizar y recoger las células una vez alcanzan una confluencia de 90% a 95%, y

j) opcionalmente caracterizar las células basándose en el porcentaje de células que expresan los marcadores positivos CD73, CD90, CD105 y CD166, y los marcadores negativos CD45, CD34 y HLA-DR.

Los resultados dados a conocer posteriormente muestran que la expresión de CD106 resulta aumentada en gran medida en la superficie de las MSC obtenidas mediante el método de la invención, del cordón umbilical o de la placenta. Dicha expresión resulta muy importante para la utilización terapéutica de las células generadas de esta manera (ver a continuación).

Por lo tanto, la presente solicitud se refiere, además, a un método para aumentar el nivel de expresión de CD106 de las MSC no diferenciadas, en el que dicho método comprende cultivar una población de MSC no diferenciadas en un medio de cultivo que comprende entre 1 y 100 ng/ml de interleucina-1p añadida y entre 1 y 100 ng/ml de interleucina-4 añadida, durante por lo menos un día, preferentemente durante dos días. Las condiciones particulares se han expuesto en detalle anteriormente; todas las formas de realización detalladas resultan de aplicación mutatis mutandis.

En otro aspecto, la invención se refiere a un cultivo celular obtenido mediante el método anteriormente descrito. Dicho cultivo celular típicamente contiene MSC CD106elevado CD151+ Nestina+ aisladas que expresan el marcador molécula 1 de adhesión a células vasculares (VCAM-1) a un nivel detectablemente más alto que las células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea adulta, tejido adiposo, cordón umbilical o placenta que no han estado en contacto con ningún factor de crecimiento durante su preparación. Dicho cultivo celular contiene:

- más de 60% de células que expresan CD106 a un nivel detectable,

- más de 98% de células que expresan CD151 a un nivel detectable,

- más de 90% de células que expresan nestina a un nivel detectable,

- más de 95% de células que expresan los marcadores CD73, CD90, CD105 y CD166 a un nivel detectable, y - menos de 2% de células que expresan los marcadores CD45, CD34 y HLA-DR a un nivel detectable.

En una forma de realización preferida, el cultivo celular de la invención se caracteriza porque:

(i) más de 60%, preferentemente más de 70%, más preferentemente más de 80%, y todavía más preferentemente más de 90% de células expresan CD106 a un nivel detectable, y

(ii) más de 98%, preferentemente más de 99% de las células expresan CD151 a un nivel detectable, y

(iii) más de 90%, preferentemente más de 92%, más preferentemente más de 98% de las células expresan nestina a un nivel detectable, y

(iv) más de 95%, preferentemente más de 96%, preferentemente más de 97%, preferentemente más de 98% de las células que expresan los marcadores positivos CD73, CD90, CD105 y CD166 a un nivel detectable, y

(v) menos de 2% de células que expresan los marcadores CD45, CD34 y HLA-DR a un nivel detectable.

En una forma de realización más preferida, dicho cultivo celular se caracteriza porque contiene más de 98% de MSC que no expresan los marcadores CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104 y CD133 a un nivel detectable. Dichos marcadores son bien conocidos en la técnica y los anticuerpos de detección de los mismos se encuentran disponibles comercialmente.

En una forma de realización preferida, el cultivo celular de la invención contiene:

- más de 80%, y todavía más preferentemente más de 90% de células que expresan CD106 a un nivel detectable, y

- más de 98%, preferentemente más de 99% de las células expresan CD151 a un nivel detectable, y

- más de 90%, preferentemente más de 99% de las células expresan nestina a un nivel detectable, y - más de 95%, preferentemente más de 96%, preferentemente más de 97%, preferentemente más de 98% de las células expresan los marcadores CD73, CD90, CD105 y CD166 a un nivel detectable, y

- menos de 2% de células que expresan los marcadores CD45, CD34 y HLA-DR a un nivel detectable.

Según la presente invención, una célula "expresa un marcador a un nivel detectable" en el caso de que dicho marcador se encuentre presente a un nivel significativo sobre su superficie, es decir, en el caso de que la señal asociada a la tinción de dicho marcador de superficie (típicamente obtenido con un anticuerpo que reconoce dicho marcador, en el que dicho anticuerpo se acopla, por ejemplo, con un pigmento fluorescente) que se mide para dicha célula, es superior a la señal correspondiente a la tinción de una célula que es conocido que no expresa dicho marcador. El experto en la materia conoce perfectamente cómo identificar dichas células/marcadores, por lo que dichos protocolos no necesitan detallarse en la presente memoria.

Los resultados dados a conocer en la parte experimental de la presente solicitud muestran que el cultivo celular obtenido mediante el método de la invención es capaz de inducir angiogénesis in vitro e in vivo. Además, dichos resultados muestran que la administración de dichas células en individuos (sujetos humanos o animales) que sufren de una enfermedad isquémica o de un trastorno del sistema circulatorio resulta en una mejora detectable de uno o más síntomas de dicha enfermedad o trastorno.

Los resultados que se dan a conocer posteriormente muestran, además, que los métodos de la invención permiten generar células que expresan un nivel elevado de proteína membranaria CD106/VCAM1. Resulta importante que dicha proteína se ha asociado recientemente a la expresión de citocinas proangiogénicas. Por lo tanto, las MSC CD106+ se han seleccionado por su eficiencia proangiogénica y se han propuesto como un tratamiento para la isquemia de las extremidades posteriores.

Por lo tanto, en un tercer aspecto, la invención se refiere a la utilización de dichas células como medicamento para tratar un individuo que sufre de una enfermedad isquémica o de un trastorno del sistema circulatorio. En otras palabras, la invención se refiere a la utilización de dichas células para la preparación de un medicamento destinado a la utilización para el tratamiento de sujetos que sufren de una enfermedad isquémica o de un trastorno del sistema circulatorio. El medicamento de la invención puede aplicarse, además, en la red capilar vascular de la piel y puede incluir aplicaciones dérmicas y cosméticas.

Puede tratarse cualquier mamífero con las células de la invención. Dicho mamífero puede ser un animal de compañía (un perro, un gato, un caballo, etc.) o un animal de ganadería (una oveja, una cabra, una vaca, etc.). Resulta evidente para el experto en la materia que, cuando un animal debe tratarse según el método de la invención, las MSC no diferenciadas iniciales se obtendrán de una muestra biológica procedente de la misma especie animal (injerto alogénico) o de una especie similar (injerto heterólogo) y los factores de crecimiento que se utilicen en el segundo medio de cultivo corresponderán a los de la misma especie animal. Por ejemplo, en el caso de que deba tratarse un gato, las MSC iniciales se obtendrán a partir de un tejido perinatal o líquido biológico de un gato, y se añadirá una IL1p de gato (recombinante o no) al segundo medio de cultivo, opcionalmente junto con IL4 de gato.

En una forma de realización preferida, dicho mamífero es un ser humano. En este caso, las MSC iniciales se obtendrán a partir de un tejido perinatal o de un líquido biológico obtenido de una mujer, y se añadirá IL1 p humana (recombinante o no, por ejemplo, SEC ID n° 6) al segundo medio de cultivo, opcionalmente junto con IL4 humana (por ejemplo, de Se C ID n° 7).

En dicho objetivo, el cultivo celular de la invención puede trasplantarse o aplicarse por vía tópica en dicho sujeto por cualquier medio convencional. En este caso, la presente invención se refiere a un método para tratar un sujeto que sufre de una enfermedad isquémica, un trastorno del sistema circulatorio, una enfermedad inmunitaria, una lesión de un órgano o una insuficiencia funcional de un órgano, en el que dicho método comprende la etapa de trasplantar el cultivo celular indicado anteriormente en dicho sujeto. Dicho trasplante puede llevarse a cabo mediante la utilización de un depósito implantado o mediante la inyección de las células in situ en el músculo o mediante inyecciones intravenosas o mediante cualquier sistema de administración apropiado. La aplicación asimismo puede llevarse a cabo tópicamente, mediante la puesta en contacto directo de las células con la piel o una membrana mucosa, o mediante la aplicación de las células con un dispositivo sobre la piel o sobre cualquier membrana mucosa, o mediante la administración de las células con cualquier sistema de administración apropiado en la piel o membrana mucosa.

Preferentemente, dicha enfermedad o trastorno se selecciona de entre el grupo que consiste en: diabetes mellitus de tipo 1, diabetes de tipo II, enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD), anemia aplásica, esclerosis múltiple, distrofia muscular de Duchenne, artritis reumatoide, ictus cerebral, fibrosis pulmonar idiopática, cardiomiopatía dilatada, osteoartritis, cirrosis, insuficiente hepática, insuficiencia renal, enfermedad oclusiva arterial periférica, isquemia de extremidad crítica, enfermedad vascular periférica, insuficiencia cardiaca, úlcera diabética o cualquier enfermedad degenerativa, sinequia, trastorno endometrial o trastorno fibrótico del tracto gastrointestinal, tal como fístula anal. Más preferentemente, dicha enfermedad o trastorno es una enfermedad oclusiva arterial periférica, una isquemia de extremidad crítica, una enfermedad vascular periférica o una úlcera diabética. En una forma de realización particular, dicha enfermedad o trastorno es una enfermedad de la piel o de una membrana mucosa, incluyendo (aunque sin limitación) una úlcera diabética, una úlcera, un traumatismo, una quemadura, una escaldadura, una herida o un problema de cicatrización de las heridas, úlcera de decúbito, una verruga, etc.

El cultivo celular de la invención puede utilizarse más precisamente en una preparación dérmica cuyo objetivo es tratar las patologías cutáneas, tales como quemaduras, heridas, úlceras, cicatrices, verrugas u otras enfermedades, tales como sinequia o trastornos fibróticos del tracto gastrointestinal (por ejemplo, fístula anal).

En otra forma de realización particular, dicha enfermedad o trastorno es una fístula anal o una lesión endometrial.

Otras aplicaciones se encuentran comprendidas dentro de la presente solicitud. En particular, resulta posible utilizar las MSC de la invención con fines dérmicos o cosméticos, por ejemplo, para regenerar las células de la piel o de una membrana mucosa; mejorar el aspecto de la piel o de una membrana mucosa, corregir un defecto de la piel o de una membrana mucosa o para cicatrizar una superficie quemada de piel o de una membrana mucosa.

Con el fin de aumentar la eficacia y facilitar la administración del medicamento de la invención, el cultivo celular de la invención puede mezclarse con cualquier agente, composición de agentes u otro material o dispositivo biológicamente compatible. El cultivo celular de la invención asimismo puede encapsularse o incluirse en cualquier sistema de administración o material biocompatible apropiado. Las células o preparación que contiene las células pueden aplicarse con un dispositivo médico, tal como un endoscopio, una endoprótesis, o una jeringa, por ejemplo. Asimismo puede aplicarse tópicamente mediante la puesta en contacto de las células con la piel o una mucosa.

La presente invención asimismo se refiere a un dispositivo médico que contiene el cultivo celular de la invención. La expresión "dispositivo médico" en la presente memoria comprende cualquier instrumento, aparato, implemento, máquina, equipo, implante o reactivo para administrar una composición terapéutica. En el contexto de la invención, dicho dispositivo médico es, por ejemplo, un parche, una endoprótesis, un endoscopio o una jeringa.

La presente invención asimismo se refiere a un sistema de administración que contiene el cultivo celular de la invención. La expresión "sistema de administración" en la presente memoria comprende cualquier sistema (medio o portador) para la administración de un producto farmacéutico en un paciente. Puede ser una administración oral o un sistema de liberación controlada. En el contexto de la invención, dicho sistema de administración es, por ejemplo, liposomas, proliposomas, microesferas, microvesículas o nanovesículas de biopolímeros, lípidos o nanopartículas.

En una forma de realización preferida de la invención, las células de la invención se incluyen en un hidrogel u otro material o excipiente biocompatible. Dicho hidrogel puede incluir notablemente hidrogel de alginato sódico, hidrogel de ácido hialurónico, hidrogel de quitosano, hidrogel de colágeno, hidrogel de HPMC, hidrogel de poli-L-lisina, hidrogel de ácido poli-L-glutámico, hidrogel de alcohol polivinílico (PVA), hidrogel de ácido poliacrílico, hidrogel de ácido polimetacrílico, hidrogel de poliacrilamida (PAM) e hidrogel de poli-N-acrilamida (PNAm ).

La presente invención se refiere, además a un hidrogel que contiene las MSC de la invención y posiblemente otro material o excipiente biocompatible. En la presente memoria resulta preferido un hidrogel de alginato, tal como para el hidrogel de alginato descrito en el documento CN106538515.

En el contexto de la presente invención, "materiales biocompatibles" son los utilizados clásicamente en aplicaciones biomédicas. Existen, por ejemplo, metales (tales como acero inoxidable, aleaciones de cobalto, aleaciones de titanio), cerámicas (óxido de aluminio, circonio, fosfatos de calcio), polímeros (siliconas, poli(etileno), poli(cloruro de vinilo), poliuretanos, poliláctidos) o polímeros naturales (alginato, colágeno, gelatina, elastina, etc.). Dichos materiales pueden ser sintéticos o naturales. Los excipientes biocompatibles son bien conocidos en la técnica y, por lo tanto, no necesitan detallarse.

Dicho hidrogel puede utilizarse con fines cosméticos o terapéuticos.

La presente invención se refiere, además, a una composición farmacéutica o veterinaria que contiene el cultivo celular de la invención, así como a la utilización de la misma para el tratamiento de las enfermedades y trastornos mencionados anteriormente. Se refiere, además, a una composición dérmica o cosmética que contiene el cultivo celular de la invención.

Dicha composición farmacéutica, veterinaria o cosmética puede contener, además, otros agentes biocompatibles (por ejemplo, un hidrogel) tal como se ha indicado anteriormente.

Dicha composición contiene preferentemente por lo menos aproximadamente entre 1 y 5x106 células.

Descripción de las figuras

Con el fin de que la exposición pueda entenderse fácilmente y ponerse en práctica, a continuación se hace referencia a formas de realización ejemplificativas y figuras ilustradas. Las figuras junto la descripción detallada, a continuación, sirven para ilustrar adicionalmente las formas de realización y explicar diversos principios y ventajas de acuerdo con la presente divulgación.

La figura 1 da a conocer un diagrama que muestra cómo puede prepararse la subpoblación de MSC CD106elevado CD151+ Nestina+ de la invención.

La figura 2 representa la morfología de las MSC adheridas a matraces de cultivo en la placenta, según el ejemplo 1.

La figura 3 representa la diferenciación de células adipogénicas y osteogénicas de MSC CD106elevado CD151+ Nestina+. Los resultados muestran que la subpoblación de MSC CD106elevado CD151+ Nestina+ es capaz de diferenciación adipogénica y osteogénica en medio apropiado. Las flechas blancas señalan gotas de lípido y una superficie fuertemente mineralizada.

La figura 4 representa un examen patológico de una angiografía: angiogramas representativos obtenidos el día postoperatorio 21.

La figura 5 representa un examen patológico mediante imágenes de perfusión Doppler láser (LDP): imágenes representativas de LDPI obtenidas los días postoperatorios 0 y 21. En el panel superior, la superficie todavía está afectada 3 semanas después del trasplante, tal como señala la flecha blanca. En los paneles inferiores, las flechas negras señalan la zona perfundida, 3 semanas después del trasplante.

La figura 6 representa los resultados de la infusión de MSC derivadas de placenta para pacientes con diabetes. En el presente ensayo clínico se incluyó un total de 15 pacientes con diabetes (11 hombres y 4 mujeres). (A) Muestra una reducción de la necesidad media de insulina tras 3 ocasiones de tratamiento con MSC CD106elevado CD151+ Nestina+ derivadas de tejido perinatal en dicho grupo de 15 pacientes, que era estadísticamente significativa (P<0.001). (B) Muestra que el tratamiento de MSC CD106elevado CD151+ Nestina+ asimismo mejoró significativamente el nivel de hemoglobina glucosilada de los pacientes con diabetes (P<0.001). Estos resultados muestran que las MSC CD106elevado CD151+ Nestina+ de origen perinatal podrían ser una buena opción para los pacientes con diabetes.

La figura 7 (A) representa el nivel de ascitis mediante la utilización de un examen de ultrasonidos antes de la infusión de las ^mS^cCD106elevado CD151+ Nestina+ en un paciente que sufre de cirrosis descompensada. Y (B) muestra el nivel de ascitis mediante la utilización de un examen de ultrasonidos un mes después de la administración de las MSC CD106elevado CD151+ Nestina+. (C) Muestra que las funciones hepáticas de dicho paciente mejoraron significativamente. La expresión de CA125 se redujo hasta un nivel normal. Además, los niveles de proteínas totales, albúmina y globulina en suero se incrementaron significativamente.

La figura 8 representa la evaluación de la tasa de perfusión en un modelo de isquemia de las extremidades posteriores en el ratón NOD/SCID después de la ligación arterial y la inyección de diversas dosis de MSC de cordón umbilical de la invención, o solución salina o VEGF.

Ejemplos

Por razones de simplicidad y fines ilustrativos, la presente invención se describe haciendo referencia a formas de realización ejemplificativas de la misma. Sin embargo, resultará evidente para el experto ordinario en la materia que la presente invención puede ponerse en práctica sin limitación a dichos datos específicos. En otros casos, no se han descrito en detalle métodos bien conocidos, para no entorpecer innecesariamente la comprensión de la presente invención.

1. Método para obtener las MSC de la invención a partir de tejido placentario

El método de la invención se ha llevado a cabo mediante:

a) recolección separada de tejido placentario humano a partir de múltiples donantes madres,

b) lavado opcional del tejido placentario tres veces utilizando 1X PBS; disección en cubos de 1 mm3 y lavado del tejido de los cubos nuevamente para eliminar la mayor parte de la sangre en el tejido.

c) Digestión opcional del tejido placentario de cada donante por separado con colagenasa; centrifugación del tejido digerido y recolección de las células mononucleares.

d) Siembra de las células mononucleares en un medio de cultivo.

e) Tripsinización y subcultivo de las células una vez alcanzan una confluencia de entre 85% y 90%.

j) Caracterización de las células basándose en el porcentaje de células que expresan los marcadores positivos CD73, CD90, CD105 y CD166, y los marcadores negativos CD45, CD34 y HLA-DR.

g) Siembra de las células en un medio de cultivo que contiene 90% de medio de Eagle modificado por Dulbecco/F12-Knockout (DMEM/F12-KO) y 10% de FBS, y factores de crecimiento a una densidad de siembra de entre 1000 y 5000 MSC por cm2, en el que comprenden por lo menos 95% de los marcadores positivos y, a lo sumo, 2% de los marcadores negativos.

h) Obtención de MSC CD106elevado CD151+ Nestina+ que comprenden más de 80% de células que expresan CD106, 98% que expresan CD151, 98% que expresan nestina y 95% de células que expresan los marcadores positivos CD73, CD90, CD105 y CD166 y menos de 2% de células que expresan los marcadores negativos CD45, CD34 y HLA-DR (para el uso en trasplantes) y la adición de 20 ng/ml de IL1p (suministrado por Preprotech) y 20 ng/ml de IL4 (suministrado por Preprotech) una vez han alcanzado una confluencia de entre 40% y 50%.

i) Tripsinización y recolección de las células una vez alcanzan una confluencia de entre 90% y 95%.

Dicho método permitió generar una subpoblación de MSC de origen placentario con un rendimiento de por lo menos 1*105 células/cm2 MSC (5x106 MSC en matraces T75 cm2 una vez habían alcanzado una confluencia de 90%) que puede utilizarse en administraciones alogénicas. Dichos cultivos celulares comprendían más de 95% de células que expresaban los marcadores positivos CD73, CD90, CD105 y CD166, y menos de 2% de células que expresaban los marcadores negativos c D45, CD34 y HLA-DR.

Las MSC CD106elevado CD151+ Nestina+ derivadas de tejido perinatal humano eran de tipo fibroblástico y crecían muy bien sobre el matraz de material plástico (ver la figura 2).

Se llevaron a cabo tres experimentos independientes (experimento n° 1, experimento n° 2 y experimento n° 3). Se añadieron 20 ng/ml de tanto interleucina 1 (p) como 4 una vez las células habían alcanzado una confluencia de entre 40% y 50% (ver la figura 1). En ese punto, las MSC comprendía más de 95% de células que expresaban los marcadores positivos CD73, CD90, CD105 y CD166 y menos de 2% de células que expresaban los marcadores negativos ^cD45, CD34 y HLA-DR. Después, las MSC continuaron creciendo hasta alcanzar una confluencia celular de 90% (ver las tablas 1 y 2, a continuación), en la práctica durante aproximadamente 2 días.

Cabe destacar que la expresión de las proteínas de superficie de las células MSC, CD106, CD151 y nestina, se incrementó significativamente después de la adición de las interleucinas 1 y 4.

La tabla 1 muestra la expresión de CD11b, CD19, CD29, CD31, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105, CD106, CD151, nestina y HLA-DR sobre MSC derivadas de tejido placentario antes de la adición de las interleucinas 1 y 4 obtenidas en placenta en los ejemplos 1, 2 y 3. Estos resultados muestran que las MSC de origen placentario presentan marcadores de superficie celular clásicos, al igual que las MSC derivadas de médula ósea y de tejido adiposo.

Tabla 1

La tabla 2 muestra la expresión de CD11b, CD19, CD29, CD31, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105, CD106, CD151, nestina y HLA-DR sobre MSC derivadas de tejido placentario después de la adición de las interleucinas 1 y 4 en los ejemplos 1, 2 y 3. Estos resultados muestran que los marcadores CD106 y proteína nestina se incrementaron significativamente 48 horas después de la adición de IL-1 e IL-4 a medio completo. Por otra parte, las células CD106elevado CD151+Nestina+ todavía presentan un marcador fenotípico clásico de superficie de las células MSC.

Tabla 2

Dichas subpoblaciones pueden secretar más factores de crecimiento celular, citocinas, factores inmunomoduladores y factores inflamatorios (ver la tabla 3). Por lo tanto, estas MSC CD106elevado CD151 Nestina+ presentan un mejor potencial de inmunomodulación y angiogénesis.

La tabla 3 muestra los niveles de expresión relacionados de los factores de crecimiento secretados en el medio agotado, según la q-PCR. Los resultados muestran que las MSC derivadas de tejido placentario presentan una expresión o secreción superior de las proteínas IL-6, IL-8, IL-10, HGF, ANG, MMP2, Ve GF-A y TGF-p a las 48 horas de la adición de IL-1 e IL-4 al medio completo.

Tabla 3

2. Método para obtener las MSC de la invención a partir de tejidos de cordón umbilical

En el presente ejemplo se utilizaron los reactivos siguientes:

2.1. Aislamiento celular mediante el método de explantes

Se extrajo el cordón umbilical de la solución de transporte y se cortó en secciones de 2 a 3 cm de longitud. Para evitar la contaminación por células sanguíneas adherentes, se descartó cada segmento de cordón que contuviese un coágulo de sangre que no pudiese eliminarse. A continuación, se desinfectaron las secciones en un baño de antibióticos y agentes antifúngicos compuesto de aMEM vancomicina 1 g/l amoxicilina 1 g/l amicacina 500 mg/l anfotericina B 50 mg/l durante 30 min a temperatura ambiente (TA). Los antibióticos se disolvieron extemporáneamente en agua estéril para inyección.

Se sacaron las secciones de cordón umbilical del baño y se enjuagaron rápidamente en 1X PBS a TA. La membrana epitelial se cortó ligeramente sin tocar los vasos. A continuación, cada sección se cortó en secciones de 0.5 cm de grosor y se depositó en el fondo de un matraz de plástico de 150 cm2 con tapa. Se depositaron 6 a 10 secciones en cada matraz, con un espacio libre circular de por lo menos 1 cm de radio en torno a cada sección y se dejó que se adhiriesen durante 15 min sin medio a TA.

Tras la adhesión, se añadió cuidadosamente medio completo (aMEM CPL al 5% 2 U/ml de heparina), para mantener los explantes adherentes sobre el fondo del matraz. A continuación, se incubaron los matraces a 37°C, con 90% de humedad y 5% de CO2.

El medio de cultivo se cambió tras 5 a 7 días.

El día 10 después del aislamiento, se comprobó la migración de las células hacia el exterior de los explantes con un microscopio invertido. En el caso de que fuese visible un círculo de células adherentes en torno a la mayoría de los explantes, se extrajeron cuidadosamente, sacándolos del matraz por la tapa con unas pinzas de un solo uso desechables estériles.

A partir de esta etapa, se comprobó visualmente la confluencia de las células cada dos días y, en caso necesario, se llevó a cabo un cambio de medio el día 17.

Una vez las células alcanzaron una confluencia de entre 70% y 90% o en D20, se eliminó el medio y las células se lavaron con 30 ml de 1X PBS por matraz. A continuación, se recolectaron las células con Trypzean® y se recogieron con el medio antiguo y se centrifugaron durante 10 min a 25000 rpm. Se descartó el sobrenadante y a continuación las células se resuspendieron en una solución de crioconservación que consistía en aMEM 100 mg/ml de HSA DMSO al 10%, y se conservaron criogénicamente.

2.2. Aislamiento celular mediante el método enzimático

A continuación, el cordón se cortó en trozos pequeños y se sumergió en un cóctel enzimático que comprendía 2.7 mg/ml de colagenasa de tipo I y 0.7 mg/ml de hialuronidasa; se incubó durante 3 h a 37°C bajo agitación suave, seguido de la adición de tripsina al 2.5% y una incubación adicional durante 30 min.

La suspensión digerida se diluyó 1:2 con medio para reducir la viscosidad de la suspensión y se pasó por una malla de nilón a fin de obtener una suspensión de células individuales. Las células se centrifugaron a 300xg durante 20 min y se sembraron a razón de 10,000 células/cm2 con medio fresco.

El medio de cultivo se cambió tras 5 a 7 días y posteriormente cada 7 días.

2.3. Descongelación y cultivo de las células

Las células se descongelaron siguiendo un protocolo clásico. Brevemente, se sacaron los tubos criogénicos del nitrógeno líquido y se sumergieron rápidamente en un baño de agua a 37°C. En cuanto no quedase hielo en los tubos, se diluyeron las células en medio completo precalentado (a 37°C) (aMEM ciprofloxacino al 0.5% (v/v) 2 U/ml de heparina LP al 5% (v/v)) y se centrifugaron rápidamente (300xg, TA, 5 min).

Tras la centrifugación, las células se suspendieron en medio completo precalentado y se evaluó el número y viabilidad (azul tripán/hemocitómetro de Mallassez).

Las células se sembraron en dos matraces de cultivo de plástico de 75 cm2 en medio completo y se incubaron (90% de humedad, 5% de CO2, 37°C).

2.4. Estimulación de las células

Tras unos cuantos días de expansión, se comprobó el nivel de confluencia de las células. Una vez la confluencia había alcanzado entre 30% y 50%, se descartó el medio antiguo y se sustituyó por medio completo fresco para la condición no estimulada, o por medio fresco complementado con 10 ng/ml de IL-1p y 10ng/ml de IL-4.

A continuación, las células se incubaron durante por lo menos 2 días antes de los experimentos de citometría de flujo.

2.5. Recolección de las células y análisis de citometría de flujo

Tras 2 a 3 días de expansión/estimulación, se comprobó la confluencia de las células. En el caso de que la confluencia hubiese alcanzado el 80%, se recolectaban las células. Brevemente, se descartó el medio antiguo y se lavaron las células con 1X DPBS. Se añadió tripsina-EDTA y las células se incubaron durante 5 min a 37°C. Se neutralizó la tripsina con por lo menos 2X el volumen de medio y se recolectó la suspensión celular y se evaluó el número de células y la viabilidad de las mismas.

El experimento de citometría de flujo requirió 1x106 células, que se centrifugaron y resuspendieron en 1X DPBS HSA al 0.4%.

Las células se marcaron con CD73, CD90 CD105, CD106, CD151 y CD31, CD34, CD45, HLA-DR siguiendo el protocolo siguiente:

1. Se evaluaron las células para su viabilidad y número.

2. Se introdujo en un tubo de plástico propileno de 15 ml el volumen de suspensión necesario para obtener 20,000 células/tubo de marcaje.

3. El tubo se centrifugó durante 5 min a 300g a 4°C.

4. Se resuspendieron las células en 1X DPBS HSA al 0.4% (diluido 10x en 4 mg/ml de HSA en 1XDPBS).

El volumen necesario era 500 pl por tubo de marcaje.

Se llevó a cabo la tinción extracelular para los marcadores CD106 y CD151 tal como recomienda el fabricante de FACS y los proveedores de los anticuerpos. Se llevó a cabo la tinción intracelular para la nestina. Para la tinción intracelular, se utilizó la solución de fijación/permeabilización denominada "kit BD Cytofix/Cytoperm".

g

En el caso de que las células no fuesen analizadas inmediatamente después de la tinción, se llevó a cabo una etapa de fijación mediante la puesta en contacto de las células con solución 1XDPBS, formaldehído al 0.5%. Tras el marcaje, las células se lavaron con 1X DPBS HSA al 0.4% y se permeabilizaron para el marcaje con nestina.

Las células marcadas se analizaron con el citómetro Accuri C6+ de BD Biosciences y se analizaron los resultados con el software BD Accuri C6 Plus.

2.6. Resultados

Se obtuvieron varios lotes de MSC derivadas de cordón umbilical (HB-COR001 a COR005-MSC) mediante el cultivo de las MSC de cortón aisladas mediante los métodos de explante dados a conocer anteriormente (2.1) bajo las condiciones expuestas en el punto 2.4, anteriormente. Para los cordones 3 y 5 (COR003 y COR005), se obtuvieron concomitantemente dos poblaciones de MSC (MSC1 y MSC2), mediante repetición de las etapas de la invención de manera separada.

La expresión de CD106 en la superficie de dichas células se midió mediante citometría de flujo.

Todos los lotes sometidos a ensayo de MSC mostraron un incremento drástico (<60%) de los niveles de expresión de CD106 (ver la tabla 4).

Tabla 4: expresión de CD106 de MSC derivadas de cordón umbilical tras la estimulación con IL1p e IL4

3. Impacto del protocolo de aislamiento sobre la expresión de CD106 en MSC derivadas de cordón umbilical

Se aislaron células madre mesenquimatosas a partir de cordón umbilical mediante la utilización de dos métodos diferentes, expuestos anteriormente (ver los puntos 2.1 y 2.2): mediante aislamiento de explantes y mediante digestión enzimática.

Todas las células fueron cultivadas en el mismo medio de cultivo (aMEM lisado de plaquetas (LP) al 5%), estimuladas en el pase n° 3 según el método de la invención y recogidas 2 días después de la estimulación. Se midió la viabilidad celular y se contaron las células.

A continuación, se midió mediante citometría de flujo la expresión de varios marcadores fenotípicos, incluyendo CD106.

Todas las MSC, con independencia del método de aislamiento o la condición de estimulación, expresaron marcadores fenotípicos de un modo clásico: 95% positivas para CD73, CD90 y CD105, mientras que eran negativas para CD31, CD34, CD45 y HLA-DR.

Asimismo eran 95% positivas para CD151+ y nestina, con independencia de la estimulación o el método de aislamiento.

Sin estimulación, las MSC aisladas mediante digestión enzimática expresaron niveles más altos de CD106 antes de la estimulación (53%) que las MSC aisladas con los métodos de explantes (20%). Sin embargo, eran menos sensibles a la estimulación con el cóctel inflamatorio: se observó un incremento más pequeño de CD106 (incremento de 4% vs incremento de 60%).

Por lo tanto, el método de explantes es el método preferido de la invención para las MSC derivadas de cordón umbilical.

Tabla 5: viabilidad y recuento celular de las MSC obtenidas tras los dos protocolos experimentales expuestos en los puntos 2.1 y 2.2.

Tabla 6: marcadores moleculares de MSC derivadas de cordón umbilical obtenidos mediante las dos condiciones experimentales expuestas en los puntos 2.1 y 2.2.

4. Efectos de la estimulación con una combinación de IL1-IL4 frente a la estimulación con IL1 o IL4 sola sobre los niveles de CD106 de las células madre mesenquimatosas de cordón umbilical

Se aislaron células madre mesenquimatosas a partir de dos cordones umbilicales mediante aislamiento de explantes (ver el punto 2.1).

Todas las células fueron cultivadas en el mismo medio de cultivo (aMEM lisado de plaquetas (LP) al 5%), estimuladas en el pase n° 4 según el método de la invención con una mezcla de 10 ng/ml de IL-1b y 10 ng/ml de IL-4 o con cada interleucina por separado (10 ng/ml cada una) y recogidas 2 días después de la estimulación. Se midió la viabilidad celular y se contaron las células.

Todas las MSC, con independencia de la condición de estimulación, expresaron los marcadores fenotípicos de una manera clásica. 95% positivas para CD73, CD90 y CD105, mientras que eran negativas para CD31, CD34, CD45 y HLA-DR. Asimismo eran más de 95% positivas para CD151+, con independencia de la estimulación. Con respecto al marcador CD106, el incremento de la expresión observado con la estimulación con una combinación de IL1 y IL4 fue 3 a 5 veces superior que el incremento de la expresión observado con la estimulación con una sola interleucina (ver la tabla 7).

Tabla 7: niveles de expresión de CD106 obtenidos tras la estimulación de las MSC con la combinación IL1-IL4 o con una sola IL.

5. Efecto de neovascularización de MSC CD106elevado CD151+ Nestina+ de origen placentario en ratas diabéticas

El presente ejemplo se centra en el efecto de neovascularización terapéutica de las MSC CD106elevado CD151 Nestina+ de origen placentario. Proporciona conocimiento sobre su potencial para el uso clínico como terapia celular combinada con la inyección de insulina para el tratamiento de la isquemia de extremidades inferiores crítica en la diabetes. Los resultados de los presentes inventores muestran que las MSC CD106elevado CD151 Nestina+ de origen placentario participan en la angiogénesis y vascularización terapéuticas con el fin de mejorar la isquemia y restaurar la perfusión de flujo sanguíneo mediante la diferenciación directa en células vasculares. Además, las MSC CD106elevado CD151 Nestina+ mejoraron el daño isquémico y la recuperación funcional en ratas diabéticas.

Se adquirieron ratas desnudas macho inmunodeficientes de seis semanas de edad de Vital River Laboratories (proveedor Charles River Laboratories en China). Se indujo la diabetes con una única inyección intraperitoneal de estreptozotocina (70 mg/kg en solución tampón de citrato, solo preparada inmediatamente antes de la inyección) después del ayuno durante la noche. Se midieron los niveles plasmáticos de glucosa en ayuno cada semana y las ratas con glucosa plasmática entre 11 mM y 15 mM fueron consideradas diabéticas. Las ratas desnudas de edades y pesos correspondientes recibieron una inyección intraperitoneal de tampón de citrato y se utilizaron como controles no diabéticos (glucemia entre 5.5 y 8 mM).

Dos semanas después, las ratas desnudas diabéticas fueron anestesiadas (60 mg/kg de pentobarbital por vía intraperitoneal) y se ocluyó la arteria femoral izquierda mediante ligación con una seda 3-0. Se aplicó la ligadura 0.5 cm proximalmente a la bifurcación de las arterias safena y poplítea. Se utilizó Lipiodol (1.5 ml/kg) para inducir un embolismo intravascular. Se aplicó una ligadura simulada en la arteria femoral izquierda, sin provocar isquemia en la extremidad posterior izquierda.

Después de establecer el modelo de isquemia, la deficiencia quirúrgica de las extremidades era evidente, ya que la extremidad ya no podía soportar ningún peso y la pata se encontraba hinchada y enrojecida. Con el tiempo, mejoró el daño isquémico en grados diferentes en todos los grupos. La recuperación de la función de la extremidad se incrementó significativamente en la población de MSC CD106elevado CD151+ Nestina+ (figura 4).

Más exactamente, los datos histológicos en la figura 4 muestran que se incrementó la densidad capilar en los grupos de trasplante celular en comparación con el grupo de PBS. Además, se observó un mayor número de capilares en los grupos de trasplante celular de subpoblación de MSC CD106elevado CD151+ Nestina+ en ratas diabéticas y ratas no diabéticas en comparación con el grupo de PBS.

La figura 5 muestra evidencia funcional de los cambios inducidos por la isquemia mediante LDPI de vascularización. La imagen muestra que el flujo de sangre resultó completamente bloqueado en la extremidad posterior izquierda el día de la cirugía; señalado por el color muy oscuro. Tres semanas después, se restauró la perfusión del flujo sanguíneo en cierto grado en todos los grupos, aunque no volvió a la normalidad en el grupo de PBS, en el que la proporción de isquemia/perfusión no isquémica solo alcanzó 52%. La recuperación de la perfusión en los grupos de trasplante celular fue significativamente superior. La proporción fue de 81% en el grupo de P-MSC de la técnica anterior (P<0.05 frente al grupo de PBS) y de 86% para el grupo de subpoblación de ^mS^cCD106elevado CD151+ Nestina+ (P<0.01 frente al grupo de PBS).

La recuperación de la perfusión en ambas subpoblaciones de MSC fue significativamente superior. Por lo tanto, los resultados revelan que las MSC mejoran la perfusión del flujo sanguíneo y que las MSC de la invención resultan más eficaces en ello. De hecho, las ^mS^cde la invención mostraron una mejora significativa en la restauración del flujo sanguíneo tanto en ratas diabéticas como en no diabéticas.

Los resultados revelan que las MSC de la invención mejoran la perfusión del flujo sanguíneo más eficientemente que las MSC de la técnica anterior. El presente ejemplo indica que la administración de las MSC de la invención es un nuevo enfoque prometedor para la isquemia de extremidad crítica diabética.

6. Efecto terapéutico de las MSC CD106elevado CD151 Nestina+ de origen placentario de la invención en pacientes con diabetes

El presente ejemplo se centra en el efecto terapéutico de las MSC CD106elevado CD151+ Nestina+ de origen placentario de la invención para pacientes que sufren de diabetes. Proporciona conocimiento sobre su potencial para un uso clínico como terapia celular para la diabetes.

En el presente ensayo clínico se incluyó un total de 15 pacientes con diabetes (11 hombres y 4 mujeres). Los criterios de inclusión fueron: pacientes con diabetes de tipo 2 diagnosticada entre noviembre de 2013 y noviembre de 2014 en el Hospital general Tianjin. Los pacientes eran de entre 30 y 85 años de edad, duración de la diabetes >3 años, que requería insulina para un control glucémico óptica a una dosis >0.7 U/kg/día durante por lo menos 1.5 años, con disfunción de la insulina, fluctuaciones mal controladas de la glucosa sanguínea con el tratamiento a base de insulina y deseo de participar en el estudio. Dichos 15 pacientes presentaban entre 42 y 67 años de edad, con una mediana de edad de 59 años; duración de la diabetes de entre 3 y 17 años, con una mediana de 8 años; necesidad diaria de insulina de entre 38 y 90 unidades, con una media de 58.7 unidades. Pruebas simultáneas de tolerancia a la glucosa, de liberación de insulina y de estimulación por péptido C, y se realizó una determinación de la hemoglobina glucosilada cada tres meses. Se llevaron a cabo pruebas de función cardiaca, hepática y renal. Se observaron sucesos adversos y efectos secundarios durante el tratamiento. Se consideró eficaz si la necesidad diaria de insulina se reducía en >50% después del tratamiento y se prolongaba más de 3 meses.

Los pacientes recibieron tres infusiones intravenosas de las MSC de origen placentario (P-MSC) de la invención, con un intervalo de un mes entre infusiones. El número total de P-MSC administradas en cada paciente fue de (1.0-1.5)x106 / kg, con una media de 1.25*106/kg. Simultáneamente, los pacientes continuaron administrándose insulina y se ajustó la dosis de la misma según los niveles de glucosa en sangre. Para las complicaciones, se mantuvieron los tratamientos generales originales. Todos los pacientes recibieron un seguimiento después de la terapia durante por lo menos 6 meses.

El presente ensayo clínico mostró una reducción de la necesidad media de insulina tras 3 administraciones de MSC de origen placentario de la invención en este grupo de 15 pacientes, que era estadísticamente significativa (P<0.001). La dosis inyectada de insulina en los pacientes con diabetes se redujo prácticamente a la mitad tras la administración de MSC de origen placentario de la invención (en comparación con la dosis media de insulina administrada durante los 6 meses previos a la administración de MSC) (figura 6A).

Dicho ensayo clínico mostró que el tratamiento con MSC de origen placentario de la invención redujo significativamente el nivel de hemoglobina glucosilada de los pacientes con diabetes (P<0.001) (figura 6B).

Estos datos apoyan que las MSC de la invención pueden utilizarse para el tratamiento de los pacientes con diabetes.

7. Efecto terapéutico de las MSC de origen placentario de la invención sobre pacientes con anemia aplásica

El presente ejemplo se centra en el efecto terapéutico de las MSC de origen placentario de la invención sobre pacientes con anemia aplásica y proporciona conocimiento sobre su potencial para el uso clínico como terapia celular para la anemia aplásica.

La anemia aplásica se considera en su mayor parte un síndrome de insuficiencia de la médula ósea (BM) mediado inmunitariamente, que se caracteriza por hipoplasia y pancitopenia con BM grasa y angiogénesis reducida. Las investigaciones anteriores han demostrado que la anemia aplásica adquirida se manifiesta en anormalidades de HSC/HPC y el microambiente hematopoyético. Una gran cantidad de pruebas sugiere que la anemia aplásica podría ser un síndrome caracterizado por trastornos de las células madre/progenitoras, incluyendo las HSC/HPC y las MSC. Las MSC apoyan la hematopoyesis y regulan la función de prácticamente todas las células inmunitarias, manteniendo la homeostasis hematopoyética e inmunitaria. Las MSC pueden modular las funciones de las células inmunitarias principales, incluyendo las células T, las células B, los monocitos, las CD, las NKT y los neutrófilos [5]. Las MSC poseen notables propiedades inmunosupresoras de Th1, Th17 y las CTL. Las MSC inhiben la proliferación de las células T, la secreción de IFN-^yy TNF-a por las células Th1, estimulando simultáneamente la producción de IL-10 por las células Th2 y la expansión de las células Treg. Sin embargo, las últimas investigaciones han mostrado que las MSC de pacientes con anemia aplásica presentan un nivel bajo de proliferación y una inmunosupresión deficiente de la activación de MLR, la activación de las células T inducida por PHA y la liberación de IFN-y [6, 7]. El reciente estudio de los presentes inventores muestra que las MSC procedentes de pacientes con anemia aplásica presentaban un efecto reducido de supresión de la proliferación y potencial clonogénico de las células T CD4+, estimulando simultáneamente la expansión de las células Treg. Se observó, además, que las MSC suprimían de modo defectuoso la producción de TNF-a e IFN-y por parte de las células T CD4+. Sin embargo, no se observó ninguna diferencia significativa en la regulación de la producción de IL-4, IL-10 e IL-17 [8]. Además, las investigaciones de los presentes inventores muestran que las MSC procedentes de pacientes con anemia aplásica muestran una morfología aberrante, una proliferación y potencial clonogénico reducidos y una apoptosis incrementada en comparación con MSC-BM procedentes de controles sanos. Las MSC de pacientes con anemia aplásica eran susceptibles a la inducción de diferenciación en adipocitos, aunque les resultaba más difícil diferenciarse en osteoblastos. En concordancia con las características biológicas anormales, el gran número de genes que participan en el ciclo celular, la división celular, la proliferación, la quimiotaxis y el linaje de las células hematopoyéticas mostraron una expresión marcadamente reducida en las MSC procedente de estos pacientes con anemia aplásica. A la inversa, más genes relacionados con la apoptosis, la adipogénesis y la respuesta inmunitaria mostraron una expresión incrementada en las MSC procedentes de pacientes con anemia aplásica. El perfil de expresión génica de las MSC confirmó adicionalmente las anormales propiedades biológicas y proporcionó pruebas significativas del posible mecanismo de destrucción del microambiente de la BM en la anemia aplásica [9].

Las MSC son un candidato terapéutico prometedor para el tratamiento de la anemia aplásica debido a los dos hechos importantes a continuación:

i) la capacidad general de las MSC de apoyar la hematopoyesis y su potente capacidad inmunosupresora, y

ii) las diferentes características biológicas y deficiencia funcional observadas en las MSC obtenidas de pacientes con anemia aplásica.

En un ensayo clínico, una niña de 6 años con fiebre intermitente continua durante más de un mes fue sometida a tratamiento con MSC. Se confirmó la anemia aplásica después de que dos biopsias de la médula ósea revelasen la hipocelularidad. No se observó ninguna mejora en el fenotipo de la sangre periférica después del tratamiento con ciclosporina y estanozolol durante prácticamente 6 meses. El trasplante de células madre hematopoyéticas no era una buena opción debido a que era muy difícil encontrar un donante compatible. Por lo tanto, se administró en el paciente una infusión intravenosa de 1*107 MSC de origen placentario de la invención. El fenotipo de la sangre periférica mejoró significativamente tras el 1° trasplante de MSC. Sin embargo, el paciente todavía dependía de la trasfusión de productos hemáticos, incluyendo la transfusión de glóbulos rojos y plaquetas. Seis meses después, el paciente aceptó por 2° vez una inyección intravenosa de 1*107 MSC de la invención. El fenotipo de la sangre periférica mejoró significativamente y alcanzó niveles prácticamente normales 12 meses después de la 2a inyección. Además, el paciente era completamente independiente de la transfusión de productos hemáticos 12 meses después de la 2a inyección (tabla 8). Estos datos apoyan que las MSC de origen placentario de la invención pueden utilizarse para el tratamiento clínico de pacientes con anemia aplásica.

Tabla 8. Fenotipo de la sangre periférica durante el tratamiento de MSC de origen placentario.

8. Efecto terapéutico de las MSC de origen placentario de la invención sobre pacientes con enfermedades hepáticas

El presente ejemplo se centra en el efecto terapéutico de las MSC de origen placentario obtenidas según el método de la invención (es decir, con el tratamiento de IL1 e IL4) administradas en pacientes que sufren enfermedades hepáticas. Proporciona conocimiento sobre su potencial para el uso clínico como terapia celular para enfermedades hepáticas.

En el presente ensayo clínico, se confirmó que un hombre de 40 años sufría hepatitis alcohólica de más de diez años de evolución. Se confirmó que el paciente presentaba cirrosis descompensada de dos años de evolución, aunque aceptó el tratamiento convencional. Debido a que no hay una buena opción para el tratamiento de la cirrosis descompensada, el paciente aceptó voluntariamente una inyección intravenosa de 4x107 MSC de la invención.

En el presente ensayo clínico, los resultados del examen de ultrasonidos mostraron un nivel de ascitis de 9.7 cm antes de administrar las MSC (ver la figura 7A). Sin embargo, el nivel de ascitis se redujo a 3.6 cm un mes después de la administración de las MSC (figura 7B). Además, los resultados mostraron que las funciones hepáticas del paciente con cirrosis descompensada mejoraron significativamente después de la administración de las MSC. Además, la expresión de CA125 en suero se redujo al nivel normal según las referencias clínicas.

Estos resultados muestran la excelente reacción clínica en los pacientes con cirrosis descompensada tratados con las MSC de la invención.

Además, los niveles séricos de proteínas totales, albúmina y globulina se incrementaron significativamente hasta alcanzar los niveles normales según las referencias clínicas (figura 7C). Estos resultados muestran que la función sintética y metabólica del hígado del paciente mejoró un mes después de la inyección intravenosa de MSC.

Por lo tanto, las MSC de origen placentario de la invención son una muy buena opción citoterapéutica para las enfermedades hepáticas.

9. Potencial angiogénico de las células de la invención obtenidas del cordón umbilical

Se sometió a ensayo adicional el potencial proangiogénico de las MSC de la invención en un modelo murino de isquemia de las extremidades posteriores.

Materiales y métodos

Se anestesiaron doce ratones NOD/SCID de 8 semanas de edad (Laboratoire Janvier) con una mezcla de ketamina y xilazina. A continuación, se ligaron las partes proximal y distal izquierdas de la arteria femoral de la pata izquierda (sutura de seda 6.0, Ethicon, Issy-Les-Moulineaux, Francia) y se extrajo la parte comprendida entre ligaduras. Los ratones que mostraban una isquemia superior a 80% después de la cirugía recibieron mediante inyección intramuscular en el músculo gastrocnemio de la extremidad isquémica dos dosis de MSC de la invención obtenidas según los protocolos expuestos en el punto 2.4, anteriormente (0.5x106 células por animal en el grupo 2, 0.05 106 células por animal en el grupo 3). Se utilizó una inyección de solución salina en el grupo de control 1. Asimismo se inyectó una dosis de 20 ng/ml de VEGF/ratón en el grupo de control 4.

El esquema de inyección, así como las dosis, se derivaron para el uso clínico deseado de las células y las dosis administradas en animales fue >10 veces la dosis propuesta para un ensayo clínico de fase I/II con seres humanos (que es aproximadamente 25x106 células/kg, es decir, aproximadamente 0.5x106 células/ratón (peso medio de un ratón=20 g)).

Se midió el flujo sanguíneo en las extremidades posteriores mediante la utilización de un escáner láser-Doppler (sistema de perfusión Doppler láser, Perimed PeriScan PIM III). La perfusión media de las extremidades isquémicas y no isquémicas se determinó antes y después de la isquemia, y cada 7 días hasta 21 días después de la isquemia. Se obtuvieron imágenes de los cambios de frecuencia láser dependientes del flujo sanguíneo aplicando píxeles de diferentes colores. Se analizaron las imágenes a fin de cuantificar el flujo sanguíneo mediante la utilización de un software de análisis de la perfusión sanguínea (LPDIwin). El porcentaje de perfusión se expresó como una proporción de extremidad posterior isquémica a no isquémica.

Tinción de hematoxilina-eosina de secciones musculares de extremidad posterior.

Los ratones fueron eutanizados al final del experimento (D21). Se diseccionaron los músculos gastrocnemios de las extremidades posteriores y se tiñeron para visualizar la distribución de los núcleos celulares en las fibras musculares. Los músculos aislados de las extremidades posteriores isquémicas se fijaron en parafina y se tiñeron con hematoxilina/eosina.

Resultados

La figura 8 muestra la tasa de reperfusión media tras la isquemia de la extremidad posterior en ratones tratados con diferentes inyecciones: NaCl al 0.9% (control negativo, n=8); VEGF, 20 ng/ml (control positivo, n=6); 50x103 células MM (n=9) y 500x103 células MM (n=7).

Estos resultados muestran que la administración de dosis altas de MSC de la invención en ratones tras la ligadura de la arteria femoral resultan en tasas de perfusión más altas en comparación con la administración de vehículo (NaCl) o VEGF solamente. Se observó una tasa de perfusión de 100% tan pronto como 7 días después de la inyección de células en ratones que recibieron la dosis más alta de células (0.5x106 células). Se observó una diferencia estadísticamente significativa con los demás grupos.

Además, un efecto de respuesta a dosis es probable, ya que, en el presente experimento preliminar, la dosis más alta de células (0.5x106 células) aparentemente consigue una mejor tasa de perfusión que una dosis 10 veces más baja.

Estos resultados confirman la potencia angiogénica real de las MSC de la invención en la mejora de la perfusión sanguínea en el presente modelo de ratón de CLI.

Resultados observados en la tinción con hematoxilina-eosina (datos no representados)

En los músculos normales, no isquémicos, los núcleos celulares están distribuidos en la periferia de la fibra muscular.

En los músculos isquémicos de los ratones de los grupos 1 (NaCl al 0.9%) y 4 (VEGF, 20 ng/ml), 21 días después de la inducción de isquemia, las células mostraban muy pocos núcleos en la periferia de la fibra muscular, ya que todavía se estaban regenerando.

En los músculos isquémicos de los ratones del grupo 3 (0.05x106 células MSC o 50,000), 21 días después de la inducción de isquemia, el 50% de las fibras musculares se había regenerado y mostraba núcleos en la periferia de la fibra. La regeneración ocurrió más rápidamente que en los grupos 1 y 4.

En los músculos isquémicos de los ratones del grupo 2 (0.5x106 células MSC o 500,000), 21 días después de la inducción de isquemia, el 100% de las fibras musculares se había regenerado y mostraba núcleos en la periferia de la fibra. El perfil de tinción del músculo era idéntico al del músculo normal, no isquémico. En el presente experimento, la dosis de 500,000 células permite una regeneración completa del músculo.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para preparar células madre mesenquimatosas (MSC) CD106elevado CD151 Nestina+, comprendiendo dicho método cultivar una población de MSC no diferenciadas en un medio de cultivo que comprende entre 1 y 100 ng/ml de interleucina 1p añadida y entre 1 y 100 ng/ml de interleucina 4 añadida, durante por lo menos un día, preferentemente durante dos días.

2. Método para aumentar el nivel de expresión de CD106 de MSC no diferenciadas, comprendiendo dicho método cultivar una población de MSC no diferenciadas en un medio de cultivo que comprende entre 1 y 100 ng/ml de interleucina 1p añadida y entre 1 y 100 ng/ml de interleucina 4 añadida, durante por lo menos un día, preferentemente durante dos días.

3. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende las etapas de:

a) proporcionar las células mononucleares contenidas en un tejido o líquido biológico perinatal,

b) permitir que dichas células mononucleares crezcan en un primer medio de cultivo libre de cualquier factor de crecimiento hasta que alcancen una confluencia de 85-90%, preferentemente sobre una superficie de plástico,

c) una vez 95% de las células expresa los marcadores positivos CD73, CD90, CD105 y CD166, y menos de 2% expresa los marcadores negativos CD45, CD34 y HLA-DR, sembrar las células a una densidad de 1000 a 5000 MSC por cm2 en un segundo medio de cultivo,

d) una vez las células alcanzan una confluencia de 40-50%, añadir entre 1 y 100 ng/ml de interleucina 1p y entre 1 y 100 ng/ml de interleucina 4, durante por lo menos un día,

e) recoger las células cuando alcanzan una confluencia de 90-95%.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la población de las células recogidas en la etapa e) contiene:

- más de 60% de células que expresan CD106 a un nivel detectable,

- más de 98% de células que expresan CD151 a un nivel detectable,

- más de 98% de células que expresan nestina a un nivel detectable,

- más de 95% de células que expresan los marcadores CD73, CD90, CD105 y CD166 a un nivel detectable, y - menos de 2% de células que expresan los marcadores CD45, CD34 y h LA-DR a un nivel detectable.

5. Cultivo celular que contiene células madre mesenquimatosas (MSC) CD106elevado CD151+ Nestina+ obtenidas mediante el método según las reivindicaciones 1 a 4, conteniendo dicho cultivo celular:

- más de 60% de células que expresan CD106 a un nivel detectable,

- más de 98% de células que expresan CD151 a un nivel detectable,

- más de 90% de células que expresan nestina a un nivel detectable,

6. Cultivo celular como se define en la reivindicación 5, para la utilización para tratar sujetos que sufren de una enfermedad isquémica, de un trastorno del sistema circulatorio, de una enfermedad inmunitaria, de una lesión o trastorno de un órgano o de una insuficiencia de la función de un órgano.

7. Cultivo celular para la utilización según la reivindicación 6, en el que dicha/o enfermedad o trastorno se selecciona en el grupo que consiste en: diabetes mellitus de tipo 1, diabetes de tipo II, GVHD, anemia aplásica, esclerosis múltiple, distrofia muscular de Duchenne, artritis reumatoide, ictus cerebral, fibrosis pulmonar idiopática, cardiomiopatía dilatada, osteoartritis, cirrosis, insuficiencia hepática, insuficiencia renal, enfermedad oclusiva arterial periférica, isquemia de extremidad crítica, enfermedad vascular periférica, insuficiencia cardiaca, úlcera diabética, trastornos fibróticos, sinequia, trastornos endometriales, úlcera diabética, una úlcera, un traumatismo, una quemadura, una escaldadura, una herida o un problema de cicatrización de heridas, una úlcera de decúbito, una verruga, una sinequia, un trastorno endometrial y un trastorno fibrótico del tubo gastrointestinal, tal como fístula anal.

8. Composición farmacéutica o veterinaria que contiene el cultivo celular como se define en la reivindicación 5.

9. Composición farmacéutica según la reivindicación 8, para la utilización para tratar sujetos que sufren de una enfermedad isquémica, un trastorno del sistema circulatorio, de una enfermedad inmunitaria, de un trastorno fibrótico, de una lesión de un órgano o de una insuficiencia de la función de un órgano, o de una enfermedad o un trastorno seleccionada/o en el grupo que consiste en: diabetes mellitus de tipo 1, diabetes de tipo II, GVHD, anemia aplásica, esclerosis múltiple, distrofia muscular de Duchenne, artritis reumatoide, ictus cerebral, fibrosis pulmonar idiopática, cardiomiopatía dilatada, osteoartritis, cirrosis, insuficiencia hepática, insuficiencia renal, enfermedad oclusiva arterial periférica, isquemia de extremidad crítica, enfermedad vascular periférica, insuficiencia cardiaca, úlcera diabética, trastornos fibróticos, sinequia y trastornos endometriales.

10. Composición dermatológica o cosmética que contiene el cultivo celular como se define en la reivindicación 5.

11. Utilización de la composición cosmética según la reivindicación 10, para regenerar las células cutáneas o mucosas, mejorar el aspecto de la piel o membrana mucosa o para corregir un defecto de la piel o membrana mucosa, tal como manchas oscuras, granos, acné, arrugas o sequedad.

12. Composición dermatológica según la reivindicación 10, para su utilización en la cicatrización de una lesión o trastorno de la piel, tal como una quemadura, una cicatriz, un angioma, un lunar o una verruga.

13. Dispositivo médico que contiene el cultivo celular como se define en la reivindicación 5, en el que es preferentemente un vendaje, un parche, una endoprótesis, un endoscopio o una jeringa.

14. Sistema de administración que contiene el cultivo celular como se define en la reivindicación 5, en el que es preferentemente micro- o nanovesículas de biopolímeros, lípidos o nanopartículas.

15. Hidrogel, preferentemente un hidrogel de alginato, que contiene el cultivo celular como se define en la reivindicación 5, opcionalmente con otro material o excipiente biocompatible.