ES2928056T3 - Movilización de elementos transponibles para mejorar variabilidad genética y epigenética en una poblacion - Google Patents
Movilización de elementos transponibles para mejorar variabilidad genética y epigenética en una poblacion Download PDFInfo
- Publication number
- ES2928056T3 ES2928056T3 ES16808953T ES16808953T ES2928056T3 ES 2928056 T3 ES2928056 T3 ES 2928056T3 ES 16808953 T ES16808953 T ES 16808953T ES 16808953 T ES16808953 T ES 16808953T ES 2928056 T3 ES2928056 T3 ES 2928056T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- stress
- plant
- inhibitor
- onsen
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title abstract description 15
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 title abstract description 11
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 claims abstract description 52
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 26
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 26
- 230000035882 stress Effects 0.000 claims description 32
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 15
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 claims description 13
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 claims description 12
- CIORWBWIBBPXCG-SXZCQOKQSA-N alpha-amanitin Chemical group O=C1N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N2C[C@H](O)C[C@H]2C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)[C@@H](O)CO)C(=O)N[C@@H](C2)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@H]1C[S@@](=O)C1=C2C2=CC=C(O)C=C2N1 CIORWBWIBBPXCG-SXZCQOKQSA-N 0.000 claims description 11
- 230000004790 biotic stress Effects 0.000 claims description 11
- 101800002638 Alpha-amanitin Proteins 0.000 claims description 10
- RXGJTYFDKOHJHK-UHFFFAOYSA-N S-deoxo-amaninamide Natural products CCC(C)C1NC(=O)CNC(=O)C2Cc3c(SCC(NC(=O)CNC1=O)C(=O)NC(CC(=O)N)C(=O)N4CC(O)CC4C(=O)NC(C(C)C(O)CO)C(=O)N2)[nH]c5ccccc35 RXGJTYFDKOHJHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000004007 alpha amanitin Substances 0.000 claims description 10
- CIORWBWIBBPXCG-UHFFFAOYSA-N alpha-amanitin Natural products O=C1NC(CC(N)=O)C(=O)N2CC(O)CC2C(=O)NC(C(C)C(O)CO)C(=O)NC(C2)C(=O)NCC(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NCC(=O)NC1CS(=O)C1=C2C2=CC=C(O)C=C2N1 CIORWBWIBBPXCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229960005502 α-amanitin Drugs 0.000 claims description 10
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 claims description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 claims description 8
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 claims description 8
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000007123 defense Effects 0.000 claims description 6
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 6
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 5
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 5
- XAUDJQYHKZQPEU-KVQBGUIXSA-N 5-aza-2'-deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 XAUDJQYHKZQPEU-KVQBGUIXSA-N 0.000 claims description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 5-azacytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 3
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 claims description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 3
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 claims description 3
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 244000038280 herbivores Species 0.000 claims description 3
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 claims description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 claims description 3
- IDYKCXHJJGMAEV-RRKCRQDMSA-N 4-amino-5-fluoro-1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound C1=C(F)C(N)=NC(=O)N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IDYKCXHJJGMAEV-RRKCRQDMSA-N 0.000 claims description 2
- NMUSYJAQQFHJEW-UHFFFAOYSA-N 5-Azacytidine Natural products O=C1N=C(N)N=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960002756 azacitidine Drugs 0.000 claims description 2
- 229930000223 plant secondary metabolite Natural products 0.000 claims description 2
- LJIRBXZDQGQUOO-KVTDHHQDSA-N 6-amino-3-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-1,4-dihydro-1,3,5-triazin-2-one Chemical compound C1NC(N)=NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 LJIRBXZDQGQUOO-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims 1
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 13
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 abstract 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 93
- 230000008642 heat stress Effects 0.000 description 51
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 48
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 27
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 21
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 21
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 16
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 16
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 13
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 11
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 11
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 11
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 10
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 10
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 108090000104 Actin-related protein 3 Proteins 0.000 description 7
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 7
- 108091092566 Extrachromosomal DNA Proteins 0.000 description 7
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 6
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 6
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- MCNOFYBITGAAGM-UHFFFAOYSA-N 2,2-dichloro-1-[5-(furan-2-yl)-2,2-dimethyl-1,3-oxazolidin-3-yl]ethanone Chemical compound C1N(C(=O)C(Cl)Cl)C(C)(C)OC1C1=CC=CO1 MCNOFYBITGAAGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 231100000729 Amatoxin Toxicity 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 4
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 4
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 3
- 101150059979 DCL2 gene Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 3
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000008995 epigenetic change Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- -1 small molecule compound Chemical class 0.000 description 3
- JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N (+)-Abscisic acid Chemical compound OC(=O)/C=C(/C)\C=C\[C@@]1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N 0.000 description 2
- WVHGJJRMKGDTEC-WCIJHFMNSA-N 2-[(1R,4S,8R,10S,13S,16S,27R,34S)-34-[(2S)-butan-2-yl]-8,22-dihydroxy-13-[(2R,3S)-3-hydroxybutan-2-yl]-2,5,11,14,27,30,33,36,39-nonaoxo-27lambda4-thia-3,6,12,15,25,29,32,35,38-nonazapentacyclo[14.12.11.06,10.018,26.019,24]nonatriaconta-18(26),19(24),20,22-tetraen-4-yl]acetamide Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H]1NC(=O)CNC(=O)[C@@H]2Cc3c([nH]c4cc(O)ccc34)[S@](=O)C[C@H](NC(=O)CNC1=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N1C[C@H](O)C[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)[C@H](C)O)C(=O)N2 WVHGJJRMKGDTEC-WCIJHFMNSA-N 0.000 description 2
- XHSQDZXAVJRBMX-DDHJBXDOSA-N 5,6-dichloro-1-β-d-ribofuranosylbenzimidazole Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=CC(Cl)=C(Cl)C=C2N=C1 XHSQDZXAVJRBMX-DDHJBXDOSA-N 0.000 description 2
- 241000208841 Ambrosia trifida Species 0.000 description 2
- PFJJMJDEVDLPNE-UHFFFAOYSA-N Benoxacor Chemical compound C1=CC=C2N(C(=O)C(Cl)Cl)C(C)COC2=C1 PFJJMJDEVDLPNE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 2
- 230000035131 DNA demethylation Effects 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- UKSLKNUCVPZQCQ-UHFFFAOYSA-N Fluxofenim Chemical compound C=1C=C(Cl)C=CC=1C(C(F)(F)F)=NOCC1OCCO1 UKSLKNUCVPZQCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 2
- 241000555303 Mamestra brassicae Species 0.000 description 2
- GRSMWKLPSNHDHA-UHFFFAOYSA-N Naphthalic anhydride Chemical compound C1=CC(C(=O)OC2=O)=C3C2=CC=CC3=C1 GRSMWKLPSNHDHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 241001147398 Ostrinia nubilalis Species 0.000 description 2
- WFVUIONFJOAYPK-KAMYIIQDSA-N Oxabetrinil Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/C#N)=N\OCC1OCCO1 WFVUIONFJOAYPK-KAMYIIQDSA-N 0.000 description 2
- 229940122277 RNA polymerase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 2
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010014709 amatoxin Proteins 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000001369 bisulfite sequencing Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000036978 cell physiology Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 2
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 2
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 2
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 2
- OPGCOAPTHCZZIW-UHFFFAOYSA-N diethyl 1-(2,4-dichlorophenyl)-5-methyl-4h-pyrazole-3,5-dicarboxylate Chemical group CCOC(=O)C1(C)CC(C(=O)OCC)=NN1C1=CC=C(Cl)C=C1Cl OPGCOAPTHCZZIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 2
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- COYBRKAVBMYYSF-UHFFFAOYSA-N heptan-2-yl [(5-chloroquinolin-8-yl)oxy]acetate Chemical group C1=CN=C2C(OCC(=O)OC(C)CCCCC)=CC=C(Cl)C2=C1 COYBRKAVBMYYSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- ZNJFBWYDHIGLCU-HWKXXFMVSA-N jasmonic acid Chemical compound CC\C=C/C[C@@H]1[C@@H](CC(O)=O)CCC1=O ZNJFBWYDHIGLCU-HWKXXFMVSA-N 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- 229940127073 nucleoside analogue Drugs 0.000 description 2
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 2
- 239000003039 volatile agent Substances 0.000 description 2
- PYKLUAIDKVVEOS-RAXLEYEMSA-N (e)-n-(cyanomethoxy)benzenecarboximidoyl cyanide Chemical compound N#CCO\N=C(\C#N)C1=CC=CC=C1 PYKLUAIDKVVEOS-RAXLEYEMSA-N 0.000 description 1
- XHSQDZXAVJRBMX-UHFFFAOYSA-N 2-(5,6-dichlorobenzimidazol-1-yl)-5-(hydroxymethyl)oxolane-3,4-diol Chemical compound OC1C(O)C(CO)OC1N1C2=CC(Cl)=C(Cl)C=C2N=C1 XHSQDZXAVJRBMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 102100033806 Alpha-protein kinase 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710082399 Alpha-protein kinase 3 Proteins 0.000 description 1
- 108091023043 Alu Element Proteins 0.000 description 1
- 101100054772 Arabidopsis thaliana ACT2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100062776 Arabidopsis thaliana DCL3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100080549 Arabidopsis thaliana NRPB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 235000017166 Bambusa arundinacea Nutrition 0.000 description 1
- 235000017491 Bambusa tulda Nutrition 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000123650 Botrytis cinerea Species 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 108020004998 Chloroplast DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000037088 Chromosome Breakage Diseases 0.000 description 1
- PYKLUAIDKVVEOS-UHFFFAOYSA-N Cyometrinil Chemical compound N#CCON=C(C#N)C1=CC=CC=C1 PYKLUAIDKVVEOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000012650 DNA demethylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940045805 DNA demethylating agent Drugs 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- YRMLFORXOOIJDR-UHFFFAOYSA-N Dichlormid Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N(CC=C)CC=C YRMLFORXOOIJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- GMBRUAIJEFRHFQ-UHFFFAOYSA-N Fenchlorazole-ethyl Chemical compound N1=C(C(=O)OCC)N=C(C(Cl)(Cl)Cl)N1C1=CC=C(Cl)C=C1Cl GMBRUAIJEFRHFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010558 Gene Alterations Effects 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 241000255967 Helicoverpa zea Species 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101000980673 Homo sapiens Multicilin Proteins 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 241001344131 Magnaporthe grisea Species 0.000 description 1
- 241000535824 Mastacembelocleidus bam Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101000940870 Mus musculus Endonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 description 1
- 241001508464 Orobanche Species 0.000 description 1
- 240000007019 Oxalis corniculata Species 0.000 description 1
- 244000082204 Phyllostachys viridis Species 0.000 description 1
- 235000015334 Phyllostachys viridis Nutrition 0.000 description 1
- 241000233622 Phytophthora infestans Species 0.000 description 1
- ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N PicoGreen Chemical compound CN(C)CCCN(CCCN(C)C)C1=CC(=CC2=[N+](C3=CC=CC=C3S2)C)C2=CC=CC=C2N1C1=CC=CC=C1 ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 1
- 241000221300 Puccinia Species 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 description 1
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 1
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000016010 Tomato spotted wilt orthotospovirus Species 0.000 description 1
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 description 1
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 description 1
- DFBIRQPKNDILPW-CIVMWXNOSA-N Triptolide Chemical compound O=C1OCC([C@@H]2C3)=C1CC[C@]2(C)[C@]12O[C@H]1[C@@H]1O[C@]1(C(C)C)[C@@H](O)[C@]21[C@H]3O1 DFBIRQPKNDILPW-CIVMWXNOSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000204362 Xylella fastidiosa Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- UELITFHSCLAHKR-UHFFFAOYSA-N acibenzolar-S-methyl Chemical compound CSC(=O)C1=CC=CC2=C1SN=N2 UELITFHSCLAHKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- BIIVYFLTOXDAOV-YVEFUNNKSA-N alvocidib Chemical compound O[C@@H]1CN(C)CC[C@@H]1C1=C(O)C=C(O)C2=C1OC(C=1C(=CC=CC=1)Cl)=CC2=O BIIVYFLTOXDAOV-YVEFUNNKSA-N 0.000 description 1
- 229950010817 alvocidib Drugs 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011425 bamboo Substances 0.000 description 1
- XMQFTWRPUQYINF-UHFFFAOYSA-N bensulfuron-methyl Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1CS(=O)(=O)NC(=O)NC1=NC(OC)=CC(OC)=N1 XMQFTWRPUQYINF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MKQSWTQPLLCSOB-UHFFFAOYSA-N benzyl 2-chloro-4-(trifluoromethyl)-1,3-thiazole-5-carboxylate Chemical compound N1=C(Cl)SC(C(=O)OCC=2C=CC=CC=2)=C1C(F)(F)F MKQSWTQPLLCSOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N desoxyabscisic acid Natural products OC(=O)C=C(C)C=CC1C(C)=CC(=O)CC1(C)C FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JSYGRUBHOCKMGQ-UHFFFAOYSA-N dichloramine Chemical compound ClNCl JSYGRUBHOCKMGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000004049 epigenetic modification Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZNJFBWYDHIGLCU-UHFFFAOYSA-N jasmonic acid Natural products CCC=CCC1C(CC(O)=O)CCC1=O ZNJFBWYDHIGLCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001483 mobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 231100000243 mutagenic effect Toxicity 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940049964 oleate Drugs 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011458 pharmacological treatment Methods 0.000 description 1
- 230000008659 phytopathology Effects 0.000 description 1
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 1
- 239000003880 polar aprotic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001012 protector Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 1
- 235000007586 terpenes Nutrition 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000018412 transposition, RNA-mediated Effects 0.000 description 1
- YKUJZZHGTWVWHA-UHFFFAOYSA-N triptolide Natural products COC12CC3OC3(C(C)C)C(O)C14OC4CC5C6=C(CCC25C)C(=O)OC6 YKUJZZHGTWVWHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H3/00—Processes for modifying phenotypes, e.g. symbiosis with bacteria
- A01H3/04—Processes for modifying phenotypes, e.g. symbiosis with bacteria by treatment with chemicals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
- A01H1/06—Processes for producing mutations, e.g. treatment with chemicals or with radiation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
- A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
- A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
- A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
- A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Botany (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Se proporciona un método para la movilización de un elemento transponible. El método comprende los pasos de a) proporcionar un inhibidor de la metilación del ADN y/o un inhibidor de la transcripción yb) poner en contacto el inhibidor o inhibidores con una célula que comprende elementos transponibles inactivados, produciendo una célula con elementos transponibles movilizados. En un segundo aspecto de la invención, se proporciona un método para aumentar la variación genética y/o epigenética en una pluralidad de organismos eucariotas. El método comprende los pasos de i. proporcionar un inhibidor de la metilación del ADN y/o un inhibidor de la transcripción, ii. poner en contacto el organismo con el(los) inhibidor(es) y iii. propagar el organismo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Movilización de elementos transponibles para mejorar variabilidad genética y epigenética en una población
Campo de la invención
[0001] La presente invención se refiere a la movilización de elementos transponibles y sus usos relacionados.
Antecedentes de la invención
[0002] Los elementos transponibles (ET) fueron descubiertos inicialmente a principios de la década de 1950 por Barbara McClintock debido a su actividad mutagénica que podría influir en la pigmentación del grano (variegación) en el maíz (McClintock, PNAS, 195036(6):344-55). Desde su descubrimiento inicial, se han atribuido numerosas funciones a los ET. De hecho, los ET ahora tienden a verse como herramientas moleculares naturales que pueden remodelar el genoma (Bire et al., Methods Mol Biol, 2012; 859: 1-28). Se ha identificado que los ET desempeñan funciones importantes (si no principales) en la estructuración de los genomas del huésped; especialmente las regiones centroméricas son ricas en ET. Se ha encontrado que el número de copias de los retrotransposones de repeticiones terminales largas (RTL) se correlaciona fuertemente con el tamaño del genoma del huésped y la movilización de los ET puede tener un impacto en la organización del genoma al inducir la rotura del cromosoma e influir en la recombinación homóloga. A nivel genético, los ET pueden tener múltiples efectos: causar mutaciones al insertarse directamente en los genes, mover genes dentro del genoma, duplicar y/o crear genes nuevos, regular la expresión génica, crear vías reguladoras novedosas y poner los genes bajo control epigenético. Actualmente, los ET se consideran un mutágeno que puede acentuar el resultado positivo de la mutagénesis en el huésped (Bennetzen et al, Annu Rev Plant Biol, 2014, 65:505-30).
[0003] Los ET han demostrado ser herramientas genéticas muy útiles y se han explotado ampliamente para la alteración y transgénesis de genes en una amplia variedad de organismos. Sin embargo, debido a que, naturalmente, los ET rara vez se activan en condiciones normales de crecimiento, actualmente solo se conocen unos pocos ET activos. Por lo tanto, solo un número muy limitado de ET se está utilizando activamente para la modificación genética. Algunos ejemplos incluyen elementos P (Drosophila), PiggyBac (insectos, líneas celulares humanas), elementos L1 LINE (ratón), Mariner (vertebrados), SleepingBeauty (animales). Para crear diversidad genética, estos ET se introducen en los organismos de interés a través de la transgénesis. Sin embargo, esto limita el uso de organismos modificados de esta manera porque son considerados como organismos genéticamente modificados (OGM) por la legislación vigente.
[0004] En plantas, se ha demostrado que la movilidad de los elementos transponibles está limitada por la metilación del Ad N y ciertas marcas de histonas (Miura et al., Nature, 2001, 411(6834):212-4; Mirouze et al., Nature, 2009, 461(7262):427-30). Por lo tanto, la supresión de la metilación del ADN en mutantes genéticos puede dar como resultado la movilización de elementos transponibles. También se demostró que los fármacos que reducen la metilación del ADN (p. ej., 5-aza-2'-desoxicitidina) pueden movilizar ciertos ET de ADN (Scortecci et al., Plant Cell Physiol, 1997, 38(3):336-43). Además, se ha informado que el estrés en plantas defectuosas en la metilación del ADN dirigida por ARN (RdDM) activa elementos transponibles (Ito, H. et al., Nature, 2011, 472: 115-19). Sin embargo, el requerimiento de mutantes genéticos en componentes implicados en la defensa frente a ET está limitando la posibilidad de activar ET en organismos no modelo u organismos de difícil transformación. Por lo tanto, la explotación de ET endógenos para obtener diversidad genética y epigenética es actualmente muy limitada.
[0005] En condiciones normales de crecimiento, los ET se movilizan muy raramente y los diferentes tratamientos para activar los ET han sido hasta ahora muy ineficaces en eucariotas. Se ha demostrado que los tratamientos con fármacos que reducen los niveles de metilación del ADN genómico permiten una activación leve de los ET (Baubec, T. et al., Plant J, 200957:542-54), pero sin dar lugar a nuevas inserciones de esos ET. Se ha demostrado en plantas que las mutaciones en factores implicados en la vía de metilación del ADN dirigida por ARN podrían movilizar ET con una frecuencia elevada. Una limitación importante de estos enfoques es que son ineficaces (tratamiento farmacológico mencionado anteriormente) o requieren mutaciones genéticas que son difíciles de obtener, especialmente en organismos que no son modelo. Por tanto, estos problemas técnicos limitan el uso y el estudio de los elementos transponibles en la mayoría de los organismos.
[0006] Varshney et al. (Nature Communications 2015. vol 6, página 6569) investigan la transcripción de transposones SlNE (elementos Alu en células humanas o B1 y B2 en células de roedores). Las células se tratan con a-amanitina, caetocina (un inhibidor de la metilación de histona-H5K9) o 5-azacitidina (un inhibidor de la metilación del ADN).
[0007] Baubec et al. (The Plant Journal 2009. vol 57, n° 3, páginas 542-554) muestran una mayor transcripción de elementos transponibles en Arabidopsis tras el tratamiento con zebularina.
[0008] Cavrak et al. (Plos Genetics 2014. vol 10, n° 1, page e1004115) explotan el mecanismo de transcripción ONSEN en Arabidopsis. ONSEN tiene un elemento sensible al calor y, tras el estrés por calor, se observa un aumento de la transcripción. En los mutantes de la metilación del ADN, la transcripción de ONSEN no aumenta en comparación con el tipo salvaje, si no se aplica estrés por calor adicional.
[0009] Matsunaga et al. (Plant and Cell Physiology 2011. vol 53, n° 5, páginas 824-833) investigan la activación de ONSEN
tras el estrés por calor. Se observa que la activación de ONSEN ante el estrés por calor es mayor en las plantas descendientes, si las plantas parentales también estuvieron sometidas a estrés por calor.
[0010] El problema que subyace a la presente invención es proporcionar los medios para la movilización eficiente de elementos transponibles. Este problema se resuelve mediante el objeto de las reivindicaciones independientes.
Descripción específica de la invención
[0011] Los inventores proporcionan aquí un tratamiento basado en fármacos que puede movilizar elementos transponibles en plantas Además, la combinación de este tratamiento con estrés conduce a la movilización de ET específicos que responden a este estrés particular. El tratamiento conduce a una alta acumulación de ADN extracromosómico de los ET activados en el organismo tratado. Además, la progenie del organismo tratado muestra una integración estable de un alto número de copias de ET en el genoma y una mayor resistencia al estrés que forma parte del tratamiento. Por lo tanto, el método de la invención supera la necesidad de mutaciones genéticas para inactivar la defensa ET, permitiendo así que los elementos transponibles se activen eficazmente en prácticamente cualquier eucariota. Esta invención permite la inducción de cambios mediados por ET en el tamaño y la estructura del genoma, la modulación de la expresión génica endógena, la transduplicación génica, la heterosis, la recombinación homóloga y la adaptación al estrés. Además, esta invención permite la identificación de nuevos ET funcionales.
[0012] Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un método para la movilización de un elemento transponible, particularmente dentro del genoma, de una célula vegetal. El método comprende:
a) proporcionar una célula vegetal que comprende uno o varios elementos transponibles latentes, es decir, inactivos, y
b) poner en contacto la(s) célula(s) con un inhibidor de la transcripción, y poner en contacto la célula adicionalmente con un inhibidor de la metilación del ADN,
c) exponer dicha célula vegetal a un estrés abiótico, estrés biótico o estrés químico,
d) aislar dicha célula vegetal y determinar si un fenotipo de dicha célula ha cambiado
dando así una célula vegetal con uno o varios elementos transponibles movilizados.
[0013] En el contexto de la presente especificación, los términos elemento transponible o transposones se utilizan en su significado conocido en la técnica de la genética molecular; se refieren a secuencias de ADN en el genoma de un organismo que pueden cambiar su posición dentro del genoma (mecanismo de cortar y pegar) o ser capaces de producir nuevas copias de sí mismas que se integran en el genoma (mecanismo de copiar y pegar). La transposición puede dar como resultado la multiplicación del elemento, lo que influye en el tamaño del genoma. Hay dos clases de transposones, los transposones de clase 1, también denominados retrotransposones, y los transposones de clase 2, también denominados transposones de ADN. Los retrotransposones se transcriben primero en ARN mediante el aparato molecular provisto por la célula huésped y luego se transcriben de manera inversa en una copia de ADN de doble cadena del ARN, denominado ADN complementario (ADNc), antes de que se inserten en una nueva posición en el genoma. Comparten algunas características como la dependencia de una transcriptasa inversa con los retrovirus. Los transposones de ADN no tienen un intermediario de ARN y son transferidos a su nueva posición en el genoma por una transposasa. La mayoría de los transposones en el genoma están inactivos y no se duplicarán ni cambiarán de posición. Por lo tanto, la activación de transposones también se denomina movilización de transposones. En la Tabla 1 se proporcionan ejemplos de transposones que responden a ciertas tensiones. Estos transposones son activados por la tensión indicada hasta cierto grado. Sin embargo, el uso del método de la invención moviliza estos transposones en un grado mucho mayor, como puede verse en los ejemplos proporcionados.
[0014] En ciertas formas de realización de cualquier aspecto de la invención, se moviliza un transposón de clase 1.
[0015] En ciertas formas de realización de cualquier aspecto de la invención, se moviliza un transposón de clase 2.
[0016] En el contexto de la presente especificación, el término metilación del ADN se usa en su significado conocido en la técnica de la biología molecular y la genética molecular; se refiere a la adición de grupos metilo al ADN, que en los eucariotas ocurre principalmente en las citosinas. La metilación del ADN es catalizada por ADN metiltransferasas (DNMT) y se puede dividir en metilación de mantenimiento, que es necesaria para transferir patrones de metilación en cadenas de a Dn recién sintetizadas, y metilación de novo. La metilación del ADN está asociada con la inactivación de la expresión génica y el silenciamiento de los transposones. La metilación del ADN puede transmitirse a las siguientes generaciones y, por lo tanto, representa una forma común de modificación epigenética.
Tabla 1: Ejemplos de transposones
[0017] En ciertas formas de realización, el inhibidor de la metilación del ADN es un compuesto exógeno.
[0018] En ciertas formas de realización, el inhibidor de la transcripción es un compuesto exógeno.
[0019] En ciertas formas de realización, el compuesto exógeno es un compuesto de molécula pequeña que tiene una masa molecular de < 1000u, particularmente < 920u.
[0020] En el contexto de la presente especificación, el término compuesto exógeno se refiere a moléculas que no están presentes en la célula en condiciones fisiológicas a menos que se agreguen técnicamente.
[0021] En ciertas formas de realización, el inhibidor de la metilación del ADN podría estar presente en al menos algunas de las células en al menos algunas condiciones fisiológicas particulares en cantidades mínimas, pero se agrega en el método de la invención en concentraciones mucho más altas para ejercer un efecto significativo. impacto en la fisiología celular. Para conseguirlo, el compuesto está presente en el medio celular a una concentración que se selecciona como mínimo 10 veces superior a la concentración del inhibidor de la metilación del ADN que se encuentra en el interior de la célula.
[0022] En determinadas formas de realización, el inhibidor de la transcripción está presente en la célula en condiciones fisiológicas y presente en un medio a una concentración que se selecciona para ser al menos 10 veces, 100 veces, 1000 veces o incluso 10.000 veces mayor que la concentración del inhibidor de la transcripción que se encuentra en el interior de la célula.
[0023] En el contexto de la presente especificación, el término estrés abiótico se refiere al impacto negativo de factores no vivos sobre un organismo vivo en un entorno específico. La variable no viva influye en el medio ambiente más allá de su rango normal de variación. Ejemplos no limitantes de estrés abiótico son calor, frío, sequía, sumersión/exceso de agua, viento, radiación ultravioleta, radiación nuclear, salinidad, metales pesados, pH del suelo, cultivo de tejidos y falta de fósforo, nitrógeno, luz, CO2 etc. En contraste, el término estrés biótico se refiere al impacto negativo de hongos, bacterias, virus, insectos, heridas por herbívoros y competencia biológica, etc.
[0024] El término estrés químico se refiere al impacto negativo de sustancias químicas ("factores de estrés”) en un organismo vivo. Estas sustancias también pueden comprender sustancias que imitan el estrés sustancias que imitan un estrés abiótico o biótico. Ejemplos no limitantes de factores químicos estresantes son herbicidas, protectores de herbicidas, insecticidas, fungicidas, metabolitos secundarios de plantas, compuestos sintéticos o naturales que inducen la defensa de las plantas.
[0025] El término protector de herbicidas se refiere a un compuesto que protege selectivamente las plantas monocotiledóneas del daño de los herbicidas mientras que las plantas dicotiledóneas todavía se ven afectadas por los herbicidas. Las plantas de cultivo comunes como el arroz, el trigo, el maíz, etc., pero también la hierba forrajera, la caña de azúcar y el bambú, son plantas monocotiledóneas, mientras que la mayoría de las especies de malas hierbas son plantas dicotiledóneas. Los protectores de herbicidas se pueden aplicar como aderezo para las semillas antes de la siembra, para preparar el suelo de la agricultura o se pueden aplicar a las láminas de las plantas cultivadas. En los dos últimos casos, se pueden aplicar protectores de herbicidas junto con los herbicidas. Ejemplos de protectores de herbicidas comunes son: Benoxacor (CAS 98730-04-2), Cloquintocet-mexilo (CAS 99607-70-2), Ciometrinilo (CAS 63278-33-1), Diclormida (CAS 37764-25-3), Fenclorazoletilo (CAS 103112-35-2), Fenclorim (CAS 3740-92-9), Flurazol (CAS 72850-64 7), Fluxofenim (CAS 88485-37-4), Furilazol (CAS 121776-33-8), Mefenpir-dietilo (CAS 135590-91-9), MG 191 (CAS 96420-72-3), anhídrido naftálico (CAS 81-84-5), MON-13900 (CAS 121776-33-8), LAB 145138 (CAS 79260-71-2) y Oxabetrinilo (CAS 74782-23-3).
[0026] En ciertas formas de realización, el elemento transponible es un retrotransposón.
[0027] En ciertas formas de realización, la célula vegetal es una célula de Arabidopsis, particularmente Arabidopsis thaliana.
[0028] En ciertas formas de realización, la célula vegetal es parte de plantas de cultivo, particularmente de la familia Poaceae que comprende plantas tales como arroz, caña de azúcar, maíz, trigo, centeno, cebada, avena o mijo.
[0029] En ciertas formas de realización, la célula vegetal es parte de una planta, y después de la exposición de la célula al paso c), la célula se cultiva para producir un organismo multicelular y se determina el fenotipo de la planta.
[0030] En determinadas formas de realización, el fenotipo del organismo comprende determinar la resistencia al factor estresante, en donde el factor estresante provoca el estrés aplicado en el paso c).
[0031] En ciertas formas de realización, la resistencia al estresor que causa el estrés aplicado en el paso c) se incrementa después de la aplicación del método de la invención.
[0032] También se describe un método para aumentar la variación genética y/o epigenética en una población de plantas. El método comprende:
i. proporcionar una planta,
ii. poner en contacto la planta con
o un inhibidor de la metilación del ADN, y/o
o un inhibidor de la transcripción,
iii. propagar la planta, dando lugar a la población de plantas con mayor variación genética y/o epigenética.
[0033] El método moviliza elementos transponibles latentes, es decir, inactivos, no transcritos actualmente o transcritos inversamente, dentro del organismo eucariótico. Dado que, según el conocimiento de los inventores, todos los organismos eucariotas comprenden elementos transponibles latentes dentro de su genoma, el elemento "organismo eucariota" es sinónimo de "organismo eucariota que comprende un elemento transponible latente".
[0034] También se describe que el método comprende adicionalmente un paso ii.a, que sigue al paso ii.: ii.a exponer el organismo eucariótico a un estrés abiótico, estrés biótico o estrés químico.
[0035] En ciertas formas de realización, el inhibidor de la metilación del ADN y/o el inhibidor de la transcripción se proporcionan como una solución en un solvente polar, en particular un solvente aprótico polar, más particularmente sulfóxido de dimetilo (DMSO).
[0036] En determinadas formas de realización, el inhibidor de la metilación del ADN y/o el inhibidor de la transcripción se proporcionan como una solución en un disolvente polar, en particular agua.
[0037] También se describe que el método comprende el paso subsiguiente iv. que comprende:
a. Determinar cualquier cambio genético y/o epigenético o
b. Determinar cualquier cambio en el fenotipo, particularmente la resistencia a cualesquiera factores estresantes aplicados en el paso ii.a
en donde estos cambios se determinan en las plantas constituyentes individuales o para una muestra representativa de la población de plantas, o para todas las plantas constituyentes de la población.
[0038] En ciertas formas de realización del primer aspecto de la invención, el estrés abiótico se selecciona de calor, frío, sequía, inmersión/exceso de agua, viento, radiación UV, radiación nuclear, salinidad, metales pesados, pH del suelo, cultivo de tejidos cultivo y privación de fósforo, nitrógeno, luz o CO2.
[0039] En ciertas formas de realización del primer aspecto de la invención, el estrés biótico se selecciona del impacto negativo de hongos, bacterias, virus, insectos, heridas por herbívoros y competencia biológica. Ejemplos no limitativos de hongos que tienen un impacto negativo serían Phytophthora infestans (añublo de la patata) y Magnaporthe grisea (añublo del arroz). Ejemplos no limitantes de bacterias que tienen un impacto negativo son Botrytis cinerea (moho gris), Xylella fastidiosa (síndrome de declive rápido de la aceituna) y Puccinia spp. (roya del trigo). Ejemplos no limitantes de virus que tienen un impacto negativo son el virus del mosaico del tabaco y el virus del marchitamiento manchado del tomate. Ejemplos no limitantes de insectos que tienen un impacto negativo son Mamestra brassicae (polilla de la col), Helicoverpa zea (gusano del maíz) y Ostrinia nubilalis (barrenador europeo del maíz). Ejemplos no limitativos de otros organismos que pueden tener un impacto negativo debido a la competencia biológica son Orobanche y Ambrosia trífida (ambrosía gigante).
[0040] En ciertas formas de realización del primer aspecto de la invención, el estrés químico se selecciona de herbicidas,
protectores de herbicidas, insecticidas, fungicidas, metabolitos secundarios de plantas, compuestos sintéticos o naturales que inducen la defensa de las plantas. Ejemplos no limitantes de compuestos que inducen la defensa de las plantas son la flagelina (compuesto natural, inductor bacteriano; Felix et al., 1999, Plant J.), una secuencia de 22 aminoácidos de la parte N-terminal conservada de la flagelina (flg22), ácido salicílico y análogos, por ejemplo, Bion® (compuesto natural con análogos sintéticos; (Vlot et al., 2009, Annu. Rev. Phytopathol.; Friedrich et al., 1996, Plant J.)), ácido jasmónico y éster metílico jasmónico (natural compuestos; Cohen et al., 1993, Phytopathology), etileno (compuesto natural; van Loon et al., 2006, Trends Plant Sci.), ácido abscísico (compuesto natural; Mauch-Mani y Mauch, 2005, Curr. Opin. Plant Biol.) y volátiles como terpenos y volátiles de hojas verdes (compuestos naturales; revisado por Unsicker et al., 2009, Curr Opin Plant Biol).
[0041] En ciertas formas de realización del primer aspecto de la invención, el inhibidor de la metilación del ADN es un análogo de nucleósido.
[0042] En ciertas formas de realización del primer aspecto de la invención, el inhibidor de la metilación del ADN se selecciona de 5-azacitidina, 5-aza-2'-desoxicitidina, 5-fluoro-2'-desoxicitidina, 5,6-dihidro-5-azacitidina y zebularina.
[0043] En ciertas formas de realización del primer aspecto de la invención, el inhibidor de la transcripción es un inhibidor de la ARN polimerasa, en particular un inhibidor de la ARN polimerasa II, un inhibidor de la ARN polimerasa IV o un inhibidor de la ARN polimerasa V, más particularmente un inhibidor de la ARN polimerasa II.
[0044] En ciertas formas de realización del primer aspecto de la invención, el inhibidor de la ARN polimerasa II se selecciona de
- amatoxinas, en particular alfa-amanitina (CAS 23109-05-9),
- derivados de amatoxinas, en particular oleato de alfa-amanitina,
- análogos de nucleósidos, en particular 5,6-dicloro-1-beta-D-ribofuranosilbencimidazol (DRB; CAS 53-85-0), - actinomicina D (CAS 50-76-0),
- flavopiridol (CAS 146426-40-6),
- triptolida (CAS 38748-32-2).
[0045] En ciertas formas de realización de cualquier aspecto de la invención descrita en el presente documento, la amatoxina, en particular la alfaamanitina, se usa con una concentración de 0,0005 pg/ml a 50 pg/ml, en particular de 0,001 |jg/ml a 25 mg/mL, más particularmente de 0,005 pg/ml a 20 pg/ml, aún más particularmente de 0,005 pg/ml a 5 pg/ml.
[0046] En ciertas formas de realización de cualquier aspecto de la invención descrita en el presente documento, el inhibidor de la metilación del ADN, en particular la zebularina, se usa a una concentración de 5 pM a 100 pM, en particular de 10 pM a 80 pM, más particular de 10 pM a 40 pM, incluso más particularmente de 20 pM a 40 pM. También se describe que la mayor variación genética y/o epigenética en una pluralidad de plantas da como resultado una mayor resistencia de la planta al estrés abiótico o biótico las plantas han estado expuestas. En otras palabras, el aumento de la variación genética y/o epigenética no es aleatorio como, por ejemplo, se esperaría de un mutágeno químico. El aumento está dirigido hacia la resistencia contra el estrés utilizado en el método. Por ejemplo, el uso del calor de estrés abiótico daría como resultado preferentemente organismos resistentes al calor. Sin desear limitarse a la teoría, los inventores asumen que los transposones se integran preferentemente en el genoma en la vecindad de los genes, creando así nuevas rutas reguladoras de genes que pueden responder al estrés aplicado previamente. Esto puede conducir a una variedad genética en los genes activados por el estrés respectivo y, por lo tanto, confiere una mayor resistencia al estrés respectivo.
[0047] También se describe el uso de una composición en un método según el primer aspecto de la invención. La composición comprende un inhibidor de la metilación del ADN y un inhibidor de la transcripción.
[0048] En ciertas formas de realización de cualquiera de los aspectos de la invención descrita en el presente documento, la relación de las concentraciones molares del inhibidor de la transcripción, en particular alfa-amanitina, al inhibidor de la metilación del ADN, en particular zebularina, es de 0,000005 a 11, más particular 0,000125 a 2, aún más particular 0,000125 a 0,125.
[0049] En ciertas formas de realización, la relación de la concentración molar depende de las concentraciones a y b, que son las siguientes:
a) el inhibidor de la metilación del ADN, en particular la zebularina, se usa a una concentración de 5 pM a 100 pM, en particular de 10 pM a 80 pM, más en particular de 10 pM a 40 pM, aún más en particular de 20 pM a 40 pM
b) la amatoxina, en particular alfa-amanitina, se usa en una concentración de 0,0005 pg/ml a 50 pg/ml, en particular 0,001 pg/ml a 25 pg/ml, más particularmente 0,005 pg/ml a 20 pg/ml, aún más particularmente 0,005 pg/ml a 5 pg/ml.
[0050] También se describe un juego de piezas para uso en el método según el primer aspecto de la invención. El kit de piezas comprende un inhibidor de la metilación del ADN y un inhibidor de la transcripción.
[0051] Siempre que las alternativas para características individuales separables, como, por ejemplo, un tipo de inhibidor u organismo, se presenten como "formas de realización", debe entenderse que dichas alternativas pueden combinarse libremente para formar formas de realización discretas de la invención descrita aquí.
[0052] La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos y figuras, a partir de los cuales se pueden extraer otras formas de realización y ventajas. Estos ejemplos pretenden ilustrar la invención pero no limitar su alcance.
Breve descripción de las figuras
[0053]
La figura 1 muestra la acumulación de ADN extracromosómico de ONSEN tras el tratamiento farmacológico y el estrés por calor. (a) Acumulación de ADN ONSEN medida por qPCR directamente después del tratamiento con estrés de control (CS) y estrés por calor (HS) en plantas de tipo salvaje (WT) y nrpb2-3 y tratamientos con alfaamanitina (A, 5 jg/m l) o cebularina (Z, 10 j M) (media ± s.e.m., n=6 repeticiones biológicas, valores relativos a Actina2). (b) Número de copias ONSEN medido por PCR cuantitativa (qPCR) en plántulas de Columbia (Col) WT directamente después del estrés de control (CS; 24h 6°C), estrés por calor (Hs ; 24h 6°C y 24h 37°C) y un tratamiento con A (5 jg/ml), Z (40 j M) o una combinación de los mismos (A&Z). (Media ± s.e.m., n= 3 repeticiones biológicas). El tratamiento doble (A y Z) conduce a una activación de ONSEN dependiente del estrés por calor muy fuerte que da como resultado hasta 700 copias extracromosómicas de ADN de ONSEN.
La figura 2 muestra la dependencia del estrés de la movilización ONSEN. El gráfico muestra el número de copias de ONSEN en plántulas de A. thaliana después del tratamiento químico con A (5 jg/ml), Z (40 j M), las combinaciones de A y Z (A&Z) en plantas WT, nrpb2-3 y nrpdl siguiendo el CS. Número de copias de ONSEN medido por qPCR (sem medio, n=3 réplicas biológicas, valores relativos a Actina2). Este resultado muestra que la producción de ADN extracromosómico ONSEN depende del estrés por calor.
La figura 3 muestra que la inhibición simultánea de metiltransferasas y Pol II imita al mutante nrpdl. (a) Análisis de metilación asimétrica de ONSEN RTL y soloLTR en plántulas no tratadas y A (5 jg/ml), Z (40 j M) o tratadas con A y Z de WT y el mutante nrpdl después de CS. Productos de PCR obtenidos a partir de ADN genómico que se utilizó sin digerir (entrada) o después de la digestión con la enzima de restricción Ddel sensible a la metilación de CHH. Actina2 se incluye como control para la digestión completa de Ddel. El tratamiento doble A&Z con A (5 jg/m l) y Z (40 j M) dio como resultado una reducción muy fuerte de la metilación del ADN en ONSEN y soloLTR comparable con el mutante nrpdl. (b) Transferencia Northern que indica la transcripción ONSEN directamente después de CS, HS y HS más el tratamiento con A (5 jg/ml), Z (40 j M) o una combinación de A y Z en plantas WT y nrpd1. Se muestra un gel de agarosa teñido con Midori como control de carga. El nivel de la transcripción ONSEN de longitud completa después del estrés por calor y el doble tratamiento con A (5 jg/m l) y Z (40 j M) es comparable al mutante nrpd1. (c) Acumulación de ADN ONSEN medido por qPCR en plántulas de plantas WT, rdr6, dcl2/3/4 y nrpd1 directamente después de CS, HS y HS más tratamiento con A, Z o una combinación de A&Z. Este resultado muestra que la RNA pol II es activa aguas arriba de las enzimas similares a DICER.
La figura 4 muestra la movilización de ONSEN inducida por fármacos en plantas de Arabidopsis de tipo salvaje. (a) Visualización de transposones que confirma nuevas inserciones de ONSEN en la generación F2 de Hs (control HS) y plantas WT tratadas con HS y A (5 jg/m l) y Z (40 j M) (HS+A&Z). Las copias ONSEN integradas se midieron mediante qPCR (parte superior) y se detectaron mediante visualización de transposones (parte inferior). Se representan los números de copia de ONSEN de siete plantas individuales no relacionadas seleccionadas. Los números de copias superiores a ocho medidos por qPCR (parte superior) y las bandas adicionales observadas en la pantalla de transposones (parte inferior) en las plantas Col WT tratadas con HS+A&Z indican nuevas inserciones de copias ONSEN adicionales. M es un marcador de tamaño de 1kb. (b), número de copias de ONSEN en la generación F1, F2 y F3 medido por qPCR (n=3 repeticiones técnicas, valores relativos a Actina2) números de copias >8 en las líneas 1-7 indican inserciones de copias adicionales de ONSEN. c, y d, fotografías de plantas F2 que contienen nuevas inserciones de ONSEN que muestran una variabilidad fenotípica tanto homogénea como dependiente del estrés inducida por el tratamiento HS+A&Z cuando se cultivan en condiciones de días largos (c) y días cortos (d). Faltan los datos de qPCR para la generación F3 de la línea 6 en (b), así como las imágenes de los fenotipos en (c) y (d) debido a la infertilidad severa y la extinción de esta línea. Los ejemplos de fenotipos observados en líneas con nuevas inserciones de ONSEN (líneas 1 a 7) incluyen mayor biomasa en condiciones de días cortos (línea 3), floración temprana en condiciones de días largos (línea 7) y acumulación reducida de clorofila (línea 1). En resumen, este conjunto de datos muestra que el tratamiento A&Z conduce a una ráfaga eficiente de transposición ONSEN. Las nuevas inserciones de ONSEN se heredan de forma estable durante varias generaciones y provocan cambios fenotípicos.
La figura 5 muestra el aumento en el número de copias de ONSEN en grupos F1 de plantas tratadas y estresadas por calor. Las plantas parentales se trataron y sometieron a estrés térmico en experimentos independientes (caracteres a-c) con una combinación de A (5 jg/m l) y Z (40 j M). Los grupos con números de copias ONSEN
significativamente aumentados (>10) se resaltan en gris oscuro. Número de copias ONSEN medido por qPCR (media ± s.e.m., n=3 repeticiones técnicas, valores relativos a Actina2). Aproximadamente el 29,4% de los grupos F1 probados de plantas de tipo salvaje tratadas con A+Z y estresadas por calor mostraron un número de copias ONSEN significativamente mayor.
La figura 6 muestra un resumen de inserciones de ONSEN novedosas confirmadas. (a) Amplia distribución del genoma y (b) Primer plano de regiones con nuevas inserciones ONSEN en la generación f2 de una planta WT seleccionada tratada con HS+A&Z (línea N° 3). La orientación de las inserciones de ONSEN se indica mediante flechas centrales.
La figura 7 muestra la activación inducida por fármacos del retrotransposón Houba en arroz (O. sativa). Análisis de mobiloma de ADN extraído de plántulas después del crecimiento en condiciones de control (C), A (5 pg/ml), Z (40 pM) y la combinación de A y Z. (a) Detalle de la profundidad de cobertura normalizada en comparación con la planta de control sin tratar obtenida después de alinear las lecturas secuenciadas en un elemento Houba. (b) Esquema de localización de cebadores (barra negra. Elemento Houba, flechas: cebadores de PCR, recuadro: RTL). (c) las formas circulares extracromosómicas de Houba se detectan específicamente en plantas tratadas con A y Z usando PCR inversa con los cebadores que se muestran en 4b. (d) La PCR específica en el ADN del cloroplasto circular se muestra como control de carga. El ADN total sometido a una amplificación de círculo rodante se usó como molde. Estos resultados demuestran la eficiente movilización dependiente de A&Z del transposón Houba en el arroz.
La figura 8 muestra una mayor tolerancia al calor en la generación F2 de plántulas de Arabidopsis tratadas. Tolerancia al estrés por calor repetitivo (42 °C) en la progenie F2 de plantas de tipo salvaje que solo tenían estrés por calor (control) o estrés por calor y se trataron con A (5 pg/ml) y Z (40 pM) (n° 1-3). (a) Se representan dos réplicas biológicas (I y II), (b) Porcentaje de plántulas vitales (Media ± s.e.m., n = 2 repeticiones biológicas). Las plántulas F2 que se originan de plantas estresadas por calor y tratadas con A&Z muestran una tolerancia al calor significativamente mayor (>60 % de plántulas vitales) en comparación con la F2 de una planta que solo sufrió estrés por calor (10 % de plántulas vitales). Esto demuestra que la movilización dependiente de A&Z de un transposón sensible al estrés por calor puede producir plantas que se adaptan mejor al estrés por calor.
La figura 9 muestra la acumulación dependiente de la dosis de ADN extracromosómico de ONSEN tras el tratamiento farmacológico y el estrés por calor. El número de copias de ONSEN se midió por qPCR en plántulas de Columbia (Col) de tipo salvaje directamente después del estrés de control (CS), el estrés por calor (HS) y un tratamiento con a-amanitina en diferentes concentraciones dadas en mg/ml. (Media ± s.e.m., n=3 repeticiones técnicas). Esto muestra que el número de transposones movilizados puede regularse por la cantidad de A utilizada para el tratamiento.
La figura 10 muestra los cambios epigenéticos en el nivel de metilación del ADN inducido por el tratamiento de células vegetales y humanas con A. (a) Gel de agarosa teñido con Midori que muestra una reducción de la metilación del ADN en el ONSEN RTL tras el tratamiento farmacológico y el estrés por calor en WT (Col) plántulas directamente después del estrés de control (CS; 24h 6°C), estrés por calor (HS; 24h 6°C y 24h 37°C) y un tratamiento con A (20 pg/ml), Z (10 pM) o una combinación de los mismos (A&Z). Se utilizó ADN no digerido como plantilla de PCR para el control de carga (entrada). La PCR en ADN digerido con Ddel muestra una reducción en la metilación del ADN después del tratamiento con A, Z o una combinación de A y Z. (b) Estado de metilación de CHH en ONSEN RTL evaluado mediante secuenciación de bisulfito realizada en plantas CS cultivadas en medio con o sin A. (c) Niveles de metilación de ADN LINE-1 evaluados en células cancerosas humanas A549 cultivadas en medio de control y medio suplementado con 0,5 pg/ml A. Esto muestra que A puede usarse como un potente agente de desmetilación del ADN en plantas y células humanas.
La figura 11 muestra la acumulación de ADN extracromosómico de ONSEN tras un tratamiento farmacológico y flagelino combinado. Número de copias ONSEN medido por PCR cuantitativa (qPCR) en plántulas de Col de tipo salvaje directamente después del estrés de control, 5 h después del tratamiento con flagelina (flg22) sola o en combinación con A (5 pg/ml), Z (40 pM) o una combinación de los mismos (A&Z). (Media ± s.e.m., n=3 repeticiones técnicas).
La figura 12 muestra la activación de ATCOPIA17 tras un tratamiento combinado farmacológico y con flagelina. El cambio de veces de ATCOPIA17 se midió mediante PCR cuantitativa (qPCR) en el ADN total en plántulas del tipo salvaje Col directamente después del estrés de control, 5 h después del tratamiento con flagelina (flg22) sola o en combinación con A (5 pg/ml), Z (40 pM) o una combinación de los mismos (A&Z). (Media ± s.e.m., n=3 repeticiones técnicas).
La figura 13 muestra la acumulación de ADN extracromosómico de ONSEN tras el tratamiento farmacológico y el estrés por calor. El número de copias ONSEN se midió mediante PCR cuantitativa (qPCR) en el ADN total en plántulas de WT directamente después del estrés de control (CS; 24h 6°C), estrés por calor (HS; 24h 6°C y 24h 37°C) y HS más tratamiento con alfa-aminitina (A, 20 pg/ml), zebularina (Z, 10 pM) y HS más la combinación de A&Z. Este resultado demuestra la solidez de los tratamientos independientemente de las concentraciones
relativas de A y Z.
Ejemplos
[0054] Los inventores han descubierto un método muy eficaz para activar y movilizar ET en eucariotas. El tratamiento involucra medicamentos que se dirigen a mecanismos eucariotas altamente conservados: metilación y transcripción del ADN.
Ejemplo 1
[0055] Con el fin de investigar el papel de Pol II en la movilidad de ET, los inventores eligieron el retrotransposón tipo copia ONSEN sensible al calor bien caracterizado (Ito, H. et al., Nature, 2011, 472: 115-119) de Arabidopsis. Los inventores probaron primero si las plantas deficientes en Pol II mostraban una actividad de ET mejorada. Para ello, los inventores aprovecharon el alelo mutante hipomórfico nrpb2-3 que acumula niveles reducidos de proteína NRPB2 (Zeng, B. et al., Genes Dev, 2009, 23: 2850-2860). Usando PCR en tiempo real, se determinó que desafiar las plántulas nrpb2-3 por estrés por calor (llamado HS aquí) conduce a un aumento leve en ONSEN ADNec en comparación con el tipo salvaje (Fig. 1a). Este resultado fue respaldado por el aumento observado en el ADNc de ONSEN después de la inactivación farmacológica de Pol II con 5 mg/ml de a-amanitina (llamada A aquí), un potente inhibidor de Pol II que no afecta a Pol IV ni a Pol V (Haag, JR et al., Mol Cell, 2012, 48: 811-818) (Fig. 1a,b). La transcripción por la ARN polimerasa II (Pol II) es inhibida por la a-amanitina, sus derivados u otros inhibidores de la Pol II. La inhibición global de la metilación del ADN se logra mediante tratamientos con zebularina o 5-aza-2'-desoxicitidina (y sus derivados). Con el fin de probar la interacción entre la represión mediada por Pol II de la activación de ET y la metilación del ADN, los inventores cultivaron plantas de tipo salvaje y nrpb2-3 en medios suplementados con cantidades moderadas de zebularina (llamado Z aquí, 40 pM para plantas de tipo salvaje, 10 pM para plantas nrpb2-3 para garantizar la viabilidad de las plántulas nrpb2-3), un inhibidor de las ADN metiltransferasas activas en las plantas (Baubec, T. et al., Plant J, 2009, 57: 542-554) y las envió a HS. La presencia de Z en el medio durante HS generalmente mejoró la producción de ONSEN ADNec. En particular, este aumento inducido en la acumulación de ADNec fue más claro en el fondo nrpb2-3 (Fig. 1a). Esto indicó que tanto la metilación del ADN como la actividad transcripcional de Pol II contribuyen a la represión de la producción de ADNc de ONSEN. Debido a que tanto la metilación del ADN como la Pol II pueden inhibirse específicamente mediante la adición de diferentes fármacos, los inventores probaron si el tratamiento de plantas de tipo salvaje con A y Z al mismo tiempo podría activar fuertemente e incluso movilizar ONSEN después de un tratamiento de estrés por calor. los Los inventores del documento cultivaron plántulas WT en medio MS suplementado con cada fármaco individualmente y ambos combinados. De acuerdo con la fuerte activación de ONSEN en plántulas nrpb 2-3 estresadas por calor y tratadas con Z, el tratamiento combinado (A+Z) de WT dio lugar a una muy alta (Fig. 1b) y dependiente de HS (Fig. 2) acumulación de ADNc de ONSEN comparable al mutante nrpdl (Fig. 3c).
Ejemplo 2
[0056] Con el fin de comprender mejor el efecto que tenían los fármacos a nivel del ADN subyacente al aumento de la activación de ONSEN después de la Hs , los inventores evaluaron cómo influyeron en la metilación del ADN en la repetición terminal larga (RTL) de un locus endógeno de ONSEN seleccionado. (AT1TE12295) y en un objetivo RdDM bien caracterizado no relacionado (soloLTR). El tratamiento de plantas con A o Z individualmente ya resultó en niveles reducidos de metilación de CHH en ONSEN RTL después de CS (Fig. 3a). La combinación de los dos fármacos conduce a una pérdida de metilación del ADN comparable a la del mutante nrpd1. La metilación del ADN en el soloLTR mostró una respuesta diferente a los tratamientos farmacológicos, ya que solo se observó una reducción en los niveles de metilación del ADN en plantas sometidas a un tratamiento combinado A y Z. A continuación, los inventores verificaron mediante Northern Blot si el grado de reducción en la metilación de CHH coincidiría con niveles aumentados de transcripción de ONSEN directamente después de HS. Los inventores encontraron que el tratamiento con Z solo ya dio como resultado los niveles de transcripción ONSEN más altos después de HS (Fig. 3b). A partir de esta observación, los inventores concluyeron que estos transcritos inducidos por Z adicionales no eran plantillas adecuadas para la producción de ADNc de ONSEN (compárense la Fig. 1 y la Fig. 3b).
[0057] En Drosophila, se ha demostrado que la transcripción antisentido mediada por Pol II da como resultado la producción de ARNsi derivados de ET de una manera dependiente de Dicer-2 (Russo, J. et al. Genetics, 2016, 202:107-21). Apoyando esta noción para Arabidopsis, una publicación reciente señaló la importancia de DCL3 en la regulación de ONSEN en el fondo ddm1 (Panda, K. et al. Genome Biol, 2016, 17:1-19). Para dilucidar si el efecto de la inhibición de Pol II también dependía de dicer, los inventores cultivaron tanto el mutante triple rdR6 como dcl2/3/4 (defectuoso en tres de las cuatro enzimas similares a dicer de plantas, DCL) en A, aplicaron HS y midió el ADNec de ONSEN. Los inventores descubrieron que A seguía potenciando la acumulación de ADNec en rdR6 mientras que la inhibición de Pol II no tenía ningún efecto en el mutante triple dcl2/3/4 (Fig. 3c). Este resultado respalda la noción de que Pol II actúa aguas arriba del paso de procesamiento catalizado por los DCL.
Ejemplo 3
[0058] La movilización de ET endógenos en plantas ha sido hasta ahora muy ineficaz, limitando así su uso en investigación básica y cultivo de plantas. No hemos observado previamente la transposición de ONSEN en plantas de tipo salvaje
tratadas con HS (Ito, H. et al. Nature, 2011, 472:115-119). Debido a que el tratamiento farmacológico A&Z dio como resultado una mayor acumulación de ADNc de ONSEN en un grado similar al de nrpdl, los inventores probaron si el tratamiento farmacológico combinado podría conducir a una movilización eficiente de ONSEN en plantas de tipo salvaje. En primer lugar, los inventores evaluaron mediante PCR en tiempo real si, y a qué frecuencias, podían detectarse nuevas copias de ONSEN en la progenie de plantas tratadas con A&Z y estresadas por calor. Los inventores encontraron nuevas inserciones de ONSEN en el 29,4 % de los grupos F1 probados (n = 51) con un número medio de copias de los grupos que alcanzaba hasta 52 (Fig. 5). A continuación, los inventores confirmaron las nuevas inserciones estables de ONSEN en un subconjunto de plantas individuales independientes de alto número de copias mediante visualización de transposones (Fig. 4a), PCR en tiempo real (Fig. 4b) y secuenciación de algunas inserciones en una línea seleccionada de alto número de
extracromosómicas similar al observado previamente en plantas deficientes en RdDM. Los inventores detectaron nuevas inserciones de ONSEN en la progenie del 27 % de las plantas tratadas. Según las mediciones de qPCR, se detectaron hasta 90 /-6 copias insertadas en plantas individuales en la F2 y generaciones sucesivas de plantas tratadas con A, Z y HS (Figura 4a). Estas inserciones fueron confirmadas además por visualización de transposones. Los inventores no observaron aumentos adicionales en el número de copias de ONSEN durante tres generaciones, lo que indica que las nuevas inserciones eran estables y que ONSEN ya no se transponía (Fig. 4b).
[0059] Las inserciones de ET pueden interrumpir genes o alterar su expresión mediante el reclutamiento de marcas epigenéticas o mediante la transcripción de lectura dependiente del estrés desde el 3'RTL en regiones flanqueantes (Lisch, D., Nat Rev Genet, 2013, 14: 49-61). Para probar esto, los inventores hicieron crecer la generación F2 de las líneas de alta copia seleccionadas antes mencionadas en condiciones de día largo y corto. Los inventores observaron que muchas líneas mostraban fenotipos claros y homogéneos en respuesta a las diferentes condiciones de crecimiento (tamaño de la planta, contenido de clorofila y tiempo de floración, Fig. 4c y d).
Ejemplo 4
[0060] Los inventores probaron si Pol II desempeña un papel más general en la represión de los ET en las plantas. Debido a su paisaje epigenético significativamente diferente en comparación con Arabidopsis, los inventores eligieron el cultivo de arroz monocotiledóneas genéticamente bien caracterizado O. sativa (Kawahara, Y. et al., 2013, Rice, 6: 4-10). Con el fin de capturar ET movilizados inducidos por fármacos, los inventores caracterizaron el mobiloma activo en plántulas de O. sativa que se cultivaron en medio MS complementado sin fármacos, solo A, solo Z o la combinación de A y Z, usando un método que permite secuenciar específicamente el ADN circular extracromosómico (eccDNA). ADNecc es un subproducto del ciclo de vida del retrotransposón RTL. Usando este enfoque, los inventores identificaron Houba, una copia como retrotransposón (Panaud, O. et al., Mol. Genet. Genomics, 2002, 268: 113-121), como altamente activado solo cuando las plantas fueron tratadas con A y Z (Fig. 7a). Los datos de secuenciación se confirmaron mediante una PCR específica de ADNecc en los RTL Houba (Fig. 7b y c).
Ejemplo 5
[0061] Debido a que el tratamiento con A solo redujo la metilación del ADN (Fig. 3a) en Arabidopsis, los inventores querían probar la solidez y generalidad de este tratamiento. Para confirmar la robustez, las plantas se trataron con A (20 pg/ml), Z (10 pg/ml) y A&Z. Una sola metilación del ADN ya fuertemente reducida a esta concentración más alta (Fig. 10a), este resultado fue luego respaldado por la evaluación de la metilación del ADN en el contexto CHH mediante secuenciación con bisulfito (promedio de 10 clones secuenciados para cada muestra). Debido a que A inhibe la enzima RNA Pol II altamente conservada y que A también es activa en células humanas, los inventores probaron el efecto de A sobre la metilación del ADN en la línea celular de cáncer humano A549. Se evaluó el contenido global de metilación del ADN en las células y se comparó con células no tratadas o tratadas con Z. La suplementación del medio de cultivo con A (0,5 pg/ml) dio como resultado una reducción del 40 % de la metilación del ADN. Esta reducción fue comparable a un tratamiento con el agente desmetilante de ADN Z (350 pM) (Fig. 10c). A continuación, los autores también evaluaron los niveles de metilación del ADN en el retrotransposón del elemento 1 intercalado largo (LINE-1). En LINE-1 A tuvo un efecto aún más pronunciado en la reducción de la metilación del ADN que Z (40% versus 20% de reducción, respectivamente). Estos resultados demuestran que un inhibidor de la transcripción puede usarse como un potente agente de desmetilación del ADN en células eucariotas.
Plantas y condiciones de crecimiento
[0062] Después de la estratificación durante dos días a 4 °C, las plantas de Arabidopsis thaliana (acceso Col-0) se cultivaron en medio A MS estéril con sacarosa al 1 % y un pH de 5,8 (medio de control) en condiciones de día largo. (16 h luz) a 24°C (día) y 22°C (noche), respectivamente. Las plantas de Oryza sativa se cultivaron en medio A MS estéril con sacarosa al 1% y un pH de 5,8 (medio control) durante 16 h a 28 °C (día) y 27 °C (noche), respectivamente.
[0063] Con el fin de analizar generaciones sucesivas, las plántulas se transfirieron al suelo y se cultivaron en condiciones de día largo (16 h de luz) a 24 °C (día) y 22 °C (noche) (A. thaliana) en una cámara de crecimiento Sanyo MLR-350 hasta la madurez de la semilla.
[0064] Para el fenotipado, las plantas de A. thaliana se cultivaron en condiciones de día largo (16 h de luz) a 24 °C (día)
y 22 °C (noche) y en condiciones de día corto (10 h de luz) a 21 °C (día y noche).) y 18 °C (noche).
[0065] La inducción de cambios epigenéticos y la activación e integración estable de elementos transponibles en plántulas de Arabidopsis se mejoró al germinarlas y cultivarlas en un medio A MS que contenía zebularina (concentración final: 10 40 |j M), a-amanitina (concentración final: 0,005-20 jg/m l) o una combinación de ambos productos químicos (medios inductivos).
[0066] Con el fin de desencadenar la transposición del retrotransposón sensible al calor ONSEN, se expusieron plántulas de siete días a un choque de frío durante 24 horas a 6 °C seguido de estrés por calor durante 24 horas a 37 °C (estrés por calor, HS) en condiciones controladas en cámara de crecimiento (Sanyo). Las plantas de control se transfirieron nuevamente a condiciones de día largo de 24 °C (día) y 22 °C (noche) después del tratamiento con frío a 6 °C durante 24 h (CS, estrés de control, según Ito et al., 2011).
[0067] Para desencadenar una respuesta de estrés biótico, se cultivaron plántulas de Arabidopsis de nueve días de edad durante nueve días en 5 ug/ul de alfa-amanitina y 40 uM de zebularina y se rociaron con flg22 (10 mM). Después de 5 h de incubación, se extrajo el ADN total de la parte aérea de las plántulas y se evaluó el número de copias de ET mediante qPCR.
qPCR en el ADN total para medir el número de copias de ONSEN y COPIA17
[0068] El ADN total de plántulas y plantas adultas se aisló usando un DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN).
[0069] En preparación para la medición de copias de ADN extracromosómico de ONSEN en CS/HS y plántulas no tratadas/tratadas, las raíces se diseccionaron directamente después del estrés por calor y las plantas se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido hasta la extracción del ADN.
[0070] Para rastrear los números de copias ONSEN en las generaciones F1-F3 de control y líneas de copias altas, se extrajo ADN de hojas verdaderas.
[0071] Para la estimación de la frecuencia de transposición de ONSEN, se aisló el ADN total de grupos que constaban de al menos ocho plántulas de la progenie de plantas tratadas con HS+A&Z. La concentración de a Dn se midió con un fluorómetro Qubit (Thermo Fisher Scientific).
[0072] Los números de copias de ONSEN se determinaron con qPCR en el ADN total usando una mezcla maestra TaqMan (Life Technologies) en un volumen final de 10 j l en el Light-Cycler 480 (Roche). El número de copias de ACTOPIA17 se midió mediante PCR cuantitativa (qPCR) en un Light-Cycler 480 (Roche), usando XYBR 421 Green I Master Mix. Actina 2 (At3g18780) sirvió como gen estándar para la normalización. Las secuencias de los cebadores y sondas para las qPCR se enumeran en la tabla 2.
[0073] Para el análisis de mobiloma-seq, el ADN de las partes aéreas de tres plántulas O. sativa se extrajo como antes (Mette, M. et al., EMBOJ, 1999, 18: 241-248).
[0074] Se purificaron 5 jg de ADN genómico de cada muestra utilizando un kit Geneclean (MPBio, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. El ADNec se aisló del producto GeneClean usando PlasmidSafe DNase (Epicentre, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, excepto que la incubación a 37 °C se realizó durante 17 h. Las muestras de ADN se precipitaron añadiendo 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3M (pH 5,2), 2,5 volúmenes de etanol y 1 j l de glucógeno (Fisher, EE. UU.) e incubando durante la noche a -20 °C. El ADN circular precipitado se amplificó mediante amplificación de círculo rodante aleatorio utilizando el kit Illustra TempliPhi (GE Healthcare, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, excepto que la incubación se realizó durante 65 horas a 28 °C. La concentración de ADN se determinó utilizando el kit DNA PicoGreen (Invitrogen, EE. UU.) usando un LightCycler480 (Roche, EE. UU.). Se utilizó un nanogramo de ADNec amplificado de cada muestra para preparar las bibliotecas utilizando el kit de bibliotecas Nextera XT (Illumina, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La calidad y la concentración del ADN se determinaron utilizando un chip Bioanalizador de ADN de alta sensibilidad (Agilent Technologies, EE. UU.). Las muestras se agruparon y cargaron en una plataforma MiSeq (Illumina, EE. UU.) y se realizó una secuenciación de extremos emparejados de 2x250 nucleótidos. El control de calidad de los archivos FASTQ se evaluó mediante la herramienta FastQC (versión 0.10.1). Para eliminar cualquier lectura procedente de genomas circulares de orgánulos, las lecturas se mapearon 198 contra los genomas de mitocondrias y cloroplastos usando el programa Bowtie2 versión 2.2,2 71 con mapeo local sensible. Las lecturas no mapeadas se mapearon contra el genoma de referencia IRGSP1,0 (http://rgp.dna.affrc.go.jp/E/IRGSP/ Build5.html) utilizando los siguientes parámetros: --sensible local, -k 1. ADN de Se enmascararon los genomas de mitocondrias y cloroplastos integrados en genomas nucleares (1.697.400 pb). Las regiones que contienen ET cubren 194.224.800 pb en O. sativa. Finalmente, para cada biblioteca, se consideró un archivo de alineación.bam correspondiente a las regiones genómicas enriquecidas para el análisis estadístico y se visualizó con el software Integrative Genomics Viewer (IGV) (https://www.broadinstitute.org/igv/home)
Tabla 2: Secuencias de cebadores y sondas que se usaron para qPCR (TaqMan, Life Technologies) para medir el número total de copias de ADN ONSEN extracromosómicas. La actina 2 sirvió como gen de control para la
normalización.
Cebador Secuencia 5'-> 3'
SEQ ID No 001 (ONSEN_ RT_fw) CCACAAGAGGAACCAACGAA
SEQ ID No 002 (ONSEN_ RT_ rev) TTCGATCATGGAAGACCGG
SEQ ID No 003 (sonda ONSEN) (FAM) AAGTCGGCAATAGCTTTGGCGAAGA (BHQ1)
SEQ ID No 004 (Actina2_RT_fw) TGCCAATCTACGAGGGTTTC
SEQ ID No 005 (Actin2_RT_rev) TTACAATTTCCCGCTCTGCT
SEQ ID No 006 (Actin2_sonda) (JOE)TCCGTCTTGACCTTGCTGGACG(BHQ-I)
SEQ ID No 007 GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTG (GenWalkAdaptator1) GT
GenWalkAdaptor2 (PHOS)ACCAGCCC(AMINO)
SEQ ID No 008 (AP1) GTAATACGACTCACTATAGGGC
SEQ ID No 009 (Copia783' LTR) AACACTTAAACACTTTCTCCA
SEQ ID NO 010 TTAGTATAAGGCTGAGCTGGAAACTG
706_ATCOPIA17 QT R
SEQ ID NO 011705 ATCOPIA17 QT CAAGCCTAACCCTCAGCTACATG
F
Visualización de transposones para confirmar la inserción de nuevas copias de ONSEN
[0075] La integración estable de copias adicionales de ONSEN ET en el genoma de plantas estresadas por calor y tratadas se comprobó mediante una visualización simplificada de transposones basada en el kit GenomeWalker Universal (Clontech Laboratories), según Ito et al. 2011.
[0076] Se extrajeron 300 ng de ADN total de plantas adultas de la generación F2 de HS /- A & Z con un DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) y se digirieron con una enzima de restricción de corte romo (Dra I). Después de la purificación con un High Pure PCR Product Purification Kit (Roche), el ADN digerido se ligó a los GenWalkAdapters recocidos 1 y 2. Para la PCR, se utilizó el cebador AP1 específico del adaptador y el cebador Copia 783' RTL específico de ONSEN. Los productos de la PCR se separaron en un gel de agarosa al 2 % que se tiñó con una solución de tinción de ácido nucleico verde Midori. Para obtener información sobre la secuencia, consulte las tablas 2 y 3.
Clonación, secuenciación y genotipado de nuevas inserciones
[0077] Con el fin de identificar la región genómica de las nuevas inserciones ONSEN, el producto PCR de la presentación de transposones se purificó usando un kit de purificación de productos de PCR de alta pureza (Roche), ligado en un vector pGEM-T (Promega) y transformado en E. coli. Después de una selección azul-blanco, se usaron clones positivos para la amplificación y secuenciación del inserto (StarSEQ). Las secuencias obtenidas se analizaron con Geneious 8.2,1 y se contrastaron con el genoma de referencia de Arabidopsis thaliana. Las PCR de genotipado estándar para probar las nuevas inserciones de ONSEN se realizaron con combinaciones del cebador específico de ONSEN "Copia 78 ET display 3'RTL" y los cebadores enumerados en las tablas 2 y 3.
Tabla 3: Nombres, propósito y secuencias de los cebadores
Claims (8)
1. Un método para la movilización de un elemento transponible en una célula vegetal, comprendiendo dicho método los pasos de:
a) proporcionar una célula vegetal que comprende un elemento transponible
b) poner en contacto dicha célula vegetal con un inhibidor de la transcripción y un inhibidor de la metilación del ADN,
c) exponer dicha célula vegetal a un estrés abiótico, estrés biótico o estrés químico,
d) aislar dicha célula vegetal y determinar si un fenotipo de dicha célula ha cambiado,
produciendo así una célula vegetal con un elemento transponible movilizado.
2. El método según la reivindicación 1, en donde dicha célula vegetal es parte de una planta, y en donde después de la exposición de dicha célula a un estrés abiótico, estrés biótico o estrés químico, la célula se cultiva para convertirla en un organismo multicelular, y se determina el fenotipo de dicha planta.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, donde el fenotipo es la resistencia a un estresor que causa el estrés abiótico, el estrés biótico o el estrés químico.
4. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 3, en donde
i. dicho estrés abiótico se selecciona de calor, frío, sequía, sumersión/exceso de agua, viento, radiación ultravioleta, radiación nuclear, salinidad, metales pesados, pH del suelo, cultivo de tejidos y falta de fósforo, nitrógeno, luz o CO2 , y/o
ii. dicho estrés biótico se selecciona del impacto negativo de hongos, bacterias, virus, insectos, heridas por herbívoros y competencia biológica, y/o
iii. dicho estrés químico se selecciona de herbicidas, protectores de herbicidas, insecticidas, fungicidas, metabolitos secundarios de plantas y compuestos sintéticos o naturales que inducen la defensa de las plantas.
5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha célula vegetal o planta se pone en contacto con un inhibidor de la metilación del ADN seleccionado entre 5-azacitidina, 5-aza-2'-desoxicitidina, 5-fluoro-2'-desoxicitidina, 5,6-dihidro-5-azacitidina y zebularina.
6. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho inhibidor de la transcripción es un inhibidor de la ARN polimerasa II.
7. El método según la reivindicación 6, en donde dicho inhibidor de la ARN polimerasa II es alfa-amanitina utilizada a una concentración de 0,0005 pg/ml a 50 pg/ml.
8. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho inhibidor de la metilación del ADN es zebularina utilizada a una concentración de 5 pmol/L a 100 pmol/L
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP15197663 | 2015-12-02 | ||
| PCT/EP2016/079276 WO2017093317A1 (en) | 2015-12-02 | 2016-11-30 | Mobilisation of transposable elements to enhance genetic and epigenetic variability in a population |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2928056T3 true ES2928056T3 (es) | 2022-11-15 |
Family
ID=54780176
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES16808953T Active ES2928056T3 (es) | 2015-12-02 | 2016-11-30 | Movilización de elementos transponibles para mejorar variabilidad genética y epigenética en una poblacion |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US12144299B2 (es) |
| EP (1) | EP3384020B1 (es) |
| JP (1) | JP6860936B2 (es) |
| CN (1) | CN108699546B (es) |
| CA (1) | CA3006632C (es) |
| CO (1) | CO2018005897A2 (es) |
| ES (1) | ES2928056T3 (es) |
| IL (1) | IL259666B (es) |
| MX (1) | MX395427B (es) |
| WO (1) | WO2017093317A1 (es) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2018333148B2 (en) * | 2017-09-14 | 2024-12-12 | Rahan Meristem (1998) Ltd | A method for producing banana plants with tolerance to Fusarium oxysporum Cubensis TR4 |
| CN120419460A (zh) * | 2025-04-30 | 2025-08-05 | 广西壮族自治区农业科学院 | 一种促进甘蔗生物固氮的辅助栽培方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ20013532A3 (cs) * | 1999-04-01 | 2002-03-13 | Mcgill University | Nový typ genetického markeru na bázi transpozonu |
| JP2003093074A (ja) | 2001-09-21 | 2003-04-02 | Ueda Seni Kagaku Shinkokai | 植物の内在性トランスポゾンの検出法及び検出されたトランスポゾン及びそれを利用した新品種作物及びその育成法 |
| DK1465993T3 (da) * | 2002-01-09 | 2010-01-11 | Minos Biosystems Ltd | Inducerbar transposition hos transgen organisme ved anvendelse af transposonvektor |
| CN1244269C (zh) * | 2002-01-24 | 2006-03-08 | 华中农业大学 | 一种大规模诱发植物基因突变的方法 |
| AU2003252483A1 (en) * | 2003-07-08 | 2005-01-21 | Japan Science And Technology Corporation | Method and system of constructing transgenic organism |
| CN1748479A (zh) | 2005-10-10 | 2006-03-22 | 湖南大学 | 一种水稻体细胞无性系诱变育种方法 |
| JP4613273B2 (ja) | 2007-02-06 | 2011-01-12 | 大学共同利用機関法人自然科学研究機構 | イネのトランスポゾン遺伝子 |
-
2016
- 2016-11-30 ES ES16808953T patent/ES2928056T3/es active Active
- 2016-11-30 JP JP2018528780A patent/JP6860936B2/ja active Active
- 2016-11-30 US US15/780,636 patent/US12144299B2/en active Active
- 2016-11-30 MX MX2018006754A patent/MX395427B/es unknown
- 2016-11-30 WO PCT/EP2016/079276 patent/WO2017093317A1/en not_active Ceased
- 2016-11-30 CN CN201680080349.8A patent/CN108699546B/zh active Active
- 2016-11-30 EP EP16808953.0A patent/EP3384020B1/en active Active
- 2016-11-30 CA CA3006632A patent/CA3006632C/en active Active
-
2018
- 2018-05-29 IL IL259666A patent/IL259666B/en unknown
- 2018-06-07 CO CONC2018/0005897A patent/CO2018005897A2/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3384020B1 (en) | 2022-08-03 |
| CN108699546B (zh) | 2022-06-07 |
| MX395427B (es) | 2025-03-25 |
| EP3384020A1 (en) | 2018-10-10 |
| JP6860936B2 (ja) | 2021-04-21 |
| CA3006632A1 (en) | 2017-06-08 |
| WO2017093317A1 (en) | 2017-06-08 |
| CA3006632C (en) | 2024-07-02 |
| CO2018005897A2 (es) | 2018-06-20 |
| US20180352764A1 (en) | 2018-12-13 |
| IL259666B (en) | 2021-09-30 |
| BR112018011189A2 (pt) | 2018-11-21 |
| CN108699546A (zh) | 2018-10-23 |
| US12144299B2 (en) | 2024-11-19 |
| JP2018535686A (ja) | 2018-12-06 |
| IL259666A (en) | 2018-07-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Xin et al. | Genetic regulation of ethylene dosage for cucumber fruit elongation | |
| Thieme et al. | Inhibition of RNA polymerase II allows controlled mobilisation of retrotransposons for plant breeding | |
| Bilichak et al. | Transgenerational response to stress in plants and its application for breeding | |
| Cai et al. | Overexpression of rat neurons nitric oxide synthase in rice enhances drought and salt tolerance | |
| Feng et al. | TaSnRK2. 9, a sucrose non-fermenting 1-related protein kinase gene, positively regulates plant response to drought and salt stress in transgenic tobacco | |
| McLAUGHLIN et al. | Sugar-responsive gene expression, invertase activity, and senescence in aborting maize ovaries at low water potentials | |
| ES2568896T3 (es) | Evento de maíz MIR604 | |
| Choe et al. | Homologous expression of γ-glutamylcysteine synthetase increases grain yield and tolerance of transgenic rice plants to environmental stresses | |
| Ansari et al. | Drought mediated physiological and molecular changes in muskmelon (Cucumis melo L.) | |
| Toorchi et al. | Proteomics approach for identifying osmotic-stress-related proteins in soybean roots | |
| CA2671425C (en) | Method for modifying insect resistance of plants by utilizing rnai technique | |
| Deng et al. | Epigenetic regulation and epigenomic landscape in rice | |
| Teotia et al. | The paralogous genes RADICAL-INDUCED CELL DEATH1 and SIMILAR TO RCD ONE1 have partially redundant functions during Arabidopsis development | |
| BRPI0814098A2 (pt) | método para obtenção de uma planta com maior resistência ao estresse, com tempo de florescimento alterado, com fenótipo foliar alterado, método para investigar uma planta, plantas, parte de uma planta ou semente mutante ou transgênica | |
| Xia et al. | Altered transcription and neofunctionalization of duplicated genes rescue the harmful effects of a chimeric gene in Brassica napus | |
| Ou et al. | DNA methylation changes induced in rice by exposure to high concentrations of the nitric oxide modulator, sodium nitroprusside | |
| Wang et al. | Roles of CRWN-family proteins in protecting genomic DNA against oxidative damage | |
| ES2928056T3 (es) | Movilización de elementos transponibles para mejorar variabilidad genética y epigenética en una poblacion | |
| Bhargava et al. | Integrative approaches to biotechnology | |
| BR112018011189B1 (pt) | Mobilização de elementos transponíveis para melhorar variabilidade genética e epigenética em uma população | |
| Cao et al. | Transcription factor ZmGBF1 enhances heat stress tolerance in maize by directly increasing expression of ZmCXE2 involved in GA pathway | |
| Khaledian et al. | Transcriptome profiling of the early-response in chickpea to cold stress | |
| Dhar et al. | Epigenetic response of plants to abiotic stress: Nature, consequences and applications in breeding | |
| Yeken | Assessing Aluminum Stress Resilience in Common Bean Roots: Phenotypic, Histochemical, and PvGST/PvPOD Gene Expression Analysis | |
| Wang | IMPROVEMENT OF TOMATO COLD TOLERANCE BY DISCOVERING AND ALTERING CONSERVED TRANSCRIPTIONAL REGULATORS |