ES2568896T3 - Evento de maíz MIR604 - Google Patents

Abstract

Un método para detectar la presencia de ADN del evento de maíz MIR604 que comprende una secuencia nucleotídica de un gen cry3A055 de SEC ID NO: 59 flanqueada por las secuencia nucleotídicas expuestas en SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 2 y SEC ID NO: 4, respectivamente, o sus complementos en una muestra biológica, que comprende: (a) poner en contacto la muestra con un primer cebador polinucleotídico y un segundo cebador polinucleotídico que actúan juntos en una reacción de amplificación del ácido nucleico en presencia de un molde de ADN del evento de maíz MIR604 para producir un amplicón de diagnóstico para el evento de maíz; (b) realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico para producir de esta manera el amplicón; y (c) detectar el amplicón; donde el amplicón comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4 y sus complementos.

Description

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semillas de maíz de primera generación resultantes, en el que la primera o segunda planta de maíz progenitora es una

planta de maíz endogámica de la invención. Según otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir semillas de maíz híbridas, que comprende las etapas de: (a) sembrar semillas de una primera línea de maíz endogámica según la invención y semillas de una segunda línea de maíz endogámica que tiene un genotipo diferente; (b) cultivar plantas de maíz que resultan de dicha siembra hasta el momento de la floración; (c) emascular flores de plantas de maíz de una las líneas endogámicas de maíz; (d) permitir que suceda la polinización de la otra línea endogámica, y (e) cosechar las semillas híbridas producidas de ese modo.

Lo anterior y otros aspectos de la invención serán más manifiesto a partir de la siguiente descripción detallada.

DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS EN EL LISTADO DE SECUENCIAS SEC ID NO: 1 es la unión de genoma-inserto 5’. SEC ID NO: 2 es la unión de inserto-genoma 3’. SEC ID NO: 3 es la secuencia de genoma + inserto 5’. SEC ID NO: 4 es la secuencia de inserto + genoma 3’. SEC ID NO: 5 es genoma de maíz que flanquea en 5’ al inserto. SEC ID NO: 6 es genoma de maíz que flanquea en 3’ al inserto. SEC ID Nos: 7-15 son cebadores de secuencias flanqueantes de 5’ útiles en la presente invención. SEC ID Nos: 16-20 son cebadores de la secuencia del promotor MTL útiles en la presente invención. SEC ID Nos: 21-28 son cebadores de la secuencia de cry3A055 útiles en la presente invención. SEC ID Nos: 29-30 son cebadores de la secuencia de ZmUbiInt útiles en la presente invención. SEC ID Nos: 31-37 son cebadores de la secuencia de pmi útiles en la presente invención. SEC ID NO: 38 es un cebador de la secuencia de NOS útil en la presente invención. SEC ID Nos: 39-46 son cebadores de secuencias flanqueantes de 3’ útiles en la presente invención. SEC ID Nos: 47-49 son cebadores y sondas TAQMAN de cry3A055. SEC ID Nos: 50-52 son cebadores y sondas TAQMAN de pmi. SEC ID Nos: 53-55 son cebadores y sondas TAQMAN de ZmADH. SEC ID NO: 56 es una sonda de MIR604 útil en la presente invención. SEC ID NO: 57 es la secuencia para la región de frontera derecha. SEC ID NO: 58 es la secuencia del promotor MTL. SEC ID NO: 59 es la secuencia del gen cry3A055. SEC ID NO: 60 es la secuencia del terminador de NOS. SEC ID NO: 61 es la secuencia del promotor ZmUbInt. SEC ID NO: 62 es la secuencia del gen pmi. SEC ID NO: 63 es la secuencia de la región de frontera izquierda.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 ilustra un vector de expresión de planta designado pZM26. El mapa identifica el sitio de restricción KpnI usado para análisis de Southern. La Figura 2 es un mapa gráfico que ilustra la organización de los elementos que comprenden las secuencias de

ácido nucleico heterólogas insertadas dentro del genoma de evento de maíz MIR604 y establece las posiciones relativas en las que las secuencias de ácido nucleico insertadas se ligan a secuencias de ADN genómico de maíz las cuales flanquean los extremos de las secuencias de ADN heterólogas insertadas. 1 = genoma vegetal

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“Gen de interés” se refiere a cualquier gen el cual, cuando se transfiere a una planta, confiere en la planta una característica deseada tal como resistencia a antibióticos, resistencia a virus, resistencia a insecto, resistencia a enfermedad, o resistencia a otras plagas, tolerancia a herbicidas, valor nutricional mejorado, comportamiento mejorado en un proceso industrial o capacidad reproductiva alterada. El “gen de interés” también puede ser uno que se transfiere a plantas para la producción de enzimas o metabolitos de valor comercial en la planta.

“Genotipo”, como se usa aquí, es el material genético heredado de plantas de maíz progenitoras, el cual no todo se expresa necesariamente en las plantas de maíz descendientes. El genotipo MIR604 se refiere al material genético heterólogo transformado en el genoma de una planta además del material genético que flanquea la secuencia insertada.

Una secuencia de ácido nucleico “heteróloga” es una secuencia de ácido nucleico no asociada naturalmente con una célula hospedante en la cual se introduce, incluyendo copias múltiples de origen no natural de una secuencia de ácido nucleico de origen natural.

Una secuencia de ácido nucleico “homologa” es una secuencia de ácido nucleico asociada naturalmente con una célula hospedante dentro de la cual se introduce.

“Ligado operablemente” se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un único fragmento de ácido nucleico tal que la función de una afecta a la función de la otra. Por ejemplo, un promotor se liga operablemente con una secuencia codificante o ARN funcional cuando es capaz de afectar la expresión de aquella secuencia codificante o ARN funcional (esto es, que la secuencia codificante o ARN funcional está bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias codificantes en orientación codificante o no codificante se pueden ligar operablemente a secuencias reguladoras.

“Cebadores”, como se usa aquí, son ácidos nucleicos aislados que se hibridan a una hebra de ADN diana complementaria mediante hibridación de ácidos nucleicos para formar un híbrido entre el cebador y la hebra de ADN diana, luego se alargan a lo largo de la hebra de ADN diana mediante una polimerasa, tal como ADN polimerasa. Los pares o conjuntos de cebadores se pueden usar para amplificación de una molécula de ácido nucleico, por ejemplo mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros métodos de amplificación de ácidos nucleicos convencionales.

Una “sonda” es un ácido nucleico aislado al cual se acopla un marcador detectable convencional o molécula informadora, tales como un isótopo radioactivo, ligando, agente quimioluminiscente, o enzima. Tal sonda es complementaria a una hebra de un ácido nucleico diana, en el caso de la presente invención, a una hebra de ADN genómico de evento de maíz, MIR604. El ADN genómico de MIR604 puede ser de una planta de maíz o de una muestra que incluye ADN del evento. Las sondas según la presente invención incluyen no solamente ácidos desoxirribonucleicos

o ribonucleicos sino también poliamidas y otros materiales de sonda que se unen específicamente a una secuencia de ADN diana y se pueden usar para detectar la presencia de esa secuencia de ADN diana.

Los cebadores y sondas generalmente tienen entre 10 y 15 nucleótidos o más de longitud, los cebadores y sondas también pueden ser de al menos 20 nucleótidos o más de longitud, o al menos 25 nucleótidos o más, o al menos 30 nucleótidos o más de longitud. Tales cebadores y sondas se hibridan específicamente a una secuencia diana en condiciones de hibridación muy restrictivas. Los cebadores y sondas según la presente invención pueden tener una complementariedad de secuencia completa con la secuencia diana, aunque se pueden mediante métodos convencionales diseñar sondas que difieren de la secuencia diana y que retienen la capacidad para hibridarse a secuencias diana.

“Condiciones restrictivas” o “condiciones de hibridación restrictivas” incluyen referencia a condiciones bajo las cuales una sonda hibridará a su secuencia diana, hasta un grado detectablemente mayor que a otras secuencias. Las condiciones restrictivas dependen de la secuencia diana y diferirán dependiendo de la estructura del polinucleótido. Mediante el control de la restricción de las condiciones de hibridación y/o lavado, se pueden identificar secuencias diana las cuales son 100% complementarias a la sonda (sondeo homólogo). Alternativamente, las condiciones de restricción se pueden ajustar para permitir cierto desemparejamiento en las secuencias de manera que se detecten menores grados de similitud (sondeo heterólogo). Las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más altas. Una guía extensiva para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Technigues in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic acid probes, Parte I, Capítulo 2 “Overview of principles of hibridation and the strategy of nucleic acid probe assays”, Elsevier: Nueva York; y Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2, Ausubel et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Intrescience: Nueva York (1995), y también Sambrook et al., (2001) Molecular cloning: A Laboratory Manual (5ª Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

La especificidad es típicamente la función de lavados post-hibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la disolución de lavado final. Generalmente, las condiciones de hibridación y lavado muy restrictivas se seleccionan para ser alrededor de 5ºC menor que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica y pH definidos) a la cual el 50% de la secuencia diana se hibrida a una sonda perfectamente emparejada. Típicamente, en condiciones muy restrictivas una sonda se hibridará a su subsecuencia diana, pero no a otras secuencias.

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Un ejemplo de condiciones de hibridación muy restrictivas para hibridación de ácidos nucleicos complementarios los cuales tienen más de 100 restos complementarios sobre un filtro en una transferencia Southern o Northern es formamida al 50% con 1 mg de heparina a 42ºC, llevándose a cabo la hibridación durante la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado de restricción muy elevada es NaCl 0,15M a 72ºC durante alrededor de 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado muy restrictivas es un lavado SSC 0,2x a 65ºC durante 15 minutos (véase, Sambrook, más abajo, para una descripción de disolución amortiguadora SSC).

Las condiciones de hibridación ejemplares para la presente invención incluyen hibridación en SDS al 7%, NaPO4 0,25 M pH 7,2 a 67ºC durante la noche, seguido de dos lavados en SDS al 5%, NaPO4 0,20 M pH 7,2 a 65ºC durante 30 minutos cada lavado, y dos lavados en SDS al 1%, NaPO4 0,20 M pH 7,2 a 65ºC durante 30 minutos cada lavado. Un lavado de restricción media ejemplar para dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 1x SSC a 45ºC durante 15 minutos. Un lavado de restricción baja ejemplar para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 4-6x SSC a 40ºC durante 15 minutos.

Para sondas de alrededor de 10 hasta 50 nucleótidos, las condiciones muy restrictivas típicamente implican concentraciones de sal de menos de alrededor de 1,0 M de ion de Na, típicamente una concentración de alrededor de 0,01 a 1,0 M de ion de Na (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3, y la temperatura típicamente es al menos alrededor de 30ºC. Las condiciones muy restrictivas también se pueden lograr con la adición de agentes de desestabilización tales como formamida. En general, una relación de señal a ruido de 2x (o mayor) que aquella observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica la detección de una hibridación específica. Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí en condiciones muy restrictivas son todavía sustancialmente idénticos si las proteínas que codifican son sustancialmente idénticas. Esto ocurre, por ejemplo, cuando una copia de un ácido nucleico se crea usando la degeneración de codón máxima permitida por el código genético.

Los siguientes son conjuntos ejemplares de condiciones de hibridación/lavado que se pueden usar para hibridar secuencias nucleotídicas que son sustancialmente idénticas a secuencias nucleotídicas de referencia de la presente invención: una secuencia nucleotídica de referencia preferiblemente se hibrida a la secuencia nucleotídica de referencia en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50ºC con lavado en SSC 2X, SDS al 0,1% a 50ºC, más deseablemente en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50ºC con lavado en SSC 1X, SDS al 0,1% a 50ºC, todavía más deseablemente en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50ºC con lavado en SSC 0,5X, SDS al 0,1% a 50ºC, preferiblemente en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50ºC con lavado en SSC 0,1X, SDS 0.1% a 50ºC, más preferiblemente en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50ºC con lavado en SSC 0,1X, SDS 0,1% a 65ºC. Las secuencias de la presente invención se pueden detectar usando todas las condiciones anteriores. Con el fin de definir la invención, se usan las condiciones muy restrictivas.

“Transformación” es un proceso para introducir un ácido nucleico heterólogo en una célula u organismo hospedante. En particular, “transformación” significa la integración estable de una molécula de ADN en el genoma de un organismo de interés.

“Transformado/transgénico/recombinante” se refiere a un organismo hospedante tal como una bacteria o una planta en la cual una molécula de ácido nucleico heteróloga se ha introducido. La molécula de ácido nucleico puede ser integrada establemente dentro del genoma del hospedante, o la molécula de ácido nucleico también puede estar presente como una molécula extracromosómica. Tal molécula extracromosómica puede ser autorreplicante. Se entiende que las células, tejidos o plantas transformadas engloban no solamente el producto final de un proceso de transformación, sino también la progenie transgénica de este. Un hospedante “no transformado”, “no transgénico”, o “no recombinante” se refiere a un organismo de tipo silvestre, por ejemplo una bacteria o planta, que no contiene la molécula de ácido nucleico heteróloga. Como se usa aquí, “transgénico” se refiere a una planta, célula vegetal, o multitud de células vegetales estructuradas o no estructuradas que tienen integrado, vía técnicas bien conocidas de manipulación genética e inserción génica, una secuencia de un ácido nucleico que representa un gen de interés dentro del genoma de la planta, y típicamente dentro de un cromosoma de un núcleo celular, mitocondria u otro orgánulo que contiene cromosomas, en una ubicación diferente a, o en un número de copias mayor que, aquel presente normalmente en la planta o célula vegetal nativa. Las plantas transgénicas resultan de la manipulación e inserción de las secuencias de ácido nucleico, en oposición a mutaciones de origen natural, para producir una planta de origen no natural o una planta con un genotipo de origen no natural. Las técnicas para transformación de plantas y células vegetales son bien conocidas en la técnica y pueden comprender por ejemplo electroporación, microinyección, transformación mediada por Agrobacterium, y transformación balística.

Se usa aquí la nomenclatura de bases de ADN y aminoácidos como se expone en 37 C.F.R. § 1.822.

Esta invención se refiere a una línea mejorada genéticamente de maíz que produce la proteína de control de insectos, Cry3A055, y una enzima fosfomanosa isomerasa (PMI) que permite a la planta utilizar manosa como una fuente de carbono. La invención se refiere particularmente a un evento de maíz transgénico designado MIR604 que comprende un genotipo novedoso, así como a composiciones y métodos para detectar ácidos nucleicos de este evento en una muestra biológica. La invención se refiere además a plantas de maíz que comprenden el genotipo MIR604, a semillas transgénicas de las plantas de maíz, y a métodos para producir una planta de maíz que comprende el genotipo MIR604 por cruzamiento de un maíz endogámico que comprende el genotipo MIR604 con él mismo u otra línea de maíz. Las

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En otro aspecto de esta realización, el primer cebador polinucleotídico, el cual se expone en SEC ID NO: 15, y el segundo cebador polinucleotídico el cual se expone en SEC ID NO: 28, funcionan juntos en presencia de un molde de ADN de evento de maíz MIR604 en una muestra para producir un amplicón de diagnóstico para el evento de maíz MIR604 como se describe en el Ejemplo 4. En otro aspecto de esta realización, el primer cebador polinucleotídico, el cual se expone en SEC ID NO: 45, y el segundo cebador polinucleotídico el cual se expone en SEC ID NO: 27, funcionan juntos en presencia de un molde de ADN de evento de maíz MIR604 en una muestra para producir un amplicón de diagnóstico para el evento de maíz MIR604 como se describe en el Ejemplo 4.

Por supuesto, es bien conocido dentro de la pericia en la técnica obtener secuencia adicional más externa en la secuencia genómica que flanquea cualquier extremo de las secuencias de ADN heterólogas insertadas para uso como una secuencia cebadora que se puede usar en tales pares de cebadores para amplificar las secuencias que son de diagnóstico para el evento MIR604. Para los fines de esta descripción, la frase “más externa en la secuencia genómica que flanquea cualquier extremo de las secuencias de ADN heterólogas insertadas” se refiere específicamente a un movimiento secuencial hacia afuera de los extremos de las secuencias de ADN heterólogas insertadas, los puntos en los cuales las secuencias de ADN insertadas son adyacentes a la secuencia de ADN genómico nativo, y externo en el ADN genómico del cromosoma particular en el que se insertaron las secuencias de ADN heterólogas. Preferiblemente, una secuencia cebadora que corresponde o es complementaria a una parte de la secuencia de inserto debería cebar el alargamiento transcripcional de una hebra naciente de ADN o ARN hacia la unión de secuencia de flanqueo más cercana. Consecuentemente, una secuencia cebadora que corresponde o es complementaria a una parte de la secuencia de flanqueo genómica debería cebar el alargamiento transcripcional de una hebra naciente de ADN o ARN hacia la unión de secuencia de flanqueo más cercana. Una secuencia cebadora puede ser, o puede ser complementaria a, una secuencia de ADN heteróloga insertada dentro del cromosoma de la planta, o una secuencia de flanqueo genómica. Un experto en la técnica podría reconocer fácilmente el beneficio de si una secuencia cebadora podría necesitar ser, o podría necesitar ser complementaria a, la secuencia como se expone dentro de la secuencia de ADN heteróloga insertada o como se expone en SEC ID NO: 3 o SEC ID NO: 4 dependiendo de la naturaleza del producto deseado a obtener a través del uso del conjunto anidado de cebadores destinados para uso en la amplificación de una secuencia de flanqueo particular que contiene la unión entre la secuencia de ADN genómico y la secuencia de ADN heteróloga insertada.

En otra realización, la presente invención comprende un método para detectar la presencia de ADN que corresponde al evento MIR604 en una muestra biológica, en el que el método comprende: (a) poner en contacto la muestra que comprende ADN con una sonda que se hibrida en condiciones muy restrictivas con ADN genómico de evento de maíz MIR604 y que no se hibrida en condiciones muy restrictivas con ADN de una planta de maíz control; (b) someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridación muy restrictivas; y (c) detectar la hibridación de la sonda al ADN. En un aspecto de esta realización, el amplicón comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, y sus complementos.

En otra realización, la presente invención comprende un método para detectar la presencia de un ADN que corresponde al evento MIR604 en una muestra biológica, en el que el método comprende: (a) poner en contacto la muestra que comprende ADN con una sonda que se hibrida en condiciones muy restrictivas con ADN genómico del evento de maíz MIR604 y que no se hibrida en condiciones muy restrictivas con ADN de una planta de maíz control; (b) someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridación muy restrictivas; y (c) detectar la hibridación de la sonda al ADN. La detección puede ser por cualquier medio bien conocido en la técnica que incluye pero no se limita a fluorescente, quimioluminiscente, radiológico, inmunológico, u otra manera. En el caso en el cual la hibridación está destinada a ser usada como un medio para la amplificación de una secuencia particular para producir un amplicón el cual es de diagnóstico para el evento de maíz MIR604, la producción y detección del amplicón, mediante cualquier medio bien conocido en la técnica, está destinada para ser indicativa de la hibridación pretendida a la secuencia diana en la que se utiliza una sonda o cebador, o secuencias en las que se utilizan dos o más sondas o cebadores. El término “muestra biológica” está destinado a comprender una muestra que contiene o es sospechosa de contener un ácido nucleico que comprende entre cinco y diez nucleótidos en cualquier lado del punto en el cual uno o el otro de los dos extremos terminales de la secuencia de ADN heteróloga insertada contacta la secuencia de ADN genómica dentro del cromosoma en el cual la secuencia de ADN heteróloga fue insertada, en la presente también conocidas como las secuencias de unión. Además, la secuencia de unión comprende como mínimo dos nucleótidos: siendo esos el primer nucleótido dentro del ADN genómico de flanqueo adyacente y ligado covalentemente al primer nucleótido dentro de la secuencia de ADN heteróloga insertada.

En todavía otra realización, la presente invención comprende un kit para detectar la presencia de ácidos nucleicos MIR604 en una muestra biológica, en el que el kit comprende al menos una molécula de ácido nucleico de suficiente longitud de nucleótidos contiguos homólogos o complementarios a una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, y SEC ID NO: 4, que funciona como un cebador o sonda de ADN específica para el evento MIR604, y otros materiales necesarios para hacer posible la hibridación o amplificación de ácido nucleico. Se puede usar una variedad de métodos de detección que incluyen TAQMAN (Perkin Elmer), amplificación térmica, reacción en cadena de ligasa, hibridación de southern, métodos de ELISA, y métodos de detección colorimétricos y fluorescentes. En particular, la presente invención proporciona kits para detectar la presencia de la secuencia diana, esto es, al menos una de las uniones del ADN inserto con el ADN genómico de la planta de maíz en MIR604, en una muestra que contiene ácido nucleico genómico de MIR604. El kit se compone de al menos un polinucleótido capaz de unirse al sitio diana o sustancialmente adyacente al sitio diana y al menos un medio para

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detectar la unión del polinucleótido al sitio diana. El medio de detección puede ser fluorescente, quimioluminiscente, colorimétrico, o isotópico, y puede estar acoplado al menos con métodos inmunológicos para detectar la unión. También se imagina un kit el cual pueda detectar la presencia del sitio diana en una muestra, esto es, al menos una de las uniones del ADN inserto con el ADN genómico de la planta de maíz en MIR604, aprovechando dos o más secuencias polinucleotídicas que juntas son capaces de unirse a secuencias nucleotídicas adyacentes a o en alrededor de 100 pares de bases, o en alrededor de 200 pares de bases, o en alrededor de 500 pares de bases o en alrededor de 1000 pares de bases de la secuencia diana y que se pueden alargar entre sí para formar un amplicón el cual contiene al menos el sitio diana.

En otra realización, la presente invención comprende un método para detectar proteína de evento MIR604 en una muestra biológica, comprendiendo el método: (a) extraer proteína de una muestra de tejido de evento de maíz MIR604;

(b) ensayar la proteína extraída usando un método inmunológico que comprende anticuerpo específico para la proteína marcadora insecticida o seleccionable producida por el evento MIR604; y (c) detectar la unión de dicho anticuerpo a la proteína marcadora insecticida o seleccionable.

Otra realización de la presente invención comprende una planta de maíz, o partes de la misma, que comprende el genotipo del evento transgénico MIR604, en la que el genotipo comprende la secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO:1, SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, SEC ID N0:4, o sus complementos. En un aspecto de esta realización, la planta de maíz procede de las líneas de maíz endogámico CG5NA58, CG5NA58A, CG3ND97, CG5NA01, CG5NF22, CG4NU15, CG00685, CG00526, CG00716, NP904, NP948, NP934, NP982, NP991, NP993, NP2010, NP2013, NP2015, NP2017, NP2029, NP2031, NP2034, NP2045, NP2052, NP2138, NP2151, NP2166, NP2161, NP2171, NP2174, NP2208, NP2213, NP2222, NP2275, NP2276, NP2316, BCTT609, AF031, H8431, 894, BUTT201, R327H, 2044BT, y 2070BT. Sin embargo, el experto en la técnica reconocerá que el genotipo MIR604 se puede introgresar en cualquier variedad vegetal que procree con el maíz, incluidas las especies de maíz salvajes, y, por lo tanto, no se pretende que las líneas endogámicas preferidas de esta realización sean limitantes.

En otra realización, la presente invención comprende una planta de maíz que comprende al menos una primera y una segunda secuencia de ADN ligadas juntas para formar una secuencia nucleotídica contigua, en la que la primera secuencia de ADN está dentro de una secuencia de unión y comprende al menos alrededor de 11 nucleótidos contiguos seleccionados del grupo que consiste en nucleótidos 792-811 de SEC ID NO:3; nucleótidos 497-516 de SEC ID NO: 4; SEC ID NO: 5; SEC ID NO: 6; y sus complementos, en la que la segunda secuencia de ADN esta dentro de la secuencia de ADN de inserto heteróloga seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 57, SEC ID NO: 58, SEC ID NO: 59, SEC ID NO: 60, SEC ID NO: 61, SEC ID NO: 62, SEC ID NO: 63, y sus complemento; y en la que la primera y la segunda secuencias de ADN son útiles como cebadores o sondas nucleotídicas para detectar la presencia de secuencias de ácido nucleico del evento de maíz MIR604 en una muestra biológica. En un aspecto de esta realización, los cebadores nucleótidos se usan en un método de amplificación de ADN para amplificar una secuencia de ADN diana a partir de ADN molde extraído de la planta de maíz, y la planta de maíz es identificable de otras plantas de maíz por la producción de un amplicón que corresponde a una secuencia de ADN que comprende SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 2.

Las plantas de maíz, de la invención pueden además caracterizarse además por que la digestión del ADN genómico de la planta con la endonucleasa de restricción KpnI da como resultado una única banda hibridante de cry3A055 usando una sonda específica para cry3A055 en condiciones muy restrictivas. En la presente se ejemplifica una sonda de cry3A055 que comprende una secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO: 56 o SEC ID 59.

Las plantas de maíz de la invención pueden además caracterizarse además por que la digestión del ADN genómico de la planta con la endonucleasa de restricción KpnI da como resultado una única banda hibridante de pmi usando una sonda específica de pmi en condiciones muy restrictivas. En la presente se ejemplifica una sonda de pmi que comprende una secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO: 62.

En una realización, la presente invención proporciona una planta de maíz, en la que el genotipo MIR604 confiere sobre la planta de maíz resistencia a los insectos o la capacidad para utilizar manosa. En un aspecto de esta realización, el genotipo que confiere resistencia a insectos sobre la planta de maíz comprende un gen cry3A055. En otro aspecto de esta realización, el genotipo que confiere sobre la planta de maíz la capacidad de utilizar manosa comprende un gen pmi.

En una realización, la presente invención proporciona una muestra biológica derivada de una planta, tejido, o semilla de maíz de evento MIR604, en la que la muestra comprende una secuencia nucleotídica que es o es complementaria a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2, y en la que la secuencia se detecta en la muestra usando un método de amplificación de ácido nucleico o hibridación de ácido nucleico. En un aspecto de esta realización, la muestra se selecciona de harina de maíz, jarabe de maíz, aceite de maíz, almidón de maíz, y cereales fabricados totalmente o en parte para contener productos de maíz.

En otra realización, la presente invención proporciona un extracto derivado de una planta, tejido, o semilla de maíz de evento MIR604, que comprende una secuencia nucleotídica que es o es complementaria a una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2. En un aspecto de esta realización, la secuencia se detecta en el extracto usando un método de amplificación de ácido nucleico o de hibridación de ácido nucleico. En

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otro aspecto de esta realización, la muestra se selecciona de harina de maíz, jarabe de maíz, aceite de maíz, almidón de maíz y cereales fabricados completamente o en parte para contener productos de maíz.

Aún en otra realización, la presente invención proporciona un método para producir una planta de maíz resistente a al menos una infestación de gusanos de raíz de maíz, que comprende: (a) cruzar sexualmente una primera planta de maíz progenitora con una segunda planta de maíz progenitora, en el que dicha primera o segunda planta de maíz progenitora comprende el ADN del evento de maíz MIR604, produciendo de ese modo una pluralidad de plantas de progenie de primera generación; (b) seleccionar una planta de progenie de primera generación que es resistente a al menos la infestación de gusanos de raíz del maíz; (c) autofecundar la planta de progenie de primera generación, produciendo de ese modo una pluralidad de plantas de progenie de segunda generación; y (d) seleccionar de las plantas de progenie de segunda generación, una planta que es al menos resistente a la infestación de gusanos de raíz del maíz; en el que las plantas de progenie de segunda generación comprenden una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2.

En otra realización, la presente invención proporciona un método para producir semillas de maíz híbridas, que comprende: (a) sembrar semillas de una primera línea de maíz endogámica que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, y SEC ID NO: 4, y semillas de una segunda línea endogámica que tiene un genotipo diferente; (b) cultivar las plantas de maíz que resultan de dicha siembra hasta el momento de la floración; (c) emascular dichas flores de plantas de una de las líneas endogámicas de maíz; (d) cruzar sexualmente entre sí las dos líneas endogámicas diferentes; y (e) cosechar la semilla híbrida producida de ese modo. En un aspecto de esta realización, la primera línea de maíz endogámica proporciona los progenitores femeninos. En otro aspecto de esta realización, la primera línea de maíz endogámica proporciona los progenitores masculinos. La presente invención también comprende la semilla híbrida producida por el método divisado, y plantas híbridas que se hacen crecer a partir de la semilla.

Un experto en la técnica reconocerá que el genotipo transgénico de la presente invención se puede introgresar mediante reproducción en otras líneas de maíz que comprenden diferentes genotipos transgénicos. Por ejemplo, el maíz endogámico que comprende el genotipo transgénico de la presente invención se puede cruzar con un maíz endogámico que comprende el genotipo transgénico del evento Bt11 resistente a lepidópteros, que se conoce en la técnica, produciendo de esta manera semillas de maíz que comprenden tanto el genotipo transgénico de la invención como el genotipo transgénico Bt11. Los ejemplos de otros eventos transgénicos que pueden cruzarse con un endogámico de la presente invención incluyen los eventos tolerantes al glifosato GA21 y NK603, el evento MON802 resistente a insectos lepidópteros/tolerante a glifosato, el evento DBT418 resistente a lepidópteros, el evento DAS06275-8 resistente a lepidópteros, el evento MS3 estéril masculino, el evento B16 tolerante a la fosfinotricina, el evento MON 80100 resistente a insectos lepidópteros, los eventos T14 y T25 tolerantes a fosfinotricina, el evento 176 resistente a insectos lepidópteros, y el evento MON863 resistente a coleópteros, todos los cuales se conocen en la técnica. Se reconocerá además que se pueden realizar otras combinaciones con el genotipo transgénico de la invención y, por lo tanto, estos ejemplos no deben considerarse limitantes.

Un experto en la técnica también reconocerá que la semilla de maíz transgénico que comprende el genotipo transgénico de la presente invención puede tratarse con diversas sustancias químicas de tratamiento de semillas, incluyendo insecticidas, para aumentar o sinergizar la actividad insecticida de la proteína Cry3A055. Por ejemplo, la semilla de maíz transgénica de la presente invención puede tratarse con el insecticida comercial Cruiser®. Tal combinación puede usarse para incrementar el espectro de actividad y para incrementar la eficacia de la proteína expresada y la sustancia química.

Reproducción

El genotipo transgénico de la presente invención puede hacer introgresar en cualquier maíz endogámico o híbrido que usa las técnicas de reproducción reconocidas en la técnica. El objetivo de la reproducción vegetal es combinar en una variedad o híbrido único diversos rasgos deseables. Para cultivos de campo, estos rasgos pueden incluir resistencia a insectos y enfermedades, tolerancia a herbicidas, tolerancia al calor y la sequía, reducción del tiempo para maduración del cultivo, mayor rendimiento, y calidad agronómica mejorada. Con la cosecha mecánica de muchos cultivos, es importante la uniformidad de características de la planta tales como germinación y establecimiento en reposo, velocidad de crecimiento, madurez, y altura de la planta y la mazorca.

Los cultivos de campo se reproducen a través de técnicas que aprovechan el método de polinización de la planta. Una planta se autopoliniza si el polen de una flor se transfiere a la misma u otra flor de la misma planta. Una planta se poliniza cruzadamente si el polen proviene de una flor en una planta diferente.

Las plantas que se han autopolinizado y seleccionado por tipo para muchas generaciones se vuelven homocigotas en casi todos los loci génicos, y producen una población uniforme de progenie de reproducción verdadera. Un cruzamiento entre dos líneas homocigóticas diferentes produce una población uniforme de plantas híbridas que pueden ser heterocigotas para muchos loci génicos. Un cruzamiento de dos plantas, cada una heterocigota en un número de loci génicos, producirá una población de plantas híbridas que difieren genéticamente y no serán uniformes.

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reproducción de planta de maíz, los endogámicos de élite se pueden usar como una línea parental o material de partida

o población de fuente, y puede servir ya sea como el progenitor donante o recurrente.

Desarrollo de Híbridos de Maíz

Un híbrido de maíz de un solo cruce resulta del cruce de dos líneas endogámicas, cada una de las cuales tiene un genotipo que complementa el genotipo de la otra. La progenie híbrida de la primera generación se designa F1. En el desarrollo de híbridos comerciales en un programa de reproducción de planta de maíz, solamente se buscan las plantas de híbrido F1. Los híbridos F1 preferidos son más vigorosos que sus progenitores endogámicos. Este vigor del híbrido, o heterosis, se puede manifestar en muchos rasgos poligénicos, que incluyen crecimiento vegetativo aumentado y rendimiento aumentado.

El desarrollo de un híbrido de maíz en un programa de reproducción de planta de maíz implica tres etapas: (1) la selección de plantas de varios conjuntos de germoplasma para cruces de reproducción inicial; (2) la autofecundación de las plantas seleccionadas a partir de los cruces de reproducción durante varias generaciones para producir una serie de líneas endogámicas, las cuales, aunque diferentes una de otra, se reproducen de verdad y son altamente uniformes; y

(3) el cruce de las líneas endogámicas seleccionadas con diferentes líneas endogámicas para producir la progenie híbrida (F1). Durante el proceso de reproducción en maíz, el vigor de las líneas disminuye. El vigor se restaura cuando dos líneas endogámicas diferentes se cruzan para producir la progenie híbrida (F1). Una consecuencia importante de la homocigosidad y homogeneidad de las líneas endogámicas es que el híbrido entre un par definido de endogámicos siempre será el mismo. Una vez que los endogámicos que dan un híbrido superior se han identificado, la semilla híbrida se puede reproducir por un tiempo indefinido en tanto que se mantenga la homogeneidad de los progenitores endogámicos. Una gran parte del vigor del híbrido mostrado por los híbridos F1 se pierde en la siguiente generación (F2). Consecuentemente, la semilla de híbridos no se usa para plantar plantas madre.

La producción de semilla híbrida requiere la eliminación o inactivación del polen producido por el progenitor femenino. La eliminación o inactivación incompleta del polen proporciona el potencial de autopolinización. Esta semilla autopolinizada inadvertidamente puede ser cosechada no intencionadamente y se puede envasar con la semilla híbrida.

Una vez que se siembra la semilla, es posible identificar y seleccionar estas plantas autopolinizadas. Estas plantas autopolinizadas serán equivalentes genéticamente a la línea endogámica femenino usada para producir el híbrido.

Como es fácilmente manifiesto por un experto en la técnica, lo anterior es solamente algunas de las diversas formas mediante las cuales el endogámico de la presente invención se puede obtener por aquellos que buscan introgresar el genotipo transgénico de la invención en otras líneas de maíz. Están disponibles otros medios, y los ejemplos anteriores son solamente ilustrativos.

EJEMPLOS

La invención además estará descrita con referencia a los siguientes ejemplos detallados. Estos ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos solamente, y no están destinados para ser limitantes a menos que se especifique de otra manera. Las técnicas de ADN recombinante y clonación molecular estándar usadas aquí son bien conocidas en la técnica y se describen por Ausubel (ed.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994); J. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d Ed., Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001); y por T. J. Silhavy, M. L. Berman, y L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984).

Ejemplo 1. Transformación y selección del evento MIR604.

El evento MIR604 fue producido por transformación mediada por Agrobacterium de la línea de maíz endogámico (Zea mays) A188. El callo embriogénico tipo I se transformó esencialmente como se describe en Negrotto et al., (Plant Cell Reports 19:798-803, 2000), usando un fragmento de ADN de plásmido pZM26 (Figura 1). pZM26 contiene una secuencia nucleotídica que comprende casetes de expresión en tándem. El primer casete de expresión se compone de una secuencia de promotor MTL (Patente US 6.018.099) ligada operablemente a una secuencia codificante de cry3A055 ligada además operablemente a una secuencia de poliadenilación y terminación de trascripción del extremo 3’ de nopalina sintetasa. El segundo casete de expresión se compone de un promotor de ubiquitina de maíz (ZmUbInt) (Christensen et al., 1992 PMB 18:675) ligado operablemente a una secuencia codificante de pmi ligada además operablemente a una secuencia de poliadenilación y terminación de trascripción del extremo 3’ de nopalina sintasa.

Los embriones inmaduros se cortaron de mazorcas de 8-12 días y se enjuagaron con medio reciente en preparación para la transformación. Los embriones se mezclaron con la suspensión de células Agrobacterium que albergan el vector de transformación pZM26, se pusieron en torbellino durante 30 segundos, y se dejaron incubar durante unos 5 minutos adicionales. La disolución de Agrobacterium en exceso se aspiró, y los embriones se movieron entonces a placas que contienen un medio de cultivo no selectivo. Los embriones se cocultivaron con el Agrobacterium que queda a 22ºC durante 2-3 días en la oscuridad. Los embriones se transfirieron a medio de cultivo suplementado con ticarcilina (100 mg/ml) y nitrato de plata (1,6 mg/l), y se incubaron en la oscuridad durante 10 días. Los embriones que producen callo embriogénico se transfirieron a medio de cultivo celular que contiene manosa.

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Nombre del cebador Secuencia del cebador SEC ID NO:

(marcador 5’ = TET, marcador 3’ = TAMRA)

Ejemplo 3. Detección de MIR604 por transferencia Southern

El ADN genómico usado para análisis de southern se aisló del tejido de hoja reunido de diez plantas que representan la generación seis de retrocruzamiento (BC6) de MIR604 usando esencialmente el método de Thomas et al., (Theor. Appl. Genet. 86:173-180, 1993). Todas las plantas usadas para aislar ADN se analizaron individualmente usando PCR de TAQMAN (como se describe en el Ejemplo 2) para confirmar la presencia de una sola copia del gen cry3A055 y el gen pmi. Para los controles segregantes negativos, el ADN se aisló de tejido de hoja reunido de cinco plantas que representan la generación BC4 del evento MIR604. Estas plantas segregantes negativas se analizaron individualmente usando PCR de TAQMAN, y los ensayos fueron negativos para la presencia del gen cry3A055 y el gen pmi, pero fueron, como se esperaba, positivos para el control interno del ensayo, el gen adh de maíz endógeno.

El análisis de Southern se llevó a cabo usando técnicas de biología molecular convencionales. EL ADN genómico (7,5 g) se digirió con enzima de restricción KpnI, que tiene un sitio de reconocimiento único en el inserto de T-ADN de MIR604 de plásmido pZM26 (Figura 1). Este enfoque permite la determinación del número de copias de los elementos, que corresponden a la sonda específica usada para cada Southern, que se ha incorporado en MIR604. Esto da como resultado una banda de hibridación por copia del elemento presente en MIR604. Tras la electroforesis en gel de agarosa y transferencia alcalina a una membrana Nytran®, las hibridaciones se llevaron a cabo usando sondas generadas con PCR de longitud completa específicas del elemento. La sonda usada en las transferencias Southern de cry3A055 y pmi comprende las secuencias nucleotídicas expuestas en SEC ID NO: 58 y SEC ID NO: 61, respectivamente. Las sondas se marcaron con 32P vía cebado aleatorio usando el sistema Rediprime™ II (Amersham Biosciences, nº de catálogo RPN1633).

Se usaron las siguientes condiciones de hibridación muy restrictivas: 1-2 millones de cpm/ml se añaden a PerfectHyb (Sigma) suplementado con 100 g/ml de ADN de timo de ternera (Invitrogen) precalentado a 65ºC. La prehibridización tiene lugar en la misma disolución como anteriormente, a la misma temperatura durante la noche o durante al menos una hora. La hibridación se llevó a cabo a 65ºC durante 3 horas seguido del lavado 2X en 2X SSC, SDS al 0,1% durante 20 minutos a 65ºC y 2X en 0,1X SSC, SDS al 0,1% durante 20 minutos a 65ºC.

En cada Southern se incluyeron tres muestras de control: (1) ADN de un segregante negativo (no transformado) usado para identificar cualesquiera secuencia de Zea mays endógenas que puedan hibridarse de forma cruzada con la sonda específica del elemento; (2) el ADN de un segregante negativo en el cual se introduce una cantidad de pZM26 digerido con KpnI que es igual a un número de copias basado en la longitud de la sonda, para demostrar la sensibilidad del experimento en la detección de una sola copia génica dentro del genoma de Zea mays; y (3) el plásmido pZM26 digerido con KpnI que es igual a un número de copias basado en la longitud de la sonda, como un control positivo para hibridación así como para demostrar la sensibilidad del experimento.

Los datos de hibridación proporcionan pruebas confirmatorias para apoyar el análisis de PCR de TAQMAN de que MIR604 contiene una sola copia de los genes cry3A055 y pmi, y que MIR604 no contiene ninguna de las secuencias de soporte de vector presente en pZM26. Como se espera para ambas sondas cry3A055 y pmi, la digestión de KpnI dio como resultado una única banda de hibridación del tamaño correcto, demostrando que una sola copia de cada gen está presente en el evento MIR604. Adicionalmente, para la sonda de soporte la carencia de hibridación demuestra la ausencia de cualquier secuencia de soporte de vector pZM26 que se incorporan en MIR604 durante el proceso de transformación.

Ejemplo 4. Secuenciación del inserto de T-ADN

La secuencia nucleotídica de todo el inserto de ADN transgénico presente en el evento MIR604 se determinó para demostrar la integridad global del inserto, la vecindad de los elementos funcionales, y para detectar cualesquiera cambio de pares de bases individuales. El inserto de MIR604 se amplificó mediante PCR a partir de ADN derivado de la generación BC5 como dos fragmentos solapantes individuales. Cada fragmento se amplificó usando un cebador polinucleotídico homólogo a secuencias genómicas vegetales que flanquean el inserto de MIR604, y un cebador polinucleotídico homólogo al gen cry3A055. Para generar el fragmento 5’, se combinó un primer cebador polinucleotídico homólogo a la secuencia de flanqueo 5’, 5’S1 (SEC ID NO: 15) con un segundo cebador polinucleotídico homólogo al ADN insertado dentro del gen cry3A055, 5’AS1 (SEC ID NO: 28). Para generar el fragmento 3’, se combinó un primer cebador polinucleotídico homólogo a la secuencia de flanqueo 3’, 9268AS (SEC ID NO: 45), con un segundo cebador polinucleotídico homólogo al ADN insertado dentro del gen cry3A055, 5161S (SEC ID NO: 27).

La amplificación mediante PCR se llevó a cabo usando el sistema de PCR Expand High Fidelity (Roche, nº de catálogo 1732650), y los siguientes parámetros de amplificación: 2 minutos a 94ºC durante 1 ciclo, seguido de 10 ciclos de 15 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55-65ºC y 5 minutos a 68ºC, seguido de 20 ciclos de 15 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55-65ºC, y 5 minutos +5 segundos/ciclo de 72ºC, seguido de 1 ciclo de 7 minutos a 72ºC.

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El amplicón que resulta de la amplificación mediante PCR usando la SEC ID NO: 15 y SEC ID NO: 28 comprendió la secuencia de unión 5’ (SEC ID NO: 1). El amplicón que resulta de la amplificación mediante PCR usando SEC ID NO: 45 y SEC ID NO: 27 comprendió la secuencia de unión 3’ (SEC ID NO: 2). Cada fragmento de secuenciación fue clonado individualmente en el vector pCR®-XL-TOPO (Invitrogen, nº de catálogo K4700-20), y se identificaron y secuenciaron tres clones distintos para cada fragmento. La secuenciación se llevó a cabo usando el analizador ABI3730XL usando química ABI BigDye® 1.1 o Big Dye 3.1 dGTP (para moldes ricos en GC). El análisis de secuencia se hizo usando el paquete Phred, Phrap, y Consed de la Universidad de Washington, y se llevó a cabo a una tasa de error menor que 1 en 10.000 bases (Ewing y Green, 1998). La secuencia de consenso final se determinó combinando los datos de secuencias de los seis clones individuales (tres para cada fragmento de secuenciación) para generar una secuencia de consenso del inserto MIR604. Para validar adicionalmente cualesquiera discrepancias de pares bases individuales entre el inserto de MIR604 y el plásmido pZM26, los productos de PCR pequeños (aproximadamente 300500 pb) específicos para cualquiera de las regiones en las que se observó una discrepancia de pares de bases en la secuencia de consenso inicial se amplificaron usando la misma metodología anterior. Para todas las discrepancias de pares de bases putativas en el inserto MIR604, la secuenciación directa del producto de PCR dio como resultado picos claros individuales en todos los pares de bases en cuestión, indicando que estas discrepancias están presentes probablemente en el inserto MIR604. El alineamiento se realizó usando el programa ClustalW con los siguientes parámetros: matriz de puntuación blosum55, penalización de apertura de salto 15, penalización de extensión de salto

6.66 (Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680).

Los datos de secuencia de consenso para el inserto de T-ADN de MIR604 demuestran que se han mantenido la integridad global del inserto y la contiguidad de los elementos funcionales en el inserto como se pretende en pZM26. El análisis de secuencia reveló que se produjo cierto truncamiento en los extremos de la frontera derecha (RB) (SEC ID NO: 57) y de la frontera izquierda (LB) (SEC ID NO: 62) del inserto de T-ADN durante el proceso de transformación que dio como resultado el evento MIR604. La porción RB del inserto de T-ADN se truncó en 44 pb, y el extremo LB del inserto de T-ADN se truncó en 43 pb. Estas supresiones no tienen efecto sobre la eficacia del inserto de T-ADN, y este fenómeno se ha observado previamente en transformación mediante Agrobacterium (Tinland y Hohn, 1995. Genetic Engineering, 17:209-229). Adicionalmente, se observaron tres cambios de pares de bases en el inserto de T-ADN de MIR604. Se produjo una discrepancia en el promotor MTL, una región reguladora que no codifica una proteína. Las dos discrepancias restantes se produjeron en la secuencia codificante de pmi, y dio como resultado dos cambios de aminoácidos; la valina en la posición 61 se ha sustituido por alanina (V61A), y la glutamina en la posición 210 se ha sustituido por histidina (Q210H). La alanina y la valina son ambas aminoácidos alifáticos que dan como resultado una sustitución conservativa. La sustitución de glutamina por histidina da como resultado la sustitución de un resto ácido por un resto básico.

Ejemplo 5. Análisis de secuencia de ADN de flanqueo

La secuencia de ADN del genoma de maíz que flanquea al ADN heterólogo insertado dentro del genoma de la planta de maíz del evento MIR604 se obtuvo usando tecnología OmniPlex™, esencialmente como se describe en Kamberov et al., (Proceedings of SPIE, Tools for Molecular Análisis and High-Throughput Screening, 4626:1-12, 2002).

Las secuencias de flanqueo y secuencias de unión 5’ y 3’ se confirmaron usando procedimientos de PCR estándar. Las secuencias de flanqueo y de unión 5’ se confirmaron usando un primer cebador polinucleotídico expuesto en SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12 o SEC ID NO: 13, combinado con un segundo cebador polinucleotídico expuesto en SEC ID NO: 16 o SEC ID NO: 17. Las secuencias de flanqueo y de unión 3’ se confirmaron usando un primer cebador polinucleotídico expuesto en SEC ID NO: 39, SEC ID NO: 40, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 42, SEC ID NO: 43 o SEC ID NO: 44, combinado con un segundo cebador polinucleotídico expuesto en SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 32, SEC ID NO: 33, SEC ID NO: 34, SEC ID NO: 35 o SEC ID NO: 36. Se reconocerá por la persona experta que se pueden usar otras secuencias cebadoras para confirmar las secuencias de flanqueo y de unión.

Se encontró que el inserto de M1R604 está flanqueado en la frontera derecha (secuencia de flanqueo 5’) por la secuencia genómica de maíz mostrada en SEC ID NO: 5, y está flanqueada en la frontera izquierda (secuencia de flanqueo 3’) por la secuencia genómica de maíz mostrada en SEC ID NO: 6. La secuencia de unión 5’ se expone en SEC ID NO: 1. La secuencia de unión 3’ se expone en SEC ID NO: 2.

Ejemplo 6. Detección de la proteína MIR604 vía ELISA

Para caracterizar el intervalo de expresión de las proteínas Cry3A055 (el principio insecticida activo) y fosfomanosa isomerasa (PMI) (el marcador seleccionable) en plantas MIR604, se determinaron las concentraciones de proteína Cry3A055 y PMI mediante ELISA en varios tejidos vegetales y plantas completas en cuatro etapas de crecimiento (verticilo, antesis, madurez de la semilla y senescencia) en dos híbridos (MIR604-B y MIR604-C) y un endogámico (MIR604-A). Los híbridos fueron hemicigotos para los transgenes en el evento MIR604, mientras que el endogámico fue homocigoto para los transgenes.

Plantas completas y plantas individuales (excepto polen) se redujeron a un polvo fino mediante procesamiento usando un molinillo de café, una amasadora, una trituradora Grindomix™ (Brinkmann Instruments; Westbury, NY, USA), mortero con una mano de almirez, o un molino, o una combinación de estos dispositivos. Todo el procesamiento se

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referencia pura que se encuentra sobre la porción lineal de la curva patrón, el volumen máximo de un extracto de control que se pudo analizar sin interferencia de fondo, y el peso correspondiente de la muestra que representó la alícuota.

La proteína PMI se detectó en la mayoría de los tejidos vegetales analizados derivados de MIR604, sin embargo a niveles bajos. En la mayoría de los casos, los resultados se presentan como medias de las cinco muestras tisulares repetidas. Para ensilaje, se analizó una réplica; por lo tanto, no se pudo calcular ninguna media. Los niveles de la muestra de control están por debajo del límite de cuantificación para todas las etapas y tejidos.

A lo largo de todas las etapas de la planta, los niveles medios de PMI medidos en hojas, raíces y plantas completas oscilaron desde indetectable (ND) hasta aprox. 0,4 g/g de peso reciente (ND-2,1 g/g de peso seco), por debajo del LOQ (<0,03 g/g de peso reciente) hasta alrededor de 0,2 /g de peso reciente (<0,1 – 1,0 g/g de peso seco), y por debajo del LOQ (<0,02 g/g de peso reciente) hasta alrededor de 0,3 g/g de peso reciente (<0,04 -2 g/g de peso seco), respectivamente. Los niveles medios de PMI medidos en pepitas en la madurez de semillas y senescencia oscilaron desde debajo del LOQ (<0,06 g/g de peso freso) hasta alrededor de 0,4 g/g de peso reciente (<0,07 – 0,5 g/g de peso seco). Los niveles medios de PMI medidos en tejido sedoso en antesis y madurez de la semilla oscilaron desde debajo del LOQ (<0,1 g/g de peso reciente) hasta alrededor de 0,8 g/g de peso reciente (<0,2 – 6,8 g/g de peso seco). PMI en polen osciló desde alrededor de 1,9 – 2,6 g/g de peso reciente (3,9 – 5,2 g/g de peso seco).

Los niveles de PMI fueron generalmente similares entre los genotipos endogámico e híbrido para cada tipo tisular en cada punto de tiempo. PMI no se pudo detectar en ensilaje en los tres tiempos de muestreo (día 15, 29 y 75), mientras que el nivel medido en el material vegetal cortado antes del ensilaje (Día 0 previo al ensilaje) fue alrededor de 0,3 g/g de peso reciente (0,7 g/g de peso seco).

Niveles de proteína Cry3A055 total estimados por acre y por hectárea

Para la línea endogámica (MIR604-A) y para ambos híbridos (MIR604-B y MIR604-C), las plantas alcanzaron su mayor biomasa en la madurez de las semillas. Las plantas también alcanzaron sus niveles medios de Cry3A055 estimados más elevados en una base por acre (y por hectárea) en la madurez de la semilla, y se estimó que contenían alrededor de 78, 141 y 240 g de Cry3A055/acre (193, 348 y 592 g/hectárea) para MIR604-A, MIR604-B y MIR604-C, respectivamente. A lo largo de la estación de crecimiento y a través de los genotipos, las estimaciones de Cry3A055 en plantas derivadas de MIR604 oscilaron desde niveles medios de alrededor de 8 g de Cry3A055/acre (21 g de Cry3A055/hectárea) en la etapa de senescencia hasta alrededor de 240 g de Cry3A055/acre (592 g Cry3A055/hectárea) en la madurez de la semilla, suponiendo una densidad de siembra de 26.500 plantas por acre (65.500 plantas/hectárea).

Ejemplo 7. Eficacia en Campo de MIR604

Gusano de raíz de maíz del oeste y del norte

Las plantas MIR604 se ensayaron para determinar la eficacia frente al gusano de raíz de maíz occidental y del norte en 12 localizaciones en los Estados Unidos de América. MIR604 se ensayó con y sin la adición del tratamiento insecticida de semillas Cruiser®. Los grupos de control consistieron en semilla tratada con dos tasas diferentes de Cruiser® y un control no tratado. Los tratamientos consistieron en cuatro réplicas de dos filas de 17,5-20 pies (5,3-6,1 metros) separados 30” (76,2 cm) en el centro diseñado en un bloque completo aleatorizado. Se escogieron al azar diez plantas por tratamiento y se evaluaron en busca de la eficacia usando una escala de 0-3, en la que 0 = ningún daño de alimentación (la puntuación más baja que se puede dar); 1 = un nodo (círculo de raíces), o el equivalente de un nodo completo, comido en aproximadamente dos pulgadas (5 cm) del tallo (línea del suelo en el 7º nodo); 2 = dos nodos completos comidos; 3 = tres o más nodos comidos (puntuación más elevada que se puede dar). El daño entre nodos completos comidos se anotó como el porcentaje del nodo perdido, es decir, 1,50 = 1 ½ nodos comidos, 0,25 = ¼ de un nodo comido.

Los resultados, mostrados en la Tabla 1, demuestran que las raíces de dos líneas fraternas de MIR604, 3-11 y 3-12, sostuvieron un daño de alimentación significativamente menor que las raíces del tratamiento con Cruiser® o las raíces del control no tratado. MIR604-3-11 y MIR6004-3-12 tuvieron puntuaciones de daño de la raíz de 0,44 y 0,42, respectivamente, en comparación con los tratamientos con Cruiser® de 0,25 y 1,25 mgA/semilla, que tuvieron puntuaciones de daño de 1,6 y 0,9, respectivamente, y la línea de control con una puntuación de daño de 2,14. Hubo una tendencia hacia puntuaciones de daño de la raíz menores en las plantas MIR604, cuyas semillas se trataron con Cruiser®, sugiriendo que Cruiser® aumentó la proteína Cry3A055, o que hubo una posible sinergia entre Cruiser® y Cry3A055. Esto fue particularmente evidente en los tratamientos de semillas de 1,0 y 1,25 mgA/MIR604, con puntuaciones de daño de raíz de 0,33 y 0,29, respectivamente.

Tabla 1. Eficacia de MIR604 con y sin tratamiento de semillas Cruiser®

Línea de maíz Tratamiento Cruiser® (mgA/Semilla) Puntuación de daño a la raíz (Escala de 0-3 CRW)

MIR604-3-11 0 0,44

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Tratamiento

Tasa de Cruiser® (mgA/Semilla) Puntuación de daño a la raíz (Escala de 0-3 CRW)

0,25

0,18

0,50

0,21

1,25

0,04

Híbrido de control

0,125 1,59

1,25

0,71

0

2,76

Tabla 4. Eficacia de MIR604 en comparación con insecticidas comerciales aplicados en el surco frente a gusano de raíz de maíz mejicano

Tratamiento Puntuación de daño a la raíz (Escala de 0-3 CRW)

MIR604

0,68

Force® 3G

0,66

Aztec® 6.7G

0,88

Lorsban® 15 G

0,81

Control no tratado

2,76

Aunque se ha descrito la invención anterior con cierto detalle a modo ilustrativo y de ejemplo con el propósito de facilitar su comprensión, será obvio que se pueden realizar ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de la presente invención.

Realizaciones de la invención:

En una primera realización, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende al menos una secuencia nucleotídica de unión del evento de maíz MIR604 seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2 y sus complementos.

La realización 2 se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN de inserto heteróloga del evento de maíz MIR604 y al menos 10 nucleótidos contiguos de un ADN de genoma de planta de maíz que flanquea dicha secuencia de ADN de inserto del evento de maíz MIR604.

La realización 3 se refiere a la molécula de ácido nucleico aislada de la realización 2 que comprende al menos 20 nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN de inserto heteróloga del evento de maíz MIR604, y al menos 20 nucleótidos contiguos de un ADN de genoma de planta de maíz que flanquea dicha secuencia de ADN de inserto del evento de maíz MIR604.

La realización 4 se refiere a la molécula de ácido nucleico aislada de la realización 2 que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN de inserto heteróloga del evento de maíz MIR604, y al menos 50 nucleótidos contiguos de un ADN de genoma de planta de maíz que flanquea dicha secuencia de ADN de inserto del evento de maíz MIR604.

La realización 5 se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4 y sus complementos.

La realización 6 se refiere a un ácido nucleico aislado que liga una molécula de ADN heteróloga al genoma de la planta de maíz en el evento de maíz MIR604 que comprende una secuencia de aproximadamente 11 a aproximadamente 20 nucleótidos contiguos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2 y sus complementos.

La realización 7 se refiere a un amplicón que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las realizaciones 1 a 6.

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5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

(a)

poner en contacto la muestra con una sonda que se hibrida en condiciones muy restrictivas con ADN genómico del evento de maíz MIR604 y no se hibrida en condiciones muy restrictivas con ADN de una planta de maíz de control;

(b)

someter la muestra y la sonda a condiciones muy restrictivas de hibridación; y

(c)

detectar la hibridación de la sonda al ADN.

La realización 24 se refiere a un kit para detectar la presencia de ácidos nucleicos de MIR604 en una muestra biológica, donde el kit comprende al menos una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos contiguos con una longitud suficiente que es, o es complementaria a, SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3 o SEC ID NO: 4 que actúa como una sonda o cebador de ADN específicos para el evento de maíz MIR604.

La realización 25 se refiere a un método para detectar la proteína del evento de maíz MIR604 en una muestra biológica que comprende: (a) extraer la proteína de una muestra de tejido del evento de maíz MIR604; (b) someter a ensayo la proteína extraída utilizando un método inmunológico que comprende un anticuerpo específico para la proteína insecticida o marcadora seleccionable producida por el evento MIR604; y (c) detectar la unión de dicho anticuerpo a la proteína insecticida o marcadora seleccionable.

La realización 26 se refiere a una planta de maíz que comprende una secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4 o sus complementos.

La realización 27 se refiere a la planta de maíz de acuerdo con la realización 26, donde la digestión del ADN genómico de la planta con la endonucleasa de restricción Kpnl da como resultado una única banda hibridante de cry3A055 utilizando una sonda específica para cry3A055 en condiciones muy restrictivas.

La realización 28 se refiere a la planta de maíz de la realización 27, donde dicha sonda comprende la secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO: 56 o SEC ID NO: 59.

La realización 29 se refiere a la planta de maíz de acuerdo con la realización 26, donde la digestión del ADN genómico de la planta con la endonucleasa de restricción Kpnl da como resultado una única banda hibridante de pmi utilizando una sonda específica para pmi en condiciones muy restrictivas.

La realización 30 se refiere a la planta de maíz de la realización 29, donde la sonda comprende la secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO: 62.

La realización 31 se refiere a la planta de maíz de acuerdo con la realización 26, que se deriva del evento MIR604.

La realización 32 se refiere a un kit para detectar la presencia de ADN de un evento de maíz MIR604 en una muestra biológica que comprende la molécula de una primera sonda que comprende al menos 11 nucleótidos contiguos que es,

o es complementaria, a una secuencia nucleotídica del grupo que consiste en SEC ID NO: 3 desde aproximadamente la posición nucleotídica 792 hasta aproximadamente la posición nucleotídica 811 y la molécula de una segunda sonda que comprende al menos aproximadamente 11 nucleótidos contiguos que es, o es complementaria a, una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 4 desde aproximadamente la posición nucleotídica 497 hasta aproximadamente la posición nucleotídica 516, donde dicha molécula se hibrida específicamente con la secuencia nucleotídica en condiciones muy restrictivas de hibridación.

La realización 33 se refiere a un método para detectar la presencia de ADN del evento de maíz MIR604 en una muestra biológica, que comprende:

(a)

poner en contacto la muestra con un primer cebador polinucleotídico y un segundo cebador polinucleotídico que actúan juntos en una reacción de amplificación del ácido nucleico en presencia de un molde de ADN del evento de maíz MIR604 para producir un amplicón de diagnóstico para el evento de maíz;

(b)

realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico, para producir de esta manera el amplicón; y

(c)

detectar el amplicón.

La realización 34 se refiere al método de la realización 33, donde el amplicón comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4 y sus complementos.

La realización 35 se refiere al método de la realización 33, donde el amplicón comprende SEC ID NO: 1, donde la secuencia del primer cebador polinucleotídico se selecciona del grupo que consiste en SEC ID NO: 7 a SEC ID NO: 15 y sus complementos, y donde la secuencia del segundo cebador polinucleotídico se selecciona del grupo que consiste en SEC ID NO: 16 a SEC ID NO: 38 y sus complementos.

La realización 36 se refiere al método de la realización 33, donde el amplicón comprende SEC ID NO: 2, donde la secuencia del primer cebador polinucleotídico se selecciona del grupo que consiste en SEC ID NO: 39 a SEC ID NO: 46

Claims (1)

1. imagen1

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