ES2929070T3 - Métodos para producir sustancias químicas a base de carbono mediante procesamiento de biomasa de algas - Google Patents
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Abstract
La presente tecnología se relaciona con métodos novedosos para convertir material de biomasa de algas para la producción de productos químicos a base de carbono, en particular ácidos carboxílicos como el ácido láctico utilizando microorganismos extremadamente termofílicos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos para producir sustancias químicas a base de carbono mediante procesamiento de biomasa de algas Campo de la invención
La presente descripción se refiere a métodos novedosos para convertir material de biomasa de algas para la producción de ácido láctico mediante el uso de microorganismos extremadamente termófilos.
Antecedentes de la invención
En general, los productos de fermentación se producen mediante la degradación del material que contiene almidón en azúcares fermentables mediante licuefacción y sacarificación seguida de la conversión directa o indirecta de los azúcares en el producto de fermentación deseado mediante el uso de un organismo de fermentación.
Por ejemplo, muchos ácidos carboxílicos se producen industrialmente a gran escala. También son omnipresentes en la naturaleza. Los ácidos carboxílicos se usan en la producción de polímeros, productos farmacéuticos, disolventes y aditivos alimentarios. Los ácidos carboxílicos de importancia industrial incluyen ácido acético (componente del vinagre, precursor de solventes y recubrimientos), ácidos acrílico y metacrílico (precursores de polímeros, adhesivos), ácido adípico (polímeros), ácido cítrico (bebidas), ácido etilendiaminotetraacético (agente quelante), ácidos grasos (recubrimientos), ácido maleico (polímeros), ácido propiónico (conservante de alimentos), ácido tereftálico (polímeros). El ácido láctico se usa ampliamente en las industrias alimentaria, farmacéutica y textil. También se usa como fuente de polímeros de ácido láctico que se usan como plásticos biodegradables. Las propiedades físicas y la estabilidad de las polilactidas se pueden controlar ajustando las proporciones de las L(+)- y D(-)-lactidas. El ácido láctico ópticamente puro se produce actualmente mediante la fermentación de glucosa derivada del almidón de maíz mediante el uso de varias bacterias lácticas (Kenji Okano, Qiao Zhang, Satoru Shinkawa, Shogo Yoshida, Tsutomu Tanaka, Hideki Fukuda y Akihiko Kondo (2009). Producción eficiente de ácido D-láctico ópticamente puro a partir de almidón de maíz crudo mediante el uso de una cepa de Lactobacillus plantarum genéticamente modificada, deficiente en el gen L-lactato deshidrogenasa y secretora de amilasa. Applied and Environmental Microbiology, 75, 462-467).
Sin embargo, las bacterias lácticas tienen requisitos nutricionales complejos y el uso de maíz como materia prima compite directamente con los alimentos y piensos.
Las materias primas que no compiten directamente con los alimentos y los piensos son biomasa lignocelulósica naturalmente resistente. La lignocelulosa es la parte no comestible de las plantas. El uso de lignocelulosa para producir ácido carboxílico evita la competencia con la industria alimentaria. La lignocelulosa es la biomasa renovable más abundante. El rendimiento de la lignocelulosa puede alcanzar aproximadamente 200 mil millones de toneladas métricas en todo el mundo por año (Zhang, YHP, SY Ding, JR Mielenz, JB Cui, RT Elander, M. Laser, ME Himmel, JR McMillan y LR Lynd. (2007). Fractionating Recalcitrant Lignocellulose at Modest Reaction Condition. Biotechnology and Bioengineering. 97(2):214-23). La lignocelulosa es una materia prima con un bajo costo de producción. La lignocelulosa se puede encontrar en todas partes y está disponible como biomasa de desecho, incluidos los residuos agrícolas (paja de trigo, bagazo de caña de azúcar y rastrojo de maíz), cultivos energéticos (pasto interruptor) y desechos sólidos municipales (productos de papel y cartón) (Hamelinck, CN, VH Geertje y APC Faaij. (2005). Ethanol from Lignocellulosic Biomass: Techno-Economic Performance in Short-, Middle- and Long-Term." Biomass and Bioenergy. 28(4):384-410.).
Sin embargo, las características de la lignocelulosa tienen diferentes desventajas para el uso como materia prima que no compite con alimentos y piensos. Debido a que la lignocelulosa se compone principalmente de lignina, hemicelulosa y fibras de celulosa, esto se combina para formar una estructura de red firme y muy compacta. En estado natural, después de la reducción de tamaño, el acceso a la celulosa todavía está bloqueado por la lignina y la hemicelulosa debido a la estructura de la pared celular intacta. Además, la celulosa tiene una estructura altamente cristalina que es muy difícil de descomponer (Hsu, TA, M. Ladisch y G. Tsao. (1980). Alcohol from Cellulose. Chem. Technol 10(5):315-19.). Por lo tanto, actualmente se usan duros procesos de pretratamiento para destruir la estructura de las paredes celulares de las plantas de biomasa lignocelulósica y hacer que la celulosa sea más accesible al proceso posterior de hidrólisis (durante la hidrólisis, la celulosa se descompone en azúcares simples). Los métodos de pretratamiento se pueden clasificar en cuatro tipos: métodos físicos (por ejemplo, molienda y molienda); métodos fisicoquímicos (por ejemplo, explosión de vapor o hidrotermólisis); métodos químicos (por ejemplo, mediante el uso de ácidos, álcalis, agentes oxidantes o solventes orgánicos para tratar la biomasa); y métodos biológicos (por ejemplo, el uso de microorganismos y hongos para tratar la biomasa) (Kumar, P., d M Barrett, MJ Delwiche y P. Stroeve. (2009). Métodos de Pretratamiento de Biomasa Lignocelulósica para Hidrólisis Eficiente y Producción de Biocombustibles. Industrial & Engineering Chemistry Research 48 (8): 3713-29.). Sin embargo, solo aquellos métodos de pretratamiento que emplean productos químicos actualmente ofrecen altos rendimientos y bajos costos vitales para el éxito económico. Entre los más prometedores se encuentran los
pretratamientos que usan ácido diluido, dióxido de azufre, control de pH casi neutro, expansión de amoníaco, amoníaco acuoso y cal, con diferencias significativas entre los patrones de liberación de azúcar.
Aunque el pretratamiento de los materiales celulósicos naturalmente resistentes es esencial, si se deben lograr altos rendimientos de las operaciones biológicas; se proyecta que esta operación sea la etapa de procesamiento único y más costoso. Por ejemplo, alrededor del 20 % del costo total para la producción de etanol se basa en el proceso de pretratamiento (Bin Yang y Charles E. Wyman. (2008). Pre treatment: the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol. Biofuels, Bioprod. Bioref. 2:26-40). Además, el pretratamiento de la biomasa lignocelulósica generalmente liberará extractos y otros productos naturales y puede formar productos de degradación, como fragmentos de lignina y derivados de los mismos, que son inhibidores o incluso tóxicos para las enzimas y los organismos aguas abajo.Bin Yang y Charles E. Wyman. (2008). Pre treatment: the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol. Biofuels, Bioprod. Bioref. 2:26-40). Esto reducirá la productividad de cualquier proceso de fermentación posterior con biomasa lignocelulósica pretratada como materia prima, si no se usan enfoques para eludir esto.
La publicación MD. Mahabur Rhaman Talukder y otros, Biochemical Engineering Journal, vol. 68, 1 de octubre de 2012se refiere a un método para la producción de ácido láctico y la extracción de lípidos de la biomasa de microalgas mediante el tratamiento térmico del cultivo de algas seguido de un tratamiento químico para separar los lípidos del hidrolizado. Luego de esto, el hidrolizado libre de lípidos fue neutralizado y usado como medio de fermentación para Lactobacillus pentosus para producción de ácido láctico a 30 °C por 24 h.
El documento WO 2010/035142 A2 se refiere a la degradación de biomasa u otra materia orgánica con cepas hipertermófilas para producir energía o electricidad.
El documento WO 2013/050583 A1 describe métodos para convertir material de biomasa lignocelulósica hidrolizada en altos niveles de un biocombustible mediante el uso de cepas bacterianas termófilas extremas.
El documento WO 2013/041668 A1 se refiere a métodos para la conversión de material de biomasa lignocelulósica en biocombustibles mediante el uso de nuevas células bacterianas termófilas extremas celulolíticas aisladas pertenecientes al género Caldicellulosiruptor.
Por lo tanto, la disponibilidad y el uso de materias primas novedosas para la producción de productos químicos a base de carbono, como los ácidos carboxílicos, sería muy ventajoso.
Resumen de la descripción
La presente descripción se refiere a métodos que usan microorganismos termófilos extremos para convertir la biomasa de algas en productos químicos basados en carbono como ácidos carboxílicos, en particular ácido láctico y/o ácido acético. La presente invención se define por las reivindicaciones.
La presente descripción se refiere a métodos para producir ácido láctico a partir de material de biomasa de algas que convierte el material de biomasa de algas en ácido láctico en un proceso de una sola etapa, que comprende el método:
a) Cultivo y crecimiento de algas en un medio líquido hasta obtener la biomasa de algas deseada,
b) combinar un cultivo microbiano de acuerdo con las reivindicaciones y la biomasa de algas; y
c) Fermentar la biomasa de algas en condiciones de acuerdo con las reivindicaciones y durante un período de tiempo suficiente para producir ácido láctico, una sal o un éster del mismo, y opcionalmente
d) aislar dicho ácido láctico, una sal o un éster del mismo.
Las modalidades de esta descripción se relacionan con el uso de microorganismos del género Caldicellulosiruptor de acuerdo con las reivindicaciones en los métodos antes mencionados.
En otro aspecto más, las modalidades de esta descripción se relacionan con métodos para convertir material de biomasa de algas en ácido láctico que comprende la etapa de poner en contacto el material de biomasa de algas con el cultivo microbiano durante un período de tiempo a una temperatura inicial y una temperatura inicial de acuerdo con las modalidades, de esta manera producir una cantidad de ácido láctico, en donde el cultivo microbiano comprende un microorganismo extremadamente termófilo de acuerdo con las reivindicaciones.
Descripción de la descripción
La presente descripción se refiere a métodos que usan microorganismos termófilos extremos para procesar biomasa de algas en ácido láctico.
La descripción se refiere, en ciertos aspectos, al uso de microorganismos termófilos, que son capaces de convertir la biomasa de algas como, por ejemplo, la microalga Nanocloropsis salina, a productos solubles que pueden usarse por el mismo u otro microorganismo para producir ácido láctico o sales o ésteres del mismo.
La aplicación de esta tecnología tiene el potencial de hacer que la producción de ácido láctico sea más factible económicamente y permitir que un intervalo más amplio de microorganismos utilice biomasa recalcitrante. El uso de materiales celulósicos como fuentes de bioenergía está actualmente limitado porque típicamente requiere un preprocesamiento del material celulósico. Dichos métodos de preprocesamiento pueden ser costosos. Por lo tanto, los métodos que reducen la dependencia del procesamiento previo de materiales celulósicos pueden tener un impacto dramático en la economía del uso de biomasa recalcitrante para la producción de biocombustibles. Un desafío en la conversión de biomasa en productos de fermentación es la obstinación y heterogeneidad del material biológico. Los presentes inventores han encontrado microorganismos del género Caldicellulosiruptor, que tienen una variedad de propiedades ventajosas para su uso en la conversión de material de biomasa de algas en ácidos carboxílicos, preferentemente en un proceso de una sola etapa.
La biomasa de algas representa una fuente renovable y potencialmente económica de azúcares para la fermentación. Por lo tanto, la industria de la producción de productos de fermentación como el ácido láctico se enfrenta al desafío de redirigir el proceso de producción de la fermentación de materiales amiláceos convertibles con relativa facilidad pero costosos, a la biomasa de algas de bajo costo.
Las algas representan un grupo diverso de eucariotas fotosintéticos primitivos que habitan la mayoría de los ecosistemas litorales de agua dulce, marinos y terrestres del planeta. Las diversas formas morfológicas que exhiben las algas incluyen unicélulas microscópicas, colonias, filamentos y talos grandes y complejos (es decir, 'cuerpos' tridimensionales como las algas marinas). La evidencia molecular reciente revela que los organismos llamados "algas" encajan en linajes evolutivos muy diferentes, incluidos los relacionados con plantas, hongos o animales (Lucentinii J (2005) Secondary endosymbiosis exposed. The Scientist 19: 22-23).
A diferencia del almidón, que contiene polímeros homogéneos y fácilmente hidrolizados, la biomasa de algas contiene paredes celulares de algas, que a menudo representan el componente dominante de la matriz extracelular y representan el porcentaje más grande o significativo del carbono fijado fotosintéticamente de las algas. Las paredes típicamente suelen ser compuestos fibrosos de polisacáridos microfibrilares incrustados en polisacáridos de matriz y proteoglicanos (revisado porDomozych, David S (septiembre de 2011) Algal Cell Walls. In: eLS. John Wiley y Sons, Ltd: Chichester. DOI: 10.1002/9780470015902.a0000315.pub3). La diversa serie de paredes celulares exhibidas en los diversos grupos de algas es una manifestación de los orígenes evolutivos antiguos y las presiones ecológicas de los hábitats terrestres modernos.
A diferencia de las plantas superiores del ejemplo, aquellas que comprenden el grupo de Traqueofita la presencia de lignocelulosa en la pared celular de las algas es bastante rara o inexistente (Patrick T. Martone1, Jose M. Estevez, Fachuang Lu, Katia Ruel, Mark W. Denny, Chris Somerville, John Ralph:Discovery of Lignin in Seaweed Reveals Convergent Evolution of Cell-Wall Architecture. Current Biology 19 (2), 27 de enero de 2009; S 169-175). Por lo tanto, los rigurosos procesos de pretratamiento necesarios para tratar las paredes celulares de las plantas de biomasa lignocelulósica pueden reducirse o eliminarse mediante el uso de biomasa de algas como materia prima. Esto hace que el uso de biomasa de algas como materia prima empobrecida en lignocelulosa tenga muchas ventajas, ya que la producción de compuestos inhibidores o incluso tóxicos de un proceso de pretratamiento se reducirá o eliminará y además reducirá los costes. Adicionalmente, las algas se producen en fotorreactores o estanques cerrados; no competirán directamente con los alimentos y piensos, que se producen en tierras agrícolas. El uso de microorganismos extremadamente termófilos en procesos de fermentación con biomasa de algas tiene varias ventajas: Las altas temperaturas pueden debilitar las paredes celulares de las algas más fácilmente que las bajas temperaturas, lo que hace que la biomasa de algas sea más degradable para los microorganismos hidrolizadores. Esto disminuirá la duración de los procesos de fermentación y, por lo tanto, reducirá los costos de los procesos de fermentación, ya que se pueden realizar más fermentaciones en el mismo período de tiempo. Además, los procesos de fermentación con organismos termófilos pueden llevarse a cabo en un solo reactor de fermentación, lo que simplifica el proceso en comparación con los organismos mesófilos o psicrófilos. Otra ventaja es la posibilidad de convertir la biomasa de algas en el producto químico a base de carbono sin un pretratamiento de la biomasa de algas.
Las algas verdes (Chlorophyta), por ejemplo, representan el linaje ancestral de las plantas terrestres y comprenden un grupo grande y diverso de organismos. Al igual que las plantas superiores, estas algas poseen clorofilas a y b, cloroplastos de doble membrana y, en la mayoría de los casos, almidón como principal reserva de alimento.
El linaje, Chlorophyta, contiene una variedad de formas unicelulares a multicelulares, móviles a inmóviles. Los miembros mejor estudiados dentro de esta clase son los volvocaleanos flagelados (Volvocales) representados por géneros tan distintos como el unicelular Chlamydomonas y el colonial Volvox (Voigt J y FrankR (2003) 14-3-3 proteins are constituents of the insoluble glycoprotein framework of the Chlamydomonas cell wall. The Plant Cell 15: 1399-1413;Voigt J, Woestemeyer J y Frank R (2007) The chaotrope-soluble glycoprotein GP2 is a precursor of the
insoluble glycoprotein network of the Chlamydomonas cell wall. Journal of Biological Chemistry 282: 30381-30392.). Estos organismos y sus parientes poseen un tipo distinto y único de pared celular basado en agregados de glicoproteínas ricas en hidroxiprolina y glicina. En el representante bien estudiado, Chlamydomonas reinhardtii, 17 30 de estas glicoproteínas se encuentran en el complejo de la pared, dispuestas en elementos fibrilares y granulares entrelazados. Las paredes de muchos de estos organismos incluyen capas cristalinas. Las glicoproteínas ricas en hidroxiprolina son bioquímicamente similares a las extensinas que se encuentran en las paredes celulares de las plantas superiores donde están involucradas en mecanismos mecanoestructurales, reguladores y de defensa. En el Volvox flagelado colonial complejo, la matriz extracelular consta de al menos cuatro zonas distintas y algunas de las glicoproteínas inclusivas están ampliamente sulfatadas. Algunas de estas glicoproteínas se han elaborado en una extensa envoltura mucilaginosa, que mantiene unidas a las células hijas. Otros miembros de Chlorophyta consisten en diversas órdenes de formas unicelulares, cocoides y filamentosas inmóviles. Las paredes de muchos incluyen beta-1,4-glucano, celulosa, que está dispuesta en fibrillas y está rodeada por una envoltura de matriz. En las algas verdes clorofitanas más primitivas (por ejemplo, Chlorella), las microfibrillas discurren en una malla aleatoria en la que la orientación de las microfibrillas de celulosa no está orientada preferentemente con respecto a la superficie celular. Algunas clorofitas contienen ciertos polisacáridos de la pared de la matriz con una similitud considerable con los que se encuentran en las plantas terrestres (Estevez Jm , Leonardi PI y Alberghina JS (2008) Cell wall carbohydrate epitopes in the green alga Oedogonium bharuchae F. minor (Oedogoniales, Chlorophyta). Journal of Phycology 44: 1257-1268.). Además, algunos miembros unicelulares de las Chlorophyceae (por ejemplo, el orden de los Chlorococcales) contienen una pared exterior de 10-30 nm de ancho que tiene el aspecto de una envoltura trilamelar. Este estrato de la pared exterior es altamente resistente a la hidrólisis química ya la degradación enzimática bacteriana. Los químicos que componen esta capa se llaman 'algaenans'. Consisten en cadenas polimetilénicas largas asociadas con grupos amida y cantidades menores de pirroles sustituidos con N-alquilo. El papel de las algas parece ser protector, especialmente al conferir resistencia a los detergentes (Corre G, Templier J, Largeau C, Rousseau B y Berkaloff C (1996) Influence of cell wall composition on the resistance of two Chlorella species (Chlorophyta) to detergents. Journal of Phycology 32: 584-590.). El grupo ulvaphycean de Chlorophyta está representado por muchos tipos morfológicos diferentes que van desde filamentos (por ejemplo, Urospora) hasta láminas complejas de tejido, los polisacáridos de la matriz que rodean al complejo esquelético fibrilar en consisten en una serie de xilogalactoarabinanos, glucuronoxilorhamanos (por ejemplo 'ulvan' sensu Ray B y Lahaye M (1995) Cell-wall polysaccharides from the marine green alga Ulva 'rigida' (Ulvales, Chlorophyta) Chemical structure of ulvan. Carbohydrate Research 274: 313-318.) y ramnoxilogalactogalacturonanos que están sulfatados de diversas formas. Las funciones de los polisacáridos de la matriz ulvafícea parecen ser similares a los mucílagos de la matriz en otras algas marinas como las algas pardas y rojas. Igualmente, en algunas formas ulváficas se produce una calcificación importante en el complejo de la pared. En el alga de arrecife de coral Halimeda, los cristales de aragonito se incrustan en la pared celular para crear una superficie dura. El linaje Streptophytan de las algas verdes a menudo se denomina alga verde Charophyceae (CGA). Este linaje es el más cercano y ancestral de las plantas terrestres. Dentro de este grupo están las plantas de piedra, Chara y Nitella, las desmidas, formas conjugadas filamentosas como Spirogyra, formas terrestres únicas como Klebsormidium (por ejemplo, encontradas en suelos desérticos) y el muy avanzado Coleochaete. Las paredes de la mayoría de los miembros de este grupo contienen componentes esqueléticos celulósicos asociados con varias matrices similares a macromoléculas(Sorensen I, Domozych DS y Willats WGT (2010) How have plant cell walls evolved? Plant Physiology 153: 366-372.;Popper ZA y Tuohy m G (2010) Beyond the green: understanding the evolutionary puzzle of plant and algal cell walls. Plant Physiology 153: 373-383.;Popper ZA (2008) Evolution and diversity of green plant cell walls. Current Opinion in Plant Biology 11: 286-292.;Popper Za y Fry SC (2003) Primary cell wall composition of bryophytes and charophytes. Annals of Botany 91: 1-12; I.). En desmidiales, la orientación de las microfibrillas en las capas de la pared es similar a la de Valonia, excepto que no se aprecia un período de repetición en la dirección de las microfibrillas a lo largo de la sucesión de capas. En los charales, las microfibrillas forman una malla entrelazada que puede tener una orientación preferencial, como longitudinal, oblicua o transversal con respecto al eje de la célula. También se han encontrado polisacáridos ricos en homogalacturonano (por ejemplo, pectinas), xiloglucanos, proteínas de extensina y arabinogalactano en el CGA (Domozych DS, Serfis A, Kiemle SN y Gret MR (2007) The structure and biochemistry of charophycean cell walls: I. Pectins of Penium margaritaceum. Protoplasma 230: 99-115., Domozych DS, S0rensen I y Willats WGT (2009a) The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara corallina. Annals of Botany 104: 1045-1056., Domozych DS, S0rensen I, Pettolino FA, Bacic A y Willats WGT (2010) The cell wall polymers of the Charophycean green alga Chara corallina: immunobinding ad biochemical screening. International Journal of Plant Sciences 171: 345-361.; Eder M y Lutz-Meindl U (2008) Pectin-like carbohydrates in the green alga Micrasterias characterized by cytochemical analysis and energy filtering TEM. Journal of Microscopy 231: 201-214.), lo que sugiere una similitud significativa con las macromoléculas de la matriz de las plantas terrestres. En algunos desmidiales, se libera una gran cantidad de mucílago a través de los poros de la pared celular, lo que a su vez hace que la célula se deslice. Igualmente, estos mucílagos ayudan a la célula a adherirse a los sustratos y pueden estar involucrados en la absorción de nutrientes y en las interacciones con bacterias beneficiosas. El mucílago es un polisacárido rico en ácido glucurónico y fucosa (Domozych y otros, 2005; Domozych y otros, 1993). Quizás el antepasado caróficeo más cercano a las plantas terrestres entre las algas verdes es Coleochaete. Las paredes de esta alga consisten en celulosa y polisacáridos de matriz similares a los que se encuentran en las plantas terrestres. Se ha identificado un recubrimiento exterior similar a una cutícula en las superficies celulares y, recientemente, se ha identificado lignina en las paredes de esta alga verde (S0rensen, I, Pettolino, FA Bacic, A., Ralph, J., Lu, F., O'Neill, MA, Fei, Z., Rose, JKC, Domozych, DS, Willats,
WGT 2011. The Charophycean green algae provide insights into the early origins of plant cell walls. Plant Journal. Volumen 68, Número 2, octubre de 2011, Páginas 201-211).
La biomasa de algas debe entenderse en su sentido más amplio, de modo que, además de las células de algas intactas, comprende además diferentes tipos de desechos de la industria y las plantas depuradoras. La biomasa de varias especies de algas contiene compuestos de alto valor agregado como ácidos grasos omega y metabolitos secundarios como cartotinoides e isoprenoides y otros. Actualmente, las células de algas se procesan y fraccionan para generar biomasa de algas empobrecidas en compuestos de alto valor agregado, que sigue siendo una materia prima valiosa para la producción fermentativa de muchos compuestos.
Por ejemplo, en un estudio de factibilidad ya se presentó la producción de ácido láctico a partir de biomasa de microalgas procesada mediante el uso de varias bacterias de ácido láctico (Talukder, Md. MR, Das, P. & Wu, JC (2012) Microalgae (Nannochloropsis salina) lipid. Biochemical Engineering Journal 68, 109-113). Sin embargo, como se señaló anteriormente, las bacterias lácticas requieren suplementos nutricionales, lo que encarece el proceso. La biomasa de algas es un vasto recurso mal explotado. Sin embargo, las levaduras pueden convertir las hexosas derivadas de los polímeros de la pared celular en etanol combustible para el que existe una demanda creciente. Las pentosas del xilano aún no se pueden convertir comercialmente en etanol, pero se están desarrollando varios microorganismos etanologénicos prometedores con la capacidad de convertir pentosas y hexosas.
Típicamente, la primera etapa en la utilización de la biomasa de algas es una etapa de pretratamiento para reducir la cristalinidad de la biomasa y aumentar el área superficial para mejorar la digestibilidad del sustrato.
El método de pretratamiento que se usa a menudo es el tratamiento termoquímico, un proceso de calentamiento del material de algas a una temperatura de 100 °C durante 8 h (Chen, P. y Oswald, W. (1998). Environmental International. 24. 889-897).
Otro tipo de hidrólisis es la hidrólisis alcalina (Razif Harun, W.S.Y. Jason, Tamara Cherrington, Michael K. Danquah. (2011). Exploring alkaline pre-treatment of microalgal biomass for bioethanol production. Applied Energy. 88. 3464 -3467) donde el material de algas se somete a un alcalino como el hidróxido de sodio, de manera que los polímeros de azúcar, celulosa y otros, se hidrolizan parcial o completamente a sus monómeros de azúcar constituyentes y la estructura de la biomasa se destruye facilitando el acceso de las enzimas hidrolíticas en las etapas de procesamiento posteriores.
Alternativamente también se puede llevar a cabo un proceso similar con ácidos mediante el uso del 1 % (v/v) de ácido sulfúrico por 30 min en combinación con un tratamiento termoquímico a 140 °C (Razif Harun y Michael K. Danquah. (2011) Influence of acid pre-treatment on microalgal biomass for bioethanol production. Bioprocess Biochemistry. 46.304 - 309).
Esta etapa de pretratamiento da como resultado la hidrólisis de polímeros como la celulosa en glucosa, mientras que el xilano se transforma en pentosas xilosa. Así, por el contrario del almidón, la hidrólisis de la biomasa de algas da como resultado la liberación de azúcares de pentosa además de azúcares de hexosa. Esto implica que los organismos de fermentación útiles necesitan ser capaces de convertir azúcares de hexosa y pentosa en productos de fermentación deseados tales como ácidos carboxílicos.
Después del pretratamiento, los esquemas de procesamiento de biomasa de algas que involucran hidrólisis enzimática o microbiana comúnmente involucran cuatro transformaciones mediadas biológicamente: (1) la producción de enzimas sacarolíticas (celulasas); (2) la hidrólisis de los componentes de carbohidratos presentes en la biomasa pretratada a azúcares; (3) la fermentación de azúcares de hexosa (por ejemplo, glucosa); y (4) la fermentación de azúcares de pentosa (por ejemplo, xilosa).
Cada etapa del procesamiento puede hacer que el proceso general sea más costoso y, por lo tanto, disminuir la viabilidad económica de producir biocombustibles o productos químicos a base de carbono a partir de material biológico de algas. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar métodos que puedan reducir el número de etapas de procesamiento necesarios para convertir material biológico de algas en biocombustible o productos químicos basados en carbono y otros materiales comercialmente convenientes.
Los ácidos carboxílicos son ácidos orgánicos caracterizados por la presencia de al menos un grupo carboxilo. La fórmula general de un ácido carboxílico es R-COOH, donde R es algún grupo funcional monovalente. Un grupo carboxilo (o carboxi) es un grupo funcional que consiste de un carbonilo (RR'C=O) y un hidroxilo (ROH), que tiene la fórmula -C(=O)OH, usualmente escrita como -COOH o -CO2H. El término ácidos carboxílicos incluye sales y ésteres de los ácidos. El ácido láctico es un ácido carboxílico con la fórmula química C3H6O3. Tiene un grupo hidroxilo adyacente al grupo carboxilo, lo que lo convierte en un alfa hidroxiácido (AHA).
En particular, estos microorganismos son extremadamente termófilos y muestran una amplia especificidad de sustrato y una alta producción natural de ácidos carboxílicos. Además, la fermentación de ácidos carboxílicos a altas temperaturas, por ejemplo, por encima de 70 °C, tiene muchas ventajas sobre la fermentación mesófila. Una ventaja de la fermentación termófila es la minimización del problema de la contaminación en cultivos por lotes, cultivos por lotes alimentados o cultivos continuos, ya que solo unos pocos microorganismos pueden crecer a temperaturas tan altas en material de biomasa de algas no desintoxicado.
También es una ventaja que las células, cepas y microorganismos de acuerdo con la presente descripción crezcan en material de biomasa de algas pretratado así como también sin tratar.
Las células, cepas, microorganismos, composiciones y cultivos microbianos aislados son capaces de crecer y producir productos de fermentación en concentraciones muy altas de materia seca de material de biomasa de algas. En el presente contexto, el término "material de biomasa de algas" pretende designar una biomasa de algas sin tratar y/o una biomasa de algas que se ha sometido a una etapa de pretratamiento de manera que el material de algas se ha separado al menos parcialmente en celulosa, pectinas, xiloglucanos, xilanos, celulosa, mananos, xilanos; agar y carragenanos (galactanos sulfatados), lignina, polisacáridos ácidos (alginatos) de esta manera aumenta el área superficial y/o accesibilidad del material. El material de algas típicamente puede derivarse de células de algas intactas o células de algas fraccionadas y procesadas, biomasa de plantas de aguas residuales, estanques, cultivos de fotobiorreactores y fermentadores, algas marinas de la agregación de océanos y lagos.
El método de pretratamiento que se usa con más frecuencia es el pretratamiento con vapor, un proceso que comprende el calentamiento del material de algas con o sin inyección de vapor a una temperatura de 130 - 230 grados centígrados con o sin una subsiguiente liberación repentina de presión. Antes o durante el pretratamiento con vapor, se puede añadir opcionalmente un catalizador como un ácido mineral u orgánico o un agente cáustico que facilite la desintegración de la estructura de la biomasa. Los catalizadores que se usan a menudo para dicho pretratamiento incluyen, entre otros, ácido sulfúrico, ácido sulfuroso, ácido clorhídrico, ácido acético, ácido láctico, hidróxido de sodio (sosa cáustica), hidróxido de potasio, hidróxido de calcio (cal), amoníaco o las respectivas sales o anhídridos de cualquiera de estos agentes.
Dicha etapa de pretratamiento con vapor puede estar precedido o no por otra etapa de tratamiento que incluya la cocción de la biomasa en agua o la vaporización de la biomasa a temperaturas de 100 - 200 °C con o sin la adición de un catalizador adecuado como un ácido orgánico o mineral o un agente cáustico que facilita la desintegración de la estructura de la biomasa. Entre la etapa de cocción y la etapa de pretratamiento con vapor subsiguiente se pueden introducir una o más etapas de lavado y separación líquido-sólido para eliminar los componentes de biomasa de algas solubilizados para reducir o prevenir la formación de inhibidores durante la etapa de pretratamiento con vapor subsiguiente.
Los inhibidores formados durante el pretratamiento con calor o vapor pueden incluir, entre otros, furfural formado a partir de azúcares de pentosa monomérica, hidroximetilfurfural formado a partir de azúcares de hexosa monomérica, ácido acético, ácido levulínico, fenoles y derivados de fenoles.
Otro tipo de hidrólisis de biomasa de algas es la hidrólisis ácida, donde el material de algas se somete a un ácido tal como ácido sulfúrico o ácido sulfuroso de manera que los polímeros de azúcar celulosa y xilanos se hidrolizan parcialmente o completamente a sus monómeros de azúcar constituyentes.
Un tercer método es la oxidación húmeda en donde el material se trata con oxígeno a 150-185 grados centígrados. Los pretratamientos pueden ir seguidos de hidrólisis enzimática para completar la liberación de monómeros de azúcar. Esta etapa de pretratamiento da como resultado la hidrólisis de la celulosa en glucosa, mientras que el xilano se transforma en pentosa xilosa. La etapa de pretratamiento puede complementarse en ciertas modalidades con un tratamiento que da como resultado una hidrólisis adicional de la celulosa y el xilano. El propósito de tal tratamiento de hidrólisis adicional es hidrolizar especies de oligosacáridos y posiblemente polisacáridos producidos durante la hidrólisis ácida, oxidación húmeda o pretratamiento con vapor de celulosa y/o xilano para formar azúcares fermentables (por ejemplo, glucosa, xilosa y posiblemente otros monosacáridos). Dichos tratamientos adicionales pueden ser químicos o enzimáticos. La hidrólisis química se logra típicamente por tratamiento con un ácido, como el tratamiento con ácido sulfúrico acuoso o ácido clorhídrico, a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 100-150 grados centígrados. La hidrólisis enzimática se realiza típicamente mediante tratamiento con una o más enzimas carbohidrasas apropiadas tales como celulasas, glucosidasas y hemicelulasas, incluidas las xilanasas. Se ha encontrado que los microorganismos de acuerdo con la presente invención pueden crecer eficientemente en diversas especies de biomasa de algas pretratadas y no tratadas (por ejemplo, algas verdes del grupo de Chlorophyta, por ejemplo, Nannochloropsis salina).
Los microorganismos de acuerdo con la presente descripción también pueden crecer de manera eficiente en la biomasa de algas agotada, material insoluble que queda después de que un cultivo ha crecido hasta la fase estacionaria tardía (por ejemplo, más de 108 células/ ml) en biomasa no tratada.
Además, los microorganismos de acuerdo con la presente descripción crecieron eficientemente en los materiales de algas solubles e insolubles obtenidos después del tratamiento térmico de la biomasa.
Sorprendentemente, se descubrió que la subespecie bacteriana de acuerdo con la presente descripción es capaz de crecer en un medio que comprende material de biomasa de algas que tiene un contenido de materia seca de al menos el 10 % p/p, como al menos el 15 % p/p, incluido al menos el 20 por ciento p/p, e incluso tan alto como al menos el 25 por ciento p/p.
Los microorganismos usados de acuerdo con la presente descripción son bacterias termófilas anaerobias, y son capaces de crecer a altas temperaturas incluso a 70 °C o más. El hecho de que las cepas sean capaces de operar a esta alta temperatura es de gran importancia en la conversión del material de algas en productos de fermentación. La velocidad de conversión de carbohidratos en ácidos carboxílicos es mucho más rápida cuando se realiza a altas temperaturas. Por ejemplo, la productividad volumétrica de ácido láctico de un bacilo termófilo es hasta diez veces superior a la de un proceso de fermentación de levadura convencional que opera a 30 grados centígrados. En consecuencia, se requiere una planta de producción más pequeña para una capacidad de planta dada, al reducir de esta manera los costos de construcción de la planta. Como también se mencionó anteriormente, la alta temperatura reduce el riesgo de contaminación por otros microorganismos, lo que se traduce en menos tiempo de inactividad, mayor productividad de la planta y menor requerimiento de energía para la esterilización de la materia prima. La alta temperatura de operación también puede facilitar la posterior recuperación de los productos de fermentación resultantes.
El material de biomasa de algas y los hidrolizados de biomasa de algas pueden contener inhibidores como furfural, fenoles y ácidos carboxílicos, que potencialmente pueden inhibir el organismo en fermentación. Por lo tanto, es una ventaja de los microorganismos de acuerdo con la presente descripción que sean tolerantes a estos inhibidores. En modalidades ventajosas, el cultivo microbiano que se usa en los métodos de acuerdo con la presente descripción comprende un microorganismo termófilo capaz de sobrevivir en condiciones de alta temperatura por encima de 70 °C.
En algunas modalidades, la biomasa de algas se pone en contacto con un cultivo microbiano de acuerdo con las reivindicaciones durante un período de tiempo entre 10 h a 300 h, preferentemente 50 h a 200 h, 80 h a 160 h, a una temperatura inicial entre 55 °C y 80 °C, preferentemente entre 72 °C y 78 °C y a un pH inicial entre 5 y 9, preferentemente entre 6 y 8.
En algunas modalidades, el microorganismo termófilo que se usa en los métodos está de acuerdo con las reivindicaciones.
El género Caldicellulosiruptor incluye diferentes especies de bacterias extremadamente termófilas (crecimiento a temperatura significativamente superior a 70 °C) celulolíticas y hemicelulolíticas estrictamente anaeróbicas que no forman esporas. La primera bacteria de este género, Caldicellulosiruptor saccharolyticus cepa Tp8T (DSM 8903) tiene una temperatura óptima de 70 °C y fue aislada de un manantial termal en Nueva Zelanda (Rainey FA, Donnison AM, Janssen Ph , Saul D, Rodrigo A, Bergquist PL, Daniel RM, Stackebrandt E, Morgan HW. (1994) Description of Caldicellulosiruptor saccharolyticus gen. 15 nov., sp. nov: an obligately anaerobic, extremely thermophilic, cellulolytic bacterium. FEMS Microbiol Lett. 120:263-266.;Sissons CH, Sharrock KR, Daniel RM, Morgan HW. (1987) Isolation of cellulolytic anaerobic extreme thermophiles from New Zealand thermal sites. Appl Environ Microbiol. 53:832-838). Hidroliza una variedad de carbohidratos poliméricos con la producción de acetato, lactato y trazas de etanol (Donnison AM, Brockelsby CM, Morgan HW, Daniel RM. (1989) The degradation of lignocellulosics by extremely thermophilic microorganisms. Biotechnol Bioeng. 33:1495-1499). El análisis filogenético mostró que constituye un nuevo linaje dentro del subfilo Bacillus/Clostridium de las bacterias Gram-positivas (Rainey FA, Donnison AM, Janssen PH, Saul D, Rodrigo A, Bergquist PL, Daniel RM, Stackebrandt E, Morgan HW. (1994) Description of Caldicellulosiruptor saccharolyticus gen. nov., sp. nov: an obligately anaerobic, extremely thermophilic, cellulolytic bacterium. FEMS Microbiol Lett. 120:263-266).
Los microorganismos que se muestran en la tabla 1 y la tabla 2 producen ácido láctico y muestran varias características: (i) alto rendimiento y baja inhibición del producto, (ii) utilización simultánea de material de biomasa de algas y/o azúcares, y (iii) crecimiento a temperaturas elevadas. Los microorganismos que se usan de acuerdo con la presente descripción son organismos termófilos robustos con un riesgo reducido de contaminación. Convierten eficientemente una gama extraordinariamente amplia de componentes de biomasa en ácido láctico.
El género Caldicellulosiruptor, puede comprender los microorganismos enumerados en la tabla 1, no todos ellos se usan en las reivindicaciones.
Tabla 1
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Las cepas enumeradas en la tabla 1 se depositaron de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest el 15 de septiembre de 2011 con DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, 38124 Braunschweig, Alemania, con los números de acceso DSMZ y las fechas de depósito respectivamente indicados, respectivamente, por DIREVO Industrial Biotechnology GmbH, Nattermannallee 1, 50829 Colonia (DE). El término "relación ADN-ADN" se refiere particularmente al porcentaje de similitud del ADN genómico o completo de dos microorganismos medido por el ensayo de hibridación/renaturalización ADN-ADN de acuerdo con De Ley y otros (1970) EUR. J. Biochem. 12, 133-142oHul3 y otros (1983) Syst. Appl. Microbiol. 4, 184-192. En particular, el ensayo de hibridación ADN-ADN lo realiza preferentemente el Servicio de Identificación DSMZ (Deutsche 5 Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania).
El término "similitud de secuencia del gen ADNr 16S" se refiere en particular al porcentaje de nucleótidos idénticos entre una región de la secuencia de ácido nucleico del gen ribosomal ARN 16S (ADNr) de un primer microorganismo y la región correspondiente de la secuencia de ácido nucleico del Gen ADNr 16S de un segundo microorganismo. Preferentemente, la región comprende al menos 100 nucleótidos consecutivos, con mayor preferencia al menos 200 nucleótidos consecutivos, al menos 300 nucleótidos consecutivos o al menos 400 nucleótidos consecutivos, con la máxima preferencia alrededor de 480 nucleótidos consecutivos.
Las cepas de acuerdo con la descripción tienen el potencial de ser capaces de producir ácidos carboxílicos como ácido láctico y ácido acético.
El uso de las cepas Caldicellulosiruptor sp. de acuerdo con la presente descripción tienen varias características muy ventajosas necesarias para la conversión de material de biomasa de algas. Por lo tanto, estas cepas base poseen toda la maquinaria genética para la hidrólisis de celulosa y xilano y para la conversión de azúcares de pentosa y hexosa en varios productos de fermentación, como ácidos carboxílicos como el ácido láctico. Como será evidente a partir de los ejemplos más abajo, el examen de la secuencia completa de ADNr 16S mostró que las cepas estrechamente relacionadas pueden estar todas relacionadas con Caldicellulosiruptor saccharolyticus, aunque las secuencias de ADNr 16S pueden ubicarlas en una subespecie separada o incluso en una especie diferente.
En una modalidad ventajosa, el microorganismo Caldicellulosiruptor sp. que se usa en un método de acuerdo con la presente descripción es de acuerdo con las reivindicaciones.
Todas las cepas enumeradas anteriormente y en la tabla 1 pertenecen al género Caldicellulosiruptor y son bacterias grampositivas estrictamente anaerobias, no formadoras de esporas, inmóviles. Las células son bastoncillos rectos de 0,4-0,5 |jm por 2,0-4,0 |jm, que se presentan tanto individualmente como en pares. Después de 7 días de incubación a 72 °C en medio sólido con agary celulosa como sustrato, ambas cepas forman colonias lechosas circulares de 0,5 -1 mm de diámetro. Se producen zonas claras alrededor de las colonias que indican degradación de la celulosa. El término "un microorganismo", como se usa en la presente, puede referirse a un solo organismo unicelular así como también a numerosos organismos unicelulares individuales. Por ejemplo, el término "un microorganismo del género Caldicellulosiruptor" puede referirse a una única célula bacteriana Caldicellulosiruptor del género Caldicellulosiruptor así como también a múltiples células bacterianas del género Caldicellulosiruptor.
Los términos "una cepa del género Caldicellulosiruptor" y "una célula Caldicellulosiruptor" se usan en la presente descripción como sinónimos. En general, el término "un microorganismo" se refiere a numerosas células. En particular, dicho término se refiere a por lo menos 103 células, preferentemente al menos 104 células, al menos 105o al menos 106 células.
Como es evidente a partir de lo siguiente, se han depositado las cepas preferidas de la presente descripción. Por lo tanto, se pueden obtener otras células, cepas, bacterias, microorganismos y/o cultivos microbianos de la presente descripción mediante la mutación de las cepas depositadas y la selección de mutantes derivados que tengan características mejoradas. Las características convenientes incluyen un mayor intervalo de azúcares que se pueden utilizar, mayor velocidad de crecimiento, capacidad para producir mayores cantidades de productos químicos a base de carbono, como el ácido láctico. Los métodos adecuados para mutar cepas de bacterias y seleccionar mutantes
deseados se describen enFunctional analysis of Bacterial genes: A practical Manual, editado por W. Schumann, S.D. Ehrlich y N. Ogasawara, 2001.
En modalidades ventajosas, los microorganismos pueden modificarse para obtener mutantes o derivados con características mejoradas. Por lo tanto, en una modalidad se proporciona una cepa bacteriana de acuerdo con la descripción, en donde se han insertado, eliminado o inactivado sustancialmente uno o más genes. La variante o mutante típicamente es capaz de crecer en un medio que comprende una biomasa de algas.
Las cepas de acuerdo con la descripción son microorganismos estrictamente anaeróbicos y, por lo tanto, se prefiere que el producto de fermentación se produzca mediante un proceso de fermentación que se realiza en condiciones estrictamente anaeróbicas. Adicionalmente, los microorganismos de acuerdo con la descripción son microorganismos extremadamente termófilos y, por lo tanto, el proceso puede funcionar de manera óptima cuando se opera a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 45-95 grados centígrados, tal como en el intervalo de aproximadamente 50-90 grados centígrados, que incluye el intervalo de alrededor de 60-85 grados centígrados, tal como el intervalo de alrededor de 65-75 grados centígrados. En una modalidad ventajosa, la temperatura es de 70 °C y superior.
Para la producción de ciertos productos de fermentación, puede ser útil seleccionar un proceso de fermentación específico, como un proceso de fermentación por lotes, incluido un proceso de alimentación por lotes o un proceso de fermentación continua. Además, puede ser útil seleccionar un reactor de fermentación tal como un reactor de celda inmovilizada, un reactor de lecho fluidizado o un biorreactor de membrana.
En algunas modalidades ventajosas, la biomasa de algas se deriva de algas verdes, de algas de la clase chlorophyceae, preferentemente del orden chlamydomonadales, preferentemente de la familia haematococcaceae, con mayor preferencia del género haematococcus como Haematococcus pluvialis.
Como se mencionó anteriormente, la biomasa de algas de acuerdo con la presente invención puede ser, pero no se limita a, las células de los taxones de algas Chlorophyta y Streptophyta (algas verdes), Rhodophyta (algas rojas), Haptophyta y Haptophytes, Ochrophytes, Synurophytes, Synurophyceae, Bacillarophyceae (diatomeas), Phaeophyta (algas pardas) y Dinophyta (Dinoflagelados), torta de algas procedente de procesos de extracción de aceite o química fina y material de biomasa de algas obtenido mediante el procesamiento de células de algas. En modalidades ventajosas, la biomasa de algas son células del taxón Chlorophyta, preferentemente Nannochloropsis salina.
En modalidades ventajosas, el material de biomasa de algas se somete a un pretratamiento mecánico, termoquímico y/o bioquímico. El material de biomasa de algas podría estar expuesto al tratamiento con vapor. En modalidades adicionales, el material de biomasa de algas se trata previamente con trituración mecánica y un tratamiento posterior con ácido láctico, ácido acético, ácido sulfúrico o ácido sulfuroso o sus respectivas sales o anhídridos bajo calor y presión con o sin liberación repentina de presión. En otra modalidad, el material de biomasa de algas se trata previamente con trituración mecánica y un tratamiento posterior con hidróxido de sodio, hidróxido de amonio, hidróxido de calcio o hidróxido de potasio bajo calor y presión con o sin liberación repentina de presión.
En modalidades ventajosas, el material de biomasa de algas se trata previamente con trituración mecánica y exposición posterior a un proceso de pretratamiento combinado de varias etapas. Dicho pretratamiento combinado de múltiples etapas puede incluir una etapa de tratamiento que consiste en cocinar en agua o vaporizar el material de biomasa de algas a una temperatura de 100 - 200 °C durante un período de tiempo entre 5 y 120 min. Pueden o no añadirse al proceso catalizadores adecuados que incluyen, entre otros, ácido láctico, ácido acético, ácido sulfúrico, ácido sulfuroso, hidróxido de sodio, hidróxido de amonio, hidróxido de calcio o hidróxido de potasio o sus respectivas sales o anhídridos. El proceso puede incluir además una etapa que comprende una operación de separación líquido-sólido, por ejemplo, filtración, separación, centrifugación o una combinación de los mismos, separar el fluido del proceso que contiene componentes total o parcialmente hidrolizados y solubilizados del material de biomasa de algas de las partes insolubles restantes del material de biomasa de algas. El proceso puede incluir además una etapa que comprende el lavado del material de biomasa de algas restante. El material sólido separado de los constituyentes de la biomasa de algas solubilizada puede luego ser tratado en una segunda etapa con vapor bajo calor y presión con o sin liberación repentina de presión a una temperatura de 150 - 250 °C por un período de tiempo entre 1 y 15 min. Con el fin de aumentar la eficacia del pretratamiento, también se puede añadir también a la segunda etapa un catalizador adecuado que incluye, entre otros, ácido láctico, ácido acético, ácido sulfúrico, ácido sulfuroso, hidróxido de sodio, hidróxido de amonio, hidróxido de calcio o hidróxido de potasio o sus respectivas sales o anhídridos.
En modalidades ventajosas, la biomasa de algas se muele antes de convertirla en ácidos carboxílicos como el ácido láctico. En una modalidad, la biomasa de algas es biomasa pretratada de Nanocloropsis salina, preferentemente pretratado con pretratamiento de vapor o pretratamiento combinado de múltiples pasos.
En modalidades ventajosas, las células, cepas, microorganismos pueden modificarse para obtener mutantes o derivados con características mejoradas. Por lo tanto, en una modalidad se proporciona una cepa bacteriana de
acuerdo con la descripción, en donde se han insertado, eliminado o inactivado sustancialmente uno o más genes. La variante o mutante típicamente es capaz de crecer en un medio que comprende un material de biomasa lignocelulósica.
En otra modalidad, se proporciona un proceso para preparar variantes o mutantes de los microorganismos de acuerdo con la presente descripción, en donde se insertan, eliminan o inactivan sustancialmente uno o más genes como se describe en la presente descripción.
En algunas modalidades, uno o más genes adicionales se insertan en las cepas de acuerdo con la presente descripción. Por tanto, para mejorar el rendimiento del producto de fermentación específico, puede ser beneficioso insertar uno o más genes que codifican una polisacarasa en la cepa de acuerdo con la invención. Por lo tanto, en modalidades específicas se proporciona una cepa y un proceso de acuerdo con la invención en donde uno o más genes codifican una polisacarasa que se selecciona de celulasas (como EC 3.2.1.4); beta-glucanasas, incluidas las glucan-1,3 beta-glucosidasas (exo-1,3 beta-glucanasas, como EC 3.2.1.58), 1,4-beta-celobiohidrolasas (como EC 3.2.1.91) y endo-1,3(4)-beta-glucanasas (tales como EC 3.2.1.6); xilanasas, incluyendo endo-1,4-beta-xilanasas (tales como EC 3.2.1.8) y xilano 1,4-beta-xilosidasas (tales como EC 3.2.1.37); pectinasas (tales como EC 3.2.1.15); alfaglucuronidasas, alfa-L-arabinofuranosidasas (como EC 3.2.1.55), acetilesterasas (como EC 3.1.1.-), acetilxilanesterasas (como EC 3.1.1.72), alfa-amilasas (como EC 3.2.1.1), beta-amilasas (como EC 3.2.1.2), glucoamilasas (como EC 3.2.1.3), pululanasas (como EC 3.2.1.41), beta-glucanasas (como EC 3.2.1.73), hemicelulasas, arabinosidasas, mananasas, incluidas manano endo-I,4-beta-manosidasas (como EC 3.2.1.78) y se incluyen manano endo-I, 6-alfa-manosidasas (como 5 EC 3.2.1.101), pectina hidrolasas, poligalacturonasas (como EC 3.2.1.15), exopoligalacturonasas (como EC 3.2.1.67) y pectatoliasas (como EC 4.2.2.10).
De acuerdo con la presente descripción, también se proporciona un método para producir un producto de fermentación que comprende cultivar una cepa de acuerdo con la invención en condiciones adecuadas.
Las cepas de acuerdo con la descripción son microorganismos estrictamente anaeróbicos y, por lo tanto, se prefiere que el producto de fermentación se produzca mediante un proceso de fermentación que se realiza en condiciones estrictamente anaeróbicas. Adicionalmente, la cepa de acuerdo con la invención es un microorganismo extremadamente termófilo y, por lo tanto, el proceso puede funcionar de manera óptima cuando se opera a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 40-95 °C, como el intervalo de aproximadamente 50-90 °C, que incluye el intervalo de alrededor de °C grados centígrados, tal como el intervalo de alrededor de 65-75 °C. En una modalidad ventajosa, el proceso se opera a 72 °C.
Para la producción de ciertos productos de fermentación, puede ser útil seleccionar un proceso de fermentación específico, como un proceso de fermentación por lotes, incluido un proceso de alimentación por lotes o un proceso de fermentación continua. Además, puede ser útil seleccionar un reactor de fermentación tal como un reactor de recipiente agitado, un reactor de celda inmovilizada, un reactor de lecho fluidizado o un biorreactor de membrana. De acuerdo con la invención, el método es útil para la producción de un amplio intervalo de ácidos carboxílicos tales como ácido láctico y ácido acético que pueden producirse de acuerdo con la invención.
La expresión "comprende", como se usa en la presente, además de su significado literal incluye además, y se refiere específicamente a las expresiones "consisten esencialmente en" y "consisten en". Por lo tanto, la expresión "comprende" se refiere a modalidades en donde el sujeto que "comprende" los elementos enumerados específicamente no comprende elementos adicionales así como también modalidades en donde el sujeto que "comprende" los elementos enumerados específicamente puede y/o verdaderamente abarca elementos adicionales. Igualmente, la expresión "tiene" debe entenderse como la expresión "comprende", que incluye además, y se refiere específicamente a las expresiones "consisten esencialmente en" y "consisten en".
Los siguientes métodos y ejemplos se brindan, por supuesto, solo con propósitos ilustrativos y no se destinan a limitar el alcance de la presente descripción de ninguna manera.
Métodos y Ejemplos
En los siguientes ejemplos, se proporcionan materiales y métodos de la presente descripción que incluyen la determinación de las propiedades de las cepas microbianas de acuerdo con la presente descripción. Debe entenderse que estos ejemplos tienen propósitos ilustrativos solamente y no deben interpretarse como limitantes de esta descripción de ninguna manera.
Ejemplo 1: Aislamiento y cultivo
Todos los procedimientos para el enriquecimiento y aislamiento de las cepas enumeradas en la tabla 1 emplearon técnicas anaeróbicas para bacterias estrictamente anaeróbicas (Hungate RE. (1969) A roll tube method for cultivation of strict anaerobes. In: Methods in Microbiology Eds. Norris JR y Ribbons DW. págs. 118-132. Nueva York: Prensa académica). Las cepas se enriquecieron a partir de muestras ambientales a temperaturas superiores a
70 °C con madera de haya como sustrato. El aislamiento se realizó mediante la recolecta de colonias cultivadas en medio de agar sólido a 72 °C en tubos de rollo Hungate (Hungate RE. (1969) A roll tube method for cultivation of strict anaerobes. In: Methods in Microbiology Eds. Norris JR y Ribbons DW. págs. 118-132. New York: Academic Press). Las células se cultivan en condiciones estrictamente anaeróbicas al aplicar el siguiente medio:
Todos los ingredientes, excepto el sulfuro, se disuelven en agua desionizada y el medio se purga con gas nitrógeno (99,999% de pureza) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de la adición de sulfuro, el valor del pH se ajusta a 7,0 a temperatura ambiente con HCl 1 M. A continuación, el medio se distribuye en tubos Hungate de 16 ml (con 8 ml de medio) o botellas de suero de 200 ml (100 ml de medio) en atmósfera de nitrógeno y los recipientes se cierran herméticamente. Después de esterilizar en autoclave a 121 °C durante 20 min, el valor de pH debe estar entre 6,8 y 7,0.
Las fuentes de carbono se añaden antes de la esterilización en autoclave. Después de la esterilización en autoclave, los cultivos se inoculan mediante la inyección de un cultivo de semillas a través del tabique del sello y se inoculan en una incubadora a 72 °C durante unas 18 horas.
Para la generación de precultivos para experimentos de fermentación, primero tubos Hungate de 16 ml (rellenado con 8 ml de medio) que contienen 4,3 g/l de celulosa (tiras de papel de filtro Whatman No.1) y 20 g/l de madera de haya molida sin tratar como sustrato se inocularon y luego se incubaron a 72 °C durante 18 horas y luego se
inocularon 8 ml de este precultivo en frascos de suero de 200 ml (100 ml de medio que contenía 1 % de celulosa microcristalina) y se cultivaron a 72 °C durante 18 horas.
Ejemplo 2: HPLC
Los azúcares y los productos de fermentación se cuantificaron mediante HPLC-IR mediante el uso de un Via Hitachi LaChrom Elite (Hitachi corp.) equipado con un Rezex ROA Organic Acid H+ (Phenomenex). Los analitos se separaron isocráticamente con 2,5 mM H2S04y a 65 °C.
Ejemplo 3: Biomasa de algas de fermentación
Se realizó un experimento por lotes con la cepa DIB104C (inoculación al 10 %; 14 ml) mediante cultivo en un recipiente de cultivo de vidrio con doble camisa (volumen de trabajo de 140 ml) en el medio descrito anteriormente (excepto para reemplazar Na2S * 9 H2O 0,75 g/L por Na2SO30,5 g/L) con la adición de 60 g de pasta celular (que consiste de 33,3 % de peso seco, es decir, 20 g de peso en seco)/L de algas verdes Nanocloropsis salina no tratadas. El recipiente se inoculó con 14 ml (volumen final 10 %) de un precultivo de semillas que se había inoculado en botellas de suero de 200 ml (100 ml de medio que contiene 1 % de celulosa microcristalina), que se cultivaron a 72 °C durante 18 horas.
La temperatura se controló a 70 °C y el valor de pH se controló a 6,75 ± 0,1 durante toda la fermentación mediante titulación con NaOH 2M. El fermentador se purgó con nitrógeno para eliminar el exceso de oxígeno antes de añadir sulfito de sodio como se describió anteriormente.
La fermentación se inició mediante la adición de un cultivo de semillas preparado como se describió antes. Se tomó una muestra después de 120 horas de tiempo de cultivo, luego se centrifugó la muestra a 14 000 g y luego se analizó el sobrenadante por HPLC. Los resultados del análisis HPLC como se describe en la Tabla 3 muestran una producción paralela de lactato (0,8 mM) y acetato (16,6 mM) que señalan la producción de ácidos carboxílicos a partir de biomasa de algas.
Tabla 3
En la Tabla 4, se exhiben los resultados de otro ejemplo para la producción de ácido láctico, ácido acético y etanol por la cepa DIB104C después de 120 h de crecimiento en biomasa de algas no tratadas de la especie de alga verde Nanocloropsis salina.
Ejemplo 4: Cultivos sobre biomasa de algas en botellas de suero
Experimentos por lotes con la cepa DIB104C (inoculación al 1 %; 1 ml) en frascos de suero de 200 ml (que contienen 100 ml de medio) en el medio descrito anteriormente (excepto sin el extracto de levadura como fuente de carbono) con la adición de 30 g de pasta celular (que consiste de 33,3 % de peso en seco, es decir, 10 g de peso en seco) / L de algas verdes Nanocloropsis salina no tratadas o esterilizadas en autoclave (121 °C, 20 minutos, 1,2 bar (=120 kPa)).Los frascos de suero se inocularon con 1 ml (volumen final 10 %) de un precultivo de semillas, que había sido inoculado en frascos de suero de 200 ml con 100 ml de medio que contenía celulosa microcristalina al 1 % a 72 °C durante 18 horas. Se generaron frascos de suero de control (sin DIB104C) mediante el uso del mismo medio (que contiene biomasa de algas no tratada o tratada en autoclave) como los que se inocularon, pero se omitió la inoculación con DIB104C.
Los frascos de suero inoculados y no inoculados se incubaron en paralelo a 72 °C a 100 rpm en un agitador de matraces de laboratorio. El cultivo se inició mediante la adición de un cultivo de semillas preparado como se describió antes. Se tomó una muestra después de un tiempo de cultivo de 77,5 horas, luego se centrifugó la muestra a 14000 g y luego se analizó el sobrenadante por HPLC. Los resultados del análisis HPLC como se describe en la tabla 4 y la tabla 5 muestran producciones paralelas de lactato, acetato y etanol. Para el análisis de la producción de los productos químicos a base de carbono lactato, acetato y etanol por DIB104C en biomasa de algas, los resultados de los frascos de suero inoculados se restaron de los resultados de los frascos de suero de control (no inoculados). Los resultados de este cálculo muestran la producción de lactato (0,3 mM), acetato (4,1 mM) y etanol (0,8 mM) por DIB104C en biomasa de algas sin tratar y producción de lactato (0,5 mM), acetato (7,9 mM) y etanol (0,6 mM ) por el DIB104C sobre biomasa de algas esterilizadas en autoclave que señala la producción de productos químicos a base de carbono a partir de biomasa de algas no tratada y esterilizada en autoclave.
Tabla 4
Tabla 5
Ejemplo 5: Cultivos sobre biomasa de algas seca en botellas de suero
Experimentos por lotes con la cepa DIB104C (inoculación al 1 %; 1 ml) en frascos de suero de 200 ml (que contienen 100 ml de medio) en el medio descrito anteriormente (que incluye extracto de levadura como fuente de carbono) con la adición de 10 g de liofilizado (es decir, 10 g de peso en seco ) / L de algas verdes Nanocloropsis salina esterilizadas en autoclave (121 °C, 20 minutos, 1,2 bar (=120 kPa)).Los frascos de suero se inocularon con 1 ml (volumen final 10 %) de un precultivo de semillas, que se había inoculado en frascos de suero de 200 ml con 100 ml de medio que contenía celulosa microcristalina al 1 % a 72 °C durante 30 horas y se agitó a 100 rpm. Se generaron frascos de suero de control (sin DIB104C) mediante el uso del mismo medio (que contiene biomasa de algas liofilizadas esterilizadas en autoclave) como los que se inocularon, pero se omitió la inoculación con DIB104C. Para los experimentos, se usaron tres juegos paralelos de frascos de suero inoculados por DIB104C y tres juegos paralelos de frascos de suero no inoculados por DIB104C (controles).
Los frascos de suero inoculados y no inoculados se incubaron en paralelo a 72 °C a 100 rpm en un agitador de matraces de laboratorio. El cultivo se inició mediante la adición de un cultivo de semillas preparado como se describió antes. Se tomaron muestras después de 0, 17, 22, 39, 63 y 134 horas de tiempo de cultivo, luego se centrifugó la muestra a 14000 g y luego se analizó el sobrenadante por HPLC. Los resultados del análisis de HPLC reflejados como el promedio de las tres botellas de suero como se describe en la tabla 6 y en la tabla 7 muestran producciones paralelas de acetato y etanol. Para el análisis de la producción de los productos químicos a base de carbono acetato y etanol por DIB104C en biomasa de algas, los resultados de los frascos de suero inoculados se restaron de los resultados de los frascos de suero de control (no inoculados).
Los resultados de este cálculo muestran la producción de acetato (6,0 mM) y etanol (0,5 mM) después de 134 horas de cultivo con DIB104C en biomasa de algas liofilizada y esterilizada en autoclave, lo que indica la producción de productos químicos a base de carbono a partir de biomasa de algas liofilizada y esterilizada en autoclave.
Tabla 6
continuación
Tabla 7
Claims (5)
1. Un método para convertir una biomasa de algas en una sustancia química a base de carbono, que comprende las etapas de poner en contacto la biomasa de algas con un cultivo microbiano durante un período de tiempo a una temperatura inicial y un pH inicial, para producir de esta manera una cantidad de la sustancia química a base de carbono, en donde el cultivo microbiano comprende un microorganismo termófilo capaz de sobrevivir en condiciones de alta temperatura por encima de 70 °C, y en donde el producto químico a base de carbono es ácido láctico o una de sus sales o ésteres, en donde el microorganismo termófilo es una cepa aislada del género Caldicellulosiruptor, en donde la cepa se selecciona del grupo que consiste en Caldicellulosiruptorsp. DIB041C, depositado como DSM 25771, Caldicellulosiruptor sp. DIB087C, depositado como DSM 25772, Caldicellulosiruptor sp. DIB103C, depositado como DSM 25773, Caldicellulosiruptor sp. DIB104C, depositado como DSM 25774 y Caldicellulosiruptor sp. DIB107C, depositado como DSM 25775, microorganismo derivado del mismo o progenie del mismo, en donde la temperatura inicial está en el intervalo entre 55 °C y 80 °C, preferentemente entre 72 °C y 78 °C.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha biomasa de algas se somete a un pretratamiento mecánico, termoquímico y/o bioquímico.
3. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde la biomasa de algas se trata además con enzimas, preferentemente enzimas degradantes de celulosa y hemicelulosa.
4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, de manera que la biomasa de algas se deriva de algas verdes como las algas de la clase chlorophyceae, preferentemente del orden clamidomonadales, preferentemente de la familia haematococcaceae, con mayor preferencia del género haematococcus.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, de manera que las algas son de la especie Haematococcus pluvialis o Nannochloropsis salina.
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