ES2929549T3 - Osteoblasto y método de preparación del mismo - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a: un método para preparar un osteoblasto a partir de una célula somática introduciendo un gen relacionado con el hueso o un producto de expresión del mismo y un gen relacionado con la reprogramación o un producto de expresión del mismo en una célula somática de un mamífero, o introduciendo un gen relacionado con la reprogramación o un producto de expresión del mismo independientemente a una célula somática de un mamífero, el método para preparar un osteoblasto en el que el gen relacionado con el hueso es al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en Runx2 (R), Osterix (O) y Dlx5 (D), y el gen relacionado con la reprogramación es al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en la familia Oct, c-Myc (M), L-Myc (L), la familia Klf, Lin- 28 y Medias 2; y un osteoblasto preparado por el método mencionado anteriormente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Osteoblasto y método de preparación del mismo

La presente invención se refiere a un método in vitro para preparar un osteoblasto a partir de una célula somática de un mamífero y a una composición que comprende un gen relacionado con el hueso o un producto de expresión del mismo y un gen relacionado con la reprogramación o un producto de expresión del mismo para su uso en la preparación un osteoblasto a partir una célula somática de un mamífero.

Antecedentes de la técnica

Se puede esperar que el trasplante de osteoblastos a un área afectada para reparar un defecto óseo debido a un tumor óseo, traumatismo, osteomielitis o similar o un defecto óseo después del curetaje de un tumor óseo o similar promueva la formación ósea y mejore el pronóstico funcional y morfológico. En realidad, se ha llevado a cabo un tratamiento realizado mediante trasplante autólogo de células de médula ósea recogidas, por ejemplo, del hueso esponjoso de un paciente, y se conoce la eficacia del tratamiento. En este caso, se considera que los osteoblastos obtenidos por inducción de la diferenciación a partir de células madre mesenquimales contenidas en células autólogas de la médula ósea contribuyen a la formación y remodelación ósea. Mientras tanto, la prevalencia de la osteoporosis ha ido aumentando a la par del envejecimiento de la población, y la fractura ósea de una persona mayor puede provocar un reposo prolongado en cama. Se considera que el trasplante de osteoblastos es capaz de promover la curación de fracturas óseas debidas a osteoporosis, traumatismos o similares, fracturas óseas intratables y pseudofracturas. Además, el trasplante de osteoblastos también puede ser útil para, por ejemplo, artritis reumatoide, osteonecrosis idiopática de la cabeza femoral, artrosis deformante, espondilosis deformante lumbar, estenosis del canal espinal, hernia de disco, espondilólisis, espondilolistesis espondilolítica, escoliosis, mielopatía cervical espondilótica, osificación del ligamento longitudinal posterior, lesión de la médula espinal, coxartrosis, gonartrosis, deslizamiento de la epífisis femoral superior, osteomalacia, reparación ósea después de la cirugía (tal como la reparación del esternón después de una cirugía cardíaca), reparación de un defecto asociado con la cirugía de la articulación del tobillo artificial, osteomielitis y osteonecrosis.

Por otro lado, una enfermedad periodontal puede denominarse como la cuarta enfermedad relacionada con el estilo de vida ocurre con una prevalencia muy alta en las personas y provoca diversas enfermedades sistémicas. A medida que avanza la enfermedad periodontal, se produce la reabsorción ósea del hueso alveolar. En consecuencia, cuando los osteoblastos pueden suministrarse a un sitio de reabsorción ósea local con alta eficacia, el hueso alveolar puede regenerarse y tratarse.

Cuando el trasplante de osteoblastos se combina con el trasplante óseo, el trasplante óseo artificial, las articulaciones artificiales y los implantes, pueden potenciarse los efectos terapéuticos.

Las células madre mesenquimales de la médula ósea, las células de la médula ósea, incluyendo las células madre mesenquimales de la médula ósea, y similares se han utilizado hasta ahora como tales osteoblastos para trasplante. Sin embargo, la recolección de la médula ósea presenta problemas. Por ejemplo, la recolección es altamente invasiva para un paciente y en algunos casos no se puede suministrar una cantidad suficiente de células de médula ósea. Por otro lado, el uso de células madre embrionarias humanas (células ES) no requiere la recolección de la médula ósea de un paciente y puede suministrar una cantidad suficiente de osteoblastos, pero puede causar un riesgo de tumorigénesis de células ES residuales después del trasplante además de cuestiones éticas. Además, el uso de células iPS no requiere la recolección de la médula ósea de un paciente y puede suministrar una cantidad suficiente de osteoblastos, pero puede provocar un riesgo de tumorigénesis de las células iPS residuales después del trasplante.

En la bibliografía de no Patente 1, hay una descripción de la introducción de un vector de lentivirus que incluye Osterix en células ES humanas y la inducción de la diferenciación en osteoblastos en un medio osteogénico.

En la bibliografía de no Patente 2 y la bibliografía de No Patente 3, hay descripciones de la preparación de osteoblastos a partir de células iPS de ratón a través de la conversión en MSCs por inducción de la diferenciación en un medio osteogénico.

En la bibliografía no Patente 4, hay una descripción de la preparación de osteoblastos introduciendo un vector de adenovirus que incluye Runx2 en células iPS de ratón y sometiendo las células a inducción de diferenciación en un medio osteogénico.

Como se describe de la bibliografía de no Patente 1 a la bibliografía de no Patente 4, los osteoblastos se preparan a partir de células madre pluripotentes, tales como células ES y células iPS, mediante inducción de diferenciación y, por lo tanto, los métodos requieren un cultivo a largo plazo y tienen riesgos de carcinogénesis.

Por ejemplo, se han realizado los siguientes informes sobre el hecho de que, cuando se introduce un grupo de genes de un factor de transcripción específico de tejido en células somáticas, se puede lograr la inducción de diferenciación directa en células tisulares sin conversión en células iPS (reprogramación directa (conversión directa)):

fibroblasto de ratón ^ condrocitos (se introdujeron los genes SOX9+Klf4+c-Myc),

fibroblasto de ratón ^ célula de músculo cardíaco (se introdujeron los genes GATA4+Mef2c+Tbx5), fibroblasto de ratón ^ célula hepática (se introdujeron los genes Hnf4a+ (Foxa1, Foxa2 o Foxa3)), fibroblastos de ratón ^ células madre neurales (por ejemplo, se introdujeron los genes Sox2+FoxG1), y célula de ratón o humana ^ célula madre hematopoyética.

La bibliografía de no Patente 5 se refiere al establecimiento de iPSCs humanas como una fuente potencial de condroprogenitores viables para la reparación del cartílago articular mediante la evaluación del potencial condrogénico in vitro de la población pluripotente frente a una población progenitora de tipo mesenquimal derivada de iPSC. La bibliografía de no Patente 6 describe la exposición de iPSC reprogramadas a partir de fibroblastos murinos de la punta de la cola a ácido retinoico solo (RA) o en combinación con TGF-p1 y 3, factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF) o proteína morfogenética ósea 2 (BMP-2). Las células resultantes expresaron marcadores putativos de células madre mesenquimales (MSCs) seleccionadas; diferenciados hacia osteoblastos y linajes de células adipocíticas in vitro en diversos grados.

Sin embargo, no hay informes de conversión directa de las células somáticas en osteoblastos.

Listado de citas

Bibliografía de no Patente

[NPL 1] Karner E et al. J Cell Physiol. 2009.

[NPL 2] Li F et al. J Cell Biochem. 2010.

[NPL 3] Biloussova G et al. Stem cells. 2011.

[NPL 4] Tashiro K et al. Stem cells. 2009.

[NPL 5] Guzzo R. M. et al. Journal of celular biochemistry 2013.

[NPL 6] Feng Li et al. BMC cell biology, biomed central, London, GB 2012.

Compendio de la invención

Problema técnico

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un método in vitro para preparar un osteoblasto que sea aplicable a la reparación de un defecto óseo debido a diversos tumores, lesiones, operaciones, etc. y al tratamiento de la reabsorción ósea tipificada por una enfermedad periodontal, fractura ósea, osteoporosis, etc. y tiene menos riesgos de carcinogénesis.

Solución al problema

Este objetivo se soluciona con el contenido de las reivindicaciones independientes. Otros aspectos se describen en las reivindicaciones secundarias. Los inventores de la presente invención han descubierto que los osteoblastos pueden obtenerse directamente introduciendo genes específicos combinados en células somáticas de un mamífero (reprogramación directa) sin convertirlos en células madre pluripotentes, tales como células ES y células iPS.

Según realizaciones de la presente invención, se proporciona lo siguiente:

Punto 1. Un método in vitro para preparar un osteoblasto a partir de una célula somática de un mamífero, incluyendo el método la introducción de un gen relacionado con el hueso o un producto de expresión del mismo y un gen relacionado con la reprogramación o un producto de expresión del mismo en la célula somática mediante reprogramación directa sin conversión en células madre pluripotentes, comprendiendo el gen relacionado con los huesos al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en Runx2 (R), Osterix (O) y Dlx5 (D), incluyendo el gen relacionado con la reprogramación al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en la familia Oct, c-Myc (M), L-Myc (L), familia GLIS, familia Klf, Lin-28 y Sox2, en el que el gen relacionado con la reprogramación o el producto de expresión del mismo comprende Oct4, y en donde la célula somática es un fibroblasto.

Punto 2. Un método in vitro para preparar un osteoblasto según el punto 1, en el que el gen relacionado con la reprogramación o el producto de expresión del mismo que se introducirá en la célula somática incluye uno de Oct4, Oct4L, Oct4M, Oct4LM, Oct4LGlis1 y Oct4LMGlis1, donde M representa "c-Myc" y L representa "L-Myc".

Punto 3. Un método in vitro según el punto 1, en el que una combinación del gen relacionado con el hueso o el producto de expresión del mismo y el gen relacionado con la reprogramación o el producto de expresión del mismo que se va a introducir en la célula somática incluye una combinación seleccionada del grupo que consiste en ROD Oct4L, RD Oct4L, RO Oct4ML, D Oct4ML, ROD Oct4M, OD Oct4L, O Oct4ML, O Oct4L, O Oct4M, OD Oct4, D Oct4L, Oct4ML, ROD Oct4ML, RD Oct4ML, OD Oct4ML, O Oct4MLGlis1 , RD Oct4M, R Oct4L G lisl, R Oct4ML, OD Oct4M, O Oct4L G lisl, ROD Oct4, RO Oct4M, RO Oct4L, RO Oct4, O Oct4 G lisl, RD Oct4, Oct4L G lisl, D Oct4M, D Oct4 G lisl, O Oct4, Oct4L, Oct4M, D Oct4, RO Oct4 K, RO Oct4Sox2 y RO Oct4Lin28, donde R representa "Runx2", O representa "Osterix", D representa "Dlx5", K representa Klf4, M representa "c-Myc" y L representa "L-Myc".

Punto 4. Un método según el punto 1, en el que una combinación del gen relacionado con el hueso o el producto de expresión del mismo y el gen relacionado con la reprogramación o el producto de expresión del mismo que se va a introducir en la célula somática incluye una combinación seleccionada del grupo que consiste en ROD Oct4L, RD Oct4L, RO Oct4ML, D Oct4ML, ROD Oct4M, OD Oct4L, O Oct4ML, O Oct4L, O Oct4M, OD Oct4, D Oct4L y Oct4ML, donde R representa "Runx2", O representa "Osterix" , D representa "Dlx5", M representa "c-Myc" y L representa "L-Myc".

Punto 5. Un método según el punto 1, en el que una combinación del gen relacionado con el hueso o el producto de expresión del mismo y el gen relacionado con la reprogramación o el producto de expresión del mismo que se va a introducir en la célula somática incluye una combinación seleccionada del grupo que consiste en ROD Oct4L, RD Oct4L, RO Oct4ML y D Oct4ML.

Punto 6. Una composición que incluye un gen relacionado con el hueso o un producto de expresión del mismo y un gen relacionado con la reprogramación o un producto de expresión del mismo para su uso en la preparación de un osteoblasto a partir de una célula somática de un mamífero, comprendiendo el gen relacionado con el hueso al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en Runx2 (R), Osterix (O) y Dlx5 (D), incluyendo el gen relacionado con la reprogramación al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en Oct4, c-Myc (M), L- Myc (L), familia GLIS, familia Klf, Lin-28 y Sox2, en donde el gen relacionado con la reprogramación o el producto de expresión del mismo comprende Oct4, y en donde la célula somática es un fibroblasto.

Punto 7. La composición según el punto 6, que es un vector que comprende un gen relacionado con el hueso y un gen relacionado con la reprogramación.

La presente invención está dirigida a una tecnología in vitro para preparar un osteoblasto a partir de una célula somática mediante la introducción de un gen relacionado con el hueso o un producto de expresión del mismo y un gen relacionado con la reprogramación o un producto de expresión del mismo. Como gen relacionado con los huesos entre esos, se selecciona al menos un tipo del grupo que consiste en Runx2 (R), Osterix (O) y Dlx5 (D). El gen incluye deseablemente al menos uno de Oxterix y Dlx5. Además, al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en los siguientes genes se selecciona como el gen relacionado con la reprogramación: familia Oct4, c-Myc (M), L-Myc (L), familia Glis, familia Klf (KLF1, KLF2, KLF3, KLF4, KLF5, KLF6, KLF7, KLF8, KLF9, KLF10, KLF11, KLF12, KLF13, KLF14, KLF15, KLF16 y KLF17), Lin-28 y Sox2. El gen relacionado con la reprogramación incluye al menos un tipo de la familia Oct4, más deseablemente al menos un tipo de la familia Oct4 y L-Myc y/o c-Myc. De la familia Oct4, se incluye Oct4. Por lo tanto, el gen relacionado con la reprogramación incluye más deseablemente tanto Oct4 como L-Myc y/o c-Myc.

En general, Oct4 puede representarse como Oct3/4, pero se representa como "Oct4" en esta divulgación.

Oct4 es un factor para la reprogramación de células somáticas para inducir multipotencia mediante la introducción de genes junto con Sox2, Klf4 y c-Myc en las células somáticas (Takahashi K, Yamanaka S. Cell, 126(4): 663-76, 2006; Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. Cell. 131(5): 861-72, 2007). Se sabe que la introducción de genes de uno cualquiera de GATA3, GATA6, SOX7, PAX1, GATA4, CEBPa, HNF4a, GRB2 y similares en lugar de Oct4 en células somáticas junto con Sox2, Klf4 y c-Myc puede reprogramar las células somáticas para inducir multipotencia (Shu et al. Cell 153: 963, 2013). En su lugar, también se pueden utilizar factores tales como GATA3, GATA6, SOX7, PAX1, GATA4, CEBPa, HNF4a y GRB2, que no son factores de reprogramación y no pertenecen a la familia Oct, pero pueden tener una función alternativa a Oct en la reprogramación en vez de Oct4.

KLF-4 también puede sustituirse por cualquier otro gen de la familia Klf (KLF1, KLF2, KLF3, KLF5, KLF6, KLF7, KLF8, KLF9, KLF10, K^l F11, KLF12, KLF13, KLF14, KLF15, KLF16 o KLF17). En esta divulgación, el término "KLF-4" se usa para la descripción como un representante de la familia Klf, pero también se pueden usar otros genes de la familia Klf de la misma manera que KLF-4.

Como familia GLIS, se proporciona GLIS1 (dedo de zinc 1 de la familia GLIS) o similar.

Como genes que pueden tener una función alternativa a KLF-4 en la reprogramación de células somáticas (inducción de células iPS), se conocen no solo genes de la familia KLF sino también, por ejemplo, un miembro de la familia IRX (tal como IRX6 (proteína homeobox 6 de Iroquois)), un miembro de la familia PTX (tal como PITX2 (factor de transcripción 2 de homeodominio similar a pares)) y DMRTB1 (familia B similar a DMRT con C-terminal 1 rica en prolina) (WO2010/098419 (2 sep, 2010)). En esta divulgación, el término "KLF-4" se usa para la descripción, pero los genes que pueden tener una función alternativa a KLF-4 en la reprogramación de células somáticas (inducción de células iPS) se pueden usar de la misma manera que KLF-4. También pueden usarse productos de esos genes, es decir, mRNAs.

En lugar de SOX2, se puede usar otro gen de la familia SOX de la misma manera que SOX2. En esta divulgación, el término "SOX2" se usa para la descripción como un representante de la familia SOX, pero también se puede usar otro gen de la familia SOX de la misma manera que SOX2.

En la presente invención, todos los genes se denominan como SOX2 por conveniencia.

En lugar de uno o más del gen relacionado con el hueso y el gen relacionado con la reprogramación, los productos de expresión de los mismos pueden usarse como alternativas. Como genes que pueden tener una función alternativa a Oct4 en la inducción de células iPS, se conocen, por ejemplo, GATA3, GATA6, SOX7, PAX1, GATA4, CEBPa, HNF4a y GRB2 (Jian Shu et al., Cell 153, 963-975, 2013). Como compuesto de molécula pequeña que puede tener una función alternativa a Oct4 en la reprogramación de células precursoras neurales, se conoce BIX-01294 (Bo Feng et al., Cell Stem Cell 4: 301,2009). Como un compuesto que puede tener una función alternativa a Klf-4 en la inducción de células iPS, se conoce la kenpaulona (Lyssiotis, CA, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 June 2; 106(22): 8912­ 8917.) y, por lo tanto, dicho compuesto puede usarse en lugar de la introducción del gen Klf-4. En esta divulgación, por conveniencia, un gen y un producto de expresión del mismo se denominan a veces colectivamente como "gen". En dicho caso, el término "introducción de un gen" se sustituye por el término "adición de una molécula", "adición de un fármaco", "adición de un compuesto", "administración de una molécula", "administración de un fármaco", “administración de un compuesto”, o similares.

Se puede añadir además otro gen a las combinaciones de genes de la presente invención.

La presente invención abarca un método in vitro para inducir un osteoblasto a partir de una célula somática. Cuando esta tecnología se aplica a una célula somática en un cuerpo, se puede producir un osteoblasto directamente en el cuerpo.

Efectos ventajosos de la invención

Según las realizaciones de la presente invención, los osteoblastos se pueden proporcionar a partir de células somáticas mediante reprogramación directa en un corto período de tiempo. Los osteoblastos se pueden inducir fácilmente a partir de células somáticas de una persona a trasplantar. Por consiguiente, incluso cuando se trasplantan los propios osteoblastos o tejidos óseos preparados a partir de las células, no se produce un problema, tal como una respuesta de rechazo inmunológico. Además, los osteoblastos se pueden inducir directamente a partir de células somáticas sin convertirlas en células iPS o células ES y, por lo tanto, se puede evitar un problema debido a las células madre pluripotentes, tal como la carcinogénesis.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una ilustración de la preparación de vectores pMXs que codifican genes de interés.

La Figura 2 es una ilustración del esquema de un experimento.

La Figura 3A es el resultado de la tinción con Alizarin Red S. La Figura 3A es una macrografía de un plato. La matriz ósea calcificada se tiñó de rojo, lo que sugirió que se indujeron osteoblastos funcionales. Consúltese la Figura 3H para los números de pocillos (el número "1" en la tabla de la Figura 3H representa la infección con vectores de retrovirus que incluyen los genes respectivos, y el blanco representa la no infección con vectores de retrovirus que incluyen los genes respectivos).

La Figura 3B es un resultado de la tinción con Alizarin Red S. La Figura 3B es una macrografía de un plato. La matriz ósea calcificada se tiñó de rojo, lo que sugiere que se indujeron osteoblastos funcionales. Consúltese la Figura 3H para los números de los pocillos (el número "1" en la tabla de la Figura 3H representa la infección con vectores de retrovirus que incluyen los genes respectivos, y el blanco representa la no infección con vectores de retrovirus que incluyen los genes respectivos).

La Figura 3C es un resultado de la tinción con Alizarin Red S. La Figura 3C es una macrografía de un plato. La matriz ósea calcificada se tiñó de rojo, lo que sugiere que se indujeron osteoblastos funcionales. Consúltese la Figura 3H para los números de pocillos (el número "1" en la tabla de la Figura 3H representa la infección con vectores de retrovirus que incluyen los genes respectivos, y el blanco representa la no infección con vectores de retrovirus que incluyen los genes respectivos).

La Figura 3D es un resultado de la tinción con Alizarin Red S. La Figura 3D es una macrografía de un plato. La matriz ósea calcificada se tiñó de rojo, lo que sugirió que se indujeron osteoblastos funcionales. Consúltese la Figura 3H para los números de pocillos (el número "1" en la tabla de la Figura 3H representa la infección con vectores de retrovirus que incluyen los genes respectivos, y el blanco representa la no infección con vectores de retrovirus que incluyen los genes respectivos).

La Figura 3E es un resultado de la tinción con Alizarin Red S. La Figura 3E es una macrografía de un plato. La matriz ósea calcificada se tiñó de rojo, lo que sugirió que se indujeron osteoblastos funcionales. Consúltese la Figura 3H para los números de pocillos (el número "1" en la tabla de la Figura 3H representa la infección con vectores de retrovirus que incluyen los genes respectivos, y el blanco representa la no infección con vectores de retrovirus que incluyen los genes respectivos).

La Figura 3F es un resultado de la tinción con Alizarin Red S. La Figura 3F es una macrografía de un plato. La matriz ósea calcificada se tiñó de rojo, lo que sugirió que se indujeron osteoblastos funcionales. Consúltese la Figura 3H para los números de pocilios (el número "1" en la tabla de la Figura 3H representa la infección con vectores de retrovirus que incluyen los genes respectivos, y el blanco representa la no infección con vectores de retrovirus que incluyen los genes respectivos).

La Figura 3G es una macrografía de una placa de 96 pocillos (consúltese la Figura 3H para ver los números de los pocillos).

La Figura 3H es un resultado de la medición de las absorbancias (550 nm a 650 nm) de las soluciones de reacción utilizando un lector de microplacas. El eje vertical del gráfico representa absorbancias, y el gráfico muestra que, a medida que aumenta la absorbancia, aumenta la cantidad de matriz ósea calcificada producida, es decir, aumenta la cantidad de fibroblastos convertidos en osteoblastos funcionales.

La Figura 31 es un resultado de la medición de las absorbancias (490 nm a 650 nm) de las soluciones de reacción utilizando un lector de microplacas mediante el mismo experimento que se muestra en la Figura 3H. El número "1" en la tabla representa la infección con vectores de retrovirus que incluyen los genes respectivos, y el blanco representa la no infección con vectores de retrovirus que incluyen los genes respectivos. Por ejemplo, el gráfico muestra que el pocillo 27 incluye células que fueron infectadas con vectores de retrovirus, incluyendo los genes Osterix, Runx2, Oct4, L-Myc y Dlx5 y no infectadas con vectores de retrovirus, incluyendo los genes c-Myc, Glis1 y EGFP, y produjo una gran cantidad de matriz ósea calcificada.

La Figura 4 es un resultado de una prueba de actividad de ALP.

La Figura 5 es una imagen teñida con ALP.

Las Figuras 6 son resultados de inmunotinción. (a) control, (b) RO Oct4M, (c) RO Oct4L: x100.

Las Figuras 7 son resultados de la tinción con Alizarin Red S. (a) Control, (b) RO Oct4M, (c) RO Oct4L: x1, (d) Control, (e) RO Oct4M, (f) RO Oct4L: x40.

La Figura 8 es un resultado de la tinción de von Kossa.

La Figura 9 es una ilustración del esquema de un experimento de cultivo tridimensional.

La Figura 10 son resultados de la tinción de Giemsa de un cultivo tridimensional. (a) fondo, (b) RO Oct4L: x1. La Figura 11 son los resultados de la tinción con Alizarin Red S de un cultivo tridimensional. (a) fondo, (b) control, (c) RO Oct4M, (d) RO Oct4L: x1.

Las Figuras 12 son imágenes teñidas con ALP (aHDF). (a) control, (b) RO Oct4G, (c) RO Oct4L: x1, (d) control, (e) RO Oct4G, (f) RO Oct4L: x40.

La Figura 13a es un resultado de la tinción con Alizarin Red S (aHDF).

La Figura 13b incluye una imagen teñida con ALP y una imagen teñida de von Kossa.

La Figura 14 es un resultado de la tinción con Alizarin Red S.

La Figura 15 son gráficos para mostrar propiedades de osteoblastos humanos inducidos por reprogramación directa.

La Figura 16 son resultados del análisis de osteoblastos humanos inducidos por reprogramación directa.

La Figura 17 es un resultado de la cuantificación de los niveles de expresión de genes mediante análisis de RT-PCR en tiempo real.

Las Figuras 18 son resultados de regeneración ósea in vivo en sitios de defectos óseos. a: micro-CT (imágenes tomográficas seriadas), b: imágenes histológicas (secciones seriadas), c: inmunohistoquímica fluorescente (anticuerpo antihumano).

La Figura 19 es un gráfico que muestra la regeneración ósea in vivo en sitios de defectos óseos (resistencia mecánica).

La Figura 20 es un resultado de la regeneración ósea in vivo en sitios de defectos óseos.

La Figura 21 es una imagen obtenida por reconstrucción tridimensional de datos de microtomografía computarizada (pCT) mostrada en la Figura 18a.

La Figura 22 es una imagen de transmisión de pCT obtenida por el mismo experimento que el que se muestra en las Figuras 18. Las flechas representan sitios de defectos óseos. Un hueso trasplantado con osteoblastos (dOBs) inducidos por reprogramación directa tiene una alta radiopacidad en un sitio de defecto óseo en comparación con un hueso trasplantado con fibroblastos gingivales humanos.

La Figura 23 es una lista de cebadores usados para RT-PCR.

La Figura 24 es una lista de cebadores utilizados para la secuenciación.

La Figura 25 es una lista de cebadores usados para RT-PCR en tiempo real.

La Figura 26 son ilustraciones de reprogramación directa en osteoblastos con un vector episomal.

Las Figuras 27 son resultados de la reprogramación directa en osteoblastos de ratón.

La Figura 28a es un resultado de la medición de los niveles de expresión de mRNA de hOsteopontina (□) y hOsteocalcina (■) mediante RT-PCR en tiempo real, y cada uno de los genes introducidos se representa como "+". La Figura 28b es un resultado de la medición de los niveles de expresión de mRNA de hOsteocalcin (■) y APL (□) mediante RT-PCR en tiempo real, y cada uno de los genes introducidos se representa como "+".

La Figura 28c es un resultado de la tinción de von Kossa. Cada uno de los genes introducidos se representa como "+".

La Figura 29a es un resultado de la medición de los niveles de expresión de mRNA de genes mediante RT-PCR en tiempo real.

La Figura 29b es una lista de cebadores utilizados para la secuenciación.

La Figura 30 son los resultados de un perfil de expresión génica exhaustivo de osteoblastos inducidos a partir de fibroblastos humanos mediante reprogramación directa.

Las Figuras 31 son resultados del análisis de osteoblastos humanos inducidos mediante reprogramación directa. (a) inmunotinción, (b) eficiencia de la reprogramación directa.

La Figura 32 es un resultado que muestra que la reprogramación de fibroblastos humanos en osteoblastos está provocada por conversión directa sin una fase similar a células madre pluripotentes. (a) inmunotinción, (b) RT-PCR en tiempo real.

La Figura 33 es un resultado del análisis del cariotipo.

La Figura 34 es un resultado que muestra que los fibroblastos humanos no incluyen células madre mesenquimales (MSCs) incorporadas.

La Figura 35 es un resultado de la tinción de osteoblastos humanos inducidos a partir de fibroblastos humanos mediante reprogramación directa.

La Figura 36 es un resultado de la medición de los niveles de expresión de mRNA de genes mediante RT-PCR en tiempo real.

La Figura 37 es un resultado de la regeneración ósea in vivo en sitios de defectos óseos.

La Figura 38 es un resultado de la regeneración ósea in vivo en sitios de defectos óseos.

La Figura 39a es una ilustración que muestra la reprogramación de fibroblastos humanos en osteoblastos mediante la introducción de genes utilizando un vector de plásmido.

La Figura 39b es un resultado de la reprogramación de fibroblastos humanos en osteoblastos mediante la introducción de genes utilizando un vector de plásmido.

La Figura 40a es una ilustración que muestra la reprogramación de fibroblastos humanos en osteoblastos mediante la introducción de genes utilizando un vector de plásmido.

La Figura 40b es un resultado de la reprogramación de fibroblastos humanos en osteoblastos mediante la introducción de genes utilizando un vector de plásmido.

La Figura 41 es un resultado de la reprogramación de fibroblastos humanos en osteoblastos en un medio libre de proteínas extrañas.

La Figura 42 es un resultado que muestra la viabilidad después de la congelación y descongelación de osteoblastos humanos inducidos a partir de fibroblastos humanos mediante reprogramación directa en un medio libre de proteínas extrañas.

Descripción de realizaciones

Según la presente invención, se pueden preparar preosteoblastos, osteoblastos inmaduros, osteoblastos maduros, células óseas y similares. En esta divulgación, por conveniencia, todas las células se denominan "osteoblastos".

Como enfermedades a tratar con osteoblastos (material de trasplante) descritas en la presente memoria se dan, por ejemplo, defectos óseos debidos a tumores óseos, traumatismos, osteomielitis y similares, defectos óseos después del curetaje de tumores óseos y similares, fractura ósea, osteoporosis, enfermedad periodontal, reabsorción ósea alveolar, artritis reumatoide, osteonecrosis idiopática de la cabeza femoral, artrosis deformante, espondilosis deformante lumbar, estenosis del canal espinal, hernia de disco, espondilólisis, espondilolistesis espondilolítica, escoliosis, mielopatía cervical espondilótica, osificación del ligamento longitudinal posterior, lesión de la médula espinal, coxartrosis, gonartrosis, epífisis capital femoral, osteomalacia, reconstrucción en un sitio de fractura ósea destruido por una fractura compleja, tal como la reconstrucción de la mandíbula inferior, reparación de hueso después de la cirugía (reparación del esternón después de una cirugía cardíaca), reparación de un sitio de defecto asociado con cirugía de articulación de tobillo artificial, osteomielitis y osteonecrosis. Además, cuando los osteoblastos se trasplantan en combinación con el trasplante de hueso, el trasplante de hueso artificial y el uso de una articulación artificial o un implante, pueden potenciarse los efectos terapéuticos. Además, cuando se trasplantan tejidos óseos preparados in vitro mediante el cultivo de osteoblastos utilizando un andamio tridimensional o similar para que tengan diversas formas, se pueden tratar las enfermedades mencionadas anteriormente. Además de las enfermedades, se dirige a diversas enfermedades implicadas en la pérdida, falta o disminución de la función de los osteoblastos.

En esta divulgación, a menos que se especifique lo contrario, el término "tratamiento" se refiere al tratamiento de un paciente que padece una enfermedad o trastorno específico y significa que el tratamiento mejora la gravedad de la enfermedad o trastorno, mejora uno o más síntomas de la misma, o retrasa o reduce la velocidad de progreso de la enfermedad o trastorno. En esta divulgación, el "tratamiento" incluye "prevención".

Los osteoblastos descritos en la presente memoria, pueden usarse no solo para el tratamiento de una enfermedad sino también para la belleza. Por ejemplo, cuando los osteoblastos o un tejido óseo formado por los osteoblastos se trasplantan a un sitio de defecto debido a una cirugía de accidente o similar, las células pueden producir una matriz ósea para reparar el sitio de defecto y ocultar el sitio de defecto mediante una reparación tridimensional. En tal caso, por conveniencia, el tratamiento para seres humanos también se denomina como tratamiento en esta divulgación. El término "paciente" puede ser reemplazado por el término "sujeto sano" o "humano", y el término "enfermedad" puede ser reemplazado por el término "belleza".

La presente divulgación también se puede usar no solo para el tratamiento de enfermedades de seres humanos sino también para el tratamiento de enfermedades de mamíferos, incluyendo mascotas, tales como perros y gatos, y ganado, tal como vacas, caballos, cerdos, ovejas y pollos. En tal caso, el término "paciente" puede ser reemplazado por el término "ganado" o "mamífero".

El material de trasplante se refiere a un material que contiene osteoblastos para ser introducido en un cuerpo vivo para reparar y reconstruir un tejido óseo. El material de trasplante incluye un material que regenera parcial o completamente un tejido óseo in vitro y se trasplanta al mismo u otro individuo. Los osteoblastos obtenidos en la presente invención se pueden utilizar para la preparación del material de trasplante. Los propios osteoblastos también pueden utilizarse como material de trasplante. En consecuencia, los osteoblastos se pueden trasplantar a un paciente como una preparación celular, se pueden trasplantar junto con una base (andamio) formada por un material artificial, tal como hidroxiapatita o cerámica bioabsorbible, o se pueden cultivar con un andamio y luego trasplantarse. En tal caso, el andamio puede adoptar varias formas tridimensionales dependiendo de la finalidad del trasplante.

Las células somáticas se derivan de los mamíferos. Cuando los osteoblastos se trasplantan a un cuerpo vivo, las células somáticas (células autólogas) derivadas de un sujeto de prueba que se somete a un trasplante se utilizan preferiblemente para reducir los riesgos de infección, respuestas de rechazo y similares. Sin embargo, en lugar de las células autólogas, se pueden usar osteoblastos preparados previamente a partir de células somáticas de otra persona u otro animal para, por ejemplo, trasplantes para fracturas repentinas de huesos o similares. Alternativamente, los osteoblastos se pueden preparar a partir de células somáticas de otra persona u otro animal preparadas previamente y usadas para trasplante. Es decir, un banco de osteoblastos o un banco de células precursoras de osteoblastos puede prepararse previamente y usarse para el trasplante. En dicho caso, con el fin de reducir los riesgos, tales como las respuestas de rechazo, la tipificación del MHC se puede realizar previamente. Además, las características y la tumorigenicidad de los osteoblastos pueden confirmarse previamente.

En esta divulgación, los ejemplos del mamífero incluyen ratones, ratas, hámsters, humanos, perros, gatos, monos, conejos, vacas, caballos y cerdos, particularmente humanos.

La presente divulgación también se puede usar para, por ejemplo, varios estudios y desarrollo de tecnologías que usan osteoblastos. Por ejemplo, la presente invención es útil para estudios básicos tales como análisis de osteogénesis, envejecimiento óseo, morfogénesis, mecanismos de remodelación, estrés mecánico contra los factores e influencias de nutrientes, inmunidad, nervios y hormonas. La presente invención también es útil, por ejemplo, para el análisis de la influencia de la exposición interna a una sustancia radiactiva, tal como el estroncio-90, en el hueso y el desarrollo de una tecnología para eliminar el estroncio-90 del hueso.

El uso de la presente invención permite establecer osteoblastos a partir de seres humanos o animales que tienen diversas enfermedades o antecedentes genéticos de una manera sencilla, rápida y económica. Por consiguiente, las anomalías en los osteoblastos relacionadas con las enfermedades o antecedentes genéticos pueden analizarse mediante una técnica bioquímica, biológica molecular o inmunológica o similar. Esto puede contribuir a los estudios sobre la clarificación de los mecanismos patogénicos de enfermedades y similares o al desarrollo de métodos de diagnóstico. El desarrollo de fármacos, las pruebas de toxicidad de fármacos y similares que utilizan dichos osteoblastos pueden contribuir al desarrollo de nuevos métodos de tratamiento para diversas enfermedades.

Las células somáticas como objetivo del método de la presente invención (reprogramación directa) son fibroblastos.

En el método in vitro de la presente invención, al menos un tipo de gen relacionado con el hueso o un producto de expresión del mismo y al menos un tipo de gen relacionado con la reprogramación o un producto de expresión del mismo se introducen en células somáticas. En esta divulgación, como "producto de expresión", se proporcionan mRNAs o proteínas de genes, tales como un gen relacionado con los huesos y un gen relacionado con la reprogramación.

El gen relacionado con el hueso es un gen que se introducirá para permitir que los osteoblastos obtenidos por reprogramación sirvan como osteoblastos, y específicamente, al menos un tipo se selecciona del grupo que consiste en Runx2 (en lo sucesivo a veces abreviado como "R"), Osterix (en lo sucesivo, a veces abreviado como "O"), y Dlx5 (en lo sucesivo, a veces abreviado como "D"). El gen incluye preferiblemente al menos un tipo de Osterix y Dlx5. Un tipo o dos o más tipos de genes o productos de expresión de los mismos se introducen preferiblemente en células somáticas, si es necesario, en combinación con otro gen relacionado con el hueso o un producto de expresión del mismo.

El gen relacionado con la reprogramación es un gen que se introduce en las células somáticas para convertir las células somáticas en osteoblastos. Los ejemplos de los mismos incluyen Oct4, Oct1A, Oct6, c-Myc (en lo sucesivo, a veces abreviado como "M"), L-myc (en lo sucesivo, a veces abreviado como "L"), N-myc, una familia de Klf (KLF1, KLF2, KLF3, KLF4 (en lo sucesivo, a veces, abreviado como "K"), KLF5, KLF6, KLF7, KLF8, KLF9, KLF10, KLF11, KLF12, KLF13, KLF14, KLF15, KLF16 y KLF17), Lin-28, Sox1, Sox2, Sox3, Sox7, Sox15, Sox17 y Sox18. Uno o dos o más tipos de esos genes se introducen en las células somáticas. Las células somáticas se pueden inducir a osteoblastos simplemente introduciendo el gen relacionado con la reprogramación que se puede inducir. Sin pretender imponer ninguna teoría, los inventores de la presente invención consideran que esto se debe a la promoción de la expresión de un gen intrínseco relacionado con el hueso mediante la introducción del gen relacionado con la reprogramación.

Se sabe que los genes relacionados con los huesos, tales como Runx2, Osterix y Dlx5, están implicados en la diferenciación, el desarrollo, la proliferación, la supervivencia y similares de las células óseas. Sin embargo, no se conoce una tecnología para inducir directamente osteoblastos a partir de células somáticas, tales como los fibroblastos (sin conversión en células madre pluripotentes). Además, se sabe que una combinación de genes relacionados con la reprogramación induce células iPS a partir de células somáticas, pero no se sabe que induzca osteoblastos. Los inventores de la presente invención han establecido una tecnología in vitro para inducir directamente osteoblastos a partir de células somáticas, que son fibroblastos, usando uno o más genes relacionados con el hueso y uno o más genes relacionados con la reprogramación en combinación. Hasta el momento, esta tecnología no ha sido conocida. Además, es muy importante que el gen relacionado con la reprogramación incluya Oct4, pero no se conoce una tecnología para inducir directamente osteoblastos usando Oct4. Además, no se conoce una tecnología para inducir directamente osteoblastos usando Oct4 y L-Myc.

Las combinaciones preferidas del gen relacionado con el hueso y el gen relacionado con la reprogramación que se introducirán en las células somáticas son las siguientes: R Oct4ML, O Oct4ML, D Oct4ML, RO Oct4ML, RD Oct4ML, OD Oct4ML, ROD Oct4ML, R Oct4L, O Oct4L, D Oct4L, RO Oct4L, RD Oct4L, OD Oct4L, ROD Oct4L, R Oct4M, O Oct4M, D Oct4M, RO Oct4M, RD Oct4M, OD Oct4M, ^r O^d Oct4M, R Oct4, O Oct4, D Oct4, RO Oct4, RD Oct4, O^d Oct4, ROD Oct4, R Oct4ML K, O Oct4ML K, D Oct4ML K, RO Oct4ML K, RD Oct4ML K, OD Oct4ML K, ROD Oct4ML K, R Oct4L K, O Oct4L K, D Oct4L K, RO Oct4L K, RD Oct4L K, OD Oct4L K, ROD Oct4L K, R Oct4M K, O Oct4M K, D Oct4M K, RO Oct4M K, RD Oct4M K, OD Oct4M K, ROD Oct4M K, R Oct4K, O Oct4K , D Oct4K, RO Oct4 K, RD Oct4 K, OD Oct4 K, ROD Oct4 K, R Oct4ML Sox 2, O Oct4ML Sox2, D Oct4ML Sox2, RO Oct4ML Sox2, RD Oct4ML Sox2, O^d Oct4ML Sox2, ROD Oct4ML Sox2, R Oct4L Sox2, O Oct4L Sox2, D Oct4L Sox2, RO Oct4L Sox2, RD Oct4L Sox2, OD Oct4L Sox2, R^o D Oct4L Sox2, R Oct4M Sox2, O Oct4M Sox2, D Oct4M Sox2, RO Oct4M Sox2, RD Oct4M Sox2, OD Oct4M Sox2, ROD Oct4M Sox2, R Oct4 Sox2, O Oct4 Sox2, D Oct4 Sox2, r O Oct4 Sox2, RD Oct4 Sox2, OD Oct4 Sox2, ROD Oct4 Sox2, R Oct4ML lin28, O Oct4ML lin28, D Oct4ML Lin28, RO Oct4ML Lin28, RD Oct4ML Lin28, OD Oct4ML Lin28, ROD Oct4ML Lin28, R Oct4L Lin28, O Oct4L Lin28, D Oct4L Lin28, RO Oct4L Lin28, RD Oct4L Lin28, OD Oct4L Lin28, ROD Oct4L Lin28, R Oct4M Lin28, O Oct4M Lin28, D Oct4M Lin28, RO Oct4M Lin28, RD Oct4M Lin28, OD Oct4M Lin28, ROD Oct4M Lin28, R Oct4 Lin28, O Oct4 Lin28, D Oct4 Lin28, RO Oct4 Lin28, RD Oct4 Lin28, OD Oct4 Lin28 , ROD Oct4 Lin28, R Oct4ML KSox2, O Oct4ML KSox2, D Oct4ML KSox2, RO Oct4ML KSox2, RD Oct4ML KSox2, OD Oct4ML KSox2, ROD Oct4ML KSox2, R Oct4L KSox2, O Oct4L KSox2, D Oct4L KSox2, RO Oct4L KSox2, RD Oct4L KSox2, OD Oct4L KSox2, ROD Oct4L KSox2, R Oct4M KSox2, O Oct4M KSox2, D Oct4M KSox2, RO Oct4M KSox2, RD Oct4M KSox2, OD Oct4M KSox2, ROD Oct4M KSox2, R Oct4 KSox2, O Oct4 KSox2, D Oct4 KSox2, RO Oct4 KSox2, RD Oct4 KSox2, OD Oct4 KSox2, ROD Oct4 KSox2, R Oct4ML KLin28, O Oct4ML KLin28, D Oct4ML KLin28, RO Oct4ML KLin28, RD Oct4ML KLin28, OD Oct4ML KLin28, ROD Oct4ML KLin28, R Oct4L KLin28, O Oct4L KLin28, D Oct4L KLin28, RO Oct4L KLin28, RD Oct4L KLin28, OD Oct4L KLin28, ROD Oct4L KLin28, R Oct4M KLin28, O Oct4M KLin28, D Oct4M KLin28, RO Oct4M KLin28, RD Oct4M KLin28, OD Oct4M KLin28, ROD Oct4M KLin28, R Oct4 KLin28, O Oct4 KLin28, D Oct4 KLin28, RO Oct4 KLin28, RD Oct4 KLin28, OD Oct4 KLin28, ROD Oct4 KSox2, R Oct4ML Sox2lin28, O Oct4ML Sox2Lin28, D Oct4ML Sox2Lin28, RO Oct4ML Sox2Lin28, RD Oct4ML Sox2Lin28, OD Oct4ML Sox2Lin28, ROD Oct4ML Sox2Lin28, R Oct4L Sox2Lin28, O Oct4L Sox2Lin28, D Oct4L Sox2Lin28, RO Oct4L Sox2Lin28, RD Oct4L Sox2Lin28, OD Oct4L Sox2Lin28, ROD Oct4L Sox2Lin28, R Oct4M Sox2Lin28, O Oct4M Sox2Lin28, D Oct4M Sox2Lin28, RO Oct4M Sox2Lin28, RD Oct4M Sox2Lin28, OD Oct4M Sox2Lin28, ROD Oct4M Sox2Lin28, R Oct4 Sox2Lin28, O Oct4 Sox2Lin28, D Oct4 Sox2Lin28, RO Oct4 Sox2Lin28, RD Oct4 Sox2Lin28, OD Oct4 Sox2Lin28, ROD Oct4 Sox2Sox2, R Oct4ML KSox2Lin28, O Oct4ML KSox2Lin28, D Oct4ML KSox2Lin28, RO Oct4ML KSox2Lin28, RD Oct4ML KSox2Lin28, OD Oct4ML KSox2Lin28, ROD Oct4ML KSox2Lin28, R Oct4L KSox2Lin28, O Oct4L KSox2Lin28, D Oct4L KSox2Lin28, RO Oct4L KSox2Lin28, RD Oct4L KSox2Lin28, OD Oct4L KSox2Lin28, ROD Oct4L KSox2Lin28, R Oct4M KSox2Lin28, O Oct4M KSox2Lin28, D Oct4M KSox2Lin28, RO Oct4M KSox2Lin28, RD Oct4M KSox2Lin28, OD Oct4M KSox2Lin28, ROD Oct4M KSox2Lin28, R Oct4 KSox2Lin28, O Oct4 KSox2Lin28, D Oct4 KSox2Lin28, RO Oct4 KSox2Lin28, RD Oct4 KSox2Lin28, OD Oct4 KSox2Lin28, ROD Oct4 KSox2Lin28. De ellos, se desean las siguientes combinaciones:

R Oct4ML, O Oct4ML, D Oct4ML, RO Oct4ML, RD Oct4ML, OD Oct4ML, ROD Oct4ML, R Oct4L, O Oct4L, D Oct4L, RO Oct4L, RD Oct4L, OD Oct4L, ROD Oct4L, R Oct4M, O Oct4M, D Oct4M , RO Oct4M, RD Oct4M, OD Oct4M, ROD Oct4M, R Oct4, O Oct4, D Oct4, RO Oct4, RD Oct4, OD Oct4, ROD Oct4, R Oct4ML K, O Oct4ML K, D Oct4ML K, RO Oct4ML K, RD Oct4ML K, OD Oct4ML K, ROD Oct4ML K, R Oct4L K, O Oct4L K, D Oct4L K, RO Oct4L K, RD Oct4L K, OD Oct4L K, ROD Oct4L K, R Oct4M K, O Oct4M K, D Oct4M K, RO Oct4M K, RD Oct4M K, OD Oct4M K, ROD Oct4M K, R Oct4 K, O Oct4 K, D Oct4 K, RO Oct4 K, RD Oct4 K, OD Oct4 K, ROD Oct4 K, R Oct4ML Sox2, O Oct4ML Sox2, D Oct4ML Sox2, RO Oct4ML Sox2, RD Oct4ML Sox2, OD Oct4ML Sox2, ROD Oct4ML Sox2, R Oct4L Sox2, O Oct4L Sox2, D Oct4L Sox2, RO Oct4L Sox2, RD Oct4L Sox2, OD Oct4L Sox2, ROD Oct4L Sox2, R Oct4M Sox2, O Oct4M Sox2, D Oct4M Sox2, RO Oct4M Sox2, RD Oct4M Sox2, OD Oct4M Sox2, ROD Oct4M Sox2, R Oct4 Sox2, O Oct4 Sox2, D Oct4 Sox2, RO Oct4 Sox2, RD Oct4 Sox2, OD Oct4 Sox2, ROD Oct4 Sox2, R Oct4ML Lin28, O Oct4ML Lin28, D Oct4ML lin28, RO Oct4ML Lin28, RD Oct4ML lin28, OD Oct4ML Lin28, ROD Oct4ML Lin28, R Oct4L Lin28, O Oct4L Lin28, D Oct4L Lin28, RO Oct4L Lin28, RD Oct4L Lin28, OD Oct4L Lin28, ROD Oct4L Lin28, R Oct4M Lin28, O Oct4M Lin28, D Oct4M Lin28, RO Oct4M Lin28, RD Oct4M Lin28, OD Oct4M Lin28, ROD Oct4M Lin28, R Oct4 Lin28, O Oct4 Lin28, D Oct4 Lin28, RO Oct4 Lin28, RD Oct4 Lin28, OD Oct4 Lin28, ROD Oct4 Lin28, R Oct4ML KSox2, O Oct4ML KSox2, D Oct4ML KSox2, RO Oct4ML KSox2, RD Oct4ML KSox2, OD Oct4ML KSox2, ROD Oct4ML KSox2, R Oct4L KSox2, O Oct4L KSox2, D Oct4L KSox2, RO Oct4L KSox2, RD Oct4L KSox2, OD Oct4L KSox2, ROD Oct4L KSox2, R Oct4M KSox2, O Oct4M KSox2, D Oct4M KSox2, RO Oct4M KSox2, RD Oct4M KSox2, OD Oct4M KSox2, ROD Oct4M KSox2, R Oct4 KSox2, O Oct4 KSox2, D Oct4 KSox2, RO Oct4 KSox2, RD Oct4 KSox2, OD Oct4 KSox2, ROD Oct4 KSox2, R Oct4ML Klin28, O Oct4ML Klin28, D Oct4ML Klin28, RO Oct4ML Klin28, RDOct4ML Klin28,

OD Oct4ML KLin28, ROD Oct4ML KLin28, R Oct4L KLin28, O Oct4L KLin28, D Oct4L KLin28, RO Oct4L KLin28, RD Oct4L KLin28, OD Oct4L KLin28, ROD Oct4L KLin28, R Oct4M KLin28, O Oct4M KLin28, D Oct4M KLin28, RO Oct4M KLin28, RD Oct4M KLin28, OD Oct4M KLin28, ROD Oct4M KLin28, R Oct4 KLin28, O Oct4 KLin28, D Oct4 KLin28, RO Oct4 KLin28, RD Oct4 KLin28, OD Oct4 KLin28, ROD Oct4 KSox2, R Oct4ML Sox2Lin28, O Oct4ML Sox2Lin28 D Oct4ML Sox2Lin28, RO OCT4ML Sox2Lin28, RD Oct4ML Sox2Lin28, OD Oct4ML Sox2Lin28, ROD Oct4ML Sox2Lin28, R Oct4L Sox2Lin28, O Oct4L Sox2Lin28, D Oct4L Sox2Lin28, RO Oct4L Sox2Lin28, RD Oct4L Sox2Lin28, OD Oct4L Sox2Lin, ROD Oct4L Sox2Lin28, R Oct4M Sox2Lin28, O Oct4M Sox2Lin28, D Oct4M Sox2Lin28, RO Oct4M Sox2Lin28, RD Oct4M Sox2Lin28, OD Oct4M Sox2Lin28, ROD Oct4M Sox2Lin28, R Oct4 Sox2Lin28, O Oct4 Sox2Lin28, D Oct4 Sox2Lin28, RO Oct4 Sox2Lin28, RD Oct4 Sox2Lin28, OD Oct4 Sox2Lin28, ROD Oct4 Sox2Sox2, R Oct4ML KSox2Lin28, O Oct4ML KSox2Lin28, D Oct4ML KSox2Lin28, RO Oct4ML KSox2Lin28, RD Oct4ML KSox2Lin28, OD Oct4ML KSox2Lin28, ROD Oct4ML KSox2Lin28, R Oct4L KSox2Lin28, O Oct4L KSox2Lin28, D Oct4L KSox2Lin28, RO Oct4L KSox2Lin28, RD Oct4L KSox2Lin28, OD Oct4L KSox2Lin28, ROD Oct4L KSox2Lin28, R Oct4M KSox2Lin28, O Oct4M KSox2Lin28 , D Oct4M KSox2Lin28, RO Oct4M KSox2Lin28, RD Oct4M KSox2Lin28, OD Oct4M KSox2Lin28, ROD Oct4M KSox2Lin28, R Oct4 KSox2Lin28, O Oct4 KSox2Lin28, D Oct4 KSox2Lin28, RO Oct4 KSox2Lin28, RD Oct4 KSox2Lin28, OD Oct4 KSox2Lin28, y ROD Oct4 KSox2Lin28. De ellos, ROD Oct4L, RD Oct4L, RO Oct4ML, D Oct4ML, ROD Oct4M, OD Oct4L, O Oct4ML, O Oct4L, O Oct4M, OD Oct4, D Oct4L, Oct4ML, ROD Oct4ML, RD Oct4ML, OD Oct4ML, O Oct4MLGlis1, RD Oct4M, R Oct4L Glis1, R Oct4ML, OD Oct4M, O Oct4L Glis1, ROD Oct4, RO Oct4M, RO Oct4L, RO Oct4, O Oct4 Glis1, RD Oct4, Oct4L Glis1, D Oct4M, D Oct4 Glis1, O Oct4, Oct4L, Oct4M, D Oct4, RO Oct4 K, RO Oct4Sox2 y RO Oct4Lin28 son particularmente deseables. De ellos, ROD Oct4L, RD Oct4L, RO Oct4ML, D Oct4ML, ROD Oct4M, OD Oct4L, O Oct4ML, O Oct4L, O Oct4M, OD Oct4 y D Oct4L son los más deseados. De ellos, los más preferidos son ROD Oct4L, RD Oct4L, RO Oct4ML y D Oct4ML. Las combinaciones deseadas son particularmente eficaces para la reprogramación directa de células humanas.

Como combinaciones preferidas de genes relacionados con la reprogramación para introducir en células somáticas para la inducción de osteoblastos con genes relacionados con la reprogramación solos, se proporcionan Oct4, Oct4L, Oct4M, Oct4LM, Oct4LGlis1 y Oct4LMGlis1.

Todos los genes están altamente conservados en los vertebrados y, en esta divulgación, se refieren a genes que incluyen homólogos a menos que se describa un nombre de animal específico. Los genes incluyen además genes que tienen funciones equivalentes a las de los productos génicos de tipo nativo incluso cuando los genes incluyen mutaciones que incluyen polimorfismos. El método de la presente invención puede llevarse a cabo de conformidad con un método de reprogramación directo conocido, excepto que se seleccionan genes específicos y, por ejemplo, puede llevarse a cabo de conformidad con un método descrito en cualquiera de las siguientes publicaciones:

Publicaciones:

1 Direct Reprogramming of Fibroblasts into Functional Cardiomyocytes by Defined Factors; Masaki Ieda, Ji-Dong Fu, Paul Delgado-Olguin, Vasanth Vedantham, Yohei Hayashi, Benoit G. Bruneau and Deepak Srivastava Cell 142: 375-386, 2010.

2 Direct conversión of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Thomas Vierbuchen, Austin Ostermeier, Zhiping P. Pang, Yuko Kokubu, Thomas C. Sudhof & Marius Wernig. Nature 463: 1035-1041,2010

3 Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Pang ZP, Yang N, Vierbuchen T, Ostermeier A, Fuentes DR, Yang TQ, Citri A, Sebastiano V, Marro S, Sudhof TC, Wernig M. Nature 476: 220-223, 2011.

4 Generation of hyaline cartilaginous tissue from mouse adult dermal fibroblast culture by defined factors. Kunihiko Hiramatsu, Satoru Sasagawa, Hidetatsu Outani, Kanako Nakagawa, Hideki Yoshidawa, and Noriyuki Tsumaki, Journal of Clinical Investigation, 121:640-657, 2011.

5 Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Pengyu Huang, Zhiying He, Shuyi Ji, Huawang Sun, Dao Xiang, Changcheng Liu, Yiping Hu, XinWang & Lijian Hui. Nature 475:386-389, 2011.

6 Direct conversión of mouse fibroblasts to hepatocyte-like cells by defined factors. Sayaka Sekiya & Atsushi Suzuki. Nature 475:390-393, 2011.

Se prefiere que un gen que se va a introducir para la conversión en osteoblastos (una combinación de un gen relacionado con el hueso y un gen relacionado con la reprogramación) se incorpore en un vector de expresión, el vector de expresión se introduzca en las células somáticas diana y el gen se exprese en las células.

Como un método para introducir un gen, también puede usarse, por ejemplo, un método que implique la infección con un vector viral, tal como un vector de retrovirus, un vector de adenovirus, un vector de lentivirus, un vector de virus adenoasociado, un vector de herpesvirus, o un vector del virus Sendai, y en el caso de la introducción de un gen y un producto de expresión del mismo, un método que implique la transfección con un vector plasmídico, un vector episomal o un producto de expresión génica (mRNA, proteína) mediante un vector no viral, tal como un liposoma catiónico, un polímero catiónico o electroporación. Además, se puede introducir mRNA. En esta divulgación, todos los medios a utilizar para la introducción de genes se denominan colectivamente como "vector".

Las células en las que se expresa un gen para el tratamiento pueden seleccionarse antes de su uso mediante la introducción de un gen que sirva como marcador selectivo de fármacos (que tenga resistencia a la puromicina, resistencia a la blasticidina S, resistencia a la neomicina, resistencia a la higromicina o similares) junto con un gen para el tratamiento y seleccionando las células con un fármaco.

Cuando los factores a introducir son un producto de expresión de un gen relacionado con el hueso y un producto de expresión de un gen relacionado con la reprogramación (tal como una proteína), un péptido llamado "dominio de transducción de proteína (PTD)" puede unirse a una proteína obtenida como un producto de expresión y añadirlo a un medio para introducir el péptido en las células somáticas. Cuando algunos de los genes relacionados con el hueso se expresan en células somáticas utilizadas como un material de los osteoblastos, no es necesario introducir la proteína desde el exterior. Además, incluso cuando no se introduce un factor de reprogramación o un gen de un factor de reprogramación, se pueden inducir osteoblastos con una molécula pequeña utilizada como una alternativa. Los ejemplos de los mismos incluyen los métodos descritos en "Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins'' Zhou H, Wu S, Joo JY, Zhu S, Han DW, Lin T, Trauger S, Bien G, Yao S, Zhu Y, Siuzdak G, Scholer HR, Duan L, Ding S. Cell Stem Cell. 2009 May 8; 4 (5): 381-4. o "Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins”. Kim D, Kim CH, Moon JI, Chung YG, Chang MY, Han BS, Ko S, Yang E, Cha KY, Lanza R, Kim KS. Cell Stem Cell. 2009 Jun 5;4(6):472-6.

Un medio inductor de diferenciación para la diferenciación de osteoblastos no está particularmente limitado y, por ejemplo, puede usarse el siguiente medio osteoinductivo.

Medio osteoinductivo = un medio obtenido añadiendo 50 pg/ml de ácido ascórbico, p-glicerofosfato 10 mM y dexametasona 100 nM (todas las concentraciones son concentraciones finales) a un medio normal.

La existencia de osteoblastos preparados puede confirmarse mediante tinción con ALP, medición de mRNA de osteocalcina o mRNA de osteopontina mediante PCR en tiempo real, tinción con Alizarin Red S (producción de matriz ósea calcificada), tinción de von Kossa o similares.

En la presente invención, los genes pueden introducirse con un plásmido o con un vector de virus, por ejemplo, un vector de retrovirus. El vector de virus se usa preferiblemente desde el punto de vista de la eficacia de la introducción y el mantenimiento de la estabilidad del gen introducido, mientras que el plásmido se usa preferiblemente para reducir el riesgo de carcinogénesis.

Un gen introducido en células somáticas puede transcribirse con un promotor LTR o puede expresarse con otro promotor en un vector. Por ejemplo, pueden usarse promotores de expresión constitutivos, tales como el promotor CMV, el promotor EF-1a y el promotor CAG, o los promotores inductivos deseados. Además, puede usarse un promotor quimérico obtenido sustituyendo parte de LTR por otro promotor. Ejemplos

A continuación, se muestran ejemplos.

Cabe señalar que de las Figuras 3 a las Figuras 11, de la Figura 14 a las Figuras 16, de la Figura 18 a la Figura 22, la Figura 26, de la Figura 28 a la Figura 32, la Figura 34, y la Figura 37 y la Figura 38 son resultados de experimentos usando una cepa de fibroblastos gingivales humanos normales, Gin-1. Las Figuras 12 y las Figuras 13, la Figura 17, la Figura 33, la Figura 35 y la Figura 36 y de las Figuras 39 a la Figura 42 son resultados de experimentos usando aHDFs (fibroblastos dérmicos humanos normales). Las Figuras 27 son resultados de experimentos usando fibroblastos fetales de ratón.

Ejemplo 1

(1) Preparación de vectores pMXs que codifican genes de interés (Figura 1)

Los genes de interés (Runx2 y similares) se amplificaron a partir de un plásmido que incluía los genes de interés mediante PCR utilizando cebadores para las regiones codificantes (las secuencias de bases de los cebadores se muestran en la Figura 23). Además, el vector pMXs puro se escindió con EcoRI. Los fragmentos resultantes se separaron mediante electroforesis y, a continuación, se extrajeron del gel de electroforesis los genes y el esqueleto del vector. Ambos se ligaron usando GeneArtsystem para preparar vectores pMXs que codifican genes de interés. Las secuencias de bases de esos vectores se confirmaron usando los cebadores que se muestran en la Figura 24

(2) Esquema del experimento (Figura 2)

Se inocularon 3x106 células Plat GP en un plato de 10 cm recubierto con queratina y se cultivaron en 1% NEAA 10% FBS DMEM (medio normal) que contenía 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina. 24 horas después, los vectores pMXs, que incluían varios genes, se introdujeron en Plat GP que sirven como células de empaquetamiento junto con el vector pCMV VSV en una proporción de 1:3 en varias combinaciones utilizando X-tremeGENE 9 mediante un método de lipofección (una solución obtenida mezclando 5 pg de un gen que se va a introducir, 2,5 pg de pCMV.VSV, 500 pl de Opti-MEM y 22,5 pl de X-tremeGENE 9 se añadieron a un plato de 10 cm suplementado con 10 ml de un medio). 24 horas después, se cambió el medio por un medio normal libre de antibióticos. El mismo día, se inocularon una cepa de fibroblastos gingivales humanos normales, Gin-1, y una cepa de fibroblastos dérmicos humanos normales, aHDF, de 2x104 células/ml a 2x105 células/ml en platos de cultivo o placas de cultivo (por ejemplo, placas de 12 pocillos o placas de 24 pocillos para inmunotinción; placas de 12 pocillos para actividad de ALP o PCR; placas de 6 pocillos para tinción con ALP; o placas de 24 pocillos, placas de 6 pocillos, platos de 35 mm o platos de 60 mm para la tinción con Alizarin Red S), y el día se definió como el día -1 de cultivo. Un día después (día 0 de cultivo), el sobrenadante del cultivo de Plat GP se pasó a través de un filtro de jeringa que tiene un diámetro de poro de 0,45 pm y el filtrado se mezcló con polibreno (concentración final: 4 pg/ml) (solución de virus). Inmediatamente después de la eliminación de los sobrenadantes de cultivo de Gin-1 y aHDF por aspiración, se añadió la solución de virus (500 pl para placas de 24 pocillos, 1 ml para placas de 12 pocillos, 1,5 ml para placas de 6 pocillos y platos de 35 mm, 2,5 ml para platos de 60 mm), y las células se cultivaron durante 24 horas (infección). Como un grupo de control, también se prepararon células no sometidas a infección con el virus. Un día después (día 1 de cultivo), se extrajeron los sobrenadantes del cultivo por aspiración y después un medio osteoinductivo (preparado añadiendo 50 pg/ml de ácido ascórbico, p-glicerofosfato 10 mM y dexametasona 100 nM (todas las concentraciones son concentraciones finales)) se añadió al medio normal, seguido de cultivo. Después de eso, el medio de cultivo se cambió cada 2 o 3 días. Las células se sometieron a tinción con ALP, una prueba de actividad de ALP y RT-PCR en tiempo real 14 días después de la introducción de los genes, a inmunotinción 20 días después de la introducción de los genes, a tinción con Alizarin Red S 20 días o 28 días después de la introducción de los genes, y a la tinción de von Kossa 28 días después de la introducción de los genes. Las células cultivadas de la misma manera sin infección con los vectores de retrovirus se usaron como control.

(3) Tinción con Alizarin Red S (Figuras 3)

Una cepa de fibroblastos gingivales humanos normales, Gin-1, se cultivó en una placa de 24 pocillos y se sometió a un experimento como se muestra en la Figura 2. 28 días después de la introducción de los genes, se eliminó el medio de cultivo por aspiración del plato de cultivo, y las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron con etanol al 95%. Las células se lavaron con agua destilada estéril y después se les añadió una solución de tinción de Alizarin Red S, seguido de reposo a temperatura ambiente durante 15 minutos. De la Figura 3A a la Figura 3F son macrografías del plato. La matriz ósea calcificada se tiñó de rojo, lo que indica que se indujeron osteoblastos funcionales. Consúltese la Figura 3H y la Figura 31 para los números de pocillos (el número "1" en las tablas de la Figura 3H y la Figura 31 significa que las células se infectaron con los vectores de retrovirus que incluían los genes, y el blanco significa que las células no se infectaron con los vectores de retrovirus que incluían los genes). Por ejemplo, las células del pocillo 27 de la Figura 3B (el tercer pocillo desde la izquierda en la primera fila) se infectaron con los vectores de retrovirus que incluyen los genes Osterix, Runx2, Oct4, L-Myc y Dlx5 y produjeron una gran cantidad de matriz ósea calcificada como se muestra en la Figura 3H. Además, la solución de tinción de Alizarin Red S se eliminó de todos los pocilios y las células se lavaron con agua destilada estéril. Después de eso, se añadió T riton X al 10 % y se dejó que el resultante reaccionara a temperatura ambiente durante 1 hora. La solución se recogió de cada pocillo y se colocó en una placa de 96 pocillos. En la Figura 3G se muestra una macrografía de la placa (consúltese la Figura 3H para conocer los números de los pocillos). Los resultados de la medición de las absorbancias (de 550 nm a 650 nm, Figuras 3H; de 490 nm a 650 nm, Figuras 31) de las soluciones de reacción utilizando un lector de microplacas se muestran en los gráficos de la Figura 3H y la Figura 31. El eje vertical del gráfico representa las absorbancias. Los gráficos muestran que, a medida que aumenta la absorbancia, aumenta la cantidad de matriz ósea calcificada producida, es decir, aumenta la cantidad de fibroblastos convertidos en osteoblastos funcionales. Por ejemplo, los gráficos muestran que las células en el pocillo 27, que se infectaron con los vectores de retrovirus que incluyen los genes Osterix, Runx2, Oct4, L-Myc y Dlx5, produjeron la mayor cantidad de matriz ósea calcificada.

(4) Prueba de actividad de ALP (Figura 4)

Una cepa de fibroblastos gingivales humanos normales, Gin-1, se cultivó en una placa de 12 pocillos y se sometió a un experimento como se muestra en la Figura 2. 14 días después de la introducción de los genes, el medio de cultivo se eliminó por aspiración del plato de cultivo celular y las células se lavaron dos veces con solución salina fisiológica. Las células se lisaron con solución salina fisiológica que contenía NP-40 al 1% y el resultante se centrifugó a 12000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se recogió y se dejó reaccionar con tampón de ALP que contenía fosfato de p-nitrofenol, y el resultante se sometió a medición usando un espectrómetro de absorción a 405 nm. Simultáneamente, se midió una cantidad de proteína total y se expresó como una cantidad corregida por la actividad de ALP por masa de proteína total. Los resultados se muestran en la Figura 4.

En las células obtenidas mediante la introducción de ROOct4, ROOct4M, ROOct4L, ROOct4G y similares, se detectaron actividades de ALP significativamente altas en comparación con el control. De todos los grupos, en las células obtenidas introduciendo ROOct4L se detectó la mayor actividad de ALP.

(5) Imagen teñida con ALP (Figura 5)

Se cultivó una cepa de fibroblastos gingivales humanos normales, Gin-1, en una placa de 6 pocillos, y las células se sometieron a un experimento como se muestra en la Figura 2. 14 días después de la introducción de los genes, se eliminó el medio de cultivo por aspiración de los pocillos, y las células se lavaron dos veces con solución salina fisiológica y se fijaron con un fijador durante 5 minutos. Las células se lavaron dos veces con agua destilada estéril. Se le añadió una solución de tinción de ALP y las células se dejaron en reposo en condiciones de protección contra la luz a temperatura ambiente durante 1 hora. Las células se lavaron dos veces con agua destilada estéril y luego se observaron a simple vista y bajo un microscopio invertido de contraste de fase. Los resultados se muestran en la Figura 5.

Algunas de las células obtenidas mediante la introducción de ROOct4M, ROOct4L u Oct4L dieron positivo para ALP. En particular, en las células obtenidas mediante la introducción de ROOct4L, las células positivas para la tinción con ALP se observaron en todo el fondo del pocillo.

(6) Inmunotinción (Figuras 6)

Una cepa de fibroblastos gingivales humanos normales, Gin-1, se cultivó en una placa de 24 pocillos y se sometió a un experimento como se muestra en la Figura 2. 21 días después de la introducción de los genes, se eliminó el medio de cultivo por aspiración del plato de cultivo, y las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 30 minutos. Las células se lavaron tres veces y después se mantuvieron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las células se dejaron reaccionar con un anticuerpo primario (osteocalcina antih) a 4°C durante 24 horas, se lavaron tres veces y después se dejaron reaccionar con un anticuerpo secundario marcado con FITC a temperatura ambiente durante 1 hora. Las células se lavaron tres veces y después se observaron bajo un microscopio de fluorescencia. Los resultados se muestran en las Figuras 6.

(a) Control, (b) ROOct4M, (c) ROOct4L: x100

En las células obtenidas introduciendo ROOct4M y ROOct4L se observó expresión de osteocalcina. En las células obtenidas introduciendo ROOct4L se observó un mayor número de células positivas a osteocalcina.

(7) Tinción con Alizarin Red S (Figuras 7)

Una cepa de fibroblastos gingivales humanos normales, Gin-1, se cultivó en un plato de 35 mm y se sometió a un experimento como se muestra en la Figura 2. 28 días después de la introducción de los genes, se eliminó el medio de cultivo por aspiración del plato de cultivo, y las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron con etanol al 95%. Las células se lavaron con agua destilada estéril y después se les añadió una solución de tinción de Alizarin Red S, seguido de reposo a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las células se lavaron con agua destilada estéril y después se observaron a simple vista y bajo un microscopio invertido de contraste de fase. Los resultados se muestran en la Figuras 7.

(a) Control, (b) ROOct4M, (c) ROOct4L: x1

(d) Control, (e) ROOct4M, (f) ROOct4L: x40

En el plato de las células obtenidas introduciendo ROOct4M o ROOct4L se observó el depósito de matriz calcificada. En particular, en el plato de las células obtenidas introduciendo ROOct4L, se observó el depósito de una gran cantidad de matriz ósea calcificada sobre todo el fondo del plato de cultivo.

(8) Tinción de von Kossa (Figura 8)

Una cepa de fibroblastos gingivales humanos normales, Gin-1, se cultivó en un plato de 35 mm y se sometió a un experimento como se muestra en la Figura 2. 28 días después de la introducción de los genes, se eliminó el medio de cultivo por aspiración del plato de cultivo, y las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron con formalina al 10%. Las células se lavaron con agua destilada estéril y después se les añadió una solución de nitrato de plata al 5%, seguido de reposo bajo luz ultravioleta durante 30 minutos. Posteriormente, las células se lavaron con agua destilada estéril y se dejaron reaccionar con una solución de tiosulfato al 5% durante 2 minutos. Las células se lavaron con agua destilada estéril y después se observaron a simple vista y bajo un microscopio invertido de contraste de fase. Los resultados se muestran en la Figura 8.

En las células obtenidas introduciendo ROOct4M se observó un depósito disperso de fosfato cálcico. En las células obtenidas introduciendo ROOct4L y Oct4L, se observó una densa deposición de fosfato de calcio sobre todo el fondo del plato de cultivo.

(9) Esquema del método de cultivo experimental tridimensional (Figura 9)

Como se muestra en la Figura 9, las células somáticas se inocularon en un plato de cultivo o una placa de cultivo el día -1, los genes se introdujeron el día 0 y el medio se intercambió por un medio inductor de diferenciación ósea el día 1. Los detalles de la inoculación de las células en el día -1, la introducción de los genes el día 0 y el intercambio del medio el día 1 son los mismos que los mostrados en la Figura 2. El día 4, se despegaron las células del plato y se inocularon 5x105 células en un andamio (PCL de inserción 3D) y se sometieron a cultivo tridimensional. El día 28, las células se sometieron a tinción de Giemsa o tinción con Alizarin Red S. Se usaron como control células cultivadas de la misma manera sin infección con vectores de retrovirus. Además, se usó como fondo una muestra cultivada de la misma manera sin la adición de las células usando el andamio solo.

(10) Tinción de Giemsa en cultivo tridimensional (Figuras 10)

Una cepa de fibroblastos gingivales humanos normales, Gin-1, se cultivó en un plato de 60 mm y se sometió a un experimento como se muestra en la Figura 9. 28 días después de la introducción de los genes, se aspiró el medio de cultivo del plato de cultivo, y las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron con metanol junto con el andamio. Las células se lavaron con agua destilada estéril y después se les añadió una solución de tinción de Giemsa, seguido de reposo a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las células se lavaron con agua destilada estéril y después se observaron a simple vista. Los resultados se muestran en las Figuras 10.

(a) fondo, (b) ROOct4L: x1

Las fotografías sugieren que las células inducidas lograron el injerto y la proliferación en el andamio.

(11) Tinción con Alizarin Red S en cultivo tridimensional (Figuras 11)

Una cepa de fibroblastos gingivales humanos normales, Gin-1, se cultivó en un plato de 60 mm y se sometió a un experimento como se muestra en la Figura 9. 28 días después de la introducción de los genes, se aspiró el medio de cultivo del plato de cultivo, y las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron con etanol al 95 % junto con el andamio. Las células se lavaron con agua destilada estéril y después se les añadió una solución de tinción con Alizarin Red S, seguido de reposo a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las células se lavaron con agua destilada estéril y después se observaron a simple vista. Los resultados se muestran en las Figuras 11.

(a) fondo, (b) control, (c) ROOct4M, (d) ROOct4L: x1

Las fotografías sugieren que las células inducidas mostraron la capacidad de producir matriz ósea calcificada en el andamio.

Además, se produjo marcadamente matriz ósea calcificada en las células obtenidas introduciendo ROOct4L.

(12) Imagen teñida con ALP (Figuras 12)

Se cultivó una cepa de fibroblastos dérmicos humanos normales, aHDF, en una placa de 6 pocillos, y las células se sometieron a un experimento como se muestra en la Figura 2. 14 días después de la introducción de los genes, se eliminó el medio de cultivo por aspiración de los pocillos, y las células se lavaron dos veces con solución salina fisiológica y se fijaron con un fijador durante 5 minutos. Las células se lavaron dos veces con agua destilada estéril, se les añadió una solución de tinción de ALP y las células se dejaron en reposo en condiciones de protección contra la luz a temperatura ambiente durante 1 hora. Las células se lavaron dos veces con agua destilada estéril y después se observaron a simple vista y bajo un microscopio invertido de contraste de fase. Los resultados se muestran en las Figuras 12.

(a) control, (b) ROOct4 M, (c) ROOct4L: x1

(d) control, (e) ROOct4 M, (f) ROOct4L: x40

Algunas de las células obtenidas mediante la introducción de ROOct4M o ROOct4L se volvieron positivas para la tinción con ALP. En particular, las células obtenidas introduciendo ROOct4L incluían muchas células positivas para tinción con ALP en todo el fondo del pocillo.

(13) Tinción con Alizarin Red S (Figura 13a y Figura 13b)

(a) Se cultivó una cepa de fibroblastos dérmicos humanos normales, aHDF, en una placa de 6 pocillos y se sometió a un experimento como se muestra en la Figura 2. 28 días después de la introducción de los genes, se eliminó el medio de cultivo por aspiración de los pocillos, y las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron con etanol al 95%. Las células se lavaron con agua destilada estéril, y después se les añadió la solución de tinción de Alizarin Red S, seguido de reposo a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las células se lavaron con agua destilada estéril y después se observaron a simple vista y bajo un microscopio invertido de contraste de fase. Los resultados se muestran en la Figura 13a.

(Izquierda) control, (Centro) ROOct4 M, (Derecha) ROOct4L: x1

En los pocillos de las células obtenidas introduciendo ROOct4M o ROOct4L se observó depósito de matriz calcificada. En particular, en las células obtenidas introduciendo ROOct4L, se observó el depósito de una gran cantidad de matriz ósea calcificada en todo el fondo del pocillo.

(b) Imágenes de microscopio invertido de contraste de fase de las células sometidas al mismo experimento que en el punto (a) y a la tinción con ALP 14 días después de la introducción de los genes (superior) o tinción de von Kossa 28 días después de la introducción de los genes (inferior) se muestran en la Figura 13b. El aumento fue de 40 veces.

(14) Tinción con Alizarin Red S (Figura 14)

Se cultivaron fibroblastos gingivales humanos normales, Gin-1, en una placa de 6 pocillos y se infectaron con una mezcla (ROOct4L) de vectores de retrovirus, que incluían los genes humanos Runx2, Osterix, Oct4 y L-Myc, una mezcla (ROOct4M) de vectores de retrovirus que incluían los genes Runx2, Osterix, Oct4 y c-Myc, o una mezcla (Oct4L) de vectores de que incluían los genes Oct4 y L-Myc. Después de la infección, las células se cultivaron durante los días que se muestran en la Figura 14 (de 1 día a 28 días). El símbolo (-) representa fibroblastos gingivales, Gin-1, no infectados con los vectores de retrovirus. Además, los osteoblastos humanos son células NHost adquiridas de Lonza Walkersville, Inc. La tinción con Alizarin Red S se llevó a cabo como se describe a continuación. El medio de cultivo se eliminó por aspiración del plato de cultivo y las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron con etanol al 95%. Las células se lavaron con agua destilada estéril, y después se les añadió la solución de tinción de Alizarin Red S, seguido de reposo a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las células se lavaron con agua destilada estéril, después se observaron bajo un microscopio invertido de contraste de fase y se fotografiaron. Las células infectadas con ROOct4L y Oct4L produjeron una gran cantidad de matriz ósea calcificada, e incluso las células infectadas con ROOct4M produjeron una cantidad menor de matriz ósea calcificada que las células infectadas con ROOct4L. ND: No determinado.

(15) Propiedades de Osteoblastos Humanos inducidos por Reprogramación Directa (Figuras 15)

De la misma manera que se muestra en la Figura 14, se infectaron fibroblastos gingivales humanos (Gin-1) con una mezcla (ROOct4L) de vectores de retrovirus, que incluía los genes humanos Runx2, Osterix, Oct4 y L-Myc, o una mezcla (ROOct4M) de vectores de retrovirus, que incluía los genes Runx2, Osterix, Oct4, y c-Myc y se cultivaron durante 28 días. El símbolo (-) representa fibroblastos gingivales, Gin-1, no infectados con los vectores de retrovirus. Se usaron células NHost adquiridas de Lonza Walkersville, Inc. como osteoblastos humanos. a: Cuantificación del depósito de calcio por el método del quelato. Las células se lavaron bien con PBS, después se despegaron con un raspador, se lisaron con ácido clorhídrico 0,5 M y se sometieron a sonicación. El lisado se centrifugó a 10000 rpm durante 5 minutos y se recogió el sobrenadante. Se mezclaron 2 gl del lisado con 240 gl de una solución de clorofosfonazo-III (LS-MPR CPZ III, AKJ Global Technology, Chiba, Japón) y se incubaron las células durante 10 minutos. Se midió una absorbancia a 690 nm utilizando un lector de microplacas y se comparó con una curva estándar para calcular la concentración de calcio (mg/dL). b-e: el RNA se recogió de las células utilizando ISOGEN II (Nippon Gene) y se transcribió de forma inversa utilizando ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO). El análisis de RT-PCR en tiempo real se llevó a cabo utilizando cebadores específicos para los genes respectivos (que se muestran en la Figura 25) y Real-time PCR Master Mix (TOYOBO) por 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems). El nivel de mRNA de cada muestra se normalizó mediante un nivel de mRNA de p-actina y después se expresó como un valor relativo a un valor de fibroblastos gingivales humanos. f: Se añadió una solución de sal monosódica de 2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio (WST-8) (Cell Count Reagent SF; Nacalai Tesque) a las células, y las células se cultivaron a 37°C durante 1 hora. Se midieron las absorbancias a 450 nm y 650 nm del sobrenadante, y cuando se definió como 100% un valor de fibroblastos gingivales humanos obtenidos sin la introducción de los genes, se calculó la viabilidad de las células respectivas. *P<0,05 y **P<0,01, (diferencias significativas respecto a los fibroblastos gingivales humanos (Gin-1) obtenidos sin introducción de los genes). #p<0,05, ##P<0,01. Los valores son la media ± S.D. (n=4).

Las células infectadas con ROOct4L pueden provocar el depósito de una mayor cantidad de calcio que los osteoblastos humanos. Incluso en las células infectadas con ROOct4M, el calcio se puede depositar al mismo nivel que en los osteoblastos humanos. Tanto las células infectadas con ROOct4L como las células infectadas con ROOct4M expresan genes específicos de osteoblastos. Además, las células infectadas con ROOct4L tienen suficiente capacidad de proliferación.

(16) Análisis de Osteoblastos Humanos inducidos por Reprogramación Directa (Figuras 16)

a: Fibroblastos gingivales humanos (Gin-1), fibroblastos gingivales humanos (Gin-1) infectados con ROOct4L y después cultivados durante 20 días (denominados dOBs en la siguiente divulgación y en los dibujos) y osteoblastos humanos (células NHost adquiridas de Lonza Walkersville, Inc.) fueron inmunoteñidos con anticuerpo antiosteocalcina humana marcado con FITC y anticuerpo anti-osteopontina marcado con FITC. El aumento fue de 100 veces. b: Se recogió RNA de las células como se ha descrito anteriormente y se sometió a análisis de micromatrices de DNA usando GeneChip (marca comercial) Human Gene 1.0 ST (Affymetrix, Inc.). Basado en la relación entre el nivel de expresión en los osteoblastos y el nivel de expresión en los fibroblastos gingivales humanos, todos los genes se clasificaron en siete grupos (menos de 0,2, 0,2 o más y menos de 0,33, 0,33 o más y menos de 0,5, 0,5 o más y menos de 2,0, 2,0 o más y menos de 3,0, 3,0 o más y menos de 5,0, 5,0 o más) (eje X). Los números de genes que pertenecen a los respectivos grupos se muestran entre paréntesis. Para los genes que pertenecen a cada grupo, se representó gráficamente la relación (media ± S.D.) del nivel de expresión en dOBs al nivel de expresión en los fibroblastos gingivales humanos. Se encontró que los genes fuertemente expresados en los osteoblastos en comparación con los fibroblastos gingivales humanos también estaban fuertemente expresados en dOBs, mientras que los genes débilmente expresados en los osteoblastos también estaban débilmente expresados en dOBs, lo que indicaba una correlación significativa (coeficiente de correlación R = 0,70, p<0,01). c: se recogió DNA de las células como se ha descrito anteriormente y se analizó la metilación de CpG en la región anterior del gen de la osteocalcina. El DNA se recolectó usando un kit de purificación de DNA genómico (Mag Extractor, Toyobo Life Science, Tokio, Japón) y se sometió a tratamiento con bisulfito usando un kit de metilación de EZ DNA (ZYMO research, Irvine, CA), y después la secuencia en la región anterior del gen de la osteocalcina se amplificó mediante PCR utilizando un cebador de sentido (5'-GTGTATTTGGTAGTTATAGTTATTTGG) y un cebador antisentido (5'-CCTCAAATTAAACACTAACTAAACTC). Los fragmentos se clonaron en el vector pTA2 y después se llevó a cabo la secuenciación utilizando los cebadores universales T7 y T3. Los pocillos negros muestran CpG metilado y los pocillos blancos muestran CpG no metilado. d-e: Se infectaron fibroblastos gingivales humanos (Gin-1) con ROOct4L y se recolectó RNA de las células antes de la infección (-) y 7 días, 14 días y 21 días después de la infección. Como control positivo, se recogió RNA de células iPS humanas. Después de la transcripción inversa, se llevó a cabo una RT-PCR en tiempo real utilizando cebadores específicos de REX-1 (d) y Nanog (e). El nivel de mRNA de cada muestra se normalizó mediante un nivel de mRNA de p-actina y después se expresó como un valor relativo a un valor de fibroblastos gingivales humanos. **P<0,01, (una diferencia significativa con respecto a los fibroblastos gingivales humanos (Gin-1) obtenidos sin introducción de los genes). Los valores son la media ± S.D. (n=4).

Se encontró que los dOBs humanos producen grandes cantidades de osteocalcina y osteopontina (a). También se encontró que los dOBs humanos tenían un perfil de expresión génica exhaustivo similar al de los osteoblastos humanos (b). Se encontró que los dOBs humanos tenían una marca epigenética de DNA cromosómico, que era diferente de la de los fibroblastos y se acercaba más a la de los osteoblastos humanos (c). Además, en cualquier momento durante la conversión causada por la infección con ROOct4L de los fibroblastos en los dOBs, no se observó una expresión significativa de mRNA para los genes REX-1 (d) y Nanog (e), lo que sugiere que la conversión no ocurrió a través de células similares a células iPS (d y e).

(17) Resultados de la cuantificación de los niveles de expresión de genes introducidos en fibroblastos dérmicos humanos mediante análisis de RT-PCR en tiempo real (Figura 17)

Los fibroblastos dérmicos humanos se infectaron con una mezcla (ROOct4L) de vectores de retrovirus, que incluían los genes humanos Runx2, Osterix, Oct4 y L-Myc, o una mezcla (ROOct4M) de vectores de retrovirus, que incluían los genes Runx2, Osterix, Oct4 y c-Myc, y se cultivaron durante 14 días (d0). El símbolo (-) representa fibroblastos gingivales, Gin-1, no infectados con los vectores de retrovirus. De la misma manera que de la Figura 15b a la Figura 15e, los niveles de expresión de los genes se cuantificaron mediante análisis de RT-PCR en tiempo real. El nivel de mRNA de cada muestra se normalizó mediante un nivel de mRNA de p-actina y después se expresó como un valor relativo a un valor de los fibroblastos gingivales humanos (Gin-1). *P<0,05, **P<0,01 (diferencias significativas con respecto a los fibroblastos gingivales humanos obtenidos sin introducción de los genes). #p<0,05, ##P<0,01. Los valores son la media ± S.D. (n=4).

(18) Regeneración ósea in vivo en el sitio del defecto óseo (Figuras 18)

Los dOBs (osteoblastos preparados por reprogramación directa) contribuyen a la regeneración ósea en un cuerpo vivo.

Los experimentos con animales se llevaron a cabo con la aprobación de la Kyoto Prefectural University of Medicine. Se anestesiaron ratones NOD/SCID machos de ocho semanas de edad (Charles River) mediante inyección intraperitoneal con pentobarbital. Se formó un defecto óseo segmentario que tenía un diámetro de aproximadamente 4 mm en la diáfisis femoral izquierda usando un taladro dental con agua vertida. Los fibroblastos gingivales humanos (Gin-1) y las células inducidas al infectar Gin-1 con una mezcla (ROOct4L) de vectores de retrovirus que incluían genes humanos Runx2, Osterix, Oct4 y L-Myc y cultivar las células durante 14 días (denominados dOBs en la siguiente divulgación y dibujos) se suspendieron en 25 pL de un medio y 75 pL de Matrigel (BD Bioscience, San Jose, CA) y se trasplantaron al sitio del defecto óseo a una concentración de 5x105 células/ratón. También se prepararon ratones sometidos a la misma operación que la descrita anteriormente sin creación del defecto óseo y trasplante (operación simulada). a: imágenes de microtomografía computarizada (pCT). 21 días después del trasplante, los ratones fueron anestesiados mediante inyección intraperitoneal con pentobarbital. Se extirpó el muslo, se fijó con formalina neutra y después se fotografió con un dispositivo de tomografía computarizada de rayos X (Scan Xmate-L090, Com Scan Techno, Yokohama, Japón). Se muestran imágenes tomográficas en serie de 10 pm. El triángulo representa un defecto óseo y la punta de flecha representa una trabécula ósea regenerada. b: El tejido del sitio del defecto óseo se incrustó en compuesto SCEM (Leica Microsystem) y se congeló rápidamente. El tejido se cortó en secciones de 6 pm y después las secciones en serie se tiñeron con hematoxilina eosina (H&E) (superior) y Alizarin Red S (inferior). El triángulo representa un defecto óseo y la punta de flecha representa una trabécula ósea regenerada. El aumento fue de 40 veces. c: Las secciones de 6 pm antes mencionadas se fijaron con paraformaldehído al 4 % y se inmunotiñeron con un anticuerpo monoclonal de ratón específico de núcleo humano (Cat: MAB1281; clon: 235-1; Millipore, Billerica, MA). El símbolo "#" representa una trabécula ósea regenerada y el símbolo "*" representa la médula ósea. El aumento fue de 100 veces.

Las imágenes de micro-CT (a) y las imágenes histológicas (b) muestran que, en el hueso trasplantado con los dOBs humanos, el sitio del defecto estaba completamente cubierto formando un callo óseo que incluía trabéculas óseas alineadas. En el hueso trasplantado con los fibroblastos, solo se formaron unos pocos callos y permaneció el defecto óseo. Las imágenes inmunofluorescentes (c) muestran que, en el hueso trasplantado con los dOBs humanos, muchos dOBs trasplantados tuvieron éxito en el injerto en el sitio de regeneración ósea. En el hueso trasplantado con los fibroblastos, sólo un pequeño número de fibroblastos trasplantados logró el injerto.

(19) Regeneración ósea in vivo en el sitio del defecto óseo (Figura 19)

Después del mismo experimento de trasplante que se muestra en las Figuras 18, 21 días después del trasplante, se sacrificó a los ratones y se recogió el fémur. Se llevó a cabo una prueba de flexión de tres puntos para medir un valor de carga máximo. En el grupo trasplantado con osteoblastos (dOBs) inducidos por infección con RO Oct4L y después cultivados durante 14 días, la resistencia mecánica del fémur mejoró significativamente en comparación con el grupo trasplantado con fibroblastos gingivales. El término "operado simulado" se refiere al fémur de ratones sometidos a la misma operación que la descrita anteriormente sin creación del defecto óseo y trasplante. *P<0,05, **P<0,01. Los valores son la media ± S.D. (n=3).

(20) Regeneración ósea in vivo en el lugar del defecto óseo (Figura 20)

21 días después del trasplante de fibroblastos gingivales humanos (izquierda) y dOBs (derecha) mediante el mismo experimento que se muestra en las Figuras 18, el sitio del defecto óseo del fémur se fotografió con un microscopio estereoscópico. Las fotografías son imágenes estereomicroscópicas (superior) (aumentos: 10 veces) e imágenes estereomicroscópicas superpuestas con instrucciones (inferior). El símbolo "*" representa un defecto óseo y el símbolo "#" representa un hueso regenerado.

En el hueso trasplantado con los dOBs humanos, se formó un callo óseo que incluía trabéculas óseas alineadas, y el sitio del defecto estaba completamente cubierto y no podía observarse visualmente. En el hueso trasplantado con los fibroblastos, solo se formaron unos pocos callos y el defecto óseo permaneció en una proporción alta.

(21) Imágenes tridimensionales reconstruidas de datos de microtomografía computarizada (pCT) mostrado en la Figura 18a (Figura 21).

El triángulo representa un defecto óseo y la punta de flecha representa una trabécula ósea regenerada.

En el hueso trasplantado con los dOBs humanos, se formó un callo óseo que incluía trabéculas óseas alineadas, y el sitio del defecto se cubrió por completo. En el hueso trasplantado con los fibroblastos, solo se formaron unos pocos callos y permaneció el defecto óseo.

(22) Imágenes de transmisión de pCT en el experimento mostrado en la Figura 18a (Figura 22).

Se muestran las imágenes de transmisión de pCT obtenidas por el mismo experimento que se muestra en la Figura 18a. La flecha representa un sitio de defecto óseo. En el hueso trasplantado con osteoblastos (dOBs) inducidos por reprogramación directa, la radiopacidad en un sitio de defecto óseo fue mayor que en el hueso trasplantado con fibroblastos gingivales humanos.

(23) Reprogramación directa en osteoblastos con vector episomal (Figuras 26)

Cada uno de los genes humanos Runx2, Osterix, Oct4 y L-Myc se insertaron en el sitio EcoRI del vector episomal pG.oriPP9.EBNA1 (en la Figura 26a se muestra pG.oriPP9.hRunx2.EBNA1 que tiene insertado Runx2). 2x105 fibroblastos gingivales humanos (Gin-1) se resuspendieron en el medio normal (1% NEAA 10% FBS DMEM que contenía 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina) como se usa en el experimento que se muestra en la Figura 1, se inoculó en un plato de 35 mm y se cultivó durante 1 día. Una mezcla de vectores episomales de los cuatro genes mencionados anteriormente (0,5 pg cada uno), el reactivo de transfección Extreme GENE9 DNA (6 pL) y Opti-MEM (200 pl) se combinaron y se añadieron a las células mencionadas anteriormente para transfectar las células. Las células se cultivaron durante 1 día, y después se descartó el medio y se cambió por un medio osteoinductivo (obtenido al añadir 50 pg/ml de ácido ascórbico, p-glicerofosfato 10 mM y dexametasona 100 nM (todas las concentraciones son concentraciones finales) a un medio normal), seguido de cultivo. 14 días después de la introducción de los genes, las células se sometieron a tinción con ALP. Se muestra una imagen de microscopio invertido de contraste de fase (b). Las abreviaturas en la Figura 26a representan los siguientes significados. CAG prom: promotor de CAG, poli A: señal de adición de poli A, oriP: secuencia oriP del virus de Epstein-Barr, EBNA1: gen del antígeno nuclear 1 del virus de Epstein-Barr, KanR: gen resistente a la kanamicina.

(24) Reprogramación directa en osteoblastos de ratón (Figuras 27)

Se infectaron fibroblastos fetales de ratón con una mezcla (RKM) de vectores de retrovirus, que incluían Runx2, Klf4 y c-Myc, o una mezcla (RKG) de vectores de retrovirus, que incluían Runx2, Klf4 y Glis1, y después se cultivaron durante x día(s). Algunas de las células no se infectaron. a: Las células se sometieron a tinción con fosfatasa alcalina (ALP), tinción con Alizarin Red S y tinción de von Kossa. El aumento fue de 40 veces. b: se recogió el RNA de las células y se cuantificaron los niveles de expresión de los genes descritos anteriormente mediante análisis de RT-PCR en tiempo real. El nivel de mRNA de cada muestra se normalizó por el nivel de mRNA de p-actina y después se expresó como un valor relativo a un valor de fibroblastos fetales de ratón obtenidos sin la introducción de los genes. *P<0,05 y **P<0,01, (diferencias significativas con respecto a los fibroblastos fetales de ratón obtenidos sin introducción de los genes). #p<0,05, ##P<0,01. Los valores son la media ± S.D. (n=4).

(25) Reprogramación directa de la cepa de fibroblastos gingivales humanos normales Gin-1 (Figura 28a, Figura 28b y Figura 28c)

Una cepa de fibroblastos gingivales humanos normales, Gin-1, se cultivó en un plato de 35 mm y se sometió a un experimento como se muestra en la Figura 2. El signo "+" en la tabla representa la infección con vectores de retrovirus que incluyen los genes respectivos, y el blanco representa la no infección con vectores de retrovirus que incluyen los genes respectivos.

a: 14 días después de la introducción de los genes, se recogió el RNA de las células y se cuantificó el mRNA de osteocalcina (barra negra) y el mRNA de osteopontina (barra blanca) mediante RT-PCR en tiempo real. Cada barra representa la media ± desviación estándar. N=3. *P<0,05 y **P<0,01 (en comparación con células no infectadas).

b: 14 días después de la introducción de los genes, se recogió el RNA de las células y se cuantificaron el mRNA de osteocalcina (barra negra) y el mRNA de ALP (barra blanca) mediante RT-PCR en tiempo real. Cada barra representa la media ± desviación estándar. N=3. **P<0,01 (en comparación con células no infectadas).

c: 28 días después de la introducción de los genes, el cultivo se retiró por aspiración del plato de cultivo, y las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron con formalina al 10%. Las células se lavaron con agua destilada estéril y después se les añadió una solución de nitrato de plata al 5%, seguido de reposo bajo luz ultravioleta durante 30 minutos. Después de eso, las células se lavaron con agua destilada estéril y se les añadió una solución de tiosulfato al 5% y se dejaron reaccionar durante 2 minutos. Las células se lavaron con agua destilada estéril y después se observaron a simple vista y bajo un microscopio invertido de contraste de fase.

Se descubrió que las células infectadas con los vectores de retrovirus, que incluían los genes Osterix+Oct4+L-Myc y los genes Runx2+Osterix+Oct4+L-Myc, producían grandes cantidades de matriz ósea calcificada. Además, también se descubrió que las células infectadas con el vector de retrovirus, que incluían los genes Oct4+L-Myc, producían una gran cantidad de matriz ósea calcificada.

(26) Propiedades de osteoblastos humanos inducidos a partir de fibroblastos humanos por reprogramación directa (Figura 29a y Figura 29b)

Se infectaron fibroblastos gingivales humanos (Gin-1) con una mezcla (ROOct4L) de vectores de retrovirus, que incluían los genes humanos Runx2, Osterix, Oct4 y L-Myc, o una mezcla (Oct4L) de vectores de retrovirus, que incluían los genes Oct4 y L-Myc, y se cultivaron durante 14 días. El signo (-) representa fibroblastos gingivales, Gin-1, no infectados con los vectores de retrovirus. Se usaron células NHost adquiridas de Lonza Walkersville, Inc. como osteoblastos humanos. De la misma manera que de la Figura 15b a la Figura 15e, el RNA se recogió de las células utilizando ISOGEN II (Nippon Gene) y se transcribió de forma inversa utilizando ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO). El análisis de RT-PCR en tiempo real se llevó a cabo utilizando cebadores específicos para los genes respectivos (mostrados en la Figura 29b), Real-time PCR Master Mix (TOYOBO) y 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems). Los resultados se muestran en la Figura 29a. El nivel de mRNA de cada muestra se normalizó por el nivel de mRNA de p-actina y después se expresó como un valor relativo a un valor de los fibroblastos gingivales humanos. *P<0,05 y **P<0,01, (una diferencia significativa con respecto a los fibroblastos gingivales humanos (Gin-1) obtenidos sin introducción de los genes). #P<0,05, ##P<0,01. Los valores son la media ± S.D. (n=4).

Tanto las células infectadas con ROOct4L como las células infectadas con Oct4L expresaron genes específicos de osteoblastos.

(27) Perfil exhaustivo de expresión génica de osteoblastos inducidos a partir de fibroblastos humanos mediante reprogramación directa (Figuras 30).

El RNA se recogió de las siguientes células. dOBs: Osteoblastos inducidos al infectar fibroblastos gingivales humanos (Gin-1) con una mezcla (ROOct4L) de vectores de retrovirus que incluían genes humanos Runx2, Osterix, Oct4 y L-Myc. Fibroblastos: fibroblastos gingivales Gin-1 no infectados con los vectores. Osteoblastos: osteoblastos humanos (células NHost) adquiridos de Lonza Walkersville, Inc. Las células se sometieron a un análisis de expresión génica exhaustivo utilizando GeneChip (marca comercial) human Gene 1.0 ST fabricado por Affymetrix. MSCs: Células madre mesenquimales de la médula ósea humana. MSC-OBs: osteoblastos inducidos mediante el cultivo de células madre mesenquimales de médula ósea humana en un medio para osteoblastos. a): Un mapa de calor y un análisis de conglomerados de genes que han aumentado y disminuido en los niveles de expresión el doble o más en comparación con los fibroblastos. b): Un mapa de calor de todos los genes. Los resultados muestran que el perfil de expresión génica de los dOBs es significativamente diferente al de los fibroblastos originales y es similar al de los osteoblastos. La similitud entre los dOBs y los osteoblastos es mayor que entre las MSC-OBs y los osteoblastos.

(28) La eficiencia de la reprogramación directa es de aproximadamente el 80%. (Figura 31)

a) : Se tiñeron los osteoblastos (dOBs) inducidos por la infección de fibroblastos gingivales humanos (Gin-1) con una mezcla (ROOct4L) de vectores de retrovirus, que incluyen los genes Runx2, Osterix, Oct4 y L-Myc, y después se cultivaron las células durante 21 días con una osteocalcina antihumana y un anticuerpo secundario marcado con Alexa fluor 488 y DAPI. DAPI puede teñir los núcleos de todas las células, y la mayoría de las células positivas para DAPI pueden producir osteocalcina.

b) : Se contaron los números de células de osteocalcina (+) DAPI (+) y células DAPI (+). Los números se calcularon con base en la siguiente expresión:

Proporción de células productoras de osteocalcina = Número de células osteocalcina (+) DAPI (+) / Número de células DAPI (+) x 100. Se encontró que aproximadamente el 80% de los fibroblastos se convirtieron en osteoblastos. Media±S.D. (n=5). **P<0,01.

(29) La reprogramación de fibroblastos humanos a osteoblastos es conversión directa sin fase similar a células madre pluripotentes (Figura 32).

Se infectaron fibroblastos gingivales humanos (Gin-1) con una mezcla (ROOct4L) de vectores de retrovirus, que incluían los genes Runx2, Osterix, Oct4 y L-Myc. Desde el día 1 hasta el día 15 después de la infección cada dos días, las células se fijaron con paraformaldehído a 4°C durante 30 minutos. Las células se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,2 % a temperatura ambiente durante 15 minutos y después se tiñeron con anticuerpo anti-Nanog y anticuerpo secundario marcado con Alexa fluor 488 y DAPI. Las células se observaron bajo un microscopio de fluorescencia y se observaron 1000 o más células positivas para DAPI en cada muestra. Sin embargo, no se observaron células positivas para Nanog en ningún momento. Se muestran imágenes típicas de microscopio de fluorescencia (ampliación: 100 veces). Como control positivo, las células iPS humanas se tiñeron de la misma manera que antes, y en todas las células se expresó fuertemente Nanog.

(30) Los osteoblastos inducidos a partir de fibroblastos dérmicos humanos normales mediante la reprogramación directa no tienen cariotipo anormal (Figura 33).

Los fibroblastos humanos se infectaron con una mezcla (ROOct4L) de vectores de retrovirus que incluían los genes Runx2, Osterix, Oct4 y L-Myc. 14 días después de eso, cuando los osteoblastos se sometieron a análisis de cariotipo, se mostró un cariotipo normal.

(31) Los fibroblastos humanos no incluyen células madre mesenquimales (MSCs) incorporadas (Figura 34).

Se cultivaron de forma independiente fibroblastos gingivales humanos (Gin-1) y, como control positivo, células madre mesenquimales (MSCs) derivadas de tejido adiposo humano en los siguientes medios: un medio para inducir la diferenciación en células adiposas (izquierda), un medio para inducir la diferenciación en osteoblastos (centro) y un medio para inducir la diferenciación en condrocitos (derecha). Las células se cultivaron durante 21 días y después se sometieron a tinción con Oil O Red (izquierda), tinción con Alizarin Red S (centro) y tinción con Alcian blue (derecha). A diferencia del caso de las MSCs, no hubo células diferenciadas de Gin-1 en células adiposas, osteoblastos y condrocitos.

Los resultados pueden eliminar la posibilidad de que los osteoblastos se hayan obtenido por diferenciación de las MSCs debido a la incorporación de las MSCs en los fibroblastos.

(32) Propiedades de osteoblastos humanos inducidos a partir de fibroblastos humanos por reprogramación directa (Figura 35)

Se infectaron fibroblastos dérmicos humanos normales con una mezcla (ROOct4L) de vectores de retrovirus, que incluían los genes humanos Runx2, Osterix, Oct4 y L-Myc, o una mezcla (Oct4L) de vectores de retrovirus, que incluían los genes Oct4 y L-Myc, y se cultivaron. El signo (-) representa fibroblastos dérmicos normales no infectados con los vectores de retrovirus. 14 días después de la introducción de los genes, las células se sometieron a tinción con ALP de la misma manera que se muestra en la Figura 5. Además, 28 días después de la introducción de los genes, las células se sometieron a tinción con Alizarin Red S de la misma manera que se muestra en la Figura 14. Además, 28 días después de la introducción de los genes, las células se sometieron a tinción de von Kossa de la misma manera que se muestra en la Figura 8.

(33) Propiedades de osteoblastos humanos inducidos a partir de fibroblastos humanos por reprogramación directa (Figura 36)

Se infectaron fibroblastos dérmicos humanos normales con una mezcla (ROOct4L) de vectores de retrovirus, que incluían los genes humanos Runx2, Osterix, Oct4 y L-Myc, o una mezcla (Oct4L) de vectores de retrovirus, que incluían los genes Oct4 y L-Myc, y se cultivaron. Se recogió el RNA de las células usando ISOGEN II (Nippon Gene) de la misma manera que de la Figura 15b a la Figura 15e y se transcribieron de manera inversa utilizando ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO). El análisis de RT-PCR en tiempo real se llevó a cabo utilizando cebadores específicos para los genes respectivos (mostrados en la Figura 25), Real-time PCR Master Mix (TOYOBO) y 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems). El nivel de mRNA de cada muestra se normalizó por el nivel de mRNA de p-actina y después se expresó como un valor relativo a un valor de los fibroblastos dérmicos humanos normales. **P<0,01 (una diferencia significativa con respecto a los fibroblastos dérmicos humanos normales obtenidos sin introducción de los genes). Los valores son la media ± S.D. (n=4).

Tanto los fibroblastos dérmicos humanos normales infectados con ROOct4L como los fibroblastos dérmicos humanos normales infectados con Oct4L pueden expresar genes específicos de osteoblastos.

(34) Propiedades de osteoblastos humanos inducidos a partir de fibroblastos gingivales humanos normales mediante reprogramación directa (Figura 37)

Se trasplantaron fibroblastos humanos y osteoblastos (dOBs) inducidos introduciendo ROOct4L en fibroblastos humanos y después cultivando las células a un sitio de defecto óseo artificial del fémur de ratones NOD/SCID de la misma manera que en las Figuras 18. Tres semanas después, se recogió el fémur y se prepararon secciones de tejido y se sometieron a tinción con HE. Basándose en las imágenes histológicas de las secciones, se midió la distancia en la dirección del eje largo de una región en la que se formó el defecto y la distancia de la región en la que se formaron los callos para calcular el "% de formación de callos" a partir de la siguiente expresión: % de formación de callos = una relación (%) de una distancia de una región en la que se formaron callos a una distancia en la dirección del eje largo de una región en la que se formó un defecto. Los valores son la media ± S.D. **P<0,01.

(35) Los dOBs trasplantados a un cuerpo vivo produjeron una matriz ósea y contribuyeron directamente a la regeneración ósea (Figura 38).

Se introdujo un gen GFP con un vector de retrovirus en osteoblastos (dOBs) inducidos introduciendo ROOct4L en fibroblastos gingivales humanos normales y después cultivando las células. De la misma manera que en las Figuras 18, las células se trasplantaron a un sitio de defecto óseo artificial del fémur de ratones NOD/SCID (derecha). Como control negativo, Matrigel solo se trasplantó a un sitio de defecto óseo artificial del fémur de ratones NOD/SCID (izquierda). Tres semanas después, se recogió el fémur y se prepararon secciones de tejido y se sometieron a inmunotinción con un anticuerpo de anti-osteocalcina humana (no reactivo con los OCs de ratón) y DAPI. En el grupo trasplantado con dOBs, se observó una formación significativa de callos en el sitio del defecto óseo, y los dOBs trasplantados tuvieron éxito en el injerto en la periferia ósea del sitio del callo. Además, se detectó osteocalcina humana en el sitio del callo y en la periferia ósea del sitio del callo. Lo anterior sugiere que los dOBs humanos trasplantados tuvieron éxito en el injerto en la periferia ósea del sitio del callo como es el caso de la regeneración ósea fisiológica. Además, lo anterior muestra que los dOBs contribuyeron directamente a la formación de callos por la matriz ósea humana producida.

(36) Los fibroblastos humanos pueden reprogramarse en osteoblastos mediante la introducción de genes con un vector de plásmido (Figura 39a y Figura 39b).

Se construyó un vector de plásmido, pCX.OXL (Figura 39a), como se describe a continuación. Una unidad de expresión para una proteína quimérica, que incluía: tres genes, Oct4, Osterix y L-myc, ligados en este orden desde el extremo N-terminal; y péptidos 2A de autoescisión insertados entre Oct4 y Osterix y entre Osterix y L-myc, se incorporó en un vector de plásmido pCX. El PCX.OXL se introdujo en fibroblastos dérmicos humanos normales mediante un método de electroporación (Neón) (centro) o lipofección (X-treme Gene 9) (derecha), y las células se cultivaron en un medio inductor durante 28 días. Las células y los fibroblastos dérmicos humanos normales obtenidos sin la introducción de los genes (izquierda) se sometieron a la tinción con Aalizarin Red S (superior) y tinción de von Kossa

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un método in vitro para preparar un osteoblasto a partir de una célula somática de un mamífero, comprendiendo el método introducir un gen relacionado con el hueso o un producto de expresión del mismo y un gen relacionado con la reprogramación o un producto de expresión del mismo en la célula somática mediante reprogramación directa sin conversión en células madre pluripotentes,

comprendiendo el gen relacionado con el hueso al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en Runx2 (R), Osterix (O) y Dlx5 (D),

comprendiendo el gen relacionado con la reprogramación al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en la familia Oct, c-Myc (M), L-Myc (L), familia GLIS, familia Klf, Lin-28 y Sox2,

en el que el gen relacionado con la reprogramación o el producto de expresión del mismo comprende Oct4, y

en el que la célula somática es un fibroblasto.

2. El método según la reivindicación 1, en el que el gen relacionado con la reprogramación o el producto de expresión del mismo que se va a introducir en la célula somática comprende uno de Oct4, Oct4L, Oct4M, Oct4LM, Oct4LGlis1 y Oct4LMGlisl, donde M representa "c-Myc", y L representa "L-Myc".

3. El método según la reivindicación 1, en el que una combinación del gen relacionado con el hueso o el producto de expresión del mismo y el gen relacionado con la reprogramación o el producto de expresión del mismo que se va a introducir en la célula somática comprende una combinación seleccionada del grupo que consiste en ROD Oct4L , RD Oct4L, RO Oct4ML, D Oct4ML, ROD Oct4M, OD Oct4L, O Oct4ML, O Oct4L, O Oct4M, OD Oct4, D Oct4L, Oct4ML, ROD Oct4ML, RD Oct4ML, OD Oct4ML, O Oct4MLGlis1, RD Oct4M, R Oct4L Glisl, R Oct4ML, OD Oct4M, O Oct4L Glisl, ROD Oct4, RO Oct4M, RO Oct4L, RO Oct4, O Oct4 Glisl, RD Oct4, Oct4L Glisl, D Oct4M, D Oct4 Glisl, O Oct4, Oct4L, Oct4M, D Oct4 , r O Oct4 K, RO Oct4Sox2 y RO Oct4Lin28, donde R representa "Runx2", O representa "Osterix", D representa "Dlx5", K representa Klf4, M representa "c-Myc" y L representa "L-Myc".

4. El método según la reivindicación 1, en el que una combinación del gen relacionado con el hueso o el producto de expresión del mismo y el gen relacionado con la reprogramación o el producto de expresión del mismo que se va a introducir en la célula somática comprende una combinación seleccionada del grupo que consiste en ROD Oct4L , RD Oct4L, RO Oct4ML, D Oct4ML, ROD Oct4M, OD Oct4L, O Oct4ML, O Oct4L, O Oct4M, OD Oct4, D Oct4L y Oct4ML, donde R representa "Runx2", O representa "Osterix", D representa " Dlx5", M representa "c-Myc" y L representa "L-Myc".

5. El método según la reivindicación 1, en el que una combinación del gen relacionado con el hueso o el producto de expresión del mismo y el gen relacionado con la reprogramación o el producto de expresión del mismo que se va a introducir en la célula somática comprende una combinación seleccionada del grupo que consiste en ROD Oct4L, RD Oct4L, RO Oct4ML y D Oct4ML.

6. Una composición que comprende un gen relacionado con el hueso o un producto de expresión del mismo y un gen relacionado con la reprogramación o un producto de expresión del mismo para usar en la preparación de un osteoblasto a partir de una célula somática de un mamífero.

comprendiendo el gen relacionado con el hueso al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en Runx2 (R), Osterix (O) y Dlx5 (D),

comprendiendo el gen relacionado con la reprogramación al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en Oct4, c-Myc (M), L-Myc (L), familia GLIS, familia Klf, Lin-28 y Sox2,

en el que el gen relacionado con la reprogramación o el producto de expresión del mismo comprende Oct4, y

en el que la célula somática es un fibroblasto.

7. La composición según la reivindicación 6, que es un vector que comprende un gen relacionado con el hueso y un gen relacionado con la reprogramación.