ES2932307T3 - Sistemas para el cocultivo de cepas de ralstonia eutropha - Google Patents

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Abstract

La presente invención se relaciona con un sistema de cocultivo que comprende dos cepas diferentes de la bacteria Cupriavidus necator (Ralstonia eutropha) y su uso para la producción de biomasa y compuestos de valor agregado. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Sistemas para el cocultivo de cepas de Ralstonia eutropha
Campo técnico
La presente invención se relaciona con un sistema de cocultivo que comprende dos cepas diferentes de la bacteria Ralstonia eutropha (Cupriavidus necator) y su uso para la producción de compuestos de valor agregado.
Antecedentes
Las técnicas de cocultivo encuentran amplias aplicaciones y son de gran importancia en la biología sintética, ya que se considera ampliamente que los consorcios de células de múltiples especies tienen un enorme potencial para la producción de compuestos industriales o médicos tanto nuevos como conocidos, y dado que estos sistemas han demostrado tener una mayor productividad. y otras ventajas sobre sus respectivos monocultivos (Bernstein et al., 2012).
En algunos casos, las cepas no se pueden monocultivar fácilmente ya que la cepa no muestra los comportamientos fisiológicos in vivo deseados , como la capacidad eficiente para metabolizar el sustrato dado. y/o para sintetizar el producto de interés, pero la presencia de otra población celular puede mejorar el éxito del cultivo o el comportamiento celular, como por conversión de sustrato complejo o eliminación de los efectos inhibidores del crecimiento de metabolitos acumulados o compuestos del medio.
Por ejemplo, los polihidroxialcanoatos (PHA), un grupo de poliésteres biodegradables naturales con amplias aplicaciones industriales, se han producido con una única cepa bacteriana productora de PHA a partir de fuentes de carbono ampliamente disponibles, como la sacarosa, o sustratos ricos en sacarosa hidrolizada (Jian Yu , 2016; Sen et al., 2019). Sin embargo, el proceso suele terminar con el consumo completo de un azúcar (glucosa) mientras se acumula el segundo (fructosa). Anteriormente se informó una diferencia en la tasa de consumo de estos dos azúcares por una cepa que acumula PHA (Raberg et al 2011; Dalsasso et al 2019). Este consumo selectivo de un azúcar individual no solo afecta el rendimiento del sustrato, sino que la mayor concentración de azúcar acumulada también inhibe el crecimiento y la productividad de PHA de la cepa bacteriana.
Una cepa de plataforma de producción microbiana bien conocida es la bacteriadel suelo Ralstonia eutropha, también conocida como Cupriavidus necator. Se sabe que la cepa de tipo salvaje Ralstonia eutropha H16 (Cupriavidus necator H16, DSM 428) produce y secuestra plásticos PHA cuando se exponen a cantidades excesivas de sustrato de azúcar. Ralstonia eutropha H16 se ha utilizado como plataforma para la producción industrial de PHA y proteínas unicelulares.. Debido al amplio espectro de utilización de sustratos y la capacidad de crecer a una alta densidad celular, esta cepa se ha estudiado y preparado intensamente durante las últimas décadas para ser una fábrica de células microbianas robusta, de manera similar a otras cepas microbianas que ya se utilizan a nivel industrial, como Saccharomyces cerevisiae, Corynebacterium glutamicum o Escherichia coli. Ralstonia eutropha H16 es capaz de crecimiento tanto autótrofo como heterótrofo, utiliza gases como CO2, H2, O2 y gas de síntesis, ácidos orgánicos de cadena corta, azúcares, ácidos grasos y lípidos y compuestos aromáticos. Además del continuo aislamiento de nuevas cepas de la especie R. eutropha de diferentes entornos, la disponibilidad de secuencias genómicas, mutagénesis, vectores de expresión y sistemas promotores han permitido la ingeniería adecuada de estas cepas para producir muchos productos biotecnológicos, como biopolímeros como politioésteres, poli(3-hidroxialcanoatos), poli(2-hidroxialcanoatos), poli(4-hidroxialcanoatos), cianoficina y productos químicos de valor añadido como los ácidos (R)-hidroxialcanoico, ácido 2-metilcítrico y diferentes alcoholes y alquenos tales como butanol, isobutanol o isopropanol. La cepa también se utiliza para la producción de bioenergía, como en las pilas de combustible, el hidrógeno impulsado por la luz o la producción de moléculas de biocombustibles sin alcohol, como los ésteres metílicos de polihidroxialcanoato o las cetonas de metilo. Además, R. eutropha tiene un gran potencial para ser una cepa huésped potente para el sistema de expresión de proteínas recombinantes (Lu et al.2016; Raberg et al. 2018).
Las cepas mutadas o manipuladas de R. eutropha pueden utilizar un espectro aún más amplio de sustratos, especialmente los azúcares mixtos o los ácidos grasos de cadena corta y media, los producidos a partir de la hidrólisis de las industrias agroalimentarias, como la celulosa, las grasas y corrientes ricas en sacarosa. Se ha estudiado el cocultivo de la cepa de R. eutropha con otras especies microbianas o bacterianas como bacillus, pseudomonas o saccharomyces para coutilizar una mezcla de sustratos y maximizar el rendimiento y la productividad del proceso (Rebocho et al. 2020; Tan et al. 2014). Además, Bhatia S.K., Bioresource Technology, 257 (2018), 92-101 describe dos cepas de Ralstonia eutropha, a saber, Ralstonia eutropha H16 y Ralstonia eutropha 5119, cada una de las cuales se cocultivó con un microbio que hidroliza la sacarosa, a saber, Bacillus subtilis y Bacillus amyloliquefaciens, para optimizar la producción de polihidroxialconato (PHA) y la generación de biomasa. Sin embargo, como las cepas microbianas de diferentes especies difieren ampliamente en sus condiciones y medios de crecimiento óptimos y requeridos, es extremadamente difícil proporcionar una cepa que no solo sea compatible con las condiciones de crecimiento y medio de la cepa monocultivada dada, sino que también sea capaz de aumentar su producción de los compuestos deseados en mayor medida que con el monocultivo. Además, es probable que cualquier cepa microbiana que se encuentre compatible para el cocultivo produzca una variedad de otros metabolitos no deseados, que pueden tener efectos no deseados, como la necesidad de etapas adicionales para separar estos compuestos.
Por lo tanto, existe una necesidad insatisfecha de sistemas de cocultivo mejorados para el cultivo de cepas o variantes de la especie Cupriavidus necator que aborde estos problemas de condiciones de cultivo, consumo optimizado de sustratos, separación de metabolitos coproducidos y productividad mejorada de los compuestos de interés.
Compendio
La invención se refiere a un sistema de cocultivo de dos cepas bacterianas pertenecientes a la especie Cupriavidus necator (Ralstonia eutropha), las dos cepas se diferencian por su capacidad de utilizar y/o metabolizar diferentes fuentes de carbono La invención se define mediante las reivindicaciones. Cualquier materia objeto que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solo con fines informativos
De hecho, los presentes inventores han descubierto que un C. necator que utiliza fructosa, como C. necator H16 (DSM 428) y un C. necator que utiliza glucosa, como C. necator H1G 3 (DSM 545), se pueden cultivar juntos utilizando sacarosa hidrolizada como fuente de carbono. C. necator DSM 428 es de tipo salvaje y usa fructosa como fuente de carbono, mientras que C. necator DSM 545, que es un mutante de C. necator H16, prefiere usar glucosa sobre fructosa como fuente de carbono. Dicho sistema de cocultivo puede garantizar un mayor rendimiento del producto y una mayor productividad en comparación con el cultivo de cualquiera de las cepas por separado. La mayor productividad se obtiene evitando el efecto inhibidor del crecimiento del azúcar acumulado y no siendo aprovechado por las bacterias. rendimiento de PHA de 70 g/L de peso seco de células e incluso mayores se han obtenido con el sistema de cocultivo descrito.
El sistema de cocultivo y el proceso aquí descrito permiten una conversión óptima de la materia prima total al producto final. Así, se minimiza el material de desecho, por ejemplo, fructosa o glucosa residual.
Una realización de la presente invención está dirigida a un sistema de cocultivo para la producción de material de proteína unicelular, piruvato y/o productos derivados del piruvato, el sistema de cocultivo que comprende un componente microbiano y un sustrato,
en el que el componente microbiano comprende o consiste en una primera y una segunda célula microbiana, en el que la primera y la segunda célula microbiana son cepas diferentes de la especie Cupriavidus necator, en el que el sustrato comprende al menos una primera fuente de carbono y una segunda fuente de carbono, la siendo la primera fuente de carbono diferente de la segunda fuente de carbono,
en el que la primera célula microbiana es capaz de metabolizar la primera fuente de carbono,
en el que la segunda célula microbiana es capaz de metabolizar la segunda fuente de carbono, y donde dichos productos derivados del piruvato son:
metabolitos asociados al crecimiento seleccionados de alcoholes, biocombustibles y/o aminoácidos; y/o
polihidroxialcanoatos homo y copoliméricos, politioésteres copoliméricos, hidroxialcanoatos monoméricos y/o cianoficina.
Un aspecto de la presente descripción se refiere a un proceso para la producción de material proteico unicelular de Cupriavidus necator, comprendiendo dicho proceso:
a) proporcionar una materia prima;
b) proporcionar un componente microbiano del sistema de cocultivo como se define en este documento; y
c) poner en contacto la materia prima con el componente microbiano del sistema de cocultivo, fermentando así la materia prima para obtener una composición fermentada que comprende piruvato y/o productos derivados del piruvato,
en el que los productos derivados del piruvato son metabolitos asociados al crecimiento seleccionados de alcoholes, biocombustibles y/o aminoácidos; y/o polihidroxialcanoatos homo y copoliméricos, politioésteres copoliméricos, hidroxialcanoatos monoméricos y/o cianoficina.
Una realización de la presente invención se refiere a un proceso para la producción de material proteico unicelular, piruvato y productos derivados del piruvato, comprendiendo dicho proceso:
a) proporcionar una materia prima;
b) proporcionar un componente microbiano del sistema de cocultivo como se define en este documento; y
c) poner en contacto la materia prima con el componente microbiano del sistema de cocultivo, fermentando así la materia prima para obtener una composición fermentada que comprende piruvato y/o productos derivados del piruvato,
en el que los productos derivados del piruvato son metabolitos asociados al crecimiento seleccionados de alcoholes, biocombustibles y/o aminoácidos; y/o polihidroxialcanoatos homo y copoliméricos, politioésteres copoliméricos, hidroxialcanoatos monoméricos y/o cianoficina.
Un aspecto de la presente descripción se refiere a un kit de piezas para la producción de material de proteína unicelular, piruvato y/o productos derivados del piruvato, el kit de piezas que comprende o consiste en una primera y una segunda célula microbiana e instrucciones de uso, en el que la primera y la segunda célula microbiana son cepas diferentes de la especie Cupriavidus necator,
en el que la primera célula microbiana es capaz de metabolizar una primera fuente de carbono, y
en el que la segunda célula microbiana es capaz de metabolizar una segunda fuente de carbono,
en el que la primera fuente de carbono difiere de la segunda fuente de carbono, y en el que los productos derivados del piruvato son metabolitos asociados al crecimiento seleccionados de alcoholes, biocombustibles y/o aminoácidos; y/o polihidroxialcanoatos homo y copoliméricos, politioésteres copoliméricos, hidroxialcanoatos monoméricos y/o cianoficina.
Un aspecto de la presente descripción está dirigido a un sistema para la producción de material proteico unicelular, piruvato y/o productos derivados del piruvato, comprendiendo dicho sistema un reactor de fermentación configurado para realizar el proceso de producción microbiana de metabolitos asociados al crecimiento como el piruvato y/o productos derivados del piruvato descritos en el presente documento, por lo tanto, mediante el uso del sistema de cocultivo descrito en el presente documento, en el que los productos derivados del piruvato son metabolitos asociados al crecimiento seleccionados entre alcoholes, biocombustibles y/o aminoácidos; y/o polihidroxialcanoatos homo y copoliméricos, politioésteres copoliméricos, hidroxialcanoatos monoméricos y/o cianoficina.
Un aspecto de la presente descripción se refiere a una composición que comprende gránulos de polihidroxialcanoato nativo obtenidos mediante el proceso descrito en el presente documento. Los bioplásticos de PHA se acumulan como gránulos intracelulares, que pueden bioextraerse y recuperarse en su forma granular nativa.
Un aspecto de la presente descripción se refiere al uso de gránulos de polihidroxialcanoato nativo obtenidos mediante el proceso descrito en el presente documento para la fabricación de un bioplástico.
Un aspecto de la presente descripción se refiere al uso de la composición que comprende gránulos de polihidroxialcanoato nativo descritos en el presente documento para la fabricación de un bioplástico.
Descripción de los dibujos
Figura 1 Fermentación discontinua alimentada con monocultivo C. necator DSM 545 para producción de PHB. Un monocultivo de C. necator DSM 545 se alimentó con sacarosa hidrolizada (una mezcla de fructosa y glucosa). Las células crecieron hasta una densidad celular relativamente alta y acumularon PHB, sin embargo, la fructosa comenzó a acumularse durante la alimentación continua.
Figura 2 Fermentación discontinua alimentada con cocultivo C. necator DSM 428 y C. necator DSM 545 para la producción de PHBV partir de sacarosa hidrolizada. Un cocultivo de las cepas que utilizaron glucosa y fructosa probadas logró consumir glucosa y fructosa y permitió que la fermentación discontinua alcanzara una mayor densidad celular y un mayor contenido de PHB en comparación con el monocultivo.
Figura 3 Fermentación discontinua alimentada con monocultivo C. necator DSM 545 para la producción de PHBV a partir de sacarosa hidrolizada. Un monocultivo de C. necator DSM 545 también se utilizó para la producción del copolímero PHBV con alimentación continua de sacarosa hidrolizada y propionato de cosustrato. La cepa que utiliza glucosa creció hasta una densidad celular relativamente alta y acumuló PHBV hasta cierto punto, sin embargo, no se pudo lograr una densidad celular más alta a pesar de que se continuó con la alimentación.
Figura 4 Fermentación discontinua alimentada con cocultivo C. necator DSM 428 y C. necator DSM 545 para la producción de PHBV a partir de sacarosa hidrolizada. El sistema de cocultivo alcanzó una mayor densidad celular y una mayor productividad de PHBV mientras continuaba la alimentación de sacarosa hidrolizada y el cosustrato, en comparación con el monocultivo C. necator DSM 545.
Descripción detallada
Definiciones
El término "célula microbiana", como se usa en el presente documento, significa células de un microorganismo, en particular de una bacteria. Preferiblemente, "una célula microbiana" se usa para referirse a una pluralidad de células microbianas de la misma cepa microbiana (bacteriana).
El término "fuente de carbono" tal como se utiliza aquí es equivalente a "fuente de carbono fermentable" y significa una fuente de carbono que un microorganismo metabolizará para obtener energía. Las fuentes de carbono típicas incluyen, pero no se limitan a, monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos, alcanos, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos, dióxido de carbono, etanol, metanol, formaldehído, formiato y aminas que contienen carbono. Cada una de las cepas de C. necator puede tener la capacidad de utilizar una única fuente de carbono para la producción de un producto y para su crecimiento, por lo que esa única fuente de carbono se denomina "única fuente de carbono". Una cepa de C. necator que utiliza, por ejemplo, glucosa o fructosa o un ácido graso como única fuente de carbono, también puede crecer en otras fuentes de carbono. El significado de la expresión "única fuente de carbono" significa que también pueden estar presentes otras fuentes de carbono.
El término "capaz de metabolizar" se usa en la presente descripción en relación con las fuentes de carbono. El término "capaz de metabolizar", tal como se usa en el presente documento, significa que una célula microbiana es capaz tanto de absorber una determinada fuente de carbono como de obtener energía de ella a través de sus sistemas metabólicos. Por ejemplo, tipo salvaje C. necator (C. necator DSM 428, DSM 428) no puede absorber la glucosa pero, sin embargo, tiene las enzimas necesarias para obtener energía de ella; de ahí el tipo salvaje C. necator (C. necator DSM 428, DSM 428) no es capaz de metabolizar la glucosa. Otras cepas de C. necator pueden absorber glucosa pero carecen de las enzimas necesarias para obtener energía de ella; por lo tanto, estas cepas no son capaces de metabolizar la glucosa. El mutante C. necador H1G 3 (DSM 545) es capaz de absorber y obtener energía de la glucosa, por lo que es capaz de metabolizar la glucosa.
El término "título" o "título de un compuesto" se refiere aquí a la concentración producida de un compuesto. Cuando el compuesto es producido por una célula, el término se refiere a la concentración total producida por la célula, es decir, la cantidad total del compuesto dividida por el volumen del medio de cultivo.
Como se usa en el presente documento, "alta densidad celular" se refiere a un cultivo que produce una gran cantidad de células microbianas procariotas o eucariotas en un volumen definido de medio de cultivo y un período definido de cultivo. El valor de alta densidad celular depende de la célula microbiana y se puede definir como el valor de densidad celular que se alcanza con la adición gradual de sustratos limitantes del crecimiento (alimentación por lotes) sin intoxicar al microbio.
El término "biocombustible" se refiere a un combustible en el que todo el carbono contenido en el combustible se deriva de la biomasa, como un desecho vegetal o animal, y se convierte bioquímicamente, al menos en parte, en un combustible por un microorganismo. Los biocombustibles incluyen, pero no se limitan a, biodiésel, biohidrógeno, biogás, dimetilfurano derivado de biomasa (DMF) y similares. En particular, el término "biocombustible" puede usarse para referirse a alcoholes derivados de plantas, como etanol, metanol, propanol o butanol, que pueden desnaturalizarse, si se desea, antes de su uso. El término "biocombustible" también se puede utilizar para referirse a mezclas de combustibles que comprenden combustibles derivados de plantas, tales como mezclas de alcohol/gasolina (es decir, gasohols). El biocombustible puede ser cualquier biocombustible producido por fermentación aeróbica o anaeróbica de material vegetal, como remolacha azucarera y melaza de caña de azúcar.
El término "material proteico unicelular" o "material SCP" se refiere a proteínas derivadas de microorganismos, como levaduras y proteínas bacterianas, para su inclusión en las dietas de los animales. Por ejemplo, "el material de proteína unicelular puede ser biomasa microbiana, como biomasa bacteriana comestible. De hecho, la biomasa bacteriana es rica en proteínas. Se han propuesto microorganismos unicelulares como hongos, levaduras y bacterias como nuevas fuentes de proteínas en alimentos para humanos y en ciertos alimentos para animales. Estos pueden ser cultivados por reproducción unicelular. Hoy en día, los microorganismos que contienen proteínas más utilizados (también denominados "material proteico unicelular") son los derivados de hongos o levaduras. La presente descripción se relaciona en algunos aspectos con la producción de proteínas unicelulares derivadas de bacterias, en particular de un cocultivo de dos cepas diferentes de la especie Cupriavidus necator.
Sistema y kit de cocultivo
Un aspecto de la presente descripción está dirigido a un sistema de cocultivo para la producción de material proteico unicelular, piruvato y/o productos derivados del piruvato,
el sistema de cocultivo que comprende un componente microbiano y un sustrato,
en el que el componente microbiano comprende o consiste en una primera y una segunda célula microbiana, en el que la primera y la segunda células microbianas son cepas diferentes de la especie
Cupriavidus necator,
en el que el sustrato comprende al menos una primera fuente de carbono y una segunda fuente de carbono, siendo la primera fuente de carbono diferente de la segunda fuente de carbono,
donde la primera célula microbiana es capaz de metabolizar una primera fuente de carbono, y
en el que la segunda célula microbiana es capaz de metabolizar la segunda fuente de carbono, y donde dichos productos derivados del piruvato son metabolitos asociados al crecimiento seleccionados entre alcoholes, biocombustibles y/o aminoácidos; y/o polihidroxialcanoatos homo y copoliméricos, politioésteres copoliméricos, hidroxialcanoatos monoméricos y/o cianoficina.
En una realización, la presente descripción está dirigida a un sistema de cocultivo para la producción de polihidroxialcanoatos,
el sistema de cocultivo que comprende un componente microbiano y un sustrato,
en el que el componente microbiano comprende o consiste en una primera y una segunda célula microbiana, en el que la primera y la segunda células microbianas son cepas diferentes de la especie
Cupriavidus necator,
en el que el sustrato comprende al menos una primera fuente de carbono y una segunda fuente de carbono, siendo la primera fuente de carbono diferente de la segunda fuente de carbono,
en el que la primera célula microbiana es capaz de metabolizar una primera fuente de carbono, y en el que la primera célula microbiana es capaz de metabolizar la segunda fuente de carbono.
En una realización, la presente descripción está dirigida a un sistema de cocultivo para la producción de material proteico unicelular de Cupriavidus necator,
el sistema de cocultivo que comprende un componente microbiano y un sustrato,
en el que el componente microbiano comprende o consiste en una primera y una segunda célula microbiana, en el que la primera y la segunda células microbianas son cepas diferentes de la especie
Cupriavidus necator,
en el que el sustrato comprende al menos una primera fuente de carbono y una segunda fuente de carbono, siendo la primera fuente de carbono diferente de la segunda fuente de carbono,
en el que la primera célula microbiana es capaz de metabolizar una primera fuente de carbono, y en el que la primera célula microbiana es capaz de metabolizar la segunda fuente de carbono.
De hecho, la presente invención ha encontrado que dos cepas de la especie bacteriana Cupriavidus necator que tienen un metabolismo similar, pero no idéntico, pueden cultivarse juntas en las mismas condiciones de cultivo y dar como resultado una producción mejorada de ciertos compuestos valiosos mientras que al mismo tiempo puede utilizar mejor el sustrato disponible en el cultivo, especialmente si ese sustrato comprende más de una fuente de carbono. De hecho, el Cupriavidus necator de tipo salvaje no es capaz de metabolizar la glucosa porque no es capaz de absorber la glucosa del medio de crecimiento (incluso si tiene las enzimas necesarias para obtener energía de la glucosa) (Raberg et al 2011), pero un número de cepas mutantes de Cupriavidus necator que utilizan glucosa han sido aisladas y/o obtenidos mediante irradiación UV (Schlegel y Gottschalk 1965), mutagénesis química (Kim et al. 1995) e ingeniería metabólica (Sichwart et al. 2011).
La presente invención ha encontrado que el cultivo conjunto de una cepa de Cupriavidus necator que es capaz de metabolizar la glucosa junto con una cepa de Cupriavidus necator que no es capaz de metabolizar la glucosa es posible e incluso ventajoso, tanto para mejorar la utilización del sustrato como para producir ciertos productos microbianos. a un título más alto en comparación con cuando una cepa de Cupriavidus necator se cultiva sola con el mismo sustrato.
La presente descripción está dirigida a un cocultivo de dos cepas pertenecientes a la especie Cupriavidus necator Los nombres Cupriavidus necator y Ralstonia eutropha se usan indistintamente en este documento.
Cupriavidus necator es una bacteria del suelo Gram-negativa de la clase Betaproteobacteria. Cupriavidus necator ha pasado por una serie de cambios de nombre. C. necator se denominó originalmente Hydrogenomonas eutrophus porque entraba en la clasificación de Hydrogenomonas. Después de caracterizar la morfología celular, el metabolismo y el contenido de GC, la nomenclatura Hydrogenomonas se disolvió porque comprendía muchas especies de microorganismos. H. eutrophus pasó a llamarse entonces Alcaligenes eutropha porque era un microorganismo con flagelación peritrichous degenerada. Al investigar el fenotipo, la composición de lípidos, la composición de ácidos grasos y el análisis del ARNr 16S,se descubrió que A. eutropha pertenecía al género Ralstonia y se denominó Ralstonia eutropha. Tras un estudio más detallado del género, se descubrió que Ralstonia comprende dos grupos fenotípicamente distintos. El nuevo género Wautersia se creó a partir de uno de estos grupos que incluía a R. eutropha. A su vez , R. eutropha pasó a llamarse Wautersia eutropha. Al observar la hibridación ADN-ADN y la comparación de fenotipos con Cupriavidus necator, se descubrió que W. eutropha era la misma especie que C. necator descrita anteriormente. Debido a que C. necator recibió su nombre en 1987 mucho antes de que cambiara el nombre a R. eutropha y W. eutropha, el nombre C. necator se asignó a R. eutropha según la Regla 23a del Código Internacional de Nomenclatura de Bacterias. Actualmente, Cupriavidus necator todavía se conoce como Ralstonia eutropha.
En una realización de la presente descripción, el componente microbiano del sistema de cocultivo comprende o consiste en una primera y una segunda célula microbiana, en donde la segunda célula microbiana es un mutante o una variante de la primera célula microbiana. La célula microbiana mutante puede ser un mutante modificado genéticamente y/o un mutante aislado de un grupo de mutantes obtenidos por mutagénesis inducida del tipo salvaje y/o un mutante aislado de la naturaleza, donde ocurre mutagénesis espontánea. En particular, las células microbianas primera y segunda difieren en su metabolismo del carbono; por ejemplo, es posible que hayan preferido una determinada fuente de carbono a otras fuentes de carbono, o que no puedan metabolizar una determinada fuente de carbono.
En una realización de la presente descripción, la primera y la segunda células microbianas son cada una pluralidad de células microbianas.
En una realización de la presente descripción, el componente microbiano consiste en la primera y la segunda célula microbiana.
En una realización de la presente descripción, la relación entre la primera célula microbiana y la segunda célula microbiana es 1:1, como 1:2, como 1:3, como 1:4, como 4:1, como 3:1, como 3:2. Por ejemplo, la relación entre la primera célula microbiana y la segunda célula microbiana se puede ajustar en función de la composición del sustrato o de la tasa de crecimiento de la cepa, como en función de las fuentes de carbono presentes en el sustrato, para optimizar la utilización y el consumo del sustrato.
En una realización de la presente descripción, la primera célula microbiana no es capaz de metabolizar la segunda fuente de carbono. Esto se debe a que la primera célula microbiana puede, por ejemplo, no ser capaz de absorber esa fuente de carbono del medio ambiente, y/o porque carece de las enzimas necesarias para obtener energía de esa fuente de carbono. Por ejemplo, la primera célula microbiana puede ser una célula de tipo salvaje de Cupriavidus necator, por ejemplo Cupriavidus necator DSM 428, que no es capaz de metabolizar la glucosa.
Si dicha célula microbiana se utiliza en un monocultivo con un sustrato que contiene y/o alimentada con fructosa y glucosa, la glucosa en el cultivo no se usará y, en cambio, puede acumularse en el medio de crecimiento (fermentación), como en la fermentación por lotes alimentados, y alcanzar concentraciones (generalmente >20 g/L) que inhiben el crecimiento celular y la formación de productos. Como consecuencia del efecto de inhibición, también se acumularán otras fuentes de carbono y nutrientes que se alimentan al medio porque las células dejan de crecer y consumir los nutrientes.
En una realización de la presente descripción, la primera y la segunda células microbianas son células microbianas productoras de polihidroxialcanoato (PHA). Cupriavidus necator es conocido por ser capaz de producir PHA bajo falta de nitrógeno y mediante el uso de monosacáridos, gases y/o ácidos grasos como precursores.
En una realización de la presente descripción, la primera y la segunda células microbianas son mesófilas. Por lo tanto, se cultivan en condiciones que pueden mantenerse fácilmente.
En una realización de la presente descripción, el sustrato comprende al menos dos fuentes de carbono, donde la primera fuente de carbono es fructosa y/o donde la segunda fuente de carbono es glucosa. Así, al menos una de las dos cepas de Cupriavidus necator puede metabolizar fructosa, y al menos una de las dos cepas de Cupriavidus necator puede metabolizar glucosa. Por ejemplo, una cepa de Cupriavidus necator puede ser capaz de metabolizar glucosa pero no fructosa, o una cepa de Cupriavidus necator puede ser capaz de metabolizar fructosa pero no glucosa, o una cepa de Cupriavidus necator puede ser capaz de metabolizar glucosa y fructosa.
Por lo tanto, en una realización de la presente descripción, la primera célula microbiana no es capaz de metabolizar la glucosa.
En una realización de la presente descripción, la primera célula microbiana no es capaz de metabolizar la segunda fuente de carbono.
En una realización de la presente descripción, la primera célula microbiana no es capaz de metabolizar la segunda fuente de carbono.
En una realización de la presente descripción, la primera célula microbiana es capaz de convertir la fructosa en piruvato. y/o productos derivados del piruvato, como la producción de material unicelular mediante el metabolismo de la fructosa. En una realización de la presente descripción, la primera célula microbiana es capaz de convertir la fructosa en metabolitos primarios o metabolitos asociados al crecimiento, como piruvato, alcoholes, biocombustibles y/o aminoácidos; y/o en metabolitos secundarios como polihidroxialcanoatos homo y copoliméricos, politioésteres copoliméricos, hidroxialcanoatos monoméricos, cianoficina y/u otros productos valiosos.
En una realización de la presente descripción, la primera célula microbiana no es capaz de usar glucosa para su crecimiento y, por lo tanto, de usar glucosa para producir material de proteína unicelular y de convertir la glucosa en piruvato. y/o productos derivados del piruvato. Esto se debe a que la primera célula microbiana, por ejemplo, no es capaz de absorber glucosa del medio ambiente, y/o porque carece de las enzimas necesarias para obtener energía de la glucosa.
En una realización de la presente descripción, la segunda célula microbiana es capaz de usar glucosa para su crecimiento y, por lo tanto, de usar glucosa para producir material de proteína unicelular y de convertir glucosa en piruvato y/o productos derivados de piruvato. En una realización de la presente descripción, la segunda célula microbiana es capaz de convertir la glucosa en biomasa, piruvato y productos derivados del piruvato, donde dichos productos derivados del piruvato son metabolitos primarios o metabolitos asociados al crecimiento, tales como alcoholes, biocombustibles y/o aminoácidos; y/o metabolitos secundarios, como polihidroxialcanoatos homo y copoliméricos, politioésteres copoliméricos, hidroxialcanoatos monoméricos y/o cianoficina.
En una realización de la presente descripción, la segunda célula microbiana tiene una capacidad reducida en comparación con la primera célula microbiana para convertir la fructosa en biomasa, por ejemplo, para usar fructosa para su propio crecimiento y, por lo tanto, para la producción de material proteico unicelular, así como para convertir la fructosa en productos asociados al crecimiento, como el piruvatoy/o productos derivados del piruvato.
En una realización de la presente descripción, la primera y la segunda células microbianas son capaces de convertir el piruvato en un polihidroxialcanoato monopolimérico (PHA), un polihidroxialcanoato copolimérico (PHA), un politioéster copolimérico (PTE) y/o un monómero de (R)-hidroxialcanoato.
En una realización de la presente descripción, la primera y la segunda células microbianas son capaces de convertir el piruvato en un polihidroxialcanoato (PHA) monopolimérico, poli(3-hidroxialcanoatos), poli(2-hidroxialcanoatos), poli(4-hidroxialcanoatos) de longitud de cadena media. hidroxialcanoatos), poli(3-hidroxibutirato) (P(3Hb )), un polihidroxialcanoato copolimérico (PHA), P(3HB-co-3HV), P(3HB-co-3HV-co-4HV), P(3HB -co-3HHx), un polihidroxialcanoato copolimérico (PHA) y politioéster (PTE) y/o un monómero de (R)-hidroxialcanoato, o una combinación de los mismos.
En una realización de la presente descripción, la primera y la segunda células microbianas son capaces de convertir el piruvato en cianoficina.
En una realización de la presente descripción, la primera y la segunda células microbianas son capaces de convertir el piruvato en ácido 2-metilcítrico, butanol, isobutanol o isopropanol, ésteres metílicos de polihidroxialcanoato, y/o metilcetonas, y/u otros productos de valor agregado.
La capacidad de una célula microbiana para metabolizar una fuente de carbono, por ejemplo glucosa y/o fructosa, se puede determinar cultivando dicha célula microbiana en un medio que comprende la fuente de carbono específica como única fuente de carbono, por ejemplo, glucosa o fructosa, y midiendo su concentración a lo largo del tiempo mediante HPLC, determinando así que la fuente de carbono se está consumiendo, por lo tanto metabolizando , si su concentración disminuye con el tiempo. Además, el aumento en la concentración a lo largo del tiempo de la biomasa y el producto, así como de los subproductos o gases del crecimiento, como el CO2, también se puede controlar, por ejemplo, mediante el control de la densidad óptica (DO) a lo largo del tiempo, donde un aumento en la DO indica que la fuente de carbono está siendo utilizada por la célula microbiana para crecer y producir biomasa. Los protocolos de HPLC para determinar la concentración residual de una fuente de carbono, como un monosacárido, como glucosa o fructosa en una muestra, son conocidos en la técnica. Se da un ejemplo en el Ejemplo 1 de la presente solicitud.
La capacidad de una célula microbiana para convertir una fuente de carbono, por ejemplo glucosa y/o fructosa, en polihidroxialcanoatos se puede determinar cultivando dicha célula microbiana en un medio que comprende la fuente de carbono específica como única fuente de carbono preferiblemente en condiciones limitantes de nitrógeno, por ejemplo, glucosa o fructosa, y midiendo la concentración de polihidroxialcanoatos en la biomasa celular a lo largo del tiempo mediante cromatografía de gases (GC), determinando así que se están produciendo polihidroxialcanoatos como producto de los azúcares que se metabolizan. Los protocolos de GC para determinar la concentración de polihidroxialcanoatos específicos, por ejemplo de polihidroxibutirato, son conocidos en la técnica. Se da un ejemplo en el Ejemplo 2 de la presente solicitud.
En una realización de la presente descripción, la primera célula microbiana es Cupriavidus necator DSM 428. Por lo tanto, en una realización de la presente descripción, la primera célula microbiana es un Cupriavidus necator de tipo salvaje.
En una realización de la presente descripción, la segunda célula microbiana es Cupriavidus necator DSM 545. Por lo tanto, en una realización de la presente descripción, la segunda célula microbiana es un mutante de Cupriavidus necator de tipo salvaje, tal como Cupriavidus necator DSM 428, donde dicho mutante es capaz de metabolizar glucosa.
En una realización de la presente descripción, dicho sistema de cocultivo es para la producción de polihidroxialcanoatos homo y copoliméricos, politioésteres copoliméricos, hidroxialcanoatos monoméricos, biocombustibles alcohólicos y no alcohólicos, y/u otros productos valiosos.
Un aspecto de la presente descripción está dirigido a un sistema para la producción de material proteico unicelular, piruvato y/o productos derivados de piruvato, comprendiendo dicho sistema un reactor de fermentación configurado para realizar el proceso de producción microbiana de material proteico unicelular, tal como biomasa microbiana, o productos asociados al crecimiento, tales como piruvato y/o productos derivados del piruvato descritos en el presente documento, por lo tanto, mediante el uso del sistema de cocultivo descrito en el presente documento, en el que los productos derivados del piruvato son metabolitos asociados al crecimiento seleccionados entre alcoholes, biocombustibles y/o aminoácidos; y/o polihidroxialcanoatos homo y copoliméricos, politioésteres copoliméricos, hidroxialcanoatos monoméricos y/o cianoficina.
Un aspecto de la presente descripción se refiere a un kit de piezas para la producción de material de proteína unicelular, piruvato y/o productos derivados del piruvato, el kit de piezas comprende o consiste en una primera y una segunda célula microbiana e instrucciones de uso. en el que la primera y la segunda células microbianas son cepas diferentes de la especie Cupriavidus necator,
en el que la primera célula microbiana es capaz de metabolizar una primera fuente de carbono, y
en el que la segunda célula microbiana es capaz de metabolizar una segunda fuente de carbono,
en el que la primera fuente de carbono difiere de la segunda fuente de carbono,
en el que los productos derivados del piruvato son metabolitos asociados al crecimiento seleccionados de alcoholes, biocombustibles y/o aminoácidos; y/o polihidroxialcanoatos homo y copoliméricos, politioésteres copoliméricos, hidroxialcanoatos monoméricos
y/o cianoficina.
En una realización de la presente descripción, la primera y la segunda fuentes de carbono que pueden ser metabolizadas por la primera y la segunda células microbianas presentes en el kit de partes son diferentes fuentes de carbono orgánico seleccionadas del grupo que consiste en glucosa, fructosa, ácido propiónico. , ácido valérico, ácido levulínico, ácido fórmico, ácido butírico, ácido cítrico, ácido acético, CO2, gas de síntesis, corto y/o ácido graso de cadena media, mercaptoalcanoato, glicerol, ácido glucónico, xilosa, N-acetil-D-glucosamina (NAG), benzoato, fenol, etanol, metanol, ácido 3-mercaptopropiónico (3MP), ácido 3-mercaptovalérico (3MV), ácido 3,3'-tiodipropiónico (TDP), ácido 3,3'-ditiodipropiónico (DTDP) y ácido 3-mercaptovalérico (3MV).
En una realización de la presente descripción, la primera y la segunda fuentes de carbono que pueden ser metabolizadas por la primera y la segunda células microbianas presentes en el kit de partes son fructosa y glucosa.
En una realización de la presente descripción, la primera y la segunda células microbianas son cada una pluralidad de células microbianas.
En una realización de la presente descripción, la primera y la segunda células microbianas son células microbianas productoras de polihidroxialcanoato (PHA).
En una realización de la presente descripción, la segunda célula microbiana es un mutante de la primera célula microbiana.
En una realización de la presente descripción, la primera célula microbiana es Cupriavidus necator DSM 428 y la segunda célula microbiana es una cepa de Cupriavidus necator capaz de metabolizar glucosa.
En una realización de la presente descripción, la primera célula microbiana es una cepa de Cupriavidus necator capaz de utilizar fructosa como única fuente de carbono, y la segunda célula microbiana es una cepa de Cupriavidus necator capaz de utilizar un ácido graso como única fuente de carbono
En una realización de la presente descripción, la primera célula microbiana es Cupriavidus necator DSM 428, y la segunda célula microbiana es una cepa de Cupriavidus necator capaz de usar un ácido graso, como un ácido graso de cadena corta o un ácido graso de cadena media, como única fuente de carbono
En una realización de la presente descripción, la primera célula microbiana es una cepa de Cupriavidus necator capaz de utilizar un ácido graso, como un ácido graso de cadena corta o un ácido graso de cadena media, como única fuente de carbono y/o en la que la segunda célula microbiana es una cepa de Cupriavidus necator capaz de utilizar glucosa como única fuente de carbono.
En una realización de la presente descripción, la primera célula microbiana es una cepa de Cupriavidus necator capaz de utilizar un ácido graso como única fuente de carbono. y/o donde la segunda célula microbiana es Cupriavidus necator DSM 545.
En una realización de la presente descripción, la primera célula microbiana es Cupriavidus necator DSM 428 y la segunda célula microbiana es Cupriavidus necator DSM 545.
C. necator DSM 428, la cepa de tipo salvaje que utiliza fructosa pero no glucosa, y C. necator DSM 545, un mutante de la cepa DSM 428 que puede utilizar glucosa y fructosa. Estas dos cepas son notablemente similares siendo el tipo salvaje y el mutante de la misma cepa, y su cultivo conjunto da como resultado un mejor consumo de las fuentes de carbono, en particular fructosa y glucosa, y un título más alto de polihidroxialcanoatos, en comparación con el monocultivo de cada una de las cepas por separado.
Existen cepas recombinantes de C. necator que prefieren ácidos grasos de cadena corta o cadena media como fuente de carbono. Estas cepas son útiles para producir PHA copoliméricos cuando forman parte de un cocultivo como se describe en el presente documento.
En una realización de la presente descripción, el kit de piezas comprende además componentes del medio que son adecuados para el cultivo de dichas células microbianas.
En una realización de la presente descripción, las instrucciones de uso del kit de piezas comprenden la receta de cultivo.
Productos derivados del piruvato y material de proteína unicelular
Cupriavidus necator es muy eficaz para convertir el piruvato en polihidroxialcanoatos; no obstante, Cupriavidus necator también puede convertir el piruvato en otros productos valiosos, por ejemplo, metabolitos primarios o metabolitos asociados al crecimiento, o incluso simplemente biomasa, que puede utilizarse como material proteico unicelular.
Los productos derivados del piruvato son todos aquellos productos que se pueden obtener mediante Cupriavidus necator cuando metaboliza aún más el piruvato, por ejemplo, a través de AcetylCoA y acetoacetyl
Producción de CoA, o a través de la ruta de biosíntesis de valina. Esto está bien explicado en Lu et al. 2016 (en particular Fig. 12.7). Por lo tanto, los ejemplos de productos derivados del piruvato son polihidroxialcanoatos homo y copoliméricos, politioésteres copoliméricos, hidroxialcanoatos monoméricos, biocombustibles alcohólicos y no alcohólicos, aminoácidos, cianoficina y/u otros productos valiosos.
Más en particular, los polihidroxialcanoatos que se pueden producir mediante los sistemas y procesos descritos en el presente documento son poli-3-hidroxibutirato (PHB, P(3HB)), polihidroxivalerato (PHV, P(3HV)), polihidroxihexanoato (PHHx, P(3HHx)) y/o poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato)(PHBV, P(3HB-co-3HV), poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato-co-4-hidroxivalerato)(PHBVV, P(3HB-co -3HV-co-4HV)), poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato)(PHBHx, P(3HB-co-3HHx), copolímeros de politioésteres (co-PTE), poli(3-hidroxibutirato- co-3-mercaptopropionato (P(3HB-co-3MP)), o una combinación de los mismos.
De manera similar, los hidroxialcanoatos monoméricos que se pueden producir mediante los sistemas y procesos descritos en este documento son (R)-hidroxibutirato, (R)-hidroxivalerato, y/o (R)-hidroxihexanoato.
De manera similar, los biocombustibles que se pueden producir mediante los sistemas y procesos aquí descritos son: biocombustibles de alcohol como butanol, isobutanol, 3-metil-1-butanol, y/o isopropanol; pero también biocombustibles sin alcohol como los aditivos del diésel, como las cetonas. Los copolímeros de politioésteres se pueden producir mediante los sistemas y procesos descritos en este documento, en particular cuando el sustrato comprende además de sacarosa hidrolizada, también uno o más de ácido 3-mercaptopropiónico (3MP), ácido 3-mercaptovalérico (3MV), ácido 3,3'-tiodipropiónico (TDP), ácido 3,3'-ditiodipropiónico (DTDP) y ácido 3-mercaptovalérico (3MV).
En una realización de la presente descripción, los copolímeros de politioésteres producidos por los sistemas y procesos descritos en el presente documento son poli(3-hidroxibutirato-co-3-mercaptopropionato)[P(HB-co-3MP)] y otros copolímeros de PTE que tienen sustratos precursores que contienen tiol.
Un aspecto de la presente descripción se refiere a una composición que comprende gránulos de polihidroxialcanoato nativo obtenidos mediante el proceso descrito en el presente documento. Los gránulos nativos producidos de acuerdo con el proceso de la presente descripción se pueden usar para preparar suspensiones estables para el recubrimiento de papel y diferentes materiales fibrosos a base de agua. Los gránulos nativos producidos de acuerdo con el proceso de la presente descripción también se pueden usar para aplicaciones biotecnológicas finas, como matriz para purificaciones de proteínas (perlas bioactivas funcionalizadas). (Grage et al. 2009)
Los gránulos nativos producidos de acuerdo con el proceso de la presente descripción también se pueden usar como reemplazos de microperlas de origen fósil en aplicaciones de cuidado personal, como mejora de la textura o como microperlas y nanoperlas funcionalizadas con diferentes formulaciones.
Un aspecto de la presente descripción se refiere al uso de gránulos de polihidroxialcanoato nativo obtenidos mediante el proceso descrito en el presente documento para la fabricación de un artículo bioplástico o formulación.
En una realización de la presente descripción, los polihidroxialcanoatos producidos de acuerdo con el proceso divulgado en este documento, o utilizando un sistema de cocultivo divulgado en este documento, pueden usarse en cualquiera de las siguientes aplicaciones: como exfoliantes y formadores de películas en el cuidado personal con capacidad para cargar formulaciones; en materiales de embalaje, incluso para alimentos; como películas de mantillo en la agricultura; como portadores de pesticidas y fertilizantes de liberación lenta; en artículos de plástico de un solo uso como productos de higiene, maquinillas de afeitar, utensilios, pañales, bolsas de compras, bastoncillos de algodón, cachorros, cubiertos, platos y pajitas; como fibras en textiles, por ejemplo telas no tejidas; en aplicaciones biomédicas (implantes para ingeniería de tejidos, apósitos para heridas y artículos quirúrgicos); en aplicaciones farmacéuticas tanto para el envasado como para la administración de fármacos, incluyendo dosificación de liberación lenta/a largo plazo) (Williams and Martin 2005); en productos moldeados, revestimientos de papel y como aditivos de rendimiento; para usos como moldeo por inyección, extrusión, termoformado, formación de espuma, impresión 3D, recubrimiento de papel y otros materiales, colas, adhesivos, como aditivo para refuerzo/potenciador de barrera o plastificación o como bloque de construcción para termofijables en pinturas y espumas; en electrónica, muebles, automóviles y edificios. Los expertos en la técnica conocen las aplicaciones de los polihidroxialcanoatos, como se encuentra, por ejemplo, en 'The Handbook of Polyhydroxyalkanoates - Postsynthetic Treatment, Processing and Application' (2020)".
Un aspecto de la presente descripción se refiere al uso de la composición que comprende gránulos de polihidroxialcanoato nativo descritos en el presente documento para la fabricación de un bioplástico.
Un aspecto de la presente descripción se relaciona con el uso de material de proteína unicelular de Cupriavidus necator obtenido mediante el proceso divulgado en el presente documento para uso en un pienso o alimento para animales y/o en un ingrediente para cosméticos y/o productos de cuidado personal. El proceso aquí descrito y/o un sistema de cocultivo descrito en este documento da como resultado la producción de coproductos que se pueden extraer y/o recuperar. Por ejemplo, ingredientes emulsionantes, espumantes y gelificantes para su uso en piensos y/o alimentos; productos completos o fracciones, por ejemplo, oligopéptidos separados, lípidos o carbohidratos con cierto tamaño molecular o aminoácidos libres, ácidos grasos, ácidos nucleicos, nucleótidos o azúcares para diversos usos; proteínas y compuestos bioactivos obtenidos a partir de hidrolizado de biomasa sin PHA para su uso en alimentos, piensos y/o cuidado personal.
Proceso para la producción de piruvato y productos derivados del piruvato.
Una realización de la presente invención se refiere a un proceso para la producción de material proteico unicelular, piruvato y/o productos derivados del piruvato, comprendiendo dicho proceso:
a) proporcionar una materia prima;
b) proporcionar un componente microbiano del sistema de cocultivo como se define en este documento; y
c) poner en contacto la materia prima con el componente microbiano del sistema de cocultivo, fermentando así la materia prima para obtener una composición fermentada que comprende piruvato y/o productos derivados del piruvato,
en el que los productos derivados del piruvato son metabolitos asociados al crecimiento seleccionados de alcoholes, biocombustibles y/o aminoácidos; y/o polihidroxialcanoatos homo y copoliméricos, politioésteres copoliméricos, hidroxialcanoatos monoméricos y/o cianoficina.
En particular, el sistema de cocultivo es un sistema de cocultivo que comprende un componente microbiano y un sustrato,
en el que el componente microbiano comprende o consiste en una primera y una segunda célula microbiana,
en el que la primera y la segunda células microbianas son cepas diferentes de la especie Cupriavidus necator,
en el que el sustrato comprende al menos una primera fuente de carbono y una segunda fuente de carbono, siendo la primera fuente de carbono diferente de la segunda fuente de carbono,
donde la primera célula microbiana es capaz de metabolizar una primera fuente de carbono, y
en el que la primera célula microbiana es capaz de metabolizar la segunda fuente de carbono.
Los productos derivados del piruvato son metabolitos asociados al crecimiento seleccionados entre alcoholes, biocombustibles y/o aminoácidos; y/o polihidroxialcanoatos homo y copoliméricos, politioésteres copoliméricos, hidroxialcanoatos monoméricos y/o cianoficina.
En una realización de la presente descripción, la materia prima se pone en contacto con el componente microbiano del sistema de cocultivo en presencia de un medio de cultivo, en el que dicho medio de cultivo puede comprender una fuente de nitrógeno, como hidróxido de amonio, y/o otras sales y minerales que se requieren para el cultivo de Cupriavidus necator.
Una realización de la presente descripción se refiere a un proceso para la producción de polihidroxialcanoatos, comprendiendo dicho proceso:
a) proporcionar una materia prima;
b) proporcionar un componente microbiano del sistema de cocultivo como se define en este documento; y
c) poner en contacto la materia prima con el componente microbiano del sistema de cocultivo, fermentando así la materia prima para obtener una composición fermentada que comprende polihidroxialcanoatos.
Una realización de la presente descripción se refiere a un proceso para la producción de material proteico unicelular de Cupriavidus necator, comprendiendo dicho proceso:
a) proporcionar una materia prima;
b) proporcionar un componente microbiano del sistema de cocultivo como se define en este documento; y
c) poner en contacto la materia prima con el componente microbiano del sistema de cocultivo, fermentando así la materia prima para obtener una composición fermentada que comprende material de proteína unicelular deCupriavidus necator.
Una realización de la presente descripción se refiere a un proceso para la producción de polihidroxialcanoatos y material proteico unicelular de Cupriavidus necator, comprendiendo dicho proceso:
a) proporcionar una materia prima;
b) proporcionar un componente microbiano del sistema de cocultivo como se define en este documento; y
c) poner en contacto la materia prima con el componente microbiano del sistema de cocultivo, fermentando así la materia prima para obtener una composición fermentada que comprende polihidroxialcanoatos y material proteico unicelular de Cupriavidus necator.
En una realización de la presente descripción, el tamaño del inóculo, tal como la concentración de las dos células microbianas del sistema de cocultivo, está entre 1% v/v y 5% v/v de la composición de fermentación total, como entre 1 %v/v y 4% v/v, como entre 1% v/v y 3% v/v, como entre 1% v/v y 2% v/v, como entre 2% v/v y 3% v/v, como entre 2% v/v y 4% v/v, como entre 2% v/v y 5% v/v, como entre 3% v/v y 4% v/v, como entre 3% v/v y 5% v/v, como entre 4% v/v y 5% v/v del columen/composición de la fermentación total. La composición de fermentación total comprende el inóculo, la materia prima, sal y nutrientes adicionales y agua.
El proceso descrito en este documento comprende una etapa de fermentación (etapa c) durante el cual el cocultivo descrito en este documento convierte dos o más fuentes de carbono presentes en la materia prima en material proteico unicelular, como biomasa, de Cupriavidus necator y/o productos de valor agregado, como el piruvato y/o productos derivados del piruvato, que pueden ser polihidroxialcanoatos homo y copoliméricos, politioésteres copoliméricos, hidroxialcanoatos monoméricos, biocombustibles alcohólicos y no alcohólicos, y/u otros productos valiosos.
La etapa de fermentación se puede realizar, por ejemplo, a través de un proceso de alimentación por lotes.
En una realización de la presente descripción, las dos células microbianas que se encuentran en el sistema de cocultivo se ponen en contacto con la materia prima en momentos diferentes. Por ejemplo, en una realización de la presente descripción, la primera célula microbiana del sistema de cocultivo se pone en contacto primero con la materia prima, y la segunda célula microbiana del sistema de cocultivo se pone en contacto con la materia prima más tarde. En una realización de la presente descripción, la primera célula microbiana y la segunda célula microbiana del sistema de cocultivo se ponen en contacto con la materia prima al mismo tiempo.
En consecuencia, en una realización de la presente descripción, la primera célula microbiana y la segunda célula microbiana del sistema de cocultivo pueden estar juntas en contacto con la materia prima y, por lo tanto, cofermentando el sustrato, durante 12 h o más, tal como para 15 h o más, como para 18 h o más, como para 20 h o más como para 24 h o más, como para 28 h o más, como para 36 h o más, como para 40 h o más, como durante 44 h o más, como durante 48 h o más, como durante 52 h o más, como durante 60 h o más. En algunas realizaciones, la primera célula microbiana se añade antes que la segunda célula microbiana; en algunas otras realizaciones, la segunda célula microbiana se añade antes que la primera célula microbiana. No obstante, la primera y la segunda células microbianas se cultivan juntas durante un cierto período de tiempo, como se define en el presente documento.
El tiempo de adición de la primera y la segunda célula microbiana, así como el tiempo de cocultivo, se optimizan en función del contenido de la fuente de carbono de la materia prima para obtener una alta tasa de consumo de la fuente de carbono y con el objetivo de utilizar toda la fuente de carbono, por ejemplo toda la glucosa y toda la fructosa, en la materia prima.
En una realización de la presente descripción, la etapa c) comprende una primera fase que permite el crecimiento del componente microbiano del sistema de cocultivo, esta fase de crecimiento también se caracteriza por la producción de piruvato y otros metabolitos primarios, como alcoholes, biocombustibles y/o aminoácidos, así como la acumulación de células microbianas, y una segunda fase que permite la producción de productos derivados del piruvato, por ejemplo, polihidroxialcanoatos homo y copoliméricos, politioésteres copoliméricos, hidroxialcanoatos monoméricos y/o cianoficina.
En una realización de la presente descripción, la fase que permite el crecimiento del componente microbiano del sistema de cocultivo se caracteriza por la presencia de un sustrato que comprende dos o más fuentes de carbono y un medio de cultivo que comprende otros nutrientes necesarios para el crecimiento microbiano. componente del sistema de cocultivo, que incluye una o más fuentes de nitrógeno, sales y minerales que pueden no estar presentes en el sustrato. La fuente de nitrógeno puede ser, por ejemplo, hidróxido de amonio.
En una realización de la presente descripción, la fase que permite la producción de polihidroxialcanoatos homo y copoliméricos Z, politioésteres copoliméricos, hidroxialcanoatos monoméricos y/o cianoficina se caracteriza por la alimentación de un medio de cultivo pobre en ciertos nutrientes. Por ejemplo, cuando se van a producir polihidroxialcanoatos, la fase de la fermentación en la etapa c) que permite la producción de los polihidroxialcanoatos se caracteriza porque el medio de cultivo es pobre en nitrógeno. De hecho, normalmente se necesita privación de nitrógeno para el cocultivo descrito en el presente documento para producir eficazmente polihidroxialcanoatos.
En una realización de la presente descripción, se alimenta hidróxido de amonio a la fermentación durante la fase que permite el crecimiento del componente microbiano y la producción de piruvato y metabolitos asociados al crecimiento seleccionados de alcoholes, biocombustiblesy/o aminoácidos pero no durante la fase que permite la producción de PHA.
En una realización de la presente descripción, se alimenta hidróxido de amonio a la fermentación durante la fase que permite el crecimiento del componente microbiano y la producción de piruvato y metabolitos asociados al crecimiento seleccionados de alcoholes, biocombustibles y/o aminoácidos y durante la fase que permite la producción de politioésteres copoliméricos, hidroxialcanoatos monoméricos y/o cianoficina.
En una realización de la presente descripción, la fase que permite el crecimiento del componente microbiano se caracteriza por una tasa de alimentación continua con una materia prima que comprende sacarosa hidrolizada o sacarosa hidrolizada y valerato y un medio de cultivo que comprende una fuente de nitrógeno tal como hidróxido de amonio.
En una realización de la presente descripción, la fase de la etapa c) que permite el crecimiento del componente microbiano y la producción de metabolitos asociados al crecimiento seleccionados de alcoholes, biocombustiblesy/o aminoácidos se caracteriza por una tasa de alimentación continua de la materia prima y del medio de cultivo durante 24 h a 38 h, como 28 h a 38 h, como 30 h a 38 h, como 32 h a 38 h, como durante 34 h a 38 h, como 36 h a 38 h, como 24 h a 34 h, como 24 h a 32 h, como 24 h a 30 h, como 24 h a 28 h, como 24 h a 26 h.
En una realización de la presente descripción, la fase de la etapa c) que permite la producción de los polihidroxialcanoatos se caracteriza por la aplicación de condiciones limitadas de nitrógeno después de aproximadamente 24 h de inoculación, como después de aproximadamente 32 h de inoculación, como después de aproximadamente 34 h de la inoculación, como después de unas 36 h de la inoculación, como después de unas 38 h de la inoculación, como después de unas 40 h de la inoculación, como después de unas 42 h de la inoculación, como después de unas 44 h de la inoculación, como después de aproximadamente 46 h de inoculación, como después de aproximadamente 48 h de inoculación, como después de aproximadamente 30 a 38 h de inoculación. "Inoculación", como se usa en el presente documento, es el momento en el que el componente microbiano, por ejemplo, la primera y la segunda células microbianas al mismo tiempo, o al menos una de las primeras o segundas células microbianas, se pone en contacto con la materia prima.
En una realización de la presente descripción, la fase de la etapa c) que permite la producción de los polihidroxialcanoatos se caracteriza por la alimentación continua de la materia prima y del medio de cultivo, en donde el medio de cultivo no comprende una fuente de nitrógeno, tal como no comprende hidróxido de amonio.
En una realización de la presente descripción, la fase de la etapa c) que permite la producción de los polihidroxialcanoatos se caracteriza por la alimentación continua de la materia prima y del medio de cultivo, en el que el medio de cultivo no comprende una fuente de nitrógeno, durante 24 h a 38 h, como de 28 h a 38 h, de 30 h a 38 h, de 32 h a 38 h, de 34 h a 38 h, de 36 h a 38 h, de 24 h a 34 h , como 24 h a 32 h, como 24 h a 30 h, como 24 h a 28 h, como 24 h a 26 h.
Una realización de la presente descripción se refiere a un proceso para la producción de polihidroxialcanoatos homo y copoliméricos, politioésteres copoliméricos, hidroxialcanoatos monoméricos, comprendiendo dicho proceso:
a) proporcionar una materia prima;
b) proporcionar un componente microbiano de un sistema de cocultivo como se define en este documento; y
c) i) poner en contacto la materia prima con las dos células microbianas del componente microbiano simultánea o secuencialmente como se describe en este documento,
c) ii) aplicar una tasa de alimentación continua de materia prima y medio de cultivo, en donde el medio de cultivo comprende una fuente de nitrógeno, durante 24 a 38 h,
c) iii) aplicar una tasa de alimentación continua de materia prima y un medio de cultivo pobre en nitrógeno durante 12 a 48 h, aplicando así condiciones limitantes de nitrógeno,
fermentando así la materia prima para obtener una composición fermentada que comprende polihidroxialcanoatos homo y copoliméricos, politioésteres copoliméricos y/o hidroxialcanoatos monoméricos.
Una realización de la presente descripción se refiere a un proceso para la producción de piruvato y/o productos derivados del piruvato, en los que los productos derivados del piruvato son metabolitos asociados al crecimiento seleccionados entre alcoholes, biocombustibles y/o aminoácidos; y/o polihidroxialcanoatos homo y copoliméricos, politioésteres copoliméricos, hidroxialcanoatos monoméricos y/o cianoficina, comprendiendo dicho proceso:
a) proporcionar una materia prima;
b) proporcionar un componente microbiano de un sistema de cocultivo como se define en este documento; y
c)
i) poner en contacto la materia prima con las dos células microbianas del componente microbiano simultánea o secuencialmente como se describe en este documento,
ii) aplicar una tasa de alimentación continua de materia prima y medio de cultivo, en el que el medio de cultivo comprende una fuente de nitrógeno, durante 24 a 38 h, como de 24 a 48 h, como de 32 a 56 h, como de 30 a 62 h, como por no más de 96 h;
fermentando así la materia prima para obtener una composición fermentada que comprende piruvato y/o productos derivados del piruvato, en los que los productos derivados del piruvato son metabolitos asociados al crecimiento seleccionados entre alcoholes, biocombustibles y/o aminoácidos; y/o polihidroxialcanoatos homo y copoliméricos, politioésteres copoliméricos, hidroxialcanoatos monoméricos y/o cianoficina.
Una de las ventajas del proceso aquí descrito es que permite alcanzar una alta densidad celular (HCD) y un alto contenido de producto, por ejemplo un alto contenido de polihidroxialcanoatos. Por lo tanto, en una realización de la presente descripción, un producto del proceso o un coproducto (por ejemplo, cuando también se producen y recuperan PHA) del proceso es la propia biomasa, como la proteína unicelular de Cupriavidus necator, que también es un producto valioso y puede usarse como se describe en este documento.
En una realización de la presente descripción, la materia prima proporcionada en el proceso descrito en este documento comprende una o más fuentes de carbono seleccionadas del grupo que consiste en glucosa, fructosa, ácido propiónico, ácido valérico, ácido levulínico, ácido fórmico, ácido butírico, ácido cítrico, ácido acético, CO2, gas de síntesis, ácidos grasos de cadena corta y/o media, mercaptoalcanoato, glicerol, ácido glucónico, xilosa, N-acetil-D-glucosamina (NAG), benzoato, fenol, etanol, metanol, ácido 3-mercaptopropiónico (3MP), ácido 3-mercaptovalérico (3MV), ácido 3,3'-tiodipropiónico (TDP), ácido 3,3'-ditiodipropiónico (DTDP) y ácido 3-mercaptovalérico (3MV).
En una realización de la presente descripción, la materia prima comprende o consiste en melaza, como materiales ricos en sacarosa, y en donde la materia prima se deriva de la caña de azúcar y/o remolacha azucarera. Melaza, como la caña de azúcar. y/o melaza de remolacha azucarera, se utilizan comúnmente para obtener sacarosa -azúcar- para la industria alimentaria. Sin embargo, los productores de todo el mundo están buscando productos alternativos y más valiosos que puedan obtenerse de la melaza. La fermentación de melazas, y en particular de sacarosa, por microorganismos como Cupriavidus necator abre una gran variedad de productos que se pueden obtener a partir de sacarosa, tales como piruvato y productos derivados de piruvato como se define aquí.
En una realización de la presente descripción, la materia prima proporcionada en el proceso descrito en el presente documento comprende glucosa y fructosa.
En una realización de la presente descripción, la materia prima es sacarosa hidrolizada. Por ejemplo, la materia prima puede ser melaza hidrolizada.
En una realización de la presente descripción, el proceso comprende además una etapa de pretratamiento que comprende hidrolizar una materia prima que comprende sacarosa para obtener la materia prima.
En una realización de la presente descripción, la materia prima comprende una concentración de sacarosa del 40% p/v o más, como 50% p/v o más, o como 60% p/v o más, como 70% p/v o más, tal como aproximadamente el 70% p/v.
En una realización de la presente descripción, la materia prima comprende una concentración de glucosa del 20% p/v o más, como 25% p/v o más o como 30% p/v o más, como 35% p/v o más, tal como aproximadamente el 35% p/v.
En una realización de la presente descripción, la materia prima comprende una concentración de fructosa del 20% p/v o más, como 25% p/v o más, o como 30% p/v o más, como 35% p/v o más, tal como aproximadamente 35% p/v.
En una realización de la presente descripción, la glucosa y la fructosa representan al menos la 60%, tal como al menos el 70% tal como al menos el 80%, como por lo menos el 90%, como por lo menos el 95%, como aproximadamente el 100% del carbono orgánico en la materia prima. Por lo tanto, la glucosa y la fructosa pueden ser las únicas fuentes de carbono disponibles para las cepas de Cupriavidus necator del sistema de cocultivo de la presente descripción.
Sin embargo, en una realización de la presente descripción, la materia prima comprende otras fuentes de carbono además de glucosa y fructosa. Por ejemplo, la materia prima también puede comprender cualquiera de ácido propiónico, ácido valérico, ácido levulínico, ácido fórmico, ácido butírico, ácido cítrico, ácido acético, CO2, gas de síntesis, y/o ácido graso de cadena media, mercaptoalcanoato, glicerol, ácido glucónico, xilosa, N-acetil-D-glucosamina (NAG), benzoato, fenol, etanol, metanol, ácido 3-mercaptopropiónico (3MP), ácido 3-mercaptovalérico (3MV), ácido 3,3'-tiodipropiónico (TDP), ácido 3,3'-ditiodipropiónico (DTDP) y ácido 3-mercaptovalérico (3MV). Estas fuentes de carbono adicionales pueden estar presentes en la materia prima según cómo se hidrolice la materia prima, por ejemplo, según la temperatura y el pH que se usen durante la hidrólisis termoácida, o según el tiempo de hidrólisis de la materia prima. Estas fuentes de carbono adicionales también se pueden agregar a la materia prima para el proceso, ya que el sistema de cocultivo de la presente descripción puede utilizar ventajosamente cualquiera de las fuentes de carbono adicionales junto con glucosa y fructosa para producir ciertos productos derivados del piruvato. Por ejemplo, si el ácido levulínico (ácido 4-cetovalérico) está presente en la materia prima, el sistema de cocultivo descrito en este documento puede usarlo para la producción de poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato)(PHBV) y/o poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato-co-4-hidroxivalerato)(P(3HB-co-3HV-co-4HV).
Una de las ventajas del proceso de la presente descripción es que permite el consumo de los azúcares presentes en la materia prima a un ritmo similar, de igual manera y completamente, o casi completamente, ya que el modo de lote alimentado utilizado para la fermentación implica que se agrega nueva materia prima a intervalos de tiempo regulares. En particular, cuando la materia prima comprende en su mayor parte glucosa y fructosa, el proceso de la presente descripción permite un consumo igual de los dos sustratos, evitando así problemas de acumulación de sustrato. Por lo tanto, el proceso de la presente descripción permite un uso eficiente de toda la fuente de carbono presente en la materia prima, gracias al sistema de cocultivo descrito en este documento.
En una realización de la presente descripción, la concentración de glucosa en la composición fermentada, por lo tanto al final del proceso, es de 20 g/L o menos, como de 15 g/L o menos, como de 10 g/L o menos, como de 5 g/L o menos, como de 1 g/L o menos.
En una realización de la presente descripción, la concentración de fructosa en la composición fermentada es de 20 g/L o menos, como 15 g/L o menos, como 10 g/L o menos, como 5 g/L o menos, tal como de 1 g/L o menos.
En una realización de la presente descripción, la concentración de fructosa y glucosa juntas (la suma de sus concentraciones) en la composición fermentada es de 20 g/L o menos, como de 15 g/L o menos, como de 10 g /L o menos, como de 5 g/L o menos, como de 1 g/L o menos.
En una realización de la presente descripción, la glucosa y la fructosa son las únicas fuentes de carbono para las células microbianas.
Se puede obtener una materia prima adecuada para el proceso de la presente descripción mediante la hidrólisis de determinadas materias primas, como la melaza y otras materias primas ricas en sacarosa. Por lo tanto, en una realización de la presente descripción, el proceso comprende una etapa de pretratamiento en el que la materia prima se trata, generalmente se hidroliza, para convertirse en la materia prima. Los métodos para hidrolizar materias primas tales como melazas y otras materias primas ricas en sacarosa son conocidos en la técnica.
En una realización de la presente descripción, la hidrólisis de la materia prima en la etapa de pretratamiento es hidrólisis termoácida o hidrólisis biológica. Las características de la materia prima pueden variar según las condiciones utilizadas para la hidrólisis de la materia prima. Por ejemplo, si se usa hidrólisis termoquímica, una temperatura más alta y un tiempo de hidrólisis más largo pueden convertir aún más parte de la fructosa en ácido levulínico, ácido fórmico, ácido acético y HMF. El ácido levulínico puede conducir a la producción de copolímeros, por ejemplo, la producción de p HbVV. En el caso de la hidrólisis biológica de la sacarosa, una enzima específica cataliza la reacción y, por lo tanto, la sacarosa hidrolizada comprende o consiste en monoazúcares (glucosa y fructosa) en proporción molar equivalente.
En una realización de la presente descripción, la hidrólisis de la materia prima en la etapa de pretratamiento es una hidrólisis biológica y utiliza enzimas, como la enzima beta-fructofuranosidasa, células bacterianas o de levadura activas o en reposo, como Saccharomyces cerevisiae en reposo. células que comprenden la enzima beta-fructofuranosidasa en su pared celular.
En una realización de la presente descripción, la materia prima comprende sacarosa y una o más fuentes de carbono seleccionadas del grupo que consiste en glucosa, fructosa, ácido propiónico, ácido valérico, ácido levulínico, ácido fórmico, ácido butírico, ácido cítrico, ácido acético, CO2, gas de síntesis, ácido graso de cadena media y corta, mercaptoalcanoato, glicerol, ácido glucónico, xilosa, N-acetil-d-glucosamina (NAG), benzoato, fenol, ácido 3-mercaptopropiónico (3MP), etanol, metanol, 3 -ácido mercaptovalérico (3MV), ácido 3,3'-tiodipropiónico (TDP), ácido 3,3'-ditiodipropiónico (DTDP) y ácido 3-mercaptovalérico (3MV).
En una realización de la presente descripción, una o más fuentes de carbono seleccionadas del grupo que consiste en glucosa, fructosa, ácido propiónico, ácido valérico, ácido levulínico, ácido fórmico, ácido butírico, ácido cítrico, ácido acético, CO2, gas de síntesis, y corto y /o ácido graso de cadena media, mercaptoalcanoato, glicerol, ácido glucónico, xilosa, N-acetil-d-glucosamina (NAG), benzoato, fenol, etanol, metanol, ácido 3-mercaptopropiónico (3MP), ácido 3-mercaptovalérico (3MV) , se añaden a la materia prima ácido 3,3'-tiodipropiónico (TDP), ácido 3,3'-ditiodipropiónico (DTDP) y ácido 3-mercaptovalérico (3MV) después o durante la etapa de pretratamiento.
En una realización de la presente descripción, la temperatura de la etapa de fermentación c) está entre 25 °C y 35 °C, como entre 27 °C y 33 °C, como entre 29 °C y 31 °C, como aproximadamente 30°C.
En una realización de la presente descripción, el pH de la etapa de fermentación c) está entre pH 6 y pH 9, como entre pH 6,5 y 8,5, como entre pH 6,7 y 8,2.
En una realización de la presente descripción, el tiempo total para la fermentación en la etapa c) es de 36 h a 96 h, como de 36 h a 84 h, de 48 h a 84 h, de 36 h a 68 h, como 48 h a 68 h, como 48 h a 72 h, como aproximadamente 62 h. El tiempo total de fermentación se puede dividir en una primera fase y una segunda fase, en la que la primera fase comprende la alimentación de materia prima y medio de cultivo, comprendiendo el medio de cultivo una fuente de nitrógeno, y en la que la segunda fase comprende la alimentación de materia prima y un medio de cultivo pobre en nitrógeno. En algunas realizaciones de la presente descripción, la alimentación de materia prima y medio de cultivo, comprendiendo el medio de cultivo una fuente de nitrógeno, se produce durante todo el tiempo de fermentación.
En una realización de la presente descripción, el oxígeno disuelto para la fermentación en la etapa c) está entre 0% v/v y 60% v/v de saturación, como entre 5% v/v y 60% v/v de saturación, como entre 10% v/v y 60% v/v, como entre 10% v/v y 40% v/v, como entre 10% v/v y 30% v/v, tal como aproximadamente el 20% v/v de saturación.
Para controlar la concentración de oxígeno disuelto durante la fermentación, se puede suministrar aire comprimido. Por lo tanto, en una realización de la presente descripción, la etapa de fermentación c) comprende aire comprimido y/o suministro de oxígeno entre 0,1 y 2,0 vvm, como entre 0,5 y 2,0 vvm (volumen/volumen/minuto), como entre 0,5 y 1,0 vvm.
En una realización de la presente descripción, la etapa de fermentación c) comprende agitación mecánica. Esto ayuda tanto a mantener una cierta concentración de oxígeno disuelto como a mantener una distribución homogénea de células, sustratos, oxígeno y otros nutrientes dentro de la composición de fermentación.
En una realización de la presente descripción, la etapa a) comprende además una etapa de esterilización de la materia prima. Por ejemplo, la esterilización se puede realizar mediante autoclave, pasteurización, pascalización, radiación ionizante o radiación UV.
En una realización de la presente descripción, el producto derivado del piruvato obtenido mediante el proceso descrito en el presente documento es un hidroxialcanoato monomérico, un polihidroxialcanoato (PHA) y/o un copolímero de politioéster (PTE).
En una realización de la presente descripción, el proceso comprende además una etapa d) de recuperación del copolímero de hidroxialcanoato monomérico, polihidroxialcanoato (PHA) y politioéster (PTE) y/o a el material proteico unicelular.
En una realización de la presente descripción, recuperar los polihidroxialcanoatos y/o los copolímeros de politioésteres en la etapa d) comprende lisar las células microbianas en la composición fermentada por células bacterianas de la especie Bacillus pumilus; centrifugación y/o filtración. En particular, es ventajoso recuperar los polihidroxialcanoatos y/o los copolímeros de politioésteres con ayuda de células bacterianas de la especie Bacillus pumilus, como se describe en detalle en WO 2016/085396, ya que este método no contiene disolventes, es rentable y permite la recuperación de polihidroxialcanoatos y/o los politioésteres en forma de gránulos nativos. Este método de extracción convierte la biomasa no PHA en biomasa hidrolizada, que se puede utilizar como hidrolizado de proteína unicelular (SCP). Por lo tanto, se pueden recuperar dos o más productos del mismo proceso y usarse para diversas aplicaciones, como se describe en el presente documento.
En una realización de la presente descripción, la composición fermentada comprende polihidroxialcanoatos, donde los polihidroxialcanoatos producidos comprenden o consisten en poli-3-hidroxibutirato (PHB), polihidroxivalerato (PHV), polihidroxihexanoato (PHH) y/o poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato)(PHBV) y/o poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato-co-4-hidroxivalerato)(P(3HB-co-3HV-co-4HV)), o una combinación de los mismos.
En una realización de la presente descripción, la composición fermentada comprende polihidroxialcanoatos, en donde los polihidroxialcanoatos producidos comprenden poli-3-hidroxibutirato (PHB).
En una realización de la presente descripción, la composición fermentada comprende polihidroxialcanoatos, en la que los polihidroxialcanoatos producidos comprenden polihidroxivalerato (PHV).
En una realización de la presente descripción, la composición fermentada comprende polihidroxialcanoatos, en la que los polihidroxialcanoatos producidos comprenden copolímero de polihidroxivalerato (PHV).
En una realización de la presente descripción, la composición fermentada comprende polihidroxialcanoatos, en la que los polihidroxialcanoatos producidos comprenden polihidroxihexanoato (PHHx).
En una realización de la presente descripción, la composición fermentada comprende polihidroxialcanoatos, en la que los polihidroxialcanoatos producidos comprenden copolímero de polihidroxihexanoato (PHHx).
En una realización de la presente descripción, la composición fermentada comprende polihidroxialcanoatos, en donde los polihidroxialcanoatos producidos comprenden poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato)(PHBV).
En una realización de la presente descripción, la composición fermentada comprende polihidroxialcanoatos, donde los polihidroxialcanoatos producidos comprenden poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato-co-4-hidroxivalerato)(P(3HB-co-3HV-co-4HV) ).
En una realización de la presente descripción, la composición fermentada comprende polihidroxialcanoatos, en los que los polihidroxialcanoatos producidos consisten en poli-3-hidroxibutirato (PHB).
En una realización de la presente descripción, la composición fermentada comprende polihidroxialcanoatos, en la que los polihidroxialcanoatos producidos comprenden polihidroxivalerato (PHV).
En una realización de la presente descripción, la composición fermentada comprende polihidroxialcanoatos, en la que los polihidroxialcanoatos producidos comprenden polihidroxihexanoato (PHH).
En una realización de la presente descripción, la composición fermentada comprende polihidroxialcanoatos, en donde los polihidroxialcanoatos producidos comprenden poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato)(PHBV).
En una realización de la presente descripción, la composición fermentada comprende polihidroxialcanoatos, donde los polihidroxialcanoatos producidos comprenden poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato-co-4-hidroxivalerato)(P(3HB-co-3HV-co-4HV) ).
En una realización de la presente descripción, los polihidroxialcanoatos producidos tienen un peso molecular promedio de al menos 100 kDa, como entre 100 kDa y 2000 kDa, como entre 200 kDa y 2000 kDa, como entre 300 kDa y 2000 kDa, como entre 400 kDa y 1500 kDa, como entre 500 kDa y 1000 kDa, como entre 800 kDa y 2000 kDa, como entre 500 kDa y 1500 kDa.
En una realización de la presente descripción, los polihidroxialcanoatos producidos tienen una longitud de cadena promedio de 3 a 6 carbonos, como una longitud de cadena promedio de 4 a 5 carbonos, como una longitud de cadena promedio de 3 carbonos, como una longitud de cadena promedio de 4 carbonos, como una longitud de cadena media de 5 carbonos, como una longitud de cadena media de 6 carbonos.
En una realización de la presente descripción, los polihidroxialcanoatos producidos son un copolímero de poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato)(PHBV) que tiene un contenido de 3-hidroxivalerato de entre 5% en moles y 40% en moles, tales como entre 5% en moles y 35% en moles, tales como entre 5% en moles y 30% en moles, tales como entre 5% en moles y 25% en moles, tales como entre 5% en moles y 20% en moles, tales como entre 5% en moles y 15% en moles, tales como entre 5% en moles y 10% en moles, tales como entre 10% en moles y 20% en moles, tales como entre 15% en moles y 20% en moles, tales como entre 10% en moles y 30% en moles, tales como entre 20% en moles y 40% en moles, tales como entre 15% en moles y 35% en moles, tales como entre 10% en moles y 25% en moles.
En una realización de la presente divulgación, los polihidroxialcanoatos producidos son un homopolímero de poli(3-hidroxibutirato) y un copolímero de poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato)(PHBV) que tiene un contenido de 3-hidroxivalerato de entre 5% en moles y 40% en moles, tal como entre 5% en moles y 35% en moles, tal como entre 5% en moles y 30% en moles, tal como entre 5% en moles y 25% en moles, tal como entre 5% en moles y 20% en moles, tal como entre 5% en moles y 15% en moles, tal como entre 5% en moles y 10% en moles, tal como entre 10% en moles y 20% en moles, tal como entre 15% en moles y 20% en moles, tal como entre 10% en moles y 30% en moles, tal como entre 20% en moles y 40% en moles, tal como entre 15% en moles y 35% en moles, tal como entre 10% en moles y 25% en moles
En una realización de la presente descripción, los polihidroxialcanoatos son gránulos de polihidroxialcanoato nativo con peso molecular y cristalinidad intactos.
En una realización de la presente descripción, el proceso descrito aquí que comprende el uso del sistema de cocultivo descrito aquí permite la producción de polihidroxialcanoatos a un título más alto en comparación con un monocultivo de una cepa de Cupriavidus necator, siempre que se utilicen las mismas condiciones de cultivo.
En una realización de la presente descripción, el título de polihidroxialcanoatos producidos es de al menos 3 g/L, tal como al menos 8 g/L, tal como al menos 10 g/L, 15 g/L, tal como al menos 20 g /L, tal como al menos 25 g/L, tal como al menos 30 g/L, tal como al menos 35 g/L, tal como al menos 40 g/L, tal como al menos 45 g/L, tal como al menos 50 g/L, tal como al menos 55 g/L, tal como al menos 60 g/L, tal como al menos 65 g/L, tal como al menos 70 g/L, tal como al menos 73 g/ L, tal como al menos 75 g/L, tal como al menos 80 g/L, tal como al menos 85 g/L, tal como al menos 90 g/L, tal como al menos 91 g/L, tal como al menos al menos 95 g/L, tal como al menos 100 g/L, tal como al menos 110 g/L, tal como al menos 125 g/L, tal como al menos 135 g/L, tal como al menos 150 g/L.
En una realización de la presente descripción, los polihidroxialcanoatos producidos constituyen al menos el 50% p/p, tal como al menos el 55% p/p, tal como al menos el 60% p/p, tal como al menos el 65% p/p, tal como al menos el 70% p/p, tal como al menos el 75% p/p, tal como al menos el 80% p/p, tal como al menos el 85% p/p, tal como al menos el 90% p/p del peso seco de la célula.
En una realización de la presente descripción, el proceso descrito en el presente documento comprende además una etapa de procesamiento del polihidroxialcanoato. Por ejemplo, poli-3-hidroxibutirato (PHB), polihidroxivalerato (PHV), polihidroxihexanoato (PHH) y/o poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato)(PHBV) y/o poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato-co-4-hidroxivalerato)(P(3HB-co-3HV-co-4HV)), o una combinación de los mismos. Por ejemplo, el polihidroxialcanoato se puede usar para hacer resinas poliméricas, látex, y/o materiales de película para uso en empaques, revestimientos, textiles, muebles y más.
En una realización de la presente descripción, el producto derivado del piruvato es un biocombustible seleccionado del grupo que consiste en butanol, isobutanol, 3-metil-1-butanol e isopropanol.
En una realización de la presente descripción, el proceso descrito en el presente comprende además una etapa d) de recuperación del butanol, isobutanol, 3-metil-1-butanol, y/o isopropanol.
En una realización de la presente descripción, el producto del proceso descrito en el presente documento es material de proteína unicelular de Cupriavidus necator.
Por lo tanto, en una realización de la presente descripción, el proceso descrito en el presente documento comprende recuperar el material de proteína unicelular de la composición fermentada en la etapa d) mediante el uso de células bacterianas de la especie Bacillus pumilus. Este método de recuperación se describe en Ibrahim et al., 2020, WO 2016/085396.
En una realización de la presente descripción, el material proteico de una sola célula recuperado se usa en piensos o alimentos para animales, y/o como ingrediente para cosméticos y/o productos de cuidado personal.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Hidrólisis de sustratos ricos en sacarosa en sus monoazúcares
Materiales y métodos:
Se utilizaron tres sustratos ricos en sacarosa diferentes de la industria de la remolacha azucarera, melaza, jugo espeso y sacarosa cristalina (contenido de sacarosa de 45 - 49, 70 - 75 y 99 - 100% p/v, respectivamente). Los sustratos se hidrolizaron en las siguientes condiciones: hidrólisis termoácida a pH 2,6 - 3,0 y temperatura controlada de 121°C, durante un período de 40, 60 u 80 minutos. Se hidrolizaron preparaciones de sustrato de Melaza y jugo espeso con su concentración original (100% p/v). La sacarosa cristalina se hidrolizó al 70% p/v concentración en agua.
Se pueden utilizar otros métodos de hidrólisis de sacarosa, como la hidrólisis enzimática (invertasa, EC 3.2.1.26) o la invertasa en células bacterianas o de levadura activas o en reposo, como método alternativo de base biológica.
El análisis de azúcares se realizó mediante un sistema de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (Agilent HPLC 1260 Infinity II Quaternary System) que consiste en una columna Bio-Rad Aminex HPX-87H operada a 50 °C y utilizando ácido sulfúrico 5 mM como base móvil. fase con un caudal de 0,5 mL/min. El sistema estaba equipado con un detector de índice de refracción, RID. El análisis cuantitativo se realizó frente a soluciones estándar de concentración definida de sacarosa de grado analítico (ACROS Organics, Bélgica), fructosa (Alfa Aesar) y glucosa (VWR Chemicals).
Resultados:
En las condiciones de hidrólisis optimizadas (121 °C durante 40 min con un pH inicial ajustado a 2,6 - 2,8), una conversión completa de sacarosa en la solución preparada (70% p/v) se logró, 97 - 100% p/v (análisis HPLC), correspondientes a las concentraciones equivalentes de sus monoazúcares, glucosa y fructosa (1:1 p/p). Se aplicó el mismo método de hidrólisis a todos los sustratos ricos en sacarosa (melaza y jugo espeso).
Ejemplo 2 - Cultivo y preparación de inóculo de las cepas DSM 428 y DSM 545 para monocultivo y cocultivo de cepas de Cupriavidus necator
Materiales y métodos:
Las cepas utilizadas en el presente estudio fueron Cupriavidus necator DSM 545 y Cupriavidus necator DSM 428 (anteriormente conocidas como Alcaligenes eutrophus, Ralstonia eutropha y Wautersia eutropha).
Las condiciones de cultivo y los medios utilizados para las dos cepas se optimizaron para lograr un crecimiento y una síntesis de polímeros simultáneos.
En las diferentes etapas del proceso se utilizaron los siguientes medios:
- Medio de activación y precultivo (Tryptic soy broth, TSB, OXOID Ltd., Inglaterra): Este medio solo se utilizó para activar los microorganismos antes de preparar los cultivos de semillas; TSB se complementó con 1 g/L glucosa durante la activación de ambas cepas C. necator DSM 428 y C. necator DSM 545. Se añadió agar (16 g/L) para la preparación de cultivos sólidos en placas.
- Medio de siembra (medio de sales minerales, MSM-1): este medio se utilizó para cultivar ambas cepas individualmente en matraces para lograr un inóculo apropiado de cada cepa que podrá crecer de manera óptima en el medio de producción, ya sea en matraces o en biorreactor. MSM-1 contiene los siguientes componentes en gramo/litro: Na2HPO4.12H2O, 9; KH2PO4, 1,5; NH4Cl, 1,0 (como principal fuente de nitrógeno); MgSO4.7H2O, 0,2; NH4 Fe(III)-citrato, 0,0012; CaCl2.2H2O, 0,02. m Sm -1 se complementó con 1 ml de solución de oligoelementos-1 (TES-1) que contenía los siguientes componentes en gramos/litro: EDTA, 50,0; FeCla, 8,3; ZnCI2, 0,84; CuCb .2H2O, 0,13; CoCl2.6H2O, 0,1; MnCl2.6H2O, 0,016; y H3BO3, 0,1. Los monoazúcares se agregaron por separado después de la esterilización, fructosa paraC.necatorDSM 428 y glucosa paraC.necatorDSM 545. El pH del cultivo se ajustó asépticamente después de la esterilización. (Schlegel etal., 1961; Ibrahim y Steinbüchel, 2009)
- Medio de producción (MSM-2) (Mozumder et al. 2014): este medio fue utilizado para el crecimiento y la síntesis de polímeros por las dos cepas en sistemas de monocultivo o cocultivo. MSM-2 contiene los siguientes componentes en gramo/lotro: ácido cítrico, 1,87; KH2PO4, 13,3; (NH4)2SO4 , 4,0 (como fuente de nitrógeno); MgSO4.7H2O, 1,2. Los componentes se complementaron con 10 ml de solución de oligoelementos-2 (TES-2) que contenía los siguientes componentes en gramos/litro: H3BO3 , 0,093; FeSO4.7H2O, 10; ZnSO4.7H2O, 2,25; MnSO4.7H2O, 0,5; (NH4)6MoyO24, 0,1; CaCl2.2H2O, 0,2; CuSO4.5H2O, 1,0. La solución de oligoelementos también contenía 10 ml/L de HCl concentrado al 37%. Los sustratos de azúcar o los sustratos ricos en sacarosa hidrolizada (preparados como se describe en el Ejemplo 1) se añadieron por separado después de la esterilización. El pH del cultivo se ajustó asépticamente después de la esterilización.
- Preparación del inóculo de cocultivo (semilla): Previo a la inoculación en medio de siembra, ambas cepas se activaron individualmente sobre TSB sólido en placas durante 20-24h. Posteriormente, una sola colonia de la placa activada de cada cepa se usó por separado para inocular dos frascos de precultivo de TSB que contenían 1 g/L glucosa, un matraz para cada cepa. Después de que el precultivo de TSB haya crecido durante 24 h, ambas cepas lograron una densidad óptica relativamente similar de cada cepa (OD60012 -16). Los cultivos de semillas de las dos cepas (MSM-1) se inocularon individualmente utilizando 5%(v/v) inóculo de precultivos de TSB en matraces Erlenmeyer de 250-mL o 1-L con 50 o 200 mL del medio de siembra, MSM-1, respectivamente, suplementado con sustrato individual. Después de 24-26 h de incubación a 30 °C y agitación a 180 rpm, se produjo el crecimiento de C. necatorDSM 428 y C. necator DSM 545 alcanzaron una densidad óptica similar (OD60012 - 16).
Los inóculos optimizados se usaron individualmente o juntos para probar el crecimiento de la cepa de tipo salvaje y la cepa mutante individualmente o en un modo de cultivo conjunto. El cultivo se realizó en matraces de agitación con MSM-2, suplementado con un azúcar o ambos azúcares puros, o el producto de hidrólisis de sustratos ricos en sacarosa. En el modo de cultivo por lotes probado en matraz, se lograron contenidos de O.D., CDW y PHA comparables mediante sistemas de monocultivo y cocultivo (datos no mostrados).
El contenido de polihidroxialcanoato en las células microbianas se analizó mediante cromatografía de gases, GC:
Las células secas se sometieron a condiciones de metanólisis en cloroformo y metanol ácido (H2SO4 al 15%) durante 3-4 horas a 100 °C. La fase de cloroformo separada se sometió a análisis GC para medir cuantitativamente el contenido de PHA frente a estándares de PHA puro. Condiciones de GC: El sistema utilizado fue Agilent 7890B, equipado con columna Zebron ZB-5HT Inferno (15 m * 0,32 mm * 0,1 um) y detector FID operado a 380°C. Se utilizó hidrógeno como gas portador. La temperatura del horno se programó para aumentar de 70°C a 350°C (10°C/min).
Conclusión:
La preparación optimizada del inóculo ayudó a preparar un inóculo activo con una densidad celular similar a la de ambas cepas. Cambio de la proporción de inóculo entre las dos cepas y/o el momento del cocultivo (momento en el que se agrega la segunda o la primera cepa al cultivo de producción) puede ayudar a optimizar el consumo de azúcar y alcanzar una mayor tasa de crecimiento y productividad de polímeros.
Ejemplo 3 - Fermentación semicontinua con monocultivo de Cupriavidus necator DSM 545 para la producción de PHB
Materiales y métodos:
La cepa utilizada fue C. necator DSM 545. La producción de PHA se llevó a cabo en el fermentador estéril in situ Biostat C 7-L. El cultivo se realizó en el medio de producción MSM-2, preparado como se describe en el Ejemplo 2. El volumen de fermentación inicial fue de 4 L. La temperatura de cultivo se controló a 30°C y el pH a 6,8-7,5 mediante NaOH (3M) o HCl (3N) . Hidróxido de amonio (NH4OH, 12,5% v/v) se utilizó para el control del pH y como suministro de nitrógeno durante la 1' etapa del proceso de fermentación por lotes alimentados para apoyar el crecimiento de alta densidad celular. Se aplicó una condición limitada de nitrógeno cambiando el amonio por hidróxido de sodio para desencadenar la etapa de biosíntesis de PHA, después de 36-38 horas de la inoculación. El oxígeno disuelto (dO2) se controló al 20% (v/v) de saturación, usando suministro de aire comprimido 0,5-2,0 (vvm) y agitando 400-900 rpm. La solución de alimentación fue 70% p/v sacarosa hidrolizada, preparada como se describe en el Ejemplo 1. Se aplicaron condiciones limitadas de nitrógeno después de 24 h de la inoculación.
Resultados:
La glucosa que utiliza la cepa C. necator DSM 545 se cultivó individualmente como monocultivo y se alimentó con solución de sacarosa hidrolizada. En este ejemplo, investigamos la incapacidad informada del mutante que utiliza glucosa para consumir por completo monoazúcares de sacarosa, glucosa y fructosa durante la fermentación por lotes, que suele ser el modo de cultivo preferido en la industria de PHA para alcanzar un crecimiento de alta densidad celular y acumulación de polímeros. El cultivo se alimentó con solución de sacarosa hidrolizada (70% p/v). La Figura 1 muestra que la cepa DSM 545 pudo utilizar azúcares, glucosa y fructosa, al menos hasta cierto punto durante la alimentación. Se puede alcanzar una densidad celular relativamente alta, 70 g/L y contenido de PHB del 59% p/p. Sin embargo, durante la fase estacionaria temprana (que corresponde a la fase de biosíntesis de PHA), la fructosa se acumula, lo que significa que la cepa DSM 545 prefiere la glucosa a la fructosa durante la fase de crecimiento de alta densidad celular y biosíntesis de polímeros. La acumulación de fructosa ocurrió a pesar de que la alimentación se detuvo 2 horas antes de la cosecha (a las 51 horas). Se han informado resultados similares antes para esta cepa cuando se cultiva en presencia de azúcares, glucosa y fructosa (Dalsasso et al. 2019). Un estudio proteómico realizado por Raberg et al. (2011), también ha demostrado que la glucosa puede apoyar la biosíntesis de PHA mediante la cepa mutante más que la fructosa.
Conclusión:
Cupriavidus necator DSM 545 prefiere usar glucosa sobre fructosa durante la biosíntesis de PHA y también para el crecimiento de alta densidad celular.
Ejemplo 4 - Fermentación discontinua alimentada con cocultivo de Cupriavidus necator DSM 428 y Cupriavidus necator DSM 545 para la producción de PHB a partir de sacarosa hidrolizada
Materiales y métodos:
El sistema de cocultivo para la producción de PHB a partir de sacarosa hidrolizada fue realizado por las dos cepas C. necator H16 (DSM 428) y C. necator H1G+3 (Ds M 545). La producción fermentativa de PHB se realizó en el fermentador de vidrio Applikon BioBundle 7-L. La fermentación comenzó con 3 L de MSM-2 como volumen inicial, y la temperatura se controló a 30°C y el pH a 6,8-7,5. El oxígeno disuelto (dO2) se controló al 20% de la saturación, utilizando un suministro de aire comprimido de 0,5-1,0 (vvm) y agitando a 400-900 rpm. En la fase exponencial temprana, la alimentación continua comenzó utilizando solución de sacarosa hidrolizada (70% p/v), preparado como se describe en el Ejemplo 1. El crecimiento celular y la síntesis de PHA y el consumo de azúcar se analizaron como se explica en el Ejemplo 1 y el Ejemplo 2, respectivamente).
Resultados:
Un cocultivo de C. necator H16 DSM 428 de tipo salvaje y su glucosa utilizando H1G+3 DSM 545 mutante fue diseñado para lograr el consumo completo de azúcares, fructosa y glucosa, mientras continúa la alimentación para alcanzar una alta densidad celular y contenido de polímeros.
Los dos azúcares se consumieron de manera diferente al comienzo de la fermentación, principalmente debido a la diferencia en la tasa de crecimiento entre las dos cepas. No obstante, el cocultivo pudo consumir ambos azúcares simultáneamente al final de la fermentación. No se detectó acumulación de fructosa hasta el final de la fermentación, 67 horas (en comparación con el Ejemplo 3, Figura 1). Se observó un ligero aumento en la concentración residual de glucosa sobre fructosa durante la fermentación (Figura 2), esto puede deberse al hecho de que la glucosa pudo ser utilizada por una de las cepas solamente, mientras que ambas cepas pudieron utilizar la fructosa de la mezcla de azúcar alimentada continuamente. Se alcanzó una mayor densidad celular (CDW) y contenido de PHB mediante la alimentación continua optimizada de sacarosa hidrolizada (91 g/L y 78% p/p, respectivamente).
Conclusión:
El sistema de cocultivo puede ayudar a lograr el consumo completo de ambos azúcares y permitir una fermentación continua prolongada para lograr un mayor crecimiento de la densidad celular y una mayor productividad de polímeros.
Ejemplo 5 - Fermentación semicontinua con monocultivo de Cupriavidus necator DSM 545 - Producción de PHBV a partir de sacarosa hidrolizada
Materiales y métodos:
El monocultivo se operó con la cepa C. necator H1G+3 DSM 545. Las condiciones de cultivo y el régimen de alimentación se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 4 en el fermentador de vidrio Applikon BioBundle 7-L, sin embargo, se utilizó propionato de sodio como cosustrato para la producción de copolímero de PHA, poli(3HB-co-3HV), ( PHBV).
El propionato se complementó con la solución de alimentación de sacarosa hidrolizada (280 g de propionato de sodio) al comienzo de la fase de biosíntesis de PHA.
Resultados:
El consumo de azúcar también se investigó durante la fermentación de alta densidad celular para la producción de copolímeros, PHBV, con el monocultivo, cepa DSM 545.
Como se muestra en la Figura 3, el monocultivo logró una alta densidad celular en 48 horas (53 g/L, CDW), después de lo cual no se pudo detectar un aumento en el peso seco de las células a pesar de la alimentación prolongada hasta las 68 horas. Este crecimiento limitado puede deberse a la acumulación de fructosa y/o el efecto inhibitorio del co-sustrato.
Ejemplo 6 - Fermentación discontinua alimentada con cocultivo de Cupriavidus necator H16 DSM 428 y Cupriavidus necator DSM 545 para la producción de PHBV a partir de sacarosa hidrolizada
Materiales y métodos:
Para la producción del copolímero PHBV en el sistema de cocultivo, también se cultivaron juntas las dos cepas C. necator DSM 428 y C. necator DSM 545. La fermentación discontinua de alimentación del cocultivo se realizó en el fermentador de vidrio Applikon BioBundle 7-L. Las condiciones de cultivo y el régimen de alimentación se instalaron como se explica en el Ejemplo 5.
Resultados:
En este ejemplo, el sistema de cocultivo también se investigó para la producción del copolímero PHBV en comparación con el sistema de monocultivo del Ejemplo 5. El sistema de cocultivo logró un aumento continuo en la densidad celular durante las 66 h de larga fermentación con alimentación continua con la solución de sacarosa hidrolizada suplementada con propionato (280 g de propionato de sodio), como se muestra en la Figura 4 (73 g/L, CDW).
Conclusión:
El sistema de cocultivo también mostró un mejor crecimiento sobre el sistema de monocultivo para la producción de copolímero de PHA, PHBV.
Conclusión general:
El sistema de cocultivo de la cepa C. necator DSM 428 y su glucosa utilizando el mutante UV C. necator DSM 545 logró mantener una tasa de consumo similar de los dos monoazúcares del sustrato de sacarosa hidrolizada a lo largo de la alimentación continua y logró una mayor densidad celular y productividad de polímero PHA en comparación con el sistema de monocultivo de la cepa que utiliza glucosa. Los datos de la Tabla 1 resumen el consumo mejorado de azúcar, CDW y contenido de PHA de todos los ejemplos presentados para la producción fermentativa de PHB y PHBV.
Tabla 1. Resumen de resultados obtenidos para mono y cocultivo de C. necator DSM 428 y C. necator DSM 545. (mono-c. = monocultivo; co-c. = co-cultivo)
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Ejemplo 7. Bioextracción de PHA de células de cocultivo
Materiales y métodos:
La bioextracción de PHA se estudió utilizando una porción de células húmedas de la fermentación del cocultivo de PHA en el Ejemplo 4 equivalente a 40-50 g de peso seco, sometidas a autoclave en 1 L de medio basal ( Ibrahim et al., 2020) (WO 2016/085396) en Applikon BioBundle 3-L. Después del someter a autoclave, el cultivo se inoculó con 50 ml de inóculo de B. pumilus FH9 bien desarrollado (16-24 h). La fermentación se realizó a temperatura controlada a 37°C. La concentración de oxígeno disuelto se mantuvo entre 5-20% de la saturación suministrando aire (0,1-0,5 vvm) y controlando la agitación (400-800 rpm). El pH del cultivo se controló a pH 7,0 - 8,0 mediante la adición de NaOH o HCl (3N). Los gránulos de PHA blanco se recuperaron mediante centrifugación y lavado con agua (Ibrahim et al., 2020, WO 2016/085396).
Resultados:
En este ejemplo, se utilizó un método de extracción de base biológica para extraer y recuperar los gránulos de PHA intracelulares sintetizados por el sistema de cocultivo de las cepas C. necator DSM 428 y C. necator DSM 545. El proceso patentado (Ibrahim et al., 2020, WO 2016/085396) se usó para hidrolizar la biomasa no PHA de las células de cocultivo mediante la acción de hacer crecer una cepa bacteriana lisante, B. pumilus FH9. Las células de cocultivo húmedo se usaron como la única fuente de carbono y nitrógeno para inducir el crecimiento de las células del bacilo y producir sus enzimas/factores de lisis celular, convirtiendo la biomasa de PHA en hidrolizado celular rico en proteínas (SCP) y liberando gránulos de PHA para recuperarse fácilmente mediante etapas de centrifugación y lavado con agua.
Conclusión:
Se ha demostrado que la bioextracción como método para la recuperación y el aislamiento de PHA de la producción de células microbianas extrae gránulos de PHA del sistema de cocultivo de R. eutropha. Además, también se produce un hidrolizado rico en proteínas (proteína unicelular, SCP).
Referencias
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un sistema de cocultivo para la producción de material proteico unicelular, piruvato y/o productos derivados del piruvato, comprendiendo el sistema de cocultivo un componente microbiano y un sustrato,
en el que el componente microbiano comprende o consiste en una primera y una segunda célula microbiana, en el que la primera y la segunda células microbianas son cepas diferentes de la especie Cupriavidus necator, en el que el sustrato comprende al menos una primera fuente de carbono y una segunda fuente de carbono, siendo la primera fuente de carbono diferente de la segunda fuente de carbono,
en el que la primera célula microbiana es capaz de metabolizar la primera fuente de carbono,
en el que la primera célula microbiana es capaz de metabolizar la segunda fuente de carbono.
en el que dichos productos derivados del piruvato son
metabolitos asociados al crecimiento seleccionados de alcoholes, biocombustibles y/o aminoácidos; y/o polihidroxialcanoatos homo y copoliméricos, politioésteres copoliméricos, hidroxialcanoatos monoméricos y/o cianoficina.
2. El sistema de cocultivo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el material de proteína unicelular es biomasa y/o biomasa hidrolizada de células de Cupriavidus necator .
3. El sistema de cocultivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores,
en el que la primera y la segunda células microbianas son cada una pluralidad de células microbianas, y en el que la primera y la segunda células microbianas son células microbianas productoras de polihidroxialcanoato (PHA).
4. El sistema de cocultivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la primera fuente de carbono es la fructosa y/o en el que la segunda fuente de carbono es glucosa,
en el que la primera célula microbiana es capaz de metabolizar fructosa, pero no es capaz de metabolizar glucosa, y
en el que la segunda célula microbiana es capaz de metabolizar glucosa.
5. El sistema de cocultivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la primera célula microbiana es Cupriavidus necator DSM 428, y/o en el que la segunda célula microbiana es una cepa de Cupriavidus necator capaz de utilizar un ácido graso como única fuente de carbono; o en el que la primera célula microbiana es una cepa de Cupriavidus necator capaz de usar un ácido graso como única fuente de carbono y/o en el que la segunda célula microbiana es Cupriavidus necator DSM 545.
6. El sistema de cocultivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la primera célula microbiana es Cupriavidus necator DSM 428, y/o
en el que la segunda célula microbiana es una cepa de Cupriavidus necator capaz de metabolizar la glucosa, tal como Cupriavidus necator DSM 545.
7. Un proceso para la producción de material proteico unicelular, piruvato y/o productos derivados del piruvato, comprendiendo dicho proceso:
a) proporcionar una materia prima;
b) proporcionar un componente microbiano de un sistema de cocultivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y
c) poner en contacto la materia prima con el componente microbiano del sistema de cocultivo, fermentando así la materia prima para obtener una composición fermentada que comprende piruvato y/o productos derivados del piruvato,
en el que los productos derivados del piruvato son metabolitos asociados al crecimiento seleccionados de alcoholes, biocombustibles y/o aminoácidos; y/o polihidroxialcanoatos homo y copoliméricos, politioésteres copoliméricos, hidroxialcanoatos monoméricos y/o cianoficina.
8. El proceso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el material proteico unicelular es biomasa y/o biomasa hidrolizada de células de Cupriavidus necator .
9. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, que comprende además una etapa de pretratamiento que comprende hidrolizar una materia prima que comprende sacarosa para obtener la materia prima en el que la materia prima comprende una concentración de sacarosa del 40% p/v o más, tal como 50% p/v o más, o tal como 60% p/v o más, tal como 70% p/v o más, tal como aproximadamente el 70% p/v.
10. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que la materia prima comprende una concentración de glucosa del 20% p/v o más, tal como 25% p/v o más o tal como 30% p/v o más, tal como 35% p/v o más, tal como aproximadamente el 35% p/v,
en el que la materia prima comprende una concentración de fructosa del 20% p/v o más, tal como 25% p/v o más o tal como 30% p/v o más, tal como 35% p/v o más, tal como aproximadamente el 35% p/v, y
en el que la glucosa y la fructosa representan al menos el 60%, tal como al menos el 70%, tal como al menos el 80%, tal como al menos el 90%, tal como al menos el 95%, tal como aproximadamente el 100% de carbono orgánico en la materia prima.
11. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que la concentración de glucosa en la composición fermentada es de 20 g/L o menos, tal como de 15 g/L o menos, tal como de 10 g/L o menos, tal como de 5 g/L o menos, tal como de aproximadamente 1 g/L o menos, y
en el que la concentración de fructosa en la composición fermentada es de 20 g/L o menos, tal como de 15 g/L o menos, tal como de 10 g/L o menos, tal como de 5 g/L o menos, tal como de 1 g/L o menos.
12. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que la temperatura de la etapa de fermentación c) está entre 25°C y 35°C, tal como entre 27°C y 33°C, tal como entre 29°C y 31°C, tal como aproximadamente 30°C, y
en el que el pH de la etapa de fermentación c) está entre pH 6 y pH 9, tal como entre pH 6,5 y 8,5, tal como entre pH 6,7 y 8,2.
13. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en el que los polihidroxialcanoatos producidos tienen un peso molecular promedio de al menos 300 kDa, tal como entre 300 kDa y 2000 kDa, tal como entre 400 kDa y 1500 kDa, tal como entre 500 kDa y 1000 kDa, tal como entre 800 kDa y 2000 kDa.
14. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, en el que los polihidroxialcanoatos producidos son un homopolímero de poli(3-hidroxibutirato), o un copolímero de poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato)(PHBV) que tienen un contenido de 3-hidroxivalerato de entre 5% en moles y 40% en moles, tales como entre 5% en moles y 35% en moles, tales como entre 5% en moles y 20% en moles, tales como entre 10% en moles y 20% en moles, tales como entre 15% en moles y 20% en moles.
15. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14, en el que el título de polihidroxialcanoatos producidos es de al menos 3 g/L, tal como al menos 8 g/L, tal como al menos 10 g/L, 15 g/L, tal como al menos 20 g/L, tal como al menos 25 g/L, tal como al menos 30 g/L, tal como al menos 50 g/L, tal como al menos 75 g/L, tal como al menos 100 g/L, tal como al menos 125 g/L, tal como al menos 150 g/L, y
en el que los polihidroxialcanoatos producidos constituyen al menos el 50% p/p, tal como al menos el 60% p/p, tal como al menos el 70% p/p, tal como al menos el 80% p/p, tal como al menos el 90% p/p del peso seco de la célula.
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