ES2933603T3 - Métodos de tratamiento del cáncer con antagonistas contra PD-1 y PD-L1 en combinación con radioterapia - Google Patents

Abstract

Esta solicitud proporciona un método para tratar el cáncer en un paciente que comprende administrar al menos una dosis de radioterapia y al menos un antagonista de PD-1 y/o PD-L1, donde al menos un antagonista de PD-1 y/o PD-L1 es administrado el mismo día que una dosis de radioterapia o hasta 4 días después inclusive. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de tratamiento del cáncer con antagonistas contra PD-1 y PD-L1 en combinación con radioterapia

Campo

Composición tal como se reivindica para su uso en métodos de tratamiento del cáncer. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico)

Antecedentes

La radioterapia (RT) sigue siendo el tratamiento no quirúrgico más importante en el tratamiento de tumores malignos sólidos, recibiendo este tratamiento alrededor del 50-60% de todos los pacientes con cáncer. La inclusión de RT en los regímenes de tratamiento reduce la recaída de la enfermedad y mejora la supervivencia global en la mayoría de los cánceres comunes (1-3). Aunque resulta eficaz, muchos pacientes padecen recaída local y enfermedad metastásica.

Además del efecto citorreductor directo de la RT, pruebas recientes sugieren que la generación de respuestas inmunitarias antitumorales puede desempeñar un papel importante en la eficacia de este tratamiento (4, 5). La RT puede conducir a la expresión de ecto-calreticulina en células tumorales así como a la liberación de varios patrones moleculares asociados a daño (DAMP) incluidos el grupo de alta movilidad Box 1 (HMGB1) y ATP que pueden conducir al reclutamiento y la activación de células presentadoras de antígenos (APC) y a la sensibilización de respuestas de células T específicas de antígeno tumoral (6-10). A pesar de esto, se produce con frecuencia escape inmunitario, permaneciendo la recaída tumoral como la principal causa de mortalidad en pacientes que reciben RT (11). La identificación e inhibición de factores clave de la inmunosupresión pueden aumentar las respuestas inmunitarias antitumorales con el potencial de mejorar el resultado del paciente.

Por tanto, se requieren con urgencia nuevos conocimientos sobre el fracaso del tratamiento y enfoques de combinación de RT más eficaces.

El eje de muerte programada 1 (PD-1) / ligando de muerte programada 1 (PD-L1) está implicado en el mantenimiento de la tolerancia periférica y la modulación de respuestas inflamatorias agudas a través de la inhibición de la función de células T y a través de la apoptosis de células T activadas (12, 13). Además de unirse a PD-1, PD-L1 puede suprimir también la función de células T a través de la interacción con CD80 (14). La expresión de PD-L1 es inducible y se cree que responde al medio inflamatorio local, particularmente interferón (IFN) de tipo I y II (12, 15, 16). Aunque apenas detectable en la mayoría de los tejidos normales, se ha descrito la expresión de PD-L1 en múltiples tumores malignos (revisado en (17)). De manera importante, estudios clínicos recientes con anticuerpos monoclonales (AcM) que seleccionan como diana PD-1 o bien PD-L1 han demostrado respuestas alentadoras en pacientes con enfermedad avanzada (18-21). Deng et al. (J Clin Invest febrero de 2014;124(2):687-95) describen que la irradiación y el tratamiento anti-PD-L1 promueven de manera sinérgica la inmunidad antitumoral en ratones. Zeng et al. (Int J Radiat Oncol Biol Phys. 1 de junio de 2013;86(2):343-9) describen que el bloqueo anti-PD-1 y la radiación estereotáctica producen supervivencia a largo plazo en ratones con gliomas intracraneales. El documento WO2012/177624A2 describe la radiación enfocada para aumentar las terapias basadas en el sistema inmunitario contra neoplasias. El documento WO2013/190555A1 describe anticuerpos frente a LSR, y usos de los mismos para el tratamiento del cáncer. Liang et al. (J Immunol. 1 de junio de 2013;190(11):5874-81) describen que el equilibrio inducido por radiación es un balance entre la proliferación de células tumorales y la destrucción mediada por células T. El documento WO2013/079174A1 describe anticuerpos anti-PD-L1 y usos de los mismos. Pilones et al. ([resumen]. En: Proceedings of the 105th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research; 5-9 de abril de 2014; San Diego, CA. Filadelfia (PA): AACR; Cancer Res 2014;74(supl. 19): número de resumen 5020. doi:10.1158/1538-7445.AM2014-5020) describen los efectos cooperativos del bloqueo de la muerte celular programada-1 y la radiación en un modelo de un carcinoma de mama escasamente inmunogénico.

Se desea una estrategia de dosificación para combinar la radioterapia y un antagonista de PD-1 y/o PD-L1 para crear un beneficio máximo para pacientes que padecen cáncer.

SUMARIO

La presente invención se define por las reivindicaciones. Un aspecto de la invención proporciona una composición que comprende al menos un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 o una parte funcional del mismo capaz de unirse al mismo antígeno o epítopo para su uso en el tratamiento del cáncer en un paciente, en el que el al menos un anticuerpo frente a PD-1 y/o PD-L1 se administra el mismo día que una fracción de la radioterapia fraccionada o hasta o incluidos 4 días después, en el que la dosis total de radioterapia fraccionada es de aproximadamente 11 Gy o menor.

El método utiliza al menos un anticuerpo frente a PD-1 y/o PD-L1 o una parte funcional del mismo.

La radioterapia es radioterapia fraccionada. En un modo, la radioterapia fraccionada comprende desde 2 hasta 7 fracciones. En otro modo, la radioterapia fraccionada comprende 5 fracciones.

En una realización, las fracciones de radioterapia se administran en días secuenciales. En otra realización, las fracciones de radioterapia se administran el día 1, día 2, día 3, día 4 y día 5. En una realización, la radioterapia comprende aproximadamente 10 Gy en 5 fracciones.

En un aspecto, el al menos un anticuerpo frente a PD-1 y/o PD-L1 se administra al menos el día 1 y/o el día 5. En un modo, el al menos un anticuerpo frente a PD-1 y/o PD-L1 se administra múltiples veces. Por ejemplo, el al menos un anticuerpo frente a PD-1 y/o PD-L1 puede administrarse 3 veces a la semana.

Los anticuerpos anti-PD-1 y/o PD-L1 incluyen MEDI4736.

Los anticuerpos anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 incluyen pembrolizumab, nivolumab, BMS-936558, AMP-224 o MPDL3280A.

En un aspecto, el cáncer es melanoma, cáncer colorrectal o cáncer de mama. En otro aspecto, se realiza más de un ciclo de tratamiento. En un aspecto adicional, se realizan desde 2-8 ciclos de tratamiento. En un modo, los ciclos de tratamiento son semanales o cada dos semanas.

Se expondrán objetos y ventajas adicionales en parte en la descripción que sigue. Los objetos y ventajas se realizarán y alcanzarán por medio de los elementos y las combinaciones señalados en las reivindicaciones adjuntas.

La presente invención se define por las reivindicaciones.

Los dibujos adjuntos, que se incorporan en y constituyen una parte de esta memoria descriptiva, ilustran una (varias) realización/realizaciones y, junto con la descripción, sirven para explicar los principios descritos en el presente documento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las figuras 1A-F ilustran que el bloqueo del eje de PD-1 / PD-L1 potencia la actividad de la radioterapia fraccionada. A y B, mediana de intensidad de fluorescencia (A) e histogramas representativos (B) de la expresión de PD-L1 en células CT26 aisladas de tumores 1, 3 o 7 días después del tratamiento con aproximadamente 10 Gy en 5 fracciones diarias de 2 Gy. C y D, ratones que portan tumores c T26 recibieron aproximadamente 10 Gy de RT administrados en 5 fracciones diarias de 2 Gy solos o bien en combinación con AcM aPD-1 (C) o bien aPD-L1 (D) dosificado a 10 mg/kg 3qw durante hasta 3 semanas. E, volúmenes tumorales 10 días después del inicio de la terapia en ratones que portan tumores 4T1 que recibieron 20 Gy de RT administrados en 5 fracciones diarias de 4 Gy solos o bien en combinación con AcM aPD-L1. F, ratones que portan tumores 4434 recibieron aproximadamente 10 Gy de RT administrados en 5 fracciones diarias de 2 Gy solos o bien en combinación con AcM aPD-L1. Los grupos experimentales contenían al menos 7 ratones y eran representativos de al menos 2 experimentos independientes. A, E y F muestran la media ± EEM. *, P<0,05 **, P<0,01, prueba de Mann-Whitney. C y D, *, indica significación en comparación con ratones de control. , indica significación en comparación con monoterapia. ***/+++, p < 0,001, prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox).

Las figuras 2A-C demuestran que la actividad terapéutica de la combinación de RT fraccionada y AcM aPD-L1 depende de la actividad de linfocitos T CD8+. A, volumen tumoral el día de la terapia, 7 y 11 días tras la terapia de combinación con 5 fracciones de 2 Gy y AcM aPD-L1. Se agotaron subconjuntos de células inmunitarias (células CD8, CD4 o bien NK) 1 día antes de la terapia manteniéndose el agotamiento durante 2 semanas. ***, P > 0,001, *, P > 0,01, *, P > 0,05, prueba de Mann-Whitney. B, curva de supervivencia. *” /+++, p < 0,001, prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox). Datos representativos de 10 ratones por cohorte. C, gráficos de densidad representativos de sangre periférica que confirman el agotamiento de los subconjuntos de células inmunitarias.

Las figuras 3A-C muestran que la combinación de RT fraccionada y AcM aPD-L1 genera memoria inmunológica protectora. A, curva de supervivencia de ratones LTS tras la reexposición contralateral con 5*105 células CT26. * P<0,05 en comparación con ratones de control (rango logarítmico; prueba de Mantel-Cox). B, inmunotransferencia por puntos representativa de la producción de IFN^y por células T CD8+ aisladas de ratones sin tratamiento previo para el tumor o bien ratones LTS tratados originalmente con RT y AcM aPD-L1. C, frecuencia de células T IFNy+ CD8+ aislada de ratones sin tratamiento previo para el tumor o bien ratones LTS tratados originalmente con RT y AcM aPD-L1 tras el cocultivo con péptidos restringidos por H2-Ld (AH1 (SPSYVYHQF) (SEQ ID NO: 91); un antígeno asociado a tumor CT26 definido o pgalactosidasa (TPHPARIGL) (SEQ ID NO: 92); péptido de control de origen procariota) o bien células CT26 irradiadas con 50 Gy durante 5 días, seguido por sensibilización con células CT26 irradiadas con 50 Gy. * P<0,05 (prueba de Mann-Whitney). Datos representativos de 2 experimentos independientes.

Las figuras 4A-C ilustran que la RT fraccionada aumenta la expresión de PD-L1 en células tumorales in vivo y depende de células T CD8+ T. A, expresión de PD-L1 en células CT26 tras el tratamiento con RT (2,5-10 Gy) in vitro. B y C, gráficos de contorno representativos (B) y mediana de intensidad de fluorescencia (C) de la expresión de PD-L1 en células CT26 (seleccionadas como células CD45') aisladas de tumores 3 días después de recibir aproximadamente 10 Gy en 5 fracciones diarias de 2 Gy en combinación con anticuerpos que agotan células CD8, CD4 o bien NK. * P<0,05 (prueba de Mann-Whitney). Los grupos experimentales contenían al menos 5 ratones y eran representativos de al menos 2 experimentos independientes.

Las figuras 5A-E muestran que la producción por células T CD8+ de IFNy es responsable de la regulación por incremento de la expresión de PD-L1 en células tumorales tras la RT fraccionada. A, expresión de PD-L1 en células tumorales CT26 de tipo natural (WT), o células transducidas con un control no dirigido (NTC) o bien ARNhp de IFN^yRI tras el cocultivo durante 24 horas con 20 ng/ml de IFNy, TNFa o bien una combinación de ambas citocinas. B, gráficos de densidad representativos que muestran la expresión de IFNy y TNFa por células T CD8+ tras el tratamiento con PBS o bien 12-miristato 13-acetato de forbol (PMA) y ionomicina, C, frecuencia de células tumorales CT26 positivas para PD-L1 (WT, ARNhp de o ARNhp de IENyPI) tras el cocultivo de 24 horas con PBS o bien esplenocitos activados con PMA/ionomicina. n/s = P>0,05, *** P<0,001 ** P<0,01 (prueba de la t de Student bilateral). D y E, gráficos de contorno representativos (D) y mediana de intensidad de fluorescencia (E) de la expresión de PD-L1 en células tumorales CT26 tras el tratamiento con RT (aproximadamente 10 Gy en 5 fracciones) en presencia de un AcM bloqueante de aIPNY (o control de isotipo) in vivo. ** P<0,01, (prueba de Mann-Whitney). Los grupos experimentales contenían al menos 5 ratones.

Las figuras 6A-D demuestran que el programa de dosificación tiene un impacto en los resultados observándose potenciación de RT solo con la terapia con AcM aPD-L1 concurrente pero no secuencial. A, esquema para estudios de programación de la dosis. Los ratones recibieron una dosis fraccionada de RT (como aproximadamente 10 Gy en 5 fracciones diarias de 2 Gy) sola o en combinación con AcM aPD-L1 comenzando el día 1 del ciclo de RT (programa A), el día 5 del ciclo de RT (programa B) o bien 7 días tras la última dosis de RT (programa C). B, curvas de supervivencia de la terapia. +, P<0,01 en comparación con la monoterapia (rango logarítmico; prueba de Mantel-Cox). C y D, expresión de PD-1 en células T CD4+ (C) y CD8+ (D) 24 horas y 7 días después de la última dosis de RT. * P<0,05 (prueba de Mann-Whitney). Los grupos experimentales contenían al menos 5 ratones y eran representativos de al menos 2 experimentos independientes.

La figura 7 muestra que el bloqueo de tanto PD-1 como PD-L1 no potencia adicionalmente la eficacia en combinación con RT fraccionada en ratones que portan tumores CT26. A) curva de supervivencia tras la dosis fraccionada de RT (como 10 Gy en 5 fracciones diarias de 2 Gy) sola o en combinación con AcM aPD-1, aPD-L1 o una combinación de ambos AcM dosificados 3qw durante 3 semanas. n/s, P>0,05, rango logarítmico; prueba de Mantel-Cox. Los grupos experimentales contenían al menos 5 ratones y eran representativos de al menos 2 experimentos independientes.

La figura 8A-B muestra que la terapia de combinación con RT fraccionada y AcM aPD-1 o bien aPD-L1 se tolera bien en ratones. Los ratones que portaban tumores CT26 recibieron 10 Gy de RT administrados en 5 fracciones diarias de 2 Gy solos o bien en combinación con AcM aPD-L1 dosificado a 10 mg/kg 3qw durante 3 semanas o bien 1 semana. Los grupos experimentales contenían al menos 7 ratones y eran representativos de al menos 2 experimentos independientes. n/s, P>0,05, prueba de Mann-Whitney.

Las figuras 9A-C ilustran que el tratamiento de células tumorales con AcM aPD-1 o aPD-L1 no sensibiliza a la muerte celular inducida por radiación in vitro. Curvas de supervivencia clonogénica para células CT26 (A), células 4T1 (B) y células 4434 (C) tratadas con RT (2,5-10 Gy) en presencia y ausencia de 2 |jg/ml de aPD1 o aPD-L1.

Las figuras 10A-C muestran que el programa de dosificación tiene un impacto sobre el resultado. A) Volúmenes tumorales tras una dosis fraccionada de RT (como 10 Gy en 5 fracciones diarias de 2 Gy) sola o en combinación con AcM aPD-L1 comenzando el día 1 del ciclo de RT (programa A), el día 5 del ciclo de RT (programa B) o bien 7 días tras la última dosis de RT (programa C). B y C) Volúmenes tumorales de ratones tratados con RT que demuestran volúmenes tumorales equivalentes a través de diferentes programas de dosificación. n/s, P>0,05 (prueba de Mann-Whitney). Los grupos experimentales contenían al menos 5 ratones y eran representativos de al menos 2 experimentos independientes.

La figura 11 muestra que la administración aguda frente a crónica del AcM aPD-L1 no tiene un impacto sobre la eficacia de la terapia de combinación. A, Los ratones que portan tumores CT26 recibieron 10 Gy de RT administrados en 5 fracciones diarias de 2 Gy solos o bien en combinación con AcM aPD-L1 dosificado a 10 mg/kg 3qw durante 3 semanas o bien 1 semana. Los grupos experimentales contenían al menos 7 ratones y eran representativos de al menos 2 experimentos independientes. n/s, P>0,05, rango logarítmico; prueba de Mantel-Cox.

DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS

La tabla 1 proporciona una lista de ciertas secuencias a las que se hace referencia en la presente solicitud. Las CDR se han indicado en negrita y subrayadas.

DESCRIPCIÓN DE LAS REALIZACIONES

I. Composición para su uso en métodos de tratamiento

La presente invención se define por las reivindicaciones. Un aspecto de la invención proporciona una composición que comprende al menos un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 o una parte funcional del mismo capaz de unirse al mismo antígeno o epítopo para su uso en el tratamiento del cáncer en un paciente, en la que el al menos un anticuerpo frente a PD-1 y/o PD-L1 se administra el mismo día que una fracción de la radioterapia fraccionada o hasta o incluidos 4 días después, en la que la dosis total de radioterapia fraccionada es de aproximadamente 11 Gy o menor.

La composición para su uso en un método de tratamiento del cáncer puede administrarse una vez (como un solo ciclo de tratamiento) o puede administrarse más de una vez (es decir, con múltiples ciclos de tratamiento), tal como en un ciclo semanal, cada dos semanas, cada tres semanas o cada mes. Si la composición para su uso en un método se administra más de una vez, puede administrarse 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 veces, o más.

Sin querer restringirse a la teoría, en una gama de modelos tumorales singénicos establecidos, se encontró que bajas dosis de RT fraccionada condujeron a la regulación por incremento de la expresión de PD-L1 en células tumorales in vivo. Se mostró que la RT fraccionada administrada en combinación con AcM aPD-1 o aPD-L1 generó respuestas de CD8+ antitumorales eficaces, lo que mejoró el control tumoral local y la supervivencia a largo plazo, y protegió contra la reexposición tumoral mediante la inducción de una respuesta inmunitaria de memoria específica de antígeno tumoral. Se encontró que la producción por células T CD8+ de IFN^y era responsable de la regulación por incremento de PD-L1 en células tumorales tras la RT fraccionada. Además, la programación de AcM anti-PD-L1 en relación con la administración de RT fraccionada parecía afectar al resultado terapéutico; mostrando beneficio la administración del antagonista el mismo día que la RT o hasta e incluidos 4 días después de la primera dosis de RT fraccionada con respecto a la administración del antagonista más de 7 días después de la conclusión de la radioterapia. Y, aunque sin querer restringirse a la teoría, la regulación por incremento de la expresión de PD-L1 por células tumorales en respuesta a bajas dosis de RT fraccionada, tal como se usa de manera rutinaria en la práctica clínica, parece ser un mecanismo de la resistencia inmunológica adaptativa por células tumorales; contribuyendo por tanto potencialmente el eje de señalización de PD-L1/PD-1 al fracaso del tratamiento con RT. La terapia de combinación con RT y el bloqueo del eje de señalización de PD-1/PD-L1 tiene el potencial de superar esta resistencia pero, basándose en los presentes estudios preclínicos, el momento de la dosificación tiene un impacto en los resultados del tratamiento, proporcionando nuevos conocimientos para su traducción a la práctica clínica.

A. Antagonistas de PD-1 y/o PD-L1 para su uso en métodos de tratamiento

La composición para su uso en el presente método comprende un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 o parte funcional del mismo.

En un aspecto, el al menos un anticuerpo frente a PD-1 y/o PD-L1 se administra el mismo día que una dosis de radioterapia o hasta o incluidos 4 días después. Por ejemplo, en un aspecto, si la radioterapia se proporciona el día 1 de un ciclo de tratamiento, el al menos un anticuerpo frente a PD-1 y/o PD-L1 puede administrarse también el día 1 del ciclo de tratamiento (es decir, el mismo día que una dosis de radioterapia). En otro aspecto, si la radioterapia se proporciona el día 1 de un ciclo de tratamiento, el al menos un anticuerpo frente a PD-1 y/o PD-L1 se administra el día 5 (es decir, 4 días después). En un aspecto adicional, el anticuerpo frente a PD-1 y/o PD-L1 puede administrarse el día 1, día 2, día 3, día 4, día 5, día 6 y/o día 7 de un ciclo de tratamiento (incluidos programas de tratamiento tanto individuales como múltiples).

En una realización, el al menos un anticuerpo frente a PD-1 y/o PD-L1 se administra múltiples veces en un ciclo de tratamiento. En otra realización, el al menos un anticuerpo frente a PD-1 y/o PD-L1 se administra 2, 3, 4, 5 o más veces en un ciclo de tratamiento. Por ejemplo, el anticuerpo puede administrarse tres veces a la semana durante un ciclo de tratamiento de una semana, o tres veces a la semana durante un ciclo de tratamiento con dos o más semanas tal como se describió anteriormente.

Los anticuerpos anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 incluyen los dados a conocer en la publicación estadounidense 2010/0028330. Los anticuerpos anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 incluyen MEDI4736.

Los anticuerpos anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 incluyen pembrolizumab, nivolumab, BMS-936558, AMP-224 o MPDL3280A.

Los anticuerpos o partes funcionales de los mismos se administran en cantidades terapéuticamente eficaces. Generalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz puede variar con la edad, la afección y el sexo del sujeto, así como la gravedad de la afección médica del sujeto. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o parte funcional del mismo oscila entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal, entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal, entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal o entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 mg/kg. La dosificación puede ajustarse, según sea necesario, para adecuarse a los efectos observados del tratamiento. La dosis apropiada se elige basándose en las indicaciones clínicas de un médico encargado.

Los anticuerpos pueden administrarse como una dosis en bolo, para maximizar los niveles circulantes de anticuerpos durante la mayor cantidad de tiempo después de la dosis. Puede usarse también infusión continua después de la dosis en bolo.

Tal como se usa en el presente documento, el término parte funcional de anticuerpo del mismo se usa en el sentido más amplio. Puede ser artificial tal como anticuerpos monoclonales (AcM) producidos mediante tecnología de hibridoma convencional, tecnología recombinante y/o un fragmento funcional del mismo. Puede incluir tanto moléculas de inmunoglobulinas intactas, por ejemplo un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal (AcM), un anticuerpo monoespecífico, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo poliespecífico, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo animal (por ejemplo, anticuerpo de camélido), anticuerpos quiméricos, así como porciones, fragmentos, regiones, péptidos y derivados de los mismos (proporcionados por cualquier técnica conocida, tal como, pero sin limitarse a, escisión enzimática, síntesis de péptidos o técnicas recombinantes), tales como, por ejemplo, inmunoglobulina carente de cadenas ligeras, Fab, Fab', F (ab')² , Fv, scFv, fragmento de anticuerpo, diacuerpo, Fd, regiones CDR, o cualquier porción o secuencia peptídica del anticuerpo que sea capaz de unirse a un antígeno o epítopo. Una parte funcional puede ser un anticuerpo de cadena sencilla, un fragmento variable de cadena sencilla (scFv), un fragmento Fab o un fragmento F(ab')².

Un anticuerpo o parte funcional se dice que es "capaz de unirse" a una molécula si es capaz de reaccionar específicamente con la molécula para unir de ese modo la molécula al anticuerpo. Los fragmentos o porciones de anticuerpos pueden carecer del fragmento Fc del anticuerpo intacto, aclararse más rápidamente de la circulación y pueden tener menos unión tisular inespecífica que un anticuerpo intacto.

Pueden producirse ejemplos de anticuerpo a partir de anticuerpos intactos usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo mediante escisión proteolítica con enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). Pueden prepararse porciones de anticuerpos mediante cualquiera de los métodos anteriores, o pueden prepararse expresando una porción de la molécula recombinante. Por ejemplo, la(s) región/regiones CDR de un anticuerpo recombinante pueden aislarse y subclonarse en un vector de expresión apropiado.

En una realización, un anticuerpo o parte funcional es un anticuerpo humano. El uso de anticuerpos humanos para terapia de seres humanos puede disminuir la posibilidad de efectos secundarios debido a una reacción inmunológica en un individuo humano contra secuencias no humanas. En otra realización, el anticuerpo o parte funcional está humanizado. En otra realización, un anticuerpo o parte funcional es un anticuerpo quimérico. De este modo, pueden incluirse secuencias de interés, tales como, por ejemplo, un sitio de unión de interés, en un anticuerpo o parte funcional.

En una realización, el anticuerpo puede tener un isotipo de IgG, IgA, IgM o IgE. En una realización, el anticuerpo es una IgG.

B. Radioterapia para su uso en métodos de tratamiento

La radioterapia, también conocida como irradiación ionizante de alta dosis, es un componente del presente enfoque terapéutico.

La radioterapia es radioterapia fraccionada. En una realización, la radioterapia fraccionada comprende desde 2 hasta 7 fracciones. En otra realización, la radioterapia fraccionada comprende desde 3 hasta 6 fracciones. En otra realización, la radioterapia fraccionada comprende desde 4 hasta 5 fracciones. En un modo, la radioterapia fraccionada comprende 2, 3, 4, 5, 6 o 7 fracciones. En una realización, la radioterapia fraccionada comprende 5 fracciones.

En un modo, las fracciones de radioterapia se administran en días secuenciales. En un modo, la radioterapia puede incluir más de una dosis un día y/o dosis en días secuenciales. En un modo, las fracciones de radioterapia se administran el día 1, día 2, día 3, día 4 y día 5. En otro modo, la radioterapia comprende aproximadamente 10 Gy en 5 fracciones (es decir, 2 Gy cada uno de 5 días).

Pueden emplearse otros programas de fraccionamiento incluidos fraccionamiento acelerado (tratamiento administrado en dosis diarias o semanales más grandes para reducir el número de semanas de tratamiento), hiperfraccionamiento (dosis más pequeñas de radiación administradas más de una vez al día) o hipofraccionamiento (dosis más grandes administradas una vez al día o con menos frecuencia para reducir el número de tratamientos).

La radioterapia pueden ser rayos x, rayos gamma o partículas cargadas. La radioterapia puede ser radioterapia de haz externo o radioterapia interna (también denominada braquiterapia). Puede emplearse también radioterapia sistémica, usando sustancias radiactivas, tales como yodo radiactivo.

La radioterapia de haz externo incluye radioterapia conformacional tridimensional, radioterapia de intensidad modulada, radioterapia guiada por imagen, tomoterapia, radiocirugía estereotáctica, terapia de protones u otros haces de partículas cargadas.

C. Cánceres para tratamiento

Las presentes composiciones para su uso en los métodos pueden usarse para tratar una variedad de tipos de cáncer. En un aspecto, el cáncer es melanoma, cáncer colorrectal o cáncer de mama. En una realización, el cáncer de mama es cáncer de mama triple negativo.

En una realización, el cáncer es cáncer de tumores corticosuprarrenales, cáncer surprarrenal, cáncer anal, cáncer del conducto biliar, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer del sistema nervioso central, cáncer de cuello uterino, cáncer de pecho, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, carcinoma epidermoide, cáncer de esófago, cáncer de ojo, glioblastoma, glioma, cáncer de vesícula biliar, tumores carcinoides gastrointestinales, tumor del estroma gastrointestinal, enfermedad trofoblástica gestacional, cabeza y cuello, enfermedad de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de laringe e hipofaringe, leucemia, cáncer de hígado (tal como carcinoma hepatocelular), cáncer de pulmón (incluidos tumores de células no pequeñas, de células pequeñas y carcinoides de pulmón), cáncer de ganglios linfáticos, linfoma, linfoma de la piel, melanoma, mesotelioma, cáncer de boca, mieloma múltiple, cáncer de la cavidad nasal y los senos paranasales, cáncer de nasofaringe, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de la cavidad oral y la orofaringe, osteosarcoma, cáncer de ovarios, cáncer pancreático, cáncer de pene, cáncer de hipófisis, cáncer de próstata, tumores malignos pediátricos, cáncer rectal, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, glándula salival, sarcoma, cáncer de piel, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de timo, cáncer de garganta, cáncer de tiroides, cáncer uterino, cáncer vaginal o cánceres de vulva.

Se hará ahora referencia en detalle a las presentes realizaciones a modo de ejemplo, ejemplos de las cuales se ilustran en los dibujos adjuntos. Siempre que sea posible, se usarán los mismos números de referencia en todos los dibujos para referirse a partes iguales o similares. Las realizaciones se explican adicionalmente en los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Métodos

A) Ratones y líneas celulares

Se obtuvieron ratones BALB/c y C57B1/6 de Harlan, RU. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por un comité de ética local y se realizaron bajo una licencia del Ministerio del Interior del Reino Unido. Se mantuvieron células de carcinoma de colon murino CT26 (ATCC) y células 4434 aisladas de ratones BRafV600E p16-/-(Richard Marias, Cancer Research UK, Manchester Institute) en DMEM, y se mantuvieron cánceres de mama triple negativos 4T1 (ATCC) en RPMI-1640, suplementado con FCS al 10 %, L-glutamina al 1 % (Invitrogen, RU). Todas las líneas celulares se examinaron rutinariamente para confirmar la ausencia de contaminación por Mycoplasma.

B) Terapia tumoral

Se les inoculó a los ratones por vía subcutánea (s.c.) 5*105 células CT26, 1*105 células 4T1 o bien 5*106 células 4434. Se realizaron las irradiaciones 7-10 días después de la inoculación (cuando los tumores tenían al menos 100 mm3) usando una unidad de rayos x Pantak HF-320 de 320 kV (Gulmay Medical, RU). Se hizo funcionar la máquina a 300 kV, 9,2 mA, con filtración instalada en el haz de rayos x para dar una calidad de radiación de capa de valor medio de Cu de 2,3 mm.

Se colocaron los ratones a una distancia de 350 mm del foco de rayos x, donde la tasa de dosis fue de 0,80 Gy/min. La administración de AcM aPD-1 (clon RMPI-14), aPD-L1 (clon 10F.9G2) (ambos de Biolegend) o AcM de control de isotipo (IgG2a e IgG2b respectivamente) comenzó el día 1 del ciclo de RT fraccionada (a menos que se establezca otra cosa) y se administró por vía intraperitoneal (i.p.) 3qw durante hasta 3 semanas a una dosis de 10 mg/kg en un volumen de dosis de 100 |jl/10 g en PBS. Para experimentos de agotamiento celular y de citocinas, los ratones recibieron AcM aCD8; clon YTS169 (un obsequio de M. Glennie, Southampton University), AcM aCD4; clon GK1.5 (Biolegend), aAsialo-GM1 (Wako Chemicals) o bien alFNY; clon XMG1.2 (BioXcell). Se tomaron muestras de sangre periférica durante la terapia para confirmar el agotamiento celular. Para experimentos de reexposición tumoral, se implantaron células tumorales en ratones supervivientes a largo plazo (LTS) de manera contralateral un mínimo de 100 días después de la implantación tumoral previa. También se realizaron implantes en ratones de control adicionales para confirmar el crecimiento tumoral. Los grupos experimentales contenían al menos 5 ratones / grupo y son representativos de al menos 2 experimentos independientes.

C) Medición de la producción de citocinas por células T CD8+ aisladas de ratones supervivientes a largo plazo

Para la estimulación in vitro, se cultivaron 3,5*106 esplenocitos de ratones LTS o bien ratones de control durante 5 días en RPMI-1640 suplementado con FCS al 10 %, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 jg/ml, L-glutamina al 1 %, 2-ME 50 jM e IL-2 recombinante humana 10 Ul/ml en presencia de 1*106 células tumorales irradiadas con 50 Gy o bien 1 jmol/ml de los péptidos restringidos por H2-Ld SPSYVYHQF (SEQ ID NO: 91) (AH1) / TPHPARIGL (SEQ ID NO: 92) (pgalactosidasa) (Anaspec, RU). Los grupos experimentales contenían 3-5 ratones y eran representativos de 2 experimentos independientes. Después de 5 días en cultivo, se reestimularon las células a una razón de 1:1 con células tumorales irradiadas con 50 Gy durante 16 horas en presencia de brefeldina A 3 ug/ml (BD Pharmingen, RU.) e IL-2 recombinante humana 100 Ul/ml (Chiron, NL). Para el análisis de FACS, se lavaron las células y se incubaron y con anticuerpo de rata anti-CD 16/32 (eBioscience, RU) para bloquear la unión inespecífica y luego se tiñeron con AcM anti-CD8a conjugado con FITC (eBioscience, RU). Entonces se fijaron/permeabilizaron las células y se tiñeron para detectar la expresión de IFNy usando un AcM conjugado con APC (eBioscience, RU).

D) Fenotipado de células tumorales e inmunitarias mediante citometría de flujo

Para obtener suspensiones de células individuales, se procesaron los tumores usando un disociador gentleMacs y un kit de disociación de tumores murinos (Miltenyi Biotec, RU). Para el análisis, se bloqueó la unión inespecífica tal como se describió anteriormente y se examinó la expresión de CD4, CD8 (BD Biosciences, UK), CD45, NKP46, PD-1 y PD-L1 mediante citometría de flujo de múltiples parámetros (todos de eBioscience a menos que se establezca lo contrario).

E) Cocultivos in vitro

Se cultivaron células tumorales en presencia de 20 ng/ml de IFNy y/o TNFa durante 24 horas antes de la evaluación de la expresión de PD-L1 mediante citometría de flujo tal como se describió anteriormente. Para el ensayo de cocultivo, se cocultivaron esplenocitos en reposo o bien activados (tratados con PBS o 12-miristato 13-acetato de forbol y cóctel de estimulación celular de ionomicina. respectivamente, (eBioscience, RU)) a una razón de 1:1 con células tumorales y se determinó la expresión de PD-L1 en células tumorales tal como se describió anteriormente. Se logró el silenciamiento de la expresión de IFNyR1 mediante transducción lentiviral de células con ARNhp (las células también se transdujeron con ARNhp no dirigido como controles) (Thermo Scientific, UK). Se midió la medición de la producción de citocinas por esplenocitos (IFNy y TNFa) mediante citometría de flujo intracelular tal como se describió anteriormente.

Ejemplo 2. El bloqueo de PD-1 o PD-L1 potencia la eficacia terapéutica de la RT

Se ha mostrado que la radioterapia modula la inmunogenicidad de células tumorales, pero pocas veces es capaz de generar respuestas terapéuticas duraderas que conduzcan solo a una inmunidad antitumoral sistémica. Se muestra que bajas dosis de RT de dosis fraccionada local administradas como aproximadamente 10 Gy en 5 fracciones conducen a un aumento de la expresión de PD-L1 en células tumorales con expresión elevada evidente 1, 3 y 5 días después de la última dosis de RT en comparación con ratones coincidentes en el tiempo, no tratados (NT) (figuras 1A y B). Este aumento mediado por RT en la expresión de PD-L1 en células tumorales alcanza un máximo a las 72 horas después de la última dosis de Rt y, aunque disminuye significativamente a los 7 días tras la RT (en comparación con la expresión en los días 1 y 3; P < 0,05 y P < 0,01 respectivamente, prueba de Mann-Whitney), sigue estando elevada en comparación con ratones ⁿ T (P < 0,05, prueba de Mann-Whitney).

Dadas estas observaciones, se planteó la hipótesis de que la respuesta inmunitaria generada tras la RT puede verse limitada a través del eje de PD-1/PD-L1. Se encontró que la RT local administrada como aproximadamente 10 Gy en 5 fracciones diarias mejoraba significativamente la supervivencia en ratones que portaban tumores CT26 establecidos en comparación con controles NT (figuras 1C y D; P < 0.05 rango logarítmico; prueba de Mantel-Cox). Los datos demuestran que este control tumoral local mediado por RT puede mejorarse sustancialmente a través de la combinación con AcM aPD-L1 o bien AcM aPD-1 (figuras 1C y D; P < 0,001 rango logarítmico; prueba de Mantel-Cox). La terapia combinada condujo a una respuesta antitumoral sinérgica que fue curativa en el 66% y el 80% de los ratones que recibieron RT en combinación con AcM aPD-L1 o AcM aPD-1, respectivamente. En contraposición a la combinación con RT, la monoterapia con AcM aPD-L1 o bien AcM aPD-1 no mejoró significativamente la supervivencia (figuras 1C y D; P > 0,05 rango logarítmico; prueba de Mantel-Cox). Además, no se observó beneficio significativo cuando los ratones recibieron RT en combinación con AcM tanto aPD-1 como aPD-L1 frente a la combinación con cualquier AcM solo (figura 7).

El bloqueo de PD-L1 también mejoró la respuesta a la RT en ratones que portan tumores 4T1 establecidos, donde la terapia combinada redujo significativamente la carga tumoral en un 38% en comparación con RT sola (figura 1£; 10 días tras el inicio de la terapia; 184,3 ± 13,5 mm2 frente a 292,8 ± 14,3 mm2 respectivamente, P < 0,01 prueba de Mann-Whitney) y mejoró significativamente la supervivencia (P < 0,001 rango logarítmico; prueba de Mantel-Cox; datos no mostrados). Se observaron también resultados similares en ratones que portaban melanomas 4434 establecidos (figura 1F). La terapia de combinación con RT local y AcM que seleccionan como diana PD-1 o bien PD-L1 se toleró bien en ratones tanto BALB/c como C57B1/6 (figuras 8A y B). Estos datos preclínicos demuestran claramente el potencial de mejora del resultado tras la RT fraccionada a baja dosis de tumores sólidos establecidos a través del bloqueo del eje de PD-1/PD-L1.

Ejemplo 3. Las células NK contribuyen al control tumoral local tras la terapia de combinación pero la supervivencia a largo plazo depende de células T CD8+

A continuación, se investigaron los mecanismos que subyacen al control tumoral a largo plazo observado tras la terapia de combinación de RT y AcM aPD-L1. Inicialmente, se usaron ensayos de formación de colonias para confirmar que los AcM aPD-1 y aPD-L1 no estaban actuando como sensibilizadores a la radiación a través de interacción directa con células tumorales (figuras 9A-C). Usando anticuerpos de agotamiento, a continuación se exploró el papel de células T efectoras y células NK en la mediación de la actividad antitumoral tras la terapia de combinación con RT/AcM aPD-L1. Los datos demuestran que, tan pronto como 7 días después del inicio de un ciclo de RT fraccionada de 5 días (comenzando la terapia con AcM aPD-L1 el día 1 del ciclo de R^t ), es evidente una carga tumoral reducida en ratones tras la terapia de combinación en comparación con ratones NT (207,5 ± 29,2 mm2 frente a 409,4 ± 86,88 mm2 respectivamente; P = 0,067, prueba de la U de Mann-Whitney) (figura 2A). Sin embargo, esta tendencia estadística a una reducción del volumen se perdió tras el agotamiento de células T CD8+ o bien células NK, donde los volúmenes tumorales no fueron significativamente diferentes de los de las cohortes NT (P = 0,52 y P = 0,70 respectivamente, prueba de la U de Mann-Whitney) pero fueron significativamente más grandes que en ratones que recibieron terapia de combinación sin agotamiento de células inmunitarias (P < 0,01; terapia combinada frente a agotamiento de CD8, y P < 0,05; terapia combinada frente a agotamiento de células NK, prueba de la U de Mann-Whitney). Para el día 11 tras el tratamiento, la terapia de combinación reduce significativamente la carga tumoral en comparación con controles NT (P < 0,001, prueba de la U de Mann-Whitney). Mientras que el agotamiento de células T CD8+ o bien células NK en este momento reduce la eficacia de la terapia de combinación (P < 0,001 y P < 0,05 respectivamente, prueba de la U de Mann-Whitney), la contribución relativa de las células T CD8+ y células NK se vuelve más evidente con un control tumoral significativamente reducido en ratones con agotamiento de células CD8 frente a NK (P < 0,05, prueba de la U de Mann-Whitney). Los datos revelan también que el agotamiento de células T CD4+ mejoró el control tumoral local tras la terapia de combinación (153,2 ± 27,0 mm2 frente a 72,7 ± 17,3mm2 respectivamente; P < 0,05, prueba de la U de Mann-Whitney).

En contraposición con el control tumoral temprano tras la terapia de combinación de RT/AcM aPD-L1, la supervivencia a largo plazo (LTS) no se vio afectada por el agotamiento de células NK (el 70% de los ratones LTS tras el tratamiento con RT/aPD-L1 frente al 77,8% tras la terapia de combinación con agotamiento de células NK) (figura 2B). El agotamiento de linfocitos T CD4+ aumentó la frecuencia de ratones LTS desde el 70% hasta el 87,5% (combinación frente a combinación agotamiento de CD4) pero esto no alcanzó la significación (P >0,05 rango; prueba de Mantel-Cox). Sin embargo, el agotamiento de células T CD8+suprimió por completo la eficacia terapéutica de la terapia de combinación de RT/AcM aPD-L1 (P < 0,001 rango logarítmico; prueba de Mantel-Cox). El agotamiento de las poblaciones de células inmunitarias se confirmó mediante citometría de flujo en muestras de sangre periférica (figura 2C). Estos datos sugieren que, aunque las células NK pueden ejercer algo de control tumoral local, esto no tiene un impacto sobre la supervivencia global y, mientras que las células T CD4+ son prescindibles o incluso capaces de suprimir respuestas, las células T CD8+ parecen mediar en el control tumoral eficaz a largo plazo tras el tratamiento con RT y AcM aPD-L1.

Ejemplo 4. El tratamiento con AcM aPD-L1 y RT genera respuestas protectoras de células T de memoria específicas de antígeno tumoral

A continuación, se investigó si se generaba memoria inmunológica tras el tratamiento con RT y AcM aPD-L1. Se muestra que los ratones LTS tratados originalmente con RT y AcM aPD-L1 fueron capaces de rechazar por completo los tumores tras la reexposición contralateral (figura 3A). Para cuantificar esta respuesta de memoria, se recogieron esplenocitos de ratones LTS que tenían más de 100 días de supervivencia libre de enfermedad y se evaluó la capacidad de células T CD8+ para producir IFNy tras el cocultivo con péptido derivado de un antígeno asociado a tumor CT26 (AH1: SPSYVYHQF (SEQ ID NO: 91)), péptido de control (p-galactosidasa: TPHARIGL (SEQ ID NO: 93)) o con células CT26 irradiadas (figuras 3B y C). Los datos revelan que los ratones LTS estaban dotados de una frecuencia significativamente mayor de linfocitos T CD8+ productores de IFN^y tras el cocultivo con péptido AH1 que los ratones sin tratamiento previo (el 6,6 % ± 0,8 frente al 2,3 % ± 0,2 respectivamente; P < 0,05, prueba de Mann-Whitney). Se observó una respuesta similar tras el cocultivo de esplenocitos con células CT26. La comparación de cocultivos de péptidos y células tumorales reveló que la frecuencia de células T CD8+ de memoria era ~3 veces menor en ratones LTS tras el cocultivo con células tumorales que con péptido AH1 y puede reflejar la supresión mediada por células tumorales de la activación de células T. Tomados conjuntamente, estos datos demuestran que la RT, cuando se combina con el bloqueo del eje de PD-1 / PD-L1 en modelos de ratón, puede generar memoria inmunológica protectora en supervivientes a largo plazo.

Ejemplo 5. La RT fraccionada conduce a regulación por incremento adaptativa dependiente de células T CD8+ de la expresión de PD-L1 en células tumorales

Inicialmente, se confirmó que el tratamiento de células tumorales con una gama de dosis de RT in vitro no tuvo ningún impacto directo sobre la expresión de PD-L1 (figura 4A). Para identificar qué poblaciones celulares dentro del microentorno tumoral eran responsables de la modulación de la expresión de PD-L1 en células tumorales, los ratones recibieron un ciclo de RT fraccionada en combinación con anticuerpos de agotamiento de células CD8, CD4 o NK. Los datos revelan que el agotamiento de células T CD8+, pero no células NK, suprime por completo la regulación por incremento mediada por RT de PD-L1 en células tumorales (figuras 4B y C). De manera interesante, se encontró que el agotamiento de células T CD4+ aumentaba adicionalmente la regulación por incremento mediada por RT de PD-L1 en células tumorales (~ 2 veces en comparación con el tratamiento con RT solo).

Ejemplo 6. La regulación por incremento adaptativa de PD-L1 por células tumorales tras la RT fraccionada depende de IFNy

Dada la correlación clínica entre IFNy en el microentorno tumoral y la expresión de PD-L1 (16) y el impacto de TNFa sobre esta respuesta (22), se evaluó el impacto de estas citocinas sobre PD-L1 en las líneas celulares. El cocultivo de células tumorales con IFNy recombinante conduce a un aumento de 20 veces significativo en la expresión de PD-L1 en la superficie celular in vitro (figura 5A). Además, aunque la adición de TNFa recombinante solo no tiene impacto sobre la expresión de PD-L1 en células tumorales, un cóctel de tanto IFN^y como TNFa puede aumentar adicionalmente la expresión de PD-L1 en células tumorales (~2 veces) en comparación con la expresión con IFN^y solo (figura 5A). Se muestra que el silenciamiento del receptor 1 de IFN-^y (IFN^yRI) en células tumorales CT26 usando ARNhp suprime por completo la regulación por incremento de PD-L1 tras el cocultivo con IFNy recombinante o bien tanto IFNy como TNFa (figura 5A).

Para establecer si las células inmunitarias activadas podrían conducir a un cambio adaptativo en la expresión de PD-L1 en células tumorales a través de la producción de IFN^y y TNFa, se cocultivaron células CT26 WT y las transducidas con ARNhp no dirigido (ARNhp NTC) y ARNhp de IFNyRI con esplenocitos en reposo (tratados con PBS) y activados (tratados con 12-miristato 13-acetato de forbol (PMA) y ionomicina) aislados (figuras 5B y C). De manera importante, estos experimentos demuestran que células inmunitarias activadas pueden elevar la expresión de PD-L1 en células tumorales a concentraciones fisiológicamente relevantes de IFNy y TNFa, de una manera dependiente de IFNyRI.

Para confirmar el papel de IFN^y en la expresión de PD-L1 en células tumorales en respuesta a la RT in vivo, los ratones recibieron RT en combinación con anticuerpo bloqueante aIPNY (o control de isotipo). El bloqueo de IFN^y redujo la expresión de PD-L1 en células tumorales en 2.6 veces en ratones NT hasta el nivel observado en células CT26 cultivadas in vitro; lo que sugiere que se produce regulación por incremento adaptativa de PD-L1 tras la implantación del tumor (figuras 5D y E). Sin embargo, la regulación por incremento significativa de PD-L1 observada tras la RT (2.4 veces en comparación con el control NT) se suprimió por completo mediante el bloqueo de IFNy, lo que confirma que esto es el impulsor de la expresión adaptativa de PD-L1 en células tumorales tras el tratamiento de RT.

Ejemplo 7. La programación simultánea de AcM aPD-L1 y RT genera una respuesta inmunitaria antitumoral eficaz

Se evaluaron 3 programas de combinación distintos donde los ratones que portaban tumores CT26 establecidos recibieron un ciclo de RT fraccionada de aproximadamente 10 Gy en 5 fracciones comenzando la administración de AcM aPD-L1 el día 1 del ciclo de RT fraccionada (programa A), el día 5 del ciclo (programa B) o bien 7 días después de la finalización de la RT (programa C) (figura 6A). No se encontraron diferencias significativas en la supervivencia global entre el programa A y B con LTS del 60% y el 57 respectivamente (P >0,05 rango logarítmico; prueba de Mantel-Cox) (figura 6B y figura 10A). En contraposición, el tratamiento secuencial con RT seguida 7 días después por AcM aPD-L1 (programa C) fue completamente ineficaz en la potenciación de la supervivencia global en comparación con RT sola (mediana de supervivencia de 30 días frente a 35 días respectivamente; P >0,05 rango logarítmico; prueba de Mantel-Cox) a pesar de una carga tumoral similar a través de los grupos (figuras 10B y C).

El análisis de células T CD4+ y CD8+ infiltrantes de tumores 24 horas después de la última dosis de RT reveló un aumento de la expresión de PD-1 en comparación con controles NT coincidentes en el tiempo (P < 0,05, prueba de Mann-Whitney) (figura 6C). En contraposición, a los 7 días tras la RT, no era evidente un cambio en la expresión de PD-1 en células T CD4+ y se encontró que disminuyó significativamente en células T CD8+ en comparación con controles NT coincidentes en el tiempo (P < 0,05, prueba de Mann-Whitney) (figura 6D). Se encontró de manera constante que la expresión de PD-1 era más alta en células T CD8+ que en células T CD4+ infiltrantes de tumores (figuras 6C y D). A continuación, se comparó la actividad tras un protocolo de dosificación de AcM aPD-L1 aguda frente a prolongada donde los ratones recibieron 3 dosis de AcM simultáneamente con RT o bien las mismas con dosificación prolongada (3qw) durante 2 semanas adicionales. No se observó ningún beneficio adicional con la administración prolongada de AcM aPD-L1 (figura 11).

Tomados conjuntamente, estos datos demuestran que el tratamiento con RT fraccionada a baja dosis conduce a un aumento agudo en la expresión de PD-1 en células T y que la terapia secuencial donde el bloqueo del eje de señalización de PD-1/PD-L1 se retrasa hasta la finalización de un ciclo de RT puede ser ineficaz posiblemente debido a la eliminación o anergia de células T CD8+ reactivas con el tumor.

Ejemplo 8. Discusión de los ejemplos anteriores

Bajas dosis de RT fraccionada conducen a la regulación por incremento de la expresión de PD-L1 en células tumorales secundaria a la producción por células T CD8+ de IFN^y. En modelos de ratón de melanoma, cáncer colorrectal y de mama, se demostró que la actividad de la RT puede potenciarse a través de la combinación con AcM aPD-L1, conduciendo a la generación de memoria inmunológica en ratones supervivientes a largo plazo que es capaz de proteger frente a la recaída del tumor. Además, los datos revelan que la programación de la dosis puede afectar a los resultados, siendo la terapia simultánea pero no la secuencial eficaz en la mejora del control tumoral local y la supervivencia.

Este es el primer estudio preclínico que demuestra que la RT fraccionada conduce a un aumento de la expresión de PD-L1 en células tumorales a través de la producción por células T CD8+ de IFNy. En este caso, la expresión de PD-L1 en células tumorales puede actuar como biomarcador de una respuesta antitumoral local, lo que sugiere que la RT local puede ser suficiente para sensibilizar respuestas de células T CD8+. Sin embargo, aunque el tratamiento con RT sola fue incapaz de generar una inmunidad anticancerígena duradera, se encontró que la actividad se potenciaba a través del bloqueo mediado por AcM de PD-1 o bien PD-L1, lo que sugiere que la señalización a través de este eje puede limitar la respuesta inmunitaria a la RT. No se observaron diferencias significativas en la supervivencia global entre la RT administrada en combinación con aPD-1 o bien aPD-L1, o una combinación de ambos AcM. Dada esta observación, parece probable que la actividad de estos AcM, cuando se administran en combinación con RT, es a través del bloqueo de la señalización de PD-1/PD-L1, y no está mediada a través de los ejes de PD-L1/CD80 o PD-1/PD-L2, aunque son necesarios experimentos adicionales para confirmar esto.

Los datos preclínicos revelan que el agotamiento de células NK redujo el control tumoral local en puntos de tiempo tempranos (hasta 11 días tras la finalización de la RT) pero no tuvo ningún impacto sobre la supervivencia global. Además, el agotamiento de células NK no tuvo ningún impacto sobre la expresión de PD-L1 en células tumorales tras la RT, lo que sugiere su limitada contribución a la producción de IFNy local. En cambio, aunque el agotamiento de células T CD4+ no tuvo ningún impacto sobre la supervivencia tras la terapia de combinación, se observaron aumentos sustanciales en la expresión de PD-L1 en células tumorales tras la RT. El agotamiento de células T CD4+ tiene un impacto sobre las poblaciones de tanto células T auxiliares como Treg. Aunque son necesarios estudios adicionales para definir las contribuciones relativas de estas subpoblaciones de células T CD4+, puede especularse que las células T auxiliares CD4+ pueden ser prescindibles para la generación de respuestas de células T CD8+ eficaces tras la terapia con RT/AcM frente a PD-L1 en el presente modelo y que las células T auxiliares, o bien más probablemente las Treg, pueden estar suprimiendo activamente la producción de IFN^y en el medio tumoral local. Por tanto, el potencial terapéutico para potenciar respuestas antitumorales por el agotamiento de Treg puede atenuarse al menos en parte a través de la expresión potenciada de PD-L1 en células tumorales.

La expresión de PD-L1 puede modularse mediante varias citocinas, incluidas IFN de tipo 1 y 2, TNFa y TGFp (16, 22, 30­ 32). Se muestra que la expresión de PD-L1 en células tumorales puede potenciarse tras el cocultivo con IFN^y y que la adición de TNFa puede aumentar adicionalmente esta respuesta. Sin embargo, el bloqueo de IFN^yR1 o el agotamiento in vivo de IFNy demuestra dependencia de la señalización mediada por IFNy para la regulación por incremento de PD-L1, siendo TNFa solo incapaz de modular la expresión de PD-L1 en células tumorales. De manera interesante, el agotamiento in vivo de IFN^y reduce la expresión de PD-L1 en células tumorales singénicas, coincidiendo con el perfil de expresión de células tumorales in vitro. Esto sugiere que el microentorno tumoral local, en ausencia de intervención terapéutica, puede fomentar la adaptación tumoral dirigida inmunológicamente, lo que puede respaldar el desarrollo tumoral. De manera similar, en lesiones melanocíticas humanas, se ha mostrado que la expresión de PD-L1 se colocaliza con zonas de infiltración de células T CD8+ y se postula que representa un mecanismo adaptativo de escape inmunitario (16). Sin embargo, en los presentes modelos de ratón preclínicos, la monoterapia con AcM que seleccionan como diana PD-1/PD-L1 demuestra solo una modesta actividad, lo que sugiere que es poco probable que la selección como diana de este eje solo ocasione respuestas inmunitarias antitumorales duraderas en todos los contextos y subraya el requisito de un enfoque combinatorio.

En contraposición al uso de una sola dosis de 12 Gy (30), los presentes resultados demuestran que la regulación por incremento de PD-L1 se produce a dosis biológicamente eficaces mucho más bajas, lo que implica la administración de RT fraccionada usando aproximadamente 10 Gy en 5 fracciones diarias. Este es un hallazgo importante dado que esta dosis por fracción se usa más comúnmente en la práctica clínica de rutina. Varios estudios han evaluado el impacto del fraccionamiento de la dosis de RT; comparación de dosis ablativas individuales, RT hipofraccionada y fraccionada, en la generación de respuestas inmunitarias antitumorales y en el microentorno tumoral (4, 5, 25, 26, 33, 34). Sin embargo, los resultados de estos estudios son equívocos y la administración de RT óptima y el impacto del fraccionamiento de la dosis de RT sobre la expresión de PD-L1 en células tumorales requiere investigación adicional.

Previamente, ninguna investigación ha abordado el impacto de la secuenciación sobre la actividad de la terapia con RT y AcM aPD-L1. Esto es especialmente pertinente dada la predisposición a adoptar un régimen de combinación secuenciado en la práctica clínica como estrategia para maximizar la tolerabilidad. Se muestra que solo el bloqueo de PD-L1 en el momento de la administración de RT puede potenciar la respuesta terapéutica en modelos de ratón, no siendo la terapia 7 días después de la finalización de la RT mejor que el tratamiento con RT sola. Además, los presentes datos revelan que la expresión de PD-L1 está elevada a las 24 horas después de la finalización de un ciclo de Rt fraccionada y permanece elevada durante al menos 7 días tras la finalización. Además, se encontró una expresión de PD-1 elevada en células T CD4+ y CD8+ infiltrantes de tumores 24 horas tras la RT en comparación con cohortes de control. Se encontró que la expresión de PD-1 era superior de manera constante en células T CD8+ frente a CD4+. Tomados conjuntamente, estos datos sugieren que la RT fraccionada local puede sensibilizar respuestas de células T CD8+ antitumorales, pero que estas pueden atenuarse mediante la señalización a través del eje de PD-1/PD-L1 y la inhibición temprana de este eje puede generar respuestas antitumorales eficaces duraderas. Además, no está claro el requisito de bloqueo crónico frente a agudo del eje de PD-1/PD-L1 cuando se combina con RT. No se observaron diferencias en la supervivencia cuando se administró AcM aPD-L1 3qw a lo largo de 1 semana simultáneamente con la administración de r T frente a un programa prolongado de hasta 3 semanas. Estos datos sugieren que los enfoques de combinación con RT pueden permitir una reducción de la duración de la terapia con AcM aPD-1/PD-L1 requerida para lograr respuestas inmunitarias antitumorales terapéuticas. Conjuntamente, estos datos tienen importantes implicaciones para el diseño de ensayos clínicos.

En resumen, este estudio demuestra que el tratamiento con RT fraccionada conduce a una regulación por incremento de la expresión de PD-L1 en células tumorales y que el bloqueo del eje de PD-1/PD-L1 puede potenciar la respuesta inmunitaria a la RT fraccionada en múltiples modelos de ratón singénicos del cáncer. Los presentes datos sugieren que la programación de la dosis de AcM aPD-L1 con RT puede generar respuestas inmunitarias terapéuticas con la capacidad de reducir la carga tumoral y mejorar la supervivencia. Esta combinación terapéutica puede ser un enfoque prometedor para el tratamiento de muchos tumores malignos sólidos donde se usa comúnmente RT y su traslado a un ensayo clínico de fase temprana está claramente justificado.

Ejemplo 9. Protocolos de tratamiento

El paciente A tiene cáncer colorrectal. En la semana 1, el paciente A recibe una cantidad eficaz de radioterapia en cinco fractopms. En la semana 1, el paciente A también recibe una dosis terapéutica de MEDI4736 el día 1, día 3 y día 5. El paciente A repite este programa durante las semanas 2, 3, 4 y 5.

El paciente B tiene cáncer de mama. En la semana 1, el paciente B recibe una cantidad eficaz de radioterapia. En la semana 1, el paciente B también recibe una dosis terapéutica de MEDI4736 el día 5. El paciente repite este programa durante las semanas 3, 5 y 7.

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Tal como se usa en el presente documento, el término aproximadamente se refiere a un valor numérico, incluidos, por ejemplo, números enteros, fracciones y porcentajes, ya se indiquen explícitamente o no. El término aproximadamente se refiere en general a una intervalo de valores numéricos (por ejemplo, /-5-10% del valor mencionado) que un experto habitual en la técnica consideraría equivalente al valor mencionado (por ejemplo, que tiene la misma función o resultado). En algunos casos, el término aproximadamente puede incluir valores numéricos que se redondean a la cifra significativa más cercana.

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende al menos un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-LI o una parte funcional del mismo capaz de unirse al mismo antígeno o epítopo para su uso en el tratamiento del cáncer en un paciente, en el que el al menos un anticuerpo frente a PD-1 y/o PD-L1 se administra el mismo día que una fracción de la radioterapia fraccionada o hasta o incluidos 4 días después, en el que la dosis total de radioterapia fraccionada es de aproximadamente 11 Gy o menor.

2. La composición para su uso de la reivindicación 1, en la que la dosis total de radioterapia fraccionada es de aproximadamente 10 Gy o menor.

3. La composición para su uso de la reivindicación 2, en la que la radioterapia fraccionada comprende desde 2 hasta 7 fracciones.

4. La composición para su uso de la reivindicación 2, en la que la radioterapia fraccionada comprende 5 fracciones.

5. La composición para su uso de la reivindicación 4, en la que las fracciones de radioterapia se administran en días secuenciales.

6. La composición para su uso de la reivindicación 5, en la que las fracciones de radioterapia se administran el día 1, día 2, día 3, día 4 y día 5.

7. La composición para su uso de la reivindicación 1, en la que la radioterapia fraccionada comprende aproximadamente 10 Gy en 5 fracciones.

8. La composición para su uso de la reivindicación 1, en la que el al menos un anticuerpo frente a PD-1 y/o PD-L1 se administra el día 1 de la radioterapia fraccionada.

9. La composición para su uso de la reivindicación 1, en la que el al menos un anticuerpo frente a PD-1 y/o PD-L1 se administra el día 5 de la radioterapia fraccionada.

10. La composición para su uso de la reivindicación 1, en la que el al menos un anticuerpo frente a PD-1 y/o PD-L1 se administra múltiples veces.

11. La composición para su uso de la reivindicación 10, en la que el al menos un anticuerpo frente a PD-1 y/o PD-L1 se administra 3 veces a la semana.

12. La composición para su uso de la reivindicación 11, en la que el anticuerpo anti-PD-L1 es durvalumab (MEDI-4736) o una parte funcional del mismo capaz de unirse a un antígeno o epítopo.

13. La composición para su uso de la reivindicación 11 o 12, en la que el anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-L1, o parte funcional del mismo capaz de unirse a un antígeno o epítopo es embrolizumab, nivolumab (BMS-936558) o atezolizumab (MPDL3280A).

14. La composición para su uso de la reivindicación 1, en la que el cancer es melanoma, cáncer colorrectal o cáncer de mama.

15. La composición de la reivindicación 1, para su uso en el tratamiento del cáncer en el que se realiza más de un ciclo de tratamiento.

16. La composición de la reivindicación 15, para su uso en el tratamiento del cáncer en el que se realizan desde 2-8 ciclos de tratamiento.

17. La composición de la reivindicación 16, para su uso en el tratamiento del cáncer en el que los ciclos de tratamiento son semanales o cada dos semanas.