JP2020121978A - 放射線療法と併用されるｐｄ−１およびｐｄ−ｌ１に対する拮抗薬を用いたがんの治療法 - Google Patents

Abstract

【課題】がんの治療において、局所性再発と転移の問題を解決する方法の提供。
【解決手段】ａ．少なくとも１用量の放射線療法を投与するステップと；ｂ．少なくとも１つのＰＤ−１及び／又はＰＤ−Ｌ１拮抗薬を投与するステップとを含み、少なくとも１つのＰＤ−１及び／又はＰＤ−Ｌ１拮抗薬が、放射線療法の投与と同日に又は４日後までに投与される方法。前記少なくとも１つのＰＤ−１及び／又はＰＤ−Ｌ１拮抗薬が、少なくとも１つのＰＤ−１及び／もしくはＰＤ−Ｌ１抗体又はその機能性部分であることが好ましい。
【選択図】図１

Description

配列表
本出願は、その内容全体が参照により援用される、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１５年６月１６日に作成され、Ｂ７Ｈ１−２７５ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは１０３，３１３バイトである。

分野
がんの治療法。

放射線療法（ＲＴ）は、依然として、固形悪性腫瘍の管理における最重要な非外科治療であり、全てのがん患者の５０〜６０％前後がこの治療を受ける。治療計画へのＲＴの組み入れは、一般的がんの大多数で疾患再発を低下させ、全生存期間を改善する（１〜３）。効果的ではあるが、多くの患者は、局所性再発と転移性疾患の問題を抱えている。

ＲＴの直接的細胞減少効果に加えて、新たに出現した証拠は、抗腫瘍免疫応答の発生が、この治療の有効性に重要な役割を果たしてもよいことを提案する（４，５）。ＲＴは、腫瘍細胞上のエクト−カルレティキュリンの発現、ならびに高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１）およびＡＴＰをはじめとするいくつかの障害関連分子パターン（ＤＡＭＰ）の放出をもたらし得て、それは抗原提示細胞（ＡＰＣ）の動員と活性化、そして腫瘍抗原特異的Ｔ細胞応答のプライミングをもたらし得る（６〜１０）。これにもかかわらず免疫逃避免が頻発し、腫瘍再発は、ＲＴを受けた患者の死亡率の主要原因のままである（１１）。免疫抑制の主要駆動機構同定および阻害は、抗腫瘍免疫応答を増強してもよく、患者転帰を改善する可能性がある。

したがって治療の失敗に関する新しい洞察と、より効果的なＲＴ組み合わせのアプローチが緊急に必要である。

プログラム死１（ＰＤ−１）／プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）系は、Ｔ細胞機能阻害および活性化Ｔ細胞のアポトーシスを通じて、末梢性免疫寛容の維持および急性炎症性応答の調節に関与する（１２，１３）。結合ＰＤ−１に加えて、ＰＤ−Ｌ１もまた、ＣＤ８０との相互作用を通じてＴ細胞機能を抑制し得る（１４）。ＰＤ−Ｌ１の発現は誘導性であり、局所炎症性環境、特にＩ型およびＩＩインターフェロン（ＩＦＮ）に応答すると考えられる（１２，１５，１６）。大部分の正常組織ではほとんど検出不能であるが、ＰＤ−Ｌ１の発現が複数の悪性腫瘍で記載されている（概説（１７））。重要なことには、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１標的化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のどちらかを用いた最近の臨床試験が、進行した疾患がある患者において有望な応答を実証している（１８〜２１）。

がんに罹患している患者に最大の利益をもたらす、放射線療法とＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬を組み合わせた投与ストラテジーが所望される。

説明に従って、患者においてがんを治療する方法は、
ａ．少なくとも１用量の放射線療法を投与するステップと；
ｂ．少なくとも１つのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬を投与するステップと
を含んでなり、少なくとも１つのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬は、放射線療法の投与と同日にまたは４日後までに投与される。

別の様式では、少なくとも１つのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬は、少なくとも１つのＰＤ−１および／もしくはＰＤ−Ｌ１抗体またはその機能性部分である。

一態様では、放射線療法は分割放射線療法である。一様式では、分割放射線療法は２〜７回の分割量（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を含んでなる。別の様式では、分割放射線療法は５回の分割量を含んでなる。

一実施形態では、放射線療法分割量は連日投与される。別の実施形態では、放射線療法分割量は、１日目、２日目、３日目、４日目、および５日目に投与される。一実施形態では、放射線療法は、５回の分割量で約１０Ｇｙを含む。

一態様では、少なくとも１つのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬は、少なくとも１日目および／または５日目に投与される。一様式では、少なくとも１つのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬は、複数回投与される。例えば、少なくとも１つのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬は、週に３回投与されてもよい。

一実施形態では、抗ＰＤ−１および／もしくはＰＤ−Ｌ１抗体またはその機能性部分一部は、ＭＥＤＩ４７３６である。

別の実施形態では、抗ＰＤ−１および／もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその機能性部分は、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ＢＭＳ−９３６５５８、ＡＭＰ−２２４、またはＭＰＤＬ３２８０Ａである。

一態様では、がんは、メラノーマ、結腸直腸がん、または乳がんである。別の態様では、２回以上の治療周期が実施される。さらなる態様では、２〜８回の治療周期が実施される。一様式では、治療周期は毎週または隔週である。

追加的な目的および利点は、一部は続く説明に記載され、一部は説明から明白であり、または実施によって習得されてもよい。目的および利点は、特に添付の特許請求の範囲で指摘される、構成要素および組み合わせの手段によって実現化され達成される。

上述の一般的な説明および以下に述べる詳細な説明は、どちらも具体例であって、例示だけを目的としており、特許請求の範囲の限定を意図するものではない。

本明細書に組み込まれてその一部を構成する添付図面は、１つの（いくつかの）実施形態を例証し、記述と共に、本明細書に記載される原理を説明するのに役立つ。

図１Ａ−Ｆは、分割放射線療法の活性を増強する、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１系の遮断を例証する。ＡおよびＢは、２Ｇｙの１日分割量５回での約１０Ｇｙによる処置の１、３または７日後に、腫瘍から単離されたＣＴ２６細胞上における、ＰＤ−Ｌ１発現の中央値蛍光強度（Ａ）、および典型的なヒストグラム（Ｂ）である。ＣおよびＤは、単独で、または１０ｍｇ／ｋｇ ３ｑｗで最高３週間投与されるαＰＤ−１（Ｃ）またはαＰＤ−Ｌ１（Ｄ）ｍＡｂのどちらかとの併用で、２Ｇｙの１日分割量５回で送達される約１０Ｇｙ ＲＴを投与された、ＣＴ２６腫瘍を有するマウスである。Ｅは、単独で、またはαＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂとの併用で、４Ｇｙの１日分割量５回で送達される２０Ｇｙ ＲＴを投与された、４Ｔ１腫瘍を有するマウスにおける治療開始１０日後の腫瘍体積である。Ｆは、単独で、またはαＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂとの併用で、２Ｇｙの１日分割量５回で送達される約１０Ｇｙ ＲＴを投与された、４４３腫瘍を有するマウスである。実験群は、少なくとも７匹のマウスを含み、少なくとも２つの独立した実験を代表する。Ａ、ＥおよびＦは、平均値±ＳＥＭを示す。^*、Ｐ＜０．０５^**、Ｐ＜０．０１、マンホイットニー検定。ＣおよびＤ、^*、対照マウスと比較した有意性を示す。⁺、単剤療法と比較した有意性を示す。^***/+++、Ｐ＜０．００１、ログランク（マンテル・コックス）検定。 図２Ａ−Ｃは、分割ＲＴおよびαＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂ組み合わせの治療活性が、ＣＤ８＋Ｔリンパ球の活性に依存することを示す。Ａは、５回の２ＧｙとαＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂとの併用療法の７日および１１日後における腫瘍体積である。免疫細胞サブセット（ＣＤ８、ＣＤ４またはＮＫ細胞のいずれか）は、治療法の１日前に枯渇され、枯渇は２週間にわたり維持された。^***、Ｐ＞０．００１、^*、Ｐ＞０．０１、^*、Ｐ＞０．０５、マンホイットニー検定。Ｂ、生存曲線。^***/+++、Ｐ＜０．００１、ログランク（マンテル・コックス）検定。コホートあたり１０匹のマウスを代表するデータ。Ｃは、免疫細胞サブセットの枯渇を裏付ける、末梢血の典型的な密度プロットである。 図３Ａ−Ｃは、分割ＲＴおよびαＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂの組み合わせが、保護的免疫記憶を生じることを示す。Ａは、５×１０⁵個のＣＴ２６細胞の対側性再チャレンジに続く、ＬＴＳマウスの生存曲線である。^*Ｐ＜０．０５対照マウスとの比較（ログランク；マンテル・コックス検定）。Ｂは、腫瘍未感作、または最初にＲＴおよびαＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂで処置されたＬＴＳマウスのどちらかから単離された、ＣＤ８⁺Ｔ細胞によるＩＦＮγ生産の典型的なドットブロットである。Ｃは、Ｈ２−Ｌｄ拘束性ペプチド（ＡＨ１（ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ）（配列番号９１）；規定のＣＴ２６腫瘍関連抗原またはβ−ガラクトシダーゼ（ＴＰＨＰＡＲＩＧＬ）（配列番号９２）；原核生物起源の対照ペプチド）、または５日間にわたり５０Ｇｙを照射されたＣＴ２６細胞のいずれかとの共培養と、それに続く５０Ｇｙ照射されたＣＴ２６細胞によるプライミングに続いて、腫瘍未感作、または最初にＲＴおよびαＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂで処置されたＬＴＳマウスのどちらかから単離された、ＩＦＮγ⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞の出現頻度である。^*Ｐ＜０．０５（マンホイットニー検定）。２つの独立した実験データを代表するデータ。 図４Ａ−Ｃは、分割ＲＴが、生体内で腫瘍細胞ＰＤ−Ｌ１発現を増大させ、ＣＤ８⁺Ｔ細胞に依存することを例証する。Ａは、生体外ＲＴ（２．５〜１０Ｇｙ）による処置後における、ＣＴ２６細胞上のＰＤ−Ｌ１の発現である。ＢおよびＣは、ＣＤ８、ＣＤ４またはＮＫ細胞枯渇抗体のいずれかとの併用で、２Ｇｙの１日分割量５回で約１０Ｇｙを投与された３日後に腫瘍から単離された、（ＣＤ４５^-細胞としてゲートされた）ＣＴ２６細胞上のＰＤ−Ｌ１発現の典型的な等高線図（Ｂ）および中央値蛍光強度（Ｃ）である。^*Ｐ＜０．０５（マンホイットニー検定）。実験群は、少なくとも５匹のマウスを含み、少なくとも２つの独立した実験を代表する。 図５Ａ−Ｅは、分割ＲＴに続いて、ＣＤ８⁺Ｔ細胞のＩＦＮγ生産が、腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１発現上方制御に関与することを示す。Ａは、２０ｎｇ／ｍｌＩＦＮγ、ＴＮＦαのどちらかとのまたは双方のサイトカインとの組み合わせとの２４時間にわたる共培養に続く、野生型ＣＴ２６腫瘍細胞（ＷＴ）、または非標的化対照（ＮＴＣ）またはＩＦＮγＲ１ ＳｈＲＮＡのどちらかによる形質導入細胞上のＰＤ−Ｌ１発現である。Ｂは、ＰＢＳまたはホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）およびイオノマイシンのどちらかによる処置に続く、ＣＤ８⁺Ｔ細胞によるＩＦＮγおよびＴＮＦαｂｙの発現を示す典型的な密度プロットであり、Ｃは、ＰＢＳまたはＰＭＡ／イオノマイシン活性化脾細胞のどちらかとの２４時間の共培養に続く、ＰＤ−Ｌ１陽性ＣＴ２６腫瘍細胞（ＷＴ、ＮＴＣ ＳｈＲＮＡまたはＩＦＮγＲ１ ＳｈＲＮＡ）の出現頻度である。ｎ／ｓ＝Ｐ＞０．０５、^***Ｐ＜０．００１^**Ｐ＜０．０１（両側スチューデントｔ検定）。ＤおよびＥは、生体内のαＩＦＮγブロッキングｍＡｂ（またはアイソタイプ対照）の存在下における、ＲＴ（５回の分割量で約１０Ｇｙ）による処置に続く、ＣＴ２６腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１発現の典型的な等高線図（Ｄ）および中央値蛍光強度（Ｅ）である。^**Ｐ＜０．０１（マンホイットニー検定）。実験群は、少なくとも５匹のマウスを含んだ。 図６Ａ−Ｄは、投与計画が予後に影響することを示し、ＲＴ相乗作用は同時αＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂ療法のみで観察され、逐次療法では観察されない。Ａは、投与日程計画研究のスキーマである。マウスは、ＲＴ周期１日目（スケジュールＡ）、ＲＴ周期５日目（スケジュールＢ）、またはＲＴ最終投与の７日後（スケジュールＣ）のいずれかに開始して、単独で、またはαＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂとの併用で、（２Ｇｙの１日分割量５回で約１０Ｇｙとして）分割ＲＴを投与された。Ｂ、治療法の生存曲線。⁺⁺、Ｐ＜０．０１単剤療法との比較（ログランク；マンテル・コックス検定）。ＣおよびＤは、ＲＴ最終投与の２４時間および７日後における、ＰＤ−１ｏｎＣＤ４⁺（Ｃ）およびＣＤ８⁺（Ｄ）Ｔ細胞の発現である。^*Ｐ＜０．０５（マンホイットニー検定）。実験群は、少なくとも５匹のマウスを含み、少なくとも２つの独立した実験を代表する。 図７は、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の双方の遮断が、ＣＴ２６−腫瘍を有するマウスにおいて、分割ＲＴとの併用で有効性をさらに向上させないことを示す。Ａ）単独で、または３週間にわたり３ｑｗ投与されるαＰＤ−１、αＰＤ−Ｌ１または双方のｍＡｂ組み合わせとの併用で、（２Ｇｙの１日分割量５回で約１０Ｇｙとして）分割投与されたＲＴに続く生存曲線。ｎ／ｓ、Ｐ＞０．０５、ログランク；マンテル・コックス検定。実験群は、少なくとも５匹のマウスを含み、２つの（ａｔ ２）独立した実験を代表する。 図８Ａ−Ｂは、分割ＲＴとαＰＤ−１またはαＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂのどちらかとによる併用療法が、マウスにおいて良好に耐えられたことを示す。単独で、または３週間または１週間のどちらかにわたり１０ｍｇ／ｋｇ ３ｑｗで投与されるαＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂとの併用で、２Ｇｙの１日分割量５回で送達される１０Ｇｙ ＲＴを投与された、ＣＴ２６腫瘍を有するマウス。実験群は、少なくとも７匹のマウスを含み、少なくとも２つの独立した実験を代表する。ｎ／ｓ、Ｐ＞０．０５、マンホイットニー検定。 図９Ａ−Ｃは、生体外において、αＰＤ−１またはαＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂによる腫瘍細胞の治療が、照射誘導細胞死を感作させないことを例証する。２μｇ／ｍｌのαＰＤ１またはαＰＤ−Ｌ１の存在不在下で、ＲＴ（２．５−１０Ｇｙ）で処置された、ＣＴ２６細胞（Ａ）、４Ｔ１細胞（Ｂ）、および４４３４細胞（Ｃ）のクローン原性生存曲線。 図１０Ａ−Ｃは、投与計画が、予後に影響することを示す。Ａ）ＲＴ周期１日目（スケジュールＡ）、ＲＴ周期５日目（スケジュールＢ）、またはＲＴ最終投与の７日後（スケジュールＣ）のいずれかに開始して、単独で、またはαＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂとの併用で、（２Ｇｙの１日分割量５回で１０Ｇｙとして）投与された分割ＲＴに続く腫瘍体積。ＢおよびＣ）異なる投与スケジュールにわたり、同等の腫瘍体積を示すＲＴ処置マウスの腫瘍体積。ｎ／ｓ、Ｐ＞０．０５、マンホイットニー検定。実験群は、少なくとも５匹のマウスを含み、２つの（ａｔ ２）独立した実験を代表する。 図１１は、αＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂの急性投与と慢性投与の対比は、併用療法の有効性に影響を及ぼさないことを示す。単独で、または３週間または１週間のどちらかにわたり１０ｍｇ／ｋｇ ３ｑｗで投与されるαＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂとの併用で、２Ｇｙの１日分割量５回で送達される１０Ｇｙ ＲＴを投与された、ＣＴ２６腫瘍を有するマウス。実験群は、少なくとも７匹のマウスを含み、少なくとも２つの独立した実験を代表する。ｎ／ｓ、Ｐ＞０．０５、ログランク；マンテル・コックス検定。

配列説明
表１は、検討中の実施形態で参照される特定の配列一覧を提供する。ＣＤＲは、下線付き太字で示される。

実施形態の説明
Ｉ．治療法
本方法は、少なくとも１用量（ｏｎｅ ｄｏｓｅ）の放射線療法投与と、少なくとも１用量の少なくとも１つのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬の投与を用いる、がん治療を包含する。例えば、患者においてがんを治療する方法は、少なくとも１用量の放射線療法を投与するステップと、少なくとも１つのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬を投与するステップとを含んでもよく、少なくとも１つのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬は、放射線療法の投与と同日にまたは４日後までに投与される。

がんを治療する方法は、１回（単回治療周期として）実施されてもよく、またはそれは、毎週、隔週、３週間毎、または毎月の周期などで、１回を超えて（すなわち、複数回治療周期で）実施されてもよい。方法が１回を超えて実施される場合、それは２、３、４、５、６、７、または８回以上実施されてもよい。

理論に束縛されるものではない一方で、本発明者らは、確立された同系腫瘍モデルの範囲内で、低用量の分割ＲＴが、生体内で腫瘍細胞のＰＤ−Ｌ１発現の上方制御をもたらしたことを発見した。本発明者らは、αＰＤ−１またはαＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂとの併用で送達される分割ＲＴが、効果的な抗腫瘍ＣＤ８⁺応答を生じ、それが、局所性腫瘍制御をおよび長期生存を改善し、腫瘍抗原特異的記憶免疫応答の誘導によって、腫瘍再チャレンジから保護したことを示す。ＩＦＮγのＣＤ８⁺Ｔ細胞産生は、分割ＲＴに続く腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１の上方制御に関与することが発見された。さらに、分割ＲＴの送達に対する抗ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂの日程計画は、治療成績に影響を及ぼすようであり；ＲＴと同日のまたは最初の分割ＲＴの投与の４日後までの拮抗薬の投与は、放射線療法終結の７日後を超える拮抗薬の投与に優る利点を示す。そして理論に束縛されるものではない一方で、診療所で慣例的に使用されるような分割ＲＴの低用量に応答する、腫瘍細胞ＰＤ−Ｌ１発現の上方制御は、腫瘍細胞による適応型免疫学的耐性機序のようであり；したがってＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１シグナル伝達系は、治療の失敗に潜在的に寄与する。ＲＴとＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達系遮断との併用療法は、この耐性を克服する可能性を有するが、本発明者らの前臨床試験によれば、投薬のタイミングは治療結果に影響を及ぼし、診療所への橋渡しに重要で新しい洞察を提供する。

Ａ．治療法で使用するためのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬
一実施形態では、本方法で使用するための少なくとも１つのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬は、抗ＰＤ−１および／もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその機能性部分である。

少なくとも１つのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬は、放射線療法の投与と同日にまたは４日後までに投与される。例えば、一態様では、放射線療法が治療周期の１日目に提供されるのであれば、少なくとも１つのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬もまた、治療周期の１日目に投与されてもよい（すなわち、放射線療法投与と同日）。別の態様では、放射線療法治療周期の１日目に提供されるのであれば、少なくとも１つのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬が、５日目（すなわち、４日後）に投与される。さらなる態様では、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬は、治療周期の１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目および／または７日目に投与されてもよい（単回および複数回治療スケジュールの双方を含む）。

一実施形態では、治療周期中に、少なくとも１つのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬が複数回投与される。別の実施形態では、少なくとも１つのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬が、治療周期中に２、３、４、５回以上投与される。例えば、拮抗薬は、１週間の治療周期にわたり毎週３回投与されてもよく、または上述されるような２以上週間の治療周期にわたり、毎週３回投与されてもよい。

一態様では、抗体またはその機能性部分は、これらの抗体およびその機能性部分の教示について参照により援用される、米国特許公開第２０１０／００２８３３０号明細書で開示されるものから選択される。一実施形態では、抗体は（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｆ）、ＭＥＤＩ４７３６である。

別の実施形態では、抗−ＰＤ−１および／または抗−ＰＤ−Ｌ１抗体は、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ＢＭＳ−９３６５５８、ＡＭＰ−２２４、またはＭＰＤＬ３２８０Ａである。

抗体またはその機能性部分は、治療有効量で投与される。通常、治療有効量は、対象の年齢、病状、および性別、ならびに対象の疾患の重症度によって異なってもよい。抗体またはその機能性部分の治療有効量は、約０．００１〜約３０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、または約１〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲にわたる。用量は、観察された治療効果に適するように、必要に応じて調節されてもよい。適切な用量は、治療医師によって、臨床的適応に基づいて選択される。

抗体は、ボーラス投与として投与されて、投与後最大時間にわたり抗体の循環レベルが最大化されてもよい。持続注入もまた、ボーラス投与後に使用されてもよい。

本明細書の用法では、抗体またはその機能性部分という用語は、最も広い意味で使用される。それは、従来のハイブリドーマ技術、組換え技術によって生成される、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）および／またはそれらの機能性断片などの人造であってもよい。それは、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、単一特異性抗体、二重特異性抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、動物抗体（例えば、ラクダ科動物抗体）、キメラ抗体などの未変化の免疫グロブリン分子、ならびに例えば、軽鎖を欠いている免疫グロブリン、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、抗体断片、二特異抗体、Ｆｄ、ＣＤＲ領域、または抗原またはエピトープに結合できる抗体の任意の部分またはペプチド配列などの（酵素的切断、ペプチド合成、または組換え技術などであるが、これに限定されるものではない、任意の周知の技術によって提供される）それらの部分、断片、領域、ペプチド、および誘導体の双方を含んでもよい。一実施形態では、機能性部分は、一本鎖抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ破片、またはＦ（ａｂ’）₂断片である。

抗体または機能性部分は、分子と特異的に反応する能力があり、その結果、分子が抗体に結合すれば、「結合できる」分子と言われる。抗体フラグメントまたは部分は、未変化抗体のＦｃ断片が欠如して、循環からより迅速に除去されてもよく、未変化抗体よりも低い非特異的組織結合を有してもよい。当該技術分野で周知の方法を使用して、未変化抗体から生成されもよい抗体の例は、例えば、（Ｆａｂ断片を生じる）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）₂断片を生じる）ペプシンなどの酵素を用いる、タンパク質分解的切断による。抗体部分は、上記方法のいずれかによって生成されてもよく、または組換え分子の一部の発現によって生成されてもよい。例えば、組換え抗体のＣＤＲ領域は、単離されて、適切な発現ベクターにサブクローニングされてもよい。

一実施形態では、抗体または機能性部分は、ヒト抗体である。ヒトの治療のためのヒト抗体の使用は、非ヒト配列に対する、ヒト個人における免疫学的反応のために、副作用の確率を小さくしてもよい。別の実施形態では、抗体または機能性部分はヒト化される。別の実施形態では、抗体または機能性部分はキメラ抗体である。このようにして、例えば、関心のある結合部位などの関心のある配列は、抗体または機能性部分に包含され得る。

一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、またはＩｇＥアイソタイプを有してもよい。一実施形態では、抗体はＩｇＧである。

Ｂ．治療法で使用される放射線療法
高線量イオン化照射としてもまた知られている放射線療法は、検討中の治療的アプローチの構成要素である。

一様式では、放射線療法は分割放射線療法である。一様式では、分割放射線療法は、２〜７回の分割量を含んでなる。別の実施形態では、分割放射線療法は、３〜６回の分割量を含んでなる。別の実施形態では、分割放射線療法は、４〜５回の分割量を含んでなる。一様式では、分割放射線療法は、２、３、４、５、６、または７回の分割量を含んでなる。一実施形態では、分割放射線療法は、５回の分割量を含んでなる。

一様式では、放射線療法分割量は、連日投与される。一様式では、放射線療法は、毎日２回以上の投与および／または連日投与を含んでもよい。一様式では、放射線療法分割量は、１日目、２日目、３日目、４日目、および５日目に投与される。別の様式では、放射線療法は、５回の分割量で約１０Ｇｙを含む（すなわち、各日２Ｇｙで５日間）。

加速分割（より大量に毎日または毎週投与で与えられ、治療週数を短縮させる治療）、過分割（１日に１回を超えて与えられるより小量の放射線投与）、または少分割（１日に１回以下与えられて、多くの場合、治療数を短縮させるより大量の投与）をはじめとするその他の分割スケジュールが用いられてもよい。

放射線療法は、Ｘ線、γ線、または荷電粒子であってもよい。放射線療法は、外部ビーム放射線療法または内部放射線療法（近接放射線療法とも称される）であってもよい。放射性ヨウ素などの放射性物質を使用する、全身放射線療法はまた、用いられてもよい。

外部ビーム放射線療法としては、３Ｄ立体構造放射線療法、強度調節放射線療法、画像誘導放射線療法、トモセラピー、定位的放射線治療、陽子線治療法、またはその他の荷電粒子ビームが挙げられる。

Ｃ．治療されるがん
本方法は、多様ながん型を治療するために使用されてもよい。一態様では、方法は、メラノーマ、結腸直腸がん、または乳がんを治療するのに使用されてもよい。一実施形態では、乳がんは、トリプルネガティブ乳がんである。

一実施形態では、がんは、がんは（ｃａｎｃｅｒ ｉｓ ｃａｎｃｅｒ ｉｓ）、副腎皮質腫瘍、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳腫瘍、乳がん、中枢神経系がん、子宮頸がん、胸部がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、類表皮がん、食道がん、眼がん、神経膠芽腫、神経膠腫、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質性腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、頭頸部、ホジキン病、カポジ肉腫、腎がん、喉頭および下咽頭がん、白血病、肝臓がん（肝細胞がんなど）、肺がん（非小細胞、小細胞、および肺カルチノイド腫瘍をはじめとする）、リンパ節がん、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、メラノーマ、中皮腫、口腔がん、多発性骨髄腫、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体がん、前立腺がん、小児悪性腫瘍、直腸がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺、肉腫、皮膚がん、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸線がん、喉がん、甲状腺がん、子宮がん、膣がん、または外陰がんである。

ここで、その例が添付図面で図示される検討中の例示的な実施形態に、詳細に言及する。可能であれば常に、図面全体を通じて同一参照番号が使用されて、同一または類似部分を指す。その他の実施形態は、ここで開示される明細書および実施の考察から、当業者には明らかになるであろう。実施形態は、以下の実施例でさらに説明される。これらの実施例は、特許請求の範囲を制限せず、単に特定の実施形態の明確化に役立つ。明細書および実施例は、例示としてのみ考慮され、真の範囲と精神は、以下の特許請求の範囲によって示されることが意図される。

実施例１．方法
Ａ）マウスおよび細胞株
ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７Ｂｌ／６マウスは、Ｈａｒｌａｎ、Ｕ．Ｋ．から入手された。全ての動物実験は、地方倫理委員会によって承認され、英国内務省免許の下で実施された。ＣＴ２６マウス結腸がん細胞（ＡＴＣＣ）および４４３４細胞は、ＢＲａｆＶ６００Ｅ ｐ１６^-/-マウス（Ｒｉｃｈａｒｄ Ｍａｒｉａｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＵＫ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から単離されて、ＤＭＥＭ中で維持され、４Ｔ１トリプルネガティブ乳がん（ＡＴＣＣ）は、１０％ＦＣＳ、１％Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｕ．Ｋ．）が添加されたＲＰＭＩ−１６４０中で維持された。全ての細胞株は慣例的にスクリーニングされ、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）混入の不在が確認された。

Ｂ）腫瘍治療
マウスには、５×１０⁵個のＣＴ２６、１×１０⁵個の４Ｔ１または５×１０⁶個の４４３４細胞のいずれかが皮下接種（ｓ．ｃ．）された。照射は、Ｐａｎｔａｋ ＨＦ−３２０３２０ ｋＶ Ｘ線ユニット（Ｇｕｌｍａｙ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｕ．Ｋ．）を使用して、接種の７〜１０日後に（腫瘍が少なくとも１００ｍｍ³の時点で）実施された。装置は３００ｋＶ、９．２ｍＡで操作され、Ｘ線ビームに濾過装置が装着されて２．３ｍｍ Ｃｕ半価層の放射線の質を与えた。マウスはＸ線焦点から３５０ｍｍの距離に配置されて、投与量速度は０．８０Ｇｙ／分であった。αＰＤ−１（クローンＲＭＰＩ−１４）、αＰＤ−Ｌ１（クローン１０Ｆ．９Ｇ２）（どちらもＢｉｏｌｅｇｅｎｄ）またはアイソタイプ対照ｍＡｂ（それぞれＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ）投与は、（特に断りのない限り）分割ＲＴ周期の１日目に開始されて、３ｑｗで最高３週間までのＰＢＳ中の１００μｌ／１０ｇの投与量中の１０ｍｇ／ｋｇ用量で腹腔内投与（ｉ．ｐ．）された。細胞およびサイトカイン枯渇実験マウスには、αＣＤ８ ｍＡｂ；クローンＹＴＳ１６９（Ｍ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙからの贈与）、αＣＤ４ ｍＡｂ；クローンＧＫ１．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、αＡｓｉａｌｏ−ＧＭ１（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）またはαＩＦＮγ；クローンＸＭＧ１．２（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）のいずれかが投与された。末梢血が処置中に採取され、細胞枯渇が確認された。腫瘍再チャレンジ実験では、長期生存（ＬＴＳ）マウスに、以前の腫瘍移植の最低限１００日後に、腫瘍細胞が対側性に移植された。追加的な対照マウスもまた移植を受けて、腫瘍増殖が確認された。実験群は、少なくとも５匹／群のマウスを含み、少なくとも２つの独立した実験を代表する。

Ｃ）長期生存マウスから単離されたＣＤ８⁺Ｔ細胞によるサイトカイン生産の測定
生体外刺激では、５０Ｇｙで照射された１×１０⁶個の腫瘍細胞または１μｍｏｌ／ｍｌのＨ２−Ｌｄ拘束性ペプチドＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（配列番号９１）（ＡＨ１）／ＴＰＨＰＡＲＩＧＬ（配列番号９２）（β−ガラクトシダーゼ）（Ａｎａｓｐｅｃ，Ｕ．Ｋ．）のどちらかの存在下で、ＬＴＳまたは対照マウスのどちらかからの３．５×１０⁶個の脾細胞が、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１％Ｌ−グルタミン、５０μＭの２−ＭＥおよび１０ＩＵ／ｍｌのヒト組換えＩＬ−２が添加されたＲＰＭＩ−１６４０中で、５日間にわたり培養された。実験群は３〜５匹のマウスを含み、２つの独立した実験を代表する。５日間の培養後に、３μｇ／ｍｌのＢｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｕ．Ｋ．）および１００ＩＵ／ｍｌのヒト組換え体ＩＬ−２（Ｃｈｉｒｏｎ，ＮＬ）の存在下において、１：１の比率で１６時間にわたり５０Ｇｙ照射腫瘍細胞で細胞が再刺激された。ＦＡＣＳ分析のために、細胞は洗浄されてラット抗−ＣＤ１６／３２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕ．Ｋ．）と共に培養され、非特異的結合がブロックされて、次にＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ８αｍＡｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｕ．Ｋ．）で染色された。次に細胞は、固定／透過処理されて、ＡＰＣコンジュゲートｍＡｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕ．Ｋ．）を使用して、ＩＦＮγの発現について染色された。

Ｄ）フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｔｅｒｙ）による腫瘍および免疫細胞表現形の決定
単細胞懸濁液を得るために、ｇｅｎｔｌｅＭａｃｓ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒおよびマウス腫瘍分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｕ．Ｋ．）を使用して、腫瘍が処理された。分析のために、上述されるように非特異的結合がブロックされ、多重パラメータフローサイトメトリーによって、ＣＤ４、ＣＤ８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＫ）、ＣＤ４５、ＮＫＰ４６、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の発現が調べられた（特に断りのない限り全てｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。

Ｅ）生体外同時培養
腫瘍細胞は、上述されるようなフローサイトメトリーによるＰＤ−Ｌ１発現の評価に先だって、２０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγおよび／またはＴＮＦαの存在下で２４時間にわたって培養された。共培養アッセイでは、（それぞれＰＢＳまたはホルボール１２−ミリステート１３−アセテートおよびイオノマイシン細胞刺激混合物、（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＫ）で処理された）休止または活性化脾細胞のどちらかが、腫瘍細胞と１：１の比率で共培養されて、ＰＤ−Ｌ１の腫瘍細胞発現が、上述されるように評価された。ＩＦＮγＲ１発現のサイレンシングは、ＳｈＲＮＡがある細胞のレンチウイルス形質導入によって達成された（細胞はまた、対照として非標的化ＳｈＲＮＡでも形質導入された）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＫ）。脾細胞サイトカイン産生（ＩＦＮγおよびＴＮＦα）の測定値は、上述されるような細胞内フローサイトメトリーによって測定された。

実施例２．ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の遮断はＲＴの治療効果を高める
放射線療法は、腫瘍細胞の免疫原性を調節することが示されているが、それは全身性の抗腫瘍免疫のみをもたらす、耐久性のある治療応答をめったに生じ得ない。本発明者らは、５回の分割量で約１０Ｇｙとして送達される低用量の局所性分割投与ＲＴが、腫瘍細胞のＰＤ−Ｌ１発現の増大をもたらし、発現の上昇は、ＲＴの最終投与の１、３、および５日後に、時間を整合させた未処置（ＮＴ）マウスと比較して、明白であることを示す（図１ＡおよびＢ）。この腫瘍細胞ＰＤ−Ｌ１発現のＲＴ媒介増大は、ＲＴの最終投与の７２時間後にピークに達し、それはＲＴの７日後に有意に低下するが（１および３日目における発現との比較；それぞれＰ＜０．０５およびＰ＜０．０１、マンホイットニー検定）、ＮＴマウスと比較して上昇したままである（Ｐ＜０．０５、マンホイットニー検定）。

これらの観察を所与として、本発明者らは、ＲＴに続いて生じた免疫応答が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１系を通じて制限されてもよいという仮説を立てた。５回の１日分割量で約１０Ｇｙとして送達される局所ＲＴは、ＮＴ対照と比較して、確立されたＣＴ２６腫瘍を有するマウスの生存期間を有意に改善することが認められた（図１ＣおよびＤ；Ｐ＜０．０５ログランク；マンテル・コックス検定）。本発明者らのデータは、αＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂまたはαＰＤ−１ ｍＡｂのどちらかとの併用を通じて、このＲＴ媒介局所腫瘍制御が、実質的に改善され得ることを示す（図１ＣおよびＤ；Ｐ＜０．００１ログランク；マンテル・コックス検定）。併用療法は、相乗的抗腫瘍応答をもたらし、それは、それぞれαＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂまたはαＰＤ−１ ｍＡｂとの併用でＲＴを投与された、６６％および８０％のマウスで治癒的であった。ＲＴとの併用とは対照的に、αＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂまたはαＰＤ−１ ｍＡｂのどちらかによる単剤療法は、生存期間を有意に改善しなかった（図１ＣおよびＤ；Ｐ＞０．０５ログランク；マンテル・コックス検定）。さらに、どちらかのｍＡｂのみとの併用との対比で、αＰＤ−１およびαＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂの双方との併用で、ＲＴがマウスに投与された場合に、顕著な利点は観察されなかった（図７）。

ＰＤ−Ｌ１の遮断はまた、確立された４Ｔ１腫瘍を有するマウスにおけるＲＴに対する反応を改善し、併用療法は、ＲＴのみと比較して、腫瘍量を有意に３８％低下させた（図１Ｅ；治療開始１０日後；それぞれ１８４．３±１３．５ｍｍ²対２９２．８±１４．３ｍｍ²、Ｐ＜０．０１マンホイットニー検定）および有意に改善された生存期間（Ｐ＜０．００１ログランク；マンテル・コックス検定；データ未掲載）。同様の結果はまた、確立された４４３４メラノーマを有するマウスでも観察された（図１Ｆ）。ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１のどちらかを標的化する局所ＲＴおよびｍＡｂによる併用療法は、ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７Ｂｌ／６マウスの双方で良好に耐えられた（図８ＡおよびＢ）。これらの前臨床データは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１系の遮断を通じて、確立された固形腫瘍の低用量分割ＲＴに続く予後を改善する可能性を明確に示す。

実施例３．ＮＫ細胞は併用療法に続いて局所腫瘍制御に寄与するが長期生存はＣＤ８⁺Ｔ細胞に依存する
次に本発明者らは、組み合わせＲＴおよびαＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂ療法に続いて観察された、長期腫瘍制御の基礎となる機序を調べた。最初にコロニー形成アッセイを使用して、αＰＤ−１およびαＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂが、腫瘍細胞との直接相互作用を通じて、放射線増感剤として作用しないことを確認した（図９Ａ〜Ｃ）。抗体枯渇を使用して、次に本発明者らは、ＲＴ／αＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂ併用療法に続く、抗腫瘍活性の仲介におけるエフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞の役割を調査した。本発明者らのデータは、（ＲＴ周期の１日目に開始するαＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂ療法による）５日間の分割ＲＴ周期開始の早くも７日後に、ＮＴマウスと比較して、併用療法に続いて、マウスにおける腫瘍量低下が明白であることを実証する（それぞれ２０７．５±２９．２ｍｍ²対４０９．４±８６．８８ｍｍ²；Ｐ＝０．０６７、マン・ホイットニーＵ検定）（図２Ａ）。しかし、体積を低下させるこの統計学的傾向は、ＣＤ８⁺Ｔ細胞またはＮＫ細胞のどちらかの枯渇に続いて失われ、腫瘍体積には、ＮＴコホート（それぞれＰ＝０．５２およびＰ＝０．７０、マン・ホイットニーＵ検定）からの有意差がなかったが、免疫細胞枯渇なしで併用療法を投与されたマウスよりも有意に大きかった（Ｐ＜０．０１；併用療法と対比したＣＤ８枯渇、およびＰ＜０．０５；併用療法と対比したＮＫ細胞枯渇、マン・ホイットニーＵ検定）。処置後１１日目までに、併用療法は、ＮＴ対照と比較して腫瘍量を有意に減少させた（Ｐ＜０．００１、マン・ホイットニーＵ検定）。この時点におけるＣＤ８⁺Ｔ細胞またはＮＫ細胞のどちらかの枯渇は、併用療法（それぞれＰ＜０．００１およびＰ＜０．０５、マン・ホイットニーＵ検定）の有効性を低下させる一方で、ＣＤ８⁺Ｔ細胞およびＮＫ細胞の相対的貢献度はより明白になり、ＣＤ８対ＮＫ細胞枯渇マウスで、腫瘍制御を有意に低下させる（Ｐ＜０．０５、マン・ホイットニーＵ検定）。本発明者らのデータはまた、ＣＤ４⁺Ｔ細胞の枯渇が、併用療法に続く局所腫瘍制御を改善したことも示す（それぞれ１５３．２±２７．０ｍｍ²対７２．７±１７．３ｍｍ²；Ｐ＜０．０５、マン・ホイットニーＵ検定）。

併用ＲＴ／αＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂ療法に続く早期腫瘍制御とは対照的に、長期生存（ＬＴＳ）は、ＮＫ細胞の枯渇によって影響を受けなかった（ＲＴ／αＰＤ−Ｌ１による処置に続くＬＴＳマウスの７０％対ＮＫ細胞枯渇による併用療法に続く７７．８％）（図２Ｂ）。ＣＤ４⁺Ｔリンパ球枯渇は、ＬＴＳマウスの出現頻度を７０％から８７．５％に増大させたが（組み合わせ対組み合わせ＋ＣＤ４枯渇）、これは有意差に達しなかった（Ｐ＞０．０５ログランク；マンテル・コックス検定）。しかし、ＣＤ８⁺Ｔ細胞の枯渇は、組み合わせＲＴ／αＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂ療法の治療効果を完全に抑制した（Ｐ＜０．００１ログランク；マンテル・コックス検定）。免疫細胞集団の枯渇は、末梢血液サンプル上のフローサイトメトリーによって確認された（図２Ｃ）。これらのデータは、ＮＫ細胞がいくらかの局所腫瘍制御を発現してもよい一方で、これは全生存影響を及ぼさず、ＣＤ４⁺Ｔ細胞は不必要であり、または応答を抑制さえできる一方で、ＣＤ８⁺Ｔ細胞は、ＲＴおよびαＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂによる処置に続いて、効果的な長期腫瘍制御を媒介するようであることを示唆する。

実施例４．αＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂおよびＲＴによる処置は保護的腫瘍抗原特異的記憶Ｔ細胞応答を生じる
次に本発明者らは、ＲＴおよびαＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂによる処置に続いて、免疫記憶が生じたかどうかを調べた。本発明者らは、最初にＲＴおよびαＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂで処置されたＬＴＳマウスが、対側性再チャレンジ（図３Ａ）に続いて、腫瘍を完全に拒絶できることを示す。この記憶応答を定量化するために、１００日を超える無病生存期間を有するＬＴＳマウスから脾細胞が収穫されて、ＣＴ２６腫瘍関連抗原に由来するペプチド（ＡＨ１：ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（配列番号９１））、対照ペプチド（β−ガラクトシダーゼ：ＴＰＨＡＲＩＧＬ（配列番号９３））、または照射ＣＴ２６細胞との共培養に続いて、ＩＦＮγを産生するＣＤ８⁺Ｔ細胞の能力が評価された（図３ＢおよびＣ）。本発明者らのデータは、ＡＨ１ペプチドとの共培養に続いて、ＬＴＳマウスに、未感作マウスよりも有意に高いＩＦＮγ産生ＣＤ８⁺Ｔリンパ球の出現頻度が与えられたことを示す（それぞれ６．６％±０．８対２．３％±０．２；Ｐ＜０．０５、マンホイットニー検定）。同様の応答が、脾細胞のＣＴ２６細胞との共培養に続いて観察された。ペプチドおよび腫瘍細胞の同時培養の比較は、記憶ＣＤ８⁺Ｔ細胞の出現頻度が、ＬＴＳマウスでは腫瘍細胞との共培養に続いて、ＡＨ１ペプチドとの共培養の約３倍低かったことを明らかにし、Ｔ細胞活性化の腫瘍細胞媒介抑制を反映するかもしれない。総合するとこれらのデータは、マウスモデルにおいて、ＲＴがＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１系の遮断と組み合わされた場合に、それが長期生存者において保護的免疫記憶を生じ得ることを示す。

実施例５．分画ＲＴは腫瘍細胞ＰＤ−Ｌ１発現にＣＤ８⁺Ｔ細胞依存性適応型上方制御をもたらす
最初に本発明者らは、生体外における一連のＲＴ投与による腫瘍細胞の治療が、ＰＤ−Ｌ１の発現にいかなる直接的影響も有しないことを確認した（図４Ａ）。腫瘍微小環境内のどの細胞集団が、ＰＤ−Ｌ１の腫瘍細胞発現の調節に関与するのかを同定するために、分割ＲＴ周期が、ＣＤ８、ＣＤ４またはＮＫ細胞枯渇抗体との併用でマウスに投与された。本発明者らのデータは、ＮＫ細胞でなくＣＤ８⁺Ｔ細胞の枯渇が、腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１のＲＴ媒介上方制御を完全に抑止することを示す（図４ＢおよびＣ）。興味深いことに、ＣＤ４⁺Ｔ細胞の枯渇は、腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１のＲＴ媒介上方制御をさらに増強することが分かった（ＲＴのみによる処置と比較して約２倍）。

実施例６．分画ＲＴに続く腫瘍細胞によるＰＤ−Ｌ１の適応型上方制御は、ＩＦＮγ依存性である
腫瘍微小環境内のＩＦＮγとＰＤ−Ｌ１発現（１６）の間の臨床相関、およびこの応答に対するＴＮＦαの影響（２２）を所与として、本発明者らは、本発明者らの細胞株内のＰＤ−Ｌ１に対するこれらのサイトカインの影響を評価した。腫瘍細胞と組換えＩＦＮγの共培養は、生体外でＰＤ−Ｌ１の細胞表面発現に顕著な２０倍の増大をもたらす（図５Ａ）。さらに、組換えＴＮＦαのみの添加が、腫瘍細胞のＰＤ−Ｌ１発現に影響を及ぼさない一方で、ＩＦＮγおよびＴＮＦαの双方の混合物は，ＩＦＮγのみによる発現と比較して、腫瘍細胞ＰＤ−Ｌ１発現をさらに増強し得る（約２倍）（図５Ａ）。本発明者らは、ＳｈＲＮＡを使用したＣＴ２６腫瘍細胞上のＩＦＮ−γ−受容体１（ＩＦＮγＲ１）のサイレンシングが、組換えＩＦＮγとの、またはＩＦＮγおよびＴＮＦαの双方との共培養に続いて、ＰＤ−Ｌ１の上方制御を完全に抑止することを示す（図５Ａ）。

活性化免疫細胞が、ＩＦＮγおよびＴＮＦαの産生を通じて腫瘍細胞のＰＤ−Ｌ１発現に適応変化をもたらし得るかどうかを確立するために、単離された休止（ＰＢＳ処理）および活性化（ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）およびイオノマイシン処理）脾細胞（図５ＢおよびＣ）と、ＷＴ ＣＴ２６細胞、そして非標的化ＳｈＲＮＡ（ＮＴＣ ＳｈＲＮＡ）およびＩＦＮγＲ１ ＳｈＲＮＡのどちらかで形質導入されたものを共培養した。重要なことには、これらの実験は、活性化免疫細胞が、腫瘍細胞ＰＤ−Ｌ１発現をＩＦＮγＲ１−依存様式で、生理学的に妥当なＩＦＮγおよびＴＮＦαの濃度に上昇させ得ることを示す。

生体内ＲＴに応答した、腫瘍細胞のＰＤ−Ｌ１発現に対するＩＦＮγの役割を確認するために、ＲＴが、αＩＦＮγ遮断抗体（またはアイソタイプ対照）との併用でマウスに投与された。ＩＦＮγ遮断は、ＮＴマウスにおいて、腫瘍細胞のＰＤ−Ｌ１発現を生体外培養されたＣＴ２６細胞上で観察されたレベルの２．６倍低下させ；腫瘍の移植に続いて起きるＰＤ−Ｌ１の適応型上方制御が示唆された（図５ＤおよびＥ）。しかし、ＲＴに続いて観察されたＰＤ−Ｌ１の顕著な上方制御は（ＮＴ対照と比較して２．４倍）、ＩＦＮγ遮断によって完全に抑制され、これがＲＴ処置に続くＰＤ−Ｌ１の適応型腫瘍細胞発現の駆動機構であることが確認される。

実施例７．αＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂおよびＲＴの併用日程計画は効果的な抗腫瘍免疫応答を生じる
本発明者らは、確立されたＣＴ２６腫瘍を有するマウスに、分割ＲＴ周期の１日目（スケジュールＡ）、周期の５日目（スケジュールＢ）またはＲＴ完了の７日後（スケジュールＣ）のいずれかに開始するαＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂの投与と共に、５回の分割量で約１０Ｇｙの分割ＲＴ周期が投与される、３つの異なる組み合わせスケジュールを評価した（図６Ａ）。スケジュールＡおよびＢの間で全生存期間の有意差は見られず、ＬＴＳは、それぞれ６０％および５７であった（Ｐ＞０．０５ログランク；マンテル・コックス検定）（図６Ｂおよび図１０Ａ）。対照的に、検群全体にわたる同様の腫瘍量にもかかわらず、ＲＴとそれに続く７日後のαＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂによる逐次処置（スケジュールＣ）は、ＲＴのみと比較して、全生存期間を向上させる上で完全に無効であった（それぞれ３０日間および３５日間の生存期間中央値数；Ｐ＞０．０５ログランク；マンテル・コックス検定）（図１０ＢおよびＣ）。

ＲＴの最終投与の２４時間後における、腫瘍浸潤性ＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺Ｔ細胞の解析は、時間を整合させたＮＴ対照と比較してＰＤ−１の発現増大を示す（Ｐ＜０．０５、マンホイットニー検定）（図６Ｃ）。対照的に、ＲＴの７日後には、ＣＤ４⁺Ｔ細胞上のＰＤ−１発現の変化は明白でなく、時間を整合させたＮＴ対照と比較して、ＣＤ８⁺Ｔ細胞上で有意に低下することが分かった（Ｐ＜０．０５、マンホイットニー検定）（図６Ｄ）。ＰＤ−１の発現は、一貫して、ＣＤ４⁺Ｔ細胞よりも、腫瘍浸潤性ＣＤ８⁺上でより高いことが分かった（図６ＣおよびＤ）。次に本発明者らは、ＲＴと同時の３用量のｍＡｂ、または同じもののさらに２週間の長期間投与（３ｑｗ）のどちらかがマウスに投与される、急性対長期αＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂ投与プロトコルに続いて、活性を比較した。長期αＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂ投与による、追加的な利点は観察されなかった（図１１）。

総合するとこれらのデータは、低用量分割ＲＴによる処置が、Ｔ細胞上のＰＤ−１発現の急性増大をもたらし、そしてＲＴ周期が完了するまで、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達系の遮断が遅延される逐次療法が、腫瘍反応性ＣＤ８⁺Ｔ細胞の欠失またはアネルギーのために、潜在的に無効であってもよいことを示す。

実施例８．前述の実施例の考察
低用量の分割ＲＴは、ＣＤ８⁺Ｔ細胞のＩＦＮγ産生に続発して、腫瘍細胞上におけるＰＤ−Ｌ１発現の上方制御をもたらす。メラノーマ、結腸直腸、および乳がんのマウスモデルにおいて、本発明者らは、αＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂとの併用を通じてＲＴの活性が向上され得て、長期生存マウスにおいて、腫瘍再発から保護できる免疫記憶の発生をもたらすことを示す。さらに、本発明者らのデータは、投与計画が予後に影響を及ぼしてもよく、同時のしかし逐次でない治療法が、局所腫瘍制御および生存期間を改善するのに効果的であることを示す。

これは、分割ＲＴが、ＣＤ８⁺Ｔ細胞のＩＦＮγ ＰＤ−Ｌ１産生を通じて、腫瘍細胞発現の増大をもたらすことを示す、最初の前臨床試験である。ここで、腫瘍細胞のＰＤ−Ｌ１発現は、局所性抗腫瘍応答の生物マーカーの機能を果たしてもよく、局所ＲＴが、ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を刺激するのに十分であってもよいことが示唆される。しかし、ＲＴのみによる処置が持続性の抗がん免疫を生じ得ない一方で、活性は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１のどちらかのｍＡｂ媒介遮断を通じて向上されることが分かり、この系を介するシグナル伝達系が、ＲＴに対する免疫応答を制限してもよいことが示唆される。本発明者らは、αＰＤ−１またはαＰＤ−Ｌ１のどちらかとの併用、または双方のｍＡｂとの併用で到達されるＲＴの間で、全生存期間における有意差を観察しなかった。この観察を所与として、ＲＴとの併用で送達される場合、これらのｍＡｂの活性は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達の遮断を通じて起こり、ＰＤ−Ｌ１／ＣＤ８０またはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２系を通じて媒介されないようであるが、これを確認するためにはさらなる実験が必要である。

本発明者らの前臨床データは、ＮＫ細胞の枯渇が、初期時点で（ＲＴ完了の最高１１日後）局所腫瘍制御を低下させるが、全生存期間には影響を及ぼさなかったことを示す。さらに、ＮＫ細胞の枯渇は、ＲＴに続く腫瘍細胞のＰＤ−Ｌ１発現に影響を及ぼさず、局所ＩＦＮγ産生に対するそれらの限定的貢献度が示唆された。対照的に、併用療法に続いて、ＣＤ４⁺Ｔ細胞の枯渇が生存期間に影響を及ぼさなかった一方で、ＲＴ後の腫瘍細胞のＰＤ−Ｌ１発現のかなりの増大が観察された。ＣＤ４⁺Ｔ細胞の枯渇は、ヘルパーＴ細胞およびＴｒｅｇ数の双方に影響する。これらのＣＤ４⁺Ｔ細胞亜集団の相対的貢献度を描写するためにはさらなる研究が必要であるが、本発明者らは、本発明者らのモデルにおいて、ＲＴ／ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂ治療法の後に効果的なＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を生じるのに、ＣＤ４⁺ヘルパーＴ細胞が不要であり、どちらかのヘルパーＴ細胞、おそらくはＴｒｅｇが、局所腫瘍環境内でＩＦＮγ産生を能動的に抑制してもよいと推測し得る。したがって、Ｔｒｅｇ枯渇によって抗腫瘍応答を促進する治療能力は、腫瘍細胞のＰＤ−Ｌ１発現向上を通じて、少なくとも部分的に減衰されてもよい。

ＰＤ−Ｌ１発現は、１型および２型ＩＦＮ、ＴＮＦα、およびＴＧＦβをはじめとするいくつかのサイトカインによって調節され得る（１６，２２，３０−３２）。本発明者らは、腫瘍細胞のＰＤ−Ｌ１発現が、ＩＦＮγとの共培養に続いて向上され得て、ＴＮＦαの添加が、この反応をさらに増強し得ることを示す。しかし、ＩＦＮγＲ１の遮断またはＩＦＮγの生体内枯渇は、ＰＤ−Ｌ１の上方制御のＩＦＮγ媒介シグナル伝達への依存を実証し、ＴＮＦαのみでは腫瘍細胞ＰＤ−Ｌ１発現は調節できない。興味深いことに、ＩＦＮγの生体内枯渇は、同系腫瘍細胞上でＰＤ−Ｌ１発現を低下させて、生体外における腫瘍細胞発現プロファイルと一致する。これは、治療的介入不在下における局所腫瘍微小環境が、腫瘍発生を支持してもよい免疫学的に駆動される腫瘍適応を助長してもよいことを提案する。同様に、ヒトメラノサイト病変では、ＰＤ−Ｌ１の発現がＣＤ８⁺Ｔ細胞浸潤領域と共局在化することが示されており、免疫逃避の適応機序に相当することが想定される（１６）。しかし、本発明者らの前臨床マウスモデルでは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１標的化ｍＡｂによる単剤療法は、軽微な活性のみを実証し、この系のみを標的化することが、全ての状況で持続性の抗腫瘍免疫応答をもたらしそうにないことが示唆され、コンビナトリアルアプローチに対する必要が強調される。

単回１２Ｇｙ投与（３０）の使用とは対照的に、本発明者らの結果は、１日分割量を５回で約１０Ｇｙを使用する分割ＲＴ送達を伴うはるかにより低い生物学的有効量で、ＰＤ−Ｌ１の上方制御が生じることを示す。この分割投与が日常的臨床診療でより一般に使用されることを考えると、これは重要な発見である。いくつかの研究が、ＲＴ分割投与の影響を評価しており；抗腫瘍免疫応答発生と腫瘍微小環境について、単回切除用量、少分割、および分割ＲＴを比較している（４、５、２５、２６、３３、３４）。しかしこれらの研究の結果は曖昧であり、最適ＲＴ送達および腫瘍細胞のＰＤ−Ｌ１発現に対するＲＴ分割投与の影響は、さらに研究を要する。

以前は、いかなる研究もＲＴおよびαＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂ療法に対する、活動順序の影響に対処していなかった。これは、診療所において、耐容性を最大化するストラテジーとして、順序組み合わせ計画を採用する傾向を考えると、特に適切である。本発明者らは、ＲＴ送達時点のＰＤ−Ｌ１遮断のみが、マウスモデルにおいて治療反応を向上させ得て、ＲＴ完了７日後の治療が、もはやＲＴのみによる処置より良好ではないことを示す。さらに、本発明者らのデータは、分割ＲＴ周期完了の２４時間後までにＰＤ−Ｌ１発現が上昇し、少なくとも完了７日後も依然として上昇したまであることを示す。さらに、本発明者らは、対照コホートと比較して、ＲＴの２４時間後における、腫瘍浸潤性ＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺Ｔ細胞上のＰＤ−１発現上昇を発見した。ＰＤ−１の発現は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞との対比でＣＤ８⁺上で、一貫してより高いことが分かった。総合するとこれらのデータは、局所分割ＲＴが、抗腫瘍ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を刺激し得るが、これらは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１系を介するシグナル伝達によって減衰されてもよく、この系の初期阻害が、持続性の有効な抗腫瘍応答を生じてもよいことを示唆する。さらに、ＲＴと組み合わせた場合における、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１系の急性遮断と対比した慢性遮断に対する必要は、不明確である。本発明者らは、最高３週間の長期スケジュールとの対比で、１週間にわたりＲＴ送達と同時にαＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂが３ｑｗで投与された場合の生存期間の差異を観察しなかった。これらのデータは、ＲＴとの組み合わせアプローチが、治療的抗腫瘍免疫応答を達成するのに要するαＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂ療法の持続期間を低下できるようにしてもよいことを示唆する。総合してこれらのデータは、臨床試験デザインに対して重要な意味を有する。

要約すると、この治験は、分割ＲＴによる処置が腫瘍細胞のＰＤ−Ｌ１発現に上方制御をもたらし、がんの複数同系マウスモデルにおいて、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１系の遮断が、分割ＲＴに対する免疫応答を向上させ得ることを実証する。本発明者らのデータは、ＲＴとαＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂの投与計画が、腫瘍量を低下させ生存期間を改善する能力によって、治療的免疫応答を生じてもよいことを示唆する。この治療組み合わせは、ＲＴが一般に使用される多くの固形悪性腫瘍の治療に取り組む上で有望であってもよく、初期臨床試験への橋渡しが、明らかに正当化される。

実施例９．治療プロトコル
患者Ａは、結腸直腸がんを有する。１週目に、患者Ａには、５回の分割量（ｆｒａｃｔｏｐｍｓ）で、有効量の放射線療法が投与される。１週目に、患者Ａには、１日目、３日目、および５日目に、ＭＥＤＩ４７３６の治療用量もまた投与される。患者Ａは、このスケジュールを２、３、４、および５週目に反復する。

患者Ｂは、乳がんを有する。１週目に、患者Ｂには、有効量の放射線療法が投与される。１週目に、患者Ｂには、５日目に治療用量のＭＥＤＩ４７３６もまた投与される。患者は、このスケジュールを３、５、および７週目に反復する。

実施例１０．特定の実施形態
以下の項目は、本明細書で開示される特定の実施形態を提供する。

項目１．
ａ．少なくとも１用量の放射線療法を投与するステップと；
ｂ．少なくとも１つのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬を投与するステップと
を含み、少なくとも１つのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬が、放射線療法の投与と同日にまたは４日後までに投与される患者においてがんを治療する方法。

項目２．少なくとも１つのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬が、少なくとも１つのＰＤ−１および／もしくはＰＤ−Ｌ１抗体またはその機能性部分である、項目１の方法。

項目３．放射線療法の前記用量が約１１Ｇｙ以下である、項目１〜２のいずれか１つの方法。

項目４．放射線療法の前記用量が約１０Ｇｙ以下である、項目３の方法。

項目５．放射線療法が分割放射線療法である、項目１〜４のいずれか１つの方法。

項目６．分割放射線療法が、２〜７回の分割量を含む、項目５の方法。

項目７．分割放射線療法が、５回の分割量を含む、項目６の方法。

項目８．放射線療法分割量が連日投与される、項目５〜７のいずれか１つの方法。

項目９．放射線療法分割量が１日目、２日目、３日目、４日目、および５日目に投与される、項目５〜８のいずれか１つの方法。

項目１０．放射線療法が５回の分割量で約１０Ｇｙを含む、項目７〜９のいずれか１つの方法。

項目１１．少なくとも１つのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬が１日目に投与される、項目１〜１０のいずれか１つの方法。

項目１２．少なくとも１つのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬が５日目に投与される、項目１〜１１のいずれか１つの方法。

項目１３．少なくとも１つのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬が複数回投与される、項目１〜１２のいずれか１つの方法。

項目１４．少なくとも１つのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬が毎週３回投与される、項目１〜１３のいずれか１つの方法。

項目１５．抗ＰＤ−１および／もしくはＰＤ−Ｌ１抗体またはその機能性部分がＭＥＤＩ４７３６である、項目１〜１４のいずれか１つの方法。

項目１６．抗ＰＤ−１および／もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその機能性部分が、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ＢＭＳ−９３６５５８、ＡＭＰ−２２４、またはＭＰＤＬ３２８０Ａである、項目１〜１５のいずれか１つの方法。

項目１７．がんがメラノーマ、結腸直腸がん、または乳がんである、項目１〜１６のいずれか１つの方法。

項目１８．２回以上の治療周期が実施される、項目１〜１７のいずれか１つの方法。

項目１９．２〜８回の治療周期が実施される、項目１８の方法。

項目２０．治療周期が毎週である、項目１８〜１９のいずれか１つの方法。

項目２１．治療周期が隔週である、項目１８〜１９のいずれか１つの方法。

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同等物
前述の書面による明細書は、当業者が実施形態を実施できるようにするのに十分であると見なされる。前述の説明および実施例は、特定の実施形態を詳述し、本発明者らによって検討される最良の態様を記載する。しかし、前述の事項がテキスト中でいかに詳述されたとしても、実施形態は、多くの様式で実施されてもよく、特許請求の範囲はそれらの任意の同等物を含むことが理解されるであろう。

本明細書の用法では、約という用語は、明示的に示されるか否かを問わず、例えば、整数、分数、および百分率をはじめとする数値を指す。約という用語は、通常、当業者が列挙された値と同等であると見なす（例えば、同一機能または結果を有する）、一連の数値（例えば、列挙された値の＋／−５〜１０％）を指す。場合によっては、約という用語は、最も近い有効数字に端数を丸めた数値を含んでもよい。

Claims (20)

1. ａ．少なくとも１用量の放射線療法を投与するステップと；
   ｂ．少なくとも１つのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬を投与するステップとを含み、少なくとも１つのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬が、放射線療法の投与と同日にまたは４日後までに投与される、患者においてがんを治療する方法。
2. 前記少なくとも１つのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬が、少なくとも１つのＰＤ−１および／もしくはＰＤ−Ｌ１抗体またはその機能性部分である、請求項１に記載の方法。
3. 放射線療法の前記用量が約７０Ｇｙ以下である、請求項１に記載の方法。
4. 放射線療法の前記用量が約５０Ｇｙ以下である、請求項３に記載の方法。
5. 前記放射線療法が分割放射線療法である、請求項４に記載の方法。
6. 前記分割放射線療法が、２〜７回の分割量を含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記分割放射線療法が、５回の分割量を含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記分割放射線療法が、連日投与される、請求項７に記載の方法。
9. 前記分割放射線療法が、１日目、２日目、３日目、４日目、および５日目に投与される、請求項８に記載の方法。
10. 前記放射線療法が、５回の分割量で約７０Ｇｙを含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記少なくとも１つのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬が、１日目に投与される、請求項１に記載の方法。
12. 前記少なくとも１つのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬が、５日目に投与される、請求項１に記載の方法。
13. 前記少なくとも１つのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬が、複数回投与される、請求項１に記載の方法。
14. 前記少なくとも１つのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１拮抗薬が、週に３回投与される、請求項１３に記載の方法。
15. 前記抗ＰＤ−１および／もしくはＰＤ−Ｌ１抗体またはその機能性部分がＭＥＤＩ４７３６である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記抗ＰＤ−１および／もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその機能性部分が、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ＢＭＳ−９３６５５８、ＡＭＰ−２２４、またはＭＰＤＬ３２８０Ａである、請求項１５に記載の方法。
17. 前記がんが、メラノーマ、結腸直腸がん、または乳がんである、請求項１に記載の方法。
18. ２回以上の治療周期が実施される、請求項１に記載の方法。
19. ２〜８回の治療周期が実施される、請求項１８に記載の方法。
20. 前記治療周期が、毎週または隔週である、請求項１９に記載の方法。