ES2934963T3 - Anticuerpos humanizados contra PSMA - Google Patents

Abstract

La presente solicitud se refiere a anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o derivados de anticuerpos humanizados y/o desinmunizados que se unen al antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) y métodos para usar dichos anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o derivados de anticuerpos en el tratamiento del cáncer de próstata y otras neoplasias. como enfermedades neurológicas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos humanizados contra PSMA

Campo de la invención

La presente solicitud se refiere a anticuerpos humanizados, a fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno o porciones de unión a antígeno de los mismos que se unen al antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), y dichos anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o porciones de los mismos para su uso en el tratamiento del cáncer de próstata.

Antecedentes

El antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), que también se conoce como glutamato carboxipeptidasa II (GCPII), N-acetil-L-aspartil-L-glutamato peptidasa I (NAALADasa I) o N-acetil-aspartilglutamato (NAAG) peptidasa, es una enzima codificada por el gen de la folato hidrolasa humana (FOLH1). El PSMA es una peptidasa de la superficie celular unida a la membrana que desempeña diferentes funciones fisiológicas y se expresa en varios tejidos como la próstata, el riñón, el intestino delgado, el sistema nervioso central y periférico. Se expresa de manera elevada por células neoplásicas epiteliales de próstata y células endoteliales vasculares de numerosos tumores malignos sólidos, incluyendo glioblastomas, cánceres de mama y de vejiga. La proteína también está involucrada en varias enfermedades neurológicas, incluidas la esquizofrenia y la ELA.

El PSMA es una glucoproteína transmembrana de clase II con una cola citoplasmática N-terminal corta de 18 aminoácidos (aa 1-18), una hélice única que atraviesa la membrana (aa 19-43) y un resto extracelular que consiste en los aa 44-750 con un peso molecular aproximado de 84 kDa (Barinka et al., 2004). Se ha demostrado que la cola citoplásmica N-terminal corta interactúa con las proteínas del andamiaje de la membrana que gobiernan la endocitosis de algunos de los sustratos unidos a PSMA, tales como la clatrina, la proteína adaptadora de clatrina 2, la filamina A (FLNa) y la caveolina-1. La parte extracelular se divide en tres dominios: la proteasa (aa 57-116 y aa 352-590), la parte apical (aa 117-351) y el dominio C-terminal o de dimerización (aa 591-750); estos restos realizan colectivamente el papel de reconocimiento de sustrato/ligando (Barinka et al., 2012) (Fig. 1). Con respecto a la secuencia de aa y la organización de dominio, la estructura extracelular en 3 dimensiones de PSMA se asemeja al receptor de transferrina (Tfr). El PSMA es enzimáticamente activo solo en su forma dimérica. Tanto la dimerización como la glucosilación son fundamentales para la correcta conformación y actividad enzimática de la molécula.

La expresión y localización del PSMA en la próstata humana normal están asociadas con el citoplasma y el lado apical del epitelio que rodea los conductos prostáticos. La transformación displásica y neoplásica del tejido prostático da como resultado la transferencia de PSMA desde la membrana apical a la superficie luminal de los conductos. Aunque originalmente se pensó que el PSMA era específico de la próstata, estudios más recientes han demostrado que también se expresa en células epiteliales (borde en cepillo) del intestino delgado, en células del túbulo renal proximal y en glándulas salivales, así como en el sistema nervioso.

En el intestino delgado, el PSMA se encuentra en el borde en cepillo del yeyuno proximal, en donde actúa como hidrolasa sobre folato poli-Y-glutamato y transporta activamente los folatos mono-glutamilados al torrente sanguíneo (Navrátil et al., 2014). Por lo tanto, presenta funciones hidrolizantes y endocíticas, al menos en seres humanos y cerdos. La internalización endocítica se produce a través de fosas recubiertas de clatrina mediante endocitosis mediada por receptores. En el sistema nervioso, el PSMA, también denominado como NAAG-Hidrolasa, cataliza la hidrólisis de NAAG, que es un neurotransmisor ampliamente distribuido en el cerebro de los mamíferos, a glutamato y N-acetilaspartato (NAA). Los diferentes papeles del PSMA en diferentes tejidos han desencadenado una amplia exploración de varios enfoques terapéuticos para dirigir la administración de fármacos y moléculas pequeñas específicamente a las células que expresan PSMa (Evans et al., 2016).

Los niveles de expresión de PSMA son más altos en los tejidos neoplásicos de diferente origen que en los tejidos normales y sanos (Evans et al., 2016; Haffner et al., 2009). Este patrón de expresión implica directamente un papel del PSMA en la progresión e invasión del cáncer y hace que la molécula sea una diana deseable para el diagnóstico y tratamiento de tumores sólidos.

Por varias razones, el PSMA es una diana ideal en el cáncer de próstata. En primer lugar, se sobreexpresa significativamente en casi todas las células de cáncer de próstata. El nivel de expresión en las células del cáncer de próstata es de 100 a 1000 veces mayor que en el tejido normal. El PSMA se expresa en casi todos los cánceres de próstata; solo el 5 % - 10 % de las lesiones de cáncer de próstata primario o cáncer de próstata tuvieron resultados negativos de PSMA en PET (Eiber et al., 2017).

En segundo lugar, su expresión aumenta aún más en estadios avanzados, en enfermedad metastásica de alto grado, en el cáncer de próstata resistente a hormonas y en el cáncer de próstata metastásico resistente a la castración (mCRPC, por sus siglas en inglés).

En tercer lugar, en contraste con otros antígenos relacionados con la próstata tales como el PSA, la fosfatasa de ácido prostético y la proteína secretora de la próstata, el PSMA no se secreta como proteína de la superficie celular de la membrana integral de tipo II y, por tanto, es una excelente diana para, por ejemplo, anticuerpos u otra terapia mediada por ligando. Después de unirse al centro activo del dominio extracelular, los ligandos de PSMA se internalizan. El reciclaje endosómico posterior aumenta la deposición, que lleva a una mayor captación del tumor, retención y posterior alta dosis local para aplicaciones terapéuticas.

En general, las metástasis del cáncer de próstata afectan con frecuencia a la médula ósea y los ganglios linfáticos, que son lugares que absorben altos niveles de anticuerpos en circulación y han respondido bien a las terapias con anticuerpos monoclonales en otros tipos de tumores como el linfoma y el cáncer de mama (Nanus et al., 2003).

En el cáncer de próstata, la expresión de PSMA está regulada negativamente por andrógenos (Israeli et al., 1993). El análisis de transcripción génica demostró que los andrógenos pueden suprimir el promotor del gen PSMA. Por tanto, el inicio de la terapia de privación de andrógenos induce una regulación positiva temprana pero temporal de la expresión de PSMA, regulación negativa bajo terapia prolongada de privación de andrógenos y, finalmente, sobreexpresión de PSMA en tumores resistentes a andrógenos. Estos efectos se podrían aprovechar potencialmente para mejorar la terapia y el diagnóstico (Eiber et al., 2017). Aunque todavía no se comprende completamente el papel directo del PSMA en la metástasis del cáncer de próstata, se ha demostrado que la terapia de ablación hormonal de andrógenos en células sensibles a los andrógenos aumenta los niveles de PSMA, y el aumento de la expresión de PSMA hace que las células sean menos invasivas. La reducción de la expresión de PSMA, por otro lado, dio como resultado un aumento de cinco veces en la actividad invasiva.

El cáncer de próstata es el cáncer que se diagnostica con mayor frecuencia en los hombres y la segunda causa más común de muerte en la civilización occidental. Debido a la importante mortalidad y morbilidad asociadas con la progresión de la enfermedad, existe una necesidad urgente de nuevos tratamientos dirigidos. Actualmente se están evaluando diversos enfoques para el tratamiento del cáncer de próstata. Las moléculas pequeñas, aptámeros o anticuerpos se utilizan como ligandos específicos para explotar PSMA para la administración dirigida de fármacos quimioterapéuticos (véase Evans et al., 2016, para revisión). Los enfoques de terapia génica dirigidos a PSMA basados en, por ejemplo, ARNi, ARN antisentido o aptámeros, se están evaluando en la actualidad, así como la terapia génica suicida mediada por PSMA. En radioinmunoterapia que actualmente se utiliza en aproximadamente el 25 % de los pacientes con enfermedad localizada en el cáncer de próstata (Cooperberg etal., 2010), la adición de un ligando dirigido, tal como un anticuerpo monoclonal o aptámero, a un radionúclido permite el direccionamiento de un antígeno de la superficie celular asociado al cáncer como el PSMA y, por lo tanto, la reducción de los efectos secundarios no deseados y la mejora de la dosis. Las inmunoterapias basadas en células dendríticas (DC) cebadas o linfocitos T que portan un receptor de antígeno quimérico (CAR) contra PSMA para provocar la actividad CTL contra células tumorales positivas para PSMA se encuentran en etapa clínica.

Los anticuerpos que se unen a PSMA se han descrito en la técnica anterior. El PSMA se caracterizó por primera vez por el anticuerpo monoclonal murino 7E11, que proviene de ratones inmunizados con fracciones de membrana celular parcialmente purificadas, aislado de la línea celular de adenocarcinoma de próstata humano (LNCap) (Horoszewicz et al., 1986). Este primer anticuerpo monoclonal publicado contra PSMA reconoce el extremo N-terminal (MWNLLH) del dominio intracelular de PSMA (Troyer et al., 1995).

Se han preparado cuatro anticuerpos monoclonales IgG murinos (J591, J415, J533 y E99) contra el dominio extracelular de PSMA que, a diferencia del 7E11, reconocen dos epítopos distintos no competidores ubicados en el exterior de la célula (Liu et al., 1997; Nanus et al., 2003).

Wolf et al. (2010a) generaron tres anticuerpos monoclonales anti-PSMA de ratón diferentes 3/A12, 3/E7 y 3/F11 que muestran una fuerte unión a la línea C4-2 de la subcélula LNCaP de cáncer de próstata positivo para PSMA con concentraciones medias de saturación semimáxima de entre 9 y 17 nM (documento EP 1883698 B2). Los anticuerpos tiñeron las células epiteliales de todas las muestras de tejido prostático normal y tumoral analizadas. Como se revela en estudios de unión competitiva, los tres anticuerpos monoclonales se unen a diferentes epítopos extracelulares de PSMA. Se descubrió que el epítopo de 3/A12 estaba cerca o se solapaba parcialmente con el del anticuerpo J591.

Un fragmento de anticuerpo monocatenario anti-PSMA (scFv), denominado D7, aislado por presentación de fagos del anticuerpo monoclonal 3/F11, se utilizó para la construcción de una inmunotoxina mediante ligación en C-terminal de la exotoxina A de Pseudomonas al ADNc de D7; esta inmunotoxina inhibió el crecimiento de células de cáncer de próstata positivas para PSMA in vitro, así como in vivo (Lobo et al., 2010b).

En contraste con los resultados obtenidos con los anticuerpos monoclonales 3/A12, 3/E7 y 3/F11 que se obtuvieron de ratones inmunizados con lisado de células LNCaP sin purificar, los mismos investigadores obtuvieron tres anticuerpos monoclonales K7, K12 y D20 de ratones inmunizados con PSMA purificado, que eran altamente reactivos solo con el antígeno aislado, pero presentaron reacción débil o nula con células LNCaP viables (Elsasser-Beile et al., 2006).

Tykvart caracterizó trece anticuerpos monoclonales de ratón específicos de PSMA diferentes en términos de su actividad de unión al antígeno natural y desnaturalizado. et al. (2014).

El documento WO2001009192 (Medarex) describe el desarrollo de anticuerpos monoclonales humanos contra el antígeno de membrana específico de la próstata. Se generaron anticuerpos monoclonales humanos anti-PSMA inmunizando ratones con PSMA purificado o preparaciones enriquecidas de antígeno PSMA. Dicho antígeno purificado es un PSMA desnaturalizado ya que se ha purificado por inmunoadsorción después de la lisis celular con detergentes iónicos.

El documento WO1997035616 (Pacific Northwest Cancer Foundation) describe anticuerpos monoclonales específicos para el dominio extracelular del antígeno de membrana específico de la próstata. Las inmunizaciones se realizaron con un péptido C-terminal o una preparación de membrana tumoral que expresa PSMA. Los anticuerpos monoclonales obtenidos no se unieron específicamente a las células que expresan PSMA y, por lo tanto, no se pueden usar con fines diagnósticos o terapéuticos.

Bander et al. (2003) desvelaron anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno de membrana específico de la próstata. Dado que la inmunización se realizó con antígeno purificado, los anticuerpos monoclonales no eran adecuados para la unión celular y no se pudo obtener scFv de ninguno de estos anticuerpos monoclonales. En el documento WO1998/03873, que describe los mismos anticuerpos o porción de unión de los mismos que reconocen un dominio extracelular de antígeno de membrana específico de la próstata, no se pudo demostrar que las porciones de unión de los anticuerpos se unan de hecho al antígeno.

El documento WO2010037836 (Micromet) describe una molécula de anticuerpo biespecífico monocatenario que comprende un primer dominio de unión capaz de unirse a un epítopo de la cadena CD3 épsilon humana y de primates no chimpancé, en donde el epítopo forma parte de una secuencia de aminoácidos comprendida en el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8, y un segundo dominio de unión capaz de unirse al antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA). La inmunogenicidad es una preocupación crítica cuando se desarrolla un fármaco basado en anticuerpos (Almagro y Fransson, 2008). Todas las proteínas exógenas utilizadas con fines terapéuticos presentan el riesgo de provocar la formación de anticuerpos anti-fármacos en los receptores (Schellekens 2002), y se ha descubierto que el uso de proteínas terapéuticas y anticuerpos de origen no humano se asocia de forma habitual con la generación de anticuerpos anti-fármacos, que a menudo lleva a la formación de inmunocomplejos perjudiciales y/o a la neutralización de los agentes terapéuticos. Además del origen y la naturaleza del anticuerpo, se ha demostrado que otros factores influyen en la inmunogenicidad, tales como el tipo de enfermedad, la vía de administración y los antecedentes genéticos de los receptores. Por tanto, por diversas razones, los anticuerpos anti-PSMA descritos anteriormente de la técnica anterior no han sido adecuados para la terapia humana, en particular debido a su potencial inmunogénico, a la falta de reconocimiento de la diana o a la afinidad de unión insuficiente.

Objetivos de la invención

En vista de la técnica anterior, por tanto, un objetivo de la presente invención era proporcionar anticuerpos humanizados, fragmentos de unión a antígeno o porciones de unión a antígeno de los mismos que se unen al antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) con alta afinidad, en particular, un epítopo del dominio extracelular de PSMA, tal como se describe en el presente documento.

Los anticuerpos, los fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno o porciones de unión a antígeno de los mismos, desvelados en el presente documento comprenden secuencias humanizadas, en particular de la región de unión al antígeno basada en VH y VL preferida que mantienen una afinidad apropiada con el ligando. Las modificaciones de la secuencia de aminoácidos para obtener dichas secuencias humanizadas pueden tener lugar en las regiones CDR y/o en las regiones marco del anticuerpo original y/o en las secuencias de regiones constantes del anticuerpo.

Otro objetivo de la presente invención era proporcionar anticuerpos que se unieran específicamente al PSMA de la superficie celular natural y, por lo tanto, tuvieran valor en aplicaciones diagnósticas y terapéuticas centradas en el PSMA como antígeno diana para el cáncer de próstata.

Era un objetivo adicional de la presente invención proporcionar compuestos para su uso en métodos para el tratamiento del cáncer de próstata.

Otro objetivo de la presente invención era proporcionar compuestos que destruyen las células de cáncer de próstata que expresan PSMA.

Otro objetivo de la presente invención era proporcionar un anticuerpo, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, con una inmunogenicidad baja o nula en humanos. Preferentemente, este anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo.

Otro objetivo de la presente invención era proporcionar conjugados de anticuerpo-fármaco (CAF) para su uso en métodos de tratamiento del cáncer de próstata.

Fue completamente sorprendente que las secuencias humanizadas de acuerdo con la presente invención, en particular, las secuencias CDR de las regiones VH y VL implicadas en la unión a la molécula diana, presentan la unión específica y fuerte como se demuestra en los ejemplos, y conservan o incluso superan las características de unión del anticuerpo murino original 3F11, sin ninguna maduración de afinidad que normalmente se requiere después de la humanización de los anticuerpos. Un experto en la materia no habría esperado que las características de unión de las variantes humanizadas fueran similares a las características de unión que el anticuerpo murino original, por no decir que incluso eran mejores. Teniendo en cuenta los cambios de secuencia en los dominios variables y, en particular, las CDR, las características de unión beneficiosas de las secuencias humanizadas demostradas en el presente documento deben considerarse un efecto técnico sorprendente.

Fue, además, completamente sorprendente que, con las secuencias humanizadas de acuerdo con la presente invención, cuando se expresa en células hospedadoras eucariotas, se obtuvieron rendimientos de expresión significativamente mejores que con las secuencias de anticuerpos originarios. La producción biotecnológica de anticuerpos humanizados, o fragmentos de anticuerpos o derivados de anticuerpos de los mismos, de acuerdo con la presente invención, por tanto, se puede realizar a un coste considerablemente menor que con las secuencias de los anticuerpos originarios.

Descripción de las figuras

Fig. 1. Representación esquemática de la proteína transmembrana PSMA como homodímero (de Evans et al., 2016).

Fig. 2. Representación esquemática de un anticuerpo. Estructura de IgG que muestra dos cadenas pesadas (H) idénticas y dos cadenas ligeras (L) idénticas. Las cadenas H tienen cuatro dominios, tres dominios C (C^h1 a C^h3) y una V^h. Las cadenas L tienen un dominio C^l y un dominio V^l. El fragmento Fv (indicado por el cuadrado) es la porción de la molécula que interactúa con el antígeno. Está compuesto por apareamiento no covalente de V^l y V^h. El fragmento Fv se muestra desde la vista de antígeno que indica la ubicación de los bucles hipervariables (de Almagro y Fransson, 2008).

Fig. 3. Alineación de secuencia de regiones variables de cadena pesada (VH) de variantes humanizadas/desinmunizadas del anticuerpo 3F11. Las sustituciones de aminoácidos frente a 3F11-ts de murino están en negrita.

Fig. 4. Alineación de secuencia de regiones variables de cadena ligera (VL) de variantes humanizadas/desinmunizadas del anticuerpo 3F11. Las sustituciones de aminoácidos frente a 3F11-ts de murino están en negrita.

Fig. 5. SDS-PAGE y tinción de Coomassie para el análisis de las variantes 13 -16 del anticuerpo 3F11 humanizado en condiciones reductoras. Se cargó 1 |jg de muestra y control por pocillo en el gel.

Fig. 6. Unión de curvas de respuesta a la dosis para variantes de anticuerpos 3F11 humanizados. Los símbolos representan la media ± EEM de muestras replicadas (n = 2 para muestras humanizadas y n = 8 para el anticuerpo quimérico 3F11-ts) para datos de unión normalizados para un experimento. Los datos transformados de MFI frente a log-dosis se normalizaron utilizando valores de MFI máximos y mínimos. R² > 0,99 en todos los casos.

Fig. 7. CE⁵⁰ unión para variantes humanizadas de anticuerpos 3F11. Los símbolos representan la CE⁵⁰ media y las barras muestran el intervalo de confianza (IC) del 95 %. Las líneas punteadas negras muestran el IC del 95 % para el anticuerpo 3F11-ts (n = 8) y las líneas punteadas rojas muestran el IC del 95 % para el 3F11-var7 (n = 1) para un experimento. La variante con la actividad de unión más alta (3F11-var7) y el anticuerpo ts están resaltados con un símbolo completo.

Descripción detallada

La divulgación técnica que se expone a continuación puede, en algunos puntos, ir más allá del alcance de la invención, que se define mediante las reivindicaciones adjuntas. Los elementos de la divulgación que no entran en el alcance de las reivindicaciones se proporcionan a título informativo, es decir, para situar la invención real reivindicada en un contexto técnico más amplio.

Tal como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una" y "el/la" incluyen referentes singulares y/o plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por añadidura debe entenderse que, en caso de que se den intervalos de parámetros delimitados por valores numéricos, se considera que los intervalos incluyen estos valores de limitación.

Tal como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se referirá a una proteína que consiste en una o más cadenas polipeptídicas codificadas por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina o ADNc derivados de los mismos. Dichos genes de inmunoglobulina incluyen los genes de la región constante kappa, lambda de cadena ligera y alfa, delta, épsilon, gamma y mu de cadena pesada, así como cualquiera de los muchos genes de región variable diferentes.

La unidad estructural básica de inmunoglobulina (anticuerpo) suele ser un tetrámero compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, las cadenas ligeras (L, que tienen un peso molecular de aproximadamente 25 kDa) y las cadenas pesadas (H, que tienen un peso molecular de aproximadamente 50-70 kDa). Cada cadena pesada está comprendida por una región variable de cadena pesada (abreviada como VH o V^h) y una región constante de cadena pesada (abreviada como CH o C^h). La región constante de cadena pesada está compuesta por tres dominios, en concreto, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera contiene una región variable de cadena ligera (abreviada como VL o V^l) y una región constante de cadena ligera (abreviada como CL o C^l). Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, que también se denominan regiones determinantes de la complementariedad (CDR) intercaladas con regiones más conservadas denominadas regiones marco (FR). Cada región VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR dispuestas del extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden de FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras forman un dominio de unión que interacciona con un antígeno.

Las CDR son más importantes para la unión del anticuerpo o la porción de unión al antígeno del mismo. Las FR pueden ser reemplazadas por otras secuencias, siempre y cuando se mantenga la estructura tridimensional que se requiere para la unión del antígeno. Los cambios estructurales de la construcción a menudo conducen a una pérdida de la unión al antígeno suficiente.

La expresión "porción de unión al antígeno" del anticuerpo (monoclonal) se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente al antígeno de membrana específico de la próstata en su forma natural. Los ejemplos de porciones de unión al antígeno del anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1, un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra, un fragmento Fd que consiste en el dominio VH y CH1, un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, y un fragmento dAb que consiste en un dominio VH y una región de determinación de la complementariedad (CDR) aislada.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo monoclonal (mAb)" se referirá a una composición de anticuerpos que tiene una población homogénea de anticuerpos, es decir, una población homogénea que consiste en una inmunoglobulina entera, o un fragmento o derivado de la misma. Particularmente preferible, tal anticuerpo se selecciona entre el grupo que consiste en IgG, IgD, IgE, IgAy/o IgM, o un fragmento o derivado de los mismos.

Tal como se usa en el presente documento, el término "fragmento" se referirá a los fragmentos de dicho anticuerpo que conservan la capacidad de unión a diana, por ejemplo, una CDR (región determinante de complementariedad), una región hipervariable, un dominio variable (Fv), una cadena pesada de IgG (que consiste en regiones VH, CH1, bisagra, CH2 y CH3), una cadena ligera de IgG (que consiste en regiones VL y CL), y/o un Fab y/o F(ab)².

Tal como se usa en el presente documento, el término "derivado" se referirá a construcciones de proteína que son estructuralmente diferentes de, pero aún así siguen teniendo alguna relación estructural con, el concepto de anticuerpo común, por ejemplo, scFv, Fab y/o F(ab)², así como construcciones de anticuerpos biespecíficas, triespecíficas o con más especificidad. Todos estos elementos se explican a continuación.

Otros derivados de anticuerpos conocidos por el experto en la materia son los diacuerpos, anticuerpos de camélido, anticuerpos de dominio, homodímeros bivalentes con dos cadenas que consisten en scFv, IgA (dos estructuras IgG unidas por una cadena J y un componente secretor), anticuerpos de tiburón, anticuerpos que consisten en una estructura de primates del nuevo mundo más una CDR de primates del viejo mundo, construcciones dimerizadas que comprenden CH3+VL+VH, otros formatos de proteína de armazón que comprenden CDR y conjugados de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo, o fragmentos o derivados del mismo, unidos a un fármaco, una toxina, una citocina, un aptámero, un ácido nucleico, tal como un ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), un polipéptido terapéutico, un radioisótopo o una etiqueta). Dichos formatos de proteína de armazón pueden comprender, por ejemplo, proteínas de anquirina y filina y otros.

Tal como se usa en el presente documento, el término "Fab" se refiere a un fragmento de IgG que comprende la región de unión al antígeno, estando dicho fragmento compuesto por un dominio constante y uno variable de cada cadena pesada y ligera del anticuerpo

Tal como se usa en el presente documento, el término "F(ab)²" se refiere a un fragmento de IgG que consiste en dos fragmentos Fab conectados entre sí por enlaces disulfuro.

Tal como se usa en el presente documento, el término "scFv" se refiere a un fragmento variable de cadena única que es una fusión de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas, unidas entre sí con un enlazador corto, que comprende por lo general de residuos de serina (S) y/o glicina (G). Esta molécula quimérica conserva la especificidad de la inmunoglobulina original, a pesar de la eliminación de las regiones constantes y la introducción de un péptido enlazador.

Los formatos de anticuerpos modificados son, por ejemplo, construcciones de anticuerpos bi- o triespecíficos, proteínas de fusión basadas en anticuerpos, inmunoconjugados y similares.

IgG, scFv, Fab y/o F(ab)² son formatos de anticuerpos que son bien conocidos por el experto en la materia. Las técnicas de apoyo relacionadas están disponibles en los respectivos libros de texto.

Los anticuerpos monoclonales (mAb) derivados de ratón pueden causar efectos secundarios inmunológicos no deseados debido a que contienen una proteína de otra especie que puede producir anticuerpos. Para superar este problema, los métodos de humanización y maduración de anticuerpos han sido diseñados para generar moléculas de anticuerpos con una inmunogenicidad mínima cuando se aplican a humanos, si bien lo ideal sería que conservaran la especificidad y la afinidad del anticuerpo parental no humano (para revisión, véase Almagro y Fransson 2008). Usando estos métodos, por ejemplo, las regiones marco de un mAb de ratón son reemplazadas por las correspondientes regiones marco humanas (el llamado injerto de CDR). El documento WO200907861 divulga la generación de formas humanizadas de anticuerpos de ratón mediante la unión de las regiones CDR de anticuerpos no humanos a las regiones constantes humanas mediante tecnología de ADN recombinante. El documento US6548640 del Consejo de Investigación Médica describe las técnicas de injerto de CDR, y el documento US5859205 de Celltech describe la producción de anticuerpos humanizados.

La humanización por injerto de CDR, sin embargo, a menudo lleva a una reducción significativa o incluso a la pérdida de la afinidad de unión, como conjunto de restos marco de soporte en la denominada zona de Vernier son importantes para mantener la conformación de las CDR (Foote y Winters 1992). Estos restos son responsables de estabilizar la estructura del bucle hipervariable y modificar su posicionamiento; ajustan la afinidad del anticuerpo. La reintroducción de restos murinos en la estructura humana (Queen et al 1989) puede abordar este problema. Estas sustituciones se denominan comúnmente "retromutaciones (back-mutations)".

La inmunogenicidad es la capacidad de inducir una respuesta de linfocitos T colaboradores (Th) que se desencadena cuando un receptor de linfocitos T único reconoce un péptido unido a moléculas de ALH (antígeno leucocitario humano) de clase II mostradas en células presentadoras de antígeno (CPA). Los péptidos se generan a partir de proteínas internalizadas por las células presentadoras de antígeno que luego se procesan a través de la vía de escisión endosomal. Solo los péptidos con suficiente afinidad por las moléculas de ALH de clase II se presentarán en la superficie celular de las CPAy posiblemente podrían desencadenar una respuesta de Th.

Mediante un proceso conocido como desinmunización es posible reducir aún más el potencial inmunogénico eliminando los epítopos de Th (Chamberlain 2002; Baker y Jones 2007). Esto se logra prediciendo qué péptidos en la proteína terapéutica respectiva pueden unirse a moléculas de ALH de clase II, y posteriormente introduciendo sustituciones que eliminan o reducen la afinidad de unión de péptidos por moléculas de ALH de clase II.

Hay varios genes de ALH de clase II y las moléculas de ALH de clase II consisten en una cadena alfa y una beta, cada una expresada a partir de un gen diferente, con variación creciente (DRA/DRB, DQA/DQB y DPA/DPB) y casi todos son altamente polimórficos; solo DRA es no polimórfico. El enfoque durante la desinmunización se encuentra en los alotipos DR que se sabe que se expresan en niveles más altos que DQ y DP. La evaluación de la relevancia de los epítopos individuales se basa en los criterios de promiscuidad, es decir, el número de alotipos de ALH a los que se une un epítopo específico, así como la importancia (frecuencia) de los alotipos en la población y una evaluación cualitativa de la fuerza de unión del complejo ALH-péptido. Como la población de linfocitos T de un individuo se ha seleccionado para no reconocer los "péptidos propios" de proteínas endógenas como los anticuerpos, es posible seleccionar la proteína que se va a desinmunizar en busca de péptidos que correspondan a péptidos propios (conocidos) que normalmente no deberían inducir una respuesta de Th.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo, un fragmento o un derivado del mismo, en el que al menos una porción de las regiones constantes y/o las regiones marco, y opcionalmente una porción de las regiones CDR, del anticuerpo proviene de o se ajusta a las secuencias de inmunoglobulina humana.

También se incluyen en el alcance de la invención variantes de secuencia de secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos reivindicadas en el presente documento que están, por ejemplo, definidas por el % de identidad de secuencia reivindicado (homología), y que mantienen dichas propiedades de los anticuerpos, fragmentos o derivados de los anticuerpos de acuerdo con la presente invención. La expresión "identidad de secuencia" se refiere al porcentaje de nucleótidos o aminoácidos idénticos cuando se realiza un alineamiento de secuencia.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "sustitución de aminoácidos" se refiere a las modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la proteína, en donde uno o más aminoácidos se remplazan con el mismo número de aminoácidos diferentes, produciendo una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos diferente a la proteína original. Se entiende que una sustitución de aminoácidos conservadores se relaciona con una sustitución que, debido a su tamaño similar, carga, polaridad y/o conformación no afecta significativamente a la estructura y función de la proteína. Los grupos de aminoácidos conservadores en ese sentido representan, por ejemplo, los aminoácidos no polares Gly, Ala, Val, Ile y Leu; los aminoácidos aromáticos Phe, Trp y Tyr; los aminoácidos cargados positivamente Lys, Arg e His; y los aminoácidos cargados negativamente Asp y Glu.

La presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado, o un fragmento de unión a antígeno o una porción de unión antígeno del mismo de acuerdo con las reivindicaciones, que se une al dominio extracelular del antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA).

A continuación, se tratarán las secuencias de CDR preferidas. Es importante comprender que las CDR están comprendidas en un marco de la proteína adecuado para que sean capaces de unirse al dominio extracelular del antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA).

También se divulga en el presente documento un anticuerpo humanizado, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, que se une al dominio extracelular de PSMA, que comprende un dominio VH que comprende las secuencias CDR de

- GX¹TX²TX³X⁴ (CDR H1), en donde X¹, X², X^a y X ^ a d a uno es Y, F, W,

- GISPGDX⁵NX⁶NYX⁷X⁸X⁹FX¹⁰G (CDR H2), en donde X⁵ es G, S; X^a es T, V; X⁷ es N, A; X⁸ es E, Q; X⁹ es N, K; X¹⁰ es K, Q; y

- DGNX¹¹PX¹²X¹³AMDS (CDR H3), en donde X¹¹, X¹², X¹³ cada uno es Y, F, W.

También se divulga en el presente documento dicho anticuerpo humanizado, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, en donde el dominio VH comprende la secuencia de CDR H1 GYTFTYF (SEQ ID NO. 1).

También se divulga en el presente documento dicho anticuerpo humanizado, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, que se une al dominio extracelular de PSMA, en donde el dominio VH comprende la secuencia de CDR H2 SEQ ID NO: 2 o el SEQ ID NO: 7 o el SEQ ID NO: 9 o el SEQ ID NO: 11. También se divulga en el presente documento dicho anticuerpo humanizado, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, que se une al dominio extracelular de PSMA, en donde el dominio VH comprende la secuencia de CDR H3 DGNFPYYAMDS (SEQ ID NO: 3).

En el presente documento se divulga un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o una porción de unión a antígeno del mismo., que se une al dominio extracelular de PSM^a , comprende un dominio V^h que comprende

• SEQ ID NO: 1 y

• SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11

• y SEQ ID NO: 3.

En el presente documento se divulga un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, que se une al dominio extracelular de PSMA, comprende un dominio VH que comprende cualquiera de las secuencias de las SEQ ID NO: 13, 15, 17 o 19.

También se divulga en el presente documento un anticuerpo humanizado, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, que se une al dominio extracelular de PSMA, que comprende un dominio VL que comprende las secuencias CDR de

- RSSQSLVHSX¹GX²TX³LH (CDR L1), en donde X¹ es N, S; X² es N, Q; X³ es Y, F, W,

- TVSNRX⁴S (CDR L2), en donde X⁴ es A, Y, F, W, y

- SQSTHVPT (CDR L3).

En el presente documento se divulga dicho anticuerpo, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende un dominio VL que comprende la secuencia CDR L1 del SEQ ID NO: 4 o el SEQ ID NO: 8 o el SEQ ID NO: 10.

En el presente documento se divulga dicho anticuerpo, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende un dominio VL que comprende la secuencia de CDR L2 del SEQ ID NO: 5 o el SEQ ID NO: 12.

En el presente documento se divulga un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende un dominio VL que comprende una combinación de

• SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10, y

• SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 12, y

• SEQ ID NO: 6.

En el presente documento se divulga un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende un dominio VL que comprende cualquiera de las secuencias de las SEQ ID NO: 14, 16, 18 o 20.

En el presente documento se divulga un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una combinación de al menos una de las secuencias de VH CDR mencionadas anteriormente y al menos una de las secuencias de VL CDR mencionadas anteriormente.

La invención se refiere a dicho anticuerpo, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción del mismo, que comprende una combinación de al menos una de las secuencias del dominio VH seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 13, 15, 17 y 19 y al menos una de las secuencias del dominio VL seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 14, 16, 18 y 20.

La invención también se refiere a cualquier anticuerpo, fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de anticuerpo de unión a antígeno descritos anteriormente., en donde el mismo se une al dominio extracelular de PSMA con afinidad de CE⁵⁰ < 0,4 pg/ml, preferentemente una afinidad de CE⁵⁰ <0,3 pg/ml, más preferentemente una afinidad de CE⁵⁰ < 0,4 pg/ml.

Como se divulga en el presente documento, dicho anticuerpo humanizado anti-PSMA, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, puede glucosilarse. El glucano puede ser una cadena de oligosacáridos N-ligados en asparagina 297 de la cadena pesada.

Dicho antígeno de membrana específico de la próstata puede ser un antígeno de membrana específico de la próstata de mamífero, no primate, primate y, en particular, humano.

El anticuerpo, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención es preferentemente de isotipo IgG.

La presente invención se refiere a un fragmento de anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste en un dominio variable (Fv), un fragmento Fab y un fragmento F(ab')² o es un Fv monocatenario (scFv).

Como se divulga en el presente documento, el anticuerpo humanizado, o fragmento de unión a antígeno o porción de unión a antígeno, tal como un scFv, descrito en la presente solicitud se unen específicamente al PSMA natural de la superficie celular y, por lo tanto, tendrán valor en aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas que se centren en el PSMA como antígeno diana para, por ejemplo, el cáncer de próstata. Dado que el PSMA se expresa en células de cáncer de próstata con una estructura terciaria y cuaternaria específica, en particular, los anticuerpos contra esta conformación celular pueden reconocer y unirse fuertemente a células de cáncer de próstata viables y tejido que expresa PSMA. Por tanto, uno de los objetivos del presente estudio fue generar dichos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígenos o porciones de unión a antígenos de los mismos, que pueden utilizarse para el direccionamiento terapéutico al cáncer de próstata.

En una realización preferida, la invención se refiere además a un conjugado de anticuerpo-fármaco (CAF, también denominado inmunoconjugado) que comprende el anticuerpo humanizado, o fragmento de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con las reivindicaciones, conjugado con un agente terapéutico, opcionalmente a través de una fracción enlazadora.

Dicho agente terapéutico podría ser, por ejemplo, un fármaco, un agente quimioterápico, un agente citotóxicotal como, por ejemplo, taxol, citocalasina B, gramicidina D, una toxina, un agente inhibidor del crecimiento, un aptámero, un ácido nucleico, tal como un ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), un polipéptido terapéutico o una sustancia radiactiva.

El CAF puede comprender una región enlazadora entre el agente terapéutico y el anticuerpo anti-PSMA, o un fragmento de anticuerpo o un derivado de anticuerpo del mismo. El enlazador se puede ser escindible mediante, por ejemplo, pero sin limitación, un agente de escisión o condiciones de pH ácidas.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un anticuerpo anti-PSMA humanizado, o fragmento de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con las reivindicaciones, estando dicho anticuerpo formulado en una formulación farmacéutica.

En forma acuosa, dicha formulación farmacéutica puede estar lista para ser administrada, mientras que en forma liofilizada dicha formulación puede ser transferida en forma líquida antes de su administración, por ejemplo, mediante la adición de agua para inyección que puede o no contener un conservante, tal como, por ejemplo, pero sin limitación, alcohol bencílico, antioxidantes como vitamina A, vitamina E, vitamina C, palmitato de retinilo, y selenio, los aminoácidos cisteína y metionina, ácido cítrico y citrato de sodio, conservantes sintéticos como los parabenos metil parabeno y propil parabeno.

Dicha formulación farmacéutica puede comprender además uno o más estabilizadores, que puede ser, por ejemplo, un aminoácido, un poliol de azúcar, un disacárido y/o un polisacárido. Dicha formulación farmacéutica puede comprender además uno o más tensioactivos, uno o más agentes isotonizantes, y/o uno o más quelantes de ion metálico, y/o uno o más conservantes.

La formulación farmacéutica, como se describe en el presente documento, puede ser adecuada para, al menos, administración intravenosa, intramuscular o subcutánea. Como alternativa, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede ser proporcionado en una formulación de liberación lenta que permite la liberación sostenida del agente biológicamente activo durante un cierto período de tiempo.

En el presente documento se divulga un envase primario, tal como una jeringa o pluma precargada, un vial, o una bolsa de infusión, que comprende dicha formulación según el aspecto anterior de la invención y/o dicho anticuerpo anti-PSMA humanizado, o fragmento o porción del mismo.

La jeringa o pluma precargada puede contener la formulación ya sea en forma liofilizada (que tiene que ser luego solubilizada, por ejemplo, con agua para inyección, antes de la administración), o en forma acuosa. Dicha jeringa o pluma suele ser un artículo desechable de un solo uso, y puede tener un volumen entre 0,1 y 20 ml. Sin embargo, la jeringa o pluma también puede ser una jeringa o una pluma multiuso o multidosis.

Dicho vial puede contener también la formulación en forma liofilizada o en forma acuosa y puede servir como dispositivo de uso único o múltiple. Como dispositivo de uso múltiple, dicho vial puede tener un volumen mayor. Dicha bolsa de infusión contiene por lo general la formulación en forma acuosa y puede tener un volumen entre 20 y 5000 ml.

Dicha formulación farmacéutica se divulga en el presente documento para el tratamiento de un trastorno médico asociado con la sobreexpresión de PSMA y comprende un anticuerpo humanizado, o fragmento de anticuerpo o derivado de anticuerpo del mismo, como se describe en el presente documento, junto con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Como se divulga en el presente documento, dicho trastorno médico asociado a la sobreexpresión de PSMA puede ser, por ejemplo, cáncer de próstata o un trastorno neurológico. Los anticuerpos anti-PSMA humanizados, o fragmentos o porciones de los mismos, pueden mediar los efectos antitumorales activando funciones inmunitarias humorales o celulares, o dirigiendo tumores con citotoxinas conjugadas o radiactividad tal como se describe anteriormente.

La presente invención se refiere a un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con las reivindicaciones, tal como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento del cáncer de próstata.

En el presente documento se divulga un método para tratar a un paciente que padece cáncer de próstata que comprende administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, como se describe en el presente documento.

En el presente documento se divulga un kit de diagnóstico para la detección de células tumorales que comprende un anticuerpo monoclonal aislado, o un fragmento de unión a antígeno o derivado del mismo, que permite la detección de los mismos después de unirse con los reactivos y dispositivos de detección adecuados. En el presente documento se divulga un método para la identificación in vitro de células tumorales mediante el cual, las células tumorales que se van a identificar se ponen en contacto con un anticuerpo monoclonal aislado, o un fragmento de unión a antígeno o porción del mismo, que lleva un marcador que puede ser detectado por dispositivos analíticos adecuados. El marcador permite la identificación diagnóstica de células tumorales, por ejemplo, en secciones de tejidos humanos obtenidos después de una cirugía o una biopsia.

La presente invención también se refiere a una célula hospedadora capaz de producir dichos anticuerpos anti-PSMA humanizados, o fragmentos de unión a antígeno o porciones de unión a antígeno de los mismos de acuerdo con las reivindicaciones. Esta puede ser una línea celular transfectada con un plásmido recombinante que contiene secuencias codificantes de dichos anticuerpos de la presente invención.

De acuerdo con otra realización preferida de la presente invención, dicha célula hospedadora es una célula de mamífero. Como se divulga en el presente documento, dicha célula hospedadora puede ser al menos una seleccionada del grupo que comprende, por ejemplo, células de riñón de cría de hámster (por ejemplo, BHK21), células de ovario de hámster chino (CHO), células de mieloma de ratón (por ejemplo, SP2/0 o NS0), células renales embrionarias humanas (por ejemplo, HEK-293), células derivadas de la retina humana (por ejemplo, PER-C6) y células de amniocitos (por ejemplo, CAP).

En una realización, la célula de mamífero es una línea celular CHO. Esta puede ser, por ejemplo, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DXB o CHO-dhfr.

La presente invención también se refiere a un ácido nucleico que codifica un anticuerpo humanizado, un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con las reivindicaciones, que se une a PSMAtal como se describe en la presente solicitud.

En una realización, la presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende

una secuencia de CDR H1 de acuerdo con el SEQ ID NO: 1,

una secuencia de CDR H2 seleccionada de cualquiera de las secuencias de acuerdo con el SEQ ID NO: 2, el SEQ ID NO: 7, el SEQ ID NO: 9 y el SEQ ID NO: 11,

una secuencia de CDR H3 de acuerdo con el SEQ ID NO: 3,

y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende

una secuencia de CDR L1 seleccionada de cualquiera de las secuencias de acuerdo con el SEQ ID NO: 4, el SEQ ID NO: 8 y el SEQ ID NO: 10,

una secuencia de CDR L2 seleccionada de cualquiera de las secuencias de acuerdo con el SEQ ID NO: 5 y el SEQ ID NO: 12, y

una secuencia de CDR L3 de acuerdo con el SEQ ID NO: 6,

pero que no comprende la combinación de una secuencia de CDR H1 de acuerdo con el SEQ ID NO: 1, una secuencia de CDR H2 de acuerdo con el SEQ ID NO: 2, una secuencia de CDR H3 de acuerdo con el SEQ ID NO: 3, una secuencia de CDR L1 de acuerdo con el SEQ ID NO: 4, una secuencia de CDR L2 de acuerdo con el SEQ ID NO: 5, y una secuencia de CDR L3 de acuerdo con el SEQ ID 6, que se une al dominio extracelular del antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA).

Para disipar cualquier duda, las 24 combinaciones posibles de dichas CDR (es decir, combinaciones de una CDR H1, una CDR H2, una CDR H3, una CDR L1, una CDR L2 y una CDR L3) se consideran descritas individualmente en la presente memoria descriptiva.

En una realización, la presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende un dominio VH que tiene al menos el 90 %, preferentemente el 95 %, de homología de secuencia con una secuencia seleccionada de cualquiera de las secuencias de acuerdo con el SEQ ID NO: 13, el SEQ ID NO: 15, el SEQ ID NO: 17 y el SEQ ID NO: 19.

En una realización, la presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una secuencia del dominio VH seleccionada de cualquiera de las secuencias de acuerdo con el SEQ iD NO: 13, el SEQ ID NO: 15, el SEQ ID NO: 17 y el SEQ ID NO: 19.

En una realización, la presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende un dominio VL que tiene al menos el 90 %, preferentemente el 95 %, de homología de secuencia con una secuencia seleccionada de cualquiera de las secuencias de acuerdo con el SEQ ID NO: 14, el SEQ ID NO: 16, el SEQ ID NO: 18 y el SEQ ID NO: 20.

En una realización, la presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una secuencia del dominio VL seleccionada de cualquiera de las secuencias de acuerdo con el SEQ iD NO: 14, el SEQ ID NO: 16, el SEQ ID NO: 18 y el SEQ ID NO: 20.

En una realización, la presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende la secuencia del dominio VH de acuerdo con el SEQ ID NO: 13 y una secuencia del dominio VL seleccionada de cualquiera de las secuencias de acuerdo con el SEQ ID NO: 14, el s Eq ID NO: 16, el SEQ ID NO: 18 y el SEQ ID NO: 20, o la secuencia del dominio VH de acuerdo con el SEQ ID NO: 15 y una secuencia del dominio VL seleccionada de cualquiera de las secuencias de acuerdo con el SEQ ID NO: 14, el SEQ ID NO: 16, el SEQ ID NO: 18 y el SEQ ID NO: 20, o la secuencia del dominio VH de acuerdo con el SEQ ID NO: 17 y una secuencia del dominio VL seleccionada de cualquiera de las secuencias de acuerdo con el SEQ ID NO: 14, el SEQ ID NO: 16, el SEQ ID NO: 18 y el SEQ ID NO: 20, o la secuencia del dominio VH de acuerdo con el SEQ ID NO: 19 y una secuencia del dominio VL seleccionada de cualquiera de las secuencias de acuerdo con el SEQ ID NO: 14, el SEQ ID NO: 16, el SEQ ID NO: 18 y el SEQ ID NO: 20.

En una realización, la presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, en donde la cadena pesada comprende cualquiera de las secuencias del SEQ ID NO: 21, el SEQ ID NO: 23, el SEQ ID NO: 25 o el SEQ ID NO: 27.

En una realización, la presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, en donde la cadena ligera comprende cualquiera de las secuencias del SEQ ID NO: 22, el SEQ ID NO: 24, el SEQ ID NO: 26 o el SEQ ID NO: 28.

En una realización, la presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende al menos una cadena pesada que comprende cualquiera de las secuencias de las SEQ ID NO: 21, 23, 25 o 27, y al menos una cadena ligera que comprende cualquiera de las secuencias de las SEQ ID NO: 22, 24, 26 o 28.

En una realización preferida, la presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende al menos una cadena pesada que comprende el SEQ ID NO: 27 y al menos una cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 28.

En una realización, la presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, que se une al dominio extracelular de PSMA con afinidad de CE⁵⁰ < 0,4 pg/ml.

En el presente documento se divulga un anticuerpo humanizado, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente divulgación, en donde el anticuerpo está glucosilado. Dicha glucosilación se puede referir a un glucano que es una cadena de oligosacáridos N-ligada en la asparagina 297 de la cadena pesada.

En una realización, la presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, en donde dicho antígeno de membrana específico de la próstata es antígeno de membrana específico de la próstata humano.

Dicho anticuerpo humanizado, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo es preferentemente del isotipo IgG.

El fragmento de anticuerpo humanizado de acuerdo con la presente invención se puede seleccionar del grupo que consiste en un dominio variable (Fv), un fragmento Fab y un fragmento F(ab')².

La porción de unión a antígeno humanizada de acuerdo con la presente invención puede ser un Fv monocatenario (scFv).

En una realización, la presente invención se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco (CAF) que comprende el anticuerpo humanizado, o fragmento de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención conjugado con un agente terapéutico, opcionalmente a través de una fracción enlazadora.

En una realización, la presente invención se refiere a una formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo humanizado, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, junto con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dicha formulación farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede ser una formulación que sea adecuada para, al menos, la administración intravenosa, intramuscular o subcutánea.

En una realización, la presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado, o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención para su uso en el tratamiento del cáncer de próstata.

En el presente documento se divulga un método para tratar a un paciente que padece cáncer de próstata que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un anticuerpo humanizado, un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o una porción de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente divulgación.

En una realización, la presente invención se refiere a un ácido nucleico que codifica un anticuerpo humanizado, un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o una porción de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención.

En una realización, la presente invención se refiere a una célula hospedadora capaz de producir un anticuerpo humanizado, un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno o una porción de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención. Dicha célula hospedadora de acuerdo con la presente invención puede ser una célula de mamífero. Preferentemente, dicha célula de mamífero de acuerdo con la presente invención es una línea celular CHO.

Los anticuerpos o fragmentos o derivados de la presente invención pueden producirse portransfección de una célula hospedadora con un vector de expresión que comprende la secuencia de codificación del anticuerpo de acuerdo con la invención. El vector de expresión o plásmido recombinante se produce colocando las secuencias de anticuerpos de codificación bajo el control de elementos genéticos reguladores adecuados, incluyendo secuencias promotoras y potenciadoras como, por ejemplo, un promotor de CMV. Las secuencias de cadenas pesadas y ligeras pueden expresarse a partir de vectores de expresión individuales que se cotransfieren, o a partir de vectores de expresión dual. Dicha transfección puede ser una transfección transitoria o una transfección estable. Las células transfectadas se cultivan posteriormente para producir la construcción de anticuerpos transfectados. Cuando se realiza una transfección estable, entonces se seleccionan clones estables que secretan anticuerpos con cadenas pesadas y ligeras adecuadamente asociadas mediante la identificación sistemática con un ensayo apropiado, tal como, por ejemplo, ELISA, subclonado, y propagado para su futura producción.

Ejemplos

La invención ha sido ilustrada y descrita en detalle en los dibujos y la descripción anterior, dicha ilustración y descripción deben considerarse ilustrativas o a modo de ejemplo. En las reivindicaciones, la palabra "que comprende/n" no excluye otros elementos o etapas, y el artículo indefinido "uno" o "una" no excluye una pluralidad. El mero hecho de que determinadas medidas se enuncien en reivindicaciones dependientes mutuamente diferentes no indica que una combinación de estas medidas no se pueda aprovechar. No se debería interpretar signo de referencia alguno en las reivindicaciones como limitante del alcance.

Todas las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento se muestran desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal; todas las secuencias de ácidos nucleicos divulgados en el presente documento se muestran en 5'->3'.

Ejemplo 1: Humanización y desinmunización del anticuerpo murino 3F11

El anticuerpo de murino anti-PSMA 3/F11 (Wolf et al., 2010a; documento EP 1883698 B2) se sometió a humanización mediante injerto de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) en una estructura aceptora seleccionada del conjunto de líneas germinales humanas.

Se realizó el inmunoperfilado con Epibase™ del 3/F11 originario contra 85 alotipos ALH de clase II, analizando epítopos o grupos de epítopos contiguos en busca de posibles sustituciones que eliminarían o reducirían la unión a los alotipos ALH con un enfoque en los alotipos ALH-DRB1. Se identificaron las posiciones críticas que componen la interfaz entre cadenas VH/VL o son responsables del conjunto discreto de estructuras canónicas de las CDR. Basándose en la alineación de secuencia de la secuencia del anticuerpo originario con las secuencias de la línea germinal humana, se identificó la secuencia de la línea germinal humana óptima más cercana como aceptor, teniendo particularmente en consideración la identidad de secuencia a través del marco, restos de interfaz entre cadenas idénticos o compatibles, bucles de soporte con las conformaciones canónicas de CDR y la combinación de líneas germinales pesadas y ligeras encontradas en anticuerpos expresados. Se descubrió que 3/F11 era más compatible con la línea germinal de cadena ligera humana VK2-A17 y la línea germinal de cadena pesada VH1-1-69 de la familia de línea germinal VK2 de cadena ligera VK2 y la familia de línea germinal de cadena pesada humana VH1, respectivamente. Para injertos de CDR, los aminoácidos en el marco originario que difieren del aceptor elegido se reemplazaron con el correspondiente aminoácido humano.

Las secuencias se analizaron en busca de posibles sitios de modificación postraduccional (desamidación de asparagina, isomerización de aspartato, recorte de lisina en C-terminal, grupos detiol Cys libres, N-glucosilación y O-glucosilación, ciclación en N-terminal, oxidación y formación de piroglutamato) que pueden causar problemas durante el desarrollo de un producto terapéutico. Los modelos estructurales de la región Fv de 3/F11 y las variantes se generaron utilizando una plataforma de modelado por simulación computacional y los fragmentos estructurales candidatos para los marcos y las CDR, así como la F^v completa se puntuaron y clasificaron.

Con el fin de evaluar el impacto de todas las sustituciones consideradas de manera eficaz, se agruparon las sustituciones cuando fue apropiado, y se seleccionaron un total de cuatro cadenas ligeras humanizadas/desinmunizadas y cuatro cadenas pesadas humanizadas/desinmunizadas. La Tabla 2 enumera el nombre de las cadenas de aminoácidos diseñadas genéticamente junto con una descripción de las modificaciones. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas diseñadas se dan en la Tabla 1. Las alineaciones de secuencia de las cadenas ligeras y pesadas humanizadas/desinmunizadas, respectivamente, se muestran en las Fig.3 y 4.

La variante de dominio variable de cadena pesada 3F11-VH-1 comprende las tres CDR de la secuencia de VH murina originaria. En la variante 3F11-VH-2, dos CDR son idénticas a la secuencia VH murina originaria, mientras que la CDR H2 difiere en cuatro posiciones de la secuencia murina originaria (aa 61-63: NEN > AQK, aa 65: K > Q). En la variante 3F11-VH-3, de nuevo, dos CDR son idénticas a la secuencia VH murina originaria, mientras que la CDR H2 difiere en cinco posiciones de la secuencia murina originaria (aa 58: T > V, aa 61-63: NEN > AQK, aa 65: K > Q). En la variante 3F11-VH-4, de nuevo, dos CDR son idénticas a la secuencia VH murina originaria, mientras que la CDR H2 difiere en seis posiciones de la secuencia murina originaria (aa 56: G > S, aa 58: T > V, aa 61-63: NEN > AQK, aa 65: K > Q).

La variante de dominio variable de cadena ligera 3F11-VL-1 comprende las tres CDR de la secuencia de VL murina originaria. En la variante 3F11-VL-2, dos CDR son idénticas a la secuencia VL murina originaria, mientras que la CDR L1 comprende una sustitución en el aminoácido N.° 35 (N > Q). En la variante 3F11-VL-3, dos CDR son idénticas a la secuencia VL murina originaria, mientras que la CDR L1 difiere en dos posiciones de la secuencia murina originaria (aa 33: N > S, aa 35: N > Q). En la variante 3F11-VL-4, CDR L1 se diferencia en dos posiciones (aa 33: N > S, aa 35: N> Q) y CDR L2 se diferencia en una posición (aa 60: F > A) de la secuencia murina originaria, y CDR L3 es idéntica a la secuencia murina originaria.

Tabla 2 : Composición de CDR de 3F11 ts y variantes de 3F11 humanizadas/desinmunizadas con sus respectivas sustituciones numeración de aminoácidos se ún Kabat et al.

3F11-VL-2 tiene opcionalmente la siguiente mutación: aa 41: F>Y. 3F11-VL-3 tiene opcionalmente la siguiente mutación: aa 41: F>Y. 3F11-VL-4 tiene opcionalmente las siguientes mutaciones: aa 41: F>Y; aa 42: L>Q, y/o aa 90: V>T.

Para evaluar el impacto de las combinaciones de sustitución, se estableció un diseño experimental de combinación de variantes tal como se describe en la Tabla 3. Mediante la combinación de las cuatro cadenas pesadas humanizadas/desinmunizadas y las cuatro cadenas ligeras humanizadas/desinmunizadas, se obtuvieron 16 anticuerpos de longitud completa humanizados/desinmunizados diferentes, que se denominan tal como se muestra en la Tabla 3.

Tabla 3 : Combinaciones de cadenas VH y VL de variantes humanizadas/desinmunizadas de 3F11 que forman 16 variantes diferentes de dominios variantes humanizados y anticuerpos de longitud completa, respectivamente. 3F11 ts com rende las cadenas VH VL murinas.

Los epítopos críticos predichos de ALH DRB1, DRB3/4/5, DQ y DP para las secuencias originarias y humanizadas/desinmunizadas se presentan en la Tabla 4. Las diferencias entre los anticuerpos originarios y las variantes en la Tabla 4 explican la eliminación respectiva de posibles epítopos.

Tabla 4 : Recuentos de epítopos críticos previstos de ALH DRB1, DRB3/4/5, DQ y DP para las secuencias ori inarias humanizadas/desinmunizadas

Ejemplo 2: Expresión y purificación de variantes humanizadas de anticuerpo anti-PSMA

Los dominios variables de cadena pesada y ligera para los anticuerpos se sintetizaron y subclonaron en vectores GS Xceed™ (Lonza). Las regiones que codifican el dominio variable de la cadena ligera se transfirieron a pXC-Kappa y las regiones que codifican el dominio variable de la cadena pesada a los vectores pXC-IgG1zadeltaK, respectivamente.

Los vectores de un solo gen (SGV, por sus siglas en inglés) se cotransfectaron transitoriamente en células de ovario de hámster chino con GS inactivado (CHOK1SV GS-KO) junto con el anticuerpo murino de referencia a una escala de 200 ml. Las transfecciones transitorias se realizaron mediante electroporación (Gene Pulse XCell, BioRad) utilizando células CHOK1SV GS-KO que habían estado en cultivo durante un mínimo de dos semanas. Las células se subcultivaron 24 horas antes de la transfección y la viabilidad celular era > 99 % en el momento de la transfección. Seis días después de la transfección, la viabilidad celular y las concentraciones de células viables se midieron en el momento de la recolección. Se descubrió que las células estaban en el intervalo de 4,4 - 7,5 x106 células viables/ml con viabilidades que varían entre el 89,0 y el 96,1 %.

Los sobrenadantes aclarados se purificaron mediante cromatografía de proteína A usando columnas HiTrap MabSelect SuRE de 5 ml preempaquetadas en un purificador AKTA mediante procedimientos convencionales. Tras eluir con formiato de sodio 10 mM, a pH 3,5, el pH de las fracciones que contienen proteína se ajustó inmediatamente mediante la adición de solución salina tamponada con fosfato 2x (PBS) para producir condiciones de tampón finales de PBS a 1x, formiato de sodio 5 mM, a pH 7,4. La Tabla 5 a continuación muestra títulos y rendimientos de productos para el anticuerpo murino originario 3F11 y las diversas variantes de anticuerpos humanizados.

Como efecto sorprendente, los inventores observaron títulos de expresión significativamente más altos para algunas de las variantes del anticuerpo anti-PSMA humanizado en comparación con el anticuerpo 3F11 murino originario (véase la Tabla AA). Con las variantes humanizadas 3F11_var2, 3F11_var6, 3F11_var9, 3F11_var11, 3F11_var13, 3F11_var15 y 3F11_var16, se obtuvieron títulos de expresión de 9,5 - 13 mg/litro, en comparación con 3,88 mg/litro para el anticuerpo 3F11 murino originario. Debido al aumento de los títulos de expresión en un factor de 3 - 4, se puede esperar que los costes de producción de productos terapéuticos basados en variantes humanizadas/desinmunizadas se reduzcan considerablemente.

Tabla 5 : Resultados de la caracterización de variantes humanizadas del anticuer o 3F11

Ejemplo 3: Caracterización bioquímica de variantes humanizadas del anticuerpo anti-PSMA

Las muestras purificadas se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y exclusión de tamaño (SE)-HPLC en un sistema de la serie Agilent 1200 utilizando una columna Zorbax GF-250 (9,4 mm DI x 25 cm) (Agilent).

En geles SDS-PAA, en condiciones no reductoras, se observó una señal a > 98 kDa para todas las variantes comparables al anticuerpo de control (IgG¹) y el 3F11 originario, que es consistente con un anticuerpo de longitud completa. En condiciones reductoras, se puede ver una señal a aprox. 28 kDa y una señal a aprox. 49 kDa para todas las variantes comparables al anticuerpo de control y al 3F11 originario, que es consistente con los tamaños de una cadena ligera y pesada de un anticuerpo, respectivamente. Los resultados representativos se muestran en la Fig. 5.

Los tiempos de retención de las variantes humanizadas de los anticuerpos monoméricos 3F11 (7,96 - 8,00 min.) en SE-HPLC fueron comparables a los del anticuerpo murino originario 3F11 (7,968 min.). Los cromatógrafos SE-HPLC para todas las muestras mostraron un pico menor adicional en tiempos de retención más bajos (aproximadamente 7,2 min.) con un área de hasta el 5,4 % que se corresponde con impurezas de mayor peso molecular, tales como agregados solubles.

Ejemplo 4: Estudios de unión celular con variantes humanizadas de anticuerpos anti-PSMA

Se evaluó la calidad y la actividad de unión de todas las variantes humanizadas de anticuerpos 3F11 en ensayos de unión celular utilizando la línea celular de carcinoma de próstata humano LNCAP (Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares, DSMZ n.° ACC 256) en un formato de ensayo basado en placa de 96 pocillos y análisis FACS basado en células. Se lavaron las células LNCAP preconfluentes al 80-90 % de confluencia y se separaron de las placas con tripsina antes de una incubación de 1 hora a 37 °C, con CO² al 5 % en los matraces para restaurar las proteínas de la superficie celular. Las células se lavaron y se ajustaron a 1x10⁶ células/ml en medio de tinción (RPMI-1640, HEPES 25 mM, h.i. al 3%, FBS y azida sódica al 0,02%). Se prepararon diversas concentraciones de las muestras de anticuerpos monoclonales (murino de ts y 16 variantes humanizadas) que variaban de 50 a 0,0032 pg/ml en medio de tinción y se incubaron con las células en placas de 96 pocillos preenfriadas durante 30 min. en hielo para permitir la unión del anticuerpo a la superficie de la célula LNCAP. Posteriormente, las células se lavaron a 4 °C con PBS para eliminar el anticuerpo libre, y el anticuerpo unido se marcó con anticuerpo secundario anti-IgG humana en cabra con FITC H&L preabsorbido (Abcam) durante 30 min. sobre hielo. Finalmente, las células se lavaron, se fijaron y se midió la fluorescencia de FITC asociada al anticuerpo unido a las células se mediante citometría de flujo (citómetro GUAVA 8HT). Los datos se analizaron utilizando el programa informático Incyte GuavaSoft 2.7 (Merck-Millipore). Los datos de dosis-respuesta obtenidos (representados como dosis transformada logarítmicamente frente a respuesta) produjeron normalmente curvas sigmoideas con pendiente variable que se ajustaron a una ecuación logística de dosis-respuesta de 4 parámetros utilizando el programa informático GraphPad Prism. La CE⁵⁰ de la dosis, definida como la concentración de anticuerpo que proporciona la mitad de la unión máxima de la célula diana, se utilizó para comparar la bioactividad de diferentes variantes de anticuerpos. Los puntos de datos representan el promedio de pocillos duplicados y el error estándar de la media (EEM). Las curvas de unión para el anticuerpo 3F11 ts originario y las dieciséis variantes humanizadas se muestran en la Fig. 6.

Bastante sorprendentemente, el ensayo de unión basado en células reveló que las dieciséis variantes humanizadas de 3F11 se unen a células que expresan PSMA con una mayor afinidad que la obtenida con el anticuerpo murino originario 3F11. La actividad de unión (CE⁵⁰) de las variantes humanizadas osciló entre 0,1784 y 0,3732 pg/ml y, en la mayoría de los casos, fue significativamente mayor (según el intervalo de confianza del 95 %, IC) que el del anticuerpo originario 3F11 (CE⁵⁰ = 0,4189 pg/ml). La 3F11-var7 mostró la mayor actividad de unión (CE⁵⁰ = 0,1784 pg/ml) seguido de cerca por 3F11-var8 y 3F11-var6 (CE⁵⁰ = 0,2040 pg/ml y CE⁵⁰ = 0,2187 pg/ml, respectivamente, véase la Tabla 6). Los resultados de un solo experimento se muestran en la Fig. 7.

T l : E ivi ni n I l r v ri n h m niz ni r F11

Estos descubrimientos fueron particularmente inesperados ya que la mayoría de las variantes humanizadas (todas las variantes que no comprendían la variante de cadena pesada 3F11_VH_1) no requirieron mutaciones inversas en las regiones marco que se extienden entre las CDR, y especialmente porque ninguna de las variantes había pasado por maduración de afinidad, que se sabe que normalmente se requiere después de la humanización de anticuerpos debido a una disminución o pérdida significativa de afinidad. Sorprendentemente, se descubrió que dicho esfuerzo adicional no era necesario con el procedimiento para la generación de variantes humanizadas y con las variantes de acuerdo con la presente invención.

Ejemplo 5: Estudios de unión celular con construcciones de scFv anti-PSMA

También se utilizaron combinaciones de las cadenas 3F11-VH-1 y 3F11-VL-1 (3F11-var1) y de las cadenas 3F11-VH-4 y 3F11-VL-4 (3F11-var16) para la generación de Fv monocatenario (scFv). Para ambas construcciones, las respectivas secuencias de dominios variables se clonaron en la composición VL-VH en el vector de expresión pHOG21 y se expresaron en células bacterianas. Después de la purificación cromatográfica de afinidad, se ensayó la unión de ambas construcciones scFv a células que expresan PSMA de la línea subcelular C4-2 de LNCAP y a células de cáncer de próstata DU145 negativas para PSMA. Ambas construcciones scFv mostraron una fuerte unión a las células C4-2, pero sin unión a las células DU145 de control negativo.

Referencias:

Almagro JC, Fransson J (2008). Humanization of antibodies. Frontiers in Bioscience Vol. 13: 1619-1633.

Baker MP, Jones TD (2007). Identification and removal of immunogenicity in therapeutic proteins. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. Vol. 10: 219-227.

Bander NH, Nanus DM, Milowsky M, Kostakoglu L, Vallabahajosula S, Goldsmith SJ (2003). Targeted systemictherapy of prostate cancer with a monoclonal antibody to prostate-specific membrane antigen. Seminars in Oncology Vol. 30, No. 5: 667-676.

Barinka C, Sácha P, Sklenár J, Man P, Bezouska K, Slusher BS et al. (2004). Identification of the N-glycosylation sites on glutamate carboxypeptidase II necessary for proteolytic activity. Protein Sci 13:1627-1635.

Barinka C, Rojas C, Slusher B, Pomper M (2012). Glutamate carboxypeptidase II in diagnosis and treatment of neurologic disorders and prostate cancer. Curr Med Chem 19: 856. Chamberlain P. (2002). Immunogenicity of therapeutic proteins. Part 1: Causes and clinical manifestations of immunogenicity. The Regulatory Review Vol. 5: 4­ 9.

Cooperberg MR, Broering JM, Carroll PR (2010). Time trends and local variation in primary treatment of localized prostate cancer. J Clin Oncol 28: 1117-1123.

Eiber M, Fendler WP, Rowe SP, Calais J, Hofman MS, Maurer T, Schwarzenboeck SM, Kratowchil C, Herrmann K, Giesel FL. (2017). Prostate-Specific Membrane Antigen Ligands for Imaging and Therapy. J Nucl Med 2017; 58:67S-76S.

Elsasser-Beile U, Wolf P, Gierschner D, Bühler P, Schultze-Seemann W, and Wetterauer U. (2006). A new generation of monoclonal and recombinant antibodies against cell-adherent prostate specific membrane antigen for diagnostic and therapeutic targeting of prostate cancer. The Prostate 66:1359-1370.

Evans JC, Malhotra M, Cryan JF and O'Driscoll CM. (2016). The therapeutic and diagnostic potential of the prostate specific membrane antigen/glutamate carboxypeptidase II (PSMA/GCPII) in cancer and neurological disease. British Journal of Pharmacology 173: 3041-3079.

Foote J and Winter G. (1992). Antibody framework residues affecting the conformation of hypervariable loops. J. Mol. Biol. 224:487-499.

Haffner MC, Kronberger IE, Ross JS, Sheehan CE, Zitt M, Mühlmann G et al. (2009). Prostate-specific membrane antigen expression in the neovasculature of gastric and colorectal cancers. Hum Pathol 40:1754-1761.

Horoszewicz JS, Kawinski E, Murphy G. (1986). Monoclonal antibodies to a new antigenic marker in epithelial prostatic cells and serum of prostatic cancer patients. Anticancer Res 7: 927-935.

Israeli RS, Powell CT, FairWR, Heston WD. (1993). Molecular cloning of a complementary DNA encoding a prostatespecific membrane antigen. Cancer Res 53: 227-230.

Liu H, Moy P, Kim S, Xia Y, Rajasekaran A, Navarro V, Knudsen B, and Bander NH. (1997). Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium. Cancer Research 57, 3629-3634.

Nanus DM, Milowsky MI, Kostakoglu L, Smith-Jones PM, Vallabahajosula S, Goldsmith SJ, and Bander NH. (2003). Clinical use of monoclonal antibody HuJ591 therapy: targeting prostate specific membrane antigen. Journal of Urology Vol. 170:S84-S89.

Navrátil M, Ptácek J, Sácha P, Starková J, Lubkowski J, Barinka C et al. (2014). Structural and biochemical characterization of the folyl-poly-Y-l-glutamate hydrolyzing activity of human glutamate carboxypeptidase II. FEBS J 281: 3228-3242.

Queen C. et al. (1989). A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. 86:10029-10033.

Schellekens, H (2002). Immunogenicity of therapeutic proteins: clinical implications and future prospects. Clin. Ther. Vol. 4: 1720-40.

Troyer J, Feng Q, Beckett M, WrightGJ. (1995). Biochemical characterization and mapping ofthe 7 E11-C5.3 epitope ofthe prostate specific membrane antigen. Urol Oncol 1(1):29-37.

Tykvart J, Navrátil V, Sedlák F, Corey E, Colombatti M, Fracasso G, Koukolík F, Bárinka C, Sácha P, and Konvalinka J. (2014). Comparative analysis of monoclonal antibodies against prostate-specific membrane antigen (PSMA). The Prostate 1-14.

Wolf P, Freudenberg N, Bühler P, Alt K, Schultze-Seemann W, Wetterauer U, and Elsasser-Beile U. (2010a). Three conformational antibodies specific for different PSMA epitopes are promising diagnostic and therapeutic tools for prostate cancer. The Prostate 70:562-569.

Wolf P, Alt K, Wetterauer D, Bühler P, Gierschner D, Katzenwadel A, Wetterauer U, and Elsasser-Beile U. (2010b). Preclinical evaluation of a recombinant anti-prostate specific membrane antigen single-chain immunotoxin against prostate cancer. J Immunother. 33:262-271.

SECUENCIAS

Las siguientes secuencias forman parte de la descripción de la presente solicitud. Con la presente solicitud se proporciona una lista electrónica de secuencias compatible con WIPO ST 25, también. Para disipar cualquier duda, si existen discrepancias entre las secuencias de la siguiente tabla y el listado de secuencias electrónicas, las secuencias de la presente tabla se considerarán correctas.

h/d, humanizado/desinmunizado; CDR, región determinante de complementariedad; FR, región marco; RC, región constante

continuación

continuación

continuación

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo humanizado, o fragmento de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende

una secuencia de CDR H1 de acuerdo con el SEQ ID NO: 1,

una secuencia de CDR H2 seleccionada de cualquiera de las secuencias de acuerdo con el SEQ ID NO: 2, el SEQ ID NO: 7, el SEQ ID NO: 9 y el SEQ ID NO: 11,

una secuencia de CDR H3 de acuerdo con el SEQ ID NO: 3,

y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende

una secuencia de CDR L1 seleccionada de cualquiera de las secuencias de acuerdo con el SEQ ID NO: 4, el SEQ ID NO: 8 y el SEQ ID NO: 10,

una secuencia de CDR L2 seleccionada de cualquiera de las secuencias de acuerdo con el SEQ ID NO: 5 y el SEQ ID NO: 12, y

una secuencia de CDR L3 de acuerdo con el SEQ ID NO: 6,

pero que no comprende la combinación de una secuencia de CDR H1 de acuerdo con el SEQ ID NO: 1, una secuencia de CDR H2 de acuerdo con el SEQ ID NO: 2, una secuencia de CDR H3 de acuerdo con el SEQ ID NO: 3, una secuencia de CDR L1 de acuerdo con el SEQ ID NO: 4, una secuencia de CDR L2 de acuerdo con el SEQ ID NO: 5 y una secuencia de CDR L3 de acuerdo con el SEQ ID 6,

que se une al dominio extracelular del antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA).

2. Anticuerpo humanizado, o fragmento de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende un dominio VH que tiene al menos el 90 %, preferentemente el 95 %, de homología de secuencia con una secuencia seleccionada de cualquiera de las secuencias de acuerdo con el SEQ ID NO: 13, el SEQ ID NO: 15, el SEQ ID NO: 17 y el SEQ ID NO: 19.

3. Anticuerpo humanizado, o fragmento de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una secuencia del dominio VH seleccionada de cualquiera de las secuencias de acuerdo con el SEQ ID NO: 13, el SEQ ID NO: 15, el SEQ ID NO: 17 y el SEQ ID NO: 19.

4. Anticuerpo humanizado, o fragmento de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende un dominio VL que tiene al menos el 90 %, preferentemente el 95 %, de homología de secuencia con una secuencia seleccionada de cualquiera de las secuencias de acuerdo con el SEQ ID NO: 14, el SEQ ID NO: 16, el SEQ ID NO: 18 y el SEQ ID NO: 20.

5. Anticuerpo humanizado, o fragmento de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una secuencia del dominio VL seleccionada de cualquiera de las secuencias de acuerdo con el SEQ ID NO: 14, el SEQ ID NO: 16, el SEQ ID NO: 18 y el SEQ ID NO: 20.

6. Anticuerpo humanizado, o fragmento de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende

la secuencia del dominio VH de acuerdo con el SEQ ID NO: 13 y una secuencia del dominio VL seleccionada de cualquiera de las secuencias de acuerdo con el SEQ ID NO: 14, el SEQ ID NO: 16, el SEQ ID NO: 18 y el SEQ ID NO: 20, o

la secuencia del dominio VH de acuerdo con el SEQ ID NO: 15 y una secuencia del dominio VL seleccionada de cualquiera de las secuencias de acuerdo con el SEQ ID NO: 14, el SEQ ID NO: 16, el SEQ ID NO: 18 y el SEQ ID NO: 20, o

la secuencia del dominio VH de acuerdo con el SEQ ID NO: 17 y una secuencia del dominio VL seleccionada de cualquiera de las secuencias de acuerdo con el SEQ ID NO: 14, el SEQ ID NO: 16, el SEQ ID NO: 18 y el SEQ ID NO: 20, o

la secuencia del dominio VH de acuerdo con el SEQ ID NO: 19 y una secuencia del dominio VL seleccionada de cualquiera de las secuencias de acuerdo con el SEQ ID NO: 14, el SEQ ID NO: 16, el SEQ ID NO: 18 y el SEQ ID NO: 20.

7. Anticuerpo humanizado, o fragmento de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la cadena pesada comprende cualquiera de las secuencias del SEQ ID NO: 21, el SEQ ID NO: 23, el SEQ ID NO: 25 o el SEQ ID NO: 27.

8. Anticuerpo humanizado, o fragmento de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la cadena ligera comprende cualquiera de las secuencias del SEQ ID NO: 22, el SEQ ID NO: 24, el SEQ ID NO: 26 o el SEQ ID NO: 28.

9. Anticuerpo humanizado, o fragmento de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende al menos una cadena pesada que comprende cualquiera de las secuencias de las SEQ ID NO: 21, 23, 25 o 27, y al menos una cadena ligera que comprende cualquiera de las secuencias de las SEQ ID NO: 22, 24, 26 o 28.

10. Anticuerpo humanizado, o fragmento de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende al menos una cadena pesada que comprende el SEQ ID NO: 27 y al menos una cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 28.

11. Anticuerpo humanizado, o fragmento de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones mencionadas anteriormente, que se une al dominio extracelular de PSMA con una afinidad de CE⁵⁰ < 0,4 pg/ml.

12. Anticuerpo humanizado, o fragmento de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones mencionadas anteriormente, en donde dicho antígeno de membrana específico de la próstata es antígeno de membrana específico de la próstata humano.

13. Anticuerpo humanizado, o fragmento de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones mencionadas anteriormente, en donde el anticuerpo es del isotipo IgG.

14. Fragmento de unión a antígeno humanizado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones mencionadas anteriormente, en donde el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un dominio variable (Fv), un fragmento Fab y un fragmento F(ab)² , o en donde la porción de unión a antígeno es un Fv monocatenario (scFv).

15. Un conjugado de anticuerpo-fármaco (CAF) que comprende el anticuerpo humanizado, o un fragmento de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones mencionadas anteriormente, conjugado con un agente terapéutico, opcionalmente a través de una fracción enlazadora.

16. Una formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo humanizado, o fragmento de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones mencionadas anteriormente, junto con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde la formulación es adecuada al menos para la administración intravenosa, intramuscular o subcutánea.

17. El anticuerpo humanizado, o fragmento de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo; de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, o la formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 16, para su uso en el tratamiento del cáncer de próstata.

18. Un ácido nucleico que codifica un anticuerpo humanizado, un fragmento de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-17.

19. Una célula hospedadora capaz de producir un anticuerpo humanizado, un fragmento de unión a antígeno o porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde la célula hospedadora es una célula de mamífero.

20. Una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 19, en donde la célula de mamífero es una línea celular CHO.