ES2938182T3 - Proteínas de fusión dirigidas/inmunomoduladoras y métodos de preparación de las mismas - Google Patents

Proteínas de fusión dirigidas/inmunomoduladoras y métodos de preparación de las mismas Download PDF

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Abstract

La presente invención se refiere en general al campo de la generación de proteínas de fusión para su uso en la terapia del cáncer y, más específicamente, a las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de fusión, en las que las proteínas de fusión quiméricas comprenden al menos un resto dirigido y al menos un resto inmunomodulador que contrarresta la tolerancia inmunológica de las células cancerosas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas de fusión dirigidas/inmunomoduladoras y métodos de preparación de las mismas
Antecedentes de la invención
Campo técnico
La presente invención se refiere generalmente al campo de un método de preparación de una proteína de fusión de anticuerpo-péptido terapéuticamente activa.
Técnica relacionada
El sistema inmunitario proporciona al cuerpo humano un medio para reconocer y defenderse él mismo contra microorganismos y sustancias reconocidas como extrañas o posiblemente peligrosas. Aunque la inmunoterapia pasiva del cáncer con anticuerpos monoclonales y la transferencia pasiva de linfocitos T para atacar células tumorales han demostrado eficacia clínica, el objetivo de la vacunación terapéutica activa para inducir estos efectores inmunitarios y establecer memoria inmunológica contra células tumorales ha seguido siendo desafiante. Se han identificado varios antígenos específicos de tumor y asociados a tumor, aunque estos antígenos son generalmente débilmente inmunogénicos y los tumores emplean diversos mecanismos para crear un entorno tolerogénico que les permite evadir el ataque inmunológico. Estrategias para vencer tal tolerancia inmunitaria y activar robustos niveles de anticuerpo y/o respuestas de linfocitos T tienen la llave para la eficaz inmunoterapia contra el cáncer. Más importante, necesitan explorarse proteínas individuales y cómo crear un polipéptido quimérico activo con una estructura terciaria activa.
El documento WO 2011/109789 A2 desvela moléculas quiméricas que comprenden un resto de direccionamiento fusionado con un resto inmunomodulador, en el que el resto de direccionamiento ya sea la cadena ligera o la cadena pesada, está fusionado con el resto inmunomodulador a través de conectores. El documento WO 2009/027471 A1 desvela métodos para aumentar el título de una proteína celular que comprenden la modificación de un ácido nucleico que codifica la proteína en células CHO mediante la deleción del resto de lisina extremo carboxílico de la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal, lo que da como resultado un título más alto en comparación con el anticuerpo de tipo silvestre. Además, el documento US 2011/104734 A1 se refiere a la producción de una proteína recombinante por una célula basada en el cultivo de células CHO en una concentración suficiente de exógeno, así como la adición de sal de Zn, tal como lactato de Zn, a los medios. Además, los métodos para la producción de anticuerpos en células CHO y la optimización de codones mediante el aumento del contenido de CG se desvelan en Birch J Retal: Advanced drug delivery reviews, elsevier, vol. 58, n.° 5-6, 7 de agosto de 2006 páginas 671-685 y en Kalwy S et al.: Molecular Biotechnology, Humana press, Inc, us, vol. 34, n.° 2, sp. lss. si, 1 de octubre de 2006 páginas 151-156,
Sumario de la invención
La presente divulgación (no cubierta por la invención reivindicada) proporciona polipéptidos quiméricos que contienen al menos un resto de direccionamiento para dirigir una célula cancerosa y al menos un resto inmunomodulador que contrarresta la tolerancia inmunitaria de la célula cancerosa, en el que el resto de direccionamiento y el resto inmunomodulador están unidos por un espaciador de aminoácidos de longitud suficiente de restos de aminoácidos de manera que ambos restos puedan unirse satisfactoriamente a su diana individual. Alternativamente, el resto de direccionamiento y el resto inmunomodulador que contrarresta la tolerancia inmunitaria de la célula cancerosa pueden estar unidos directamente entre sí. Los polipéptidos quiméricos/de fusión de la divulgación (no cubierta por la invención reivindicada) son útiles para unirse a un receptor de célula cancerosa y reducir la capacidad de células cancerosas para evitar una respuesta inmunitaria.
La presente invención se basa en preparar proteínas quiméricas/de fusión por expresión de polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión que contrarrestan o invierten la tolerancia inmunitaria de células cancerosas. Las células cancerosas son capaces de escapar de la eliminación por agentes quimioterapéuticos o anticuerpos dirigidos a tumor mediante mecanismos inmunosupresores específicos en el microentorno del tumor y tal capacidad de las células cancerosas es reconocida como tolerancia inmunitaria. Tales mecanismos inmunosupresores incluyen citocinas inmunosupresoras (por ejemplo, factor de crecimiento transformante beta (TGF-p)) y linfocitos T reguladores y/o células dendríticas (DC) mieloides inmunosupresoras. Contrarrestando la tolerancia inmunitaria inducida por tumor, la presente divulgación (no cubierta por la invención reivindicada) proporciona composiciones y métodos eficaces para el tratamiento del cáncer, opcional en combinación con otro tratamiento del cáncer existente. La presente invención proporciona estrategias para contrarrestar la tolerancia inmunitaria inducida por tumor y potenciar la eficacia antitumoral de la quimioterapia activando y haciendo uso de la antitumoral adaptativa mediada por linfocitos T contra células cancerosas resistentes o diseminadas.
También se desvela una molécula (no cubierto por la invención reivindicada) que incluye al menos un resto de direccionamiento fusionado con al menos un resto inmunomodulador. El resto de direccionamiento se une específicamente a una molécula diana, y el resto inmunomodulador se une específicamente a una de las siguientes moléculas: (i) Factor de crecimiento transformante-beta (TGF-p): (ii) ligando 1 de muerte programada 1 (PD-L1) o ligando 2 de muerte programada 1 (PD-L2); (iii) ligando de activador de receptor del factor nuclear-KB (RANK) (RANKL); (iv) receptor de factor de crecimiento transformante-beta (TGF-pR); (v) muerte programada 1 (PD-1); (vi) receptor de 4-1BB o (vii) activador de receptor de nuclear factor-KB (RANK).
En un aspecto adicional (no cubierto por la invención reivindicada), el resto de direccionamiento incluye un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo que incluye las cadenas ligera o pesada del anticuerpo, un scFv o un polipéptido que contiene un Fc que se une específicamente a un componente de una célula tumoral, un antígeno tumoral, la vasculatura tumoral, el microentorno tumoral o una célula inmunitaria infiltrante de tumor. Preferentemente, el resto de direccionamiento es un anticuerpo o un fragmento del mismo que tiene afinidad de unión por un componente de una célula tumoral. Notablemente, cada una de la cadena pesada y la cadena ligera puede estar unida individualmente a un resto inmunomodulador separada y distinta. Además, una cadena pesada o ligera de un resto de direccionamiento de anticuerpo puede estar unida a un resto inmunomodulador que a su vez puede estar unido a un segundo resto inmunomodulador en el que hay un conector entre los dos restos inmunomoduladores.
También se divulga un polipéptido quimérico (no forma parte de la invención), que comprende un resto de direccionamiento a un tumor y un resto inmunomodulador que comprende una molécula que se une al factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), en el que el resto de direccionamiento a un tumor es un anticuerpo que se une EGFR1, en donde el anticuerpo puede ser el anticuerpo completo, la cadena pesada o la cadena ligera. El resto de direccionamiento a un tumor puede incluir anticuerpos monoclonales que se dirigen a una célula cancerosa, incluyendo pero sin limitación a cetuximab, trastuzumab, ritubximab, ipilimumab, tremelimumab, muromonab-CD3 abciximab, daclizumab, basiliximab, palivizumab, infliximab, gemtuzumab ozogamicina, alemtuzumab, ibritumomab tiuxetan, adalimumab, omalizumab, tositumomab, 1-131 tositumomab, efalizumab, bevacizumab, panitumumab, pertuzumab, natalizumab, etanercept, IGN101 (Aphton), volociximab (Biogen Idee y PDL BioPharm), mAb anti-CD80 (Biogen Idee), mAb anti-CD23 (Biogen Idel), CAT-3888 (Cambridge Antibody Technology), CDP-791 (Imclone), eraptuzumab (Immunomedics), MDX-010 (Medarex y BMS), MDX-060 (Medarex), MDX-070 (Medarex), matuzumab (Merck), CP-675.206 (Pfizer), CAL (Roche), Sg N-30 (Seattle Genetics), zanolimumab (Serono y Genmab), adecatumumab (Sereno), oregovomab (United Therapeutics), nimotuzumab (YM Bioscience), ABT-874 (Abbott Laboratories), denosumab (Amgen), AM 108 (Amgen), AMG 714 (Amgen), fontolizumab (Biogen Idee y PDL BioPharm), daclizumab (Biogent Idee y PDL BioPharm), golimumab (Centocor y Schering-Plough), CNTO 1275 (Centocor), ocrelizumab (Genetech y Roche), HuMax-CD20 (Genmab), belimumab (HGS y GSK), epratuzumab (Immunomedics), MLN1202 (Millennium Pharmaceuticals), visilizumab (PDL BioPharm), tocilizumab (Roche), ocrerlizumab (Roche), certolizumab pegol (UCB, antes Celltech), eculizumab (Alexion Pharmaceuticals), pexelizumab (Alexion Pharmaceuticals y Procter & Gamble), abciximab (Centocor), ranibizimumab (Genetech), mepolizumab (GSK), TNX-355 (Tanox), o MYO-029 (Wyeth).
En otro aspecto (no cubierto por la invención reivindicada), el resto de direccionamiento a un tumor es un anticuerpo monoclonal que se une a HER2/Neu, CD20, CTLA4, EGFR1 y en el que el anticuerpo puede ser el anticuerpo completo, la cadena pesada o la cadena ligera.
En otro aspecto más (no cubierto por la invención reivindicada), el resto de direccionamiento es una molécula que se une específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR1, Erb-B 1), HER2/neu (Erb-B2), CD20, antígeno de linfocitos T citotóxicos-4 (CTLA-4) que es esencial para la función de los Treg (CD 152); H-1 e interleucina-6 (IL-6).
En aún otro aspecto (no cubierto por la invención reivindicada), el resto de direccionamiento se une específicamente a un componente de un linfocito T regulador (treg), una célula supresora mieloide o una célula dendrítica. En otro aspecto (no cubierto por la invención reivindicada), el resto de direccionamiento se une específicamente a una de las siguientes moléculas: (i) CD4; (ii) CD25 (receptor de IL-2ct; IL-2aR); (iii) receptor del factor de crecimiento transformante-beta (TGF-pR); (vi) factor de crecimiento transformante-beta (TGF-p): (vii) muerte programada 1 (PD-1); (viii) ligando de muerte programada 1 (PD-LI o PD-L2.
En otro aspecto (no cubierto por la invención reivindicada), el resto inmunomodulador se une específicamente a una de las siguientes moléculas: (i) factor de crecimiento transformante-beta (TGF-p): (ii) ligando de muerte programada 1 (PD-L1 o PD-L2); o receptor de 4-1BB.
En otro aspecto más (no cubierto por la invención reivindicada), el resto inmunomodulador incluye una molécula que se une a TGF-p e inhibe la función del mismo. Específicamente, el resto inmunomodulador incluye un dominio de unión a ligando extracelular del receptor del factor de crecimiento transformante beta TGF-pRII, TGF-pRIIb o TGF-pRIII. En otro aspecto, el resto inmunomodulador incluye un dominio de unión a ligando extracelular (ECD) del TGF-±RII. Aún más, el resto inmunomodulador puede incluir el ligando H-4-1BB que se une al receptor de 4-1BB para estimular los linfocitos T y ayudar a erradicar el tumor.
En aún otro aspecto (no cubierto por la invención reivindicada), el resto de direccionamiento incluye un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un polipéptido que se une específicamente a HER2/neu, EGFR1, CD20 o el antígeno de linfocitos T citotóxicos-4 (CTLA-4) y en el que el resto inmunomodulador incluye un dominio de unión a ligando extracelular de TGF-pRII.
En otro aspecto (no cubierto por la invención reivindicada), el resto inmunomodulador incluye una molécula que se une específicamente al ligando 1 de muerte programada 1(PD-L 1) o al ligando 2 de muerte programada 1 (PD-L2) e inhibe su actividad. En otro aspecto (no cubierto por la invención reivindicada), el resto inmunomodulador incluye un dominio de unión a ligando extracelular o ectodominio de la muerte programada 1 (PD-1).
En un aspecto adicional (no cubierto por la invención reivindicada), el resto de direccionamiento incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o polipéptido que se une específicamente a HER2/neu, EGFR1, CD20, antígeno de linfocitos T citotóxicos-4 (CTLA-4), CD25 (receptor de lL-2a; IL-2aR) o CD4 y en el que, el resto inmunomodulador incluye un dominio de unión a ligando extracelular o ectodominio de muerte programada 1 (PD-1). En un aún otro aspecto (no cubierto por la invención reivindicada), el resto de direccionamiento incluye un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a CD20, y el resto inmunomodulador incluye una secuencia del factor de crecimiento transformante-p (TGF-p).
En un aspecto (no cubierto por la invención reivindicada), la presente divulgación proporciona genes optimizados que codifican un polipéptido de fusión que comprende al menos un resto de orientación y al menos un resto inmunomodulador para tratar cáncer en un sujeto humano en los que los genes optimizados se han modificado para aumentar la expresión en un sujeto humano. Preferentemente, los genes optimizados comprenden secuencias para codificar un resto de direccionamiento o un resto inmunomodulador seleccionado de SEQ ID NO: 12 a 28 (aspecto no cubierto por la invención reivindicada).
En otro aspecto la presente divulgación proporciona un vector que comprende genes optimizados para tratar cáncer en un sujeto humano, en el que los genes optimizados se han modificado para aumentar las secuencias de CG (aspecto no cubierto por la invención reivindicada). Preferentemente, el vector incluye secuencias para codificar al menos un resto de direccionamiento y al menos un resto inmunomodulador seleccionado de SEQ ID NO: 12 a 28. En un aspecto alternativo (aspecto no cubierto por la invención reivindicada), la presente divulgación proporciona un vector de expresión que comprende polinucleótidos de genes optimizados que codifican al menos un resto de direccionamiento y al menos un resto inmunomodulador seleccionados de SEQ ID NO: 12 a 28.
En aún otro aspecto, la presente divulgación proporciona una célula hospedadora recombinante transfectada con un polinucleótido que codifica un péptido de proteína de fusión de la presente invención (aspecto no cubierto por la invención reivindicada).
En un aspecto, la presente invención proporciona un método de preparación de proteínas de fusión de anticuerpopéptido terapéuticamente activas, comprendiendo el método;
preparar una secuencia de nucleótidos de codón optimizada de la proteína de fusión de anticuerpo-péptido, en la que la secuencia de nucleótidos de codón optimizada está optimizada para la expresión en una célula hospedadora de ovario de hámster chino (CHO), en la que la proteína de fusión de anticuerpo-proteína comprende un resto de direccionamiento y un resto inmunomodulador, en la que el resto de direccionamiento y el resto inmunomodulador están unidos por un espaciador de aminoácidos seleccionado de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 11, en el que el resto inmunomodulador es TGF-pRII que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; en el que el resto de direccionamiento se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-EGFR1, que consiste en la cadena pesada de SEQ ID NO: 5 y la cadena ligera de SEQ ID NO: 6, un anticuerpo anti-HER2/Neu que consiste en la cadena pesada de SEQ ID NO: 1 y la cadena ligera de SEQ ID NO: 2; y un anticuerpo anti-CTLA4 que consiste en la cadena pesada de SEQ ID NO: 7 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 8, en la que SEQ ID NO: 4 se une a través del espaciador de aminoácidos al extremo carboxilo de SEQ ID NO: 1 o SEQ iD NO: 2 de anti-HER2/Neu; el extremo carboxilo de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6 de anti-EGFR1; o el extremo carboxilo de SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8 de anti-CTLA-4;
clonar la secuencia optimizada de dicha proteína de fusión de anticuerpo-péptido en una célula hospedadora de ovario de hámster chino (CHO) capaz de expresión transitoria o continua;
cultivar la célula hospedadora CHO en un modo de lotes alimentados en un medio de fermentación en condiciones adecuadas para cultivar y permitir que la célula hospedadora CHO exprese una proteína clonada, en el que el medio de fermentación comprende una sal de metal de transición divalente; en la que la sal de metal de transición divalente incluye un ion de zinc, en la que la sal de metal de transición divalente es una sal de sulfato de zinc heptahidratada y purificar la proteína de fusión de anticuerpo-péptido expresada y, opcionalmente, comprobar las capacidades de unión biespecífica de la proteína de fusión de anticuerpo-péptido a sus dianas. El método de la presente invención proporciona secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de fusión de anticuerpo-péptido terapéuticamente activas y tal expresión puede realizarse en una línea celular transitoria o una línea celular estable. La expresión transitoria se lleva a cabo transfectando o transformando el hospedador con vectores que llevan las proteínas de fusión en células hospedadoras de mamífero
Una vez se expresan los péptidos de fusión, se someten a purificación y opcionalmente a pruebas in vitro para comprobar su biespecificidad, es decir, que tienen la capacidad para unirse a tanto el resto diana como al resto inmunomodulador. Tales pruebas pueden incluir prueba in vitro tal como ELISA o ensayos de unión de linfocitos NK/T para validar la unión de diana bifuncional o estimulación de células inmunitarias.
En particular, una vez los péptidos de fusión específicos demuestran la biespecificidad deseada, tales péptidos de fusión se seleccionan para subclonar en una línea celular estable para expresión y purificación a mayor escala. Tales líneas celulares estables es CHO.
En un aspecto adicional, el medio de cultivo puede mejorarse mediante adiciones a tal medio. El medio de cultivo incluye una sal de metal de transición divalente que se añade al cultivo celular ya sea inicialmente o en modo de lotes alimentados para reducir la acumulación de lactato durante el cultivo y/o reducir la heterogeneidad de las proteínas de fusión. La sal de metal de transición deseable incluye un ion zinc, en la que la sal de metal de transición divalente es sal de sulfato de zinc heptahidratada y la adición del ion metálico puede llevarse a cabo durante diferentes fases de la producción.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, dibujos y reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras 16-21 y 46-65 no están cubiertas por la presente invención y se presentan únicamente con fines ilustrativos.
La Figura 1 muestra las secuencias de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión anti-HER2/neu-TGFpRII en la región constante LC con la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de anti-HER2/neu (SeQ ID NO: 1) y la cadena ligera de anti-HER2/neu (SEQ ID NO: 2) está unida a restos de aminoácidos para TGF-pRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) identificados en negrita y en las que un conector (SEQ ID NO: 3) está situado entre la cadena ligera de anti-HER2/neu y TGF-pRII y se muestra en cursiva.
La Figura 2 muestra las secuencias de aminoácidos de la proteína de fusión anti-EGFR1-TGFpRII en la región constante LC con secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de anti-EGFR1 (SEQ ID NO: 5) y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de anti-EGFR1 (SEQ ID NO: 6) está unida a restos de aminoácidos para TGF-pRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) identificados en negrita y en las que un conector (SEQ ID NO: 3) está situado entre la cadena ligera de anti-EGFR1 y TGF-pRII y se muestra en cursiva.
La Figura 3 muestra las secuencias de aminoácidos de la proteína de fusión anti-CTLA4-TGFpRII en la región constante LC con secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de anti-CTLA4 (SEQ ID NO: 7) y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de anti-CTLA4 (SEQ ID NO: 8) está unida a restos de aminoácidos para TGF-pRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) identificados en negrita y en las que un conector (SEQ ID NO: 3) está situado entre la cadena ligera de anti-CTLA4 y TGF-pRII y se muestra en cursiva.
La Figura 4 muestra las secuencias de aminoácidos de la proteína de fusión anti-HER2/neu HC-4-1BB y LC-TGFpRII con secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión anti-HER2/neu/HC-4-1BB en la que la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada de anti-HER2/neu (SEQ ID NO: 1) está unida a un conector (SEQ ID NO: 3) mostrado en cursiva y la secuencia para 4-1BB (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 9) está en fuente de texto escrito y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de anti-HER2/neu (SEQ ID NO: 2) está unida a restos de aminoácidos para TGF-pRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) identificados en negrita y en las que un conector (SEQ ID NO: 3) está situado entre la cadena ligera de anti-HER2/neu y TGF-pRII y se muestra en cursiva.
La Figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión anti-EGFR1 HC-4-1BB y LC-TGFpRII con secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión cadena pesada de anti-EGFR1-4-1BB en la que la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada de anti-EGFR1 (SEQ ID NO: 5) está unida a un conector (SEQ ID NO: 3) mostrado en cursiva y la secuencia para 4-1BB (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 9) está en fuente de texto escrito y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de anti-EGFR1 (SEQ ID NO: 6) está unida a restos de aminoácidos para TGF-pRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) identificados en negrita con un conector (SEQ ID NO: 3) entremedias.
La Figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión anti-CTLA4 HC-4-1BB y LC-TGFpRII con secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión cadena pesada de anti-CTLA4-4-1BB en la que la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada de anti-CTLA4 (SEQ ID NO: 7) está unida a un conector (SEQ ID NO: 3) mostrado en cursiva y la secuencia para 4-1BB (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 9) está en fuente de texto escrito y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de anti-CTLA4 (SEQ ID NO: 8) está unida a restos de aminoácidos para TGF-pRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) identificados en negrita con un conector (SEQ ID NO: 3) entremedias.
La Figura 7 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión anti-HER2/neu HC-PD1 y LC-TGFpRII con secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión cadena pesada de anti-HER2/neu-PD1 en la que la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada de anti-HER2/neu (SEQ ID NO: 1) está unida a un conector (SEQ ID NO: 3) mostrado en cursiva y la secuencia para PD1 (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 10) está en fuente de texto escrito y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de anti-HER2/neu (SEQ ID NO: 2) está unida a restos de aminoácidos para TGF-pRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) identificados en negrita con un conector (SEQ ID NO: 3) entremedias.
La Figura 8 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión anti-EGFRI HC-PD1 y LC-TGFpRII con secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la proteína de fusión de anti-EGFR1-PD1 en la que la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de anti-EGFRI (SEQ ID NO: 5) está unida a un conector (SEQ ID NO: 3) mostrado en cursiva y la secuencia para PD1 (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 10) está en fuente de texto escrito y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de anti-EGFRI (SEQ ID NO: 6) está unida a restos de aminoácidos para TGF-pRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) identificados en negrita con un conector (SEQ ID NO: 3) entremedias.
La Figura 9 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión anti-CTLA4 HC-PD1 y LC-TGFpRII con secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión cadena pesada de anti-CTLA4-PD1 en la que la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de anti-CTLA4 (SEQ ID NO: 7) está unida a un conector (SEQ ID NO: 3) mostrado en cursiva y la secuencia para PD1 (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 10) está en fuente de texto escrito y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de anti-CTLA4 (SEQ ID NO: 8) está unida a restos de aminoácidos para TGF-pRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) identificados en negrita con un conector (SEQ ID NO: 3) entremedias.
La Figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión anti-HER2/neu HC-TGFpRII-4-1BB con secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión cadena pesada de anti-HER2/neu-TGFpRII-4-1BB en la que la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada de anti-HER2/neu (SEQ ID NO: 1 con una Lys adicional en el extremo carboxílico ) está unida a un conector (SEQ ID NO: 3) mostrado en cursiva y la secuencia para TGFpRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) se identifica en negrita y la secuencia de aminoácidos para 4-1BB (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 9) está en fuente de texto escrito con el conector entremedias (SEQ ID NO: 11) y que incluye la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de anti-HER2/neu (SEQ ID NO: 2).
La Figura 11 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión anti-EGFR1 HC-TGFpRII-4-1BB con secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión cadena pesada de anti-EGFR1-TGFpRII-4-1BB en la que la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada de anti-EGFR1 (SEQ ID NO: 5 con una Lys adicional en el extremo carboxílico) está unida a un conector (SEQ ID NO: 3) mostrado en cursiva y la secuencia para TGFpRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) se identifica en negrita y la secuencia de aminoácidos para 4-1BB (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 9) está en fuente de texto escrito con el conector entremedias (SEQ ID NO: 11) y que incluye la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de anti-EGFR1 (SEQ ID NO: 6). La Figura 12 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión anti-CTLA4 HC-TGFpRII-4-1BB con secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión cadena pesada de anti-CTLA4-TGFpRII-4-1BB en la que la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de anti-CTLA4 (SEQ ID NO: 7 con una Lys adicional en el extremo carboxílico) está unida a un conector (SEQ ID NO: 3) mostrado en cursiva y la secuencia para TGFpRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) se identifica en negrita y la secuencia de aminoácidos para 4-1BB (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 9) está en fuente de texto escrito con el conector entremedias (SEQ ID NO: 11) y que incluye la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de anti-CTLA4 (SEQ ID NO: 8). La Figura 13 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión anti-HER2/neu HC-TGFpRII-PD1 con secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión cadena pesada de anti-HER2/neu-TGFpRII-PD1 en la que la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de anti-HER2/neu (SEQ ID NO: 1 con una Lys adicional en el extremo carboxílico) está unida a un conector (SEQ ID NO: 3) mostrado en cursiva y la secuencia para TGFpRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) se identifica en negrita y la secuencia de aminoácidos para PD-1 (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 10) está en fuente de texto escrito con el conector entremedias (SEQ ID NO: 11) y que incluye la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de anti-HER2/neu (SEQ ID NO: 2).
La Figura 14 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión de anti-EGFR1 HC-TGFpRII-PD1 con secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión cadena pesada de anti-EGFR1-TGFpRII-PD1 en la que la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de anti-EGFR1 (SEQ ID NO: 5 con una Lys adicional en el extremo carboxílico) está unida a un conector (SEQ ID NO: 3) mostrado en cursiva y la secuencia para TGFpRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) se identifica en negrita y la secuencia de aminoácidos para PD-1 (resto inmunomodulador) (SEQIDNO:10) está en fuente de texto escrito con el conector entremedias (SEQ ID NO: 11) y que incluye la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de anti-EGFRI (SEQ ID NO: 6). La Figura 15 muestra la proteína de fusión anti-CTLA4 HC-TGFpRII-PD1 con secuencia de aminoácidos de proteína de fusión cadena pesada anti-CTLA4-TGFpRII-PD1 en la que la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de anti-CTLA4 (SEQ ID NO: 7 con una Lys adicional en el extremo carboxílico) está unida a un conector (SEQ ID NO: 3) mostrado en cursiva y la secuencia para TGFpRN (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) se identifica en negrita y la secuencia de aminoácidos para PD-1 (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 15) está en fuente de texto escrito con el conector entremedias (SEQ ID NO: 11) y que incluye la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de anti-CTLA4 (SEQ ID NO: 8).
La Figura 16 muestra la secuencia de nucleótidos de la región constante de la cadena pesada de anti-HER2/neu con conector (SEQ ID NO: 12) y ECD de TGFpRII (SEQ ID NO: 13) que han sido optimizadas en codones para la expresión en célula CHO.
La Figura 17 muestra la secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena pesada de anti-HER2/neu (SEQ ID NO: 14), región variable de la cadena ligera de anti-HER2/neu (SEQ ID NO: 15) y región constante de la cadena pesada de anti-EGFR1 con conector (SEQ ID NO: 16) que han sido optimizadas en codones para la expresión en célula CHO.
La Figura 18 muestra la secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena pesada de anti-EGFR1 (SEQ ID NO: 17), región variable de la cadena ligera de anti-EGFR1 (SEQ ID NO: 18), región variable de la cadena pesada de anti-CTLA4 (SEQ ID NO: 19) y región variable de la cadena ligera de anti-CTLA4 (SEQ ID NO: 20) que han sido optimizadas en codones para la expresión en célula CHO.
La Figura 19 muestra la secuencia de nucleótidos de la molécula IgG1 anti-CD20 (SEQ ID NO: 21), región variable de la cadena pesada de anti-CD20 (SEQ ID NO: 22) y región variable de la cadena ligera de anti-CD20 (SEQ ID NO: 23) que han sido optimizadas en codones para la expresión en célula CHO.
La Figura 20 muestra la secuencia de nucleótidos de 4-1BB (SEQ ID NO: 24) y cadena pesada de anti-IL6R (SEQ ID NO: 25) que han sido optimizadas en codones para la expresión en célula CHO.
La Figura 21 muestra la secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena ligera de anti-IL6R (SEQ ID NO: 26), cadena pesada de anti-4-1BB (SEQ ID NO: 27) y región variable de la cadena ligera de anti-4-1BB (SEQ ID NO: 28) que han sido optimizadas en codones para la expresión en célula CHO.
La Figura 22 muestra el análisis de anti-HER2/neu-TGFpRII y anti-EGFR1-TGFpRII purificadas en proteína A al 12 % de PAGE
La Figura 23 A muestra muestras de anti-HER2/neu-TGFpRII analizadas por cromatografía en proteína A/SEC y B muestras de anti-EGFR1-TGFpRII analizadas por cromatografía en proteína A/SEC.
La Figura 24 A muestra que las moléculas anti-HER2/neu-TGFpRII y anti-EGFR1-TGFpRII se unen a TGFp que indica que la proteína de fusión es funcional y B muestra que anti-HER2-TGFpRII inhibe la proliferación de la línea celular BT474 similar a Bmab200 (Herceptin).
La Figura 25 muestra que anti-EGFR1-TGFpRII inhibe la proliferación de la línea celular A431 similar a Cetuximab.
La Figura 26 muestra que la actividad de ADCC de anti-HER2-TGFpRII en células BT474 es similar a la de Bmab200 (Herceptin).
La Figura 27 muestra la actividad de ADCC de anti-EGFR1-TGFpRII en células A431 en las que las actividades de ADCC son similares a las de Cetuximab.
La Figura 28 muestra la actividad de ADCC de actividad de ADCC de anti-EGFR1-4-1BB en comparación con anti-EGFR1-TGFpRII y cetuximab.
La Figura 29 A muestra que la actividad de unión de anti-CTLA4-TGFpRII a TGFp1 es comparable a anti-EGFR1-TGFpRII y B muestra la actividad de unión de anti-CTLA4-TGFpRII a CTLA4.
La Figura 30 A muestra la actividad de unión de anti-CTLA4-TGFpRII para determinar el nivel de unión de PD1-Fc y B muestra la actividad de unión de anti-EGRF1-4-1BB para determinar la unión de 4-1BBL.
La Figura 31 A muestra la actividad de unión de anti-EGFR1-4-1BB a EGFR y B muestra la actividad de unión de PD1-Fc-4-1BB para encontrar PDL1-Fc.
La Figura 32 muestra la actividad de unión de anti-EGFR1-PD1 a EGFR y PD1.
La Figura 33 muestra fotografías de proteínas expresadas y alquilación de reducción de las mismas.
La Figura 34 A muestra el espectro de masas espectro de masas de la cadena ligera (LC) (reducido) de la fusión anti-HER2/neu-ECD de TGFpRII y B muestra el espectro de masas de LC (reducido) deconvolucionado de la fusión anti-HER2/neu-ECD de TGFpRII.
La Figura 35 muestra el espectro de masas de la cadena pesada (HC) (reducido) de la fusión anti-HER2/neu-ECD de TGFPRII.
La Figura 36 A muestra el espectro de masas de LC (reducido) de anti-EGFRI-ECD de TGFpRII y B muestra el espectro de masas de LC (reducido) deconvolucionado de anti-EGFRI-ECD de TGFpRII.
La Figura 37 muestra el espectro de masas de HC (reducido) de anti-EGFRI-ECD de TGFpRII.
La Figura 38 A muestra el cromatograma de UV de péptidos trípticos de la proteína de fusión anti-HER2/neu-ECD de TGFpRII y B muestra el cromatograma iónico total (TIC) de péptidos trípticos de la proteína de fusión anti-HER2/neu-ECD de TGFpRII.
Las Figuras 39, 40 y 41 proporcionan listas de péptido tríptico esperado/observado de la cadena ligera, cadena pesada y motivo unido de la proteína de fusión anti-HER2/neu-ECD de TGFpRII, respectivamente.
La Figura 42 A muestra el cromatograma de UV de péptidos trípticos de la proteína de fusión anti-EGFRI-ECD de TGFpRII y B muestra el cromatograma iónico total (TIC) de péptidos trípticos de la proteína de fusión anti-EGFRI-ECD de TGFpRII.
La Figura 43 proporciona una lista de péptido tríptico esperado/observado de la cadena ligera de la proteína de fusión anti-EGFRI-ECD de TGFpRII.
La Figura 44 muestra la lista de péptido tríptico esperado/observado de la cadena pesada de la proteína de fusión anti-EGFRI-ECD de TGFpRII.
La Figura 45 muestra la lista de péptido tríptico esperado/observado de la cadena pesada de la proteína de fusión anti-EGFRI-ECD de TGFpRII.
La Figura 46 muestra las secuencias de aminoácidos de la proteína de fusión cantuzumab-TGFpRII en la región constante LC con secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de cantuzumab (SEQ ID NO: 29) y secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de cantuzumab (SEQ Id NO: 30) unida a restos de aminoácidos para TGF­ pRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) identificados en negrita y en las que un conector (SEQ ID NO: 3) está situado entre la cadena ligera de cantuzumab y TGF-pRII y se muestra en cursiva.
La Figura 47 muestra las secuencias de aminoácidos de la proteína de fusión cixutumumab-TGFpRII en la región constante LC con secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de cixutumumab (SEQ ID NO: 31) y secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de cixutumumab (SEQ ID NO: 32) unida a restos de aminoácidos para TGF­ pRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) identificados en negrita y en las que un conector (SEQ ID NO: 3) está situado entre la cadena ligera de cixutumumab y TGF-pRII y se muestra en cursiva.
La Figura 48 muestra las secuencias de aminoácidos de la proteína de fusión clivatuzumab-TGFpRII en la región constante LC con secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de clivatuzumab (SEQ ID NO: 33) y secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de clivatuzumab (SEQ ID NO: 34) unida a restos de aminoácidos para TGF­ pRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) identificados en negrita y en las que un conector (SEQ ID NO: 3) está situado entre la cadena ligera de clivatuzumab y TGF-pRII y se muestra en cursiva.
La Figura 49 muestra las secuencias de aminoácidos de la proteína de fusión pritumumab-TGFpRII en la región constante LC con secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de pritumumab (SEQ ID NO: 35) y secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de pritumumab (SEQ ID NO: 36) unida a restos de aminoácidos para TGF­ pRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) identificados en negrita y en las que un conector (SEQ ID NO: 3) está situado entre la cadena ligera de pritumumab y TGF-pRII y se muestra en cursiva.
La Figura 50 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión cantuzumab HC-4-1BB y LC-TGFpRII en la que la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada de cantuzumab (SEQ ID NO: 29) está unida a un conector (SEQ ID NO: 3) que se muestra en cursiva y la secuencia para 4-1BB (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 9) está en fuente de texto escrito y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de cantuzumab (SEQ ID NO: 30) está unida a restos de aminoácidos para TGF-pRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) identificados en negrita con un conector (SEQ ID NO: 3) entremedias.
La Figura 51 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión cixutumumab HC-4-1BB y LC-TGFpRII en la que la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada de cixutumumab (SEQ ID NO: 31) está unida a un conector (SEQ ID NO: 3) mostrado en cursiva y la secuencia para 4-1BB (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 9) está en fuente de texto escrito y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de cixutumumab (SEQ ID NO: 32) está unida a restos de aminoácidos para TGF-pRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) identificados en negrita con un conector (SEQ ID NO: 3) entremedias.
La Figura 52 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión clivatuzumab HC-4-1BB y LC-TGFpRII en la que la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada de clivatuzumab (SEQ ID NO: 33) está unida a un conector (SEQ ID NO: 3) mostrado en cursiva y la secuencia para 4-1BB (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 9) está en fuente de texto escrito y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de clivatuzumab (SEQ ID NO: 34) está unida a restos de aminoácidos para TGF-pRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) identificados en negrita con un conector (SEQ ID NO: 3) entremedias.
La Figura 53 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión pritumumab HC-4-1BB y LC-TGFpRII en la que la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada de pritumumab (SEQ ID NO: 35) está unida a un conector (SEQ ID NO: 3) mostrado en cursiva y la secuencia para 4-1BB (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 9) está en fuente de texto escrito y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de pritumumab (SEQ ID NO: 36) está unida a restos de aminoácidos para TGF-pRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) identificados en negrita con un conector (SEQ ID NO: 3) entremedias.
La Figura 54 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión cantuzumab - HC-PD1 y LC-TGFpRII en la que la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada de cantuzumab (SEQ ID NO: 29) está unida a un conector (SEQ ID NO: 3) mostrado en cursiva y la secuencia para PD1 (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 10) está en fuente de texto escrito y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de cantuzumab (SEQ ID NO: 30) está unida a restos de aminoácidos para TGF-pRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) identificados en negrita con un conector (SEQ ID NO: 3) entremedias.
La Figura 55 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión cixutumumab - HC-PD1 y LC-TGFpRII en la que la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada de cixutumumab (SEQ ID NO: 31) está unida a un conector (SEQ ID NO: 3) mostrado en cursiva y la secuencia para PD1 (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 10) está en fuente de texto escrito y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de cixutumumab (SEQ ID NO: 32) está unida a restos de aminoácidos para TGF-pRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) identificados en negrita con un conector (SEQ ID NO: 3) entremedias.
La Figura 56 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión clivatuzumab - HC-PD1 y LC-TGFpRII en la que la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada de clivatuzumab (SEQ ID NO: 33) está unida a un conector (SEQ ID NO: 3) mostrado en cursiva y la secuencia para PD1 (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 10) está en fuente de texto escrito y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de clivatuzumab (SEQ ID NO: 34) está unida a restos de aminoácidos para TGF-pRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) identificados en negrita con un conector (SEQ ID NO: 3) entremedias.
La Figura 57 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión pritumumab - HC-PD1 y LC-TGFpRII en la que la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada de pritumumab (SEQ ID NO: 35) está unida a un conector (SEQ ID NO: 3) mostrado en cursiva y la secuencia para PD1 (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 10) está en fuente de texto escrito y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de pritumumab (SEQ ID NO: 36) está unida a restos de aminoácidos para TGF-pRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) identificados en negrita con un conector (SEQ ID NO: 3) entremedias.
La Figura 58 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión cantuzumab HC-TGFpRII-4-1BB en la que la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada de cantuzumab (SEQ ID NO: 29) está unida a un conector (SEQ ID NO: 3) mostrado en cursiva y la secuencia para TGFpRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) se identifica en negrita y la secuencia de aminoácidos para 4-1BB (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 9) está en fuente de texto escrito con el conector entremedias (SEQ ID NO: 11) y que incluye la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de cantuzumab (SEQ ID NO: 30).
La Figura 59 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión cixutumumab HC-TGFpRII-4-1BB en la que la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada de cixutumumab (SEQ ID NO: 31) está unida a un conector (SEQ ID NO: 3) mostrado en cursiva y la secuencia para TGFpRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) se identifica en negrita y la secuencia de aminoácidos para 4-1BB (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 9) está en fuente de texto escrito con el conector entremedias (SEQ ID NO: 11) y que incluye la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de cixutumumab (SEQ ID NO: 32).
La Figura 60 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión clivatuzumab HC-TGFpRII-4-1BB en la que la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada de clivatuzumab (SEQ ID NO: 33) está unida a un conector (SEQ ID NO: 3) mostrado en cursiva y la secuencia para TGFpRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) se identifica en negrita y la secuencia de aminoácidos para 4-1BB (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 9) está en fuente de texto escrito con el conector entremedias (SEQ ID NO: 11) y que incluye la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de clivatuzumab (SEQ ID NO: 34).
La Figura 61 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión pritumumab HC-TGFpRII-4-1BB en la que la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada de pritumumab (SEQ ID NO: 35) está unida a un conector (SEQ ID NO: 3) mostrado en cursiva y la secuencia para TGFpRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) se identifica en negrita y la secuencia de aminoácidos para 4-1BB (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 9) está en fuente de texto escrito con el conector entremedias (SEQ ID NO: 11) y que incluye la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de pritumumab (SEQ ID NO: 36).
La Figura 62 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión cantuzumab HC-TGFpRII-PD1 en la que la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada de cantuzumab (SEQ ID NO: 29) está unida a un conector (SEQ ID NO: 3) mostrado en cursiva y la secuencia para TGFpRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) se identifica en negrita y la secuencia de aminoácidos para PD1 (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 10) está en fuente de texto escrito con el conector entremedias (SEQ ID NO: 11) y que incluye la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de cantuzumab (SEQ ID NO: 30).
La Figura 63 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión cixutumumab HC-TGFpRII-PD1 en la que la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada de cixutumumab (SEQ ID NO: 31) está unida a un conector (SEQ ID NO: 3) mostrado en cursiva y la secuencia para TGFpRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) se identifica en negrita y la secuencia de aminoácidos para PD1 (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 10) está en fuente de texto escrito con el conector entremedias (SEQ ID NO: 11) y que incluye la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de cixutumumab (SEQ ID NO: 32).
La Figura 64 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión clivatuzumab HC-TGFpRII-PD1 en la que la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada de clivatuzumab (SEQ ID NO: 33) está unida a un conector (SEQ ID NO: 3) mostrado en cursiva y la secuencia para TGFpRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) se identifica en negrita y la secuencia de aminoácidos para PD1 (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 10) está en fuente de texto escrito con el conector entremedias (SEQ ID NO: 11) y que incluye la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de clivatuzumab (SEQ ID NO: 34).
La Figura 65 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión pritumumab HC-TGFpRII-PD1 en la que la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada de pritumumab (SEQ ID NO: 35) está unida a un conector (SEQ ID NO: 3) mostrado en cursiva y la secuencia para TGFpRII (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 4) se identifica en negrita y la secuencia de aminoácidos para PD1 (resto inmunomodulador) (SEQ ID NO: 10) está en fuente de texto escrito con el conector entremedias (SEQ ID NO: 11) y que incluye la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de pritumumab (SEQ ID NO: 36).
Descripción detallada de la invención
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de inmunología, biología molecular, microbiología, biología celular y ADN recombinante, que están dentro de la experiencia de la materia. Véanse, por ejemplo, Sambrook, et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a edición (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987)); la serie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, y ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)).
Definiciones
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el significado comúnmente entendido por un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Como se usa en la descripción de la invención y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una" y "el" y "la" pretenden incluir las formas en plural también, a menos que el contexto indique claramente de otro modo. Los siguientes términos tienen los significados dados:
El término "polinucleótido", como se usa en el presente documento, significa una secuencia de nucleótidos conectada por enlaces fosfodiéster. Los polinucleótidos se presentan en el presente documento en la dirección de dirección 5' a 3'. Un polinucleótido utilizado en la presente invención puede ser una molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN) o molécula de ácido ribonucleico (ARN). Donde un polinucleótido es una molécula de ADN, esa molécula puede ser un gen o una molécula de ADNc. Bases de nucleótidos se indican en el presente documento por el código de una sola letra: adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C), inosina (I) y uracilo (U). Un polinucleótido utilizado en la presente invención puede prepararse usando técnicas convencionales muy conocidas para un experto en la materia.
El término "optimizado", como se usa en el presente documento, significa que una secuencia de nucleótidos ha sido alterada para codificar una secuencia de aminoácidos usando codones que son preferidos en una célula de ovario de hámster chino (CHO). La secuencia optimizada de nucleótidos se manipula para retener completamente o en la medida de lo posible la secuencia de aminoácidos originalmente codificada por la secuencia de nucleótidos de partida, que también se conoce como la secuencia "parental". Las secuencias optimizadas en el presente documento han sido manipuladas para tener codones que se prefieren en células CHO de mamífero. Las secuencias de aminoácidos codificadas por secuencias de nucleótidos optimizadas también se denominan optimizadas. El término "expresión", como se usa en el presente documento, se define como la transcripción y/o traducción de una secuencia de nucleótidos particular accionada por su promotor.
El término "transfección" de una célula, como se usa en el presente documento, significa que el material genético se introduce en una célula con el fin de modificar genéticamente la célula. La transfección puede llevarse a cabo mediante una variedad de medios conocidos en la técnica, tales como transducción o electroporación.
El término "cáncer", como se usa en el presente documento, se define como enfermedad caracterizada por el crecimiento rápido e incontrolado de células aberrantes. Las células cancerosas pueden extenderse localmente o a través de la circulación sanguínea y el sistema linfático a otras partes del cuerpo. Ejemplos de diversos cánceres incluyen, pero no se limitan a, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de piel, cáncer ocular, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer cerebral, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón y similares.
El término "transgén" se usa en un sentido amplio para significar cualquier secuencia de nucleótidos heteróloga incorporada en un vector para la expresión en una célula diana y secuencias de control de la expresión asociadas, tales como promotores. Se aprecia por aquellos expertos en la materia que las secuencias de control de la expresión se seleccionarán basándose en la capacidad para promover la expresión del transgén en la célula diana. Un ejemplo de un transgén es un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión quimérica de la presente divulgación.
El término "vector de expresión", como se usa en el presente documento, significa un vector que contiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifica al menos parte de un producto génico capaz de ser transcrito. Los vectores de expresión pueden contener una variedad de secuencias de control, que se refieren a secuencias de ácidos nucleicos necesarias para la transcripción y posiblemente traducción de una secuencia codificante operativamente unida en un organismo hospedador particular. Además de secuencias de control que gobiernan la transcripción y traducción, vectores y vectores de expresión pueden contener secuencias de ácidos nucleicos que también sirven a otras funciones. El término también incluye un plásmido o virus recombinante que comprende un polinucleótido que va a administrarse en una célula hospedadora, ya sea in vitro o in vivo. La célula hospedadora es una célula de ovario de hámster chino (CHO)
El término "sujeto," como se usa en el presente documento, significa un animal humano o vertebrado que incluye un perro, gato, caballo, vaca, cerdo, oveja, cabra, pollo, mono, rata y ratón.
El término "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en el presente documento, significa la cantidad del compuesto objeto que provocará la respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, animal o humano que está siendo buscada por el investigador, veterinario, doctor médico u otro profesional clínico.
El término "farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, significa que el vehículo, diluyente o excipiente debe ser compatible con los otros componentes de formulación y no perjudicial para el receptor de la misma.
El término "recombinante", como se usa en el presente documento, significa una entidad genética distinta de la generalmente encontrada en la naturaleza. Como se aplica a un polinucleótido o gen, esto significa que el polinucleótido es el producto de diversas combinaciones de etapas de clonación, restricción y/o ligación, y otros procedimientos que producen la producción de una construcción que es distinta de un polinucleótido encontrado en la naturaleza.
El término "identidad sustancial" o "similitud sustancial", como se usa en el presente documento cuando se refiere a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que cuando se alinea óptimamente con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su hebra complementaria), existe identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente del 95 al 99 % de la secuencia.
El término "péptido", "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente para indicar un polímero de secuencia de al menos dos aminoácidos covalentemente unidos por un enlace amida.
El término "homólogo", como se usa en el presente documento y se refiere a péptidos, se refiere a similitud de secuencias de aminoácidos entre dos péptidos. Cuando una posición de aminoácido en ambos de los péptidos está ocupada por aminoácidos idénticos, son homólogos en esa posición. Así, por "sustancialmente homólogo" significa una secuencia de aminoácidos que es ampliamente, pero no completamente, homóloga, y que retiene la mayor parte o toda de la actividad de la secuencia a la que es homóloga. Como se usa en el presente documento, "sustancialmente homólogo", como se usa en el presente documento, significa que una secuencia es al menos el 50 % idéntica, y preferentemente al menos el 75 % y más preferentemente el 95 % de homología con el péptido de referencia. Modificación de secuencias de péptidos adicional están incluida, tales como variaciones, deleciones, sustituciones o derivatizaciones menores de la secuencia de aminoácidos de las secuencias desveladas en el presente documento, mientras que el péptido tenga sustancialmente la misma actividad o función que los péptidos sin modificar. En particular, un péptido modificado retendrá actividad o función asociada al péptido sin modificar, el péptido modificado generalmente tendrá una secuencia de aminoácidos "sustancialmente homóloga" a la secuencia de aminoácidos de la secuencia sin modificar.
El término "administrar", como se usa en el presente documento, se define como la introducción física real de la composición en o sobre (según convenga) el sujeto hospedador. Todos y cada uno de los métodos de introducción de la composición en el sujeto se contemplan en el presente documento; el método no depende de cualquier medio particular de introducción y no debe interpretarse así. Los medios de introducción son muy conocidos para aquellos expertos en la materia, y preferentemente, la composición se administra por vía subcutánea o por vía intratumoral. Un experto en la materia reconocerá que, aunque puede usarse más de una vía para administración, una vía particular puede proporcionar una reacción más inmediata y más eficaz que otra vía. Puede llevarse a cabo administración local o sistémica por administración que comprende administración o instilación de inmunovacunas en cavidades del cuerpo, inhalación o insuflación de un aerosol, o por introducción parenteral, que comprende administración intramuscular, intravenosa, intraportal, intrahepática, peritoneal, subcutánea o intradérmica. En el supuesto caso de que el tumor esté en el sistema nervioso central, la composición debe administrarse por vía intratumoral debido a que no existe sensibilización del sistema inmunitario en el sistema nervioso central.
Aunque los agentes quimioterapéuticos pueden inducir muerte de células tumorales "inmunogénica" y facilitar la presentación cruzada de antígenos por células dendríticas, los tumores crean un entorno tolerogénico que les permite suprimir la activación de respuestas inmunitarias innatas y adaptativas y evadir el ataque inmunológico por células efectoras inmunitarias. La presente divulgación proporciona estrategias (no forma parte de la invención reivindicada) para contrarrestar la tolerancia inmunitaria inducida por tumor en el microentorno del tumor y puede potenciar la eficacia antitumoral de la quimioterapia activando y haciendo uso de la inmunidad antitumoral adaptativa mediada por linfocitos T contra células cancerosas diseminadas.
La presente divulgación se basa en el descubrimiento de que los anticuerpos o proteínas de fusión inmunomoduladores dirigidos de la presente invención pueden contrarrestar o invertir la tolerancia inmunitaria de las células cancerosas. Las células cancerosas son capaces de escapar de la eliminación por agentes quimioterapéuticos o anticuerpos dirigidos a tumor mediante mecanismos inmunosupresores específicos en el microentorno del tumor y tal capacidad de las células cancerosas es reconocida como tolerancia inmunitaria. Contrarrestando la tolerancia inmunitaria inducida por tumor, la presente divulgación (no forma parte de la invención reivindicada) proporciona composiciones y métodos eficaces para el tratamiento de cáncer, opcional en combinación con otro tratamiento para el cáncer existente.
La presente divulgación proporciona composiciones y métodos de producción de proteínas de fusión que contrarrestan la tolerancia inmunitaria en el microentorno del tumor y promueven la inmunidad antitumoral adaptativa mediada por linfocitos T para el mantenimiento de protección duradera a largo plazo contra cánceres recurrentes o diseminados (no forma parte de la invención reivindicada). Estas proteínas de fusión se diseñan para facilitar las respuestas inmunitarias de linfocitos T a largo plazo eficaces contra células tumorales por al menos uno de los siguientes:
a. promover la muerte de células tumorales mediante potenciamiento de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC); y
b. aumentar la activación y proliferación de linfocitos T CD8+ antitumorales por negación de la supresión inmunitaria mediada por linfocitos T reguladores y células supresoras mieloides. Estas respuestas inmunitarias antitumorales pueden activarse en tándem con la sensibilización de células tumorales a citotoxicidad mediada por efectores inmunitarios, estableciéndose así un bucle de retroalimentación positiva que aumenta la citorreducción tumoral y refuerza la inmunidad antitumoral adaptativa.
Además, las proteínas de fusión de la presente divulgación (no forma parte de la invención reivindicada) se distinguen de y son superiores a las moléculas terapéuticas existentes en al menos uno de los siguientes aspectos: (i) Para contrarrestar la tolerancia inmunitaria en el microentorno del tumor y promover la inmunidad antitumoral adaptativa mediada por linfocitos T para el mantenimiento de protección a largo plazo contra cánceres recurrentes o diseminados (para la prevención o tratamiento de diversos cánceres); (ii) Para producir composiciones de células inmunitarias para terapia celular adoptiva de diversos cánceres; y (iii) Para servir de adyuvantes o vacunas inmunitarios para la profilaxis de diversos cánceres o enfermedades infecciosas.
Los anticuerpos y/o proteínas de fusión inmunoestimulantes dirigidos de la divulgación (no forma parte de la invención reivindicada) proporcionan la capacidad de alterar las redes inmunosupresoras en el microentorno del tumor. Los tumores emplean una amplia matriz de mecanismos reguladores para evitar o suprimir la respuesta inmunitaria. Células cancerosas promueven activamente la tolerancia inmunitaria en el microentorno del tumor mediante la expresión de citocinas y moléculas que inhiben la diferenciación y maduración de células dendríticas (DC) presentadoras de antígeno. Las citocinas inmunosupresoras y ligandos producidos por células tumorales incluyen los siguientes: (i) Factor de crecimiento transformante-beta (TGF-p); (ii) ligando 1 de muerte programada 1 (PD-L1; B7-H1); (iii) factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); y (iv) interleucina-10 (IL-10).
Además de bloquear la maduración de células dendríticas (DC), estas moléculas promueven el desarrollo de subconjuntos especializados de linfocitos T CD4+ inmunosupresores (linfocitos T reguladores; linfocitos Treg) y células supresoras derivadas de mieloide (MDSC). Tregs son una sub-población minoritaria de linfocitos T CD4+ que expresan constitutivamente CD25 [la cadena cc del receptor de interleucina-2 (IL-2)] y el factor de transcripción de la caja forkhead P3 (FOXP3). Los Tregs (linfocitos CD4+CD25+FoxP3+) mantienen la tolerancia inmunitaria restringiendo la activación, proliferación y funciones efectoras de una amplia gama de células inmunitarias, que incluyen linfocitos T CD4 y CDS, linfocitos citolíticos espontáneos (NK) y NKT, linfocitos B y células presentadoras de antígenos (APC) in vitro e in vivo.
La acumulación de linfocitos Treg en el microentorno del tumor refuerza la tolerancia inmunitaria del tumor y facilita la progresión y metástasis del tumor. El aumento de expresión de citocinas inmunosupresoras (TGF-p; PD-L1) y Tregs infiltrantes de tumor se correlaciona con una reducción de la supervivencia de pacientes con diversos tipos de cánceres. Las proteínas de fusión desveladas en el presente documento (no forma parte de la invención reivindicada) inhiben moléculas inmunosupresoras clave expresadas por la célula tumoral dirigida o linfocitos Treg infiltrantes de tumor y células supresoras de mieloide (DCs o MDSC). Como tales, proporcionan la capacidad dirigida para inhibir el desarrollo o función de Tregs dentro del microentorno del tumor.
Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" incluye anticuerpos mono- o polivalentes naturales o artificiales que incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales, monoclonales, multiespecíficos, humanos, humanizados o quiméricos, anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fab, fragmentos F(ab), fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-Id contra anticuerpos de la invención) y fragmentos de unión a epítope de cualquiera de los anteriores. El anticuerpo puede ser de cualquier origen animal que incluye aves y mamíferos. En un aspecto, el anticuerpo es, o deriva de, un ser humano, murino (por ejemplo, ratón y rata), burro, oveja, conejo, cabra, cobaya, camello, caballo, o pollo. Además, tal anticuerpo puede ser una versión humanizada de un anticuerpo. El anticuerpo puede ser monoespecífico, biespecífico, triespecífico, o de mayor multiespecificidad. El anticuerpo en el presente documento incluye específicamente un anticuerpo "quimérico" en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, además de fragmentos de tales anticuerpos, mientras que presenten la actividad biológica deseada.
Se han empleado diversos métodos para producir anticuerpos. La tecnología de hibridomas, que se refiere a una línea celular clonada que produce un único tipo de anticuerpo, usa células de diversas especies, que incluyen ratones (murina), hámsteres, ratas y seres humanos. Otro método de preparación de un anticuerpo usa ingeniería genética que incluye técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, anticuerpos preparados a partir de estas técnicas incluyen, entre otros, anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados. Un anticuerpo quimérico combina ADN que codifica regiones de más de un tipo de especie. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede derivar de la región variable de un ratón y la región constante de un ser humano. Un anticuerpo humanizado procede predominantemente de un ser humano, aún cuando no contenga porciones no humanas. Al igual que un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado puede contener una región constante completamente humana. Pero a diferencia de un anticuerpo quimérico, la región variable puede derivar parcialmente de un ser humano. Las porciones sintéticas no humanas de un anticuerpo humanizado frecuentemente proceden de CDR en anticuerpos murinos. En cualquier caso, estas regiones son cruciales para permitir que el anticuerpo reconozca y se una a un antígeno específico.
De acuerdo con la invención, el método comprende preparar una secuencia de nucleótidos de codón optimizado de la proteína de fusión de anticuerpo-péptido, en la que la secuencia de nucleótidos de codón optimizado está optimizada para la expresión en una célula hospedadora de ovario de hámster chino (CHO), en la que la proteína de fusión de anticuerpo-proteína comprende un resto de direccionamiento y un resto inmunomodulador, en el que el resto de direccionamiento y el resto inmunomodulador están unidos por un espaciador de aminoácidos seleccionado de SEQ ID NO: 3 o SEQ iD NO: 11, en el que el resto inmunomodulador es TGF-pII que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; en el que el resto de direccionamiento se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-EGFR1, que consiste en la cadena pesada de SEQ ID NO: 5 y la cadena ligera de SEQ ID NO: 6, un anticuerpo anti-HER2/Neu que consiste en la cadena pesada de SEQ ID NO: 1 y la cadena ligera de SEQ ID NO: 2; y un anticuerpo anti-CTLA4 que consiste en la cadena pesada de SEQ ID NO: 7 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 8, en la que SEQ ID NO: 4 se une a través del espaciador de aminoácidos al extremo carboxilo de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID No : 2 del anti-HER2/Neu; extremo carboxilo de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6 del anti-EGFR1; o el extremo carboxilo de SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8 del anti-CTLA-4.
Un fragmento de anticuerpo puede incluir una porción de un anticuerpo intacto, por ejemplo, que incluye la unión al antígeno o región variable del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; fragmentos Fc o productos de fusión de Fc; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de una sola cadena; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmento(s) de anticuerpo. Un anticuerpo intacto es uno que incluye una región variable de unión al antígeno, además de un dominio constante de la cadena ligera (CL) y dominios constantes de la cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de la secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de la secuencia nativa humana) o variante de la secuencia de aminoácidos de los mismos o cualquier otro Fc modificado (por ejemplo, glucosilación u otro Fc modificado).
Una vez preparada una secuencia de nucleótidos de codón optimizada de la proteína de fusión de anticuerpopéptido como se ha descrito anteriormente, se clona en cualquier vector adecuado para su expresión. Numerosos vectores de clonación son conocidos para aquellos expertos en la materia, y la selección de un vector de clonación apropiado es una cuestión de elección. El gen puede ponerse bajo el control de un promotor, sitio de unión al ribosoma (para expresión bacteriana) y, opcionalmente, un operador (denominados conjuntamente en el presente documento elementos de "control"), de manera que la secuencia de ADN que codifica el polipéptido deseado se transcribe en ARN en la célula hospedadora transformada por un vector que contiene esta construcción de expresión. La secuencia codificante puede o puede no contener un péptido señal o secuencia conductora. Pueden añadirse secuencias conductoras heterólogas a la secuencia codificante que producen la secreción del polipéptido expresado a partir del organismo hospedador. También pueden ser deseables otras secuencias reguladoras que permiten la regulación de la expresión de las secuencias de proteínas con respecto al crecimiento de la célula hospedadora. Tales secuencias reguladoras son conocidas para aquellos expertos en la materia, y ejemplos incluyen aquellos que producen la expresión de un gen para ser encendido o apagado en respuesta a un estímulo químico o físico, que incluye la presencia de un compuesto regulador. Otros tipos de elementos reguladores también pueden estar presentes en el vector, por ejemplo, secuencias potenciadoras.
Las secuencias de control y otras secuencias reguladoras pueden unirse a la secuencia codificante antes de la inserción en un vector, tal como los vectores de clonación descritos anteriormente. Alternativamente, la secuencia codificante puede clonarse directamente en un vector de expresión que ya contiene las secuencias de control y un sitio de restricción apropiado.
El vector de expresión puede entonces utilizarse para transformar una célula hospedadora apropiada, que es una célula hospedadora de ovario de hámster chino (CHO) capaz de una expresión transitoria o continua.
El método de la invención comprende además cultivar la célula hospedadora CHO en un modo de lotes alimentados en un medio de fermentación en condiciones adecuadas para cultivar y permitir que la célula hospedadora CHO exprese una proteína clonada, en el que el medio de fermentación comprende una sal metálica transitoria divalente; en la que la sal metálica transitoria divalente incluye un ion de zinc, en la que la sal metálica transitoria divalente es sal de sulfato de zinc heptahidratada. La proteína puede aislarse entonces de las células hospedadoras y se purifica. Si el sistema de expresión secreta la proteína en medio de crecimiento, la proteína puede purificarse directamente a partir del medio. Si la proteína no se secreta, se aísla de lisados celulares. El método comprende la purificación de la proteína de fusión de anticuerpo-péptido expresada y, opcionalmente, la comprobación de las capacidades de unión biespecífica de la proteína de fusión de anticuerpo-péptido a sus dianas. La selección de las condiciones de crecimiento y los métodos de recuperación apropiados está dentro de la experiencia de la técnica. Una vez purificadas, las secuencias de aminoácidos de las proteínas pueden determinarse, es decir, por ciclo repetitivos de degradación de Edman, seguido de análisis de aminoácidos por HPLC. También se conocen en la técnica otros métodos de secuenciación de aminoácidos.
Una vez producido, puede probarse la actividad inhibidora de un polipéptido candidato evaluando la capacidad del candidato para inhibir la translocación nuclear inducida por lipopolisacárido de NF-.kappa.B, por ejemplo, usando células endoteliales murinas.
Parte experimental
A continuación, están ejemplos de realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen para fines ilustrativos solo, y no pretenden limitar el alcance de la presente invención de ningún modo. Se han hecho esfuerzos para garantizar la exactitud con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), pero, por supuesto, debe permitirse cierto error experimental y desviación.
Ejemplo 1
Se expresaron proteínas de fusión que comprenden cadena pesada de IgG unida a ligandos inmunomoduladores (ya sea supresores o activadores) por genes de codón optimizado para la expresión de células CHO. Las secuencias de nucleótidos de codón optimizado definidas por SEQ ID NO: 12 a 28 se expresaron en células (CHO) y las proteínas quiméricas/de fusión expresadas se muestran en la Tabla 1
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Se caracterizaron las proteínas expresadas usando SDS-PAGE y las proteínas de fusión expresadas anti-HER2/neu-TGFpRII y anti-EGFR1-TGFpRII se purificaron de sobrenadantes de cultivo usando columna de proteína A y los resultados se muestran en la Figura 22. En particular, la masa de la cadena ligera de anti-EGFR1-TGFpRII es más alta y puede ser debido a la presencia de dos sitios de glucosilación en las regiones variables de la cadena ligera y pesada. Tanto las masas de las cadenas pesadas de anti-HER2/neu-TGFpRII como de anti-EGFR1-TGFpRII son más altas debido a TGFpRII. También la cadena pesada de anti-HER2/neu-TGFpRII tiene cuatro sitios de N-glucosilación, mientras que anti-EGFR1-TGFpRII tiene zinco sitios de N-glucosilación.
Ejemplo 2
Cromatografía en proteína A/SEC. Se analizaron las muestras de anti-HER2/neu-TGFpRII y anti-EGFR1-TGFpRII por cromatografía en proteína A/SEC y los resultados se muestran en la Figura 23. La Figura 23A muestra un pico afilado de elución de Bmab200 (Herceptin) frente a un pico de elución más ancho que se cree que es una medida de heterogeneidad debido a la presencia de glucosilación ya que existen tres sitios de N-glucosilación adicionales que están presentes en la región de TGFpRII. En particular, el almacenamiento a -80 °C no causó agregación. El desplazamiento en la posición o aspecto del pico claramente en la columna de SEC indica que el aumento en el peso molecular es debido al componente de fusión. Esto confirma nuevamente que la molécula de longitud completa está siendo expresada. La Figura 23B muestra un pico de elución afilado de Bmab200 (Herceptin) frente a un pico de elución más ancho que se cree que es una medida de heterogeneidad debido a la presencia de sitios de glucosilación ya que existen tres sitios de N-glucosilación adicionales presentes en la región de TGFpRII. Nuevamente, el almacenamiento a -80 °C no causó agregación. El desplazamiento en la posición o aspecto del pico pronto en la columna de SEC indica que el aumento en el peso molecular es debido al componente de fusión. Esto confirma nuevamente que la molécula de longitud completa está siendo expresada.
Ejemplo 3
Ensayos funcionales para las proteínas de fusión. Se llevó a cabo experimento de ELISA para comprobar la capacidad de unión de anti-HER2/neu-TGFpRII y anti-EGFR1-TGFpRII a TGFp. La Figura 24A muestra que las moléculas anti-HER2/neu-TGFpRII y anti-EGFR1-TGFpRII se unen a TGFp, que indica que la proteína de fusión es funcional. La Figura 24B muestra que anti-HER2-TGFpRII inhibe la proliferación de la línea celular BT474 similar a Bmab200 (Herceptin). La Figura 25 muestra que anti-EGFR1-TGFpRII inhibe la proliferación de la línea celular A431 similar a cetuximab.
Ejemplo 4
Se realizó la actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo ADCC para la proteína de fusión anti-HER2/neu-TGFpRII para determinar que la proteína se unía a los receptores diana sobre las células. Los resultados se muestran en la Figura 26, en la que la actividad se determina en células BT474 y es evidente que la actividad de ADCC (% de lisis de células) de anti-HER2-TGFpRII en células BT474 es similar a la de Bmab200 (Herceptin). La Figura 27 muestra la actividad de ADCC de anti-EGFR1-TGFpRII en células A431, en las que las actividades de ADCC son similares a las de cetuximab. La Figura 28 muestra la actividad de ADCC de actividad de ADCC de anti-EGFR1-4-1BB en comparación con anti-EGFR1-TGFpRII y cetuximab.
Ejemplo 5
Actividad de unión de las proteínas expresadas. El objetivo de este ensayo es probar la funcionalidad de las proteínas de fusión para unirse a los receptores diana en las células en un modo dependiente de la dosis. La Figura 29A muestra que la actividad de unión de anti-CTLA4-TGFpRII a TGFp1 es comparable a anti-EGFR1-TGFpRII y B muestra la actividad de unión de anti-CTLA4-TGFpRII a CTLA4. La Figura 30A muestra la actividad de unión de anti-CTLA4-TGFpRII para determinar el nivel de unión de PD1-Fc y B muestra la actividad de unión de anti-EGRF1-4-1BB para determinar la unión de 4-1BBL. La Figura 31A muestra la actividad de unión de anti-EGFR1-4-1BB a EGFR y B muestra la actividad de unión de PD1-Fc-4-1BB para encontrar PDL1-Fc. La Figura 32 muestra la actividad de unión de anti-EGFR1-PD1 a EGFR y PD1.
Ejemplo 6
Confirmación de la estructura primaria de molécula. Como se muestra en la Figura 33, las proteínas expresadas se evalúan para determinar el peso molecular y la presencia de glucosilación. Las muestras se analizaron por SDS-PAGE reductora y no reductora. Las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo se separan mediante alquilación por reducción de manera que puedan evaluarse las estructuras reducidas. La digestión tríptica de las proteínas de fusión proporciona la identificación de la secuencia primaria. Se realiza análisis de EM/EM de las proteínas.
Análisis de espectrometría de masas de anti-HER2/neu-TGFpRII y anti-EGFR1-TGFpRII. Se expresó la proteína de fusión mostrada en la Figura 1 y se probó. La Figura 34A muestra el espectro de masas espectro de masas de la cadena ligera (LC) (reducido) de la fusión anti-HER2/neu-ECD de TGFpRIl y B muestra el espectro de masas deconvolucionado de LC (reducido) de la fusión anti-HER2/neu-ECD de TGFpRII. La Figura 35 muestra el espectro de masas de la cadena pesada (HC) (reducido) de la fusión anti-HER2/neu-ECD de TGFpRII.
Se expresó y probó la proteína de fusión mostrada en la Figura 2. La Figura 36A muestra el espectro de masas de LC (reducido) de anti-EGFRI-ECD de TGFpRII y B muestra el espectro de masas deconvolucionado de LC (reducido) de anti-EGFRI-ECD de TGFpRII. La Figura 37 muestra el espectro de masas de HC (reducido) de anti-EGFRI-ECD de TGFpRII.
Ejemplo 7
Se inspeccionaron las proteínas de fusión que tienen secuencias de aminoácidos como se describen en las Figuras 1 y 2 usando cromatografía de UV y proporcionando cromatogramas resultantes de la separación cromatográfica del digesto tríptico de las proteínas de fusión y se probó con UV de 218-222 nm de longitud de onda. También se evaluó la corriente iónica total (TIC) correspondiente a la traza de UV. La Figura 38A muestra el cromatograma de UV de péptidos trípticos de la proteína de fusión anti-HER2/neu-ECD de TGFpRII y B muestra el cromatograma iónico total (TIC) de péptidos trípticos de la proteína de fusión anti-HER2/neu-ECD de TGFpRII. Las Figuras 39, 40 y 41 proporcionan listas de péptido tríptico esperado/observado de la cadena ligera, cadena pesada y motivo unido de la proteína de fusión anti-HER2/neu-ECD de TGFpRII, respectivamente. En particular, se identificaron todos los péptidos esperados de las moléculas que incluyen los péptidos de las cadenas ligeras y pesadas y los péptidos del motivo unido (TGFpRII).
La Figura 42A muestra el cromatograma de UV de péptidos trípticos de la proteína de fusión anti-EGFR1-ECD de TGFpRII y B muestra el cromatograma iónico total (TIC) de péptidos trípticos de la proteína de fusión anti-EGFR1-ECD de TGFpRII. Las Figuras 43, 44 y 45 proporcionan listas de péptido tríptico esperado/observado de la cadena ligera, cadena pesada y motivo unido de la proteína de fusión anti-EGFR1-ECD de TGFpRII, respectivamente. Nuevamente, se identificaron todos los péptidos esperados de las moléculas que incluyen los péptidos de las cadenas ligeras y pesadas y los péptidos del motivo unido (TGFpRII).
Ejemplo 8
La línea de células hospedadoras usada para la expresión de la expresión de proteínas de fusión recombinantes es células CHO o el derivado de células CHO. Las células CHO citadas aquí es cualquier célula Freedom CHO-S; las células CHO-S son células derivadas de CHO adaptadas a cultivo en suspensión sin suero de alta densidad en medio químicamente definido que son capaces de producir altos niveles de proteína recombinante secretada o células CHO K1; que tienen el mismo que ATCC No. CCL-61. Es básicamente una línea de células adherentes. Vectores usados para la línea celular estable:
El vector Freedom pCHO 1.0, diseñado por ProBioGen AG, para expresar uno o dos genes de interés en la dirección 3' de los dos promotores del CMV híbridos diferentes de vector. Este vector contiene el marcador de selección de dihidrofolato reductasa (DHFR) y un gen de resistencia a puromicina, que permite la selección usando MTX y puromicina, simultáneamente.
Se clonan la cadena ligera o las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de la proteína de fusión de la cadena ligera en los sitios de enzimas de restricción AvrII y BstZl7 bajo el control del promotor EF2/CMV. Se clonan la cadena pesada o las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de la proteína de fusión de la cadena pesada, en sitios de enzimas de restricción EcoRV y Pad bajo el control del promotor CMV/EF1.
La(s) construcción (construcciones) se transfectan en células Freedom CHO-S / células CHOK1. Se selecciona la cepa de células clonales individual altamente productora para producir la proteína de fusión recombinante. Preparar

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un método de preparación de una proteína de fusión de anticuerpo-péptido terapéuticamente activa, comprendiendo el método,
preparar una secuencia de nucleótidos de codón optimizado de la proteína de fusión de anticuerpo-péptido, en la que la secuencia de nucleótidos de codón optimizado está optimizada para la expresión en una célula hospedadora de ovario de hámster chino (CHO), en la que la proteína de fusión de anticuerpo-péptido comprende un resto de direccionamiento y un resto inmunomodulador, en la que el resto de direccionamiento y el resto inmunomodulador están unidos por un espaciador de aminoácidos seleccionado de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 11, en el que el resto inmunomodulador es TGF-pRII que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; en la que la fracción de direccionamiento se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-EGFRI, que consiste en la cadena pesada de SEQ ID NO: 5 y la cadena ligera de SEQ ID NO: 6, un anticuerpo anti-HER2/Neu que consiste en la cadena pesada de SEQ ID NO: 1 y la cadena ligera de SEQ ID NO: 2; y un anticuerpo anti-CTLA4 que consiste en la cadena pesada de SEQ ID NO: 7 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 8, en la que SEQ ID NO: 4 se une a través del espaciador de aminoácidos al extremo carboxilo de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 del anti-HER2/Neu; el extremo carboxilo de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6 del anti-EGFR1; o el extremo carboxilo de SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8 del anti-CTLA-4;
clonar la secuencia optimizada de dicha proteína de fusión de anticuerpo-péptido en una célula hospedadora de ovario de hámster chino (CHO) capaz de expresión transitoria o continua;
cultivar la célula hospedadora CHO en un modo de lotes alimentados en un medio de fermentación en condiciones adecuadas para crecer y permitir que la célula hospedadora CHO exprese una proteína clonada, en el que el medio de fermentación comprende una sal metálica transitoria divalente, en la que la sal metálica transitoria divalente incluye un ion de zinc, en la que la sal metálica transitoria divalente es una sal de sulfato de zinc heptahidratada y
purificar la proteína de fusión de anticuerpo-péptido expresada y opcionalmente comprobar las capacidades de unión biespecífica de la proteína de fusión de anticuerpo-péptido a sus dianas.
2. El método de la reivindicación 1, en el que la sal metálica transitoria divalente se introduce en el cultivo celular inicialmente o en modo de lotes alimentados.
3. El método de la reivindicación 2, en el que la sal de sulfato de zinc heptahidratada está en una concentración inicial de 0,4 mM añadida al medio de fermentación, la fermentación de producción comienza con un recuento celular inicial de 0,3-0,45x106 células/ml a 37± 1 °C durante los primeros 3-4 días, seguido de un cultivo a 31±1 °C hasta el 7° día y en el que la acumulación de lactato se reduce en casi un 10-40 % durante el cultivo celular.
4. El método de la reivindicación 1, en el que la proteína de fusión de anticuerpo-péptido expresada se somete a cromatografía de afinidad utilizando una columna A de proteína Mab Select Xtra que tiene un pH específico.
5. El método de la reivindicación 1, en el que al sobrenadante que se une y pasa a través de la columna A de proteína Mab Select Xtra se le ajusta el pH al pH específico de la columna A de proteína.
6. El método de la reivindicación 1, en el que la proteína de fusión de anticuerpo-proteínas se une a través de la región Fc del anticuerpo a la columna, mientras que las impurezas se eliminan como flujo a través.
7. El método de la reivindicación 1, en el que la proteína de fusión de anticuerpo-proteína unida a la columna se eluye utilizando glicina a pH 3,0 y se ajusta a pH neutro para el almacenamiento.
8. El método de la reivindicación 1, en el que la proteína purificada se almacena a -20 °C o a 2-8 °C.
9. El método de la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos optimizada comprende un aumento de nucleótidos CG con respecto a una secuencia de nucleótidos no optimizada.
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