ES2938355T3 - Composición que comprende HMOS para el tratamiento de la diarrea no infecciosa - Google Patents

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Abstract

La solicitud se refiere a composiciones sintéticas que contienen uno o más monosacáridos u oligosacáridos de leche humana para el tratamiento de diarreas no infecciosas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composición que comprende HMOS para el tratamiento de la diarrea no infecciosa
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a composiciones y procedimientos para el tratamiento de la diarrea no infecciosa.
Antecedentes de la invención
La diarrea afecta a la mayoría de las personas en algún momento de su vida. Aparece cuando se deteriora la eficacia del intestino para absorber agua, electrolitos y nutrientes. En los intestinos ingresan aproximadamente 8-9 litros de líquido diariamente, de los cuales 1-2 litros representan la ingesta de alimentos y líquidos, y el resto proviene de fuentes endógenas tales como las secreciones salivales, gástricas, pancreáticas, biliares e intestinales. La mayor parte del líquido, aproximadamente 6-7 litros, se absorbe en el intestino delgado y solo aproximadamente 1 -2 litros alcanzan el colon. La mayor parte se absorbe a medida que pasa por el colon, dejando una producción de heces de aproximadamente 100 a 200 g/día. Por lo tanto, pequeños cambios en esta eficacia de absorción pueden cambiar radicalmente la humedad de las heces. Una gran diversidad de fármacos, toxinas, patógenos y alimentos pueden deteriorar la eficacia de absorción de electrolitos y agua, lo que provoca diarrea.
La frecuencia intestinal normal varía de tres veces al día a tres veces a la semana en la población sana. La diarrea es el aumento de la frecuencia de las deposiciones, con una consistencia de las heces menos sólida de lo normal. La diarrea aguda se define como tres o más deposiciones al día de forma reducida con respecto lo normal, y dura menos de 14 días. Si la duración de los síntomas es superior a 1 mes, se considera diarrea crónica. La mayor parte de los casos de diarrea aguda son autolimitados, están provocados por agentes infecciosos (por ejemplo, virus, bacterias, parásitos) y no requieren medicación a menos que el paciente esté inmunodeprimido.
Desde un punto de vista mecánico, la absorción puede verse deteriorada por solutos osmóticamente activos mal absorbidos en la luz intestinal, por la alteración de la función de las células absortivas, por aumentos en la secreción de las células de las criptas y por un tránsito demasiado rápido del contenido intestinal. Muy a menudo, la absorción se ve deteriorada por mecanismos que actúan en conjunto. Por ejemplo, un volumen excesivo de contenido intestinal puede acelerar el tránsito intestinal; las citocinas de las células inflamatorias epiteliales pueden aumentar la secreción de las criptas y pueden influir en el sistema nervioso entérico para acelerar el tránsito; las sales biliares y los ácidos grasos de cadena larga, deficientemente absorbidos en el intestino delgado, pueden bloquear la absorción de agua y electrolitos en el colon. El colon emplea distintos mecanismos para asegurar que suministra al colon recto-sigmoide unas heces formadas, probablemente el factor más importante en la continencia fecal. El colon tiene una capacidad de reserva mediante la cual puede absorber 2-3 litros adicionales de agua y electrolitos provenientes del intestino delgado en un día. Las bacterias del colon fermentan los carbohidratos y las proteínas solubles que escaparon a la absorción en el intestino delgado, dando gases absorbibles y ácidos grasos de cadena corta. De lo contrario, estos solutos no fermentados y no absorbibles serían osmóticamente activos en el contenido del colon y causarían diarrea.
La mayor parte de los casos de diarrea, especialmente la diarrea aguda, están relacionados con infecciones; especialmente debidas a organismos de Campylobacter, Salmonella, Shigella, E. coli, Vibrio y Aeromonas. En la mayor parte de los casos, la diarrea se soluciona por sí misma dentro de un periodo de 48 horas y no se necesita más tratamiento que la rehidratación. Las causas de diarrea no infecciosa incluyen enfermedad inflamatoria intestinal, síndrome del intestino irritable, enfermedad isquémica del intestino, obstrucción parcial del intestino delgado, absceso pélvico en la zona del recto-sigmoide, impactación fecal, síndrome carcinoide, alergias alimentarias, intolerancia a la lactosa, la ingestión de azúcares poco absorbibles tales como lactulosa, ingesta aguda de alcohol y efectos adversos de medicamentos recetados; a menudo antibióticos y quimioterapia/radiación. La diarrea no infecciosa es frecuentemente persistente, crónica y difícil de tratar. Los tratamientos comunes incluyen agentes antimotilidad tales como loperamida para reducir el número de deposiciones, secuestrantes de ácidos biliares, enzimas digestivas que contienen lactasa, probióticos, etc.
La diarrea no infecciosa es particularmente común en pacientes con síndrome del intestino irritable (SII). El síndrome del intestino irritable es un trastorno clínicamente heterogéneo de pacientes humanos, en particular adultos, que presenta síntomas crónicos tales como dolor abdominal, malestar abdominal, distensión abdominal, fatiga y cambios en los patrones de deposición, tales como patrones de deposiciones sueltas o más frecuentes, diarrea y estreñimiento. Las pruebas clínicas de rutina en los pacientes generalmente no muestran anomalías, aunque sus intestinos pueden ser más sensibles a determinados estímulos, tales como las pruebas de insuflación con balón. La prevalencia mundial del SII es de alrededor del 10-20% (Longstreth et al. Gastroenterology 130, 1480 (2006)) pero puede ser superior en determinados países. Se desconocen las causas del SII, pero se cree que las alteraciones del eje cerebro-intestino, las infecciones gastrointestinales agudas, el crecimiento excesivo de bacterias en el intestino delgado, el uso de antibióticos y la disbiosis son factores de riesgo importantes (Kim et al. Digest. Dis. Sci.57, 3213 (2012)). Otros factores de riesgo son una edad joven, fiebre prolongada, ansiedad y depresión. Generalmente se produce una inflamación crónica de bajo grado en pacientes con SII, pero por lo demás hay pocas o ninguna manifestación clínica observable.
El diagnóstico del SII es complicado. No se pueden realizar pruebas basadas en biomarcadores para diagnosticar el SII. El diagnóstico generalmente implica excluir afecciones que producen síntomas similares al SII y después seguir un procedimiento para categorizar los síntomas de un paciente. Se recomienda descartar infecciones parasitarias, la intolerancia a la lactosa y la enfermedad celíaca en todos los pacientes antes de realizar un diagnóstico de SII. Una vez diagnosticados, los pacientes se clasifican generalmente según los criterios de Roma IV en cuatro subtipos de síntomas basándose en la consistencia de las heces: diarrea predominante (SII-D), estreñimiento predominante (SII-C), subtipo mixto (SII-A o SII-M) con episodios alternos de diarrea y estreñimiento y SII no subtipificado (SII-U).
No existe cura para el SII y los tratamientos actuales se enfocan en tratar de aliviar los síntomas. Los tratamientos adoptan diversas formas, tales como ajustes en la dieta, medicamentos e intervenciones psicológicas. La educación del paciente y las buenas relaciones médico-paciente también son importantes. No obstante, la mayoría de los tratamientos son insatisfactorios y la mayor parte de los pacientes continúan experimentando dolor crónico, fatiga y otros síntomas. Si bien el SII no tiene un efecto directo sobre la esperanza de vida, su alta prevalencia y los efectos significativos sobre la calidad de vida lo convierten en una afección con un alto coste social. La desesperanza general asociada con el SII es una fuente de frustración tanto para los pacientes como para los profesionales de la salud que los tratan.
La investigación actual ha implicado a la microbiota gastrointestinal, el eje cerebro-intestino y los mastocitos en la fisiopatología del SII. La microbiota gastrointestinal humana incluye al menos 1000 especies de bacterias y en el intestino de cada individuo habitan aproximadamente 1014 células bacterianas individuales de aproximadamente 160 especies diferentes (Qin et al. Nature 464, 59 (2010)). Se cree que la constitución genética y la inmunidad adquirida de un individuo, así como los factores ambientales, influyen en su microbiota gastrointestinal. La microbiota, a su vez, determina la inmunidad y la fisiología del individuo dentro del sistema gastrointestinal. También se cree que un individuo sano mantiene una relación simbiótica con la microbiota que coloniza sus intestinos, mientras que un individuo con SII presenta un desequilibrio en esta interacción microbiota-huésped.
Los tratamientos dirigidos a la microbiota gastrointestinal, tales como antibióticos, probióticos y prebióticos, parecen aliviar los síntomas del SII; al menos temporalmente. Por ejemplo, el antibiótico rifaximina parece reducir las deposiciones en pacientes con SII-D.
El dolor abdominal y la incomodidad asociados con el SII están conectados al eje cerebro-intestino y a la respuesta a las hormonas del estrés. Los pacientes con SII normalmente experimentan motilidad intestinal anormal e hipersensibilidad visceral mediada por el eje cerebro-intestino o el sistema central de respuesta al estrés. Una rama del eje cerebro-intestino es la vía eferente central, que está formada por el sistema nervioso simpático y el eje hipotálamo-hipofisario-suprarrenal (HHS). En los trastornos sensibles al estrés, incluido el SII, se liberan hormonas del estrés del eje HHS, tales como hormona adrenocorticotrópica (ACTH), cortisol y catecolamina. Algunos estudios han demostrado que la respuesta del eje HHS en pacientes con SII está provocada por una mayor activación inmunitaria de la mucosa, que a su vez aumenta los niveles de citocinas en plasma para estimular el eje HHS.
Además del microbioma intestinal y del eje intestino-cerebro, los mastocitos también pueden desempeñar un papel importante en la patogenia del SII. El aumento de la infiltración y la activación de mastocitos en los segmentos intestinales distales se asocian con el inicio de los síntomas y la gravedad del SII. Estas células también están implicadas en la respuesta elevada de los nervios aferentes viscerales al estímulo de la mucosa en pacientes con SII. La hiperplasia de mastocitos se observa comúnmente tras una infección por bacterias tanto en el SII posinfeccioso como en el SII no posinfeccioso.
Un desarrollo reciente en el tratamiento del SII ha sido una dieta baja en FODMAP. Esta dieta requiere que los pacientes restrinjan la ingesta de carbohidratos FODMAP. Estos son oligosacáridos, disacáridos, monosacáridos y polioles fermentables que se absorben deficientemente en el intestino delgado proximal, son osmóticamente activos y están fermentados por bacterias intestinales de las que algunas producen hidrógeno. La adhesión a esta dieta ha dado como resultado mejoras en los síntomas de algunos pacientes (Staudacher et al. J. Hum. Nutr. Diet. 24, 487 (2011)). Sin embargo, algunos de los carbohidratos FODMAP son fibras beneficiosas, y los alimentos que las contienen son frutas, verduras y legumbres comunes y altamente nutritivas.
De manera similar, para la intolerancia a la lactosa no existe una terapia de tratamiento universalmente aceptada. Sin embargo, las estrategias existentes para la gestión de las afecciones incluyen evitar los productos lácteos que contienen lactosa (leches, quesos blandos y helados) y consumir lactasa antes de una comida que contenga lactosa. Si bien la restricción de la lactosa en la dieta puede mejorar las molestias gastrointestinales, los efectos a largo plazo de una dieta baja o exenta de productos lácteos pueden ser motivo de preocupación, ya que los productos lácteos proporcionan un paquete de nutrientes esenciales tales como calcio, proteínas, riboflavina, vitamina A y vitamina D. El calcio dietético es una parte importante de la cantidad diaria recomendada de vitaminas y minerales, y para muchas personas no es posible lograr la ingesta diaria recomendada de calcio con una dieta baja en lácteos o exenta de lácteos. Se ha observado que la deficiencia de calcio puede dar lugar a un mayor riesgo de osteoporosis, hipertensión y posiblemente cáncer.
Los fármacos de lactasa son eficaces y están disponibles sin receta. Sin embargo, es preciso consumirlos antes de las comidas que contengan lactosa. Además, aunque es poco frecuente, pueden provocar efectos secundarios graves relacionados con alergias.
La diarrea no infecciosa provocada por quimioterapia o radiación es un problema común en pacientes con cáncer. Se ha informado que la incidencia de diarrea inducida por quimioterapia (CID) es tan alta como del 50-80% en los pacientes con cáncer tratados. La CID puede causar agotamiento de líquidos y electrolitos, desnutrición, deshidratación y hospitalización, todo lo cual puede provocar problemas cardiovasculares y la muerte. La CID está provocada por un daño agudo en la mucosa intestinal (que incluye pérdida del epitelio intestinal, necrosis superficial e inflamación de la pared intestinal) que causa un desequilibrio entre la absorción y la secreción en el intestino delgado que da lugar a una secreción excesiva de electrolitos y líquidos. La profilaxis de la CID es muy limitada y solo se recomiendan unos pocos tratamientos en las directrices actuales: loperamida, tintura de opio desodorizada y octreótido. No obstante, estos tratamientos se enfocan solo en los síntomas y pueden usarse solo temporalmente (Stein et al. Ther. Adv. Med. Oncol. 2, 51 (2010)).
El documento WO 2015/095747 divulga el uso de composiciones nutricionales que comprenden, entre otros, oligosacáridos de la leche humana seleccionados para prevenir o tratar la deshidratación.
Elison et al. Br. J. Nutr. 116, 1356 (2016) demostraron que 2'-FL y LNnT son seguros y bien tolerados en adultos sanos, moduladores específicos de la microbiota adulta, y pueden ser un instrumento valioso para restaurar la homeostasis en adultos con una microbiota desequilibrada.
El documento WO 2017/084673 se refiere a una composición sintética que comprende oligosacáridos de la leche humana para su uso en la restauración, al menos parcialmente, de la microbiota gastrointestinal comensal y prevenir o mitigar la diarrea asociada a antibióticos.
Por lo tanto, existe la necesidad de una intervención segura y eficaz para el tratamiento de la diarrea no infecciosa.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona composiciones sintéticas que comprenden uno o más oligosacáridos de la leche humana (HMO) que pueden usarse ventajosamente para la profilaxis o el tratamiento de la diarrea no infecciosa en un ser humano, en particular un individuo humano no lactante, en las que el ser humano es un paciente intolerante a la lactosa.
En consecuencia:
• un primer aspecto de la presente invención se refiere a un oligosacárido de la leche humana o una mezcla de oligosacáridos de la leche humana para la profilaxis o el tratamiento de la diarrea no infecciosa en un ser humano, en el que el ser humano es un paciente intolerante a la lactosa; y
• un segundo aspecto de la presente invención se refiere a una composición sintética para la profilaxis o el tratamiento de la diarrea no infecciosa en un ser humano, en el que el ser humano es un paciente intolerante a la lactosa, comprendiendo la composición una cantidad eficaz de uno o más oligosacáridos de la leche humana.
Preferentemente, la cantidad de un oligosacárido de la leche humana es eficaz para aumentar (i) la abundancia, en particular la abundancia relativa, de bifidobacterias y/o (ii) la actividad de beta-galactosidasa, en el tubo gastrointestinal del ser humano. De forma más preferida, en un periodo de aproximadamente 14 días de tratamiento, las bifidobacterias incrementadas son un miembro del grupo filogenético de Bifidobacterium adolescentis, por ejemplo, Bifidobacterium pseudocatenulatum y/o Bifidobacterium adolescentis, y, después de aproximadamente 14 días de tratamiento, son Bifidobacterium longum y/o Bifidobacterium bifidum.
El paciente puede tener disbiosis intestinal y/o alteración de la barrera mucosa.
Preferentemente, el oligosacárido de la leche humana es 2'-FL, 3-FL, DFL, LNnT, LNT, 3'-SL, 6'-SL o LNFP-I o una mezcla de los mismos. Por ejemplo, la composición puede comprender una mezcla de HMO fucosilados tales como 2'-FL y/o DFL, y un HMO neutro no fucosilado tal como LNnT o LNT, o ambos. En una forma de realización preferida, el oligosacárido de la leche humana es una mezcla de 2'-FL y LNnT y/o LNT. En esta forma de realización, 2'-FL y LNnT/LNT pueden estar presentes en una relación en masa de aproximadamente 5:1 a 1:1; de forma más preferida de aproximadamente 4:1 a 2:1. En otra forma de realización preferida, el oligosacárido de la leche humana es una mezcla de 2'-FL y/o DFL y LNnT y/o LNT. En esta forma de realización, 2'-FL/DFL y LNnT/LNT pueden estar presentes en una relación en masa de aproximadamente 5:1 a 1:1; de forma más preferida de aproximadamente 4:1 a 2:1.
Preferentemente, los uno o más HMO se administran a un ser humano que lo necesite en dos etapas:
(a) en una primera etapa, durante un periodo de tratamiento inicial de aproximadamente 14 días, para aumentar la abundancia relativa de bifidobacterias del grupo filogenética Bifidobacterium adolescentis; y
(b) en una segunda etapa, durante un periodo de tratamiento adicional de 1 o más días después del periodo de tratamiento inicial, para aumentar la abundancia relativa de Bifidobacterium longum y/o Bifidobacterium bifidum,
en la microbiota del tubo gastrointestinal de dicho ser humano.
La composición sintética puede ser una composición nutricional o farmacéutica. Preferentemente, la composición sintética de la invención se administra diariamente. Además, la composición sintética se administra preferentemente durante un periodo de al menos un mes, tal como al menos 2 meses o durante un periodo de tiempo más largo, por ejemplo de forma crónica de manera continua.
La composición sintética se puede administrar al ser humano o al paciente como una dosis diaria de aproximadamente 1 g a aproximadamente 15 g, tal como de aproximadamente 3 g a aproximadamente 10 g de HMO. El paciente puede recibir una cantidad mayor, preferentemente de 5 g a 10 g por día, de los HMO durante un máximo de 8 semanas, seguida de una cantidad menor, preferentemente de 1 g a 5 g por día, durante un periodo de tiempo posterior, si es necesario, periodo que puede ser de 1 semana a 1 mes o incluso más prolongado.
Descripción detallada de la invención
Sorprendentemente, se ha descubierto que los oligosacáridos de la leche humana (HMO) pueden disminuir la frecuencia de las deposiciones y mejorar la consistencia de las heces en pacientes que padecen diarrea no infecciosa, particularmente aquellos que padecen disbiosis intestinal o una alteración de la barrera mucosa. Los HMO aumentan preferentemente la abundancia de bifidobacterias en el tubo gastrointestinal, que metabolizan los carbohidratos, en particular los que escaparon a la absorción en el intestino delgado, dando lactato y ácidos grasos de cadena corta, lo que los hace menos activos osmóticamente en el colon. Además, los HMO actúan para reducir la inflamación mucosa crónica y/o reparar el daño a la barrera mucosa, reduciendo potencialmente la secreción de las criptas. Los HMO también pueden actuar sobre los complejos motores migratorios intestinales dependientes de las neuronas para gestionar trastornos de la motilidad intestinal y posiblemente presentan efectos beneficiosos sobre el sistema nervioso central de los pacientes. Como resultado, se reduce la frecuencia de las deposiciones y mejora la consistencia de las heces.
La expresión "administración oral" significa preferentemente cualquier forma convencional para la administración oral de una composición a un paciente que provoque la deposición de la composición en el tubo gastrointestinal (incluido el estómago) del paciente. En consecuencia, la administración oral incluye la deglución de la composición por parte del paciente, la alimentación entérica a través de una sonda nasogástrica y similares.
La expresión "cantidad eficaz" significa preferentemente una cantidad de una composición que proporciona un oligosacárido de la leche humana en una cantidad suficiente como para obtener el resultado de tratamiento deseado en un paciente. Se puede administrar una cantidad eficaz en una o más dosis al paciente para lograr el resultado de tratamiento deseado.
La expresión "oligosacárido de la leche humana" o "HMO" significa preferentemente un carbohidrato complejo que se encuentra en la leche materna humana que puede estar en forma ácida o neutra. Se sabe que existen más de 200 estructuras de HMO diferentes en la leche materna humana (Urashima et al.: Milk Oligosaccharides, Nova Biomedical Books, Nueva York, 2011). Los HMO pueden ser oligosacáridos de cadena principal, fucosilados y sialilados. Los HMO de cadena principal consisten en Glu, Gal y GlcNAc y están desprovistos de Fuc y ácido siálico. Los ejemplos de HMO de cadena principal incluyen lacto-N-tetraosa (LNT), lacto-N-neotetraosa (LNnT), lacto-N-neohexaosa (LNnH) y lacto-N-hexaosa (LNH). Los fucosil-HMO son lactosas fucosiladas o HMO de cadena principal fucosilados, tales como 2'-fucosilactosa (2'-FL), lacto-N-fucopentaosa I (LNFP-I), lacto-N-difucohexaosa I (LNDFH-I), 3-fucosil-lactosa (3-FL), difucosil-lactosa (DFL), lacto-N-fucopentaosa III (LNFP-III), fucosil-para-lacto-N-neohexaosa (F-pLNnH), lacto-N-difucohexaosa I (LNDFH-I), fucosil-lacto-N-hexaosa II (FlNH-II), lacto-N-fucopentaosa V (LNFP-V), lacto-N-difucohexaosa II (LNDFH-II), fucosil-lacto-N-hexaosa I (FLNH-I), fucosil-lacto-N-hexaosa III (FLNH-III) y fucosil-paralacto-N-neohexaosa (F-pLNnH). Los sialil-HMO son lactosas sialiladas o HMO de cadena principal sialilados, tales como 3',6-disialillacto-N-tetraosa (DSLNT), 6'-sialil-lactosa (6'-SL), 3'-sialil-lactosa (3'-SL), 6'- sialil-lacto-N-neotetraosa (LST c), 3'-sialil-lacto-N-tetraosa (LST a) y 6-sialil-lacto-N-tetraosa (LST b). Se puede considerar que los HMO que contienen grupos tanto sialilo como fucosilo pertenecen a cualquiera de los dos últimos grupos. Los ejemplos de sialily fucosil-HMO incluyen disialil-fucosil-lacto-N-hexaosa II (DSFLNH-II), fucosil-sialil-lacto-N-neohexaosa I (FSLNnH-I), fucosil-sialil-lacto-N-hexaosa I (FSLNH-I) y 3-fucosil-3'-sialil-lactosa (FSL). En el contexto de la presente invención, la lactosa no está incluida en el grupo de los HMO.
Los términos "microbiota", "microflora" y "microbioma" significan preferentemente una comunidad de microorganismos vivos que normalmente habita en un órgano o una parte del cuerpo. Los miembros más dominantes de la microbiota gastrointestinal incluyen microorganismos de los filos de Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria, Synergistetes, Verrucomicrobia, Fusobacteria y Euryarchaeota;a nivel de género los microorganismos de Bacteroides, Faecalibacterium, Bifidobacterium, Roseburia, Alistipes, Collinsella, Blautia, Coprococcus, Ruminococcus, Eubacterium y Dorea; y a nivel de especie microorganismos de Bacteroides uniformis, Alistipes putredinis, Parabacteroides merdoe, Ruminococcus bromii, Dorea longicatena, Bacteroides caccae, Bacteroides thetaiotaomicron, Eubacterium hollii, Ruminococcus torques, Faecalibacterium prausnitzii, Ruminococcus lactaris, Collinsella aerofaciens, Dorea formicigenerans, Bacteroides vulgatus y Roseburia intestinalis. En algunos casos, la microbiota gastrointestinal incluye la microbiota asociada a la mucosa, que se encuentra en la capa de moco que cubre el epitelio del tubo gastrointestinal o está unida a la misma, y la microbiota asociada a la luz, que se encuentra en la luz del tubo gastrointestinal.
El término "paciente" significa un individuo humano de 3 años de edad y mayor que tiene una diarrea no infecciosa y es intolerante a la lactosa.
Preferentemente, el paciente tiene disbiosis intestinal, tal como una microbiota alterada y/o una barrera mucosa alterada.
El término "profilaxis" significa un tratamiento dado o una acción adoptada para prevenir una enfermedad en el paciente, enfermedad que está asociada o desencadenada por una diarrea no infecciosa.
Los términos "síndrome del intestino irritable" y "SII" se refieren preferentemente a un grupo de trastornos intestinales funcionales de seres humanos, en particular adultos, caracterizados por uno o más síntomas crónicos que incluyen dolor abdominal, malestar abdominal, distensión abdominal, fatiga y cambios en los patrones de deposición, tales como patrones de deposiciones sueltas o más frecuentes, diarrea y estreñimiento, normalmente en ausencia de cualquier anomalía estructural aparente. Existen al menos tres formas de SII, según el síntoma que predomine: (1) con predominio de diarrea (SII-D); (2) con predominio de estreñimiento (IBS-C); y (3) SII con patrón de deposiciones alternas (SII-A o SII-M). También existen varios subtipos clínicos de SII, tales como el SII posinfeccioso (SII-PI) o el SII no subtipificado (SII-U). Preferentemente, la invención se refiere a pacientes con SII-D o/y SII-A.
El término "bifidobacteria" significa un miembro del género Bifidobacterium que se encuentra comúnmente en el tubo gastrointestinal humano. Ejemplos de bifidobacterias son Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum y miembros del grupo filogenético de Bifidobacterium adolescentis. Las bifidobacterias del grupo filogenético de Bifidobacterium adolescentis son, por ejemplo, Bifidobacterium pseudocatenulatum y/o Bifidobacterium adolescentis.
La expresión "actividad de beta-galactosidasa" significa la actividad enzimática de una enzima que tiene actividad de glucósido hidrolasa, en particular, lactasa, que está involucrada en la hidrólisis del disacárido lactosa para dar monómeros constituyentes de galactosa y glucosa en el intestino humano. La actividad de beta-galactosidasa se puede medir analizando la concentración de glucosa liberada después de 30 min de reacción in vitro utilizando lactosa como sustrato. Los procedimientos analíticos para medir la actividad de lactasa in vitro son bien conocidos en la técnica. Preferentemente, la actividad de beta-galactosidasa medida en las muestras del paciente después de la administración de una composición sintética de la invención aumenta al menos el 15-20%, de forma más preferida el 20-50%, en comparación con la actividad enzimática medida en muestras tomadas del paciente antes del comienzo de la administración de uno o más HMO o de la composición sintética que comprende uno o más HMO. La expresión "composición sintética" significa una composición que se prepara artificialmente y preferentemente significa una composición que contiene al menos un compuesto que se produce ex vivo químicamente y/o biológicamente, por ejemplo mediante reacción química, reacción enzimática o de forma recombinante. En algunas formas de realización, una composición sintética puede ser, pero preferentemente no lo es, idéntica a una composición de origen natural. La composición sintética normalmente comprende uno o más HMO que son capaces de aumentar preferentemente la abundancia de bifidobacterias. En algunas formas de realización, la composición sintética puede comprender uno o más compuestos o componentes distintos de los HMO que pueden tener un efecto sobre las bifidobacterias de la microbiota de un sujeto humano in vivo, por ejemplo oligosacáridos no digeribles o prebióticos. También en algunas formas de realización, las composiciones sintéticas pueden comprender uno o más componentes nutricionalmente o farmacéuticamente activos que no afectan negativamente a la eficacia de los compuestos mencionados anteriormente. También se describen a continuación algunas formas de realización no limitantes de una composición sintética de la invención.
La expresión "abundancia relativa de bifidobacterias" significa la abundancia de bifidobacterias con respecto a otro género en la microbiota del tubo gastrointestinal.
La expresión "crecimiento relativo de bifidobacterias" significa el crecimiento de bifidobacterias con respecto a otro género en la microbiota del tubo gastrointestinal.
La expresión "ser humano no lactante" o "no lactante" significa en el presente contexto un ser humano de 3 años de edad y mayor. Un ser humano no lactante puede ser un niño, un adolescente, un adulto o un anciano.
La expresión "administración entérica" significa cualquier forma convencional de suministro de una composición a un ser humano que provoque la deposición de la composición en el tubo gastrointestinal (incluido el estómago). Los procedimientos de administración entérica incluyen la alimentación a través de una sonda nasogástrica o una sonda de yeyuno y la administración oral, sublingual y rectal.
La expresión "administración oral" significa cualquier forma convencional para la administración de una composición a un ser humano a través de la boca. En consecuencia, la administración oral es una forma de administración entérica.
La expresión "periodo inicial" de tratamiento con un HMO o una mezcla de HMO es de aproximadamente 14 días a partir del inicio del tratamiento; "periodo adicional" de tratamiento significa 1 o más días tras el periodo inicial de tratamiento.
El término "aproximadamente" en el presente contexto significa hasta el 2,5% de desviación a partir del valor correspondiente.
El término "preferentemente" se utiliza en el presente documento para indicar el mejor modo de realización de la invención, no para limitar el alcance de la invención.
HMO para la profilaxis o el tratamiento de la diarrea no infecciosa en un ser humano
Los HMO para la profilaxis o el tratamiento de la diarrea no infecciosa en un ser humano pueden ser un solo HMO o una mezcla de cualesquiera HMO adecuados para los fines de la invención. Preferentemente, el HMO es un HMO neutro fucosilado o no fucosilado. De forma más preferida, los HMO para la profilaxis o el tratamiento de la diarrea no infecciosa en un ser humano son una mezcla de al menos un primer HMO y al menos un segundo HMO, en la que el primer HMO es un HMO neutro fucosilado y el segundo HMO es un HMO neutro no fucosilado. En particular, la mezcla contiene un HMO fucosilado seleccionado de la lista que consiste en 2'-FL, 3-FL, DFL, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LNDFH-I, LNDFH-II, LNDFH-III, FLNH-I, FLNH-II, FLNnH, FpLNH-I y F-pLNnH II, y un HMO no fucosilado seleccionado de la lista que consiste en LNT, LNnT, LNH, LNnH, pLNH y pLNnH. Preferentemente, la mezcla contiene un HMO fucosilado seleccionado de la lista que consiste en 2'-FL, 3-FL y DFL, y un HMO no fucosilado seleccionado de la lista que consiste en LNT y LNnT; ventajosamente la mezcla comprende 2'-FL y/o DFL y LNnT y/o LNT. En algunas formas de realización, la mezcla consiste esencialmente en dos HMO neutros, por ejemplo un HMO fucosilado seleccionado de la lista que consiste en 2'-FL, 3-FL, DFL, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LNDFH-I, LNDFH-II, LNDFH-III, FLNH-I, FLn H-II, FLNnH, FpLNH-I y F-pLNnH II, y un HMO no fucosilado seleccionado de la lista que consiste en LNT, LNnT, LNH, LNnH, pLNH y pLNnH. Preferentemente, la mezcla consiste esencialmente en un h Mo fucosilado seleccionado de la lista que consiste en 2'-FL, 3-FL y DFL, y un HMO no fucosilado seleccionado de la lista que consiste en LNT y LNnT; en una forma de realización preferida, la mezcla consiste esencialmente en 2'-FL y LNnT, en otra forma de realización preferida, la mezcla consiste esencialmente en 2'-FL y LNT.
Los HMO pueden aislarse o enriquecerse mediante procesos bien conocidos a partir de leche(s) secretada(s) por mamíferos que incluyen, pero sin limitación, las especies humana, bovina, ovina, porcina o caprina. Los HMO también se pueden producir mediante procesos bien conocidos que utilizan fermentación microbiana, procesos enzimáticos, síntesis química o combinaciones de estas tecnologías. Como ejemplos, mediante el uso de la química se puede producir LNnT tal como se describe en los documentos WO 2011/100980 y WO 2013/044928, se puede sintetizar LNT tal como se describe en los documentos WO 2012/155916 y WO 2013/044928, se puede producir una mezcla de LNT y LNnT tal como se describe en los documentos WO 2013/091660, se puede producir 2'-FL tal como se describe en los documento WO 2010/115934 y WO 2010/115935, se puede producir 3-FL tal como se describe en el documento WO 2013/139344, se pueden producir 6'-SL y sus sales tal como se describe en el documento WO 2010/100979, se pueden producir oligosacáridos sialilados tal como se describe en el documento WO 2012/113404 y se pueden producir mezclas de oligosacáridos de la leche humana tal como se describe en el documento WO 2012/113405. Como ejemplos de producción enzimática, se pueden producir oligosacáridos sialilados tal como se describe en el documento WO 2012/007588, se pueden producir oligosacáridos fucosilados tal como se describe en el documento WO 2012/127410, y ventajosamente se pueden producir mezclas diversificadas de oligosacáridos de la leche humana tal como se describe en los documentos WO 2012/156897 y WO 2012/156898. Con respecto a los procedimientos biotecnológicos, los documentos WO 01/04341 y WO 2007/101862 describen cómo producir oligosacáridos de la leche humana de núcleo opcionalmente sustituidos con fucosa o ácido siálico utilizando E. coli genéticamente modificada.
Composición sintética que comprende HMO
La composición sintética puede comprender un solo HMO o una mezcla de cualesquiera HMO adecuados para el propósito de la invención. Preferentemente, el HMO es un HMO neutro fucosilado o no fucosilado. De forma más preferida, la composición comprende una mezcla de al menos un primer HMO y al menos un segundo HMO, en la que el primer HMO es un HMO neutro fucosilado y el segundo HMO es un HMO neutro no fucosilado. En particular, la composición puede contener un HMO fucosilado seleccionado de la lista que consiste en 2'-FL, 3-FL, DFL, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LNDFH-I, LNDFH-II, LNDFH-III, FLNH-I, FLNH-II, FLNnH, FpLNH-I y F-pLNnH II, y un HMO no fucosilado seleccionado de la lista que consiste en LNT, LNnT, LNH, LNnH, pLNH y pLNnH. Preferentemente, la composición contiene un HMO fucosilado seleccionado de la lista que consiste en 2'-FL, 3-FL y DFL, y un HMO no fucosilado seleccionado de la lista que consiste en LNT y LNnT, ventajosamente la composición comprende 2'-FL y /o DFL y LNnT y/o LNT. En algunas formas de realización, la composición comprende una mezcla que consiste esencialmente en dos HMO neutros, por ejemplo un HMO fucosilado seleccionado de la lista que consiste en 2'-FL, 3-FL, DFL, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LNDFH-I, LNDFH-II, LNDFH-III, FLNH-I, FLNH-II, FLNnH, FpLNH-I y F-pLNnH II, y un HMO no fucosilado seleccionado de la lista que consiste en LNT, LNnT, LNH, LNnH, pLNH y pLNnH. Preferentemente, la composición comprende una mezcla que consiste en un HMO fucosilado seleccionado de la lista que consiste en 2'-FL, 3-FL y DFL, y un HMO no fucosilado seleccionado de la lista que consiste en LNT y LNnT; en una forma de realización preferida la composición comprende una mezcla que consiste esencialmente en 2'-FL y LNnT, en otra forma de realización preferida la composición comprende una mezcla que consiste esencialmente en 2'-FL y LNT.
Una composición sintética de la presente invención que comprende uno o más oligosacáridos de la leche humana puede adoptar cualquier forma adecuada. Por ejemplo, la composición puede encontrarse en forma de una composición nutricional que contenga otros macronutrientes tales como proteínas, lípidos u otros carbohidratos, preferentemente en la que el otro carbohidrato sea lactosa y/o un carbohidrato diferente a un HMO. La composición sintética también puede ser una composición farmacéutica.
Composiciones nutricionales
Una composición nutricional de la presente invención puede contener fuentes de proteína, lípidos y/o carbohidratos digeribles y puede encontrarse en forma líquida o en polvo. La composición se puede diseñar para que sea la única fuente de nutrición o un suplemento nutricional. Para los pacientes con SII, se prefiere un suplemento nutricional; especialmente un suplemento que puede constituir un sustituto de una comida o de un tentempié. Preferentemente, la composición nutricional presenta una cantidad reducida de lactosa o, mejor aún, está desprovista de lactosa. Preferentemente, la composición nutricional también está desprovista de carbohidratos FODMAP o presenta una cantidad baja de los mismos.
Las fuentes de proteína adecuadas incluyen proteínas de la leche, proteína de soja, proteína de arroz, proteína de guisante y proteína de avena, o mezclas de las mismas. Las proteínas de la leche pueden encontrarse en forma de concentrados de proteína de leche, en forma de proteína de suero o en forma de caseína, o mezclas de los mismos. Las proteínas de soja, arroz, guisante y avena pueden estar en forma de proteínas aisladas. La proteína puede ser proteína entera o proteína hidrolizada, tanto parcialmente hidrolizada como ampliamente hidrolizada. La proteína puede proporcionar del 5% al 50%, preferentemente del 10% al 30%, de la energía de la composición nutricional. La fuente de proteína preferentemente no es una fuente de carbohidratos no fermentables tales como la lactosa. Por lo tanto, si se usa una proteína de la leche como fuente de proteína, la proteína de la leche presenta preferentemente una cantidad reducida de lactosa o está desprovista de lactosa.
La fuente de proteína puede ser una fuente de glutamina, treonina, cisteína, serina, prolina o una combinación de estos aminoácidos. La fuente de glutamina puede ser un dipéptido de glutamina y/o una proteína enriquecida con glutamina. La glutamina puede incluirse debido al uso de glutamina por parte de los enterocitos como fuente de energía. La treonina, la serina y la prolina son aminoácidos importantes para la producción de mucina. La mucina recubre el tubo GI y puede reducir la permeabilidad. La cisteína es un importante precursor del glutatión, que es clave para las defensas antioxidantes del cuerpo.
Los carbohidratos digeribles adecuados incluyen maltodextrina, almidón hidrolizado o modificado o almidón de maíz, polímeros de glucosa, jarabe de maíz, sólidos de jarabe de maíz, tapioca, sacarosa y glucosa, o mezclas de los mismos. Los carbohidratos digeribles en general proporcionan de aproximadamente el 35% a aproximadamente el 75%, preferentemente de aproximadamente el 45% a aproximadamente el 70%, de la energía de la composición nutricional. Preferentemente, el carbohidrato digerible está desprovisto de lactosa.
Los lípidos adecuados incluyen aceite de colza, aceite de semilla de girasol, aceite de palma, aceite de soja, grasa de leche, aceite de maíz y lecitina de soja. Los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFA), especialmente los ácidos grasos omega-3, tales como el ácido docosahexaenoico (DHA), pueden incluirse en la fuente de lípidos porque tienen propiedades antiinflamatorias. Fuentes adecuadas de LC-PUFA son aceites vegetales, aceites de plancton marino, aceites fúngicos y aceites de pescado. La fuente de lípidos también puede incluir triglicéridos de cadena media (MCT). Los aceites de coco fraccionados son una fuente adecuada de triglicéridos de cadena media. La fuente de lípidos proporciona preferentemente de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 25% de la energía de la composición nutricional; por ejemplo, de aproximadamente el 10% al 20%. El contenido de lípidos se reduce preferentemente porque las dietas ricas en grasas pueden provocar síntomas del SII.
La composición nutricional también puede incluir vitaminas y minerales. Si la composición nutricional está prevista para ser la única fuente de nutrición, preferentemente incluye un perfil de vitaminas y minerales, preferentemente un perfil completo de vitaminas y minerales. El término "completo" en el presente contexto significa un perfil de vitaminas y minerales que comprende todas las vitaminas y minerales esenciales para la función corporal, en el que las vitaminas esenciales incluyen al menos 9 vitaminas del grupo de ejemplo que se indica a continuación, tal como 10, 11, 12 o 13, o más, y los minerales esenciales incluyen al menos 5 minerales del grupo de ejemplo que se indica a continuación, tal como de 6 a 13 o más. Los ejemplos de vitaminas incluyen vitaminas A, complejo B (tal como B1, B2, B6 y B12), C, D, E y K, niacina y vitaminas ácidas tales como ácido pantoténico y ácido fólico y biotina. Los ejemplos de minerales incluyen calcio, hierro, zinc, magnesio, yodo, cobre, fósforo, manganeso, potasio, cromo, molibdeno, selenio, níquel, estaño, silicio, vanadio y boro.
La composición nutricional también puede incluir un carotenoide tal como luteína, licopeno, zeaxantina y betacaroteno. La cantidad total de carotenoide incluida puede variar de aproximadamente 0,001 gg/ml a aproximadamente 10 gg/ml. La luteína se puede incluir en una cantidad de aproximadamente 0,001 gg/ml a aproximadamente 10 gg/ml, preferentemente de aproximadamente 0,044 gg/ml a aproximadamente 5 g/ml de luteína. El licopeno se puede incluir en una cantidad de aproximadamente 0,001 gg/ml a aproximadamente 10 gg/ml, preferentemente de aproximadamente 0,0185 mg/ml a aproximadamente 5 g/ml de licopeno. El betacaroteno puede comprender de aproximadamente 0,001 gg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, por ejemplo de aproximadamente 0,034 gg/ml a aproximadamente 5 gg/ml de betacaroteno.
La composición nutricional también puede contener otros diversos ingredientes convencionales, tales como conservantes, emulsionantes, espesantes, tampones, fibras y probióticos, especialmente probióticos que pueden ayudar a reducir los síntomas en pacientes con SII (por ejemplo, VSL#3, B. infantis 35624, B. animalis subesp. lactis BB-12, B. lactis Bi-07, L. rhamnosus GG, L. rhamnosus Lc705, L. plantarum DSM 9843, L. plantarum CECT7484, L. plantarum CECT7485, L. acidophilus NCFM, L. fermentum CECT5716, B breve bb99, Propionibacterium freundenreichii ssp. Shermanii JS, P. acidilactici CECET7483, Streptococcus faecium), compuestos antioxidantes/antiinflamatorios que incluyen tocoferoles, carotenoides, ascorbato/vitamina C, palmitato de ascorbilo, polifenoles, glutatión y superóxido dismutasa (melón), otros factores bioactivos (por ejemplo, hormonas de crecimiento, citocinas, TFG-p), colorantes, sabores y estabilizantes, lubricantes, etc.
La composición nutricional puede encontrarse en forma de un polvo soluble, un concentrado líquido o una formulación lista para su uso. También pueden estar presentes diversos sabores, fibras y otros aditivos.
Las composiciones nutricionales se pueden preparar mediante cualquier técnica de fabricación utilizada comúnmente para preparar composiciones nutricionales en forma sólida o líquida. Por ejemplo, la composición se puede preparar a partir de diversas soluciones alimenticias. Se puede preparar una solución alimenticia de proteína en grasa calentando y mezclando la fuente de lípidos y añadiendo después un emulsionante (por ejemplo, lecitina), vitaminas liposolubles y al menos una porción de la fuente de proteína mientras se calienta y se agita. También se prepara una solución alimenticia de carbohidratos mediante la adición de minerales, minerales traza y ultratraza, espesantes o agentes de suspensión al agua mientras se calienta y se agita. La solución resultante se mantiene durante 10 minutos con calor y agitación continuos antes de añadir carbohidratos (por ejemplo, HMO y fuentes de carbohidratos digeribles). Las soluciones alimenticias resultantes, a continuación, se combinan entre sí mientras se calienta y se agita y el pH se ajusta a 6,6-7,0, después de lo cual la composición se somete a un procesamiento de corta duración a alta temperatura durante el cual la composición se trata térmicamente, se emulsiona y se homogeneiza, y después se deja enfriar. Se añaden vitaminas hidrosolubles y ácido ascórbico, el pH se ajusta al intervalo deseado si es necesario, se añaden sabores y se añade agua para lograr el nivel de sólidos totales deseado.
Para un producto líquido, la solución resultante puede envasarse asépticamente para formar una composición nutricional envasada asépticamente. De esta forma, la composición nutricional puede encontrarse en una forma líquida lista para el consumo o en una forma líquida concentrada. Alternativamente, la composición se puede secar por pulverización y procesarse y envasarse como un polvo reconstituible.
Cuando el producto nutricional es un líquido nutricional listo para el consumo, la concentración total de HMO en el líquido, en peso del líquido, es de aproximadamente el 0,02% a aproximadamente el 2,0%, incluyendo de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 1,5%, incluyendo de aproximadamente el 0,3% a aproximadamente el 1,0%. Cuando el producto nutricional es un líquido nutricional concentrado, la concentración total de HMO en el líquido, en peso del líquido, es de aproximadamente el 0,04% a aproximadamente el 4,0%, incluyendo de aproximadamente el 0,2% a aproximadamente el 3,0%, incluyendo de aproximadamente el 0,6% a aproximadamente el 2,0%
Formas de dosificación unitaria
La composición sintética también puede encontrarse en una forma de dosificación unitaria tal como una cápsula, un comprimido o una bolsita. Por ejemplo, la composición puede encontrarse en forma de un comprimido que comprende los monosacáridos y/u oligosacáridos de la leche humana y uno o más componentes adicionales para ayudar a la formulación y la administración, tales como diluyentes, excipientes, antioxidantes, lubricantes, colorantes, aglutinantes, disgregantes, y similares.
Los diluyentes, excipientes, lubricantes, colorantes, aglutinantes y disgregantes adecuados incluyen polietileno, poli(cloruro de vinilo), etilcelulosa, polímeros de acrilato y sus copolímeros, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), carboximetilcelulosa sódica, poli(metacrilato de hidroxietilo) (PHEMA), poli(alcohol vinílico) (PVA), polivinilpirrolidona (PVP), poli(óxido de etileno) (PEO) o poliacrilamida (PA), carragenano, alginato de sodio, policarbófilo, poli(ácido acrílico), tragacanto, metilcelulosa, pectina, gomas naturales, goma xantana, goma guar, goma karaya, hipromelosa, estearato de magnesio, celulosa microcristalina y dióxido de silicio coloidal. Los antioxidantes adecuados son vitamina A, carotenoides, vitamina C, vitamina E, selenio, flavonoides, polifenoles, licopeno, luteína, lignano, coenzima Q10 ("CoQIO") y glutatión.
Las formas de dosificación unitaria, especialmente aquellas en forma de bolsita, también pueden incluir diversos nutrientes, incluidos macronutrientes.
Las formas de dosificación unitaria se pueden administrar por vía oral, por ejemplo en forma de comprimido, cápsula o pella que contiene una cantidad predeterminada, o en forma de polvo o gránulos que contienen una concentración predeterminada o en forma de gel, pasta, solución, suspensión, emulsión, jarabe, bolo, electuario o suspensión, en un líquido acuoso o no acuoso, que contiene una concentración predeterminada. Las composiciones de administración oral pueden incluir aglutinantes, lubricantes, diluyentes inertes, saborizantes y humectantes. Las composiciones administradas por vía oral, tales como comprimidos, se pueden recubrir opcionalmente y se pueden formular para proporcionar una liberación mantenida, retardada o controlada de la mezcla que contienen.
Las formas de dosificación unitaria también pueden administrarse mediante supositorio rectal, sonda de aerosol, sonda nasogástrica o infusión directa en el tubo GI o el estómago.
Las formas de dosificación unitaria también pueden incluir agentes terapéuticos tales como antivirales, antibióticos, probióticos, analgésicos y antiinflamatorios. La composición sintética en forma de dosificación unitaria puede ser una composición farmacéutica o un suplemento nutricional.
Dosificación de administración
Para reducir o prevenir los síntomas de diarrea no infecciosa en un paciente, la cantidad del o de los HMO requerida para su administración al paciente variará dependiendo de factores tales como el riesgo y la gravedad de la enfermedad, la edad del paciente, la forma de la composición, y otros medicamentos que se administren al paciente. No obstante, un médico puede establecer fácilmente la cantidad requerida y generalmente se encontrará en el intervalo de aproximadamente 200 mg a aproximadamente 20 g por día, en determinadas formas de realización de aproximadamente 1 g a aproximadamente 15 g por día, de aproximadamente 3 g a aproximadamente 10 g por día, en determinadas formas de realización de aproximadamente 3 g a aproximadamente 7,5 g por día. Se puede determinar una dosis adecuada en función de diversos factores, incluidos, por ejemplo, el peso y/o el estado corporal, la gravedad de la afección, si se administra como tratamiento o como profilaxis, otras dolencias y/o enfermedades, la incidencia y/o la gravedad de los efectos secundarios y la forma de administración. Los intervalos de dosis apropiados pueden determinarse mediante procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Durante una fase de tratamiento inicial, la dosificación puede ser mayor o menor dependiendo de la necesidad de aumentar la abundancia de bifidobacterias o la tolerancia inicial a los HMO. Durante una fase de mantenimiento, la dosificación se puede ajustar para un uso crónico a largo plazo.
La duración de la administración de HMO variará según factores tales como el riesgo y la gravedad de la afección médica, la edad, la forma de la composición, la dosis y otros medicamentos que se administren. No obstante, la duración la puede establecer fácilmente un médico. En general, se requerirá una duración de al menos una semana para que afecte de forma suficiente a los síntomas. Por ejemplo, la duración puede ser de 1 a 3 meses o superior. La administración puede continuar crónicamente durante un periodo de tiempo indefinido.
Ejemplos
Los ejemplos siguientes se presentan para ilustrar formas de realización no limitantes de la invención.
Ejemplo 1: Ensayo humano en pacientes intolerantes a la lactosa
Se reclutan un total de 60 hombres y mujeres con intolerancia a la lactosa para participar en un estudio aleatorizado, doble ciego, paralelo y controlado con placebo. Después de una visita de selección y un periodo de preinclusión de 1 a 2 semanas, los sujetos elegibles se distribuyen aleatoriamente en dos grupos, cada uno de 30 participantes. A un grupo se le administra un producto de placebo que contiene 5 gramos de glucosa, al otro grupo se le administra un producto de tratamiento que contiene 5 gramos de una mezcla con una relación en masa de 4:1 de 2'-FL y LNnT durante 30 días.
Los criterios de inclusión incluyen adultos de 18 a 60 años de edad con antecedentes autoinformados actuales o recientes de intolerancia a los lácteos de al menos 1 mes de duración y con síntomas gastrointestinales después del consumo de lácteos. Los criterios de exclusión incluyen la participación en un estudio clínico un mes antes de la visita de selección; resultados anormales en las pruebas de detección clínicamente relevantes para la participación en el estudio; padecer una enfermedad grave tal como cáncer, diabetes, enfermedad coronaria grave, enfermedad renal, enfermedad neurológica o enfermedad psiquiátrica grave o cualquier afección que pueda confundir los resultados del estudio; ingestión de antibióticos, prebióticos o probióticos 3 meses antes del estudio; consumo regular de cualquier medicamento que pudiera interferir con la evaluación de los síntomas 2 semanas antes del estudio; y mujeres embarazadas o en periodo de lactancia.
En la visita de selección (primera visita), se registran los antecedentes médicos y la medicación concomitante y se recogen muestras de sangre para un análisis de seguridad. La intolerancia a la lactosa se confirma mediante una provocación con 25 gramos de lactosa, en la que los síntomas gastrointestinales (asociados con la intolerancia a la lactosa) y la producción de hidrógeno se evalúan mediante una prueba de aliento con hidrógeno (HBT) durante 6 horas después de la provocación con lactosa. Un HBT positivo se define como una elevación de gas hidrógeno de 20 partes por millón (ppm) en 4 puntos temporales dentro de las 6 horas posteriores a una dosis de carga de lactosa. Se distribuye un kit de muestra fecal y se indica a los participantes que mantengan las muestras fecales recogidas en el congelador hasta la próxima visita.
En la segunda visita, se verifican los criterios de elegibilidad y los sujetos elegibles se distribuyen aleatoriamente en las dos ramas del ensayo (grupo de tratamiento y de placebo). Se recogen muestras fecales y se almacenan a -80 °C hasta su análisis. Se distribuyen equipos para nuevas muestras fecales. Los participantes se familiarizan con un sistema interactivo habilitado para Internet que registra datos diariamente y se les proporciona o productos de tratamiento o productos de placebo. Se pide a los sujetos que no cambien su dieta habitual y que eviten los productos lácteos durante el periodo de tratamiento de 30 días.
Durante el periodo de tratamiento de 30 días, los participantes consumen diariamente un placebo o un producto de tratamiento. Se indica a los participantes que consuman los productos por la mañana con el desayuno. El cumplimiento se supervisa por medio del sistema interactivo habilitado para Internet. Los participantes también utilizan el sistema para registrar:
• Información sobre la escala de forma de heces de Bristol (BSFS),
• Información de la escala de calificación de síntomas gastrointestinales (GSRS).
El cuestionario GSRS incluye 15 artículos que abarcan cinco dimensiones (dolor abdominal, indigestión, reflujo, diarrea, estreñimiento) y utiliza una escala de Likert de siete grados.
En la tercera visita, después del periodo de tratamiento de 30 días, se recogen muestras fecales. Además, se provoca a los participantes con 25 gramos de lactosa midiéndose la digestión de la lactosa por medio de la producción de hidrógeno mediante la HBT, mientras que la evaluación de los síntomas gastrointestinales (asociados con la intolerancia a la lactosa) se mide mediante la autoevaluación de los síntomas del participante a lo largo de un periodo de 6 horas tras la provocación con lactosa.
Después de completar el periodo de tratamiento, se realiza un seguimiento de los participantes durante 30 días adicionales y se les indica que vuelvan a introducir los productos lácteos en sus dietas. Durante el periodo de seguimiento, los participantes registran información de BSFS y GSRS.
Al final del estudio, cada participante tiene una visita de salida con el equipo médico y se recogen muestras fecales.
La digestión de la lactosa se mide mediante la producción de hidrógeno (BH) en el aliento. La BH se mide en partes por millón (ppm) utilizando un sensor químico de hidrógeno manual validado (gastrolizador EC60, Bedfont Scientific Ltd, Reino Unido). Después de una medición basal (hora 0), los participantes ingieren 25 g de lactosa mezclada con agua. A continuación, se vuelve a medir la BH a los 30 y 60 minutos, y a las 3 horas y las 6 horas después de la provocación con lactosa. El valor basal se resta de las lecturas registradas en cada intervalo de tiempo posterior. En general, un valor basal aceptable es de 20 ppm o inferior. Un valor positivo definitivo se define como más de 20 ppm por encima del valor basal en cualquier punto temporal. Los resultados de cada medición de BH se suman para obtener un valor de BH total.
Los síntomas de intolerancia a la lactosa se registran en una escala de Likert de cuatro puntos al inicio del estudio (0 h) y a las 3 y las 6 horas después de la ingestión de 25 g de lactosa. Se asigna una puntuación de 0 si no había síntomas, 1 para síntomas leves, 2 para síntomas moderados y 3 para síntomas graves a la hinchazón, la flatulencia, el dolor abdominal y los calambres.
Para evaluar el perfil de la microbiota, se extrae ADN de las muestras fecales mediante un kit de aislamiento de ADN PowerSoil de 96 pocillos (MO-BIO). Se mantiene vacío un mínimo de un pocillo de muestra por placa para que sirva como control negativo durante la PCR. La PCR se realiza con el cebador directo S-D-Bact-0341-b-S-17 y el cebador inverso S-D-Bact-0785-a-A-21 con adaptadores Illumina adjuntos [11]. Estos son cebadores 16S ADNr bacterianos universales, que se dirigen a la región V3-V4. Se utiliza el programa de PCR siguiente: 98 °C durante 30 s, 25x (98 °C durante 10 s, 55 °C durante 20 s, 72 °C durante 20 s), 72 °C durante 5 min. La amplificación se verifica procesando los productos en un gel de agarosa al 1%. Se añaden códigos de barras en una PCR anidada utilizando el kit Nextera Index Kit V2 (Illumina) con el programa de PCR siguiente: 98 °C durante 30 s, 8x (98 °C durante 10 s, 55 °C durante 20 s, 72 °C durante 20 s), 72 °C durante 5 min. La unión de los cebadores se verifica procesando los productos en un gel de agarosa al 1%. Los productos de la PCR anidada se normalizan con el kit de placa de normalización SequalPrep y se agrupan. Las bibliotecas agrupadas se concentran por evaporación y la concentración de ADN de las bibliotecas agrupadas se mide en un fluorómetro Qubit utilizando el kit de ensayo de alta sensibilidad Qubit (Thermo Fisher Scientific). La secuenciación se realiza en un secuenciador de escritorio MiSeq utilizando el kit de reactivos MiSeq V3 (Illumina) para una secuenciación de extremos emparejados de 2 x 300 pb. Se utiliza la versión de 64 bits de USEARCH para el análisis bioinformático de los datos de secuencia.
Se evalúa la beta-galactosidasa bacteriana como medida de la actividad enzimática de las heces. La betagalactosidasa fecal se mide mediante la adición de 20 gl de heces homogeneizadas en tampón a 480 gg de O-nitrofenil-beta-D-galactopiranósido en tampón de fosfato de sodio (pH 7,0). Se deja que la reacción discurra a 45 °C durante 10 min. Se añade carbonato de sodio (1 M) para detener la reacción. Posteriormente se lee la densidad óptica a 420 nm y se comunica la actividad de beta-galactosidasa como unidades/g de heces.
Los resultados muestran que la ingestión oral de HMO reduce la frecuencia de las deposiciones y mejora la consistencia de las heces. Los HMO también modulan la microbiota intestinal y, específicamente, estimulan el crecimiento de las bifidobacterias. El aumento de la abundancia de bifidobacterias se produce a expensas de Escherichia y Clostridium, que se reducen. El nivel de bifidobacterias se ha correlacionado positivamente con la betagalactosidasa y negativamente con la producción de gas hidrógeno. Además, los resultados muestran que los síntomas de dolor abdominal, calambres, hinchazón y flatulencia normalmente provocados por el consumo de lactosa mejoran después del aporte complementario de HMO en personas con intolerancia a la lactosa. En conjunto, los HMO pueden aumentar las bifidobacterias y cambiar el entorno intestinal y, por lo tanto, reducir los síntomas gastrointestinales y, en particular, la diarrea.
Ejemplo 2: Composición nutricional
Se prepara una composición nutricional lista para el consumo a partir de agua, maltodextrina, jarabe de maíz, azúcar, concentrado de proteína de leche, aceite vegetal (colza, maíz y girasol con alto contenido en oleico), aislado de proteína de soja, goma arábiga, sabores, HMS/HMO, citrato de potasio, fosfato de magnesio, gel y goma de celulosa, carbonato de calcio, ascorbato de sodio, lecitina de soja, bitartrato de colina, fosfato de calcio, acetato de alfatocoferilo, ácido ascórbico, goma de carragenano, pirofosfato férrico, sabores, edulcorantes (estevia), palmitato de vitamina A, niacinamida, vitamina D3, pantotenato de calcio, sulfato de manganeso, sulfato de cobre, clorhidrato de piridoxina, clorhidrato de tiamina, betacaroteno, riboflavina, cloruro de cromo, ácido fólico, biotina, yoduro de potasio, fitonadiona, selenito de sodio, molibdato de sodio, vitamina B12.
La composición proporciona un complemento nutricional que es una buena fuente de proteínas, baja en grasas, vitaminas, minerales y antioxidantes, y cumple con los criterios FODMAP. Además, la composición contiene HMS y/o HMO que pueden promover el crecimiento de bacterias intestinales beneficiosas y modular la inflamación crónica.
Ejemplo 3: Composición de la cápsula
Se prepara una cápsula llenando aproximadamente 1 g de HMS/HMO en una cápsula de gelatina 000 utilizando una máquina de llenado. Posteriormente se cierran las cápsulas. Los HMS/HMO se encuentran en forma de polvo de flujo libre.
Ejemplo 4: Función de barrera mucosa
Se evalúan 2'-FL y LNnT con respecto a su capacidad para inducir la expresión de MUC2, TFF3, EIMp, CHST5 y GAL3ST2 en el modelo de cultivo de células LS174T humanas de células caliciformes. La línea celular LS174T humana se obtiene de la American Type Culture Collection (ATCC). Las células LS174T se mantienen en medio mínimo esencial (MEM) suplementado según las instrucciones a 37 °C en 5% de CO2. Se disuelven 2'-FL y LNnT en agua de cultivo celular a la concentración requerida. Las células LS174T se tratan con la solución de HMO que contiene 0 o 5 mg de HMO/ml.
Las células LS174T se recogen y se suspenden en reactivo Trizol y el ARN total se aísla usando un kit de análisis de ARN (Qiagen) según las instrucciones del fabricante, y los aislados de ARN se cuantifican utilizando análisis Nanodrop (Thermo Fisher Scientific). Los aislados de ARN se transcriben inversamente utilizando un kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems) para crear ADNc, que después se usa para evaluar la expresión génica mediante RT-PCR cuantitativa.
Para la RT-PCR cuantitativa, se obtienen ensayos de expresión génica TaqMAN específicos de Applied Biosystems, que incluyen ensayos de expresión para MUC2, TFF3, CHST5 y GAL3ST2. La PCR cuantitativa en tiempo real se realiza utilizando la mezcla maestra TaqMAN PCR Master Mix (Applied Biosystems). Las reacciones se realizan por duplicado en una placa de 384 pocillos utilizando un sistema de PCR rápido en tiempo real 7900HT de Applied Biosystems. Los resultados se analizan utilizando el programa informático SDS 2.3 y se calculan mediante el procedimiento delta delta Ct. Todas las muestras se normalizan a la expresión de Gus-p y se calcula la inducción en número de veces sobre los controles no tratados. La expresión génica se expresa como aumento en número de veces en comparación con las células de control carentes de HMO. El experimento se repite tres veces.
Los resultados indican que el tratamiento con 2'-FL y LNnT aumenta la expresión de los genes MUC2 y TFF3 en comparación con los cultivos de control. El aumento de la expresión de los genes de las células caliciformes es específico y no universal, como se evidencia mediante la inducción mínima o la falta de inducción de CHST5 y GAL3ST2, respectivamente. MUC2 y TFF3 son componentes clave de la barrera mucosa y mejoran la función de la barrera mucosa.
Ejemplo de referencia 1: Ensayo en pacientes humanos con SII-D
Se reclutan un total de 60 pacientes con SII masculinos y femeninos para participar en el estudio. Después de una visita de selección y un periodo de preinclusión de 1 a 2 semanas, se seleccionan los pacientes. Los pacientes se distribuyen aleatoriamente en tres grupos, cada uno de 20 pacientes, de los que dos grupos consumen el producto de tratamiento y un grupo el producto de placebo durante 4 semanas. El producto de tratamiento contiene 5 o 10 gramos de una combinación de 2'-FL y LNnT en una relación de 4:1, mientras que el producto de placebo contiene 5 gramos de glucosa. Ambos productos se presentan en forma de polvo en un envase de dosificación unitaria.
Los pacientes son elegibles para participar si tienen una edad entre 18 y 60 años, cumplen la definición de SII-D, SII-C o SII-A/M según los criterios de Roma IV para el SII y tienen una puntuación general de SII-SSS > 174 durante el periodo de preinclusión de 2 semanas. Todos los pacientes reclutados son capaces de comprender y están dispuestos a cumplir con los procedimientos del estudio. Los pacientes se excluyen si: tienen alguna enfermedad gastrointestinal conocida que pueda causar síntomas o interferir con el resultado del ensayo, en particular intolerancia a la lactosa y enfermedad celíaca; han participado en un estudio clínico un mes antes de la visita de selección; tienen resultados anormales en las pruebas de detección que son clínicamente relevantes para la participación en el estudio; padecen una enfermedad grave tal como cáncer, diabetes, enfermedad coronaria grave, enfermedad renal, enfermedad neurológica o enfermedad psiquiátrica grave o cualquier afección que pueda confundir los resultados del estudio; han usado suplementos de probióticos en dosis altas (se permite el yogur) durante 1 mes antes del estudio; han consumido antibióticos 1 mes antes del estudio; han consumido regularmente cualquier medicamento que pudiera interferir con la evaluación de los síntomas 2 semanas antes del estudio; se les ha diagnosticado y se han tratado de SII durante más de 10 años; y mujeres embarazadas o en periodo de lactancia.
En la visita de selección se registran los antecedentes clínicos y médicos y la medicación concomitante. Se evaluarán los criterios diagnósticos del SII y se completará la parte 2 del cuestionario del SII-SSS.
Se distribuye un kit de muestra fecal junto con la escala de forma de heces de Bristol (BSFS) y el diario de deposiciones (BMD) para completar durante los 7 días justo antes de la visita 2. Se les pedirá a los pacientes que registren su dieta 3 días justo antes de la visita 2, y se les recordará que no cambie su dieta habitual durante el estudio.
En la segunda visita, se verifican los criterios de elegibilidad y los sujetos elegibles se distribuyen aleatoriamente en las tres ramas del ensayo. Se realiza una exploración física y se contestan una serie de cuestionarios (escalas GSRS-IBS, IBS-SSS, HADS, NRS-11, VSI, IBS-QOL y PHQ-15). Los cuestionarios se rellenan electrónicamente. Aquellos que no son capaces de usar el sistema electrónico, o no quieren hacerlo, completan los cuestionarios en papel. Basándose en los síntomas clínicos y los datos de los cuestionarios, los pacientes se clasifican en uno de los tres grupos siguientes; predominantemente diarrea (SII-D), predominantemente estreñimiento (SII-C) o alternante/mixto (SII-A/M). Esto permite la asignación de pacientes de cada subgrupo a los grupos de intervención. Cuando se asignan a los grupos, los pacientes reciben o bien productos de tratamiento o bien productos de placebo. Se realiza una sigmoidoscopia y se toman biopsias de la mucosa y aspirados fecales. Se pregunta a los pacientes sobre cualquier evento adverso y cualquier cambio en su medicación habitual. Se recopila la BSFS y el BMD y se distribuyen nuevos formularios, que se han de rellenar diariamente durante el periodo de intervención. Se recogen muestras fecales y se distribuye equipo para nuevas muestras. Se recogen muestras de sangre para análisis rutinarios de química clínica y hematología y de biomarcadores y se recoge una muestra de saliva para analizar el estado secretor de FUT2. Se recopilan registros de la dieta y se pide a los pacientes que registren su dieta durante 3 días justo antes de la visita 3. Se recuerda a los pacientes que no cambien su dieta habitual durante el estudio.
En la tercera visita se realiza una exploración física y se contestan varios cuestionarios (escalas GSRS-IBS, IBS-SSS, HADS, NRS-11, VSI, IBS-QOL y PHQ-15). Los cuestionarios se rellenan electrónicamente. Aquellos que no son capaces de usar el sistema electrónico, o no quieren hacerlo, completan los cuestionarios en papel. Los productos de estudio restantes y los diarios de cumplimiento se recopilan para verificar el cumplimiento. Se recogen muestras de sangre para análisis rutinarios de química clínica y hematología y de biomarcadores, y se realiza una sigmoidoscopia y se toman biopsias de la mucosa y aspirados fecales. Se pregunta a los pacientes sobre cualquier evento adverso y cualquier cambio en su medicación habitual. Se recogen muestras fecales y se distribuye equipo para recoger nuevas muestras. Se recopila la BSFS y el BMD y se distribuyen nuevos formularios, que se completarán durante los 7 días previos a la visita 4. Se recopilan registros de la dieta y se recuerda a los pacientes que no cambien su dieta habitual durante el estudio.
El periodo de tratamiento tiene una duración de 4 semanas, los pacientes reciben diariamente 5 o 10 g de mezcla de 2'-FL LNnT o 5 g de glucosa. Se indica a los pacientes que consuman los productos por la mañana con el desayuno. El cumplimiento se supervisa a través del sistema interactivo habilitado para Internet.
Al final del estudio, cada paciente tiene una visita de salida con el equipo médico. Las muestras fecales y de sangre se recogen y se analizan como anteriormente. Se responde a una serie de cuestionarios (escalas GSRS-IBS, IBS-SSS, HADS, NRS-11, VSI, IBS-QOL y PHQ-15). Los cuestionarios se rellenan electrónicamente. Aquellos que no son capaces de usar el sistema electrónico, o no quieren hacerlo, completan los cuestionarios en papel. Se pregunta a los pacientes sobre cualquier evento adverso y cualquier cambio en su medicación o dieta habitual, y se recopila la BSFS y el DMO.
Para evaluar el perfil de la microbiota, se extrae ADN de las muestras fecales mediante un kit de aislamiento de ADN PowerSoil de 96 pocillos (MO-BIO). Se mantiene vacío un mínimo de un pocillo de muestra por placa para que sirva como control negativo durante la PCR. La PCR se realiza con el cebador directo S-D-Bact-0341-b-S-17 y el cebador inverso S-D-Bact-0785-a-A-21 con adaptadores Illumina adjuntos (Klindworth et al. Nucleic Acids Res. 41, e1 (2013)). Estos son cebadores 16S ADNr bacterianos universales, que se dirigen a la región V3-V4. Se utiliza el programa de PCR siguiente: 98 °C durante 30 s, 25x (98 °C durante 10 s, 55 °C durante 20 s, 72 °C durante 20 s), 72 °C durante 5 min. La amplificación se verifica procesando los productos en un gel de agarosa al 1 %. Se añaden códigos de barras en una PCR anidada utilizando el kit Nextera Index Kit V2 (Illumina) con el programa de PCR siguiente: 98 °C durante 30 s, 8x (98 °C durante 10 s, 55 °C durante 20 s, 72 °C durante 20 s), 72 °C durante 5 min. La unión de los cebadores se verifica procesando los productos en un gel de agarosa al 1%. Los productos de la PCR anidada se normalizan con el kit de placa de normalización SequalPrep y se agrupan. Las bibliotecas agrupadas se concentran por evaporación y la concentración de ADN de las bibliotecas agrupadas se mide en un fluorómetro Qubit utilizando el kit de ensayo de alta sensibilidad Qubit (Thermo Fisher Scientific). La secuenciación se realiza en un secuenciador de escritorio MiSeq con el kit de reactivos MiSeq V3 (Illumina) para una secuenciación de extremos emparejados de 2 x 300 pb. Se utiliza la versión de 64 bits de USEARCH para el análisis bioinformático de los datos de secuencia.
Los pacientes del tratamiento informan de una reducción en el dolor/sensibilidad visceral, una reducción en la frecuencia de las deposiciones y una mejora en la consistencia de las heces en comparación con el grupo de placebo. El análisis de biomarcadores sanguíneos indica que los pacientes tratados tienen niveles reducidos de marcadores inflamatorios, y el análisis de biopsia revela una permeabilidad intestinal reducida que indica una barrera mucosa mejorada y una evidencia reducida de activación y desgranulación de mastocitos. El análisis fecal indica que los pacientes del tratamiento tienen niveles reducidos de disbiosis intestinal y un nivel más alto de bifidobacterias; especialmente las del grupo filogenético de Bifidobacterium adolescentis inicialmente y posteriormente Bifidobacterium longum y Bifidobacterium bifidum.
Ejemplo de referencia 2: Ensayo en niños tratados con antibióticos
Son reclutan un total de 40 niños de 5 a 10 años de edad para participar en el estudio. Los niños están comenzando una terapia antibiótica de amplio espectro recetada por un médico para un trastorno infeccioso. Todos los niños reclutados y sus cuidadores son capaces de comprender y están dispuestos a cumplir con los procedimientos del estudio. Los niños se excluyen si: han participado en un estudio clínico un mes antes de la visita de selección; padecen una enfermedad grave, tal como enfermedades gastrointestinales, cáncer, diabetes, enfermedad coronaria grave, enfermedad renal, enfermedad neurológica o enfermedad psiquiátrica grave o cualquier afección que pueda confundir los resultados del estudio; han usado suplementos de probióticos en dosis altas (se permite el yogur) durante los 3 meses anteriores al estudio; han consumido antibióticos 3 meses antes del estudio y han consumido regularmente cualquier medicamento que pudiera interferir con la evaluación de los síntomas 2 semanas antes del estudio.
En una visita de selección, se registran los antecedentes médicos y la medicación concomitante. Además, se verifican los criterios de elegibilidad y los sujetos elegibles se distribuyen aleatoriamente en dos grupos, cada uno de 20 niños. El periodo de tratamiento (6 semanas) se divide en dos, de la forma siguiente.
• Periodo 1 (2 semanas): Grupo 1 (placebo), Grupo 2 (producto de tratamiento),
• Periodo 2 (4 semanas): Grupo 1 (placebo), Grupo 2 (producto de tratamiento).
El producto de tratamiento contiene 5 gramos de una combinación de 2'-FL y LNnT (relación de masa 4:1), mientras que el producto de placebo contiene 5 gramos de glucosa. Ambos productos se encuentran en forma de polvo en una bolsita. Cada uno de los productos se administra diariamente en forma de bolo en el desayuno y no se controla la dieta; sin embargo, se les pide a los participantes que no cambien su dieta normal a lo largo del transcurso del estudio.
En la visita inicial, se distribuyen kits para muestras fecales y productos de tratamiento o de placebo. Se le indica al cuidador de cada niño que mantenga las muestras fecales en el congelador hasta la próxima visita. Se recuerda a los niños y al cuidador que no cambien la dieta habitual de los niños durante el estudio. En esta visita se recoge una muestra fecal y se almacena a -80 °C hasta su análisis.
El estudio tiene una duración de dos más cuatro semanas y los niños consumen diariamente un producto de placebo y/o de tratamiento. El cumplimiento se supervisa a través del sistema interactivo habilitado para Internet.
Los participantes también utilizan el sistema para registrar:
• Información sobre la escala de forma de heces de Bristol (BSFS),
• Cuestionario para trastornos GI funcionales pediátricos (QPFG).
El cuestionario QPFG abarca dimensiones tales como dolor y malestar abdominal, deposiciones y otros síntomas gastrointestinales.
Al final del periodo 1, se recogen muestras fecales y se distribuyen nuevos productos de tratamiento o de placebo. Al final del periodo 2 (visita de salida), cada niño tiene una visita con el equipo médico y se recogen muestras fecales. Después de 6 meses, se recogen muestras fecales en una visita de seguimiento.
Para evaluar el perfil de la microbiota, se extrae ADN de las muestras fecales mediante un kit de aislamiento de ADN PowerSoil de 96 pocillos (MO-BIO). Se mantiene vacío un mínimo de un pocillo de muestra por placa para que sirva como control negativo durante la PCR. La PCR se realiza con el cebador directo S-D-Bact-0341-b-S-17 y el cebador inverso S-D-Bact-0785-a-A-21 (Klindworth et al. Nucleic Acids Res.41, e1 (2013)) con adaptadores Illumina adjuntos. Estos son cebadores 16S ADNr bacterianos universales, que se dirigen a la región V3-V4. Se utiliza el programa de PCR siguiente: 98 °C durante 30 s, 25x (98 °C durante 10 s, 55 °C durante 20 s, 72 °C durante 20 s), 72 °C durante 5 min. La amplificación se verifica procesando los productos en un gel de agarosa al 1%. Se añaden códigos de barras en una PCR anidada utilizando el kit Nextera Index Kit V2 (Illumina) con el programa de PCR siguiente: 98 °C durante 30 s, 8x (98 °C durante 10 s, 55 °C durante 20 s, 72 °C durante 20 s), 72 °C durante 5 min. La unión de los cebadores se verifica procesando los productos en un gel de agarosa al 1%.
Los productos de la PCR anidada se normalizan utilizando el kit de placa de normalización SequalPrep y se agrupan. Las bibliotecas agrupadas se concentran por evaporación y la concentración de ADN de las bibliotecas agrupadas se mide en un fluorómetro Qubit utilizando el kit de ensayo de alta sensibilidad Qubit (Thermo Fisher Scientific). La secuenciación se realiza en un secuenciador de escritorio MiSeq con el kit de reactivos MiSeq V3 (Illumina) para una secuenciación de extremos emparejados de 2 x 300 pb. Se utiliza la versión de 64 bits de USEARCH (Edgar, 2013) para el análisis bioinformático de los datos de secuencia.
Los análisis fecales revelan que los HMO son capaces de prevenir la disbiosis mitigada por antibióticos y mejorar una composición de microbiota favorable mediante el aumento de la abundancia de bifidobacterias y especialmente el grupo fitogénico de Bifidobacterium adolescentis durante y después de la terapia antibiótica. Además, la incidencia de diarrea se ha reducido en los niños.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Uno o más oligosacáridos de la leche humana (HMO) para su uso en la profilaxis o el tratamiento de la diarrea no infecciosa en un ser humano, en los que el ser humano es un paciente intolerante a la lactosa.
2. Una composición sintética para su uso en la profilaxis o el tratamiento de la diarrea no infecciosa en un ser humano, en la que el ser humano es un paciente intolerante a la lactosa, comprendiendo la composición una cantidad eficaz de un oligosacárido de la leche humana (HMO).
3. Uno o más HMO para su uso según la reivindicación 1 o la composición sintética para su uso según la reivindicación 2, en los que el ser humano tiene disbiosis intestinal y/o una barrera mucosa alterada.
4. Uno o más HMO o la composición sintética para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se reduce la frecuencia de las deposiciones y se mejora la consistencia de las heces.
5. Uno o más HMO para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 4 eficaces para aumentar (i) la abundancia, en particular la abundancia relativa, de bifidobacterias, y/o (ii) la actividad de beta-galactosidasa, en el tubo gastrointestinal del ser humano.
6. La composición sintética para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, que comprende una cantidad de HMO eficaz para aumentar (i) la abundancia, en particular la abundancia relativa, de bifidobacterias y/o (ii) la actividad de beta-galactosidasa, en el tubo gastrointestinal del ser humano.
7. Uno o más HMO para su uso según la reivindicación 5 o la composición sintética para su uso según la reivindicación 6, en los que las bifidobacterias, en el periodo de tratamiento inicial, son las del grupo filogenético de Bifidobacterium adolescentis y, después de aproximadamente 14 días de tratamiento, son Bifidobacterium longum y/o Bifidobacterium bifidum.
8. Uno o más HMO o la composición sintética para su uso según la reivindicación 7, en los que la bifidobacteria del grupo filogenético de Bifidobacterium adolescentis es Bifidobacterium pseudocatenulatum y/o Bifidobacterium adolescentis.
9. Uno o más HMO para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1,3 a 5, 7 y 8, en los que el HMO es un HMO neutro fucosilado o no fucosilado.
10. Uno o más HMO para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 a 5, 7 y 8, en los que el HMO es 2'-FL, 3-FL, DFL, LNnT, LNT, 3'-SL, 6'-SL o LNFP-I, o una mezcla de los mismos.
11. Uno o más HMO para su uso según la reivindicación 10, en el que los uno o más HMO son una mezcla que comprende o consiste esencialmente en 2'-FL y/o DFL y LNnT y/o LNT.
12. La composición sintética para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 y 6 a 8, en la que el HMO es un HMO neutro fucosilado o no fucosilado.
13. La composición sintética para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 y 6 a 8, en la que el HMO es 2'-FL, 3-FL, DFL, LNnT, LNT, 3'-SL, 6'-SL o LNFP-I, o una mezcla de los mismos.
14. La composición sintética para su uso según la reivindicación 13, en la que el HMO es una mezcla que comprende o consiste esencialmente en 2'-FL y/o DFL y LNnT y/o LNT.
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