ES2939810T3 - Detección múltiple de la vaginosis bacteriana - Google Patents
Detección múltiple de la vaginosis bacteriana Download PDFInfo
- Publication number
- ES2939810T3 ES2939810T3 ES16783760T ES16783760T ES2939810T3 ES 2939810 T3 ES2939810 T3 ES 2939810T3 ES 16783760 T ES16783760 T ES 16783760T ES 16783760 T ES16783760 T ES 16783760T ES 2939810 T3 ES2939810 T3 ES 2939810T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- seq
- sequence
- primer
- hybridizing
- primer pair
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 208000004926 Bacterial Vaginosis Diseases 0.000 title abstract description 31
- 208000037009 Vaginitis bacterial Diseases 0.000 title abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 59
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 36
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 171
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 89
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 claims description 66
- 241000207201 Gardnerella vaginalis Species 0.000 claims description 54
- 241001633064 Atopobium vaginae Species 0.000 claims description 53
- 241000218492 Lactobacillus crispatus Species 0.000 claims description 49
- 241001561398 Lactobacillus jensenii Species 0.000 claims description 49
- 241000604449 Megasphaera Species 0.000 claims description 48
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 39
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 claims description 30
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims description 30
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 27
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 17
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims description 10
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 6
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 6
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 6
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003899 penis Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 claims description 3
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000003708 urethra Anatomy 0.000 claims description 3
- 108010002147 Gardnerella vaginalis vaginolysin Proteins 0.000 claims description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 76
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 63
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 63
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 abstract description 15
- 208000005448 Trichomonas Infections Diseases 0.000 abstract description 12
- 206010044620 Trichomoniasis Diseases 0.000 abstract description 12
- 201000007096 Vulvovaginal Candidiasis Diseases 0.000 abstract description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 4
- 238000010998 test method Methods 0.000 abstract description 2
- 241000224526 Trichomonas Species 0.000 abstract 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 199
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 75
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 71
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 51
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 51
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 38
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 29
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 21
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 16
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 16
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 16
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 15
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 241000224527 Trichomonas vaginalis Species 0.000 description 12
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 12
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- -1 fluorophores Substances 0.000 description 6
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 5
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 4
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 4
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 4
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 4
- 241000287436 Turdus merula Species 0.000 description 4
- 206010046914 Vaginal infection Diseases 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 238000011330 nucleic acid test Methods 0.000 description 4
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 244000197813 Camelina sativa Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 201000008100 Vaginitis Diseases 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 3
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000013464 vaginal disease Diseases 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 9H-carbazole Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035657 Abasia Diseases 0.000 description 2
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- IXQIUDNVFVTQLJ-UHFFFAOYSA-N Naphthofluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C(C=CC=1C3=CC=C(O)C=1)=C3OC1=C2C=CC2=CC(O)=CC=C21 IXQIUDNVFVTQLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000235645 Pichia kudriavzevii Species 0.000 description 2
- SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N Quinoline Chemical compound N1=CC=CC2=CC=CC=C21 SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000005670 electromagnetic radiation Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- VYXSBFYARXAAKO-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate;hydron;chloride Chemical compound [Cl-].C1=2C=C(C)C(NCC)=CC=2OC2=CC(=[NH+]CC)C(C)=CC2=C1C1=CC=CC=C1C(=O)OCC VYXSBFYARXAAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- RDOWQLZANAYVLL-UHFFFAOYSA-N phenanthridine Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3C=NC2=C1 RDOWQLZANAYVLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N pyrene Chemical compound C1=CC=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000012340 reverse transcriptase PCR Methods 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- TZMSYXZUNZXBOL-UHFFFAOYSA-N 10H-phenoxazine Chemical compound C1=CC=C2NC3=CC=CC=C3OC2=C1 TZMSYXZUNZXBOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JNGRENQDBKMCCR-UHFFFAOYSA-N 2-(3-amino-6-iminoxanthen-9-yl)benzoic acid;hydrochloride Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[NH2+])C=C2OC2=CC(N)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O JNGRENQDBKMCCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- GOLORTLGFDVFDW-UHFFFAOYSA-N 3-(1h-benzimidazol-2-yl)-7-(diethylamino)chromen-2-one Chemical compound C1=CC=C2NC(C3=CC4=CC=C(C=C4OC3=O)N(CC)CC)=NC2=C1 GOLORTLGFDVFDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SMBSZJBWYCGCJP-UHFFFAOYSA-N 3-(diethylamino)chromen-2-one Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C(N(CC)CC)=CC2=C1 SMBSZJBWYCGCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IDLISIVVYLGCKO-UHFFFAOYSA-N 6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=C(C(O)=O)C=C2C21C1=CC(OC)=C(O)C(Cl)=C1OC1=C2C=C(OC)C(O)=C1Cl IDLISIVVYLGCKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZIDRAQTRIQDX-UHFFFAOYSA-N 6-carboxy-x-rhodamine Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(C([O-])=O)C=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 WQZIDRAQTRIQDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VWOLRKMFAJUZGM-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyrhodamine 6G Chemical compound [Cl-].C=12C=C(C)C(NCC)=CC2=[O+]C=2C=C(NCC)C(C)=CC=2C=1C1=CC(C(O)=O)=CC=C1C(=O)OCC VWOLRKMFAJUZGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 7-hydroxycoumarin Natural products O1C(=O)C=CC2=CC(O)=CC=C21 CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- KXDAEFPNCMNJSK-UHFFFAOYSA-N Benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC=C1 KXDAEFPNCMNJSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000144583 Candida dubliniensis Species 0.000 description 1
- 241000222173 Candida parapsilosis Species 0.000 description 1
- 241000222178 Candida tropicalis Species 0.000 description 1
- 235000008733 Citrus aurantifolia Nutrition 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N Fluorine atom Chemical compound [F] YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 241000203736 Mobiluncus Species 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000235343 Saccharomycetales Species 0.000 description 1
- 235000011941 Tilia x europaea Nutrition 0.000 description 1
- 241001502500 Trichomonadida Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000000999 acridine dye Substances 0.000 description 1
- 208000005652 acute fatty liver of pregnancy Diseases 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 1
- 238000007846 asymmetric PCR Methods 0.000 description 1
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N benzo-alpha-pyrone Natural products C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000005081 chemiluminescent agent Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 description 1
- 150000004775 coumarins Chemical class 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000007848 endpoint PCR Methods 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N fluoranthrene Natural products C1=CC(C2=CC=CC=C22)=C3C2=CC=CC3=C1 GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000007849 hot-start PCR Methods 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000007850 in situ PCR Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000000937 inactivator Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000004571 lime Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000007837 multiplex assay Methods 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical class 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N pibenzimol Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=CC=C(N=C(N2)C=3C=C4NC(=NC4=CC=3)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1 INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 150000004032 porphyrins Chemical class 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000000040 protozoan parasite Species 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 238000007430 reference method Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 239000001022 rhodamine dye Substances 0.000 description 1
- 238000009666 routine test Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000007862 touchdown PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(O)=CC=C21 ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Natural products Cc1cc2C=CC(=O)Oc2cc1OCC=CC(C)(C)O HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010046901 vaginal discharge Diseases 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000001018 xanthene dye Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6893—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for protozoa
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
- C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
- C12Q2537/143—Multiplexing, i.e. use of multiple primers or probes in a single reaction, usually for simultaneously analyse of multiple analysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
- C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
- C12Q2565/101—Interaction between at least two labels
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
En el presente documento se describen métodos y composiciones para la detección de candidiasis vulvovaginal (VVC), tricomoniasis y vaginosis bacteriana (BV). En algunas realizaciones, la presencia o ausencia de Candida asociada a VVC, Trichomonas valginalis y una pluralidad de bacterias relacionadas con BV en una muestra se determina usando métodos de prueba multiplex basados en ácidos nucleicos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Detección múltiple de la vaginosis bacteriana
Referencia al listado de secuencias
La presente solicitud se presenta junto con un listado de secuencias en formato electrónico. El listado de secuencias se proporciona como un archivo titulado SEQLISTING_GENOM.143WO.TXT, creado el 20 de abril de 2016, que tiene un tamaño de 36 Kb. La información en el formato electrónico del listado de secuencias se incorpora al presente documento por referencia en su totalidad.
Antecedentes
Campo
La presente divulgación se refiere a métodos y composiciones para la detección de trastornos vaginales, por ejemplo, candidosis vulvovaginal (CVV), tricomoniasis y vaginosis bacteriana (VB). De manera más específica, la presente divulgación se refiere a la detección de especies de Candida asociadas a la CVV, de Trichomonas vaginalis (T. vaginalis) y de una pluralidad de bacterias relacionadas con la VB en ejemplos biológicos, tales como muestras de hisopos vaginales de mujeres con síntomas clínicos de vaginitis y/o vaginosis, mediante métodos de prueba basados en ácidos nucleicos.
Descripción de la técnica relacionada
Candida es un género de levadura y es la causa más común de infecciones fúngicas en todo el mundo. Muchas especies de Candida se encuentran como un comensal inofensivo, forman parte de la flora normal de un hospedador y pueden ser endosimbiontes de hospedadores, incluidos los seres humanos. Sin embargo, en el caso de un desequilibrio o de un hospedador inmunodeprimido, se sabe que Candida invade y provoca enfermedades. Se sabe que algunas especies de Candida, tales como C. albicans, C. dubliniensis, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei, y C. glabrata, están asociadas con la candidosis vulvovaginal (CVV). Trichomonas vaginalis es parásito protozoario anaerobio flagelado, que es el microorganismo causal de la tricomoniasis. La vaginosis bacteriana (VB) es una infección de la vagina provocada por una alteración del equilibrio normal de las bacterias en la vagina.
Hasta la fecha, las pruebas convencionales para diagnosticar la CVV, la tricomoniasis y la VB se basan en múltiples métodos subjetivos que son métodos interpretativos. En general, estas pruebas implican el examen microscópico de la preparación en húmedo de muestras de pacientes (por ejemplo, flujo vaginal), incluida la observación de hifas fúngicas o levaduras en ciernes para la c Vv y la observación de tricomonas móviles para la tricomoniasis. La puntuación de Nugent y los criterios de Amsel son las pruebas más utilizadas para diagnosticar la VB. La puntuación de Nugent es un sistema de puntuación de tinción de Gram que se calcula mediante la evaluación de la presencia de bacilos grampositivos grandes (morfotipos de Lactobacillus), bacilos gramvariables pequeños (morfotipos de Gardnerella vaginalis) y bacilos gramvariables curvos (morfotipos de Mobiluncus spp.). Los criterios de Amsel requieren que al menos tres de los cuatro criterios siguientes estén presentes para un diagnóstico confirmado: (1) flujo escaso, blanco, amarillo y homogéneo, (2) células clave de la vaginosis en la microscopía, (3) pH del líquido vaginal >4,5 y (4) liberación de un olor a pescado al añadir una solución alcalina de hidróxido de potasio (KOH) al 10 %. Estas pruebas convencionales pueden ser costosas, laboriosas y lentas, por ejemplo, Candida debe cultivarse durante 48 horas en medios cromogénicos o hasta 7 días en medios menos selectivos antes de que se pueda hacer un diagnóstico. Cartwright et al. (J. Clin. Microbiol. 50 (2012), 2321-2329) describe ensayos de PCR múltiples para detectar la VB basados en una combinación de diferentes organismos indicadores que incluyen A. vaginae, BVAB-2, G. vaginalis, Megasphaera y L. crispatus.
Sin embargo, aún existe la necesidad de desarrollar métodos más eficaces y rápidos para detectar la candidosis vulvovaginal, la tricomoniasis y la vaginosis bacteriana, por ejemplo, un método que permita la detección de los tres trastornos vaginales en un solo ensayo, con el fin de ofrecer tratamientos adecuados a los pacientes.
Sumario
Esta necesidad se aborda mediante la provisión de la materia objeto como se define en las reivindicaciones.
Por lo tanto, en un aspecto se divulga un método para detectar Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaera de tipo 1 y BVAB2 en una muestra biológica que comprende:
poner en contacto dicha muestra biológica con una pluralidad de pares de cebadores, en donde la pluralidad de pares de cebadores comprende:
al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con los genes del ARNr 16S de Lactobacillus crispatus y Lactobacillus jensenii, en donde cada cebador en dicho al menos un par de cebadores consiste en una
secuencia de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a la SEQ ID NO: 14 o a la SEQ ID NO: 15,
al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de BVAB2, en donde cada cebador en dicho al menos un par de cebadores consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a la SEQ ID NO: 4 o a la SEQ ID NO: 5, al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de Megasphaera de tipo 1, en donde cada cebador en dicho al menos un par de cebadores consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a la SEQ ID NO: 7 o a la SEQ ID NO: 8,
al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen vly de Gardnerella vaginalis, en donde cada cebador en dicho al menos un par de cebadores consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10 a 12 o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10 a 12, y
al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de Atopobium vaginae, en donde cada cebador en dicho al menos un par de cebadores consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a la SEQ ID NO: 1 o a la SEQ ID NO: 2;
generar amplicones de las secuencias del ARNr 16S de Atopobium vaginae, BVAB2, Megasphaera de tipo 1, y/o Lactobacillus crispatus y Lactobacillus jensenii, y/o amplicones de la secuencia del gen vly de Gardnerella vaginalis de dicha muestra biológica, si dicha muestra comprende uno o más de Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaera de tipo 1 y BVAB2a; y
determinar la presencia o la cantidad de uno o más productos amplificados como indicación de la presencia de uno o más de Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaera de tipo 1 y BVAB2 en dicha muestra biológica.
En algunas realizaciones, la etapa de "poner en contacto" comprende además poner en contacto dicha muestra biológica y dichos cebadores con ADN polimerasa, una pluralidad de nucleótidos libres que comprenden adenina, timina, citosina y guanina, y/o un tampón para producir una mezcla de reacción. Los ácidos nucleicos extraídos de la muestra biológica pueden comprender o consistir en ADN bicatenario. De manera opcional, una mezcla de reacción puede contener además cationes biovalentes, iones potasio de catión monovalente, una o más sondas marcadas detectables y/o cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, la etapa de "generar amplicones" implica (a) calentar la mezcla de reacción a una primera temperatura predeterminada durante un primer período de tiempo predeterminado para separar las cadenas de ADN bicatenario presentes en la muestra biológica o en los ácidos nucleicos, (b) enfriar la mezcla de reacción a una segunda temperatura predeterminada durante un segundo periodo de tiempo predeterminado en condiciones que permitan que los cebadores se hibriden con sus secuencias complementarias y permitan que la ADN polimerasa extienda los cebadores, y (c) repetir las etapas (a) y (b) al menos 1o a 12 veces. En algunas realizaciones, las etapas (a) y (b) se repiten al menos 15, 20, 22 o 25 veces.
En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra clínica. En algunas realizaciones, la muestra biológica se recoge de la uretra, pene, ano, garganta, cuello uterino o vagina. En algunas realizaciones, la muestra biológica es ADN, ARN o ácidos nucleicos totales extraídos de una muestra clínica.
La pluralidad de pares de cebadores puede comprender un primer cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 1, un segundo cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 2, un tercer cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 4, un cuarto cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 5, un quinto cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 7, un sexto cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 8, un séptimo cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 10, un octavo cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 11, un noveno cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 12, un décimo cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 14 y un undécimo cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 15.
En algunas realizaciones, el par de cebadores capaces de hibridarse con los genes del ARNr 16S de Lactobacillus crispatus y Lactobacillus jensenii son las SEQ ID NO: 1 y 2; el par de cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de BVAB2 son las SEQ ID NO: 4 y 5; el par de cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de Megasphaera el tipo 1 son las SEQ ID NO: 7 y 8; el par de cebadores capaces de hibridarse con el gen vly de Gardnerella vaginalis son: a) las SEQ ID NO: 10 y 12 o b) las SEQ ID NO: 11 y 12; y el par de cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de Atopobium vaginae son las SEQ ID NO: 1 y 2.
En algunas realizaciones, la amplificación se lleva a cabo utilizando un método seleccionado del grupo que consiste en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), amplificación mediada por replicasa, inmunoamplificación, amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA), replicación de secuencia autosostenida (3SR), amplificación de círculo rodante y amplificación mediada por transcripción (TMA). Por ejemplo, la PCR puede ser PCR en tiempo real. En algunas realizaciones, la PCR es PCR cuantitativa en tiempo real (QRTPCR). En algunas realizaciones, cada cebador comprende una secuencia de nucleótidos exógena que permite una manipulación posterior a la amplificación de los productos de amplificación sin un efecto significativo sobre la propia amplificación. En algunas realizaciones, cada cebador está flanqueado por secuencias complementarias que comprenden un fluoróforo en el extremo 5' y un inactivador de fluorescencia en el extremo 3'.
En algunas realizaciones, determinar la presencia o la cantidad de uno o más productos amplificados comprende poner en contacto los productos amplificados con una pluralidad de sondas oligonucleotídicas, en donde cada una de la pluralidad de sondas oligonucleotídicas comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 6, 9, 13 y 16, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 6, 9, 13 y 16. En algunas realizaciones, cada una de la pluralidad de sondas oligonucleotídicas comprende, o consiste en, una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 6, 9, 13 y 16. En algunas realizaciones, al menos una de la pluralidad de sondas oligonucleotídicas comprende una fracción emisora de fluorescencia y una fracción inactivadora de fluorescencia.
La presente divulgación también proporciona una composición para la detección de Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaera de tipo 1 y BVAB2 que comprende:
al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con los genes del ARNr 16S de Lactobacillus crispatus y Lactobacillus jensenii, en donde cada cebador en dicho al menos un par de cebadores consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a la SEQ ID NO: 14 o a la SEQ ID NO: 15,
al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de BVAB2, en donde cada cebador en dicho al menos un par de cebadores consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a la SEQ ID NO: 4 o a la SEQ ID NO: 5, al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de Megasphaera de tipo 1, en donde cada cebador en dicho al menos un par de cebadores consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a la SEQ ID NO: 7 o a la SEQ ID NO: 8,
al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen vly de Gardnerella vaginalis, en donde cada cebador en dicho al menos un par de cebadores consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10 a 12 o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10 a 12, y
al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de Atopobium vaginae, en donde cada cebador en dicho al menos un par de cebadores consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a la SEQ ID NO: 1 o a la SEQ ID NO: 2.
En algunas realizaciones, el al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con los genes del ARNr 16S de Lactobacillus crispatus y Lactobacillus jensenii comprende un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 1 y un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 2; el al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de BVAB2a comprende un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 4 y un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 5; el al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de Megasphaera de tipo 1 comprende un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 7 y un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 8; el al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen vly de Gardnerella vaginalis comprende un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 10 y un cebador que consiste en la secuencia de s Eq ID NO: 11; y el al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de Atopobium vaginae comprende un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 12, un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 14 y un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 15.
La composición puede, en algunas realizaciones, comprender además una pluralidad de sondas oligonucleotídicas, en donde cada una de la pluralidad de sondas oligonucleotídicas comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 6, 9, 13 y 16, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 6, 9, 13 y 16. En algunas realizaciones, cada una de la pluralidad de sondas oligonucleotídicas comprende, o consiste en, una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 6, 9, 13 y 16. En algunas realizaciones, al menos una de la pluralidad de sondas comprende una fracción emisora de fluorescencia y una fracción inactivadora de fluorescencia.
Descripción detallada
Los títulos de las secciones que se utilizan en el presente documento solo tienen una finalidad organizativa y no deben interpretarse como limitantes de la materia descrita. En el caso de que uno o más de los materiales bibliográficos y similares citados definan o utilicen un término de tal manera que contradiga la definición de ese término en esta solicitud, la presente solicitud será la determinante. Aunque las presentes enseñanzas se describen junto con diversas realizaciones, no se pretende que las presentes enseñanzas estén limitadas a dichas realizaciones. Por el contrario, las presentes enseñanzas abarcan varias alternativas, modificaciones y equivalentes, como apreciarán los expertos en la materia.
Definiciones
Como se utiliza en el presente documento, un "ácido nucleico" se refiere a un compuesto polimérico que comprende nucleósidos o análogos de nucleósidos que tienen bases heterocíclicas nitrogenadas, o análogos de bases, unidas entre sí por enlaces de la cadena principal del ácido nucleico (por ejemplo, enlaces fosfodiéster) para formar un polinucleótido. Los ejemplos no limitantes de ácido nucleico incluyen ARN, ADN y análogos de los mismos. La cadena principal del ácido nucleico puede incluir una variedad de enlaces, por ejemplo, uno o más de los enlaces azúcarfosfodiéster, enlaces péptido-ácido nucleico, enlaces fosforotioato o metilfosfonato o mezclas de dichos enlaces en un único oligonucleótido. Las fracciones de azúcar en el ácido nucleico pueden ser ribosa o desoxirribosa, o compuestos similares con sustituciones conocidas. Se incluyen en el término ácido nucleico las bases nitrogenadas convencionales (por ejemplo, A, G, C, T y U), los análogos de bases conocidas (por ejemplo, inosina), los derivados de bases de purina o pirimidina y los restos "abásicos" (es decir, sin base nitrogenada para una o más posiciones de la cadena principal). Es decir, un ácido nucleico puede incluir solo azúcares convencionales, bases y enlaces que se encuentran en el ARN y el ADN, o incluyen componentes y sustituciones convencionales (por ejemplo, bases y análogos convencionales unidos a través de una cadena principal de metoxi, o bases convencionales y uno o más análogos de bases unidos a través de una cadena principal de ARN o ADN).
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "ácidos nucleicos aislados" se refiere a la purificación de ácidos nucleicos a partir de uno o más componentes celulares. Un experto en la materia apreciará que las muestras procesadas para "aislar los ácidos nucleicos" de las mismas pueden incluir componentes e impurezas distintas de los ácidos nucleicos. Las muestras que comprenden ácidos nucleicos aislados se pueden preparar a partir de muestras utilizando cualquier método aceptable conocido en la materia. Por ejemplo, las células se pueden lisar mediante agentes de lisis conocidos, y los ácidos nucleicos se pueden purificar total o parcialmente a partir de otros componentes celulares. Los reactivos y protocolos adecuados para las extracciones de ADN y ARN se pueden encontrar en, por ejemplo, las publicaciones de solicitudes de patente de Estados Unidos n.° US 2010-0009351 y US 2009-0131650, respectivamente (cada una de las cuales se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad). En las pruebas de ácidos nucleicos (por ejemplo, los métodos de amplificación e hibridación que se analizan con más detalle a continuación), la solución de ácido nucleico extraída se puede añadir directamente a un reactivo (por ejemplo, ya sea en líquido, unido a un sustrato, en forma liofilizada, o similar, como se analiza con más detalle a continuación), necesario para realizar una prueba de acuerdo con las realizaciones divulgadas en el presente documento.
Como se utiliza en el presente documento, "plantilla" se refiere a todo o parte de un polinucleótido que contiene al menos una secuencia de nucleótidos diana.
Como se utiliza en el presente documento, un "cebador" se refiere a un polinucleótido que puede servir para iniciar una reacción de extensión de la cadena del ácido nucleico. La longitud de un cebador puede variar, por ejemplo, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 nucleótidos, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleótidos, de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 nucleótidos o de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 nucleótidos. La longitud de un cebador puede ser de aproximadamente 10 nucleótidos, aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 25 nucleótidos, aproximadamente 30 nucleótidos, aproximadamente 35 nucleótidos, aproximadamente 40 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 75 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos o un intervalo entre dos cualesquiera de estos valores. En algunas realizaciones, el cebador tiene una longitud de 10 a aproximadamente 50 nucleótidos, es decir, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 2526, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 o más nucleótidos. En algunas realizaciones, el cebador tiene una longitud de 18 a 32 nucleótidos.
Como se utiliza en el presente documento, una "sonda" se refiere a un polinucleótido que puede hibridarse (por ejemplo, de manera específica) con una secuencia diana en un ácido nucleico, en condiciones que permitan la hibridación, permitiendo así la detección de la secuencia diana o del ácido nucleico amplificado. En general, la "diana" de una sonda se refiere a una secuencia dentro o un subconjunto de una secuencia de ácido nucleico amplificada que se hibrida de manera específica con al menos una parte de un oligómero de sonda mediante enlaces de hidrógeno convencionales (es decir, emparejamiento de bases). Una sonda puede comprender secuencias específicas de diana y otras secuencias que contribuyen a la conformación tridimensional de la sonda. Las secuencias son "suficientemente complementarias" si permiten una hibridación estable en condiciones de hibridación adecuadas de un oligómero de sonda con una secuencia diana que no es completamente complementaria a la secuencia específica de diana de la sonda. La longitud de una sonda puede variar, por ejemplo, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 nucleótidos, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleótidos, de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 nucleótidos o de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 nucleótidos. La longitud de una sonda puede ser de aproximadamente 10 nucleótidos, aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 25 nucleótidos, aproximadamente 30 nucleótidos, aproximadamente 35 nucleótidos, aproximadamente 40 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos o un intervalo entre dos cualesquiera de estos valores. En algunas realizaciones, la sonda tiene una longitud de 10 a aproximadamente 50 nucleótidos. Por ejemplo, los cebadores y/o las sondas pueden tener al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 o más nucleótidos. En
algunas realizaciones, la sonda puede ser no específica de secuencia.
Preferentemente, los cebadores y/o las sondas pueden tener entre 8 y 45 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, los cebadores y/o sondas pueden tener al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 o más nucleótidos de longitud. El cebador y la sonda se pueden modificar para que contengan nucleótidos adicionales en el extremo 5' o 3', o en ambos. Un experto en la materia apreciará que las bases adicionales al extremo 3' de los cebadores de amplificación (no necesariamente las sondas) son generalmente complementarias a la secuencia molde. Las secuencias del cebador y de la sonda también se pueden modificar para eliminar los nucleótidos en el extremo 5' o 3'. Un experto en la materia apreciará que para que funcionen para la amplificación, los cebadores o las sondas tendrán una longitud mínima y una temperatura de hibridación como las divulgadas en el presente documento.
Los cebadores y las sondas pueden unirse a sus dianas a una temperatura de hibridación que es una temperatura menor que la temperatura de fusión (Tf). Como se utiliza en el presente documento, "Tf" y "temperatura de fusión" son términos intercambiables que se refieren a la temperatura a la que el 50 % de una población de moléculas polinucleotídicas bicatenarias se disocia en cadenas sencillas. Las fórmulas para calcular la Tf de los polinucleótidos son bien conocidas en la materia. Por ejemplo, la Tf puede calcularse mediante la siguiente ecuación: Tf = 69,3 0,41 x (G C)% - 6 - 50/L, donde L es la longitud de la sonda en nucleótidos. La Tf de un polinucleótido híbrido también se puede estimar mediante una fórmula adoptada de ensayos de hibridación en sal 1 M y normalmente utilizada para calcular la Tf para cebadores de PCR: [(número de A T) x 2 °C (número de G C) x 4 °C]. Véase, por ejemplo, C. R. Newton et al. PCR, 2.a ed., Springer-Verlag (Nueva York: 1997), pág. 24. Existen en la materia otros cálculos más sofisticados, que tienen en cuenta las características estructurales y de secuencia para el cálculo de la Tf. La temperatura de fusión de un oligonucleótido puede depender de la complementariedad entre el cebador o la sonda oligonucleotídica y la secuencia de unión, y de las condiciones de la sal. En algunas realizaciones, una sonda o cebador oligonucleotídico proporcionado en el presente documento tiene una Tf inferior a aproximadamente 90 °C en tampón KCl 50 mM y Tris-HCl 10 mM, por ejemplo, aproximadamente 89 °C, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 8079, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39 °C o inferior, incluidos los intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
En algunas realizaciones, los cebadores divulgados en el presente documento, por ejemplo, los cebadores de amplificación, se pueden proporcionar como un par de cebadores de amplificación, por ejemplo, que comprende un cebador directo y un cebador inverso (primer cebador de amplificación y segundo cebador de amplificación). Preferentemente, los cebadores directo e inverso tienen unas Tf que no difieren en más de 10 °C, por ejemplo, que difieren en menos de 10 °C, en menos de 9 °C, en menos de 8 °C, en menos de 7 °C, en menos de 6 °C, en menos de 5 °C, en menos de 4 °C, en menos de 3 °C, en menos de 2 °C o en menos de 1 °C.
Las secuencias del cebador y de la sonda pueden modificarse mediante sustituciones de nucleótidos (con respecto a la secuencia diana) dentro de la secuencia oligonucleotídica, siempre que el oligonucleótido contenga suficiente complementariedad para hibridarse de manera específica con la secuencia de ácido nucleico diana. De este modo, se pueden sustituir al menos 1,2, 3, 4 o hasta aproximadamente 5 nucleótidos. Como se utiliza en el presente documento, el término "complementario" se refiere a la complementariedad de secuencias entre regiones de dos cadenas polinucleotídicas o entre dos regiones de la misma cadena polinucleotídica. Una primera región de un polinucleótido es complementaria a una segunda región del mismo polinucleótido o de uno diferente si, cuando las dos regiones están dispuestas en forma antiparalela, al menos un nucleótido de la primera región es capaz de emparejarse con una base de la segunda región. Por lo tanto, no se necesita que dos polinucleótidos complementarios se emparejen en cada posición nucleotídica. "Totalmente complementario" se refiere a un primer polinucleótido que es 100% o "totalmente" complementario a un segundo polinucleótido y, por lo tanto, forma un par de bases en cada posición de nucleótido. "Parcialmente complementario" también se refiere a un primer polinucleótido que no es 100% complementario (por ejemplo, 90 %, u 80 % o 70 % complementarios) y que contiene nucleótidos no emparejados en una o más posiciones nucleotídicas. En algunas realizaciones, un oligonucleótido incluye una base universal.
Como se utiliza en el presente documento, una "secuencia de nucleótidos exógena" se refiere a una secuencia introducida por cebadores o sondas utilizadas para la amplificación, de manera que los productos de amplificación contendrán una secuencia de nucleótidos exógena y una secuencia de nucleótidos diana en una disposición que no se encuentra en la plantilla original a partir de la cual se copió la secuencia de nucleótidos diana.
Como se utiliza en el presente documento, "identidad de secuencia" o "porcentaje de identidad", tal como se aplica a las moléculas de ácido nucleico, es el porcentaje de restos de ácido nucleico en una secuencia de molécula de ácido nucleico candidata que son idénticos a una secuencia de molécula de ácido nucleico en cuestión, después de alinear las secuencias para lograr el máximo porcentaje de identidad, y sin considerar ninguna sustitución de restos de ácido nucleico como parte de la identidad de la secuencia. La identidad de la secuencia de ácido nucleico se puede determinar mediante cualquier método conocido en la materia, por ejemplo, CLUSTALW, T-COFFEE y BLASTN.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "suficientemente complementario" se refiere a una secuencia de bases de ácido nucleico contiguas que es capaz de hibridarse con otra secuencia de bases mediante puentes de hidrógeno entre una serie de bases complementarias. Las secuencias de bases complementarias pueden ser
complementarias en cada posición de la secuencia del oligómero mediante el uso de emparejamiento de bases convencional (por ejemplo, G:C, A:T o A:U) o pueden contener uno o más restos que no son complementarios (incluidas las posiciones abásicas), pero en la que la secuencia de bases complementaria completa es capaz de hibridarse de manera específica con otra secuencia de bases en condiciones de hibridación adecuadas. Las bases contiguas pueden ser al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 99 % o el 100 % complementarias a una secuencia con la que se pretende hibridar un oligómero. Las secuencias sustancialmente complementarias pueden referirse a secuencias que varían en porcentaje de identidad del 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 75, 70 o menos, o cualquier valor intermedio, en comparación con la secuencia de referencia. Un experto en la materia puede elegir fácilmente las condiciones de hibridación adecuadas que pueden predecirse en función de la composición de la secuencia de bases, o determinarse mediante el uso de pruebas de rutina (véase, por ejemplo, Green y Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 4.a ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012)).
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "PCR múltiple" se refiere a un tipo de PCR en la que se incluye más de un conjunto de cebadores en una reacción que permite amplificar una sola diana o dos o más dianas diferentes en un solo tubo de reacción. La PCR múltiple puede ser, por ejemplo, PCR en tiempo real.
Oligonucleótidos y composiciones que los contienen
Como se describe en el presente documento, se pueden realizar amplificaciones de ácidos nucleicos para determinar la presencia, la ausencia y/o el nivel de Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaera de tipo 1 y BVAB2 en una muestra. En algunas realizaciones, la presencia, la ausencia y/o el nivel de Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaera de tipo 1 y BVAB2 se determina mediante la detección de uno o más genes diana de cada uno de los organismos diana mediante métodos conocidos en la materia, tales como amplificaciones de ADN. En algunas realizaciones, se puede realizar una PCR múltiple para detectar la presencia, la ausencia o el nivel para cada uno de Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaera de tipo 1 y BVAB2.
Cada uno de Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaera de tipo 1 y BVAB2 se puede detectar mediante canales separados en amplificaciones de ADN. En algunos casos, puede ser deseable utilizar un solo canal de fluorescencia para detectar la presencia, la ausencia y/o el nivel de dos o más de Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaera de tipo 1 y BVAB2. Por ejemplo, se puede utilizar un solo canal de fluorescencia para detectar la presencia, la ausencia y/o el nivel de dos de Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaera de tipo 1 y BVAB2 (por ejemplo, BVAB-2 y Megasphaera-1). Dicha combinación puede, en algunas realizaciones, reducir la cantidad de reactivo necesario para realizar el experimento y proporcionar una métrica cualitativa precisa sobre la cual se puede evaluar una determinación de la VB. Sin quedar ligados a ninguna teoría particular, se cree que el uso de marcadores combinados puede aumentar la sensibilidad y la especificidad del ensayo. En algunas realizaciones, se utilizan canales de fluorescencia separados para detectar la presencia, la ausencia y/o el nivel de cada uno de Lactobacillus spp. (por ejemplo L. crispatus y L. jensenii), G. vaginalis, y Atopobium vaginae, y se utiliza un solo canal de fluorescencia para detectar la presencia, la ausencia y/o el nivel de BVAB-2 y Megasphaera-1.
Se proporcionan los oligonucleótidos (por ejemplo, cebadores y sondas de amplificación) que son capaces de hibridarse de manera específica (por ejemplo, en condiciones convencionales de amplificación de ácidos nucleicos, por ejemplo, condiciones de PCR convencionales y/o condiciones de hibridación estrictas) a una región génica diana, o complemento de la misma, en L. crispatus, L. jensenii, G. vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaera de tipo 1 (Megasphaera-1) y BVAB-2. La amplificación de la región génica diana de un organismo en una muestra (por ejemplo, una muestra de hisopado vaginal) puede, en algunas realizaciones, ser indicativo de la presencia, la ausencia y/o el nivel del organismo en la muestra.
La región génica diana puede variar. En algunas realizaciones, se proporcionan los oligonucleótidos (por ejemplo, cebadores y sondas de amplificación) que son capaces de hibridarse de manera específica (por ejemplo, en condiciones convencionales de amplificación de ácidos nucleicos, por ejemplo, condiciones de PCR convencionales y/o condiciones de hibridación estrictas) a una región génica que codifica el ARN ribosomal 16S (ARNr 16S) en un organismo. En algunas realizaciones, el organismo es Atopobium vaginae. En algunas realizaciones, el organismo es BVAB2. En algunas realizaciones, el organismo es Megasphaera de tipo 1. En algunas realizaciones, el organismo es L. crispatus. En algunas realizaciones, el microorganismo es L. jensenii. El gen del ARNr 16S se utiliza como gen diana para la amplificación del ADN para detectar la presencia, la ausencia y/o el nivel de Atopobium vaginae, BVAB-2, Megasphaera de tipo 1, L. crispatus y/o L. jensenii en la muestra. Ejemplos de oligonucleótidos capaces de hibridarse de manera específica con la región génica del ARNr 16S en BVAB-2 son las SEQ ID NO: 4 a 6 como se proporciona en la tabla 1 y las secuencias que tienen un emparejamiento incorrecto con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4 a 6. Ejemplos de oligonucleótidos capaces de hibridarse de manera específica con la región del gen ARNr 16S en Megasphaera son las SEQ ID NO: 7 a 9 como se proporciona
en la tabla 1 y las secuencias que tienen un emparejamiento incorrecto con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7 a 9. En algunas realizaciones, los cebadores y las sondas que pueden unirse de manera específica a la región génica del ARNr 16S de Atopobium vaginae se utilizan en la detección de la presencia, la ausencia y/o el nivel de Atopobium vaginae en una muestra biológica. Ejemplos de oligonucleótidos capaces de hibridarse de manera específica con la región génica del ARNr 16S en Atopobium vaginae son las SEQ ID NO: 1 a 3 como se proporciona en la tabla 1 y las secuencias que tienen un emparejamiento incorrecto con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1 a 3. Ejemplos de oligonucleótidos capaces de hibridarse de manera específica con la región génica del ARNr 16S en L. crispatus y L. jensenii son las SEQ ID NO: 14 a 16 como se proporciona en la tabla 1 y las secuencias que tienen un emparejamiento incorrecto con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 14 a 16.
La toxina vaginolisina (VLY) es el principal factor de virulencia de G. vaginalis, codificada por el gen vly. La VLY pertenece a las citolisinas dependientes del colesterol, una familia de toxinas formadoras de poros que se sabe que alteran las membranas plasmáticas provocando lisis celular y que se cree que juegan un papel clave en la virulencia de G. vaginalis. En algunas realizaciones, se proporcionan los oligonucleótidos (por ejemplo, cebadores y sondas de amplificación) que son capaces de hibridarse de manera específica (por ejemplo, en condiciones convencionales de amplificación de ácidos nucleicos, por ejemplo, condiciones de PCR convencionales y/o condiciones de hibridación estrictas) a una región génica que codifica vly en G. vaginalis. En algunas realizaciones, el gen vaginolisina (vly) se utiliza como gen diana para la amplificación del ADN para detectar la presencia, la ausencia y/o el nivel de G. vaginalis en la muestra. En algunas realizaciones, se utilizan cebadores y sondas que pueden unirse de manera específica a la región génica vly de G. vaginalis en la detección de la presencia, la ausencia y/o el nivel de G. vaginalis en una muestra biológica. Ejemplos de oligonucleótidos capaces de hibridarse de manera específica con la región del gen vly en G. vaginalis son las SEQ ID NO: 10 a 13 como se proporciona en la tabla 1 y las secuencias que tienen un emparejamiento incorrecto con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10 a 13.
Tabla 1. Cebador y sondas para la detección de Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Gardnerella vaginalis,
A i m v in M h r i 1 BVAB2
continuación
En el presente documento también se proporcionan oligonucleótidos (por ejemplo, cebadores o sondas de amplificación) que contienen 1 emparejamiento incorrecto con respecto a las SEQ ID NO: 1 a 16 o el complemento de las mismas.
Los ácidos nucleicos proporcionados en el presente documento pueden estar de varias formas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los ácidos nucleicos se disuelven (ya sea solos o en combinación con otros ácidos nucleicos) en solución, por ejemplo, en tampón. En algunas realizaciones, se proporcionan ácidos nucleicos, ya sean solos o en combinación con otros ácidos nucleicos aislados, como una sal. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos se proporcionan en forma liofilizada de manera que se pueden reconstituir. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los ácidos nucleicos aislados divulgados en el presente documento se pueden proporcionar solos en un sedimento liofilizado o en un sedimento liofilizado con otros ácidos nucleicos aislados. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos se proporcionan fijos a una sustancia sólida, tal como una perla, una membrana o similar. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos se proporcionan en una célula hospedadora, por ejemplo, una estirpe celular que lleva un plásmido, o una estirpe celular que lleva una secuencia integrada de forma estable.
También se divulgan en el presente documento composiciones, mezclas de reacción y kits que comprenden los oligonucleótidos (por ejemplo, cebadores y/o sondas de amplificación) que son capaces de hibridarse de manera específica con la secuencia del gen del ARNr 16S de Atopobium vaginae, BVAB-2, Megasphaera de tipo 1, L. crispatus, y/o L. jensenii, o un complemento del mismo. La composición, la mezcla de reacción y el kit comprenden uno o más pares de cebadores de amplificación capaces de hibridarse de manera específica con la secuencia del ARNr 16S, o un complemento de la misma, de Atopobium vaginae. En algunas realizaciones, el cebador consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 1 o 2. En algunas realizaciones, el cebador consiste en una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a una secuencia de SEQ ID NO: 1 o 2. La composición, la mezcla de reacción y el kit comprenden uno o más sondas capaces de hibridarse de manera específica con la gen del ARNr 16S, o complemento de la misma, de Atopobium vaginae. En algunas realizaciones, la sonda comprende una secuencia de SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, la sonda consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, la sonda consiste en una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a una secuencia de SEQ ID NO: 3.
La composición, la mezcla de reacción y el kit comprenden uno o más pares de cebadores de amplificación capaces de hibridarse de manera específica con la secuencia del ARNr 16S, o un complemento de la misma, de BVAB-2. En algunas realizaciones, el cebador consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 4 o 5. En algunas realizaciones, el cebador consiste en una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a una secuencia de SEQ ID NO: 4 o 5. La composición, la mezcla de reacción y el kit comprenden uno o más sondas capaces de hibridarse de manera específica con la gen del ARNr 16S, o complemento de la misma, de BVAB-2. En algunas realizaciones, la sonda comprende una secuencia de SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones, la sonda consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones, la sonda consiste en una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a una secuencia de SEQ ID NO: 6.
La composición, la mezcla de reacción y el kit comprenden uno o más pares de cebadores de amplificación capaces de hibridarse de manera específica con la secuencia del ARNr 16S, o un complemento de la misma, de Megasphaera de tipo 1. En algunas realizaciones, el cebador consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 7 u 8. En algunas realizaciones, el cebador consiste en una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a una secuencia de SEQ ID NO: 7 u 8. La composición, la mezcla de reacción y el kit comprenden uno o más sondas capaces de hibridarse de manera específica con la gen del ARNr 16S, o complemento de la misma, de Megasphaera de tipo 1. En algunas realizaciones, la sonda comprende una secuencia de SEQ ID NO: 9. En algunas realizaciones, la sonda consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 9. En algunas realizaciones, la sonda consiste en una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a una secuencia de SEQ ID NO: 9.
La composición, la mezcla de reacción y el kit comprenden uno o más pares de cebadores de amplificación capaces de hibridarse de manera específica con la secuencia del ARNr 16S, o un complemento de la misma, de L. crispatus y/o L. jensenii. En algunas realizaciones, el cebador consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 14 o 15. La composición, la mezcla de reacción y el kit comprenden uno o más sondas capaces de hibridarse de manera específica con la gen del ARNr 16S, o complemento de la misma, de L. crispatus y/o L. jensenii. En algunas realizaciones, la sonda comprende una secuencia de SEQ ID NO: 16. En algunas realizaciones, la sonda consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 16. En algunas realizaciones, la sonda consiste en una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a una secuencia de SEQ ID NO: 16.
Las composiciones, las mezclas de reacción y los kits también comprenden oligonucleótidos (por ejemplo, cebadores y/o sondas de amplificación) que son capaces de hibridarse de manera específica con la secuencia del gen vly de G. vaginalis, o un complemento de la misma. La composición, la mezcla de reacción y el kit comprenden uno o más pares de cebadores de amplificación capaces de hibridarse de manera específica con la secuencia del gen vly de G. vaginalis, o un complemento de la misma. En algunas realizaciones, el cebador consiste de una secuencia de SEQ ID NO: 10, 11 o 12. En algunas realizaciones, el cebador consiste en una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a una secuencia de SEQ ID NO: 10, 11 o 12. En algunas realizaciones, la composición, la mezcla de reacción y el kit comprenden una o más sondas adicionales capaces de hibridarse de manera específica con la secuencia del gen vly de G. vaginalis, o complemento de la misma. En algunas realizaciones, la sonda comprende una secuencia de SEQ ID NO: 13. En algunas realizaciones, la sonda consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 13. En algunas realizaciones, la sonda consiste en una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a una secuencia de SEQ ID NO: 13.
Las sondas oligonucleotídicas pueden, en algunas realizaciones, incluir una fracción detectable. Por ejemplo, las sondas oligonucleotídicas divulgadas en el presente documento pueden comprender un marcador radiactivo. Los ejemplos no limitantes de marcadores radiactivos incluyen 3H, 14C, 32P y 35S. En algunas realizaciones, las sondas oligonucleotídicas pueden incluir uno o más marcadores o fracciones detectables no radiactivos, que incluyen, pero sin limitación, ligandos, fluoróforos, agentes quimioluminiscentes, enzimas y anticuerpos. Otros marcadores detectables para utilizar con sondas, que pueden permitir un aumento de la sensibilidad del método de la invención, incluyen biotina y radionucleótidos. Será evidente para el experto en la materia que la elección de un marcador particular dicta la manera en que se une a la sonda. Por ejemplo, las sondas oligonucleotídicas marcadas con uno o más colorantes, de modo que tras la hibridación con un ácido nucleico molde se genera un cambio detectable en la fluorescencia. Si bien los colorantes no específicos pueden ser deseables para algunas aplicaciones, las sondas específicas de secuencia pueden proporcionar mediciones de amplificación más precisas. Una configuración de sonda específica de secuencia puede incluir un extremo de la sonda unido a un fluoróforo y el otro extremo de la sonda unido a un inactivador. Cuando la sonda no está hibridada, puede mantener una configuración de bucle-tallo, en la que el fluoróforo se inactiva por el inactivador, evitando así que el fluoróforo emita fluorescencia. Cuando la sonda se hibrida con una secuencia nucleica molde, se linealiza, lo que aleja el fluoróforo del inactivador y, por lo tanto, permite que el fluoróforo emita fluorescencia. Otra configuración de la sonda específica de secuencia puede incluir una primera sonda unida a un primer fluoróforo de un par FRET y una segunda sonda unida a un segundo fluoróforo de un par FRET. La primera sonda y la segunda sonda se pueden configurar para hibridarse con secuencias de un amplicón que están lo suficientemente cerca para permitir la transferencia de energía por FRET cuando la primera sonda y la segunda sonda se hibridan con el mismo amplicón.
En algunas realizaciones, la sonda específica de secuencia comprende un oligonucleótido como se divulga en el presente documento conjugado con un fluoróforo. En algunas realizaciones, la sonda se conjuga con dos o más fluoróforos. Los ejemplos de fluoróforos incluyen: colorantes de xanteno, por ejemplo, colorantes de fluoresceína y rodamina, tales como el isotiocianato de fluoresceína (FITC), el monoclorhidrato de éster etílico del ácido 2-[etilamino)-3-(etilimino)-2-7-dimetil-3H-xanten-9-il]benzoico (R6G) (emite una radiación de respuesta en la longitud de onda que varía entre aproximadamente 500 y 560 nm), el yoduro de 1,1,3,3,3',3-hexametilindodicarbocianina (HIDC) (emite una radiación de respuesta en la longitud de onda que varía entre aproximadamente 600 y 660 nm), la 6-carboxifluoresceína (normalmente conocida por las abreviaturas FAM y F), la 6-carboxi-2',4',7',4,7-hexaclorofluoresceína (HEX), la 6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína (JOE o J), la N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA o T), la 6-carboxi-X-rodamina (ROX o R), la 5-carboxirrodamina-6G (R6G5 o G5), la 6-carboxirrodamina-6G (R6G6 o G6) y la rodamina 110; colorantes de cianina, por ejemplo, los colorantes Cy3, Cy5 y Cy7; cumarinas, por ejemplo, la umbeliferona; colorantes de bencimida, por ejemplo, Hoechst 33258; colorantes de fenantridina, por ejemplo, rojo Texas; colorantes de etidio; colorantes de acridina; colorantes de carbazol; colorantes de fenoxazina; colorantes de porfirina; colorantes de polimetina, por ejemplo, colorantes de cianina tales como Cy3 (emite una radiación de respuesta en la longitud de onda que varía entre 540 y 580 nm), Cy5 (emite una radiación de respuesta en la longitud de onda que varía entre 640 y 680 nm), etc.; colorantes BODIPY y colorantes de quinolina. Los fluoróforos específicos de interés incluyen: pireno, cumarina, dietilaminocumarina, FAM, clorotriazinilo de fluoresceína, fluoresceína, R110, eosina, JOE, R6G, HIDC, tetrametilrodamina, TAMRA, lisamina, ROX, naftofluoresceína, rojo Texas, naftofluoresceína, Cy3 y Cy5, CAL naranja flúor y similares.
En algunas realizaciones, la sonda se conjuga con un inactivador. Un inactivador puede absorber la radiación electromagnética y disiparla en forma de calor, por lo que permanece oscuro. Los inactivadores ilustrativos incluyen Dabcyl, NFQ, tal como BHQ-1 o BHQ-2 (Biosearch), IOWA BLACK FQ (IDT) e IOWA BLACK RQ (IDT). En algunas realizaciones, el inactivador se selecciona para emparejarse con un fluoróforo para absorber la radiación electromagnética emitida por el fluoróforo. Los pares de fluoróforo/inactivador útiles en las composiciones y métodos divulgados en el presente documento son bien conocidos en la materia y se pueden encontrar, por ejemplo, descritos en Marras, "Selection of Fluorophore and Quencher Pairs for Fluorescent Nucleic Acid Hybridization Probes" disponible en www.molecular-beacons.org/download/marras,mmb06 %28335 %293.pdf.
En algunas realizaciones, un fluoróforo se une a un primer extremo de la sonda y un inactivador se une a un segundo extremo de la sonda. La unión puede incluir enlaces covalentes y, opcionalmente, puede incluir al menos una molécula
enlazadora situada entre la sonda y el fluoróforo o el inactivador. En algunas realizaciones, un fluoróforo se une al extremo 5' de una sonda y un inactivador se une al extremo 3' de una sonda. En algunas realizaciones, un fluoróforo se une al extremo 3' de una sonda y un inactivador se une al extremo 5' de una sonda. Los ejemplos de sondas que se pueden utilizar en la amplificación cuantitativa de ácidos nucleicos incluyen balizas moleculares, sondas SCORPION™ (Sigma), sondas TAQMAN™ (Life Technologies) y similares. Otras tecnologías de detección de ácidos nucleicos que son útiles en las realizaciones divulgadas en el presente documento incluyen, pero sin limitación, tecnología de sonda de nanopartículas (véase Elghanian, et al. (1997) Science 277:1078-1081) y tecnología de sonda Amplifluor (véanse las patentes de EE. UU. n.°: 5.866.366; 6.090.592; 6.117.635; y 6.117.986).
La presente invención se refiere a una composición para la detección de Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaera de tipo 1 y BVAB2, en donde la composición comprende: cebadores capaces de hibridarse con los genes del ARNr 16S de L. crispatus y/o L. jensenii, en donde cada cebador consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a la SEQ ID NO: 14 o a la SEQ ID NO: 15; cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de BVAB2, en donde cada cebador consiste en una secuencia de SeQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a la SEQ ID NO: 4 o a la SEQ ID NO: 5; cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de Megasphaera de tipo 1, en donde cada cebador consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a la SEQ ID NO: 7 o a la SEQ ID NO: 8; cebadores capaces de hibridarse con el gen vly de G. vaginalis, en donde cada cebador consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10 a 12 o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10 a 12, y cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de Atopobium vaginae, en donde cada cebador consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a la SEQ ID NO: 1 o a la SEQ ID NO: 2.
En algunas realizaciones, los cebadores capaces de hibridarse con los genes del ARNr 16S de L. crispatus y/o L. jensenii comprenden, o consisten en, un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 1 y un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 2; los cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de BVAB2 comprenden, o consisten en, un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 4 y un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 5; los cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de Megasphaera de tipo 1 que comprenden, consisten en, un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 7 y un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 8; los cebadores capaces de hibridarse con el gen vly de G. vaginalis comprenden, o consisten en, un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 10 y un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 11; y los cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de Atopobium vaginae comprenden, o consisten en, un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 12, un cebador que comprende, o consiste en, la secuencia de SEQ ID NO: 14 y un cebador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 15.
La composición puede comprender además una pluralidad de sondas oligonucleotídicas, en donde cada una de la pluralidad de sondas oligonucleotídicas comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 6, 9, 13 y 16, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 6, 9, 13 y 16. En algunas realizaciones, cada una de la pluralidad de sondas oligonucleotídicas comprende, o consiste en, una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 6, 9, 13 y 16.
Cualquier sonda descrita en el presente documento puede comprender una fracción emisora de fluorescencia y una fracción inactivadora de fluorescencia.
Como se divulga en el presente documento, una mezcla de reacción puede comprender uno o más de los cebadores divulgados en el presente documento, una o más de las sondas divulgadas en el presente documento (por ejemplo, las sondas que contienen fluoróforos) o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la mezcla de reacción comprende una o más de las composiciones que contienen cebador y/o sonda divulgadas en el presente documento. La mezcla de reacción también puede comprender varios componentes adicionales. Los ejemplos de los componentes adicionales en la mezcla de reacción incluyen, pero sin limitación, ADN molde, ADN polimerasa (por ejemplo, Taq ADN polimerasa), desoxinucleótidos (dNTP), solución de tampón, cationes biovalentes, iones de potasio de catión monovalente y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la mezcla de reacción es una mezcla maestra para PCR en tiempo real.
Muestras
Los métodos y composiciones divulgados en el presente documento son adecuados para detectar trastornos vaginales, en particular, VB, en una amplia diversidad de muestras. Como se utiliza en el presente documento, una "muestra" se refiere a cualquier tipo de material de origen biológico tomado de uno o más sujetos de los que se sospecha que padecen VB. La muestra puede comprender, por ejemplo, líquido, tejido o células. La muestra puede comprender un material biológico tomado directamente de un sujeto, células o tejidos cultivados, o cualquier fracción o productos producidos o procedentes de materiales biológicos. Una muestra puede estar purificada, parcialmente
purificada, sin purificar, enriquecida o amplificada.
La muestra puede ser una muestra biológica, por ejemplo, una muestra clínica. En algunas realizaciones, la muestra se toma de una fuente biológica, tal como la vagina, uretra, pene, ano, garganta, cuello uterino, caldos de fermentación, cultivos celulares y similares. La muestra puede comprender, por ejemplo, líquido y células de la vagina. La muestra biológica se puede utilizar (i) directamente tal como se obtiene del sujeto o la fuente, o (ii) después de un tratamiento previo para modificar el carácter de la muestra. Por lo tanto, la muestra de prueba se puede tratar previamente antes de su uso, por ejemplo, mediante la alteración de células o de partículas víricas, la preparación de líquidos a partir de materiales sólidos, la dilución de líquidos viscosos, el filtrado de líquidos, la concentración de líquidos, la inactivación de componentes interferentes, la adición de reactivos, la purificación de ácidos nucleicos y similares. Por consiguiente, una "muestra biológica" como se utiliza en el presente documento incluye ácidos nucleicos (ADN, ARN o ácidos nucleicos totales) extraídos de una muestra clínica o biológica. La preparación de muestras también puede incluir el uso de una solución que contenga tampones, sales, detergentes y/o similares que se utilizan para preparar la muestra para el análisis. En algunas realizaciones, la muestra se procesa antes de la prueba molecular. En algunas realizaciones, la muestra se analiza directamente y no se procesa antes de la prueba. La muestra puede ser, por ejemplo, una muestra vaginal, tal como una sola muestra de hisopado vaginal. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de hisopado vaginal de una mujer con síntomas clínicos de vaginitis y/o vaginosis.
Las muestras vaginales o de orina a menudo están infectadas con múltiples organismos. Los cebadores y la sondas divulgadas son tolerantes a infecciones mixtas de la matriz vaginal o de orina.
En algunas realizaciones, una muestra a analizar se procesa antes de realizar los métodos divulgados en el presente documento. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la muestra se puede aislar, concentrar o someter a varias otras etapas de procesamiento antes de realizar los métodos divulgados en el presente documento. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la muestra se puede procesar para aislar los ácidos nucleicos de la muestra antes de poner en contacto la muestra con los oligonucleótidos, como se divulga en el presente documento. En algunas realizaciones, los métodos divulgados en el presente documento se realizan en la muestra sin cultivar la muestra in vitro. En algunas realizaciones, los métodos divulgados en el presente documento se realizan en la muestra sin aislar los ácidos nucleicos de la muestra antes de poner en contacto la muestra con los oligonucleótidos como se divulga en el presente documento.
Extracción de muestras
En extracciones normales de muestras, las células se lisan mediante cizallamiento mecánico con perlas de vidrio como se describe en la patente de EE. UU. n.° 7.494.771, para lisar los organismos diana. Como se divulga en el documento WO03/008636, dicho método genérico de lisis celular es eficaz para una amplia variedad de organismos diana y matrices de muestras. También existen otros métodos de lisis menos universales que están diseñados de manera específica para dirigirse a una determinada especie o grupo de organismos, o que explotan actividades enzimáticas o químicas específicas. Por ejemplo, la enzima ACP se utiliza normalmente para lisar organismos grampositivos (Ezaki et al., J. Clin. Microbiol., 16(5):844-846 (1982); Paule et al., J. Mol. Diagn., 6(3): 191-196 (2004); patente de EE. UU. n.° 3.649.454) y micobacterias (patente de EE. UU. n.° 5.185.242), pero en general se considera menos eficaz con respecto a la lisis de especies gramnegativas tales como E. coli y Pseudomonas aeruginosa (Patente de EE. UU. n.° 3.649.454).
Pruebas de ácidos nucleicos
Los métodos descritos en el presente documento pueden incluir, por ejemplo, pruebas de ácidos nucleicos. Por ejemplo, la prueba puede incluir la prueba de secuencias de ácido nucleico diana en una muestra. Se pueden utilizar varias formas de pruebas de ácidos nucleicos en las realizaciones divulgadas en el presente documento, que incluyen, pero sin limitación, pruebas que implican la amplificación de ácidos nucleicos.
Como se utiliza en el presente documento, la amplificación de ácidos nucleicos se refiere a cualquier procedimiento conocido para obtener múltiples copias de una secuencia de ácido nucleico diana o su complemento o fragmentos de la misma, mediante métodos específicos de secuencia. Los ejemplos de métodos de amplificación conocidos incluyen, pero sin limitación, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) (por ejemplo, amplificación por desplazamiento múltiple (MDA)), amplificación mediada por replicasa, inmunoamplificación, amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA), replicación de secuencia autosostenida (3SR), amplificación de círculo rodante y amplificación mediada por transcripción (TMA). Véase, por ejemplo, Mullis, "Process for Amplifying, Detecting, and/or Cloning Nucleic Acid Sequences", patente de EE. UU. n.° 4.683.195; Walker, "Strand Displacement Amplification", patente de EE. UU. n.° 5.455.166; Dean et al., "Multiple displacement amplification", patente de EE. UU. n.° 6.977.148; Notomi et al., "Process for Synthesizing Nucleic Acid", patente de EE. u U. n.° 6.410.278; Landegren et al. patente de EE. UU. n.° 4.988.617 "Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids"; Birkenmeyer, "Amplification of Target Nucleic Acids Using Gap Filling Ligase Chain Reaction", patente de EE. UU. n.° 5.427.930; Cashman, "Blocked-Polymerase Polynucleotide Immunoassay Method and Kit", patente de EE. UU. n.° 5.849.478; Kacian et al., "Nucleic Acid Sequence Amplification Methods", patente de EE. UU. n.° 5.399.491; Malek et al., "Enhanced Nucleic Acid Amplification Process", patente de EE. UU. n.° 5.130.238; Lizardi et al., BioTechnology,
6:1197 (1988); Lizardi et al., patente de EE. UU. n.° 5.854.033 "Rolling circle replication repórter systems". En algunas realizaciones, se pueden realizar dos o más de los métodos de amplificación de ácidos nucleicos antes mencionados, por ejemplo, de manera secuencial.
Por ejemplo, la amplificación LCR utiliza al menos cuatro oligonucleótidos separados para amplificar una diana y su cadena complementaria mediante múltiples ciclos de hibridación, unión y desnaturalización (patente EP n.° 0320308). La SDA amplifica mediante el uso de un cebador que contiene un sitio de reconocimiento para una endonucleasa de restricción que corta una cadena de un ADN doble semimodificado que incluye la secuencia diana, seguido de amplificación en una serie de etapas de extensión de cebador y desplazamiento de cadena (Patente de EE. UU. n.° 5.422.252 de Walker et al.).
La PCR es un método bien conocido en la materia para la amplificación de ácidos nucleicos. La PCR implica la amplificación de una secuencia diana mediante dos o más cebadores oligonucleotídicos específicos de secuencia extensibles que flanquean la secuencia diana. El ácido nucleico que contiene la secuencia diana de interés se somete a un programa de múltiples rondas de ciclos térmicos (desnaturalización, hibridación y extensión) en presencia de los cebadores, una polimerasa de ADN termoestable (por ejemplo, Taq polimerasa) y varios dNTP, lo que da como resultado la amplificación de la secuencia diana. La PCR utiliza varias rondas de reacciones de extensión con cebadores en las que una ADN polimerasa termoestable sintetiza de manera simultánea cadenas complementarias de una región definida de una molécula de ADN. Al final de cada ciclo, cada molécula de ADN recién sintetizada actúa como una plantilla para el siguiente ciclo. Durante rondas repetidas de estas reacciones, el número de cadenas de ADN recién sintetizadas aumenta exponencialmente de tal manera que después de 20 a 30 ciclos de reacción, el ADN molde inicial se habrá replicado varios miles o millones de veces. Los métodos para llevar a cabo diferentes tipos y modos de PCR se describen con detalle en la bibliografía, por ejemplo en "PCR Primer: A Laboratory Manual" Dieffenbach y Dveksler, eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995, y por Mullis et al. en patentes (por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 4.683.195, 4.683.202 y 4.800.159) y en publicaciones científicas (por ejemplo, Mullis et al.
1987, Methods in Enzymology, 155:335-350).
La PCR puede generar productos de amplificación de bicatenarios adecuados para el procesamiento posterior a la amplificación. Si se desea, los productos de amplificación se pueden detectar mediante visualización con electroforesis en gel de agarosa, mediante un formato de inmunoensayo enzimático con detección colorimétrica basada en sonda, mediante tecnología de emisión de fluorescencia o mediante otros medios de detección conocidos por un experto en la materia.
Se ha descrito una amplia variedad de métodos de PCR en muchas fuentes, por ejemplo, Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, sección 15, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York (1994). Los ejemplos de métodos de PCR incluyen, pero sin limitación, PCR en tiempo real, PCR de punto final, polimorfismos en la longitud de los fragmentos amplificados mediante PCR (AFLP-PCR), PCR Alu, p Cr asimétrica, PCR de colonias, PCR DD, PCR degenerada, p Cr de inicio en caliente, PCR in situ, p Cr inversa, PCR larga, PCR múltiple, PCR anidada, PCR-ELISA, PCR-RFLP, polimorfismo de conformación de cadena simple mediante PCR (PCR-SSCP), PCR competitiva cuantitativa (QC-PCR), amplificación rápida de extremos de ADNc mediante PCR (RACE-PCR), amplificación aleatoria de ADN polimórfico mediante PCR (RAPD-PCR), PCR en tiempo real, PCR palindrómica extragénica repetitiva (Rep-PCR), p Cr de transcriptasa inversa (RT-PCR), TAIL-PCR, Touchdown PCR y Vectorette PCR.
PCR en tiempo real, también llamada reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR), y se pueden utilizar para cuantificar y amplificar de manera simultánea una parte específica de una molécula de ácido nucleico determinada. Se puede utilizar para determinar si una secuencia específica está presente en la muestra; y si está presente, el número de copias de la secuencia que están presentes. La expresión en "tiempo real" se refiere al control periódico durante la PCR. Determinados sistemas, tales como los sistemas de detección de secuencias ABI 7700 y 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, California) realizan el control durante cada ciclo térmico en un punto predeterminado o definido por el usuario. El análisis en tiempo real de la PCR con sondas de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET, del inglés fluorescence resonance energy transfer) mide los cambios en la señal del colorante fluorescente de un ciclo a otro, preferentemente menos cualquier señal de control interno. El procedimiento en tiempo real sigue el patrón general de PCR, pero el ácido nucleico se cuantifica después de cada ronda de amplificación. Dos ejemplos de métodos de cuantificación son el uso de colorantes fluorescentes (por ejemplo, SYBRGreen) que se intercalan en el ADN bicatenario y de sondas oligonucleotídicas de ADN modificadas que emiten fluorescencia cuando se hibridan con un ADN complementario. Los agentes intercalantes tienen una fluorescencia relativamente baja cuando no se unen y una fluorescencia relativamente elevada cuando se unen a ácidos nucleicos bicatenarios. Por ello, los agentes intercalantes se pueden utilizar para controlar la acumulación de ácidos nucleicos bicatenarios durante una reacción de amplificación de ácidos nucleicos. Los ejemplos de dichos colorantes no específicos útiles en las realizaciones divulgadas en el presente documento incluyen agentes intercalantes tales como SYBR Green I (Molecular Probes), yoduro de propidio, bromuro de etidio y similares.
Las muestras vaginales a menudo están infectadas con múltiples organismos. Los cebadores y las sondas divulgadas son tolerantes a infecciones mixtas de la matriz vaginal. Debido a las secuencias diana específicas, a los cebadores y a las sondas, los métodos y composiciones divulgados en el presente documento se pueden utilizar para detectar la presencia/ausencia o el nivel de Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Gardnerella vaginalis, Atopobium
vaginae, Megasphaera de tipo 1 y BVAB2 en una muestra con elevada sensibilidad, especificidad y precisión.
Los cebadores divulgados en el presente documento se pueden combinar con sistemas de PCR adicionales utilizando un perfil de PCR térmico y químico uniforme para proporcionar un grupo de ensayos para la detección de organismos vaginales, para mejorar la sensibilidad y la consistencia general del ensayo.
En algunas realizaciones, la PCR múltiple se realiza para amplificar y detectar, por ejemplo, mediante medios directos o indirectos, la presencia o la ausencia de Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaera de tipo 1 y BVAB2 para permitir el diagnóstico de la VB mediante una prueba. La presencia o la ausencia de L. crispatus, L. jensenii, G. vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaera de tipo 1 y BVAB-2, se puede determinar mediante la amplificación y la detección de la presencia o la ausencia del gen del ARNr 16S de L. crispatus, L. jensenii, Atopobium vaginae, BVAB-2, Megasphaera de tipo 1 y la presencia o la ausencia del gen vly de G. vaginalis.
Por consiguiente, algunas realizaciones para la detección y/o identificación de Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaera de tipo 1 y BVAB2 en una muestra incluyen las etapas de proporcionar una muestra de prueba; y de poner en contacto la muestra con cebadores oligonucleotídicos como se describe anteriormente que pueden hibridarse y amplificar de manera específica genes del ARNr 16S de L. crispatus, L. jensenii, Atopobium vaginae, BVAB-2, Megasphaera de tipo 1, y el gen vly de G. vaginalis, en condiciones convencionales de amplificación de ácidos nucleicos y/o condiciones de hibridación estrictas. Como se describe en el presente documento, la muestra se puede poner en contacto con todos los cebadores y sondas a la vez, o se puede poner en contacto primero con algunos de los cebadores y sondas y después con el resto de los cebadores y sondas.
En algunas realizaciones, la puesta en contacto se realiza en condiciones que permiten la hibridación específica de los cebadores con la región génica diana correspondiente si el organismo diana está presente en la muestra. Se puede determinar la presencia y/o la cantidad de sonda que se une de manera específica a la región génica diana correspondiente (si está presente en la muestra que se está analizando), en donde la sonda unida es indicativa de la presencia del organismo diana correspondiente en la muestra. En algunas realizaciones, la cantidad de sonda unida se utiliza para determinar la cantidad del organismo diana correspondiente en la muestra.
La etapa de determinación se puede lograr mediante cualquier método conocido por los expertos en la materia, que incluyen, pero sin limitación, hibridación in situ, después de la etapa de puesta en contacto. La detección de dobletes híbridos (es decir, de una sonda unida de manera específica a la región génica diana) se puede llevar a cabo mediante una serie de métodos. Normalmente, los dobletes de hibridación se separan de los ácidos nucleicos no hibridados y después se detectan los marcadores unidos a los dobletes. Dichos marcadores se refieren a marcadores radiactivos, fluorescentes, biológicos o enzimáticos o marcadores de uso convencional en la materia. Se puede conjugar un marcador con las sondas oligonucleotídicas o con los ácidos nucleicos procedentes de la muestra biológica. Los expertos en la materia apreciarán que se pueden emplear etapas de lavado para eliminar el exceso de muestra/ácidos nucleicos diana o sonda oligonucleotídica (así como el conjugado no unido, cuando corresponda). Además, los formatos de ensayo heterogéneos convencionales son adecuados para detectar los híbridos mediante los marcadores presentes en los cebadores y sondas oligonucleotídicas.
Se proporciona un método para detectar Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaera de tipo 1 y BVAB2 en una muestra biológica, en donde el método comprende: poner en contacto la muestra biológica con una pluralidad de pares de cebadores, en donde la pluralidad de pares de cebadores comprende: cebadores capaces de hibridarse con los genes del ARNr 16S de L. crispatus y L. jensenii, en donde cada cebador consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a la SEQ ID NO: 14 o a la SEQ ID NO: 15; cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de BVAB2, en donde cada cebador consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a la SEQ ID NO: 4 o a la SEQ ID NO: 5; cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de Megasphaera de tipo 1, en donde cada cebador consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a la SEQ ID NO: 7 o a la SEQ ID NO: 8; cebadores capaces de hibridarse con el gen vly de G. vaginalis, en donde cada cebador consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10 a 12 o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10 a 12, y cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de Atopobium vaginae, en donde cada cebador consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a la SEQ ID NO: 1 o a la SEQ ID NO: 2; generar amplicones de las secuencias del ARNr 16S de Atopobium vaginae, BVAB2, Megasphaera de tipo 1, y/o L. crispatus y L. jensenii, y/o amplicones de la secuencia del gen vly de G. vaginalis de dicha muestra biológica, si dicha muestra comprende uno o más de Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaera de tipo 1 y BVAB2; y determinar la presencia o la cantidad de uno o más productos amplificados como indicación de la presencia de Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaera de tipo 1 y BVAB2 en dicha muestra biológica.
En algunas realizaciones, la pluralidad de pares de cebadores comprende un cebador que consiste en la secuencia
de SEQ ID NO: 1, un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 2, un cebador que consiste en la secuenci de SEQ ID NO: 4, un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 5, un cebador que consiste en la secuenci de SEQ ID NO: 7, un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 8, un cebador que consiste en la secuenci de SEQ ID NO: 10, un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 11, un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 12, un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 14 y un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 15.
En algunas realizaciones, determinar la presencia o la cantidad de uno o más productos amplificados comprende poner en contacto los productos amplificados con una pluralidad de sondas oligonucleotídicas, en donde cada una de la pluralidad de sondas oligonucleotídicas comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ
ID NO: 3, 6, 9, 13 y 16, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 6, 9, 13 y 16. Por ejemplo, cada sonda puede comprender, o consistir en, una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 6, 9, 13 y 16.
Como se describe en el presente documento, la amplificación se puede realizar mediante PCR en tiempo real, por ejemplo, PCR cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR). Los cebadores adecuados para utilizar en los métodos y composiciones descritos en el presente documento pueden comprender una secuencia de nucleótidos exógena que permite la manipulación posterior a la amplificación de los productos de amplificación sin un efecto significativo sobre la propia amplificación. En algunas realizaciones, el cebador puede estar flanqueado por secuencias complementarias que comprenden un fluoróforo en el extremo 5' y un inactivador de fluorescencia en el extremo 3'.
Las sondas oligonucleotídicas divulgadas en el presente documento pueden comprender una fracción emisora de fluorescencia y una fracción inactivadora de fluorescencia.
Los métodos divulgados en el presente documento son susceptibles de automatización, proporcionando así una opción de alto rendimiento para la detección y/o cuantificación de Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaera de tipo 1 y BVAB2 en una muestra. Se pueden utilizar varias plataformas de PCR múltiple, por ejemplo, BD MAX™, Viper™ o Viper™ LT, para realizar una o más etapas de los métodos divulgados. Los métodos se pueden realizar de forma múltiple. Por ejemplo, la amplificación y/o la detección de ácidos nucleicos, en algunas realizaciones, comprenden la realización de PCR múltiple.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan para demostrar situaciones y entornos particulares en los que se puede aplicar esta tecnología y no pretenden restringir el alcance de la invención y de las reivindicaciones incluidas en esta divulgación. En los siguientes ejemplos, la detección de la CVV y de la tricomoniasis solo se divulga con fines de referencia y las realizaciones correspondientes no pertenecen a la invención reivindicada.
Ejemplo 1
Detección de CVV, tricomoniasis y VB en muestras de hisopado vaginal
El estudio descrito en este ejemplo muestra la detección de especies de Candida asociadas con la CVV, la tricomoniasis y la VB mediante una prueba de diagnóstico in vitro cualitativa automatizada en muestras de hisopado vaginal. La prueba utiliza PCR en tiempo real para la amplificación de dianas de ADN y sondas de hibridación fluorogénica para la detección e identificación de organismos diana.
Se recogieron hisopos vaginales de mujeres con síntomas clínicos de vaginitis/vaginosis. Las muestras vaginales se caracterizaron mediante In Pouch™ TV para T. vaginalis mientras que el cultivo seguido de la identificación BD Phoenix™ se utilizó para especies de Candida y la puntuación de Nugent (Nugen et al., J. Clin. Microbiol. 29(2):297-301 (1991)), como método de referencia para la VB. Los criterios de Amsel (Amsel et al., Am. J. Med. 74(1):14-22 (1983)) se utilizaron solo en la determinación de los estados de la VB para muestras con puntuación de Nugent intermedia (puntuación de Nugent 4 a 6). Tres hisopos fueron para la prueba en el sistema BD MAX™ (Becton, Dickinson and Company, New Jersey) para la detección de tricomoniasis, especies de Candida asociadas con la CVV y de VB mediante un análisis de curva de rendimiento diagnóstico (ROC). El diagnóstico de la VB se determinó mediante un algoritmo basado en parámetros de PCR para la detección de bacterias relacionadas con la VB, incluidas las especies de Lactobacillus, G. vaginalis, Atopobium vaginae, BVAB-2 y Megasphaera-1.
La PCR en tiempo real para la amplificación de dianas de ADN se realizó con los cebadores proporcionados en la tabla 1 y se utilizaron las sondas de hibridación fluorogénica proporcionadas en la tabla 1 para detectar especies de Candida asociadas con la CVV, T. vaginalis y las bacterias relacionadas con la VB L. crispatus, L. jensenii, G. vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaera de tipo 1 y BVAB2 en cada una de las muestras de hisopado vaginal.
Se realizó un estudio de inclusión con cepas cultivables originarias de 12 países. El análisis del estudio de inclusión se basó en el estado positivo/negativo de cada diana individual de acuerdo con los umbrales de parámetros de PCR establecidos. Como se muestra en la tabla 2, el ensayo es capaz de detectar una gran diversidad de cepas
pertenecientes a especies implicadas en la CVV, la tricomoniasis y la VB. El nivel de detección de organismos específicos en mezclas demostró un elevado nivel de sensibilidad analítica, lo que indica que los médicos pueden obtener una identificación clara de los patógenos implicados en la infección vaginal y seleccionar el tratamiento con solo una muestra vaginal.
T l 2. E i in l i n
En estudios de infección conjunta simulada, se probó una carga baja de T. vaginalis o una carga baja de C. glabrata y C. krusei en presencia de cargas elevadas de C. albicans; y se probó una carga baja de T. vaginalis en presencia de una carga elevada de C. glabrata. Para cada estudio anterior, se utilizó una matriz simulada en lugar de la matriz vaginal debido a la presencia de algunas dianas en la flora vaginal de mujeres asintomáticas/sintomáticas. Los resultados de los estudios de infección conjunta simulada se muestran en la tabla 3.
Las muestras clínicas se definieron como muestra positiva/negativa para especies de Candida y T. vaginalis. Los resultados del estudio de rendimiento que se muestran en la tabla 4 demuestran que el grupo vaginal divulgado en el presente documento se puede utilizar para detectar T. vaginalis y especies de Cándida con elevada sensibilidad y especificidad.
T l 4. E i r n imi n r T. v. i n i
El rendimiento del ensayo para la detección de la VB se estableció mediante un análisis de curva de rendimiento diagnóstico (ROC). Con métricas de PCR a partir de la amplificación y la detección de especies de Lactobacillus, G. vaginalis, Atopobium vaginae, BVAB-2y Megasphaera-1, se construyó un algoritmo basado en un modelo de regresión logística para estimar la probabilidad positiva de la VB y dar una única identificación de VB positiva o negativa. Se consideró que los pacientes tenían VB si su probabilidad estimada superaba un umbral determinado por el análisis de la curva r Oc .
Como se muestra en la tabla 5, los resultados preliminares del rendimiento del ensayo (sensibilidad/especificidad) basados en el análisis de 771 muestras clínicas caracterizadas en total fueron del 91,9% (sensibilidad)/86,2 % (especificidad) o aumentaron al 95,4 (sensibilidad)/92,5 % (especificidad) cuando no se consideraron los resultados intermedios de la puntuación de Nugent y de los criterios de Amsel.
T l . E i r n imi n r l i n VB
continuación
Este ejemplo demuestra que las composiciones y los métodos divulgados en el presente documento se pueden utilizar para detectar organismos relacionados con la CVV, la TV y la VB con elevada especificidad y sensibilidad.
Ejemplo 2
Selección de cebadores y sondas para la detección múltiple de CVV, tricomoniasis y VB en muestras vaginales
Se han diseñado y probado varios cebadores y sondas para determinar su rendimiento en la amplificación y la detección de especies de Candida asociadas a CVV, T. vaginalis y VB de manera individual o de forma múltiple. Las tablas 6a y 6b proporcionan varios cebadores, pares de cebadores y sondas que no se seleccionaron debido a una serie de propiedades no deseadas, incluida una señal débil, falta de amplificación, gran tamaño de amplicón, señal de falso positivo, detección no específica, sensibilidad a la variación de temperatura, fallo en la detección de un gran número de cepas variantes, limitaciones en el ensayo múltiple, selectiva de cebadores/sondas asociados e interacción con otros cebadores/sondas. Sorprendentemente, como se describe en el ejemplo 1, se encontró que varios cebadores y sondas funcionan bien en la amplificación y la detección de especies de Candida asociadas a CVV, T. vaginalis y VB de manera individual o de forma múltiple. Las propiedades superiores de esos cebadores, sondas y algunas combinaciones de los mismos no se predijeron. Por otra parte, la capacidad de los oligonucleótidos de las SEQ ID NO: 1 a 16 para actuar de manera eficaz (es decir, amplificar y detectar de manera específica el ADN diana) en una reacción de PCR en tiempo real múltiple no se predijo. Asimismo, la capacidad de los oligonucleótidos de las SEQ ID NO: 17 a 29 para actuar de manera eficaz (es decir, amplificar y detectar de manera específica el ADN diana) en una reacción de PCR en tiempo real múltiple no se predijo.
T l . r n n l i n r l i n VB
T l . r n n l i n r l i n VV ri m ni i
(continuación)
(continuación)
continuación
En las tablas 7a y 7b se proporcionan una serie de mezclas maestras de cebadores y sondas que no se seleccionaron debido a una serie de propiedades no deseadas, incluida la señal de falso positivo y el fallo de detección de cepas variantes.
T l 7. M zl m r n l i n r l i n VB
continuación
continuación
continuación
(continuación)
Un experto en la materia reconocerá que, para este y otros procesos y métodos divulgados en el presente documento, las funciones realizadas en los procesos y métodos se pueden implementar en diferente orden. Asimismo, las etapas y operaciones descritas solo se proporcionan como ejemplos, y algunas de las etapas y operaciones pueden ser opcionales, combinarse en menos etapas y operaciones, o expandirse en etapas y operaciones adicionales sin restar valor a la esencia de las realizaciones divulgadas.
Con respecto al uso de sustancialmente cualquier término plural y/o singular en el presente documento, los expertos en la materia pueden traducir del plural al singular y/o del singular al plural según sea apropiado al contexto y/o la aplicación. Las diversas permutaciones singular/plural se pueden exponer expresamente en el presente documento por razones de claridad.
Los expertos en la materia entenderán que, en general, los términos utilizados en el presente documento, y especialmente en las reivindicaciones adjuntas (por ejemplo, los cuerpos de las reivindicaciones adjuntas) en general se tiene la intención de que sean términos "abiertos" (por ejemplo, la expresión "que incluye" se debería interpretar como "que incluye pero sin limitación", la expresión "que tiene" se debería interpretar como "que tiene al menos", la expresión "que incluye" se debería interpretar como "que incluye pero sin limitación", etc.). Los expertos en la materia entenderán además que si se tiene la intención de un número específico de una mención de reivindicación introducida,
Claims (14)
1. Un método para detectar Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaera de tipo 1 y BVAB2, que comprende:
poner en contacto una muestra biológica con una pluralidad de pares de cebadores, en donde
la pluralidad de pares de cebadores comprende:
al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con los genes del ARNr 16S de Lactobacillus crispatus y Lactobacillus jensenii, en donde cada cebador en dicho al menos un par de cebadores consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a la SEQ ID NO: 14 o a la SEQ ID NO: 15,
al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de BVAB2, en donde cada cebador en dicho al menos un par de cebadores consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a la SEQ ID NO: 4 o a la SEQ ID NO: 5, al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de Megasphaera de tipo 1, en donde cada cebador en dicho al menos un par de cebadores consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a la SEQ ID NO: 7 o a la SEQ ID NO: 8,
al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen vly de Gardnerella vaginalis, en donde cada cebador en dicho al menos un par de cebadores consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10 a 12 o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10 a 12, y
al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de Atopobium vaginae, en donde cada cebador en dicho al menos un par de cebadores consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a la SEQ ID NO: 1 o a la SEQ ID NO: 2;
generar amplicones de las secuencias del ARNr 16S de Atopobium vaginae, BVAB2, Megasphaera de tipo 1, y/o Lactobacillus crispatus y Lactobacillus jensenii, y/o amplicones de la secuencia del gen vly de Gardnerella vaginalis de dicha muestra biológica, si dicha muestra comprende uno o más de Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaera de tipo 1 y BVAB2; y
determinar la presencia o la cantidad de uno o más productos amplificados como indicación de la presencia de uno o más de Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaera de tipo 1 y BVAB2 en dicha muestra biológica.
2. El método de la reivindicación 1, en donde
el par de cebadores capaces de hibridarse con los genes del ARNr 16S de Lactobacillus crispatus y Lactobacillus jensenii consisten en las secuencias de SEQ ID NO: 14 y 15, respectivamente;
el par de cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de BVAB2 consisten en las secuencias de SEQ ID NO: 4 y 5, respectivamente;
el par de cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de Megasphaera de tipo 1 consisten en las secuencias de SEQ ID NO: 7 y 8, respectivamente;
el par de cebadores capaces de hibridarse con el gen vly de Gardnerella vaginalis consisten en las secuencias de:
a) SEQ ID NO: 10 y 12, respectivamente o
b) SEQ ID NO: 11 y 12, respectivamente;
y el par de cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de Atopobium vaginae consisten en las secuencias de SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente.
3. El método de una cualquiera de la reivindicación 2, en donde determinar la presencia o la cantidad de uno o más productos amplificados comprende poner en contacto los productos amplificados con una pluralidad de sondas oligonucleotídicas, en donde cada una de la pluralidad de sondas oligonucleotídicas comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 6, 9, 13 y 16, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 6, 9, 13 y 16.
4. Una composición para la detección de Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaera de tipo 1 y BVAB2, que comprende:
al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con los genes del ARNr 16S de Lactobacillus crispatus y Lactobacillus jensenii, en donde cada cebador en dicho al menos un par de cebadores consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a la SEQ ID NO: 14 o a la SEQ ID NO: 15,
al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de BVAB2, en donde cada cebador
en dicho al menos un par de cebadores consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a la SEQ ID NO: 4 o a la SEQ ID NO: 5, al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de Megasphaera de tipo 1, en donde cada cebador en dicho al menos un par de cebadores consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a la SEQ ID NO: 7 o a la SEQ ID NO: 8,
al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen vly de Gardnerella vaginalis, en donde cada cebador en dicho al menos un par de cebadores consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10 a 12 o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10 a 12, y
al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de Atopobium vaginae, en donde cada cebador en dicho al menos un par de cebadores consiste en una secuencia de s Eq ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a la SEQ ID NO: 1 o a la SEQ ID NO: 2.
5. La composición de la reivindicación 4, en donde
el al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con los genes del ARNr 16S de Lactobacillus crispatus y Lactobacillus jensenii comprende un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 14 y un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 15;
el al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de BVAB2a comprende un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 4 y un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 5;
el al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de Megasphaera de tipo 1 comprende un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 7 y un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 8;
el al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen vly de Gardnerella vaginalis comprende: (a) un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 10 y un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 12, o (b) un cebador que consiste en la secuencia de s Eq ID NO: 11 y un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 12; y
el al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen del ARNr 16S de Atopobium vaginae comprende un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 1 y un cebador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 2.
6. La composición de la reivindicación 5, que comprende además una pluralidad de sondas oligonucleotídicas, comprendiendo cada una de la pluralidad de sondas oligonucleotídicas una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 6, 9, 13 y 16, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 6, 9, 13 y 16.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha muestra biológica es una muestra clínica o en donde dicha muestra biológica se recoge de la uretra, pene, ano, garganta, cuello uterino o vagina.
8. El método de la reivindicación 3, en donde determinar la presencia o la cantidad de uno o más productos amplificados comprende poner en contacto los productos amplificados con una pluralidad de sondas oligonucleotídicas, consistiendo cada una en una secuencia de SEQ Id NO: 3, 6, 9, 13 o 16, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 6, 9, 13 y 16.
9. El método de la reivindicación 3 u 8, en donde determinar la presencia o la cantidad de uno o más productos amplificados comprende poner en contacto los productos amplificados con cinco sondas oligonucleotídicas, consistiendo cada una en las secuencias de SEQ ID NO: 3, 6, 9, 13 y 16, respectivamente.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 7 a 9, en donde cada cebador está flanqueado por secuencias complementarias que comprenden un fluoróforo en el extremo 5' y un inactivador de fluorescencia en el extremo 3'.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3 y 8 a 9, en donde al menos una de la pluralidad de sondas oligonucleotídicas comprende una fracción emisora de fluorescencia y una fracción inactivadora de fluorescencia.
12. La composición de la reivindicación 6, consistiendo cada una de la pluralidad de sondas oligonucleotídicas en las secuencias de SEQ ID NO: 3, 6, 9, 13 y 16, respectivamente.
13. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 y 12, en donde al menos una de la pluralidad de sondas comprende una fracción emisora de fluorescencia y una fracción inactivadora de fluorescencia.
14. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 y 12 a 13, que comprende además una ADN polimerasa, cationes bivalentes, iones potasio de catión monovalente o una combinación de los mismos.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201562152754P | 2015-04-24 | 2015-04-24 | |
| US201662279220P | 2016-01-15 | 2016-01-15 | |
| PCT/US2016/028433 WO2016172204A1 (en) | 2015-04-24 | 2016-04-20 | Multiplex detection of vulvovaginal candidiasis, trichomoniasis and bacterial vaginosis |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2939810T3 true ES2939810T3 (es) | 2023-04-27 |
Family
ID=57144192
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES16783760T Active ES2939810T3 (es) | 2015-04-24 | 2016-04-20 | Detección múltiple de la vaginosis bacteriana |
| ES22200785T Active ES2985997T3 (es) | 2015-04-24 | 2016-04-20 | Detección múltiple de la candidiasis vulvovaginal, la tricomoniasis y la vaginosis bacteriana |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES22200785T Active ES2985997T3 (es) | 2015-04-24 | 2016-04-20 | Detección múltiple de la candidiasis vulvovaginal, la tricomoniasis y la vaginosis bacteriana |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US11098376B2 (es) |
| EP (3) | EP4166678B1 (es) |
| KR (2) | KR102786859B1 (es) |
| AU (4) | AU2016252551B2 (es) |
| CA (2) | CA2982467C (es) |
| DK (2) | DK4166678T3 (es) |
| ES (2) | ES2939810T3 (es) |
| WO (1) | WO2016172204A1 (es) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102786859B1 (ko) * | 2015-04-24 | 2025-03-26 | 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 | 외음질 칸디다증, 질편모충증 및 세균성 질염의 복합 검출 방법 |
| CN108779499B (zh) * | 2016-01-04 | 2023-08-11 | 简·探针公司 | 用于检测念珠菌属物种的方法和组合物 |
| CN106701944A (zh) * | 2016-12-28 | 2017-05-24 | 上海市东方医院 | 一种用于检测光滑假丝酵母菌lamp引物组合物及其lamp检测试剂盒和使用方法 |
| CN106521010A (zh) * | 2016-12-28 | 2017-03-22 | 上海速创诊断产品有限公司 | 一种用于检测近平滑假丝酵母菌的lamp引物组合物及其lamp检测试剂盒和使用方法 |
| US20200237738A1 (en) | 2017-10-24 | 2020-07-30 | Md Biolab Co., Ltd. | Pharmaceutcal composition for preventing or treating cancer, containing streptonigrin and rapamycin as active ingredients |
| RU2670206C1 (ru) * | 2017-12-26 | 2018-10-19 | Общество с ограниченной ответственностью "НекстБио" | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Atopobium vaginae в слизистой оболочке влагалища |
| RU2670207C1 (ru) * | 2017-12-26 | 2018-10-19 | ООО "НекстБио" | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК Gardnerella vaginalis в слизистой оболочке влагалища |
| EP3794518A1 (en) | 2018-05-16 | 2021-03-24 | Catalog Technologies, Inc. | Printer-finisher system for data storage in dna |
| KR102937202B1 (ko) * | 2018-08-24 | 2026-03-11 | 젠-프로브 인코포레이티드 | 세균성 핵산을 검출하고 세균성 질염을 진단하기 위한 조성물 및 방법 |
| RU2702237C1 (ru) * | 2018-11-29 | 2019-10-07 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта" | Способ приготовления препарата отделяемого слизистой влагалища для оценки микробиоценоза |
| CN109487000B (zh) * | 2018-12-29 | 2021-09-24 | 博奥生物集团有限公司 | 引物组合及其应用 |
| AU2020299621B2 (en) * | 2019-07-03 | 2025-10-30 | Gen-Probe Incorporated | Oligonucleotides for use in determining the presence of Trichomonas vaginalis in a sample. |
| US20220205020A1 (en) * | 2020-12-30 | 2022-06-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of bacteria and fungi associated with bacterial and candida vaginosis |
| US20220290221A1 (en) * | 2021-03-15 | 2022-09-15 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detecting severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2) variants having spike protein mutations |
| WO2023225362A1 (en) * | 2022-05-19 | 2023-11-23 | Cepheid | Mvp cartridge and methods of use and manufacture |
| US20240195429A1 (en) | 2022-12-13 | 2024-06-13 | Lx Semicon Co., Ltd. | Analog-to-digital converter and semiconductor device having the same |
| CN116042902B (zh) * | 2023-01-30 | 2025-07-25 | 上海仁度生物科技股份有限公司 | 一种同时检测六种念珠菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针 |
| JP2026507014A (ja) * | 2023-02-25 | 2026-02-27 | エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | カンジダ種検出のための組成物および方法 |
| CN117106938B (zh) * | 2023-08-31 | 2024-05-28 | 苏州创澜生物科技有限公司 | 一种用于检测阴道炎病原体的试剂、试剂盒及应用 |
Family Cites Families (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3649454A (en) | 1969-01-18 | 1972-03-14 | Takeda Chemical Industries Ltd | Bacteriolytic enzyme and process for the production thereof |
| US3716452A (en) | 1970-09-17 | 1973-02-13 | Kirin Brewery | Lysis of yeast cell walls |
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4800159A (en) | 1986-02-07 | 1989-01-24 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences |
| US5849478A (en) | 1986-08-14 | 1998-12-15 | Cashman; Daniel P. | Blocked-polymerase polynucleotide immunoassay method and kit |
| AU622426B2 (en) | 1987-12-11 | 1992-04-09 | Abbott Laboratories | Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization |
| US4988617A (en) | 1988-03-25 | 1991-01-29 | California Institute Of Technology | Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids |
| US5130238A (en) | 1988-06-24 | 1992-07-14 | Cangene Corporation | Enhanced nucleic acid amplification process |
| CA2020958C (en) | 1989-07-11 | 2005-01-11 | Daniel L. Kacian | Nucleic acid sequence amplification methods |
| US5427930A (en) | 1990-01-26 | 1995-06-27 | Abbott Laboratories | Amplification of target nucleic acids using gap filling ligase chain reaction |
| US5455166A (en) | 1991-01-31 | 1995-10-03 | Becton, Dickinson And Company | Strand displacement amplification |
| US5185242A (en) | 1991-06-24 | 1993-02-09 | Becton Dickinson And Company | Method for lysing mycobacteria using achromopeptidase |
| US5422252A (en) | 1993-06-04 | 1995-06-06 | Becton, Dickinson And Company | Simultaneous amplification of multiple targets |
| US6090592A (en) | 1994-08-03 | 2000-07-18 | Mosaic Technologies, Inc. | Method for performing amplification of nucleic acid on supports |
| US5854033A (en) | 1995-11-21 | 1998-12-29 | Yale University | Rolling circle replication reporter systems |
| US6117635A (en) | 1996-07-16 | 2000-09-12 | Intergen Company | Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon |
| US20100267012A1 (en) | 1997-11-04 | 2010-10-21 | Bergeron Michel G | Highly conserved genes and their use to generate probes and primers for detection of microorganisms |
| US20030049636A1 (en) | 1999-05-03 | 2003-03-13 | Bergeron Michel G. | Species-specific, genus-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial and fungal pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for diagnosis in microbiology laboratories |
| US5866366A (en) | 1997-07-01 | 1999-02-02 | Smithkline Beecham Corporation | gidB |
| US6117986A (en) | 1998-06-10 | 2000-09-12 | Intergen Company, L.P. | Pyrimidines linked to a quencher |
| US6410278B1 (en) | 1998-11-09 | 2002-06-25 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Process for synthesizing nucleic acid |
| AU2002354838B2 (en) | 2001-07-19 | 2007-11-29 | Infectio Diagnostic (I.D.I.) Inc. | Universal method and composition for the rapid lysis of cells for the release of nucleic acids and their detection |
| US6977148B2 (en) | 2001-10-15 | 2005-12-20 | Qiagen Gmbh | Multiple displacement amplification |
| US7625704B2 (en) * | 2005-08-31 | 2009-12-01 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Methods and compositions for identifying bacteria associated with bacteria vaginosis |
| FR2909099B1 (fr) * | 2006-11-24 | 2012-10-19 | Univ Aix Marseille Ii | Methode de diagnostic et de suivi d'une vaginose bacterienne par quantification moleculaire. |
| US8324372B2 (en) | 2007-07-13 | 2012-12-04 | Handylab, Inc. | Polynucleotide capture materials, and methods of using same |
| US20100009351A1 (en) | 2008-07-11 | 2010-01-14 | Handylab, Inc. | Polynucleotide Capture Materials, and Method of Using Same |
| US8945842B2 (en) * | 2009-01-14 | 2015-02-03 | Becton, Dickinson And Company | Assay for Trichomonas vaginalis by amplification and detection of Trichomonas vaginalis AP65-1 gene |
| WO2011103274A1 (en) | 2010-02-17 | 2011-08-25 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and methods to detect atopobium vaginae nucleic acid |
| CN103282511A (zh) * | 2010-11-01 | 2013-09-04 | 贝克顿·迪金森公司 | 阴道加特纳菌测定 |
| AU2012249751B2 (en) | 2011-04-25 | 2016-11-03 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and methods for detecting BV-associated bacterial nucleic acid |
| AU2012304327B2 (en) | 2011-09-08 | 2015-07-09 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and methods for detecting BV-associated bacterial nucleic acid |
| US9970060B2 (en) | 2011-11-23 | 2018-05-15 | Medical Diagnostic Laboratories, Llc | Quantitation and profiling of vaginal microflora |
| CA2806382C (en) | 2012-02-20 | 2021-11-23 | Laboratory Corporation Of America Holdings | Diagnostic methods and markers for bacterial vaginosis |
| KR102786859B1 (ko) * | 2015-04-24 | 2025-03-26 | 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 | 외음질 칸디다증, 질편모충증 및 세균성 질염의 복합 검출 방법 |
-
2016
- 2016-04-20 KR KR1020237026463A patent/KR102786859B1/ko active Active
- 2016-04-20 DK DK22200785.8T patent/DK4166678T3/da active
- 2016-04-20 CA CA2982467A patent/CA2982467C/en active Active
- 2016-04-20 DK DK16783760.8T patent/DK3286323T3/da active
- 2016-04-20 KR KR1020177032958A patent/KR102565860B1/ko active Active
- 2016-04-20 WO PCT/US2016/028433 patent/WO2016172204A1/en not_active Ceased
- 2016-04-20 ES ES16783760T patent/ES2939810T3/es active Active
- 2016-04-20 EP EP22200785.8A patent/EP4166678B1/en active Active
- 2016-04-20 EP EP16783760.8A patent/EP3286323B1/en active Active
- 2016-04-20 ES ES22200785T patent/ES2985997T3/es active Active
- 2016-04-20 CA CA3224392A patent/CA3224392A1/en active Pending
- 2016-04-20 AU AU2016252551A patent/AU2016252551B2/en active Active
- 2016-04-20 US US15/567,051 patent/US11098376B2/en active Active
- 2016-04-20 EP EP24174382.2A patent/EP4435119A3/en active Pending
-
2020
- 2020-07-16 AU AU2020205314A patent/AU2020205314C1/en active Active
-
2021
- 2021-07-08 US US17/370,923 patent/US12037649B2/en active Active
- 2021-12-13 AU AU2021286250A patent/AU2021286250B2/en active Active
-
2023
- 2023-03-15 AU AU2023201615A patent/AU2023201615B2/en active Active
-
2024
- 2024-05-23 US US18/673,186 patent/US20240368709A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US12037649B2 (en) | Multiplex detection of vulvovaginal candidiasis, trichomoniasis and bacterial vaginosis | |
| KR20230097143A (ko) | 박테리아 호흡기 병원체의 멀티플렉스 검출 | |
| US10752962B2 (en) | Detection of Neisseria gonorrhoeaes | |
| KR20230097079A (ko) | 비브리오 파라헤몰리티쿠스의 신속 확인 및 형결정 | |
| CN102007222A (zh) | 用于检测耐药微生物的方法 | |
| BR112017022379B1 (pt) | Método e composição para detectar bactérias relacionadas à vaginose bacteriana | |
| KR20230097044A (ko) | 비브리오 콜레라에의 멀티플렉스 검출 및 형결정 |