ES2985997T3 - Detección múltiple de la candidiasis vulvovaginal, la tricomoniasis y la vaginosis bacteriana - Google Patents

Detección múltiple de la candidiasis vulvovaginal, la tricomoniasis y la vaginosis bacteriana Download PDF

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Abstract

En el presente documento se describen métodos y composiciones para la detección de candidiasis vulvovaginal (WC), tricomoniasis y vaginosis bacteriana (BV). En algunas realizaciones, la presencia o ausencia de Candida asociada a WC, Trichomonoas valginalis y una pluralidad de bacterias relacionadas con BV en una muestra se determina utilizando métodos de prueba basados en ácidos nucleicos multiplex. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Detección múltiple de la candidiasis vulvovaginal, la tricomoniasis y la vaginosis bacteriana
Listado de secuencias
La presente solicitud se presenta junto con un listado de secuencias en formato electrónico. El listado de secuencias se proporciona como un archivo titulado SEQLISTING_GENOM.143WO.TXT, creado el 20 de abril de 2016, que tiene un tamaño de 36 Kb.
Antecedentes
Campo
La presente divulgación se refiere a métodos y composiciones para la detección de trastornos vaginales, por ejemplo, candidosis vulvovaginal (CVV), tricomoniasis y vaginosis bacteriana (VB). De manera más específica, la presente divulgación se refiere a la detección de especies deCandidaasociadas a la CVV, deTrichomonas vaginalis (T. vaginalis)y de una pluralidad de bacterias relacionadas con la VB en ejemplos biológicos, tales como muestras de hisopos vaginales de mujeres con síntomas clínicos de vaginitis y/o vaginosis, mediante métodos de prueba basados en ácidos nucleicos.
Descripción de la técnica relacionada
Candidaes un género de levadura y es la causa más común de infecciones fúngicas en todo el mundo. Muchas especies deCandidase encuentran como un comensal inofensivo, forman parte de la flora normal de un hospedador y pueden ser endosimbiontes de hospedadores, incluidos los seres humanos. Sin embargo, en el caso de un desequilibrio o de un hospedador inmunodeprimido, se sabe queCandidainvade y provoca enfermedades. Se sabe que algunas especies deCandida,tales comoC. albicans, C. dubliniensis, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei,yC. glabrata,están asociadas con la candidosis vulvovaginal (CVV).Trichomonas vaginalises parásito protozoario anaerobio flagelado, que es el microorganismo causal de la tricomoniasis. La vaginosis bacteriana (VB) es una infección de la vagina provocada por una alteración del equilibrio normal de las bacterias en la vagina.
Hasta la fecha, las pruebas convencionales para diagnosticar la CVV, la tricomoniasis y la VB se basan en múltiples métodos subjetivos que son métodos interpretativos. En general, estas pruebas implican el examen microscópico de la preparación en húmedo de muestras de pacientes (por ejemplo, flujo vaginal), incluida la observación de hifas fúngicas o levaduras en ciernes para la<c>V<v>y la observación de tricomonas móviles para la tricomoniasis. La puntuación de Nugent y los criterios de Amsel son las pruebas más utilizadas para diagnosticar la VB. La puntuación de Nugent es un sistema de puntuación de tinción de Gram que se calcula mediante la evaluación de la presencia de bacilos grampositivos grandes (morfotipos deLactobacillus),bacilos gramvariables pequeños (morfotipos deGardnerella vaginalis)y bacilos gramvariables curvos (morfotipos deMobiluncusspp.). Los criterios de Amsel requieren que al menos tres de los cuatro criterios siguientes estén presentes para un diagnóstico confirmado: (1) flujo escaso, blanco, amarillo y homogéneo, (2) células clave de la vaginosis en la microscopía, (3) pH del líquido vaginal >4,5 y (4) liberación de un olor a pescado al añadir una solución alcalina de hidróxido de potasio (KOH) al 10 %. Estas pruebas convencionales pueden ser costosas, laboriosas y lentas, por ejemplo,Candidadebe cultivarse durante 48 horas en medios cromogénicos o hasta 7 días en medios menos selectivos antes de que se pueda hacer un diagnóstico. Mahmoudi Radet al.(Infectious diseases in obstetrics and gynecology 2012) divulga una PCR múltiple para detectar la candidiasis vulvovaginal dirigiéndose al ADNr 18S y al ADNr 28S de diferentes especies deCandida.El documento WO 2010/083274 enseña un cebador para detectar una región del gen AP65-1 deTrichomonas vaginalis.
Sin embargo, aún existe la necesidad de desarrollar métodos más eficaces y rápidos para detectar la candidosis vulvovaginal, la tricomoniasis y la vaginosis bacteriana, por ejemplo, un método que permita la detección de los tres trastornos vaginales en un solo ensayo, con el fin de ofrecer tratamientos adecuados a los pacientes.
Sumario
La presente invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas. La invención se refiere a un método para detectar especies deCandidaasociadas a la candidiasis vulvovaginal (CVV) yTrichomonas vaginalisen una muestra biológica, en donde las especies deCandidaasociadas a la CVV comprendenCandida glabrata, Candida albicans, Candida tropicalis, C. dubliniensis, C. parapsilosis, Candida krusei,que comprenden:
poner en contacto dicha muestra biológica con una pluralidad de pares de cebadores, en donde la pluralidad de pares de cebadores comprende:
al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen tef1 deCandida glabrata,en donde cada cebador de dicho al menos un par de cebadores comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21 o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21,
una pluralidad de cebadores capaces de hibridarse con el gen tef1 de al menos una de las especiesCandida albicans, Candida tropicalis, C. dubliniensisyC. parapsilosis,en donde cada cebador de dicho al menos un par de cebadores comprende una secuencia de la S<e>Q ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a la SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25;
al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen te fl deCandida krusei,en donde cada cebador de dicho al menos un par de cebadores comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 28, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a la SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 28; y
al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen AP-65 deTrichomonas vaginalis,en donde cada cebador de dicho al menos un par de cebadores comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a la SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18; y
generar amplicones de las secuencias de tef1 de las especies deCandiday/o amplicones de la secuencia del gen AP-65 deTrichomonas vaginalisa partir de dicha muestra biológica, si dicha muestra comprende una o más de las especies deCandidaasociadas al CVV y/oTrichomonas vaginalis;
determinar la presencia o la cantidad de uno o más productos amplificados como indicación de la presencia de especies deCandidaasociadas al CVV yde Trichomonas vaginalisen dicha muestra biológica.
La presente invención también se refiere a una composición para la detección de especies deCandidaasociadas a la candidiasis vulvovaginal (CVV) yTrichomonas vaginalis,en donde las especies deCandidaasociadas a la CVV comprendenCandida glabrata, Candida albicans, Candida tropicalis, C. dubliniensis, C. parapsilosis, Candida krusei,que comprende:
al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen tef1 deCandida glabrata,en donde cada cebador de dicho al menos un par de cebadores comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21 o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21;
una pluralidad de cebadores capaces de hibridarse con el gen tef1 de al menos una de las especiesCandida albicans,Candida tropicalis,C. dubliniensisyC. parapsilosis, en donde cada cebador de dicho al menos un par de cebadores comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a la SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25;
al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen tef1 deCandida krusei,en donde cada cebador de dicho al menos un par de cebadores comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 28, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a la SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 28; y
al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen AP-65 deTrichomonas vaginalis,en donde cada cebador de dicho al menos un par de cebadores comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a la SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18.
La presente invención se refiere además a una mezcla de reacción que comprende la composición de la presente invención, en donde la mezcla de reacción comprende además ADN molde, ADN polimerasa, desoxinucleótidos (dNTP), solución de tampón, cationes bivalentes, cationes monovalentes o cualquier combinación de los mismos.
Descripción detallada
Los títulos de las secciones que se utilizan en el presente documento solo tienen una finalidad organizativa y no deben interpretarse como limitantes de la materia descrita. En el caso de que uno o más de los materiales bibliográficos y similares citados definan o utilicen un término de tal manera que contradiga la definición de ese término en esta solicitud, la presente solicitud será la determinante. Aunque las presentes enseñanzas se describen junto con diversas realizaciones, no se pretende que las presentes enseñanzas estén limitadas a dichas realizaciones. Por el contrario, las presentes enseñanzas abarcan varias alternativas, modificaciones y equivalentes, como apreciarán los expertos en la materia.
En el presente documento se proporcionan métodos y composiciones para la detección de la candidiasis vulvovaginal (CVV) y la tricomoniasis. Por ejemplo, se dispone de cebadores y sondas que pueden unirse a genes específicos de especies deCandidaasociadas a la CVV yTrichomonas vaginalis (T. vaginalis)para determinar la presencia o ausencia de las especies de Candida asociadas a la CVV yT. vaginalisen una muestra, tal como una muestra biológica. En algunas realizaciones, puede llevarse a cabo una amplificación múltiple del ácido nucleico para permitir la detección de las especies deCandidayT. vaginalisasociadas a la CVV en un único ensayo.
Definiciones
Como se utiliza en el presente documento, un "ácido nucleico" se refiere a un compuesto polimérico que comprende nucleósidos o análogos de nucleósidos que tienen bases heterocíclicas nitrogenadas, o análogos de bases, unidas entre sí por enlaces de la cadena principal del ácido nucleico (por ejemplo, enlaces fosfodiéster) para formar un polinucleótido. Los ejemplos no limitantes de ácido nucleico incluyen ARN, ADN y análogos de los mismos. La cadena principal del ácido nucleico puede incluir una variedad de enlaces, por ejemplo, uno o más de los enlaces azúcarfosfodiéster, enlaces péptido-ácido nucleico, enlaces fosforotioato o metilfosfonato o mezclas de dichos enlaces en un único oligonucleótido. Las fracciones de azúcar en el ácido nucleico pueden ser ribosa o desoxirribosa, o compuestos similares con sustituciones conocidas. Se incluyen en el término ácido nucleico las bases nitrogenadas convencionales (por ejemplo, A, G, C, T y U), los análogos de bases conocidas (por ejemplo, inosina), los derivados de bases de purina o pirimidina y los restos "abásicos" (es decir, sin base nitrogenada para una o más posiciones de la cadena principal). Es decir, un ácido nucleico puede incluir solo azúcares convencionales, bases y enlaces que se encuentran en el ARN y el ADN, o incluyen componentes y sustituciones convencionales (por ejemplo, bases y análogos convencionales unidos a través de una cadena principal de metoxi, o bases convencionales y uno o más análogos de bases unidos a través de una cadena principal de ARN o ADN).
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "ácidos nucleicos aislados" se refiere a la purificación de ácidos nucleicos a partir de uno o más componentes celulares. Un experto en la materia apreciará que las muestras procesadas para "aislar los ácidos nucleicos" de las mismas pueden incluir componentes e impurezas distintas de los ácidos nucleicos. Las muestras que comprenden ácidos nucleicos aislados se pueden preparar a partir de muestras utilizando cualquier método aceptable conocido en la materia. Por ejemplo, las células se pueden lisar mediante agentes de lisis conocidos, y los ácidos nucleicos se pueden purificar total o parcialmente a partir de otros componentes celulares. Los reactivos y protocolos adecuados para las extracciones de ADN y ARN se pueden encontrar en, por ejemplo, las publicaciones de solicitudes de patente de Estados Unidos n.° US 2010-0009351 y US 2009-0131650, respectivamente. En las pruebas de ácidos nucleicos (por ejemplo, los métodos de amplificación e hibridación que se analizan con más detalle a continuación), la solución de ácido nucleico extraída se puede añadir directamente a un reactivo (por ejemplo, ya sea en líquido, unido a un sustrato, en forma liofilizada, o similar, como se analiza con más detalle a continuación), necesario para realizar una prueba de acuerdo con las realizaciones divulgadas en el presente documento.
Como se utiliza en el presente documento, "plantilla" se refiere a todo o parte de un polinucleótido que contiene al menos una secuencia de nucleótidos diana.
Como se utiliza en el presente documento, un "cebador" se refiere a un polinucleótido que puede servir para iniciar una reacción de extensión de la cadena del ácido nucleico. La longitud de un cebador puede variar, por ejemplo, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 nucleótidos, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleótidos, de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 nucleótidos o de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 nucleótidos. La longitud de un cebador puede ser de aproximadamente 10 nucleótidos, aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 25 nucleótidos, aproximadamente 30 nucleótidos, aproximadamente 35 nucleótidos, aproximadamente 40 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 75 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos o un intervalo entre dos cualesquiera de estos valores. En algunas realizaciones, el cebador tiene una longitud de 10 a aproximadamente 50 nucleótidos, es decir, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 2526, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 o más nucleótidos. En algunas realizaciones, el cebador tiene una longitud de 18 a 32 nucleótidos.
Como se utiliza en el presente documento, una "sonda" se refiere a un polinucleótido que puede hibridarse (por ejemplo, de manera específica) con una secuencia diana en un ácido nucleico, en condiciones que permitan la hibridación, permitiendo así la detección de la secuencia diana o del ácido nucleico amplificado. En general, la "diana" de una sonda se refiere a una secuencia dentro o un subconjunto de una secuencia de ácido nucleico amplificada que se hibrida de manera específica con al menos una parte de un oligómero de sonda mediante enlaces de hidrógeno convencionales (es decir, emparejamiento de bases). Una sonda puede comprender secuencias específicas de diana y otras secuencias que contribuyen a la conformación tridimensional de la sonda. Las secuencias son "suficientemente complementarias" si permiten una hibridación estable en condiciones de hibridación adecuadas de un oligómero de sonda con una secuencia diana que no es completamente complementaria a la secuencia específica de diana de la sonda. La longitud de una sonda puede variar, por ejemplo, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 nucleótidos, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleótidos, de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 nucleótidos o de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 nucleótidos. La longitud de una sonda puede ser de aproximadamente 10 nucleótidos, aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 25 nucleótidos, aproximadamente 30 nucleótidos, aproximadamente 35 nucleótidos, aproximadamente 40 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos o un intervalo entre dos cualesquiera de estos valores. En algunas realizaciones, la sonda tiene una longitud de 10 a aproximadamente 50 nucleótidos. Por ejemplo, los cebadores y/o las sondas pueden tener al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 o más nucleótidos. En algunas realizaciones, la sonda puede ser no específica de secuencia.
Preferentemente, los cebadores y/o las sondas pueden tener entre 8 y 45 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, los cebadores y/o sondas pueden tener al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 o más nucleótidos de longitud. El cebador y la sonda se pueden modificar para que contengan nucleótidos adicionales en el extremo 5' o 3', o en ambos. Un experto en la materia apreciará que las bases adicionales al extremo 3' de los cebadores de amplificación (no necesariamente las sondas) son generalmente complementarias a la secuencia molde. Las secuencias del cebador y de la sonda también se pueden modificar para eliminar los nucleótidos en el extremo 5' o 3'. Un experto en la materia apreciará que para que funcionen para la amplificación, los cebadores o las sondas tendrán una longitud mínima y una temperatura de hibridación como las divulgadas en el presente documento.
Los cebadores y las sondas pueden unirse a sus dianas a una temperatura de hibridación que es una temperatura menor que la temperatura de fusión (T<f>). Como se utiliza en el presente documento, "T<f>" y "temperatura de fusión" son términos intercambiables que se refieren a la temperatura a la que el 50 % de una población de moléculas polinucleotídicas bicatenarias se disocia en cadenas sencillas. Las fórmulas para calcular la T<f>de los polinucleótidos son bien conocidas en la materia. Por ejemplo, la T<f>puede calcularse mediante la siguiente ecuación: T<f>= 69,3 0,41 x (G C)% - 6 - 50/L, donde L es la longitud de la sonda en nucleótidos. La T<f>de un polinucleótido híbrido también se puede estimar mediante una fórmula adoptada de ensayos de hibridación en sal 1 M y normalmente utilizada para calcular la T<f>para cebadores de PCR: [(número de A T) x 2 °C (número de G C) x 4 °C]. Véase, por ejemplo, C. R. Newtonet al.PCR, 2.a ed., Springer-Verlag (Nueva York: 1997), pág. 24. Existen en la materia otros cálculos más sofisticados, que tienen en cuenta las características estructurales y de secuencia para el cálculo de la T<f>. La temperatura de fusión de un oligonucleótido puede depender de la complementariedad entre el cebador o la sonda oligonucleotídica y la secuencia de unión, y de las condiciones de la sal. En algunas realizaciones, una sonda o cebador oligonucleotídico proporcionado en el presente documento tiene una T<f>inferior a aproximadamente 90 °C en tampón KCl 50 mM y Tris-HCl 10 mM, por ejemplo, aproximadamente 89 °C, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 8079, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39 °C o inferior, incluidos los intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
En algunas realizaciones, los cebadores divulgados en el presente documento, por ejemplo, los cebadores de amplificación, se pueden proporcionar como un par de cebadores de amplificación, por ejemplo, que comprende un cebador directo y un cebador inverso (primer cebador de amplificación y segundo cebador de amplificación). Preferentemente, los cebadores directo e inverso tienen unas T<f>que no difieren en más de 10 °C, por ejemplo,que difieren en menos de 10 °C, en menos de 9 °C, en menos de 8 °C, en menos de 7 °C, en menos de 6 °C, en menos de 5 °C, en menos de 4 °C, en menos de 3 °C, en menos de 2 °C o en menos de 1 °C.
Las secuencias del cebador y de la sonda pueden modificarse mediante sustituciones de nucleótidos (con respecto a la secuencia diana) dentro de la secuencia oligonucleotídica, siempre que el oligonucleótido contenga suficiente complementariedad para hibridarse de manera específica con la secuencia de ácido nucleico diana. De este modo, se pueden sustituir al menos 1, 2, 3, 4 o hasta aproximadamente 5 nucleótidos. Como se utiliza en el presente documento, el término "complementario" se refiere a la complementariedad de secuencias entre regiones de dos cadenas polinucleotídicas o entre dos regiones de la misma cadena polinucleotídica. Una primera región de un polinucleótido es complementaria a una segunda región del mismo polinucleótido o de uno diferente si, cuando las dos regiones están dispuestas en forma antiparalela, al menos un nucleótido de la primera región es capaz de emparejarse con una base de la segunda región. Por lo tanto, no se necesita que dos polinucleótidos complementarios se emparejen en cada posición nucleotídica. "Totalmente complementario" se refiere a un primer polinucleótido que es 100% o "totalmente" complementario a un segundo polinucleótido y, por lo tanto, forma un par de bases en cada posición de nucleótido. "Parcialmente complementario" también se refiere a un primer polinucleótido que no es 100% complementario (por ejemplo, 90 %, u 80 % o 70 % complementarios) y que contiene nucleótidos no emparejados en una o más posiciones nucleotídicas. En algunas realizaciones, un oligonucleótido incluye una base universal.
Como se utiliza en el presente documento, una "secuencia de nucleótidos exógena" se refiere a una secuencia introducida por cebadores o sondas utilizadas para la amplificación, de manera que los productos de amplificación contendrán una secuencia de nucleótidos exógena y una secuencia de nucleótidos diana en una disposición que no se encuentra en la plantilla original a partir de la cual se copió la secuencia de nucleótidos diana.
Como se utiliza en el presente documento, "identidad de secuencia" o "porcentaje de identidad", tal como se aplica a las moléculas de ácido nucleico, es el porcentaje de restos de ácido nucleico en una secuencia de molécula de ácido nucleico candidata que son idénticos a una secuencia de molécula de ácido nucleico en cuestión, después de alinear las secuencias para lograr el máximo porcentaje de identidad, y sin considerar ninguna sustitución de restos de ácido nucleico como parte de la identidad de la secuencia. La identidad de la secuencia de ácido nucleico se puede determinar mediante cualquier método conocido en la materia, por ejemplo, CLUSTALW, T-COFFEE y BLASTN.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "suficientemente complementario" se refiere a una secuencia de bases de ácido nucleico contiguas que es capaz de hibridarse con otra secuencia de bases mediante puentes de hidrógeno entre una serie de bases complementarias. Las secuencias de bases complementarias pueden ser complementarias en cada posición de la secuencia del oligómero mediante el uso de emparejamiento de bases convencional (por ejemplo, G:C, A:T o A:U) o pueden contener uno o más restos que no son complementarios (incluidas las posiciones abásicas), pero en la que la secuencia de bases complementaria completa es capaz de hibridarse de manera específica con otra secuencia de bases en condiciones de hibridación adecuadas. Las bases contiguas pueden ser al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 99 % o el 100 % complementarias a una secuencia con la que se pretende hibridar un oligómero. Las secuencias sustancialmente complementarias pueden referirse a secuencias que varían en porcentaje de identidad del 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 75, 70 o menos, o cualquier valor intermedio, en comparación con la secuencia de referencia. Un experto en la materia puede elegir fácilmente las condiciones de hibridación adecuadas que pueden predecirse en función de la composición de la secuencia de bases, o determinarse mediante el uso de pruebas de rutina (véase, por ejemplo, Green y Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 4.a ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012)).
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "PCR múltiple" se refiere a un tipo de PCR en la que se incluye más de un conjunto de cebadores en una reacción que permite amplificar una sola diana o dos o más dianas diferentes en un solo tubo de reacción. La PCR múltiple puede ser, por ejemplo, PCR en tiempo real.
Oligonucleótidos y composiciones que los contienen
Como se describe en el presente documento, se pueden realizar amplificaciones de ácidos nucleicos para determinar la presencia, la ausencia y/o el nivel de especies deCandidayT. vaginalisen una muestra. Se sabe que algunas especies deCandidaestán asociadas a la CVV, entre ellasC. albicans, C. dubliniensis, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. kruseiyC. glabrata.En algunas realizaciones, la presencia, ausencia y/o nivel de especies deCandidayT. vaginalisasociadas a la CVV se determina detectando uno o más genes diana de cada uno de los organismos diana utilizando métodos conocidos en la técnica, tales como amplificaciones de ADN. En algunas realizaciones, se puede realizar una PCR múltiple para detectar la presencia, la ausencia o el nivel de cada una de las especies diana deCandidayT. vaginalis.En algunas realizaciones, se realiza una PCR múltiple para detectar la presencia, la ausencia y/o el nivel para cada una de las especies diana deCandidaasociada a CVV yT. vaginalis.En algunas realizaciones, las especies deCandidaasociadas a CVV sonC. albicans, C. dubliniensis, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. kruseiyC. glabrata.
Cada una de las especies diana deCandidaasociadas a la CVV yT. vaginalisse puede detectar utilizando canales separados en amplificaciones de ADN. En algunos casos, puede ser deseable utilizar un solo canal de fluorescencia para detectar la presencia, la ausencia y/o el nivel de dos o más de las especies deCandidaasociadas a CVV (incluidasCandida glabrata, Candida albicans, Candida tropicalis, C. dubliniensis, C. parapsilosis, Candidakrusei) yT. vaginalis.
Se proporcionan los oligonucleótidos (por ejemplo, cebadores y sondas de amplificación) que son capaces de hibridarse de manera específica (por ejemplo, en condiciones convencionales de amplificación de ácidos nucleicos, por ejemplo, condiciones de PCR convencionales y/o condiciones de hibridación estrictas) a una región génica diana, o complemento de la misma, en especies deCandidayT. vaginalisasociadas a CVV. La amplificación de la región génica diana de un organismo en una muestra (por ejemplo, una muestra de hisopado vaginal) puede, en algunas realizaciones, ser indicativa de la presencia, ausencia y/o nivel del organismo en la muestra.
La proteína AP65 es una proteína de 65 KDa del organismo parásitoT. vaginalis,que al reponerse de hierro actúa como una adhesina de superficie que media la citoadherencia del parásito a las células epiteliales vaginales. En algunas realizaciones divulgadas en el presente documento, se proporcionan oligonucleótidos (por ejemplo, cebadores y sondas de amplificación) capaces de hibridarse específicamente (por ejemplo, en condiciones de amplificación de ácidos nucleicos convencionales, por ejemplo, condiciones de PCR convencionales y/o condiciones de hibridación estrictas) con una región del gen que codifica AP65 enT. vaginalis.En algunas realizaciones, el gen AP65 se utiliza como gen diana de la amplificación del ADN para detectar la presencia, la ausencia y/o el nivel deT. vaginalisen la muestra. Algunos ejemplos de oligonucleótidos capaces de hibridarse específicamente con la región del gen AP65 enT. vaginalisincluyen, pero no se limitan a, la SEQ ID NO: 17-19 como se proporciona en la Tabla 1 y secuencias que tienen un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 17-19.
El gen del factor de elongación 1 alfa (tef1) que se encuentra en las especies deCandidacodifica el factor de síntesis de proteínas EF, que participa en el proceso de traslación durante la síntesis de proteínas. Como se conoce en la técnica, el gen tef1 también suele denominarse gen tef1 o gen tuf. En algunas realizaciones divulgadas en el presente documento, se proporcionan oligonucleótidos (por ejemplo, cebadores y sondas de amplificación) capaces de hibridarse específicamente (por ejemplo, en condiciones de amplificación de ácidos nucleicos convencionales, por ejemplo, condiciones de PCR convencionales y/o condiciones de hibridación estrictas) con una región génica que codifica el tef1 en especies deCandida.En algunas realizaciones, el gen tef1 se utiliza como gen diana de la amplificación del ADN para detectar la presencia, la ausencia y/o el nivel de especies deCandidaasociadas a la CVV en la muestra. En algunas realizaciones, las especies deCandidaasociadas a la CVV comprendenC. albicans, C.dubliniensis,C. tropicalis, C. parapsilosis, C. kruseiyC. glabrata.En algunas realizaciones, la especie deCandida asociadaa CVV esCandida krusei.En algunas realizaciones, la especie deCandidaasociada a la CVV esCandida glabrata.En algunas realizaciones, la especie deCandidaasociada a la CVV esC. albicans, C. dubliniensis, C.
tropicalis, C. parapsilosiso una combinación de las mismas. Los ejemplos de oligonucleótidos capaces de hibridarse específicamente con la región del gen tef1 enC. glabrataincluyen, pero no se limitan a, las SEQ ID NO: 20-22 como se proporcionan en la Tabla 1 y las secuencias que tienen un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 20-22. Algunos ejemplos de oligonucleótidos capaces de hibridarse específicamente con la región del gen te fl enC. albicans, C. dubliniensis, C. tropicalisyC. parapsilosisincluyen, pero no se limitan a, las SEQ ID NO: 23-26 tal y como se proporcionan en la Tabla 1 y las secuencias que tienen un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 23-26. Los ejemplos de oligonucleótidos capaces de hibridarse específicamente con la región del gen tef1 enC. kruseiincluyen, entre otros, las SEQ ID NO: 27-29 tal y como se proporcionan en la Tabla 1 y las secuencias que tienen un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 27-29.
Tabla 1.Los cebadores y las sondas para la detección de las especies deCandidayT. vaginalisasociadas a la CVV de la presente invención se enumeran en la tabla siguiente. Además de los cebadores y sondas reivindicados, también se enumeran en la tabla siguiente otros cebadores y sondas para la detección de especies relacionadas con VVB que
En el presente documento, también se proporcionan oligonucleótidos (por ejemplo, cebadores o sondas de amplificación) que contengan 1 o 2 emparejamientos incorrectos o nucleótidos universales con respecto a las SEQ ID NO: 17-32 o el complemento de las mismas. En algunas realizaciones, el oligonucleótido comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 17-32. En algunas realizaciones, el oligonucleótido comprende una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 17-32. En algunas realizaciones, el oligonucleótido consiste en una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 17-32. En algunas realizaciones, el oligonucleótido consiste en una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 17-32.
Los ácidos nucleicos proporcionados en el presente documento pueden estar de varias formas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los ácidos nucleicos se disuelven (ya sea solos o en combinación con otros ácidos nucleicos) en solución, por ejemplo, en tampón. En algunas realizaciones, se proporcionan ácidos nucleicos, ya sean solos o en combinación con otros ácidos nucleicos aislados, como una sal. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos se proporcionan en forma liofilizada de manera que se pueden reconstituir. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los ácidos nucleicos aislados divulgados en el presente documento se pueden proporcionar solos en un sedimento liofilizado o en un sedimento liofilizado con otros ácidos nucleicos aislados. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos se proporcionan fijos a una sustancia sólida, tal como una perla, una membrana o similar. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos se proporcionan en una célula hospedadora, por ejemplo, una estirpe celular que lleva un plásmido, o una estirpe celular que lleva una secuencia integrada de forma estable.
Se proporcionan composiciones, la mezcla de reacción y los kits que comprenden los oligonucleótidos (por ejemplo, cebadores de amplificación y/o sondas) capaces de hibridarse específicamente con la secuencia del gen AP-65 deT. vaginalis,o un complemento de la misma. La composición, la mezcla de reacción y el kit comprenden uno o más pares de cebadores de amplificación capaces de hibridarse específicamente con la secuencia del gen AP-65 deT. vaginalis,o un complemento de la misma. En algunas realizaciones, el cebador comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 17 o 18. En algunas realizaciones, el cebador comprende una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a una secuencia de la SEQ ID NO: 17 o 18. En algunas realizaciones, el cebador consiste en una secuencia de la SEQ ID NO: 17 o 18. En algunas realizaciones, la composición, la mezcla de reacción y el kit comprenden una o más sondas capaces de hibridarse específicamente con la secuencia del gen AP-65 deT. vaginaliso complemento de la misma. En algunas realizaciones, la sonda comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 19. En algunas realizaciones, la sonda comprende una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a una secuencia de la SEQ ID NO: 19. En algunas realizaciones, la sonda consiste en una secuencia de la SEQ ID 19. En algunas realizaciones, la sonda consiste en una secuencia con un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a una secuencia de la SEQ ID NO: 19.
Se proporcionan composiciones, mezclas de reacción y kits que comprenden los oligonucleótidos (por ejemplo, cebadores de amplificación y/o sondas) capaces de hibridarse específicamente con la secuencia del gen tef1 de una o más especies deCandidao un complemento de la misma. En algunas realizaciones, la composición, la mezcla de reacción y el kit comprenden uno o más pares de cebadores de amplificación capaces de hibridarse específicamente con la secuencia del gen tef1 deCandida glabratao complemento de la misma. En algunas realizaciones, el cebador comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 20 o 21. En algunas realizaciones, el cebador comprende una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a una secuencia de la SEQ ID NO: 20 o 21. En algunas realizaciones, el cebador consiste en una secuencia de la SEQ ID NO: 20 o 21. En algunas realizaciones, el cebador consiste en una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a una secuencia de la SEQ ID NO: 20 o 21. En algunas realizaciones, la composición, la mezcla de reacción y el kit comprenden una o más sondas capaces de hibridarse específicamente con la secuencia del gen tef1 deCandida glabratao complemento de la misma. En algunas realizaciones, la sonda comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 22, 26 o 29. En algunas realizaciones, la sonda comprende una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a una secuencia de la SEQ ID NO: 22. En algunas realizaciones, la sonda consiste en una secuencia de la SEQ ID NO: 22. En algunas realizaciones, la sonda consiste en una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a una secuencia de la SEQ ID NO: 22.
En algunas realizaciones, la composición, la mezcla de reacción y el kit comprenden uno o más pares de cebadores de amplificación capaces de hibridarse específicamente con la secuencia del gen te fl de una o más especies de Candida o complemento de la misma, en donde las especies deCandidacomprendenC. albicans, C. dubliniensis, C. tropicalisy C.parapsilosis.En algunas realizaciones, el cebador comprende una secuencia de las SEQ ID NO: 20, 21, 23, 24, 25, 27 o 28. En algunas realizaciones, el cebador comprende una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a una secuencia de la SEQ ID NO: 23, 24 o 25. En algunas realizaciones, el cebador consiste en una secuencia de la SEQ ID NO: 23, 24 o 25. En algunas realizaciones, el cebador consiste en una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a una secuencia de la SEQ ID NO: 23, 24 o 25. En algunas realizaciones, la composición, la mezcla de reacción y el kit comprenden una o más sondas capaces de hibridarse específicamente con la secuencia del gen tef1 de una o más especies deCandidao complemento de la misma, en donde las especies deCandidacomprendenC. albicans, C. dubliniensis, C. tropicalisyC. parapsi.En algunas realizaciones, la sonda comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, la sonda comprende una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a una secuencia de la SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, la sonda consiste en una secuencia de la SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, la sonda consiste en una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a una secuencia de la SEQ ID NO: 26.
En algunas realizaciones, la composición, la mezcla de reacción y el kit comprenden uno o más pares de cebadores de amplificación capaces de hibridarse específicamente con la secuencia del gen tef1 deCandida kruseio complemento de la misma. En algunas realizaciones, el cebador comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 27 o 28. En algunas realizaciones, el cebador comprende una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a una secuencia de la SEQ ID NO: 27 o 28. En algunas realizaciones, el cebador consiste en una secuencia de la SEQ ID NO: 27 o 28. En algunas realizaciones, el cebador consiste en una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a una secuencia de la SEQ ID NO: 27 o 28. En algunas realizaciones, la composición, la mezcla de reacción y el kit comprenden una o más sondas capaces de hibridarse específicamente con la secuencia del gen tef1 deCandida kruseio complemento de la misma. En algunas realizaciones, la sonda comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones, la sonda comprende una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a una secuencia de la SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones, la sonda consiste en una secuencia de la SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones, la sonda consiste en una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a una secuencia de la SEQ ID NO: 29.
Las sondas oligonucleotídicas pueden, en algunas realizaciones, incluir una fracción detectable. Por ejemplo, las sondas oligonucleotídicas divulgadas en el presente documento pueden comprender un marcador radiactivo. Los ejemplos no limitantes de marcadores radiactivos incluyen 3H, 14C, 32P y 35S. En algunas realizaciones, las sondas oligonucleotídicas pueden incluir uno o más marcadores o fracciones detectables no radiactivos, que incluyen, pero sin limitación, ligandos, fluoróforos, agentes quimioluminiscentes, enzimas y anticuerpos. Otros marcadores detectables para utilizar con sondas, que pueden permitir un aumento de la sensibilidad del método de la invención, incluyen biotina y radionucleótidos. Será evidente para el experto en la materia que la elección de un marcador particular dicta la manera en que se une a la sonda. Por ejemplo, las sondas oligonucleotídicas marcadas con uno o más colorantes, de modo que tras la hibridación con un ácido nucleico molde se genera un cambio detectable en la fluorescencia. Si bien los colorantes no específicos pueden ser deseables para algunas aplicaciones, las sondas específicas de secuencia pueden proporcionar mediciones de amplificación más precisas. Una configuración de sonda específica de secuencia puede incluir un extremo de la sonda unido a un fluoróforo y el otro extremo de la sonda unido a un inactivador. Cuando la sonda no está hibridada, puede mantener una configuración de bucle-tallo, en la que el fluoróforo se inactiva por el inactivador, evitando así que el fluoróforo emita fluorescencia. Cuando la sonda se hibrida con una secuencia nucleica molde, se linealiza, lo que aleja el fluoróforo del inactivador y, por lo tanto, permite que el fluoróforo emita fluorescencia. Otra configuración de la sonda específica de secuencia puede incluir una primera sonda unida a un primer fluoróforo de un par FRET y una segunda sonda unida a un segundo fluoróforo de un par FRET. La primera sonda y la segunda sonda se pueden configurar para hibridarse con secuencias de un amplicón que están lo suficientemente cerca para permitir la transferencia de energía por FRET cuando la primera sonda y la segunda sonda se hibridan con el mismo amplicón.
En algunas realizaciones, la sonda específica de secuencia comprende un oligonucleótido como se divulga en el presente documento conjugado con un fluoróforo. En algunas realizaciones, la sonda se conjuga con dos o más fluoróforos. Los ejemplos de fluoróforos incluyen: colorantes de xanteno, por ejemplo, colorantes de fluoresceína y rodamina, tales como el isotiocianato de fluoresceína (FITC), el monoclorhidrato de éster etílico del ácido 2-[etilamino)-3-(etilimino)-2-7-dimetil-3H-xanten-9-il]benzoico (R6G) (emite una radiación de respuesta en la longitud de onda que varía entre aproximadamente 500 y 560 nm), el yoduro de 1,1,3,3,3',3-hexametilindodicarbocianina (HIDC) (emite una radiación de respuesta en la longitud de onda que varía entre aproximadamente 600 y 660 nm), la 6-carboxifluoresceína (normalmente conocida por las abreviaturas FAM y F), la 6-carboxi-2',4',7',4,7-hexaclorofluoresceína (HEX), la 6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína (JOE o J), la N,N,N',N'-tetrametil-6carboxirodamina (TAMRA o T), la 6-carboxi-X-rodamina (ROX o R), la 5-carboxirrodamina-6G (R6G5 o G5), la 6-carboxirrodamina-6G (R6G6 o G6) y la rodamina 110; colorantes de cianina, por ejemplo, los colorantes Cy3, Cy5 y Cy7; cumarinas, por ejemplo, la umbeliferona; colorantes de bencimida, por ejemplo, Hoechst 33258; colorantes de fenantridina, por ejemplo, rojo Texas; colorantes de etidio; colorantes de acridina; colorantes de carbazol; colorantes de fenoxazina; colorantes de porfirina; colorantes de polimetina, por ejemplo, colorantes de cianina tales como Cy3 (emite una radiación de respuesta en la longitud de onda que varía entre 540 y 580 nm), Cy5 (emite una radiación de respuesta en la longitud de onda que varía entre 640 y 680 nm), etc.; colorantes BODIPY y colorantes de quinolina. Los fluoróforos específicos de interés incluyen: pireno, cumarina, dietilaminocumarina, FAM, clorotriazinilo de fluoresceína, fluoresceína, R110, eosina, JOE, R6G, HIDC, tetrametilrodamina, TAMRA, lisamina, ROX, naftofluoresceína, rojo Texas, naftofluoresceína, Cy3 y Cy5, CAL naranja flúor y similares.
En algunas realizaciones, la sonda se conjuga con un inactivador. Un inactivador puede absorber la radiación electromagnética y disiparla en forma de calor, por lo que permanece oscuro. Los inactivadores ilustrativos incluyen Dabcyl, NFQ, tal como BHQ-1 o BHQ-2 (Biosearch), IOWA BLACK FQ (IDT) e IOWA BLACK RQ (IDT). En algunas realizaciones, el inactivador se selecciona para emparejarse con un fluoróforo para absorber la radiación electromagnética emitida por el fluoróforo. Los pares de fluoróforo/inactivador útiles en las composiciones y métodos divulgados en el presente documento son bien conocidos en la materia y se pueden encontrar, por ejemplo, descritos en Marras, "Selection of Fluorophore and Quencher Pairs for Fluorescent Nucleic Acid Hybridization Probes" disponible en www.molecular-beacons.org/download/marras,mmb06 %28335 %293.pdf.
En algunas realizaciones, un fluoróforo se une a un primer extremo de la sonda y un inactivador se une a un segundo extremo de la sonda. La unión puede incluir enlaces covalentes y, opcionalmente, puede incluir al menos una molécula enlazadora situada entre la sonda y el fluoróforo o el inactivador. En algunas realizaciones, un fluoróforo se une al extremo 5' de una sonda y un inactivador se une al extremo 3' de una sonda. En algunas realizaciones, un fluoróforo se une al extremo 3' de una sonda y un inactivador se une al extremo 5' de una sonda. Los ejemplos de sondas que se pueden utilizar en la amplificación cuantitativa de ácidos nucleicos incluyen balizas moleculares, sondas SCORPION™ (Sigma), sondas TAQMAN™ (Life Technologies) y similares. Otras tecnologías de detección de ácidos nucleicos que son útiles en las realizaciones divulgadas en el presente documento incluyen, pero sin limitación, tecnología de sonda de nanopartículas (véase Elghanian,et al.(1997) Science 277:1078-1081) y tecnología de sonda Amplifluor (véanse las patentes de EE. UU. n.°: 5.866.366; 6.090.592; 6.117.635; y 6.117.986).
La presente invención se refiere a una composición para la detección de especies deCandidaasociadas con la CVV yT. vaginalisen una muestra biológica, en donde la composición comprende: cebadores capaces de hibridarse con el gen tef1 deCa. glabrata,en donde cada cebador comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21 o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21; cebadores capaces de hibridarse con el gen tef1 de al menos uno deC. albicans, C. tropicalis, C. dubliniensisyC. parapsilosis,en donde cada cebador comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a la SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, o SEQ ID NO: 25; cebadores capaces de hibridarse con el gen tef1 deC. krusei,en donde cada cebador comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 28, o una secuencia con un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a la SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 28; y cebadores capaces de hibridarse con el gen AP-65 deT. vaginalis,en donde cada cebador comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18, o una secuencia con un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a la SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18.
En algunas realizaciones, los cebadores capaces de hibridarse con el gen tef1 deC. glabratacomprenden, o consisten en, un cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 20 y un cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 21; los cebadores capaces de hibridarse con el gen tef1 de al menos uno deC. albicans, C. tropicalis, C. dubliniensisyC. parapsilosiscomprenden, o consisten en, un cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 23, un cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 24, y un cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 25; los cebadores capaces de hibridarse con el gen tef1 deC. kruseicomprenden o consisten en, un cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 27 y un cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 28; y los cebadores capaces de hibridarse con el gen AP-65 deT. vaginaliscomprenden, o consisten en, un cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 17 y un cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 18.
La composición puede, en algunas realizaciones, comprender además una pluralidad de sondas oligonucleotídicas, en donde cada una de la pluralidad de sondas oligonucleotídicas comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 22, 26, 29 y 19, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 22, 26, 29 y 19. En algunas realizaciones, cada una de la pluralidad de sondas oligonucleotídicas comprende, o consiste en, una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 22, 26, 29 y 19.
Cualquier sonda descrita en el presente documento puede comprender una fracción emisora de fluorescencia y una fracción inactivadora de fluorescencia.
Como se divulga en el presente documento, una mezcla de reacción puede comprender uno o más de los cebadores divulgados en el presente documento, una o más de las sondas divulgadas en el presente documento (por ejemplo, las sondas que contienen fluoróforos) o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la mezcla de reacción comprende una o más de las composiciones que contienen cebador y/o sonda divulgadas en el presente documento. La mezcla de reacción también puede comprender varios componentes adicionales. Los ejemplos de los componentes adicionales en la mezcla de reacción incluyen, pero sin limitación, ADN molde, ADN polimerasa (por ejemplo, Taq ADN polimerasa), desoxinucleótidos (dNTP), solución de tampón, cationes biovalentes, iones de potasio de catión monovalente y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la mezcla de reacción es una mezcla maestra para PCR en tiempo real.
Muestras
Los métodos y composiciones divulgados en el presente documento son adecuados para detectar trastornos vaginales, en particular, CVV y tricomoniasis, en una amplia diversidad de muestras. Como se utiliza en el presente documento, una "muestra" se refiere a cualquier tipo de material de origen biológico tomado de uno o más sujetos de los que se sospecha que padecen CVV y/o tricomoniasis. La muestra puede comprender, por ejemplo, líquido, tejido o células. La muestra puede comprender un material biológico tomado directamente de un sujeto, células o tejidos cultivados, o cualquier fracción o productos producidos o procedentes de materiales biológicos. Una muestra puede estar purificada, parcialmente purificada, sin purificar, enriquecida o amplificada.
La muestra puede ser una muestra biológica, por ejemplo, una muestra clínica. En algunas realizaciones, la muestra se toma de una fuente biológica, tal como la vagina, uretra, pene, ano, garganta, cuello uterino, caldos de fermentación, cultivos celulares y similares. La muestra puede comprender, por ejemplo, líquido y células de la vagina. La muestra biológica se puede utilizar (i) directamente tal como se obtiene del sujeto o la fuente, o (ii) después de un tratamiento previo para modificar el carácter de la muestra. Por lo tanto, la muestra de prueba se puede tratar previamente antes de su uso, por ejemplo, mediante la alteración de células o de partículas víricas, la preparación de líquidos a partir de materiales sólidos, la dilución de líquidos viscosos, el filtrado de líquidos, la concentración de líquidos, la inactivación de componentes interferentes, la adición de reactivos, la purificación de ácidos nucleicos y similares. Por consiguiente, una "muestra biológica" como se utiliza en el presente documento incluye ácidos nucleicos (ADN, ARN o ácidos nucleicos totales) extraídos de una muestra clínica o biológica. La preparación de muestras también puede incluir el uso de una solución que contenga tampones, sales, detergentes y/o similares que se utilizan para preparar la muestra para el análisis. En algunas realizaciones, la muestra se procesa antes de la prueba molecular. En algunas realizaciones, la muestra se analiza directamente y no se procesa antes de la prueba. La muestra puede ser, por ejemplo, una muestra vaginal, tal como una sola muestra de hisopado vaginal. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de hisopado vaginal de una mujer con síntomas clínicos de vaginitis y/o vaginosis.
Las muestras vaginales o de orina a menudo están infectadas con múltiples organismos. Los cebadores y las sondas divulgadas son tolerantes a infecciones mixtas de la matriz vaginal o de orina.
En algunas realizaciones, una muestra a analizar se procesa antes de realizar los métodos divulgados en el presente documento. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la muestra se puede aislar, concentrar o someter a varias otras etapas de procesamiento antes de realizar los métodos divulgados en el presente documento. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la muestra se puede procesar para aislar los ácidos nucleicos de la muestra antes de poner en contacto la muestra con los oligonucleótidos, como se divulga en el presente documento. En algunas realizaciones, los métodos divulgados en el presente documento se realizan en la muestra sin cultivar la muestrain vitro.En algunas realizaciones, los métodos divulgados en el presente documento se realizan en la muestra sin aislar los ácidos nucleicos de la muestra antes de poner en contacto la muestra con los oligonucleótidos como se divulga en el presente documento.
Extracción de muestras
En extracciones normales de muestras, las células se lisan mediante cizallamiento mecánico con perlas de vidrio como se describe en la patente de EE. UU. n.° 7.494.771, para lisar los organismos diana. Como se divulga en el documento WO03/008636, dicho método genérico de lisis celular es eficaz para una amplia variedad de organismos diana y matrices de muestras. También existen otros métodos de lisis menos universales que están diseñados de manera específica para dirigirse a una determinada especie o grupo de organismos, o que explotan actividades enzimáticas o químicas específicas. Por ejemplo, la enzima ACP se utiliza normalmente para lisar organismos grampositivos (Ezakiet al.,J. Clin. Microbiol., 16(5):844-846 (1982); Pauleet al.,J. Mol. Diagn., 6(3): 191-196 (2004); patente de EE. UU. n.° 3.649.454) y micobacterias (patente de EE. UU. n.° 5.185.242), pero en general se considera menos eficaz con respecto a la lisis de especies gramnegativas tales comoE. coliyPseudomonas aeruginosa(Patente de EE. UU. n.° 3.649.454).
Los inventores de la presente divulgación se sorprendieron al descubrir que ni el ACP ni la proteinasa K pueden lisar eficazmente las paredes de las células deCandida,y que la liasa descrita en la patente de EE. UU n.° 3.716.452 puede lisar eficazmente las paredes celulares de las especies deCandida.La lisis celular puede realizarse a distintas temperaturas, por ejemplo, entre 18 °C y 75 °C, por ejemplo, 37 °C y 50 °C. Es ventajoso lisar las células a 37 °C para lograr una mayor eficacia de lisis en comparación con 50 °C (LND490E38). En algunas realizaciones, la liasa se utiliza para lisar especies deCandida,incluidas, entre otras,C. albicans, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalisyC. glabrata.El tiempo necesario para lograr la eficacia de lisis deseada para la muestra no está particularmente limitado. En algunas realizaciones, se requieren aproximadamente 10 minutos para lograr la eficacia de lisis deseada de la muestra.
Pruebas de ácidos nucleicos
Los métodos descritos en el presente documento pueden incluir, por ejemplo, pruebas de ácidos nucleicos. Por ejemplo, la prueba puede incluir la prueba de secuencias de ácido nucleico diana en una muestra. Se pueden utilizar varias formas de pruebas de ácidos nucleicos en las realizaciones divulgadas en el presente documento, que incluyen, pero sin limitación, pruebas que implican la amplificación de ácidos nucleicos.
Como se utiliza en el presente documento, la amplificación de ácidos nucleicos se refiere a cualquier procedimiento conocido para obtener múltiples copias de una secuencia de ácido nucleico diana o su complemento o fragmentos de la misma, mediante métodos específicos de secuencia. Los ejemplos de métodos de amplificación conocidos incluyen, pero sin limitación, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) (por ejemplo, amplificación por desplazamiento múltiple (MDA)), amplificación mediada por replicasa, inmunoamplificación, amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA), replicación de secuencia autosostenida (3SR), amplificación de círculo rodante y amplificación mediada por transcripción (TMA). Véase, por ejemplo, Mullis, "Process for Amplifying, Detecting, and/or Cloning Nucleic Acid Sequences", patente de EE. u U. n.° 4.683.195; Walker, "Strand Displacement Amplification", patente de EE. UU. n.° 5.455.166; Deanet al.,"Multiple displacement amplification", patente de EE. UU. n.° 6.977.148; Notomiet al.,"Process for Synthesizing Nucleic Acid", patente de EE.<u>U. n.° 6.410.278; Landegrenet al.patente de EE. UU. n.° 4.988.617 "Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids"; Birkenmeyer, "Amplification of Target Nucleic Acids Using Gap Filling Ligase Chain Reaction", patente de EE. UU. n.° 5.427.930; Cashman, "Blocked-Polymerase Polynucleotide Immunoassay Method and Kit", patente de EE. UU. n.° 5.849.478; Kacianet al.,"Nucleic Acid Sequence Amplification Methods", patente de EE. UU. n.° 5.399.491; Maleket al.,"Enhanced Nucleic Acid Amplification Process", patente de EE. UU. n.° 5.130.238; Lizardiet al.,BioTechnology, 6:1197 (1988); Lizardiet al.,patente de EE. UU. n.° 5.854.033 "Rolling circle replication reporter systems". En algunas realizaciones, se pueden realizar dos o más de los métodos de amplificación de ácidos nucleicos antes mencionados, por ejemplo, de manera secuencial.
Por ejemplo, la amplificación LCR utiliza al menos cuatro oligonucleótidos separados para amplificar una diana y su cadena complementaria mediante múltiples ciclos de hibridación, unión y desnaturalización (patente EP n.° 0320308). La SDA amplifica mediante el uso de un cebador que contiene un sitio de reconocimiento para una endonucleasa de restricción que corta una cadena de un ADN doble semimodificado que incluye la secuencia diana, seguido de amplificación en una serie de etapas de extensión de cebador y desplazamiento de cadena (Patente de EE. UU. n.° 5.422.252 de Walkeret al.).
La PCR es un método bien conocido en la materia para la amplificación de ácidos nucleicos. La PCR implica la amplificación de una secuencia diana mediante dos o más cebadores oligonucleotídicos específicos de secuencia extensibles que flanquean la secuencia diana. El ácido nucleico que contiene la secuencia diana de interés se somete a un programa de múltiples rondas de ciclos térmicos (desnaturalización, hibridación y extensión) en presencia de los cebadores, una polimerasa de ADN termoestable (por ejemplo, Taq polimerasa) y varios dNTP, lo que da como resultado la amplificación de la secuencia diana. La PCR utiliza varias rondas de reacciones de extensión con cebadores en las que una ADN polimerasa termoestable sintetiza de manera simultánea cadenas complementarias de una región definida de una molécula de ADN. Al final de cada ciclo, cada molécula de ADN recién sintetizada actúa como una plantilla para el siguiente ciclo. Durante rondas repetidas de estas reacciones, el número de cadenas de ADN recién sintetizadas aumenta exponencialmente de tal manera que después de 20 a 30 ciclos de reacción, el ADN molde inicial se habrá replicado varios miles o millones de veces. Los métodos para llevar a cabo diferentes tipos y modos de PCR se describen con detalle en la bibliografía, por ejemplo en "PCR Primer: A Laboratory Manual" Dieffenbach y Dveksler, eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995, y por Mulliset al.en patentes (por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 4.683.195, 4.683.202 y 4.800.159) y en publicaciones científicas (por ejemplo, Mulliset al.
1987, Methods in Enzymology, 155:335-350).
La PCR puede generar productos de amplificación de bicatenarios adecuados para el procesamiento posterior a la amplificación. Si se desea, los productos de amplificación se pueden detectar mediante visualización con electroforesis en gel de agarosa, mediante un formato de inmunoensayo enzimático con detección colorimétrica basada en sonda, mediante tecnología de emisión de fluorescencia o mediante otros medios de detección conocidos por un experto en la materia.
Se ha descrito una amplia variedad de métodos de PCR en muchas fuentes, por ejemplo, Ausubelet al.(eds.), Current Protocols in Molecular Biology, sección 15, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York (1994). Los ejemplos de métodos de PCR incluyen, pero sin limitación, PCR en tiempo real, PCR de punto final, polimorfismos en la longitud de los fragmentos amplificados mediante PCR (AFLP-PCR), PCR Alu, p Cr asimétrica, PCR de colonias, PCR DD, PCR degenerada,<p>C<r>de inicio en caliente, PCRin situ,<p>C<r>inversa, PCR larga, PCR múltiple, PCR anidada, PCR-ELISA, PCR-RFLP, polimorfismo de conformación de cadena simple mediante PCR (PCR-SSCP), PCR competitiva cuantitativa (QC-PCR), amplificación rápida de extremos de ADNc mediante PCR (RACE-PCR), amplificación aleatoria de ADN polimórfico mediante PCR (RAPD-PCR), PCR en tiempo real, PCR palindrómica extragénica repetitiva (Rep-PCR), p Cr de transcriptasa inversa (RT-PCR), TAIL-PCR, Touchdown PCR y Vectorette PCR.
PCR en tiempo real, también llamada reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR), y se pueden utilizar para cuantificar y amplificar de manera simultánea una parte específica de una molécula de ácido nucleico determinada. Se puede utilizar para determinar si una secuencia específica está presente en la muestra; y si está presente, el número de copias de la secuencia que están presentes. La expresión en "tiempo real" se refiere al control periódico durante la PCR. Determinados sistemas, tales como los sistemas de detección de secuencias ABI 7700 y 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, California) realizan el control durante cada ciclo térmico en un punto predeterminado o definido por el usuario. El análisis en tiempo real de la PCR con sondas de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET, del inglésfluorescence resonance energy transfer)mide los cambios en la señal del colorante fluorescente de un ciclo a otro, preferentemente menos cualquier señal de control interno. El procedimiento en tiempo real sigue el patrón general de PCR, pero el ácido nucleico se cuantifica después de cada ronda de amplificación. Dos ejemplos de métodos de cuantificación son el uso de colorantes fluorescentes (por ejemplo, SYBRGreen) que se intercalan en el ADN bicatenario y de sondas oligonucleotídicas de ADN modificadas que emiten fluorescencia cuando se hibridan con un ADN complementario. Los agentes intercalantes tienen una fluorescencia relativamente baja cuando no se unen y una fluorescencia relativamente elevada cuando se unen a ácidos nucleicos bicatenarios. Por ello, los agentes intercalantes se pueden utilizar para controlar la acumulación de ácidos nucleicos bicatenarios durante una reacción de amplificación de ácidos nucleicos. Los ejemplos de dichos colorantes no específicos útiles en las realizaciones divulgadas en el presente documento incluyen agentes intercalantes tales como SYBR Green I (Molecular Probes), yoduro de propidio, bromuro de etidio y similares.
Las muestras vaginales a menudo están infectadas con múltiples organismos. Los cebadores y las sondas divulgadas son tolerantes a infecciones mixtas de la matriz vaginal. Debido a las secuencias diana específicas, a los cebadores y a las sondas, los métodos y composiciones divulgados en el presente documento se pueden utilizar para detectar la presencia/ausencia o el nivel de especies deCandidaasociadas con la CVV y/oT. vaginalisen una muestra con elevada sensibilidad, especificidad y precisión.
Los cebadores divulgados en el presente documento se pueden combinar con sistemas de PCR adicionales utilizando un perfil de PCR térmico y químico uniforme para proporcionar un grupo de ensayos para la detección de organismos vaginales, para mejorar la sensibilidad y la consistencia general del ensayo.
En algunas realizaciones, la PCR múltiple se lleva a cabo para amplificar y detectar, por ejemplo, por medios directos o indirectos, la presencia o ausencia de especies deCandidaasociadas a la CVV yT. vaginalispara permitir el diagnóstico de la CVV y la tricomoniasis utilizando una sola prueba. En la PCR múltiple, la presencia o ausencia de especies deCandidaasociadas a la CVV puede determinarse amplificando y detectando la presencia o ausencia del gen tef1 deC. albicans, C. dubliniensis, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. kruseiy C.glabrata;la presencia o ausencia deT. vaginalispuede determinarse amplificando y detectando la presencia o ausencia del gen AP-65 deT. vaginalis.
En consecuencia, algunas realizaciones para la detección y/o identificación de especies deCandidayT. vaginalisasociadas a la CVV en una muestra incluyen las etapas de proporcionar una muestra de prueba; y poner en contacto la muestra con cebadores oligonucleotídicos como los descritos anteriormente que pueden hibridarse y amplificar específicamente (1) genes tef1 deC. albicans, C. dubliniensis, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. kruseiyC. glabrata,y (2) el gen AP-65 deT. vaginalis,y sondas oligonucleotídicas que pueden hibridarse específicamente con (1) regiones del gen tef1 deC. albicans, C. dubliniensis, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. kruseiyC. glabratay (2) la región del gen AP-65 deT. vaginalisen condiciones de amplificación de ácidos nucleicos convencionales y/o condiciones de hibridación estrictas. Como se describe en el presente documento, la muestra puede ponerse en contacto con todos los cebadores y sondas a la vez, o puede ponerse en contacto con algunos de los cebadores y sondas primero y posteriormente con el resto de los cebadores y sondas. En algunas realizaciones, la muestra se pone en contacto con los cebadores que pueden hibridarse y amplificar específicamente (1) genes tef1 deC. albicans, C. dubliniensis, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. kruseiy C.glabrata,y (2) el gen AP-65 deTrichomonasvaginalis, y las sondas que pueden hibridarse específicamente con (1) las regiones del gen tef1 deC. albicans, C. dubliniensis, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. kruseiyC. glabrata,y (2) la región del gen AP-65 deT. vaginalis.
La sonda oligonucleotídica puede tener, por ejemplo, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 45 nucleótidos de longitud, y comprende una fracción detectable. En algunas realizaciones, la puesta en contacto se realiza en condiciones que permiten la hibridación específica de los cebadores con la región génica diana correspondiente si el organismo diana está presente en la muestra. Se puede determinar la presencia y/o la cantidad de sonda que se une de manera específica a la región génica diana correspondiente (si está presente en la muestra que se está analizando), en donde la sonda unida es indicativa de la presencia del organismo diana correspondiente en la muestra. En algunas realizaciones, la cantidad de sonda unida se utiliza para determinar la cantidad del organismo diana correspondiente en la muestra.
La etapa de determinación se puede lograr mediante cualquier método conocido por los expertos en la materia, que incluyen, pero sin limitación, hibridaciónin situ,después de la etapa de puesta en contacto. La detección de dobletes híbridos (es decir, de una sonda unida de manera específica a la región génica diana) se puede llevar a cabo mediante una serie de métodos. Normalmente, los dobletes de hibridación se separan de los ácidos nucleicos no hibridados y después se detectan los marcadores unidos a los dobletes. Dichos marcadores se refieren a marcadores radiactivos, fluorescentes, biológicos o enzimáticos o marcadores de uso convencional en la materia. Se puede conjugar un marcador con las sondas oligonucleotídicas o con los ácidos nucleicos procedentes de la muestra biológica. Los expertos en la materia apreciarán que se pueden emplear etapas de lavado para eliminar el exceso de muestra/ácidos nucleicos diana o sonda oligonucleotídica (así como el conjugado no unido, cuando corresponda). Además, los formatos de ensayo heterogéneos convencionales son adecuados para detectar los híbridos mediante los marcadores presentes en los cebadores y sondas oligonucleotídicas.
Se proporciona un método para detectar especies deCandidaasociadas a la CVV (incluyendoCandida glabrata, Candida albicans, Candida tropicalis, C. dubliniensis, C. parapsilosis, Candida krusei)yT. vaginalisen una muestra biológica, en donde el método comprende: poner en contacto la muestra biológica con una pluralidad de pares de cebadores, en donde la pluralidad de pares de cebadores comprende: cebadores capaces de hibridarse con el gen tef1 deC. glabrata,en donde cada cebador comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21 o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21; cebadores capaces de hibridarse con el gen te fl de al menos uno deC. albicans, C. tropicalis, C. dubliniensisyC. parapsilosis, en donde cada cebador comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25, o una secuencia con un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a las SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID No : 25; cebadores capaces de hibridarse con el gen tef1 deC. krusei,en donde cada cebador comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 28, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a la SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 28; y cebadores capaces de hibridarse con el gen AP-65 deT. vaginalis,en donde cada cebador comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a la SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18; y generar amplicones de las secuencias de tef1 de las especies deCandiday/o amplicones de la secuencia del gen AP-65 deT. vaginalisa partir de dicha muestra biológica, si dicha muestra comprende una o más de las especies deCandidaasociadas a la CVV y/oT. vaginalis;determinar la presencia o cantidad de uno o más productos amplificados como indicación de la presencia de especies deCandidaasociadas a la CVV yT. vaginalisen dicha muestra biológica.
En algunas realizaciones, la pluralidad de pares de cebadores comprende un cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 20, un cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 21, un cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 23, un cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 24, un cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 25, un cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 27, un cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 28, un cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 17 y un cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 18.
En algunas realizaciones, los cebadores capaces de hibridarse con el gen tef1 deC. glabratacomprenden las SEQ ID NO: 20 y 21; los cebadores capaces de hibridarse con el gen tef1 de al menos una deC. albicans, C. tropicalis, C. dubliniensisyC. parapsilosiscomprenden: (a) SEQ ID NO: 23 y 24, (b) SEQ ID NO: 23 y 25 o (c) una combinación de las mismas; los cebadores capaces de hibridarse con el gen tef1 deC. kruseicomprenden las SEQ ID NO: 27 y 28; y los cebadores capaces de hibridarse con el gen AP-65 deT. vaginaliscomprenden las SEQ ID NO: 17 y 18.
Como se describe en el presente documento, la amplificación se puede realizar mediante PCR en tiempo real, por ejemplo, PCR cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR). Los cebadores adecuados para utilizar en los métodos y composiciones descritos en el presente documento pueden comprender una secuencia de nucleótidos exógena que permite la manipulación posterior a la amplificación de los productos de amplificación sin un efecto significativo sobre la propia amplificación. En algunas realizaciones, el cebador puede estar flanqueado por secuencias complementarias que comprenden un fluoróforo en el extremo 5' y un inactivador de fluorescencia en el extremo 3'.
Las sondas oligonucleotídicas divulgadas en el presente documento pueden comprender una fracción emisora de fluorescencia y una fracción inactivadora de fluorescencia.
Los métodos divulgados en el presente documento son susceptibles de automatización, por lo que proporcionan una opción de alto rendimiento para la detección y/o cuantificación de especies deCandidaasociadas con la CVV (incluidasCandida glabrata, Candida albicans, Candida tropicalis, C. dubliniensis, C. parapsilosis, Candida krusei)yT. vaginalisen una muestra. Se pueden utilizar varias plataformas de PCR múltiple, por ejemplo, BD MAX™, Viper™ o Viper™ LT, para realizar una o más etapas de los métodos divulgados. Los métodos se pueden realizar de forma múltiple. Por ejemplo, la amplificación y/o la detección de ácidos nucleicos, en algunas realizaciones, comprenden la realización de PCR múltiple.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan para demostrar situaciones y entornos particulares en los que se puede aplicar esta tecnología y no pretenden restringir el alcance de la invención y de las reivindicaciones incluidas en esta divulgación. En los siguientes ejemplos, la detección de vaginosis bacteriana (VB) solo se divulga con fines de referencia y las realizaciones correspondientes no pertenecen a la invención reivindicada.
Ejemplo 1
Detección de CVV, tricomoniasis y VB en muestras de hisopado vaginal
El estudio descrito en este ejemplo muestra la detección de especies deCandidaasociadas con la CVV, la tricomoniasis y la VB mediante una prueba de diagnósticoin vitrocualitativa automatizada en muestras de hisopado vaginal. La prueba utiliza PCR en tiempo real para la amplificación de dianas de ADN y sondas de hibridación fluorogénica para la detección e identificación de organismos diana.
Se recogieron hisopos vaginales de mujeres con síntomas clínicos de vaginitis/vaginosis. Las muestras vaginales se caracterizaron mediante In Pouch™ TV paraT. vaginalismientras que el cultivo seguido de la identificación BD Phoenix™ se utilizó para especies deCandiday la puntuación de Nugent (Nugenet al.,J. Clin. Microbiol. 29(2):297-301 (1991)), como método de referencia para la VB. Los criterios de Amsel (Amselet al.,Am. J. Med. 74(1):14-22 (1983)) se utilizaron solo en la determinación de los estados de la VB para muestras con puntuación de Nugent intermedia (puntuación de Nugent 4 a 6). Tres hisopos fueron para la prueba en el sistema BD MAX™ (Becton, Dickinson and Company, New Jersey) para la detección de tricomoniasis, especies deCandidaasociadas con la CVV y de VB mediante un análisis de curva de rendimiento diagnóstico (ROC). El diagnóstico de la VB se determinó mediante un algoritmo basado en parámetros de PCR para la detección de bacterias relacionadas con la VB, incluidas las especies deLactobacillus, G. vaginalis, Atopobium vaginae, BVAB-2yMegasphaera-1.
La PCR en tiempo real para la amplificación de dianas de ADN se realizó con los cebadores proporcionados en la tabla 1 y se utilizaron las sondas de hibridación fluorogénica proporcionadas en la tabla 1 para detectar especies deCandidaasociadas con la CVV,T. vaginalisy las bacterias relacionadas con la VBL. crispatus, L. jensenii, G. vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaerade tipo 1 yBVAB2en cada una de las muestras de hisopado vaginal.
Se realizó un estudio de inclusión con cepas cultivables originarias de 12 países. El análisis del estudio de inclusión se basó en el estado positivo/negativo de cada diana individual de acuerdo con los umbrales de parámetros de PCR establecidos. Como se muestra en la tabla 2, el ensayo es capaz de detectar una gran diversidad de cepas pertenecientes a especies implicadas en la CVV, la tricomoniasis y la VB. El nivel de detección de organismos específicos en mezclas demostró un elevado nivel de sensibilidad analítica, lo que indica que los médicos pueden obtener una identificación clara de los patógenos implicados en la infección vaginal y seleccionar el tratamiento con solo una muestra vaginal.
T l 2.E i in l i n
En estudios de infección conjunta simulada, se probó una carga baja deT. vaginaliso una carga baja deC. glabratayC. kruseien presencia de cargas elevadas deC. albicans;y se probó una carga baja deT. vaginalisen presencia de una carga elevada de C.glabrata.Para cada estudio anterior, se utilizó una matriz simulada en lugar de la matriz vaginal debido a la presencia de algunas dianas en la flora vaginal de mujeres asintomáticas/sintomáticas. Los resultados de los estudios de infección conjunta simulada se muestran en la tabla 3.
Las muestras clínicas se definieron como muestra positiva/negativa para especies deCandidayT. vaginalis.Los resultados del estudio de rendimiento que se muestran en la tabla 4 demuestran que el grupo vaginal divulgado en el presente documento se puede utilizar para detectarT. vaginalisy especies de Cándida con elevada sensibilidad y especificidad.
T l 4.E i r n imi n r T. v. in i
El rendimiento del ensayo para la detección de la VB se estableció mediante un análisis de curva de rendimiento diagnóstico (ROC). Con métricas de PCR a partir de la amplificación y la detección de especies deLactobacillus, G. vaginalis, Atopobium vaginae, BVAB-2yMegasphaera-1,se construyó un algoritmo basado en un modelo de regresión logística para estimar la probabilidad positiva de la VB y dar una única identificación de VB positiva o negativa. Se consideró que los pacientes tenían VB si su probabilidad estimada superaba un umbral determinado por el análisis de la curva r Oc .
Como se muestra en la tabla 5, los resultados preliminares del rendimiento del ensayo (sensibilidad/especificidad) basados en el análisis de 771 muestras clínicas caracterizadas en total fueron del 91,9% (sensibilidad)/86,2 % (especificidad) o aumentaron al 95,4 (sensibilidad)/92,5 % (especificidad) cuando no se consideraron los resultados intermedios de la puntuación de Nugent y de los criterios de Amsel.
T l .E i r n imi n r l i n VB
Este ejemplo demuestra que las composiciones y los métodos divulgados en el presente documento se pueden utilizar para detectar organismos relacionados con la CVV, la TV y la VB con elevada especificidad y sensibilidad.
Ejemplo 2
Selección de cebadores y sondas para la detección múltiple de CVV, tricomoniasis y VB en muestras vaginales
Se han diseñado y probado varios cebadores y sondas para determinar su rendimiento en la amplificación y la detección de especies deCandidaasociadas a CVV,T. vaginalisy VB de manera individual o de forma múltiple. Las tablas 6a y 6b proporcionan varios cebadores, pares de cebadores y sondas que no se seleccionaron debido a una serie de propiedades no deseadas, incluida una señal débil, falta de amplificación, gran tamaño de amplicón, señal de falso positivo, detección no específica, sensibilidad a la variación de temperatura, fallo en la detección de un gran número de cepas variantes, limitaciones en el ensayo múltiple, selectiva de cebadores/sondas asociados e interacción con otros cebadores/sondas. Sorprendentemente, como se describe en el ejemplo 1, se encontró que varios cebadores y sondas funcionan bien en la amplificación y la detección de especies deCandidaasociadas a CVV,T. vaginalisy VB de manera individual o de forma múltiple. Las propiedades superiores de esos cebadores, sondas y algunas combinaciones de los mismos no se predijeron. Por otra parte, la capacidad de los oligonucleótidos de las SEQ ID NO: 1 a 16 para actuar de manera eficaz (es decir, amplificar y detectar de manera específica el ADN diana) en una reacción de PCR en tiempo real múltiple no se predijo. Asimismo, la capacidad de los oligonucleótidos de las SEQ ID NO: 17 a 29 para actuar de manera eficaz (es decir, amplificar y detectar de manera específica el ADN diana) en una reacción de PCR en tiempo real múltiple no se predijo.
T l. r n n l i n r l i n VB
T l .r n n l i n r l i n VV ri m ni i
En las tablas 7a y 7b se proporcionan una serie de mezclas maestras de cebadores y sondas que no se seleccionaron debido a una serie de propiedades no deseadas, incluida la señal de falso positivo y el fallo de detección de cepas variantes.
T l 7.M zl m r n l i n r l i n VB
T l 7.M z l m r n l i n r l i n VV ri m ni i
Un experto en la materia reconocerá que, para este y otros procesos y métodos divulgados en el presente documento, las funciones realizadas en los procesos y métodos se pueden implementar en diferente orden. Asimismo, las etapas y operaciones descritas solo se proporcionan como ejemplos, y algunas de las etapas y operaciones pueden ser opcionales, combinarse en menos etapas y operaciones, o expandirse en etapas y operaciones adicionales sin restar valor a la esencia de las realizaciones divulgadas.
Con respecto al uso de sustancialmente cualquier término plural y/o singular en el presente documento, los expertos en la materia pueden traducir del plural al singular y/o del singular al plural según sea apropiado al contexto y/o la aplicación. Las diversas permutaciones singular/plural se pueden exponer expresamente en el presente documento por razones de claridad.
Los expertos en la materia entenderán que, en general, los términos utilizados en el presente documento, y especialmente en las reivindicaciones adjuntas (por ejemplo, los cuerpos de las reivindicaciones adjuntas) en general se tiene la intención de que sean términos "abiertos" (por ejemplo, la expresión "que incluye" se debería interpretar como "que incluye pero sin limitación", la expresión "que tiene" se debería interpretar como "que tiene al menos", la expresión "que incluye" se debería interpretar como "que incluye pero sin limitación", etc.). Los expertos en la materia entenderán además que si se tiene la intención de un número específico de una mención de reivindicación introducida, dicha intención se mencionará explícitamente en la reivindicación y, en ausencia de dicha mención, no existirá dicha intención. Por ejemplo, como ayuda para la comprensión, las siguientes reivindicaciones adjuntas pueden contener el uso de las expresiones introductorias "al menos una" y "una o más" para introducir citaciones de las reivindicaciones. Sin embargo, el uso de tales expresiones no debe interpretarse en el sentido de que la introducción de una mención de reivindicación por los artículos indefinidos "un" o "uno/a" limita cualquier reivindicación particular que contenga dicha mención de reivindicación introducida a las realizaciones que contengan solo una mención de este tipo, incluso cuando la misma reivindicación incluye las expresiones introductorias "uno/a o más" o "al menos uno/a" y artículos indefinidos tales como "un" o "uno/a" (por ejemplo, "un" y/o "uno/a" debe interpretarse como "al menos uno/a" o "uno/a o más"); lo mismo se aplica al uso de artículos definidos para introducir menciones de reivindicaciones. Además, incluso si se menciona explícitamente un número específico de una mención de reivindicación introducida, los expertos en la materia reconocerán que dicha mención debe interpretarse en el sentido de al menos el número mencionado (por ejemplo, la simple mención de "dos menciones", sin otros modificadores, significa al menos dos menciones o dos o más menciones). Asimismo, en aquellos casos en que una convención análoga a "al menos uno de A, B y C, etc." se utilice, en general, dicha construcción está pensada en el sentido de que un experto en la materia entendería la convención (por ejemplo, "un sistema que tiene al menos uno de A, B y C" incluiría, aunque sin limitación, sistemas que tienen A solo, B solo, C solo, A y B juntos, A y C juntos, B y C juntos, y/o A, B y C juntos, etc.). En aquellos casos en que una convención análoga a "al menos uno de A, B o C, etc." se utilice, en general, dicha construcción está pensada en el sentido de que un experto en la materia entendería la convención (por ejemplo, "un sistema que tiene al menos uno de A, B o C" incluiría, aunque sin limitación, sistemas que tienen A solo, B solo, C solo, A y B juntos, A y C juntos, B y C juntos, y/o A, B y C juntos, etc.). Los expertos en la materia entenderán además que prácticamente cualquier palabra y/o expresión disyuntiva que presente dos o más términos alternativos, ya sea en la descripción, en las reivindicaciones o en los dibujos, debe entenderse que contempla las posibilidades de incluir uno de los términos o expresiones, cualquiera de los términos o expresiones o ambos términos o expresiones. Por ejemplo, se entenderá que la expresión "A o B" incluye las posibilidades de "A" o "B" o "A y B".
Además, cuando las particularidades o aspectos de la divulgación se describen en términos de grupos de Markush, los expertos en la materia reconocerán que la divulgación también se describe de esta manera en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo Markush.
Tal como entenderá el experto en la materia, para todos y cada uno de los fines, tal como en términos de proporcionar una descripción escrita, todos los intervalos divulgados en el presente documento también abarcan todos y cada uno de los posibles subintervalos y combinaciones de subintervalos de los mismos. Cualquier intervalo enumerado puede reconocerse fácilmente como lo suficientemente descriptivo y permite que el mismo intervalo se divida en al menos mitades iguales, tercios, cuartos, quintos, décimos, etc. Como ejemplo no limitante, cada intervalo analizado en el presente documento puede dividirse fácilmente en un tercio inferior, tercio medio y tercio superior, etc. También comprenderá un experto en la materia que términos lingüísticos tales como "hasta", "al menos", y similares incluyen el número citado y se refiere a los intervalos que posteriormente pueden desglosarse en subintervalos como se ha analizado anteriormente.
Siempre que se proporcione un intervalo de valores en el presente documento, el intervalo debe incluir el valor inicial, el valor final, cada valor individual o intervalo de valores entre ellos, a menos que se indique específicamente lo contrario. Por ejemplo, "de 0,2 a 0,5" significa 0,2, 0,3, 0,4, 0,5; intervalos intermedios tales como 0,2-0,3, 0,3-0,4, 0,2 0,4; incrementos intermedios tales como 0,25, 0,35, 0,225, 0,335, 0,49; intervalos de incrementos intermedios tales como 0,26-0,39; y similares. Como otro ejemplo, un grupo que tiene 1 a 3 células se refiere a grupos que tienen 1, 2 o 3 células. Asimismo, un grupo que tiene 1 a 5 células se refiere a grupos que tienen 1, 2, 3, 4 o 5 células y así sucesivamente.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para detectar especies deCandidaasociadas a la candidiasis vulvovaginal (CVV) yTrichomonas vaginalisen una muestra biológica, en donde las especies deCandidaasociadas a la CVV comprendenCandida glabrata, Candida albicans, Candida tropicalis, C. dubliniensis, C. parapsilosis, Candida krusei,que comprende:
poner en contacto dicha muestra biológica con una pluralidad de pares de cebadores, en donde la pluralidad de pares de cebadores comprende:
al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen te fl deCandida glabrata,en donde cada cebador de dicho al menos un par de cebadores comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21 o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21,
una pluralidad de cebadores capaces de hibridarse con el gen tef1 de al menos una de las especiesCandida albicans, Candida tropicalis, C. dubliniensisyC. parapsilosis,en donde cada cebador de dicho al menos un par de cebadores comprende una secuencia de la S<e>Q ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a la SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25;
al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen tef1 deCandida krusei,en donde cada cebador de dicho al menos un par de cebadores comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 28, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a la SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 28; y
al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen AP-65 deTrichomonas vaginalis,en donde cada cebador de dicho al menos un par de cebadores comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a la SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18; y
generar amplicones de las secuencias de tef1 de las especies deCandiday/o amplicones de la secuencia del gen AP-65 deTrichomonas vaginalisa partir de dicha muestra biológica, si dicha muestra comprende una o más de las especies deCandidaasociadas al CVV y/oTrichomonas vaginalis;
determinar la presencia o la cantidad de uno o más productos amplificados como indicación de la presencia de especies deCandidaasociadas al CVV yde Trichomonas vaginalisen dicha muestra biológica.
2. El método de la reivindicación 1, en donde
el par de cebadores capaces de hibridarse con el gen tef1 deCandida glabrataes las SEQ ID NO: 20 y 21; los cebadores capaces de hibridarse con el gen tef1 de al menos una deCandida albicans, Candida tropicalis, C. dubliniensisyC. parapsilosisson:
a) SEQ ID NO: 23 y 24,
b) SEQ ID NO: 23 y 25, o
c) una combinación de las mismas;
el par de cebadores capaces de hibridarse con el gen tef1 deCandida kruseiconsiste en las SEQ ID NO: 27 y 28; y
el par de cebadores capaces de hibridarse con el gen AP-65 deTrichomonas vaginalises las SEQ ID NO: 17 y 18.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde la determinación de la presencia o cantidad de uno o más productos amplificados comprende poner en contacto de los productos amplificados con una pluralidad de sondas oligonucleotídicas, en donde cada una de la pluralidad de sondas oligonucleotídicas comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 22, 26, 29, y 19, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 22, 26, 29, y 19.
4. El método de la reivindicación 3, en donde la determinación de la presencia o cantidad de uno o más productos amplificados comprende poner en contacto los productos amplificados con una pluralidad de sondas oligonucleotídicas, cada una de las cuales consiste en una secuencia de las SEQ ID NO: 22, 26, 29, y 19, o una secuencia que tenga un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 22, 26, 29 y 19.
5. El método de la reivindicación 3 o 4, en donde al menos una de la pluralidad de sondas oligonucleotídicas comprende una fracción emisora de fluorescencia y una fracción inactivadora de fluorescencia.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la pluralidad de pares de cebadores comprende un primer cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 20, un segundo cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 21, un tercer cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 23, un cuarto cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 24, un quinto cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 25, un sexto cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 27, un séptimo cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 28, un octavo cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 17 y un noveno cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 18.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dicha amplificación se lleva a cabo utilizando un método seleccionado del grupo que consiste en reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), amplificación mediada por replicasa, inmunoamplificación, amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA), replicación de secuencia autosostenida (3SR), amplificación de círculo rodante y amplificación mediada por transcripción (TMA).
8. El método de la reivindicación 7, en donde dicha PCR es PCR en tiempo real o PCR cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR).
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde cada cebador comprende una secuencia de nucleótidos exógena que permite la manipulación posterior a la amplificación de los productos de amplificación sin un efecto significativo en la propia amplificación.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde cada cebador está flanqueado por secuencias complementarias que comprenden un fluoróforo en el extremo 5' y un inactivador de fluorescencia en el extremo 3'.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde dicha muestra biológica es una muestra clínica, o en donde dicha muestra biológica se recoge de la uretra, el pene, el ano, la garganta, el cuello uterino o la vagina.
12. Una composición para la detección de especies deCandidaasociadas a la candidiasis vulvovaginal (CVV) yTrichomonas vaginalis,en donde las especies deCandidaasociadas a la CVV comprendenCandida glabrata, Candida albicans, Candida tropicalis, C. dubliniensis, C. parapsilosis, Candida krusei,que comprende:
al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen tef1 deCandida glabrata,en donde cada cebador de dicho al menos un par de cebadores comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21 o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21,
una pluralidad de cebadores capaces de hibridarse con el gen tef1 de al menos una de las especiesCandida albicans,Candida tropicalis,C. dubliniensisyC. parapsilosis, en donde cada cebador de dicho al menos un par de cebadores comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a la SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25;
al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen tef1 deCandida krusei, en donde cada cebador de dicho al menos un par de cebadores comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 28, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a la SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 28; y
al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen AP-65 deTrichomonas vaginalis,en donde cada cebador de dicho al menos un par de cebadores comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a la SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18.
13. La composición de la reivindicación 12, en donde
el al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen tef1 deCandida glabratacomprende un cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 20 y un cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 21;
la pluralidad de cebadores capaces de hibridarse con el gen tef1 de al menos uno deCandida albicans, Candida tropicalis, C. dubliniensisyC. parapsilosiscomprende un cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 23, un cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 24 y un cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 25;
el al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen tef1 deCandida kruseicomprende un cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 27 y un cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 28; y
el al menos un par de cebadores capaces de hibridarse con el gen AP-65 deTrichomonas vaginaliscomprende un cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 17 y un cebador que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 18.
14. La composición de la reivindicación 12 o 13, que comprende además una pluralidad de sondas oligonucleotídicas, en donde cada una de la pluralidad de sondas oligonucleotídicas comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 22, 26, 29 y 19, o una secuencia que tiene un emparejamiento incorrecto o dos emparejamientos incorrectos con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 22, 26, 29 y 19; y opcionalmente en donde al menos una de la pluralidad de sondas comprende una fracción emisora de fluorescencia y/o una fracción inactivadora de fluorescencia.
15. Una mezcla de reacción que comprende la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en donde la mezcla de reacción comprende además ADN molde, ADN polimerasa, desoxinucleótidos (dNTP), solución de tampón, cationes bivalentes, iones potasio de cationes monovalentes, o cualquier combinación de los mismos.
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