ES2940808T3 - Preparado fermentado con oligosacáridos no digeribles para su uso en infecciones inducidas por rotavirus - Google Patents

Preparado fermentado con oligosacáridos no digeribles para su uso en infecciones inducidas por rotavirus Download PDF

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Abstract

Se divulga un método para tratar y/o prevenir la infección por rotavirus en un lactante o niño pequeño, y sus síntomas relacionados que comprenden administrar una composición nutricional que es al menos parcialmente fermentada por bacterias productoras de ácido láctico y comprende oligosacáridos no digeribles. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Preparado fermentado con oligosacáridos no digeribles para su uso en infecciones inducidas por rotavirus CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La presente invención pertenece al campo de los preparados nutricionales para bebés y niños pequeños, preparados para lactantes, para el tratamiento o prevención de la infección por rotavirus.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0002] Las infecciones virales son comunes entre las personas de todas las edades, pero parecen concentrarse con frecuencia en bebés y niños. Muchas infecciones virales provocan fiebre y dolores o molestias corporales y no son tan graves, y la mayoría de los niños con infecciones virales mejora sin tratamiento. En particular durante la infancia, a los padres les resulta difícil saber si su bebé está enfermo con una infección potencialmente grave y requiere atención médica inmediata. El rotavirus (RV) es el principal agente etiológico mundial de diarrea deshidratante grave en niños menores de 5 años. El RV infecta y se replica principalmente en los enterocitos maduros que no se dividen cerca de las puntas de las vellosidades del intestino delgado. Como resultado, los bebés desarrollan diarrea, vómitos y fiebre durante entre 3 días y 1 semana, generalmente con reinfecciones, que tienden a ser menos graves que la primera infección. El tratamiento más común consiste en soluciones de rehidratación oral (SRO). Como la patogenia del RV en humanos aún no está clara y las vacunas contra el RV no se han implementado a nivel mundial, la modulación mediante intervenciones nutricionales con componentes bioactivos es de interés.
[0003] La leche humana es el alimento preferido para los bebés. La leche humana proporciona varios factores bioactivos que benefician al sistema inmunitario relativamente inmaduro de los neonatos en etapas tempranas de la vida y pueden prevenir o reducir la gravedad de la infección por rotavirus, como la lactoferrina y los oligosacáridos de la leche humana. Sin embargo, no siempre es posible o deseable dar leche materna a un bebé. En tales casos, los preparados para lactantes o los preparados de continuación son una buena alternativa. Estos preparados deben tener una composición óptima para imitar los efectos beneficiosos de la leche humana de la manera más similar posible.
[0004] En los últimos años se han estudiado varias intervenciones nutricionales con compuestos bioactivos. Entre estos compuestos, los probióticos han sido los más estudiados debido a sus conocidos efectos inmunomoduladores y a su acción directa, a menudo en el intestino delgado, que es el punto principal de infección por RV. En el documento de patente WO 00/53201 se describen cepas de bacterias ácido lácticas capaces de prevenir la diarrea y prevenir la infección por rotavirus. En el documento WO 2004/2168 se describen bifidobacterias para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, incluida la diarrea asociada a rotavirus. En el documento WO 02/39834 se describen bacterias probióticas para prevenir o inhibir el rotavirus de la diarrea. En el documento EP 2407532 se describe que una cepa probiótica y su sobrenadante de B. Brevis previene el crecimiento in vitro de rotavirus. En Rigo-Adrovers et al, 2017, British Journal of Nutrition, 117, 209-217, se probaron dos conceptos diferentes. La primera es un preparado fermentado inactivado por calor, y la segunda es una mezcla específica de galacto-oligosacáridos de cadena corta, fructo-oligosacáridos de cadena larga y oligosacáridos ácidos derivados de la pectina. Ambos conceptos nutricionales provocaron una mejoría de los síntomas clínicos de la infección por rotavirus. En Rigo-Adrover et al 2018, Frontiers in Immunology, doi:10.3389/fimmu.2018.01318, se describió un estudio sobre el papel preventivo de una mezcla de galactooligosacáridos de cadena corta y fructo-oligosacáridos de cadena larga y del probiótico Bifidobacterium brevis M-16V y de la combinación de la mezcla prebiótica y el probiótico en un modelo de doble infección por RV en ratas. Las intervenciones en la dieta mejoraron los síntomas clínicos después de la primera infección.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0005] Los inventores han probado una combinación de preparado fermentado y una mezcla de oligosacáridos no digeribles contra los efectos de la infección por rotavirus. Sorprendentemente, la combinación de preparado fermentado con oligosacáridos no digeribles dio como resultado una unión mucho mayor de las partículas de rotavirus en comparación con la unión de los componentes individuales del preparado fermentado o los oligosacáridos no digeribles. La infección por rotavirus y sus síntomas inducidos se estudió utilizando un modelo con ratas jóvenes. La infección por rotavirus indujo la pérdida de peso, que se observó principalmente después del período de diarrea, y los efectos inducidos por el rotavirus en el peso de los órganos mejoraron en el grupo que recibió una combinación de preparado fermentado y una mezcla de oligosacáridos no digeribles. La administración de preparado fermentado con oligosacáridos no digeribles dio como resultado una reducción de la incidencia, de la duración y de la gravedad de la diarrea inducida por rotavirus. Además, se observó una reducción de la excreción del virus. Además, la permeabilidad de la barrera intestinal en animales infectados con rotavirus disminuyó más en el grupo al que se administró la combinación de preparado fermentado y oligosacáridos no digeribles según lo determinado por alfa 1 antitripsina.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0006] Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método para tratar y/o prevenir la infección por rotavirus o la diarrea inducida por rotavirus en un bebé o un niño pequeño, que comprende administrar al bebé o niño pequeño una composición nutricional que está fermentada al menos parcialmente por bacterias productoras de ácido láctico y comprende oligosacáridos no digeribles.
[0007] La invención también se puede describir como el uso de una composición fermentada y oligosacáridos no digeribles para la fabricación de una composición nutricional que está fermentada al menos parcialmente por bacterias productoras de ácido láctico y comprende oligosacáridos no digeribles, para usar en el tratamiento y/o prevenir la infección por rotavirus o la diarrea inducida por rotavirus en un bebé o niño pequeño.
[0008] La invención también se puede describir como una composición nutricional que está fermentada al menos parcialmente por bacterias productoras de ácido láctico y comprende oligosacáridos no digeribles, para usar en el tratamiento y/o prevención de infecciones por rotavirus o diarrea inducida por rotavirus en un bebé o niño pequeño.
[0009] En una forma de realización, tratar y/o prevenir la infección por rotavirus o la diarrea inducida por rotavirus es
a. reducir la incidencia de la diarrea inducida por rotavirus o la infección por rotavirus,
b. reducir la duración de la diarrea inducida por rotavirus o la infección por rotavirus,
c. reducir la gravedad de la diarrea inducida por rotavirus o la infección por rotavirus,
d. prevenir un crecimiento reducido o un crecimiento deficiente y/o un desarrollo reducido o un desarrollo deficiente inducido por rotavirus,
e. aumentar el bloqueo de partículas de rotavirus,
f. reducir la carga rotaviral, y/o
g. aumentar la función de barrera intestinal durante la infección por rotavirus.
[0010] La presente invención también se refiere a un método para
a. reducir la incidencia de la diarrea inducida por rotavirus o la infección por rotavirus,
b. reducir la duración de la diarrea inducida por rotavirus o la infección por rotavirus,
c. reducir la gravedad de la diarrea inducida por rotavirus o la infección por rotavirus,
d. prevenir un crecimiento reducido o un crecimiento deficiente y/o un desarrollo reducido o un desarrollo deficiente inducido por rotavirus,
e. aumentar el bloqueo de partículas de rotavirus,
f. reducir la carga rotaviral, y/o
g. aumentar la función de barrera intestinal durante la infección por rotavirus,
[0011] en un bebé o niño pequeño, que comprende administrar al bebé o niño pequeño una composición nutricional que está fermentada al menos parcialmente por bacterias productoras de ácido láctico y que comprende oligosacáridos no digeribles.
[0012] La invención también se puede definir como el uso de una composición fermentada y oligosacáridos no digeribles para la fabricación de una composición nutricional que está fermentada al menos parcialmente por bacterias productoras de ácido láctico y comprende oligosacáridos no digeribles, para su uso para
a. reducir la incidencia de la diarrea inducida por rotavirus o la infección por rotavirus,
b. reducir la duración de la diarrea inducida por rotavirus o la infección por rotavirus,
c. reducir la gravedad de la diarrea inducida por rotavirus o la infección por rotavirus,
d. prevenir un crecimiento reducido o un crecimiento deficiente y/o un desarrollo reducido o un desarrollo deficiente inducido por rotavirus,
e. aumentar el bloqueo de partículas de rotavirus,
f. reducir la carga rotaviral, y/o
g. aumentar la función de barrera intestinal durante la infección por rotavirus,
en un bebé o niño pequeño.
[0013] La invención también puede definirse como una composición nutricional que está fermentada al menos parcialmente por bacterias productoras de ácido láctico y comprende oligosacáridos no digeribles, para su uso para
a. reducir la incidencia de la diarrea inducida por rotavirus o la infección por rotavirus,
b. reducir la duración de la diarrea inducida por rotavirus o la infección por rotavirus,
c. reducir la gravedad de la diarrea inducida por rotavirus o la infección por rotavirus,
d. prevenir un crecimiento reducido o un crecimiento deficiente y/o un desarrollo reducido o un desarrollo deficiente inducido por rotavirus,
e. aumentar el bloqueo de partículas de rotavirus,
f. reducir la carga rotaviral, y/o
g. aumentar la función de barrera intestinal durante la infección por rotavirus,
en un bebé o niño pequeño.
Composición fermentada
[0014] La composición nutricional en los métodos o usos de acuerdo con la presente invención, en lo sucesivo denominada también la presente composición nutricional, o composición nutricional de la invención o composición nutricional final, está fermentada al menos parcialmente. Una composición nutricional fermentada parcialmente comprende al menos en parte una composición fermentada por bacterias productoras de ácido láctico. Por tanto, en el contexto de la presente invención, una composición nutricional que está fermentada al menos parcialmente se refiere a una composición nutricional que comprende un sustrato de leche fermentado por bacterias productoras de ácido láctico. Se demostró que la presencia de composición fermentada en la composición nutricional final da como resultado, tras la administración, un efecto contra la diarrea por rotavirus y sus síntomas.
[0015] La fermentación tiene lugar preferiblemente durante el proceso de producción de la composición nutricional. Preferiblemente, la composición nutricional no contiene cantidades significativas de bacterias viables en el producto final, y esto puede lograrse mediante inactivación por calor después de la fermentación o inactivación por otros medios. Preferiblemente, la composición fermentada es un producto derivado de la leche, que es un sustrato de leche fermentado por bacterias productoras de ácido láctico, en el que el sustrato de leche comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en leche, suero, proteína de suero, hidrolizado de proteína de suero, caseína, hidrolizado de caseína o mezclas de estos. Adecuadamente, las composiciones nutricionales que comprenden composiciones fermentadas y oligosacáridos no digeribles y la forma de producirlos se describen en WO 2009/151330, WO 2009/151331 y WO 2013/187764.
[0016] La composición fermentada comprende preferiblemente fragmentos de células bacterianas como glucoproteínas, glucolípidos, peptidoglucano, ácido lipoteicoico (LTA), lipoproteínas, nucleótidos y/o polisacáridos capsulares. Es ventajoso usar la composición fermentada que comprende bacterias inactivadas y/o fragmentos de células directamente como parte del producto nutricional final, ya que esto dará como resultado una mayor concentración de fragmentos de células bacterianas. Cuando se utilizan preparaciones comerciales de bacterias productoras de ácido láctico, estas normalmente se lavan y el material se separa del medio de crecimiento acuoso que comprende los fragmentos de células bacterianas, reduciendo o eliminando así la presencia de fragmentos de células bacterianas. Además, tras la fermentación y/u otras interacciones de las bacterias productoras de ácido láctico con el sustrato de la leche, se pueden formar compuestos bioactivos adicionales, como ácidos grasos de cadena corta, péptidos y/u oligosacáridos bioactivos y otros metabolitos, que también pueden resultar en una función de la microbiota intestinal más parecida a la función de la microbiota intestinal de los bebés. Dichos compuestos bioactivos que se producen durante la fermentación por bacterias productoras de ácido láctico también pueden denominarse posbióticos. Se cree que una composición que comprende dichos posbióticos es ventajosamente más parecida a la leche materna, ya que la leche materna no es una fórmula sintética limpia, sino que contiene metabolitos, células bacterianas, fragmentos de células y similares. Por lo tanto, se cree que la composición fermentada, en particular el producto derivado de leche fermentada, tiene un efecto mejorado en comparación con el producto derivado de leche no fermentada sin o con meras bacterias productoras de ácido láctico sobre el efecto antirrotavirus.
[0017] Preferiblemente, la composición nutricional final comprende del 5 al 97,5 % en peso de la composición fermentada con respecto al peso en seco, más preferiblemente del 10 al 90 % en peso, más preferiblemente del 20 al 80 % en peso, incluso más preferiblemente del 25 al 60 % en peso. Como forma de especificar que la composición nutricional final comprende al menos parcialmente una composición fermentada, y para especificar el grado de fermentación, se puede tomar la cantidad de la suma de ácido láctico y lactato de la composición nutricional final, ya que este es el producto final metabólico producido por las bacterias productoras de ácido láctico tras la fermentación. La presente composición nutricional final comprende preferiblemente del 0,02 al 1,5 % en peso de la suma de ácido láctico y lactato con respecto al peso en seco de la composición, más preferiblemente del 0,05 al 1,0 % en peso, incluso más preferiblemente del 0,2 al 0,5 % en peso. Preferiblemente, al menos el 50 % en peso, incluso más preferiblemente al menos el 90 % en peso, de la suma de ácido láctico y lactato está en forma de isómero L(+). Por tanto, en una forma de realización, la suma de ácido láctico L(+) y lactato L(+) es superior al 50 % en peso, más preferiblemente superior al 90 % en peso, con respecto a la suma total de ácido láctico y lactato. En el presente documento, lactato L(+) y ácido láctico L(+) también se denominan L-lactato y ácido L-láctico.
Bacterias productoras de ácido láctico utilizadas para producir la composición fermentada
[0018] Las bacterias productoras de ácido láctico utilizadas para preparar la composición fermentada, en particular para la fermentación del sustrato lácteo, se proporcionan preferiblemente como un cultivo único o mixto. Las bacterias productoras de ácido láctico consisten en los géneros Bifidobacterium, Lactobacillus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus y Weissella. Preferiblemente, las bacterias productoras de ácido láctico utilizadas para la fermentación comprenden bacterias del género Bifidobacterium y/o Streptococcus.
[0019] Preferiblemente, el Streptococcus es una cepa de S. termophilus. La selección de una cepa adecuada de S. termophilus se describe en el ejemplo 2 de la patente EP 778885 y en el ejemplo 1 de la patente FR 2723960. En otra forma de realización preferida según la presente invención, la composición nutricional comprende 102­ 105 ufc de bacterias vivas de S. termophilus, por g de peso en seco de la composición nutricional final, preferiblemente la composición nutricional final comprende 103-104 bacterias vivas de S. termophilus por gramo de peso en seco.
[0020] Las cepas preferidas de S. termophilus para preparar la composición fermentada para los fines de la presente invención han sido depositaas por Compagnie Gervais Danone en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) administrada por el Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, París, Francia el 23 de agosto de 1995 con el número de acceso 1-1620 y el 25 de agosto de 1994 con el número de acceso I-1470. Otras cepas de S. termophilus están disponibles en el mercado.
[0021] Las bifidobacterias son bacterias grampositivas, anaerobias, con forma de bastón. Las especies de Bifidobacterium preferidas para preparar la composición fermentada para los fines de la presente invención tienen preferiblemente al menos un 95 % de identidad de la secuencia de ARNr 16 S en comparación con la cepa tipo de la respectiva especie Bifidobacterium, más preferiblemente al menos un 97 % de identidad como se define en los manuales sobre este tema, por ejemplo Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2.a ed., Cold Spring Harbor (N.Y.) Laboratory Press. Las bifodobacterias preferiblemente utilizadas también están descritas por Scardovi, V. Genus Bifidobacterium. p.1418- p.1434. En: Bergey's manual of systematic Bacteriology. vol. 2. Sneath, PHA, NS Mair, ME Sharpe y J.G. Holt (ed.). Baltimore: Williams & Wilkins. 1986. 635 pp. Preferiblemente, la bacteria productora de ácido láctico utilizada para la fermentación comprende o es al menos una Bifidobacterium seleccionada del grupo formado por B. Brevis, B. infantis, B. bifidum, B. catenulatum, B. adolescentis, B. thermophilum, B. gallicum, B. animalis o lactis, B. angulatum, B. pseudocatenulatum, B. thermacidophilum y B. longum más preferiblemente B. Brevis, B. infantis, B. bifidum, B. catenulatum, B. longum, más preferiblemente B. longum y B brevis, incluso más preferiblemente B brevis, más preferiblemente B. brevis seleccionadas del grupo formado por B. brevis Bb-03 (Rhodia/Danisco), B. brevis M-16V (Morinaga), B. brevis R0070 (Instituto Rosell, Lallemand), B brevis BR03 (Probiotical), B brevis BR92 (Cell Biotech) DSM 20091, LMG 11613 y B. brevis 1-2219 depositadas en la CNCM, París Francia. De la manera más preferible, la bacteria B. brevis es B. brevis M-16V (Morinaga) o B. brevis I-2219, aún más preferiblemente B. brevis I-2219.
[0022] De la manera más preferible, la composición nutricional de la invención comprende una composición fermentada que está fermentada por bacterias productoras de ácido láctico que comprenden tanto B. brevis como S. termophilus. En una forma de realización, la fermentación por bacterias productoras de ácido láctico es la fermentación por Streptococcus thermophilus y Bifidobacterium brevis. En una forma de realización, la composición nutricional final comprende una composición fermentada en la que las bacterias productoras de ácido láctico se inactivan después de la fermentación.
[0023] Preferiblemente, la composición fermentada no es fermentada por Lactobacillus bulgaricus. Los productos fermentados por L. bulgaricus no se consideran adecuados para los bebés, ya que en los bebés de corta edad la deshidrogenasa específica que convierte el D-lactato en piruvato es mucho menos activa que la deshidrogenasa que convierte el L-lactato.
[0024] Preferiblemente, la composición nutricional de la invención comprende bacterias productoras de ácido láctico inactivadas y/o fragmentos bacterianos derivados de bacterias productoras de ácido láctico que equivalen a más de 1 x 104 ufc de bacterias productoras de ácido láctico por g con respecto al peso en seco de la composición final, más preferiblemente 1 x 105 ufc, aún más preferiblemente 1 x 106 ufc. Preferiblemente, las bacterias inactivadas o los fragmentos bacterianos son equivalentes a menos de 1 x 1013 ufc de bacterias productoras de ácido láctico por g con respecto al peso en seco de la composición final, más preferiblemente 1x1011 ufc, aún más preferiblemente 1 x 1010 ufc. La correlación de las bacterias ácido lácticas inactivadas y la equivalencia con las ufc se puede determinar mediante técnicas moleculares, conocidas en la técnica, o comprobando el proceso de producción.
Proceso de fermentación
[0025] Preferiblemente, la composición fermentada es un producto derivado de la leche, que es un sustrato de leche fermentado por bacterias productoras de ácido láctico, comprendiendo dicho sustrato de leche al menos uno seleccionado del grupo que consiste en leche, suero, proteína de suero, hidrolizado de proteína de suero, caseína, hidrolizado de caseína o mezclas de los mismos. El producto derivado de la leche o sustrato lácteo destinado a la fermentación está adecuadamente presente en un medio acuoso. El sustrato de leche destinado a la fermentación comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en leche, suero, proteína de suero, hidrolizado de proteína de suero, caseína, hidrolizado de caseína o mezclas de los mismos. La leche puede ser leche entera, leche semidesnatada y/o leche desnatada. Preferiblemente, el sustrato de destinado a la fermentación comprende leche desnatada. El suero puede ser suero dulce y/o suero ácido. Preferiblemente, el suero está presente en una concentración de 3 a 80 g de peso en seco por litro de medio acuoso que contiene sustrato lácteo, más preferiblemente de 40 a 60 g por litro. Preferiblemente, el hidrolizado de proteína de suero está presente en 2 a 80 g de peso en seco por litro de medio acuoso que contiene sustrato de leche, más preferiblemente de 5 a 15 g/l. Preferiblemente, la lactosa está presente en 5 a 50 g de peso en seco por litro de sustrato acuoso, más preferiblemente de 1 a 30 g/l. Preferiblemente, el sustrato de leche que contiene el medio acuoso comprende tampón salino para mantener el pH dentro de un rango deseado. Preferiblemente se usa dihidrógeno fosfato de sodio o potasio como tampón salino, preferiblemente a razón de 0,5 a 5 g/l, más preferiblemente de 1,5 a 3 g por litro. Preferiblemente, el medio acuoso que contiene sustrato lácteo comprende cisteína en una cantidad de 0,1 a 0,5 g por litro de sustrato acuoso, más preferiblemente de 0,2 a 0,4 g/l. La presencia de cisteína da como resultado un potencial redox bajo del sustrato, lo que es ventajoso para la actividad de las bacterias productoras de ácido láctico, particularmente bifidobacterias. Preferiblemente, el medio acuoso que contiene sustrato lácteo comprende extracto de levadura en una cantidad de 0,5 a 5 g/l de medio acuoso que contiene sustrato lácteo, más preferiblemente de 1,5 a 3 g/l. El extracto de levadura es una rica fuente de cofactores enzimáticos y factores de crecimiento para las bacterias productoras de ácido láctico. La presencia de extracto de levadura mejorará la fermentación por bacterias productoras de ácido láctico.
[0026] Adecuadamente, el sustrato de leche, en particular el medio acuoso que contiene sustrato de leche, se pasteuriza antes del paso de fermentación, para eliminar la presencia de bacterias vivas no deseadas. Convenientemente, el producto se pasteuriza después de la fermentación, para inactivar las enzimas. Convenientemente, la inactivación de las enzimas tiene lugar a 75 °C durante 3 min. Adecuadamente, el medio acuoso que contiene sustrato lácteo se homogeneiza antes y/o el producto derivado de la leche se homogeneiza después de la fermentación. La homogeneización da como resultado un sustrato y/o producto fermentado más estable, especialmente en presencia de grasa.
[0027] La densidad de inoculación es preferiblemente de entre 1x102 a 5*1010, preferiblemente de entre 1*104 a 5*109 ufc de bacterias productoras de ácido láctico/ml de medio acuoso que contiene sustrato lácteo, más preferiblemente de entre 1*107 a 1*109 ufc de bacterias productoras de ácido láctico/ml de medio acuoso que contiene sustrato de leche. La densidad final de bacterias después de la fermentación es preferiblemente de entre 1 x 103 a 1x1010, más preferiblemente de entre 1x104 a 1x109 ufc/ml de medio acuoso que contiene sustrato de leche.
[0028] La fermentación se realiza preferiblemente a una temperatura de aproximadamente 20 °C a 50 °C, más preferiblemente de 30 °C a 45 °C, incluso más preferiblemente de aproximadamente 37 °C a 42 °C. La temperatura óptima para el crecimiento y/o actividad de las bacterias productoras de ácido láctico, más particularmente los lactobacilos y/o las bifidobacterias, está entre 37 °C y 42 °C.
[0029] La incubación se realiza preferiblemente a un pH de 4 a 8, más preferiblemente de 6 a 7,5. Este pH no induce la precipitación de proteínas y/o un sabor adverso, mientras que, al mismo tiempo, las bacterias productoras de ácido láctico, como los lactobacilos y/o las bifidobacterias, son capaces de fermentar el sustrato lácteo.
[0030] El tiempo de incubación oscila preferiblemente entre 10 minutos y 48 horas, preferiblemente entre 2 horas y 24 horas, más preferiblemente entre 4 horas y 12 horas. Un tiempo suficientemente largo permite que la fermentación y la producción concomitante de fragmentos de células inmunogénicas tales como glucoproteínas, glucolípidos, peptidoglucano, ácido lipoteicoico (LTA), flagelos, lipoproteínas, ADN y/o polisacáridos capsulares y metabolitos (postbióticos) tenga lugar en una cantidad suficiente o en mayor medida, mientras que no es necesario un tiempo de incubación innecesariamente largo por razones económicas.
[0031] Preferiblemente, un producto derivado de la leche o sustrato de leche, preferiblemente leche desnatada, se pasteuriza, enfría y fermenta con una o más cepas productoras de ácido láctico, preferiblemente una cepa de S. thermophilus, a un cierto grado de acidez, al que el producto fermentado se enfría y almacena. Preferiblemente, un segundo producto derivado de la leche se prepara de manera similar usando una o más especies de Bifidobacterium para la fermentación. Posteriormente, los dos productos fermentados se mezclan preferiblemente entre sí y se mezclan con otros componentes que componen un preparado para lactantes, excepto el componente graso. Preferiblemente, la mezcla se precalienta y, posteriormente, la grasa se agrega en línea, se homogeneiza, se pasteuriza y se seca. Alternativamente, la fermentación tiene lugar con Bifidobacterium, preferiblemente B brevis, y S. termophilus ambos en el tanque de fermentación.
[0032] Los procedimientos para preparar una composición fermentada adecuados para el propósito de la presente invención son conocidos de por sí. En la patente EP 778885, que se incorpora a la presente por referencia, se describe en particular en el ejemplo 7 un proceso adecuado para preparar una composición fermentada. En la patente FR 2723960, que se incorpora a la presente por referencia, se describe, en particular en el ejemplo 6, un proceso adecuado para preparar una composición fermentada. Brevemente, se concentra un sustrato de leche, preferiblemente pasteurizado, que contiene lactosa y opcionalmente otros macronutrientes tales como grasas, preferiblemente grasas vegetales, caseína, proteína de suero, vitaminas y/o minerales, etc, a entre un 15 y un 50 % de materia seca y luego se inocula con S. thermophilus, por ejemplo con un 5 % de un cultivo que contiene 106 a 1010 bacterias por ml. Preferiblemente, este sustrato de leche comprende péptidos de proteína de leche. La temperatura y la duración de la fermentación son las mencionadas anteriormente. Adecuadamente, después de la fermentación, la composición fermentada puede pasteurizarse o esterilizarse y, por ejemplo, secarse por pulverización o liofilizarse para proporcionar una forma adecuada para formularse en el producto final.
[0033] Un método preferido para preparar la composición fermentada que se utilizará en la composición nutricional de la invención se describe en el documento de patente WO 01/01785, más particularmente en los ejemplos 1 y 2. Un método preferido para preparar la composición fermentada para utilizar en la composición nutricional de la invención se describe en WO 2004/093899, más particularmente en el ejemplo 1.
[0034] Las células vivas de bacterias productoras de ácido láctico en la composición fermentada se eliminan preferiblemente después de la fermentación, por ejemplo mediante inactivación y/o eliminación física. Preferiblemente, las células se inactivan. Preferiblemente, las bacterias productoras de ácido láctico se eliminan por calor después de la fermentación del sustrato de leche. Las formas preferibles de eliminación por calor son la pasteurización (flash), la esterilización, el tratamiento a temperatura ultra alta, el tratamiento térmico a alta temperatura/corto tiempo y/o el secado por atomización a temperaturas a las que las bacterias no sobreviven. Los fragmentos de células se obtienen preferiblemente mediante tratamiento térmico. Con este tratamiento térmico se inactiva preferiblemente al menos el 90 % de los microorganismos vivos, más preferiblemente al menos el 95 %, aún más preferiblemente al menos el 99 %. Preferiblemente, la composición nutricional fermentada comprende menos de 1x105 unidades formadoras de colonias (ufc) de bacterias ácido lácticas vivas por gramo de peso en seco. El tratamiento térmico se realiza preferiblemente a una temperatura que oscila entre 70 y 180 °C, preferiblemente entre 80 y 150 °C, preferiblemente durante aproximadamente 3 minutos a 2 horas, preferiblemente de 80 a 140 °C durante 5 minutos a 40 minutos. Ventajosamente, la inactivación de las bacterias ácido lácticas da como resultado una menor acidificación posterior y un producto más seguro. Esto es especialmente ventajoso cuando la composición nutricional se va a administrar a bebés o niños pequeños y, aun con una composición fermentada que comprendía bacterias ácido lácticas inactivadas se observaron efectos beneficiosos sobre las infecciones por rotavirus. Adecuadamente, después de la fermentación, la composición fermentada puede pasteurizarse o esterilizarse y, por ejemplo, secarse por pulverización o liofilizarse para proporcionar una forma adecuada para formularse en el producto final.
Oligosacáridos no digeribles
[0035] La presente composición nutricional comprende oligosacáridos no digeribles y preferiblemente comprende al menos dos oligosacáridos no digeribles diferentes, en particular dos fuentes diferentes de oligosacáridos no digeribles. La presencia de oligosacáridos no digeribles es necesaria para mejorar los efectos sobre la infección por rotavirus. La presencia tanto de los oligosacáridos no digeribles como de la composición fermentada al menos parcialmente, en particular el producto derivado de la leche obtenido por fermentación con bacterias productoras de ácido láctico, es necesaria para mejorar el efecto anti-rotavirus, en particular en la unión de las partículas del rotavirus, o en el bloqueo de partículas en los sitios de adhesión en las células epiteliales intestinales.
[0036] El término "oligosacáridos", tal como se usa en el presente documento, se refiere a sacáridos con un grado de polimerización (GP) de 2 a 250, preferiblemente un GP de 2 a 100, más preferiblemente de 2 a 60, incluso más preferiblemente de 2 a 10. Si el oligosacárido con un GP de 2 a 100 se incluye en la presente composición nutricional, esto da como resultado composiciones que pueden contener oligosacáridos con un GP de 2 a 5, un GP de 50 a 70 y un GP de 7 a 60. El término "oligosacáridos no digeribles" como se usa en la presente invención se refiere a oligosacáridos que no se digieren en el intestino por la acción de ácidos o enzimas digestivas presentes en el tubo digestivo superior humano, por ejemplo, en el intestino delgado y el estómago, sino que preferiblemente son fermentados por la microbiota intestinal humana. Por ejemplo, la sacarosa, la lactosa, la maltosa y las maltodextrinas se consideran digeribles.
[0037] Preferiblemente, los presentes oligosacáridos no digeribles son solubles. El término "soluble" como se usa en el presente documento, cuando hace referencia a polisacáridos, fibras u oligosacáridos, significa que la sustancia es al menos soluble de acuerdo con el método descrito por L. Prosky y col., J. Assoc. Off. Anal. Chem 71, 1017-1023 (1988).
[0038] Los oligosacáridos no digeribles incluidos en las presentes composiciones nutricionales en los métodos o usos según la presente invención incluyen preferiblemente una mezcla de diferentes oligosacáridos no digeribles. Los oligosacáridos no digeribles se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en fructo-oligosacáridos, tales como inulina, dextrinas no digeribles, galacto-oligosacáridos, tales como transgalacto-oligosacáridos, xilooligosacáridos, arabino-oligosacáridos, arabinogalacto-oligosacáridos, gluco-oligosacáridos, gentiooligosacáridos, glucomano-oligosacáridos, galactomano-oligosacáridos, manano-oligosacáridos, isomaltooligosacáridos, nigero-oligosacáridos, glucomano-oligosacáridos, quito-oligosacáridos, oligosacáridos de soja, fuco-oligosacáridos, sialiloligosacáridos y mezclas de los mismos. Dichos oligosacáridos comparten muchas propiedades bioquímicas y tienen beneficios funcionales similares, incluida la mejora de la función de la microbiota intestinal. Sin embargo, se entiende que algunos oligosacáridos no digeribles y, preferiblemente, algunas mezclas tienen un efecto aún más mejorado. Por lo tanto, más preferiblemente, los oligosacáridos no digeribles se seleccionan del grupo que consiste en fructo-oligosacáridos, tales como inulina, y galactooligosacáridos, tales como betagalacto-oligosacáridos, y mezclas de los mismos, aún más preferiblemente betagalacto-oligosacáridos y/o inulina, de la manera más preferible betagalacto-oligosacáridos. En una forma de realización, en la composición nutricional según la presente invención, los oligosacáridos no digeribles se seleccionan del grupo que consiste en galacto-oligosacáridos, fructo-oligosacáridos y mezclas de los mismos, más preferiblemente betagalacto-oligosacáridos, fructo-oligosacáridos y mezclas de los mismos.
[0039] El oligosacárido no digerible se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en beta-galactooligosacárido, alfa-galacto-oligosacárido y galactano. De acuerdo con una forma de realización más preferida, el oligosacárido no digerible es beta-galacto-oligosacárido. Preferiblemente, el oligosacárido no digerible comprende galacto-oligosacárido con enlaces glucosídicos beta (1,4), beta (1,3) y/o beta (1,6) y una glucosa terminal. El transgalacto-oligosacárido está disponible, por ejemplo, con el nombre comercial Vivinal®GOS (Domo FrieslandCampina Ingredients), Bi2muno (Clasado), Cup-oligo (Nissin Sugar) y Oligomate55 (Yakult).
[0040] Los oligosacáridos no digeribles comprenden preferiblemente fructo-oligosacáridos. Los fructooligosacáridos pueden, en otro contexto, tener nombres como fructopolisacáridos, oligofructosa, polifructosa, polifructano, inulina, leván y fructano y pueden referirse a oligosacáridos que comprenden unidades de fructosa unidas por enlaces beta, que están preferiblemente unidas por enlaces beta (2,1) y/o beta glucosídicos, y un GP preferible de entre 2 y 200. Preferiblemente, los fructo-oligosacáridos contienen una glucosa terminal con enlace beta (2,1) glucosídico. Preferiblemente, los fructo-oligosacáridos contienen al menos 7 unidades de fructosa unidas por enlaces beta. En otra forma de realización preferida, se usa inulina. La inulina es un tipo de fructooligosacárido en el que al menos el 75 % de los enlaces glucosídicos son enlaces beta (2,1). Por lo general, la inulina tiene una longitud de cadena media de entre 8 y 60 unidades de monosacáridos. Un fructooligosacárido adecuado para usar en las composiciones de la presente invención está disponible en el mercado con el nombre comercial Raftiline®HP (Orafti). Otras fuentes adecuadas son Raftilose (Orafti), Fibrulose y Fibruline (Cosucra) y Frutafit y Frutalose (Sensus).
[0041] Preferiblemente, la presente composición nutricional comprende una mezcla de galacto-oligosacáridos y fructo-oligosacáridos. Preferiblemente, la mezcla de galacto-oligosacáridos y fructo-oligosacáridos está presente en una proporción en peso de 1/99 a 99/1, más preferiblemente de 1/19 a 19/1, más preferiblemente de 1/1 a 19/1, más preferiblemente de 2/1 a 15/1, más preferiblemente de 5/1 a 12/1, incluso más preferiblemente de 8/1 a 10/1, incluso más preferiblemente en una proporción de aproximadamente 9/1. Esta proporción en peso es particularmente ventajosa cuando los galacto-oligosacáridos tienen un GP medio bajo y los fructo-oligosacáridos tienen un GP relativamente alto. La más preferida es una mezcla de galacto-oligosacáridos con un GP medio por debajo de 10, preferiblemente por debajo de 6, y fructo-oligosacáridos con un GP medio por encima de 7, preferiblemente por encima de 11, incluso más preferiblemente por encima de 20.
[0042] Preferiblemente, la presente composición nutricional comprende una mezcla de fructo-oligosacáridos de cadena corta y fructo-oligosacáridos de cadena larga. Preferiblemente, la mezcla de fructo-oligosacáridos de cadena corta y fructo-oligosacáridos de cadena larga está presente en una proporción en peso de 1/99 a 99/1, más preferiblemente de 1/19 a 19/1, incluso más preferiblemente de 1/10 a 19/1, más preferiblemente de 1/5 a 15/1, más preferiblemente de 1/1 a 10/1. Se prefiere una mezcla de fructo-oligosacáridos de cadena corta con un GP medio por debajo de 10, preferiblemente por debajo de 6 y fructo-oligosacáridos con un GP medio por encima de 7, preferiblemente por encima de 11, incluso más preferiblemente por encima de 20.
[0043] Preferiblemente, la presente composición nutricional comprende una mezcla de fructo-oligosacáridos de cadena corta y galactooligosacáridos de cadena corta. Preferiblemente, la mezcla de fructo-oligosacáridos de cadena corta y galacto-oligosacáridos de cadena corta está presente en una proporción en peso de 1/99 a 99/1, más preferiblemente de 1/19 a 19/1, aún más preferiblemente de 1/10 a 19/1, más preferiblemente de 1/5 a 15/1, más preferiblemente de 1/1 a 10/1. Se prefiere una mezcla de fructo-oligosacáridos y galacto-oligosacáridos de cadena corta con un GP medio por debajo de 10, preferiblemente por debajo de 6.
[0044] Preferiblemente, la composición nutricional no comprende oligosacáridos ácidos derivados de pectina. Dichos oligosacáridos son ricos en oligosacáridos de ácido galacturónico. En el contexto de la presente invención, los oligosacáridos ácidos derivados de pectina se caracterizan por ser una mezcla de oligómeros de ácido galacturónico con un grado de polimerización de 2-30. Por lo tanto, preferiblemente la presente composición no comprende oligosacáridos de ácido galacturónico. Estos oligosacáridos son ampliamente conocidos por su capacidad para bloquear la adhesión de patógenos a los receptores en el intestino. Sin embargo, sorprendentemente, su presencia no fue necesaria para obtener un efecto de bloqueo máximo de las partículas de rotavirus cuando los oligosacáridos no digeribles se combinaron con una composición nutricional fermentada.
[0045] La presente composición nutricional comprende preferiblemente del 2,5 al 20 % en peso de oligosacáridos no digeribles totales, más preferiblemente del 2,5 al 15 % en peso, incluso más preferiblemente del 3,0 al 10 % en peso, de la manera más preferible del 5,0 al 7,5 % en peso, con respecto al peso en seco de la composición nutricional. Para 100 ml, la presente composición nutricional comprende preferiblemente del 0,35 al 2,5 % en peso de oligosacáridos no digeribles totales, más preferiblemente del 0,35 al 2,0 % en peso, incluso más preferiblemente del 0,4 al 1,5 % en peso, para 100 ml de la composición nutricional. Una cantidad menor de oligosacáridos no digeribles será menos eficaz para mejorar los efectos antirrotavirus, mientras que una cantidad demasiado alta provocará efectos secundarios de distensión abdominal y molestias abdominales.
Composición nutricional
[0046] La composición nutricional utilizada según la presente invención también se puede considerar una composición farmacéutica y es adecuada para su administración a bebés. La presente composición nutricional es preferiblemente para administración enteral, más preferiblemente para administración oral.
[0047] La presente composición nutricional es preferiblemente un preparado para lactantes, un preparado de continuación, leche para niños pequeños o un preparado para niños pequeños, o leche de crecimiento destinada a niños de corta edad o un preparado para niños de corta edad. Más preferiblemente, la composición nutricional es un preparado para lactantes o un preparado de continuación. La presente composición nutricional se puede aplicar ventajosamente como alimento completo para lactantes. Preferiblemente, la presente composición nutricional es un preparado para lactantes. Un preparado para lactantes se define como un preparado para su uso en bebés y puede ser, por ejemplo, un preparado de inicio, destinado a bebés de 0 a 6 o de 0 a 4 meses de edad. Un preparado de continuación está destinado a bebés de 4 o 6 meses a 12 meses de edad. A esta edad, los bebés comienzan a destetarse con otros alimentos. Un preparado de leche para niños pequeños o de crecimiento o para niños de corta edad está destinado a niños de 12 a 36 meses de edad. La presente composición comprende preferiblemente un componente lipídico, un componente proteico y un componente carbohidrato y se administra preferiblemente en forma líquida. La presente composición nutricional también puede presentarse en forma de alimento seco, preferiblemente en forma de polvo, que se acompaña de instrucciones para mezclar dicho alimento seco, preferiblemente en polvo, con un líquido adecuado, preferiblemente agua. La composición nutricional utilizada según la invención comprende preferiblemente otras fracciones, tales como vitaminas, minerales, oligoelementos y otros micronutrientes con el fin de hacer de ella una composición nutricional completa. Preferiblemente, los preparados infantiles contienen vitaminas, minerales, oligoelementos y otros micronutrientes de acuerdo con las directivas internacionales.
[0048] La presente composición nutricional comprende preferiblemente lípidos, proteínas y carbohidratos digeribles, donde el lípido proporciona del 5 al 50 % de las calorías totales, la proteína proporciona del 5 al 50 % de las calorías totales y el carbohidrato digerible proporciona del 15 al 90 % de las calorías totales. Preferiblemente, en la presente composición nutricional el lípido proporciona del 35 al 50 % de las calorías totales, la proteína proporciona del 7,0 al 12,5 % de las calorías totales y el carbohidrato digerible proporciona del 40 al 55 % de las calorías totales. Para el cálculo del % de calorías totales de la proteína, se debe tener en cuenta el total de energía proporcionada por proteínas, péptidos y aminoácidos. Preferiblemente, el lípido proporciona de 3 a 7 g de lípido por 100 kcal, preferiblemente de 4 a 6 g por 100 kcal, la proteína proporciona de 1,6 a 4 g por 100 kcal, preferiblemente de 1,7 a 2,5 g por 100 kcal y el carbohidrato digerible proporciona de 5 a 20 g por 100 kcal, preferiblemente de 8 a 15 g por 100 kcal de la composición nutritiva. Preferiblemente, la presente composición nutricional comprende lípidos que proporcionan de 4 a 6 g por 100 kcal, proteínas que proporcionan de 1,6 a 2,0 g por 100 kcal, más preferiblemente de 1,7 a 1,9 g por 100 kcal y carbohidratos digeribles que proporcionan de 8 a 15 g por 100 kcal de la composición nutricional. En una forma de realización, el lípido proporciona de 3 a 7 g de lípido por 100 kcal, preferiblemente de 4 a 6 g por 100 kcal, la proteína proporciona de 1,6 a 2,1 g por 100 kcal, preferiblemente de 1,6 a 2,0 g por 100 kcal y el carbohidrato digerible proporciona 5 a 20 g por 100 kcal, preferiblemente de 8 a 15 g por 100 kcal de la composición nutricional y donde preferiblemente el componente carbohidrato digerible comprende al menos un 60 % en peso de lactosa con respecto al carbohidrato digerible total, más preferiblemente al menos un 75 % en peso, incluso más preferiblemente al menos un 90 % en peso de lactosa con respecto al carbohidrato digerible total. La cantidad de calorías totales está determinada por la suma de calorías derivadas de proteínas, lípidos, carbohidratos digeribles y oligosacáridos no digeribles.
[0049] La presente composición nutricional comprende preferiblemente un componente que es un carbohidrato digerible. Los componentes que son carbohidratos digeribles preferidos son lactosa, glucosa, sacarosa, fructosa, galactosa, maltosa, almidón y maltodextrina. La lactosa es el principal carbohidrato digerible presente en la leche humana. La presente composición nutricional comprende preferiblemente lactosa. Como la presente composición nutricional comprende una composición fermentada que se obtiene por fermentación por bacterias productoras de ácido láctico, la cantidad de lactosa se reduce en comparación con su fuente debido a la fermentación, en la que la lactosa se convierte en lactato y/o ácido láctico. Por tanto, en la preparación de la presente composición nutricional se añade preferiblemente lactosa. Preferiblemente, la presente composición nutricional no comprende grandes cantidades de carbohidratos distintos de la lactosa. En comparación con los carbohidratos digeribles como la maltodextrina, la sacarosa, la glucosa, la maltosa y otros carbohidratos digeribles con un índice glucémico alto, la lactosa tiene un índice glucémico más bajo y, por lo tanto, se prefiere. La presente composición nutricional comprende preferiblemente carbohidrato digerible, en el que al menos el 35 % en peso, más preferiblemente al menos el 50 % en peso, más preferiblemente al menos el 60 % en peso, más preferiblemente al menos el 75 % en peso, incluso más preferiblemente al menos el 90 % en peso, de la manera más preferible al menos el 95 % en peso del carbohidrato digerible es lactosa. Con respecto al peso en seco, la presente composición nutricional comprende preferiblemente al menos un 25 % en peso de lactosa, preferiblemente al menos un 40 % en peso, más preferiblemente al menos un 50 % en peso de lactosa.
[0050] La presente composición nutricional comprende preferiblemente al menos un lípido seleccionado del grupo que consiste en lípidos animales (excluyendo los lípidos humanos) y lípidos vegetales. Preferiblemente, la presente composición comprende una combinación de lípidos vegetales y al menos un aceite seleccionado del grupo que consiste en aceite de pescado, aceite animal, aceite de algas, aceite fúngico y aceite bacteriano. El lípido de la presente composición nutricional proporciona preferiblemente de 3 a 7 g por 100 kcal de la composición nutricional, preferiblemente el lípido proporciona de 4 a 6 g por 100 kcal. Cuando está en forma líquida, por ejemplo, como líquido listo para el consumo, la composición nutricional comprende preferiblemente de 2,1 a 6,5 g de lípidos por 100 ml, más preferiblemente de 3,0 a 4,0 g por 100 ml. Con respecto al peso en seco, la presente composición nutricional comprende preferiblemente del 12,5 al 40 % en peso de lípidos, más preferiblemente del 19 al 30 % en peso. Preferiblemente, el lípido comprende los ácidos grasos esenciales ácido alfa-linolénico (ALA), ácido linoleico (LA) y/o ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (AGPI-CL). Los AGPI-CL, LA y/o ALA se pueden proporcionar como ácidos grasos libres, en forma de triglicéridos, en forma de diglicéridos, en forma de monoglicéridos, en forma de fosfolípidos o como una mezcla de uno o más de los anteriores. Preferiblemente, la presente composición nutricional comprende al menos una, preferiblemente al menos dos fuentes de lípidos seleccionadas del grupo que consiste en aceite de semilla de colza (tal como aceite de colza, aceite de semilla de colza bajo en ácido erúcico y aceite de canola), aceite de girasol alto oleico, aceite de cártamo alto oleico, aceite de oliva, aceites marinos, aceites microbianos, aceite de coco, aceite de palmiste. La presente composición nutricional no es leche humana.
[0051] La presente composición nutricional comprende preferiblemente proteína. La proteína utilizada en la composición nutricional se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en proteínas animales no humanas, preferiblemente proteínas de la leche, proteínas vegetales, como preferiblemente proteína de soja y/o proteína de arroz, y mezclas de las mismas. La presente composición nutricional contiene preferiblemente caseína y/o proteína de suero, más preferiblemente proteínas de suero bovino y/o caseína bovina. Así, en una forma de realización, la proteína de la presente composición nutricional comprende proteína seleccionada del grupo que consiste en proteína de suero y caseína, preferiblemente proteína de suero y caseína, preferiblemente la proteína de suero y/o la caseína es de leche de vaca. Preferiblemente, la proteína comprende menos del 5 % en peso con respecto a la proteína total de aminoácidos libres, dipéptidos, tripéptidos o proteína hidrolizada. La presente composición nutricional comprende preferiblemente caseína y proteínas de suero en una proporción en peso de caseína:proteína de suero de 10:90 a 90:10, más preferiblemente de 20:80 a 80:20, aún más preferiblemente de 35:65 a 55:45.
[0052] El % en peso de proteína con respecto al peso en seco de la presente composición nutricional se calcula según el método Kjeldahl midiendo el nitrógeno total y usando un factor de conversión de 6,38 en el caso de la caseína, o un factor de conversión de 6,25 para otras proteínas distintas de la caseína. El término 'proteína' o 'componente proteico' como se usa en la presente invención se refiere a la suma de proteínas, péptidos y aminoácidos libres.
[0053] La presente composición nutricional comprende preferiblemente proteína que proporciona de 1,6 a 4,0 g de proteína por 100 kcal de la composición nutricional, preferiblemente proporciona de 1,6 a 3,5 g, incluso más preferiblemente de 1,75 a 2,5 g por 100 kcal de la composición nutricional. En una forma de realización, la presente composición nutricional comprende proteína que proporciona de 1,6 a 2,1 g de proteína por 100 kcal de la composición nutricional, preferiblemente de 1,6 a 2,0 g, más preferiblemente de 1,7 a 2,1 g, incluso más preferiblemente de 1,75 a 2,0 g por 100 kcal de la composición nutricional. En una forma de realización, la presente composición nutricional comprende proteína en una cantidad inferior a 2,0 g por 100 kcal, proporcionando preferiblemente de 1,6 a 1,9 g, incluso más preferiblemente de 1,75 a 1,85 g por 100 kcal de la composición nutricional. Un contenido de proteína demasiado bajo con respecto al total de calorías resultará en un crecimiento y desarrollo menos adecuado en bebés y niños pequeños. Una cantidad demasiado alta supondrá una sobrecarga metabólica, por ejemplo, para los riñones de los bebés y niños pequeños. Cuando está en forma líquida, por ejemplo, como líquido listo para consumir, la composición nutricional comprende preferiblemente de 0,5 a 6,0 g, más preferiblemente de 1,0 a 3,0 g, incluso más preferiblemente de 1,0 a 1,5 g de proteína por 100 ml, de la manera más preferible de 1,0 a 1,3 g de proteína por 100 ml. Con respecto al peso en seco, la presente composición nutricional comprende preferiblemente del 5 al 20 % en peso de proteína, preferiblemente al menos 8 % en peso de proteína con respecto al peso en seco de la composición nutricional total, más preferiblemente del 8 al 14 % en peso, incluso más preferiblemente del 8 al 9,5 % en peso de proteína con respecto al peso en seco de la composición nutricional total.
[0054] Para satisfacer las necesidades calóricas de un bebé o un niño pequeño, la composición nutricional comprende preferiblemente de 45 a 200 kcal/100 ml de líquido. Para los bebés, la composición nutricional tiene más preferiblemente de 60 a 90 kcal/100 ml de líquido, aún más preferiblemente de 65 a 75 kcal/100 ml de líquido. Esta densidad calórica asegura una relación óptima entre el agua y el consumo de calorías. Para niños pequeños, con una edad entre 12 y 36 meses, la composición nutricional tiene más preferiblemente una densidad calórica de entre 45 y 65, incluso más preferiblemente de entre 50 y 60 kcal/100 ml. La osmolaridad de la presente composición está preferiblemente entre 150 y 420 mOsmol/l, más preferiblemente entre 260 y 320 mOsmol/l. La baja osmolaridad tiene como objetivo reducir aún más el estrés gastrointestinal, que puede afectar a la infección por rotavirus.
[0055] Cuando la composición nutricional está en una forma líquida lista para el consumo, el volumen preferido administrado diariamente está en el rango de aproximadamente 80 a 2500 ml, más preferiblemente aproximadamente de 200 a 1200 ml por día. Preferiblemente, el número de tomas por día está entre 1 y 10, preferiblemente entre 3 y 8. En una forma de realización, la composición nutricional se administra diariamente durante un período de al menos 2 días, preferiblemente durante un período de al menos 4 semanas, preferiblemente durante un período de al menos 8 semanas, más preferiblemente durante un período de al menos 25 semanas, en forma líquida, donde el volumen total administrado diariamente está entre 200 ml y 1200 ml y donde el número de tomas por día está entre 1 y 10.
[0056] La presente composición nutricional, cuando está en forma líquida, tiene preferiblemente una viscosidad de entre 1 y 60 mPa.s, preferiblemente de entre 1 y 20 mPa.s, más preferiblemente de entre 1 y 10 mPa.s, más preferiblemente de entre 1 y 6 mPa.s. La baja viscosidad asegura una administración adecuada del líquido, por ejemplo, un paso adecuado a través de toda la tetina. Además, esta viscosidad se parece mucho a la viscosidad de la leche humana. Además, una baja viscosidad da como resultado un vaciamiento gástrico normal y una mejor ingesta de energía, lo cual es esencial para los bebés, que necesitan la energía para un crecimiento y desarrollo óptimos. La presente composición nutricional alternativamente está en forma de polvo, adecuado para la reconstitución con agua para obtener un líquido listo para beber. La presente composición nutricional se prepara preferiblemente mezclando una composición en polvo con agua. Normalmente, el preparado para lactantes se prepara de esa manera. Por tanto, la presente invención también se refiere a una composición energética envasada en la que dicho envase está provisto de instrucciones para mezclar el polvo con una cantidad adecuada de líquido, dando como resultado una composición líquida con una viscosidad de entre 1 y 60 mPa.s. La viscosidad del líquido se determina utilizando un reómetro Physica Rheometer MCR 300 (Physica Messtechnik GmbH, Ostfilden, Alemania) a una velocidad de cizallamiento de 95 s-1 a 20 °C.
Aplicación
[0057] Los métodos o usos según la presente invención que comprenden la administración de la presente composición nutricional también se refieren a la administración de una cantidad eficaz de la composición nutricional a un sujeto que necesita dicho tratamiento, preferiblemente un bebé o un niño pequeño.
[0058] Los inventores descubrieron que una combinación de preparado fermentado (que proporciona compuestos postbióticos) y una mezcla de oligosacáridos no digeribles mostró la capacidad de mejorar la infección por rotavirus y la diarrea inducida por rotavirus. El preparado fermentado enriquecido con oligosacáridos no digeribles redujo la incidencia, duración y gravedad del proceso de diarrea. Además, la combinación pudo interactuar directamente con el virus y mejorar el sistema inmunológico del huésped. Se observó un efecto mejorado inesperado del preparado fermentado con oligosacáridos no digeribles en comparación con el preparado fermentado sin oligosacáridos no digeribles u oligosacáridos no digeribles al analizar el bloqueo directo de las partículas de rotavirus. Esto es indicativo de la reducción de la carga rotaviral en el tubo digestivo. La carga viral, también conocida como carga vírica o título viral, es una expresión numérica de la cantidad de partículas virales infecciosas por ml. Una mayor carga vírica, título o carga viral a menudo guarda una correlación con la gravedad o la infección.
[0059] Además, los mayores efectos antirrotavirus sobre la duración, la incidencia y la gravedad se observaron en el grupo al que se le administraron oligosacáridos no digeribles y preparado fermentado. Especialmente, el efecto sobre una duración más corta se observó solo en este grupo y no puede explicarse por los efectos de los oligosacáridos no digeribles o el preparado fermentado solos. Curiosamente, la combinación de preparado fermentado con oligosacáridos no digeribles aumentó la función de barrera intestinal durante la infección por rotavirus en mayor medida, según lo evaluado por la permeabilidad de la barrera intestinal mediante el ensayo de alfa-1-antitripsina. Sin pretender ceñirse a la teoría, la mejora observada en la función de barrera intestinal puede explicarse por el aumento inesperado del ácido butírico intestinal. El butirato es conocido como combustible para las células epiteliales intestinales y para mejorar la barrera intestinal. El aumento de la concentración de ácido butírico es mayor de lo que se puede esperar en función de las concentraciones halladas en el grupo alimentado con oligosacáridos no digeribles o con el preparado fermentado solo.
[0060] Sin querer ceñirse a la teoría, la menor excreción viral después de la intervención sugiere que los componentes analizados pueden tener un efecto sobre la unión con el virus. Este efecto antiinfeccioso e independiente de la microbiota de la combinación de oligosacáridos no digeribles y el preparado fermentado puede implicar una interacción directa con los patógenos y puede estar asociado con el mimetismo de los receptores. Así, algunos componentes de la mezcla administrada pueden estar actuando como análogos de receptores solubles para moléculas específicas del huésped a los que podría adherirse el virus. Por lo tanto, esta interacción entre el patógeno y la combinación de preparado fermentado y oligosacáridos no digeribles puede desalojar al patógeno adherente de las células epiteliales en el intestino delgado, reduciendo así la carga de la infección o la infectividad del rotavirus y reduciendo así la incidencia, duración y/o gravedad de la diarrea. Además, se observó una eliminación reducida del virus y una respuesta inmune sistémica e intestinal diferente. También es importante el hallazgo de que la infección por rotavirus indujo un menor aumento de peso, principalmente observado después del período de diarrea, y los efectos de esta infección por rotavirus sobre el aumento de peso mejoraron en el grupo que recibió una combinación de preparado fermentado y una mezcla de oligosacáridos no digeribles. No sólo se observaron efectos sobre el crecimiento, en particular sobre el peso corporal, sino también efectos sobre los pesos relativos de los órganos en el grupo que estaba infectado con rotavirus. El bazo, el hígado, el intestino delgado y el intestino grueso se redujeron en peso, incluso en peso relativo (% en peso del peso corporal total) del grupo RV en comparación con el grupo de referencia. Esto es indicativo de que no solo el crecimiento, sino también el desarrollo se ve afectado después de una infección por rotavirus o una diarrea inducida por rotavirus. Sin embargo, estos efectos mejoraron, y se asemejaron más al grupo de referencia no infectado, en el grupo que recibió una combinación de preparado fermentado y una mezcla de oligosacáridos no digeribles. La prevención de la pérdida de peso o la prevención de una reducción en el crecimiento o un crecimiento deficiente (en particular, el aumento de peso), o la prevención de la reducción del desarrollo de órganos como el hígado, el bazo, el intestino delgado y/o el intestino grueso es de suma importancia en el desarrollo y bebé o niño pequeño en crecimiento. Estas observaciones son indicativas tanto de un crecimiento mejorado (en particular aumento de peso) como de un desarrollo mejorado del bebé o niño pequeño después de una infección por rotavirus o diarrea inducida por rotavirus, cuando se administra la composición nutricional de la presente invención.
[0061] Por lo tanto, en una forma de realización, la presente invención se refiere a un método o uso para prevenir el crecimiento reducido o el crecimiento deficiente y/o el desarrollo reducido o el desarrollo deficiente inducidos por la infección por rotavirus, más preferiblemente el aumento de peso reducido o el aumento de peso deficiente, en bebés o niños pequeños. Preferiblemente, el método o uso para prevenir el crecimiento reducido o el crecimiento deficiente y/o el desarrollo reducido o el desarrollo deficiente inducidos por la infección por rotavirus en bebés o niños pequeños consiste en la prevención del crecimiento reducido o el crecimiento deficiente y/o el desarrollo reducido o el desarrollo deficiente en el periodo posterior a la infección por rotavirus o la diarrea inducida por rotavirus. Este método o uso se puede lograr mediante la administración de una composición nutricional que está fermentada al menos parcialmente por bacterias productoras de ácido láctico y comprende oligosacáridos no digeribles.
[0062] Por lo tanto, en una forma de realización, la presente invención se refiere a un método o uso para prevenir y/o tratar la infección por rotavirus o la diarrea inducida por rotavirus. Más en particular, en diferentes formas de realización, el efecto sobre la infección por rotavirus o la diarrea inducida por rotavirus es una reducción en la incidencia de la diarrea inducida por rotavirus o infección por rotavirus, o una reducción en la duración de la diarrea inducida por rotavirus o infección por rotavirus, o una reducción en la gravedad de la diarrea inducida por rotavirus o infección por rotavirus. En formas de realización adicionales, el efecto sobre la infección por rotavirus o la diarrea inducida por rotavirus es la prevención del crecimiento reducido o crecimiento deficiente y/o desarrollo reducido o desarrollo deficiente inducido por rotavirus, o el aumento del bloqueo de partículas de rotavirus, o la reducción de la carga de rotavirus o el aumento de la función de barrera intestinal durante la infección por rotavirus. La invención, en una forma de realización, se refiere a un método o uso para bloquear partículas de rotavirus, reducir la carga de rotavirus y/o reducir la excreción de rotavirus. Esto se logra mediante la administración de una composición nutricional como se ha descrito anteriormente, que está fermentada al menos parcialmente por bacterias productoras de ácido láctico y comprende oligosacáridos no digeribles, en particular galacto-oligosacáridos de cadena corta (scGOS) y fructo-oligosacáridos de cadena larga (lcFOS), a un bebé o niño pequeño.
[0063] En formas de realización adicionales, la presente invención se refiere a un método para reducir la incidencia de diarrea inducida por rotavirus o infección por rotavirus, o reducir la duración de la diarrea inducida por rotavirus o infección por rotavirus, o reducir la gravedad de la diarrea inducida por rotavirus o infección por rotavirus, o prevenir el crecimiento reducido o el crecimiento deficiente y/o el desarrollo reducido o el desarrollo deficiente inducido por rotavirus, o aumentar el bloqueo de partículas de rotavirus, o reducir la carga de rotavirus o aumento de la función de barrera intestinal durante la infección por rotavirus, mediante la administración de una composición nutricional como se ha descrito anteriormente, que está fermentada al menos parcialmente por bacterias productoras de ácido láctico y comprende oligosacáridos no digeribles, en particular scGOS y IcFOS, a un bebé o niño pequeño.
[0064] Para todos los métodos y usos, los efectos ventajosos reivindicados son en comparación con los bebés a los que no se les administra la composición nutricional de la presente invención; en otras palabras, cuando se compara con bebés a los que se les administra una composición nutricional que no está fermentada al menos parcialmente y que no comprende oligosacáridos no digeribles.
[0065] La presente composición nutricional se administra a un bebé o niño pequeño, con una edad de 0 a 36 meses. Preferiblemente, la composición nutricional se administra a un bebé, es decir, un sujeto humano con una edad de 0 a 12 meses, más preferiblemente a un bebé con una edad de 0 a 6 meses.
[0066] En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se utilizan en su sentido no limitativo para indicar que se incluyen los elementos que siguen a la palabra, pero no se excluyen los elementos que no se mencionan específicamente. Además, la referencia a un elemento mediante el artículo indefinido "un" o "una” no excluye la posibilidad de que esté presente más de uno de los elementos, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solo uno de los elementos. El artículo indefinido “un” o “una” generalmente significa "al menos uno/a”. % en peso significa porcentaje en peso. A menos que se indique lo contrario, un día se refiere a un período de 24 h (que comienza y termina a medianoche).
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Efecto de preparado fermentado con oligosacáridos no digeribles sobre la infección por rotavirus en ratas. Materiales y métodos
[0067] La cepa de rotavirus (RV) seleccionada para la infección (SA-11 de simio) se produjo como se describe en Pérez-Cano FJ, et al, 2007, Pediatr. Res. 2007;62: 658-663. Brevemente, la propagación del virus se realizó en células fetales de riñón de mono verde africano (MA-104) y se tituló como TCIDsü/mL (TCID, dosis invectiva en cultivo tisular). Los virus se produjeron de acuerdo con los principios vigentes de Buenas Prácticas de Laboratorio.
[0068] Se obtuvieron ratas Lewis preñadas G14 de Janvier (Le-Genest-Saint-Isle, Francia) y se alojaron individualmente en jaulas (2184L Eurostandard Tipo II L, Tecniplast, West Chester, PA, EE. UU.) con lecho de partículas fibrosas grandes y papel tisú como enriquecimiento. Se realizó un control diario y se les permitió dar a luz a término. El día del parto se registró como día 1 de vida. Las camadas se unificaron en siete crías/madre con un número similar de cada sexo en cada nido. Las crías tuvieron libre acceso a los pezones y a dieta para ratas. Las madres tenían acceso al agua y a la dieta comercial (Teklad Global Diet 2014, Envigo, Indianapolis, IN, USA) correspondiente a la dieta ad libitum del American Institute of Nutrition (AIN)-93G. Cada madre y su camada fueron alojadas individualmente en condiciones de temperatura y humedad controladas, en un ciclo de 12 h:12 h luz:oscuridad. Además, los animales fueron ubicados en una sala especial aislada y segura, especialmente diseñada y autorizada para trabajar en condiciones de bioseguridad nivel 2.
[0069] El preparado nutricional experimental o los componentes nutricionales evaluados fueron:
1) preparado para lactantes fermentado tratado térmicamente. La leche fermentada se obtuvo por fermentación de un preparado para lactantes con Bifidobacterium brevis C50 y Streptococcus thermophilus 065 durante el proceso de fabricación. Este proceso añadió a la composición de la fórmula metabolitos bacterianos activos y fragmentos celulares (compuestos postbióticos). Ha estado disponible en el mercado en Francia con el nombre de Calisma y Apaisia, como un producto de Bledina. Los métodos adecuados sobre cómo obtener esta preparado para lactantes se describen en el ejemplo 1 de WO 2004/093899. 2) Una mezcla de oligosacáridos no digeribles scGOS (fuente Vivinal® GOS, Borculo Domo FrieslandCampina) e IcFOS (Fuente Raftiline® HP, Orafti) en una proporción de 9:1 peso/peso.
3) Vehículo: El vehículo de la composición nutricional o ingredientes en 1 y 2 fue agua mineral.
[0070] Se distribuyeron ratas G14 Lewis recién nacidas y lactantes en varios grupos experimentales diferentes:
1) grupo de referencia (REF), que era un grupo de control que no estaba infectado con rotavirus y no recibió intervención en la dieta
2) un grupo de rotavirus (RV), que era un grupo de control que estaba infectado con rotavirus y no recibió intervención en la dieta
3) un grupo de estudio (FM+G/F), que se infectó con rotavirus y se complementó con leche fermentada (FM) como se ha descrito anteriormente y una mezcla de oligosacáridos no digeribles scGOS/IcFOS (G/F). FM y G/F se administraron en una cantidad de 3 g/100 g de peso corporal/día y 0,8 g/100 g de peso corporal/día, respectivamente.
[0071] Cada grupo estuvo compuesto por tres camadas con siete crías cada una (n=21/grupo). El grupo REF y RV recibieron vehículo en la misma cantidad que el grupo FM+G/F. Las dietas o vehículo se administraron desde el día 3 de vida hasta el último día del experimento. La inoculación de RV se realizó al día 7 de vida.
[0072] Se inoculó SA-11 (2*10® TCIDso/rata en 100 pL de solución tamponada con fosfato (PBS), al día 7 de vida en ratas lactantes del grupo RV y FM+G/F. Las inoculaciones de RV se realizaron 1 h después de la separación de las madres para evitar la interferencia entre el RV y los componentes de la leche. El grupo REF recibió el mismo volumen de PBS en las mismas condiciones.
[0073] La infección por SA-11 se evaluó los días 8-21 mediante la tasa de crecimiento y los índices clínicos derivados de las muestras fecales. La recogida de muestras fecales se realizó una vez al día presionando suavemente y masajeando el abdomen. Las muestras se puntuaron, pesaron y congelaron inmediatamente a -20 °C para su posterior análisis.
[0074] Los animales fueron sacrificados en dos momentos diferentes: tres animales de cada camada fueron sacrificados 1 semana después de la inoculación con RV, el día 14 (n=9/grupo), mientras que los otros cuatro animales de cada camada continuaron recibiendo la dieta hasta el final del período de lactancia, el día 21 (n=12/grupo). El día del sacrificio se recolectó sangre por punción cardiaca para determinación de hematocrito (HCT) y obtención de sueros, la cual se almacenó a -20 °C hasta su posterior análisis. Se pesaron el hígado, el bazo, el intestino grueso y el intestino delgado. Además, el intestino delgado se cortó en trozos de 5 mm y se incubó con PBS durante 10 min a 37 °C en un agitador para obtener el lavado intestinal (GW). Después de la centrifugación, los sobrenadantes se almacenaron a -20 °C hasta su análisis.
[0075] La gravedad de la diarrea se evaluó tanto por el peso fecal como por la puntuación de las heces. Las muestras fecales se puntuaron del 1 al 4 (índice de diarrea, DI) según el color, la textura y la cantidad de acuerdo con la siguiente escala: normal (índice de diarrea = 1), amarillo verdoso suelto (índice de diarrea = 2), amarillo verdoso totalmente suelto (índice de diarrea=3), gran cantidad de heces acuosas (índice de diarrea=4). Una puntuación de diarrea > 2 indica heces diarreicas, mientras que las puntuaciones del índice de diarrea < 2 indican ausencia de diarrea. Además, para encontrar un valor global de gravedad de la diarrea se realizó el análisis del área bajo la curva (AUC) de la gravedad durante el período de diarrea (días 7-13). El índice máximo de diarrea se definió como la puntuación más alta durante el período de diarrea.
[0076] La incidencia de diarrea se expresó por el % de animales diarreicos (% AD), considerando el número de animales de cada grupo, y por el % de heces diarreicas (% HD), teniendo en cuenta el número de muestras totales recogidas cada día en cada grupo. Las AUC del % de animales diarreicos y el % de heces diarreicas durante los días 7-13 se calcularon como un valor global de incidencia. El % máximo de animales diarreicos y heces diarreicas se definió como los valores más altos durante el período de diarrea. El período de diarrea se calculó para cada animal como el intervalo entre el primer y el último día de diarrea. También se contaron los días reales con diarrea dentro del período de diarrea.
[0077] En todos los casos, los valores medios y de AUC para la gravedad, el % AD y el % HD se calcularon en función de los valores basales debido a aspectos intrínsecos de cada tratamiento; en esencia, restando los valores basales del día anterior a la inoculación con el rotavirus debido a aspectos intrínsecos de cada tratamiento (resultados normalizados). Este efecto es particularmente prominente en los grupos que consumieron G/F debido a un efecto intrínseco de ablandamiento de las heces.
[0078] Se utilizaron partículas SA-11 inactivadas con UV a 105/ml para recubrir placas de 96 pocillos (Nunc MaxiSorp, Wiesbaden, Alemania). Después del bloqueo con PBS-albúmina sérica bovina al 1 % (BSA, 1 h, temperatura ambiente [RT]), se añadieron sueros diluidos apropiados o muestras de lavado intestinal (3 h, RT). Se añadió Ig de conejo anti-rata conjugada con peroxidasa de Dako (Barcelona, España) o anticuerpos monoclonales (MAb) de IgA de ratón anti-rata biotinilados (A93-2), IgG1/2a (R19-15) o IgM (G53-238) de BD Biosciences (Heidelberg, Alemania) después del lavado. Posteriormente, se añadió extravidina conjugada con peroxidasa (Sigma-Aldrich, Madrid, España) y sustrato. Se usaron sueros agrupados de animales infectados con RV de estudios previos como control positivo en cada placa. Se utilizó ajuste polinomial cuadrático. La concentración total de anticuerpos anti-RV e IgG, IgA e IgM anti-RV del grupo RV recibió el valor de 100 unidades arbitrarias (UA)/mL y se expresaron los resultados del grupo FM+P y los del día 21 con respecto a este valor dado.
[0079] Se diluyeron muestras fecales de hasta 10 días después de la inoculación del virus (7-16 días de edad) en PBS a 20 mg/mL y se homogeneizaron usando un Polytron (Kinematica, Luzern, Suiza). Los homogeneizados fecales se centrifugaron (200 g, 5 min, 4 °C) y los sobrenadantes se congelaron a -20 °C hasta su uso. Las partículas virales de los homogeneizados fecales se cuantificaron mediante la técnica ELISA mencionada anteriormente.
[0080] Para el análisis estadístico se utilizó el paquete de software PASW Statistics 20 (SPSS Inc, Chicago, IL, EE. UU.). Se aplicaron las pruebas de Komolgorov-Smirnov y Levene para evaluar la distribución normal y la igualdad de varianzas, respectivamente. Se realizó un ANOVA convencional de un factor considerando al grupo experimental como variable independiente. Cuando la inoculación/tratamiento con SA-11 tuvo un efecto significativo sobre la variable dependiente, se aplicó la prueba post hoc de Scheffé. Se utilizaron las pruebas U de Kruskal-Wallis y Mann-Whitney cuando se encontró una distribución no normal o una varianza diferente.
Finalmente, se utilizó la prueba de chi-cuadrado para comparar la incidencia de la diarrea. Las diferencias se consideraron significativas a valores de P < 0,05. Todos los resultados se expresan como media y EEM del número de animales.
Resultados
Efectos sobre el crecimiento:
[0081] Se registró el peso corporal en todos los animales y ni la dieta ni la infección viral influyeron en su crecimiento. No se observaron diferencias hasta 1 semana después de la inoculación (día 14). Esto significa que se puede ignorar la pérdida de peso corporal debida a una infección o a la influencia de la dieta. Sin embargo, al final del experimento en el día 21 (n=9/grupo), se observaron algunas diferencias. En el grupo RV se observó una disminución significativa del peso corporal en comparación con los grupos REF y FM+G/F. Si se tiene en cuenta la ganancia de peso corporal total (% del día 2 al 21), se sigue observando esta inducción de pérdida de peso corporal en el grupo RV (p<0,05) y la protección por la intervención FM+G/F (ver Tabla 1).
Tabla 1: Peso corporal (g) durante el estudio, antes y después de la inoculación del virus el día 7. Los resultados se ex resan como valores medios EEM n=21 animales/ ru o .
Figure imgf000015_0001
[0082] En el grupo REF se observó una ganancia relativa de peso corporal del 411,11 %. En el grupo RV este fue significativamente menor (p<0,05) y 310,45 %, en el grupo FM+G/F no se observó este aumento reducido del peso corporal, y el aumento relativo fue de 439,90 %.
Efecto sobre los órganos
[0083] La infección por rotavirus también indujo algunos cambios en el peso de los órganos tanto en el día 14 como en el 21. Específicamente, 7 días después de la infección (día 14 de vida) la infección por RV indujo un peso relativo más bajo del bazo y más alto del hígado (p<0,05 vs. REF). El efecto sobre el peso del hígado también se observó en el grupo FM+G/F, pero el efecto sobre el bazo mejoró en el grupo FM+G/F. Los resultados del día 21 evidenciaron un impacto significativo en el grupo RV con menor peso relativo del bazo, hígado e intestino delgado (ID) en comparación con el grupo REF (p<0,05). También el peso relativo del intestino grueso fue menor. Sin embargo, la suplementación con la mezcla FM+G/F evitó el impacto de la infección por RV en esas variables (p<0,05 vs RV) y los pesos relativos fueron superiores y no estadísticamente diferentes al grupo de referencia.
Incidencia de la diarrea
[0084] Se utilizaron dos enfoques diferentes para evaluar la incidencia de la diarrea: % de animales diarreicos (% a D) y % de heces diarreicas (% HD).
[0085] El % AD mostró que casi todos los animales inoculados con RV, el 95-100 %, presentaron diarrea en algún momento. Como era de esperar, menos del 5 % de los animales del grupo REF (sin inoculación con RV) presentaron diarrea. El % AD del grupo RV fue superior al 80 % durante los primeros 4 días inmediatamente posteriores a la inoculación de SA-11 (del día 8 al día 11 de vida). Después de eso, este porcentaje disminuyó, y el día 13 ninguno de los animales del grupo RV tenía heces parecidas a la diarrea. Los animales del grupo FM+G/F mostraron alguna mejoría durante el período de diarrea. En concreto, este grupo mostró una tendencia a la disminución del % AD con respecto al grupo RV a partir de los dos días posteriores a la inducción de la infección (día 8-11). Se observó una mejora de la incidencia de la diarrea, que fue significativamente menor que la del grupo RV, en los días 9 y 10 de vida (p<0,05).
[0086] El cálculo de la incidencia de diarrea como el % HD, que solo tiene en cuenta el número de heces diarreicas con respecto a las muestras fecales obtenidas, mostró el mismo patrón que los resultados anteriores para todos los grupos, y se observó un efecto ventajoso cada vez mayor en el grupo FM+G/F; mostrando un menor % de heces diarreicas los días 8, 9, 10, 11 y 12.
[0087] El proceso de diarrea en el grupo RV comenzó 1-2 días después de la inoculación y finalizó alrededor del día 11 de vida. Tanto el periodo diarreico como los días con diarrea fueron entre 3 y 4 días. En el grupo FM+G/F, la duración de estos períodos fue un poco más corta, especialmente al observar el % de heces diarreicas (HD). En este caso se acortó la duración de la diarrea y ya no se observaron heces diarreicas el día 11. En cualquier caso, el grupo RV tuvo la máxima incidencia (% AD y % HD) 3 días después de la inducción de RV (día 10), mientras que el grupo FM+G/F mostró el valor más alto el primer día tras la infección (día 8).
[0088] Cuando se calcularon tanto el % AD-AUC (Área bajo la curva) como el % HD-AUC, el grupo RV tuvo valores de 328,57 y 362,06 unidades arbitrarias, respectivamente, mientras que los animales REF no desarrollaron diarrea y tuvieron valores de AUC alrededor de 0. En en el grupo FM+G/F se observó una clara reducción global. El % AD-AUC se redujo a 207,14 (63 % en comparación con el grupo RV) y el % HD-AUC se redujo a 107,87 (30 % del grupo RV).
Gravedad de la diarrea
[0089] El índice de diarrea (ID) en el grupo RV fue superior a 2,5 desde el día 8 hasta el día 10, después de lo cual la puntuación media descendió a aproximadamente 2 el día 11 e incluso más baja a partir de entonces, lo que indica ausencia de diarrea en la mayoría de los animales. En el grupo FM+G/F se observó una reducción significativa y el ID estuvo por debajo de 2 en todos los días post-infección a excepción del primer día.
[0090] El AUC del patrón de gravedad (sAUC) fue de 5,99 en el grupo RV. Se observó una reducción significativa a 3,27 (alrededor del 55 %) en el sAUC para el grupo FM+G/F (p<0,05), lo que demuestra una reducción general en la gravedad del proceso.
Excreción viral
[0091] La excreción viral se evaluó después de la inoculación (días 7-16). En todos los animales inoculados con RV, la máxima eliminación viral (p<0,054 vs REF) ocurrió el primer día después de la inoculación (día 8), mientras que no se observaron diferencias entre los grupos REF y RV después. En el primer día después de la inoculación, la intervención FM+G/F evitó parcialmente dicho aumento de la excreción, mostrando una carga viral más baja que el grupo RV (alrededor del 35 %; p<0,05) y más similar a los animales REF.
Respuesta inmune
[0092] Se evaluaron anticuerpos séricos anti-RV (totales, IgG, IgM e IgA) e IgA e IgM intestinales los 14 y 21 días de vida. El grupo RV tenía niveles medibles del anti-RV específico total, IgA, IgG e IgM en suero e intestino incluso en el día 14 de vida en comparación con el grupo REF.
[0093] La suplementación dietética con FM+G/F fue capaz de modificar la respuesta inmune humoral específica frente al RV. El día 14, mientras que los anticuerpos anti-RV séricos totales no parecían verse afectados por la dieta, se observó una tendencia hacia un aumento de la IgM, un aumento significativo de la IgG (p<0,05 vs RV) y una disminución significativa de la IgA (p< 0,05 frente a RV).
[0094] Con respecto al compartimiento intestinal, hubo una tendencia a la inducción de niveles más altos de IgA el día 14 pero niveles más bajos el día 21 debido a la dieta FM+G/F. Parece que la mezcla de FM+G/F potencia la respuesta temprana (día 14) en términos de sueros anti-RV IgG y anti-RV IgA intestinal
Ejemplo 2: experimentos de bloqueo de rotavirus
[0095] Se realizó un ensayo de bloqueo in vitro para probar la capacidad de FM+G/F, FM o G/F para unirse al rotavirus SA11. Se co-incubó una placa de 96 pocillos con 5*104 partículas/ml de SA-11 en PBS-Tween al 1 % en peso con diferentes diluciones del preparado nutricional o componentes nutricionales (diluciones en agua mineral) y se incubó durante 30 min. Las partículas virales no unidas se cuantificaron por ELISA (Pérez-Cano F J, et al, 2007, Pediatr Res 2007;62: 658-663). Las partículas del virus SA-11 (105 a 103/ml) se usaron como estándar en cada placa. Este ensayo permite cuantificar el número de partículas de SA-11 detectadas tras la incubación con varias diluciones del producto, así como el porcentaje de inhibición. FM+G/F en forma no diluida fue de 267 mg/ml, de los cuales 211 mg/ml de FM y 56 mg de G/F. Para FM y G/F, las soluciones madre fueron 211 mg/ml y 56 mg/ml respectivamente. Estas cantidades se eligieron porque corresponden a la ingesta por día del ejemplo 1.
[0096] Los resultados se muestran en la Tabla 2. Todas las diluciones del preparado nutricional o componentes nutricionales como se usan en el ejemplo 1 tienen una actividad inhibidora. En particular, FM+G/F mostró una alta actividad de unión, lo que indica un alto potencial de bloqueo de esta mezcla.
Tabla 2: Porcentaje de inhibición de la detección de partículas RV después de la incubación con G/F, FM y FM+G/F a diferentes diluciones del preparado nutricional n y/o componentes nutricionales. Los resultados se expresan con su EEM de duplicados de tres experimentos independientes.
Figure imgf000017_0001
[0097] Se cree que la unión de las partículas de rotavirus es beneficiosa. Su bloqueo por interacción directa evitará o disminuirá la entrada del rotavirus en los enterocitos y la replicación en el intestino delgado. La unión de partículas de rotavirus fue mucho mayor con FM+G/F de lo que cabría esperar en función dex los datos de G/F y FM solos. Estos resultados son indicativos de un efecto mejorado inesperado del consumo de una composición que comprende una combinación de composición fermentada parcialmente y oligosacáridos no digeribles en la prevención y/o el tratamiento de la infección por rotavirus o de la diarrea inducida por rotavirus. En particular, se puede esperar un efecto sobre la prevención, la reducción de la carga viral de la infección por rotavirus, y esto puede dar como resultado una reducción de la gravedad, una reducción de la incidencia y una reducción de la duración de la diarrea por rotavirus y/o una reducción de la excreción viral, en comparación con las composiciones que no contienen composición fermentada u oligosacáridos no digeribles.
Ejemplo 3: Efecto de preparado fermentado con oligosacáridos no digeribles sobre la infección por rotavirus en ratas.
[0098] Se realizó un experimento similar al ejemplo 1, excepto en que la inoculación con el RV se realizó el día 5. Se midió la permeabilidad intestinal adicional y se midieron los ácidos grasos de cadena corta cecales como se conoce en la técnica.
[0099] El preparado nutricional experimental o los componentes nutricionales evaluados fueron:
1) Preparado para lactantes fermentado tratado térmicamente. La leche fermentada se obtuvo por fermentación de un preparado para lactantes con Bifidobacterium brevis C50 y Streptococcus thermophilus 065 durante el proceso de fabricación. Este proceso añadió a la composición de la fórmula metabolitos bacterianos activos y fragmentos celulares (compuestos postbióticos). Está disponible en el mercado en Francia con el nombre de Lactofidus o Lactofidia como producto de Bledina. Se aplicó un paso de calor adicional para matar las bacterias productoras de ácido láctico después del paso de fermentación (10 min, 90 °C). La diferencia con la fórmula del ejemplo 1 es que tiene lugar una fermentación y una producción de ácido láctico ligeramente aumentadas. La cantidad de ácido L-láctico fue de aproximadamente 1,1 g por 100 g.
2) Una mezcla de oligosacáridos no digeribles scGOS (fuente Vivinal® GOS, Borculo Domo FrieslandCampina) y IcFOS (Fuente Raftiline® HP, Orafti) en una proporción de 9:1 peso/peso.
3) Vehículo: El vehículo de la composición nutricional o ingredientes nutricionales en 1 y 2 fue agua mineral.
[0100] Se distribuyeron ratas G14 Lewis recién nacidas y lactantes en varios grupos experimentales diferentes:
1) grupo de referencia (REF), que era un grupo de control no infectado con rotavirus y que no recibió intervención en la dieta
2) un grupo de rotavirus (RV), que era un grupo de control infectado con rotavirus y que no recibió intervención en la dieta
3) un grupo de estudio (G/F), infectado con rotavirus y al que se suplementó con una mezcla de oligosacáridos no digeribles scGOS/IcFOS (G/F). Los G/F se administraron en una cantidad de 0,8 g/100 g de peso corporal/día, respectivamente.
4) un grupo de estudio (FM), infectado con rotavirus y al que se suplementó con leche fermentada (FM). La FM se administró en una cantidad de 3 g/100 g de peso corporal/día.
5) un grupo de estudio (FM+G/F), infectado con rotavirus y al que se suplementó con leche fermentada (FM) como se ha descrito anteriormente y una mezcla de oligosacáridos no digeribles scGOS/IcFOS (G/F). FM y G/F se administraron en una cantidad de 3 g/100 g de peso corporal/día y 0,8 g/100 g de peso corporal/día, respectivamente.
[0101] Como control también se incluyeron 3 grupos de ratas a las que se alimentó con los mismos suplementos que los grupos 3, 4 y 5, pero sin infección por rotavirus. Los valores de diarrea obtenidos en estos grupos se utilizaron como referencia para normalizar el índice de diarrea ID y la incidencia de diarrea (% AD).
Resultados:
[0102] Según el índice de diarrea (ID), el episodio de diarrea duró desde el día 6 (1 día después de la inoculación de RV) hasta el día 9 en el grupo 2 de RV. En el día 10, la diarrea había cesado en todos los grupos. La duración de la diarrea determinada por el ID fue la misma en los grupos 3 y 4. El ID máximo en los días de diarrea (días 6­ 9) se observó en el grupo 2. En el grupo 5, la diarrea, según el ID, el día 9 ya era significativamente menor que el grupo RV 2. En todos los días de diarrea, el ID fue más bajo en el grupo 5. Esto es indicativo de una duración más corta de la diarrea en el grupo experimental 5.
[0103] La incidencia de diarrea (según el número de animales con diarrea con respecto al total de animales, % AD) fue la más baja en el grupo 5. En el día 9 solo en el grupo 5 la incidencia de diarrea ya estaba ausente, mientras que todavía estaba presente en los grupos 2, 3 y 4, lo que indica una menor duración o infección por rotavirus cuando se administra la combinación de leche fermentada (FM) y olisacáridos no digeribles.
T l : In i in i n i i rr n n rm liz i n
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[0104] La incidencia máxima de diarrea (AMD), la incidencia pico, fue significativamente menor (utilizando una prueba de Chi-cuadrado) en el grupo 5 en comparación con el grupo 2. La AMD también se redujo en los grupos 3 y 4, en comparación con el grupo 2. El área bajo la curva del índice de diarrea en el transcurso del experimento fue más baja en el grupo 5 (8,33) y más alta en el grupo 2 (166,66). Este valor fue 29,52 en el grupo 3 y 86,23 en el grupo 4. De nuevo, el valor bajo en el grupo 5 es más bajo de lo esperado según los efectos en los grupos 3 y 4 solos. Esto indica una gravedad reducida en el grupo que consumió tanto FM como G/F.
[0105] La permeabilidad intestinal se determinó por medio de los niveles de alfa-1 antitripsina en el lavado intestinal en el día 8. Curiosamente, la combinación de FM con G/F fue la que más aumentó la función de barrera intestinal durante la infección por rotavirus.
[0106] La mejora observada en la función de barrera intestinal puede explicarse por el aumento inesperado del ácido butírico intestinal en el grupo 5. El butirato es conocido como combustible para las células epiteliales intestinales y para mejorar la barrera intestinal. El nivel de butirato cecal en el grupo 2 fue de 239,21 pmol/g de material cecal. El aumento de la concentración de ácido butírico en el grupo 5 (484,39 pmol/g de material cecal) es mayor de lo que cabría esperar en función de las concentraciones halladas para el grupo 3 (164,75; pmol/g de material cecal, es decir, una reducción de butirato) y 4 (309,72 pmol/g de material cecal) solo.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Composición nutricional que comprende un sustrato de leche fermentado por bacterias productoras de ácido láctico y comprende oligosacáridos no digeribles seleccionados del grupo que consiste en fructo-oligosacáridos, dextrinas no digeribles, galacto-oligosacáridos, xilo-oligosacáridos, arabino-oligosacáridos, arabinogalactooligosacáridos, gluco-oligosacáridos, gentio-oligosacáridos, glucomano-oligosacáridos, galactomanooligosacáridos, manano-oligosacáridos, isomalto-oligosacáridos, nigero-oligosacáridos, glucomanooligosacáridos, quito-oligosacáridos, oligosacáridos de soja, sialil-oligosacáridos y fuco-oligosacáridos, y mezclas de los mismos, para su uso en el tratamiento y/o la prevención de la infección por rotavirus o la diarrea inducida por rotavirus en un bebé o un niño pequeño.
2. Composición nutricional que comprende un sustrato de leche fermentado por bacterias productoras de ácido láctico y comprende oligosacáridos no digeribles seleccionados del grupo que consiste en fructo-oligosacáridos, dextrinas no digeribles, galacto-oligosacáridos, xilo-oligosacáridos, arabino-oligosacáridos, arabinogalactooligosacáridos, gluco-oligosacáridos, gentio-oligosacáridos, glucomano-oligosacáridos, galactomanooligosacáridos, manano-oligosacáridos, isomalto-oligosacáridos, nigero-oligosacáridos, glucomanooligosacáridos, quito-oligosacáridos, oligosacáridos de soja, sialil-oligosacáridos y fuco-oligosacáridos, y mezclas de los mismos, para su uso para
a. reducir la incidencia de la diarrea inducida por rotavirus o la infección por rotavirus,
b. reducir la duración de la diarrea inducida por rotavirus o la infección por rotavirus,
c. reducir la gravedad de la diarrea inducida por rotavirus o la infección por rotavirus,
d. prevenir el crecimiento reducido o el crecimiento deficiente y/o el desarrollo reducido o el desarrollo deficiente inducido por rotavirus,
e. aumentar el bloqueo de partículas de rotavirus,
f. reducir la carga rotaviral, y/o
g. aumentar la función de barrera intestinal durante la infección por rotavirus,
en un bebé o un niño pequeño.
3. Composición nutricional para su uso según la reivindicación 2, donde la reducción, la prevención o el aumento se observa en comparación con un bebé o niño pequeño al que se le administra una composición nutricional que no está fermentada al menos parcialmente y no comprende oligosacáridos no digeribles.
4. Composición nutricional para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la composición nutricional comprende del 0,1 al 1,5 % en peso de la suma de ácido láctico y lactato con respecto al peso en seco de la composición, y preferiblemente donde la suma de L-láctico ácido y L-lactato es más del 50 % en peso con respecto a la suma de ácido láctico y lactato totales.
5. Composición nutricional para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la composición nutricional comprende bacterias productoras de ácido láctico, preferiblemente seleccionadas del grupo que consiste en Bifidobacterium y Streptococcus, preferiblemente ambas.
6. Composición nutricional para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la composición nutricional comprende bacterias productoras de ácido láctico inactivadas.
7. Composición nutricional para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la composición nutricional comprende del 2,5 al 15 % en peso de oligosacáridos no digeribles con respecto al peso en seco de la composición nutricional.
8. Composición nutricional para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los oligosacáridos no digeribles se seleccionan del grupo que consiste en galacto-oligosacáridos y fructooligosacáridos, preferiblemente ambos.
9. Composición nutricional para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la composición nutricional no comprende oligosacáridos ácidos derivados de pectina, en particular oligosacáridos de ácido galacturónico.
10. Composición nutricional para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la composición nutricional es un preparado para lactantes o un preparado de continuación.
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