ES2942024T3 - Métodos para caracterizar enlaces disulfuro - Google Patents

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Abstract

Se proporcionan composiciones y métodos para analizar enlaces disulfuro. Un método ejemplar incluye la preparación de estándares de péptidos que no tienen enlaces disulfuro, estándares de péptidos con enlaces disulfuro codificados y estándares de péptidos con enlaces disulfuro nativos de acuerdo con la secuencia de la región del producto farmacéutico proteico que incluye el enlace disulfuro, la digestión de una muestra del producto farmacéutico proteico en péptidos, separando los péptidos del producto farmacéutico proteico, analizando los péptidos del producto farmacéutico proteico y los estándares peptídicos, identificando péptidos con enlaces disulfuro codificados y nativos por tiempo de retención, y cuantificando el nivel de péptidos con enlaces disulfuro codificados. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para caracterizar enlaces disulfuro
Campo técnico de la invención
La invención se refiere, en general, a sistemas y métodos para caracterizar anticuerpos, en particular enlaces disulfuro.
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio y la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. N.° 62/792.994 presentada el 16 de enero de 2019.
Antecedentes de la invención
Durante el desarrollo de anticuerpos monoclonales (mAb) desde el candidato a fármaco hasta el producto comercializado, pueden producirse problemas con la estabilidad, modificaciones postraduccionales u otros cambios en el anticuerpo. Las alteraciones en la estructura y función de los anticuerpos pueden causar problemas tales como una vida útil deficiente o incluso inmunogenicidad en el paciente. Por lo tanto, es importante caracterizar adecuadamente la estructura del anticuerpo y monitorizarla durante la producción. El control y la garantía de calidad de los anticuerpos son fundamentales para la pureza y la seguridad de los productos de mAb.
Los enlaces disulfuro son importantes para la integridad estructural, la estabilidad y las funciones biológicas de los mAb. Los enlaces disulfuro no nativos pueden causar cambios en la estructura y estabilidad de los mAb. La afinidad de unión de los mAb a los antígenos puede verse afectada hasta en un 50 % si los enlaces disulfuro están incompletos (Xiang, T., et al., Anal Chem, 81:8101-8108 (2009)). La baja energía de disociación de los enlaces disulfuro y la alta flexibilidad de la región bisagra conducen con frecuencia a modificaciones y escisiones en la región bisagra (Moritz, B., y Stracke, J.O., Electrophoresis, 36:769-785 (2017)). Además, la administración de estructuras unidas por disulfuro no nativos a seres humanos tiene el potencial de desencadenar respuestas inmunitarias no deseadas. Por lo tanto, el análisis de los enlaces disulfuro es importante para la evaluación del control de calidad de los mAb. Los métodos actuales para analizar los enlaces disulfuro de mAb requieren mucho tiempo y trabajo.
Por lo tanto, es un objeto de la invención proporcionar sistemas y métodos para caracterizar anticuerpos monoclonales, en particular, enlaces disulfuro en anticuerpos monoclonales.
Se mencionan también los siguientes documentos:
• Wang et al (2011) Analytical Chemistry, 83(8): 3133-3140 que se ocupa de la caracterización y comparación de enlaces disulfuro y patrones de intercambio en anticuerpos monoclonales terapéuticos: usando LC-MS con disociación por transferencia de electrones;
• Clark et al (2013) Analytical Chemistry, 85(2): 1192-1199 que se ocupa de un enfoque simple para asignar conectividad de disulfuro usando cromatogramas de iones extraídos de espectros de disociación por transferencia de electrones;
• Lakbub et al (2016) Analytical Methods 8(31): 6046-6055 que se ocupa de la caracterización de enlaces disulfuro de anticuerpos monoclonales IgG3 endógenos usando LC-MS: una investigación de isoformas mediadas por disulfuro de IgG3;
• Li et al (2013) Analytical Biochemistry, 439(2): 184-186 que se ocupa de la cromatografía líquida y la espectrometría de masas con reducción parcial poscolumna para el análisis de enlaces disulfuro nativos e intercambiados; • Resemann et al (2018) Mabs, 10(8): 1200-1213 que se ocupa de la caracterización automatizada rápida del intercambio de enlaces disulfuro y la determinación de isoformas de IgG2; y
• WO 2016/018978 que se ocupa de la cuantificación de terapias con anticuerpos monoclonales mediante LC-MS/MS.
Sumario de la invención
Se proporcionan métodos para caracterizar enlaces disulfuro. En particular, en una realización, la presente invención proporciona un método para identificar enlaces disulfuro intercambiados en un producto farmacéutico proteico e incluye los pasos de preparar estándares peptídicos que tienen regiones del producto farmacéutico proteico que contienen uno o más enlaces disulfuro. En particular, la presente invención proporciona un método para identificar enlaces disulfuro intercambiados en un producto farmacéutico proteico, que comprende:
preparar estándares peptídicos que comprenden regiones del producto farmacéutico proteico que contienen uno o más enlaces disulfuro, en donde un primer estándar peptídico comprende un primer enlace disulfuro intercambiado, y un segundo estándar comprende un segundo y diferente enlace disulfuro intercambiado, y en donde el primer y el segundo estándares peptídicos tienen tiempos de retención en cromatografía líquida conocidos diferentes;
digerir una muestra de un producto farmacéutico proteico en péptidos; y
analizar una muestra que contiene los péptidos del producto farmacéutico proteico y los estándares peptídicos usando un sistema LC-Ms 2, en donde los péptidos detectados en el tiempo de retención del primer estándar indican la presencia del enlace disulfuro intercambiado del primer estándar peptídico presente en el producto farmacéutico proteico, y los péptidos detectados en el tiempo de retención del segundo estándar peptídico, el tiempo de retención indica la presencia de los enlaces disulfuro intercambiados del segundo estándar peptídico presentes en el producto farmacéutico proteico.
Los estándares peptídicos se pueden preparar para que contengan cada tipo diferente de enlace disulfuro intercambiado. Por ejemplo, un estándar puede incluir un enlace disulfuro cruzado y otro estándar puede incluir un enlace disulfuro intracatenario. La figura 1A muestra formas de ejemplo de enlaces disulfuro que pueden estar presentes en el estándar peptídico. En una realización, el estándar peptídico contiene un enlace disulfuro normal o paralelo. Cada estándar peptídico tiene un tiempo de retención en cromatografía líquida conocido diferente en comparación con los otros estándares peptídicos. El método incluye digerir una muestra de un producto farmacéutico proteico en péptidos y analizar una muestra que contiene péptidos del producto farmacéutico proteico y los estándares peptídicos usando un sistema de espectrometría de masas en tándem con cromatografía líquida (sistema LC-MS2). Los péptidos detectados en los tiempos de retención de los diferentes estándares son indicativos de la presencia en el producto farmacéutico proteico del tipo de enlace disulfuro en el estándar peptídico específico. En una realización, el producto farmacéutico proteico es un anticuerpo monoclonal. En otras realizaciones, el producto farmacéutico proteico es una proteína recombinante, una proteína de fusión o una combinación de las mismas.
Los estándares peptídicos se pueden preparar usando técnicas convencionales. Por ejemplo, se puede usar una reacción de oxidación para generar enlaces disulfuro en los estándares peptídicos. En una realización, la reacción de oxidación se realiza usando Cu2+.
Otra realización proporciona un método para producir un producto farmacéutico proteico, que comprende:
producir el producto farmacéutico proteico en un cultivo celular; identificar enlaces disulfuro intercambiados del producto farmacéutico proteico usando el método de la presente invención para identificar enlaces disulfuro intercambiados en un producto farmacéutico proteico, y
modificar una o más condiciones de cultivo celular, de purificación o de excipiente para reducir la cantidad de enlaces disulfuro bisagra cruzados del producto farmacéutico proteico a menos del 1,0 %.
El método incluye modificar una o más condiciones de cultivo celular, de purificación o de excipiente para reducir la cantidad de enlaces disulfuro bisagra cruzados del producto farmacéutico proteico a menos del 1,0 %. La una o más condiciones pueden incluir condiciones de cultivo celular tales como temperatura, pH, niveles de oxígeno, especies de oxígeno reactivo, tensioactivos, o combinaciones de los mismos.
En otra realización, el método de la presente invención produce anticuerpos monoclonales que tienen menos del 30 % de enlaces disulfuro intercambiados
Breve descripción de los dibujos
La figura 1A es una ilustración esquemática que muestra la oxidación de un péptido bisagra reducido que tiene la secuencia THTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 1). La figura 1B es un cromatograma que muestra péptidos bisagra que se oxidaron durante la noche, dando como resultado péptidos con dos enlaces disulfuro cruzados y péptidos bisagra con dos enlaces disulfuro paralelos. Los péptidos tienen la secuencia THTCPPCPAPELLG (SEQ iD NO: 1) . La figura 1C es un cromatograma que muestra péptidos con un enlace disulfuro paralelo (Pico 1 y 3) o cruzado (Pico 2). El eje X representa el tiempo (minutos) y el eje Y representa la abundancia.
Las figuras 2A-2B son cromatogramas que muestran la formación de enlaces disulfuro en péptidos que se incubaron con Cu2+ durante la noche. Los péptidos fueron ~0,1 pg/ml (figura 2A) o ~8 pg/ml (figura 2B). Los péptidos tienen la secuencia THTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 1). El eje X representa el tiempo (minutos) y el eje Y representa la abundancia relativa.
Las figuras 3A-3H son cromatogramas que muestran los resultados del análisis N-terminal del estándar peptídico bisagra paralelo. Los ejes X representan el tiempo (minutos) y los ejes Y representan mV. La Figura 3l es una ilustración esquemática de los diversos péptidos que pueden detectarse durante los ciclos de análisis N-terminal. Las secuencias peptídicas son las siguientes: TTCPPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 1), C-PTH (SEQ ID NO: 2) y PPCPAPELLG (SEQ ID NO: 3).
Las figuras 4A-4H son cromatogramas que muestran los resultados del análisis N-terminal del estándar peptídico bisagra cruzado. Los ejes X representan el tiempo (minutos) y los ejes Y representan mV. La Figura 4I es una ilustración esquemática de los diversos péptidos que pueden detectarse durante los diversos ciclos de análisis N-terminal. Las secuencias peptídicas son las siguientes: THTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 1), C-PTH (SEQ ID NO: 2) y PPCPAPELLG (SEQ ID NO: 3).
Las figuras 5A y 5B son cromatogramas que muestran los resultados del análisis por LC-MS de los péptidos restantes después de cuatro ciclos de degradación de Edman. La figura 5A muestra péptidos con enlaces disulfuro cruzados y la figura 5B muestra péptidos con enlaces disulfuro paralelos. Las figuras 5C-5F son cromatogramas de los péptidos individuales de la figura 5 A. Las secuencias peptídicas son las siguientes: C-PTH (SEQ ID NO: 2) y PPCPAPELLG (SEQ ID NO: 3).
La figura 6A es un cromatograma de un estándar peptídico bisagra paralelo para mAb1 IgG1. La figura 6B es un cromatograma de un estándar peptídico bisagra cruzado para mAb IgG1. La figura 6C es un cromatograma de péptidos de mAb1 IgG1. El eje X representa el tiempo (minutos) y el eje Y representa la abundancia relativa. Los péptidos tienen la secuencia THTc Pp CPAPELLG (Se Q ID NO: 1).
La figura 7A es un cromatograma de un estándar peptídico bisagra paralelo para mAb1 IgG4. La figura 7B es un cromatograma de un estándar peptídico bisagra cruzado para mAb1 IgG4. La figura 7C es un cromatograma de péptidos de mAb1 IgG4. El eje X representa el tiempo (minutos) y el eje Y representa la abundancia relativa. Los péptidos tienen la secuencia YGPPCPPPCPAPEFLG (Se Q ID NO: 4).
Descripción detallada de la invención
I. Definiciones
Debe apreciarse que esta divulgación no se limita a las composiciones y métodos descritos en el presente documento, así como a las condiciones experimentales descritas, ya que pueden variar. También debe entenderse que la terminología que se usa en el presente documento es únicamente con el fin de describir ciertas realizaciones y no se pretende que sea limitante, dado que el alcance de la presente divulgación estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto en la materia a la que pertenece la presente divulgación. Aunque cualquier composición, método y material similares o equivalentes a aquellos descritos en el presente documento se pueden usar en la práctica o el ensayo de la presente invención.
El uso de los términos "un", "una", "el", "la", y referentes similares en el contexto de la descripción de la invención reivindicada en el presente documento (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o el contexto lo contradiga claramente.
La enumeración de intervalos de valores en el presente documento meramente pretende servir como método abreviado de hacer referencia de manera individual a cada valor separado que se encuentre dentro del intervalo, salvo que se indique lo contrario en el presente documento y cada valor separado se incorpora a la memoria descriptiva como si se enumerara de manera individual en el presente documento.
El uso del término "aproximadamente" pretende describir valores por encima o por debajo del valor indicado en un intervalo de apróx. /- 10 %; en otras realizaciones, los valores pueden oscilar por encima o por debajo del valor establecido en un intervalo de apróx. /- 5 %; en otras realizaciones, los valores pueden oscilar por encima o por debajo del valor establecido en un intervalo de apróx. /- 2 %; en otras realizaciones, los valores pueden oscilar por encima o por debajo del valor establecido en un intervalo de apróx. /- 1 %. Los intervalos anteriores están destinados a ser aclarados por el contexto, y no se implica ninguna limitación adicional. Todos los métodos descritos en el presente documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cada uno de los ejemplos o lenguaje ilustrativo (por ejemplo, "tal como") proporcionados en el presente documento, tiene por objeto simplemente ilustrar mejor la invención y no plantea una limitación en el alcance de la invención, a menos que se reivindique de otro modo. Ninguna de las expresiones de la memoria descriptiva debe interpretarse como indicativa de que cualquier elemento no reivindicado sea esencial para poner en práctica la invención.
"Proteína" se refiere a una molécula que comprende dos o más residuos de aminoácidos unidos entre sí mediante un enlace peptídico. La proteína incluye polipéptidos y péptidos y también puede incluir modificaciones tales como glucosilación, unión de lípidos, sulfatación, gamma-carboxilación de restos de ácido glutámico, alquilación, hidroxilación y ribosilación de ADP. Las proteínas pueden ser de interés científico o comercial, incluyendo fármacos a base de proteínas, y las proteínas incluyen, entre otras cosas, enzimas, ligandos, receptores, anticuerpos y proteínas quiméricas o de fusión. Las proteínas son producidas por diversos tipos de células recombinantes usando métodos de cultivo celular bien conocidos y generalmente se introducen en la célula mediante técnicas de ingeniería genética (por ejemplo, tales como una secuencia que codifica una proteína quimérica o una secuencia optimizada por codones, una secuencia sin intrones, etc.) en la que puede residir como un episoma o integrarse en el genoma de la célula.
"Anticuerpo" se refiere a una molécula de inmunoglobulina que consiste en cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada tiene una región variable de cadena pesada (HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada contiene tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera tiene una región variable de cadena ligera y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera consiste en un dominio (CL). Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. El término "anticuerpo" incluye la referencia a inmunoglobulinas tanto glucosiladas como no glucosiladas de cualquier isotipo o subclase. El término "anticuerpo" incluye moléculas de anticuerpo preparadas, expresadas, creadas o aisladas por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados de una célula hospedadora transfectada para expresar el anticuerpo. El término anticuerpo también incluye un anticuerpo biespecífico, que incluye una inmunoglobulina heterotetramérica que se puede unir a más de un epítopo diferente. Los anticuerpos biespecíficos se describen generalmente en la patente de EE. UU. n.° 8.586.713.
"Región bisagra" se refiere al tramo flexible de aminoácidos en la parte central de las cadenas pesadas de las clases de inmunoglobulinas IgG e IgA, que une estas 2 cadenas por enlaces disulfuro. En las inmunoglobulinas IgG, la región bisagra se encuentra entre los dominios constantes CH1 y CH3. La región bisagra proporciona flexibilidad al anticuerpo y permite una unión más fácil al antígeno.
Las "proteínas de fusión de Fc" comprenden parte o la totalidad de dos o más proteínas, una de las cuales es una porción Fc de una molécula de inmunoglobulina, que de otro modo no se encuentran juntas en la naturaleza. La preparación de proteínas de fusión que comprenden determinados polipéptidos heterólogos fusionados a diversas porciones de polipéptidos derivados de anticuerpos (que incluyen el dominio Fc) se ha descrito, por ejemplo, por Rath, T., et al., Crit Rev Biotech, 35(2): 235-254 (2015), Levin, D., et al., Trends Biotechnol, 33(1): 27-34 (2015)) "Las proteínas de fusión de receptor y Fc" comprenden uno o más dominios extracelulares de un receptor acoplado a una fracción Fc, que, en algunas realizaciones, comprende una región bisagra seguida de un dominio CH2 y CH3 de una inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la proteína de fusión de Fc comprende dos o más cadenas de receptor distintas que se unen a uno o más ligandos. Por ejemplo, una proteína de fusión de Fc es una trampa, tal como por ejemplo una trampa de IL-1 o una trampa de VEGF.
El término "enlace disulfuro" se refiere al enlace formado por la oxidación de dos grupos SH, cada uno unido a una cisteína. Los enlaces disulfuro juegan un papel importante en el plegamiento y la estabilidad de muchas proteínas. Las IgG incluyen dos cadenas pesadas (HC) y dos cadenas ligeras (LC) unidas covalentemente por un total de 16 enlaces disulfuro intermoleculares o intramoleculares. Los mAb IgG contienen 32 residuos de cisteína, 5 residuos de cisteína en cada LC y 11 residuos de cisteína en cada HC. Cada LC contiene un dominio variable y un dominio constante con una conexión por enlace disulfuro. La 5a cisteína en la LC está unida a cualquiera de la 3a o 5a cisteína de la HC para formar un enlace disulfuro intercatenario. Las cadenas pesadas incluyen un dominio variable N-terminal (VH) y tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3) con una región bisagra entre CH1 y CH2 (Vidarsson, G., et al., Front Immunol, 5:520 (2014)). Las 6a y 7a cisteína en cada HC se unen formando la región bisagra. La región bisagra de una inmunoglobulina ayuda a formar la estructura en forma de Y de la molécula de inmunoglobulina. La forma de Y hace posible la flexibilidad de las moléculas de inmunoglobulina requeridas en la unión al antígeno.
"Enlace disulfuro intracatenario" se refiere a los enlaces que se forman entre dos cisteínas dentro de la misma cadena proteica.
"Enlace disulfuro intercatenario" se refiere a enlaces que se forman entre dos cisteínas de cadenas individuales de la misma proteína o entre dos cisteínas de proteínas distintas.
"Enlace disulfuro intercambiado" se refiere a un enlace disulfuro en el que una cisteína se une a una cisteína a la que normalmente no se une. Por ejemplo, la cisteína X se une a la cisteína Z en lugar de a la cisteína Y. Ejemplos de enlaces disulfuro intercambiados incluyen, pero no se limitan a, enlaces disulfuro cruzados e intracatenarios.
Como se usa en el presente documento, el término "bisagra cruzada" se refiere a una región bisagra del anticuerpo en la que los enlaces disulfuro dentro de la región bisagra del anticuerpo están en una formación cruzada en lugar de paralela, como se ve en la parte inferior derecha de la figura 1A.
El término "LC-MS" se refiere a cromatografía líquida-espectrometría de masas, que es una técnica de química analítica que combina las capacidades de separación física de la cromatografía líquida (o HPLC) con las capacidades de análisis de masas de la espectrometría de masas (MS).
II. Métodos para caracterizar enlaces disulfuro
Los enlaces disulfuro son críticos para la estructura terciaria, estabilidad y función biológica de IgG. Los residuos de cisteína están implicados en los enlaces disulfuro. Cada subclase de moléculas de IgG humana tiene una estructura disulfuro homogénea bien definida; sin embargo, hay muchos casos notificados en los que existe heterogeneidad de enlaces disulfuro. Dos cisteínas cualesquiera muy próximas formarán un enlace covalente, incluso cisteínas que no se emparejan de forma natural. La formación de enlaces disulfuro entre cisteínas emparejadas de forma no natural se denomina intercambio o agregación. En el presente documento se divulgan diferentes métodos para identificar enlaces disulfuro. En el presente documento también se divulgan métodos para producir productos farmacéuticos proteicos con menos del 30 % de enlaces disulfuro intercambiados.
A. Caracterización de enlaces disulfuro
El análisis de los enlaces disulfuro es importante para la evaluación del control de calidad de los mAb. En una realización, los enlaces disulfuro están en la región bisagra. Los métodos tradicionales para el análisis del patrón de enlace disulfuro de la región bisagra de mAb implican proteólisis, fraccionamiento y análisis por degradación de Edman, que consumen mucho tiempo y son laboriosos. Además, métodos tradicionales tales como técnicas basadas en MS2 no distinguen entre péptidos bisagra cruzados y paralelos. La identificación de enlaces disulfuro intercambiados es difícil debido al número muy bajo de enlaces disulfuro intercambiados que se producen. Los anticuerpos con enlaces disulfuro intercambiados en la región bisagra pueden ser menos estables y tienen potencial para inducir inmunogenicidad si se administran a un sujeto. En el presente documento se divulgan composiciones y métodos de uso de las mismas para caracterizar enlaces disulfuro en proteínas, por ejemplo, anticuerpos monoclonales. En el presente documento se proporcionan estándares peptídicos con patrones de enlaces disulfuro nativos e intercambiados. Estos estándares peptídicos se pueden usar en el análisis por espectrometría de masas para centrar el análisis en péptidos que se eluyen con los estándares peptídicos. También se proporcionan métodos para aplicar los estándares peptídicos divulgados a la caracterización de enlaces disulfuro de la región bisagra.
1. Estándares peptídicos para el análisis de patrones de enlaces disulfuro de mAb
En una realización, el estándar peptídico está formado por dos péptidos unidos covalentemente entre sí por uno o más enlaces disulfuro. Los enlaces disulfuro intercambiados se producen cuando se forma un enlace disulfuro entre dos aminoácidos que no son directamente opuestos entre sí. La figura 7A muestra el enlace disulfuro paralelo natural. La figura 7B muestra un enlace disulfuro cruzado de ejemplo, también denominado enlace disulfuro intercambiado. La figura 1A muestra enlaces disulfuro paralelos, cruzados e intracatenarios. En una realización, los estándares peptídicos se pueden usar para identificar la presencia de enlaces disulfuro paralelos, cruzados o intracatenarios en una muestra de proteína, por ejemplo, enlaces disulfuro intercambiados o enlaces disulfuro nativos en un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal. En otra realización, los estándares peptídicos pueden detectar enlaces disulfuro intracatenarios en una proteína o péptido. A continuación se proporcionan detalles adicionales para preparar y usar los péptidos con enlaces disulfuro divulgados.
i. Síntesis
Una realización proporciona un método para sintetizar estándares peptídicos con enlaces disulfuro. Los estándares peptídicos se pueden sintetizar usando técnicas conocidas en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, la síntesis en fase líquida, síntesis de péptidos en fase sólida y tecnología recombinante (Stawikowski, M., y Fields, G.B., Current Protoc Protein Sci, Capítulo: Unidad 18.1 (2002)).
Los estándares peptídicos pueden incluir fragmentos de la proteína que contienen los enlaces disulfuro a analizar. La proteína se puede fragmentar o secciones de la proteína que contienen los enlaces disulfuro a analizar se pueden sintetizar y usar para producir estándares peptídicos con enlaces disulfuro. En algunas realizaciones, la secuencia de estándar peptídico tiene un 100 % de identidad de secuencia con la región de la proteína o el producto farmacéutico proteico de interés que incluye el enlace disulfuro. En otras realizaciones, la secuencia de estándar peptídico tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la región de la proteína o el producto farmacéutico proteico de interés que incluye el enlace disulfuro. La secuencia de estándar peptídico puede tener un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la región de la proteína o el producto farmacéutico proteico de interés que incluye el enlace disulfuro. En otras realizaciones, la secuencia del estándar peptídico solo representa una porción de la región que incluye el enlace disulfuro. Los estándares peptídicos tienen normalmente de 5 a 20 aminoácidos de longitud.
La formación de enlaces disulfuro en los estándares peptídicos puede inducirse a través de la oxidación de residuos de cisteína en el estándar peptídico. Los métodos para formar enlaces disulfuro en la cisteína incluyen, pero sin limitación, oxidación con aire, oxidación química y exposición del péptido al cobre (Cu2+) o zinc. La oxidación con aire se produce mezclando péptidos que contienen tiol y cisteína en un tampón abierto al aire. En otra realización, la formación de disulfuros en un péptido se puede lograr mediante el intercambio de disulfuros, por ejemplo, usando 5,5-ditiobis(2-nitrobenzoato) (DTNB o Reactivo de Ellman). En una realización, otros productos químicos comunes para inducir la oxidación de residuos de cisteína son los reactivos activados, que incluyen, pero sin limitación, yodo, haluros de sulfenilo, yodoacetamidas, maleimidas, haluros bencílicos y bromometilcetonas. En otra realización, los enlaces disulfuro se pueden formar exponiendo el péptido a cobre o zinc. Esto se puede lograr usando un electrodo de platino inerte o un electrodo sacrificial (cobre o zinc) o generando iones metálicos en espectrometría de masas con ionización por electropulverizacón (ESI-MS). En una realización, la relación molar de péptido:Cu2+ necesaria para inducir la formación de enlaces disulfuro es 5:1. Una concentración de péptido más alta puede inducir preferentemente la formación de dímeros bisagra sobre la formación de enlaces disulfuro intracatenarios.
Los estándares peptídicos se pueden exponer a Cu2+ para inducir enlaces disulfuro simples paralelos o cruzados. En una realización, los estándares peptídicos se oxidan durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 6 horas. En una realización preferida, los estándares peptídicos se oxidan durante 2 horas. En otra realización, los estándares peptídicos se pueden oxidar hasta 24 horas para inducir dos o más enlaces disulfuro paralelos o cruzados.
ii. Autenticación
En una realización, se determinan las características de los estándares peptídicos sintetizados. Las características incluyen el tiempo de retención y m/z de cada estándar peptídico. Los estándares peptídicos sintetizados se pueden separar o fraccionar usando diversos métodos de cromatografía. Los estándares peptídicos que contienen enlaces disulfuro paralelos se distinguen de los estándares peptídicos que contienen enlaces disulfuro cruzados o intracatenarios.
En una realización, el análisis de secuencia N-terminal se puede usar para confirmar la identidad de los estándares peptídicos. el análisis de secuencia N-terminal implica una serie de reacciones químicas que derivatizan y eliminan un aminoácido a la vez del extremo N de péptidos purificados o proteínas intactas. El análisis N-terminal puede detectar enlaces disulfuro porque la reacción para eliminar un aminoácido a la vez del extremo N no altera los enlaces entre los residuos de cisteína en el enlace disulfuro.
En otra realización, la degradación de Edman se puede utilizar para secuenciar los estándares peptídicos con enlaces disulfuro. La degradación de Edman es similar al análisis N-terminal en el sentido de que detecta la secuencia de una proteína o péptido en orden eliminando un aminoácido a la vez del extremo N de la proteína o péptido. Sin embargo, la primera ronda de degradación de Edman a menudo está contaminada con impurezas y, por lo tanto, no proporciona una determinación precisa del aminoácido N-terminal. La degradación de Edman puede detectar enlaces disulfuro porque la reacción para eliminar un aminoácido a la vez del extremo N no altera los enlaces entre los residuos de cisteína en el enlace disulfuro. En una realización, el análisis N-terminal se puede combinar con la degradación de Edman para dar una secuencia completa y ordenada de los estándares peptídicos con enlaces disulfuro sintetizados.
Se consideran otros métodos de secuenciación de péptidos. Estos incluyen, pero sin limitación, análisis C-terminal y espectrometría de masas.
2. Métodos para caracterizar enlaces disulfuro en la región bisagra
Una realización proporciona métodos para identificar y caracterizar enlaces disulfuro en un producto farmacéutico proteico. En otra realización, los métodos identifican y caracterizan enlaces disulfuro específicamente en la región bisagra de un anticuerpo. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG. Un método de ejemplo incluye preparar estándares peptídicos con enlaces disulfuro intercambiados y estándares peptídicos con enlaces disulfuro nativos de acuerdo con la secuencia del producto farmacéutico proteico, escindir una muestra de un producto farmacéutico proteico en péptidos, analizar los estándares peptídicos y los péptidos de productos farmacéuticos proteicos, identificar enlaces disulfuro intercambiados y nativos en péptidos comparando el tiempo de retención y cuantificar el nivel de péptidos con enlaces disulfuro intercambiados. La detección de péptidos que tienen el mismo tiempo de retención o m/z que el estándar peptídico indica que el tipo de enlace disulfuro en el estándar peptídico está presente en el producto farmacéutico proteico.
i. Preparación de muestras de proteínas
La proteína o el producto farmacéutico proteico de interés se puede obtener, por ejemplo, de un biorreactor que contiene células diseñadas para producir anticuerpos monoclonales.
La proteína o el producto farmacéutico proteico de interés se digiere en péptidos. Los métodos para digerir proteínas son conocidos en la técnica. Las proteínas se pueden digerir mediante digestión enzimática con enzimas proteolíticas o mediante digestión no enzimática con productos químicos. Ejemplos de enzimas proteolíticas para digerir proteínas incluyen, pero sin limitación, tripsina, pepsina, quimotripsina, termolisina, papaína, pronasa, Arg-C, Asp-N, Glu-C, Lys-C y Lys-N. Se pueden usar combinaciones de enzimas proteolíticas para asegurar una digestión completa. Ejemplos de productos químicos para digerir proteínas incluyen, pero sin limitación, ácido fórmico, ácido clorhídrico, ácido acético, bromuro de cianógeno, 2-nitro-5-tiocianobenzoato e hidroxialamina.
En una realización, el producto farmacéutico proteico puede someterse a doble digestión. En esta realización, la primera digestión se puede realizar usando una proteasa de amplia especificidad, tal como, pero sin limitación, proteinasa K, termolisina, substilisina, papaína, quimotripsina o elastasa. La segunda digestión se puede realizar usando tripsina. En una realización, la enzima FabRICATOR® se usa para digerir la proteína o el producto farmacéutico proteico. La enzima FabRICATOR® digiere los anticuerpos en un sitio específico debajo de la bisagra, generando, por lo tanto, fragmentos F(ab')2 y Fc/2. La digestión con FabRICATOR® se puede combinar con la digestión tríptica.
ii. Análisis del patrón de enlaces disulfuro de la región bisagra
La mezcla peptídica digerida de la proteína o el producto farmacéutico proteico se puede analizar mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS o LC-MS2) para determinar la masa de los péptidos digeridos. En una realización, la mezcla peptídica digerida se separa por cromatografía líquida, por ejemplo cromatografía de exclusión por tamaño.
A continuación, la mezcla peptídica se puede analizar mediante espectrometría de masas. Los métodos para realizar espectrometría de masas son conocidos en la técnica. Véase por ejemplo (Aeberssold, M., y Mann, M., Nature, 422:198-207 (2003)) Los tipos de espectrometría de masas comúnmente utilizados incluyen, pero sin limitación, espectrometría de masas en tándem (MS/MS), espectrometría de masas con ionización por electropulverización, cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) y desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI). En otra realización, la monitorización de la reacción seleccionada (SRM) se realiza en la mezcla peptídica. En SRM, se selecciona un ion de una masa particular en la primera etapa de un espectrómetro de masas en tándem y se selecciona un ion producto de la fragmentación del ion precursor en el segundo espectrómetro de masas para la detección. El método de la presente invención para identificar enlaces disulfuro intercambiados en un producto farmacéutico proteico comprende analizar una muestra que contiene los péptidos del producto farmacéutico proteico y los estándares peptídicos usando un sistema LC-MS2.
En una realización, también se analizan los estándares peptídicos bisagra. Los estándares se usan para caracterizar la región bisagra del producto farmacéutico proteico de interés. En una realización, el tiempo de retención de los estándares peptídicos bisagra conocidos se compara con el tiempo de retención de la mezcla peptídica del producto farmacéutico proteico de interés. La detección de péptidos que tienen el mismo tiempo de retención o m/z que el estándar peptídico indica que el tipo de enlace disulfuro en el estándar peptídico está presente en el producto farmacéutico proteico.
B. Proteínas de interés
En una realización, la proteína de interés es un producto farmacéutico proteico o es una proteína de interés adecuada para la expresión en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, la proteína puede ser un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo quimérico o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un ScFv o fragmento del mismo, una proteína de fusión de Fc o un fragmento de la misma, un factor de crecimiento o un fragmento del mismo, una citocina o un fragmento de la misma, o un dominio extracelular de un receptor de la superficie celular o un fragmento del mismo. Las proteínas en los complejos pueden ser polipéptidos simples que consisten en una única subunidad, o proteínas complejas de múltiples subunidades que comprenden dos o más subunidades. La proteína de interés puede ser un producto biofarmacéutico, aditivo o conservante alimentario, o cualquier producto proteico sujeto a normas de purificación y calidad.
En algunas realizaciones, la proteína de interés es un anticuerpo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo biespecífico, un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno, un anticuerpo monocatenario, un diacuerpo, triacuerpo o tetracuerpo, una molécula similar a inmunoglobulina G tetravalente, doble específica, denominada inmunoglobulina de dominio variable doble (DVD-IG), un anticuerpo IgD, un anticuerpo IgE, un anticuerpo IgM, un anticuerpo IgG, un anticuerpo de IgG1, un anticuerpo de IgG2, un anticuerpo IgG3 o un anticuerpo IgG4. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG2. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG4. En otra realización, el anticuerpo comprende una bisagra quimérica. En aún otras realizaciones, el anticuerpo comprende un Fc quimérico. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico IgG2/IgG4. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico IgG2/IgG1. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico IgG2/ IgG1/IgG4.
En algunas realizaciones, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-muerte celular programada 1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD1 como se describe en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N.° US2015/0203579A1), un ligando-1 anti-muerte celular programada (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-LI como se describe en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N.° US2015/0203580A1), un anticuerpo anti-Dll4, un anticuerpo anti-angiopoyetina-2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-ANG2 como se describe en la patente de EE. UU. N.° 9.402.898), un anticuerpo anti-similar a angiopoyetina 3 (por ejemplo, un anticuerpo anti-AngPtl3 como se describe en la patente de EE. UU. N.° 9.018.356), un anticuerpo anti-receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (por ejemplo, un anticuerpo anti-PDGFR como se describe en la patente de EE. UU. N.° 9.265.827), un anticuerpo anti-Erb3, un anticuerpo anti-receptor de prolactina (por ejemplo, anticuerpo anti-PRLR como se describe en la patente de EE. UU. N.° 9.302.015), un anticuerpo anti-Complemento 5 (por ejemplo, un anticuerpo anti-C5 como se describe en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.° US2015/0313194A1), un anticuerpo anti-TNF, un anticuerpo anti-receptor del factor de crecimiento epidérmico (por ejemplo, un anticuerpo anti-EGFR como se describe en la patente de EE. UU. N.° 9.132.192 o un anticuerpo anti-EGFRvIII como se describe en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.° US2015/0259423A1), un anticuerpo anti-proproteína convertasa subtilisina/kexina-9 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PCSK9 como se describe en la patente de EE. UU. N.° 8.062.640 o la patente de EE. UU. N.° 9.540.449) un anticuerpo anti-factor de crecimiento y diferenciación-8 (por ejemplo, un anticuerpo anti-GDF8, también conocido como anticuerpo anti-miostatina, como se describe en las patentes de EE.UU. N.° 8.871.209 o 9.260.515), un anti-receptor de glucagón (por ejemplo, anticuerpo anti-GCGR como se describe en las publicaciones de solicitud de patente de EE.UU. N.° US2015/0337045A1 o US2016/0075778A1), un anticuerpo anti-VEGF, un anticuerpo anti-IL1R, un anticuerpo contra el receptor de interleucina 4 (por ejemplo, un anticuerpo anti-IL4R como se describe en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N.° US2014/0271681A1 o las patentes de EE. UU. N.° 8.735.095 u 8.945.559), un anticuerpo antirreceptor de interleucina 6 (por ejemplo, un anticuerpo anti-IL6R como se describe en las patentes de EE. UU. N.° 7.582.298, 8.043.617 o 9.173.880), un anticuerpo anti-lL1, un anticuerpo anti-IL2, un anticuerpo anti-IL3, un anticuerpo anti-IL4, un anticuerpo anti-IL5, un anticuerpo anti-IL6, un anticuerpo anti-IL7, un anti-interleucina 33 (por ejemplo, anticuerpo anti-IL33 como se describe en las patentes de EE. Uu . N.° 9.453.072 o 9.637.535), un anticuerpo anti-virus sincitial respiratorio (por ejemplo, anticuerpo anti-RSV como se describe en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.° 9.447.173), un anti-grupo de diferenciación 3 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3, como se describe en las patentes de EE.UU. N.° 9.447.173 y 9.447.173, y en la solicitud de EE. UU. N.° 62/222.605), un anti-grupo de diferenciación 20 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD20 como se describe en las patentes de EE. UU. N.° 9.657.102 y US20150266966A1 y en la patente de EE. UU. N.° 7.879.984), un anticuerpo anti-CD19, un anticuerpo anti-CD28, un anticuerpo anti-grupo de diferenciación-48 (por ejemplo, anticuerpo anti-CD48 como se describe en la patente de EE. UU. N.° 9.228.014), un anticuerpo anti-Fel d1 (por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. N.° 9.079.948) anti-virus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (por ejemplo, un anticuerpo anti-MERS como se describe en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N.° US2015/0337029A1), un anticuerpo anti-virus del Ébola (por ejemplo, como se describe en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N.° US2016/0215040), un anticuerpo anti-virus del Zika, un anticuerpo anti-gen 3 de activación de linfocitos (por ejemplo, un anticuerpo anti-LAG3 o un anticuerpo anti-CD223), un anticuerpo anti-factor de crecimiento nervioso (por ejemplo, un anticuerpo anti-NGF como se describe en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N.° US2016/0017029 y patentes de EE.UU. N.° 8.309.088 y 9.353.176) y un anticuerpo anti-Proteína Y. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo biespecífico anti-CD3 x anti-CD20 (como se describe en las publicaciones de solicitud de patente de EE.UU. N.° US2014/0088295A1 y US20150266966A1), un anticuerpo biespecífico anti-CD3 x anti-Mucina 16 (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico anti-CD3 x anti-Muc16) y un anticuerpo biespecífico anti-CD3 x anti-antígeno de membrana específico de próstata (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico anti-CD3 x anti-PSMA). En algunas realizaciones, la proteína de interés se selecciona del grupo que consiste en abciximab, adalimumab, adalimumab-atto, adotrastuzumab, alemtuzumab, alirocumab, atezolizumab, avelumab, basiliximab, belimumab, benralizumab, bevacizumab, bezlotoxumab, blinatumomab, brentuximab vedotina, brodalumab, canakinumab, capromab pendetida, certolizumab pegol, cemiplimab, cetuximab, denosumab, dinutuximab, dupilumab, durvalumab, eculizumab, elotuzumab, emicizumab-kxwh, emtansinealirocumab, evinacumab, evolocumab, fasinumab, golimumab, guselkumab, ibritumomab tiuxetán, idarucizumab, infliximab, infliximab-abda, infliximab-dyyb, ipilimumab, ixekizumab, mepolizumab, necitumumab, nesvacumab, nivolumab, obiltoxaximab, obinutuzumab, ocrelizumab, ofatumumab, olaratumab, omalizumab, panitumumab, pembrolizumab, pertuzumab, ramucirumab, ranibizumab, raxibacumab, reslizumab, rinucumab, rituximab, sarilumab, secukinumab, siltuximab, tocilizumab, tocilizumab, trastuzumab, trevogrumab, ustekinumab y vedolizumab.
En algunas realizaciones, la proteína de interés es una proteína recombinante que contiene una fracción Fc y otro dominio, (por ejemplo, una proteína de fusión de Fc). En algunas realizaciones, una proteína de fusión de Fc es una proteína de fusión de receptor y Fc, que contiene uno o más dominios extracelulares de un receptor acoplados a una fracción Fc. En algunas realizaciones, la fracción Fc comprende una región bisagra seguida de un dominio CH2 y CH3 de una IgG. En algunas realizaciones, la proteína de fusión de receptor de Fc contiene dos o más cadenas de receptor distintas que se unen o bien a un solo ligando o bien a múltiples ligandos. Por ejemplo, una proteína de fusión de Fc es una proteína TRAMPA, tal como, por ejemplo, una trampa de IL-1 (por ejemplo, rilonacept, que contiene la región de unión a ligando de IL-1RAcP fusionada a la región extracelular de Il-1R1 fusionada al Fc de hIgG1; véase la patente de EE. UU. N.° 6.927.004, que se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad), o una trampa de VEGF (por ejemplo, aflibercept o ziv-aflibercept, que comprende el dominio de Ig 2 del receptor Flt1 de VEGf fusionado al dominio de Ig 3 del receptor Flk1 de VEGF fusionado a Fc de hIgG1; véanse las Patentes de los Estados Unidos N.° 7.087.411 y 7.279.159). En otras realizaciones, una proteína de fusión de Fc es una proteína de fusión de ScFv-Fc, que contiene uno o más de uno o más dominios de unión a antígeno, tales como un fragmento de cadena pesada variable y un fragmento de cadena ligera variable, de un anticuerpo acoplado a una fracción Fc.
C. Producción de mAb con patrón de enlace disulfuro nativo
Una realización proporciona métodos para producir un producto farmacéutico proteico que contiene menos del 30 % de enlaces disulfuro intercambiados. Un método de ejemplo incluye cultivar células que producen el anticuerpo en un cultivo celular en condiciones adecuadas para producir el anticuerpo, purificar el anticuerpo en condiciones adecuadas para extraer el anticuerpo, mezclar el anticuerpo con excipientes en condiciones adecuadas para estabilizar el anticuerpo, obtener una muestra del anticuerpo a partir del cultivo celular, tras la purificación del anticuerpo a partir del cultivo celular, o tras la adición de excipientes al anticuerpo purificado, caracterizar los enlaces disulfuro del anticuerpo de acuerdo con los métodos divulgados y modificar una o más condiciones de cultivo celular, de purificación o de excipiente para reducir la cantidad de enlaces disulfuro bisagra cruzados del anticuerpo.
Las una o más condiciones de cultivo celular, de purificación o de excipiente que se cambian para reducir la cantidad de enlaces disulfuro intercambiados en el anticuerpo incluyen, pero sin limitación, temperatura, pH, niveles de oxígeno, especies de oxígeno reactivo, tensioactivos, o combinaciones de los mismos. En una realización, una estrategia de cultivo celular libre de aminoácidos podría afectar a la formación de enlaces disulfuro.
En una realización, las células que producen el anticuerpo son células de ovario de hámster chino. En otra realización, las células son células de hibridoma.
En una realización, el producto farmacéutico proteico puede tener menos del 30 % de enlaces disulfuro intercambiados en la región bisagra. El producto farmacéutico proteico puede tener menos del 30 %, 25 %, 20 %, 18 %, 16 %, 14 %, 12 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 1 %, 0,5 % o 0,1 % de enlaces disulfuro intercambiados en la región bisagra.
En otra realización, el producto farmacéutico proteico puede tener menos del 10 % de enlaces disulfuro intercambiados en total. El producto farmacéutico proteico puede tener menos del 10 %, 9,5 %, 9 %, 8,5 %, 8 %, 7,5 %, 7 %, 6,5 %, 6 %, 5,5 %, 5 %, 4,5 %, 4 %, 3,5 %, 3 %, 2,5 %, 2 %, 1,5 %, 1 %, 0,5 % o 0,1 % de enlaces disulfuro intercambiados.
Ejemplos
Ejemplo 1: Síntesis de péptidos bisagra paralelos y cruzados
Métodos:
Reticulación
Los péptidos que contenían cisteína se adquirieron de un vendedor comercial. Los péptidos se reticularon mediante incubación con Cu2+ 1 mM como oxidante en presencia de aire. La relación molar de péptido a Cu2+ era 5:1.
Análisis N-terminal/Degradación de Edman
Los péptidos reticulados se suspendieron en
agua y se colocaron en un secuenciador de proteínas. Los péptidos se expusieron a isotiocianato de fenilo (PITC). El PITC se acopla con el residuo N-terminal para formar un polipéptido de PTC. Se añadió ácido trifluoroacético a la reacción y el residuo N-terminal de PTC se escindió con ácido, dando como resultado la liberación de un aminoácido ATZ inestable. El aminoácido ATZ se separó de la solución peptídica en un matraz de conversión que contenía acetato de etilo. El aminoácido ATZ se convirtió en un aminoácido PTH estable con un 25 % de TFA, v/v en agua. La solución de aminoácido PTH se inyectó en una HPLC. Cada aminoácido del péptido se identifica por HPLC.
Resultados
Se ha notificado que Cu2+ induce la formación de enlaces disulfuro mediante la producción de radicales (Prudent, M., y Girault, H.H., Metallomics, 1:157-165 (2009)). Los péptidos expuestos a Cu2+ en una relación molar de péptido/Cu2+ de 5/1 formaron enlaces disulfuro como se ilustra en la figura 1A. La primera oxidación formó un único, enlace no selectivo que era de naturaleza paralela o cruzada (figuras 1A y 1C). Durante la formación del segundo enlace disulfuro, se descubrió que la conectividad paralela era la conexión preferida (figura 1B). Se descubrió que la concentración de péptido afectaba al tipo de enlace disulfuro que se formaba. Una mayor concentración de péptido, 8 |jg/ml, indujo la formación de más dímeros bisagra paralelos que una concentración de 0,1 jg/m l (figuras 2A-2B). Una mayor concentración de péptidos favorece los puentes intermoleculares.
La identidad de los péptidos se confirmó mediante análisis N-terminal y degradación de Edman (figuras 3A-3I, figuras 4A-4I y figuras 5A-5B).
Ejemplo 2: Análisis de la región bisagra de dos mAb
Métodos
Caracterización de enlaces disulfuro bisagra
Los anticuerpos se digirieron primero en péptidos. Los anticuerpos IgG1 se sometieron a digestión enzimática doble usando proteinasa K seguida de tripsina. Los anticuerpos IgG4 se sometieron a digestión con FabRICATOR seguido de tripsina. Los estándares peptídicos bisagra se prepararon como se indicó anteriormente, usando la secuencia de la región bisagra de los anticuerpos IgG1 e IgG4 para preparar los péptidos. Las mezclas peptídicas digeridas se sometieron a análisis por LC-MS. Los estándares peptídicos bisagra también se sometieron a análisis por LC-MA. Se realizó un análisis del tiempo de retención para comparar el tiempo de retención de los péptidos de anticuerpos con el tiempo de retención de los estándares peptídicos bisagra.
Resultados
El mAb1 IgG1 se sometió a digestión en péptidos y los péptidos resultantes se sometieron a análisis por LC/MS. Los estándares peptídicos bisagra descritos anteriormente también se sometieron a análisis por LC/MS. Como se muestra en las figuras 6A-6C, el mAb1 IgG1 tiene aproximadamente un 0,9 % de enlaces disulfuro bisagra cruzados.
Un segundo anticuerpo, mAbl IgG4, también se analizó usando los métodos divulgados y estándares peptídicos con enlaces disulfuro bisagra. Como se muestra en las figuras 7A-7C, el mAb1 IgG4 tenía aproximadamente un 0,6 % de enlaces disulfuro bisagra cruzados.
Si bien en la memoria descriptiva anterior se ha descrito esta invención en relación con ciertas realizaciones de la misma, y se han presentado muchos detalles con fines ilustrativos, será evidente para los expertos en la materia que la invención es susceptible de realizaciones adicionales y que algunos de los detalles descritos en el presente documento pueden variar considerablemente sin apartarse de los principios básicos de la invención.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un método para identificar enlaces disulfuro intercambiados en un producto farmacéutico proteico, que comprende:
preparar estándares peptídicos que comprenden regiones del producto farmacéutico proteico que contienen uno o más enlaces disulfuro, en donde un primer estándar peptídico comprende un primer enlace disulfuro intercambiado, y un segundo estándar comprende un segundo y diferente enlace disulfuro intercambiado, y en donde el primer y el segundo estándares peptídicos tienen tiempos de retención en cromatografía líquida conocidos diferentes;
digerir una muestra de un producto farmacéutico proteico en péptidos; y
analizar una muestra que contiene los péptidos del producto farmacéutico proteico y los estándares peptídicos usando un sistema LC-Ms 2, en donde los péptidos detectados en el tiempo de retención del primer estándar indican la presencia del enlace disulfuro intercambiado del primer estándar peptídico presente en el producto farmacéutico proteico, y los péptidos detectados en el tiempo de retención del segundo estándar peptídico, el tiempo de retención indica la presencia de los enlaces disulfuro intercambiados del segundo estándar peptídico presentes en el producto farmacéutico proteico.
2. El método de la reivindicación 1, en donde los enlaces disulfuro intercambiados se seleccionan del grupo que consiste en enlaces disulfuro cruzados, enlaces disulfuro entrecruzados y enlaces disulfuro intracatenarios.
3. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el método incluye un estándar peptídico que contiene un enlace disulfuro paralelo.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde los enlaces disulfuro en los estándares peptídicos se forman a través de una reacción de oxidación que comprende la oxidación con Cu2+.
5. El método de la reivindicación 4, en donde la relación molar de péptido:Cu2+ para la formación de enlaces disulfuro es 5:1.
6. El método de la reivindicación 1, en donde digerir la muestra comprende digestión tríptica o digestión enzimática doble.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el producto farmacéutico proteico comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, una proteína recombinante, una proteína de fusión o una combinación de los mismos.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el enlace disulfuro está en la región bisagra de un anticuerpo.
9. Un método para producir un producto farmacéutico proteico, que comprende:
producir el producto farmacéutico proteico en un cultivo celular; llevar a cabo el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 identificando así enlaces disulfuro intercambiados del producto farmacéutico proteico, y modificar una o más condiciones de cultivo celular, de purificación o de excipiente para reducir la cantidad de enlaces disulfuro bisagra cruzados del producto farmacéutico proteico a menos del 1,0 %.
10. El método de la reivindicación 9, en donde la una o más condiciones de cultivo celular, de purificación o de excipiente que se modifican se seleccionan del grupo que consiste en temperatura, pH, niveles de oxígeno, especies de oxígeno reactivo, tensioactivos, o combinaciones de los mismos.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9-10, en donde el producto farmacéutico proteico se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, una proteína de fusión, una proteína recombinante o una combinación de los mismos.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en donde el producto farmacéutico proteico tiene menos del 30 % de enlaces disulfuro intercambiados.
13. El método de la reivindicación 12, en donde el producto farmacéutico es un anticuerpo monoclonal y en donde los enlaces disulfuro están en la región bisagra del anticuerpo.
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