ES2942671T3 - Composiciones y métodos para el tratamiento de deficiencias de colágeno tipo VII - Google Patents

Composiciones y métodos para el tratamiento de deficiencias de colágeno tipo VII Download PDF

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Abstract

La presente invención se refiere a vectores lentivirales autoinactivantes que comprenden el gen COL7A1 o una variante funcional del mismo y su uso en un método para el tratamiento de la deficiencia de colágeno tipo VII, como la epidermólisis distrófica dominante y la epidermólisis distrófica recesiva. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para el tratamiento de deficiencias de colágeno tipo VII
Lista de secuencias
La presente solicitud contiene una lista de secuencias que se ha enviado electrónicamente en formato ASCII. Dicha copia ASCII, creada el 9 de marzo de 2017, se denomina 0100-0016PR1_SL.txt y tiene un tamaño de 92924 bytes.
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere al tratamiento de deficiencias de colágeno tipo VII tales como la epidermólisis ampollosa distrófica que comprende la administración de células autólogas modificadas genéticamente que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica el colágeno tipo VII (C7) o una variante funcional del mismo.
Antecedentes de la invención
El colágeno tipo VII (C7) es una proteína importante para la formación de fibrillas de anclaje en la unión dermoepidérmica (DEJ), que mantiene unidas las capas de la piel (Burgeson 1993; Leigh et al. 1988). La epidermólisis ampollosa distrófica (DEB) es una enfermedad hereditaria caracterizada por una deficiencia de C7 que produce una alteración de las fibrillas de anclaje para adherirse entre la epidermis y la dermis subyacente que afecta a la piel y los órganos. Las mutaciones del gen COL7A1 que codifica C7 causan la deficiencia de C7. Los pacientes que padecen DEB son muy susceptibles a la formación de ampollas graves. La epidermólisis ampollosa distrófica dominante (DDEB) se caracteriza por ampollas generalizadas. La dermatosis ampollosa transitoria es una forma de DDEB, que se corrige sola durante la infancia. La epidermólisis ampollosa distrófica recesiva (RDEB) es un trastorno debilitante que produce ampollas en la piel. La RDEB inversa es otra forma de RDEB, donde se forman ampollas en zonas donde la piel roza con la piel. Sin estas fibrillas, las capas de la piel se separan y producen ampollas graves, heridas abiertas y cicatrices en respuesta a cualquier tipo de fricción, incluidas las actividades diarias normales como frotarse o rascarse.
Actualmente no existen tratamientos curativos y los pacientes dependen en gran medida del cuidado paliativo de las heridas. Los estudios preclínicos que emplean una serie de estrategias muestran resultados alentadores que sugieren que los efectos de la enfermedad se pueden corregir mediante el restablecimiento de la función de C7 en la piel de la RDEB. Los enfoques iniciales se basaban en el injerto de tejido epidérmico frágil modificado y requerían la extracción del tejido de la piel que se va a reemplazar, lo que generaba cicatrices (Mavilio et al. 2006; Chen, Nat. Gineta. 2002; Siprashvili 2010). Otros métodos han incluido la administración del C7 correctivo mediante la expresión directa basada en virus y la administración sistémica de proteína recombinante (Remington 2009; Woodley et al. 2003). Todos estos tratamientos potenciales tienen una serie de inconvenientes que incluyen problemas de coste y bioseguridad.
El uso de vectores lentivirales (LV) autoinactivantes (SIN) y defectuosos en la replicación ofrece varias ventajas para la terapia génica: 1) capacidad para transducir tanto células en división como no en división, 2) alta eficiencia de transducción, 3) expresión transgénica sostenida a largo plazo, 4) la capacidad de dispensar secuencias que codifican proteínas virales que podrían desencadenar una respuesta inmunitaria, 5) un mayor perfil de seguridad debido a la repetición terminal larga (LTR) SIN transcripcionalmente inactiva, y 6) la capacidad de empaquetar transgenes grandes. Los estudios de seguridad de los ensayos clínicos que utilizan vectores LV para la terapia génica no han mostrado una integración preferencial en o cerca de protooncogenes o genes supresores de tumores. Los pacientes a los que se les administró una dosis de 10000 millones de células T transducidas con vector LV por sujeto y se les hizo un seguimiento durante una mediana de 4 años, no mostraron leucemia u otros acontecimientos adversos. Los ensayos con indicaciones de leucodistrofia metacromática, síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS) y adrenoleucodistrofia X (ALD), no pusieron de manifiesto expansión clonal aberrante observada hasta 21 meses, 32 meses y 36 meses de seguimiento, respectivamente (Biffi et al. 2013; Aiuti et al. 2013).
El tratamiento con fibroblastos dérmicos humanos modificados genéticamente (GM-HDF) autólogos ofrece una alternativa prometedora basada en corregir el defecto hereditario ex vivo en los fibroblastos del propio paciente (Ortiz-Urda et al. 2003; Woodley et al. 2003). Georgiadis et al. (J. investigative üermatology 136: 284-92 (2015)) describieron la transducción de fibroblastos de RDEB con un vector lentiviral autoinactivante que codifica COL7a1 de codones optimizados. Se ha descrito que los fibroblastos corregidos por el gen hCOL7A1 son mejores que los queratinocitos para suministrar C7 a la zona de la membrana basal (BMZ) en ratones con injertos de piel de RDEB (Goto et al. 2006). Además, la inyección de fibroblastos se puede completar más fácilmente que el injerto de queratinocitos.
Sumario de la invención
La presente invención se dirige a células modificadas genéticamente autólogas para su uso en un método de tratamiento de un paciente que padece una deficiencia de colágeno tipo VII (C7), en donde dicho método comprende: (i) poner en contacto células, obtenidas de la dermis o la epidermis, preferiblemente fibroblastos o queratinocitos, del paciente con deficiencia de C7, con un vector lentiviral de transducción que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica COL7A1 o una variante funcional del mismo para formar las células modificadas genéticamente autólogas que tienen un número de copias del vector, en donde dicho vector lentiviral tiene un número de copias del vector de transducción en el intervalo de 0.1 a 5.0 copias por célula; (ii) cultivar dichas células modificadas genéticamente autólogas; y administrar una cantidad eficaz de las células modificadas genéticamente al paciente con deficiencia de C7, en donde el vector lentiviral de transducción comprende además (a) una repetición terminal larga (LTR) 5' modificada, en donde el promotor de la 5’ LTR modificada es un promotor de citomegalovirus, (b) al menos un elemento del tracto de polipurina central lentiviral, y (c) una 3’ LTR modificada, en donde la 3’ LTR modificada comprende una deleción respecto a la 3’ LTR de tipo natural, en donde se ha eliminado un elemento regulador postranscripcional (PRE) del virus de la hepatitis. La administración se puede hacer por inyección, preferiblemente inyección intradérmica. En un aspecto de la invención, la deficiencia de C7 es la epidermólisis ampollosa distrófica (DEB), tal como epidermólisis ampollosa distrófica recesiva (RDEB) o epidermólisis ampollosa distrófica dominante (DDEB). También se prevé que los subtipos de RDEB sean tratados según la presente invención, incluidos RDEB de Hallopeau-Siemens, RDEB no Hallopeau-Siemens, RDEB inversa, RDEB pretibial, RDEB acral y RDEB centrípeta. En una realización de la invención, el vector lentiviral de transducción está en forma de una partícula de vector lentiviral.
En una realización de la invención, la partícula de vector lentiviral de transducción se construye a partir de un vector lentiviral de transferencia que comprende (a) una repetición terminal larga 5' modificada en LTR, en donde el promotor de la 5’ LTR modificada es un promotor de citomegalovirus, (b) el gen COL7A1 o una variante funcional del mismo, (c) al menos un tracto de polipurina central lentiviral, y (d) una 3' LTR modificada, en el donde la 3' LTR modificada comprende una deleción con respecto a la 3' LTR de tipo natural, en donde se ha eliminado un elemento regulador postranscripcional (PRE) del virus de la hepatitis, en donde el gen COL7A1 o variante funcional se incorpora a las células para formar células modificadas genéticamente que tienen un gen COL7A1 o variante funcional del mismo.
En una realización, hay al menos dos elementos de tracto de polipurina central lentiviral. En otra realización, el PRE es un elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE). Preferiblemente, el vector lentiviral de transferencia usado para construir el vector de transducción se selecciona del grupo que consiste en pSMPUW y pFUGW. Preferiblemente, la partícula de vector lentiviral de transducción es INXN-2004 o INXN-2002.
La partícula de vector lentiviral INXN-2004 comprende un vector de transferencia que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 34.
La partícula de vector lentiviral INXN-2002 se construye a partir de un plásmido de expresión lentiviral pSMPUW que comprende (a) una repetición terminal larga 5' modificada en LTR, en donde el promotor de la 5’ LTR modificada es un promotor de citomegalovirus, (b) un gen COL7A1 funcional, (c) al menos un tracto central de polipurina lentiviral, y (d) una 3' LTR modificada, en donde la 3' LTR modificada comprende una deleción respecto a la 3' LTR de tipo natural, en donde se ha eliminado un elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis (PRE).
La administración de los fibroblastos modificados genéticamente autólogos al paciente con deficiencia de C7 se puede realizar de cualquier manera adecuada, incluyendo por inyección, vía tópica, oral o insertados en una matriz biocompatible.
Otro aspecto de la invención se dirige a fibroblastos modificados genéticamente autólogos de un paciente con deficiencia de C7, tal como un paciente con RDEB o DDEB, transducidos con una partícula de vector lentiviral que comprende un gen COL7A1 funcional o una variante funcional del mismo, y que expresa colágeno tipo VII, en donde la partícula de vector lentiviral tiene un número de copias del vector de transducción en el intervalo de 0.1 a 5.0 copias por célula, en donde dicha partícula de vector lentiviral de transducción se construye a partir de un vector lentiviral de transferencia que comprende (a) una repetición terminal larga 5' modificada en LTR, en donde el promotor de la 5’ LTR modificada es un promotor de citomegalovirus, (b) un gen COL7A1 funcional, (c) al menos un tracto central de polipurina lentiviral, y (d) una 3' LTR modificada, en donde la 3' LTR modificada comprende una deleción respecto a la 3' LTR de tipo natural, en donde se ha eliminado un elemento regulador postranscripcional (PRE) del virus de la hepatitis, en donde el gen COL7A1 o la variante funcional del mismo se incorpora a las células para formar células modificadas genéticamente que tienen un gen COL7A1.
Otra realización se dirige a un vector lentiviral autoinactivante formado a partir de un vector de transferencia que comprende (a) una 5' terminal larga modificada en LTR, en donde el promotor de la 5’ LTR modificada es un promotor de citomegalovirus, (b) el gen COL7A1 o una variante funcional del mismo, (c) al menos un elemento del tracto de polipurina central lentiviral, y (d) una 3’ LTR modificada, en donde la 3’ LTR modificada comprende una deleción respecto a la 3' LTR de tipo natural, y en donde se ha eliminado un elemento regulador postranscripcional (PRE) del virus de la hepatitis, en donde el p Re eliminado es un elemento regulador postranscripcional PRE de la marmota (WPRE). En una realización, el vector comprende al menos dos elementos del tracto de polipurina central lentiviral. El vector de la invención incluye el vector denominado INXN-2004 y que comprende la secuencia del plásmido IGE308 (SEQ ID NO: 34); o el vector denominado INXN-2002 en el presente documento.
Otra realización de la invención se dirige a composiciones farmacéuticas que comprenden un fibroblasto obtenido de un paciente que padece RDEB o DDEB transducido con un vector lentiviral según las reivindicaciones, tal como el vector lentiviral denominado INXN-2004 que comprende la secuencia del plásmido IGE308; o el vector lentiviral denominado INXN-2002 en el presente documento.
En una realización, la presente invención se dirige a células transducidas in vitro o ex vivo utilizando los vectores según las reivindicaciones, tales como INXN-2002 e INXN-2004.
En una realización, la presente invención se dirige a fibroblastos autólogos transducidos usando vectores INXN-2002 o INXN-2004, que pueden obtenerse y propagarse según los métodos descritos en la patente de EE. UU. N° 8,728,819 y solicitud de patente internacional/ WO2008/027984 titulada "Métodos para cultivar fibroblastos con pases mínimos y usos de los mismos".
La presente invención también se refiere a una población de células autólogas para usar en el tratamiento de un paciente que padece pseudosindactilia, en donde dicha población de células autólogas se va a obtener de dicho paciente y se transduce con una partícula de vector lentiviral que comprende un gen COL7A1 funcional o una variante funcional del mismo, y que expresa colágeno tipo VII, en donde dicha partícula de vector lentiviral tiene un número de copias del vector de transducción en el intervalo de 0.1 a 5.0 copias por célula, en donde dicha partícula de vector lentiviral de transducción se construye a partir de un vector lentiviral de transferencia que comprende (a) una repetición terminal larga 5' modificada en LTR, en donde el promotor de la 5’ LTR modificada es un promotor de citomegalovirus, (b) un gen COL7A1 funcional, (c) al menos un tracto de polipurina central lentiviral, y (d) una 3’ LTR modificada, en donde la 3’ LTR modificada comprende una deleción respecto a la 3’ LTR de tipo natural, en donde se ha eliminado un elemento regulador postranscripcional (PRE) del virus de la hepatitis, en donde el gen COL7A1 o la variante funcional del mismo se incorpora a las células para formar células modificadas genéticamente que tienen un gen COL7A1.
La invención se refiere además a un uso médico para tratar, inhibir o reducir las ampollas de una epidermólisis ampollosa distrófica (DEB) o para tratar lesiones en pacientes que padecen RDEB que comprende administrar las células genéticamente modificadas autólogas de la presente invención.
Otro aspecto de la invención se refiere a una población aislada de fibroblastos modificados genéticamente autólogos de un paciente con deficiencia de C7, tal como un paciente con DDEB o RDEB, transducidos con una partícula de vector que comprende un gen COL7A1 funcional o variante funcional del mismo y que expresa colágeno tipo VII, así como métodos para preparar estas poblaciones aisladas, como se define en las reivindicaciones.
La invención también se refiere a un método para aumentar el número de copias del transgén integradas por célula en fibroblastos o queratinocitos dérmicos humanos genéticamente modificados, que comprende (a) poner en contacto un vector lentiviral de transducción que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un gen COL7A1 o una variante funcional del mismo con un fibroblasto o queratinocito dérmico humano obtenido de un paciente con deficiencia de C7 para formar una composición de transducción; (b) someter la primera composición de transducción a espinoculación para formar fibroblastos o queratinocitos dérmicos humanos transducidos; (c) poner en contacto los fibroblastos o queratinocitos dérmicos humanos transducidos de la etapa (b) con un segundo vector lentiviral de transducción para formar una segunda composición de transducción; y (d) someter dicha primera composición de transducción a espinoculación para formar fibroblastos o queratinocitos dérmicos humanos transducidos, en donde el número de copias de transgén integradas de los fibroblastos o queratinocitos dérmicos humanos transducidos es al menos 5, 10, 15, 20, 25, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 o 50 veces mayor respecto a los fibroblastos o queratinocitos dérmicos humanos transducidos no sometidos a espinoculación o a una segunda etapa de transducción, y en donde el vector lentiviral de transducción comprende además (a) una repetición terminal larga 5' (LTR) modificada, en donde el promotor de la 5’ LTR modificada es un promotor de citomegalovirus, (b) al menos un elemento del tracto de polipurina central lentiviral, y (c) una 3’ LTR modificada, en donde la 3’ LTR modificada comprende un deleción respecto a la 3' LTR de tipo natural, en donde se ha eliminado un elemento regulador postranscripcional (PRE) del virus de la hepatitis. En un aspecto, el vector lentiviral de transducción es INXN-2002 o INXN-2004, preferiblemente INXN-2004. Se ha encontrado que los fibroblastos o queratinocitos dérmicos humanos transducidos tienen al menos o aproximadamente 1, 2, 5, 10, 20, 25, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 o 50 veces mayor número de copias de transgén integradas por célula respecto a una composición de transducción no sometida a espinoculación o supertransducción. En otra realización, la invención se refiere a tener un número de copias de transgén integradas por célula de al menos 0. 05, 0.09, 0.41 o 0.74 o un intervalo entre aproximadamente de 0.1 a aproximadamente 5, de 0.1 a aproximadamente 1, de 0.4 a aproximadamente 1 o de 0.4 a aproximadamente 0.75. Se ha encontrado que la expresión aumenta usando los métodos de transducción descritos en el presente documento. Por ejemplo, se ha encontrado que la expresión de C7 ha aumentado 10, 25, 50, 100, 150 o 200 veces con respecto a los fibroblastos o queratinocitos dérmicos humanos transducidos no sometidos a espinoculación o a una segunda transducción.
Breve descripción de los dibujos
Puede obtenerse una comprensión más completa de la presente invención con referencia a los dibujos adjuntos, cuando se consideran junto con la descripción detallada posterior. Las realizaciones ilustradas en los dibujos están destinadas únicamente a ejemplificar la invención y no deben interpretarse como una limitación de la invención a las realizaciones ilustradas.
La figura 1A representa trímeros de colágeno tipo VII (C7), que forman fibrillas de anclaje. El gen COL7A1 codifica una cadena alfa de 290 kDa y tres de las cadenas forman una triple hélice (trímero). Imagen de Bruckner-Tuderman L. Molecular Therapy (2008) 17:6-7.
La Figura 1B representa la estructura general de la piel normal y de RDEB. Las fibrillas de anclaje de C7 se unen a otros colágenos, proteínas de la matriz extracelular y Lam332 para mediar la unión de la dermis a la epidermis. La ausencia de fibrillas de anclaje puede conducir a la formación de ampollas.
La figura 2 describe un procedimiento de producción de GM-HDF a escala de cGMP según un aspecto de la presente invención. Se clonó un casete de expresión de C7 en el esqueleto de un lentivirus autoinactivante. En una producción a escala piloto se generó el vector lentiviral (INXN-2002) que comprende el gen COL7A1 (LV-COL7) con un título de ~9 x 106 Ul/ml para su uso en el procedimiento de producción a escala de cGMP. Los fibroblastos se aislaron de biopsias de pacientes con RDEB, se cultivaron y luego se dividieron en tres grupos para la transducción simulada, alta y baja de LV-COL7. Cada grupo de fibroblastos se cultivó a escala 2 x CS10 y luego se crioconservó (principio activo). Para el tratamiento del paciente, los viales de principio activo se descongelan y formulan (producto farmacéutico), luego se envían de regreso a la clínica para la inyección en el sitio de la herida del paciente del que proceden.
La figura 3A proporciona el número de copias de LV-COL7 (para INXN-2002) por célula. Los viales del principio activo se descongelaron y se analizaron las copias de ADN de LV-COL7 por célula usando qPCR. Los cebadores eran específicos para el vector lanzadera LV. Los resultados demuestran niveles dependientes de la dosis de copias por célula con un promedio de 0.38 y 0.18 copias de los grupos de dosis alta y baja, respectivamente.
La Figura 3B proporciona los niveles de expresión de C7 producidos por fibroblastos de pacientes con RDEB transducidos con LV-COL7: Los viales de principio activo se descongelaron y cultivaron durante 3 días. Se recogieron los líquidos sobrenadantes de cultivos celulares acondicionados y se analizaron los niveles de C7 mediante ELISA. Los resultados muestran una expresión de proteína dependiente de la dosis del virus que varía de 60 a 120 ng/ml de C7 en células transducidas con LV-COL7.
La Figura 3C muestra la forma trimérica de C7 producida por fibroblastos de pacientes con RDEB transducidos con LV-COL7: También se usaron líquidos sobrenadantes de cultivos celulares acondicionados en un ensayo de inmunoprecipitación. El C7 inmunoprecipitado se separó en SDS-PAGE no desnaturalizante y se visualizó mediante transferencia Western. El C7 producido por los fibroblastos de RDEB era predominantemente trimérico expresando las células transducidas con LV-COL7 más COL7 que las células transducidas de forma simulada (Grupo C). También se observaron algunas especies de menor peso molecular que mostraban inmunorreactividad.
La Figura 4A representa la unión de COL7 purificado a Lam332. COL7 se expresó en células CHO-DG44, se purificó mediante cromatografía de exclusión por tamaño y se analizó la unión preferencial a Lam332 en comparación con BSA para establecer el ensayo (el aumento en la OD450 corresponde al aumento en la unión de COL7 a la Laminina-332).
La Figura 4B representa la unión a Lam332 de COL7 en líquidos sobrenadantes de cultivo de fibroblastos transducidos con LV-COL7 (transducidos por el vector INXN-2002). Los viales del principio activo se descongelaron y se cultivaron durante 3 días. Los líquidos sobrenadantes de cultivos celulares acondicionados se recogieron y se analizó la unión a Lam332 en comparación con el control BSA. Los resultados muestran una unión a Lam332 dependiente de la dosis del virus.
La Figura 5 representa injertos de piel de RDEB compuestos en el dorso de ratones SCID a los que se inyectó por vía intradérmica 1 x 106 GM-HDF (transducidos por el vector INXN-2002) y se analizó por tinción inmunofluorescente con anticuerpos humanos específicos para COL7. Se muestran imágenes representativas. Se observó la localización de COL7 en injertos compuestos (n = 4) generados con queratinocitos de RDEB el día 10 después de la inyección intradérmica de 1 x 106 HDF-GM. Los injertos de control positivo generados a partir de queratinocitos y fibroblastos normales mostraron una tinción intensa de COL7 y los injertos de control negativo no mostraron tinción de COL7 en las mediciones de referencia (flechas en DEJ para comparación de referencia negativa).
La Figura 6 proporciona un esquema del vector plasmídico de expresión lentiviral pSMPUW.
La figura 7 compara las características del vector de expresión lentiviral pSMPUW respecto a los vectores de expresión lentivirales de tercera generación.
La Figura 8 proporciona un esquema del vector de plásmido de expresión lentiviral pFUGW.
La figura 9 representa una micrografía electrónica de partículas del virus VIH-1.
La Figura 10 proporciona los resultados de inmunoprecipitación para GM-HDF de TR8 que detectan la formación de trímeros de C7.
La figura 11A proporciona los resultados de inmunoprecipitación para GM-HDF de TR10 y ER1 que detectan la formación de trímeros C7.
La Figura 11B proporciona los resultados de inmunoprecipitación para TR9 que detectan la formación de trímeros de C7.
La figura 12 muestra los resultados de unión de Lam332 por C7 expresados por GM-HDF.
La Figura 13 proporciona un esquema de la construcción del plásmido del vector lentiviral, que codifica un gen COL7A1.
La Figura 14 presenta un esquema de la estructura del genoma de ARN proviral del vector lentiviral INXN-2002.
La figura 15 muestra un esquema que representa los detalles de la partícula del virus INXN-2002 maduro.
La Figura 16 proporciona un esquema del ensayo de inmortalización in vitro para evaluar el potencial de genotoxicidad por inserción de INXN-2002.
La Figura 17 representa la morfología y estructuras celulares típicas de FXC-007 en cultivo.
La figura 18 proporciona un gráfico de los niveles de expresión de C7 determinados por ELISA para dosis particulares de GM-HDF de TR8.
La figura 19 proporciona la transferencia western que muestra la inmunoprecipitación de trímeros C7 contra anticuerpos específicos de NC1 producidos por GM-HDF de FCX-007.
La Figura 20 muestra la lectura del ensayo (densidad óptica a 450 nm (OD450)) para un ensayo de unión para detectar la interacción de C7 con laminina 332 o pocillos recubiertos con albúmina de suero bovino (BSA). El C7 unido se detectó usando un anticuerpo específico de NC1 de C7 y un anticuerpo secundario conjugado con HRP.
La Figura 21A representa gráficamente la cantidad de migración celular de fibroblastos de pacientes normales y con RDEB transducidos con LV-COL7 a lo largo del tiempo.
La Figura 21B proporciona imágenes de la migración celular de fibroblastos de pacientes normales y con RDEB transducidos con LV-COL7 a lo largo del tiempo.
La Figura 22 proporciona el esquema para la clonación del gen COL7A1 humano.
La Figura 23 proporciona el esquema de la clonación del gen COL7A1 en el vector de expresión pSMPUW para producir el plásmido de transferencia del vector lentiviral INXN-2002, IGE230.
La Figura 24 proporciona la representación esquemática de la construcción del plásmido de transferencia de vector lentiviral INXN-2004 (IGE308).
La Figura 25A representa esquemáticamente los elementos génicos del plásmido IGE308.
La Figura 25B representa esquemáticamente los elementos génicos del plásmido IGE308.
La Figura 26 proporciona el análisis de inmunofluorescencia de injertos compuestos inyectados de GM-HDF.
La Figura 27 proporciona un gráfico que representa los niveles de transcripción de LV-COL7 medidos por su valor de cambio frente a las células de control.
La Figura 28 proporciona imágenes representativas de la tinción de C7 para fibroblastos de RDEB transducidos con INXN-2002 y LV-HA-COL7.
La Figura 29 proporciona una representación gráfica de los niveles de proteína C7 medidos en los líquidos sobrenadantes celulares de GM-HDF transducidos por TR8, TR9, T10 y ER1.
La figura 30 representa gráficamente la corrección de la hipermotilidad de los GM-HDF a lo largo del tiempo para TR8, TR9, TR10 y ER1.
La Figura 31 representa imágenes de inmunofluorescencia indirecta (IF) representativas para examinar la expresión de proteína C7 por células GM-HDF utilizando un anticuerpo específico para C7 con dos aumentos, 20x y 5x. (Solo se ensayó el grupo A para TR12.1 y TR13. Solo se muestra el grupo A de TR8 para comparar con procedimientos anteriores).
La figura 32 proporciona el porcentaje de células positivas para C7 (C7+) de los GM-HDF para cada grupo de experimento de entrenamiento de TR11, TR12.1 y TR13.
La Figura 33 proporciona una representación gráfica de la cantidad de niveles de proteína C7 expresados para TR8, TR11, TR12.1 y 13. Las barras de error representan la desviación estándar; n=3. Solo se muestran los resultados del grupo A para TR8, TR12.1 y TR13.
La Figura 34 proporciona SDS-PAGE/inmunotransferencias para la detección de trímeros de C7 de los GM-HDF (a) TR11, (b) TR12.1 y TR13.
La Figura 35 representa un gráfico de C7 expresado por GM-HDF que se une a Laminina-332 (Lam332) para TR11, TR12.1 y TR13.
La Figura 36 proporciona los resultados de los ensayos de migración celular que representan la corrección de la hipermotilidad (% de migración) a lo largo del tiempo para los GM-HDF para TR11, TR12.1 y TR13. Se proporciona la hipermotilidad de fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) y fibroblastos de control de células de epidermólisis ampollosa distrófica recesiva.
Descripción detallada de la invención
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos y cualquier acrónimo utilizado en el presente documento tienen los mismos significados que entiende normalmente un experto en la técnica en el campo de esta invención. Aunque se puede usar cualquier composición, método, kits y medios para comunicar información similar o equivalente a los descritos en el presente documento para practicar esta invención, las composiciones, métodos, kits y medios preferidos para comunicar información se describen en el presente documento.
Con el fin de que la presente invención pueda entenderse más fácilmente, se definen ciertos términos en el presente documento. Se establecen definiciones adicionales a lo largo de la descripción detallada.
El uso de la palabra "un" o "una" cuando se usa junto con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva puede significar "uno", pero también es consistente con el significado de "uno o más, "al menos uno" y "uno o más de uno".
A lo largo de esta solicitud, el término "aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye la variación inherente de error para el dispositivo, el método que se emplea para determinar el valor, o la variación que existe entre los sujetos de estudio. Por lo general, el término pretende abarcar aproximadamente o menos del 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11 %, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% o 20% de variabilidad dependiendo de la situación.
El uso del término "o" en las reivindicaciones significa "y/o" a menos que se indique explícitamente que se refiere solo a alternativas o las alternativas se excluyen mutuamente, aunque la descripción apoye una definición que se refiera solo a alternativas y "y/ o."
Tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y reivindicación(es), las palabras "que comprende" (y cualquier forma de comprender, tal como “comprender" y "comprende"), "que tiene" (y cualquier forma de tener, tal como "tener" y "tiene"), "que incluye" (y cualquier forma de incluir, tal como "incluye" e "incluir") o "que contiene" (y cualquier forma de contener, tal como "contiene" y "contener") son inclusivos o abiertos y no excluyen elementos adicionales no citados o etapas del método. Se contempla que cualquier realización descrita en esta memoria descriptiva puede implementarse con respecto a cualquier método o composición de la invención, y viceversa. Además, las composiciones de la invención se pueden usar para lograr métodos de la invención.
Los ácidos nucleicos y/o las secuencias de ácidos nucleicos son "homólogos" cuando derivan, natural o artificialmente, de un ácido nucleico o secuencia de ácido nucleico ancestral común. Las proteínas y/o secuencias de proteínas son homólogas cuando sus ADN codificantes derivan, natural o artificialmente, de un ácido nucleico o secuencia de ácido nucleico ancestral común. Las moléculas homólogas pueden denominarse homólogos. Por ejemplo, cualquier proteína de origen natural, como se describe en el presente documento, puede modificarse mediante cualquier método de mutagénesis disponible. Cuando se expresa, este ácido nucleico mutagenizado codifica un polipéptido que es homólogo a la proteína codificada por el ácido nucleico original. La homología generalmente se deduce de la identidad de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o proteínas (o secuencias de los mismos). El porcentaje preciso de identidad entre secuencias que es útil para establecer la homología varía con el ácido nucleico y la proteína en cuestión, pero se usa rutinariamente tan solo un 25% de identidad de secuencia para establecer la homología. También pueden usarse niveles más altos de identidad de secuencia, p. ej., 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% o más para establecer la homología. Los métodos para determinar los porcentajes de identidad de secuencia (p. ej., BLASTP y BLASTN usando parámetros predeterminados) se describen en el presente documento y están disponibles en general.
Los términos "idéntico" o "identidad de secuencia" en el contexto de dos secuencias de ácidos nucleicos o secuencias de aminoácidos de polipéptidos se refiere a los restos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para una máxima correspondencia a lo largo de una ventana de comparación especificada. Una "ventana de comparación", como se usa en el presente documento, se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, normalmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más normalmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150, en la que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias estén alineadas de manera óptima. Los métodos de alineamiento de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. La alineación óptima de secuencias para la comparación puede realizarse mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; por el algoritmo de alineación de Needleman y Wunsch (1970) J. MoI. BíoI.48:443; por el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nat. Acad. Scí USA 85:2444; mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (incluidos, pero no limitados a CLUSTAL en el programa pC/Gene de Intelligentics, Mountain View Calif., GAP, BeSt FIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el paquete de software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis., EE. UU.); el programa CLUSTAL está bien descrito por Higgins y Sharp (1988) Gene 73: 237-244 y Higgins y Sharp (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-10890; Huang et al (1992) Computer Applications in the Biosciences 8: 155-165; y Pearson et al. (1994) Methods in Molecular Biology 24:307-331. La alineación también se realiza a menudo mediante inspección y alineamiento manual.
En una clase de realizaciones, los polipéptidos del presente documento son al menos 70%, generalmente al menos 75%, opcionalmente al menos 80%, 85%, 90%, 98% o 99% o más idénticos a un polipéptido de referencia, o un fragmento del mismo, p. ej., medido por BLASTP (o CLUSTAL, o cualquier otro software de alineamiento disponible) utilizando parámetros predeterminados. De manera similar, los ácidos nucleicos también se pueden describir con referencia a un ácido nucleico inicial, p. ej., pueden ser 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 98%, 99% o más idénticos a un ácido nucleico de referencia o un fragmento del mismo, p. ej., medido por BLASTN (o CLUSTAL, o cualquier otro software de alineamiento disponible) utilizando parámetros predeterminados. Cuando se dice que una molécula tiene cierto porcentaje de identidad de secuencia con una molécula más grande, significa que cuando las dos moléculas están alineadas de manera óptima, dicho porcentaje de restos en la molécula más pequeña encuentra un resto coincidente en la molécula más grande de acuerdo con el orden en que las dos moléculas están óptimamente alineadas.
La expresión "sustancialmente idéntico" aplicado a secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos significa que una secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos comprende una secuencia que tiene al menos 90% de identidad de secuencia o más, preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al menos 98% y lo más preferiblemente al menos 99%, en comparación con una secuencia de referencia usando los programas descritos anteriormente (preferiblemente BLAST) usando parámetros estándar. Por ejemplo, el programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc, Nati, Acad, Scí. USA 89:10915 (1992)). El porcentaje de identidad de secuencia se determina comparando dos secuencias alineadas de forma óptima a lo largo de una ventana de comparación, en donde la parte de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para una alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que aparecen la base de ácido nucleico o el resto de aminoácido idénticos en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia. Preferiblemente, la identidad sustancial existe en una región de las secuencias que tiene al menos aproximadamente 50 restos de longitud, más preferiblemente en una región de al menos aproximadamente 100 restos, y más preferiblemente las secuencias son sustancialmente idénticas en al menos aproximadamente 150 restos. En una realización más preferida, las secuencias son sustancialmente idénticas en toda la longitud de las regiones codificantes.
Una "variante funcional" de una proteína descrita en el presente documento puede, por ejemplo, comprender la secuencia de aminoácidos de la proteína de referencia con al menos o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 sustituciones de aminoácidos conservadoras. La frase "sustitución de aminoácidos conservadora" o "mutación conservadora" se refiere a la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido con una propiedad común. Una forma funcional de definir propiedades comunes entre aminoácidos individuales es analizar las frecuencias normalizadas de cambios de aminoácidos entre proteínas correspondientes de organismos homólogos (Schulz, G. E. y Schirmer, R. H., Principies of Protein Structure, Springer-Verlag, Nueva York (1979)). De acuerdo con dichos análisis, se pueden definir grupos de aminoácidos donde los aminoácidos dentro de un grupo se intercambian preferiblemente entre sí y, por lo tanto, se parecen más entre sí en su impacto en la estructura de proteína general (Schulz, G. E. y Schirmer, R. H., véase antes). Los ejemplos de mutaciones conservadoras incluyen sustituciones de aminoácidos de los aminoácidos dentro de los subgrupos anteriores, por ejemplo, arginina por lisina y viceversa, de modo que se pueda mantener una carga positiva; ácido aspártico por ácido glutámico y viceversa, de modo que se pueda mantener una carga negativa; treonina por serina de modo que se pueda mantener un --OH libre; y asparagina por glutamina de modo que se pueda mantener un --NH2 libre. En una realización de la presente invención, un gen COL7A1 codifica la proteína C7 o una variante funcional de la misma, siempre que la variante sea capaz de anclar las fibrillas entre la epidermis y la dermis.
Como alternativa o adicionalmente, las variantes funcionales pueden comprender la secuencia de aminoácidos de la proteína de referencia con al menos una sustitución de aminoácidos no conservadora. Las "mutaciones no conservadoras" implican sustituciones de aminoácidos entre diferentes grupos, por ejemplo, triptófano por lisina, o serina por fenilalanina, etc. En este caso, es preferible que la sustitución de aminoácidos no conservadora no interfiera con, o inhiba la actividad biológica de, la variante funcional. La sustitución de aminoácidos no conservadora puede potenciar la actividad biológica de la variante funcional, de manera que la actividad biológica de la variante funcional aumenta en comparación con la secuencia de referencia.
Las proteínas descritas en el presente documento (incluidas partes funcionales y variantes funcionales de las mismas) pueden comprender aminoácidos sintéticos en lugar de uno o más aminoácidos naturales. Dichos aminoácidos sintéticos son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ácido aminociclohexanocarboxílico, norleucina, ácido a-amino-n-decanoico, homoserina, S-acetilaminometil-cisteína, trans-3- y trans-4-hidroxiprolina, 4 -aminofenilalanina, 4-nitrofenilalanina, 4-clorofenilalanina, 4-carboxifenilalanina, p-fenilserina p-hidroxifenilalanina, fenilglicina, anaftilalanina, ciclohexilalanina, ciclohexilglicina, ácido indolina-2-carboxílico, ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico, ácido aminomalónico, monoamida del ácido aminomalónico, N'-bencil-N'-metil-lisina, N',N'-dibencil-lisina, 6-hidroxilisina, ornitina, ácido a-aminociclopentanocarboxílico, ácido a-aminociclohexanocarboxílico, ácido aaminocicloheptanocarboxílico, ácido a-(2-amino-2-norbornano)-carboxílico, ácido a,Y-diaminobutírico, ácido a,pdiaminopropiónico, homofenilalanina y a-terc-butilglicina.
La invención incluye los vectores INXN-2002; e IGE308 también denominado en el presente documento INXN-2004, así como vectores sustancialmente idénticos y/u homólogos a los mismos, así como variantes funcionales de los mismos.
El término "paciente" o "sujeto" se refiere a mamíferos, incluidos seres humanos y animales.
El término "tratar" se refiere a reducir o aliviar los síntomas y/o prevenir recaídas y/o la progresión de la DEB, incluyendo RDEB y/o DDEB.
La expresión "células autólogas" se refiere a las células obtenidas y luego devueltas al mismo individuo. En particular, las células pueden extraerse del cuerpo de un paciente con DEB, que posteriormente se pueden modificar genéticamente, cultivar para proliferar y luego devolver al cuerpo del paciente del que se extrajeron originalmente.
El término "transducción" se refiere al suministro de un gen(es) usando un vector viral o retroviral por medio de una infección viral en lugar de una transfección.
La expresión "vector lentiviral de transducción" o "partícula de vector lentiviral de transducción" se refiere a las partículas de vector lentiviral infecciosas formadas a partir de la cotransfección de una línea celular de empaquetamiento con el vector plasmídico de expresión/transferencia lentiviral que comprende el gen COL7A1 o variante funcional del mismo, un vector(es) de empaquetamiento y un vector de envoltura. El vector lentiviral de transducción se recoge del líquido sobrenadante del cultivo de células productoras después de la transfección. Las líneas celulares de empaquetamiento adecuadas se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, la línea celular 293T.
La expresión "vector lentiviral" se refiere a un vector que contiene elementos genéticos estructurales y funcionales fuera de las LTR que derivan principalmente de un lentivirus.
La expresión “vector autoinactivante” (SIN) se refiere a vectores en los que la región promotora-potenciadora de 3’ LTR, conocida como la región U3, se ha modificado (p. ej., por eliminación o sustitución) para evitar la transcripción viral más allá de la primera ronda de replicación viral. En consecuencia, los vectores son capaces de infectar y luego integrarse en el genoma del hospedante solo una vez y no pueden pasar más. Los vectores SIN reducen en gran medida el riesgo de crear virus competentes para la replicación no deseados, ya que la región U3 de la 3' LTR se ha modificado para evitar la transcripción viral más allá de la primera ronda de replicación, lo que elimina la capacidad de pase del virus.
La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se emplea en el presente documento para referirse a soluciones líquidas que, dentro del alcance del buen criterio médico, son adecuadas para su uso en contacto con las células autólogas modificadas genéticamente sin afectar a su actividad y sin ser tóxicas para los tejidos de seres humanos y animales o causar irritación, respuesta alérgica u otras complicaciones, en consonancia con una relación beneficio/riesgo razonable. Un vehículo farmacéuticamente aceptable útil puede ser una solución inyectable que es biocompatible con las células autólogas modificadas genéticamente y que no reduce su actividad ni produce su muerte.
La presente descripción se refiere a una terapia con células autólogas genéticamente modificadas para pacientes con deficiencia de C7. Los "pacientes con deficiencia de C7" carecen o tienen una producción sustancialmente reducida de colágeno tipo VII (C7), que es importante para la formación de fibrillas de anclaje en la unión dermoepidérmica (DEJ), lo que da como resultado la epidermólisis ampollosa distrófica (DEB). La presente descripción se refiere a la modificación genética de células obtenidas de un paciente con DEB, tales como fibroblastos o queratinocitos, para insertar un gen COL7A1 funcional o variante funcional del mismo, expandir las células modificadas genéticamente y administrar una población de células modificadas genéticamente de nuevo al paciente con DEB.
Las células se pueden obtener de un paciente que padece DEB. Se prefieren fibroblastos o queratinocitos. Las células se pueden obtener mediante métodos conocidos, incluyendo muestras de piel de pacientes, raspados y biopsias, por ejemplo. En una realización, las células se obtienen de la piel sin ampollas de un paciente con DEB. En otra realización, las células se obtienen de la piel con ampollas de un paciente con DEB. Las células obtenidas de un paciente con DEB tienen un gen COL7A1 mutado, no funcional o ausente. Estas células se cultivan utilizando técnicas de cultivo celular convencionales. Las células obtenidas del paciente posteriormente se tratan ex vivo con material genético que codifica un gen de colágeno tipo VII funcional (C7) o una variante funcional del mismo.
El gen COL7A1 tiene el ácido nucleico, SEQ ID NO: 1, que codifica una cadena alfa de 290 kDa, en donde tres cadenas forman una triple hélice (trímero), como se representa en la Figura 1 A. C7 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y es la proteína importante para la formación de fibrillas de anclaje en la unión dermoepidérmica (DEJ). Las mutaciones en el gen C7 producen una ausencia o reducción de C7, el cual forma fibrillas de anclaje que mantienen la unión de la epidermis a la dermis. Las fibrillas de anclaje de C7 se unen a otros colágenos, proteínas de la matriz extracelular y Lam332 que median la unión de la dermis a la epidermis, como se muestra en la Figura 1B. La ausencia de fibrillas de anclaje conduce a la formación de ampollas en la piel. Los vectores pueden comprender ácidos nucleicos y polipéptidos sustancialmente idénticos a COL7A1 y C7 respectivamente. En otro aspecto, los vectores pueden comprender ácidos nucleicos que codifican una variante funcional de la proteína COL7A1 o C7, con la condición de que la variante sea capaz de anclar las fibrillas entre la epidermis y la dermis. En otro aspecto, sólo se puede usar el marco de lectura abierto del gen COL7A1 que codifica la proteína C7 o una variante funcional de la misma. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de COL7A1 tiene codones optimizados para aumentar la expresión de C7 en la célula transducida, como se sabe en la técnica.
Según la presente invención, el COL7A1 se puede transducir en las células de DEB obtenidas de un paciente usando un vector lentiviral de transducción, que es defectuoso en la replicación y autoinactivante. Los vectores lentivirales autoinactivantes se obtienen del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1), que son pseudotipados con una proteína de envoltura VSV-G heteróloga en lugar de la proteína de envoltura del VIH-1. Como se ha descrito previamente, se introduce una deleción de 400 pb en la región U3 de la LTR que da como resultado un vector autoinactivante (SIN) (Zuffery 1998). Los vectores de la presente invención se distinguen de los vectores SIN de segunda y tercera generación. En particular, los vectores de la presente invención se han modificado para mejorar las características de seguridad y aumentar la capacidad de clonación como se describe más adelante en el presente documento.
Los vectores utilizados para construir los vectores lentivirales de transducción de la presente invención se introducen mediante transfección o infección en una línea celular de empaquetamiento. La línea celular de empaquetamiento produce partículas de vector lentiviral de transducción que contienen el genoma del vector. Después de la cotransfección de los vectores de empaquetamiento, el vector de transferencia y un vector de envoltura a la línea celular de empaquetamiento, el virus recombinante se recupera del medio de cultivo y se titula mediante métodos convencionales usados por los expertos en la técnica. Por lo tanto, las construcciones de empaquetamiento pueden introducirse en líneas celulares humanas mediante transfección con fosfato de calcio, lipofección o electroporación, generalmente junto con un marcador seleccionable dominante, tal como kanamicina, neomicina, DHFR o glutamina sintetasa, seguido de selección en presencia del fármaco apropiado y aislamiento de clones. El gen marcador seleccionable se puede ligar físicamente a los genes de empaquetamiento en la construcción.
Se conocen líneas celulares estables en donde las funciones de empaquetamiento están configuradas para ser expresadas por una célula de empaquetamiento adecuada. Por ejemplo, véase la patente de EE. UU. N° 5,686,279; y Ory et al., (1996), que describen células de empaquetamiento. Las células de empaquetamiento con un vector lentiviral incorporado en ellas forman células productoras. Las células productoras son, por lo tanto, células o líneas celulares que pueden producir o liberar partículas virales infecciosas empaquetadas que llevan el gen terapéutico de interés. Un ejemplo de líneas celulares de empaquetamiento de vectores lentivirales adecuadas incluye las células 293.
Según la invención, el vector lentiviral de transducción se construye a partir de un vector plasmídico de expresión lentiviral que comprende (a) una repetición terminal larga (LTR) 5' modificada, en donde el promotor de la 5’ LTR modificada es un promotor de citomegalovirus, (b) el gen COL7A1, (c) al menos un elemento del tracto de polipurina central lentiviral, y (d) una 3’ LTR modificada, en donde la 3’ LTR modificada comprende una deleción respecto a la 3' LTR de tipo natural, en donde se ha eliminado un elemento regulador transcripcional (PRE) del virus de la hepatitis B.
En otro aspecto de la invención, el elemento regulador postranscripcional (PRE) del virus de la hepatitis B eliminado es un elemento regulador postranscripcional PRE de marmota (WPRE).
En otro aspecto de la invención, el vector plasmídico de expresión lentiviral comprende dos o más elementos del tracto de polipurina central lentiviral (cPPT). Se ha descubierto que la incorporación del elemento cPPT aumenta los niveles de expresión génica.
En otro aspecto de la invención, la 3’ LTR puede modificarse para eliminar un fragmento de 400 pb (como describe Zuffery 1998), en lugar de la eliminación de 133 pb comúnmente utilizada de vectores de LV SIN de 3a generación convencionales. Se cree que la eliminación de 400 pb aumenta la seguridad al evitar la transcripción de lectura completa y también aumenta el título viral porque la transcripción del vector es más estable en las células de empaquetamiento.
En otro aspecto más de la descripción, el plásmido de expresión lentiviral puede incorporar un elemento regulador postranscripcional (PRE) del virus de la hepatitis B, que es preferiblemente el elemento regulador postranscripcional PRE de la marmota (WPRE). Se ha encontrado que el WPRE aumenta el título viral del vector.
Se ha demostrado que la adición de cPPT y la eliminación de 3' LTR modificada mejoran la función del vector lentiviral que comprende el gen COL7A1 de la presente invención para aumentar los niveles de expresión génica, el título viral y la seguridad.
La presente invención incluye además el uso de vectores de transferencia lentivirales en los que se eliminan ciertos elementos comunes para los vectores de expresión lentivirales de tercera generación. En particular, las preocupaciones de seguridad para el uso de vectores lentivirales en seres humanos se basan en el temor de generar un lentivirus competente para la replicación, que puede surgir de la recombinación entre genomas divididos de vectores lentivirales de 3a generación. (Tareen et al., 2013.). La secuencia gag y/o los elementos de respuesta a rev (RRE) pueden eliminarse del vector viral con el fin de reducir la homología de secuencia con otros plásmidos auxiliares y aumentar así la seguridad para los seres humanos. En consecuencia, en una realización de la invención, la secuencia gag está ausente en el vector. En otra realización de la invención, tanto la secuencia gag como la RRE están ausentes en el vector.
Los materiales de partida para generar los vectores lentivirales de la presente invención son preferiblemente un vector de plásmido de expresión lentiviral que comprende un cPPT y un PRE que pueden acomodar la inserción del gen grande COL7A1 (8.89 kpb) o una variante funcional del mismo. Preferiblemente, el material de partida para construir el vector lentiviral de transducción de la presente invención se selecciona de los vectores plasmídicos de expresión lentivirales, pSMPUW (Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA) y pFUGW (Addgene, Cambridge, MA).
En un aspecto de la invención, el vector plasmídico de expresión lentiviral pSMPUW se selecciona para la construcción del vector lentiviral de transducción. La Figura 6 muestra un esquema de los elementos genéticos en el vector plasmídico de expresión lentiviral pSMPUW. Las características del vector de expresión lentiviral pSMPUW se han modificado respecto a los vectores de expresión de lentivirus de 3a generación con el fin de mejorar los niveles de expresión génica y las características de seguridad, como se representa en la Figura 7. En particular, el vector de expresión lentiviral pSMPUW codifica un sitio de clonación múltiple (MCS) seguido por el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE). El elemento gag residual (Agag) y el RRE se eliminaron de la construcción del vector pSMPUW. Además, la construcción del vector pSMPUW utilizó una deleción mayor de 400 pb en la región U3 de 3'LTR en lugar de la deleción de 133 pb comúnmente utilizada en un vector de LV SIN convencional de tercera generación. El gen COL7A1 de tipo natural se incorporó en el vector pSMPUW.
En otro aspecto de la invención, el plásmido de expresión lentiviral pFUGW se selecciona para la construcción del vector lentiviral de transducción. La Figura 8 muestra un esquema de los elementos genéticos en este vector de plásmido. Las características del vector pFUGW incluyen un RRE, dos elementos cPPT y un elemento WPRE, que pueden mejorar la producción lentiviral y la expresión transgénica.
En otro aspecto de la invención, el elemento WPRE se ha eliminado del vector lentiviral.
En una realización de la presente invención, las partículas de vector lentiviral de transducción de la presente invención se denominan INXN-2O02 (vector plasmídico de transferencia - IGE230) o INXN-2004 (vector plasmídico de transferencia - IGE308), o un vector sustancialmente idéntico que comprende variantes funcionales del mismo.
Las células obtenidas del paciente con DEB se transforman con un gen COL7A1 funcional. En un aspecto, las células se transducen con un vector lentiviral que tiene el gen COL7A1. En otro aspecto, el vector lentiviral es un vector autoinactivante. El número de copias del transgén integradas se puede evaluar usando cualquier método conocido. Por ejemplo, el número de copias se puede determinar mediante PCR cuantitativa, amplificación de sonda dependiente de ligación multiplex, hibridación in situ fluorescente (FISH), selección de número de copias basada en micromatrices y cariotipo convencional. El número de copias de transgén integradas en cada célula puede estar modulado por la dosis de virus administrada a las células durante la producción. El número de copias de transgén integradas por célula en las células de RDEB obtenidas transducidas con un vector que contiene COL7A1 depende de la dosis.
Las células obtenidas del paciente con DEB y transformadas con el gen COL7A1 funcional tendrán un gen COL7A1 funcional y presentan morfologías celulares normales. Se puede hacer que estas células proliferen o se expandan en cultivo usando técnicas de cultivo celular convencionales.
Se observan características morfológicas de fibroblastos normales entre los fibroblastos obtenidos transducidos con vectores de transducción de COL7A1 dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, las morfologías de fibroblastos normales incluyen células que presentan aspecto alargado, fusiforme o forma de huso con extensiones delgadas. Las morfologías normales incluyen además células que parecen células estrelladas aplanadas más grandes que pueden tener bordes de dirección citoplásmica. La Figura 9 muestra un ejemplo de morfología celular normal para fibroblastos transducidos con un vector de transducción de COL7A1.
También se ha observado la producción de C7 producido por células de DEB obtenidas de un paciente y transducidas con un vector de transducción de COL7A1. En particular, la formación de trímeros de C7 es importante en el ensamblaje de fibrillas de anclaje. Se ha encontrado que las células de pacientes con DEB transducidas con un vector de transducción de COL7A1 son capaces de formar los trímeros de C7 con la estructura, tamaño y función correctos.
En un aspecto de la invención, es posible verificar que el C7 expresado por fibroblastos transducidos con un vector de transducción de COL7A1, como se define en las reivindicaciones, será capaz de formar fibrillas de anclaje usando inmunoprecipitación con un anticuerpo específico anti-C7. Por ejemplo, el anticuerpo específico anti-C7, fNC1, se puede usar para la captura selectiva y la concentración de C7 de líquidos sobrenadantes de cultivos para la detección por SDS-PAGE/inmunotransferencia. Por ejemplo, las Figuras 9 y 10 demuestran que el C7 producido por fibroblastos transducidos con un vector de transducción de COL7A1 eran predominantemente triméricos.
En otro aspecto de la invención, la función de C7 puede evaluarse usando métodos conocidos, tales como el uso de un ensayo de unión a laminina o ensayo de migración celular. Se ha demostrado que C7 se une a los componentes de la matriz extracelular (ECM) inmovilizada, incluida la fibronectina, Laminina-332 (Lam332), COL1 y COL4 (Chen, et al., 2002a). La interacción entre C7 y Lam332 se produce a través del dominio NC1 NH2-terminal de C7 y depende de la conformación nativa tanto de Lam332 como del NC1 de C7 (Rousselle, et al., 1997). La asociación entre C7 y Lam332 es importante para establecer la arquitectura correcta de Lam332 en la unión dermoepidérmica. Tal organización es importante para las interacciones con ligandos extracelulares y receptores de superficie celular, y para la señalización celular (Waterman, et al., 2007). En un aspecto de la descripción, se ha desarrollado un ELISA que usa un anticuerpo contra el dominio NC1 de C7 para detectar la unión de C7 a Lam332 purificada. Aunque ya se ha descrito en la bibliografía un ELISA de unión a C7/Lam332 (Chen, et al., 2002a), hasta donde saben los autores de la invención, nunca se ha utilizado para analizar la presencia de C7 en los líquidos sobrenadantes de las células transducidas. Los resultados en la Figura 12 muestran la unión dependiente de la dosis a Lam332 por C7 expresado por los GM-HDF de los experimentos de entrenamiento y genotecnológicos.
Además, se puede utilizar un ensayo de migración celular para evaluar la actividad funcional de C7. Estudios previos han mostrado que los fibroblastos y queratinocitos de RDEB muestran un aumento en la motilidad en relación con sus homólogos normales, y que la motilidad normal se puede restablecer mediante la expresión de C7 (Chen, et al., 2000; Chen, et al., 2002b; Cogan, et al., 2014; Baldeschi et al., 2003). El ensayo adecuado incluye el ensayo de migración de sal de oro coloidal para medir la migración de fibroblastos y queratinocitos, o un ensayo de cicatrización de heridas para medir la migración de queratinocitos. Las células que tienen actividad C7 funcional presentarán una motilidad reducida en relación con las células de RDEB en dichos ensayos.
La presente invención se dirige, en un aspecto, a formulaciones farmacéuticas que comprenden células autólogas modificadas genéticamente de pacientes con DEB. Estas células pueden estar presentes en cualquier cantidad adecuada para la administración al paciente en el que se recogieron originalmente las células. Por ejemplo, estas células pueden encontrarse presentes en una concentración celular de 1.0 - 5.0 x 107 células/ml, 1.0 - 4.0 x 107 células/ml, 1.0 - 3.0 x 107 células/ ml, o 1.0 - 2.0 x 107 células/ml. Las células están presentes en una suspensión adecuada para mantener la viabilidad de las células, tal como en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). En particular, la viabilidad de las células en la formulación está presente en una cantidad de > 60%, 70%, 75% u 80%. También pueden estar presentes en la formulación excipientes adecuados, tales como solución salina tamponada con fosfato que puede usarse para lavar las células de viales descongelados que contienen el autólogo genéticamente modificado. Preferiblemente, no está presente rojo de fenol en la formulación final.
Las células modificadas genéticamente autólogas de la presente descripción tienen un número de copias del vector de transducción de al menos o aproximadamente 0.05, 0.09, 0.41 o 0.74 o en el intervalo de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 6.0, de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 5.5, de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 5.0, de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 4.5, de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 4.0, de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 3.5, de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 3.0, de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1, de aproximadamente 0.4 a aproximadamente 1, o de aproximadamente 0.4 a aproximadamente 0.75. Preferiblemente, el número de copias del vector de transducción está en el intervalo de aproximadamente 0.1 aproximadamente 5.0. Se ha encontrado que los fibroblastos o queratinocitos dérmicos humanos transducidos tienen un número de copias del transgén integradas por célula al menos o aproximadamente 1, 2, 5, 10, 20, 25, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 o 50 veces mayor en relación con una composición de transducción no sometida a espinoculación o supertransducción. Además, los valores de expresión de la proteína C7 de las células FCX-007 de la presente invención son > 300, 350, 400, 450, 500, 550 o 600 ng/día/ E6 células. Preferiblemente, los valores de expresión de la proteína C7 de las células autólogas modificadas genéticamente de la presente invención son > 500 ng/día/E6 células. La presente invención también ha encontrado que la expresión de C7 ha aumentado 10, 25, 50, 100, 150 o 200 veces con respecto a los fibroblastos o queratinocitos dérmicos humanos transducidos no sometidos a espinoculación o una segunda transducción.
La multiplicidad de infección (MOI) se refiere al número de partículas de vector por célula utilizadas en la transducción. Según la presente invención, el número de copias del vector de transducción deseado se ha logrado incluso cuando las MOI disminuyen, como se muestra en los ejemplos a continuación. Por ejemplo, la invención se refiere a MOI de < 15, < 14, < 13, < 12, < 11 o < 10. Preferiblemente, la MOI es aproximadamente de 1 a 10.
Las formulaciones de la presente invención pueden ser para usar en el tratamiento de diversas enfermedades de pacientes que padecen deficiencia de Tipo VII. En particular, las formulaciones de la presente invención son adecuadas para tratar la DEB, incluyendo DDEB o RDEB. En una realización de la invención, el uso médico es para tratar subtipos de RDEB, incluyendo, pero no limitados a, RDEB de Hallopeau-Seiemens, RDEB no Hallopeau-Siemens, RDEB inversa, RDEB pretibial, RDEB acral y RDEB centrípeta.
La invención se refiere además al uso médico para el tratamiento, reducción, prevención y/o inhibición de diversos síntomas atribuidos a las deficiencias de C7. Por ejemplo, se sabe que la DEB produce cicatrices después de las ampollas, lo que puede causar deformidades por contracturas, dificultad para tragar si están afectados la boca y el esófago, fusión de los dedos de las manos y los pies y movilidad limitada. Por tanto, en un aspecto de la invención se contempla el uso médico para el tratamiento, reducción, inhibición y/o prevención de la pseudosindactilia, también conocida como síndrome de la mano en mitón. En otro aspecto, la invención se refiere al uso médico para el tratamiento, reducción, inhibición y/o prevención de fibrosis profunda y/o cicatrización asociada con la RDEB y/o DDEB, que puede producir milio, contracturas articulares, fibrosis de tejidos blandos generalizada, fibrosis de órganos, lesiones corneales, placas cicatriciales, alopecia cicatricial, distrofia ungueal, anquiloglosia y aumento de la frecuencia de caries dental, por ejemplo. En otro aspecto, la invención se refiere al uso médico para el tratamiento, reducción, prevención y/o inhibición de lesiones en la mucosa oral y lesiones gastrointestinales asociadas con la RDEB. Otra realización se refiere al uso médico para el tratamiento, prevención, reducción y/o inhibición de ampollas asociadas con pacientes con DEB.
La administración de las células autólogas modificadas genéticamente se puede realizar en cualquier momento apropiado, como sería capaz de determinar un experto en la técnica en función de las necesidades del paciente. Por ejemplo, la administración se puede realizar una vez, una vez al día, una vez al mes, una vez al trimestre o 1 -2 veces al año.
La formulación de la presente invención que contiene las células autólogas modificadas genéticamente puede administrarse al paciente mediante cualquier método conocido, que incluye, pero no se limita a inyección, vía tópica, oral o insertada en una matriz biocompatible. La inyección puede ser, p. ej., inyección parenteral, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraósea, intraarterial, ocular e intraperitoneal o directa en un órgano/tejido específico, p. ej., próstata o hígado. Por vía tópica, la formulación se puede administrar directamente en un sitio afectado, tal como en el sitio de una lesión. El desbridamiento del tejido afectado puede preceder a la aplicación directa de la formulación en el sitio. Alternativamente, la formulación puede encapsularse en un sistema de administración adecuado, tal como una cápsula de polímero, o insertarse en una matriz o injerto biocompatible, p. ej., matriz de colágeno, en un hidrogel, injerto de piel o malla.
Las células autólogas genéticamente modificadas de la presente invención pueden administrarse solas o en combinación con otros tratamientos para un paciente que padece DEB. Los ejemplos de agentes terapéuticos utilizados para tratar la DEB incluyen el cuidado tópico, tal como Zorblisa, injertos de piel, antiinflamatorios, anticuerpos, otras terapias potenciales basadas en genes o células. En otra realización, las células modificadas de la presente invención pueden administrarse por la piel o zonas mucosas donde las terapias de trasplante de médula ósea (u otras terapias celulares del sistema, tales como las células madre mesenquimales) no proporcionaron una terapia suficiente. La capacidad de expresión de C7 de las células autólogas genéticamente modificadas preferiblemente no se ve afectada por una combinación con otros agentes terapéuticos.
La presente invención se refiere además a un método para potenciar o aumentar el número de copias de transgén integradas por célula en las células modificadas genéticamente obtenidas de pacientes con deficiencia de C7 y transducidas según la presente invención. En particular, se ha encontrado que ciertas etapas durante la transducción mejoraron sustancialmente el número de copias del transgén en estas células. Según la invención, las células obtenidas del paciente deficiente en C7 se ponen en contacto con el vector lentiviral de transducción de la presente invención y esa composición se somete a espinoculación, también conocida como transducción por centrifugación. De esta manera, los vectores lentivirales se centrifugan sobre las células diana. La adición de la espinoculación ha aumentado inesperadamente el número de copias por células en los fibroblastos dérmicos humanos modificados genéticamente en un nivel de al menos 5, 10, 15, 20, 25, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 o 50 veces en relación con una transducción sin espinoculación o transducción. Sin embargo, con el fin de identificar métodos adicionales para aumentar el número de copias, se ha descubierto inesperadamente una segunda etapa de transducción (o supertransducción) en la que las células diana se pasan por la primera transducción con espinoculación, y posteriormente se pasan por una segunda transducción opcionalmente con espinoculación. De esta manera, se ha encontrado que esta supertransducción con espinoculación aumenta el número de copias en un aumento adicional de 2 veces en relación con el método de transducción tradicional original que no incluía espinoculación ni supertransducción.
En otra realización, se ha encontrado que cambiar el vector lentiviral de INXN-2002 a INXN-2004 aumentó el número de copias de transgén en los fibroblastos dérmicos humanos modificados genéticamente en 4 veces con respecto a la transducción tradicional sin espinoculación o supertransducción.
Mediante la evaluación exhaustiva de los números de copias de transgenes integradas, se encontró que el cambio acumulativo de añadir espinoculación, añadir supertransducción con espinoculación y cambiar de INXN-2002 a INXN-2004, en relación con el procedimiento de transducción original que no incluía espinoculación o supertransducción, aumentó inesperadamente el número de copias > 27 veces (véase el Ejemplo 9: comparación de TR12.1 y TR3 con TR8 en estudios originales (que no incluían espinoculación ni supertransducción). Por consiguiente, la presente invención se refiere al aumento del número de copias de las células transducidas del paciente con deficiencia de C7.
Para ilustrar adicionalmente la invención, se proporcionan los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos
FCX-007 es una suspensión de células vivas de fibroblastos dérmicos humanos autólogos modificados genéticamente usando un vector lentiviral (INXN-2002) (como se muestra en el Ejemplo 1) o un vector lentiviral (INXN-2004) (como se muestra en el Ejemplo 2) para expresar la proteína de colágeno humano tipo 7.
Ejemplo 1
A. Elucidación de la estructura y características de FCX-007 transducidas con el vector lentiviral INXN-2002
Las células FCX-007 derivadas de células con el vector lentiviral INXN-2002 se suspenden en un medio de crioconservación que consiste en medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) sin suero fetal bovino (50.0%), Profreeze-CDMTM (42.5%) y dimetilsulfóxido (DMSO) (7.5%). Las características estructurales del principio activo (DS, por sus siglas en inglés ürug Substance) FCX-007 incluyen la estructura primaria de las células de fibroblastos dérmicos humanos (HDF) autólogas y la estructura del vector lentiviral utilizado para transducir y modificar genes de las células HDF.
B. Vector lentiviral (INXN-2002)
El vector lentiviral (LV) INXN-2002, que se utiliza para transducir e introducir el gen del colágeno 7A1 humano en las células HDF, es un vector lentiviral recombinante que codifica el gen del colágeno 7A1 humano. El LV INXN-2002 es un vector lentiviral autoinactivante (SIN) que se construye basado en el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) pseudotipado con una proteína heteróloga de envoltura VSV-G. La partícula de virus para el vector lentiviral INXN-2002 tiene aproximadamente 120 nm de diámetro y está compuesta por numerosas proteínas con dos copias de un genoma de ARN monocatenario. No se dispone de una fórmula molecular específica, peso molecular o estereoquímica.
Las características estructurales del LV INXN-2002 incluyen la estructura primaria del genoma viral de ARN y la estructura de la partícula viral. La estructura primaria del genoma de ARN de INXN-2002 se determina por la secuenciación completa de nucleótidos del genoma viral. La estructura de las partículas virales se deduce de la estructura de las partículas del VIH-1 con pseudotipado de la proteína VSV-G añadida. A continuación se proporciona una visión general de la estructura del ácido nucleico y la estructura de la partícula viral.
C. Estructura del genoma viral de ARN de INXN-2002
El LV INXN-2002 es un vector lentiviral autoinactivante (SIN) que se construye basado en el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) pseudotipado con una proteína heteróloga de la envoltura VSV-G en lugar de la proteína de la envoltura del VIH-1. Se introduce una deleción de 400 pb en la región U3 de la LTR que da como resultado un vector autoinactivante (SIN) (Zuffery 1998). El vector plasmídico de expresión lentiviral pSMPUW (Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA) se seleccionó para la construcción del LV INXN-2002. La Figura 6 muestra un esquema de los elementos genéticos en el vector plasmídico de expresión lentiviral pSMPUW.
Los elementos de codificación entre las 5’ y 3' LTR del virus VIH-1 están completamente vaciados. El vector codifica un sitio de clonación múltiple seguido por el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE). Con el fin de maximizar la capacidad de clonación del vector, estos elementos se eliminaron digiriendo el vector con BamHI del sitio de multiclonación y KpnI en el extremo 5' de la repetición terminal izquierda 3'. El casete de expresión del gen COL7A1 con un promotor CMV se clona en el vector digerido mediante reasociación monocatenaria para generar la construcción del plásmido del vector lentiviral que codifica el gen COL7A1 como se muestra en la Figura 13.
La construcción del plásmido del vector lentiviral se cotransfecta en células HEK293T con tres plásmidos auxiliares (pCMV-G, pCMV-Rev2 y pCgp) para producir las partículas de vector lentiviral INXN-2002. El plásmido pCMV-G proporciona la proteína de superficie de pseudotipado VSV-G, pCMV-Rev2 proporciona la proteína Rev del VIH-1 para un transporte y empaquetamiento eficientes del ARN, y pCgp proporciona las proteínas enzimáticas virales y estructurales para la producción de las partículas de vector lentiviral INXN-2002. La figura 14 muestra un esquema de la estructura del genoma de ARN proviral del vector lentiviral INXN-2002.
D. Estructura de la partícula del vector lentiviral INXN-2002
El vector lentiviral INXN-2002 se construye basándose en un esqueleto del vector derivado del VIH-1 y tiene una estructura de partícula viral similar al virus VIH-1. La figura 9 muestra una micrografía electrónica de partículas de VIH-1.
La partícula de VIH-1 tiene una forma esférica de aproximadamente 120 nm de diámetro, con un peso molecular estimado de 277 MDa (Carlson 2008). La partícula tiene una membrana de bicapa lipídica atravesada con proteína de envoltura. La proteína de la envoltura interacciona con los receptores de las células diana para la infección y el suministro del genoma viral de ARN a las células diana. En el interior de la partícula viral se puede observar un núcleocentro en forma de cono, donde se alojan dos hebras del genoma del ARN viral. El núcleo-centro en forma de cono está formado por la proteína de la cápside viral.
Para INXN-2002, se utiliza VSV-G (glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G)) como sustituta de las proteínas de la envoltura del VIH-1, lo que da como resultado una mejor estabilidad del vector, tropismo de la célula diana y eficiencia de transducción (Cronin 2005).
Durante la producción, las partículas virales INXN-2002 se ensamblan y brotan de la superficie de las células HEK293T transfectadas. La proteína VSV-G es proporcionada por el plásmido auxiliar pCMV-G, el núcleo del vector y las proteínas enzimáticas son proporcionadas por el plásmido auxiliar pCgp, y la proteína Rev, que se necesita para el transporte eficiente del genoma de ARN y el empaquetamiento en la partícula viral, es proporcionada por el plásmido pCMV-Rev2. Obsérvese que todas las demás proteínas accesorias del VIH-1, incluidas Vpu, Vif, Vpr, Nef y Tat, se eliminan del vector INXN-2002.
Después de brotar de la superficie de la célula productora, la enzima proteasa empaquetada dentro de la partícula del virus escinde la proteína precursora Gag en sus proteínas constituyentes (MA, CA, NC), para convertir el virión inmaduro en una partícula de vector INXN-2002 infecciosa madura. La figura 15 muestra un esquema que representa los detalles de la partícula de virus INXN-2002 maduro.
Dos hebras del genoma de ARN de INXN-2002 están empaquetadas dentro del núcleo en forma de cono formado por la proteína de la cápside (CA). La proteína de la nucleocápside (NC) forma un complejo estable con el genoma de ARN dentro del núcleo de la cápside. La proteína de la matriz forma una capa en la superficie interna de la membrana. El virus brota a través de la membrana plasmática celular enriquecida con la proteína de envoltura VSV-G y forma la envoltura lipídica. Basado en el reciente análisis tridimensional de la estructura de las partículas de virus VIH-1 (Carlson 2008), la Tabla 1 muestra las proteínas componentes que componen el vector lentiviral INXN-2002 y una breve descripción de la función de cada uno de los componentes.
Tabla 1: Proteínas componentes principales del vector lentiviral INXN-2002
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E. Caracterización de INXN-2002
La Tabla 2 proporciona una lista de los ensayos de caracterización y las especificaciones para INXN-2002 fabricado por City of Hope. Los resultados del ensayo de caracterización se proporcionan en el CoA adjunto para el número de lote I n X n - 2 0 0 2 0786-240-0002-1, el lote previsto para su uso en la fabricación del producto clínico FCX-007.
Tabla 2: Caracterización de INXN-2002
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F. Caracterización de INXN-2002 mediante un ensayo de inmortalización in vitro
El potencial de genotoxicidad por inserción de INXN-2002 se evaluó usando un ensayo de inmortalización in vitro (IVIM). El ensayo se realizó en el Centro Médico del Hospital Infantil de Cincinnati, División de Hematología Experimental y Biología del Cáncer (CCHMC).
El principio del ensayo IVIM se basa en el entendimiento de que las células normales de médula ósea (BM) de linaje negativo (Lin-) dejarán de proliferar después de 3-4 semanas in vitro, pero en presencia de ciertas integraciones de vectores que causan la regulación por aumento de protooncogenes, algunos clones continuarán proliferando después de 5 o más semanas. El número de dichos clones inmortalizados es representativo del potencial oncogénico del vector. Los clones inmortalizados se expanden y se analizan además los marcadores de células madre por FACS, el número de copias del vector por qPCR o el sitio de integración por LAM-PCR. La inserción en sitios de integración comunes (cis) tales como Evil o Prdm 16 se observa con frecuencia en clones inmortalizados generados en ensayos IVIM (Calmels et al., 2005; Modlich et al., 2008).
Se aislaron células de médula ósea (BM) de linaje negativo (Lin-) de ratones C57BL/6 a partir de BM completa mediante separación magnética usando anticuerpos específicos de linaje. A continuación, las células de BM Lin- se cultivaron y estimularon en medio de crecimiento completo durante 2 días. El día 4, las células se transdujeron con el vector INXN-2002 en una placa de 48 pocillos recubierta con RetroNectin (10 pg/cm2, Takara). La figura 16 muestra una configuración esquemática del ensayo IVIM.
Para mejorar la eficiencia de transducción de INXN-2002 en células de BM Lin-, el vector INXN-2002 se concentró aproximadamente 14 veces usando un concentrador centrífugo. Para la transducción, se añadieron 80 pl del INXN-2002 concentrado a cada pocillo que contenía 1.5 x 105 células con 150 pl de medio de transducción. La placa se centrifugó a 1000 g a 32°C durante 70 minutos (espinoculación) para mejorar aún más la eficacia de la transducción. Las células se incubaron a 37°C, 5% de CO2 incubadora O/N.
Con el fin de lograr un alto número de copias del vector INXN-2002 en las células de BM Lin- transducidas, la transducción de INXN-2002 se repitió el día 5, día 6 y día 7 para un total de 4 transducciones consecutivas.
Las células de BM Lin- transducidas se expandieron durante 10 días y la concentración celular se ajustó a 2 - 4 x 105 células/ml cada dos días, y se suministró medio de nuevo según fuera necesario. El día 10 después de la transducción, se recogieron y contaron las células. Luego, una parte de las células se envió para aislamiento de ADN y qPCR para determinar el número de copias del vector (VCN). Las células restantes se volvieron a poner en cultivo para el potencial cultivo en placa del ensayo IVIM entre los días 18-21.
La Tabla 3 muestra el resultado del experimento del ensayo piloto de células de BM Lin- transducidas con INXN-2002 recogidas el día 10.
Tabla 3: Análisis de células de BM Lin- después de la transducción el Día 10
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A pesar del uso del vector INXN-2002 concentrado y las transducciones por espinoculación consecutivas 4x, el número de copias del vector alcanzado en las células de BM Lin- fue significativamente menor que el número de copias objetivo de 1-3 esperado para el ensayo IVIM. El ensayo piloto se terminó.
Debido a los bajos números de copias de vectores experimentados en los ensayos IVIM, así como a los bajos números de copias de vectores logrados en todas los experimentos de transducción de células de fibroblastos de RDEB, se cree que este lote de INXN-2002 presenta un riesgo mínimo de genotoxicidad por inserción cuando se usa para transducir células de fibroblastos de RDEB. No se prosiguió con el análisis de este lote de INXN-2002 mediante el ensayo IVIM.
G. FCS-007 transducidas con INXN-2002
Las células de fibroblastos dérmicos humanos utilizados para la fabricación de FCX-007 se derivan de una biopsia de piel viva. La biopsia se digiere usando Liberase® (Roche) para liberar las células de fibroblastos dérmicos y luego las células se expanden en cultivo usando técnicas de cultivo celular convencionales. Al finalizar la expansión del cultivo después de la transducción de INXN-2002, las células se recogen y se lavan, luego se formulan para que contengan 1.0 - 3.0 x 107 células/ml. Se analiza la pureza del DS y se confirma que contiene > 98% de fibroblastos mediante tinción con CD90 con viabilidad celular de > 85%.
Las células FCX-007 transducidas con LV INXN-2002 en la formulación del DS presentan morfologías típicas de fibroblastos cuando se cultivan en superficies de cultivo de tejidos. Específicamente, las células pueden presentar un aspecto alargado, fusiforme o forma de huso con extensiones delgadas, o las células pueden aparecer como células estrelladas aplanadas más grandes que pueden tener bordes de dirección citoplásmica. También se puede observar una mezcla de estas morfologías. La Figura 17 muestra una morfología y estructura celular típica del DS FCX-007 en cultivo.
Las células expresan proteínas características de los fibroblastos normales, incluido el marcador específico de fibroblastos, CD90 (Thy-1), una glicoproteína de superficie celular de 35 kDa, y las proteínas de la matriz extracelular, tal como varios tipos de colágeno.
H. FCX-007 derivadas del vector lentiviral INXN-2002: caracterización de la liberación del principio activo
El principio activo FCX-007 se caracteriza para la liberación en tres etapas durante la fabricación: durante el procedimiento, recolección a granel y después de la crioconservación (DS). La Tabla 4 proporciona una lista de los ensayos de caracterización y las especificaciones para la liberación del DS FCX-007 fabricado por PCT. Los resultados del ensayo de caracterización para el principio activo terminado se proporcionan en los CoT adjuntos para el experimento de entrenamiento 8 grupo A, grupo B y grupo C (control no transducido).
Tabla 4: Caracterización de la liberación del principio activo FCX-007
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I. Caracterización adicional de DS FCX-007 derivado de INXN-2002
Se ha realizado una caracterización adicional de FCX-007 en los experimentos de producción de entrenamiento para confirmar la expresión de C7 funcional. Las evaluaciones representativas que se muestran a continuación son del experimento de entrenamiento 8 (TR8), donde las células se transdujeron con una dosis alta (3.4 UI/célula) o una dosis baja (1.7 UI/célula) de LV-COL7, o se transdujeron de forma simulada. Estos grupos de transducción también se denominan grupo A, B y C, respectivamente.
J. DS FCX-007 transducidas con INXN-2002: nivel de expresión de C7
Se desarrolló un ensayo de inmunofluorescencia ligada a enzimas (ELISA) con el fin de cuantificar la expresión de C7 por FCX-007. Para este ensayo, los viales del principio activo de TR8 (transducidos en dosis alta, dosis baja y de forma simulada) se descongelaron y cultivaron durante 3 días y los líquidos sobrenadantes de cultivos celulares acondicionados se recolectaron y se analizó el C7. Los resultados de la Figura 18 muestran la expresión de proteína dependiente de la dosis del virus que varía de 60 a 120 ng/ml de C7 en células transducidas con LV-COL7.
K. DS FCX-007 transducidas con INXN-2002: formación de trímero de C7
Las fibrillas de anclaje se forman a partir del ensamblaje de trímeros de C7. La expresión adecuada y la formación de trímeros de C7 por FCX-007 se pueden detectar por inmunoprecipitación de C7 seguida de análisis de SDS-PAGE no desnaturalizante/inmunotransferencia. Para la Figura 19, se inmunoprecipitó C7 de los líquidos sobrenadantes de cultivos de células FCX-007 en el pase 1 y el pase 2 después de la descongelación usando un anticuerpo específico de NC1 y se separó en SDS-PAGE no desnaturalizante y luego se visualizó mediante transferencia Western. El C7 producido por los fibroblastos de RDEB era predominantemente trimérico (flecha roja; ~870 kDa) expresando las células transducidas con LV-COL7 (grupos de transducción A y B) más C7 que las células transducidas de forma simulada (grupo C, asterisco). También se observaron formas monoméricas (290 kDa) y diméricas (580 kDa). Los controles del ensayo incluyeron inmunoprecipitación de C7 purificado (Pur COL7) e inmunoprecipitación sin anticuerpo ni muestra de ensayo (controles IP).
L. FCX-007 transducidas con INXN-2002: unión de C7 a Lam332
C7 interacciona con la Laminina-332 en la unión dérmica/epidérmica (DEJ). La interacción entre C7 y la Lammina-332 es importante para anclar la funcionalidad de las fibrillas (Chen 2002, Rousselle 1997, Waterman 2007). En Intrexon se desarrolló un ensayo de unión para la detección de esta interacción. Los viales del principio activo (transducido en dosis alta, dosis baja y de forma simulada) se descongelaron y cultivaron durante 2 días. Los líquidos sobrenadantes de cultivos celulares acondicionados se recogieron y se incubaron con Lam332 o pocillos recubiertos con albúmina de suero bovino (BSA) y se detectó la unión de C7 usando un anticuerpo específico de NC1 de C7 y un anticuerpo secundario conjugado con HRP. La lectura del ensayo es la densidad óptica a 450 nm (OD450). Los resultados en la Figura 20 muestran la unión dependiente de la dosis del virus a Lam332 en comparación con un control de BSA.
M. FCX-007 derivadas de la evaluación de la migración de INXN-2002
Se desarrolló un ensayo de migración para evaluar la función de C7. Chen 2000 ha demostrado que las células de piel del paciente con RDEB migran más rápido que las células de piel normal hacia el margen de una herida artificial creada en los vasos de cultivo de tejidos, y que la aplicación de C7 puede restablecer la tasa de migración. Se descongelaron y cultivaron fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF; Lonza) y células de viales de principio activo FCX-007. Las células se sembraron en placas de cultivo con un inserto para evitar la adherencia celular en una pequeña tira de la placa de cultivo. A continuación, se retiró la tira y se controló mediante microscopía la velocidad a la que las células migraron a la zona abierta y se cuantificó utilizando el complemento de delineación de formas irregulares para el software ImageJ. Las Figuras 21A-21B muestran tanto el porcentaje de migración (A) como las imágenes de migración (B) para este ensayo. Los resultados muestran que los fibroblastos del paciente con RDEB transducidos de forma simulada migran a la zona abierta más rápido que los NHDF, y la transducción con LV-COL7 revierte las células del paciente a una tasa de migración similar a la de los NHDF. Estos resultados son consistentes con los descritos por Chen 2000.
Ejemplo 2: FCX-007 transducidas con vector lentiviral INXN-2004
FCX-007 es un producto de células de fibroblastos autólogos modificados genéticamente por el vector lentiviral INXN-2004 (LV-COL7) para expresar la proteína de colágeno 7 humana (C7). Los materiales utilizados para fabricar DS FCX-007/INXN-2004 que se describen a continuación son similares a los expuestos anteriormente en el Ejemplo 1, excepto que se utilizó el plásmido del vector LV-COL7 IGE-230 para la producción de INXN-2002. Se usó el plásmido del vector LV-COL7 IGE-308 para hacer el vector INXN-2004. Se usaron los mismos plásmidos auxiliares, pCMV-G, pCMV-Rev2 y pCgp para cotransfectar una línea celular 293 WCB.
Vector lentiviral INXN-2004
Plásmido de transferencia del vector LV-COL7 IGE308
El plásmido IGE308 se construyó utilizando métodos de clonación molecular convencionales. El procedimiento de construcción implicó la clonación del gen COL7A1 humano e introducción del gen COL7A1 clonado en un esqueleto de vector lentiviral (SIN), pFUGW, para producir el plásmido de transferencia del vector LV-COL7 IGE308.
Clonación del gen COL7A1 humano
El gen COL7A1 clonado en el plásmido de transferencia del vector LV-COL7 IGE308 es el mismo gen COL7A1 clonado en INXN-2002 (plásmido de transferencia de vector IGE230).
Los cebadores se diseñaron y produjeron con la transcriptasa inversa Takara PrimeScript para amplificar el gen COL7A1 del ADNc genómico humano. Se diseñaron cuatro pares de cebadores, como se muestra en la Tabla 5, cada uno para amplificar aproximadamente 2 kb del gen COL7A1.
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Los productos se amplificaron con dos pares de cebadores (CollF2/CollR4 y CollF4/CollR1) diseñados para amplificar los 3790 pares de bases (pb) del extremo 5' de COL7A1 del ADNc genómico humano junto con un extremo saliente 5' para la clonación en el vector de expresión. Los dos productos de PCR de 5' (2127 pb y 2993 pb) se unieron mediante PCR de extensión por superposición para generar un producto final de 3790 pb.
Con el fin de clonar el resto del gen, se sintetizó un fragmento de ADN (341 pb, Col1A1-3, Tabla 6, que abarca los 322 pb finales del gen COL7A1 con solapamientos con el fragmento de gen de 3790 pb 5' amplificado por PCR y el vector de clonación.
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Los dos fragmentos del gen COL7A1 (3790 pb y Col1A1-3) se ensamblaron en un vector de expresión inducible (VVN-257673) que se había digerido previamente con NheI y ClaI utilizando el kit de clonación In-Fusion HD. Los clones bacterianos se cribaron por PCR con cebadores específicos del vector principal y secuencia de COL7A1 para identificar candidatos para la secuenciación. Los clones positivos se confirmaron por digestión y secuenciación de fragmentos de ADN de COL7A1. El plásmido resultante se denominó VVN-4311835.
VVN-4311835 y un plásmido de expresión de COL7A1 (SC300011) adquirido de Origene se digirieron con BstZ17I y SapI. Un fragmento de 6276 pb del gen COL7A1 se clonó desde SC300011 en VVN-4311835. El plásmido resultante, VVN-4311835 (usaba el mismo número de plásmido), se secuenció completamente y se confirmó que la secuencia de COL7A1 estaba completa y sin mutaciones.
El plásmido VVN-4311835 se digirió con NheI y ClaI, dos enzimas de restricción con sitios justo fuera de la secuencia codificante de COL7A1. El gen COL7A1 escindido se clonó en un vector de expresión constitutivo, VVN-257231, que también se digirió con NheI y ClaI, para producir VVN-4319958. VVN-4319958 expresa el COL7A1 humano de longitud completa bajo el control del promotor constitutivo de CMV.
La Figura 22 proporciona un esquema para la clonación del gen COL7A1 humano.
Introducción del gen COL7A1 clonado en un vector lentiviral (SIN)
El vector de expresión lentiviral pSMPUW (VPK-211, Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA) se seleccionó inicialmente para la construcción del vector lentiviral INXN-2002 que codifica el gen COL7A1 basado en sus características de seguridad mejoradas y gran capacidad de clonación.
La Figura 7 compara el vector pSMPUW con un vector LV SIN de 3a generación convencional. El vector pSMPUW codifica un sitio de clonación múltiple (MCS) seguido por el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE). El gag residual (Agag) y el elemento RRE se eliminaron de la construcción del vector pSMPUW. Además, la construcción del vector pSMPUW utilizó una deleción mayor de 400 pb en la región U3 de 3’ LTR en lugar de la deleción de 133 pb comúnmente utilizada en un vector LV SIN de 3a generación convencional.
Los detalles de la clonación del gen COL7A1 en el vector de expresión lentiviral pSMPUW para la construcción del vector lentiviral INXN-2002 se describieron antes en el Ejemplo 1, y se describen además más adelante.
Se generó un inserto que contenía un promotor CMV seguido de una secuencia Kozak y una versión truncada del gen COL7A1 con sitios de restricción BclI y SapI para usar para la introducción de la secuencia codificante completa. Este inserto se sintetizó en dos fragmentos, CColG y ColG2 (IDT) (Tabla 8). Estos dos fragmentos se ensamblaron con el vector pSMPUW digerido utilizando el kit de clonación In-Fusion HD. Los clones positivos se identificaron usando PCR de colonias con un cebador específico para el esqueleto del plásmido (63968-3R) y un cebador específico para el gen COL7A1 (ColS14). Los plásmidos de clones positivos se purificaron y se confirmó la secuencia para generar IGE228. IGE228 se digirió con FspI y BamHI.
Los primeros intentos de clonar el gen COL7A1 usando los sitios BclI y SapI no tuvieron éxito. Se ideó una estrategia alternativa utilizando un producto de PCR como un enlazador para circunvalar el sitio de restricción BclI. Se usaron los cebadores EPF5 y CollR3 para generar un producto de PCR a partir de la plantilla de plásmido VVN-4319958. Este producto se digirió con BamHI, que corta 48 pb secuencia arriba del extremo 5' de COL7A1, y FspI, que corta 1630 pb en el extremo 5' de COL7A1 para generar el enlazador 5'.
El gen COL7A1 de tipo natural se cortó con FspI y SapI de VVN-4319958. Este fragmento se ligó al IGE228 digerido y al enlazador 5' para generar una construcción de lentivirus para la expresión de COL7A1, VVN-4580853 (también denominado IGE230). Los clones positivos se identificaron utilizando los cebadores ColS13, específicos para COL7A1 y 63968-3R, específico del esqueleto lentiviral. El plásmido se secuenció desde el promotor CMV hasta el extremo 3' de COL7A1.
La Tabla 7 a continuación muestra las secuencias de genes sintéticas y los cebadores utilizados para la introducción del gen COL7A1 en el vector de expresión lentiviral pSMPUW.
Tabla 7: Elementos de genes sintéticos y cebadores
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La Figura 23 proporciona un esquema de la clonación del gen COL7A1 en el vector de expresión pSMPUW para producir el plásmido de transferencia del vector lentiviral INXN-2002, IGE230.
Los resultados de continuar el desarrollo indicaron que la eliminación del elemento RRE y el uso de una eliminación grande de 400 pb en la región U3 de 3' LTR en la construcción del vector pSMPUW, combinados con el requisito de empaquetar un gen COL7A1 grande (8.8 kpb), dio como resultado un impacto negativo en la producción del vector LV-COL7 (título infeccioso) y la posterior transducción y expresión de proteína C7 en células de fibroblastos de RDEB.
Se seleccionó un vector SIN de 3S GEN, pFUGW (FUGW, plásmido n.° 14883, www.addgene.org) para construir un vector LV-COL7 de segunda generación, INXN-2004. INXN-2004 se construyó para mejorar el número de copias del vector. La figura 8 proporciona un esquema de los elementos genéticos en el vector de plásmido de expresión lentiviral pFUGW.
El vector pFUGW contiene un RRE, dos elementos cPPT, así como un elemento WPRE (elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota) para lograr una mejor producción de vectores lentivirales y expresión transgénica. El plásmido de transferencia de vector lentiviral IGE308 se construyó para maximizar la capacidad de clonación de transgenes para adaptarse a la inserción del gen COL7A1 grande (8.8 kpb).
El elemento WPRE, el promotor hUBC y el gen indicador GFP se eliminaron mediante digestión del vector con PacI y Xhol. Se generó un inserto que contenía el extremo 5' del promotor CMV seguido de un fragmento pequeño del extremo 3' del gen COL7A1. Este inserto (ColCN) se sintetizó en IDT como un fragmento G-Block (secuencia en la Tabla 8). El fragmento se ensambló con el vector pFUGW digerido usando un método derivado de clonación de Gibson. Los clones positivos se identificaron usando PCR de colonias con cebadores específicos del esqueleto del plásmido (FugwQCF y FugwQCR). Los plásmidos de clones positivos se purificaron y se confirmó la secuencia para generar IGE301.
A continuación, se digirió IGE301 con BaeI. IGE230 se digirió con AseI y SapI para crear un fragmento que contenía el extremo 3' del promotor CMV, la 5'UTR y la mayoría del gen COL7A1. El fragmento se transfirió al vector IGE301 digerido con BaeI usando un método derivado de la clonación de Gibson. Los clones positivos se identificaron utilizando los cebadores ColS13, específicos para COL7A1 y FugwQCR, específico del esqueleto lentiviral. Se purificaron plásmidos de clones positivos y se confirmó la secuencia para generar IGE308.
La Tabla 8 a continuación proporciona las secuencias de genes sintéticos y los cebadores utilizados para la introducción del gen COL7A1 en el vector de expresión lentiviral pFUGW.
Los plásmidos se prepararon con Maxi con el kit MaxiPrep de Qiagen según el protocolo del fabricante.
Tabla 8: Elementos génicos sintéticos y cebadores utilizados en las etapas finales de la creación de IGE308
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La figura 24 proporciona una representación esquemática de la construcción del plásmido de transferencia de vector lentiviral INXN-2004 (IGE308).
Producción del plásmido IGE-308
El plásmido IGE308 se produjo utilizando un procedimiento que consiste en cinco etapas: transformación, producción de reserva de glicerol, aumento de escala, captura, diafiltración y formulación.
Transformación: se proporcionó un banco de semillas del plásmido IGE308 a Aldevron para su transformación en E. coIí competentes (DH10B). Las placas de transformación se almacenaron a 34°C, que es el estándar para construcciones lentivirales.
Producción de reserva de glicerol - se crearon cultivos de semillas seleccionando colonias aisladas de la placa de transformación. Cada cultivo se preparó con miniprep y el mejor cultivo de semillas, determinado mediante gel de agarosa, se usó para hacer las reservas de glicerol de trabajo. Aumento de escala - se cultivó un cultivo de 500 ml en cada uno de los siguientes tipos de medios: medio de crecimiento rápido y medio de rendimiento máximo (para un total de dos cultivos de 500 ml) con el fin de comparar los medios. Los cultivos se inocularon utilizando las reservas de glicerol creadas en la etapa dos y se llevó a cabo un panel completo de ensayos de control de calidad (QC) en cada preparación. Esto también permitió a Aldevron ensayar la estabilidad del plásmido en cada tipo de medio. Basándose en los resultados iniciales del QC, se eligió el medio de crecimiento rápido para el crecimiento de E. coIí transformada en matraces agitadores a 34°C. Se preparó un total de 8 L de cultivo.
Captura - Los 8 L de cultivo de E. coIí se lisaron e inicialmente se purificaron usando cromatografía de intercambio aniónico DMAE que produjo un total de 833.8 mg de plásmido. Se llevó a cabo una etapa de purificación adicional usando cromatografía HIC (cromatografía de interacción hidrofóbica) sobre resina OS. Esta etapa produjo 663 mg de ADN purificado.
Concentración y formulación: el plásmido purificado se ajustó luego al tampón final y la concentración mediante diafiltración en serie. El tampón final utilizado fue TE.
Se envió un total de 200 mg de plásmido IGE308 en una concentración de 1.4 mg/ml. El plásmido IGE308 se analizó antes de seguir con la fabricación de INXN-2004.
Análisis de la secuencia del plásmido IGE308
El plásmido IGE308 utilizado para la fabricación de INXN-2004 se secuenció por completo en SeqWright en condiciones de GLP utilizando paseo con cebador y la síntesis de oligonucleótidos para producir una cobertura de secuencia bidireccional de 4 veces. El plásmido IGE308 tiene un tamaño de 16777 pb. La secuencia mostró una coincidencia de 100% con la secuencia de referencia de construcción de IGE308 proporcionada a SeqWright. Los elementos génicos en el plásmido IGE308 se ilustran en las Figuras 25A-25B. La Tabla 9 proporciona una lista de elementos génicos con sus funciones correspondientes.
Tabla 9: Tamaño y funciones de los elementos génicos en el plásmido IGE308
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La secuencia del gen COL7A1 en el plásmido IGE308 (sin el codón de parada TGA) se comparó con la secuencia del colágeno tipo VII, alfa 1 (COL7A1) Homo sapiens, de GenBank (NM_000094.3). El alineamiento de la secuencia se proporciona en el Apéndice 4. Se identificaron tres mutaciones puntuales silenciosas como se citan en la Tabla 10 a continuación. No se identificó ningún hueco en la secuencia. Las tres mutaciones puntuales silenciosas no tienen impacto en la proteína C7 codificada.
Tabla 10: Comparación de secuencias de COL7A1 en IGE308 y consenso de GenBank
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Plásmidos auxiliares, pCMV-G, pCMV-Rev2 y pCgp
CoH proporcionó los tres plásmidos auxiliares utilizados para la producción del vector LV INXN-2004, pCMV-G, pCMV-Rev2 y pCgp.
Banco de células de trabajo 293T (WCB)
CoH proporcionó el WCB 293T utilizado para la producción del vector LV INXN-2004.
Otros materiales de partida para la fabricación de INXN-2004
CoH también proporcionó otros materiales de partida utilizados para la producción del vector LV INXN-2004.
Tejido de biopsia
Se recogen tres biopsias de piel en sacabocados (punch) de 3-4 mm (capas de dermis y epidermis) de una zona sin ampollas del cuerpo del sujeto con RDEB usando prácticas asépticas convencionales. Las biopsias son recogidas por el médico tratante, se ponen en un vial que contiene solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril, fría, y se envían al día siguiente en un contenedor refrigerado de transporte de sustancias infecciosas, que es apropiado para enviar tejido potencialmente biopeligroso y está diseñado para mantener una temperatura de 2-8°C.
a. Reactivos, disolventes y materiales auxiliares
i. Reactivos y disolventes
En el procedimiento de fabricación del principio activo FCX-007 se utilizan dos reactivos de origen animal: suero bovino fetal (FBS) y solución de tripsina-EDTA. Medio de crecimiento completo
El medio de crecimiento completo (CGM) se utiliza en la fabricación de FCX-007 durante todas las etapas de expansión del cultivo celular. El CGM se prepara mezclando 18 L de IMDM en una bolsa de 20 L con 2 L de FBS mediante transferencia aséptica. La bolsa de CGM formulada se almacena en un refrigerador a 5±3°C.
a. Medio de crecimiento de iniciación
El medio de crecimiento de iniciación (IGM) se utiliza en la fabricación de FCX-007 para la siembra inicial de fibroblastos después de la digestión de la biopsia en un matraz de cultivo de células T-75 en presencia de antibióticos. El medio de crecimiento de iniciación se prepara reciente mediante la adición de forma aséptica de 0.6 ml de la solución de antibiótico concentrada (GA) 100 veces dentro de una BSC ISO5 a 58.2 ml de CGM en una botella cuadrada de medios de 500 ml. Las concentraciones finales son gentamicina 0.4 mg/ml, anfotericina B 0.295 pg/ml. También se añade solución de GSH (1.2 ml de solución 50X) a la botella cuadrada de medios de 500 ml. Las botellas se cierran y se invierten 3-5 veces para mezclar. El IGM se calienta dentro de una incubadora a 37°C durante al menos 60 minutos antes de su uso inmediato.
El medio de crecimiento de iniciación se prepara nuevo inmediatamente antes de su uso y, por lo tanto, no se aplica fecha de caducidad ni se realizan pruebas de liberación de control de calidad.
b. Medio de transducción
Se utiliza medio de transducción (TM) durante la transducción de INXN-2004 de células de fibroblastos. El medio de transducción se prepara reciente dentro de una BSC ISO5 añadiendo 40 ml de IMDM a un tubo de centrífuga de 250 ml que contiene 10 ml de CGM para diluir la concentración del FBS al 2% en el medio. El tubo de 250 ml se mezcla y se pone dentro de una incubadora a 37.0°C para que se caliente hasta que se necesite para la transducción de INXN-2004.
El medio de transducción se prepara nuevo inmediatamente antes de su uso y, por lo tanto, no se aplica fecha de caducidad ni se realizan pruebas de liberación de control de calidad.
c. Solución GSH
El GSH se complementa con el medio de crecimiento de iniciación (IGM) y CGM usado en los cultivos de células de fibroblastos T-75 y T-175 en la etapa previa para mejorar el crecimiento celular. Se prepara una solución madre de GSH 50X dentro de una BSC ISO5 disolviendo 51.1 g de GSH en 1 L de IMDM. La solución se filtra a través de 0.22 pm. La solución filtrada se divide en partes alícuotas en tubos de centrífuga de 50 ml con 20 ml por tubo y se almacena congelada a -80°C para su uso posterior.
d. Solución de RetroNectin™
RetroNectin™ se utiliza en el procedimiento de producción de FCX-007 para mejorar la eficiencia de transducción de INXN-2004 en células de fibroblastos. Dentro de una BSC ISO5, usando una jeringa de 5 ml y una aguja de 18 g, se transfieren asépticamente 2.5 ml de WFI a un vial de RetroNectin® de calidad clínica para reconstituir RetroNectin® a 1.0 mg/ml. RetroNectin® se disuelve completamente agitando suavemente. Todo el contenido del vial de RetroNectin® se extrae usando la jeringa de 5 ml adjunta. La aguja 18 g se reemplaza asépticamente con un filtro de jeringa de 0.22 pm en la jeringa, y el RetroNectin® reconstituido se filtra de forma estéril en un tubo de centrífuga de 250 ml. Usando una pipeta del tamaño adecuado, se transfieren 122.5 ml de PBS al RetroNectin® reconstituido en el tubo de centrífuga de 250 ml para diluir el RetroNectin® a 20 pg/ml, que luego se mezcla bien usando una pipeta. Usando una pipeta de tamaño adecuado, se añaden 6.3 ml de la solución de RetroNectin® diluida a cada uno de los matraces T-25 para recubrir la superficie con RetroNectin® a 5 pg/cm2. Para la primera ronda de transducción de INXN-2004, se preparan matraces T-25 de 5x a 10x. Para la supertransducción de INXN-2004, se preparan matraces T-25 18x.
La solución de RetroNectin™ se prepara nueva inmediatamente antes de su uso y, por lo tanto, no se aplica fecha de caducidad ni se realizan pruebas de liberación de control de calidad.
Medio de crioconservación
El medio de crioconservación es una solución concentrada dos veces que se añade a los fibroblastos recolectados y lavados durante el procedimiento de fabricación de FCX-007 para formular el cultivo de reserva de células y el principio activo FCX-007 para su almacenamiento en nitrógeno líquido. El medio de crioconservación se prepara mezclando 0.85 volúmenes de ProFreeze™-CDM (2X) con 0.15 volúmenes de DMSO para obtener un volumen de medio de crioconservación.
El medio de crioconservación se prepara nuevo inmediatamente antes de su uso y, por lo tanto, no se aplica una fecha de caducidad ni se realizan pruebas de liberación de control de calidad.
Ejemplo 3: Experimento de entrenamiento 8, 9 y 10 y digestión enzimática de biopsia mejorada
Experimento de entrenamiento 8 y digestión enzimática de biopsia mejorada
En los TR anteriores, se sospechaba que el método de digestión de la biopsia no podía lograr una digestión eficaz del tejido de la biopsia de 3-4 mm de tamaño. En el TR8, se incorporó al procedimiento la aplicación de fuerza de cizallamiento adicional durante el proceso de digestión para mejorar la eficiencia general de la digestión. El proceso de digestión se modificó a lo siguiente: agitar con vórtice en pulsos el tubo de centrífuga al ajuste máximo durante 5 segundos, cada 15 ± 2 minutos durante la digestión, devolviendo el tubo de centrífuga al agitador orbital después de cada agitación con vórtice; al final de los 60 minutos de incubación, agitar con vórtice en pulsos el tubo de centrífuga en el ajuste máximo durante 10 segundos.
Se procesó y digirió una biopsia de un donante de RDEB utilizando el método de digestión mejorada. Las células de la digestión se sembraron en un matraz T-75 utilizando medio de cultivo complementado con GSH. Las células mostraron un buen crecimiento y alcanzaron una confluencia de 90% el día 14 para el pase. Para evaluar las condiciones de transducción de INXN-2002, las células recolectadas del matraz T-75 se sembraron en 3x matraces T-175, como control, grupo A y grupo B. Las células de los tres grupos se expandieron, se transdujeron con el vector LV-COL7 piloto 10 L en 1-CS (el grupo de control se transdujo de forma simulada) y luego se expandieron más en 2x 10-CS antes de recolectar para la crioconservación.
Tabla 11: Crecimiento celular y rendimiento celular en el experimento de entrenamiento 8
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El número total de células recolectadas de la 10-CS se consideró adecuado para la producción adicional del producto farmacéutico FCX-007 para inyección. Las células recolectadas se analizaron para determinar el número de copias del gen COL7A1 (eficiencia de transducción), expresión de la proteína C7, viabilidad celular y pureza celular. La Tabla 12 proporciona los resultados del análisis de las células recolectadas de los tres grupos.
Tabla 12: Análisis de células recolectadas del experimento de entrenamiento 8
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1 Título de INXN-2002 UI: 9.2 x 106 Ul/ml que se determinó en Intrexon utilizando un ensayo de título de infección de H1299 en etapa de desarrollo temprano.
2 Los detalles de los ensayos se proporcionan en la Sección 3.2.S.4.
3 BLQ: por debajo del límite de cuantificación
Se observó un aumento dependiente de la dosis de la multiplicidad de infección (MOI) en el número de copias del gen COL7A1 y la expresión de la proteína C7. Los detalles del desarrollo y la optimización de la transducción de INXN-2002 se describen a continuación. Aunque el título bajo de UI de INXN-2002 limitó la MOI de transducción y el posterior número de copias del gen COL7A1, se observó que la expresión de la proteína C7 era biológicamente relevante en el entorno preclínico, como lo demuestran los resultados in vitro e in vivo. En general, los resultados muestran que las células de fibroblastos de RDEB se pueden transducir con INXN-2002 y expresar la proteína C7 funcional.
El producto de células del grupo A del TR8 se utilizó para los estudios demostrativos preliminares y estudios de toxicología y biodistribución.
Experimento de entrenamiento 9
Se procesó y digirió una biopsia de un donante de RDEB utilizando el método de digestión mejorada. Las células de la digestión se sembraron en un matraz T-75 utilizando medio de cultivo complementado con GSH. Al igual que TR8, las células mostraron un buen crecimiento y alcanzaron una confluencia de 90% el día 19 para el pase. Para evaluar las condiciones de transducción de LV-COL7, las células recolectadas del matraz T-75 se sembraron en 3x matraces T-175, como Control, Grupo A y Grupo B. Las células de los tres grupos se expandieron, se transdujeron con el vector LV-HA-COL7 (que contiene un marcador HA en la construcción) en 1-CS (el grupo de control se transdujo de forma simulada), luego se expandieron más en 2x 10-CS antes de ser recolectadas. Las células recolectadas se analizaron para determinar el número de copias del gen COL7A1 (eficiencia de transducción), la expresión de la proteína C7 y la pureza celular. La Tabla 13 proporciona el crecimiento celular en TR9.
Tabla 13: Crecimiento celular y rendimientos celulares en el experimento de entrenamiento 9
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1 El vector LV-HA-COL7 es un vector de investigación que incorporaba un marcador HA a la secuencia de COL7A1 en el vector LV INXN-2002.
2 El número total de células recolectadas de la 10-CS se considera adecuado para la producción adicional del producto farmacéutico FCX-007 para inyección.
La Tabla 14 proporciona los resultados del análisis de las células recolectadas de los tres grupos.
Tabla 14: Análisis de células recolectadas del experimento de entrenamiento 9
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1 Título del vector LV-HA-Col7: 2.0 x 106 Ul/ml que se determinó en Intrexon utilizando un ensayo de título de infección de H1299 en etapa de desarrollo temprano.
2 Los detalles de los ensayos se proporcionan en la Sección 3.2.S.4.
3 BLQ: por debajo del límite de cuantificación
Se observó de nuevo un aumento dependiente de la dosis de la MOI en el número de copias del gen COL7A1 y la expresión de la proteína C7. Una vez más, los resultados muestran que las células de fibroblastos de RDEB pueden cultivarse con éxito, transducirse con el vector LV-HA-COL7 y expresar la proteína C7.
Experimento de entrenamiento 10 y aumento de la escala a seis 10-CS
De acuerdo con el protocolo clínico propuesto (véase el Módulo 5), son necesarias 4 x 108 células del producto farmacéutico FCX-007 para una sola dosis de tratamiento, con la posibilidad de repetir la dosificación. Para cumplir con las necesidades proyectadas del producto FCX-007, es necesario aumentar la escala de la etapa final de expansión celular a seis 10-CS en función de los rendimientos de células alcanzados en el TR8 y TR9.
Se procesó y digirió una biopsia de un donante de RDEB utilizando el método de digestión mejorada. Las células de la digestión se sembraron en un matraz T-75 utilizando medio de cultivo complementado con GSH. Las células mostraron un buen crecimiento y alcanzaron una confluencia de 90% el día 19 para el pase. Las células recolectadas del matraz T-75 se sembraron en 2x matraces T-175, uno para la transducción de INXN-2002 y otro para el control del sustrato celular. Las células de un matraz se expandieron, se transdujeron con INXN-2002 en 1-CS y luego se expandieron más en 6x 10-CS antes de recolectarlas. La Tabla 15 proporciona el crecimiento celular en el TR10.
Tabla 15: Crecimiento celular y rendimientos celulares en el experimento de entrenamiento 10
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En relación con las células en el TR8 y TR9, las células en el TR10 crecieron más lentamente y produjeron menos células en cada etapa de pase, lo que indica una posible variabilidad entre los diferentes donantes de RDEB.
El número total de células recolectadas de las 6x 10-CS se considera adecuado para la producción de una dosis del producto farmacéutico FCX-007 para inyección.
La Tabla 16 proporciona los resultados del análisis de las células recolectadas.
Tabla 16: Análisis de células recolectadas de TR10
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1 Título de INXN-2002 UI: 9.2 x 106 Ul/ml que se determinó en Intrexon utilizando un ensayo de título de infección de H1299 en etapa de desarrollo temprano.
2 Los detalles de los ensayos se proporcionan en la Sección 3.2.S.4.
Ejemplo 4
Desarrollo y optimización de la transducción de INXN-2002
La transducción lentiviral de células de fibroblastos dérmicos se desarrolló y optimizó inicialmente utilizando células de fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF; Lonza, CC-2511) cultivadas en placas de 96 pocillos con un modelo lentiviral GFP (GeneCopoeia, LP-EGFP-LV105-0205).
Utilizando el protocolo de transducción de LV de GeneCopoeia como punto de partida, la optimización inicial evaluó las condiciones, incluida la densidad celular en el momento de la transducción, el volumen del cultivo de transducción, el uso de RetroNectin™, sobreinfección (retransducción de células con virus en dos días consecutivos), tiempo de siembra de células (en el momento de la transducción frente a un día antes de la transducción) y contenido de suero en los medios de transducción. A continuación, se implementó el procedimiento de transducción óptimo en un entorno de producción GMP. Los detalles de los estudios se describen a continuación.
A. Efecto de las condiciones de siembra celular y recubrimiento de RetroNectin™ para transducción de LV
Los NHDF en fase de crecimiento exponencial se recolectaron y sembraron en placas de 96 pocillos en dos fechas diferentes en diferentes densidades de siembra. Un conjunto de placas de 96 pocillos no tratadas para cultivo de tejidos se recubrieron con RetroNectin™ según la recomendación del fabricante (la densidad del recubrimiento de RetroNectin™ fue de 20 gg/cm2). Para las células sembradas un día antes de la transducción de LV (Día -1), se retira el medio gastado y se añade medio nuevo (100 gl) con el vector de LV a los pocillos el Día 0 para la transducción. Para el día de las condiciones de transducción (Día 0), se añaden simultáneamente a los pocillos las células y el vector LV en 100 gl de medio nuevo. La MOI utilizada fue de 2000 pv/célula para todas las condiciones. Después de una incubación durante la noche, se eliminó el medio y las células se alimentaron con 100 gl de medio nuevo para cultivo adicional. Noventa y seis horas después de la transducción, las células se recolectaron para el análisis de la eficiencia de la transducción mediante el análisis FACS de la señal de GFP en un BD LSRII y se analizaron con el software FlowJo (v.10). La Tabla 17 proporciona las eficiencias de transducción de LV en las diferentes condiciones.
Tabla 17: Efecto de las condiciones de siembra celular y recubrimiento de RetroNectin™ en la transducción de LV de células de fibroblastos (% de células positivas para GFP)
Figure imgf000031_0002
1 Area superficial para una placa de 96 pocillos: 0.32 cm2
NR = No realizado
Los resultados demuestran que no es necesario sembrar previamente las células el día anterior a la transducción de LV. Las células y el vector LV se pueden añadir simultáneamente en el momento de la transducción, lo cual es conveniente para las operaciones de fabricación GMP. El recubrimiento de la superficie de cultivo con RetroNectin™ antes de la transducción de LV aumentó significativamente la eficiencia de la transducción del LV. Se desea la mayor densidad de siembra celular de aproximadamente 1 x 104 células/cm2 durante la transducción de LV, ya que la menor densidad de siembra de células dio como resultado una menor eficiencia de transducción de LV.
B. Efecto de la MOI y supertransducción en la eficiencia de transducción de LV
En este estudio, se examinaron los efectos de la MOI y la supertransducción en la transducción del LV de células de fibroblastos.
Un conjunto de placas de 96 pocillos no tratadas para cultivo de tejidos se cubrió previamente con RetroNectin™ (20 gg/cm2) antes de utilizarlas para la transducción. En el momento de la transducción, se añadieron a un pocillo 3000 células con el vector LV en un volumen de 100 gl. Después de una incubación durante una noche, se eliminó el medio y se alimentaron las células con 100 gl de medio nuevo para el cultivo adicional. Para la supertransducción, se retiró el medio de cultivo de los pocillos un día después de la transducción inicial (aproximadamente 24 horas) y se añadió a los pocilios la misma cantidad de vector LV en 100 pl de medio nuevo. Después de 3 horas de transducción, se eliminó el medio y las células se alimentaron con 100 pl de medio nuevo para cultivo adicional. Noventa y seis horas después de la transducción, las células se recolectaron para el análisis de eficiencia de transducción mediante análisis FACS de la señal GFP en un BD LSRII y se analizaron utilizando el software FlowJo (v.10). La Tabla 18 proporciona las eficiencias de transducción de LV en las diferentes condiciones.
Tabla 18: Efecto de la MOI y supertransducción en la transducción de LV de células de fibroblastos (% de células positivas para GFP)
Figure imgf000032_0001
Una MOI cada vez más alta dio como resultado mayores eficiencias de transducción con y sin supertransducción. La supertransducción dio como resultado un aumento gradual en la eficiencia de transducción de LV. Sin embargo, el aumento no se consideró significativo y no se implementó en el entorno de producción GMP.
C. Volumen de cultivo de la transducción de LV y concentración de FBS
Las partículas del vector lentiviral primero necesitan hacer contacto con las células de fibroblastos en cultivo con el fin de lograr la transducción. Al igual que otras partículas virales, las partículas LV en solución siguen un movimiento browniano y una transducción productiva es generalmente un suceso aleatorio. Se ha demostrado que la reducción de la profundidad del medio de cultivo a un volumen mínimo o el uso de espinotransducción mejora la transducción del vector viral en las células diana (Nyberg-Hoffman 1997). Se evaluó el efecto del volumen de transducción/profundidad de cultivo y la concentración media de FBS en la transducción con LV de células de fibroblastos.
Un conjunto de placas de 96 pocillos no tratadas para cultivo de tejidos se cubrió previamente con RetroNectin™ (20 pg/cm2) antes de utilizarlas para la transducción. En el momento de la transducción, se añadieron a los pocillos 3000 células con el vector LV en un volumen de 100 pl o 50 pl de medio con FBS al 10%. Se repitieron las mismas condiciones de transducción en medio con FBS al 2%. Después de una incubación durante la noche, se retiró el medio y todas las células se alimentaron con 100 pl de medio nuevo con FBS al 10% para cultivo adicional. La MOI utilizada fue de 2000 pv/célula para todas las condiciones. Noventa y seis horas después de la transducción, las células se recolectaron para el análisis de la eficiencia de la transducción mediante el análisis FACS de la señal de GFP en un BD LSRII y se analizaron con el software FlowJo. La Tabla 19 proporciona las eficiencias de transducción de LV en las diferentes condiciones.
Tabla 19: Efecto del volumen de cultivo (profundidad) y FBS en la transducción de LV (% de células positivas para GFP)
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Como era de esperar, la reducción del volumen del medio de transducción (profundidad) dio como resultado un aumento notable en la eficiencia de transducción de LV. Además, los resultados indican que el uso de un medio de transducción con FBS al 2% es beneficioso para la transducción de LV. Basándose en estos resultados, se incorporó un medio de transducción con FBS al 2% en el procedimiento de fabricación GMP, manteniendo el volumen del medio de transducción al mínimo, aproximadamente 60 ml en 1 -CS. En el procedimiento de fabricación GMP para FCX-007, se utilizará una CellSTACK® de 1 capa con una superficie de 636 cm2 para la transducción de LV de células de fibroblastos. Se determinó que es factible utilizar un volumen de transducción de 60 ml (0.9 mm de profundidad) sin causar un efecto perjudicial (p. ej., secado) en las células durante el período de transducción de 3 horas.
D. Evaluaciones del recubrimiento de RetroNectin™ y tipo de superficie de cultivo
El recubrimiento de RetroNectin™ de la superficie de cultivo aumentó significativamente la transducción de LV de las células de fibroblastos. El fabricante de RetroNectin™ recomienda una cantidad de recubrimiento de RetroNectin™ en el intervalo de 4 pg/cm2 a 20 pg/cm2. Para minimizar la cantidad de RetroNectin™ utilizada sin afectar negativamente a la transducción del LV de las células de fibroblastos, se evaluó la cantidad de RetroNectin™ utilizada para el recubrimiento.
Además, el fabricante de RetroNectin™ recomienda el uso de una superficie de plástico no tratada para cultivo de tejidos para el recubrimiento de RetroNectin™. Sin embargo, los matraces de cultivo y las CellSTACK® utilizados para el cultivo celular de fibroblastos están todos tratados para cultivo de tejidos. Tanto las placas de 96 pocillos tratadas para cultivo de tejidos como las no tratadas para cultivo de tejidos se recubrieron con diferentes cantidades de RetroNectin™ y se evaluó la transducción con LV de células de fibroblastos.
Tanto las placas de 96 pocillos tratadas para cultivo de tejidos como las no tratadas para cultivo de tejidos se recubrieron previamente con diferentes cantidades de RetroNectin™ (20 gg/cm210 gg/cm2 y 5 gg/cm2) antes utilizarlas para la transducción. En el momento de la transducción se añadieron a cada pocillo 3000 células con vector LV en un volumen de 50 gl de medio de transducción con FBS al 2%. Después de 3 horas de transducción, se retiró el medio y todas las células se alimentaron con 100 gl de medio nuevo con FBS al 10% para el cultivo adicional. La MOI utilizada fue de 2000 pv/célula para todas las condiciones. Noventa y seis horas después de la transducción, las células se recolectaron para el análisis de la eficiencia de la transducción mediante el análisis FACS de la señal de GFP en un BD LSRII y se analizaron con el software FlowJo. La Tabla 20 proporciona las eficiencias de transducción de LV en las diferentes condiciones.
Tabla 20: Efecto de la cantidad de RetroNectin™ y tipo de superficie de cultivo en la transducción con LV de células de fibroblastos (% de células positivas para GFP)
Figure imgf000033_0001
Se observaron eficiencias comparables de transducción de LV de los fibroblastos para las tres dosis de RetroNectin™ utilizadas para el recubrimiento. Como resultado, se seleccionó una densidad de recubrimiento de RetroNectin™ de 5 gg/cm2 para usar en el procedimiento de producción de FCX-007. Aunque se observó una menor eficiencia de transducción de LV en la superficie tratada para cultivo de tejidos, la diferencia no se considera lo suficientemente significativa para evitar el uso de matraces tratados para cultivo de tejidos en la etapa de transducción de INXN-2002 del procedimiento de fabricación de FCX-007.
Resumen del desarrollo y optimización de la transducción con LV de fibroblastos
Basándose en los resultados del estudio descritos anteriormente utilizando el vector modelo LV-GFP para la transducción de células de fibroblastos, se seleccionó el siguiente protocolo de transducción de LV para la transducción con INXN-2002 de células de fibroblastos derivadas de donante de RDEB:
Recubrir previamente la superficie de cultivo con RetroNectin™ a 5 gg/cm2. Los matraces tratados para cultivo de tejidos se pueden utilizar para el recubrimiento con RetroNectin™.
Añadir las células y vector LV simultáneamente en el momento de la transducción, con una densidad de siembra celular de aproximadamente 1 x 104 células/cm2.
Utilizar una MOI alta que no cause efectos tóxicos en las células para lograr una alta eficiencia de transducción (10 ml de vector de LV-Col7 INXN-2002 por transducción).
T ransducir durante 3 horas a 37°C en un medio de transducción con FBS al 2% y luego cambiar o alimentar las células con un medio que contenga FBS al 10%.
Utilizar un volumen de medio de transducción bajo, 50 gl/pocillo para una placa de 96 pocillos o 60 ml para una CellSTACK® de 1 capa, para una alta eficiencia de transducción.
No se requiere supertransducción.
F. Transducción con el LV INXN-2002 de células de fibroblastos
Basándose en el protocolo de transducción de LV desarrollado anteriormente, se utilizó INXN-2002 para transducir células de fibroblastos humanos normales (NHDF, Lonza, CC-2511) en una placa de 96 pocillos. Teniendo en cuenta el título relativamente bajo de INXN-2002, se utilizaron tres dosis de INXN-2002 para la transducción, 12.5 gl (dilución 1:4), 3.1 gl (dilución 1:16) y 0.8 gl (dilución 1:64). Las células transducidas se sometieron a pases tres veces para asegurar la integración estable del vector LV-COL7 en el genoma celular transducido. En el pase 3, se extrajo el ADN genómico de las células y se analizó por qPCR utilizando un cebador específico para la secuencia del vector LV-COL7. La eficiencia de transducción se cuantificó como número de copias del gen por célula. La Tabla 21 proporciona la eficiencia de transducción medida por el número de copias del gen por célula.
Tabla 21: Transducción con INXN-2002 de células de fibroblastos
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1 Título de INXN-2002 UI: 9.2 x 106 Ul/ml que se determinó en Intrexon utilizando un ensayo de título de infección de H1299 en etapa de desarrollo temprano.
2 El número de copias del gen por célula se determinó en Intrexon utilizando un ensayo de qPCR en etapa de desarrollo temprano, lo que dio como resultado un número de copias del gen aproximadamente 10 veces mayor en comparación con el ensayo completamente desarrollado que se transfirió a BioReliance para el análisis del producto FCX-007. La diferencia se debió al uso de un conjunto de cebadores de qPCR y patrones de plásmidos circulares diferentes en el ensayo de la etapa de desarrollo inicial.
En la dosis más alta del vector INXN-2002, % de dilución (MOI= 40), se observó un efecto tóxico significativo en las células: la mayoría de las células no se recuperaron de la etapa de transducción, lo que produjo un número mínimo de copias de genes por célula al final de la expansión celular. La MOI óptima de INXN-2002 fue de aproximadamente 10 UI/célula, lo que daba como resultado un número de copias del gen de 0.86.
Transducción del LV INXN-2002 en experimentos de entrenamiento
Siguiendo el protocolo de transducción de LV (Sección [0260]) y los resultados de dosificación/MOI del vector de transducción INXN-2002 de los estudios de 96 pocillos, la transducción de INXN-2002 de células de fibroblastos de RDEB se realizó a escala en TR8, TR9 y TR10. La CellSTACK® de 1 capa utilizada para la transducción de INXN-2002 se recubrió previamente con RetroNectin™ a 5 pg/cm2. En el momento de la transducción, se añadieron las células e INXN-2002 simultáneamente en 60 ml de medio de transducción con FBS al 2% a la CellSTACK® de 1 capa. Después de 3 horas en la incubadora a 37°C, las células se alimentaron con 130 ml de medio de crecimiento completo con FBS al 10%. Las células transducidas se sometieron a pases dos veces, primero a una CellSTACK® de 10 capas y luego a dos o seis CellSTACK® de 10 capas para la recolección de células. Los números de copias del gen en las células recolectadas se analizaron por qPCR. La Tabla 22 proporciona los resultados de transducción de INXN-2002 de los experimentos de entrenamiento ejecutados.
Tabla 22: Resumen de la transducción de LV-COL7 en experimentos de entrenamiento
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1 La MOI se determinó basándose en el título en IU del vector LV-Col7 INXN-2002 determinado en Intrexon usando un ensayo de título de infección de H1299 en etapa de desarrollo temprano, que dio como resultado un valor de título aproximadamente 10 veces mayor en comparación con el ensayo completamente desarrollado que se transfirió a BioReliance para el análisis del producto FCX-007. La diferencia se debió al uso de un conjunto de cebadores de qPCR y patrones de plásmidos circulares diferentes en el ensayo de la etapa de desarrollo temprano.
2 Las copias del gen por célula se cuantificaron utilizando el ensayo de qPCR completamente desarrollado, que se transfirió a BioReliance para el análisis del producto FCX-007
3 BLQ: Por debajo del límite de cuantificación
Siguiendo el protocolo de transducción de LV desarrollado con placas de 96 pocillos a pequeña escala, se logró la transducción exitosa con INXN-2002 de células de fibroblastos de RDEB a escala para la fabricación de FCX-007. El número de copias de gen en las células transducidas aumentó con una mayor MOI de transducción. Debido al título bajo de INXN-2002, el número de copias del gen en el producto de células recolectadas transducidas fue relativamente bajo. Con el fin de producir el producto de células FCX-007 con un número de copias de gen alto factible, se seleccionaron 10 ml de INXN-2002 para la transducción en la producción GMP, ya que causaba efectos tóxicos mínimos en las células durante la transducción.
Experimento genotecnológico (ER)
En la preparación para la fabricación GMP de FCX-007 y la finalización de los registros de lotes maestros (MBR) de producción, se realizó un experimento genotecnológico utilizando una biopsia de un donante de RDEB con registros de lotes de producción aprobados. El vector LV INXN-2002 de calidad GMP se usó para la transducción. La Tabla 23 proporciona cifras de crecimiento celular del experimento de ingeniería.
Tabla 23: Crecimiento celular y rendimientos celulares en el experimento genotecnológico
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El crecimiento celular y los rendimientos del ER son comparables a los del TR8 y TR9, y son notablemente más rápidos y más altos en relación con el TR10, lo que indica la variabilidad del crecimiento celular entre diferentes donantes con RDEB. Las células recolectadas se cargaron y crioconservaron como se muestra en la Tabla 24.
Tabla 24: Viales del principio activo FCX-007 llenados en el experimento genotecnológico
Figure imgf000035_0002
El número total de células recolectadas de las 6x 10-CS se considera adecuado para la producción de dos dosis del producto farmacéutico FCX-007 para inyección.
Las células recolectadas se analizaron de acuerdo con las especificaciones del principio activo FCX-007 propuestas. La Tabla 25 proporciona los resultados del análisis para las células recolectadas.
Tabla 25: Análisis del experimento genotecnológico del principio activo FCX-007
Figure imgf000035_0003
Figure imgf000036_0001
1 Los detalles de los ensayos se proporcionan en la Sección 3.2.S.4.2.
2 Ensayo interno de Intrexon. Los ensayos se están transfiriendo a BioReliance para el ensayo de liberación de GMP
3 Ensayo interno de Intrexon. Los ensayos se están transfiriendo a PCT para el ensayo de liberación de GMP
4 El ensayo de RCL no se realizó en el material del producto celular ya que el material no se usó para estudios adicionales Ejemplo 5 - Descripción del desarrollo del procedimiento de fabricación para mejorar la eficiencia de transducción con LV-Col7
Los productos celulares FCX-007 fabricados usando el procedimiento descrito anteriormente tenían niveles bajos de eficacia de modificación génica, como indica el bajo número de copias del gen y niveles de expresión de C7 cuando se utilizó el vector INXN-2002 para la transducción celular. Se siguieron dos enfoques para aumentar la eficiencia de transducción de LV-Col7 en células de fibroblastos de RDEB: 1) desarrollo de un nuevo vector lentiviral LV-Col7 (INXN-2004) que ofrece un mejor título de vector y una expresión transgénica estable mejorada (colágeno VII) en las células de fibroblastos transducidas, y 2) mayor optimización del procedimiento de transducción con LV-Col7 en células de fibroblastos. Los detalles del desarrollo del nuevo vector INXN-2004 se describen en la Sección 3.2.S.2.3. A continuación se describen los estudios de la optimización adicional del procedimiento de transducción con LV-Col7, así como los procedimientos de expansión celular.
Transducción por centrifugación (espinoculación)
La transducción por centrifugación implica la centrifugación de vectores virales sobre las células diana en un entorno de fuerza g. Se ha descrito en la bibliografía que la transducción por centrifugación (espinoculación) aumenta la eficiencia de la transducción del vector retroviral en las células diana (J V iro l M e thods. agosto de 1995; 54 (2-3): 131­ 43. “Centrifugal enhancement of retroviral mediated gene transfer”. Bahnson AB1, Dunigan JT, Baysal BE, Mohney T, Atchison RW, Nimgaonkar MT, Ball ED, Barranger JA. y H u m G e n e Ther. enero 1994; 5 (1): 19-28. “ Improved methods of retroviral vector transduction and production for gene therapy”. Kotani H1, Newton PB 3°, Zhang S, Chiang YL, Otto E, Weaver L, Blaese RM, Anderson WF, McGarrity GJ.).
Se cultivaron células de fibroblastos de RDEB del TR8 anterior. Las células en fase de crecimiento exponencial se recolectaron y utilizaron para este estudio. Los lotes de vector INXN-2002 anteriores se utilizaron para la transducción. Para la transducción por centrifugación, se añadieron 1 x 103 células con diferentes MOI de INXN-2002 en 50 pl de medio de transducción (IMDM FBS al 2%) a cada pocillo de placas recubiertas para cultivo de tejidos de 96 pocillos que se recubrieron previamente con RetroNectin (5 pg/cm2). Las placas que contenían células más el vector INXN-2002 se centrifugaron a 1300 g, 4°C durante 1.5 horas. Después de la centrifugación, las placas se pusieron en una incubadora a 37°C para permitir que las células se recuperaran y crecieran durante 3 horas. Después de lo cual, se añadieron a cada pocillo 100 pl de medio de cultivo completo (IMDM 10FBS+GSH). Las placas se devolvieron a la incubadora para el cultivo adicional. La transducción convencional sin centrifugación descrita anteriormente se usó como control. Después de la transducción, las células se sometieron a pases tres veces, 3-5 días de cultivo entre cada pase celular. En el último pase, se recolectaron los líquidos sobrenadantes del cultivo para evaluar los niveles de expresión de la proteína C7, mientras que las células se recolectaron para el análisis del número de copias del gen por célula. La Tabla 26 muestra los niveles de expresión de Col7 para las diferentes condiciones de transducción. Tabla 26: Nivel de expresión de C7
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La Tabla 27 proporciona el número de copias del vector por célula de las células recolectadas.
Tabla 27: Número de copias de vector por célula
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INXN-2002, título UI: 2.36 x 10 Ul/ml (determinado en Intrexon)
INXN-2002, título UI: 2.36 x 106 Ul/ml (determinado en Intrexon)
Los resultados muestran un aumento modesto tanto en los niveles de producción de Col7 como en el número de copias del vector por célula usando el método de transducción por centrifugación, especialmente a las MOI más bajas y en las diluciones del vector INXN-2002 ensayadas.
Optimización de los parámetros de transducción por centrifugación
Se evaluaron los parámetros de transducción por centrifugación, incluidos el tiempo de centrifugación, la velocidad y la temperatura, con el objetivo de aumentar aún más la eficiencia de transducción de INXN-2002. En este estudio se utilizaron las mismas condiciones de cultivo celular descrita anteriormente. En el experimento inicial, se examinó la temperatura de centrifugación. Se centrifugaron placas de 96 pocillos que contenían células más el vector INXN-2002 a 4°C o 25°C (TA) durante 1.5 horas a 1300 g. A esto le siguió otro experimento donde se centrifugaron placas de 96 pocillos que contenían células más el vector INXN-2002 a 4°C o 25°C (TA) durante 1 o 2 horas, a una velocidad alta de 1300 g o a una velocidad baja de 300 g, para examinar el efecto de la velocidad de centrifugación en la eficiencia de transducción de INXN-2002. En ambos experimentos, las células se devolvieron a una incubadora a 37°C para la incubación posterior a la centrifugación. Tres horas más tarde, se añadieron a cada pocillo 100 gl de medio de cultivo completo. Las células se sometieron a pases tres veces antes de ser recolectadas para el análisis de la expresión de Col7 en el líquido sobrenadante del cultivo y el análisis del número de copias del vector por célula en las células recolectadas.
La Tabla 28 proporciona el efecto de la temperatura de transducción por centrifugación sobre los niveles de expresión de Col7 y el número de copias del vector por célula. La transducción convencional sin centrifugación se incluyó como un control.
Nuevamente, se demostró una mayor transducción de INXN-2002, como lo indica la expresión de proteína C7 y el número de copias de vector por célula más altos, usando transducción por centrifugación en comparación con la transducción sin centrifugación convencional. La temperatura de transducción por centrifugación no demostró impacto en la eficiencia de transducción general.
La Tabla 29 a continuación proporciona el efecto de la velocidad de centrifugación, así como de la temperatura y el tiempo en la eficiencia de transducción del INXN-2002.
Tabla 28: El efecto de la temperatura de transducción por centrifugación en la eficiencia de transducción del INXN-2002
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Título de INXN-2002 UI: 2.36 x 106 UI/ml (determinado en Intrexon)
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Los resultados indican una modesta mejora en la eficiencia de transducción de INXN-2002, indicado por la expresión de la proteína C7 y el número de copias del vector, cuando la transducción por centrifugación se realizó a TA, 1300 g, durante 1 hora. Se desconoce la significación de la mejora y se seleccionaron los parámetros de transducción por centrifugación desarrollados inicialmente (centrifugación a 1300 g durante 1.5 horas a 4°C) para uso en estudios futuros.
Supertransducción para aumentar más la eficiencia de la transducción del INXN-2002
La supertransducción (una segunda transducción) se evaluó en el desarrollo temprano de la transducción de INXN-2002, que se describe anteriormente. La supertransducción se evaluó nuevamente en combinación con la transducción por centrifugación para aumentar aún más la eficiencia de transducción de INXN-2002 en células de fibroblastos. A diferencia del método anterior, en el estudio actual, la supertransducción se realizó en las células un pase después de la transducción por centrifugación inicial. Se espera que la inclusión de un pase de células permita que las células se recuperen de la transducción por centrifugación inicial y se vuelvan más receptivas a la 2a supertransducción.
De manera similar, se recolectaron y usaron para este estudio células de fibroblastos de RDEB del TR8 anterior en fase de crecimiento exponencial. Para la transducción del INXN-2002 se utilizó el método de transducción por centrifugación optimizado descrito anteriormente, centrifugación a 1300 g durante 1.5 horas a 4°C. Las células transducidas se sometieron a pase una vez a las 72-96 horas después de la transducción por centrifugación inicial. Después de 72-96 horas de cultivo en el segundo pase, las células se recogieron y se volvieron a transducir utilizando las mismas condiciones de transducción por centrifugación. Después de la supertransducción por centrifugación, las células se sometieron a pase tres veces adicionales antes de recolectarlas para el análisis de la expresión de Col7 en el líquido sobrenadante del cultivo y el análisis del número de copias del vector por célula en las células recolectadas. Para el estudio se utilizó el vector INXN-2002. La Tabla 30 proporciona el efecto de la supertransducción por centrifugación en la eficiencia de transducción del INXN-2002.
Tabla 30: Efecto de la supertransducción por centrifugación
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Título de INXN-2002 UI: 2.36 x 106 UI/ml (determinado en Intrexon)
La supertransducción por centrifugación dio como resultado un aumento significativo en la eficiencia de transducción de INXN-2002 en células de fibroblastos de RDEB. La expresión de la proteína C7 aumentó aproximadamente 1.7 veces y el número de copias del vector por célula aumentó aproximadamente 3 veces.
Los datos demuestran un aumento de 40% en la expresión de Col7 y un aumento de 60% en el número de copias por célula con la transducción adicional. Debido a este aumento, se añadió la superinfección al protocolo de producción. Transducción con el vector INXN-2004
Simultáneamente con el desarrollo del método de transducción mejorado, también se desarrolló un nuevo vector LV-Col7 (al que se hace referencia como "INXN-2004") basado en un esqueleto de vector lentiviral diferente (es decir, pFUGW).
Transducción por una sola centrifugación de INXN-2004
Las células de fibroblastos de RDEB del TR8 anterior en fase de crecimiento exponencial se recolectaron y usaron para este estudio. En el primer estudio, se llevó a cabo una sola ronda de transducción por centrifugación, como se describe anteriormente, utilizando un lote piloto del vector INXN-2004. La transducción convencional sin centrifugación se incluyó en el estudio como control. Las células se sometieron a pases tres veces antes de recolectarlas para el análisis de la expresión de Col7 en el líquido sobrenadante del cultivo y el análisis del número de copias del vector por célula en las células recolectadas. La Tabla 31 proporciona los niveles de expresión de Col7 y el número de copias del vector por célula utilizando la transducción del vector INXN-2004.
Tabla 31: Expresión de la proteína C7 y número de copias del vector por célula usando la transducción de INXN-2004
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Título de INXN-2004 UI: 2.36 x 106 UI/ml (determinado en Intrexon)
Respecto al vector INXN-2002, se logró una mejora significativa en la eficiencia de transducción con el uso de INXN-2004 en combinación con el método de transducción por centrifugación. Además, el vector INXN-2004 parece ser significativamente más activo en la transducción de células de fibroblastos de RDEB incluso en condiciones de transducción sin centrifugación, como lo indica la expresión de proteína C7 aproximadamente 10 veces mayor y el número de copias del vector por célula. Los resultados apoyan el uso de la base pFUGW para la construcción del nuevo vector INXN-2004.
De acuerdo con lo descrito anteriormente, la transducción por centrifugación parece exacerbar el efecto tóxico del vector INXN-2004 en las células de fibroblastos en condiciones de MOI más altas, como lo indican los niveles más bajos de expresión de C7 y el número de copias del vector a la MOI17. Esto no afecta a la fabricación de FCX-007 ya que se ha demostrado que el uso de una MOI más baja es igual de efectiva.
Supertransducción por centrifugación de INXN-2004
En el segundo estudio, se utilizó la supertransducción por centrifugación (como se describe anteriormente) para la transducción de INXN-2004. La escala de transducción se aumentó de una placa de 96 pocillos a un matraz T-25. Los parámetros de transducción permanecieron sin cambios, incluido la misma densidad de recubrimiento de RetroNectin™ de 5 gg/cm2, y la misma densidad celular en la transducción de 1x104 células/cm2. El volumen de transducción en el matraz T-25 fue de 4.2 ml. Para la transducción, el matraz T-25 que contenía las células y el virus se centrifugó a 4°C, durante 1.5 horas a 1300 g. Las células se devolvieron a una incubadora a 37°C y se incubaron durante tres horas. Después de la incubación inicial, se añadieron 4.2 ml de medio de cultivo completo al matraz para la incubación adicional. Las células se sometieron a pases tres veces antes de recolectarlas para el análisis de la expresión de Col7 en el líquido sobrenadante del cultivo y el análisis del número de copias del vector por célula en las células recolectadas. La Tabla 32 proporciona el efecto de la supertransducción por centrifugación en la eficiencia de transducción del vector INXN-2004. Se utilizó un lote piloto del vector INXN-2004 para el estudio.
Tabla 32: Efecto de la supertransducción por centrifugación para el vector INXN-2004
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Título de INXN-2004 UI: 2.36 x 106 UI/ml (determinado en Intrexon)
Como se observó para el vector INXN-2002 anterior, la supertransducción por centrifugación dio como resultado un aumento significativo, aproximadamente 5 veces, en el número de copias del vector por célula en las células de transducción, a pesar de un aumento relativamente modesto en el nivel de expresión de la proteína Col7, bajo unas condiciones de transducción de MOI baja.
Resumen de desarrollo y optimización de la transducción
Se lograron mejoras significativas en la eficiencia de transducción de LV-Col7 en células de fibroblastos de RDEB en el desarrollo continuo del procedimiento, tanto con el vector INXN-2002 anterior como con el nuevo INXN-2004. Las mejoras son para permitir la fabricación de un producto celular FCX-007 biológicamente potente. Basándose en los resultados del estudio de desarrollo del procedimiento de fabricación, se eligió el siguiente procedimiento de transducción para la fabricación de FCX-007 utilizando el vector INXN-2004 para la transducción.
Recubrir previamente la superficie de cultivo con RetroNectin a 5 gg/cm2. Se utilizan matraces tratados para cultivo de tejidos para el recubrimiento con RetroNectin™.
Añadir células y el vector INXN-2004 simultáneamente en el momento de la transducción. La densidad de siembra celular es de aproximadamente 1 x 104 células/cm2.
Centrifugar la mezcla de transducción de células y vector INXN-2004 en el recipiente de transducción a 4°C, durante 1.5 horas a 1300 g.
Incubar las células durante 1.5 a 2.0 horas a 37°C después de la transducción en medio de transducción con FBS al 2% y luego cambio o alimentación de las células con medio de cultivo completo con FBS al 10%.
Usar un volumen de medio de transducción bajo (50 gl/pocillo para una placa de 96 pocillos o 0.35 ml/cm2).
Llevar a cabo una supertransducción en las células después de un pase posterior a la transducción inicial.
Ejemplo 6 - Análisis de fibroblastos dérmicos humanos modificados genéticamente de RDEB transducidos por INXN-2002
Se analizaron fibroblastos dérmicos humanos modificados genéticamente de RDEB (GM-HDF) derivados del vector lentiviral INXN-2002 con el fin de:
Evaluar la localización de la expresión de COL7 en injertos de piel humanos compuestos establecidos (preparados en dermis porcina) compuestos por queratinocitos de RDEB mediante inyección ID.
Evaluar la potencial carcinogenicidad/tumorigenicidad en piel humana de RDEB compuesta injertada (preparada en dermis porcina) en ratones SCID tratados con GM-HDF de RDEB
Un intento inicial de evaluar la función de GM-HDF (derivados de INXN-2002) mediante la siembra de fibroblastos en el lado reticular de cultivos de injertos compuestos no tuvo éxito, posiblemente debido a la migración inadecuada de los GM-HDF a la dermis porcina desvitalizada o al tiempo insuficiente para la difusión adecuada y depósito de rC7 el día 19. Se utilizó un enfoque alternativo para evaluar la función mediante inyección ID directa de injertos existentes en seis animales de respaldo en el estudio. Los injertos compuestos de RDEB preparados en dermis porcina parecen ser más robustos de lo previsto, lo que hace posible la inyección directa en injertos de piel de RDEB establecida. Este enfoque imita más de cerca la enfermedad y la vía de administración clínica.
Este informe de estudio presenta datos de una evaluación inicial de la inyección ID de GM-HDF en injertos de RDEB establecidos. Se planean estudios adicionales para lograr objetivos a largo plazo para la farmacología in vivo.
A. Materiales de estudio
A.1 Artículo(s) de ensayo
Se preparó el artículo de ensayo y se ensayaron las especificaciones de liberación del principio activo antes del envío. El artículo de ensayo para inyección de injerto de piel se preparó un día antes de cada día de tratamiento programado. El GM-HDF se descongeló, se lavó, se resuspendió en DMEM y se evaluó frente a las especificaciones de liberación. El GM-HDF se envió para entrega al día siguiente y se administró dentro de las 48 horas. Se aisló y expandió el HDF de RDEB no corregido (transducido de forma simulada) del mismo paciente que el GM-HDF mediante los mismos métodos. El artículo de ensayo y las células que se utilizarán para la preparación de injertos de piel compuestos se enviaron congelados. Las células utilizadas para la preparación de injertos de piel se descongelarán y se cultivarán para el ensayo. El número de lote TR8 (Control no transducido) se utilizó como control negativo de RDEB-HDF. El número de lote TR8 Grupo A (GM-HDF-LV-COL7) se utilizó como artículo de ensayo de GM-HDF.
El análisis del artículo de ensayo se realizó en las instalaciones de fabricación antes del envío. El artículo de ensayo restante se almacenará a -70°C durante 1 año. El artículo de ensayo se almacenará en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM).
A.2. Otros productos químicos y materiales
Se proporciona una lista de otros materiales a continuación en la Tabla 33.
Tabla 33: Otros materiales del estudio
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Células del grupo 1 (control negativo): las células de RDEB no transducidas del donante del experimento de entrenamiento 8 se descongelaron y se pasaron una vez antes de la transfección. Dos días después del pase de las células, las células se recogieron y se transfectaron 1.2 x 106 células en un tubo cónico de 50 ml en medio de crecimiento de bajo contenido de suero (ATCC PCS-201-030 y PCS-201-041) utilizando el agente de transfección basado en lípidos Transfex (ATCC) con el plásmido COL7 VVN 4317513. Después de una incubación de 10 minutos con complejo Transfex, ADN y Optimem (LifeTech), 1x106 células transfectadas se transfirieron a un matraz T150, y 2 x 105 células se pusieron en un T25 y se pusieron en una incubadora a 37°C 5% de CO2 durante 16 horas, momento en el que se retiró el medio y se reemplazó con medio de crecimiento completo (IMDM (Sigma), L-glutatión reducido 920 mg/l (Sigma) FBS inactivado por calor al 10% (Atlantic Biologicals) y 1XGlutamax (LifeTech)). A continuación, las células se devolvieron a la incubadora a 37°C 5% de CO2 hasta el momento del envío. En el momento del envío, todos los matraces de células se llenaron hasta su capacidad máxima, de forma que todas las partes del matraz estuvieran en contacto con el medio independientemente de la orientación del matraz.
B. Diseño del estudio
B.1. Aleatorización
Debido a las altas tasas de fracaso de los injertos de piel humana de RDEB, los ratones de estos grupos de animales no se aleatorizan.
B.2. Justificación de la especie y número en el estudio
El ratón NOD. CB.17-PRKDC scid/scid es la especie convencional para usar en estudios de eficacia/toxicología preclínica demostrativos preliminares y es una especie de roedor de elección para dichas evaluaciones utilizando modelos de xenoinjerto humano. Este estudio se diseñó para minimizar el número de animales en estudio que proporcionarían datos suficientes para evaluar los artículos de ensayo.
B.3. Vía de administración
Los fibroblastos se administrarán por inyección intradérmica para injertos de piel normales. A los injertos compuestos se les administrarán células mediante siembra antes del injerto.
B.4. Administración de dosis
Las inyecciones de células intradérmicas de GM-HDF de RDEB transducidos con lentivirus (corregidos por COL7A1) (usando INXN-2002) y controles negativos (vehículo o RDEB-HDF) se realizarán con una aguja de calibre 30. La inyección se realizará perforando primero la piel y luego dirigiendo la aguja lo más superficialmente posible hacia arriba hacia atrás, hacia la superficie.
A los injertos compuestos se les administrarán células mediante siembra antes del injerto de acuerdo con el protocolo descrito en el estudio in vitro con la distinción de que el sistema de cultivo compuesto no se elevará a la interfase airelíquido antes del injerto.
B.4.1. Preparación de fibroblastos para inyección (injertos compuestos)
Los fibroblastos se retiraron del almacenamiento en nitrógeno líquido una semana antes de la inyección, se descongelaron en un baño de agua a 37°C hasta que quedó un pequeño cristal de hielo, luego se desinfectaron y se transfirieron a BSC. Los viales se resuspendieron en 10 ml de volumen de lavado de PBS y se centrifugaron durante 10 minutos a 1000 RPM. El líquido sobrenadante se descartó y las células se lavaron en DMEM FBS al 10% 1x medio antibiótico y se volvieron a centrifugar durante 10 minutos a 1000 RPM. El sedimento se resuspendió en el volumen apropiado y se sembró en placas TC de 15 cm. Los medios se cambiaron cada dos días y se sometieron a pases a confluencia del 80% hasta que los injertos estaban listos para inyectar. El día de la inyección, los fibroblastos se tripsinizaron, se neutralizaron en DMEM+ FBS al 10% y se centrifugaron durante 10 min a 10000 RPM, el sedimento de células se resuspendió y se tomó una parte alícuota de células, las células se contaron con tinción de azul de tripano para determinar la viabilidad. Las células se resuspendieron de tal manera que se extraen en la jeringa 1.0 x 106 células en un volumen de 50 ul. Se colocó una aguja de 30 g y se puso a 4°C hasta que el ratón estuvo listo para ser inyectado.
Tabla 34: Injertos de piel compuestos (siembra de fibroblastos)
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Tabla 35: Injertos de piel compuestos (inyecciones intradérmicas de fibroblastos)
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Tabla 36: Grupos de estudio para la evaluación de xenoinjertos inyectados por vía ID
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C. Injertos de piel
C.1 Injertos de piel humana con RDEB
C.1.1 Fibroblastos
Los fibroblastos humanos modificados genéticamente (GM-HDF de RDEB) producidos por transferencia de genes lentivirales, que incluyen el vector lentiviral INXN-2002, junto con fibroblastos normales y fibroblastos de RDEB no corregidos como controles, son los tipos de células utilizados para infundir inicialmente la dermis de piel. Las células se cultivan sobre dermis desvitalizada para formar equivalentes de piel de aproximadamente 2 cm cuadrados. Los compuestos de piel regenerada consisten en queratinocitos humanos cultivados sobre dermis humana desvitalizada infundida con fibroblastos.
Aislamiento y cultivo de queratinocitos primarios.
Las células de queratinocitos de tipo natural se aíslan de prepucio neonatal, mientras que los queratinocitos de RDEB primarios se aíslan de muestras de piel de pacientes. Estos últimos se obtienen como una biopsia en sacabocados de 6 mm sumergida en 15 ml de medio de crecimiento de queratinocitos 50/50V en un tubo de centrífuga de 15 ml enviado en hielo húmedo. No puede haber burbujas en las muestras enviadas. El medio 50/50V contiene 50% de medio 154 (Invitrogen) complementado con HKGS (extracto de hipófisis bovina al 0.2% [BPE], insulina bovina [5 mg/ml], hidrocortisona [0.18 mg/ml], transferrina bovina [5 mg/ml], factor de crecimiento epidérmico humano [0.2 ng/ml]) y 50% de SFM de queratinocitos (KSFM; Invitrogen) complementado con EGF1-53 BPE humano recombinante. Se añaden antibióticos AV100 (amikacina/vancomicina) para reducir la contaminación bacteriana.
Se separa la dermis y la epidermis por tratamiento con dispasa 25 U/ml (Becton Dickinson) durante la noche a 4°C. La epidermis se despega entonces de la dermis y se pone en un tubo de centrífuga de 15 ml con 5 ml de TrypLE 10x. El "despegado" epidérmico se incuba en un baño de agua a 37°C durante 15-30 min con agitación suave cada 5 min. TrypLE se neutraliza con igual volumen de DTI (inhibidor de tripsina definido) o DMEM+FBS al 10%. Las células se sedimentan a 1200 rpm y se siembran en 12 ml 50/50 V en matraces miméticos con colágeno 1 T75 Purecoat™ de Corning® . En el caso de que no esté disponible el matraz PureCoat™ del fabricante, en su lugar se puede utilizar 1 ml de solución de recubrimiento de colágeno 1 por placa de plástico de 10 cm durante 15 minutos a 37°C. El recubrimiento de colágeno 1 es una solución filtrada 0.2 uM de colágeno Vitrogen 100 (1 ml), HEPES (2 ml), BSA (100 ul de 100 mg/ml) y 1x HBSS (100 ml). El exceso de recubrimiento de colágeno se aspira antes de la siembra celular. Los matraces se agitan con movimientos circulares para garantizar una distribución uniforme de las células y se ponen en una incubadora humidificada a 37°C 5% de CO2 durante al menos una noche antes de cualquier manipulación u observación. Se permite que las células se adapten a las condiciones de cultivo de tejidos durante 3 días. Después de la adaptación, el medio se cambia una vez cada 2 días o según sea necesario. Los queratinocitos se pasan sobre plástico de cultivo tisular normal cuando están aproximadamente al 70% de confluencia.
En el medio 50/50V, los queratinocitos crecen bien durante cinco pases. Los queratinocitos se utilizan en los primeros cuatro pases.
Preparación de dermis desvitalizada porcina
Obtener láminas de piel porcina de espesor dividido. Esto se puede preparar de manera similar a la dermis humana desvitalizada (como antes) a partir de piel porcina extraída mediante dermatomo. Lavar la dermis porcina 3x en PBS estéril que contiene 1x penicilina/estreptomicina/anfotericina/gentamicina e incubar en PBS con NaCl 1 M y 2x antibióticos a 37°C durante 72 horas. Separar la epidermis y descartar, lavar 3 veces con 1XPBS que contiene antibióticos para eliminar el exceso de sal y gentamicina en solución.
Confirmar la esterilidad cultivando un trozo de dermis porcina en 50/50V o KGM durante 4 días. La dermis se puede almacenar a 4°C en solución antibiótica, cambiando el PBS semanalmente. La dermis no debe almacenarse durante más de unos pocos meses antes de su uso.
Fibroblastos de siembra de cultivos organotípicos
Cortar la dermis desvitalizada en piezas cuadradas de 2 cm. Poner la membrana basal de la dermis hacia abajo en placas de cultivo de 6 pocillos y dejar que la dermis se seque ligeramente.
Sembrar fibroblastos en cada pocillo, centrifugar a 1200 rpm durante 5 minutos y volver a 37°C con 5% de CO2 humidificado durante 3-4 días, cambiando el medio todos los días. Durante este tiempo, los fibroblastos se adhieren a la dermis y comienzan a migrar al tejido.
Siembra de queratinocitos
Después de que los fibroblastos hayan migrado a través de la dermis, despegar cuidadosamente la dermis y transferirla al soporte dérmico anular (ADS). Añadir una capa delgada de Matrigel para sellar y asegurar la dermis en el dispositivo. Añadir 5 ml de KGM al compartimento estromal del ADS. KGM es una mezcla 3:1 de DMEM:F12 de Ham complementado con FBS (10%), adenina (1.8 x 10-4 M), hidrocortisona (0.4 pg/ml), insulina (5 pg/ml), toxina del cólera (1 x 10-10 M), EGF (10 ng/ml), transferrina (5 pg/ml) y triyodo-L-tironina (1.36 ng/ml). Tripsinizar, contar y sembrar queratinocitos en un volumen total de 100 pl de KGM por ADS. Devolver el conjunto de ADS a la incubadora. No perturbar el ADS durante al menos 24 h. Los queratinocitos en la parte superior de la dermis deben permanecer en la interfase aire-líquido. Cambiar el KGM en la cámara inferior todos los días. El cultivo organotípico continuará durante 1-2 semanas.
Cultivo organotípico de injerto
Los cultivos organotípicos estarán listos para injertar después de 7-10 días. El injerto se llevará a cabo como se describe anteriormente para injertos de piel humana normal. Los vendajes y las suturas se retirarán después de 7 a 10 días y el animal se envolverá de nuevo con vendajes nuevos durante otra semana. A partir de entonces, el injerto se expondrá al aire para que madure.
Recolección de injertos y seccionamiento
Sacrificar humanamente los ratones y recoger cuidadosamente el injerto. Bisecar el injerto y cortar un corte adicional de 1 mm. Recortar el corte hasta un cuadrado de 1 mm y enviarlo para microscopía inmunoelectrónica (IEM). Congelar las mitades restantes en OCT en hielo seco mientras se detecta el borde central. El seccionamiento comenzará en este borde. Una mitad se seccionará para su análisis inmediato y la mitad restante se almacenará para un análisis posterior. Cortar diez secciones de 8 pm a partir del borde central y etiquetar secuencialmente. Descartar las siguientes cuarenta secciones. Repetir hasta llegar al final del injerto. Secar al aire y fijar con acetona/metanol 50/50 helado.
Inyección de injertos compuestos de RDEB establecidos
Los fibroblastos se inyectarán por vía intradérmica directamente en la piel después del injerto establecido. Las inyecciones no superarán los 50 pl en volumen.
Las inyecciones se realizaron en ratones a los que se injertaron previamente injertos compuestos como se describe en el presente documento: se sembró dermis porcina desvitalizada mediante centrifugación con dosis variable de GM-HDF de RDEB y se cultivó en cultivo de tejidos durante 1 semana. Posteriormente, se dio la vuelta a la dermis y se sembraron 1 millón de queratinocitos de RDEB y se dejaron crecer en cultivo durante una semana más. Después de este período de dos semanas en cultivo tisular como se describe anteriormente, los injertos se pusieron en ratones SCID y se suturaron en el sitio, se vendaron durante 13 días. Los apósitos se retiraron en ese momento, y a los 38-41 días después del injerto, se inyectó en los injertos un volumen de 50 ul de fibroblastos.
D. Procedimientos experimentales
D. 1. Localización de COL7
Se utilizó microscopía de inmunofluorescencia para evaluar la expresión de colágeno tipo VII. Para el análisis de inmunofluorescencia (IF) de cultivos de piel con anticuerpo NP185 específico anti-C7 humano.
D.1.2. Métodos para la microscopía de inmunofluorescencia de anticuerpos NP 185
Los injertos compuestos se recolectaron de ratones SCID inmediatamente después de llevar a cabo la eutanasia con CO2. Los injertos se bisecaron en dos y se colocaron en bloques de OCT. Los bloques congelados de tejido se seccionaron en un criostato Leica CM1850 a un espesor de 8 pM a -21°C y se fijaron en metanol al 50%/acetona al 50% helado. Los portaobjetos se rehidrataron y lavaron en 1XPBS tres veces, se incubaron en anticuerpo primario (NP185 10 ug/ml; anti-Colágeno VII humano de ratón) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron y se incubaron en anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón marcado con Alexa 488 (1:400, 1 hora, temperatura ambiente, Life Technologies) y una contratinción nuclear con Hoescht 33342 (Life Technologies). Las muestras se lavaron tres veces en 1xPBS, se montaron usando Fluoromount antes de la formación de imágenes. Las imágenes se tomaron en un microscopio de fluorescencia Zeiss Observer.Z1 con un aumento de 20X.
Los injertos recogidos el día 19 se incluyeron como grupos de control positivo y negativo. Los grupos experimentales se inyectaron el día 38, 39 o 41 y se recogieron los días 48, 49 o 51 (Tabla 37).
Tabla 37: Días de Injerto, Inyección y recolección
Figure imgf000045_0001
E. Análisis de datos
Las imágenes de IF se prepararon y proporcionaron al PI con enmascaramiento. Los datos fueron analizados e interpretados por el PI antes del desenmascaramiento.
F. Resultados
Los resultados representativos del análisis de IF del tejido del injerto recogido se presentan en la Figura 26.
La tinción de C7 en la DEJ se visualizó en todas las condiciones de tinción de NP185, excepto el control negativo (imagen de "RDEB sin corregir" - véanse las flechas en la DEJ para la comparación con base negativa). Con respecto a los controles positivos, se observó una tinción de la DEJ intensa en la DEJ de injertos sembrados de queratinocitos/fibroblastos normales. Se observó un pequeño foco de tinción positiva en el grupo 1 al que se inyectó fibroblastos no corregidos (Imagen 1b) en una pequeña sección que podría representar fibroblastos corregidos previamente sembrados, sin embargo, el resto de los injertos con inyección de fibroblastos no corregidos en ambos ratones parecen ser menos intensos (como se representa en la imagen 1a). Se observó tinción de C7 en la DEJ en las imágenes representativas de cuatro injertos de ratón a los que se inyectaron fibroblastos corregidos (4a-d) incluso después de solo 10 días post-inyección.
No se observaron tumores en ningún injerto durante el transcurso del estudio.
G. Conclusiones
Los GM-HDF de RDEB del TR8 inyectados por vía intradérmica a la dosis clínica aproximada propuesta produjeron C7 que se localizaba en la DEJ in v ivo en injertos compuestos de queratinocitos de RDEB en dermis de cerdo desvitalizada. Además, los resultados de la siembra de GM-HDF en injertos compuestos antes del injerto indican que los GM-HDF podrían persistir en la expresión de C7 que se localiza en la DEJ. Este modelo se puede utilizar para caracterizar la localización, durabilidad, persistencia y corrección de fenotipo aproximando el efecto de los GM-HDF predictivo de la dosis clínica.
Los resultados de estos estudios muestran las inyecciones intradérmicas de GM-HDF autólogos como un tratamiento eficaz de la RDEB en pacientes.
Ejemplo 7 - Caracterización de células GM-HDF in v itro sin GLP y evaluaciones demostrativas preliminares Los objetivos de este estudio son los siguientes: (a) caracterizar los GM-HDF producidos utilizando el método de producción de GMP a escala previsto para usar para el tratamiento de pacientes con RDEB; (b) evaluar el número de copias de LV integradas y los niveles de expresión de C7; y (c) confirmar la funcionalidad de C7 expresada por los GM-HDF
A. Materiales del estudio
A.1. Artículo(s) de ensayo
Se caracterizaron los GM-HDF de los experimentos de entrenamiento 8, 9 y 10 y el experimento genotecnológico (como se describe anteriormente).
Tabla 38: Información general de producción para TR8, TR9, TR10 y ER1
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1Las células del grupo de control se transdujeron de forma simulada
2Solo se generó un grupo de transducción de LV-COL7 para TR10 y para ER1
B. Secuencias de cebador y sonda utilizadas en análisis de qPCR
Tabla 39: Secuencias de cebadores y sondas utilizadas para ensayos de qPCR
Figure imgf000046_0002
1Cebadores/sondas adquiridos de IDT.
2Secuencias de cebador/sonda específicas de LV derivadas de Greenberg et al. (2006).
C. Procedimientos experimentales
C.1 Número de copias de LV-COL7
El aislamiento de ácidos nucleicos se realizó utilizando el kit AllPrep de Qiagen según las instrucciones del fabricante. El ADNg aislado de 3 x 105 células GM-HDF se normalizó a 12.5 ng/pl. Se usaron 8 pl del ADNg normalizado en un ensayo de 20 pl (10 pl de Taqman® Gene Express, 1.8 pl de agua exenta de nucleasas, 0.06 pl de cebador directo 100 pM, 0.06 pl de cebador inverso 100 pM, 0.04 pl de sonda Taqman® 100 pM). También se analizó una curva de calibración de vector lanzadera lentiviral C7 linealizado diluido en serie (1 e6 copias/reacción a 5 copias/reacción), más 4 de ADNg humano (1.5e4 células/reacción) en el ensayo de 20 gl mencionado anteriormente. El ensayo de Taqman® utilizado fue PR13843. También se llevó a cabo una curva de calibración adicional de 8 gl de ADNg humano comercial (Clontech) (1.5e4 células/reacción a 2e2 células/reacción) en un ensayo de 20 gl (10 gl de Taqman® Gene Express, 1.0 L de agua exenta de nucleasas, 1 gl de 20X conjunto de cebador/sonda ACTB). Todas las muestras se procesaron en un ABI7900 utilizando los siguientes parámetros de ciclo: 2 minutos a 50°C, 10 minutos a 95°C y 40 ciclos de 15 segundos a 95°C y 1 minuto a 60°C.
C.2 RT-qPCR de COL7A1
Se descongelaron viales de células GM-HDF y se aislaron el ADNg y ARN utilizando el kit AllPrep de Qiagen. Se usó ARN (800 gg) para generar ADNc usando qScript™ de Quanta según las instrucciones del fabricante. Luego, el ADNc y el ADNg se ensayaron usando el ensayo de Taqman® PR13653 como se describe anteriormente. Los datos se normalizaron respecto al gen de mantenimiento ACTB (dCT) y luego se compararon con los datos de control (ddCT). El ddCT resultante se convierte en el cambio usando la fórmula 2A-(ddCT).
C.3 Inmunofluorescencia de C7
Para el análisis de inmunofluorescencia, se permitió que 1.2 x 104 HDF-GM se adhirieran a cubreobjetos recubiertos con PDL/Lamina en placas de 24 pocillos durante la noche y luego se fijaron y permeabilizaron con una mezcla al 50%/50% de metanol/acetona. Los cubreobjetos se lavaron 3 veces con PBS 1X y luego se bloquearon con suero de cabra al 10% en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de tres lavados adicionales con PBS, los cubreobjetos se incubaron con 1.25 gg/ml de anticuerpo fNC1 en suero de cabra al 1%/PBS, seguido de 3 lavados adicionales con PBS e incubación con 5 gg/ml de anti-IgG de conejo de cabra conjugado con Alexa Fluor® 555 en suero de cabra al 1%/PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Los cubreobjetos se tiñeron con reactivo NucBlue® Live Cell Stain Ready Probes antes de montarlo en los portaobjetos. Las imágenes se adquirieron en un microscopio Zeiss Axio Observer con un aumento de 20X utilizando un tiempo de exposición de 290 ms. Se fijaron NHDF o GM-HDF, se permeabilizaron y tiñeron con tinción celular NucBlueLive® para visualizar núcleos (azul) o con el anticuerpo fNC1 y anti-IgG de conejo de cabra conjugado con Alexa Fluor® 555 (5 gg/ml) para visualizar la expresión de C7 (rojo). Las imágenes se adquirieron con un aumento de 20X utilizando un tiempo de exposición de 290 ms.
C.4 ELISA de la proteína C7
Brevemente, una curva de calibración del fragmento His-NC1 purificado (9.8 - 625 ng/ml) o líquidos sobrenadantes recogidos que contenían proteína C7 (de GM-HDF en cultivo durante tres a cinco días) se inmovilizaron en una placa de 96 pocillos Nunc MaxiSorp® durante la noche a 4°C. Los patrones y las muestras se analizaron en la misma matriz de muestra (medio acondicionado de fibroblastos de RDEB al 20%). Los pocillos recubiertos se lavaron con PBST y se bloquearon con BSA al 3%/PBS durante 1 hora a 37°C. La detección se realizó utilizando un anticuerpo anti-NC1 policlonal (fNC1, 0.5 gg/ml) seguido de incubación con el anticuerpo secundario de burro anti-IgG de conejo HRP (Jackson ImmunoResearch, 0.08 gg/ml). Los anticuerpos unidos se detectaron mediante desarrollo colorimétrico con solución de sustrato TMB. Después de inactivar la reacción, se midió la absorbancia a 450 nm en el SpectraMax® Plus 384 (Molecular Devices).
C.5 Inmunoprecipitación de trímeros de C7
En primer lugar, las perlas magnéticas de Proteína G se lavaron con 1 X PBS-T. Las perlas se unieron al imán durante un mínimo de 2 minutos antes de retirar el líquido sobrenadante y en todas las etapas posteriores. Después de los lavados, las perlas se recubrieron con 5 gg del anti-C7 fNC1 y se incubaron durante 10 minutos con rotación (Glas-Col, ajuste a 30 ~ 14 rpm a temperatura ambiente). Las perlas se unieron al imán para separar el líquido sobrenadante y se lavaron con tampón de unión a Ab/lavado. Se recogieron los líquidos sobrenadantes de los GM-HDF en cultivo durante tres a cinco días. El líquido sobrenadante que contenía C7 se añadió a la mezcla de perlas/líquido sobrenadante de C7 y se incubó durante la noche a 4°C con rotación (ajuste a 30 ~ 14 rpm). Al día siguiente, las perlas se unieron al imán y se lavaron tres veces usando tampón de lavado. El antígeno diana se eluyó en 20 gl de tampón de elución (glicina 50 mM, pH 2.8 y 10 gl de colorante de carga 4X). Las muestras se desnaturalizaron a 70°C durante 10 minutos. A continuación, se cargaron (por pocillo) 12 gl de un total de 30 gl (la muestra restante se almacenó a 4°C) en un gel de acetato de Tris al 3-8% de 12 pocillos y se procesó durante 4 horas a 150 voltios. El gel se retiró del casete y se empapó en tampón de transferencia que contenía metanol al 10% durante 20 minutos. Se realizó la transferencia húmeda durante la noche del gel a una membrana de nitrocelulosa a 15 voltios a 4°C. Al día siguiente, se aumentó el voltaje a 50 voltios durante 30 min en hielo. Una vez completada la transferencia, la transferencia se bloqueó usando leche al 5% en TBS-T con agitación (Labnet ProBlot™ Rocker 25, ajuste a 60 rpm) durante 2 horas a temperatura ambiente e incubado con anti-C7 LH7.2 (0.25 gg/ml) disponible comercialmente con agitación durante 2 horas a temperatura ambiente. La transferencia se lavó 3 veces con 1X TBS-T (5 min cada una) con agitación antes de detectarla con anti-IgG de ratón de cabra conjugado con HRP (0.1 gg/ml) con agitación durante 1 hora a temperatura ambiente. La transferencia se desarrolló usando el sustrato Lumiglo Ultra™Chemiluminescent y Fujifilm LAS 3000 Imaging System.
C.6 Unión a Lam332
Las placas de 96 pocillos MaxiSorp™ se recubrieron con 1 gg de Lam332 o BSA en tampón de carbonato 100 mM, pH 9.3 durante la noche a 4°C. Las placas se enjuagaron cinco veces con PBS-T y luego se bloquearon con BSA al 1% en PBS-T a temperatura ambiente durante 1 hora. Los pocillos recubiertos se enjuagaron cinco veces con PBS-T y se incubaron con los líquidos sobrenadantes de las células transducidas durante la noche a 4°C. Después de tres lavados más con PBS-T, el C7 unido se incubó con el anticuerpo fNC1 (0.5 pg/ml, PBS-T) a temperatura ambiente durante 3 horas, seguido de incubación con anti-IgG de conejo de burro conjugado con HRP (0.8 pg/ ml concentración final en PBS-T) a temperatura ambiente durante 2 h. La detección de los anticuerpos unidos a C7 se hizo mediante una reacción colorimétrica con TMB y se midió leyendo la absorbancia del producto a 450 nm en un lector de placas SpectraMax® Plus 384 (Molecular Devices). Todas las incubaciones se llevaron a cabo en un agitador orbital (GeneMate) a un ajuste de velocidad de 2.
C.7. Ensayo de migración celular
Se usó un kit de ensayo de curación de heridas de 24 pocillos CytoSelect™ de Cell Biolabs, Inc. para el ensayo de migración celular. Los GM-HDF (0.8 x 105) se sembraron en presencia de un inserto de herida en placas de 24 pocillos y se cultivaron durante 48 horas. A continuación, se retiró el inserto de herida y las células se cultivaron adicionalmente en medio de suero reducido (1%) que contenía 15 pg/ml de colágeno tipo I (COL1) durante 8 horas. Se adquirieron imágenes de campo claro de las heridas 0, 2, 4, 6 y 8 horas después de retirar el inserto de herida usando el sistema de citometría de imágenes Celigo® (Cyntellect). El área superficial de la herida en cada momento se midió utilizando ImageJ (Institutos Nacionales de Salud). Los datos se dieron como el porcentaje de migración (% de migración) que cubre el área de la herida.
C. 7. Análisis de datos
La qPCR se realizó utilizando un instrumento ABI 7900 utilizando el software SDS2.3. Los datos experimentales se visualizaron y exportaron en el software SDS 2.4. Se usó el software ImagJ para cuantificar el porcentaje de migración celular para el ensayo descrito anteriormente. ImageJ es un programa de procesamiento de imágenes de código abierto desarrollado por el Instituto Nacional de Salud y diseñado para imágenes científicas multidimensionales. D. Resultados
D.1. Caracterización de la expresión de C7
D.1.1. Número de copias de LV-COL7 y niveles de transcripción
Se diseñaron ensayos Taqman® contra varias regiones del vector lanzadera viral. De los ensayos Taqman® probados, los diseños dirigidos a la secuencia codificante de C7 demostraron niveles inaceptables de amplificación de fondo. El ensayo Taqman® seleccionado, PR13843, se dirigió a una secuencia que se encuentra en el extremo 5' del esqueleto del LV como se describe en Greenberg et al. (2006).
Se obtuvieron células del experimento de entrenamiento de GM-HDF, se lavaron con dPBS y se resuspendieron en tampón RLT. Se utilizó el kit AllPrep de Qiagen para aislar el ADN (para el número de copias) y el ARN (para el nivel de transcripción de ARNm) de los viales de principio activo de cada grupo de cada experimento de entrenamiento. Luego, el ADN y el ARN aislados se sometieron a ensayos de qPCR y RT-qPCR como se describe anteriormente en la Sección C.1 y C.2, respectivamente. La Tabla 40 muestra el número de copias/célula de las experimentos de entrenamiento 8, 9 y 10 (TR8, TR9 y TR10) y el experimento genotecnológico (ER1). Los datos demuestran que el número de copias del transgén integradas en cada célula puede ser modulado por la dosis de virus administrada a las células durante la producción y es inferior a 1 copia/célula. De manera similar, los niveles de transcrito LV-COL7, que se muestran en la Figura 40, también se correlacionan con la dosis de virus y el número de copias, expresando los grupos A y B de los experimentos de entrenamiento los niveles más altos (3 a 5 LOG) de la secuencia lentiviral de C7 en comparación con las células de control.
Tabla 40: Número de copias de LV-COL7 en células del experimento de producción de GM-HDF
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1 Los grupos de control se transdujeron de forma simulada y no se expusieron a LV-COL7
2 BLQ: por debajo del límite de cuantificación
3 Solo se generó un solo grupo de transducción para TR10 y para ER1
D.1.2. Expresión de proteína C7
Se usó inmunofluorescencia indirecta (IF) para examinar la expresión de proteína C7 por células GM-HDF usando un anticuerpo específico para C7. Se usaron fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) como control positivo para este ensayo y los grupos de control de los experimentos de entrenamiento se usaron como controles negativos. En las imágenes representativas que se muestran en la Figura 28 a continuación, un pequeño porcentaje (<10%) de fibroblastos de RDEB transducidos con INXN-2002 y LV-HA-COL7 muestran tinción de C7, lo que es consistente con el número de copias de LV integradas (Tabla 18). La señal de los GM-HDF que son positivos para C7 es más brillante que la señal de los NHDF, lo que indica una mayor cantidad de C7 producida por los GM-HDF.
Intrexon desarrolló un ELISA directo para medir el C7 secretado por los GM-HDF en los medios de cultivo celular. Este ensayo, como se describe anteriormente en la Sección C.4, utilizó un anticuerpo policlonal específico de la región NC1. Los resultados del ensayo ELISA de los GM-HDF de las tres series de experimentos muestran que la expresión de C7 depende de la dosis de LV con niveles de expresión que varían de 45-90 ng/ml de líquidos sobrenadantes de las células (Figura 29).
D.2. Evaluación funcional de C7 expresado por GM-HDF 9.2.1. Formación de trímeros de C7
La formación de trímeros de C7 es importante en el ensamblaje de las fibrillas de anclaje. Para verificar que el C7 expresado por los GM-HDF será capaz de formar fibrillas de anclaje, se evaluó si el C7 expresado formaba o no trímeros usando inmunoprecipitación (IP) con un anticuerpo específico anti-C7 (fNC1) para la captura selectiva, luego la concentración de C7 de los líquidos sobrenadantes de cultivo para la detección por SDS-PAGE/inmunotransferencia.
Las condiciones óptimas para la inmunoprecipitación se establecieron ensayando un anticuerpo de C7 comercial y el anticuerpo de C7 fNC1. El recubrimiento de perlas de proteína G con fNC1 dio como resultado niveles más altos de unión a C7 en comparación con el recubrimiento con el anticuerpo disponible comercialmente. Los controles utilizados en este ensayo incluyen un control sin anticuerpo para descartar la unión no específica de C7 a las perlas, así como perlas recubiertas de anticuerpo incubadas con y sin C7 purificado enriquecido en medios acondicionados como controles para la especificidad de C7 aislado de líquidos sobrenadantes de cultivos de GM-HDF.
Los resultados de inmunoprecipitación para TR8 y para TR10 y ER1 mostraron que el C7 producido por los GM-HDF era predominantemente trimérico (Figura 10 y Figura 11, respectivamente). También se observaron algunas especies de menor peso molecular que mostraban inmunorreactividad, e incluían las formas dimérica y monomérica de 290 kDa. La IP de C7 de los GM-HDF del TR9 se detectó en la inmunotransferencia en niveles bajos tanto por un anticuerpo anti-C7 (panel izquierdo, Figura 11B) como por un anticuerpo específico para el marcador HA incorporado en la proteína C7 (panel derecho, Figura 11B).
D.2.2. Unión de Lam332 por C7 expresado de los GM-HDF
Se ha demostrado que C7 se une a componentes de la matriz extracelular (ECM) inmovilizada, incluida la fibronectina, Laminina-332 (Lam332), COL1 y COL4 (Chen, et al., 2002a). La interacción entre C7 y Lam332 se produce a través del dominio NC1 NH2-terminal de C7 y depende de la conformación nativa tanto de Lam332 como de NC1 de C7 (Rousselle, et al., 1997). La asociación entre C7 y Lam332 es importante para establecer la arquitectura correcta de Lam332 en la unión dermoepidérmica. Tal organización es importante para las interacciones con ligandos extracelulares y receptores de superficie celular, y para la señalización celular (Waterman, et al., 2007). Intrexon desarrolló un ELISA utilizando un anticuerpo contra el dominio NC1 de C7 para detectar la unión de C7 a Lam332 purificada. Aunque ya se ha descrito en la bibliografía un ELISA de unión C7/Lam332 (Chen, et al., 2002a), hasta donde saben los autores de la invención, nunca se ha utilizado para analizar la presencia de C7 en los líquidos sobrenadantes de las células transducidas. Los resultados en la Figura 12 muestran la unión dependiente de la dosis a Lam332 por C7 expresado por los GM-HDF de los experimentos de entrenamiento y genotecnológicos.
D.2.3. Ensayo de migración celular
Estudios previos han mostrado que los fibroblastos y queratinocitos de RDEB muestran un aumento en la motilidad en relación con sus homólogos normales, y que la motilidad normal se puede restablecer mediante la expresión de C7 (Chen, et al., 2000; Chen, et al., 2002b; Cogan, et al., 2014; Baldeschi et al., 2003). La mayoría de estos estudios emplearon el ensayo de migración de sal de oro coloidal para medir la migración de fibroblastos y queratinocitos, o un ensayo de cicatrización de heridas para medir la migración de queratinocitos. Aquí se usó el kit de ensayo de cicatrización de heridas de 24 pocillos CytoSelect™ (Cell Biolabs, Inc.) para medir la motilidad de los NHDF y GM-HDF. La tinción inmunofluorescente para C7 puso de manifiesto que solo un pequeño porcentaje (<10%) de las células transducidas expresaban niveles altos de la proteína, lo que planteaba la cuestión de si un pequeño número de células productoras de C7 podría tener un efecto global sobre la migración celular. Para determinar si la presencia de C7 en los medios de cultivo es suficiente para revertir el fenotipo de hipermotilidad de la RDEB, el ensayo de cicatrización de herida se llevó a cabo en los GM-HDF de los tres experimentos de entrenamiento, con NHDF como control positivo y los grupos de control transducidos de forma simulada (RDEB) como control negativo.
Los fibroblastos de control del TR8, TR10 y ER1 presentan un fenotipo de hipermotilidad que se invierte con la expresión de C7 (Figura 30). Sin embargo, los fibroblastos de control del TR9 no presentan un fenotipo de hipermotilidad significativo, lo que dificulta la investigación de la funcionalidad de C7 marcado con HA en este ensayo. Conclusiones
El número de copias del transgén integradas por célula en los GM-HDF dependía de la dosis de virus que variaba de 0. 009 a 0.03 copias del transgén por célula.
La expresión de C7 dependiente de la dosis de las células GM-HDF se confirmó mediante qRT-PCR, tinción de inmunofluorescencia y ELISA.
Se confirmó que la estructura del C7 expresado por las células GM-HDF era predominantemente trimérica por inmunoprecipitación/SDS-PAGE/análisis de inmunotransferencia para TR8, TR10 y ER1. TR9 mostró una formación mínima de trímeros.
Se demostró que el C7 producido a partir de las células GM-HDF del TR8 es funcional mediante la unión a Laminina-332 en un ensayo de unión in vitro y mediante la corrección del fenotipo de hipermotilidad de las células de control de RDEB en un ensayo de migración in vitro. TR9 mostró unión a Laminina-332, sin embargo, los resultados del ensayo de migración eran equívocos. Los HA-GM-HDF del TR9 generados a partir de la transducción con LV-HA-COL7 mostraron niveles bajos de trímero, menos unión a Lam332 y falta de una corrección clara de la hipermotilidad. Debido a la falta de confirmación de la funcionalidad in vitro de HA-C7 expresado por los HA-GM-HDF del TR9, se eligieron células del TR8 para evaluaciones de farmacología/toxicología híbridas in vitro e in vivo. Esto eliminó la capacidad de evaluar la expresión, localización y persistencia en injertos compuestos de piel humana normal o de RDEB preparados con piel humana desvitalizada. Finalmente, para estos estudios se utilizaron injertos compuestos preparados con dermis porcina desvitalizada. Se usó inmunotinción con anticuerpo anti-C7 específico humano para distinguir rC7 de C7 nativo en este enfoque.
Ejemplo 8 - Producto farmacéutico
El producto farmacéutico FCX-007 consiste en una suspensión estéril de las propias células fibroblastos autólogas vivas de cada paciente, que se modifican genéticamente utilizando INXN-2004 LV-COL7 para codificar el gen C O L 7 A 1 de tipo natural humano, formulado en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) sin rojo fenol.
Desarrollo de formulaciones
El desarrollo de la formulación FCX-007 y la dosificación de células se basó en la experiencia de fabricación de Fibrocell con azficel-T (LAVIV®); un producto de células vivas de fibroblastos autólogos para inyección. Las células de fibroblastos se han formulado con éxito en DMEM en un intervalo de concentración celular de 0.5 - 3.0 x 107 células/ml sin problemas de viscosidad (azficel-T BLA n.° 125348). Los datos sugieren que la viscosidad se convierte en un problema para la inyección del producto cuando la concentración celular alcanza 5.8 x 107 células/ml. Como resultado, se seleccionó DMEM a una concentración celular de 1.0-3.0 x 107 células/ml como la formulación para el DP (producto farmacéutico, por sus siglas en inglés ü ru g P roduct) FCX-007.
Exceso
Se envían hasta diez viales de DP FCX-007 a la clínica como una dosis para la inyección de tratamiento. En el momento de la administración, el vial de DP se invierte suavemente tres veces y luego se extrae asépticamente 1 ml de cada vial en una jeringa estéril de 1 ml con una aguja de calibre 21. A continuación, la aguja de calibre 21 se reemplaza por una aguja de calibre 30 para la administración intradérmica. El procedimiento se repite para los 9 viales de producto restantes.
Los viales de DP FCX-007 se llenan con 1.2 ml de la suspensión de células de fibroblastos en un vial de 2.0 ml de capacidad para un volumen recuperable de 1.0 ml. El exceso de 0.2 ml está destinado a garantizar que se pueda obtener 1.0 ml del vial en el momento de la administración en la clínica.
a. Propiedades fisicoquímicas y biológicas
1. Propiedades fisicoquímicas
El DP FCX-007 se presenta como una suspensión de células de fibroblastos autólogos modificados genéticamente en DMEM sin rojo fenol con una carga de 1.2 ml en un criovial de 2 ml. Los ensayos demuestran que las células son un cultivo vivo. La Tabla 41 muestra las propiedades fisicoquímicas de DP FCX-007.
Tabla 41: Propiedades fisicoquímicas de DP FCX-007
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Propiedades biológicas
FCX-007 es un producto de células de fibroblastos autólogos estériles que están modificados genéticamente para expresar la proteína de colágeno 7 humana (C7). El número de copias del vector INXN-2004 por célula y la expresión de la proteína C7 son propiedades biológicas únicas del DP FCX-007. El DP FCX-007 es un producto de suspensión de células vivas que se produce a partir del DS FCX-007 lavando las células del DS FCX-007 descongeladas en tampones PBS y DMEM. Se analizan el número de copias del vector INXN-2004 por célula y la expresión de la proteína C7 en el DS FCX-007 antes de su liberación para fabricar el DP FCX-007. La Tabla 42 muestra las propiedades biológicas del DP FCX-007.
Tabla 42: Propiedades biológicas del DP FCX-007
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Fórmula del lote
Para preparar el producto farmacéutico FCX-007, los viales del principio activo FCX-007 se extraen de la fase de vapor del almacenamiento congelado de nitrógeno líquido, se descongelan y se mezclan dentro de una BSC ISO 5. Las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS), seguido de un lavado con medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) sin rojo fenol antes de suspenderse en DMEM sin rojo fenol a una concentración objetivo de 1.0 - 3.0 x 107 células/ml. Luego, las células formuladas se introducen en crioviales de 2 ml con 1.2 ml/vial. El material del producto farmacéutico preparado para cada tratamiento de inyección se define como un lote. El tamaño del lote de tratamiento propuesto es de hasta diez (10) viales de 2 ml que contienen 1.2 ml de suspensión celular. La Tabla 43 proporciona una lista de todos los componentes utilizados en el procedimiento de fabricación del producto farmacéutico.
Tabla 43: Composición y cantidad del lote del producto farmacéutico FCX-007
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1 El vial contiene 1.2 ml de suspensión de células FCX-007
2 El residuo de lavado de PBS se diluye con DMEM sin rojo fenol, de modo que es posible que haya cantidades en trazas de PBS, pero no cuantificables.
Descripción del procedimiento de fabricación y controles del procedimiento
b. Diagrama de flujo del procedimiento de fabricación
La fabricación del producto farmacéutico FCX-007 comienza cuando los viales del principio activo FCX-007 se retiran del almacenamiento en nitrógeno líquido y se descongelan usando un ThermoMixer®. En una BSC ISO5, las células DS FCX-007 descongeladas se mezclan en un tubo de centrífuga de 250 ml que contiene >5x el volumen aparente de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para la resuspensión. Las células se centrifugan a 1000 rpm durante 10 minutos a 5 ± 3°C y se separa el tampón de lavado PBS. A esto le sigue un lavado con > 5x el volumen aparente de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) mediante resuspensión y centrifugación a 1000 rpm durante 10 minutos a 5 ± 3°C. Se separa el tampón de lavado DMEM. Las células lavadas se vuelven a suspender en DMEM sin rojo fenol hasta una concentración objetivo de 2.0 x 107 células/ml. La suspensión celular se carga manualmente en crioviales estériles de 2.0 ml en una BSC ISO5 hasta un volumen de 1.2 ml por vial para producir los viales de DP FCX-007. Los viales del producto farmacéutico se almacenan a 2-8°C hasta que el control de calidad los libera para su envío en un transportador Credo Cube™ al centro clínico.
Descripción del procedimiento de fabricación
El producto farmacéutico FCX-007 se fabrica como se indicó anteriormente. INXN-2002 es un nombre sinónimo de FCX-007.
Etapa 1: Retirada de viales de principio activo FCX-007 del almacenamiento en nitrógeno líquido y verificación de lotes El principio activo FCX-007, que se almacena en un congelador de nitrógeno líquido, se solicita a Gestión de materiales. Luego, los viales de principio activo FCX-007 se extraen para este lote de producción de producto farmacéutico FCX-007 antes de transferirlos a la sala limpia.
Etapa 2: Descongelación de los crioviales
El despeje de línea de la sala limpia se lleva a cabo por la QA (garantía de calidad) despeje de línea de producción GMP/limpieza de línea GTP por SOP-0099 GMP, con el fin de liberar la sala para su uso de procesamiento. Los operadores inician el monitoreo ambiental (EM) de la sala, el personal y la BSC según el SOP-0129 (Monitoreo ambiental y del personal en procedimiento) antes del procesamiento y el muestreo de EM no viable en la BSC durante el procesamiento.
Los crioviales de DS FCX-007 se desinfectan y descongelan en un ThermoMixer® equilibrado a 37°C hasta que la suspensión de células se descongela casi por completo y queda un trocito de cristales de hielo. Los viales descongelados se transfieren a una BSC.
Etapa 3: Lavado con PBS
Dentro de la BSC, con una pipeta, transfiera aproximadamente 150 ml de PBS (> 5 volúmenes de la suspensión de células DS FCX-007) a un tubo de centrífuga de 250 ml. El contenido de los crioviales descongelados se transfiere al tubo de centrífuga de 250 ml. Utilice la suspensión celular diluida para enjuagar la pipeta. Utilice una pipeta para transferir 3.0 ml de PBS nuevo a cada criovial como enjuague. Transfiera el enjuague a un tubo de centrífuga de 250 ml. Agite con movimientos circulares el tubo suavemente para mezclar la suspensión de células. Transfiera el tubo de centrífuga a una centrífuga y centrifugue las células a 1000 RPM durante 10 minutos a 5 ± 3°C. Después de la centrifugación, retire el líquido sobrenadante de lavado con PBS del tubo.
i. Etapa 4: Lavado con DMEM
Usando una pipeta, añada aproximadamente 200 ml de DMEM sin rojo fenol (> 5 volúmenes de la suspensión de células de DS FCX-007) al tubo para volver a suspender el sedimento celular. Agite con movimientos circulares el tubo suavemente para mezclar la suspensión de células. T ransfiera el tubo de centrífuga a una centrífuga y centrifugue las células a 1000 RPM durante 10 minutos a 5 ± 3°C. Después de la centrifugación, usando una pipeta, transfiera 0.9 ml del líquido sobrenadante del frasco de la centrífuga a cada uno de los 2 crioviales de 2 ml separados (1.8 ml en total) etiquetados como "Lote, QC-Esterilidad". Deje los crioviales etiquetados para esterilidad a un lado en la BSC. Aspire el líquido sobrenadante de lavado con DMEM restante del tubo de centrífuga.
Etapa 5: Resuspensión de sedimentos celulares en DMEM
El volumen de DMEM utilizado para volver a suspender el sedimento celular se calcula como:
Volumen de suspensión de células DS FCX-007 descongeladas dividido por 1.5
El factor de volumen de 1/1.5 compensa la posible pérdida de células durante las etapas de lavado con el fin de dar como resultado una concentración de células en el intervalo especificado de 1.0-3.0 x 107 células/ml después de la resuspensión.
Utilice una pipeta para transferir la cantidad calculada de DMEM para volver a suspender el sedimento celular en el tubo de centrífuga. Utilice una pipeta para transferir 0.1 ml de la suspensión celular a un criovial de 2 ml con la etiqueta "Lote, QC-Recuento y viabilidad" y envíe el criovial al QC para el recuento de células. Utilice una pipeta para medir el volumen restante de la suspensión celular total y ponga la suspensión celular en un refrigerador a 2-8°C para usar para el llenado final posterior.
Etapa 5a: Redilución (si es necesario)
Si la concentración de células en el QC es superior a 3.0 x 107 células/ml, realice una dilución adicional usando DMEM nuevo para alcanzar una concentración de células de 2.0 x 107 células/ml. Vuelva a enviar una muestra de suspensión celular al QC para el recuento de células y confirmar la concentración celular final.
Etapa 6: Llenado final
Recupere las células del refrigerador y transfiera las células a la BSC para el llenado final. Use una pipeta para llenar manualmente con la suspensión celular bien mezclada crioviales de 2 ml en el siguiente orden:
Llene con 0.1 ml de suspensión celular el primer vial de muestra de esterilidad (añadido a la muestra retenida de la etapa 4)
Llene los viales con el producto a 1.2 ml por vial
Llene con 0.1 ml de suspensión celular el segundo vial de muestra de esterilidad (añadido a la muestra retenida de la etapa 4)
Llene el vial de QC a <1.8 ml por vial
Envíe los viales de esterilidad y QC para su análisis.
Etapa 7: Almacene los viales de DP para su liberación y envío
Mantenga los viales de DP a 5 ± 3°C para liberarlos y enviarlos al centro clínico.
Descripción de los controles en el procedimiento
Controles Ambientales
Todas las manipulaciones de cultivos celulares se llevan a cabo en cabinas de seguridad biológica (BSC) con certificado ISO 5 dentro de un entorno ambiental de ISO7 utilizando técnicas asépticas. Los recipientes de crioviales de 2 ml del producto farmacéutico final se compran preesterilizados a Corning. Los operadores que realizan el llenado final están calificados para operaciones de llenado aséptico.
Controles y ensayos en el procedimiento
Los controles y ensayos del procedimiento realizados para la liberación del producto farmacéutico FCX-007 se describen a continuación.
Etapa 1
La QA verifica el lote correcto del principio activo FCX-007 antes de utilizarlo en la fabricación del DP FCX-007. Etapa 2
La temperatura del ThermoMixer® utilizado para descongelar los viales del principio activo FCX-007 se controla a 37°C. El contenido de cada vial se descongela hasta que queda un trozo de hielo en el vial para evitar el sobrecalentamiento.
Etapa 3
El volumen de lavado con PBS se controla a > 5 volúmenes de la mezcla de células DS FCX-007 para garantizar el lavado adecuado de las células. Las condiciones de centrifugación se controlan a 1000 rpm, 10 minutos y 5±3°C para garantizar una sedimentación celular suficiente.
Etapa 4
De manera similar a la etapa de lavado con PBS, el volumen de lavado con DMEM se controla a > 5 volúmenes de la mezcla de células DS FCX-007 para garantizar el lavado adecuado de las células. Las condiciones de centrifugación se controlan a 1000 rpm, 10 minutos y 5±3°C para garantizar una sedimentación celular suficiente. Se toman dos partes alícuotas de 900 gl de líquido sobrenadante de lavado con DMEM para usar en el ensayo de esterilidad del producto final.
Etapa 5 y 5(a) (si son necesarias)
La concentración de células resuspendidas se controla a 1.0 -3.0 x 107 células/ml y viabilidad > 70%.
Etapa 6
El volumen de llenado de los viales con DP FCX-007 se controla a 1.2 ml de llenado por vial. Se realiza un recuento final de células y una medición de viabilidad, así como una tinción de Gram en el vial de QC lleno. Los dos viales de esterilidad se someten a ensayos de esterilidad. Los resultados de este ensayo de esterilidad no se reciben hasta después de la liberación del producto farmacéutico, por lo que la liberación del DP se realiza basándose en una tinción de Gram negativa. El uso de un ensayo microbiano rápido en esta situación se indica en la Guía para revisores y patrocinadores de la FDA "Contenido y revisión de la información química, de fabricación y de control (CMC) para la investigación de aplicaciones de nuevos medicamentos (IND) de terapia con células somáticas humanas" de abril de 2008.
ii. Control de materiales
El procedimiento de fabricación del producto farmacéutico FCX-007 utiliza productos desechables de un solo uso que entrarán en contacto con las materias primas (p. ej., pipetas, tubos de centrífuga y crioviales) para eliminar las consideraciones de problemas de limpieza y transferencia. Las materias primas seleccionadas para su uso en el procedimiento de fabricación son aceptables para el procesamiento farmacéutico cumpliendo con la USP VI. Todos los artículos desechables se compran preesterilizados por radiación gamma. Los tampones de lavado PBS y DMEM se compran estériles a proveedores comerciales. Las etapas del procedimiento tienen los parámetros del procedimiento apropiados identificados, tales como el tiempo y la temperatura.
Ejemplo 9 - Caracterización in vitro de GM-HDF optimizados
Este ejemplo describe la caracterización de los GM-HDF generados usando un procedimiento de transducción de LV mejorado, la construcción de LV-COL7 INXN-2004. Se ejecutaron tres experimentos de entrenamiento (TR11, TR12.1 y TR13) para generar células para los análisis a escala de GMP. TR11 se transdujo con el vector de LV-COL7 INXN-2002 y se usó para evaluar un procedimiento de transducción del LV mejorado por centrifugación (espinoculación) con y sin una segunda etapa de transducción (supertransducción). TR12.1 y TR13 se transdujeron con el vector de LV-COL7 INXN-2004 utilizando procedimientos de transducción mejorados determinados mediante la evaluación de TR11. Los GM-HDF de cada experimento de entrenamiento se caracterizaron usando ensayos para evaluar resultados tales como el número de copias de LV-COL7 integradas, la expresión de proteína de C7 y la funcionalidad del C7 expresado por los GM-HDF.
Los niveles de integración del LV y expresión de C7 aumentaron primero con la adición de la etapa de supertransducción y aumentaron aún más con el uso del LV-COL7 INXN-2004. El C7 se expresó a partir de los GM-HDF de los tres experimentos de entrenamiento ensamblado en la forma trimérica y se unió a la Laminina-332, que es importante en la formación de fibrillas de anclaje. La expresión de C7 por los GM-HDF pudo revertir la hipermotilidad observada en los fibroblastos de RDEB. Se seleccionaron los GM-HDF de TR12.1 y 13 para usar en estudios de toxicología GLP in vivo.
Los objetivos de este estudio eran (a) demostrar la mejora en el número de copias del LV integradas y la expresión de C7 como resultado de 1) un procedimiento de transducción mejorado incorporado en el método de producción GMP a escala y 2) la adopción de la construcción de LV-COL7 INXN-2004 y (b) confirmar la funcionalidad de C7 expresada por los GM-HDF
1. Materiales de estudio
1.1. Artículo(s) de ensayo
Se caracterizaron los GM-HDF de los experimentos de entrenamiento (TR) 11, 12.1 y 13.
Tabla 44: Información general de producción para TR11, TR12.1 y TR13
Figure imgf000054_0001
1 Las células del grupo de control se transdujeron de forma simulada
2 El grupo B de TR12.1 y TR13 fue solo para investigación. El pase de estos grupos terminó temprano y, por lo tanto, no completaron el procedimiento de producción a gran escala.
1.2. Secuencias de cebadores y sonda
Tabla 45: Secuencias de cebadores y sonda utilizadas para ensayos de qPCR
Figure imgf000055_0001
1 Cebadores/sonda adquiridos de IDT.
2 Secuencias de cebadores/sonda específicas de LV derivadas de Greenberg et al. (2006).
2. Procedimientos experimentales
2.1. Número de copias de LV-COL7
El aislamiento de ácidos nucleicos se realizó utilizando el kit AllPrep de Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNg se aisló de 6.7 x 105 células GM-HDF y se usaron 8 pl de ADNg en un ensayo de 20 pl (10 pl de Taqman® Gene Express, 1.8 pl de agua exenta de nucleasas, 0.06 pl de cebador directo 100 pM, 0.06 pl de cebador inverso 100 pM, 0.04 pl de sonda Taqman® 100 pM). También se analizó una curva de calibración del vector lanzadera lentiviral LV-COL7 linealizado diluido en serie (1e6 copias/reacción a 5 copias/reacción), más 4 pl de ADNg humano (1.5e4 células/reacción) en el ensayo de 20 pl mencionado anteriormente. El ensayo Taqman® utilizado fue PR13843. También se realizó una curva de calibración adicional de 8 pl de ADNg humano comercial (Clontech) (1.5e4 células/reacción a 2e2 células/reacción) en un ensayo de 20 pl (10 pl de Taqman® Gene Express, 1.0 L de agua exenta de nucleasas, 1 pl de 20X conjunto de cebador/sonda ACTB). Todas las muestras se analizaron por triplicado en un ABI7900HT utilizando los siguientes parámetros de ciclo: 2 minutos a 50°C, 10 minutos a 95°C y 40 ciclos de 15 segundos a 95°C y 1 minuto a 60°C.
2.2. Inmunofluorescencia de C7
Para el análisis de inmunofluorescencia, se permitió que 1.2 x 104 GM-HDF se adhirieran a cubreobjetos recubiertos con PDL/Lamin en placas de 24 pocillos durante la noche y luego se fijaron y permeabilizaron con una mezcla al 50%/50% de metanol/acetona. Los cubreobjetos se lavaron 3 veces con 1X PBS y luego se bloquearon con suero de cabra al 10% en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de tres lavados adicionales con PBS, los cubreobjetos se incubaron con 1.25 pg/ml de un anticuerpo policlonal fNC1 (a-fNC1) en suero de cabra al 1%/PBS, seguido de 3 lavados adicionales con PBS e incubación con 5 pg/ml de anti-IgG de conejo de cabra conjugado con Alexa Fluor® 555 en suero de cabra al 1%/PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Los cubreobjetos se tiñeron con reactivo NucBlue® Live Cell Stain Ready Probes antes de montarlo en los portaobjetos. Las imágenes se adquirieron en un microscopio Zeiss Axio Observer con un aumento 20X utilizando un tiempo de exposición de 290 ms. Los NHDF o GM-HDF se fijaron, permeabilizaron y tiñeron con NucBlue® Live Cell Stain para visualizar los núcleos (azul) o con el anticuerpo fNC1 y anti-IgG de conejo de cabra conjugado con Alexa Fluor® 555 (5 pg/ml) para visualizar la expresión de C7 (rojo). Las imágenes se adquirieron a aumentos de 20X y 5X utilizando un tiempo de exposición de 290 ms.
2.3. Citometría de flujo de C7
Se recolectaron los GM-HDF (~500000 células) en cada pocillo de una placa con fondo en V de 96 pocillos, se concentraron por centrifugación (1500 rpm, 5 min, temperatura ambiente) y se separaron los líquidos sobrenadantes del medio de cultivo. A continuación, las células se resuspendieron en 200 pl de CytoFix, se transfirieron a una placa con fondo en V de 96 pocillos y se incubaron durante 30 min a 4°C. Después de la fijación, el fijador se separa por centrifugación (1500 rpm, 5 min, 4°C) y las células se permeabilizan con 200 pl de metanol al 100% helado durante 30 min sobre hielo. A continuación, las células se mantuvieron a -20°C antes del procedimiento de tinción. Para la tinción, las células permeabilizadas se lavaron dos veces con 200 pl de tampón de incubación (0.5 g de BSA en 100 ml de PBS), con centrifugación (300 rpm, 5 min, temperatura ambiente) entre lavados para eliminar el tampón. Las células lavadas se resuspendieron en 100 pl de tampón de incubación que contenía a-fNC1 diluido 1:400 y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las células se lavaron dos veces como se describe anteriormente y se resuspendieron en 100 pl de tampón de incubación que contenía el anticuerpo secundario de IgG de conejo-AlexaFluor 555 diluido 1:2000 y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, las células se lavaron dos veces como se describe anteriormente y se resuspendieron en 100 pl de PBS. Las células que expresan C7 se contaron por citometría de flujo utilizando el software BD LSRII y BD FACSDiva (V6.2) con los siguientes parámetros: voltaje FSC = 484, voltaje SSC = 209, PE = 500.
2.4. ELISA de proteína C7
Brevemente, una curva de calibración del fragmento His-NC1 purificado (9.8 - 625 ng/ml) o los líquidos sobrenadantes recolectados que contenían proteína C7 (de GM-HDF en cultivo durante tres a cinco días) se inmovilizaron en una placa de 96 pocillos Nunc MaxiSorp® durante la noche a 4°C. Los patrones y las muestras se analizaron en la misma matriz de muestra (10% de medio acondicionado con fibroblastos de RDEB). Los pocillos recubiertos se lavaron con PBST y se bloquearon con BSA al 3%/PBS durante 1 hora a 37°C. La detección se realizó utilizando Ab a-fNC1 (0.5 pg/ml) seguido de incubación con anticuerpo secundario de burro anti-IgG de conejo HRP (Jackson ImmunoResearch, 0.08 pg/ml). Los anticuerpos unidos se detectaron mediante desarrollo colorimétrico con solución de sustrato TMB. Después de inactivar la reacción, se midió la absorbancia a 450 nm en el SpectraMax® Plus 384 (Molecular Devices).
2.5. Inmunoprecipitación de trímeros de C7
En primer lugar, las perlas magnéticas de Proteína G se lavaron con 1 X PBS-T. Las perlas se unieron al imán durante un mínimo de 2 minutos antes de separar el líquido sobrenadante y en todas las etapas posteriores. Después de los lavados, las perlas se recubrieron con 5 pg de a-fNC1 y se incubaron durante 10 minutos con rotación (Glas-Col, configurando 30 ~ 14 rpm a temperatura ambiente). Las perlas se unieron al imán para separar el líquido sobrenadante y se lavaron con tampón de lavado/unión de Ab. Se recogieron los líquidos sobrenadantes de los GM-HDF en cultivo durante tres a cinco días. Se añadió el líquido sobrenadante que contenía C7 a la mezcla de perlas/líquido sobrenadante de C7 y se incubó durante la noche a 4°C con rotación (ajuste a 30 ~ 14 rpm). Al día siguiente, las perlas se unieron al imán y se lavaron tres veces usando tampón de lavado. El antígeno diana se eluyó en 20 pl de tampón de elución (glicina 50 mM, pH 2.8 y 10 pl de colorante de carga 4X). Las muestras se desnaturalizaron a 70°C durante 10 minutos. A continuación, se cargaron (por pocillo) 12 pl de un total de 30 pl (la muestra restante se almacenó a 4°C) en un gel de acetato de T ris al 3-8% de 12 pocillos y se procesó durante 4 horas a 150 voltios. El gel se retiró del casete y se sumergió en tampón de transferencia que contenía metanol al 10% durante 20 minutos. Se realizó la transferencia húmeda durante la noche del gel a una membrana de nitrocelulosa a 15 voltios a 4°C. Al día siguiente, se aumentó el voltaje a 50 voltios durante 30 min sobre hielo. Una vez completada la transferencia, la transferencia se bloqueó usando leche al 5% en TBS-T con agitación (Labnet ProBlot™ Rocker 25, ajuste a 60 rpm) durante 2 horas a temperatura ambiente y se incubó con anti-C7 LH7.2 (0.25 pg/ml) disponible comercialmente con agitación durante 2 horas a temperatura ambiente. La transferencia se lavó 3 veces con 1X TBS-T (5 min cada una) con agitación antes de detección con anti-IgG de ratón de cabra conjugado con HRP (0.1 pg/ml) con agitación durante 1 hora a temperatura ambiente. La transferencia se desarrolló usando el sustrato quimioluminiscente Lumiglo Ultra™ y Fujifilm LAS 3000 Imaging System.
2.6. Unión de Lam332
Las placas de 96 pocillos MaxiSorp™ se recubrieron con 1 pg de Lam332 o BSA en tampón de carbonato 100 mM, pH 9.3 durante la noche a 4°C. Las placas se enjuagaron cinco veces con PBS-T y luego se bloquearon con BSA al 1% en PBS-T a temperatura ambiente durante 1 hora. Los pocillos recubiertos se enjuagaron cinco veces con PBS-T y se incubaron con los líquidos sobrenadantes de las células transducidas durante la noche a 4°C. Después de tres lavados más con PBS-T, el C7 unido se incubó con a-fNC1 (0.5 pg/ml, PBS-T) a temperatura ambiente durante 3 horas, seguido de incubación con anti-IgG de conejo de burro conjugado con HRP (concentración final en PBS-T 0.8 pg /ml) a temperatura ambiente durante 2 h. La detección de los anticuerpos unidos a C7 se realizó mediante una reacción colorimétrica con TMB y se midió leyendo la absorbancia del producto a 450 nm en un lector de placas SpectraMax® Plus 384 (Molecular Devices). Todas las incubaciones se llevaron a cabo en un agitador orbital (GeneMate) a un ajuste de velocidad de 2.
2.7. Ensayo de migración celular
Se usó el kit de ensayo de curación de heridas de 24 pocillos CytoSelect™ de Cell Biolabs, Inc. para el ensayo de migración celular. Los GM-HDF (0.8 x 105) se sembraron en presencia de un inserto de herida en placas de 24 pocillos y se cultivaron durante 48 horas. A continuación, se retiró el inserto de herida y las células se cultivaron adicionalmente en medio de suero reducido (1%) que contenía 15 pg/ml de colágeno tipo I (COL1) durante 8 horas. Se adquirieron imágenes de campo claro de las heridas 0, 2, 4, 6 y 8 horas después de retirar el inserto de herida con el sistema de citometría de imagenes Celigo® (Cyntellect). El área superficial de la herida en cada momento se midió utilizando ImageJ (Institutos Nacionales de Salud). Los datos se dan como el porcentaje de migración (% de migración) que cubre el área de la herida.
3. Análisis de datos
La qPCR se realizó utilizando un instrumento ABI 7900 utilizando el software SDS2.3. Los datos experimentales se visualizaron y exportaron en el software SDS 2.4. Se utilizó el software FlowJo V10 para analizar los datos de citometría de flujo. Se utilizó el software ImagJ para cuantificar el porcentaje de migración celular para el ensayo descrito en la Sección 2.7. ImageJ es un programa de procesamiento de imágenes de código abierto desarrollado por el Instituto Nacional de Salud y diseñado para imágenes científicas multidimensionales.
4. Resultados
4.1. Caracterización de la expresión de C7
Los objetivos generales de esta evaluación eran aumentar el número de copias y la expresión de proteína mediante una comparación de métodos de transducción y vectores LV. Los objetivos específicos eran:
1. Evaluar el efecto de la supertransducción en el número de copias integradas
2. Evaluar el efecto de la espinoculación en el número de copias integradas
3. Compare los valores del número de copias entre INXN-2002 e INXN-2004 en condiciones supertransducidas y espinoculadas.
Se usaron dos lotes GMP de construcciones de LV-COL7 para estos estudios: el INXN-2002 y la construcción INXN-2004 como se describe en este ejemplo.
4.1.1. Número de copias de LV-COL7
Se obtuvieron células del experimento de entrenamiento de GM-HDF y se determinó el número de copias como se describe anteriormente en la Sección 2.1. La Tabla 46 a continuación proporciona el número de copias/célula de los experimentos de entrenamiento que utilizan los nuevos métodos de transducción. La optimización inicial implementó la adición de centrifugación durante el etapa de transducción ("espinoculación"). La transducción convencional se había utilizado anteriormente con INXN-2002 y dio como resultado un número de copias integradas que variaban de 0.013 a 0.025. La adición de solo la etapa de espinoculación para la transducción con INXN-2002 dio como resultado un aumento de >2 veces en el número de copias integradas a 0.05 por célula (TR11 Grupo B, Tabla 46) en comparación con los resultados de TR8 de estudios anteriores.
Para mejorar aún más el número de copias integradas, se añadió una segunda transducción ("supertransducción") al procedimiento de producción de GM-HDF. La adición de la supertransducción, utilizando también espinoculación, aumentó aún más el número de copias integradas de INXN-2002 en aproximadamente 2 veces (TR11 Grupo A, Tabla 46). Los estudios de investigación a pequeña escala (no mostrados) demostraron que una construcción de LV-COL7 INXN-2004 de segunda generación, que utiliza un esqueleto de LV autoinactivante de 3a generación alternativo, tenía el potencial de lograr un mayor número de copias integradas, lo que daba como resultado niveles de expresión más altos, al mismo tiempo que utilizaba una multiplicidad de infección (MOI) más baja que la utilizada para INXN-2002. Cuando se usó a escala de GMP con el procedimiento de transducción optimizado (espinoculaciones con supertransducción), INXN-2004 mejoró aún más el número de copias integradas de LV de aproximadamente 4 a 8 veces más que la construcción INXN-2002 para lograr un número de copias promedio de 0.41. a 0.74 (TR12.1 y TR13, respectivamente, Tabla 46).
Cabe destacar que los grupos B de TR12.1 y TR13 no se ensayaron respecto al número de copias ya que no pasaron por todo el procedimiento de producción (Tabla 44). Las evaluaciones precisas del número de copias requieren células que se hayan sometido a pases varias veces después de la transducción para garantizar que ya no queden copias episomales de LV, que pueden inflar artificialmente los números de copias medidos.
Tabla 46: Número de copias de LV-COL7 en células del experimento de producción de GM-HDF
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1 Solo los grupos indicados fueron supertransducidos; todos los grupos de TR11, TR12.1 y TR13 fueron espinoculados
2 Los datos del grupo A de TR8 se presentan como un comparador para los resultados anteriores presentados en RDEB-ADSO-2 3 El grupo de control se transdujo de forma simulada y no se expuso a LV-COL7
4 BLQ: por debajo del límite inferior de cuantificación
5 El grupo B tanto para TR12.1 como TR13 no se continuó durante todo el procedimiento de producción y no se ensayó respecto a los números de copias de LV-COL7
4.1.2. Expresión de proteína C7
Se usó inmunofluorescencia indirecta (IF) para examinar la expresión de proteína C7 por células GM-HDF usando un anticuerpo específico para C7. Los grupos A y B de TR11, y solo el grupo A de TR12.1 y TR13 se analizaron por IF. Se usaron fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) como control positivo y el grupo de control de TR11 se usó como control negativo. A continuación, en la Figura 31, se muestran imágenes representativas con dos aumentos, 20x y 5x. También se incluyen como comparación para el procedimiento original imágenes de IF de células del grupo A de TR8 que tenían números de copias de LV-COL7 integradas de 0.015 por célula. De acuerdo con el número de copias de LV integradas presentado en la Tabla 46 anterior, solo se visualizó un pequeño número de GM-HDF de TR11 con anticuerpos para C7, aunque aún mayor que el número de células positivas para C7 de TR8. Además, los números de copias más altos medidos de los GM-HDF de TR12.1 y TR13 se correlacionan con números más altos de células positivas para la detección de C7. Cabe destacar que la señal de los GM-HDF que son positivos para C7 es más brillante que la señal de los NHDF, lo que sugiere mayores cantidades de C7 producidas por los GM-HDF por célula.
A continuación, se cuantificó el número específico de células que expresaban C7 utilizando un ensayo de citometría de flujo. Como se describe en la Sección 2.3, este ensayo utilizó un anticuerpo policlonal específico de la región NC1. Para este experimento, se incluyeron células del grupo B de TR12.1 y TR13 para comparar el procedimiento de transducción único (Grupo B) con el procedimiento de supertransducción (Grupo A) utilizando la construcción de LV-COL7 de segunda generación (INXN-2004). Como se muestra en la Figura 32 a continuación, el porcentaje de células positivas para C7 (C7+) para cada grupo de experimento de entrenamiento es consistente con el número cualitativo de células que expresan C7 detectado por IF (Figura 32) y se correlaciona con el número de copias medido (Tabla 46). La comparación de células C7+ entre el grupo A y el grupo B para TR12.1 y TR13 confirma la casi duplicación de los niveles de expresión que se predecirían mediante la adición de una segunda transducción.
Se usó un ELISA directo para medir el C7 secretado por los GM-HDF en los medios de cultivo celular. Este ensayo, como se describe en la Sección 2.4, también utilizó el anticuerpo policlonal específico de la región NC1. Los resultados del ensayo ELISA de los GM-HDF de los tres experimentos de entrenamiento muestran que la expresión de C7 depende del nivel de número de copias de LV integradas alcanzando los niveles de expresión aproximadamente 2300 ng/día/1e6 células (Figura 33). En comparación con el grupo A de TR8 como resultado representativo de estudios previos (RDEB-ADSO-2), esto representa un aumento de >200 veces en la expresión de C7 (Figura 33).
4.2. Evaluación funcional de C7 expresado por GM-HDF
4.2.1. Formación de trímeros de C7
La formación de trímeros C7 es fundamental en el ensamblaje de las fibrillas de anclaje (Bruckner-Tuderman, 1999). Para verificar que el C7 expresado por los GM-HDF será capaz de formar fibrillas de anclaje, se evaluó la formación de trímeros de C7 en los GM-HDF por inmunoprecipitación (IP) con un anticuerpo específico anti-C7 (fNC1) para captura selectiva, y después la concentración de C7 de los líquidos sobrenadantes de cultivo para detección por SDS-PAGE/inmunotransferencia. Se usó C7 recombinante purificado como control positivo y la etapa de captura sin anticuerpo específico de C7 se usó como control negativo. Los resultados de la IP para los tres experimentos de entrenamiento mostraron que el C7 producido por los HDF-GM era predominantemente trimérico (Figura 34) con algunas especies de menor peso molecular presentes que mostraban inmunorreactividad, probablemente las formas dimérica y monomérica de C7.
4.2.2. Unión de Lam332 por C7 expresado de los GM-HDF
Se ha mostrado que C7 se une a los componentes de la matriz extracelular (ECM) inmovilizada, incluida la fibronectina, Laminina-332 (Lam332), COL1 y COL4 (Chen, et al., 2002a). La interacción entre C7 y Lam332 se produce a través del dominio NC1 NH2-terminal de C7 y depende de la conformación nativa tanto de Lam332 como de NC1 de C7 (Rousselle, et al., 1997). La asociación entre C7 y Lam332 es importante para establecer la arquitectura correcta de Lam332 en la unión dermoepidérmica. Tal organización es fundamental para las interacciones con ligandos extracelulares y receptores de superficie celular, y para la señalización celular (Waterman, et al., 2007). Intrexon desarrolló un ELISA utilizando un anticuerpo contra el dominio NC1 de C7 para detectar la unión de C7 a Lam332 purificado. Los resultados de dos experimentos, presentados en la Figura 35, muestran la unión dependiente del número de copias a Lam332 por C7 expresado por los GM-HDF de los tres experimentos de entrenamiento. Se utilizaron células de control de TR11 como control negativo en ambos experimentos.
4.2.3. Ensayo de migración celular
Estudios previos han mostrado que los fibroblastos y queratinocitos de RDEB muestran un aumento en la motilidad en relación con sus homólogos normales, y que la motilidad normal se puede restablecer mediante la expresión de C7 (Chen, et al., 2000; Chen, et al., 2002b; Cogan, et al., 2014; Baldeschi et al., 2003). La mayoría de estos estudios emplearon el ensayo de migración de sal de oro coloidal para medir la migración de fibroblastos y queratinocitos, o un ensayo de cicatrización de heridas para medir la migración de queratinocitos. En este ejemplo, se usó un kit de ensayo de cicatrización de heridas de 24 pocillos CytoSelect™ (Cell Biolabs, Inc.) para medir la motilidad de los NHDF y GM-HDF. Para determinar si la presencia de C7 en el medio de cultivo es suficiente para revertir el fenotipo de hipermotilidad de la RDEB, el ensayo de cicatrización de heridas se llevó a cabo en GM-HDF de los tres experimentos de entrenamiento, con NHDF como control positivo y los grupos de control de transducción simulada (RDEB) como control negativo. Los fibroblastos de control del grupo C de TR11 (RDEB) presentaban un fenotipo de hipermotilidad que se invierte con la expresión de C7 (Figura 36). Curiosamente, los niveles de reversión del fenotipo no dependían del número de copias integradas/niveles de expresión de C7, lo que sugiere que incluso los niveles bajos de expresión de C7 son suficientes para revertir el fenotipo de hipermotilidad.
5. Conclusiones
El número de copias del transgén integradas por célula en los GM-HDF se mejoró mediante la adición de métodos de transducción mejorados (espinoculación y supertransducción) y un cambio a la construcción de LV-COL7 INXN-2004, con niveles logrado tan altos como 0.74 copias por célula. El número de veces de mejora lograda con cada cambio de procedimiento es el siguiente:
- La adición de espinoculación: >2 veces
- La adición de supertransducción (con espinoculación): ~2 veces
- El cambio de INXN-2002 a INXN-2004: >4 veces
- El cambio acumulado total desde el procedimiento original: promedio de >27 veces (TR12.1 y TR13 en comparación con TR8 utilizado en los estudios originales)
La expresión de C7 dependiente del número de copias integradas de las células GM-HDF se confirmó mediante tinción de inmunofluorescencia, citometría de flujo y ELISA. Se logró una mejora de >200 veces en la expresión de C7 en relación con los resultados de TR8 presentados en la presentación IND 16582 Serie 0000.
Se confirmó que la estructura del C7 expresado por las células GM-HDF era predominantemente trimérica por inmunoprecipitación/SDS-PAGE/análisis de inmunotransferencia.
Además, se confirmó que el C7 producido de las células GM-HDF era funcional con la unión a Laminina-332 in v itro y por la corrección del fenotipo de hipermotilidad de las células RDEB de control en un ensayo de migración in vitro Apéndice 4
COL7Al ATGACGCTGCGGCTTCTGGTGGCCGCGCTCTGCGCCGGGATCCTGGCAGAGGCGCCCCGA 60
ATGACGCTGCGGCTTCTGGTGGCCGCGCTCTGCGCCGGGATCCTGGCAGAGGCGCCCCGA 60 . - A A A A A a A A A A a- AA k - A A A A A A A A A A A - A A A A A A A A A k - * A A A A A A A A A A COL7Al GTGCGA.GCCCAGCACAGGGAGA.GAGTGACCTGCACGCGCCTTTACGCCGCTGACATTGTG 12 0 G e n b a n k GTGCGAGCCCAGCACAGGGAGAGAGTGACCTGCACGCGCCTTTACGCCGCTGACATTGTG 120
A A- A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A - A A A A A A A A A A ■ ■' ■ ir A A A A A A COL7Ai TTCTTACTGGATGGCTCCTCATCCATTGGCCGCAGCAATTTCCGCGAGGTCCGCAGCTT? 180 G e n b a n k TTCTTACTGGATGGCTCCTCATCCATTGGCCGCAGCAATTTCCGCGAGGTCCGCAGCTTT 18 0 kkkkkkkkkky rkkkkkkkkkkkk"? rkkkkkkkkkkkk l 'rkkkkkkkkkkkk COL7Al CTCGAAGGGCTGGTGCTGCCTTTCTCTGGAGCAGCCAGTGCACAGGGTGTGCGCTTTGCC 240 G e n b a n k CTCGAAGGGCTGGTGCTGCCTTTCTCTGGAGCAGCCAGTGCACAGGGTGTGCGCTTTGCC 240
A A A A A A A A A A ) k A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A COL7Al ACAGTGGAGTAGAGCGATGACCGACGGACAGAGTTCGGGCTGGATGCACTTGGCTCTGGG 300 G e n b a n k ACAGTGCAGTACAGCGATGACCCACGGACAGAGTT CGGC CT GGAT GCACTT GGCT CT GGG 300
. - A A A A A A A A A A a AA k - A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A k A A A A A A A A A A A 70L7Al GGTGATGTGATCCGCGCCATCCGTGAGCTTAGCTACAAGGGGGGCAACACTCGCACAGGG 360 Jenbank GGTGA.TGTGA.TCCGCGCCATCCGTGA.GCTTAGCTACAAGGGGGGCAACACTCGCACAGGG 360
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A k A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A COL7Al GCTGCAATTCTCCATGTGGGTGACCATGTCTTCCTGCCCCAGCTGGGCCGACCTGGTGTC 42 0 G e n b a n k GCTGCAATTCTCCATGTGGCTGACCATGTCTTCCTGCCCCAGCTGGCCCGACCTGGTGTC 42 0 kkkkkkkkkk i rkkkkkkkkkkkk i rkkkkkkkkkkkk l 'rkkkkkkkkkkkk COL7Al CCCAAGGTCTGCATCCTGATCACAGACGGGAAGTCCCAGGA.CCTGGTGGACACAGCTGCC 480 G e n b a n k CCCAAGGTCTGCA.TCCTGATCACAGACGGGAAGTCCCAGGACCTGGTGGACACAGCTGCC 480
A A A A A A A A A A ) k A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A k COL7Al CAAAGGGTGAAGGGGCAGGGGGTCAAGGTATTTGCTGTGGGGATCAAGAATGCTGACCCT 540 G e n b a n k CAAAGGCTGAAGGGGCAGGGGGTCAAGCTATTTGCTGTGGGGñ.TCAAGAATGCTGACCCT 540 a A A A A a a A A A A A A A A A a A A A A a a A A A A A A A A A a a A A A A A A A A A a A A A A a a A A A A A A A A A a COL7Al GAGGAGCTGAAGCGAGTTGCCTCACAGCCCACCAGTGACTTCTTCTTCTTCGTCAATGAC 60 0 G e n b a n k GAGGAGCTGAAGCGAGTTGCCTCACAGCCCACCAGTGACTTCTTCTTCTTCGTCAATGAC 60 0
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A k A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A COL7Al TTCAGCATCTTGAGGACACTACTGCCCCTCGTTTCCCGGAGAGTGTGCACGACTGCTGGT 660 G e n b a n k TTCAGCATCTTGAGGACACTACTGCCCCTCGTTTCCCGGAGAGTGTGCACGACTGCTGGT 660
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A COL7A.i GGCGTGCCTGTGA.CCCGA.CCTCCGGA.TGA.CTCGACCTCTGCTCCA.CGAGACCTGGTGCTG 120 G e n b a n k GGCGTGCCTGTGACCCGA.CCTCCGGA.TGACTCGACCTCTGCTCCA.CGA.GACCTGGTGCTG 720 k -y -y k k k k -y k i k -y -y k k k k -y k i COL7Al TCTGAGCCAAGCAGCCAATCCTTGAGAGTACAGTGGACAGCGGCCAGTGGCCCTGTGACT 780 G e n b a n k TCTGAGCCAAGCAGCCAATCCTTGAGAGTACAGTGGACAGCGGCCAGTGGCCCTGTGACT 780
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A COL7Al GGCTA.CAAGGTCCAGTACACTCCTCTGACGGGGCTGGGACAGCCA.CTGCCGAGTGAGCGG 84 0 G e n b a n k GGCTACAAGGTCCAGTACACTCCTCTGACGGGGCTGGGACAGCCACTGCCGAGTGAGCGG 840 k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k COL7Al CAGGAGGTGAACGTCCCAGCTGGTGAGACCAGTGTGCGGCTGCGGGGTCTCCGGCCACTG 300 G e n b a n k CAGGAGGTGAACGTCCCAGCTGGTGAGACCAGTGTGCGGCTGCGGGGTCTCCGGCCACTG 900
A A A A' A A A A A A A A A A A' A A A A A' A A A A A A A A A A A' A A A A A A A A A A A' A A A A H A A A A A A A A A A' A A COL7Al ACCGAGTACCAAGTGACTGTGATTGCCCTCTACGCCAAGAGCATCGGGGAGGCTGTGAGC 960 Genbank ACCGAGTACCAAGTGACTGTGATTGCCCTCTACGCCAACAGCATCGGGGAGGCTGTGAGC 360 vkkkkkkkkkkkk? rkkkkkkkkkkkkkkkkkkk? rkkkkkkkkkk
COL 7 PCI GGGACAGCTCGGACCACTGCCCTAGAAGGGCCGGAACTGACCATCCAGAATACCACAGCC 102 0 G e n b a n k GGGACAGCTCGGACCACTGCCCTAGAAGGGCCGGAACTGACCATCCAGAATACCACAGCC 1020
* A- A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A
COL 7A i CACAGCCTCCTGGTGGCCTGGCGGAGTGTGCCAGGTGCCACTGGCTACCGTGTGACATGG 1080 G e n b a n k CACAGCCTCCTGGTGGCCTGGCGGAGTGTGCCAGGTGCCACTGGCTACCGTGTGACATGG 1080
A A A A A A A A a A A A A a a A A A A A A A A A a A A A A a a A A A A a A A A A a a A A A A A A A A A a A A A A a a A A
COL 7A l CGGGTCCTCAGTGGTGGGCCCACACAGCAGCAGGAGCTGGGCCCTGGGCAGGGTTCAGTG 1140 G e n b a n k CGGGTCCTCAGTGGTGGGCCCACACAGCAGCAGGAGCTGGGCCCTGGGCAGGGTTCAGTG 1140
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A a ■ - A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A
COL 7A l TTGCTGCGTGACTTGGAGCCTGGCACGGACTATGAGGTGACCGTGAGCAGCCTATTTGGC 1200 G e n b a n k TTGCTGCGTGACTTGGAGCCTGGCACGGACTATGAGGTGACCGTGAGCACCCTATTTGGC 1200 a A A A A a a A A A A A A A A A a A A A A a a A A A A A A A A A a a A A A A A A A A A a A A A A a a A A A A A A A A A a
COL 7A l CGCAGTGTGGGGCCCGCCACTTCCCTGATGGCTCGCACTGACGCTTCTGTTGAGCAGACC 1260 G e n b a n k CGCAGTGTGGGGCCCGCCACTTCCCTGATGGCTCGCACTGACGCTTCTGTTGAGCAGACC 1260
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A
COL 7A l CTGCGCCCGGTCATCCTGGGCCCCACATCCATCCTCCTTTCCTGGAACTTGGTGCCTGAG 1320 G e n b a n k CTGCGCCCGGTCATCCTGGGCCCCACATCCATCCTCCTTTCCTGGAACTTGGTGCCTGAG 1320
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A
COL 7A. i GCCCGTGGCTACCGGTTGGAA.TGGCGGCGTGAGACTGGCTTGGAGCCACCGCAGAA.GGTG 1380 G e n b a n k GCCCGTGGCTACCGGTTGGAATGGCGGCGTGAGACTGGCTTGGAGCCA.CCGCA.GAAGGTG 13 80
A A A A A A A A A A A A A A A 6 A -y A A A A A A A v
COL 7A l GTACTGCCCTCTGATGTGACCCGCTACCAGTTGGATGGGCTGCAGCCGGGCACTGAGTAC 1440 G e n b a n k GTACTGCCCTCTGATGTGACCCGCTACCAGTTGGATGGGCTGCAGCCGGGCACTGAGTAC 1440
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A
COL 7 PCI CGCCTCACACTCTACACTCTGCTGGA.GGGCCACGAGGTGGCCACCCCTGCAACCGTGGT! 1500 G e n b a n k CGCCTCACACTCTACACTCTGCTGGAGGGCCACGAGGTGGCCACCCCTGCAACCGTGGTT 1500 c A A A- -A- A k -y k i - A A A A A A A
COL 7A l CCCACTGGACCAGAGCTGCCTGTGAGCCCTGTAACAGACCTGCAAGCCACCGAGCTGCCC 1560 G e n b a n k CCCACTGGACCAGAGCTGCCTGTGAGCCCTGTAACAGACCTGCAAGCCACCGAGCTGCCC 1560
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A
COL7AI. GGGCAGCGGGTGCGAGTGTCCTGGAGCCCAGTCCCTGGTGCCACCCAGTACCGCATCATT 1620 G e n b a n k GGGCA.GCGGGTGCGAGTGTCCTGGAGCCCAGTCCCTGGTGCCACCCAGTACCGCATCATT 1620
A A A A A A A A A A A A A A A 6 A -A- A- -A- A A A A A •>
COL 73U GTGCGCAGCACCCAGGGGGTTGAGCGGACCCTGGTGCTTCCTGGGAGTCAGACAGCATTC 1680 G e n b a n k GTGCGCAGCACCCAGGGGGTTGAGCGGACCCTGGTGCTTCCTGGGAGTCAGACAGCATTC 1680
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A
COL 7 PCI GA.CTTGGATGACGTTCAGGCTGGGCTTAGCTACACTGTGCGGGTGTCTGCTCGAGTGGGT 1740 G e n b a n k GACTTGGATGACGTTCAGGCTGGGCTTAGCTACACTGTGCGGGTGTGTGCTCGAGTGGGT 1740
■A- A- -A- A A A- A -A- -A- A A -*• A- A A A -A- A -A- -A- A -A- A -A- -A- A A A A -A- ve A A- -A- -A- A A A A A A A -A- A A A A -A- A A A A A A A A A A A
COL 7A l CCCCGTGAGGGCAGTGCCAGTGTCCTCACTGTCCGCCGGGAGCCGGAAACTCCACTTGCT 1800 G e n b a n k CCCCGTGAGGGCAGTGCCAGTGTCCTCACTGTCCGCCGGGA.GCCGGAAACTCCACTTGCT 1800
■k k k k k k k k k k k k k k kk k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k kk k k k k k k k k k k k k k k k k k
COL 7A.1 GTTCCAGGGCTGCGGGTTGTGGTGTCAGATGCAACGCGAGTGAGGGTGGCCTGGGGACCC 1860 G e n b a n k GTTCCAGGGCTGCGGGTTGTGGTGTCAGATGCAACGCGAGTGAGGGTGGCCTGGGGACCC 1860
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A COL7Al GTCC.CTGGAGCCAGTGGATTTCGGATTAGCTGGAGCACAGGCAGTGGTCCGGAGTCCAGC 1920 Genbank GTCCCTGGAGCCAGTGGATTTCGGATTAGCTGGAGCACAGGCAGTGGTCCGGAGTCCAGC 1920
* A- A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A J - A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A COL7Al CAGACACTGCCCCCAGACTCTACTGCCACAGACATCACAGGGCTGCAGCCTGGAACCACC 1980 G e n b a n k CAGACACTGCCCCCAGACTCTACTGCCACAGACATCACAGGGCTGCAGCCTGGAACCACC 19 80
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COL7Al TACCAGGTGGCTGTGTCGGTACTGCGAGGCAGAGAGGAGGGCCCTGCTGCAGTCATCGTG 2040 G e n b a n k TACCAGGTGGCTGTGTCGGTACTGCGAGGCAGAGAGGAGGGCCCTGCTGCAGTCATCGTG 204 0 ir A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A J ir A A A A A A A A A A A A A ■,
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GCTCGAACGGACCCACTGGGCCCAGTGAGGACGGTCCATGTGACTCAGGCCAGCAGCTCA 2100
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GCTGGAACGGACCCACTGGGCCCAGTGAGGACGGTCCATGTGACTCAGGCCAGCAGCTCA 2100
' * ' k k k k ' * ' ‘+ r k k k k ‘+ r k k k k ' * - k k k k ' * ' ‘+ r k k k k ‘+ r k k k k ' * ' ‘+ r k k k k ‘+ r k k k k ' * - k k k k ' * ' ‘+ r k k k k ‘+ r k k k k ' * -COL7Al t c t g t c a c c a t t a c c t g g a a .c:a g g g t t c c t g g c g c c a c a g g a t a c a ,g g g t t t c :c t g g c .a c 2160 G e n b a n k TCTGTCACCATTACCTGGACCAGGGTTCCTGGCGCCACAGGATACAGGGTTTCCTGGCAC 2160
A A- A A- A A A A A A A A A- A A A A A A A A A A A A A A A A- A A A A A J r A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A COL7Ai TCAGCCCACGGCCCAGAGAAATCCCAGTTGGTTTCTGGGGAGGCCAGGGTGGCTGAGGTG 2220 G e n b a n k t c a g c c g a c g g g c c a g a g a a a t g c c a g t t g g t t t c t g g g g a g g c c a c g g t g g c t g a g c t g 2220 kkkkkkkkkk- j ' r k kk kk kk kk kk kl It A A A a A A A A a a A A COL7Al GATGGACTGGAGCCAGATACTGAGTATACGGTGCATGTGAGGGCCCATGTGGCTGGCGTG 2280 G e n b a n k GATGGACTGGAGCCAGATACTGAGTATACGGTGCATGTGAGGGCCCATGTGGCTGGCGTG 2280
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A COL7Al GATGGGGCCCCTGCCTCTGTGGTTGTGAGGACTGCCCCTGAGCCTGTGGGTCGTGTGTCG 2340 G e n b a n k GATGGGCCCCCTGCCTCTGTGGTTGTGAGGACTGCCCCTGAGCCTGTGGGTCGTGTGTCG 2340 a A A A A a a A A A A A A A A A a A A A A a a A A A A A A A A A a a A A A A A A A A A a A A A A a a A A A A A A A A A a COL7Al AGGCTGCAGATCCTCAATGCTTCCAGCGACGTTCTACGGATCACCTGGGTAGGGGTCACT 2400 G e n b a n k AGGCTGCAGATCCTCAATGCTTCCAGCGACGTTCTACGGATCACCTGGGTAGGGGTCACT 2400
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A COL7Al GGAGCCACAGCTTACAGACTGGCCTGGGGCGGGAGTGAAGGGGGCCGCATGAGGCACCAG 2460 G e n b a n k GGAGCCACAGCTTACAGACTGGCCTGGGGCCGGAGTGAAGGCGGCCCCATGAGGCACCAG 2460 kkkkkkkkkk- j ' r k kk kk kk kk kk kl It A A A a A A A A a a A A COL7Al ATACTCCCAGGAAACACAGACTCTGCAGAGATCCGGGGTCTCGAAGGTGGAGTCAGCTA.C 2520 G e n b a n k ATACTCCCAGGAAACACA.GACTCTGCAGA.GATCCGGGGTCTCGAA.GGTGGAGTCAGCTAC 2520 r A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A rJ r A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A COL7Al TCAGTGGGAGTGACTGCACTTGTCGGGGACCGCGAGGGGACACCTGTCTGCATTGTTGTC 2580 G e n b a n k TCAGTGCGAGTGACTGCACTTGTCGGGGACCGCGAGGGCACACCTGTCTCCATTGTTGTC 2580 a A A A A a a A A A A A A A A A a A A A A a a A A A A A A A A A a a A A A A A A A A A a A A A A a a A A A A A A A A A a COL7Al ACTACGCCGCCTGAGGCTCCGCCAGCCCTGGGGACGCTTCACGTGGTGCAGCGCGGGGAG 2640 G e n b a n k ACTACGCCGCCTGAGGCTCCGCCAGCCCTGGGGACGCTTCACGTGGTGCAGCGCGGGGAG 2640
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A COL7Al CACTCGCTGAGGCTGCGCTGGGAGCCGGTGCCCAGAGCGCAGGGCTTCCTTCTGCACTGG 2700 G e n b a n k CACTCGCTGAGGCTGCGCTGGGAGCCGGTGCCCAGAGCGCAGGGCTTCCTTCTGCACTGG 2700
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A COL7A.i CAACCTGA.GGGTGGCCAGGAA.CAGTCCCGGGTCCTGGGGCCCGAGCTCAGCAGCTATCAC 27 60 G e n b a n k CAACCTGAGGGTGGCCAGGAACAGTCCCGGGTCCTGGGGCCCGAGCTCAGCAGCTA.TCAC 27 60
■k -k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k COL7Al CTGGACGGGCTGGAGCCAGCGACACAGTACCGCGTGAGGCTG/kGTGTCCTAGGGCCiGCT 2820 G e n b a n k CTGGACGGGCTGGAGCCAGCGACACAGTACCGCGTGAGGCTGAGTGTCCTAGGGCC1|GCT 2820
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COL7Al CCCGCTGGGCCCAGAGGAGCTACCGGAGTCCAAGGGGAACGGGGCCCACCCGGCTTGGTT 47 4 O Genbank CCCGCTGGGCCCAGAGGAGCTACCGGAGTCCAAGGGGAACGGGGCCCACCCGGCTTGGTT 474 O * A- A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A COL7Al CTTCCTGGAGACCCTGGCCCCAAGGGAGACCCTGGAGACCGGGGTCCCA'TTGGCCTTAC? 4800 G e n b a n k CTTCCTGGAGACCCTGGCCCCAAGGGAGACCCTGGAGACCGGGGTCCCATTGGCCTTACT 4800
A A A A A A A A a A A A A a a A A A A A A A A A a A A A A a a A A A A a A A A A a a A A A A A A A A A a A A A A a a A A COL7Al GGCAGAGCAGGACCCCCAGGTGACTCAGGGCCTCCTGGAGA.GAAGGGAGACCCTGGGCGG 4860 G e n b a n k GGCAGAGCAGGACCCCCAGGTGACTCAGGGCCTCCTGGAGAGAAGGGAGACCCTGGGCGG 4860
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A COL7Al CCTGGCCCCCCAGGACCTGTTGGCCCCCGAGGACGAGATGGTGAAGTTGGAGAGAAAGGT 4920
CCTGGCCCCCCAGGACCTGTTGGCCCCCGAGGACGAGATGGTGAAGTTGGAGAGAAAGG? 4920 a A A A A a a A A A A A A A A A a A A A A a a A A A A A A A A A a a A A A A A A A A A a A A A A a a A A A A A A A A A a COL7Al GACGAGGGTCCTCCGGGTGACCCGGGTTTGCCTGGAAAAGCAGGCGAGCGTGGCCTTCGG 4980 G e n b a n k GACGAGGGTCCTCCGGGTGACCCGGGTTTGCCTGGAAAAGCAGGCGAGCGTGGCCTTCGG 498 O A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A COL7Ai GGGGCACCTGGAGTTCGGGGGCCTGTGGGTGAAAAGGGAGACCAGGGAGATCCTGGAGAG 5040 G e n b a n k GGGGCACCTGGAGTTCGGGGGCCTGTGGGTGAAAAGGGAGACCAGGGAGATCCTGGAGAG 5040
A A A A A A A A a A A A A a a A A A A A A A A A a A A A A a a A A A A a A A A A a a A A A A A A A A A a A A A A a a A A COL7Al GATGGACGAAATGGCAGCCCTGGATCATCTGGACCCAAGGGTGACCGTGGGGAGCCGGGT 5100 G e n b a n k GA.TGGACGAAATGGCAGCCCTGGATCATCTGGACCCAAGGGTGACCGTGGGGAGCCGGGT 5100
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A COL7Al CCCCCAGGACCCCCGGGACGGCTGGTAGACACAGGACCTGGAGCCAGAGAGAAGGGAGAG 5160 G e n b a n k CCCCCAGGACCCCCGGGACGGCTGGTAGACACAGGACCTGGAGCCAGAGAGAAGGGAGAG 5160 a A A A A a a A A A A A A A A A a A A A A a a A A A A A A A A A a a A A A A A A A A A a A A A A a a A A A A A A A A A a
Figure imgf000065_0001
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Figure imgf000066_0012
Figure imgf000066_0013
Figure imgf000066_0014
COL7Al GGTCATGGAGACCCTGGACCACCTGGTGCCC.CGGGTCTTGCTGGCCCTGCAGGACCCC.Afi 6600 Genbank GGTCATGGAGACCCTGGACCACCTGGTGCCCCGGGTCTTGCTGGCCCTGCAGGACCCCAA 6600 i A- ■> > ■' '■ A- -A A A A- A- A A A A A- A- A A A A- A A A A A A A A A A A t r A- A- k A Ar A .J
COL7Al GGACCTTCTGGCCTGAAGGGGGAGCCTGGAGAGACAGGACCTCCAGGACGGGGCCTGACT 6660 G e n b a n k GGACCTTCTGGGCTGAAGGGGGAGCCTGGAGAGACAGGACCTCCAGGACGGGGCGTGACT 6660 COL7Al GGACCTACTGGAGCTGTGGGACTTCCTGGACCCCCCGGCCCTTCAGGCCTTGTGGGTCCA 6720 G e n b a n k GGACCTACTGGAGCTGTGGGACTTCCTGGACCCCCCGGCCCTTCAGGCCTTGTGGGTCCA 6720 i A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A ) i A A A A A A A A i A A A A A A A A A A A A A ■, COL7Al CAGGGGTCTCCAGGTTTGCCTGGACAAGTGGGGGAGACAGGGAAGCCGGGAGCCCCAGGT 6780 G e n b a n k CAGGGGTCTCCAGGTTTGCCTGGACAAGTGGGGGAGACAGGGAAGCCGGGAGCCCCAGGT 6780 a A A A A a a A A A A A A A A A a A A A A a a A A A A A A A A A a a A A A A A A A A A a A A A A a a A A A A A A A A A a COL7Al CGA.GATGGTGCCAGTGGAA.AAGATGGAGACAGAGGGAGCCCTGGTGTGCCAJGGGTCAA.CA 68 40 G e n b a n k CGAGATGGTGCCAGTGGAAAAGATGGAJGACAGAJGGGAGCCCTGGTGTGCCAGGGTCACCA. 68 40 r A- k ■k k. k k k k k. k k k k k k k k k k k.7 <■ k k k k k k k k k k k i
COL7Al GGTCTGCCTGGCCCTGTCGGACCTAAAGGAGAACCTGGCCCCACGGGGGCCCCTGGACAG 69 00 G e n b a n k GGTCTGCCTGGCCCTGTCGGACCTAAAGGAGAACCTGGCCCCACGGGGGCCCCTGGACAG 6900 COL7Al GCTGTGGTCGGGCTCCCTGGAGCAAAGGGAGAGAAGGGAGCCCCTGGAGGCCTTGCTGGA. 6960 G e n b a n k GCTGTGGTCGGGCTCCCTGGAGCAAAGGGAGAGAAGGGAGCCCCTGGAGGCCTTGCTGGA 6960
A ■> > > A . i j - n . ■> A í. ■■ A- A ■> í. > A- -A A A A- A- -A -A A A A- A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A COL7Al GACCTGGTGGGTGAGCCGGGAGCCAAAGGTGACCGAGGACTGCCAGGGCCGCGAGGCGAG 7020 G e n b a n k GACCTGGTGGGTGAGCCGGGAGCCAAAGGTGACCGAGGACTGCCAGGGCCGCGAGGCGAG 7020 a A A A A a a A A A A A A A A A a A A A A a a A A A A A A A A A a a A A A A A A A A A a A A A A a a A A A A A A A A A a AAJGGGTGAAGCTGGCCGTGCAGGGGAGCCCGGAGAJCCCTGGGGAAGATGGTCAGAAAGGG 708 o
Figure imgf000067_0001
AAGGGTGAAGCTGGCCGTGCAGGGGAGCCCGGAGACCCTGGGGAAGATGGVrCAGAAAGGG 7080
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A COL7Ai GCTCCAGGACCCAAAGGTTTCAAGGGTGACCCAGGAGTCGGGGTCCCGGGCTCCCCTGGG 7140 G e n b a n k GCTCCAGGACCC.AAAGGTTTCAAGGGTGACCCAGGAGTCGGGGTCCCGGGCTCCCCTGGG 7140 COL7Al CCTCCTGGCCCTCCAGGTGTGAAGGGAGATCTGGGCCTCCCTGGCCTGCCCGGTGCTCCT 7200 Genbank CCTCCTGGCCCTCCAGGTGTGAAGGGAGATCTGGGCCTCCCTGGCCTGCCCGGTGCTCC! 7200
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A COL7Al GGTGTTGTTGGGTTCCCGGGTCAGACAGGCCCTCGAGGAGAGATGGGTCAGCCAGGCCCT 72 60 G e n b a n k GGTGTTGTTGGGTTCCCGGGTCAGACAGGCCCTCGAGGAGAGATGGGTCAGCCAGGCCCT 72 60 í A A A A A A A A a í A A a a A A A
COL7Al AGTGGA.GAGCGGGGTCTGGCAGGCCCCCCAGGGAGAGAAGGAATCCCAGGACCCCTGGGG 732 O G e n b a n k AGTGGAGAGCGGGGTCTGGCAGGCCCCCCAGGGAGAGAAGGAATCCCAGGACCCCTGGGG 7320
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A COL7Al CCACCTGGACCACCGGGGTCAGTGGGACCACCTGGGGCCTCTGGACTCAAAGGAGACAAG 7380 G e n b a n k CCACCTGGACCACCGGGGTCAGTGGGACCACCTGGGGCCTCTGGA.CTCAAAGGAGACAAG 7380
■ A A A A A A A A A A A A .i - A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A i COL7A.i GGAGACCCTGGAGTAGGGCTGCCTGGGCCCCGAGGCGAGCGTGGGGAGCCAGGCATCCGG 7440 G e n b a n k GGAGACCCTGGAGTAGGGCTGCCTGGGCCCCGAGGCGAGCGTGGGGAGCCAGGCATCCGG 7440 COL7Al GGTGAAGATGGCCGCCCCGGCCAGGAGGGACCCCGAGGACTCACGGGGCCCCCTGGCAGC 7500 G e n b a n k GGTGAAGATGGCCGOCCCGGCCAGGAGGGAOCCCGAGGACTOACGGGGCCCCCTGGCAGC 7500
Figure imgf000068_0001
Figure imgf000068_0002
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 G en ban k CACTGTGCCTGCCAGGGCCAGTTCATCGCATCTGGATCACGACCCCTCCCTAGTTATGCT 3460 ■k -k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k COL7Al GCAGACACTGCCGGCTCCCAGCTCCATGCTGTGCCTGTGCTCCGCGTCTCTCATGCAGAG 8520 G e n b a n k GCAGACACTGCCGGCTCCCAGCTCCATGCTGTGCCTGTGCTCCGCGTCTCTCATGCAGAG 8520
A ■> ■> i- 1- a- ‘ -> A 1- A- A A A A A- A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A COL7Al GAGGAAGAGCGGGTACCCCCTGAGGATGA.TGAGTACTCTGAATACTCCGAGTATTCTGTG 35 80 G e n b a n k GA.GGAAGAGCGGGTACCCCCTGAGGA.TGATGAGTACTCTGAATACTCCGAGTATTCTGTG 85 80 k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k COL7Al GAGGAGTACCAGGACCCTGAAGCTCCTTGGGATAGTGATGACCCCTGTTCCCTGCCACTG 8640 G e n b a n k GAGGAGTACCAGGACCCTGAAGCTCCTTGGGATAGTGATGACCCCTGTTCCCTGCCACTG 8640
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A
Figure imgf000069_0001
Figure imgf000069_0002
Figure imgf000069_0003
COL7Al AC T G CC CAGGAC 8832 ( SEQ I D NO 23 )
G e n b a n k ACTGCCCAGGAC 8832 ( SEQ I D NO 24 )
A A A A A A A A A A A A
Lo siguiente es un análisis comparativo de la SECUENCIA 60010743-ITX-00001_CONTIG (SEQ ID NO: 34) en relación con la SECUENCIA REF IGE308 (SEQ ID NO: 34).
Figure imgf000070_0001
Figure imgf000071_0001
Figure imgf000072_0001
Figure imgf000073_0001
60:010743-IIX-OO 00 l_Análisis_Comparativc>
60010743-1TX Final.SPF
IGE30S SecuenciaRef 2561 3TTTATTACA GGGACA3CAG A3ATCCAGTT TGGTCAATTA AGCA7TAGTT ATTAATAGTA ATCAATTACG GGGTCATTAG
+2561 G7T TAITACA GGGACAGCAG AGATCCAGTI TGGTCAAITA AGCATTAGTT ATTAATAGTA ATCAATTACG GGGTCATTAG
IGE3C&_SecuencraRef 2641 T7CATAGCCC ATATATGGAG TTCCGCGTTA CATAACTTAC GGCAAATGGC CCGGCT5GTT GACCGCCCAA CGACCCCCGC 60 O lC 'J í3-I7X -0000 l_C or.tig - 2641 I7CATAGCCE ATATATGGAG TTCCGCGTTA CATAACT1AC GGTAAATGGC CCGCCTGGTT GACCGCCCAA CGACCCCCGC * 2641 T7CATACCCC ATATATGGAG TTCCGCGTTA CATAACTTAC CGTAAATCGC CCCCCTGCTT GACCGCCCAA CGACCCCCGC
IGE3C 8_SecuenciaRef *2721 CCATTGACGT CAATAATGAC GTATGTTCCC ATAGCAACGC CAATAGGGAC TTTCCATTGA C3TCAATGGG TGGAGTATTT 6QQ10743-ICX-DDÜÜ1 C ontig *2721 CCATTGACGT CAATAATGAC GTATGTTCCC ATAGCAACGC CAATAGGGAC TTTCCATTGA C3TCAATGGG TGGAGTATTT * 2721 CCATTGACGT CAATAATGAC GTATGTTCCC ATAGTAACGC CAATAGGGAC TTTCCATTGA C3TCAATGGG TGGAGTATTT
IGE3C &_SecuendaRef * 28 d ACGGTAAACT GCCCACTTGG TAGTACATCA AGTGTATCAT ACGCCAAGTA CGCCCCCTAT T3ACGTCAAT GACGGTAAAT 6OO1O743-ITX-0DOQ1 Contig- *2801 ACGGTAAACT GCCCACTTGG TAGTACATCA AGTGTATCAT ACGCCAAGTA CGCCCCCTAT T3ACGTCAAT GACGGTAAAT 2ÜU1 ACGGTAAACT GCCCACTTGG TAGTACATCA AGTGTATCAT ACGCCAAGTA CGCCCCCTAT T3ACG1CAAT GACGGTAAAT
IGE3C 8_SecuenciaRef *2881 g g c c c g c e t s g t a t t a t g c c c a g t a c a t g a c c t t a t g g g a c t c t c c t a c i t g c e a g ia c a t c t g c g t a t t a g t c a t c g c t 60010743-IT3t-00001_C ontig- *2881 GGCCCGCCTS g t a t t a t g c c c a g t a c a t g a c c t t a ig g g a c t t t c c t a c i t g g c a g ia c a t c t g c g t a t t a g t c a t c g c t 2881 GGCCCGCCTG GTATTATGCC CAGTACATGA CCT TAIGGGA CTTTCCTACI TGG3AGTACA TCTGCGTATT AGTCATCGCT
!GE3C8_SecuenciaRef t2961 A7TACCATG3 TCATGCGG7T TTGGCAGTAC ATCAATCCCC GTGGATAGCG GTTTGACTCA C3GGGATTTC CAAGTCTCCA 60010743 -IT X -00001 C ontig *2961 A7TACCATG3 TGATGCGG7T TTGGCAGTAC A7CAATGGGC GTGGA7AGCS GTTTGACTCA C3GGGATTTC CAAGTCTCCA *2961 A7TACCATGG TGATGCGG7T TTGGCAGTAC ATCAATGGGC GTGGATAGCS GTTTGACTCA C3GGGATTTC CAAGTCTCCA
iGE3Q8_SeeuenciaRef 3041 CCCCATTGAC GTCAATGGGA GTITGT7TTG GCACCAAAAT CAACGGGACI TTCCAAAATG TCGTAACAAC TCCGCCCCAT 60010743-l7X-(JCl001_Cpntig *3041 CCCCATTGAC GTCAATGGGA GTTTGTTTTG GCACCAAAAT CAACGGGACI TTCCAAAATG TCGTAACAAC TCCGCCCCAT 3041 CCCCATTGAC GTCAATGGGA GTTTGTTTTG GCACCAAAAT CAACGGGACT TTCCAAAATG TCGTAACAAC TCCGCCCCAT
iGE308_SecuenciaRe1 *3121 IGACGCAAAI GGGCBGTAGG CGTGTACGGr GGGAGGTCT& TACAAGCAGA GCTGGTTTAG T3AACCGTCA GATCCGCTAG 6O O 10743-i7X -0000 l_C pntig *3121 TGACGCAAAT GGGCGGTAGG CGTQTACGGT GGGAGGTCTA TACAAGCAGA GCTGGTTTAG T3AACCGTCA GATCCGCTAG *3121 TGACGCAAAT GGGCGGTAGG CGTGTACGGT GGGAGGTCTA TACAAGCAGA GCTGGTTTAG T3AACCGTCA GATCCGCTAG
Figure imgf000075_0001
Figure imgf000076_0001
60010743-.TX-000 01_Análi sis_Comparativo
60010743-1TX Final.SPF
KiEOOO_SecuenciaRef #4¡,B1 A'XGTGCGCC CG3TCAT GCT G JG G C C CfiGA TCGATCCTCC GTTGCTGGRA CTTGGTGGCC GAGGCCCi- TG G IT TACGG3TT íD0l0743-ITS-3OC3l_Cg>j.»ig #4481 ACCCTGCGCC CG3TCAT CCT G 3C-CCCCACA TCCA7CCTCC CTTCCTGGAA CT TGGTGCCT GAGGCCCGTG GCTACCGGT7
#4481 ACCCTSCGCC CGGTCATCCT GSGCCCCACA TCCA7CCTCC TTTCCTGGAA CTTGGTGCCT GAGGCCCGPG GCTACCGGTT
ig e 3 o 8_SecuenciaRef #4361 GGAATGGCGG CGZGAGACTG GCTIGGAGGC ACCGGAGAAG GTGGTACTGC CCTCTGATGT GACGCGCTAC CAGTTGGATG 6OO10743-ITX-OOOQl_Cantig #4361 GGAATGGCGG CGTGAGACTG GCTTGGAGCC ACCGGAGAAG GTGGTACTGC CCTCTGATGT GACGCGCTAC CAGTTGGATG #4361 GGAATGGCGG CGTGAGACTG GCTTGGAGCC ACCGGAGAAG GTGGTACTGC CCTCTGATGT GACGCGCTAC CAGTTGGATG
iGE3oe_SecuenciaRef #4341 GGCTGCAGCC GGGCACTGAG TACCGCCTCA CACTCTACAC TCTGCTGGAG GGCCACGAGG TGGCCACCCC TGCAACCGT3 6 Q 01Q 743 - IT X -£> DQ 0 l_Cont±g #4541 GGCTGCAGCC GGGCACTGAG TACCGCCTCA CACTCTACAC TCTGCTGGAG GGCCACGAGG TGGCCACCCC TGCAACCGTG #4541 GGCTGCAGCC GGGCACTGAG TACCGCCTCA CACTCTACAC TCTGC7GGAG GGCCACGAGG TGGCCACCCC TGCAACCGTG
ig e 30 B_SecuenciaRef #4721 GTTCCCACTG GACCAGAGCC GCCTGCGA3C CCIGCAACAG ACCTGCAAGC CACCGAGCTG CCCGGGCAGC GGGTGCGAGT 60010743 - IT X -0000l_ C o n tig #4721 GTTCCCACTG GACCAGAGCT GCCTGTGA3C CCTG7AACAG ACCTGCAAGC CACCGAGCTG CCCGGGCAGC GGGTGCGAGT #4721 GTTCCCACTG GACCAGAGCT GCCTGTGA3C CCTG^AACAG ACCTGCAAGC CACCGAGCTG CCCGGGCAGC GGGTGCGAGT
iGE308_SeaienciaRef #4301 GTCCTGGAGC CCAGTCCCTG GTGCCAQCCA GTACCGCATC ATTGTGCGCA GCACCCAGGG GGTTGAGCGG ACCCTGGTGC 60010743 - IT X -0000l_ C o n tig #4301 GTCCTGGAGC CCAGTCCCTG GIGCCACCCA GTACCGCATC ATTGTGCGCA GCACCCA3GG GGTTGAGCGG ACCCTGGTGC #4301 GTCCTGGAGC CCAGTCCCTG CrGCCACCCA GTACCGCATC ATTGTGCGCA GCACCCAGGG GGTTGAGCGG ACCCTGGTGC
IGE308_Secuenc¡aRef #4381 TTCCTGGG&G TCAGACAGCA TTCGACTTSG ATGACGTTCA GGCTGGGCTT AGCTACACTG TGCGGGTGTC TGCTCGAGTG 60010743 - IT X -0000l_ C o n tig #4381 TTCCTGGGAG TCAGACAGCA TTCGACTT3G ATGACGTTCA GGCTGGGCTT AGCTACACTG TGCGGGTGTC TGCTCGAGTG #43B1 TTCCTGGGAG TCAGACAGCA TTCGACTTGG ATGACGTTCA GGCTGGGCTT AGCTACACTG TGCGGGTGTC TGCTCGAGTG
ig e 306 SecuenciaRel #4061 GGTCCCCGTG AGGGCAGTGC CAGTGTCCTC ACTGTCCGCC GGGAGCCGGA AACTCCACTT GCTGTTCCAG GGCTGCGGGT 60010743 -1 T X -3000l_ C o n tig #4061 GGTCCCCGTG AGGGCAGTGC CAGTGTCCTC ACTGTCCGCC GGGAGCCGGA AACTCCACTT GCTGTTCCAG GGCTGCGGGT #4061 GGTCCCCGTG AGGGCAGTGC CAGTGTCCTC ACTG7CCGCC GGGAGCCGGA AACTCCACTT GCT GTTCCAG GGCTGCGGGT
j f í l ig e 3 o 8_SecuenciaRef #5041 TGTGGTGTCA GATGCAACGC GAGTGAGGGT GGCCTGGGGA CCCGTCCCIG GAGCCAGTGG ATTTCGGATT AGCTGGAGCA
60010743-ITX -00001._£ #5041 7GTSGTBTCA GATGCAACGC GAGTGAGGGT GGCCTGGGGA CCCGTCCCTG GAGCCAGTGG ATTTCGGATT AGCTGGAGCA
#5041 TGTGGTGTCA GATGCrwiCGC GAGTGAGGGT GGCCTGGGGA CCCGTCCCTG GAGCCAGTGG ATTTCGGATT AGCTGGAGCA
Figure imgf000078_0001

60010743- I T X -00001 A n á l i s i s C o m p a r a t i v o
60010743- f T X _ F i n a l f s P F
i -E30 SSecuenciaRef #5761 ACTTCrCCC- CACCCCCAC 3 CCACACCTtT CTCCATTCTT CTCACTACCC CCCCTCACCC TCCCCCACCC CTCCCCAGCC SOÜL 0743 -1 TX-OC 301__Ccr.it i g #57é l ACTTGTCGGG GACCGCGAG3 GCACACCCGT CTCCATTGTT GTCACTACGC CGCCTGAGGC TCCGCCAGCC CTGGGGACGC #5761 ACTTGTCGC-G GACCGCGAGG GCACACCTGT CTCCATTGTT C-TCACTACGC CGCCTGAGGC TCCGCCAGCC CTGGGGACGC
i GE308 _ Secuencia Ref f 5841 TTCACGTGGT GCAGCGCGGG GAGCACTCGC T3AGGCTGC3 CTGGGAGCCG GTGCCCAGAG CGCAGGGCTT CCTTCTGCAC 6Q 010743-ITX-003Q 1._C (w tíg #5841 TTCACGTGGT GCAGCGCGGG GAGCACTCGC T3AGGCTGCS CTGGGAGCCG GTGCCCAGAG CGCAGGGCTT CCTTCTGCAC #=5841 TTCACGTGGT GCAGCGCGGG GAGCAC 7CC-C T3AGGCTGCS CTGGGAGCCG GTGCCCAGAG CGCAGGGCTT CCTTCTGCAC
i3E306_SecuenciaRe1 {=5921 TGGCAACCTG A3GGTGGCCA GGAACAGTCC CGGGTCCTGG GGCCCGAGCT CAGCAGCTAT CACCTGGACG GGCISGA5CC 60ai9743-ITX -C Q 3Q l_ c o n t ig {=5921 TGGCAACCTG AGGGTGCCCA GGAACAGTCC C3GSTCGTC3 GGCCCGAGCT CAGCAGCTAT CACCTCCACC GGCTCCAGCC #5921 TGGCAACCTG AGGGTGGCCA GGAAC AST'CC C3GGTCCCGG GGCCCGAGCT CAGCAGCTAT CACCTGGACG GGCTGGAGCC
IGE308_SecuenciaRef #6001 AGCGACACAG TACCGCGTGA GGCTGAGTGT CCTAGGGCCG GCTGGAGAAG GGCCCTCTGC AGAGGTGACT GCGCGCACTG 60010743-ITX -C 0301. Cofitig- #6001 AGCGACACAG TACCGCGTGA GSCCC-AGTC-T CCTAGG3CC3 GCTGGAGAAG GGCCCTCTGC AGAGGTGACT GCGCGCACTG #6001 AGCGACACAG TACCGCGTGA GGCTGAGTGT CCTAGGGCCG GCTGGAGAAG GGCCCTCTGC AGAGGTGACT GCGCGCACTG
i s e 3 oe _ SecuenciaRef #6081 AGTCACCTCG TG'ETCCAAGC AITGAACTAC GPGTGGTGGA CACCTCGATC GACTCGGTGA CTTTGGCCTG GACTCCAGTG 6QQ10743-ITX-GQ3Q1__Concig> #6081 AGTCACCTCG TG1ICCAAGC AITGAACTAC GTGTGC-TGGA CACCTCGATC GACTCGGTGA CTTTGGCCTG GACICCAGTG #6081 ACTCACCTCG T CITCCAACC AITCAACTAC c t c t c c rc c A CACCTCGATC CACTCCCTCA CTTTCCCCTC CACTCCACTC
i se308_secue neiaRef #6161 TCCAGGGCAT CCAGCTACAT CCTA1CCTGG C3GCCACTCA GAGGCCCTGG CCAGGAAGTS CCTGGGTCCC CGCASACACT 60010743 XTX C0001 Cent i g- #6161 TCCAGGGCAT CCAGCTACAT CCTATCCTGG C3GCCACCCA GAGGCCCTGG CCAGGAAGTG CCTGGGTCCC CGCAGACACT #6161 TCCAGGGCAT CCAGCTACAT CCTATCCTGG C3GCCACTCA GAGGCCCTGG CCAG3AAGTG CCTGGGTCCC CGCAGACACT
lOE306_Secuenci8Re1 #6241 TCCAGGGATC TCAAGCTCCC AGCGGGTCAC A3GGCTAGAG CCTGGCGTCT CTTACATCTT CTCCCTGACG CCTGTCCTGG
60010743-ITX-C0301_ #6241 TCCAGGGATC TCAAGCTCCC ASCGGGTGAC A3GGCTAGAG CCTGGCGTCT CTTACATCTT CTCCCTGACG CCTGTCCTGG
■c” l i í
#6241 TCCAGGGATC TCAAGCTCCC ASCGGGTGAC A3GGCTAGAG CCTGGCGTCT CTTACATCTT CTCCCTGACG CCTGTCCTGG
Figure imgf000079_0001
Figure imgf000080_0001
Figure imgf000081_0001
60010743-1TX-0000l__Análisis Comparativo
60010743-ÍTX FinalTSPF
:GE3;3_Secu»nciaRef +7S83 GÍCCCt GGGT SAGg CTGGa G ASAA&GGCGft ACGt GC-ACCC: CCAGGCtCAG CGGGATCCCG GGGGCTGCCA GgGGTTSCt G finn i : : ; ¿-.i—t t x - ntimi" c r . r - i g t 'fiti'l FCCCCTFKRT GAGRCTGKAG A " AAGRGCGA ACGTRF ACC C CCAGGCCEAG CRGGP.TCCCK GGGGCTGFCA fíKRRTTGCTF ¿=7681 GCCCCTGGGT GAGGCIGGAG A3AAGG3CGA ACGTGGACCC CCAGGCCCAG CG3GATCCCG GGGGCTGCCA GGGGTTGCTG
“GE 33 B_Secuencia Ref ¿=7751 GACGTCCTGG AGCCAAGGGT ECTGAAGGGC CACCAGGACC CACTGGCCGC CAAGGAGAGA AGGGGGAGCC TGGTCGCCCT 60C10743 - I T X - 0000 l_ C o n tig #7761 GACGTCCTGG AGCCAAGGST CCTSAAGGGC CACCAGGACC CACTGGCCGC CAAGGAGAGA AGGGGGAGCC TGGTCGCCCT #7761 GACGTCCTGG AGCCAAGG5T CCTGflfiGGGC CACCAGGACC CACTGGCCGC CAAGGAGAGA AGGGGGAGCC TGGTCGCCCT
-GE 333_Secuencia Re1 ¿=7841 GS3GACCCT© CAGTGSTG3G ACCIGCTGTT GCTGGACCCA AAGGAGAAAA GG3AGATGTG GGGCCCGCTG GGCCCAGAGS 60C 10í33-ITX-!)ü001_C orLtig #7841 GGGGACCCTG CAGTGGTGGG AECTGCTGTT GCTGGACCCA AAGGAGAAAA GG3AGATGTG GGGCCCGCTG GGCCCAGAGG #7841 GGGGACCCTG CAGTGGTGGG ACCIGCTGTT GCTGGACCCA AAGGAGAAAA GG3AGATGTG GGGCCCGCTG GGCCCAGAGG
j f í ? ) ZiGGE303_SecuenciaRef #7921 ASCTACCGGA GTCCAAGG3G AAC3GGSCCC ACCCGGCTTG GTTCTTCCTG GA3ACCCTGG CCCCAAGGGA GACCCTGGAG j¡É -l\ 60C 13743-ITX-D 0001_C © ntig #7921 AGCTACCGGA GTCCAAGGGG AACGGGGCCC ACCCGGCTTG GTTCTTCCTG GA3ACCCTGG CCCCAAGGGA GACCCTGGAG #7921 ACICTACCGEA GTCCAAGGGG AACGGGGCCC ACCCGGCTTG GTTCTTCCTG GAGACCCTGG CCCCAAGGGA GACCCTGGAG
ZGE33S_SeciienciaRef #8001 ACCGGGGTCC CATTG GCdT ACT3GCAGAG CAGGACCCCC AGGTGACTCA GGGCCTCCTC- GAGAC-AAGGG AGACCCIGGG 60C10743 - IT X -0000l_ C o n lig #8001 ACCGGGGTCC C A TTG SC dT ACT3GCAGAS CAGGACCCCC AGGTGACTCA GG3CCTCCTG SAGAGAAGGG AGACCCIGGG #8001 ACCGGGGTCC C A TTG SC dT ACT3GCAGAS CAGGACCCCC AGGTGACTCA GGSCCTCCTG GAGAGAAGGG AGACCCTGG3
“ GE303_SecuenciaRef #8081 C3SCCTGGCC CCCCASGAEC T3TTGGCCCC CGAGGACGAG ATGGTGAAGT 7G3AGAGAAA 3GTGACGAGG GTCCTCCGGS 60 C 10743 -IT X -00001 _ C o n tig #8081 CG3CCTGGCC CCCCASGACC TSTIGGCCCC CGAGGACGAG ATGGTGAAGT 7G3AGAGAAA GG1GACGAGG GTCCTCCGGG #8081 C33CCTGGCC CCCCAGGACC TGTTGGCCCC CGAGGACGAG ATGGTGAAGT TG3AGAGAAA GGTGACGAGG GTCCTCCGGG
IGE 30 B_$ecue nc iaRef #8161 TCACCCGGGT TTGCCTGCAA AAGCAGCCGA GCGTGCCC1T CGCCGGCCAC CT3GAGTTCG GGGGCCTGTG GGTCAAAAGG 60 C 10743 -iT X -00001 _ C o n tig #8161 TSACCCGGGT TTGCCTGCAA AAGCAG3CGA GCGTGGCCTT CGGGGGGCAC CT3GAGTTCG GGGGCCTGTG GGTGAAAAGG #8161 TSACCCGGGT TTGCCIGGAA AAGCAGGCGA GCGTGGCC1T CGGGGGGCAC CT3GAGTTCC- GGGGCCTGTG GGTC-AAAAGG
ZSE 303_ Secuencia Ref #8241 GA3ACCAGGG ASATCCTGSA 3AG3AT3GAC GAAATGSCAG CCCTGGATCA TCIGGACCCA AGGSTGACCG TGGGGAGCC3 60C10743-TTX-00001_Corvfcig #8241 GAGACCAGGG AGATCCTG3A 3AG3AT3GAC GAAATGGCAG CCCTGGATCA TCIGGACCCA AGGSTGACCG TGGGGAGCCG #8241 GA3ACCAGGG AGATCCTG3A 3AG3ATGGAC GAAATGGCAG CCCTGGATCA TCIGGACCCA AGGGTGACCG TGGGGAGCCG
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j t i l 3CE30S _5ecuenc¡aRef #■12161 g g a g c .i g c t c c c t t t t c c a c t c a Ca c c t c a g c t a c c t t t a a Ca CCa a t Ca Ct t a c a a c c c a c c t c t a c a t Ct t a g c c a Ct ^^ IfiooifiTi.i-TTx-nnnio1 tim #121 SI Fifi ARPA (iPTfi RRTTTTCCAP T.AGACCTCA fifi TACCTTTA APACf.AATGA CT TAC AA.GRfT APR"RTAKA" CTTAfitCATT #12161 GGAGGAGGTG GGrTTrCCAG TCACACCTCA GGTACCTPTA AGACCAATGA CTTACAAGGG AGCTGTAGAT CTTAGCCAC1
J t r ^ l iGE306_SecuenciaRef #12241 TTTTAAAAGA AAAGGGGGGA CIGGAAGGGC TAATTCACTC CCAACGAAGA CAAGATATCC TTGATCTGTG GATCTACCAC 6O01O743-ITX-OOCOl_C¡>ntig #12241 TTTTAAAAGA AAAGGGGGGA CIGGAAGGGC TAATTCACTC CCAACGAAGA CAAGATATCC TTGATCTGTG GATCTACCAC #12241 TTTTAAAAGA AAAGGGGGGA CIGGAAGGGC TAATTCACTC CCAACGAAGA CAAGATATCC TTGATCTGTG GATCTACCAC
j s i IGE308_SecuenciaRef #12321 ACACAAGGCT ACTTCCCTGA TIGGCAGAAC TACACACCAG GGCCAGGGAT CAGATATCCA CTGACCTTTG GATGGTGCTA 6QQ1Q743-ITX-00CQ1 CCrtltig #12321 ACACAAGGCT ACTTCCCTGA TIGGCAGAAC TACACACCAG GGCCAGGGAT CAGATATCCA CTGACCTTTG GATGGTGCTA #12321 ACACAAGGCT ACTTCCCTGA TIGGCAGAAC TACACACCAG GGCCAGGGAT CAGATATCCA CTGACCTTTG GATGGTGCTA
iGE30e_SeoienciaRef #12401 CAAGCTAGTA CCAGTTGAGC AASAGAAGGT AGAAGAAGCC AATGAAGGAG AGAACACCCG CTTGTTACAC CCTGTGA3CC E^^6O01Q743-ITX-OOCOl_CC>ntig #12401 CAAGCTAGTA CCAGTTGAGC AAGAGAAGGT AGAAGAAGCC AATGAAGGAG AGAACACCCG CTTGTTACAC CCTGTGAGCC #12401 CAAGCTAGTA CCAGTTGAGC AAGAGAAGGT AGAAGAAGCC AATGAAGGAG AGAACACCCG CTTGTTACAC CCTGTGAGCC
j t c - ' l IG E308 1 #12431 TGCATGGGAT GGATGACCCG GAGAGAGAAG TATTAGAGTG GAGGTTTGAC AGCCGCCTAG CATTTCATCA CATGGCCCGA 4 ^ 60010743 - I T X - 00 C 01 _ C o n t i g #12481 TGCATGGGAT GGATGACCCG GAGAGAGAAG TATTAGAGTG GAGGTTTGAC AGCCGCCTAG CATTTCATCA CATGGCCCGA #12431 TGCATGGGAT GGATGACCCG GAGAGAGAAG TATTAGAGTG GAGGTTTGAC AGCCGCCTAG CATTTCATCA CATGGCCCGA
j í T - l ig e 308_Secue nciaRef #12561 GAGCIGCATC CGGACTGTAC CGGGTCTCTC TGGTTAGACC AGATCTGAGC CTGGGAGCTC TCTGGCTAAC TAGGGAAGCC 60Q1Q743-ITX-QQC01 c o n t ig #12361 GAGCIGCATC CGGACTGTAC TSGGTCTCTC TGGTTAGACC AGATCTGAGC CTGGGAGCTC TCTGGCTAAC TAGGGAACCC #12561 GAGCIGCATC CGGACTGTAC TSGGTCTCTC TGGTTAGACC AGATCTGAGC CTGGGAGCTC TCTGGCTAAC TAGC-GAACCC
j f Ü IGE308 secuenciaRef #12641 ACTGCTTAA3 CCTCAATAAA GCTTGCCTTG AGTGCTTCAA GTAGTGTGTG CCCGTCTGTT GTGTGACTCT GGTAACTAGA 60C H 0743-IT X -00C 01_C t>n tig #12641 ACTGCTTAAG CCTCAATAAA GCTTGCCTTG AGTGCTTCAA GTAGTGTGTG CCCGTCTGTT GTGTGACTCT GGTAACTAGA #12641 ACTGCTTAAG CCTCAATAAA GCTTGCCTTG AGTGCTTCAA GTAGTGTGTG CCCGTCTGTT GTGTGACTCT GGTAACTAGA
j f ó ) !GE306_SecuenciaRef #12721 3ATCCCTCAG ACCCTTTTAG TCAGTGTGGA AAATCTCTAG CAGGGCCCGT TTAAACCCGC TGATCAGCCT CGACTGTGCC ■ | ^ J 60010743 -IT X -00 C 01 _ C o n tig #12721 SATCCCTCAG ACCCTTTTAG TCAGTGTGGA AAATCTCTAG CAGGGCCCGT TTAAACCCGC TGATCAGCCT CGACTGTHCC #12721 GATCCCTCAG ACCCTTTTAG TCAGTGTGGA AAATCTCTAG CAGGGCCCGT TTAAACCCGC TGATCAGCCT CGACTGTGCC
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3GE338 SecuenciaRef «14721 T3AGCTAACT CACATTAAT? GCSnGCGCT CACTGCCC3C TTC CCAGTCG GGAAS.CCTGT CSTGCCAGCT 3CA7TAATGA 4 ^ 1 6001 J743-nX-LIUÜUl_ «14 ,'21 TGAGCTAACT CACATTAATT GCGTT3CGCT CACT3CCC3C TTC CCAGTCG GGAAACCTGT CGTGCCAGCT GCA7TAATGA «14721 TGAGCTAACT CACATTAATI GCGTTGCGCT CACTGCCGGC TTCCCAGTCG GGAAACCTGI C 3TGCCAGCT GCAtTAATGÍS
7GR.30 B_SecuenctaRef #14B01 ATCG3CCAAC GCGCGPBGAG AGGCGGTTTG C3TAT*TeGGC GCTCTTCCGC TTCCTCCSCTC ACTGACTCGC TGCGCTCGGT 6C 010743-ITX -00301 C ontig #14601 ATCG 3CCAAC GCGCGGGGAG AGGCGGTTTG CGTATTGGGC GCTCTTCCGC TTCCTCG'CTC ACTGACTCGC TGCGCTCGGT
414601 ATCG3CCAACGCGCGGGGAGAGGCGGriIGC31ATTGGGCGCCCTCCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGT
j S I TCE3 a 8_SecuenciaRef «14881 CCTTCCCETC CCC-CCACCGG TATCAGCTCA CTCAAACGCG CTAATACCGT TATCCACACA ATCAGGCCAT AACCCACCAA 4 ^ *1 600107l33-ITX-003QX_Csntlg #14881 CGTTCGGCTG CGGCGAGCGG TftTCAGCTCA CICAAAC-GCG GTAATACGGT TATCCACAGA ATCAGC-GGAT AACGCAC-GAA #14801 CGTTCGGCTG CGGCGAGCGG TATCAGCICA CTCAAAGGCG GTAATACGGT TATCCACAGA ATCAGGGGAT AACGCAGGAA
i g e 306_ SecuenciaRef #14961 AGAACACGTG AGCAAAAGGC CAGCAAAA3G CCAGGAACCG TAAAAAGGCC GC5TTGCTGG CGTTITTCCA TAGGCTCCGC 6C010743-ITX“ 00301_Contig «14961 AGAACATGTG AGCAAAAGGC CAGCAAAAGG CCAGGAACCG TAAAAAGGCC GCGTTGCTGG CGTTITTCCA TAGGCTCCGC #14961 AGAACACGTG AGCAAAAGGC CAGCAAAAGG CCAGGAACCG TAAAAAGGCC GCGTTGCTGG CGTTITTCCA TAGGCTCCGC
-GE3 a B_SecuenciaRef #15041 CCCCCTGACG AGCATCACAA AAATCSACGC TCAAGTCAGA GGTGGCGAAA CCCGACAGGA CTATAAAGAT ACCAGGCGTT 60Q107fl3-rrX-Q CQ01_C O fltig #15041 CCCCCTGACG AGCATCACAA AAATCGAC3C TCAAGTCAGA GGCGGCGAAA CCCGACAGGA CTATAAAGAT ACCAGGCGTT #15041 CCCCCTCACC AGCATCACAA AAATCGACCC TCAAGTCAGA CCTGCCCAAA CCCCACACCA CTATAAAGAT ACCAGGCGTT
iGE309_SeeuenciaRef #15121 CCCCCCVGGA AGCXCCCTCG TGCGCTC1CC TSTTCCGACC CTGCCGCTTA CCGGATACCI GrCCHCCTTT CTCCCTTCGG 60 Q 107 a3 -n x -0030 I_C o n tig #15121 TCCCCCTGGA AGCTCCCTCG TGCGCTCTCC TGTTCCGACC CTGCCGCTTA CCGGATACCI GPCCGCCTTT CTCCCTTCGG #15121 TCCCCCTGGA AGCTCCCTCG TGCGCTCTCC T3TTCCGACC CTGCCGCTTA CCGGATACCI GTCCGCCTTT CTCCCTTCGG
iGE3ae secuencraRef #15201 GAAGCG7GGC GCTTTCTCAT AGCTCACGCT GTAGGTATCT CAGTTCGGTG TAGGTCGTTC GCTCCAAGCT GGGCTGTGTG 6G 010743-ITX-00301 COiltlg #15201 GAAGCGTGGC GCTTTCTCAT AGCTCACGCT GTAGGTATCT CAGTTCGGTG TAGGTCGTTC GCTCCAAGCT GGGCTGTGTG #15201 GAAGCGCGGC GCTTTCTCAT AGCTCACGCT GTAGGTATCT CAGTTCGGTG TAGGTCGTTC GCTCCAAGCT GGGCTGTGTG
CGE3as_SecuerciaRef #15281 CACGAACCCC CCGTTCAGCC CGACCGCTGC GCCTTATCCG GTAACCATCG TCTTGAGTCC AACCCGGTAA GACACGACTT 60010743-ITX-Q 03Q l_C sntig #15281 C/iCGAACCCC CCGTTCAGCC CGACCGC13C GCCTTATCCG GTAACCATCG TCTTGAGTCC AACCCGGTAA GACACGACTT #15281 CÁCGAACCCC CCGTTCAGCC CGACCGCTGC GCCTPATCCG GTAACIATCG ICTTGAGTCC AACCCGGTAA 3ACACGACTT
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i Ge 398_SecuenciaRef 16001 GCAACCTIAT CCGCClCCAT CCA£;TClñT7 AATIGT7GCC Gt-GAAGCIAG AGTAAG7AGr TCGCCAGTTA ATñGTTTGCG 600 iD 743 - iT x - c ; : : i_ C ü r L 7 io 16001 GCAACCTTAC CCGCCTCCAT CCAGTCTATT AACTGTCGCC GGGAAGCTAG AGTAAGCAGT TCGCCAGTTA ATAGTTGGGG *16001 GCAACTTTAT CCGCCTCCAT CCAGI'CTATT AATTGT'l'GCC GGGAAGCTAG AGTAASTAGT TCGCCAGTTA ATAGTTTGCG
j t E I i ge 30 B_Secuenc¡aRef *16061 CAACGTTGTT GCCATTGCTA CAGSCAICGC GGTGTCACGC CCGTCGTTTG GTATG3CTTC ATTCAGCTCC GGTTCCCAAC ■1^ ] SCO 13743 -IC X -00 aD l_ C o :itig *16061 CAACGTTGTT GCCATTGCTA CAGGCATCGT GGTGTCACGC TCGTCGTTTG GTATGGCTTC ATTCAGCTCC GGTTCCCAAC *16061 CAACGTTGTT GCCATTGCTA CAGGCATCGT GGTGTCACGC TCGTCGTTTG GTATGGCTTC ATTCAGCTCC GGTTCCCAAC
j f í l ig e 3 a B_secue nciaRef 16161 GATCAAGGCG AGTTACATGA TCCCCCATGT TGTGCAAAAA AGCGGTTAGC TCCTTCGGTC CTCCGATCGT TGTCAGAAGT 6 o o iQ 743 - ir x -o o a a i_ c o A tig r *16161 GATCAAGGCG AGTTACATGA TCCCCCATGT TGTGCAAAAA AGCGGTTAGC TCCTTCGGTC CTCCGATCGT TGTCAGAAGT *16161 GATCAAGGCG AGTTACATGA TCCCCCATGT TGTGCAAAAA AGCGGITAGC TCCTTCGGTC CTCCGATCGT TGTCAGAAGT
jf^ lIi ig e 338_SecuenciaRef *1624 ' AAGTTGGCCG CAGTGTTATC ACTCATGGT" ATGGCAGCAC "GCATAATTC TCTTACTGTC ATGCCATCCG TAAGATGCTT - | É | ) 6C 013743-ITX-0f5331_C o-n tl! *16241 AAGTTGGCCG CAGTGTTATC ACTCATGGTT ATGGCAGCAC TGCATAATTC TCTTACTGTC ATGCCATCCG TAAGATGCTT *16241 AAGTTGGCCG CAGTGTTATC ACTCATGGTT ATGGCAGCAC TGCATAATTC TCTTACTGTC ATGCCATCCG TAAGATGCTT
j fc c 'lI i IGE33B_Secuenc¡aRef *16321 TTCTGTGACT GGTGAGTACT CAACCAAGTC ATTCTGAGAA TAGTGTATGC GGCGACCGAG TTGCTCTTGC CCGGCGTCAA ■|^ | S C 013743-IT X -00 a01_ C on ti! *16321 TTCTGTGACT GGTGAGTACT CAACCAAGTC ATTCTGAGAA TAGTGTATGC GGCGACCGAG TTGCTCTTGC CCGGCGTCAA *16321 TTCTGTGACT GGTGAGTACT CAACCAAGTC ATTCTGAGAA TAGTGTATGC GGCGACCGAG TTGCTCTTGC CCGGCGTCAA
¿ S I i ge3 D 6_Secuenc¡aRef *16401 TAC3GGATAA TACCGCGCCA CATR3CAGAA CTTTAAAAGT GCTCATCATT GGAAAACGTT CTTCGGGGCG AAAACTCTCA n | |£ j j 6 C 0 ia 743 -IT X -00 a 01 _ C o n ti? *16401 TACGGGATAA TACCGCGCCA CATRGCAGAA CTTTAAAAGT GCTCATCATT GGAAAACGTT CTTCGGGGCG AAAACTCTCA 16401 TACGGGATAA TACCGCGCCA CATAGCAGAft CTTTAAAAGT GCTCATCATT GGAAAACGTT CTTCGGGGCG AAAACTCTCA
j f é ) iGE338_SecuenciaRef *16461 AGGATCTTAC CGCTGTTGAG ATCCAGTTCG ATGTAACCCA CTCGTGCACC CAACT3ATCT TCAGCATCTT TTACTTTCAC - J ^ j fiC 0 ia ? 43 -IT X -Q 0 a a i_ C o .n tiff *1646. AGGATCTTAC C2CTGTTGAG ATCCAGXTCG ATGTAACCCA CTCGTGCACC CAACTGATCT TCAGCATCTT TTACTTTCAC *16401 AGGATCTTAC CGCTGTTGAG ATCCAGITCG ATGTAACCCA CTCGTGCACC CAACT3ATCT TCAGCATCTT TTACTTTCAC
j f ? l i ge 308_secuene¡aRef *16561 CAGCGTTTCT GGGTGAGCAA AAACAGGAAG GCAAAATGCC GCAAAAAAGG GAATAAGGGC GACACGGAAA TGTTGAATAC ■ | ^ ) S C 010743-lTX -Q aa a i_C o .n tig +16561 CAGCGTTTCT GGGTGAGCAA AAACAGGAAG GGAAAATGCC GCAAAAAAGG GAATAAGGGC GACACGGAAA TGTTGAATAC 1656. CAGCGTTTCT GGGTGAGCAA AAACAGGAAG GCAAAATGCC GCAAAAAAGG GAATAAGGGC GACACGGAAA TGTTGAATAC Referencias
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Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Células autólogas modificadas genéticamente para usar en un método para tratar a un paciente que padece una deficiencia de colágeno tipo VII (C7), en donde dicho método comprende:
(i) poner en contacto células, obtenidas de la dermis o epidermis del paciente con deficiencia de C7, con un vector lentiviral de transducción que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica COL7A1 o una variante funcional de la misma, para formar las células modificadas genéticamente autólogas que tienen un número de copias del vector, en donde dicho vector lentiviral tiene un número de copias del vector de transducción en el intervalo de 0.1 a 5.0 copias por célula;
(ii) cultivar dichas células modificadas genéticamente autólogas; y
(iii) administrar una cantidad efectiva de las células modificadas genéticamente al paciente con deficiencia de C7,
en donde el vector lentiviral de transducción comprende además (a) una repetición terminal larga (LTR) 5' modificada, en donde el promotor de la 5 ’ LTR modificada es un promotor de citomegalovirus, (b) al menos un elemento del tracto de polipurina central lentiviral, y (c) una 3 ’ LTR modificada, en donde la 3’ LTR modificada comprende una deleción respecto a la 3 ’ LTR de tipo natural, en donde se ha eliminado un elemento regulador postranscripcional (PRE) del virus de la hepatitis.
2. Las células modificadas genéticamente autólogas para el uso de la reivindicación 1, en donde las células se seleccionan de fibroblastos y queratinocitos.
3. Las células modificadas genéticamente autólogas para el uso de la reivindicación 1, en donde la deficiencia de C7 es epidermólisis ampollosa distrófica.
4. Las células modificadas genéticamente autólogas para el uso de la reivindicación 1, en donde la deficiencia de C7 es una epidermólisis ampollosa distrófica, epidermólisis ampollosa distrófica recesiva (RDEB), epidermólisis ampollosa distrófica dominante (DDEB), Hallopeau-Siemens, RDEB no Hallopeau-Siemens, RDEB inversa, RDEB pretibial, RDEB acral o RDEB centrípeta.
5. Las células modificadas genéticamente autólogas para el uso de la reivindicación 1, en donde dicho vector lentiviral de transducción está en forma de una partícula de vector lentiviral.
6. Las células modificadas genéticamente autólogas para el uso de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde las células modificadas genéticamente se van a administrar al paciente por inyección, vía tópica, oral o insertadas en una matriz biocompatible.
7. Un fibroblasto modificado genéticamente autólogo de un paciente que padece una deficiencia de colágeno tipo VII transducido con una partícula de vector lentiviral que comprende un gen C O L7 A 1 funcional o una variante funcional del mismo, y que expresa el colágeno tipo VII, en donde dicha partícula de vector lentiviral tiene un número de copias del vector de transducción en el intervalo de 0.1 a 5.0 copias por célula, en donde dicha partícula de vector lentiviral de transducción se construye a partir de un vector lentiviral de transferencia que comprende (a) una repetición terminal larga 5' modificada en LTR, en donde el promotor de la 5’ LTR modificada es un promotor de citomegalovirus, (b) un gen C O L7A 1 funcional, (c) al menos un tracto de polipurina central lentiviral, y (d) una 3 ’ LTR modificada, en donde la 3’ LTR modificada comprende una deleción respecto a la 3' LTR de tipo natural, en donde se ha eliminado un elemento regulador postranscripcional (PRE) del virus de la hepatitis, en donde el gen C O L 7 A 1 o la variante funcional del mismo se incorpora a las células para formar células modificadas genéticamente que tienen un gen C O L7A 1 funcional.
8. Un vector lentiviral autoinactivante formado a partir de un vector de transferencia que comprende (a) una 5' terminal larga modificada en la LTR, en donde el promotor de la 5 ’ LTR modificada es un promotor de citomegalovirus, (b) el gen C O L7A 1 o una variante funcional del mismo, (c) al menos un elemento del tracto de polipurina central lentiviral, y (d) una 3 ’ LTR modificada, en donde la 3’ LTR modificada comprende una deleción respecto a la 3 ’ LTR de tipo natural, y, en donde se ha eliminado un elemento regulador postranscripcional (PRE) del virus de la hepatitis, en donde el PRE eliminado es un elemento regulador postranscripcional PRE de marmota (WPRE).
9. Un vector de transferencia que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 34.
10. Una partícula de vector lentiviral que comprende el vector lentiviral autoinactivante de la reivindicación 8 o el vector de transferencia de la reivindicación 9.
11. Una partícula de vector lentiviral construida a partir de un plásmido de expresión lentiviral pSMPUW que comprende (a) una repetición terminal larga 5' modificada en LTR, en donde el promotor de la 5 ’ LTR modificada es un promotor de citomegalovirus, (b) un gen C O L7A 1 funcional, (c) al menos un tracto de polipurina central lentiviral, y (d) una 3’ LTR modificada, en donde la 3 ’ LTR modificada comprende una deleción respecto a la 3' LTR de tipo natural, en donde se ha eliminado un elemento regulador postranscripcional (PRE) del virus de la hepatitis.
12. Una línea celular de empaquetamiento de virus estable que produce la partícula de vector lentiviral de la reivindicación 10 o la reivindicación 11.
13. Una composición farmacéutica que comprende un fibroblasto obtenido de un paciente que padece RDEB o DDEB transducido con el vector lentiviral de la reivindicación 10 o la reivindicación 11.
14. Una célula transducida in v itro o e x v ivo con el vector de la reivindicación 10 o la reivindicación 11.
15. Una población de células autólogas para usar en el tratamiento de un paciente que padece pseudosindactilia, en donde dicha población de células autólogas se va a obtener de dicho paciente y se va a transducir con una partícula de vector lentiviral que comprende un gen C O L7A 1 funcional o una variante funcional del mismo, y que expresa el colágeno tipo VII, en donde dicha partícula de vector lentiviral tiene un número de copias del vector de transducción en el intervalo de 0.1 a 5.0 copias por célula, en donde dicha partícula de vector lentiviral de transducción se construye a partir de un vector lentiviral de transferencia que comprende (a) una repetición terminal larga 5' modificada en LTR, en donde el promotor de la 5 ’ LTR modificada es un promotor de citomegalovirus, (b) un gen C O L7A 1 funcional, (c) al menos un tracto de polipurina central lentiviral, y (d) una 3 ’ LTR modificada, en donde la 3’ LTR modificada comprende una deleción respecto a la 3' LTR de tipo natural, en donde se ha eliminado un elemento regulador postranscripcional (PRE) del virus de la hepatitis, en donde se incorpora el gen C O L7 A 1 o la variante funcional del mismo a las células para formar células modificadas genéticamente que tienen un gen C O L7A 1 funcional.
16. Un método para preparar una población aislada de células modificadas genéticamente que expresan colágeno tipo VII (C7) autólogas de un paciente que padece deficiencia de C7 que comprende: poner en contacto células, obtenidas de la dermis o epidermis del paciente con deficiencia de C7, con una partícula de vector lentiviral de transducción que comprende el gen C O L7 A 1 o una variante funcional del mismo, para formar células autólogas modificadas genéticamente que comprenden el gen C O L7A 1 que tiene un número de copias del vector en donde dicha partícula de vector lentiviral tiene un número de copias del vector de transducción en el intervalo de 0.1 a 5.0 copias por célula, y cultivar dichas células autólogas modificadas genéticamente para obtener una población aislada de células modificadas genéticamente que expresan C7, en donde dicha partícula de vector lentiviral de transducción se construye a partir de un vector lentiviral de transferencia que comprende (a) una repetición terminal larga 5' modificada en LTR, en donde el promotor de la 5 ’ LTR modificada es un promotor de citomegalovirus, (b) un gen C O L7A 1 funcional, (c) al menos un tracto de polipurina central lentiviral, y (d) una 3’ LTR modificada, en donde la 3’ LTR modificada comprende una deleción respecto a la 3' LTR de tipo natural, en donde se ha eliminado un elemento regulador postranscripcional (PRE) del virus de la hepatitis, en donde el gen C O L7A 1 o la variante funcional del mismo se incorpora a las células para formar células modificadas genéticamente que tienen un gen C O L7A 1 funcional.
17. Una población aislada de células modificadas genéticamente que expresan colágeno tipo VII (C7) producida por el método de la reivindicación 16.
18. Una formulación farmacéutica que comprende la población aislada de la reivindicación 17.
19. Un método para aumentar el número de copias del transgén integradas por célula en fibroblastos o queratinocitos dérmicos humanos modificados genéticamente que comprende
(a) poner en contacto un vector lentiviral de transducción que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un gen C O L7A 1 o una variante funcional del mismo con un fibroblasto o queratinocito dérmico humano obtenido de un paciente con deficiencia de C7 para formar una primera composición de transducción;
(b) someter dicha primera composición de transducción a espinoculación para formar fibroblasto o queratinocito dérmico humano transducido;
(c) poner en contacto los fibroblastos o queratinocitos dérmicos humanos transducidos de la etapa (b) con un segundo vector lentiviral de transducción para formar una segunda composición de transducción; y
(d) someter dicha primera composición de transducción a espinoculación para formar fibroblasto o queratinocito dérmico humano transducido,
en donde el número de copias del transgén integradas de los fibroblastos o queratinocitos dérmicos humanos transducidos es al menos 5, 10, 15, 20, 25, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 o 50 veces mayor en relación con fibroblastos o queratinocitos dérmicos humanos transducidos no sometidos a espinoculación o a una segunda etapa de transducción, y en donde el vector lentiviral de transducción comprende además (a) una repetición terminal larga 5' (LTR) modificada, en donde el promotor de la 5 ’ LTR modificada es un promotor de citomegalovirus, (b) al menos un elemento del tracto de polipurina central lentiviral, y (c) una 3 ’ LTR modificada, en donde la 3 ’ LTR modificada comprende una deleción respecto a la 3' LTR de tipo natural, en donde se ha eliminado un elemento regulador postranscripcional (PRE) del virus de la hepatitis.
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